MXPA04011312A - Metodo para el tratamiento de desordenes dislipidemicos. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona metodos para el tratamiento o prevencion de una condicion o padecimiento asociado con dislipidemia, cuyas composiciones comprenden complejos de apolipoproteina-esfingomielina. Los metodos de la invencion permiten la reduccion de 4 a 20 veces la cantidad de apolipoproteina requerida para la administracion terapeutica para originar un efecto de mejoramiento.

Description

MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE DESÓRDENES DISLIPIDEMICOS 1. CAMPO TÉCNICO La invención proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades, condiciones o trastornos asociados con la dislipidemia con complejos de apolipoproteína-esfingomieiina o composiciones farmacéuticas de los mismos. La invención proporciona además composiciones para tratar o prevenir una enfermedad, condición o trastorno asociado con la dislipidemia y métodos para la producción de las composiciones. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El colesterol circulante es transportado por las lipoproteínas del plasma -partículas complejas de composición de lípidos y proteínica que transportan lípidos en la sangre. Cuatro clases principales de partículas de lipoproteínas circulan en el plasma y están involucradas en el sistema de transporte de grasa: quilomicrones , lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) , lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína de alta densidad (HDL) . Los quilomicrones constituyen un producto de vida corta de la absorción de grasa intestinal. La VLDL y particularmente, LDL son responsables del suministro o entrega de colesterol desde el hígado (donde se sintetiza u obtiene de fuentes dietéticas) a los tejidos extrahepáticos , incluyendo las paredes arteriales. La HDL en contraste, media el transporte invertido de colesterol (RCT) , la remoción del colesterol de los tejidos extrahepáticos al hígado, donde se cataboliza, elimina o recicla. El HDL también juega un papel en la inflamación, transportando lípidos oxidados e interleucinas . Las partículas de lipoproteínas tienen un núcleo hidrofóbico comprendido de colesterol (normalmente en forma de un colesterolil éster) y triglicéridos . El núcleo está rodeado por un revestimiento superficial que comprende fosfolípidos , colesterol no esterificado y apolipoproteínas . Las apolipoproteínas median el transporte de lípidos, y algunas pueden interactuar con las enzimas involucradas en el metabolismo de lípidos. Al menos diez apolipoproteínas han sido identificadas, incluyendo ApoA-I, ApoA-II, ApoA- IV, ApoA-V, ApoB, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE, ApoJ y ApoH . Otras proteínas tales como LCAT ( lecitina : colesterol aciltransferasa) , CETP (proteína de transferencia de colesterolil ásteres) , PLTP (proteína de transferencia de fosfolípidos) y PON (paraoxonasa) se encuentran asociadas también con las lipoproteínas. Las enfermedades cardiovasculares tales como la enfermedad cardiaca coronaria, la enfermedad arterial coronaria y aterosclerosis están vinculadas predominantemente con niveles elevados de colesterol del suero. Por ejemplo, la aterosclerosis es una enfermedad lentamente progresiva caracterizada por la acumulación de colesterol dentro de las paredes arteriales. Evidencia convincente apoya la teoría de que los lípidos depositados en las lesiones ateroscleróticas se derivan principalmente de las LDLs del plasma: por lo tanto, las LDLs se han vuelto conocidas popularmente como el colesterol "malo". En contraste, los niveles elevados de HDL del suero se correlacionan inversamente con las enfermedades cardiacas coronarias. Actualmente, los niveles elevados de suero de des se consideran como un factor de riesgo negativo. Se hipotetiza que los altos niveles del HDLs del plasma no son sólo protectores contra la enfermedad cardiaca coronaria, sino que actualmente pueden inducir la regresión de las placas ateroscleróticas (ver, por ejemplo, Badimon et al., 1992, Circulation 86 (Suppl. III).-86-94; Dansky y Fisher, 1999, Circulation 100:1762-63; Tangirala et al., 1999, Circulation 100 (17) : 1816-22 ; Fan et al., 1999, Atherosclerosis 147(1) .-139-45 ; Deckert et al 1999, Circulation 100(1) .-1230-35; et al 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. 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Invest. 60:455-61) y/o inducen su regresión (Badimon et al., 1990, J. Clin. Invest. 85:1234-41) . 2.1 TRANSPORTE INVERTIDO DE COLESTEROL, HDL Y APOLIPOPROTEÍNA A-I La vía del transporte invertido de colesterol (RCT) funciona para eliminar el colesterol de la mayoría de los tejidos extrahepáticos y es crucial para mantener la estructura y función de la mayoría de las células en el cuerpo. La RCT consiste principalmente de tres etapas (a) escape de colesterol, es decir, la remoción inicial del colesterol de varios agrupamientos de células periféricas; (b) esterificación del colesterol mediante la acción de la lecitina : colesterol aciltransferasa (LCAT) , previniendo una reentrada del colesterol saliente a las células; y (c) asimilación de colesterol de HDL y colesterolil ésteres por las ululas del hígado para la hidrólisis, después reciclado, almacenamiento excreción en bilis o catabolismo a ácidos biliares . La LCAT, la enzima clave en la RCT, es producida por el hígado y circula en el plasma asociado con la fracción de HDL. La LCAT convierte el colesterol derivado de las células en colesterolil ésteres, los cuales son secuestrados en el HDL destinado para la remoción (ver Joñas 2000, Biochim. Biophys.

Acta 1529 (1-3) :245-56) . La proteína de transferencia de colesterolil ésteres (CEPT) y la proteína de transferencia de fosfolípidos (PLTP) contribuyen a la remodelación adicional de la población de HDL circulante. La CEPT mueve los colesterolil ésteres fabricados por LCAT a otras lipoproteínas, particularmente lipoproteínas que comprenden ApoB, tales como VLDL y LDL. PLTP suministra lecitina a la HDL. Los triglicéridos de HDL son catabolizados por la triglicérido lipasa hepática extracelular, y el colesterol de lipoproteína es removido por el hígado vía varios mecanismos. Las características funcionales de las partículas de HDL se determinan principalmente por sus componentes de apolipoproteínas principales tales como ApoA-I y ApoA-II. Cantidades menores de ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoA-IC, ApoE, ApoJ han sido observadas también asociadas con la HDL. La HDL existe en una amplia variedad de tamaños diferentes y mezclas diferentes de los constituyentes mencionados arriba, dependiendo del estatus de la remodelación durante la cascada o trayectoria de la RCT metabólica. Cada partícula de HDL usualmente comprende al menos una molécula, y usualmente dos a cuatro moléculas de ApoA-I. Las partículas de HDL pueden comprender también solamente ApoE (partículas de ?-LpE) , las cuales se conocen por ser responsables del escape de colesterol, como se describe por el Prof. BERD Assmann (ver, por ejemplo, von Eckardstein et al., 1994, Curr Opin Lipidol . 5 (6) : 404-16) . La ApoA-I es sintetizada por el hígado y el intestino delgado como preapolipoproteína A-I, la cual es secretada como la proapolipoproteína A-I (proApoA-I) y escindida rápidamente para generar la forma de plasma de la ApoA-I, una sola cadena de polipéptido de 243 aminoácidos (Brewer et al., 1978, Biochem. Biophys . Res. Común. 80:623-30). La preproApoA-I que se inyecta de manera experimental directamente al flujo sanguíneo es escindida también en la forma de plasma de ApoA-I (Klon et al., 2000, Biophys. J. 79 (3) : 1679-85 ; Segrest et al.,, 2000, Curr. Opin. Lipidol. 11 (2 ): 105-15 ; Segrest et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 (45) :31744-58) . La ApoA-I comprende 6 a 8 diferentes oí-hélices de 22 aminoácidos o repeticiones funcionales separadas por una porción enlazadora que es frecuentemente prolina. Las unidades repetidas existen en la conformación helicoidal antipática (Segrest et al., 1974, FEBS Lett . 38: 247-53) y confieren las actividades biológicas principales de la ApoA-I, es decir, enlace de lípidos y activación de la lecitina colesterol acil transíerasa (LCAT) . Las ApoA-I forma tres tipos de complejos estables con lípidos: complejos pequeños, pobres en lípidos conocidos como pre-ß-? HDL; partículas discoidales aplanadas que comprenden lípidos polares (fosfolípidos y colesterol) conocidas como pre-p-2 HDL; y partículas esféricas, que comprenden tanto lípidos polares y no polares, conocidos como HDL esférica o madura (HDLL3 y HDLL2) . La mayoría de la HDL en la población circulante comprende tanto ApoA-I y ApoA-II (la "fracción AI/AII HDL") . Sin embargo, la fracción de HDL que comprende sólo ApoA-I (la "fracción AI -HDL") parece ser más efectiva en la RCT. Ciertos estudios epidemiológicos soportan la hipótesis de que la fracción Apo-AI-HDL es anti-aterogénica (Parra et al., 1992, Arterioscler . Thromb. 12:701-07; Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307). Aunque el mecanismo para la transferencia de colesterol desde la superficie celular (es decir, efluente de colesterol) es desconocido, se cree que el complejo pobre en lípidos, pre-ß-l HDL, es el aceptor preferido para el colesterol transferido desde el tejido periférico involucrado en la RCT. (Ver Davidson et al 1994, J. Biol . Chem. 269-22975-82; Bielicki et al 1992 J. Lipid Res. 33:1699-1709; Rothblat et al 1992, J. Lipid Res. 33:1091-97; Y Kawano et al., 1993, Biochemistry 32:5025-28; Kawano et al., 1997, Biochemistry 36:9816-25). Durante este proceso de reclutamiento del colesterol desde la superficie celular, la pre-ß HDL se convierte rápidamente a pre-p-2 HDL. La PLTP puede incrementar la velocidad de la formación de discos de pre- -2 HDL, pero se carece de datos que indican un papel para la PLTP en la RCT. La LCAT reacciona preferencialmente con la HDL discoidal, pequeña (pre-ß) y esférica (es decir, madura) , transfiriendo el grupo 2-acilo de la lecitina u otros fosfolípidos al residuo de hidroxilo libre del colesterol para generar colesterolil esteres (retenidos en la HDL) e lisolecitina . La reacción de LCAT requiere la ApoA-I como un activador, es decir, la ApoA-I es el cofactor natural para LCAT. La conversión del colesterol secuestrado en la HDL a este éster, previene la re-entrada del colesterol en las células, el resultado neto es que el colesterol es removido de las células . Los colesterolil ésteres en las partículas de HDL madura en la fracción Apoya-HDL (es decir, que comprende ApoA-I y sin ApoA-II) son removidas por el hígado y procesadas en bilis más efectivamente que aquellos derivados de la HDL que comprende tanto ApoA-I y ApoA-II (la fracción AI/AII-HDL) . Esto puede ser debido, en parte, al enlace más efectivo de la ApoAI-HDL a la membrana de los hepatocitos. Ha sido hipotetizada la existencia de un receptor de HDL, y un receptor depurador, clase B , tipo I (AR-BI) ha sido identificado como un receptor de HDL (Acton et al., 1996 Science 271:518-20; Xu et al., 1997, Lipid Res. 38:1289-98). SR-BI es expresado más abundantemente en los tejidos esteroidogénicos (por ejemplo, suprarrenales), y en el hígado (Landschultz et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:984-95; Rigotti et al., 1996, J. Biol . Chem. 271:33545-49) . La CETP también puede jugar un papel en la RCT. Los cambios en la actividad de la CETP o sus aceptores, VLDL, y LDL, juegan un papel en la "remodelación" de la población de HDL. Por e emplo, en ausencia de CETP, las des se vuelven partículas alargadas que no son eliminadas. (Para revisiones de RCT y HDLs, ver Fielding y Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:211-28; Barrans et al., 1996, Biochem. Biophys . Acta 1300:73-85; Hirano et al., 1997, Arterioscler . Thromb. Vasc . Biol . 17 (6) : 1053-59) . La HDL también juega un papel en el transporte invertido de otros lipidos y en la destoxificación, es decir, el transporte de lipidos desde las células, órganos, y tejidos al hígado para el catabolismo y la excreción. Tales lipidos incluyen esfingomielina (SM) , lipidos oxidados, y lisofosfatidilcolina . Por ejemplo, Robins y Fasulo (1997, J. Clin. Invest. 99:380-84) han demostrado que las des estimulan el transporte de esterol de plantas por el hígado en secreciones biliares. El componente principal de la HDL, ApoA-II, puede asociarse con la SM in vitro. Cuando la ApoA-I se reconstituye in vitro con SM de cerebros de bovino (BBSM) , ocurre una velocidad máxima de reconstitución a 28 °C, temperatura que se aproxima a la temperatura de transición de fase para la BBSM (Swaney, 1983, J. Biol . Chem. 258(2), 1254-59) . A relaciones de BBSM:ApoA-I de 7.5:1 o menos (p/p) , se forma una sola partícula de HDL homogénea reconstituida que comprende tres moléculas de ApoA-I por partícula y que tiene una relación molar BBSM:ApoA-I de 360:1. Esta aparece en el microcopio electrónico como un complejo discoidal similar al obtenido mediante la recombinación de ApoA-I con fosfatidilcolina a relaciones elevadas de fosfolípidos/proteínas . A relaciones de BBSM:ApoA-I de 15:1 (p/p) , sin embargo, se forman complejos discoidales de diámetro mayor que tienen una relación molar mayor de fosfolípidos/proteínas (535:1) . Estos complejos son significativamente más grandes, más estables y más resistentes a la desnaturalización que los complejos de ApoA-I formados con fosfatidilcolina . La esfingomielina (SM) se eleva en la cercanía de los aceptores de colesterol (pre- -HDL y lipoproteina que comprende ApoE ?-migrante) , sugiriendo que la SM podría mejorar la habilidad de estas partículas para promover la salida de colesterol (Dass y Jessup 2000, J. Pharm. Pharmacol . 52:731-61; Huang et al., 1994, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 91:1834-38; Fielding y Fielding 1995, J. Lipid Res. 36:211-28) . 2.2 MECANISMO PROTECTOR DE LA HDL Y APOA-I Los estudios recientes sobre el (los) mecanismo (s) de la HDL se han enfocado en la apolipoproteína A-I (ApoA-I) , el componente principal de la HDL. Los niveles de plasma altos de ApoA-I están asociados con la ausencia o reducción de lesiones coronarias ( aciejko et al., 1983, N. Engl . J. Med. 309:385-89; Sedlis et al., 1986, Circulation 73:978-84). La infusión de ApoA-I o de HDL en animales experimentales ejerce cambios bioquímicos significativos, así como reduce la extensión y severidad de las lesiones ateroscleróticas . Después de un reporte inicial por Maciejko y Mao (1982, Arteriosclerosis 2:407a). Badimon et al., (1989, Lab. Invest . 60:455-61; 1989, J. Clin. Invest. 85:1234-41) encontraron que estos podrían reducir significativamente la extensión de lesiones ateroscleróticas (reducción del 45%) y su contenidos de colesterol ésteres (reducción de 58.5%) en conejos alimentados con colesterol, infundiendo HDL (d=l .063-1.325 g/ml) . Ellos encontraron también que las infusiones de HDL llevan a una regresión cercana al 50% de las lesiones establecidas. Esper et al., (1987, Arteriosclerosis 7:523a) ha mostrado que las infusiones de HDL pueden cambiar marcadamente la composición de lipoproteínas del plasma de conejos de Watanabe con hipercolesterolemia heredada, los cuales desarrollan lesiones arteriales tempranas. En estos conejos. las infusiones de HDL pueden doblar más que la relación entre la HDL protectora y la LDL aterogénica. El potencial de la HDL para prevenir las enfermedades arteriales en modelos animales ha sido acentuada por la observación de que la ApoA-I puede ejercer una actividad fibrinolítica in vitro (Saku et al., 1985 Thromb. Res. 39:1-8). Ronneberger (1987, Xth Int. Congr. Pharmacol . Sydney, 990) demostró que la ApoA-I puede incrementar la fibrinolisis en perros sabuesos y en monos Cinomologos. Una actividad similar puede ser notada in vitro en plasma humano. Ronnerberger fue capaz de confirmar una reducción de la deposición de lipidos y la formación de placas arteriales en animales tratados con ApoA-I . Los estudios in vitro indican que los complejos de ApoA-I y lecitina pueden promover el escape de colesterol libre de células musculares lisas arteriales cultivadas (Stein et al., 1975, Biochem. Biophys. Acta, 380:106-18). Mediante este mecanismo, la HDL puede reducir también la proliferación de estas células (Yoshida et al., 1984, Exp. Mol. Pathol . 41:258-66) . Han sido aisladas dos mutaciones humanas de formación natural de la ApoA-I, en las cuales el residuo de arginina está mutado a cisteína. En la apolipoproteína A-IMiiano (ApoA-IM) , esta substitución ocurre en el residuo 173, en tanto que en la apolipoproteína A-IPariS (ApoA-IP) , esta substitución ocurre en el residuo 151 (Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900; Weisgraber et al., 1983, J. Biol . Chem. 258:2508-13; Bruckert et al., 1997, Atherosclerosis 128:121-28; Daum et al., 1999 J. Mol. Med. 77:614-22; Klon et al., 2000, Biophys. J. 79 (3 ): 1679-85) . Las partículas de HDL reconstituida que comprenden homodímeros enlazados por disulfuro ya sea de ApoA-IM o ApoA-IP son similares a las partículas de HDL reconstituidas que comprenden ApoA-I del tipo silvestre en su habilidad para eliminar las emulsiones de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y su habilidad para promover el escape o eflujo de colesterol (Calabresi et al., 1997, Biochemistry 36:12428-33; Franceschini et al., 1999, Arterioscler . Thromb. Vasc. Biol. 19:1257-62; Daum et al., 1999 J. Mol. Med. 77:614-22). En ambas mutaciones, los individuos heterócigos tienen niveles disminuidos de HDL pero paradó icamente, están en riesgo reducido de aterosclerosis (Franceschini et al., 1980 J. Clin. Invest. 66:892-900; Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-13; Bruckert et al., 1997, Atherosclerosis 128:121-28) . Las partículas de HDL reconstituidas que comprenden cualquier variante son capaces de la activación de la LCAT, aunque con eficiencia disminuida cuando se compara con las partículas de HDL reconstituidas que comprenden la ApoA-I del tipo silvestre (Calabresi et al., 1997a, Biochem. Biophys . Res. Común. 232:345-49; Daum et al., 1999, J. mol. Med. 77 :614-22) . La mutación ApoA-IM es transmitida como un rasgo dominante autosomal ; 8 generaciones de portadores dentro de una familia han sido identificados (Gualandri et al., 1984, Am. J. Hum. Genet . 37:1083-97). El estatus de los individuos portadores de ApoA-IM se caracteriza por la reducción remarcable en el nivel de colesterol de HDL. A pesar de esto, los individuos portadores no muestran aparentemente ningún riesgo disminuido de enfermedades arteriales. En realidad, mediante la examinación de los registros genealógicos, parece que estos sujetos pueden ser "protegidos" de la aterosclerosis (Sirtori et al., 2001, Circulation, 103:1949-1954; Roma et al., 1993, J. Clin. Invest. 91 (4) : 1445-520) . El mecanismo del posible efecto protector de la ApoA-IM en los portadores de la mutación parece estar vinculado con una modificación en la estructura de la ApoA-IM imitante, con la pérdida de una hélice alfa y una exposición incrementada de los residuos hidrofóbicos (Franceschini et al., 1985, J. Biol . Chem. 260:1632-35). La pérdida de la estructura estrecha de las hélices alfa múltiples lleva a una flexibilidad incrementada de la molécula, la cual se asocia mas fácilmente con los lípidos, en comparación con la ApoA-I normal. Además, los complejos apolipoproteínas-lípidos son más susceptibles de desnaturalización, sugiriendo por lo tanto que la entrega de lípidos se mejora también en el caso de la mutante. Bielicki et al., (1997, Arterioscler . Thromb . Vasc . Biol . 17 (9):163-43) ha demostrado que la ApoA-IM tiene una capacidad limitada para reclutar colesterol de membrana en comparación con la ApoA-I del tipo silvestre. Además, la HDL naciente formada por la asociación de la ApoA-IM con los lípidos de membrana fueron predominantemente partículas de 7.4 nm en lugar de complejos más grandes de 9 y 11 nra formados por la ApoA-I del tipo silvestre. Estas observaciones indican que la substitución Argn3^CySi73 en la secuencia primaria de ApoA-I, interfiere con el proceso normal de reclutamiento de colesterol celular y ensamble del HDL naciente. La mutación está asociada aparentemente con una eficiencia disminuida para la remoción de colesterol de las células. Sus propiedades antiaterogénicas pueden no estar relacionadas por lo tanto con la RCT. El cambio estructural más notable atribuido a la substitución es la dimerización de la ApoA-IM (Bielicki et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17(9) :163-43) . ApoA-IM puede formar homodímeros con si misma y heterodímeros con ApoA-II. Los estudios de fracciones de sangre que comprenden una mezcla de apolipoproteínas indican que la presencia de dímeros y complejos en la circulación puede ser responsable de una vida media de eliminación incrementada de las apolipoproteínas . Tal vida media de eliminación incrementada ha sido observada en estudios clínicos de portadores de la mutación (Gregg et al., 1988, NATO AR on Human Apolipoprotein utants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone SG) . Otros estudios indican que los dímeros de ApoA-IM (ApoA- IM/ApoA- IM) actúan como factores de inhibición en la interconversion de partículas de HDL in vitro (Franceschini et al., 1990 J. Biol . Chem. 265 : 12224-31) . 2.3 TRATAMIENTOS ACTUALES PARA LOS TRASTORNOS DISLIPIDEMICOS Y LOS RELACIONADOS Los trastornos dislipidémicos son enfermedades asociadas con colesterol del suero elevado y triglicéridos elevados y relaciones de HDL:LDL del suero disminuidas, e incluyen hiperlipidemia, especialmente hipercolesterolemia , enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad arterial coronaria, enfermedades vasculares y perivasculaes , y enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis . También se incluyen los síndromes asociados con la aterosclerosis tales como la claudicación intermitente, causada por la insuficiencia arterial . Está disponible actualmente un número de tratamientos para bajar el colesterol y los triglicéridos elevados del suero asociados con los trastornos dislipidémicos . Sin embargo, cada uno tiene sus propios inconvenientes y limitaciones en términos de eficacia, efectos colaterales y calificación de la población de pacientes . Las resinas de enlace de ácido-bilis son una clase de fármacos que interrumpen el reciclaje de los ácidos biliares desde el intestino al hígado, por ejemplo, colestiramina (Questran Light®, Bristol-Myers Squibb) , y clorhidrato de colestipol (Colestid®, The Upjohn Company) . Cuando se toman oralmente, estas resinas cargadas positivamente se enlazan a los ácidos biliares cargados negativamente en el intestino. Ya que las resinas no pueden ser absorbidas desde el intestino, estas son excretadas llevando con ellas los ácidos biliares. El uso de tales resinas en el mejor de los casos, sin embargo, solo baja los niveles de colesterol del suero en aproximadamente 20% y está asociado con efectos colaterales gastrointestinales, incluyendo constipación y ciertas deficiencias vitamínicas. Además, como las resinas se enlazan a otros fármacos, otras medicaciones deben ser tomadas otras medicaciones orales al menos una hora antes o cuatro a ser horas después de la ingestión de la resina; complicando por lo tanto los regímenes de fármacos del paciente cardiaco. Las estatinas son agentes que bajan el colesterol, que bloquean la síntesis del colesterol inhibiendo la HMGCo reductasa - la enzima clave involucrada en la vía sintética del colesterol. Las estatinas, por ejemplo, la lovastatina (Mevacor®) , simvastatina (Zocor®) , pravastatina (Pravachol®, fluvastatina (Lescol®) y atorvastatina (Lipitor®) , se usan algunas veces en combinación con las resinas de enlace a ácidos biliares. Las estatinas reducen significativamente el colesterol del suero y los niveles de LDL del suero, y detienen la progresión de la ateroesclerosis coronaria. Sin embargo, los niveles de colesterol de HDL del suero se incrementan solo moderadamente. El mecanismo del efecto de disminución de LDL puede involucrar tanto la reducción de la concentración de VLDL y la inducción de la expresión celular del receptor de LDL, llevando a la producción reducida y/o catabolismo incrementado de LDLs . Los efectos colaterales, incluyendo disfunciones del hígado y los ríñones se asocian con el uso de estos fármacos (The Physicians Desk Reference (56th ed., 2002) Medical Economice) . La niacina (ácido nicotínico) es un complejo de vitamina B soluble en agua usado como un suplemento alimenticio y un agente antigiperlipidemico . La niacina disminuye la producción de VLDL y es efectiva para disminuir la LDL. En algunos casos, se usa en combinación con resinas de enlace de ácidos biliares. La niacina puede incrementar la HDL cuando se usa a dosis adecuadas, sin embargo, su utilidad está limitada por efectos colaterales serios cuando se usa a tales dosis altas. El Niaspan® es una forma de niacina de liberación extendida que produce menos efectos colaterales que la niacina pura. La Niacina/Lovastatina (Nicostatina® es una formulación que contiene tanto niacina y lovastatina y combina los beneficios de cada fármaco . Los fibratos son una clase de fármacos que disminuyen los lípidos usados para tratar varias formas de hiperlipidemia (es decir, triglicéridos elevados del suero) que pueden estar asociadas también con la hipercolesterolemia . Los fibratos parecen reducir la fracción de VLDL e incrementar modestamente el HDL - sin embargo los efectos de estos fármacos sobre el colesterol del suero son variables. En los Estados Unidos, los fibratos tales como clorfibrato (Atromid-S®) , fenofibrato (Tricor®) y benzafibrato (Bezalip®) han sido aprobados para usarse como fármacos antilipidemicos , pero no han recibido aprobación como agentes contra la hipercolesterolemia. Por ejemplo, el clorfibrato es un agente antilipidemico que actúa (vía un mecanismo desconocido) para bajar los triglicéridos del suero, reduciendo la fracción de VLDL. Aunque el colesterol del suero puede ser reducido en ciertas subpoblaciones de pacientes, la respuesta bioquímica al fármaco es variable, y no es siempre posible predecir cuales pacientes obtendrán resultados favorables. Atrimid-S® no ha sido mostrado por ser efectivo para la prevención de enfermedades cardiacas coronarias. El fármaco relacionado químicamente y farmacológicamente, gemfibrozil (Lipod®) es un agente regulador de lípidos que disminuye moderadamente los triglicéridos del suero y el colesterol de VLDL, e incrementa moderadamente el colesterol de HDL - las subfracciones de HDL2 y HDL3 así como tanto ApoA-I y A-II (es decir, la fracción AI/AII-HDL) . Sin embrago, las respuesta a los lípidos es heterogénea, especialmente entre diferentes poblaciones de pacientes. Además, en tanto que la prevención de enfermedades coronarias fue observada en pacientes masculinos de entre 40-55 sin historia o síntomas de enfermedades cardiacas coronarias existentes, no es claro en que extensión estos descubrimientos pueden ser extrapolados a otras poblaciones de pacientes (por ejemplo, mujeres hombres mayores y jóvenes) . En realidad, se observó eficacia en pacientes con enfermedades cardiacas coronarias establecidas. Efectos colaterales serios que están asociados con el uso de fibratos incluyendo toxicidad tal como malignidades, (especialmente cáncer gastrointestinal), enfermedad de la vesícula biliar y una incidencia incrementada en mortalidad no coronaria. Estos fármacos no están indicados para el tratamiento de pacientes con alta LDL o baja HDL como su única anormalidad de lípidos (The Physicians Desk Referente (56th ed. , 2002) Medical Economías) . La terapia de reemplazo de estrogenos orales puede ser considerada para la hipercolesterolemia moderada en mujeres posmenopáusicas . Sin embargo, incrementos en la HDL pueden estar acompañados con un incremento en los triglicéridos . El tratamiento con estrogenos está, por supuesto, limitado a una población específica de pacientes (mujeres posmenopáusicas) y está asociado con efectos colaterales serios incluyendo la inducción de neoplasmas malignos, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedades tromboembólicas , adenoma hepático, presión sanguínea elevada, intolerancia a la glucosa, e hipercalcemia . Existe por lo tanto la necesidad de fármacos más seguros que son más eficaces en disminuir el colesterol del suero, incrementar los niveles de HDL del suero y/o tratar enfermedades, condiciones o trastornos asociados con la dislipidemia . Por ejemplo, la HDL, así como las formas recombinantes de ApoA-I complejadas con fosfolípidos pueden servir como drenaj es/depuradores para moléculas apolares o anfipáticas, por ejemplo el colesterol y derivados (oxiesteroides , esteróles oxidados, esteróles de plantas, etc.), los colesterol ésteres, fosfolípidos y derivados (fosfolípidos oxidados) , triglicéridos, productos de oxidación, y lipopolisacáridos (LPS) (ver, por ejemplo, Casas et al., 1995, J. Surg. Res. Nov; 59 (5) : 544-52) . La HDL puede servir también como un depurador para la T F-OÍ y otras linfocinas. La HDL puede servir también como una portadora para las paraoxonasas del suero humanas, por ejemplo, PON-1, -2, -3. La paraoxonasa, una esterasa asociada con la HDL, es importante para proteger los componentes celulares contra la oxidación. La oxidación de la LDL, la cual ocurre durante la tensión oxidativa, parece directamente vinculada con el desarrollo de la aterosclerosis (Aviram, 2000, Free Radie. Res. 33 Suppl : S85-97) . La paraoxonasa parece jugar un papel en la susceptibilidad a la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares (Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5 (9) : 381-86) . La paraoxonasa del suero humana (PON-1) se enlaza a las lipoproteínas de alta densidad (HDLs) . Su actividad se relaciona inversamente con la aterosclerosis. La PON-1 hidroliza los organofosfatos y puede proteger contra la aterosclerosis mediante la inhibición de la oxidación de la HDL y la lipoproteína de baja densidad (LDL) (Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5 (9) : 381-86) . Los estudios experimentales sugieren que la protección está asociada con la habilidad de la PON-1 para hidrolizar peróxidos de lípidos específicos en las lipoproteínas oxidadas. Las intervenciones que preservan o mejoran la actividad de la PON-1 pueden ayudar a retardar la aparición de la aterosclerosis y las enfermedades cardiacas coronarias. La HDL además tiene un papel como un agente antitrombótico y reductor de fibrinogenos , y como un agente en ataques hemorrágicos (Cockerril et al., WO 01/13939. publicado en marzo 1, 2001) . La HDL, y la ApoA-I en particular, ha mostrado facilitar un intercambio de lipopolisácaridos producidos por la sepsis en partículas de lípidos que comprenden ApoA-I resultando en la neutralización funcional de los lipopolisácaridos ( right et al., W09534289, publicada en Diciembre 21, 1995; Wright et al., Patente Norteamericana No. 5,928,624 expedida en julio 27, 1999; Wright et al., Patente Norteamericana No. 5,932,536, expedida en Agosto 3, 1999). El uso terapéutico de la ApoA-I, ApoA-IMiiano, ApoA-IParig y otras variantes, así como HDL reconstituida, está limitado actualmente, sin embargo, por la gran cantidad de apolipoproteína requerida para la administración terapéutica y por el costo de la producción de las proteínas, considerando el bajo rendimiento global de la producción. Ha sido sugerido por los primeros intentos clínicos que el rango de dosificación está entre 1.5 - 4 g de proteína por infusión para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. El número de infusiones requeridas para un tratamiento completo es desconocido (Ver, por ejemplo, Eriksson et al., 1999, Circulation 100 (6) : 594-98 ; Carlson, 1995, Nutr. Metab.

Cardiovasc. Dis. 5:85-91; Nanjee et al . , 2000, Arterioscler . Thromb. Vasc . Biol . 20 (9) : 2148-55 ; Nanjee et al . , 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19 (4) : 979-89; Nanjee et al., 1996 Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16 (9) : 1203-14) . Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar nuevos métodos de tratamiento para enfermedades, condiciones o trastornos dislipidémicos que minimicen la cantidad de apolipoproteína requerida para la administración. La cita o identificación de cualquier referencia en la Sección 2 o cualquier otra sección de esta solicitud no deberá ser considerada como una admisión de que tal referencia está disponible como técnica previa a la presente invención. 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad, condición o trastornos asociado con la dislipidemia, los cuales métodos utilizan complejos de apolipoproteínas-esfingomielina o composiciones que comprenden complejos de apolipoproteína-esfingomielina, por ejemplo apolipoproteínaA-I-S (ApoA-I-SM) . Muy sorprendentemente, ha sido descubierto que cuando las apolipoproteínas tales como la ApoA-I se administran en forma de complejos de apolipoproteína-esfingomielina ("Apo-SM"), se requiere mucho menos apolipoproteína para lograr la misma o mejor movilización del colesterol, y por lo tanto, el beneficio terapéutico que el proporcionado por otros complejos de apolipoproteína-lípidos . Por ejemplo, en tanto que los regímenes de tratamiento con fosfatidilcolina de soya ("PC de soya" requieren la administración de desde 20-50 mg/kg (o 1-4 g/persona) de apolipoproteína cada 2-5 días (i.v.), los regímenes de tratamiento de acuerdo a la invención requieren la administración de sólo 0.05 a 25 mg/kg (40 mg a 2 g por persona) de apolipoproteína cada 2-10 días (i.v.). Por lo tanto los métodos de la invención reducen 2 a 25 veces la cantidad de apolipoproteína requerida para el beneficio terapéutico, reduciendo por ello substancialmente el costo del tratamiento, haciendo el régimen de tratamiento más conveniente para el paciente y quizá reduciendo los posibles efectos adversos asociados con la administración del fármaco.

Ha sido descubierto además que la movilización del colesterol (elevación de colesterol de HDL arriba de un nivel de línea base antes de la administración, en donde el nivel de línea base es un nivel inicial de colesterol de HDL, o es un nivel conocido por una persona con experiencia en la técnica como un nivel que debería tener el paciente en cuestión, o debería tener un' individuo del tamaño y género antes de la administración de un fármaco) está sostenida significativamente durante un periodo más largo de tiempo por los complejos de proApoA-I-SM, es decir, más que lo que está por los complejos de apolipoproteína- fosfolípidos convencionales. Por lo tanto, los tratamiento de acuerdo a la invención pueden ser menos frecuentes que los protocolos de tratamiento actuales, típicamente, aproximadamente cada 2 a 10 días, cuando se comparan con aproximadamente 2 a 5 días, sin pérdida del beneficio terapéutico. Además, una dosis disminuida puede ser administrada con la misma frecuencia. En muchas modalidades, la administración es aproximadamente cada 5 a 10 días, reduciendo significativamente el número de visitas clínicas u hospitalarias requeridas por el paciente. La invención abarca, en una modalidad, una unidad dé dosificación farmacéuticamente aceptable e inyectable la cual comprende menos de 3500 mg de un complejo de apolipoproteína-esfingomielina . En modalidades alternativas, la composición comprende menos de 1750 mg, menos: de 1400 mg, menos de 700 mg y menos de 350 mg por forma de dosificación unitaria. El uso de complejos ApoA-I-SM de acuerdo a la invención es ventajoso también porque las dosis anticipadas menores del volumen de complejos de ApoA-I-SM infundidos o inyectados lleva a la administración más rápida y más sencilla y el confort mejorado del paciente. El uso de complejos de ApoA-I-SM de acuerdo a la invención es ventajoso además porque la SM es un lípido químicamente mucho más estable que la fosfatidilcolina de soya (PC de soya) , por lo tanto existe una estabilidad mayor de los complexos de ApoA-I y una vida útil de almacenamiento mayor del producto en comparación con los complejos de la invención.

Los métodos de la invención proporcionan beneficios virtualmente en cualquier contexto en el cual sea ventajosa la terapia con apolipoproteínas . Por ejemplo, los métodos de la invención pueden ser usados ventajosamente para tratar o prevenir virtualmente cualquier enfermedad, condición o trastorno asociado con la dislipidemia que sea tratable con apolipoproteínas. Usando los métodos de la invención, una dosis de apolipoproteína de 2 a 25 veces menor que la dosis efectiva de apolipoproteína individualmente, o apolipoproteína y PC de soya, puede ser administrada. Como los complejos de Apo-SM se administran sistémicamente , .estos pueden ser usados para tratar o prevenir la aterosclerosis y la estenosis, movilizando el colesterol de la vasculatura completa de un paciente incluyendo los vasos pequeños. 4. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 muestra los cambios absolutos en los niveles de la fracción de HDL de colesterol no esterificado en seguida de la administración de dosis de 15 mg/kg de complejos r-proApoA-I-SM y r-proApoA-I-POPC . Eje X: tiempo (horas) . Eje Y: Cambio en el colesterol de HDL libre (mg/dL) . 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad condición o trastorno asociado con la dislipidemia utilizando complejos de apolipoproteína-esfingomielina o composiciones farmacéuticas que comprenden complejos de apolipoproteína-esfingomielina ("Apo-SM"), por ejemplo apolipoproteína-I-SM (ApoA-I-SM) . Como se usan aquí, los términos "dislipidemia" o "dislipidémico" se refiere a un nivel anormalmente elevado o disminuido de lípidos en el plasma sanguíneo, incluyendo pero no limitados a, el nivel alterado de lípidos asociado con las siguientes condiciones enfermedades cardiacas coronarias; enfermedades arteriales coronarias; enfermedades cardiovasculares, hipertensión, restenosis, enfermedades vasculares o perivasculares ; trastornos dislipidémicos ; dislipoproteinemia ; altos niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína de muy baja densidad; bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína Lp(a); altos niveles de apolipoproteína B; aterosclerosis (incluyendo tratamiento y prevención de aterosclerosis) ; hiperlipidemia; hipercolesterolemia; hipercolesterolemia familiar (FH) ; hiperlipidemia combinada familiar (FCH) ; deficiencias de la lipoproteína lipasa, tales como hipertriglicemia, hipoalfalipoproteinemia, e hipercolesterolemialipoproteína . Muy sorprendentemente, se ha descubierto que cuando se administran apolipoproteínas tales como la Apo-AI en forma de complejos de apolipoproteína-esfingomielina (Apo-SM) , se requiere mucho menos apolipoproteína para lograr la misma o mejor movilización del colesterol y, por lo tanto, el beneficio terapéutico, que el proporcionado por los complejos apolipoproteína-lípidos de fosfatidilcolinas tales como la PC de soya. La invención abarca el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con la dislipidemia en un humano con necesidad del mismo, el cual comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un complejo de apolipoproteína-esfingomielina a dicho humano. Preferiblemente el complejo es un sólido, incluyendo un sólido liofilizado, adecuado para reconstitución en una solución de partículas discoidales de apolipoproteína-esfingomielina . La administración es preferiblemente parenteral, especialmente intravenosa, inyección de bolo, intramuscular, subcutánea y las similares. Por lo tanto los métodos de la invención usan 2 a 25 veces menos apolipoproteína que la que se requiere cuando se administra un complejo de apolipoproteína y PC de soya. Se ha descubierto además que la movilización de colesterol (elevación de colesterol de HDL arriba del nivel de la línea base (inicial) antes de la administración) está sostenida por un periodo más largo por los complejos de proApoA-I-SM de lo que está por los complejos de apolipoproteína-fosfatidilcolina . Por lo tanto, los tratamientos de acuerdo a la invención pueden ser aplicados menos frecuentemente, típicamente aproximadamente cada 2 a 10 días, sin pérdida de beneficios terapéuticos. Además, una dosis disminuida puede ser administrada con la misma frecuencia. En muchas modalidades, el tratamiento puede ser aplicado cada 5 a 10 días, reduciendo significativamente el número de visitas clínicas u hospitalarias requeridas por el paciente . El uso de los complejos de ApoA-I-SM de acuerdo a la invención es también ventajoso porque las dosis anticipadas menores del volumen de complejos de ApoA-I-SM infundidas o inyectadas lleva a la administración más rápida y más sencilla y el confort mejorado del paciente. El uso de complejos de ApoA-I-SM de acuerdo a la invención es ventajoso además porque la SM es un lípido químicamente mucho más estable que la fosfatidilcolina de soya (PC de soya) , por lo tanto existe una mayor estabilidad de los complejos de ApoA-I y una vida útil de almacenamiento mayor del producto en comparación con los complejos convencionales .

Los métodos de administración de la invención proporciona beneficios en virtualmente cualquier contexto en el cual sea ventajosa la terapia con apolipoproteínas . Por ejemplo, los métodos de la invención pueden ser usados ventajosamente para tratar o prevenir virtualmente cualquier enfermedad, condición o trastorno asociado con la dislipidemia, o síntomas de los mismos, sensibles a las apolipoproteínas. Se esperaría que usando los métodos de la invención, una dosificación de apolipoproteína de 2 a 25 veces menor que la dosis efectiva conocida actualmente en la técnica sea efectiva para tratar o prevenir las enfermedades o provocar un efecto de mejoría. Como los complejos de Apo-SM se administran sistémicamente , estos pueden ser usados para tratar o prevenir la aterosclerosis y la estenosis, movilizando el colesterol del la vasculatura completa de un paciente incluyendo los vasos pequeños . La invención está ilustrada por los ejemplos de trabajo que demuestran que los complejos de ApoA-I-SM de la invención pueden incrementar la concentración de HDL e incrementar el escape o salida del colesterol celular. El uso de complejos de ApoA-I-SM descritos aquí en modelos animales in vivo resulta en un incremento del los niveles de colesterol de HDL en el plasma, lo cual es un indicativo de la movilización/salida del colesterol por las partículas de HDL recombinantes (es decir, complejos ApoAI-SM) . Además, el incremento de la concentración de colesterol de HDL inducido por la inyección de partículas de ApoAI-SM es significativamente mayor que el inducido por laS partículas de ApoAI-fosfatidilcolina (tales como ApoAI-PC de soya) y ApoAI-POPC) . Para claridad de descripción, y no a manera de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las subsecciones establecidas abajo. 5.1 APOLIPOPROTEÍNAS Y PÉPTIDOS DE APOLIPOPROTEÍNAS La invención utiliza composiciones de apolipoproteínas en las cuales una apolipoproteína se compleja con esfingomielina ("complejos Apo-SM") . Virtualmente cualquier apolipoproteína o derivado de apolipoproteína o análogo que proporcione beneficios terapéuticos cuando se usa para tratar o prevenir los trastornos listados arriba puede ser complejado con la SM y administrado ventajosamente a dosis menores que las convencionales de acuerdo a la invención. Además puede ser usada cualquier proteína o péptido de naturaleza a-helicoidal que también activa la LCAT. Las apolipoproteínas incluyen, pero no se limitan a, las formas de preapolipoproteína de ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V y apoE; las formas pro y madura de ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, y ApoE humanas; y las formas polimórficas activas, isoformas, variantes y mutantes así como las formas truncadas, las más comunes de las cuales son ApoA-IMiiano, (ApoA-IM) y ApoA-IParis (ApoA-IP) . Los homo y heterodímeros (cuando son factibles) de la ApoA-I pro y madura (Duvenger et al., 1996 Arterioscler . Thromb. Vasc . Biol . 16 (12) : 1424-29) , ApoA-IM (Pranceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:163235), ApoA-IParis (Daum et al., 1999, J. Mol. Med . 77:614-22), ApoA-II (Shelness et al., 1985 J. Biol. Chem. 260 (14) : 8637-46 ; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259 (15) : 9929-35) , ApoA-IV (Duvenger et al., 1991, Euro J. Biochem. 201 (2 ) : 373 -83 ) , ApoE (Malean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 (14) :8993-9000) , ApoJ y ApoH pueden ser utilizadas también dentro del ámbito de la invención. Las apolipoproteinas utilizadas por la invención también incluyen las apolipoproteinas recombinantes o purificadas. Eos complejos apolipoproteína-SM que pueden ser usados de acuerdo a los métodos de la invención incluyen aquellos escritos en la Patente Norteamericano No. 6,287,590, publicada en Septiembre 11, 2001, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Los métodos para obtener las apolipoproteinas utilizadas por la invención son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, Cheng et al., 1980 J. Lipids Res. 21 (3) : 284-91 ; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28 (8) : 913-29. Las apolipoproteinas utilizadas por la invención incluyen además los péptidos que corresponden a las apolipoproteínas así como los agonistas que imitan la actividad de la ApoA-I, ApoA-IM, ApoA-II, ApoA-IV, y ApoE, tales como aquellos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,004,925, 6,037,323 y 6,046,166 (publicada por Dasseux et al . , ) y en la Patente Norteamericana no. 5,840,688 (publicada en Noviembre 24, 1998 por Tso) ; y las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Tales péptidos pueden ser sintetizados o fabricados usando cualquier técnica para la síntesis de repetidos conocida en la técnica, ver, por ejemplo, las técnicas descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,004,925, 6,037,323 y 6,046,166. Las preparaciones adecuadas que tienen una vida media de almacenamiento larga pueden ser preparadas liofilizando los péptidos- ya sea para preparar volúmenes para reformulación, o para preparar alícuotas individuales o unidades de dosificación que pueden ser reconstituidas mediante rehidratación con agua estéril o una solución estéril amortiguada apropiada antes de la administración a un sujeto. Los complejos Apo-SM pueden incluir un sólo tipo de apolipoproteína, o mezclas de dos o más diferentes apolipoproteínas, las cuales pueden ser derivadas de la misma o diferentes especies. Aunque no se requiere, los complejos Apo-SM comprenderán preferiblemente las apolipoproteínas derivadas de las especies animales que son tratadas, para evitar inducir una respuesta inmune a la terapia. La (las) apol ipoproteína (s) pueden ser complej adas o formar complejos con muchos tipos de análogos o derivados de SM. En general, para que un análogo o derivado de SM sea efectivo en un complejo Apo-SM de la invención, puede ser sensible a la hidrólisis por LCAT, como es la SM de formación natural. La SM es un fosfolípido muy similar en su estructura a la fosfatidilcolina, pero con un enlace de amida en lugar de un enlace de éster. La SM no es un substrato para la LCAT y de manera general no puede ser hidrolizada por esta. Sin embargo, puede actuar como un inhibidor de LCAT o puede disminuir la actividad de la LCAT diluyendo la concentración del fosfolípido substrato. Ya que la SM no esta hidrolizada, permanece más tiempo en circulación. Esta característica permite a los complejos que comprenden Apo-SM tener una duración mayor del efecto farmacológico (movilización del colesterol) y recojan más lípidos, en particular el colesterol . Esto resultará en dosis menos frecuentes o más pequeñas necesarias para el tratamiento con las partículas de Apo-SM. L (las) apolipoproteína (s) pueden formar complejos con la SM derivada de virtualmente cualquier fuente. Por ejemplo, la SM puede ser obtenida de la leche, huevos, o el cerebro. Los análogos o derivados de SM pueden ser usados también. Los ejemplos no limitantes de análogos y derivados de SM útiles incluyen, pero no se limitan a palmitoilesfingomielina y estearilesfingomielina . La esfingomielina puede ser enriquecida artificialmente en una cadena de acilo saturada o insaturada particular. Por ejemplo, la esfingomielina de leche (Avanti Phospholipid, Alabaster, AL) se caracteriza por cadenas de acilo saturadas largas. La esfingomielina de leche comprende aproximadamente 20% de cadenas de acilo C16:0 (16 carbonos, saturadas) en comparación con el 80% comprendido en la esfingomielina de huevo. Usando extracción por solvente, la esfingomielina de leche puede ser enriquecida en una cadena de acilo particular para tener una composición en cadenas de acilo comparable coa, por ejemplo, la esfingomielina de huevo. Las cadenas de acilo que pueden ser utilizadas por la invención incluyen, pero no se limitan a cadenas de acilo saturadas (tales como cadenas de dipalmitoil, diestearoil, diaraquidonil , y dibenzil acilo), cadenas insaturadas (tales como cadenas de dioleoil) , cadenas mezcladas de cadenas de acilo saturadas e insaturadas (tales como cadenas de palmitoil o oleoil) , cadenas saturadas e insaturadas de longitudes mezcladas, y análogos de éter de cadenas de acilo saturadas e insaturadas. La SM puede ser semi - sintética de manera que tiene una cadena de acilo particular. Por ejemplo, la esfingomielina de leche puede ser purificada primero, después una cadena de acilo particular, por ejemplo, la cadena de acilo C16:=, puede ser escindida y reemplazada por otra cadena de acilo (preferiblemente ácido palmitito o ácido oleico) . La SM puede ser sintetizada también completamente, por ejemplo, mediante síntesis a gran escala. Ver, por ejemplo, Dong et al., Patente Norteamericana No. 5,220,043, titulada Synthesis of D-erythro-sfingomielins, publicada en Junio 15, 1993; eis, 1999, Chem. Phys . Lipids 102 (1-2) : 3-12. Preferiblemente, un nivel de saturación predefinido y una composición de ácidos grasos se selecciona para la SM sintética . Los complejos puede incluir también opcionalmente uno- o más fosfolípidos además de la SM. Virtualmente cualquier tipo de fosfolípido puede ser usado, incluyendo, pero no limitados a, fosfolípidos de cadena de alquilo pequeña, fosfatidilcolina (PC) , fosfatidilcolina de huevo, fosfatidilcolina de soya, dipalmitoilfosfatidilcolina , dimiristoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, l-miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, 1-palmitoil -2-miristoilfosfatidilcolina, -palmitoil estearoilfosfatidilcolina l-estearoil-2-palmitoilfosfa idilcolina , -palmitoil oleoilfosfatidilcolina, 1-oleoil -2 -palmitilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina , dioleoilfosfatidiletanolamina, dilauroilfosfatidilglicerol fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol , esfingomielina, esfingolípidos , fosfatidilglicerol , difosfatidilglicerol , dimiristoilfosfatidilglicerol , dipalmitoilfosfatidilglicerol , diestearoilfosfatidilglicerol , dioleoilfosfatidilglicerol , ácido dimiristoilfosfatidico, ácido dipalmitoilfosfatidico, dimiristoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina , dimiristoilfosfatidilserina , dipalmitoilfosfatidilerina, fosfatidilserina cerebral, esfingomielina cerebral, dipalmitoilesfingomielina , diestearoilesfingomielina, ácido fosfatidieo, galactocerebrosida, gangiosidas, cerebrosidas , dilaurilfosfatidilcolina, (1,3) -D-manosil- (1,3) diglicerida, aminofenilglicosido, glicolípidos de 3 -colesteril-6 ' - (glicosiltio) hexil éter, y colesterol y sus derivados. Las composiciones comprenderán típicamente aproximadamente de 40-85% en peso de fosfolípidos totales y aproximadamente 60-15% en peso de apolipoproteína total. (Este rango corresponde aproximadamente a una relación molar de 1:25 a 1:200 de apolipoproteína a fosfolípido) . Si se incluye un segundo fosfolípido opcional, la esfingomielina comprendería típicamente desde aproximadamente 25 a 75% en peso del componente de fosfolípido total, con el balance que es el segundo tipo de fosfolípido. Los complejos de apolipoproteína-fosfolípido pueden ser complejados en relaciones de fosfolípido : apoliproteína (Ri) que varían dependiendo de la apolipoproteína y la naturaleza de la SM y el (los) otro(s) fosfolípidos comprendidos en el complejo, así como el tamaño esperado del complejo que varía en tamaño desde 2-12 nm. Para la ApoA-I, la relación molar fosfolipido : ApoA-I puede variar desde 25 a 200. El porcentaje de SM en el complejo puede variar desde 25% a 100% de la composición total de fosfolípido. Por ejemplo, SM : PC : ApoA- I podría ser 25:25:1 (Ri=50) o 75:75:1 (Ri=150) . Las relaciones en peso pueden ser obtenidas usando un peso molecular (MW) de 650-800 para el fosfolípido. Los complejos puede incluir también opcionalmente paraoxonasa (PON) , antioxidantes, ciclodextrinas u otros materiales que ayudan a atrapar el colesterol en el núcleo o la superficie de las partículas similares a HDL. Las partículas de HDL puede opcionalmente ser pegilado (por ejemplo, cubiertas con glicol de polietileno u otro polímero) para incrementar la vida media de circulación. Los complejos de apolipoproteína, fosfolípidos, y Apo-fosfolípidos utilizados por la invención también incluyen moléculas que están etiquetadas con cualquier marcador detectable conocido en la técnica, incluyendo los isótopos estables (por ejemplo, 13C, 1N, 2H, etc.); isótopos radioactivos (por ejemplo, 14C, 3H, 125I, etc.); fluoroforos, quimioluminiscentes ; o marcadores enzimáticos. 5.2 MÉTODOS PARA FABRICAR COMPLEJOS DE APO-SM Los complejos de Apo-SM pueden ser preparados en una variedad de formas, incluyendo, pero no limitadas a vesículas, liposomas, proteoliposomas , micelas, y partículas discoidales. Una variedad de métodos bien conocidos por aquellas personas experimentadas en la técnica pueden ser usados para preparar los complejos de Apo-SM. Un número de técnicas disponibles para preparar liposomas o proteoliposomas pueden ser usadas. Por ejemplo, la apolipoproteína puede ser sometida a cotratamiento con sonido (usando un sonicador de baño o sonda) con el lípido apropiado (es decir, esfingomielina) para formar complejos. Alternativamente, la apolipoproteína puede ser combinada con vesículas de lípidos preformadas resultando en la formación espontánea de complejos de Apo-SM. Los complejos de Apo-SM pueden ser formados también mediante un método de diálisis de detergente, por ejemplo, una mezcla de Apo, SM y un detergente tal como chocolate se somete a diálisis para remover el detergente y se reconstituye para formar complejos de Apo-SM (ver, por ejemplo, Joñas et al., 1986, Methods Enzymol . 128:553-82), o usando un dispositivo de extrusión o mediante homogeneización. En una modalidad, los complejos de Apo-SM pueden ser preparados mediante el método de dispersión de colato como se describe en la Sección 6.1 (Ejemplo 1) . En pocas palabras, el lípido seco se hidrata en amortiguador de NaHC03, después se sometió a un vórtice y se somete a tratamiento con sonido hasta que todos el lípido se dispersa. Se agrega solución de colato, la mezcla se incuba por 30 minutos con sometimiento a vórtice y tratamiento por sonido periódicos hasta que se vuelve clara, indicando que se forman miscelas de colato de lípido. Se agrega ProApoA-I en amortiguador de NaHC03, y la solución se incuba por 1 hora a aproximadamente 37°C-50°C. La relación de lípido :proApoA-I en la solución puede ser desde 1:1 a 200:1 (mol/mol) , pero en una modalidad preferida, la relación es de 2:1 en peso de lípido a peso de proteína (p/p) - El colato se remueve entonces mediante los métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el colato puede ser removido mediante diálisis, ultrafiltración o mediante remoción de moléculas de colato mediante adsorción sobre cuentas o resinas de afinidad. En una modalidad, las cuentas de afinidad, por ejemplo, BIO-BEADS® (Bio-Rad Laboratoires) se agregan a la preparación de complejos Apo-lípidos y el colato para absorber el colato. En otra modalidad, la preparación, por ejemplo, una preparación miscelar de los complejos de Apo-SM y colato, se hace pasar a través de una columna empacada con cuentas de afinidad. En una modalidad específica, el colato se remueve de una preparación de complejos de proApoA-I-lípido cargando la preparación sobre BIO-BEADS® dentro de una jeringa. La jeringa se sella entonces con una película de barrera y se incuba con balanceo a 4°C durante toda la noche. Antes del uso, el colato se remueve inyectando la solución a través de BIO-BEADS®, donde es absorbido por las cuentas. Los complejos de Apo-SM tienen una vida media incrementada en la circulación cuando los complejos tienen un tamaño u densidad similares a la HDL, especialmente a las HDLs en las poblaciones pre-ß-? o pre-$-2 HDL. Las preparaciones estables que tienen una vida media de almacenamiento larga pueden ser preparadas mediante liofilización - El procedimiento de co-liofilización descrito abajo es un enfoque preferido debido a la estabilidad de la formulación resultante y la facilidad del proceso de preparación de las formulaciones/partículas. Los métodos de co-liofilización se describen también en la Patente Norteamericana No. 6,287,590 (titulada Peptide/lipid complex formation by co-lyophilization, por Dasseux, publicada en Septiembre 11, 2001) , la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Los complejos de Apo-SM liofilizados pueden ser usados para preparar volúmenes para reformulación farmacéutica, o para preparar alícuotas individuales o unidades de dosificación que pueden ser reconstituidas por rehidratación con agua estéril o una solución amortiguada apropiada antes de la administración a un sujeto. Como se describe arriba, la apolipoproteína puede formar complejo con una variedad de esfingomielinas . Esta esfingomielina puede ser enriquecida artificialmente en una cadena de acilo saturada o insaturada particular. Por ejemplo, la esfingomielina de leche (Avanti Phospholipid, Alabaster, AL) se caracteriza por cadenas de acilo saturadas largas. La esfingomielina de leche comprende aproximadamente 20% de cadenas de acilo C16:0 (16 carbonos, saturadas) en comparación con el 80% comprendido en la esfingomielina de huevo. Usando extracción por solvente, la esfingomielina de leche puede ser enriquecida en una cadena de acilo particular para tener una composición en la cadena de acilo comparable, por ejemplo, con la esfingomielina de huevo. Las cadenas de acilo que pueden ser utilizadas por la invención incluyen, pero no se limitan a cadenas de acilo saturadas (tales como cadenas de dipalmitoil, diestearoil, diaraquidonil , y dibehenoil acilo), cadenas insaturadas (tales como cadenas de dioleil) , cadenas mezcladas de cadenas de acilo saturadas e insaturadas (tales como palmitoil u oleil) , cadenas saturadas y/o insaturadas de longitudes mezcladas, y análogos de éter de cadenas de acilo saturadas e insaturadas . En ciertas modalidades preferidas, se selecciona una fuente de esfingomielina natural para evitar la contaminación por priones (por ejemplo, en la esfingomielina cerebral) o la contaminación viral (por ejemplo, en la esfingomielina de huevo) . En otra modalidad preferida, la SM completamente sintética se selecciona para evitar la contaminación, en otras modalidades, se usa una SM con alto estado de saturación para mejorar la estabilidad química del complejo de Apo-AI-SM. La SM pede ser semi- sintética de modo que tiene una cadena de acilo particular. Por ejemplo, la esfingomielina de leche puede ser purificada primero a partir de la leche, entonces una cadena de acilo particular, por ejemplo, la cadena de acilo C16:0, puede ser escindida y reemplazada por otra cadena de acilo (preferiblemente ácido palmitito o ácido oleico) . La SM puede ser sintetizada completamente, por ejemplo, mediante síntesis a gran escala (ver, por ejemplo, Dong et al., Patente Norteamericana No. 5,220,043, titulada Synthesis of D-erythro-sphingomyelins , publicada en Junio 15, 1993; Weis, 1999, Chem. Phys . Lipids 102 (l-2):3-12).

Preferiblemente, se selecciona un nivel predefinido de saturación y composición de ácidos grasos para la SM sintética . Las Patentes Norteamericanas Nos. 6.004,925, 6,037,323, 6,046,166 y 6,287,590 (incorporadas aquí como referencia en sus totalidades) describen un método simple para preparar complejos de apolipoproteína-lípidos (Apo-lípidos) que tienen características similares a la HDL. Este método preferido, la co-liofilización de las soluciones de Apo y lípido en un solvente orgánico (o mezclas de solventes) y la formación de complejos de Apo-lípido durante la hidratación del polvo liofilizado, tienen las siguientes ventajas: (1) El método requiere muy pocos pasos. (2) El método utiliza solvente(s) barato(s). (3) La mayoría.^ o todos los ingredientes incluidos se usan para formare los complejos designados, evitando por lo tanto desperdicio de materiales iniciales que es común a otros métodos. (4) Se forman compuestos liofilizados que son muy estables durante el almacenamiento. Los complejos resultantes pueden ser reconstituidos inmediatamente antes del uso. (5) Los complejos resultantes usualmente no necesitan ser purificados posteriormente después de la formación y antes del uso. (6) Se evitan los compuestos tóxicos incluyendo detergentes tales como colato. (7) El método de producción puede ser escalado fácilmente y es adecuado para fabricación GMP (es decir, en un ambiente libre de endotoxinas) . En una modalidad preferida, los métodos de co-liofilización conocidos comúnmente en la técnica se usan para preparar los complejos de Apo-SM. En pocas palabras, los pasos de la co- liofili zación incluyen solubilizar la Apo y el lípido en un solvente orgánico o mezcla de solventes, o solubilizar la Apo y el lípido por separado y mezclarlos juntos. Las características deseables del solvente o la mezcla de solventes son: (i) una polaridad relativa media para ser capaz de disolver lípidos hidrofóbicos y la proteína antipática, (ii) los solventes deberían ser solventes de la clase 2 o 3 de acuerdo a las líneas directivas sobre solventes de la FDA (Federal Register, volumen 62, No. 247) para evitar la toxicidad potencial asociada con los solventes orgánicos residuales, (iii) bajo punto de ebullición para asegurar la facilidad de remoción del solvente durante la liofilización, (iv) alto punto de fusión para proporcionar congelación rápida, altas temperaturas del condensador, y por ello menos cuidado del secado por congelación. En una modalidad preferida, se usa ácido acético glacial. Combinaciones, por ejemplo, de metanol, ácido acético glacial, xileno, o ciclohexano pueden ser usadas también. La solución de Apo/lípido se liofiliza entonces para obtener polvo de Apo/lipido homogéneo. Las condiciones de liofilización pueden ser optimizadas para obtener la evaporación rápida del solvente con una cantidad mínima de solvente residual en el polvo de Apo/lípido liofilizado. La selección de las condiciones del secado por congelamiento pueden ser determinadas por los técnicos experimentados, y depende de la naturaleza del solvente, el tipo y las dimensiones del receptáculo, por ejemplo, el frasco que contiene la solución, el volumen llenado, y las características del secador por congelamiento usado. La concentración de la solución de lípido/Apo antes de la liofilización, para la remoción del solvente orgánico y la formación exitosa de los complejos, es preferiblemente de 10 a 50 mg/ml para la concentración de Apo y 20 a 100 mg/ml para la concentración de lípido. Los complejos de Apo-lípido se forman espontáneamente después de la hidratación del polvo liofilizado de Apo-lípido con un medio acuoso de pH y osmolalidad apropiados. En algunas modalidades, el medio puede contener también estabilizadores tales como sucrosa, trehalosa, glicerina y otros. En algunas modalidades, la solución debe ser calentada varias veces arriba de la temperatura de transición para que los lípidos formen complejos. La relación de lípido a proteína para la formación exitosa de complejos de Apo-SM puede ser desde 1:1 a 200:1 (mol/mol ) , y es preferiblemente 2:1 en peso de lípido a peso de proteína (p/p) . El polvo se hidrata para obtener concentraciones finales del complejo de 5-30 mg/ml expresadas en equivalentes de proteína. En una modalidad, el polvo de Apo se obtiene mediante secado por congelamiento la solución de Apo en solución acuosa de NH4HCO3. Una solución homogénea de Apo y el lípido (es decir, esfingomielina) se forma disolviendo sus polvos y Apo en ácido acético glacial. La solución se liofiliza entonces, y los complejos de Apo- lípido similares a HDL se forman por hidratación con medio acuoso del polvo liofilizado. El otro método preferido es la homogeneizacion. Este método puede ser usado para preparar complejos de Apo- PC de soya y se usa rutinariamente para la formulación de complejas de AI -Miiano-POPC . La homogeneizacion puede ser adaptada fácilmente para la formación de complejos de Apo-SM. Brevemente, este método comprende formar una suspensión de lípidos en solución acuosa de Apo mediante Eltraturex™, y la homogeneizacion de la suspensión formada de lípido-proteína , usando un homogeneizador a alta presión hasta que la suspensión se vuelve una suspensión clara-opalescente y se forman los complejos. Las temperaturas elevadas de transición del lípido se usan durante la homogeneizacion. La solución se homogeniza durante un periodo de tiempo extendido de 1-14 horas y a presión elevada. En otra modalidad, se forman complejos de Apo-SM mediante co-liofilización del fosfolxpido con soluciones o suspensiones de péptidos o proteínas. La solución homogénea de péptido/proteína y SM, (más cualquier otro fosfolípido de elección) en un solvente orgánico o mezcla de solventes orgánicos puede ser liofilizada, y los complejos de Apo-SM pueden ser formados espontáneamente mediante hidratación del polvo liofilizado con un amortiguador acuoso. Ejemplos de solventes orgánicos o sus mezclas incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido acético y xileno, ácido acético y ciclohexano, y metano y xileno. Una proporción adecuada de proteína (péptido) a lípido puede ser determinada empíricamente de modo que los complejas resultantes posean las propiedades físicas y químicas apropiadas, es decir, usualmente (pero no necesariamente) similares en tamaño a la HDL. La mezcla resultante de Apo y lípido en el solvente se congela y se liofiliza a sequedad. Algunas veces, un solvente adicional debe ser agregado a la mezcla para facilitar la liofilización. Este producto liofilizado puede ser almacenado por periodos largo y permanecerá estable . El producto liofilizado puede ser reconstituido para obtener una solución o suspensión del complejo de Apo-lípido.

Para este fin, el polvo liofilizado se rehidrata con una solución acuosa a un volumen adecuado (típicamente 5-20 mg de complejo Apo-SM/ml) el cual es conveniente, por ejemplo, para inyección intravenosa. En una modalidad preferida, el polvo liofilizado se rehidrata con solución salina amortiguada, bicarbonato salino, o una solución salina fisiológica. La mezcla puede ser agitada o sometida a un vórtice para facilitar la rehidratación . En general, el paso de reconstitución sería conducido a una temperatura igual a o mayor que la temperatura de transición de fase del componente lípido de los complejos. En cuestión de minutos, resultará una preparación clara de complejos de Apo-lípido reconstituidos. Una alícuota de la preparación reconstituida resultante puede ser caracterizada para confirmar que los complejos e la preparación tienen la distribución de tamaño deseada; por ejemplo, la distribución de tamaño de la HDL. La caracterización de la preparación reconstituida puede ser llevada a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitados a filtración por exclusión de tamaño, filtración en gel, y cromatografía por permeación de gel . Por ejemplo, después de la hidratación del polvo de Apo-lípido liofilizado o al final de la homogeneización o la diálisis de colato, las partículas similares a HDL de Apo-lípido se caracterizan con respecto a su tamaño, concentración, pH final y osmolalidad de la solución resultante, en algunos casos se caracterizan las integridades del lípido y la apolipoproteína . El tamaño de las partículas de Apo-lípido resultantes es determinativo de su eficacia, por lo tanto se prefiere hacer esta medición para la caracterización de las partículas. En una modalidad, la cromatografía por permeación de gel (GPC) , por ejemplo, puede ser usado un sistema de cromatografía de líquidos a alta presión equipado con una columna Superdex™ de 1x30 cm (Pharmacia Biotech) y un detector de UV. Los complejos se eluyen con solución salina amortiguada con bicarbonato comprendida de NaCl 140 nM y bicarbonato de sodio 20 nM administrada a una velocidad de flujo de 0,-.5 ml(min. Una cantidad típica de complejo inyectado es de 0.1 a 1 mg en base al peso de proteína. Los complejos se monitorean por absorbancia a 280 nm. La concentración de la proteína y el lípido de la solución de partículas de Apo-lípido puede ser medida mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyen, pero no limitados a, ensayos de la proteína y el fosfolípido así como mediante métodos cromatográficos tales como HPLC, cromatografía de filtración en gel, GC acoplado con varios detectores incluyendo espectrometría de masas, UV o arreglo de diodos, fluorescencia, dispersión elástica de luz y otros. La integridad del lipido y las proteínas puede ser determina da también mediante las mismas técnicas cromatográficas , así como el mapeado del péptido, gel de SDS-page, secuenciación de las terminales N y C para las proteínas y análisis estándar para determinar la oxidación del lipido o lípidos. 5.2.1. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Las composiciones farmacéuticas utilizadas por la invención comprenden complejos de Apo-SM como el ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración y suministro in vivo. Como los péptidos pueden comprender terminaciones ácidas y/o básicas y/o cadenas laterales, los péptidos pueden ser incluidos en las composiciones en ya sea en forma ácidos o bases libres, o en forma de sales farmacéuticamente aceptable. Las composiciones inyectables incluyen suspensiones soluciones o emulsiones estériles del ingrediente activo en vehículos acuosos o aceitosos. Las composiciones pueden comprender también agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Las composiciones para inyección puede ser presentadas en forma de dosificaciones unitarias, por ejemplo, en ampolletas o en recipientes de dosis múltiples, y pueden comprender preservativos agregados. Para infusión, las composiciones se suministran preferiblemente en una bolsa de infusión fabricada de un material compatible con los complejos de Apo-lípido, tales como vinil acetato de etileno o cualquier otro material compatible conocido en la técnica. Alternativamente, las composiciones inyectables pueden ser suministradas en forma de polvo para reconstitución antes del uso con un vehículo adecuado, incluyendo, pero no limitados a agua estéril libre de pirógenos, solución de dextrosa, etc. para este fin, la Apo puede ser liofilizada, o co-liofilizada en formas de dosificación unitarias y reconstituida antes del uso in vivo. Para la administración prolongada, el ingrediente activo puede ser formulado como una composición de depósito, para administración por implantación; por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, o intramuscular. Así, por ejemplo, el complejo Apo-lípido o la apolipoproteína individualmente pueden ser formulados con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o en espuma de fosfolípidos o resinas de intercambio iónico. Alternativamente, pueden ser usados los sistemas de administración transdérmica fabricados como un disco o parche adhesivo que libera lentamente el ingrediente activo para absorción percutánea. Para este fin, los mejoradotes de permeación pueden ser usados para facilitar la penetración transdérmica del ingrediente activo. Un beneficio particular puede ser logrado incorporando los complejos de Apo-SM utilizados por la invención en un parche de nitroglicerina para usarse en pacientes con enfermedad cardiaca isquémica e hipercolesterolemia . Si se desea, las composiciones pueden ser presentadas en un empaque o dispositivo dispensador que puede comprender una o más formas de dosificación unitarias que comprenden el ingrediente activo. El empaque puede comprender por ejemplo una hoja fina de metal o plástico, tal como un empaque de burbuja. El empaque o dispositivo dispensador puede estar acompañado por instrucciones para la administración. 5.3 MÉTODOS DE TRATAMIENTO Los complejos de Apo-SM utilizados por invención pueden ser usados para tratar o prevenir virtualmente cualquier enfermedad, condición o trastorno sensible a las apolipoproteínas u otras partículas de apolipoproteínas-fosfolípidos (por ejemplo, ApoAI-PC de soya, ApoAI-POPC) , incluyendo pero no limitadas a, enfermedad cardiaca coronaria; enfermedad arterial coronaria; enfermedades cardiovasculares, hipertensión, restenosis, enfermedades vasculares o perivasculares; trastornos dislipidémicos ; dislipoproteinemia; altos niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad; bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína Lp(a); altos niveles de apolipoproteína B; aterosclerosis (incluyendo tratamiento o prevención de aterosclerosis) ; hiperlipidemia ,-hipercolesterolemia; hipercolesterolemia familiar (FH) ; hiperlipidemia combinada familiar (FCH) ; deficiencias de la lipoproteína lipasa, tales como hipertrigliceridemia, hipoalfalipoproteinemia , e hipercolesterolemialipoproteína . Usando los métodos de la invención, podría esperarse que una dosificación de apolipoproteína desde 2 a 25 veces menor que la dosificación efectiva conocida actualmente en la técnica, sea eficaz para tratar o prevenir las enfermedades o para dar lugar a un efecto de mejoría. En una modalidad, los métodos de la invención abarcan un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la dislipidemia, que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una apolipoproteína y esfingomielina en una cantidad efectiva para lograr un nivel de suero de la apolipoproteína libre o formando complejo en el rango de 10 mg/dL a 300 mg/dL arriba de una nivel de línea base (inicial) antes de la administración, entre 5 minutos y 1 día después de la administración. En otra modalidad, los métodos de la invención abarcan un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la dislipidemia que comprende administrar a un sujeto un complejo de apolipoproteína-esfingomielina en una cantidad efectiva para lograr concentraciones de plasma circulantes de la fracción de colesterol de HDL entre 10% y 1000% de la concentración de la fracción de colesterol de HDL inicial, entre 5 minutos y 1 día después de la administración. En otra modalidad, los métodos de la invención abarcan un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la dislipidemia, que comprende administrar a un sujeto un complejo de apolipoproteína-esfingomielina en una cantidad efectiva para lograr una concentración de plasma circulante de la fracción de colesterol de HDL entre 30 y 300 mg/dL, entre 5 minutos y 1 día después de la administración. En otra modalidad, los métodos de la invención abarcan un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la dislipidemia, que comprende administrar a un sujeto un complejo de apolipoproteína-esfingomielina en una cantidad efectiva para lograr concentraciones del plasma circulante de colesterolil esteres de entre 30 y 300 mg/dL, entre 5 minutos y 1 día después de la administración. Los complejos de Apo-SM pueden ser usados individualmente o en terapias de combinación con otros fármacos usados para tratar o prevenir las condiciones anteriores. Tales terapias incluyen, pero no se limitan a la administración simultánea o secuencias de los fármacos involucrados. Por ejemplo, en el tratamiento de la hipercolesterolemia o la aterosclerosis , las formulaciones de Apo-SM pueden ser administradas con cualquiera de una o más terapias para disminuir el colesterol actualmente en uso; por ejemplo, resinas de ácidos biliares, niacina, estatinas, y/o fibratos. Tal régimen combinado puede producir efectos terapéuticos particularmente benéficos ya que cada fármaco actúa sobre un objetivo diferente en la síntesis y transporte del colesterol, es decir, las resinas de ácidos biliares afectan el reciclaje del colesterol, la población de quilomicrones y de LDL; la niacina afecta principalmente la población de VLDL y LDL; las estatinas inhiben la síntesis de colesterol, disminuyendo la población de LDL (y quizá incrementando la expresión de los receptores de LDL) ; en tanto que los complejos de Apo-SM afectan la RCT, incrementan la HDL, y promueven el escape o salida del colesterol. En otra modalidad, los complejos de Apo-SM pueden ser usados en conjunción con los fibratos para tratar o prevenir enfermedad cardiaca coronaria; enfermedad arterial coronaria; enfermedades cardiovasculares, hipertensión, restenosis, enfermedades vasculares o perivasculares ; trastornos dislipidémicos ; dislipoproteinemia; altos niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad; bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína Lp(a); altos niveles de apol ipoproteína B; aterosclerosis (incluyendo tratamiento o prevención de aterosclerosis) ; hiperlipidemia ,- hipercolesterolemia; hipercolesterolemia familiar (FH) ; hiperlipidemia combinada familiar (FCH) ; deficiencias de la lipoproteína lipasa, tales como hipertrigliceridemia , hipoalfalipoproteinemia, e hipercolesterolemialipoproteína . Las formulaciones y regímenes de tratamiento ejemplares se describen abajo. Los complejos de Apo-SM utilizados por la invención pueden ser administrados mediante cualquier ruta adecuada que asegure la biodisponibilidad en la circulación. Una característica importante de la invención es que los complejos de Apo-SM pueden ser administrados en dosis menores al 1-10% de la dosis efectiva requerida para la apolipoproteína (Apo) o el repetido de Apo administrados individualmente, y en dosis de 2-25 veces menores que la dosis efectiva requerida para la administración de Apo-PC de soya (o Apo PC de huevo o Apo-POPC) . Se requiere la administración a dosis (para inyección intravenosa) tan bajas como aproximadamente 40 mg a 2g/persona de apolipoproteína cada 2 a 10 días, en lugar de las grandes cantidades de apolipoproteína (20 mg/kg a 100 mg/kg por administración cada 2 a 5 días, 1.4 g a 8 g por humano de tamaño promedio) requeridas por los regímenes de tratamiento actualmente disponibles. Los complejos de Apo-SM utilizados por la invención se administran en dosificaciones que incrementan la pequeña fracción de HDL, y preferiblemente, la fracción de pre-ß- (y pre-?) y HDL similar a pre-ß. La administración puede ser mejor lograda mediante las rutas de administración parenteral, incluyendo inyecciones intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica , subcutánea (SC), e intraperitoneal . En ciertas modalidades, la administración es mediante un perfusor, un infiltrador o un catéter. En las modalidades preferidas, los complejos de Apo-SM se administran mediante inyección, mediante una bomba implantable subcutáneamente o mediante una preparación de depósito, en cantidades que lograr una concentración de suero circulante igual a la contenida a través de la administración parenteral . La administración puede ser lograda a través de una variedad de regímenes de tratamiento diferentes. Por ejemplo, pueden ser administradas varias inyecciones intravenosas periódicamente durante un sólo día, con el volumen total acumulativo de las inyecciones sin alcanzar la dosis toxica diaria. Alternativamente, puede ser administrada una inyección intravenosa aproximadamente cada 3 a 15 días, preferiblemente aproximadamente cada 5 a 10 días, y más preferiblemente cada 10 días. En aun otra alternativa, puede ser administrada una dosis escalonada, iniciando con aproximadamente 1 a 5 dosis a una dosis de entre (50-200 mg) por administración, seguido después por dosis repetidas de entre 200 y 1 g por administración. Dependiendo de las necesidades del paciente, la administración puede ser mediante infusión lenta con una duración de más de una hora, mediante infusión rápida de una hora o menos, o mediante una sola inyección de bolo. La formación de complejos de la apolipoproteína con la SM en lugar de con otro lípido, por ejemplo, fosfatidilcolina (PC) , incrementa su toxicidad a una dosis individual dada, porque el complejo remueve más colesterol de la circulación del suero, permitiéndole tener una eficacia farmacológica y efectos tóxicos mayores. Por ejemplo, si la apolipoproteína-SM se administra parenteralmente , por ejemplo, mediante inyección, entonces es toxico a una dosis de 200 mg/kg. Sin embargo, si se dan inyecciones a una dosificación menor por varios días, incrementadas después gradualmente, el receptor se adaptará a la administración y puede ser lograda una dosis final superior. Por ejemplo, puede ser administrada una inyección en dos días secuenciales a una concentración de 10 mg/kg, seguido por inyección en los siguientes dos días secuencias a una concentración de 20 mg/kg, seguido por inyección en los siguientes dos días secuenciales a una concentración de 30 mg/kg seguido por inyección en los días subsecuentes de 40 mg/kg por día. Bajo tal itinerario, los complejos de apoiipoprcteína-S pueden ser administrados hasta por dos semanas son problemas de toxicidad. Otras rutas de administración pueden ser usadas. Por ejemplo, la absorción a través del tracto gastrointestinal puede ser lograda mediante las rutas de administración orales (incluyendo pero no limitadas a ingestión, rutas bucal y sublingual) siempre que se usen formulaciones apropiadas (por ejemplo, revestimientos entéricos) para evitar o minimizar la degradación del ingrediente activo, por ejemplo, en los ambientes rudos de la mucosa oral, el estómago y/o el intestino delgado. Al ernativamente, la administración vía el tejido mucoso tal como los modos vaginal y rectal de administración pueden ser usados para evitar o minimizar la degradación en el tracto gastrointestinal . En aún otra alternativa, las formulaciones de la invención pueden ser administradas transcutaneamente (por ejemplo, trandermicamente) o mediante inhalación. Se apreciará que la ruta preferida puede variar con la condición, la edad y la conformidad del receptor La dosis actual de complejos de Apo-SM variará con la ruta de administración. En una modalidad, la dosis se ajusta para lograr un nivel de suero de apol ipoproteína libre o complejada en el rango de 10 mg/dl a 300 mg/dl arriba de un nivel de línea base (inicial) antes de la administración, entre 5 minutos y 1 días después de la administración de los complejos de Apo-SM. En otra modalidad, la dosis se ajusta para lograr concentraciones de plasma circulante de una fracción de colesterol de HDL entre 10% y 1000% de la concentración de la fracción de colesterol de HDL, entre 5 minutos y 1 hora después de la administración intravenosa. En otra modalidad, la dosis se ajusta para lograr concentraciones de plasma circulante temporales o permanentes de la fracción de colesterol de HDL entre 30 y 300 mg/dl, entre 5 minutos y 1 día después de la administración. En otra modalidad, la dosis se ajusta para lograr concentraciones del plasma circulante, temporales o permanentes de colesterolil ásteres de entre 30 y 300 mg/dl, entre 5 minutos y 1 día después de la administración intravenosa. Los datos obtenidos en sistemas de modelos animales descritos en las Patentes Norteamericanas nos 6,004,925, 6,037,323 y 6,046,166 (publicadas por Dasseux et al., incorporadas aquí como referencia en su totalidad) muestran que los péptidos de ApoA-I se asocian con el componente de HDL y tienen una vida media proyectada en humanos de aproximadamente cinco días. Por lo tanto, en una modalidad, los complejos de Apo-SM pueden ser administrados mediante inyección intravenosa a una dosis entre aproximadamente 0.1 g-1 g de Apo-SM por administración cada 2 a 10 días por persona de tamaño promedio. La toxicidad y la eficacia terapéutica de los varios complejos de Apo-SM pueden ser determinadas usando procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) , y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la relación LD5o/ED5o. Se prefieren Los complejos de Apo-SM que exhiben índices terapéuticos grandes. Los pacientes pueden ser tratados desde unos pocos días a varias semanas antes de un acto medico (por ejemplo, el tratamiento preventivo) , o durante o después de un acto medico. La administración puede ser concomitante a o contemporánea con otra terapia invasiva, tal como, angioplastia, ablación de carótida, rotocuchillas o transplante de órganos (por ejemplo, corazón, ríñones, hígado, En ciertas modalidades, los complejos de Apo-SM se administran a un paciente cuya síntesis de colesterol es controlada por una estatina o un inhibidor de la síntesis del colesterol. En otras modalidades, los complejos de Apo-SM se administran a un paciente que experimenta el tratamiento con una resina de enlace, por ejemplo, una resina semi -sintética tal como colestiramina, o con una fibra, por ejemplo fibra vegetal, para atrapar las sales biliares y el colesterol, para incrementar la excreción de ácidos biliares y bajar las concentraciones sanguíneas de colesterol. 5.4 OTROS USOS Los complejos de Apo-SM utilizados por la invención pueden ser usados en ensayos in vitro para medir la HDL del suero, por ejemplo para propósitos de diagnostico. Ya que los repetidos de ApoA-I, ApoA-II y Apo se asocian con el componente de HDL del suero, los complejos de Apo-SM pueden ser usados como "marcadores" para la población de HDL, y las poblaciones de HDL de pre-ß? y pre- 2. Además, los complejos de Apo-SM pueden ser usados como marcadores para las subpoblaciones de HDL que son efectivas en la RCT. Para este fin, el Apo-SM puede ser agregado o mezclado con una muestra de suero del paciente; después de un tiempo de incubación apropiado, puede ser ensayado el componente de HDL detectando el Apo-SM incorporado. Esto puede ser logrado usando Apo-SM etiquetado (por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas, tintes, etc.), o mediante inmunoensayos usando anticuerpos (o fragmentos de anticuerpos) específicos para Apo-SM. Alternativamente, el Apo-SM etiquetado puede ser usado en procedimientos de análisis de imágenes (por ejemplo, exploradores CAT, exploradores MRI) para visualizar el sistema circulatorio, o para monitorear la RCT, o para visualizar la acumulación de HDL en los depósitos grasos, lesiones ateroscleróticas , y las similares, donde la HDL sería activa en el escape de colesterol. 6. EJEMPLOS 6.1 EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DE COMPLEJOS PROAPOA-I-LÍPIDO Los complejos de proApoA-I y fosfolípidos son fármacos candidatos que imitan potencialmente las actividades biológicas de las HDL. Este ejemplo describe la preparación de complejos de proApoA-I-fosfolípido. 6.1.1 MATERIALES Y MÉTODOS Los complejos de proApoA-I-lípidos se prepararon mediante el método de dispersión de colato. Se usaron cuatro lípidos: Fosfolipon 90 G (PC de soya) , esfingomielina, dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) , y l-palmitoil-2-oleil- fosfatidilcolina (POPC) . Se hizo una solución de 30 mg/ml agregando 0.9677 g de ácido cólico a 32.25 mi de amortiguador de NaHCC>3 2 mM. Para preparar la solución de proApoA-I, se empleó solución de proApoA-I (Eurogentec) a una concentración de 1 mg/ml en urea 6M. 60 mi de la solución de la solución de proApoA- I -urea 6M se dializaron contra 1200 mi de amortiguador de NaHC03 2mM usando una unidad de filtración de flujo tangencial (Sistema Labscale TFF, Millipore) equipado con una membrana de corte de 10 kDa . Enseguida de la diálisis, la solución se concentró a un volumen final de 20 mi. La solución restante se recolectó y se determinó que la concentración de proteína fue 2.62 mg/ml de solución mediante el análisis de proteína de Markwell-Lowry (Markwell et al., 1987, Anal. Biochem. 87(1):206-10). Para preparar la solución de Fosfolipon 90 G (PC de soya) , Fosfolipon 90 G (Rhóne-Poulenc Nattermann Phospfolipid GMBH # 228154) se dividió en alícuotas de 50 mi y se almacenó bajo gas N2 a 20°C. Se hizo una solución de 25 mg/ml de Fosfolipon 90G agregando 0.7815 g de Fosfolipon 90 G a 31.26 mi de cloroformo. Se hizo una solución de 25 mg/ml de esfingomielina agregando 0.0637 g de esfingomielina a 2.548 mi de cloroformo . Se prepararon también soluciones de 25 mg/ml de 1,2-dipalmitoil-secuencia de nucleótidos -glicero-3 - fosfocolina (DPPC) y l-palmitoil-2-oleil-fosfatidilcolina (POPC) en cloroformo . Alícuotas de 250 µ? de la Fosfolipon 90 G, esfingomiel ina, DPPC y POPC se colocaron entonces en tubos de vidrio y se evaporó el cloroformo mediante soplado de N2 y sometimiento a un vórtice para producir 6.25 mg de lipido seco por tubo. 400 µ? de amortiguador de NaHC03 2 mM se agregaron a cada tubo y se hidrataron los lípidos por 15 min a 37°C, para todos los lípidos excepto DPPC, el cual se hidrató a 50°C por 15 min. Los tubos de solución se sometió a un vórtice y se sometieron a tratamiento por sonido periódicamente hasta que se dispersaron todos los lípidos. 160 µ? de la solución de colato de 30 mg/ mi se agregaron a cada tubo. 160 mi de la solución de colato de 30 mg/ml se agregaron a cada tubo para clarificar la solución de esfingomielina . Las soluciones de colato-lípido se incubaron a 37°C (para la POPC, SM y PC de soya) y 50 °C (para DPPC) . Durante la incubación, las soluciones se sometieron a un vórtice y se sometieron a tratamiento por sonido periódicamente. Si las diluciones no estuvieron claras después de los pasos de sometimiento a un vórtice y tratamiento por sonido, entonces se agregó solución de colato adicional a la solución de lípido-colato en una serie de alícuotas de 100 mi. La incubación, sometimiento a vórtice, tratamiento por sonido y adición de colato continuaron hasta que todas las soluciones se volvieron claras. La solución de colato total agregada fue de 160, 260, 560, y 560 mi para la SM, DPPC, PC de soya y POPC, respectivamente. Las soluciones de colato- lipido se incubaron por un total de 30 min. 1.908 mi de la solución de 2.62 mg/ml de proApoA-I en amortiguador de NaHC03 2 mM se agregaron a cada tubo. La relación de proApoA- I : lipido en la solución fue de 5mg:6.25 mg o 1:1.25 (p/p) . Las soluciones de proApoA-I -lípido-colato se incubaron por 1 h a 37°C (para la POPC, SM, y PC de soya) y a 50°C (para la DPPC) . Para remover el colato, el cual es toxico, se incubaron las soluciones con resina de intercambio iónico (BIO-BEADS®, sigma) . La BIO-BEADS se activaron mediante incubación de un volumen de BIO-BEADS® secas con dos volúmenes de amortiguador de aHC03 2mM por 6 horas. Jeringas de plástico de 10 mi y 30 mi se cargaron con BIO-BEADS® activadas. La preparación de los complejos de proApoA-I -lipido se cargo entonces sobre las BIO-BEADS®. Para las soluciones de esfingomielina y DPPC, aproximadamente 5-7 mi de BIO-BEADS® se agregaron por 4.8 mg de solución de colato. Para la PC de soya y la POPC, aproximadamente 12 mi de BIO-BEADS® se agregaron por 16.8 mg de solución de colato. Las soluciones de complejo de proApoA-I -lipido se cargaron entonces sobre las BIO-BEADS® dentro de las jeringas. Las jeringas se sellaron entonces con una película de barrera y se incubaron con balanceo a 4°C durante toda la noche. Al final de al incubación, las soluciones de complejos de proApoA-I-lípido se recolectaron y se filtraron a través de filtros PES de 0.22 mm. Las soluciones se almacenaron entonces a 4°C antes del análisis. La soluciones de complejo se analizaron usando GPC (cromatografía por permeación de gel) usando una columna Superdex™ 200 de 1x30 cm (Pharmacia Biotech) . Se suministró una fase acuosa móvil conteniendo amortiguador de NaHC03 20 mM a una velocidad de flujo de 05 ml/min. El volumen de la inyección fue de 100 µ?. El tiempo de corrida fue de 45 ruin. Ese detectó el complejo por absorción a 280 nm. El tiempo de retención del complejo de proApoA-I-lípido se comparó con el tiempo de retención de la HDL de conejo purificada. 6.1.2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los cromatogramas de los complejos de proApoA-I-lípido contenían dos máximos principales, el primero, que apareció alrededor de 22 min, correspondió a un peso molecular de aproximadamente 200-300 kDa. El segundo, apareció a alrededor de 26 min, correspondió a un peso molecular de aproximadamente 100 kDa. En cada cromatograma el pico a 22 min correspondió a los complejos de proApoA-I-lípido ricos en lípido, en tanto que el pico a los 26 min correspondió a los complejos de proApoA-I-lípido pobres en lípidos. El cromatograma de la HDL de conejo purificada estándar produjo un sólo máximo a alrededor de 20 min. Calculado a partir del tiempo de retención de la HDL de conejo purificada, se optimizó la formulación para dar un máximo monomodal a alrededor de 22 min de complejos de proApoA- I - lípido ricos en lípido. La relación entre los máximos de 22 min y 26 min fue diferente para los diferentes lípidos, para los complejos de proApoA-I-POPC, y proApoA-I-PC de soya a una relación de 1:125 de proteína/lípido (p/p) , la fracción del área de 26 min, en relación con el área total, fue sólo de 10-20%. Por lo tanto, no se requirió optimización adicional para estos complejos. En contraste, para los complejos de proApoA-I-SM y proApoA-I-DPPC a una relación de 1:1.25 (p/p) proteína/lípido, la fracción del área del máximo de 26 min al área total fue de 30-50%. La diferencia entre la relación del pico de 22 min y de 26 min para los diferentes lípidos podría ser atribuida a las variaciones en el peso molecular y la estructura de los lípidos, y por lo tanto, diferentes relaciones p/p de proteína a lípidos requeridos para formar los complejos ricos en lípidos. Para incrementar la fracción rica en lípidos, el máximo de 22 min para los complejos de proApoA- 1 - SM, la relación p/p de SM a proteína se incrementó en el ejemplo 2 de abajo . 6.2 EJEMPLO 2: OTRA PREPARACIÓN DE COMPLEJOS DE PROAPOA-I LÍPIDO En base a los resultados obtenidos en la Sección 6.1 (Ejemplo 1) , se incrementó la proporción de SM, para producir preferencialmente un sólo máximo de complejos de proApoA- I -SM . Este ejemplo demuestra que la relación de proApoA-I a esfingomielina puede ser variada para producir un sólo máximo del complejo proApoA-I-esfingomielina a una relación de 1:2 (P/P) · 6.2.1 MATERIALES Y MÉTODOS Los complejos de proApoA-I-SM se prepararon siguiendo el método de co-solubilización. Una solución de proApoA-I en urea 6M (Eurogentec) se concentró 5 veces y se dializó contra 10 volúmenes de NaHC03 5 ttiM. La concentración de proteína se midió entonces llevando a cabo un ensayo de proteína de Markwell -Lowry . La solución de proteína se liofilizó después. Se hizo una solución de 25 mg/ml de proApoA-I en ácido acético disolviendo 128.2 mg de polvo de proApoA-I liofilizado en 5.13 mi de ácido acético glacial (JT Baker) . Se hizo una solución base de 50 mg/ml de esfingomielina disolviendo 256.0 mg de esfingomielina (Avanti) en 5.12 mi de ácido acético glacial . Las soluciones de proApoA-I:SM se combinaron a relaciones peso: eso (p/p) de 1:1, 1:1.25, 1:1.5 y 1:2 combinando 1.0 mi de solución base de proApoA-I con 0.5, 0.625, 0.75 y 1.0 mi de solución base de esfingomielina . Las soluciones combinadas se filtraron usando una jeringa llevando 0.2 µp\ de filtro de poliestersulfona (Whatman) y se registró el volumen de solución filtrada. Las soluciones de proApoA-I se congelaron a -40°C por aproximadamente 1.5 horas después se liofilizaron y se secaron por congelamiento como se indica a las temperaturas y en el orden mostrado abajo: Temperatura Tiempo -20°C 2 h -20°C a 23°C 12 h 50°C 6 h 23°C 1.5 h Los complejos de proApoA-I SM se formaron hidratando el polvo liofilizado en solución salina de bicarbonato (NaCl 140 mM, NaHC03 20 mM) a una concentración de 10 mg/ml de proteína. Las soluciones se calentaron a 52 °C y se enfriaron a la temperatura ambiente tres veces para facilitar la hidratación.

Alícuotas de 200 µ? de soluciones del complejo se diluyeron usando 200 µ? de solución salina de bicarbonato y se analizaron en una columna GPC Superdex 200 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech AB) usando las siguientes condiciones. El amortiguador de corrida fue NaCl 140 mM y NaHC03 20 mM. La velocidad de flujo fue 0.5 ml/min. El tiempo de corrida fue de 50 min. El volumen de inyección fue de 10 µ? . La longitud de onda de detección fue de 220 nm. Los tiempos de retención de los complejos se compararon con el tiempo de retención de un estándar de filtración en gel (Bio-Rad) . 6.2.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los cromatogramas contenían dos máximos principales a 24 y 29 minutos. El máximo a 24 min correspondió a los complejos de proApoA-I-SM en tanto que el máximo a 29 min correspondió a la proteína proApoA-I libre. La relación entre los máximos de 24 y 29 min difiere dependiendo de la relación de proApo-A-I-SM con un porcentaje más grande del máximo que aparece en la porción del complejo cuando se incrementó la relación p/p. A 1:2 p/p de proApoA- 1 - SM, se observó un sólo máximo a 24 min, por lo tanto se obtuvo la distribución homogénea del tamaño del complejo. 6.3 EJEMPLO 3: EFICACIA FARMACOLÓGICA DE LOS COMPLEJOS r-proApoA- i-ESFINGOMIELINA EN COMPARACIÓN CON LOS COMPLEJOS DE r-proApoA-I-POPC Los complejos de proApoA-I-lípido son fármacos candidatos que imitan potencialmente las actividades biológicas de la HDL. El objetivo de este estudio fue comparar las propiedades farmacodinámicas (es decir, la movilización del colesterol en el plasma) del proApoA-I-SM con las de los complejos de proApoA-I-fosfotidilcolina tales como proApoA-I -POPC . La proApoA-I recombinante humana (r-proApoA-I) se uso en este estudio. La proapoiipoproteína A-I comprende seis aminoácidos (Arg-His-Phe-Trp-Gln-Glu) unidos al extremo de la terminal amino de la ApoA-I. 6.3.1. MATERIALES Y MÉTODOS Formulación del Complejo Los complejos proApoA-i-SM y proApoA-I-POPC se prepararon mediante el método de diálisis de colato como se describe arriba. La relación de apolipopropteína a lípido fue de 1:2 (peso de proteína/peso del lípido) para proApoA-I-SM y proApo-A-I-POPC. La solución de propina r-proApoA-I (Eurogentec, Belgum) en 1 mg/ml en urea 6M se dializó con 20 volúmenes de solución de NH4HC03 5 mM (pH 8) . La concentración de proteína después de la diálisis de determinó mediante un Ensayo de Lowry Modificado . Se agregó colato de sodio (Sigma) a la solución de proteína a una relación de 1:2 (peso de r-proApoA- I/peso de colato de sodio) . Después se agregaron los fosfolípidos a las soluciones de proteína-colato a una relación de peso de 1:2 de apolipoproteína a fosfolípido. Las soluciones de proteína- colato-fosfolípido se incubaron a 37°C para las soluciones que contenían POPC y 50 °C para las soluciones que contenían SM.

Durante la incubación se mezclaron y vortexing periódicamente las soluciones. Después de 1 hora de incubación, se formaron soluciones claras. El colato, el cual es toxico para humanos y animales, se removió de las soluciones mediante incubación en presencia de una resina de intercambio iónico Biobeads™ (BioRad) . Biobeads™ se agregó a la solución de proteína-fosfolípido-colato a una relación de 1:2 de volumen de Biobeads™ hidratada a volumen de solución. Las soluciones resultantes se incubaron por 12 horas a 4°C bajo balaceo. Durante la incubación, el colato fue absorbido por la resina de intercambio iónico Biobeads™. La remoción del colato resultó en la formación de complejos de apolipoproteína-fosfolípido libres de colato. Al final de la incubación las soluciones se filtraron para remover la Biobeads™ y las soluciones resultantes se esterilizaron. Se agregó trehalosa a la solución final a 80 mg/ml para ajustar la osmolalidad. Las soluciones resultantes se analizaron y se almacenaron a 4°C antes de la inyección en los animales . Caracterización del Complejo Después de la formulación, los complejos de apolipoproteína- fosfolípido se analizaron para determinar su tamaño, concentración de proteína, pH de solución y osmolalidad. Los tamaños de los complejos se analizaron usando GPC (cromatografía por permeación de gel) equipada con una columna Superdex™ 200 (Pharmacia Biotech) 1x30. Se administró una fase acuosa móvil conteniendo NaHC03 20 mM (pH 8) a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. El volumen de inyección fue de 100 mi. Los complejos se detectaron mediante absorción de UV a 280 nm. La concentración de proteína se determinó mediante métodos rutinarios (es decir, un ensayo de Markwell Lowry modificado) . Diseño de Estudios en animales Conejos hembras NZ , reproducidos al azar pesando aproximadamente 3-3.6 kg se usaron en este estudio. Los complejos de apolipoproteína- fosfolípidos se inyectaron intravenosamente mediante infusión de bolo lenta en la vena marginal de la oreja. Para el muestro de sangre, aproximadamente 1-2 mi de sangre se recolectaron de la vena lateral de la oreja en la oreja sin inyección (o en algunos vasos, de la arteria medial) usando una jeringa de 3 mi sin anticoagulante. Todos los tubos recolectados sin anticoagulante se mantuvieron a la temperatura ambiente por 30-60 min para su coagulación. Las muestras de sangre se sometieron a centrifugación en el plazo de 1 hora después de de la recolección y el suero de cada muestra se separó en alícuotas y se almacenó a -80°C hasta el momento del análisis.

Tres conejos recibieron complejos de r-proApoA-I-POPC en tanto que otros tres recibieron complejos de r-proApoA- I -SM .

Los complejos se administraron a una dosis de 15 mg/kg en base al contenido de proteína. Las muestras de sangre se recolectaron a antes de la sangría, a los 5 min, 30 min, 1 h, 2 h, 24 h, y 48 h. Análisis de las muestras de sangre Se determinaron los fosfolípidos del suero (Phospholipid B, Equipo # 990-54009, Wako Chemicals GMBH, Neuss, Alemania) , triglicéridos (Triglycerides , Equipo # 1488872, Boehringer Mannheim Corporation, Indianápolis , IN) , colesterol total y colesterol no esterificado, con los equipos comercialmente disponibles para un Analizador Automático Hitachi 912 (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN) . Los perfiles de lipoproteína se analizaron usando cromatografía por filtración en gel en una columna Superosa 6HR 1x30 cm equipada con detección en línea de colesterol libre total como se describe por Kieft et al., (J. Lipid Res 1991; 32:859-866, 1991) . El colesterol esterificado en el suero y en las fracciones de lipoproteína VLDL, LDL y HDL se calcularon substrayendo los valores de colesterol libre del colesterol total . Análisis de Datos Se graficaron los cursos de tiempo de los cambios absoluto y porcentual en el colesterol libre del suero (no esterificado) , el colesterol libre de HDL ( (no esterificado) .

Se calculó el área bajo la curva para el colesterol movilizado mediante un método trapezoidal y se comparó con varios complejos de r-pro-ApoA-I-fosfolípido. 6.3.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los complejos de proApoA-I-SM y proApoA-I -POPC (relación 1:2 de peso de proteína/peso de fosfolípido) se administraron a una dosis de 15 mg/kg (en base al contenido de proteína) a conejos hembras NZW. Inesperadamente, se observó una movilización significativamente más alta de colesterol libre con la administración de complejos de proApoA-I-SM en comparación con los complejos de proApoA-I-POPC. El colesterol libre de HDL se incrementó en 31 mg/dl después de 30 min enseguida de la administración de proApoA-I-SM versus en 7 mg/dl 30 min enseguida de la administración de complejos de proApoA-I-POPC (FIG. 1) . Además, se observaron diferencias grandes en las áreas bajo las curvas de las concentración de colesterol libre y colesterol de HDL libre versus el tiempo para el periodo de tiempo de 0 a 24 h (AUC0-24h) · Para el colesterol de HDL libre los valores de AUC0-24 fueron de 22.3 mg*hr(dl y 354.2 mg*hr/dl para los complejos de r-proApoA- I -POPC y r-proApoA-I-SM respectivamente. Esto indica que los complejos de r-proApoA-I-SM movilizaron 16 veces más colesterol de HDL libre en 24 horas en comparación con los complejos de r-proApoA-I-POPC . Todas las referencias citadas se incorporan aquí en su totalidad como referencia y para todos los propósitos en la misma extensión como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente fuera indicada específicamente e individualmente para ser incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos. La cita de cualquier publicación es por su descripción antes de la fecha de presentación y no debería ser considerada como una admisión de que la presente invención no esta facultada para preceder tale publicación en virtud de la invención previa. Muchas modificaciones de esta invención pueden ser hechas sin apartarse del su espíritu y ámbito, como será aparente para aquellas personas experimentadas en la técnica. Las modalidades específicas descritas se ofrecen a manera de ejemplo solamente, y la invención deberá ser limitada únicamente por lo términos de las reivindicaciones anexas junto con el ámbito completo de los equivalentes a los cuales dan derecho tales reivindicaciones.

Claims (51)

1. 81
2. REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar la dislipidemia o una enfermedad asociada con la dislipidemia, caracterizado porque comprende, administrar a un sujeto un complejo de apolipoproteína-esfingomielina que comprende apolipoproteína y esfingomielina en una cantidad efectiva para lograr un nivel de suero de apolipoproteína libre o complejada en el rango de 10 mg/dL a 300 mg/dL arriba de un nivel de línea base antes de la administración. 2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad asociada con la dislipidemia se selecciona a partir del grupo que consiste de enfermedad cardiaca coronaria; enfermedad arterial coronaria; enfermedades cardiovasculares, hipertensión, restenosis, enfermedades vasculares o perivasculares ; trastornos dislipidémicos ; dislipoproteinemia; altos niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad; bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína Lp(a); altos niveles de apolipoproteína B; aterosclerosis (incluyendo tratamiento o prevención de aterosclerosis) ; hiperlipidemia,- hipercolesterolemia ; hipercolesterolemia familiar (FH) ; hiperlipidemia combinada familiar (FCH) ; deficiencias de la lipoproteína lipasa, tales como 82 hipertrigliceridemia , hipoalfalipoproteinemia , e hipercolesterolemialipoproteína .
3. 3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la apolipoproteína se selecciona a partir del grupo que consiste de preapolipoproteína, preproApoA- I , proApoA-I, ApoA-I, preproApoA-II , proApoA-II, ApoA-II, preproApoA- IV, proApoA-IV, ApoA-IV, ApoA-V, preproApoE, proApoE, ApoE, preproApoA-iMiiano, proApoA- IMiiano, ApoA- IMiiano, preproApoA- Iparis , proApoA- IParís, y ApoA-IParis.
4. 4. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque la apolipoproteína es un homodímero.
5. 5. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque la apolipoproteína es un heterodímero .
6. 6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la relación de SM : apolipoproteína del complejo está en el rango de 1:1 a 200:1 (mol /mol) .
7. 7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la relación de SM : apolipoproteína del complejo está en el rango de 1:2 a 200:1 (mol /mol ) .
8. 8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la relación de SM: apolipoproteína del complejo es aproximadamente 2:1 (p/p) .
9. 9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo comprende apolipoproteína y esfingomielina . 83
10. 10. El método de al reivindicación 9, caracterizado porque el complejo incluye además fosfatidilcolina .
11. 11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque la fosfatidilcolina es fosfatidilcolina de soya.
12. 12. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque desde 50% a 70% del contenido de lípido del complejos es esfingomielina .
13. 13. El método de al reivindicación 1, caracterizado porque desde 30-50% del contenido de lípido del complejo es fosfatidilcolina .
14. 14. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de apolipoproteína-esfingomielina se administra a un intervalo periódico en una cantidad de aproximadamente 40 mg a 2 g por persona por administración.
15. 15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la administración es administración intravenosa.
16. 16. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el intervalo periódico es aproximadamente cada 3 a 15 días .
17. 17. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el intervalo periódico es aproximadamente cada 5 a 10 días .
18. 18. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el intervalo periódico es cada 10 días. 84
19. 19. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el intervalo periódico es varias veces por día, en donde la dosis no alcanza una dosis toxica diaria.
20. 20. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la administración es mediante infusión lenta con una duración de más de una hora.
21. 21. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la administración es mediante infusión rápida de una hora o menos .
22. 22. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la administración es mediante una sola inyección de bolo .
23. 23. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo se co-administra con resinas de ácidos biliares, niacina, estatinas, o fibratos.
24. 24. Un método para tratar una enfermedad asociada con la dislipidemia, caracterizado porque comprende, administrar a un sujeto un complejo de apolipoproteíria-esfingomielina en una cantidad efectiva para lograr concentraciones de plasma circulante de una fracción de colesterol de HDL, entre 10% y 1000% de la concentración de la fracción de colesterol de HDL inicial antes de la administración.
25. 25. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la enfermedad asociada con la dislipidemia se 85 selecciona a partir del grupo que consiste de enfermedad cardiaca coronaria; enfermedad arterial coronaria; enfermedades cardiovasculares, hipertensión, restenosis, enfermedades vasculares o perivasculares ; trastornos dislipidémicos ; dislipoproteinemia; altos niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad; bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad; altos niveles de colesterol de lipoproteína Lp(a); altos niveles de apolipoproteína B; aterosclerosis (incluyendo tratamiento o prevención de aterosclerosis) ; hiperlipidemia; hipercolesterolemia; hipercolesterolemia familiar (FH) ; hiperlipidemia combinada familiar (FCH) ; deficiencias de la lipoproteína lipasa, tales como hipertrigliceridemia , hipoalfalipoproteinemia, e hipercolesterolemial ipoproteína .
26. 26. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la apolipoproteína se selecciona a partir del grupo que consiste de preapol ipoproteína, preproApoA-I , proApoA-I, ApoA-I, preproApoA-II , proApoA-II, ApoA-II, preproApoA- IV, proApoA-IV, ApoA-IV, ApoA-V, preproApoE, proApoE, ApoE, preproApoA-iMiiano, proApoA- IMiiano, ApoA- IMiiano, preproApoA- Iparis , proApoA- Iparis/ y ApoA-IParis.
27. 27. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque la apolipoproteína es un homodímero. 86
28. 28. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque la apol ipoproteína es un heterodímero .
29. 29. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la relación de SM: apolipoproteína del complejo está en el rango de 1:1 a 200:1 (mol/mol).
30. 30. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la relación de SM: apolipoproteína del complejo está en el rango de 1:2 a 200:1 (mol/mol).
31. 31. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la relación de S : apolipoproteína del complejo es aproximadamente 2:1 (p/p) .
32. 32. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque el complejo comprende apolipoproteína y esfingomielina .
33. 33. El método de al reivindicación 32, caracterizado porque el complejo incluye además fosfatidilcolina .
34. 34. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque la fosfatidilcolina es fosfatidilcolina de soya.
35. 35. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque desde 50% a 70% del contenido de lipido del complejo es esfingomielina .
36. 36. El método de al reivindicación 24, caracterizado porque desde 30-50% del contenido de lipido del complejo es fosfatidilcolina .
37. 37. El método de la reivindicación 24, caracterizado 87 porque el complejo de apolipoproteína-esfingomielina , se administra a un intervalo periódico en una cantidad de aproximadamente 40 mg a 2 g por persona por administración.
38. 38. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la administración es administración intravenosa.
39. 39. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque el intervalo periódico es aproximadamente cada 3 a 15 días .
40. 40. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque el intervalo periódico es aproximadamente cada 5 a 10 días .
41. 41. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque el intervalo periódico es cada 10 días.
42. 42. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque el intervalo periódico es varias veces por día, en donde la dosis no alcanza una dosis toxica diaria.
43. 43. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la administración es mediante infusión lenta con una duración de más de una hora.
44. 44. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la administración es mediante infusión rápida de una hora o menos .
45. 45. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la administración es mediante una sola inyección de bolo. 88
46. 46. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque el complejo se co-administra con resinas de ácidos biliares, niacina, estatinas, o fibratos.
47. 47. Un método para tratar la dislipidemia o una enfermedad asociada con la dislipidemia, caracterizado porque, comprende administrar a un sujeto un complejo de apolipoproteína-esfingomielina en una cantidad efectiva para lograr una concentración de plasma circulante de una fracción de colesterol de HDL entre 30 y 300 mg/dL.
48. 48. Un método para tratar la dislipidemia o una enfermedad asociada con la dislipidemia, caracterizado porque comprende, administrar a un sujeto un complejo de apolipoproteína-esfingomielina en una cantidad efectiva para lograr una concentración de plasma circulante de colesterolil ésteres entre 30 y 300 mg/dL.
49. 49. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el rango de 10 mg/dL a 300 mg/dL se logra entre 5 minutos y 1 día después de la administración.
50. 50. El método de la reivindicación 24 o 47, caracterizado porque la concentración del plasma circulante de la fracción de colesterol de HDL se alcanza entre 5 minutos y 1 día después de la administración .
51. 51. El método de la reivindicación 48, caracterizado porque la concentración del plasma circulante de colesterolil ésteres se alcanza entre 5 minutos y 1 día después de la administración.