TWI531388B

TWI531388B - 脂蛋白配方及其製造方法

Info

Publication number: TWI531388B
Application number: TW100123185A
Authority: TW
Inventors: 撒姆耳萊特; 馬丁殷伯登; 雷恩哈德伯利; 馬索沃克利
Original assignee: Csl有限公司
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2016-05-01
Also published as: US20170196935A1; US11058747B2; JP5989641B2; CN103118683A; CA2803031C; IL223815A; AU2011274238A1; HUE042391T2; US20160022768A1; CN105396122B; US20200171126A1; CN105396122A; JP2013529648A; EP3178481B1; EP2588113B1; DK2588113T3; EP3178481A1; SG186386A1; US11723953B2; ES2617977T3

Description

脂蛋白配方及其製造方法

本發明係關於重組高密度脂蛋白配製物。更明確而言，本發明係關於具有低毒性的重組高密度脂蛋白配製物。

高密度脂蛋白(HDL)係一類特徵為含有高密度(>1.063g/mL)和小型(Stoke’s直徑=5至17nm)脂質和蛋白的異質性脂蛋白。不同數量和性質之各種HDL亞類的脂質、載脂蛋白、酵素和脂質轉運蛋白含量可形成不同的形狀、密度、尺寸、電荷和抗原性。載脂蛋白-AI(Apo-AI)係主要HDL蛋白，但亦可能存在其他載脂蛋白例如Apo-AII和Apo-V。

流行病學和臨床學的研究已經建立高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度和心血管疾病風險之間的逆關聯性(Assmann等人研究概況，2004，Circulation 109 III-8)。更明確而言，已顯示臨床投與重組HDL配製物對近期罹患急性冠心病(ACS)之高膽固醇病人具有療效。

通常，此類重組HDL配製物包含蛋白例如Apo-AI、脂質例如磷脂醯膽鹼以及去污劑例如膽酸鹽或脫氧膽酸鹽。此外，可含有膽固醇。如美國專利5,652,339中所述，當製造重組HDL配製物時可在不利用於某些情況下被用於溶解脂質成分(例如磷脂醯膽鹼)的有機溶劑生產重組HDL。已進行此類被命名為CSL-111之重組HDL配製物的臨床試驗，但是高劑量治療由於早期的肝功能檢查異常而被停藥。以CSL-111治療的病人在斑塊負荷指數上呈有利趨勢。然而，仍未獲得粥狀動脈瘤體積或正常斑塊體積與安慰劑比較之百分比變化的統計學顯著性。

發明之摘要

本發明的一目的係提供可緩和或消除先前技術中一或多種重組HDL配製物缺乏的一種重組HDL配製物。

本發明的一較佳目的係提供低或最小毒性的一種重組HDL配製物。

本發明的另一較佳目的係提供有效預防及/或治療性處理包括但不侷限於冠狀動脈粥樣硬化之疾病或症狀的一種重組HDL配製物。

本發明泛指包含一載脂蛋白、一磷脂以及在無毒程度或至少呈現相對低毒性之去污劑的一種脂蛋白配製物。在特定具體實施例中，該去污劑和脂質的濃度係低於導致、造成或與肝毒性有關的程度。

在一態樣中，本發明提供包含有一載脂蛋白或其片段、一脂質以及投與人類時可呈現肝毒性的最低或閥值濃度之5~50%之一去污劑的一種重組高密度脂蛋白(rHDL)配製物。

在另一態樣中，本發明提供製造包含一載脂蛋白、一脂質及一去污劑之rHDL配製物的一種方法，該方法包括提供投與人類時呈現肝毒性之rHDL配製物內約5~50%濃度去污劑的步驟。

在又另一態樣中，本發明提供治療人類疾病、障礙或病症的一種方法包括根據第一態樣之rHDL投與至人類或根據第二態樣之製造方法，因而治療該人類的疾病、障礙或病症。

在仍又另一態樣中，本發明提供根據第一態樣或根據第二態樣之製造方法以用於治療人類之疾病、障礙或病症的一種rHDL配製物。

該去污劑的濃度較佳為可呈現肝毒性的最低或閥值濃度之5~10%。在某些具體實施例中，其相當於約0.03g/L載脂蛋白。

該去污劑較佳為膽鹽或膽酸。更明確而言，該去污劑為膽酸鈉。

該載脂蛋白可為高密度脂蛋白(HDL)之正常及/或功能性成分的任何載脂蛋白。該載脂蛋白的濃度較佳為約20~50g/L。該載脂蛋白較佳為Apo-AI或其片段。

適當的脂質含量為可導致或與肝毒性有關的最低或閥值濃度之20~70%。該脂質的濃度較佳為約30~60g/L。該脂質的濃度最佳為約30~50g/L，或在某些具體實施例中為約34或47g/L。

該脂質較佳為一種磷脂。該磷脂更佳為，或包含磷脂醯膽鹼(PC)。

在一較佳具體實施例中，該載脂蛋白脂質的克分子比係在1：20至1：100的範圍。該載脂蛋白脂質的克分子比最佳為約1：40或1：55。

該rHDL配製物適當時進一步包含一安定劑。該安定劑較佳為糖例如蔗糖。其較佳濃度為rHDL配製物的約65~85g/L。

此申請案的全文中，除非內文中要求否則，"含有"、"包含"和"包含有"一詞意指包括不排除任何其他整數或整數群的一被陳述整數或整數群。

發明之詳細說明

本發明至少部分係導因於先前技術中顯示過量去污劑造成CSL-111重組HDL(rHDL)配製物，特別是當配製物內使用不同去污劑對Apo-A1比例時呈現肝毒性的意外發現。基於此，膽酸鈉的用量為約0.3g/g Apo-A1。然而，發明者亦發現無法完全去除去污劑並且必需維持在能使rHDL配製物具有足夠安定性和治療活性的程度。

此外，與減少存在於CSL-111內的脂質濃度比較，已意外地發現降低肝毒性並不實質上損及rHDL配製物的治療活性。

在一又進一步的發現中，已確認最適合rHDL配製物之載脂蛋白：脂質的克分子比。

因此，在本發明的一態樣中提供包含有一載脂蛋白或其片段、一脂質以及投與人類時可呈現肝毒性的最低或閥值濃度之5~50%濃度之一去污劑的一種rHDL配製物。

如此處所述，一"重組HDL(rHDL)"配製物可為功能上相似、類似、相當於或模擬通常存在於血漿內之高密度脂蛋白(HDL)的任何人工製造脂蛋白配製物或組成物。rHDL配製物的範圍包括"HDL模擬物"和"合成HDL顆粒"。

就此而論，"投與一rHDL配製物至人類時呈現肝毒性"意指一rHDL配製物內之去污劑於投與至人類之後可造成、產生或與其後至少一不良反應有關的程度。通常該不良反應係肝毒性，例如以異常或損及肝功能為證。可能為異常或損及肝功能的非侷限性實例包括升高丙胺酸轉胺酶(ALT)活性、升高天冬胺酸轉胺酶(AST)活性及/或膽紅素濃度升高。根據本發明，適當的去污劑濃度為如下文中所述不造成、導致或與不良反應無關的程度。通常，此將可於輸液結束後被測得。

去污劑的濃度較佳為可呈現肝毒性的最低或閥值濃度之5~35%。此範圍包括，例如5、10、15、20、25、30和35%。去污劑的濃度更佳為可呈現肝毒性的最低或閥值濃度之5~20%。該濃度較佳為可呈現肝毒性的最低或閥值濃度之5~10%。較佳為以可呈現肝毒性的最低或閥值去污劑濃度表示這些程度。

藉由實例，本發明操作中已顯示可造成、導致或至少與肝毒性有關的去污劑濃度為0.3g/g Apo-AI或6g/L rHDL配製物(於20g/L Apo-AI)。因此，5~10%的此去污劑濃度為0.015~0.03g/g Apo-AI或0.5~0.9g/L rHDL配製物(於30g/L Apo-AI)。

該去污劑的"濃度"可為去污劑的一絕對量、去污劑的一濃度(如rHDL配製物的質量體積)及/或去污劑之數量或濃度相對該rHDL配製物另一成分之數量或濃度的比例。

僅藉由實例，以存在於rHDL配製物內之載脂蛋白(如Apo-AI)的總質量表示去污劑的濃度。

雖然安全性和避免肝毒性為本發明的一目標，但是本發明亦要求足以使rHDL配製物維持安定的濃度。如將更詳述於實例中的描述，從安定性和無毒性的角度而言去污劑的最適濃度為0.45g/L含30g/L載脂蛋白的rHDL配製物。雖然以測量rHDL配製物的濁度較佳，但是可藉由技術中已知的任何方法測量安定性。

適合用於rHDL配製物內的去污劑可為任何離子性(如陽離子、陰離子、兩性離子)或非離子性去污劑，包括膽酸及其鹽。離子性去污劑包括膽酸及其鹽、聚山梨糖酸酯(如PS80)、CHAPS、CHAPSO、鯨蠟基三甲基溴化銨、月桂醯肌胺酸、第三辛基苯丙磺酸和4’-胺基-7-芐醯胺基牛磺膽酸。

膽酸通常為含有24個碳原子的二羥或三羥類固醇，包括絡膽酸(cholic)、去氧膽酸、鵝去氧膽酸或熊去氧膽酸(ursodeoxychokic)。該去污劑較佳為一種膽鹽例如膽酸鹽、去氧膽酸鹽、鵝去氧膽酸鹽或熊去氧膽酸鹽。一種最佳的去污劑為膽酸鈉。

該載脂蛋白可為天然HDL或一重組高密度脂蛋白(rHDL)之功能性、生物學活性成分的任何載脂蛋白。通常，該載脂蛋白為血漿源或重組載脂蛋白例如Apo-AI、Apo-AII、 Apo-AV、前Apo-AI或一變體例如米蘭型Apo-AI。該載脂蛋白較佳為Apo-AI。該載脂蛋白的生物學活性片段亦同樣重要。片段可為天然、化學合成或重組。僅藉由實例，Apo-AI的生物學活性片段較佳為具有至少50、60、70、80、90%或95~100%或甚至大於100%的Apo-AI之卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(LCAT)刺激活性。

該載脂蛋白的適當濃度為約20~50g/L。此包括20、25、30、35、40、45和50g/L以及介於這些值之間的任何範圍。該載脂蛋白的濃度較佳為約30g/L。

該rHDL配製物包含不導致肝毒性的一脂質。該脂質的適當濃度為導致或與肝毒性有關之程度的約20~70%。在特定具體實施例中，該脂質的濃度較佳為導致或與肝毒性有關之程度的約25、30、35、40、45、50、55、60或65%，以及介於這些值之間的任何範圍。較佳為以可呈現肝毒性的最低脂質或閥值表示這些程度。

藉由實例，本發明操作中已顯示可導致、造成或至少與肝毒性有關的脂質濃度為84g/L。因此，該脂質的濃度較佳為約30~60g/L。此包括30、35、40、45、50、55和60g/L以及介於這些值之間的任何範圍。該脂質的最佳濃度為約30~50g/L，或在某些具體實施例中為約34或47g/L。

該脂質的"濃度"可為脂質的一絕對量、脂質的一濃度(如rHDL配製物的質量體積)及/或脂質之數量或濃度相對該rHDL配製物另一成分之數量或濃度的比例。僅藉由實例，該脂質的濃度可被表示為存在於rHDL配製物內之載脂蛋白(如Apo-AI)的克分子比。

在一較佳具體實施例中，該載脂蛋白：脂質的克分子比為在1：20至1：100的範圍。此範圍包括例如1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80和1：90的克分子比。該載脂蛋白：脂質的克分子比更佳為在1：40至1：75的範圍。該載脂蛋白：脂質的最佳比例為約1：40或1：55。

該脂質可為天然HDL或重組高密度脂蛋白(rHDL)之功能性、生物學活性成分的任何脂質。此類脂質包括磷脂質、膽固醇、膽固醇酯、脂肪酸及/或三酸甘油酯。該脂質較佳為磷脂質。磷脂的非侷限性實例包括磷脂醯膽鹼(PC；卵磷脂)、磷脂酸、磷脂醯乙醇胺(PE；腦磷脂)、磷脂醯甘油(PG)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷脂醯肌醇(PI)和神經鞘磷脂(SM)或其天然或合成衍生物。天然衍生物包括蛋磷脂醯膽鹼、蛋磷脂醯甘油、大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、大豆磷脂醯甘油、腦磷脂醯絲胺酸、神經鞘脂、腦神經鞘磷脂、半乳糖腦苷脂、神經節糖苷、腦苷脂、腦磷脂(cephalin)、心磷脂(cardiolipin)和二鯨蠟基磷酸脂。合成衍生物包括雙軟脂醯基卵磷脂(DPPC)、雙癸醯基卵磷脂(DDPC)、雙瓢兒菜醇卵磷脂(DEPC)、雙豆蔻醯卵磷脂(DMPC)、雙硬脂醯基卵磷脂(DSPC)、雙月桂基卵磷脂(DLPC)、棕櫚醯基油醯基卵磷脂(POPC)、棕櫚醯基肉豆蔻醯基卵磷脂(PMPC)、棕櫚醯基硬脂醯基卵磷脂(PSPC)、雙油醯基卵磷脂(DOPC)、雙油醯基磷脂醯基乙醇胺(DOPE)、月桂醯基磷脂醯甘油(DLPG)、雙硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)、雙豆蔻醯磷脂醯甘油(DMPG)、雙軟脂醯磷脂醯甘油(DPPG)、雙硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)、雙油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯甘油(POPG)、雙豆蔻醯基磷脂酸(DMPA)、雙軟脂醯基磷脂酸(DPPA)、雙硬脂醯基磷脂酸(DSPA)、雙豆蔻醯磷脂醯乙醇胺(DMPE)、雙軟脂醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、雙豆蔻醯基磷脂醯絲胺酸(DMPS)、雙軟脂醯基磷脂醯絲胺酸(DPPS)、雙硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)、雙油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、雙油醯基磷脂醯絲胺酸(DOPS)、雙棕櫚醯基神經鞘磷脂(DPSM)以及雙硬脂醯基神經鞘磷脂(DSSM)。該磷脂質亦可為任何上述磷脂的衍生物或類似物。

該磷脂較佳為，或包含單獨的磷脂醯膽鹼或結合一或多種其他的磷脂質。另一磷脂質的實例為神經鞘磷脂(sphingomyelin)。

該rHDL配製物可適當地進一步包含一安定劑。明確而言，該安定劑可於冷凍乾燥時維持rHDL配製物的安定性。適當的安定劑為一碳水化合物例如糖或糖醇。適當糖醇的實例為甘露糖醇和山梨糖醇。該安定劑較佳為雙糖例如蔗糖。蔗糖的濃度較佳為約65~85g/L(相當於約6.5~8.5%w/v)的rHDL配製物。該蔗糖的濃度較佳為約75g/L(相當於約7.5%w/w)。與CSL-111比較，以絕對和相對脂蛋白濃度而言此為一低蔗糖濃度。一般認為此相對低的蔗糖可增加本發明rHDL配製物的輸注率。其他安定劑可為或包括但不侷限於胺基酸(如甘胺酸、脯胺酸)、抗氧化劑、乳化劑、表面活性劑、螯合劑、明膠、合成油、多元醇、褐藻酸鹽或任何醫藥上可接受載劑及/或賦形劑。基於此，請參考"胜肽和蛋白的醫藥配製物發展"，Frokjaer等人，Taylor & Francis(2000)，"醫藥賦形劑手冊"第三版，Kibbe等人，Pharmaceutical Press(2000)以及國際公告案WO 2009/025754中的實例。

在一最佳具體實施例中，該rHDL配製物包含：(i)約30g/L的Apo-AI；(ii)每克Apo-AI約0.03g的膽酸鈉；(iii)約34或47g/L的磷脂醯膽鹼；以及(iv)約75g/L的蔗糖；(v)其中Apo-AI：磷脂醯膽鹼的克分子比為約1：40或1：55。

在另一態樣中，本發明提供製造包含一載脂蛋白、一脂質及一去污劑之rHDL配製物的一種方法，該方法包括提供投與人類時呈現肝毒性之rHDL配製物內約5~50%濃度去污劑的步驟。該方法較佳為包括提供投與人類時呈現肝毒性之約5~10%濃度去污劑的步驟。

在本方法的一較佳具體實施例中，降低或除去去污劑的最初或開始濃度至投與rHDL配製物至人類時不呈現肝毒性的程度。

可藉由技術中已知的任何方法降低或除去去污劑包括例如過濾、疏水性吸附或疏水性交互層析法、透析、離子交換吸附和離子交換層析法。

在一些具體實施例中，使用適合用於降低去污劑濃度的非極性聚苯乙烯樹脂。此類樹脂較佳為以交聯共聚物型(例如交聯苯乙烯和二乙烯苯共聚物)。非侷限性實例包括Amberlite XAD-2和Bio Beads SM。

過濾包括但不侷限於技術中所習知的凝膠過濾、凝膠滲透、透析過濾和超過濾法。凝膠過濾的一非侷限性實例為利用多孔、交聯葡聚糖例如Sephadex樹脂。

在極適合用於大量生產的一最佳具體實施例中，藉由透析過濾法降低該去污劑的濃度。

該方法較佳為包括於不存在有機溶劑之下結合脂質和載脂蛋白的步驟。

因此，在一較佳具體實施例中本發明提供一種製造rHDL配製物的方法，其步驟包括：(I)於不存在有機溶劑和膽酸鹽去污劑之下將磷脂醯膽鹼加至Apo-A1溶液；(II)將步驟(I)所製造的溶液內膽酸鹽去污劑濃度降低至約0.03g/g Apo-A1；(III)將安定劑較佳為蔗糖加至步驟(II)的溶液。

加入步驟(I)的磷脂醯膽鹼時較佳為使Apo-AI：磷脂醯膽鹼的比例為約1：40或1：55。

步驟(III)之蔗糖的最終濃度較佳為約75g/L。

該方法較佳為進一步包括冷凍乾燥步驟(III)所製造之rHDL配製物的步驟(IV)。

將瞭解在一特定具體實施例中該製造rHDL配製物的方法適合用於大規模商業化製造適合投與人類的一定量具有安全性rHDL配製物。該大規模商業化製造方法的一非侷限性實例被摘錄於第9圖。

在又另一態樣中，本發明提供治療人類疾病、障礙或病症的一種方法包括根據上文中所述製造方法將上文中所述的rHDL投與至人類以治療該人類疾病、障礙或病症的步驟。

本發明亦根據上文中所述的製造方法提供一種如上文中所述用於治療人類疾病、障礙或病症的rHDL配製物。

該疾病、障礙或病症對該rHDL配製物的預防或治療性投藥可產生適當的反應。此類疾病、障礙或病症的非侷限性實例包括心血管疾病(如急性冠心病(ACS、動脈粥樣硬化症和心肌梗塞)或易罹患ACS、高膽固醇血症(如高血清膽固醇或高LDL膽固醇)以及導因於低高密度脂蛋白(HDL)濃度之低膽固醇血症如症狀性丹吉爾病(Tangier disease)的疾病、障礙或病症例如糖尿病、中風或心肌梗塞。

可藉由技術中已知的任何投藥途徑投與rHDL配製物。通常，藉由腸道外的方法投與rHDL配製物，例如藉由靜脈輸注或注射。

rHDL配製物的投藥劑量可在1~120mg/kg體重的範圍。該劑量較佳為在5~80mg/kg的範圍，包括10、20、30、40、50、60和70mg/kg的劑量。

因此參考下列非侷限性實例可完全瞭解本發明的較佳具體實施例並且被實際運用。

下文中所述的實例係提供初步試驗以測定rHDL配製物內(例如CSL-111)造成肝毒性的因子(實例1和2)和形成，以及本發明rHDL配製物之具體實施例的毒性檢測(實例3至8)。

實例1 比較不同Apo-A1：PC比的肝毒性以及控制膽酸鹽濃度的效應

於大鼠模式內藉由ALT活性測定含不同Apo-AI：PC比例(1：150、1：100和1：50)之HDL製劑的肝毒性程度(詳細模式請看下列實例2)。各HDL製劑含有範圍從1：150之6g/L至1：50製劑之1.1g/L的不同膽酸鹽濃度。

其結果顯示1：150 HDL製劑從投與300mg/kg開始可增加ALT的濃度。1：100 HDL製劑則從400mg/kg劑量開始增加ALT的濃度，其增加程度持續至600mg/kg。對照之下，1：50 HDL製劑則於高至600mg/kg劑量仍未發現ALT活性的增加(第1圖)。這些結果認為藉由HDL製劑內的PC及/或膽酸鹽濃度可降低肝毒性。為探究膽酸鹽濃度是否直接影響ALT活性進行完全除去膽酸鹽之CSL-111的試驗。結果證明以300mg/kg輸注至大鼠時減少CSL-111製劑內的膽酸鹽可降低ALT濃度(第2圖)。此外若將膽酸鹽加回至該耗竭的HDL製劑時，以300mg/kg輸注該再補充HDL製劑至大鼠時可增加ALT濃度(第2圖)。這些試驗證明減少膽酸鹽至約1g/L實質上可降低rHDL毒性，但亦具有使PC降低至約1：50 Apo-A1：PC的額外致因。

實例2 比較級化膽酸鹽濃度和Apo-A1：PC比的肝毒性試驗 簡介

此試驗的目標為測定以級化膽酸鹽濃度和如下Apo-A1對PC比例rHDL PC 1：150(3g/L膽酸鹽)、rHDL PC 1：100(1g/L膽酸鹽)、rHDL PC 1：50(3g/L膽酸鹽)、rHDL PC 1：50(0.2g/L膽酸鹽)之重組HDL配製物(rHDL)的肝毒性。使用清醒大鼠模式測定上述配製物對肝功能的影響。藉由測定血清內的肝酵素活性(ALT和AST)評估肝毒性。

Apo-A1被視為是該配製物的活性成分及Apo-A1血漿濃度為其暴露量的關鍵指標。

材料和方法 投與受測rHDL配製物 受測rHDL配製物1

受測rHDL配製物2

受測rHDL配製物3

受測rHDL配製物4

試驗設計

此試驗被設計成總共14隻大鼠的開放式四組試驗。投藥方法摘錄於表1。

治療組

實驗動物

將動物置於固定裝置(大鼠固定器)內然後以靜脈導管穿刺側尾靜脈。供試品被輸注60/120分鐘。

於1h/2h和7h/8h靜脈輸注之後從眼後靜脈叢抽取血液樣本，然後置入血清試管內，儲存於-20℃。

測定肝酵素

利用市售(Greiner Biochemica)的酵素光度檢測試驗套組分析樣本的AST和ALT活性。

測定Apo-AI血漿濃度

藉由濁度分析法測定人類Apo-AI的濃度。

結果

測定具有Apo-AI對PC比例為1：50、1：100和1：150以及一預設膽酸鹽濃度為1或3g/L或膽酸鹽耗竭(0.2g/L)的rHDL配製物。以食鹽水作為載劑以及CSL-111作為陽性對照。於輸注結束(分別為1h或2h，600和900mg/kg)的基線(0時間點)以及於7h或8h時採取血液樣本。於上述的時間點測定肝酵素活性(ALT和AST)以及人類Apo-AI濃度。

基線的AST濃度為介於63和87U/L之間。於輸注結束時以及除了Apo-AI：PC 1：50(0.2g/L膽酸鹽)之外的全部配製物於7h/8h時間點均增加AST濃度。

基線的ALT濃度為介於39和45U/L之間。於輸注結束時以及除了Apo-AI：PC 1：50(0.2g/L膽酸鹽)之外的全部配製物於7h/8h時間點均增加AST濃度。

基線的人類Apo-AI濃度為低於可偵測的最低限值。投與600mg/kg的全部配製物於輸注結束時其濃度增加至約13g/L。以900mg/kg的1：50配製物可產生15g/L的Apo-AI濃度。

全部組的平均和標準偏差、劑量和時間點均摘錄於表2至4。

結論

總而言之僅Apo-AI：PC比例1：50(0.2g/L膽酸鹽)的 rHDL配製物於900mg/kg不導致肝功能試驗的異常。對照含有較高膽酸鹽濃度(3g/L)之相同1：50 rHDL配製物於600mg/kg之下顯示AST和ALT的濃度均上升。因此認為藉由控制rHDL配製物的脂質和殘留去污劑含量可使肝毒性降至最低。

實例3 比較rHDL配製物內膽酸鹽濃度的安定性試驗

本發明rHDL配製物的一具體實施例中顯示與先前技述中rHDL配製物CSL-111比較可明顯降低肝毒性，同時可維持至少與CSL-111相同的生物學活性。此rHDL配製物與CSL-111的不同在於具有較低的蛋白對PC比例、較低的膽酸鹽濃度、較高的蛋白含量以及低蔗糖濃度。

重組HDL的配製 Apo-AI起始材料

使用純化和滅菌Apo-AI溶液作為起始材料。其批量為30g或35g蛋白質。

脂質溶液

下列為製造該脂質溶液的配方。首先，製造含10mM Tris、10mM NaCl和1mM EDTA的緩衝液。根據方程式1計算所需數量：

接著，將膽酸鈉(1.3g/mol脂質)加至該溶液並且使其溶解。

然後，加入計得的脂質量(方程式2)，溫和地攪拌6~18h(脂質溶解)再利用0.2um Millipore Millipak 40 Gamma Gold型濾過器(Millipore貨號MPGL04GH2)進行預過濾步驟。

M(脂質)：775g/mol的PC；731g/mol的SM

M(Apo-AI)：28,078g/mol

脂質培養和UF/DF

將Apo-AI溶液(30g~35g蛋白質)置入5L的雙夾套容器內並且冷卻至1~4℃。接著加入脂質溶液及於1~4℃攪拌2~16小時。就某些試驗而言，該蛋白-脂質溶液於30℃被加熱30分鐘後再冷卻，然後於1~4℃培養2~16小時。

除去膽酸鹽時，以10kDa卡匣對7~9體積的1%蔗糖溶液進行UF/DF。

然後將該溶液濃縮至22~28g/L(20g/L蛋白於FP內濃縮)或32~38g/L(30g/L蛋白於FP內濃縮)及藉由加入蔗糖和WFI而形成7.5%蔗糖和20g/L或30g/L蛋白。將該rHDL批量滅菌過濾(Sartopore 2，150cm2，PES，切成0.1um，Sartorius貨號5441358K-00)及充填入層流內。

以琥石(amberlite)降低膽酸鹽 製備琥石

以Nalgene 0.2um PES過濾器(貨號595-4520)進行全部過濾步驟。

將琥石XAD-2(400g)加入500mL的甲醇20%(v/v)。將懸浮液攪拌1~2小時，然後濾除琥石。接著，將300ml的1M NaOH加入1000mL燒瓶內，加入琥石後於15分鐘的攪拌之下加熱至55~60℃。濾除琥石之後再將此程序另外重複兩次。然後，以水(SWA)清洗該琥石直至中性pH時為止(約10~15L)，濾除，加至300mL的甲醇，攪拌1小時然後混合物於2~8℃至少放置隔夜。移除甲醇，將琥石濾除，以約10L的水(SWA)清洗及再一次濾除。然後，將該琥石倒入約4L相當於該將被清除之重組HDL蔗糖濃度的7.5或10%蔗糖溶液內。將該混合物攪拌數分鐘及於使用前將其濾除。

以琥石降低膽酸鹽

將該重組HDL冷卻至2~8℃，加入琥石XAD-2及將混合物攪拌3.5小時。濾除該琥石並且排出。此步驟進行兩次。

視該實驗，就5g蛋白質而言，各清除步驟係使用100~160g的琥石。

清除之後，加回膽酸鹽以形成不同的膽酸鹽濃度。

就降低重組HDL 1：75 PC至0.7g/L的膽酸鹽而言，藉由加入不同比例的琥石至重組HDL(初步試驗)實驗性測定準備加入琥石的數量。這些試驗發現每5g蛋白質需要50g琥石的處理。然後以此琥石對蛋白質的比例計算用於該主要批量的清除量。

安定性評估 CSL-111

膽酸鹽係一種於冷凍乾燥時會影響肝毒性的化合物。因此，減少終配製物內的膽酸鹽為主要的目標。以CSL-111進行初步的試驗。為尋找不影響產品安定性的最低膽酸鹽濃度，以琥石處理重組CSL-111之後再加回膽酸鹽以獲得不同的濃度。

進行這些材料的安定性評估。同樣，研究不同膽酸鹽濃度對冷凍乾燥CSL-111之安定性的影響。

重組HDL 1：50 PC/1：75 PC

以琥石清除膽酸鹽及補充回膽酸鹽以獲得不同膽酸鹽濃度的兩種配製物(1：50 PC和1：75 PC)。將這些溶液冷凍乾燥、重組，及進行安定性試驗以便測定在不影響這些配製物的安定性之下所需的最低膽酸鹽濃度。

結果 CSL-111的結果

利用琥石處理CSL-111以除去膽酸鹽。然後加回膽酸鹽以獲得用於本試驗所需的不同濃度。

低於2.8g/L膽酸鹽的範圍內，當膽酸鹽濃度進一步降低時其濁度隨之增加。當膽酸鹽濃度高於2.8g/L時，其濁度幾乎無任何改變(第3圖)。

然後將這些樣本冷凍乾燥和重組。於儲存0h、24h和7 天之後測量其濁度。冷凍乾燥和重組之後其濁度值較高於未冷凍乾燥樣本(比較第3和4圖)。

該重組CSL-111顆粒似乎需要最低的膽酸鹽濃度以維持其安定性。若膽酸鹽的濃度過低時，將產生聚集體和提高濁度。同樣，分子大小分佈的變化較快於低膽酸鹽濃度。

重組HDL 1：50 PC

濁度的資料摘錄於表5和6。

該濁度資料顯示膽酸鹽濃度≧0.3g/L時在室溫(RT)下的變化極小。

室溫下24h後的SE-HPLC層析圖(未顯示)證明具有相同濁度值的趨勢。當膽酸鹽濃度≧0.3g/L時，其變化不大。介於0.8~1.0g/L之間時，其層析圖顯示幾乎無差異。因此，若膽酸鹽濃度高於1.0g/L以上時不預期可獲得安定性的提升。就含20g/L蛋白的1：50配製物而言，介於0.3~1.0g/L之間的膽酸鹽濃度因而被認為最適當。計算含30g/L蛋白的一產品時，其最適當膽酸鹽的濃度範圍為從0.5~1.5g/L。

重組HDL 1：75 PC

該1：75配製物的濁度測量(第7和8圖)顯示膽酸鹽濃度低於0.6g/L時明顯增加濁度。另一濃度(0.6~2.0g/L膽酸鹽)於儲存一天之後其差異不大。

室溫下24h後分子大小分佈的SE-HPLC層析圖(未顯示)顯示被清除及另一樣本之間有顯著的差異。

膽酸鹽介於1.0~1.3g/L之間時，其層析圖顯示幾乎無差異。因此，若膽酸鹽濃度高於1.3g/L以上時無法提升安定性。就含20g/L蛋白的1：75配製物而言，介於0.6~1.3g/L之間的膽酸鹽濃度因而被認為最適當。就含30g/L蛋白的一配製物而言，此相當於0.9~2.0g/L的最終膽酸鹽濃度。

結論

本發明的rHDL配製物選擇使用0.5~1.5g/L作為最適當膽酸鹽濃度。低於此範圍時將降低安定性。膽酸鹽濃度高於1.5g/L時將些微地增加安定性。然而，較高的膽酸鹽濃度預期將大幅地提高肝毒性。

實例4 與CSL-111比較的肝毒性試驗 簡介

此試驗的目標為確認本發明rHDL配製物的一具體實施例於靜脈輸注至兔子之後在肝毒性分析中具有較低的毒性。肝毒性被定義為增加血清中的肝酵素(ALT)活性。Apo-A1被視為是該兩種配製物的活性成分及Apo-A1血漿濃度為其暴露量的關鍵指標。

材料和方法 投與受測rHDL配製物 受測rHDL配製物1

受測rHDL配製物2

試驗設計

此試驗被設計成總共6隻雌兔的開放式雙組試驗。投藥方法摘錄於表5。

治療組

實驗動物

動物模式

將動物固定於固定裝置(兔子固定器)。將靜脈導管插入耳靜脈。以40分鐘靜脈輸注投與測試物件。

從耳動脈抽取血液樣本，然後置入血清和鏈球菌激酶-血漿(5%)瓶內。血液樣本的處理為血清儲存於-20℃以及血漿為儲存於-80℃。

測定肝酵素

利用市售(Greiner Biochemica)的酵素光度檢測試驗套組分析樣本的ALT活性。

測定Apo-AI血漿濃度

藉由濁度分析法測定人類Apo-AI的濃度。

結果

體外資料的平均值和標準偏差摘錄於表6至7。

此處受測rHDL配製物的具體實施例並未增加ALT的血清濃度。CSL-111的ALT於第8h從25U/L增加至94U/L。

rHDL配製物(1.5mg/dL)和CSL-111(1.6mg/dL)於40分鐘的時間點時可看到人類Apo-AI峰濃度。

實例5

測定本發明含較低磷脂濃度之顆粒用於製造合成HDL顆粒的能力。Apo-AI磷脂質比例為從1：2至1：55的範圍。

為製造合成HDL顆粒，將膽酸鈉(New Zealand製藥)溶解於緩衝液(10mM NaCl、1mM EDTA、10mM TRIS,pH 8.0)內然後攪拌直至清徹時為止。

將適量膽酸鹽加至大豆卵磷脂(磷脂GmbH)，然後於室溫攪拌16小時。以10mM NaCl將該Apo-AI溶液稀釋至9.0g/L的蛋白質濃度(藉由OD280測定)，然後混合適量的脂質溶液而獲得適當蛋白對脂質比例。於2~8℃將該混合物攪拌16小時。利用1%蔗糖作為電泳緩衝液於HiPrep 26/10脫鹽管柱上除去膽酸鹽以製備HDL模擬物。藉由超過濾將洗出液分別濃縮至20g/L的蛋白質濃度和7.5%的蔗糖。

將該重組HDL製備物培養(儲存)於2~8℃及在0、5和 14天之後測量下列的參數：-穿透率(405nm)、粒徑分佈(SE-HPLC)、內毒素、SDS-PAGE(還原和非還原)、原態膠體電泳(Native PAGE)、LCAT活性、Apo-AI濃度和體內毒性。

於第0天時進行下列的附加試驗：(i)藉由適合含脂質樣本的改性縮二脲濃縮蛋白質(將脫氧膽酸鹽加至縮二脲溶液)；(ii)磷脂醯膽鹼濃度(ProDiagnos-ticamti-diagnostics GmbH)；以及(iii)藉由Gallsauren和Gallsauren-Stoppreagens比色測試套組(Trinity Biotech)測定膽酸鹽濃度。

利用Superose 6 10/300GL管柱(GE Healthcare)以含有PBS+0.1%疊氮化鈉作為電泳緩衝液的SE-HPLC測定粒徑分佈。流率為0.5mL/分，注射5uL樣本，偵測波長為280nm。藉由SDS-PAGE(還原/未還原)利用以4~12% NuPAGE Noves Bis-Tris凝膠及MOPS或MES電泳緩衝液(Invitrogen)的Xcell SureLock Mini-Cell分析該合成HDL顆粒。以Bio-Safe考馬斯染色(Bio-Rad)可看到蛋白質帶。利用含4~16%原態Page Novex Bis-Tris凝膠和原態PAGE電泳緩衝液套組(Invitrogen)的Xcell SureLock Mini-Cell進行原態PAGE。以GelCode藍色染料試劑(Thermo Scientific)可看到蛋白質帶。利用3D CE儀(Agilent Tech.)和延伸光路徑CE毛細管(50um,56cm；均為Agilent Tech.)的毛細管電泳法測定該Apo-AI濃度。該電泳緩衝液為53mM Na-Borat pH 9.1、0.21% SDS、5%甲醇。在25kV操作該電泳法。

LCAT活性被測定四次。簡言之，抽吸10uL樣本至一冷卻管。將150uL人類血漿、150uL PBS和20uL 14C膽固醇(Perkin Elmer)溶解於25mg/mL人類白蛋白溶液內，混合及於2~8℃培養90分鐘。將複製樣本培養於37℃，其他兩件樣本(黑)則於2~8℃培養30分鐘。加入2mL乙醇中止該反應及其後以己烷(1x5mL，1x3mL)萃取兩次。將該己烷揮發至乾燥及使殘留物再溶解於0.5mL己烷內。藉由使萃取物通過以2x1mL己烷洗脫的固相胺基SPE管柱從其他物質分離出膽固醇酯。於β閃爍計數器上測定洗出液內的放射性。

體外毒性涉及製備HEP-G2細胞(第1天)：從一T75燒瓶取出對數期培養的HEP-G2細胞，除去培養基及以PBS清洗細胞。冷凍乾燥及懸浮於10mL培養基(90% DMEM、10%不活化FCS、1%非必需胺基酸、1%青/鏈黴素)之後藉由Neubaure/錐蟲藍測定其濃度。將100ul細胞(10x104C/mL)/孔種入96孔F-底平板內。將該平板於37℃/5% CO2、95% H20培養隔夜。培養(第2天)：於培養基內製備最高化合物濃度的700uL樣本。移除第一行之孔的培養液及將200uL溶液加至細胞。進行一系列的1：2倍序列稀釋及將平板於37℃/5% CO2、95% H2O培養72小時。活力(第3天)：將50Ul的3x天然紅色溶液(100mL PBS內的70mg天然紅)加至各孔。將平板於37℃/5% CO2、95% H2O培養2小時及以200uL PBS/孔清洗一次，然後將100uL乙醇加入各孔再將平板置於振盪器上20分鐘。於540nm讀取各孔的吸光率。

表8為含有不同磷脂對蛋白比例之合成HDL顆粒的特性摘要。其%穿透率顯示該顆粒為安定。LCAT值隨著存在於合成顆粒內磷脂的減少而降低。此與磷脂被作為LCAT的基質具有一致性。

HPLC-SEC結果顯示1：20和1：30比例的顆粒可被洗脫成單對稱峰。具有較低脂質對Apo-AI程度的合成HDL顆粒含有較1：5和1：2比例顆粒更為顯著的肩部。此外，當降低磷脂對蛋白比例時，其主峰的洗脫時間逐漸變遲。此表示該顆粒逐漸變小。此大小變化亦反應在原態PAGE的結果，其比例從1：55降低至1：2時將增加低分子量帶的強度。全部樣本的SDS-PAGE亦有類似的結果。

體外檢測結果顯示各製劑於超過14天的期間仍然維持安定的細胞活性。當該細胞與最高濃度的重組HDL(2mg/mL)共同培養時，隨著脂質的增加其細胞活性有些微降低(請看下表9)。

實例6

檢測利用不同去污劑重組合成HDL顆粒的毒性效應。

藉由將琥石XAD-2球珠於20%甲醇內培養隔夜及其後以1M氫氧化鈉清洗4次和以超純水清洗兩次的方法製造該顆粒。球珠在使用前以7.5%蔗糖清洗及於過濾器上乾燥。

藉由下列方法製造該合成HDL顆粒。以WFI重組含有殘留膽酸鹽的冷凍乾燥HDL顆粒至30g/L的蛋白質濃度。將琥石XAD-2球珠(10g/每g蛋白質)加至重組HDL製劑及振盪下於2~8℃培養3.5小時。藉由過濾移除球珠之後此步驟以琥石XAD-2球珠的另一種蛋白(10g球珠/每g蛋白質)再重覆一次。然後藉由過濾移除球珠及加入去污劑(膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、辛基葡糖苷、Polysorbate 80)而獲得1g/L或6g/L的終去污劑濃度。

然後如上述實例的檢測方法測定該樣本的安定性。

藉由光度檢測法測定Polysorbate 80製劑的去污劑濃度。以5mL的0.1M醋酸銨沈澱以及藉由離心沈降1000uL樣本內的蛋白。將上清液揮發至乾燥及再溶解於1mL四硼酸鈉pH 9.1緩衝液(0.953g四硼酸鈉以水加至100mL，加入10mL HCl)內，加入4mL TBPE-K溶液(1.76g氯化鉀、0.48g四硼酸鈉、4800uL 0.1M KOH、5mL乙醇內0.015g TBPE-K，以水加至100mL)，然後於頭尾相覆混合機上以2.5mL二氯甲烷萃取30分鐘。相分離之後於611nm(對照波長700nm)測定該二氯甲烷相的吸附量。

表10為含有不同磷脂對蛋白比例之合成HDL顆粒的特性摘要。其%透光率和LCAT值顯示該顆粒具有安定和功能性。

HPLC-SEC結果顯示該含有不同去污劑的顆粒可被洗脫成單對稱峰。此於原態PAGE的圖譜中亦可發現相同的情形。全部樣本的SDS-PAGE亦有類似情形。

體外檢測結果顯示細胞活性視去污劑存在的濃度而不同。特別是於高去污劑濃度之下將降低細胞的活性。然而在14天的期間該值仍維持安定狀態(請看表11)。

*空白細胞表示未取得該資料。

實例7

除了使用POPC(NOF公司)重組HDL顆粒之外，以上文中實例5中所述的方法製造該合成HDL顆粒。然後藉由實例5中所述的方法測定該顆粒。

結果顯示其係具有與以大豆卵磷脂重組之合成HDL顆粒類似毒性的一種安定/功能性產物(表12和13)。

實例8

藉由健康自願者的單次或多次靜脈輸注可測定出本發明之重組HDL配製物逐漸升高劑量的安全性、忍受性和藥物動力學。此試驗具有使用上升劑量之合成HDL顆粒以及另一使用正常食鹽水(0.9%)作為安慰劑比較藥的兩組。該輸注係於隨機和雙盲目(病人、測定者和結果判定者)的方式進行。

該健康自願者為18至55歲的男性或女性，以及體重至少45kg。其他入選條件包括在18和42.0kg/m2之間的體質指數(BMI)。排除條件包括(i)臨床上重大醫學疾病、障礙或病症的證據；(ii)肝膽疾病的證據；(iii)臨床上有關異常實驗室檢測結果的證據；以及(iv)曾經酗酒或吸毒的證據。

安全性和忍受性的測定將藉由：(i)輸注後高至14天與藥物有關之臨床不良事件出現頻率；以及(ii)輸注後高至14天肝功能試驗的檢測(如丙胺酸轉胺酶(ALT)或天冬胺酸轉胺酶(AST)的升高)。輸注合成HDL顆粒後測量高至10天的藥物動力學資料。特定的檢測包括測量脂蛋白的血漿濃度。

結論

評估本發明rHDL配製物和CSL-111配製物以測定本發明rHDL配製物是否於維持生物學活性之下仍能改善其毒性強度。本發明的rHDL配製物具有1：40或1：55的低Apo-AI對PC比例，同時CSL-111具有1：150的比例。此外進一步的純化可形成實質上低膽酸鹽的配製物。因而本發明的rHDL配製物與CSL-111比較呈現較低的肝毒性。重要的是，兩種配製物具有類似Apo-AI的血清濃度，而證明具有類似的活性成分暴露量(請看表7)。

全文專利說明書的目的為描述本發明的較佳具體實施例而不侷限於本發明的任何一具體實施例或特定類性質。所述及圖解的該具體實施例可進行各種的變化和修飾而不偏離本發明。

此專利說明書中所提及有關各種專利和科學文件、電腦程式和演算法的揭示藉由引述被完整併入於此。

請參考下列有助於瞭解詳述於下文中之本發明非侷限性具體實施例的圖例，其中：第1圖為同步減少低肝毒性膽酸鹽和磷脂醯膽鹼之急性大鼠試驗的結果；第2圖為選擇性減少低肝毒性膽酸鹽之急性大鼠試驗的結果；第3圖為存在不同濃度膽酸鹽之下CSL 111之濁度分析的結果；第4圖為存在不同濃度膽酸鹽於冷凍乾燥和重組之後CSL 111濁度的結果；第5圖為室溫(RT)下重組HDL對PC 1：50之濁度分析的結果；第6圖為37℃下重組HDL對PC 1：50之濁度分析的結果；第7圖為室溫下重組HDL對PC 1：75之濁度分析的結果；第8圖為37℃下重組HDL對PC 1：75之濁度分析的結果；以及第9圖為一具體實施例中rHDL配製物之製造過程的概述。

Claims

一種包含有一脂蛋白A1(Apo-A1)或其片段、一磷脂以及一去污劑的重組高密度脂蛋白(rHDL)配製物，其特徵在於該去污劑的濃度為0.5~1.5g/L rHDL配製物且0.015~0.030g/g脂蛋白A1；該脂蛋白A1與該磷脂的克分子比例為1：40或1：55。
如申請專利範圍第1項之rHDL配製物，其中該去污劑係膽鹽或膽酸。
如申請專利範圍第2項之rHDL配製物，其中該去污劑係膽酸鈉。
如申請專利範圍第1項之rHDL配製物，其中該磷脂係磷脂醯膽鹼。
如申請專利範圍第1項之rHDL配製物，其中該配製物進一步包含一安定劑。
一種製造如申請專利範圍第1項所述之rHDL配製物的方法，包括：(I)於不存在有機溶劑和去污劑之下將磷脂加至Apo-A1溶液，其中Apo-A1：磷脂醯膽鹼的比例為約1：40或1：55；(II)將步驟(I)所製造的溶液內去污劑濃度降低至約0.015~0.030g/g Apo-A1；(III)將安定劑加至步驟(II)的溶液，以獲取前述rHDL配製物。
如申請專利範圍第6項之方法，其中該去污劑的濃度為約0.5~1.5g/L。
如申請專利範圍第6項之方法，其中該去污劑係膽鹽或膽酸。
如申請專利範圍第8項之方法，其中該去污劑係膽酸鈉。
如申請專利範圍第6項之方法，其中該磷脂的濃度為可呈現肝毒性的最低或閥值之濃度的20~70%。
如申請專利範圍第6項之方法，其中該磷脂係磷脂醯膽鹼。
一種包含有如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之rHDL配製物在製備治療人類疾病、障礙或病症的藥物之用途。
如申請專利範圍第12項所述之rHDL配製物在製備治療人類疾病、障礙或病症的藥物之用途，其中該疾病、障礙或病症包括心血管疾病、高膽固醇血症或低膽固醇血症。
如申請專利範圍第13項所述之rHDL配製物在製備治療人類疾病、障礙或病症的藥物之用途，其中該心血管疾病包括急性冠心病(ACS)、動脈粥樣硬化症和心肌梗塞。