JPS61152632A - 抗動脈硬化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分舒〉 本発明は新規な抗動脈硬化剤に関するものである。更に
詳しくは９本発明はヒトアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体を
有効成分として含有する新規な抗動脈硬化剤に関するも
のである。

〈従来技術〉 現在、各種血管病変の主要基礎疾患とされる粥状動脈硬
化症（以下、動脈硬化症と記す）の主原因の一つとして
、血管壁への脂質、特にコレステロールエステルの蓄積
が挙げられている。一方。

脂質代謝に様々な役割を果しているとされる血漿リボ蛋
白に関する研究が進展し、その一種である高比重リボ蛋
白（以下、ＨＤＬと記す）については、動脈硬化症との
関連で、ＨＤＬの持つ機能。

特に血管壁からの遊離コレステロールの除去作用が注目
されている。

一方、ＨｎＬの構成成分については、アｇｈ−１以外に
アポＡ−１およびその他のアポリボ蛋白成分並びに各種
のリン脂質およびコレステロールが知られている。又、
ＨＤｔ、はＨＤ　Ｌ２およびＨＤ　Ｌｓ等に小分類する
ことも可能である。

しかしながら、コレステロールの除去作用と動脈硬化症
の改善については密接に結びついているわけではない。

又、上記のＭＤＩ、の各成分が動脈硬化症の改善に結び
つくかどうか疫学的手法により種々解析が検討されつつ
あるが本疾患の多要因性のため解析が困難であり、未だ
確定されるにいたっていない。

〈発明が解決しようとする問題〉 本発明者等は動脈硬化症の予防および治療効果を有する
物質の探索について鋭意検討した結果。

ヒトアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体が上記目的にかなうこ
とを見い出し本発明を完成した。

〈発明の構成〉 本発明はヒトアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体を有効成分と
する抗動脈硬化剤に関する。

リン脂質としては７オスフアチジルフリン、フォス７ア
チジルエタノールアミン、７オスフアチジルセリン、フ
ォス７アチジルイ／シトール、スフィンゴミエリン（以
下、８６Ｐ）等があげられるが、ジパルミトイルフォス
フ丁チジルコリン（以下、ＤＰＰＣ）Ｉの７オスフテチ
ジルコリン。

スフィンゴミエリンが好ましい。これらは、単独で使用
してもよいが、２種類以上を併用してもよい。本発明に
かかわる複合体におけるアポＡ−１とリン脂質の構成比
は特に制限はないが、リン脂質としてＤＰＰＣ，ＢＳＰ
またはＤＰＰ（３とＢ１２を併用した場合には調製した
複合体の品質から通常モル比で１　：１５０〜１８０．
好ましくは１：１６０前後である。

本発明にかかわる複合体はヒトアポＡ−１とリン脂質と
を使用して、一般的なリポソーム調製方法例えばコール
酸透析法、超音波法、エタ／−ル注入法、トリトンＸ−
１００バッチ法等により調製し得る。

このようにして調製した複合体は、ゲル濾過法によりｌ
ピークを示すことおよび電子顕微鏡観察により微小かつ
均一の円板上粒子が連結したいわ１し ゆるｍ−ロー状粒子が殆どを占めていることから本発明
にかかわるヒトアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体が単なる混
合物ではなく複合体を形成していること又、該複合体が
均一性に優れていることを確認した。また、かかる複合
体の形態は肝臓で生合成された未成熟のＨＤＬと類似し
ていることから両者の構造上の類似性が想定され、複合
体を生体に投与した際、最も効果のある形態と考えられ
る。

このようにして調製した複合体は安定な物質であり９例
えば５℃以下の冷所に長期間安定に保存し得る。

なお１本発明の対象物質であるヒトアポＡ−Ｉ・リン脂
質複合体を製するに使用するアポ人−１は一般的方法９
例えば、血清から超遠心分画法。

セファクリル５−ａｏｏ等によるゲル濾過法およびＤＫ
ＡＩＣ−セルロース等によるイオン交換クロマトグラフ
ィー法などを組合わせて分離・、精製することにより調
製し得る。

〈発明の効果〉 本発明の効果は■培養血管平滑筋細胞内からのコレステ
ロール除去作用、■生体投与時における血清のＨＤＬ分
画への量的および時間的分布状態。

■動脈硬化症に対する改善効果および■安全性試験によ
り確認した。

更に詳細に述べれば■の効果は と）［１動脈またはウサギ胸部大動脈の外植体から培養
したヒトまたはウサギ血管平滑筋細胞を用い、これ等に
　哨−コレステａ−ルを取り込ませた培養細胞系を使用
する試験方法等により確認し得た。

■の効果は 生体に及ぼす抗原抗体反応の影響を考慮して。

例えば１２５１で標識したウサギアポＡ−１から調製し
た１ｆｌ１４Ｉ−ウサギアポＡ−１ｓ　ＤＰＰＣ−ＢＳ
Ｐ複合体をウサギに投与し、血清中のリボ蛋白画分の放
射活性を測定する等の方法により確認し得た。

■の効果は 高コレステロール食２例えばコレステセールおよびラー
Ｆを添加した飼料等で飼育して大動脈などの血管壁にコ
レステロールを蓄積させたウサギの動脈硬化症モデルを
作成する。次いでこのウサギ動脈硬化症モデルの胸部大
動脈を摘出し、その病変部位、即ちアテローム部位およ
び脂肪沈着部位の外植体の培養系を使用する試験方法等
により確認し得た。

更に、この改善効果は、前記の高コレステロール食を負
荷して作成したウサギ動脈硬化症モデルに前記ウサギア
ポＡ−Ｉ・リン脂質複合体９例えばウサギアポ＆−１−
ＤＰＰＣ−８８Ｐ複合体等を投与し、大動脈および冠状
動脈の病変部位について生化学的および病理学的検討を
行なう方法により確認し得た。

■の効果５部ち。

アポＡ−１−ＤＰＰＧ−ＢＳＰ複合体が極めて低毒性で
あることは９例えばウサギアポＡ−１・ＤＰＰＣ−ＢＳ
Ｆ複合体のウサギに対する急性毒性試験（静脈内投与）
を行なった結果、ＬＤｓ（１値はｏ、５９／Ｊ９以上で
あることなどから確認し得た。

猶、ウサギアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体はヒトアポＡ−
Ｉ・リン脂質複合体と、物理化学的性質。

例えば分子量、アポ蛋白とリン脂質の組成比、形態及び
コレステロール除去効果等において同等であ地ことをゲ
ル濾過、電顕観察並びに前記■の効果等により確認した
。

本発明のヒトアポ＆−Ｉ・リン脂質複合体の投与量とし
ては例えば長寿症候群の血清アポＡ−ルベルを維持する
量、即ち健常人の血清アポＡ−■レベルの２倍以上を維
持する量を挙げ得る。

更に、詳しくはヒトアボム−■・リン脂質複合体の好ま
しい投与量及び投与方法としては１例えばアポＡ−１量
に換算して、１回１．５ｇ〜８．５ｇ／人づつ週２回、
１ケ月間またはそれ以上連続して静脈内投与する方法を
挙げ得る。

本発明のヒトアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体の製剤型とし
ては、各種の製剤上及び生理学的に許容し得る剤型１例
えば注射剤等を挙げ得る。

〈実施例〉 以下９本発明について実施例及び試験例を挙げて説明す
る。

実施例１（ヒトアポＡ−ｊ・リン脂質複合体及びウサギ
アポＡ−Ｉ・リン脂質複合体の調製）リン脂質は、ｎｐ
ｐｃ単独、またはＢＳＰ単独。

またはｏｐｐａとＢＳＰの等モル混合物の３つの組成を
用いた。２５１０９のリン脂質を１０−のりｐロホルム
に溶解した後に、窒素気流下で薄膜状に乾固させクロロ
ホルムを完全に除く。次に緩衝液（ＩＯＩＩＭ）リス−
塩酸、１ｍＭエチレンジアミン西酢酸、ＩＩＩＭアジ化
ナトリウム、１５０票Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８，０）
を１〇−加え。

７０℃に加温して攪はんする。次に８０２０”９のコー
ル酸ナトリウム（リン脂質１モルに対してコール酸ナト
リウム２モルの割合）を加え、相転移温度（以秀Ｄ　Ｐ
　Ｐ　ＧのＴｃ　；　４１℃、ＢＳＰのＴｃ；８Ｚ”Ｃ
，ＤＰＰＯ及びＢＳＰの混合物のＴｃ；４１℃）に１０
分間保つ。

次にヒトまたはウサギアポＡ−１の前記緩衝溶液４６ｄ
（アポＡ−１量としてｓｏｇ、ａｑ（リン脂質１６０モ
ルに対してアポＡ−１が１モルの割合））を加え、　Ｔ
ｃ　で７２時間インキュベートしてヒトまたはウサギア
ポＡ−Ｉ・リン脂質複合体を調製した。調製した複合体
は更に生理的食塩水に対して４℃で７℃時間透析を行い
コール酸ナトリウムを除去した。このようにして調製し
たヒト或いはウサギアｇｈ−ｘ・リン脂質複合体につい
て七７？Ｗ−スＣＬ−４Ｂ（！１Ｘ４４８ａａ）のカラ
ムにより前記緩衝液でゲル濾過を行い、各溶出画分の蛋
白量及びリン脂質量を測定した。その結果、ヒトアポＡ
−Ｉ・リン脂質複合体及びウサギアｆ、　Ａ　−Ｉ・リ
ン脂質複合体のいずれにおいてもリン脂質及びアポ蛋白
の単一ピークが同一のフラクシ曹ンに見られた。又１両
複合体の分子量は約８２万であり、アボムー■とリン脂
質との組成比（モル比）は平均１３１６５であった。又
、ヒト或はウサギアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体について
電子顕微鏡像より大きさを測定した。その結果。

いずれの複合体もほぼ均一な直径２００〜ｓ　ｏ　ｏ　
Ｘ。

厚さ５０λの円板状物質が数珠状につながった。

いわゆるルーローを形成していることを認めた。

試験例１（ヒトアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体及びウサギ
アポＡ−Ｉ・リン脂質複合体のヒト及びウサギ培養平滑
筋細胞からのコレステロール除去作用） ヒトの屓動脈またはウサギの胸大動脈の外植体から、１
０％胎児牛血清（ｙＣｓ）と抗生物質を含有するダルベ
ツコ改変イープル（ＤＭＥ）培養液を用いて、平滑筋細
胞を生育させた。細胞は５％二酸化炭素と９５％空気の
気相中、３？”Ｃで培養した。２週間培養した後にトリ
プシン処理を行い、二次培養を行った。このようにして
作成したヒト或いはウサギの平滑筋細胞を早チルコン８
０４７皿（培養面積２．０ｄ／ウエル）にａｏｏｏ。

４１／皿の細胞密度で６％ＦＧ８と抗生物質を含む１−
のＤＭＥ培養液中で培養した。１５時間培養し、細胞が
皿に付着した後に、培養液を５％ＦＣｉＳ、抗生物質と
哨−コレスチロール（０，２５μｃｉ／−）を含むｌ−
の０ＭＩＣ培養液に交換して、さらに４８時間培養を行
い、３［（−コレステロールを細胞内に取り込ませた。

４８時間培養後に前記の殖−コレスチロールを含む培養
液を除き、ＤＭＥ培養液で３回洗浄した。その後に被検
群として、実施例１に準じて調製し、ＤＭＥ培養液で透
析を行ったヒトまたはウサギアポＡ＝Ｉ・リン脂質複合
体のＤＭＥ培養液（培養液１−あたりアポＡ−１量とし
て５〜１１００ｐ含む）１−を被検培養液として加え、
８時間培養を行った後に、培養液及び細胞中の３Ｈ−コ
レステロールの放射活性を測定した。対照群はＤＭＥ培
養液で培養を行い、被検群及び対照群とも各群４枚の皿
で実験を行った。コレステロール除去作用（コレステロ
ール除去率＞は次式で表わした。

コレステロール除去率（％） ×１００ （上記式中ＲＡは放射活性を意味する。）ヒトまたはウ
サギアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体のヒト培養血管平滑筋
細胞に対するコレステロール除去作用を表１に示した０
ヒトアポＡ−１−ＤＰＰＣ−ＢＳＰ複合体、ヒトアポＡ
−Ｉ−ＤＰＰＣ複合体及びヒトアポＡ−１・Ｂ８Ｐ複合
体はヒト培養血管平滑筋細胞に対して強いコレステロー
ル除去作用を示し、ウサギアポＡ−Ｉ−ＤＰＰＣ・８５
Ｆ複合体もヒト培養血管平滑筋細胞に対してコレステロ
ール除去作用を示した。

表１ ヒトアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体及びウサギアポＡ−Ｉ
・リン脂質複合体のウサギ培養血管平滑筋細胞に対する
コレステロール除去作用を表２に示した。ウサギアポＡ
−１・ｎｐｐｃ−Ｂｓｐ複合体はウサギ培養血管平滑筋
細胞に対して強いコレステルール除去作用を示した。ま
た、ヒトアポＡ−Ｉ−ＤＰＰＯ−Ｂ８Ｐ複合体及びヒト
７ぎＡ−Ｉ−ＤＰＰＣ複合体も共にウサギ培養血管平滑
筋細胞に対して強いコレステロール除去作用を示し、そ
の作用の強さはウサギアポＡ−Ｉ−ＤＰＰ（３−ＢＢＰ
複合体と同程度であった。

試験例２（ウサギアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体投与後の
血清リボ蛋白画分への分布） ′１−塩化ヨウ素法によりラベルした１鵬！−ウサギア
ボＡ−１を用いて、実施例１に準じてｌｆｉニーウサギ
アポアポ　１−　ＤＰＰＣ書ＢＳＰ複合体を調製した。

正常ウサギに１４の１２ｓＩ−ウサギアポＡ−Ｉ−ＤＰ
ＰＣ−ＢＳＰ複合体の生理的食塩水（アポＡ−ｉ量とし
て１００μｑ／ｄｗ放射活性；２　Ｘ　１０＠ｃｐｍ、
＾ａ）を耳静脈より静注し、投与８３時間後の血清を超
遠心法により超低比重リボ蛋白（ＶＬＤＩ−）＋低比重
リボ蛋白（ＬＤＬ）、ＨＤＬ及び超高比重リボ蛋白（Ｖ
ＨＤＩ、）を分画し。

各リボ蛋白画分の１ｆｉＩの放射活性を測定した。表３
に示す様に、１町−ウサギアポＡ−Ｉ−ＤＰＰＣ−Ｂ　
ｓ二接合体は投与８３時間後にはほとんどＨＤＬ画分に
存在していた。

表３ 試験例８（ウサギアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体の動脈硬
化症ウサギの大動脈から調製した外植体に対するコレス
テロール除去作用 ）ニューシーラントホワイトの雄性ウサギを０．５％コ
レステ四−ル及び５％ラードを添加した飼料で１０週間
飼育後、正常食でさらに８週間飼育し大動脈にコレステ
ロールが蓄積した動脈硬化症ウサギを作成した。この動
脈硬化症ウサギの胸大動脈を無菌的に取り出し、脂肪を
取り除き、外膜をつけたままアテローム部位と脂肪沈着
部位を分離した。それぞれの部位を１ｘ２ｍ＋の切片に
切り。

外植体として使用した。被検培養液としては、５％ｙｅ
ｓと抗生物質を含むＤＭＩＣ培養液に、実施例１に準じ
て調製したウサギアポＡ−Ｉ−ＤＰＰＱ、８８Ｐ複合体
（アポＡ−１量として２１＋Ｉ９／ｄ　）を加えたもの
を使用し、対照は５％ＦＯ８と抗生物質を含むＤＭＥ培
養液を使用した。外植体２０個を２４の培養液を加えた
５０−の培養７ラスフ〔７テルコン３０１８（ベクトン
、ジッキンソン社製）〕中、ａ日１００及び８日後の計
８回培養液を交換して１０日間、３７℃、５−二酸化炭
素。

９５％空気の気相中で培養した。全外植体及び培養液の
コレステ四−ルはイソプロピルアルコール−ｎ−ヘキサ
ン（２：　３）で抽出し、高速液体クロマトクラフィー
で測定した。コレステロール除去作用（コレステロール
除去率）は次式で表わした。

コレステロール除去率（％） 表４に示す様に、ウサギアポＡ−Ｉ−ＤＰＰＣ・ＢＳＰ
複合体は対照の約４〜７倍のコレステロール除去率を示
し、その作用は脂肪沈着部位においてとくに明確であっ
た。

表４ 試験例４（ウサギアポＡ−Ｉ−ＤＰＰＧ−ＢＳＰ複合体
の動脈硬化症ウサギへの投与による動脈硬化改善効果） ニューシーラントホワイトの雄性ウサギを０．５％コレ
ステロール及び５％ラードを含む飼料で１０週間飼育後
、さらに正常食で５週間飼育し。

血管壁にコレステロールが蓄積した動脈硬化症ウサギを
３８匹作成した。この動脈硬化症ウサギの中より、血清
コレステルール値、虹彩の脂肪沈着の同程度のものを８
匹選抜して実験に使用した。

被検群には実施例１に従って調製し、０．４５μ議のフ
ィルターを通して無菌にしたウサギアポＡ−１・１）Ｐ
ＰＣ−ＢＳＰ複合体の生理的食塩水（１ｇＬｔあたりア
ポＡ−Ｉ量として、１０■を含む）を２匹のウサギに、
４ｄ／１９の割合で、２日おきに４週間、計１０回、耳
静脈より静注した。対照群には生理的食塩水を４ｓ／／
に９の割合で６匹のウサギに静注した。

屠殺時の血清のアポ＾−■及び高比重リポ蛋白コレステ
ロール量（ＨＤＬ−コレステロール）ヲ測定して表５に
示した。このウサギアポＡ−１・ＤＰＰＯ−ＢＳＰ複合
体を前記の動脈硬化症ウサギに投与することにより、血
清のアポＡ−ＩとＨＤ　Ｌ　−コｌ／　スｆ　ｏ−ルＩ
ｋが増ｍし、ｍ清コレステロールの改善効果を示した。

また屠殺後摘出した大動脈のコレステロール量とその組
成を高速液体クロマトグラフィーにより測定し表６に示
した。

このウサギアポＡ−Ｉ−ＤＰＰＣ−Ｂ８ｐＨ合体を前記
の動脈硬化症ウサギに投与することにより血管壁のコレ
ステロール量は減少し、また血管壁＋７）：ｆｆし７．
チロール組成においてもオレイン酸コレＸ　ｆ　ロール
の割合が減少し、遊離コレステロールの割合が増加して
おり、血管壁での動脈硬化の改善効果が示された。

表６ 表６ 更に、大動脈についてアテローム性病巣及び脂肪沈着病
巣を病変部位として、大動脈中の病変部位の占める割合
を画像解析装置により測定し表７に示した。ウサギアポ
Ａ−Ｉ・リン脂質複合体を投与したウサギ大動脈の病変
部の割合は対照と比べて減少しており、血管壁での動脈
硬化の改善効果が示された。

屠殺時摘出した心臓について連続切片を作成し。

冠状動脈枠（左冠状動脈回施枝、前下行枝及び右冠状動
脈）と分校細小動脈に分けて血管の狭窄の発生頻度（狭
窄血管数／全血管数ｘｉｏｏ）を測定した。その結果は
表８に示す通り、ウサギアポＡ−Ｉ・リン脂質複合体の
投与により、冠状動脈幹２分校細小動脈ともに狭窄頻度
の軽減化が見られ、冠状動脈に対しても動脈硬化の改善
効果が認められた。

表８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒトアポＡ− I ・リン脂質複合体を含有する抗動
   脈硬化剤。 ２）リン脂質がジパルミトイルホスファチジルコリンお
   よび／またはスフィンゴミエリンである特許請求の範囲
   第１項記載の抗動脈硬化剤。