JP2015535263A - 再構成されたｈｄｌ製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、アポリポタンパク質、脂質及び凍結乾燥安定剤を含む再構成された高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）製剤に関する。上記製剤は、減少した腎毒性及び特に凍結乾燥された形態で良好な長期安定性を有する。

Description

本発明は、再構成された高密度リポタンパク質製剤、及び特に医薬用途に適した安定性及び生物学的特性を有する製剤に関する。

高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、正常血清において見られる様々な範囲のリポタンパク質粒子を形成する。成熟ＨＤＬ粒子は、タンパク質及び脂質を含有する球状構造の形態で存在する。これらの粒子の外層内はより極性の脂質、リン脂質及び遊離コレステロールであり、全て水性環境に向かって外側に配向した荷電した基を有する。エステル化コレステロール及びトリグリセリドのようなより疎水性の脂質は、粒子のコア中に存在する。新しく形成されたか発生しようとしているＨＤＬ粒子は脂質が不十分であり、円盤状の形状である。タンパク質成分は外層内に組み込まれる。主なタンパク質成分は、少量のアポＡ−ＩＩ、アポＡ−ＩＶ、アポＣＩＩＩ、アポＤ、アポＥ及びアポＪを伴うアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）である。レシチン−コレステロールアセチルトランスフェラーゼ、ＰＡＦアセチルヒドロラーゼ及びパラオキソナーゼのような様々な他のタンパク質がＨＤＬ粒子に存在する。ＨＤＬは高密度（＞１．０６３ｇ／ｍｌ）及び小さいサイズ（ストークス径＝５〜１７ｎｍ）を特徴とする。

患者の血流に注入されて天然に存在するＨＤＬの生物学的効果を模倣し得る人工ＨＤＬを開発しようとする努力がなされてきた。これらの人工粒子は、一般的には「再構成されたＨＤＬ」（ｒＨＤＬ）と呼ばれるか、又はＨＤＬミメティックもしくは合成ＨＤＬ粒子と呼ばれることもある。人工粒子は、天然粒子の成分、特にアポＡ−Ｉ及び脂質を含有する。例えば、特許文献１は、アポＡ−Ｉ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及び少量のコール酸ナトリウムを含むｒＨＤＬを記載する。特許文献２は、アポＡ−Ｉ、スフィンゴミエリン（ＳＭ）及びホスファチジルグリセロール（例えば、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（ｌ−グリセロール）］（ＤＰＰＧ））を含むｒＨＤＬを記載する。

ｒＨＤＬ製剤を使用前に凍結乾燥する（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）（フリーズドライ（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ））することが便利である。凍結乾燥は、固形タンパク質医薬を製造するために一般的に使用される方法である。しかし、このプロセスは様々な凍結及び乾燥のストレス、例えば可溶化タンパク質の濃縮、氷晶の形成、ｐＨ変化などを生じる。これらのストレスは全て様々な程度までタンパク質を変性し得る。従って、凍結及び乾燥の両方のプロセスの間のタンパク質安定性を保護するために、安定剤がしばしばタンパク質製剤化において必要とされる。凍結乾燥の間のｒＨＤＬ製剤の安定性を維持するために、糖類及び糖アルコールのような安定剤が使用されてきた。例えば、特許文献３は、１０％スクロース又は１０％スクロースと５％マンニトールとの混合物で安定化される血漿由来リポタンパク質を開示する。特許文献１は、ｒＨＤＬ製剤の約６５〜８５ｇ／Ｌの濃度（約６．５〜８．５％質量／質量と等価）で使用される糖類及び糖アルコールを開示する。特許文献２は、それぞれ４％質量／質量及び２％質量／質量で混合物で使用される、安定剤としてのスクロース及びマンニトールを開示する。ｒＨＤＬの製造及び貯蔵安定性に対する調査が非特許文献１において行われた。ここで、１：１５０のアポＡ−Ｉ：ダイズＰＣ比を有するｒＨＤＬは、１又は５％スクロースで十分に安定化することができなかったが、一方で１０％スクロースは最適と記載された。

これらの文書のｒＨＤＬ製剤は、注入治療を意図されるが、注入製品における高糖濃度は腎障害を引き起こし得るか、又は増悪させ得る。このことは、ｒＨＤＬの対象患者集団において、これらの患者がしばしば腎臓を障害されているので、特に問題である。

ＷＯ２０１２／００００４８ ＷＯ２０１２／１０９１６２ ＵＳ５，０８９，６０２

Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６、７８５−７９２ （２０１１）

従って、本発明の目的は、これらの以前の製剤の代替又はそれらと比較して改善されたｒＨＤＬ製剤を提供することであった。特に、本発明者らは、減少した腎毒性を有する安定なｒＨＤＬ製剤を探求した。

この問題は、請求項１に記載の製剤により解決される。さらに好ましい実施態様は従属請求項において規定される。

驚くべきことに、請求項１のｒＨＤＬ製剤が良好な長期安定性を示すということが見出された。以前の製剤よりも少ない凍結乾燥安定剤を含有することにより、製剤は腎毒性のより少ない危険性も示す。低い凍結乾燥安定剤濃度はまた、ｒＨＤＬ機能の機能性アッセイにおいてｒＨＤＬがより良好に機能することを可能にする。本発明者らはまた、アミノ酸、特にプロリンが、ｒＨＤＬ製剤のための有用な凍結乾燥安定剤であるということを見出した。

発明の要旨
本発明は、アポリポタンパク質、脂質及び凍結乾燥安定剤を含むｒＨＤＬ製剤を提供し、ここでアポリポタンパク質と脂質との間の比は約１：２０〜約１：１２０（ｍｏｌ：ｍｏｌ）である。

好ましくは、凍結乾燥安定剤は、約１．０％〜約６．０％（質量／ｒＨＤＬ製剤の質量）、例えば、１．０、１．１、１．２又は１．３から５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０の濃度で存在する。この少量の凍結乾燥安定剤は腎毒性の危険性を減少し得る。造影剤は腎臓でのクリアランスについて凍結乾燥安定剤と競合し得るので、急性冠症候群治療（ＡＣＳ）の間にこれらの造影剤を投与されている患者にも特に適している。好ましい実施態様において、凍結乾燥安定剤は、約１．０％から６．０％未満、例えば約１．０％〜５．９％の濃度で存在する。好ましくは、凍結乾燥安定剤は、約３．０から６．０％未満、例えば約３．０〜５．９％の濃度で存在する。より好ましくは、凍結乾燥安定剤は、約４．０〜５．５％、特に４．３〜５．３％、より特に４．３〜５．０％、そして最も好ましくは４．６〜４．８％（質量／質量）の濃度で存在する。このような製剤は良好な安定性及び低い腎毒性を示す。

あるいは、又はさらに、アポリポタンパク質と凍結乾燥安定剤との間の比が約１：１〜約１：３（質量：質量）であることが好ましい。特に、アポリポタンパク質と凍結乾燥安定剤との間の比は、約１：１〜約１：２．４（質量：質量）、例えば１：２（質量：質量）未満である。本発明者らは、これらの製剤が、数ヶ月の貯蔵後でさえ、凍結乾燥されたサンプルのサイズ分布の変化をわずかしか示さないか変化を示さず、安定なままであるということを見出した。しかし、いくつかの実施態様において、アポリポタンパク質と凍結乾燥安定剤との間の比はこれより少なくてもよく、例えば約１：１〜約１：７、そして特に約１：１〜約１：５（質量：質量）であり得る。

本発明はまた、アポリポタンパク質、脂質及び凍結乾燥安定剤を含むｒＨＤＬ製剤を提供し、ここで凍結乾燥安定剤はアミノ酸を含む。好ましくは、アミノ酸はプロリンである。本発明者らは、アミノ酸が、特に少量の他の安定剤との混合物での場合に、ｒＨＤＬ製剤のための良好な凍結乾燥安定剤であるということを見出した。

本発明はまた、ヒトにおける疾患、障害又は状態を予防又は処置するための上述のｒＨＤＬ製剤を提供する。適切には、疾患、障害又は状態は、ｒＨＤＬ製剤の予防的又は治療的投与に対して応答性である。

発明の詳細な説明
本発明の文脈内で、用語「再構成されたＨＤＬ（ｒＨＤＬ）製剤」は、典型的には血漿中に存在する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と機能的に似ているか、類似するか、相当するか、又は模倣する、いずれかの人工的に製造されたリポタンパク質製剤又は組成物を意味する。ｒＨＤＬ製剤は、それらの範囲内に「ＨＤＬミメティック」及び「合成ＨＤＬ粒子」を含む。

本発明の文脈内で、用語「凍結乾燥安定剤」は、凍結乾燥の間、タンパク質を安定化する物質を意味する。このような凍結乾燥安定剤は当該分野で周知であり、例えばＷａｎｇ（２０００）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ２０３：１−６０において概説されている。本発明における使用のために好ましい凍結乾燥安定剤は、糖類、糖アルコール、アミノ酸、又はそれらの混合物を含む。例えば、本発明者らは、スクロースのような二糖類が凍結乾燥安定剤としての使用に特に適した糖であるということを見出した。使用され得る他の二糖類としては、フルクトース、トレハロース、マルトース及びラクトースが挙げられる。二糖類に加えて、ラフィノース及びマルトトリオースのような三糖類が使用され得る。より大きなオリゴ糖、例えばマルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースも適切であり得る。あるいは、グルコース、マンノース及びガラクトースのような単糖類が使用され得る。これらの単糖類、二糖類、三糖類及びより大きなオリゴ糖は、単独で、又は互いに組み合わせて使用され得る。上記のように、糖アルコールである凍結乾燥安定剤も使用され得る。これらの糖アルコールもまた、単独又は組み合わせて使用され得る。本発明における使用のための特定の糖アルコールはマンニトールである。使用され得る他の糖アルコールとしては、イノシトール、キシリトール、ガラクチトール、及びソルビトールが挙げられる。グリセロールのような他の多価アルコールもまた適切であり得る。凍結乾燥安定剤として使用され得るアミノ酸としては、プロリン、グリシン、セリン、アラニン、及びリジンが挙げられる。修飾アミノ酸、例えば４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸ナトリウム、サルコシン、及びγ−アミノ酪酸もまた使用され得る。本発明者らは、プロリンが凍結乾燥安定剤としての使用のために特に適しているということを見出した。

特定の実施態様において、凍結乾燥安定剤は、糖類及び糖アルコールの混合物を含む。例えば、スクロース及びマンニトールの混合物が使用され得る。糖類及び糖アルコールは、いずれかの適切な比、例えば約１：１（質量：質量）〜約３：１（質量：質量）、及び特に約２：１（質量：質量）で混合され得る。２：１未満の比、例えば、３：２未満の比が特に想定される。典型的には、比は１：５より大きく、例えば１：２（質量：質量）より大きい。いくつかの実施態様において、製剤は４％未満のスクロース及び２％マンニトール（質量／ｒＨＤＬ製剤の質量）、例えば３％スクロース及び２％マンニトールを含む。いくつかの実施態様において、製剤は４％スクロース及び２％未満のマンニトールを含む。いくつかの実施態様において、製剤は４％未満のスクロース及び２％未満のマンニトール、例えば、約１．０％〜３．９％スクロース及び約１．０％〜１．９％（質量／質量）マンニトールを含む。

特定の実施態様において、凍結乾燥安定剤は、糖類及びアミノ酸の混合物を含む。例えば、スクロース及びプロリンの混合物が使用され得る。糖類及びアミノ酸は、いずれかの適切な比、例えば、約１：１〜約３：１（質量：質量）、及び特に約２：１（質量：質量）の比で混合され得る。２：１未満の比、例えば３：２（質量：質量）未満の比が特に想定される。典型的には、比は１：５より大きく、例えば１：２（質量：質量）より大きい。好ましくは、アミノ酸は、約１．０〜約２．５％の濃度、例えば１．０、１．２、又は１．３から２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、又は２．５％（質量／ｒＨＤＬ製剤の質量）の濃度で存在する。いくつかの実施態様において、製剤は、１．０％スクロース及び２．２％プロリン、又は３．０％スクロース及び１．５％プロリン、又は４％スクロース及び１．２％プロリンを含む。アミノ酸は、等張液を維持するために糖に加えられ得る。３５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇより大きな浸透圧を有する溶液は典型的には高浸透圧であるが、２５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ未満のものは典型的に低浸透圧である。２５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ〜３５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有する溶液が典型的に等張性である。

特定の実施態様において、凍結乾燥安定剤は、糖アルコール及びアミノ酸の混合物を含む。凍結乾燥安定剤は、糖類、糖アルコール、及びアミノ酸の混合物を含み得る。

アポリポタンパク質は、天然に存在するＨＤＬ又は再構成された高密度リポタンパク質／ｒＨＤＬの機能性の生物学的に活性な成分であるいずれかのアポリポタンパク質であり得る。典型的に、アポリポタンパク質は、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩ、アポＡ−Ｖ、プロ−アポＡ−Ｉのような血漿由来もしくは組換えのアポリポタンパク質又はアポＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏのような変異体のいずれかである。好ましくは、アポリポタンパク質はアポＡ−Ｉである。より好ましくは、アポＡ−Ｉは、野生型配列を含む組換え由来であるかもしくはＭｉｌａｎｏ配列のいずれかであるか、またあるいはヒト血漿から精製される。アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の生物学的に活性なフラグメントの形態であり得る。このようなフラグメントは、天然に存在するものでも、化学的に合成されたものでも、組換えでもよい。例のみとして、アポＡ−Ｉの生物学的に活性なフラグメントは、アポＡ−Ｉのレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）刺激活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％〜１００％を有し、又は１００％より高くさえある。

本発明において、アポリポタンパク質：脂質のモル比は、典型的には約１：２０〜約１：１２０、そして好ましくは約１：２０〜約１：１００、より好ましくは約１：２０〜約１：７５（ｍｏｌ：ｍｏｌ）、そして特に１：４５〜１：６５である。この範囲は、約１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５及び１：１００のようなモル比を含む。アポリポタンパク質：脂質の特に有利な比は１：４０〜１：６５（ｍｏｌ：ｍｏｌ）である。これは、本発明に従うｒＨＤＬ製剤が、肝臓毒性を生じないレベルで脂質を含むということを確実にする。

他の実施態様において、アポリポタンパク質：脂質のモル比は、約１：８０〜約１：１２０の範囲であり得る。例えば、この比は１：１００〜１：１１５、又は１：１０５〜１：１１０であり得る。これらの実施態様において、このモル比は、例えば１：８０〜１：９０、１：９０〜１：１００、又は１：１００〜１：１１０であり得る。好ましい実施態様において、本発明に従うｒＨＤＬ製剤は、ｒＨＤＬ粒子をさらに安定化させるために界面活性剤をさらに含む。界面活性剤は、胆汁酸及びその塩を含めて、ｒＨＤＬ製剤における使用に適したいずれのイオン性（例えば、カチオン性、アニオン性、双性イオン性）界面活性剤でも非イオン性界面活性剤でもよい。イオン性界面活性剤としては、胆汁酸及びその塩、ポリソルベート（例えばＰＳ８０）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、セチルトリメチル−アンモニウムブロミド、ラウロイルサルコシン、ｔｅｒｔ−オクチル フェニル プロパンスルホン酸及び４’−アミノ−７−ベンズアミド−タウロコール酸が挙げられ得る。

胆汁酸は、典型的には２４個の炭素を有する、ジヒドロキシ化又はトリヒドロキシル化ステロイドであり、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸又はウルソデオキシコール酸が挙げられる。好ましくは、界面活性剤は、胆汁酸塩、例えばコール酸塩、デオキシコール酸塩、ケノデオキシコール酸塩又はウルソデオキシコール酸塩である。特に好ましい界面活性剤はコール酸ナトリウムである。界面活性剤、特にコール酸ナトリウムの濃度は、好ましくは０．３〜１．５ｍｇ／ｍＬである。胆汁酸濃度は、比色分析アッセイを含む様々な方法（例えば、Ｌｅｒｃｈ ｅｔ．ａｌ．、１９９６、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．７１：１５５−１６４；Ｓｈａｒｍａ、２０１２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ．３（２）、２８−３４；並びにＧａｌｌｓａｅｕｒｅｎ試験キット及びＧａｌｌｓａｅｕｒｅｎ−Ｓｔｏｐｐｒｅａｇｅｎｓ（Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を参照のこと）を使用して決定され得る。本発明のいくつかの実施態様において、ｒＨＤＬ製剤は、比色分析アッセイにより決定して０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬのコール酸塩レベル、及び約４．０〜５．５％、特に４．３〜５．３％、より特に４．３〜５．０％、そして最も好ましくは４．６〜４．８％（質量／質量）の濃度で凍結乾燥安定剤を含む。特定の実施態様において、凍結乾燥安定剤はスクロースである。このような製剤は良好な安定性並びに低い腎毒性及び肝毒性を示す。

アポリポタンパク質と凍結乾燥安定剤との間の比は、この比が約１：１〜約１：７（質量：質量）となるように通常調整される。より好ましくは、この比は約１：１〜約１：３、特に約１：１．１〜約１：２である。特定の実施態様において、従ってｒＨＤＬ製剤は、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９又は１：２（質量：質量）の比を有する。しかし、アポリポタンパク質と凍結乾燥安定剤との間の比が約１：７（質量：質量）ほど多くまで拡大され得る（例えば約１：４．５ （質量：質量））少量のタンパク質（例えば＜２０ｍｇ／ｍＬ）が存在する特定の実施態様についても考慮される。

適切には、アポリポタンパク質は約５〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。これには、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５及び５０ｍｇ／ｍｌ並びにこれらの量の間のいずれかの範囲が含まれる。アポリポタンパク質は、好ましくは約２５〜４５ｍｇ／ｍｌの濃度である。他の実施態様において、アポリポタンパク質は約５〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば約８〜１２ｍｇ／ｍｌの濃度であり得る。

脂質は、天然に存在するＨＤＬ又は再構成された高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の機能性の生物学的に活性な成分であるいずれかの脂質であり得る。このような脂質としては、リン脂質、コレステロール、コレステロール−エステル、脂肪酸及び／又はトリグリセリドが挙げられる。好ましくは、脂質は少なくとも１つの荷電された、もしくは無荷電のリン脂質、またはそれらの混合物である。

好ましい実施態様において、本発明に従うｒＨＤＬ製剤は、界面活性剤と無荷電リン脂質との組み合わせを含む。代替の好ましい実施態様において、ｒＨＤＬ製剤は、荷電したリン脂質を含むが、界面活性剤は全く含まない。さらなる好ましい実施態様において、ｒＨＤＬ製剤は荷電した脂質及び無荷電の脂質も界面活性剤も含む。

本明細書において使用される、中性リン脂質とも呼ばれる「無荷電のリン脂質」は、生理的ｐＨでほぼゼロの正味荷電を有するリン脂質である。無荷電のリン脂質は双性イオンであり得るが、他の種類の正味中性のリン脂質が公知であり、使用され得る。「荷電したリン脂質」は、生理的ｐＨで正味荷電を有するリン脂質である。荷電したリン脂質は、単一の種類の荷電したリン脂質であっても、２つ又はそれ以上の異なる、典型的には同様の荷電したリン脂質の混合物であってもよい。いくつかの例において、荷電したリン脂質は負に荷電したリン脂質である。

本発明に従う製剤はまた、いくつかの無荷電の脂質の混合物又は無荷電の脂質と荷電した脂質の混合物のような異なる脂質の混合物を含み得る。リン脂質の例としては、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）又はそれらの天然もしくは合成の誘導体が挙げられる。天然の誘導体としては、卵ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルグリセロール、大豆ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルグリセロール、脳ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、セファリン、カルジオリピン及びリン酸ジセチルが挙げられる。合成誘導体としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジミリストリホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＭ）及びジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＭ）が挙げられる。リン脂質は、上記のリン脂質のいずれかの誘導体又は類縁体であってもよい。もっとも良好な結果は、ホスファチジルコリンで得ることができた。別の実施態様において、本発明に従う製剤中の脂質は、スフィンゴミエリン及びホスファチジルグリセロール（例えばＤＰＰＧ）のような負に荷電したリン脂質である。スフィンゴミエリン及びホスファチジルグリセロール（特にＤＰＰＧ）の混合物は、本発明における使用について具体的に想定される。これらの実施態様において、スフィンゴミエリン及びホスファチジルグリセロールは、いずれかの適切な比、例えば９０：１０〜９９：１（質量：質量）、典型的には９５：５〜９８：２、そして最も典型的には９７：３で存在し得る。

本発明に従う製剤は、典型的には、約１．０％〜約６．０％、例えば１．０、１．１、１．２又は１．３％から５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０％、好ましくは約１．０％から６．０％未満、例えば約１．０％〜５．９％（質量／ｒＨＤＬ製剤の質量）の凍結乾燥安定剤濃度を有する。好ましくは、約３．０％から６．０％未満、例えば約３．０％〜５．９％、好ましくは約４．０〜５．９％、好ましくは約４．０％〜５．５％、好ましくは４．３〜５．３％、好ましくは４．３〜５．０％、そして最も好ましくは４．６〜４．８％（質量／質量）、そして上記製剤において、アポリポタンパク質と脂質との間の比は、好ましくは約１：２０〜約１：７５、より好ましくは約１：４５〜約１：６５（ｍｏｌ：ｍｏｌ）である。凍結乾燥安定剤は、好ましくは、場合によりマンニトールもしくはソルビトールのような糖アルコール、又はプロリンのようなアミノ酸と組み合わせた、糖類（例えば、スクロース）である。

好ましい実施態様において、本発明に従うｒＨＤＬ製剤は、６〜８の範囲、好ましくは７〜８の範囲内のｐＨを有する。なおより好ましくは、ｐＨは７．３〜７．７の範囲である。

本発明の好ましい実施態様において、製剤は凍結乾燥されている。凍結乾燥安定剤、好ましくはアポリポタンパク質：脂質比と組み合わせた、スクロース、スクロース及びマンニトール、又はスクロース及びプロリンの存在に起因して、凍結乾燥により、長い貯蔵寿命を有する安定な粉末が得られる。この粉末は貯蔵されても、そのままもしくは粉末としての貯蔵後に使用されてもよく、又は再水和後に使用されて再構成された高密度リポタンパク質製剤を形成してもよい。

本発明は、再構成高密度リポタンパク質の大規模製造のために使用され得る。凍結乾燥された製品は、大量生産で製造されても、あるいは、混合されたタンパク質／脂質溶液が、凍結乾燥前により小さな容器（例えば単回用量単位）に分配されてもよく、そしてこのようなより小さな単位は滅菌単位投薬形態として使用され得る。凍結乾燥された製剤は、再構成された高密度リポタンパク質であるタンパク質−脂質複合体の液剤又は懸濁剤を得るために再構成され得る。凍結乾燥された粉末は、水溶液を用いて再水和されて適切な体積にされる。好ましい水溶液は、注射用水（ＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水又は生理食塩水である。再水和を促進するために混合物を撹拌し得る。好ましくは、再構成工程は室温で行われる。

ＷＯ ２０１２／００００４８に記載されるような、脂質及びアポリポタンパク質を含む液剤を得る方法は当業者に周知である。

１つの好ましい実施態様において、本発明は、濃度が約１．０％〜約６．０％（質量／ｒＨＤＬ製剤の質量）（例えば、１．０、１．１、１．２又は１．３から５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０）に達するまで、脂質及びアポリポタンパク質を含む溶液に凍結乾燥安定剤を加える工程を含む、ｒＨＤＬ製剤を製造する方法を提供する。好ましい実施態様において、凍結乾燥安定剤は、約１．０％から６．０％未満、例えば約１．０％〜５．９％の濃度に達するまで加えられる。好ましくは、凍結乾燥安定剤は、約３．０から６．０％未満、例えば約３．０〜５．９％の濃度に達するまで加えられる。より好ましくは、凍結乾燥安定剤は、約４．０〜５．５％、特に４．３〜５．３％、より特に４．３〜５．０％、そして最も好ましくは４．６〜４．８％（質量／質量）の濃度に達するまで加えられる。溶液は既に安定剤を含有していてもよい。

好ましい実施態様において、溶液はコール酸ナトリウムのような界面活性剤をさらに含む。好ましい実施態様において、ｒＨＤＬ製剤は、血漿から精製されたアポＡ−Ｉを、約１．０％〜約６．０％、好ましくは約１．０％から６．０％質量／質量未満の濃度の、コール酸ナトリウム及びスクロースの存在下にてホスファチジルコリン（ＰＣ）と混合して、円盤形の非共有結合で結合した粒子（分子量約１４４ｋＤａ）を生成することにより製造される。

特定の実施態様において、ｒＨＤＬ製剤は、アポＡ−Ｉ（組み換え体又は血漿から精製）並びに約１．０％〜約６．０％質量／質量、好ましくは約１．０％から６．０％未満の濃度のコール酸塩及びスクロースにより安定化されたホスファチジルコリンから構成される。特定の実施態様において、コール酸塩レベルは約０．５〜約１．５ｍｇ／ｍＬである。好ましくは組換えアポＡ−Ｉは、野生型配列又はＭｉｌａｎｏ配列（発現された場合に二量体を形成する）のいずれかを含む。

本発明の凍結乾燥されたｒＨＤＬ製剤は、当該分野で公知の凍結乾燥のいずれかの方法を使用して形成され得、これらの方法としては、限定されないが、フリーズドライが挙げられ、すなわち、アポリポタンパク質／脂質含有溶液を凍結後に減圧エバポレーションにかける。

得られる凍結乾燥されたｒＨＤＬ製剤は、実質的にそれらの元の安定性特徴を、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６ヶ月又はそれ以上保持し得る。例えば、２〜８℃又は２５℃で貯蔵された凍結乾燥されたｒＨＤＬ製剤は、６ヶ月又はそれ以上貯蔵された場合に、ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより測定して、実質的に同じ分子サイズ分布を典型的に保持し得る。ｒＨＤＬ製剤の特定の実施態様は、２〜８℃及び／又は室温で貯蔵された場合に、少なくとも６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月又はそれ以上でさえ、安定でかつ商用医薬品に適切であり得る。

本発明に従うｒＨＤＬ製剤は、ヒトにおける疾患、障害又は状態を予防又は処置する際に使用され得る。適切には、疾患、障害又は状態は、本発明に従うｒＨＤＬ製剤の予防的又は治療的投与に対して応答性である。このような疾患、障害又は状態の例としては、アテローム性動脈硬化症；心血管疾患（例えば、狭心症及び心筋梗塞のような急性冠症候群（ＡＣＳ））；又はＡＣＳの素因になる糖尿病のような疾患、障害もしくは状態；高コレステロール血症（例えば、上昇した血清コレステロール又は上昇したＬＤＬコレステロール）及びタンジール病の症状を示すような減少したレベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の結果として生じた低コレステロール血症が挙げられる。

本発明に従うｒＨＤＬ製剤は、当該分野で公知のいずれかの投与経路により投与され得る。好ましくは、ｒＨＤＬ製剤は、静脈内（ＩＶ）注入又は注射のように、非経口投与される。好ましい実施態様において、ｒＨＤＬ製剤は、ＩＶ注入に適した粒子を形成するように再構成されたアポＡ−Ｉ（組み換え体又は血漿から精製）を含む。

ｒＨＤＬ製剤の投与される投薬量は、約１〜約１２０ｍｇ／体重ｋｇの範囲であり得る。好ましくは、投薬量は、８ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、及び７０ｍｇ／ｋｇの投薬量を含めて、約５〜約８０ｍｇ／ｋｇの範囲である。あるいは、送達は、ｒＨＤＬの固定投薬量により、すなわち、患者の体重とは独立した量で達成され得る。好ましい固定投薬量としては、アポリポタンパク質０．１〜１５ｇ、０．５〜１２ｇ、１〜１０ｇ、２〜９ｇ、３〜８ｇ、４〜７ｇ又は５〜６ｇが挙げられる。特に好ましい固定投薬量としては、アポリポタンパク質１〜２ｇ、３〜４ｇ、５〜６ｇ又は６〜７ｇが挙げられる。特定の固定投薬量の非限定的な例としては、アポリポタンパク質０．２５ｇ、０．５ｇ、１．０ｇ、１．７ｇ、２．０ｇ、３．４ｇ、４．０ｇ、５．１ｇ、６．０ｇ、６．８ｇ及び８．０ｇが挙げられる。従って、バイアルは、好ましくは、バイアルあたり０．２５ｇ、０．５ｇ、１、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、８又は１０ｇのタンパク質含有量を有する凍結乾燥されたｒＨＤＬ製剤を含む。より好ましくは、タンパク質含有量は、バイアルあたり０．５、１、２、４、６、８、又は１０ｇのいずれかである。

本発明はまた、本明細書に開示されるアポリポタンパク質製剤の１つ又はそれ以上の単位用量及び１つ又はそれ以上の他のキット構成要素を含むアポリポタンパク質キットを提供する。

適切には、このキットは、本明細書において以前に記載されたような、ヒトにおける疾患、障害又は状態を予防的又は治療的に処置するためのものである。

１つ又はそれ以上の他のキット構成要素の非限定的な例としては、使用のための指示書；各々の単位用量を含有するバイアル、コンテナーもしくは他の貯蔵容器；針、カテーテル、注射器、チューブなどのような送達デバイス；及び／又はキットを安全にかつ都合よく貯蔵及び／若しくは輸送するために適したパッケージングが挙げられる。好ましくは、使用のための指示書は、ラベル又は添付文書であり、ここでラベル又は添付文書は、アポリポタンパク質製剤が、それを必要とするヒト被験体に固定用量を投与することにより、心血管疾患のような疾患又は状態を処置するために使用され得るということを示す。

「添付文書」は、アポリポタンパク質製剤のコマーシャルパッケージに含まれる指示書を指し、上記アポリポタンパク質製剤の使用に関する適応症、用法、投薬量、投与、禁忌及び／又は警告についての情報を含む。

本明細書における目的のために、「バイアル」は、アポリポタンパク質製剤を保持する容器を指す。バイアルは、注射器により穿刺可能なストッパにより密封され得る。一般に、バイアルはガラス材料から形成される。バイアル中のアポリポタンパク質製剤は、液体、統括乾燥、凍結などを含む様々な状態であり得る。固定投薬量アポリポタンパク質製剤は、好ましくは、濁度が好ましい基準であるほどには安定である。約５、１０、１５、２０、又は３０ＮＴＵ未満の濁度レベルが、一般的には安定投薬量アポリポタンパク質製剤とみなされ得る。濁度測定は、０時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、７２時間、７日間、及び１４日間のような期間にわたって、室温又は２〜８℃のような貯蔵温度でアポリポタンパク質をインキュベートすることにより行われ得る。好ましくは、アポリポタンパク質製剤は、それが１４日間室温で貯蔵され、かつ約１５ＮＴＵ未満の濁度を示す場合に、液体として安定であるとみなされる。

キットは、医療従事者によるアポリポタンパク質製剤の投与、又は患者もしくは介護者による自己投与を容易にし得る。

本明細書で使用される用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」も「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」も包含し、例えば、Ｘを「含む」と記載される製剤又は製剤の成分は、全くＸのみだけからなるものであっても、追加のもの（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含んでいてもよい。

数値ｘに関連する用語「約」は、例えばｘ±１０％を意味する。

語「実質的に」は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないものであってもよい。必要な場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

本発明が複数の連続した工程を含む方法を提供する場合、本発明は、工程の総数未満を含む方法も提供し得る。異なる工程は、異なる場所において（例えば、異なる国において）異なる人々により全く異なる時点で行われ得る。

具体的に記載されていなければ、２つ又はそれ以上の成分を混合する工程を含む方法は、いずれかの特定の混合順序を必要としない。従って、成分はいずれの順序でも混合され得る。３つの成分がある場合、２つの成分が互いに混合され得、次いでこの組み合わせが第三の成分と混合され得るなど。

本発明の様々な実施態様が本明細書に記載される。当然のことながら、各実施態様において記載される特徴は、他の記載される特徴と組み合わされてさらなる実施態様を提供し得る。特に、適切、典型的又は好ましいと本明細書において強調される実施態様は、互いに組み合わされ得る（それらが互いに排他的である場合を除く）。

５〜１０％ 質量／質量スクロースを含有する製剤の分子サイズ分布。 ４及び７．５％質量／質量スクロースを含有する製剤の分子サイズ分布の直接比較。 １、２、３、４及び７．５％（質量／質量）スクロースを含有する製剤の分子サイズ分布。 スクロース及びプロリン並びに７．５％スクロースを含有する製剤の分子サイズ分布。 ４〜１０％ 質量／質量スクロース製剤についてのＬＣＡＴ活性。 ４〜１０％ 質量／質量スクロース製剤についてのＬＣＡＴ活性。 １、２、３、４及び７．５％質量／質量スクロース製剤についてのＬＣＡＴ活性。 スクロース及びプロリンを含有する製剤についてのＬＣＡＴ活性。 コレステロール流出に対するスクロース濃度の影響。 コレステロール流出に対するスクロース濃度の影響。 コレステロール流出に対するスクロース及びプロリンを含有する製剤の影響。 異なるスクロース濃度を有する製剤並びにスクロース及びプロリンを含有する製剤の濁度。 異なるスクロース濃度を有する製剤並びにスクロース及びプロリンを含有する製剤の濁度。 異なるスクロース濃度を有する製剤並びにスクロース及びプロリンを含有する製剤の濁度。 異なるスクロース濃度を有する製剤並びにスクロース及びプロリンを含有する製剤の濁度。 異なるスクロース濃度を有する製剤並びにスクロース及びプロリンを含有する製剤の濁度。 異なるスクロース濃度を有する製剤並びにスクロース及びプロリンを含有する製剤の濁度。 異なるスクロース濃度を有する製剤並びにスクロース及びプロリンを含有する製剤の濁度。 異なるスクロース濃度を有する製剤並びにスクロース及びプロリンを含有する製剤の濁度。 異なるスクロース濃度を有する凍結乾燥（ｌｙｏ）ケーキの写真。 異なるスクロース濃度並びにスクロース及びプロリンを有する凍結乾燥ケーキの写真。

〔実施例〕
実施例１：サンプルの製造
以下の実験のためのサンプルを作製するために、コール酸ナトリウム（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を緩衝液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）に溶解し、そして透明になるまで撹拌した。大豆ホスファチジルコリン（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ＧｍｂＨ）を、適切な体積のコール酸塩に加え、そして１６時間室温で撹拌した。アポＡ−Ｉ溶液を、１０ｍＭ ＮａＣｌを用いて９．０ｍｇ／ｍＬ（ＯＤ２８０により決定）のタンパク質濃度まで希釈し、そして適切な体積の脂質溶液と混合し、１：４５〜１：６５の範囲のタンパク質対脂質比を得た。この混合物を２〜８℃で３０分間から１６時間撹拌した。ＨＤＬミメティックを、ダイアフィルトレーション緩衝液として１％スクロースを使用してコール酸塩透析により調製した。溶出液を、３３〜３８ｇタンパク質／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮した。スクロースを所望の濃度（１％、２％、３％、４％、５％、６．５％、７％、１０％質量／質量）が得られるまで加えた。溶液のｐＨを、０．２Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５０±０．１に調整し、その後、ＷＦＩ（注射用水）を加えて３０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。次いで、最終製剤を、０．２＋０．１μｍフィルターに通して滅菌ろ過し、そして１００ｍＬガラスバイアルにバイアルあたり１．７ｇタンパク質で充填して凍結乾燥した。

いくつかの製剤において、プロリンを所望の濃度まで加えた。プロリンは等張製剤を維持する。

実施例２：分子サイズ分布
粒子形成をＨＰＬＣ−ＳＥＣを使用して決定し、そして様々な製剤の分子サイズ分布により評価した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）をＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ＨＲ １０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１４０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１０ ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム、０．０２％ ＮａＮ３、ｐＨ７．４を用いて、０．５ｍｌ／分の流量で行った。約９０μｇタンパク質のサンプルをアプライし、そして溶出プロファイルを２８０ｎｍで記録した。

最終製剤において５〜１０％質量／質量スクロースを含有する製剤について差がほとんど観察されず（図１）、５％質量／質量以上のスクロースを含有する製剤が再構成後の粒子安定性に影響を及ぼさなかったということを示唆した。図１は、（１）内部コントロール、２：５％質量／質量スクロース、３：６．５％質量／質量スクロース、４：７．５％質量／質量スクロース及び５：１０％質量／質量スクロースの完全なクロマトグラムを示す。

さらに、７．５％質量／質量スクロースと４％質量／質量スクロースとの間の直接比較は、これらの製剤が同様の分子サイズ分布を示すということを実証した（図２Ａ）。

図２Ｂ及び２Ｃは、スクロース濃度１、２、３、及び４％（質量／質量）並びにスクロース及びプロリンを含む製剤についての結果を示す。

全ての試験された製剤は安定である。４〜７．５％質量／質量のスクロース顔料は最適であり、再構成後の粒子安定性に影響を及ぼさなかった。

実施例３：ＬＣＡＴ活性化
様々な製剤中のｒＨＤＬ中止の有効性の尺度を、ＬＣＡＴ活性を測定することにより決定した。ＨＤＬ粒子は、ＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）との相互作用により、動脈壁に沿って形成されるプラーク又は細胞からコレステロールを捕捉することができる。血漿酵素のレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）は、遊離コレステロールをコレステリルエステル（コレステロールのより疎水性の形態）に変換し、次いでこれが代謝される肝臓へ輸送される前にＨＤＬ粒子のコアに捕捉される。最終製剤中のスクロース含有量がｒＨＤＬ粒子の有効性に影響を及ぼした場合、ＬＣＡＴ活性は減少するだろう。

レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性エステル化を、Ｓｔｏｋｋｅ及びＮｏｒｕｍに記載されるように（Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．１９７１；２７（１）：２１−７）アッセイした。プールしたヒト血漿１５０μｌ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ）を、１０μｌ ｒＨＤＬサンプル及び１５０μｌ ＰＢＳとともに、２０μｌ ［４−１４Ｃ］コレステロール（７．５μＣｉ／ｍｌ）の存在下で１．５時間４℃にてインキュベートした。コレステロールのエステル化を開始するために、反応混合物の半分を３７℃で３０分間おいて、一方で残りの半分をさらに４℃で３０分間インキュベートした（バックグラウンドノイズを決定するため）。両方のサンプルについて、コレステロール及びコレステリルエステルを、ｎ−ヘキサンを用いて液液抽出により抽出した。コレステリルエステルを、固相抽出カラム（ＳａｍｐｌｉＱ アミノ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、そしてシンチレーション計数により測定して、非エステル化コレステロールから分離した。４℃で貯蔵したサンプルの計数率を、３７℃で貯蔵したサンプルの計数率から差し引いた。同じ手順を参照サンプルでも行った。ＬＣＡＴ活性を参照サンプルの％として表す。

図３Ａ及び３Ｂは、４〜１０％ 質量／質量スクロース製剤についてのＬＣＡＴ活性を示す。図３Ｃは、１〜４％ 質量／質量スクロース製剤についてのＬＣＡＴ活性を示す。最終製剤においてスクロースが５〜１０％ 質量／質量の範囲に及ぶ場合はＬＣＡＴ活性において非常に小さい差異しか見られないが（図３Ａ）、スクロースがさらに４％ 質量／質量まで減少される場合はわずかな減少傾向が明らかである（図３Ｂ）。図３Ｄは、スクロース及びプロリンを含む製剤についてのＬＣＡＴ活性を示す。ＬＣＡＴ活性において、スクロース及びプロリンを含有する製剤については明らかな傾向は観察されなかった。従って、スクロースプロリン製剤におけるＨＤＬ粒子の有効性は維持される。

実施例４：コレステロール流出
コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）は、蓄積されたコレステロールが分泌のために血管壁から肝臓に輸送される経路である。細胞は、遊離コレステロールを脂質欠乏アポＡ−ＩにＡＢＣＡ１経路を介して流出する。コレステロール流出アッセイは、細胞から放出されたコレステロールを受容するＨＤＬの能力を測定する。スクロース含有量が粒子形成及び／又は完全性に影響を及ぼす場合、差異はコレステロール流出に影響を及ぼすだろうと予測される。

マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４及びＲＡＷ ２６４．７からのコレステロール流出は、ｃＡＭＰ刺激に高度に応答性であり、これによりＡＢＣＡ１が上方調節される（Ｂｏｒｔｎｉｃｋ ｅｔ．ａｌ．，．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００；２７５（３７）：２８６３４−４０）。ＲＡＷ２６４．７細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。細胞を、１０％（体積／体積）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）中で加湿ＣＯ₂インキュベーターにて３７°で培養した。流出実験のために、細胞を２４ウェルプレートに１ウェルあたり０．３５ｘ１０⁶細胞の密度で播種した。後日、細胞を［１，２−³Ｈ］コレステロール（１μＣｉ／ｍＬ、ＧＥ）で、５％（体積／体積）ＦＣＳを追加したＤＭＥＭ中で標識した。３６時間の標識期間後に、細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、０．２％脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＤＭＥＭ中で０．３ｍＭ ８−ブロモアデノシン３’，５’−環状一リン酸ナトリウム塩−ｃＡＭＰ（８Ｂｒ−ｃＡＭＰ）の存在下又は存在しない場合に１６時間インキュベートしてＡＢＣＡ１を上方調節した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を様々なコレステロールアクセプターとともにＤＭＥＭ／０．２％無脂肪酸ＢＳＡ培地中でインキュベートした。５〜６時間のインキュベーション後に、プレートを５００ｇで１０分間遠心分離して、浮遊細胞及び細胞デブリを除去した。細胞上清中の放射能を、液体シンチレーション計数により測定した。総細胞結合［³Ｈ］コレステロールを、コントロールウェル中の細胞を少なくとも３０分間０．１Ｍ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で抽出した後に決定した。コレステロール流出を、細胞及び培地における総放射能と比較して、培地中に放出された放射能のパーセンテージとして表した。コントロールと８Ｂｒ−ｃＡＭＰ刺激細胞との間の流出の差異を、ＡＢＣＡ１依存性流出の尺度とみなした。

図４Ａ及び４Ｂは、スクロース濃度が７．５％質量／質量から４％質量／質量へと減少するにつれて、コレステロール流出が増加したということを示す。プロリン含有製剤と７．５％スクロース製剤との間にコレステロール流出の明らかな差異は観察されなかった（図４Ｃ）。

実施例５：濁度
用語濁度は、溶液の混濁又はかすみを記載するために使用される。厳密には、濁度は、溶液中に存在する要素による可視光の多重散乱事象により生じる。濁度は正味の散乱光から生じるので、サンプル経路長、タンパク質濃度、及びタンパク質／凝集体／粒子のサイズに依存する。全ての減少したスクロースの製剤が再構成の際に同じタンパク質濃度を含有し、かつ同じ経路長で測定されたことを考慮すると、濁度の差異は、様々なスクロース製剤から生じたタンパク質／凝集体／粒子のサイズ及び／又は数の差異に起因し得る。

ＬＥＤ比濁計（Ｈａｃｈ ２１００ＡＮ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｉｍｅｔｅｒ、Ｌｏｖｅｌａｎｄ、ＣＯ．）を用いて、ホルマシン（ｆｏｒｍａｃｉｎ）を標準として使用して濁度を決定した。結果を相対的光散乱として示す（ＮＴＵ）。

４〜１０％質量／質量スクロースを含有する製剤は、再構成の際に同様の濁りの溶液を生じた（図５Ａ及び５Ｂ）。４％未満のスクロース濃度は増加した濁度を示した（図５Ｅ及び５Ｇ）。濁度に基づいて、４％（質量／質量）及びそれより高いスクロース濃度が最適である。

貯蔵の際の溶液の濁度の相対的増加は、タンパク質生物製剤における凝集の指標としてしばしば引用される。図５Ｃ、５Ｄ、５Ｆ及び５Ｈは、液体形態での貯蔵の際に濁度の増加が殆ど無いか全くないことを示し、それにより粒子の安定性を示している。

実施例６：凍結乾燥ケーキ外観
４％ 質量／質量及び７．５％ 質量／質量スクロースを含むスクロース製剤は、最も安定な凍結乾燥ケーキを生じた（図６）。

１〜４％ 質量／質量を含むスクロース製剤、並びにスクロース及びプロリンを含有する製剤もまた、安定な凍結乾燥ケーキを生じた（図７）。

実施例７：ｒＨＤＬ製剤の安定性
凍結乾燥されたｒＨＤＬ製剤（実施例１に従って製造された）の安定性を、４０℃で１２週間の貯蔵（光から保護）の前及び後に調べた。試験したパラメータは、ｐＨ、濁度、ＬＣＡＴ活性化、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ（凝集体含有量、単一ピーク中のリポタンパク質％及びその相対的保持時間）及びコレステロール流出（Ｃ−流出）（表１及び２）を含んでいた。結果は、製剤が貯蔵期間にわたって安定なままであることを示す。

Claims (53)

1. アポリポタンパク質、脂質及び凍結乾燥安定剤を含む再構成された高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）製剤であって、ここでアポリポタンパク質と脂質との間の比は約１：２０〜約１：１２０（ｍｏｌ：ｍｏｌ）であり、そして凍結乾燥安定剤は約１．０％から６．０％未満（ｒＨＤＬ製剤の質量／質量）の濃度で存在する、上記ｒＨＤＬ製剤。
2. アポリポタンパク質と凍結乾燥安定剤との間の比が、約１：１（質量：質量）〜約１：７（質量：質量）である、請求項１に記載のｒＨＤＬ製剤。
3. アポリポタンパク質と凍結乾燥安定剤との間の比が約１：１（質量：質量）〜約１：３（質量：質量）である、請求項２に記載のｒＨＤＬ製剤。
4. アポリポタンパク質と凍結乾燥安定剤との間の比が約１：１（質量：質量）〜約１：２．４（質量：質量）である、請求項３に記載のｒＨＤＬ製剤。
5. アポリポタンパク質と凍結乾燥安定剤との間の比が約１：１（質量：質量）から１：２（質量：質量）未満である、請求項４に記載のｒＨＤＬ製剤。
6. 凍結乾燥安定剤が、約１．０〜５．９％（質量／質量）の濃度で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
7. 凍結乾燥安定剤が約３．０〜５．９％（質量／質量）の濃度で存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
8. 凍結乾燥安定剤が約４．０〜５．５％（質量／質量）の濃度で存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
9. 凍結乾燥安定剤が４．３〜５．３％（質量／質量）の濃度で存在する、請求項８に記載のｒＨＤＬ製剤。
10. 凍結乾燥安定剤が４．６〜４．８％（質量／質量）の濃度で存在する、請求項９に記載のｒＨＤＬ製剤。
11. 凍結乾燥安定剤が糖類、糖アルコール、アミノ酸又はそれらの混合物を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
12. 糖類が単糖類、二糖類又は三糖類である、請求項１１に記載のｒＨＤＬ製剤。
13. 糖類が二糖類である、請求項１２に記載のｒＨＤＬ製剤。
14. 二糖類が、スクロース、フルクトース、トレハロース、マルトース又はラクトースである、請求項１３に記載のｒＨＤＬ製剤。
15. 二糖類がスクロースである、請求項１４に記載のｒＨＤＬ製剤。
16. 糖アルコールが、マンニトール、イノシトール、キシリトール、ガラクチトール又はソルビトールである、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
17. 糖アルコールがマンニトールである、請求項１６に記載のｒＨＤＬ製剤。
18. アミノ酸が、プロリン、グリシン、セリン、アラニン、リジン、４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸ナトリウム、リジン塩酸塩、サルコシン、又はγアミノ酪酸である、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
19. アミノ酸がプロリンである、請求項１８に記載のｒＨＤＬ製剤。
20. 凍結乾燥安定剤が糖類を含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
21. 凍結乾燥安定剤が糖アルコールを含む、請求項１１及び１６〜１７のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
22. 凍結乾燥安定剤がアミノ酸を含む、請求項１１及び１８〜１９のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
23. 凍結乾燥安定剤が糖類及び糖アルコールの混合物を含む、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
24. 糖類及び糖アルコールが、約１：１（質量：質量）〜約３：１（質量：質量）の比で混合される、請求項２３に記載のｒＨＤＬ製剤。
25. 糖類及び糖アルコールが２：１（質量：質量）未満の比で混合される、請求項２６に記載のｒＨＤＬ製剤。
26. 凍結乾燥安定剤が糖類及びアミノ酸の混合物を含む、請求項１１〜１５及び１８〜１９のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
27. 凍結乾燥安定剤が１％スクロース及び２．２％プロリン（質量／質量）を含む、請求項２６に記載のｒＨＤＬ製剤。
28. 凍結乾燥安定剤が３％スクロース及び１．５％プロリン（質量／質量）を含む、請求項２６に記載のｒＨＤＬ製剤。
29. 凍結乾燥安定剤が４％スクロース及び１．２％プロリン（質量／質量）を含む、請求項２６に記載のｒＨＤＬ製剤。
30. 凍結乾燥安定剤が糖アルコール及びアミノ酸の混合物を含む、請求項１１、及び１６〜１９のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
31. 界面活性剤をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
32. 界面活性剤がコール酸ナトリウムを含む、請求項３１に記載のｒＨＤＬ製剤。
33. アポリポタンパク質と脂質との間の比が約１：２０〜約１：１００（ｍｏｌ：ｍｏｌ）である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
34. アポリポタンパク質の濃度が約５〜約５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
35. アポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
36. アポＡ−Ｉが血漿から精製される、請求項３５に記載のｒＨＤＬ製剤。
37. アポＡ−Ｉが、好ましくは野生型又はＭｉｌａｎｏ配列を含む組み換え体である、請求項３５に記載のｒＨＤＬ製剤。
38. アポリポタンパク質がアポリポタンパク質のフラグメントである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
39. 脂質が、少なくとも１つの荷電した、もしくは無荷電のリン脂質又はそれらの混合物、又は好ましくはホスファチジルコリンを含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
40. アポリポタンパク質が血漿から精製されたアポＡ−Ｉであり、脂質がホスファチジルコリンであり、凍結乾燥安定剤がスクロースであり、かつ製剤がコール酸ナトリウム界面活性剤をさらに含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
41. アポリポタンパク質と脂質の間の比が、１：４５〜１：６５（ｍｏｌ：ｍｏｌ）であり；凍結乾燥安定剤が４．６〜４．８％（質量／質量）の濃度で存在し；かつコール酸ナトリウムが０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項４０に記載のｒＨＤＬ製剤。
42. アポリポタンパク質が組換えアポＡ−Ｉであり、脂質がスフィンゴミエリン及びホスファチジルグリセロールの混合物であり、かつ凍結乾燥安定剤がスクロース及びマンニトールの混合物である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
43. アポリポタンパク質と脂質との間の比が１：８０〜１：１２０（ｍｏｌ：ｍｏｌ）であり、スフィンゴミエリン及びホスファチジルグリセロールが９０：１０〜９９：１（質量：質量）の比で存在し、そしてスクロース及びマンニトールが２：１（質量：質量）未満の比で混合される、請求項４２に記載のｒＨＤＬ製剤。
44. ６〜８の範囲のｐＨを有する、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
45. 凍結乾燥されている、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
46. 請求項４５に記載の凍結乾燥されたｒＨＤＬ製剤を含むバイアルであって、ここでタンパク質含有量が、バイアルあたり１、２、４、６、８、又は１０ｇである、上記バイアル。
47. アポリポタンパク質、脂質及び凍結乾燥安定剤を含むｒＨＤＬ製剤の製造方法であって、アポリポタンパク質と脂質との間の比は１：２０〜１：１２０（ｍｏｌ：ｍｏｌ）であり、脂質、及びアポリポタンパク質を含む溶液に約１．０％から６．０％（質量／質量）未満の濃度に達するまで凍結乾燥安定剤を加える工程を含む、上記方法。
48. ヒトにおける疾患、障害又は状態を処置する際の使用のための、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤。
49. 疾患、障害又は状態が、心血管疾患、高コレステロール血症又は低コレステロール血症を含む、請求項４８に記載の使用のためのｒＨＤＬ製剤。
50. 疾患、障害又は状態が、急性冠症候群（ＡＣＳ）、アテローム性動脈硬化症、狭心症及び心筋梗塞を含む、請求項４９に記載の使用のためのｒＨＤＬ製剤。
51. 請求項１〜４５のいずれか１項に記載のｒＨＤＬ製剤をヒトに投与し、それによりヒトにおける疾患、障害又は状態を予防又は処置することを含む、ヒトにおける疾患、障害又は状態を予防又は処置する方法。
52. 疾患、障害又は状態が、心血管疾患、高コレステロール血症又は低コレステロール血症を含む、請求項５１に記載の方法。
53. 疾患、障害又は状態が、急性冠症候群（ＡＣＳ）、アテローム性動脈硬化症、狭心症及び心筋梗塞を含む、請求項５２に記載の方法。