CN110172093A - 制备载脂蛋白a-i的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从含Apo A‑I的蛋白质级分(A)获得Apo A‑I的方法，包括悬浮含Apo A‑I的蛋白质级分(A)在缓冲溶液(B)中，从悬浮液中除去杂质，同时保持增溶的Apo A‑I蛋白质，随后从悬浮液中沉淀Apo A‑I和收集Apo A‑I沉淀物。通过这样的方法获得的Apo A‑I，由这种Apo A‑I获得的重构的高密度脂蛋白，和包括这样的Apo A‑I和/或重构的高密度脂蛋白等的药物组合物也被提供。

Description

制备载脂蛋白A-I的方法
本申请是申请号为201480032030.9、申请日为2014年6月5日、发明名称为“制备载脂蛋白A-I(Apo A-I)的方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及从含有Apo A-I的蛋白质级分回收载脂蛋白A-I(Apo A-I)的方法。
背景技术
人载脂蛋白A-I是(HDL)的主要蛋白质组分，其是在血液中的重要脂蛋白。它是由肝脏和小肠合成并负责的HDL在血中的生理功能；从外周组织去除胆固醇，将其运载回肝脏或其它脂蛋白，这通过被称为“反向胆固醇运输”(RCT)的机制。
根据流行病学和纵向研究，血清胆固醇水平的升高和冠状动脉心脏疾病的发展之间的明显的相关性已被多次证实。
因此，高密度脂蛋白(HDL)中的Apo A-I被认为具有抗炎功能和抑制冠心病的发生和发展。此外，Apo A-I已经显示出降低血液中低密度脂蛋白(LDL)水平和已知结合到内毒素，从而在高密度脂蛋白的抗内毒素作用中具有主要作用。
高密度脂蛋白和Apo A-I的“保护性”的作用作为其主要性质已在多项研究中被证实，使得Apo A-I成为有希望的候选物(特别是作为重构的HDL的一部分)，用于在动脉粥样硬化治疗，急性冠脉综合征的治疗(ACS)，抗炎治疗，抗毒素治疗，肝靶向药物等中的应用。
现今人血浆大量被收集和处理成各级分，其中一些含有载脂蛋白A-I。所述级分可能由乙醇分级分离根据在美国最初开发和称为科恩或科恩-Oncley方法的方法来制备[E.J.Cohn等人,J.Am.Chem.Soc.68,459-475,1946；J.L.Oncley等人,J.Am.Chem.Soc.71,541-550,1949]。含有载脂蛋白的血浆组分也可通过这种方法的一个变体，Kistler-Nitschmann方法来制备[H.Nitschmann等人,Helv.Chim.Acta 37,866-873,1954；P.Kistler and H.Nitschmann,Vox Sang 7,414-424,1962]。这两种方法都基于示差沉淀醇。
各种方法已在文献中被描述从乙醇沉淀级分回收载脂蛋白A-I：
例如，US5089602涉及通过再悬浮级分在pH范围为3至5或6至9的含水缓冲溶液，从人血浆或血清级分制备载脂蛋白。通过加入短链脂肪醇析出不良污染物。使用了含有高乙醇浓度的(68-96％乙醇)缓冲液进行沉淀污染物。通过升高的温度，微碱性pH值，或者通过加入离液剂或表面活性物质(其随后通过凝胶过滤除去)抑制脂蛋白的潜在聚合。阴离子交换层析步骤被包括以结合污染物，而载脂蛋白通过。
Kim等人，Manufacturing and Shelf Stability of Reconstituted High-density Lipoprotein for Infusion Therapy,Biotechnology and BioprocessEngineering 16,785-792(2011)公开了使用含有在6M的浓度的脲的提取缓冲液。
上述两种方法的组合在WO 98/07751被说明为用于从人血浆中回收载脂蛋白A(Apo A-I)或载脂蛋白E(ApoE)。所述文献公开了一种方法，其包括通过使用含有8M脲素的提取缓冲液中的至少一个预纯化步骤，使用阴离子交换层析的进一步纯化步骤。在WO 98/07751中，由使用含有20％乙醇的提取缓冲液的实验导致Apo A-I的1％的回收率。WO2009/025754教导从α-1抗胰蛋白酶分离Apo A-I的方法，包括使用较低的乙醇浓度(8至14％)，以沉淀Apo A-I。
其他方法，如超高速离心机和高效液相色谱(HPLC)也可用于回收Apo A-I。然而，Apo A-I的制备是非常耗时和仅少量的Apo A-I可以通过这些方法来制备。这些方法因此不适合于Apo A-I的工业生产。
因此，仍然需要一种用于从含Apo A-I的蛋白质级分提取和回收Apo A-I的方法，其是适合于大规模生产，并且其允许以高产率获得Apo A-I。
发明内容
本文提供的是从含Apo A-I的蛋白质级分(A)获得Apo A-I的方法，包括：a)悬浮含Apo A-I的蛋白质级分于缓冲溶液，其含有15至30％的直链的或支链C1至C4醇(w/w)以形成悬浮液，其中所述悬浮的含Apo A-I的蛋白质级分(A)具有6.4至10.0的范围的pH，(b)从所述悬浮液中除去杂质，同时保持Apo A-I蛋白溶解(增溶)，(C)从悬浮液沉淀Apo A-I，以及(d)收集所述的Apo A-I沉淀物。
在一些实施方案中，缓冲溶液包括20％(w/w)的直链或支链C1至C4醇。在一些实施方案中，悬浮的含Apo A-I的蛋白质级分(A)具有从8.1到8.5的范围的pH。在一些实施方案中，悬浮的含Apo A-I的蛋白质级分(A)具有7.0至7.6的范围的pH。在一些实施例中，缓冲溶液包含5mM至35mM的NaHCO3。在一些实施方案中，直链或支链C1至C4醇是乙醇。
在一些实施方案中，Apo A-I蛋白质级分与缓冲溶液的体积比在步骤(a)中是从1：1到1：5。
在一些实施方案中，在步骤(a)形成的所述悬浮液具有小于5mS/cm的电导率。
在一些实施方案中，在步骤(b)中，通过加入直链或支链的C1至C4醇至45至65％(w/w)的醇浓度导致沉淀，除去杂质。在一些实施方案中，在步骤(b)加入的直链或支链的C1至C4醇具有约-5℃至15℃的温度。在一些实施方案中，在步骤(b)沉淀的杂质从所述悬浮液中通过过滤，离心，倾析，超滤和/或沉降而除去。
在一些实施方案中，在步骤(c)中，悬浮液的pH调节为4.6至5.6的范围内。在一些实施方案中，在步骤(c)中，该悬浮液具有 的温度以用于Apo A-I的沉淀。
在任何实施例中，该方法可以进一步包括步骤(e)，其中，例如通过加入醇例如在为约40％至约96％(w/w)乙醇范围内的浓度的乙醇，使得所收集的Apo A-I的沉淀物脱脂(去脂)。在具体实施方案中通过加入乙醇至浓度为约40％，或者约50％使得所收集的ApoA-I的沉淀物脱脂。乙醇可以是任何药物级乙醇。在本发明的具体实施方案中乙醇是95％的药物级乙醇(含有5％甲醇的3A)。
根据一些实施例，该方法以至少0.50克/升血浆的产率生产纯化Apo A-I。
在本发明的另一个方面，提供了纯化Apo A-I，其包括：(a)小于0.3毫克(mg)的IgA每克的Apo A-I。
还提供了通过如本文所述任何方法获得的Apo A-I，包括这样的Apo A-I和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物和/或生产这种组合物的方法。
还提供了从通过如本文所述任何方法获得的Apo A-I制备的重构的HDL，包括这种重构的HDL和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物和/或生产重构的HDL和/或包含其的药物组合物的方法。
附图简要说明
图1：缓冲液体积，缓冲液浓度，乙醇浓度，温度，pH和混合时间对Apo A-I产率的影响。图1示出了当使用含有较低浓度乙醇的缓冲液(缓冲溶液)(B)时从血浆获得的Apo A-I的产率达到最大。
图2：乙醇浓度，pH对Apo A-I产率的影响。图2表明，当使用含有在15和30％的范围内的浓度的乙醇的缓冲液(缓冲溶液)(B)时从血浆获得的Apo A-I的产率被最大化。
图3：等值线图表示乙醇浓度和pH对Apo A-I产率的影响。图3进一步示出了使用浓度为范围内的乙醇时pH对Apo A-I产率的影响。当Apo A-I悬浮在含有15至30％的范围内浓度的乙醇的缓冲液(缓冲溶液)(B)中，并且悬浮液的pH在6.4到10.0范围内的时产率达到最大。
图4：拟合线图，显示乙醇浓度对Apo A-I产率的影响。图4示出了当使用含有在15和30％的范围内的浓度的乙醇的缓冲液(缓冲溶液)(B)时从血浆获得的Apo A-I的产率被最大化。
图5：通过在实施例6中所述的方法纯化的Apo A-I沉淀物(步骤d)中蛋白水解活性(A)和非活化部分凝血酶时间(NaPTT)凝固时间(B)。图5示出了，在级分IV物质再增溶期间，最小化冷却时间降低了在纯化Apo A-I制剂中的蛋白水解活性和凝血因子的激活。
详细说明
本文所述的是从含Apo A-I的蛋白质级分(A)获得Apo A-I的方法，包括以下步骤：(a)悬浮含Apo A-I的蛋白质级分(A)在含有的直链或支链的C1至C4醇(w/w)的缓冲液(缓冲溶液)(B)中，其中，所述悬浮的含Apo A-I的蛋白质级分(A)具有6.4至10.0的范围内的pH，和(b)从所述悬浮液中除去杂质，同时保持Apo A-I蛋白质溶解(增溶)。在具体的实施方案中，步骤(b)之后是(c)从所述悬浮液沉淀Apo A-I，和，任选地，(d)收集Apo A-I沉淀物。
在本文所描述的方法的上下文中，术语“悬浮包含Apo A-I的蛋白质级分”是指溶解(增溶)所述含Apo A-I的蛋白质级分，从而使至少主要部分的蛋白质级分进入溶液中。
令人惊奇的是，已经发现，如果含Apo A-I的蛋白质级分(A)溶解于一定体积的含有的直链或支链的C1至C4醇(w/w)的缓冲液(缓冲溶液)(B)，其中悬浮的含有Apo A-I的蛋白质级分(A)具有范围为6.4至10.0的pH，包括6.4至7.5或8.1至8.5，那么可以在给定的缓冲液体积中比用先前已知的方法悬浮更多Apo A-I蛋白，即使没有加入离液序列高的物质，如脲。因此，与以前已知的方法相比，从起始级分(A)中获得的Apo A-I的量可显著增加。
这些发现是特别值得注意的，因为，根据现有技术，浓度为 的范围内(w/w)的乙醇不足以溶解Apo A-I蛋白，从而导致非常低的产率。
与这些期望相反，在一些实施方案中，根据本文描述的方法的pH和乙醇浓度的独特的组合实现了具有至少为0.50克/升的血浆(g/L血浆)的Apo A-I产率的纯化Apo A-I。在一些实施方案中，通过本文所述(在步骤b)中的方法获得至少0.60克/升血浆的Apo A-I。相反，当乙醇的量超过30％重量/重量，则Apo A-I回收率较低。例如，在45％w/w的Apo A-I回收率为约0.12克/升血浆，这表明在此描述的方法能够增加Apo A-I回收率至少300％。
本文描述的方法提供比在现有技术中建议的更简单和更经济的增溶Apo A-I的方式。另外，由于使用较低浓度的的直链或支链的C1至C4醇减少爆炸危险，在用于沉淀步骤的制造单元(部门)构建方面提供了较低成本的优点。
此外，在实施方案中，其中悬浮的含Apo A-I的蛋白质级分(A)的pH范围是从6.4至9.0，该pH水平被认为防止蛋白质的脱酰胺化，从而导致降低的所得的生物制药药物将是免疫原性的风险。在一些实施方案中，悬浮的含Apo A-I的蛋白质级分(A)具有6.4至9.0的范围内的pH，包括从7.2至8.8，或从8.0到8.6，或从8.1到8.5，或从8.2到8.4，或从6.4至7.4的范围内的pH。
本文所述的方法是快速，稳健的，特异性和安全的，并在加工过程中提供感兴趣的产品的改进的产率和纯度。因此，本文所描述的方法特别适合于在Apo A-I的大规模纯化使用。适于大规模纯化在本公开的上下文中是指从几十千克的起始材料诸如人血浆级分起始的纯化，例如从50千克或更多，如500千克含Apo A-I蛋白的起始级分起始的纯化。
如本文所用，“血浆”是指液体血液成分，包括血浆衍生物，以及含血浆的组合物。
与常规使用的方法相比，本方法从而便于产品产率和所涉及的经济之间的改进和可接受的平衡。
本发明的方法现在将以特定实施例示出。但是应该从下面的说明理解，本发明包括以下所示的不同的步骤，成分和参数的不同实施方案的所有排列和组合。
包括Apo A-I的任何起始材料可以用于本文所描述的方法，如含有大量的Apo A-I的任何起始材料，如含有大量Apo A-I的蛋白的任何未纯化的混合物。
术语“Apo A-I”指的Apo A-I蛋白及其级分。通常情况下，载脂蛋白(apolipoprotein)A-I是血浆来源的或重组载脂蛋白(apolipoprotein)A-I，如Apo A-I，前(pro-)Apo-A1或变体，如Apo A-I米兰(Milano)或所谓的抗氧化形式，如4WF。在一些实施方案中，载脂蛋白A-I是血浆来源的Apo A-I。还设想的是载脂蛋白A-I的生物活性片段。片段可以是天然存在的，化学合成的或重组的。
根据具体的实施方案，起始材料是含Apo A-I的蛋白质级分(A)，例如选自人血浆的级分如血浆级分IV-I或IV(有时也被称为沉淀物IV或类似物)，例如，根据科恩(Cohn)分级分离法或Kistler和Nitschmann方法或其他类似的方法由人血浆的冷乙醇分级分离获得的级分。其他实例可包括含有Apo A-I的硫酸铵沉淀物。当使用血浆体级分IV为起始材料，在此描述的方法提供了充分利用血浆资源的优点。在具体的实施方案中，起始材料是级分IV或Cohn级分IV1或Cohn级分IV4或类似的级分。在进一步具体的实施方案中，起始材料是从级分IV沉淀物衍生而得。其他的含Apo A-I的蛋白的级分(A)可以包括那些其中α-1-抗胰蛋白酶(AAT)被预先除去的级分，预先除去α-1-抗胰蛋白酶是为了单独制造成AAT治疗产品，如ZemairaTM。这样的含Apo A-I的蛋白质级分的实例在WO 2009/025754中描述。可以通过以下从Apo A-I用分离AAT：i)处理包括Apo A-I和AAT的起始人血浆级分，以由含有AAT的级分分离含有Apo A-I的级分，包括：a)任选地处理用来作为起始材料的起始人血浆级分，使得Apo A-I和AAT两者被溶解(增溶)；b)通过加入乙醇至8-14％v/v的浓度和调节pH至约5至约6，沉淀溶解(增溶)的Apo A-I，使得Apo A-I沉淀，并使得AAT保留在溶液中；和c)从含有AAT的溶液分离沉淀的Apo A-I。此沉淀的Apo A-I，在本发明的具体实施方案中，是含Apo A-I的蛋白质级分(A)。包括AAT和Apo A-I的起始人血浆级分可以选自一种或多种级分IV-I或IV(有时也被称为沉淀物IV或类似物)，根据科恩分级分离法或Kistler和Nitschmann法或其他类似的方法由人血浆的冷乙醇分级分离得到一种或多种级分IV-I或IV。在一些情况下，这些级分可被称为科恩级分IV，来自Kistler-Nitschmann上清液A和A+1的沉淀物(例如沉淀物A+Ⅳ)。其他实例可包括含有AAT和Apo A-I的硫酸铵沉淀物。在一些实施方案中，含Apo A-I的蛋白质级分包括细碎的二氧化硅，如AerosilTM。
含Apo A-I的蛋白质级分(A)悬浮在含有的直链的或支链C1至C4醇(w/w)的缓冲液(缓冲溶液)(B)中和悬浮的含Apo A-I的蛋白质级分(A)具有6.4到10.0范围内的pH。在一些实施例中在含Apo A-I的蛋白质级分(A)已悬浮在缓冲液(缓冲溶液)(B)中后，悬浮的含Apo A-I的蛋白质级分(A)的pH被调整为的范围。
在一些实施方案中，用于增溶所述的Apo A-I蛋白质级分(A)的缓冲溶液(B)包含16至28％，或17至26％，或18至24％或19％至22％的直链的或支链的C1至C4醇(w/w)。
在一些实施方案中，用于增溶所述的Apo A-I蛋白质级分(A)的缓冲溶液(B)包括20％的直链或支链C1至C4醇(w/w)。与现有技术的方法相比，这种低乙醇浓度不仅从经济观点来看是有利的，而且也允许增溶增加的量的Apo A-I蛋白质级分(A)，增加来自给定量的起始材料的纯化Apo A-I的总产率。
在一些实施方案中，缓冲溶液(B)具有范围为6.4至10.0的pH，包括从6.4至9.0，或从7.2至8.8或8.0至8.6或6.4至7.4的范围的pH。在更具体的实施方案中，缓冲溶液(B)的pH是在从8.1到8.5的范围内，如8.3。这些pH范围被认为最小化Apo A-I蛋白质的脱氨基和变性。
在其他更具体的实施方案中，缓冲溶液(B)的pH值是在7.0至7.4的范围内，如7.3。该pH范围被认为是最小化Apo A-I蛋白质的脱氨基和变性。
缓冲溶液(B)可采用任何合适的盐来制备。一种用于制备缓冲液(缓冲溶液)(B)的合适的盐是NaHCO3。NaHCO3是价格低廉且大量市售的，并且因此非常适合于工业规模的应用。在一些实施方案中，缓冲溶液(B)包含5mM至35mM NaHCO3，如15mM或25mM的NaHCO3。这些缓冲条件已被证明是在用于增溶Apo A-I蛋白质级分(A)中特别有效。此外，NaHCO3是特别有利的，由于其低毒性和易用性。然而，也可以使用其他合适的缓冲剂。缓冲剂的选择应考虑到，特定药剂(试剂)需要是生物相容的和具有在含水/醇溶液中良好的溶解度特性。
由于价格，毒性和工业实用性的原因，直链或支链C1至C4醇通常是乙醇。乙醇具有容易处理和也适于工业应用的进一步的优点。然而，除了乙醇，其他醇类，如甲醇，正丙醇或异丙醇，正丁醇，仲丁醇，异丁醇或叔丁醇适合用于目前所描述的方法中。
当使用乙醇时，乙醇通常是任何药物级乙醇。在本发明的具体实施方案中，乙醇是一种96％的药物级乙醇(如94％乙醇和2％的甲基乙基酮(MEK))。在本发明的具体实施方案中乙醇是一种95％的药物级乙醇(含有5％甲醇的3A)。
为了尽量减少凝血因子和蛋白酶的活化，含Apo A-I的蛋白质级分(A)(例如级分IV)在缓冲液(缓冲溶液)(B)中的悬浮液的温度在缓冲液(缓冲溶液)(B)接触含Apo A-I的蛋白质级分(A)的约90分钟的范围内被冷却至1.0±0.5℃。在具体实施方案中，将悬浮液在缓冲液B接触的含Apo A-I的蛋白质级分(A)(例如，级分IV)的约60分钟内冷却至1.0±0.5℃。
在一些实施方案中，Apo A-I级分(A)悬浮在缓冲液(缓冲溶液)(B)中后，如果需要的话，悬浮液的pH被调节为在6.4至10.0范围内，例如从7.0至7.4范围内，如7.3或诸如是在从8.1到8.5的范围内，如8.3。
为了方便Apo A-I在缓冲液(缓冲溶液)(B)中的悬浮，缓冲液(缓冲溶液)(B)当它接触所述含Apo A-I的蛋白质级分(A)时可具有约10℃至26℃的温度，包括约10℃至16℃，例如约13℃。
在一些实施方案中，蛋白质级分(A)与缓冲液(缓冲溶液)(B)的体积比是从1：1到1：5，例如1：2。使用Apo A-I级分(A)与缓冲液(缓冲溶液)(B)的低的体积比是在工业规模生产中尤其有利于降低材料和储存缓冲液的成本。
在一些实施方案中，悬浮液的电导率小于5mS/cm，如在从0.5至1.0mS/cm的范围内。
如上所述，含有Apo A-I的蛋白质级分(A)在缓冲液(缓冲溶液)(B)的增溶后，杂质如存在于Apo A-I蛋白质级分(A)中的其它不期望的蛋白质或其它成分从悬浮液中被去除，而载脂蛋白Apo A-I的蛋白质保持在溶液中(步骤(b))。在一些实施方案中，通过添加直链或支链的C1至C4醇至45至65％(w/w)，如50％(w/w)或60％(w/w)的醇浓度而沉淀杂质。这种范围被认为是有效增溶许多蛋白质级分，除了Apo A-I。因此，该纯化步骤提供了从其它不希望的级分分离Apo A-I的高度特异性和有效的方法。
为了方便杂质的沉淀，加入到悬浮液的直链或支链的C1至C4醇可具有约-5℃至30℃的温度，如约5℃。
在一些实施方案中，直链或支链C1至C4醇是乙醇。在具体的实施方案中的乙醇浓度的范围是从55％至65％(w/w)。
pH保持在范围内。在一些实施方案中pH的范围是从6.4至9.0，包括7.2至8.8，或从8.0到8.6，或从8.1到8.5，或从8.2到8.4，或从6.4至7.4。
在一些实施方案中，将沉淀的杂质从悬浮液中通过任何已知的方法除去，所述方法如过滤，离心，倾析，超滤和/或沉降。在一些实施方案中，杂质通过过滤除去。按照这些实施例中，过滤器可以被选择以专门保留沉淀的杂质，但是不保留期望的产物，例如，不保留期望的Apo A-I蛋白。在这样的方法中有用的过滤器包括聚丙烯滤板和CH9纤维素滤板。
在一些实施方案中，已除去杂质后，从悬浮液中沉淀Apo A-I(步骤(c))。此Apo A-I沉淀可通过调节悬浮液的pH至4.6至5.6范围，如5.4的pH而进行。在此pH范围内，Apo A-I的沉淀被认为是高选择性的，使得其它不期望的蛋白质可以保留在溶液中。
在一些实施方案中，悬浮液的温度被调整(如果需要的话)为从-2至20℃的范围，以沉淀Apo A-I。
在一些实施方案中，收集Apo A-I沉淀物(步骤(d))。按照这些实施例，沉淀Apo A-I后，有利于液体通过过滤器的助滤剂可以加入到悬浮液。助滤剂是无机矿物粉末或有机纤维材料，其与过滤硬件结合使用，以提高过滤性能。通常采用的助滤剂包括硅藻土，珍珠岩和纤维素。合适的助滤剂是本领域已知的，并且包括CeliteTM 574助滤剂。
在一些实施方案中，Apo A-I沉淀物通过任何合适的方法收集，合适的方法诸如上述的针对杂质过滤指出的。在一些实施方案中，Apo A-I沉淀物通过过滤收集。按照这些实施例，过滤器可以被选择，使得所期望的Apo A-I蛋白被保留，而其他更小的成分通过过滤器孔。
在具体的实施方案中，该方法还包括使用洗涤溶液以除去来自沉淀的Apo A-I的杂质。洗涤溶液可以是水或合适的洗涤缓冲液。如果使用洗涤步骤，进行该洗涤使得Apo A-I蛋白留在过滤器上，而杂质被溶解和洗掉。
根据进一步的具体实施方案中，该方法包含进一步的步骤(e)，其中如通过加入醇例如在约40％至约96％乙醇(w/w)范围内的浓度的乙醇，对所收集的Apo A-I沉淀物进行脱脂。在目前描述的方法的上下文中的“脱脂”是指去除脂质，因此减少了Apo A-I产品的脂质含量。
脱脂Apo A-I沉淀物(纯化的Apo A-I)可被存储在或低于-20℃，为期长达一年而不丧失蛋白质功能。
从本发明的方法衍生的Apo A-I可另外经受专用病毒减少步骤(病毒灭活和/或病毒清除(病毒去除))，以确保病毒病原体的去除。常见的病毒灭活技术包括物理方法如经典的巴氏灭菌过程(60℃加热10小时)，短波长紫外光照射或γ射线照射和化学方法如溶剂洗涤剂或低pH温育。病毒清除(病毒去除)技术包括尺寸排阻方法如病毒过滤，其也常常被称为纳米过滤。这些病毒过滤方法已被证明是有效的方法，其用于从蛋白质溶液中去除病毒。在一些实施例中本发明纯化的Apo A-I是经受病毒减少步骤，例如热灭活和/或病毒过滤，如EP13179755.7中所述。
本发明提供一种纯化的Apo A-I，其特征在于下列性能：
(a)每克Apo A-I的小于0.3毫克(mg)的IgA；
(b)每克Apo A-I的少于0.7毫克的IgG抗体；
(c)每克Apo A-I的少于0.05毫克的IgM抗体；
(d)每克Apo A-I的少于4.9毫克的结合珠蛋白；
(e)每克Apo A-I的少于2.7毫克的血液结合素；
(f)每克Apo A-I的少于6.4毫克的纤维蛋白原；
(g)每克Apo A-I的少于0.9毫克的铜蓝蛋白；
(h)每克Apo A-I的少于14.6毫克的白蛋白；
(i)每克Apo A-I的少于2.3毫克的α-2-巨球蛋白；
(j)每克Apo A-I的少于12毫克的α-1-抗胰蛋白酶；和
(K)每克Apo A-I的少于3.9毫克的转铁蛋白。
蛋白质的含量可通过比浊法测定。Apo A-I含量也可以用高效毛细管电泳法测定。
在本发明的另一个方面，提供了一种纯化的Apo A-I，其包括：(a)每克的Apo A-I的小于0.3毫克的IgA。在具体实施方案中的Apo A-I制剂包含每克Apo A-I的少于0.2毫克的IgA；或每克Apo A-I的小于0.1毫克的IgA；或每克Apo A-I的小于0.075毫克的IgA；或每克Apo A-I的小于0.05毫克的IgA；或每克Apo A-I的小于0.02毫克的IgA。有利的是具有低的IgA的纯度水平，因为它可能会影响药物制剂的安全性，所述药物制剂包含具有较低水平的Apo A-I制剂，较低水平被期望最小化IgA缺乏患者中抗IgA形成的风险。这种状况是最常见的原发性抗体缺乏，其影响约1：133的人，以及因为该状况是相对温和的，它常常不被受影响的人所意识到。
如前所述的纯化Apo A-I可以被配制成药物组合物，如被配制成重构的HDL，其用于治疗用途。这种药物组合物可以包括药学上可接受的载体或稀释剂。药学上可接受的载体或稀释剂的非限制性实例包括水，乳化剂，粘合剂，填充剂，表面活性剂，缓冲剂，稳定剂，盐类，醇类，和多元醇，洗涤剂，蛋白质和肽，脂质，树胶，糖和其它碳水化合物，虽然对药学上可接受的载体或稀释剂没有限制。
重构的HDL可能，除了Apo A-I，包含一种或多种脂质，洗涤剂和稳定剂，虽然不局限于此。脂质的非限制性实例包括磷脂，胆固醇，胆固醇酯，脂肪酸和/或甘油三酸酯。优选，所述脂质是磷脂。非限制性的磷脂的例子包括磷脂酰胆碱(PC)(卵磷脂)，磷脂酸，磷脂酰乙醇胺(PE)(脑磷脂)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)或其天然或合成的衍生物。稳定剂可以是碳水化合物，例如糖(例如蔗糖)或糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)，虽然不局限于此。如果存在的话，洗涤剂可以是任何离子(例如阳离子，阴离子，两性离子)洗涤剂或非离子洗涤剂，包括胆汁酸及其盐，如胆酸钠。
Apo A-I和/或重构的HDL制剂的治疗用途可以包括治疗或预防心血管疾病(例如急性冠脉综合征(ACS，动脉粥样硬化和心肌梗塞)或疾病，障碍或状况如糖尿病，中风或心肌梗塞，其使人易患ACS，高胆固醇血症(例如升高的血清胆固醇或升高的LDL胆固醇)和低胆固醇血症，其产生自降低的水平的高密度脂蛋白(HDL)，诸如是丹吉尔病(tangierdisease)的症状的。
实施例
如上所述，含有大量的Apo A-I的蛋白的任何未纯化的混合物可以用作起始材料以用于本文所述的纯化方法。
在以下的实施例中，Apo A-I用根据科恩分级分离方法或Kistler和Nitschmann方法的冷的乙醇分级分离从人血浆萃取，得到血浆级分IV-或IV作为起始起始材料。在步骤(a)中，级分IV悬浮于缓冲溶液(B)，然后在步骤(b)在暴露于更高的乙醇浓度前调节pH以沉淀各种杂质。通过深度过滤在助滤剂的存在下去除杂质，然后将pH移位至接近Apo A-I的等电点以沉淀Apo A-I，作为步骤(c)。添加助滤剂并将该Apo A-I沉淀物通过过滤在步骤(d)收集。任选地，所述Apo A-I的沉淀物可以被重新悬浮和加入乙醇(例如40-96％w/w的)，以除去残留的脂质，作为步骤(e)。
利用毛细管电泳在不同的采样点对Apo A-I含量进行了测量。
纯度以百分比表示，用毛细管电泳测定，也针对SDS-PAGE凝胶进行肉眼评价。
实施例1：级分IV沉淀物制备
人血浆冷却至约0℃，并调节至约7.2pH。冷的乙醇加入到约8％的浓度(w/w)，并将温度降低到约-2℃。通过离心或过滤除去所形成的沉淀物(级分I)。
将来自以上方法的滤液或上清液调整为约pH 6.9，和冷乙醇加入到约20％的浓度(w/w)。然后将温度降低到-5℃，并将该混合物再次进行离心或过滤。所形成的沉淀物(级分II+III)放置一边用于其他目的。
将来自以上方法的滤液或上清液调整至pH约为5，而乙醇浓度调节至约20％(w/w)。将温度调节至约-5℃。通过离心或过滤除去所形成(级分IV)的沉淀物，并存储，直到需要在糊膏的形式。此级分IV糊膏含有Apo A-I，以及污染蛋白和脂质。
实施例2：影响从沉淀物IV回收Apo A-I的因素
使用实验的设计(DOE)的方法的初始实验集中于沉淀物IV(例如，含有级分IV)在碳酸氢钠缓冲液中的溶解，目的是增溶更多的ApoA-I。表1总结了用于采用中心点运行的Plackett-Burman设计的六个方法参数的条件。检查的参数包括缓冲液体积，乙醇浓度，温度，pH和混合时间。针对沉淀物IV增溶步骤的初步筛选执行十三次运行。
沉淀物IV糊膏等分溶于在DOE设计中规定的缓冲液的体积。然后将pH根据DOE设计来调节，之后在分配给该运行的温度将悬浮液混合。对悬浮液采样，并且将样品以4500转离心十五分钟。将得到的上清液进行分析。对测试的结果进行标准化，并表示为g Apo A-I/L血浆。
表1：用于沉淀物IV的溶解的Plackett-Burman筛选设计矩阵。
表2是在初始的Plackett-Burman筛选DOE获得的结果的总结，其中的ApoA-I产率被标准化和表示为g ApoA-I/L血浆。
所述Minitab16DOE分析的结论是，只有乙醇浓度对产率有p<0.05，其中重悬浮缓冲液中乙醇浓度越低，增溶的ApoA-I越多(图1)。
表2：用于沉淀物IV的溶解的Plackett-Burman筛选设计矩阵的结果。
实施例3：乙醇浓度和pH对从沉淀物IV回收Apo A-I的影响
该研究包括10次运行，其中乙醇浓度在20至50％之间变化，pH在6.4和7.2之间。这项研究是被运行作为重复的22完全因子DOE设计，具有中心点(表3)。该方法涉及将等分沉淀物IV糊膏溶解于2份15mM碳酸氢钠缓冲液，其具有根据DOE的乙醇浓度。然后根据DOE设计调节pH，之后将悬浮液调节至0±1℃的温度，混合1小时。对悬浮液取样，并且将样品以4500转离心十五分钟。将得到的上清液进行分析。测试的结果进行标准化，并表示为g ApoA-I/L血浆。
表3：用于沉淀物IV的溶解的22完全因子优化DOE设计矩。
标准的运行顺序 乙醇浓度(％) pH
1 50 6.4
2 20 6.4
3 35 6.8
4 20 7.2
5 50 7.2
6 50 7.2
7 20 6.4
8 50 6.4
9 20 7.2
10 35 6.8
所述Minitab16DOE分析得出的结论是，对产率有p<0.05唯一的因素是乙醇浓度(表4)。结果表明，在重悬缓冲液中乙醇浓度越低，增溶的ApoA-I越多，当乙醇浓度为20至30％时观察到最大产率(图2)。再悬浮溶液的pH表现出轻微影响，将pH从6.4增加至7.2导致更高的Apo A-I回收率。然而这并没有被发现具有显著性(p＝0.113)。
表4：用于沉淀物IV的溶解的22完全因子优化设计的结果。
标准运行顺序 产率(g/L PEQ)
1 0.62
2 0.84
3 0.82
4 0.87
5 0.69
6 0.74
7 0.83
8 0.72
9 0.86
10 0.82
图3进一步示出了使用为范围内的乙醇浓度时pH对Apo A-I产率的影响。当Apo A-I悬浮于如本文所述的缓冲液(缓冲溶液)(B)中时，产率最大化，缓冲液(缓冲溶液)(B)包含在15至30％的范围内的浓度的乙醇和6.4至7.2的范围内的pH。
实施例4：乙醇浓度对来自沉淀物IV的Apo A-I回收率I的影响。
进行线性实验，以确定在哪些乙醇浓度的Apo A-I的产率在增溶步骤中是最大化的。0，15和30％的乙醇浓度被一式两份地进行测试，如上所述。表5是线性乙醇浓度实验所得到的结果的总结，其中的ApoA-I产率被标准化和表示为g ApoA-I/L血浆和纯度以百分比表示。
表5：用于沉淀物IV的溶解的线性乙醇浓度实验的结果。
标准运行顺序 乙醇浓度(％) 产率(g/L PEQ)
1 0 0.47
2 15 0.91
3 30 0.84
4 30 0.83
5 15 0.80
6 0 0.48
如图4中所示，当使用含有在15和30％的范围内的浓度的乙醇的缓冲液(缓冲溶液)(B)时从血浆获得的Apo A-I的产率被最大化。
实施例5：乙醇浓度和pH对从沉淀物IV回收Apo A-I的影响
沉淀物IV溶解在两份悬浮缓冲液中，所述悬浮缓冲液采用15mM的碳酸氢钠，0.5mMEDTA在根据表6的各种的乙醇浓度中制成，之后用根据表6的0.5M的HCl或0.5M的NaOH调整pH。
pH值设定后，对悬浮液取样并将样品在4500转离心十五分钟。将得到的上清液进行分析。对结果进行标准化，并表示为g apoA-I/L血浆。
以前的研究表明，在沉淀物IV重悬浮步骤中，当在悬浮缓冲液中使用15％-30％的乙醇浓度时，Apo A-I产率最大化。重悬浮的pH被发现仅具有微小的影响，但是检查的范围窄，pH值6.4-pH 7.2。以确定是否更宽的pH范围影响Apo A-I产率，按照表6进行实验，和计算Apo A-I产率。
表6：重悬浮缓冲液和pH条件。
试验编号 悬浮缓冲液 pH
1470.E009.08 15％乙醇 5.0
1470.E009.09 15％乙醇 10.0
1470.E009.10 30％乙醇 5.0
1470.E009.11 30％乙醇 10.0
1470.E009.12 20％乙醇 7.4
这些实验的结果列于表7中。在pH5.0，Apo A-I产率是与乙醇浓度是检测不到地无关的。在20％乙醇的溶解，在15％或30％乙醇的存在下pH 7.4和pH 10.0提供Apo A-I回收率(步骤b)的相似水平(表7)。
表7：用于沉淀物Ⅳ的溶解的乙醇浓度和pH实验的结果。
N/A.-Apo A-I的检测不到的水平
实施例6：在回收的Apo A-I中蛋白酶活性和激活的凝血因子
Apo A-I的纯化涉及Apo A-I的沉淀和测定来自步骤(d)的Apo A-I沉淀物中蛋白水解活性和活化的凝血因子存在。
等分的沉淀物IV糊膏被溶解在2份悬浮液缓冲液(缓冲溶液)(B)中(15mM的NaHCO3/20％乙醇缓冲液)。将该混悬液调整至0±1℃的温度。冷却装置被程序化，使得悬浮液在10，65或120分钟内达到1℃的目标温度。然后在该温度(约0±1℃)将悬浮液混合大约一小时。混合后，使用0.5M的NaOH或0.5M的HCl溶液调节该悬浮液的pH，得到约7.3的pH。
预冷至-4℃的乙醇被加至60％的最终浓度，同时保持悬浮液的温度在-1至2℃。乙醇加入后，将悬浮液混合约30分钟。
继温育后，过滤助剂加入到该悬浮液中。通过已被15mM的碳酸氢钠/60％乙醇预先洗涤的深度过滤器进行过滤，从不溶性杂质分离可溶性Apo A-I材料(Apo A-I滤液)。滤饼用15mM的碳酸氢钠/60％的乙醇洗涤。
0.5M的HCl溶液的量被加入到Apo A-I滤液，得到5.4±0.1的pH的悬浮液。该悬浮液的温度调节至约0℃，并保持所述pH/温度条件约2小时。
接着，助滤剂加入到该悬浮液中，通过深度过滤收集Apo A-I沉淀物。深度过滤器用60％的乙醇预先洗涤。执行用96％的乙醇的初始后洗涤，随后是20％的乙醇后洗涤。
针对蛋白水解活性对纯化的ApoA-I的沉淀物进行分析和测量非活化部分凝血酶时间(NaPTT)凝血时间。这些测试对在步骤(d)的Apo A-I沉淀物中残留蛋白酶的量提供指示。
为了准备来自步骤(d)的Apo A-I沉淀物以用于测试，通过添加一份沉淀物到三份2％的SDS/100mM Tris pH8.5缓冲液将其溶解。然后将含有Apo A-I的悬浮液混合45分钟至1小时。将悬浮液随后离心，将上清液用于测定蛋白水解活性和NaPTT)。
蛋白水解活性测定是比色法，其中含有Apo A-I的上清液以1:3与缓冲溶液(pH8.0)混合。然后将该溶液(200μL)连同包含20μL的pNA的底物加入微孔板孔。然后将板在37℃温育10分钟，之后在405nm处初始读数。温育在相同条件下继续进行，在30，60和90分钟采取进一步读数(405纳米)。在孵育结束时，通过测量0和90分钟之间所形成的pNA量，对蛋白水解活性(nkat/L)进行了计算。
由根据欧洲药典专著2.6.22的普通的非活化部分凝血酶时间(NaPTT)试验测定，Apo A-I沉淀物批次(来自步骤(d))的活化的凝血因子的存在。
结果表明，在步骤(a)在级分IV的再增溶期间，通过缩短用于降低温度至1℃的时间可以最小化Apo A-I沉淀物(在步骤(d))中蛋白酶活性的水平和活化的凝血因子(图5)。
实施例7：Apo A-I的大规模回收率
通过将沉淀物IV糊膏(500-550千克)溶解在2份15mM碳酸氢钠/20％乙醇缓冲液中，制造较大规模的批次(n＝17)。然后将悬浮液调节到0±1℃的温度，并且混合大约一小时。混合后，用0.5M的NaOH或0.5M的HCl将pH调节至7.3。
加入乙醇溶液至高达60％的终浓度，将悬浮液混合约15分钟。然后将悬浮液通过已被预先用15mM的NaHCO3/60％乙醇洗涤的压滤机过滤。随后的滤饼也用15mM的NaHCO3/60％乙醇洗涤。
对测试的结果进行标准化，并将其表示为g Apo A-I每L血浆。根据17个批次，平均回收率为0.6g/L(在步骤(b))。
实施例8：来自Kistler-Nitschmann级分IV的Apo A-I的纯化-在悬浮期间pH的效果
通过改变在7.2-12.0的范围内的pH，评价pH在重新悬浮来自沉淀物IV的Apo A-I中对纯化的Apo A-I的总产率影响。
获得纯化的Apo A-I的方法涉及将沉淀物IV溶解于两份20％的EtOH沉淀物IV溶解缓冲液，其含15mM碳酸钠(22±2℃)。在将缓冲液加入沉淀物Ⅳ后，将悬浮液温度在约15分钟内降低至2℃(2±1℃)。混合约15分钟后，将悬浮液的pH调节到在7.2至12.0的范围内的目标pH，之后添加96％的乙醇以达到60％的终浓度。
随后的悬浮液在C盐(Celite)574的存在下被过滤。滤液的pH然后降低至约pH5.3，并且在约0℃被温育约2小时。然后加入助滤剂，悬浮液混合约30分钟，之后被过滤，ApoA-I沉淀物被收集。然后用96％的乙醇对Apo A-I沉淀物进行脱脂。
为了确定脱脂的Apo A-I沉淀物的Apo A-I含量和其它特性，沉淀物在室温在3份pH 8.5含有2％SDS的100mM Tris缓冲液中溶解45分钟。将样品在分析前进行离心。
研究了pH在沉淀物IV再悬浮步骤对脱脂的Apo A-I沉淀物中整体的Apo A-I产率的影响，当使用较高的pH的提取条件时得到更高的回收水平(表8)。采用高效毛细管电泳(惠普(Hewlett Packard)3D CE，安捷伦科技)测定Apo A-I的数量。在变性条件下，即，在SDS的存在下进行测定。随后可以在水性和含脂质样品(例如，重构的HDL)中测定Apo A-I含量。简言之，将含有约2-3毫克/毫升Apo A-I的样品(150μL)(如果需要用水稀释)采用16％的SDS(25μL)和苯丙氨酸(25μL，2或4毫克/毫升)制备。然后将样品在沸水浴中温育3分钟，然后在电泳缓冲液(50mM硼酸钠，0.2％SDS，pH 9.1，300μL)中1∶2.5稀释并过滤(0.45μm)。然后将样品加载到熔融石英毛细管(56厘米乘50微米内径(id)，安捷伦G1600-61232)。电泳反应在25kV进行。所用的标准是一个国际Apo A-I标准(BCR-393)，并从20至950微克/mL建立了标准曲线。定量是基于与内标(苯丙氨酸)比较的相对峰面积。
表8：纯化Apo A-I(每升血浆克)的产率作为用于从级分IV提取Apo A-I的pH的函数。
生产批次 pH 7.3 pH 8.1 pH 8.3 pH 8.4 pH 8.5 pH 8.7
产率 0.22 0.28 0.37 0.53 0.51 0.50 0.56
通过比浊法(BN ProSpec，西门子)，采用从西门子获得的参照，对照和抗血清，来确定在纯化Apo A-I制剂(每克Apo A-I的血浆蛋白mg)中其他血浆蛋白的水平。针对IgA含量，按照制造商的说明使用来自西门子的N胶乳的IgA试剂盒。
在纯化Apo A-I制剂中其他血浆蛋白的水平保持稳定，直到级分IV提取步骤的pH达到pH 8.5。在较高的pH提取条件，例如pH8.7，血浆蛋白的水平增加(表9)。
表9：纯化的Apo A-I中杂质含量作为用于从级分IV提取Apo A-I的pH值的函数。

Claims (6)

1.通过包括如下步骤的方法从含Apo A-I的蛋白质级分(A)获得的Apo A-I：
(a)将所述含Apo A-I的蛋白质级分(A)悬浮在含有(W/W)的直链或支链C1至C4醇的缓冲溶液(B)中形成含有可溶性Apo A-I的悬浮液，其中该悬浮液的pH在6.4至10.0的范围内，
(b)从所述悬浮液中除去杂质，同时保持Apo A-I溶解，
(c)从所述悬浮液中沉淀Apo A-I，以及
(d)收集Apo A-I沉淀物。
2.权利要求1的Apo A-I，每克Apo A-I具有低于0.3毫克的IgA。
3.一种药物组合物，它包含根据权利要求1或权利要求2的Apo A-I，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
4.重构的高密度脂蛋白，它包含根据权利要求1或权利要求2的Apo A-I。
5.一种药物组合物，包括根据权利要求4的重构的高密度脂蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂。
6.纯化的Apo A-I，它每克Apo A-I具有低于0.3毫克的IgA。
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