CN109701004B - 去除污染物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及去除污染物的方法。具体而言，本发明提供一种用于纯化Apo A‑I的方法，其包括提供包含Apo A‑I和盐酸胍的溶液并通过具有从15nm至35nm的孔径范围的过滤器过滤该溶液从而减少Apo A‑I的病毒污染的步骤。本发明提供一种Apo A‑f制备物，其针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)；和/或针对无包膜病毒具有至少9log的LRV；和/或针对脂质包膜病毒具有至少8.5log的LRV。本发明还提供包含Apo A‑I的药物组合物和重构的高密度脂蛋白制剂以及用于治疗疾病、紊乱或病况的方法。

Description

去除污染物的方法

本申请是申请日为2014年8月8日、申请号为201480044463.6、发明名称为“去除污染物的方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种用于纯化载脂蛋白的方法，特别是用于从含有载脂蛋白A-I(ApoA-I)的溶液去除病毒病原体的方法，并涉及提供一种Apo A-I制备物。

背景技术

载脂蛋白是可溶性脂蛋白复合体中的主要蛋白质组分，载脂蛋白A-I(ApoA-I)为高密度脂蛋白(HDL)颗粒的主要蛋白质组分。

载脂蛋白的A、C和E家族由共同的祖先基因进化而来，它们在结构上是相似的。这些蛋白质分子一般含有一系列22-氨基酸串联重复，其常常被脯氨酸残基分隔开。重复的22-氨基酸节段形成两亲性的α-螺旋，其能够既与脂质结合又与水表面结合。在人Apo A-I(243个氨基酸；28.1kDa)的情况下，有八个22聚体和两个11聚体的两亲性螺旋(Lund-Katz&Phillips,2010,Subcell Biochem.51,183-227)。载脂蛋白的两亲性的α-螺旋在稳定脂蛋白中起着关键性的作用。它们通过定向载脂蛋白来做到这一点，使得主要疏水性的螺旋面能够与复合体中的疏水性脂质发生相互作用，而载脂蛋白的主要亲水性的相对面与周围含水环境发生相互作用。但是，当这些蛋白质与脂质组分分开时，疏水性氨基酸残基暴露于含水环境可使它们变得难以处理。特别是α-螺旋的疏水面具有自缔合的倾向，其导致聚集体形成和在一些条件下发生沉淀。例如，据估计，当被存储于pH 7.4的50mM磷酸盐缓冲液中时，1mg/mL含有Apo A-I Milano的溶液含有80％的聚集形式的蛋白质(Suurkuusk&Hallén,2002,Spectroscopy 16,199-206)。

Apo A-I由肝脏和小肠合成并负责HDL在血液中的生理功能；通过被称为“反向胆固醇运输”(RCT)的机制从外周组织去除胆固醇，将其运载回肝脏或其它脂蛋白。结果，HDL颗粒以一系列尺寸存在于血浆中，并由于这些RCT脂质运输活性而不断重构。因此，HDL颗粒的特征在于高密度(>1.063g/ml)并且尺寸范围为大约5至20nm(斯托克斯直径)。根据流行病学和纵向研究，血清胆固醇水平的升高和冠状动脉心脏疾病(CHD)的发展之间的明显的相关性已被多次证实。因此，HDL中的Apo A-I被认为具有抗炎功能并抑制CHD的发生和发展。此外，Apo A-I已经显示出降低血液中低密度脂蛋白(LDL)水平和已知与脂多糖或内毒素结合，从而在HDL的抗内毒素功能中具有主要作用。HDL和作为其主要蛋白质组成的ApoA-I的“保护性”的作用已在多项研究中被证实。Apo A-I的高血浆水平与CHD和冠状动脉病变存在的降低的风险有关。因此，Apo A-I有希望应用于像重构的HDL的药物，其用于在急性冠脉综合征、动脉粥样硬化治疗、抗炎治疗、抗毒素治疗、肝靶向药物等中的应用。

通常使用生物学原料制造重组或血浆来源的生物学药物，所述生物学原料被固有地污染有诸如病毒的病原体。此外，一些制造方法由于其性质容易受到来自外部来源的病原体污染。因此，需要生物学药物的制造商向他们的制造方法中引入足够的病毒清除步骤，以确保他们的产品不含污染物。

用重组DNA在细胞培养物、转基因动物或转基因植物中生产生物技术产品(通常为蛋白质或DNA)。生产中使用的常见细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、大肠杆菌细菌和酵母。通常以分批模式实施基于细胞的生产系统，然而也在使用少量灌注系统。主要以基于CHO的8,000–25,000L规模的发酵器在1,000–100,000L的规模进行最终商业规模的发酵。

现在，大量收集人血浆(例如，据已估计，在2010年全世界收集了3千万升的血浆)并将其加工成各级分；这些级分中的一些级分含有载脂蛋白，Apo A-I。这样的血浆级分的实例包括科恩上清I，科恩级分II+III和科恩级分IV(例如科恩级分IV-1)或其变化(例如为Kistler/Nitschmann级分IV)。因为血液和血浆潜在地含有输血传播的病原体，当血液来源的或血浆来源的组分被用作药物或用作治疗递送的载体时，这样的病原体、特别是病毒必须被去除或灭活。但是，即使这些组分被高度纯化，病毒通常不容易被去除并且可能仍然存在于血浆来源的组分中。特别受到关注的尤其是小的无包膜病毒，诸如尺寸为大约27-32nm的小核糖核酸病毒科(例如甲型肝炎病毒)和尺寸为大约18-26nm的细小病毒。这是由于它们的小尺寸和它们的高物理化学稳定性。因此，存在开发使得血浆来源的蛋白质药物的病毒被有效去除或灭活的方法的持续需要。

常见的病毒灭活技术包括物理方法诸如经典的巴氏灭菌操作(60℃加热10小时)，短波长紫外光照射或γ射线照射和化学方法诸如溶剂去污剂或低pH温育。病毒去除技术包括尺寸排阻方法诸如病毒过滤，其也常常被称为纳米过滤。这些病毒过滤方法已被证明是用于从蛋白质溶液中去除病毒的有效方法。

病毒过滤具有用于从蛋白质溶液中去除病毒的温和方法的益处，并且通常允许高的蛋白质回收水平并完全保留蛋白质的生物学活性。最佳的病毒过滤器必须使得容量、处理量(throughput)和选择性最大化。病毒过滤器的容量是恒压过滤期间在通量下降到不可接受的低值之前每m²过滤器的表面积能够处理的滤液的总体积。处理量是指进料可被过滤的速度(最大可持续透过通量)。选择性是指产生高的产品回收和高的病毒颗粒保留的能力。这些过滤器必须能够以可接受的滤液通量处理整个批量的进料，拒绝病毒颗粒，并使蛋白质通过最大化。病毒过滤期间的结垢通常受蛋白质聚集体、DNA、部分变性的产物或其他碎片控制。

过滤器制造商通常给市售过滤器指定像标称或平均的孔径等级的术语，其通常表示满足某种颗粒或微生物保留标准，而不是表示实际孔的几何尺寸。

对于病毒清除，通过过滤膜进行过滤，所述过滤膜具有小于待去除的病毒的有效直径的标称孔径。只有少量异常大的孔(300kDa或更大的标称截留分子量，NMWCO)的存在将允许过量病毒泄漏。因此，必须这样制造病毒过滤器以便消除所有宏观缺陷。这通常是通过使用复合膜实现的，其提供所需的病毒保留和机械稳定性的组合。如以下文献：Manabe.S,Removal of virus through novel membrane filtration method.,Dev.Biol.Stand.,(1996)88:81-90；Brandwein H等人,Membrane filtration for virus removal.,DevBiol(Basel).,(2000)102:157-63；Aranha-Creado等人,Clearance of murine leukaemiavirus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporousmembrane filter.,Biologicals.(1998)June；26(2):167-72；Mocé-Llivina等人,Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes infiltering viral suspensions,Journal of Virological Methods,(2003)April,Vol.109,Issue 1,Pages 99-101中所述，去除病毒的过滤膜通常由诸如再生纤维素，例如铜铵-再生纤维素或合成聚合物材料如亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)或亲水性聚醚砜(PES)的材料制成。

已被描述的病毒过滤方法包括WO96/00237，其涉及通过向溶液加入盐到至少0.2M水平过滤病毒的方法，所述溶液含有大分子(即蛋白质)。该申请人建议使用呈现高盐析效应的盐，所述效应是霍夫迈斯特(Hofmeister)序列中高的一端的特性，特别是柠檬酸盐、酒石酸盐、硫酸盐、乙酸盐或磷酸盐阴离子和钠、钾、铵或钙阳离子。特别优选的是氯化钠，并且不使用在该序列中低的一端呈现低盐析效应的盐(例如GuHCl)。

与WO96/00237一致，Kim等人(Biotechnology&Bioprocess Engineering,2011,16,785-792)描述了在氯化钠的存在下(250mM NaCl，30mM Tris，pH 8)Apo A-I的病毒过滤。该步骤是在从DEAE-FF柱洗脱之后立刻进行的。然而，Apo A-I聚集的倾向限制了制造，因为理想情况下需要完成过滤步骤或者是因为Apo A-I从柱洗脱或者是因为Apo A-I需要在非常低的蛋白质浓度(例如0.1mg/mL)下在盐的存在下进行存储。这后一种方法的缺点则是需要过大的过滤体积。病毒过滤器的成本是巨大的。因此，由于例如载脂蛋白聚集或过大的过滤体积导致过滤器容量的任何减少可能导致商业规模上显著更高的加工成本。

WO03/105989涉及包合物(clathyrate)改性剂(诸如多元醇糖或糖醇(即蔗糖和山梨糖醇))的用途，并且旨在增加过滤膜表面的疏水性和降低蛋白质的流体动力学半径以及减少期望被过滤的蛋白质的自缔合倾向。

US 2003/232969A1涉及用于通过纳米过滤从像纤维蛋白原(340kDa)的高分子量蛋白质的溶液去除病毒的方法。

像相对较小(28kDa)的Apo A-I的载脂蛋白应该是容易进行病毒过滤的。但是，如上文已经描述过的，它们的疏水性质以及它们的令人遗憾的形成聚集体的倾向促进蛋白质团块在过滤器表面上的形成并且还堵塞过滤器的孔。就过滤器本身而言，这既可以通过孔的堵塞和/或通过饼或沉淀的形成而发生于膜的上表面上也可以发生在膜的孔结构内。结垢引起恒压操作下流速的衰减并增加在恒定滤液通量下的操作压力。过滤器结垢的结果是，可能存在过滤选择性的下降，其导致更低的蛋白质回收和/或更低的病毒保留。此外，过滤器结垢降低容量和处理量，其导致更长的过滤时间和/或需要增加过滤器面积。另外，对于维持载脂蛋白的溶解性和防止聚集是最佳的操作条件可能对于确保高的病毒清除并不是最佳的。特别是可能被用于稳定载脂蛋白的离液物质可改变病原体(例如病毒)的可过滤性，还可能改变过滤膜。结果，特定浓度的离液物质的存在可能也使得不期望的病毒渗透穿过过滤膜，从而否定了处理包含载脂蛋白的溶液的步骤的有用性。

因此，本发明的目的是提供用于安全去除病毒(特别是小的无包膜病毒诸如细小病毒科)的过滤方法，其适用于包含载脂蛋白(像Apo A-I)的溶液，并且其也适用于产业应用。

发明内容

通过一种用于纯化载脂蛋白A-I(Apo A-I)的方法来广义地实现本发明的目的，所述方法包括通过具有合适的孔径的过滤器过滤包含Apo A-I和盐酸胍(GuHCl)的溶液。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于纯化载脂蛋白A-I(Apo A-I)的方法，包括以下步骤：a)提供包含Apo A-I和盐酸胍(GuHCl)的溶液；以及b)通过具有15nm至35nm的孔径范围的过滤器过滤所述溶液。

在一个实施方案中，所述方法是用于减少Apo A-I的病毒污染。在本发明的一些实施方案中，所述方法是用于减少Apo A-I的病毒污染，其中病毒污染包括细小病毒。在特定实施方案中，细小病毒是小鼠的细小病毒(MVM)。在本发明的一些实施方案中，所述方法是用于减少Apo A-I的病毒污染，其中病毒污染包括小核糖核酸病毒科病毒。在特定实施方案中，小核糖核酸病毒科病毒是脑心肌炎病毒(EMCV)或甲型肝炎病毒。

在一个优选的实施方案中，所述溶液包含5至30g/L的范围内的Apo A-I蛋白浓度，特别是5至20g/L，例如7至12g/L。

在一个优选的实施方案中，所述溶液包含减少或抑制所述Apo A-I聚集的GuHCl浓度。所述溶液可以特别包含1.3至3.2M、特别是1.5至2.0M的范围内的GuHCl浓度。更优选地，溶液中GuHCl浓度为1.7M。

在一个实施方案中，所述溶液的pH在7.1至7.5的范围内，诸如为7.3。

在一个实施方案中，所述溶液通过以下一个或多个步骤制备：1)将Apo A-I沉淀物悬浮于4.0至4.6M的GuHCl；和/或2)将悬浮液稀释至5至30g/L的范围内的Apo A-I蛋白浓度，和/或稀释至1.3M至3.2M的范围内的GuHCl浓度。

在一个实施方案中，在步骤b)之后，进行用于病毒灭活的热处理步骤。热处理包括以下步骤：调整所述溶液的pH在6.6至8.0的范围内；以及随后在55至61℃的温度将所述溶液加热大约30分钟至大约4小时。

在一个备选的实施方案中，在步骤a)之前，进行用于病毒灭活的热处理步骤。热处理可以包括以下步骤：提供pH在6.6至8.0的范围内的包含GuHCl和Apo A-I的溶液；以及随后在55至61℃的温度将所述溶液加热大约30分钟至大约4小时。

在优选的实施方案中，具有pH在6.6至8.0的范围内的溶液包含2.7M至3.9M的范围内、或者更优选地为3.5M的GuHCl浓度。

在本发明的实施方案中，具有pH在6.6至8.0的范围内的溶液的pH优选在7.0-8.0的范围内。在特定实施方案中，pH为7.3。

本发明的一个方面还提供由本发明的方法纯化的Apo A-I。

本发明的一个方面还提供一种Apo A-I制备物，其针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)；和/或针对无包膜病毒具有至少9log的LRV；和/或针对脂质包膜病毒具有至少8.5log的LRV。在特定实施方案中，所述Apo A-I制备物适合于药物用途。

在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含根据前述方面所述的Apo A-I或Apo A-I制备物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在又一个方面，本发明提供一种生产药物组合物的方法，包括根据前述方面所述的方法生产Apo A-I和组合所述Apo A-I与药学上可接受的载体或稀释剂；或组合前述方面所述的Apo A-I制备物与药学上可接受的载体或稀释剂；由此生产所述药物组合物。

本发明的另一个方面提供一种rHDL制剂，其包含根据前述方面所述的Apo A-I或Apo A-I制备物和脂质。

在又一个方面，本发明提供一种生产重构的HDL制剂的方法，包括根据前述方面所述的方法生产Apo A-I和组合所述Apo A-1与脂质；或组合前述方面所述的Apo A-I制备物与脂质；由此生产所述重构的HDL制剂。

本发明的又一个方面提供治疗或预防哺乳动物的疾病、紊乱或病况的方法，包括向哺乳动物施用根据前述任意方面的哺乳动物Apo-A1、Apo-A1制备物、药物组合物或rHDL制剂的步骤，由此治疗或预防所述疾病、紊乱或病况。

附图的简要说明

图1：显示了在3.2M GuHCl、19.7g/L蛋白质的条件下纳米过滤过程中溶液的处理量[kg/m²]。

图2：显示了在1.7M GuHCl、8.9g/L蛋白质的条件下纳米过滤过程中溶液的处理量[kg/m²]。

图3：显示了在1.7M GuHCl、5.8g/L蛋白质的条件下纳米过滤过程中溶液的处理量[kg/m²]。

图4：显示了整个纳米过滤过程中的负荷(load)和通量。

发明详述

在整个说明书中，除非语境另有要求，否则单词“包含(comprise)”(或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化)应当理解为意指含有包括所述的元素或整数或者元素或整数的组的意思，但并不排除任何其他的元素或整数或者元素或整数的组。

在本说明书中对任何在先出版物(或来源于它的信息)的引用、或对任何已知主题的引用不是并且不应该被视为对以下内容的认可或承认或任何形式的暗示：在先出版物(或来源于它的信息)或已知主题构成本说明书所属领域的公知常识的一部分。

必须注意的是，除非语境另外清楚地说明，否则本说明书中使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括其复数方面。因此，例如对“一种蛋白质”的引用包括单一的蛋白质以及两种或更多种蛋白质。

与数值x有关的术语“大约”是指例如x±10％。

尽管本发明提供涉及多个连续步骤的方法，本发明也可以提供涉及小于步骤总数的方法。可以在非常不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同的国家)进行不同的步骤。

除非具体指明，否则包含混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序进行混合。如果有三种组分，那么两种组分可以互相进行组合，然后可以将它们的组合与第三种组分进行组合，等等。

在过滤器的语境中的术语“孔径”通常是指过滤器中的孔的尺寸。通常，孔径小于或不到能够被该过滤器去除的最小病毒的尺寸。在该语境中，虽然本发明的某些实施方案可能提到孔径的几何性质(例如直径)，但是如将在后文中进行更详细地描述，应当理解的是可以从功能上定义孔径。

已经出乎意料地发现，当使用根据本发明的盐酸胍(GuHCl)(有时也称为氯化胍或缩写为GdHCl、GdmCl或GndCl)时，可以通过具有15nm至35nm的孔径范围的过滤器过滤ApoA-I溶液，实现基本上或完全的病毒清除，而没有蛋白质的聚集和堵塞过滤器。在特定实施方案中，过滤器具有以下范围的孔径：15nm至35nm；或15nm至小于35nm；或15nm至30nm；或15nm至25nm；或15nm至20nm；或20nm至25nm；或18nm至23nm；或15nm至26nm；或18nm至26nm；或27nm至32nm；或25nm至30nm；或20nm至30nm。

在本发明的实施方案中，具有范围为15nm至35nm的孔径的过滤器具有范围为15nm至35nm的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有以下范围的平均孔径：15nm至小于35nm；或15nm至30nm；或15nm至26nm；或18nm至26nm；或15nm至25nm；或15nm至20nm；或20nm至25nm；或18nm至23nm；或27nm至32nm；或25nm至30nm；或20nm至30nm。在特定实施方案中，平均孔径为大约15nm；或大约20nm；或大约25nm；或大约30nm；或大约35nm。

从以下两个观点看，使用GuHCl是有利的：1)由于其离液性，GuHCl用作抗聚集剂并由此抑制溶液中例如Apo A-I蛋白的聚集体团块的形成；2)但是，它没有不可逆地影响载脂蛋白结构，使得一旦去除GuHCl，Apo A-I螺旋重新形成并且该蛋白质能够与脂质缔合形成颗粒，如重构的HDL。此外，该载脂蛋白维持其生物学活性，这对于该产物进一步用作药物物质非常重要。

本发明的一个优点是能够提高流速并降低过滤所需的液体体积以及过滤面积和处理时间。结果，在短时间内能够过滤更多的Apo A-I溶液，大大提高该方法的效率。

能够用本发明有效去除的病毒可以具有小于大约300nm的尺寸。能够被合适地去除的病毒的尺寸为小于大约200nm。此类病毒的实例包括巨细胞病毒(大约180-200nm，血浆产物)；单纯疱疹病毒(大约150-200nm，重组产物)；以及EB(epstein-barr)病毒(大约120-200nm，重组抗体产物)。能够被去除的病毒的尺寸优选小于大约120nm。此类病毒的实例包括HIV(大约80-120nm，血浆来源的产物)。通常，能够被去除的病毒大于大约20nm，即细小病毒(15-26nm，血浆和重组来源的产物)的大致尺寸。尺寸为大约18-26nm的细小病毒(如B19(血浆产物))难以从治疗性蛋白质源中去除，因此纳米过滤通常被认为是评价病毒清除率的关键制造步骤，因为20nm范围的过滤器孔径接近于细小病毒的已知尺寸。尽管如此，本发明的方法允许安全和有效去除小病毒，诸如细小病毒科的成员和甲型肝炎病毒(大约27-32nm，血浆产物)、乙型肝炎病毒(大约42nm，血浆产物)、丙型肝炎病毒(大约30-60nm，血浆产物)和脑心肌炎病毒(大约25-30nm；重组产物)。这是尤其值得注意的，因为根据现有技术，需要用于稀释的过量液体以防止蛋白质的聚集和过滤器的堵塞，其常常导致小病毒的穿透(break-through)。

在本发明的特定实施方案中，过滤器具有能够从包含Apo A-I和盐酸胍(GuHCl)的溶液去除细小病毒(诸如MVM或B19)；和/或甲型肝炎病毒；和/或小核糖核酸病毒(诸如脑心肌炎病毒)的孔径。

根据对数减少值(LRV)对病毒保留进行适当表征，LRV被定义为进料中病毒浓度与滤液中病毒浓度的比的对数(底数为10)：LRV＝-log10S，其中S是病毒的筛分系数。总共所需的LRV取决于原料的性质和病毒污染的潜力。病毒过滤步骤通常被设计成提供最小为4的病毒去除对数(LRV)。将高滴度感染性病毒(具有不同的物理特性)加标至成比例缩小的模块并评估LRV来进行病毒清除研究。包膜病毒和无包膜病毒两种病毒的去除可以被证实。常见模型病毒包括动物细小病毒(例如MVM，B19)、脊髓灰质炎病毒(非特异性模型病毒)、脑心肌炎病毒(EMCV)(小核糖核酸病毒科病毒如甲型肝炎病毒的模型)、猴病毒40(SV40，非特异性模型病毒)、辛德比斯病毒(丙型肝炎病毒的模型)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV，黄病毒科病毒如丙型肝炎病毒的模型)、鸭乙型肝炎病毒(乙型肝炎病毒的模型)、日本脑炎病毒(丙型肝炎病毒的模型)和呼肠弧病毒(非特异性模型病毒)。也可以用噬菌体进行初始设计研究，其可以高得多的纯度和滴度获得，并且其测定要容易得多(并且更加廉价)。

病毒过滤验证研究通常以小规模进行，通常使用具有13-47mm的皿的自成一体的装置。所有的工艺参数以线性方式成比例缩小并应当代表对于病毒清除的最差情形的条件。同样重要的是与产业规模工艺设计相比每表面积处理更多量的进料流以保证在最差情形的工艺条件情况下进行验证。应当在若干级分中测量病毒清除率。最近的几项研究已经证实，当使用细小型病毒过滤器(孔径20nm)时，病毒清除率能够随着膜结垢(渗透率减小)的程度而降低。

本发明的方法提供非常有效的灭活和/或去除病毒的方式。原则上，假定实际存在这样的高病毒含量，本发明允许非常小的无包膜病毒(诸如细小病毒)的含量减少至少3log的LRV(减少至病毒数量的1/1,000)，合适地减少至少4log的LRV(减少至1/10,000)，合适地减少至少5log的LRV(减少至1/100,000)和优选减少至少6log的LRV(减少至病毒数量的1/1,000,000)。

此外，根据本发明的过滤方法能够容易地与其他病毒去除或灭活步骤(诸如热处理步骤)组合，用于确保甚至更高的病毒耗尽。

任选地，可以在病毒过滤之前进行预过滤或澄清过滤步骤，以去除大尺寸的颗粒。也可以用包含具有比去除病毒的膜的孔径更大的孔径的膜的过滤器进行这样的预过滤。在本发明的一个实施方案中，预过滤器具有0.05-0.5μm的孔径范围。在特定实施方案中，预过滤器选自Pall尼龙膜过滤器(SKL 7002NTP 0.1μm或FTKNI)或Sartopore 2过滤器。在特定实施方案中，使用每kg Apo A-I沉淀物原料至少0.025m²过滤器表面积来选择预过滤器的尺寸。在其他实施方案中，使用每kg Apo A-I沉淀物原料至少0.014m²过滤器表面积来选择预过滤器的尺寸。在特定实施方案中，预过滤器尺寸的范围为每kg Apo A-I沉淀物原料大约0.014m²至大约0.035m²过滤器表面积。可以与病毒过滤器一致或与病毒过滤器不一致进行预过滤。在特定实施方案中，与病毒过滤器一致进行预过滤。在特定实施方案中，预过滤器由与病毒去除过滤器相同的膜材料制成。

适用于根据本发明的病毒过滤方法的过滤器是市售可得的并且可以例如尤其是以Planova BioEx(Asahi Kasei Corporation)的名称被购买到。有时，这样的过滤器被称为‘小病毒’去除过滤器。

在特定实施方案中，病毒去除过滤器包含由选自以下的一种或多种材料制得的膜：铜铵-再生纤维素、亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)、复合PVDF、表面改性的PVDF、尼龙和聚醚砜。

在本发明的实施方案中，过滤膜是平片膜或中空纤维膜。平片膜的实例包括亲水化PVDF过滤膜，诸如Pegasus^TMGrade SV4小病毒去除过滤器(Pall Corporation)。在一个实施方案中，过滤器包含PVDF平片膜。在一个实施方案中，过滤器包含亲水性PVDF平片膜，或复合PVDF平片膜，或表面改性的PVDF平片膜。在一个特定实施方案中，过滤器是Pegasus^TMGrade SV4。

在其他实施方案中，过滤器是中空纤维膜。中空纤维膜形式通常含有一束吸管形的中空纤维，其中每个中空纤维的壁含有由细毛细管互连的空隙组成的孔的三维网状结构。中空纤维过滤器的实例包括Planova^TMBioEX过滤器(Asahi Kasei Corporation)，其引入了中空纤维膜形式的亲水改性的聚偏二氟乙烯(PVDF)。在一个实施方案中，过滤器包含中空纤维膜形式的PVDF膜。在一个实施方案中，过滤器包含亲水性PVDF中空纤维膜形式，或复合PVDF中空纤维膜形式，或表面改性的PVDF中空纤维膜形式。在特定实施方案中，过滤器是Planova^TMBioEX。

对于比较可能具有非常不同的结构的过滤膜的目的，使用可视化方法(如显微术)检查孔径并不适当。因此，本文所述的对孔径的引用描述了用功能性方法代替可视化方法所评估的过滤器的结构性质。可以使用功能性方法估计过滤器的孔径。这样的方法包括泡点测量法、液-液孔隙率法、侵入孔隙率测定法、大分子(例如噬菌体)和/或定义了尺寸的颗粒的筛分法。

根据ASTM E1294-89(‘使用自动液体孔隙率计对膜过滤器的孔径特征的标准测试方法’)可以测量平均流量泡点。简而言之，该方法涉及用全氟己烷(例如Fluorinert TMFC-72)润湿过滤器，然后施加气压差以去除液体。其中湿流量等于一半的干流量(不含润湿溶剂的流量)的压差被用于计算平均流量孔径。

在本发明的特定实施方案中，过滤器具有用全氟己烷测量的大于100psi或大于120psi的平均流量泡点。

在本发明的其他实施方案中，可以通过向过滤器施加胶体金颗粒溶液估计过滤器的孔径(例如AGPTS——Asahi Kasei Corporation的金颗粒测试系统)。在开始测试之前，原位(in-line)可视波长光谱仪测量初始吸光度。当金颗粒溶液通过过滤器时，第二吸光度读数评定金颗粒去除速率，并且基于吸光度值的LRV计算测定孔径的分布结果。

载脂蛋白可以是任意载脂蛋白，其为天然存在的HDL的功能活性组分、生物学活性组分或重构的高密度脂蛋白(rHDL)的功能活性组分、生物学活性组分。特定的载脂蛋白包括A、C和E家族的成员。通常，载脂蛋白是血浆来源的载脂蛋白或重组载脂蛋白，诸如Apo A-I、Apo A-II、Apo A-V、pro-Apo A-I或变体如Apo A-I Milano或所谓的抗氧化形式如4WF。在特定实施方案中，载脂蛋白是Apo A-I。在一些实施方案中，Apo A-I来源于血浆。在其他实施方案中，Apo A-I是重组Apo A-I。优选地，Apo A-I是包含野生型序列或Milano序列重组来源的，或者它是由人血浆纯化的。Apo A-I可以是单体、二聚体、或三聚体或多聚体或其混合物的形式。载脂蛋白可以是载脂蛋白的生物学活性片段的形式。这样的片段可以是天然存在的、化学合成的或重组的。仅作为举例的方式，Apo A-I的生物学活性片段优选具有Apo A-I的卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)刺激活性的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％至100％或甚至大于100％。

含有载脂蛋白(如Apo A-I)的原料可以来源于例如根据Kistler和Nitschmann分级方法的沉淀物IV，其已经被例如冷乙醇沉淀法进一步纯化。在备选的实施方案中，含有载脂蛋白(如Apo A-I)的原料是细胞培养物/发酵提取物。在实施方案中，由大肠杆菌宿主/载体系统或以下哺乳动物宿主细胞的细胞培养物产生Apo A-I，包括、但不限于，中国仓鼠卵巢(例如CHO-KI或CHO-S)、VERO、BHK、BHK 570、HeLa、COS-I、COS-7、MDCK、293、3T3、PC12和W138或来自骨髓瘤细胞或细胞系(例如鼠骨髓瘤细胞或细胞系)。在特定实施方案中，细胞培养物可以在无血清培养基中进行培养。在实施方案中，细胞培养物可以在缺乏动物来源的组分的无血清培养基中进行培养。

使用前，Apo A-I沉淀物可以在-20℃以下的温度被存储于冷冻室中。

对于悬浮Apo A-I沉淀物，Apo A-I沉淀物与溶液的体积比的范围可以为1:2至1:5。在一些实施方案中，Apo A-I沉淀物与溶液的体积比的范围为1:3至1:4。在特定实施方案中，Apo A-I沉淀物与溶液的体积比是1:3，或1:3.1，或1:3.2，或1:3.3，或1:3.4，或1:3.5。

为了便于重悬，在将冷冻的Apo A-I沉淀物加入溶液之前，可以通过使用例如制药锤(pharma-hammer)在聚乙烯袋内将冷冻的Apo A-I沉淀物分解成小块(直径<5cm)。

随后可以用WFI(注射用水)稀释悬液，以将溶液中Apo A-I的蛋白质浓度和GuHCl浓度调整至所需的范围。

在一些实施方案中，包含Apo A-I和盐酸胍(GuHCl)的溶液来源于如PCT/AU2014/000584中所述的纯化的Apo A-I。

在本发明的语境中，“5至30g/L的Apo A-I”的表述和类似的表述是指将5至30g载脂蛋白A-I(Apo A-I)蛋白溶于1L溶液中。过滤步骤的载脂蛋白浓度范围通常为0.5g/L至50g/L。在特定实施方案中，步骤a)的溶液中Apo A-I蛋白浓度范围为5至25g/L；或5至20g/L；或5至15g/L；或5至12g/L；或7至12g/L；或5至11g/L；或7至11g/L；或5至10g/L；或7至10g/L。在本发明的一些实施方案中，通过在280nm测量的吸光度并且然后按照实施例1中所述计算蛋白质浓度来测定包含Apo A-I和盐酸胍(GuHCl)的溶液的蛋白质浓度。在一些实施方案中，通过比浊法或高效毛细管电泳(使用实施例1中所述的方法)测定包含Apo A-I和盐酸胍(GuHCl)的溶液的蛋白质浓度。

尤其优选的是，步骤a)的溶液的GuHCl浓度在1.3至3.2M的范围内。在特定实施方案中，GuHCl浓度在以下范围内：1.3至3.0M；或1.3至2.75M；或1.3至2.5M；或1.5至3.0M；或1.5至2.75M；或1.5至2.5M；或1.5至2.25M；或1.5至2.0M；或1.5至1.9M。更优选地，GuHCl浓度在1.6至1.9M的范围内，并且最优选地，GuHCl浓度是1.7M。该浓度对于抑制溶液中Apo A-I蛋白聚集体的形成、改善过滤性(即容量和处理量)和确保过滤膜中病毒的最大保留(即选择性)是理想的。在本发明的实施方案中，使用离子交换色谱法测定包含Apo A-I和盐酸胍(GuHCl)的溶液的GuHCl浓度。在本发明的特定实施方案中，使用离子色谱法(HPLC)以合适的阳离子交换柱(例如IonPac CS19分析柱，4x 250mm(Thermo Scientific,Dionex))测定胍的含量。可将Dionex IonPac CS19柱与Reagent-Free^TM离子色谱法(RFIC^TM)系统和电导率检测用于自动甲磺酸(MSA)洗脱液产生和电解洗脱液抑制。以这种方式，来自移动相(例如甲磺酸即MSA)的离子所带来的背景被抑制并且可以通过测量电导率进行胍的检测。可以将含有Apo A-I和胍的样品与内标(例如乙酸甲脒)混合并稀释于水中使得胍浓度为大约0.1-2.0mg/mL。可以等度(isocratic)模式或梯度模式运行色谱。可以基于具有五点校准(0.1-2.0mg/mL)和内标的峰面积进行定量。

根据一个实施方案，病毒过滤步骤前溶液的pH在以下范围内：大约7至大约10；或大约7至大约9；或大约7至大约8。在特定实施方案，病毒过滤步骤前溶液的pH在7.1至7.5的范围内。在又一个实施方案中，病毒过滤步骤前溶液的pH为7.3。该pH范围位于生理pH(大约7.35-7.45)或几乎位于生理pH。理想情况下，pH将远离载脂蛋白的等电点至少一个pH单位。在特定实施方案中，pH远离载脂蛋白的等电点至少一个pH单位。在人Apo A-I及其变体的情况下，等电点范围通常为大约pH 5.2至5.8。可以通过等电聚焦(IEF)测定载脂蛋白的等电点，诸如通过Contiero等人(1997)Electrophoresis 18(1),122-126中所述的方法。当在IEF图谱中存在多个载脂蛋白同种型的峰时，则可以使用平均等电点。

在本发明的语境中，当溶液的pH在给定的pH范围(例如7.1至7.5的范围)内时，这意味着该溶液“具有”该范围的pH，例如7.1至7.5的pH。这意味着在7.1至7.5的pH下形成该溶液，或者在它形成之后被变成7.1至7.5的pH。

总之，在向溶液加入Apo A-I蛋白前测量所述溶液的pH；或者在将Apo A-I蛋白与该溶液混合后直接测量pH。通常，在将前体组分混合后立即测量步骤a)的溶液的pH。备选地，也可以通过基于混合物中的组分的预计的量和浓度的计算来测定混合物的pH。

在本发明中，溶液是指这样的溶液，其含有至少50％(重量)的水，任选地包括一种或多种溶剂，诸如甲醇或乙醇。溶剂可以是任意药物级溶剂。在本发明的特定实施方案中，溶剂是乙醇，例如药物级的95％的乙醇(例如含有5％甲醇的3A)。在又一个实施方案中，溶液包含大约20％的乙醇。

任选地，在过滤溶液之前将步骤a)中所使用的过滤器用WFI和/或GuHCl溶液进行预洗涤。该预洗涤步骤提高通过该过滤器的蛋白质的渗透率。在一个特定实施方案中，将过滤器用1.3至2.0M GuHCl进行预洗涤。

为了将通过病毒过滤的蛋白质的损失最小化，在一些实施方案中，过滤之后，将过滤器用GuHCl进行后洗涤。在特定实施方案中，将过滤器用1.3至2.0M GuHCl进行后洗涤。

可以使用切向流过滤(TFF)或‘死端’过滤(也称为正常或直接流动过滤)进行病毒过滤。病毒过滤器最初被设计用于具有邻近非对称膜的上表层流动的进料的TFF。TFF通过清扫膜表面以减少浓度极化和结垢来提供高通量。然而，死端过滤的简单性和资金成本较低已经导致专门设计用于死端过滤的病毒过滤器的普遍使用。与TFF相反，这些死端过滤器通常以朝向进料流的膜的更开放的一侧进行操作，使得蛋白质聚集体和其他大的污垢被捕获于大孔子结构内，从而保护病毒保留表层。使用一次性使用的死端过滤器的优点包括它们同时简化了系统设计和验证，减少劳动力和资金成本。

死端过滤通常涉及使用单个泵以促使流体从表面通过膜。

切向过滤一般需要在过滤膜的表面维持恒定流速的第一泵和通过在膜的背面建立负压抽吸蛋白质通过膜的第二泵。

在特定实施方案中，通过死端过滤进行过滤。

在特定实施方案中，使用恒压过滤或恒速过滤进行死端过滤方法。在一个特定实施方案中，使用恒压过滤进行死端过滤方法。

取决于本文中待使用的去除病毒的膜的材料，用这样的过滤压力进行过滤，所述压力与膜能够承受的水平相同或低于膜能够承受的水平，例如用大约0.2至大约3.4巴的压力。在特定实施方案中，将过滤压力保持在大约0.2巴至大约3.4巴之间。在实施方案中，将过滤压力保持在大约1至大约3巴；或在大约1.5至大约3巴；或在大约1.7至大约3巴；或在大约2至大约3巴；或在大约2.2至大约3巴；或在大约2.2至大约2.7巴。在实施方案中，将过滤压力保持在大约1.7巴至大约2.4巴；或在大约2.2巴至大约2.4巴。

温度对蛋白质溶液的粘度有作用，并且还对用病毒去除膜过滤时的通量有作用。在过滤步骤中待使用的溶液应当具有从0℃直至使所涉及的蛋白质变性的温度的范围内的温度。溶液的温度适当地在从大约10℃直至大约50℃的范围内。在特定实施方案中，溶液的温度在从大约18℃直至大约35℃的范围内。在一些实施方案中，溶液在大约18℃至大约26℃的室温下进行过滤。

在特定实施方案中，串联使用两种或更多种过滤器。在一个特定实施方案中，串联使用两种具有孔径范围为15nm至35nm的过滤器进行过滤。在一些特定实施方案中，两种或更多种过滤器具有以下的孔径范围：15nm至小于35nm；或15nm至30nm；或15nm至25nm；或15至20nm；或20nm至25nm。在特定实施方案中，两种或更多种过滤器具有选自以下的平均孔径：大约15nm；或大约20nm；或大约25nm；或大约30nm；或大约35nm。

在本发明的实施方案中，病毒过滤器的容量是每m²的过滤器表面积至少200kg或至少300kg或至少340kg或至少500kg或至少750kg或至少1000kg的包含Apo A-I和GuHCl的溶液。

可以通过将Apo A-I沉淀物悬浮于包含4.0至4.6M GuHCl的溶液中并随后将悬浮液稀释至期望的5至30g/L的范围内的Apo A-I蛋白浓度和稀释至期望的1.3至3.2M的范围内的GuHCl浓度来制备步骤a)的溶液。

在本发明的特定实施方案中，用于纯化载脂蛋白(Apo A-I)的方法包括过滤包含大约7至大约8的pH的5至30g/L的Apo A-I和浓度为1.3至3.2M的盐酸胍(GuHCl)的溶液。其中，过滤器具有15nm至35nm的孔径范围并且过滤是在大约1至大约3巴的压力和大约18℃至大约35℃的温度下的死端过滤。

在本发明的特定实施方案中，用于纯化载脂蛋白(Apo A-I)的方法包括过滤包含大约7至大约8的pH的5至20g/L的Apo A-I和浓度为1.5至3.0M的盐酸胍(GuHCl)的溶液。其中，过滤器具有15nm至小于35nm的孔径范围并且过滤是在大约1至大约3巴的压力和大约18℃至大约35℃的温度下的死端过滤。

在本发明的特定实施方案中，用于纯化载脂蛋白(Apo A-I)的方法包括过滤包含大约7至大约8的pH的5至20g/L的Apo A-I和浓度为1.5至2.0M的盐酸胍(GuHCl)的溶液。其中，过滤器具有15nm至26nm的孔径范围并且过滤是在大约1至大约3巴的压力和大约18℃至大约35℃的温度下的死端过滤。

作为常规实践，在使用前和使用后测试病毒过滤器的完整性以确保过滤器实现所需要的水平的性能。为了便于此，过滤器制造商已经开发了各种破坏性和非破坏性的物理完整性测试。这些物理完整性测试的目的是为了确认：(1)病毒过滤器得到正确安装；(2)过滤器没有缺陷和损伤；以及(3)过滤器的性能与制造商的技术规范和最终用户的病毒保留研究均一致。最常使用的非破坏性测试包括泡点测试、前进流动测试(例如PalltronicFlowstar XC(Pall))、水侵入测试和二元气体测试。泡点测试和前进流测试均评估湿润的膜作为气体自由流动的屏障。水侵入测试(也称为HydroCorr测试)使用干燥的疏水性膜作为水(非润湿流体(a non-wetting fluid))自由流动的屏障。二元气体测试使用渗透率具有高度差异的两种气体的混合物，并且该测试是基于测量水湿润的膜的上游和下游气体混合物的组成。金颗粒测试(Planova过滤器(Asahi Kasei Corporation)所使用的使用后完整性测试)是破坏性的完整性测试。使用非破坏性测试一般是由于这样的选项：如果初始测试失败了可以重新测试过滤器的完整性。如果使用后完整性测试和重新测试失败了，重新过滤是病毒过滤步骤的常见实践。如上所述，这些测试另外能够被用于估计过滤器的孔径。

根据本发明的一个特定实施方案，该方法进一步包括用于进一步病毒耗尽的热处理步骤。在一个优选的实施方案中，在步骤a)之前进行所述热处理步骤(选项I)。在一个备选的实施方案中，在步骤b)之后进行所述热处理步骤(选项II)。

用于热灭活步骤的载脂蛋白浓度通常范围为0.5至50g/L。在特定实施方案中，该Apo A-I蛋白浓度在5至30g/L的范围内。

根据上面的实施方案中的选项I，在步骤a)之前、由此在病毒过滤之前进行热处理步骤。在这种情况下，在第一步中提供在6.6至10.0的pH下(在特定实施方案中在6.6至8.0的pH下)包含GuHCl(例如浓度为2.7至3.9M)和Apo A-I的溶液。然后，为了灭活仍然可能存在于溶液中的病毒，随后在55至61℃的温度将所述溶液加热大约30分钟至大约4小时。

根据上面的实施方案中的选项II，在步骤b)之后、由此在病毒过滤之后进行热处理步骤。在这种情况下，调整步骤b)之后溶液中的GuHCl浓度以提供包含GuHCl(例如浓度为2.7至3.9M)并且在6.6至8.0的pH下的溶液。然后，为了灭活仍然可能存在于溶液中的病毒，随后在55至61℃的温度将所述溶液加热大约30分钟至大约4小时。

对于选项I和选项II这两个选项，具有6.6至8.0的pH的溶液的GuHCl浓度优选在3.0至3.9M的范围内并且最优选为3.5M。在该浓度范围内，溶液中蛋白质聚集体的形成得到抑制。

在一个实施方案中，具有6.6至8.0的pH的溶液的pH在7.0至8.0的范围内。在特定实施方案中，溶液的pH为7.3或大约7.3。这意味着根据本发明的方法是在生理pH(大约7.35-7.45)或几乎在生理pH下进行的，其降低靶蛋白质变性和失去其生物学活性的风险。

在选项I的情况下，其中在病毒过滤之前进行热处理步骤，优选通过将Apo A-I沉淀物悬浮于4.0至4.6M GuHCl中并随后将GuHCl浓度调整至2.7至3.9M的范围内并将pH调整至6.6至8.0的范围内(例如通过稀释)来制备具有6.6至8.0的pH的溶液。GuHCl浓度可以特别在2.7至3.5M的范围内。

热处理之后，从具有在6.6至8.0范围内的pH的溶液通过将Apo A-I蛋白浓度和GuHCl浓度调整至溶液(A)的所需要的范围(例如通过用WFI稀释溶液)制备用于步骤a)的溶液。

在选项II的情况下，其中在病毒过滤之后进行热处理步骤，优选从步骤b)之后的溶液通过将溶液的Apo A-I蛋白浓度调整至5至30g/L的范围内并将溶液的GuHCl浓度调整至1.3至3.2M的范围内制备具有6.6至8.0的pH的溶液。

包含GuHCl和具有6.6至8.0的范围内的pH的溶液的具体组合使得病毒清除比根据先前已知的巴氏杀菌操作快得多，即在60℃以大约30分钟至大约4小时内代替公认的10小时的方法。

由于实现病毒清除所需的时间的减少，本发明的方法特别适用于产业应用，其中时间是关键因素。

此外，由于靶蛋白质暴露于升高的温度的时间缩短，该蛋白质不可逆变性的风险被大大降低，甚至无需添加稳定剂，并因此不必冒削弱蛋白质功能的风险。这使得本发明的方法特别适用于从旨在用于治疗用途的蛋白质或作为治疗递送载体的蛋白质去除病毒。

尽管上文的热处理方法是优选的，应当认识到的是，热处理步骤还可以涉及更传统的方法，如将Apo A-I溶液在60℃加热至少10小时。

热处理和过滤步骤的组合具有能够使得所制造的Apo A-I针对细小病毒(如MVM)具有至少12log的LRV，针对无包膜病毒(如EMCV)具有至少9log的LRV，和针对脂质包膜病毒(如BVDV)具有至少8.5log的LRV的潜力。

本发明提供一种Apo A-I制备物，其针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)；和/或针对无包膜病毒具有至少9log的LRV；和/或针对脂质包膜病毒具有至少8.5log的LRV。在一些实施方案中，本发明提供一种Apo A-I制备物，其针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)；和/或针对无包膜病毒具有至少9log的LRV。在一些实施方案中，本发明提供一种Apo A-I制备物，其针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)。在特定实施方案中，细小病毒是MVM。在特定实施方案中，无包膜病毒是小核糖核酸病毒科病毒，诸如EMCV。在特定实施方案中，脂质包膜病毒是黄病毒科病毒。在特定实施方案中，Apo A-I制备物适用于药物用途。在本发明的特定实施方案中，通过实施例6的方法测定Apo A-I制备物的MVM和/或EMCV的LRV。

在本发明中使用的溶液可以进一步包含添加剂，例如EDTA。在特定实施方案中，以大约1mM的浓度加入EDTA。

尽管可以在实验室规模进行本发明的方法，它们能够可扩展至产业规模而无需对条件进行显著改变。因此，在本文所公开的一个实施方案中，在产业或商业规模上进行本发明的方法。优选地，本发明的方法适用于人载脂蛋白A-1(Apo A-I)的商业规模制造。例如，当使用血浆级分作为本发明的方法中的原料时，那么商业规模制造将会涉及使用来源于至少大约500kg血浆的血浆级分。更优选地，起始血浆级分将来源于每批至少大约5,000kg、7,500kg、10,000kg和/或15,000kg的血浆。

随后可以将纯化的载脂蛋白与其他组分进行配制以制备药物组合物，例如以制备重构的HDL(rHDL)。因此，本发明的方法可以包括将纯化的载脂蛋白与脂质混合以制备rHDL制剂的额外步骤。本文使用的rHDL制剂可以是任何人工生产的载脂蛋白制剂或组合物，其功能上功能上相似于、类似于、对应于或模仿通常存在于血液的血浆中的高密度脂蛋白(HDL)。rHDL制剂的范围包括“HDL模拟物”和“合成的HDL颗粒”。适当地，rHDL制剂包含载脂蛋白、脂质和任选地去污剂。

本发明的rHDL制剂可以进一步包含胆固醇。可以使用有机溶剂生产该制剂，当生产该制剂时，所述有机溶剂在一些情况下被用于溶解脂质组分(例如磷脂酰胆碱)(诸如在US 5,652,339所述)。但是，优选的是在不存在有机溶剂的情况下生产载脂蛋白制剂。

适当地，载脂蛋白浓度为大约5-100g/L，优选10-50g/L或更优选25-45g/L。这包括5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100g/L以及在这些量之间的任意范围。在其他实施方案中，载脂蛋白浓度可以为大约5至20g/L，例如大约8至12g/L。

脂质可以是任意脂质，其为天然存在的HDL的组分或重构的高密度脂蛋白(rHDL)的组分。这样的脂质包括磷脂、胆固醇、胆固醇酯、脂肪酸和/或甘油三酯。优选地，脂质是磷脂。磷脂的非限制性的实例包括磷脂酰胆碱(PC)(卵磷脂)、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)(脑磷脂)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)、鞘氨醇-1-磷酸酯或其天然或合成的衍生物。天然的衍生物包括蛋PC、蛋PG、大豆PC、氢化大豆PC、大豆PG、脑PS、鞘脂、脑SM、半乳糖脑苷脂、神经节苷脂、脑苷脂、脑磷脂、心磷脂和双十六烷基磷酸酯。合成的衍生物包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二癸酰磷脂酰胆碱(DDPC)、二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰磷脂酰基胆碱(POPC)、棕榈酰肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSM)和二硬脂酰鞘磷脂(DSSM)。磷脂还可以是上文的任意磷脂的衍生物或类似物。

在一些实施方案中，rHDL的脂质组分包含至少两种不同的磷脂酰胆碱。在特定实施方案中，至少两种磷脂酰胆碱是棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。在特定实施方案中，本发明的重构的HDL制剂包含POPC和DPPC。在特定实施方案中，POPC:DPPC的比为大约75:25；或大约50:50。

在其他具体实施方案中，脂质是(或包含)鞘磷脂与带负电的磷脂(诸如磷脂酰甘油(例如1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(1-甘油)]))的组合。鞘磷脂与磷脂酰甘油(特别是1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(1-甘油)])的组合被具体设想为用作脂质。在这些实施方案中，鞘磷脂与磷脂酰甘油可以任何合适的比存在，例如90:10至99:1(w:w)，通常为95:5至98:2并且最通常为97:3。

优选地，磷脂是(或包含)单独的磷脂酰胆碱或与一种或多种其他磷脂组合的磷脂酰胆碱。另一种磷脂的实例是鞘磷脂。在一些实施方案中，载脂蛋白制剂可以包含去污剂。

通常，尽管并非排他性地，脂质可以10-100g/L或优选30-60g/L的浓度存在。

去污剂可以是适用于rHDL制剂的任何离子型(例如阳离子、阴离子、两性离子)去污剂或非离子型去污剂，包括胆汁酸及其盐。离子型去污剂可以包括胆汁酸及其盐、聚山梨酯(例如PS80)、CHAPS、CHAPSO、十六烷基三甲基溴化铵、月桂酰肌氨酸、正丁基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐、正癸基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐和4'-氨基-7-苯甲酰氨基牛磺胆酸。

胆汁酸通常为具有24个碳的二羟基化或三羟基化的类固醇，包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸或熊脱氧胆酸。优选地，去污剂是胆汁盐，诸如胆酸盐、脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐或熊脱氧胆酸盐。特别优选的去污剂是胆酸钠。

然而，已经显示高水平的去污剂与一些系统中的肝脏毒性有关，例如0.3g/g Apo-AI或6g/L rHDL制剂(20g/L Apo-AI)的水平。因此，优选5-10％的该水平的去污剂用于本发明，即0.015-0.03g/g Apo-AI或0.5-0.9g/L rHDL制剂(30g/L Apo-AI)。去污剂的“水平”可以是去污剂的绝对量，去污剂的浓度(例如质量/单位体积的rHDL制剂)和/或去污剂的量或浓度相对于rHDL制剂中另一组分的量或浓度的比。仅作为实例，可以根据rHDL制剂中存在的载脂蛋白(例如Apo-AI)的总质量来表示去污剂的水平。具有30g/L载脂蛋白的rHDL制剂的去污剂浓度不低于大约0.45g/L在稳定性和非毒性方面是最佳的。虽然rHDL制剂的浊度是优选的量度，但是可以有利地通过本领域任何已知的手段测量稳定性。在特定实施方案中，去污剂浓度在rHDL制剂中为0.5-1.5g/L之间。可以使用比色法测定去污剂浓度。例如，使用

测试试剂盒和

Stoppreagens，将血浆加至反应小瓶(1mL反应体积中125μL血浆)。

更一般地，当存在于本发明的rHDL制剂中时去污剂的水平是其呈现肝脏毒性的水平的大约5-35％。该范围包括、例如5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％。更优选地，去污剂的水平是其呈现肝脏毒性的水平的大约5-20％。有利地，该水平是其呈现肝脏毒性的水平的大约5-10％。优选地，根据呈现肝脏毒性的去污剂的最小水平或阈值水平来表示这些水平。可以通过不同的体外和体内模型评估肝脏毒性。体外模型的一个实例使用HEP-G2细胞。这涉及将HEP-G2细胞培养至对数期。然后，从培养基取出细胞并在胰酶消化前在PBS中进行洗涤，并重悬于10mL的培养基(90％DMEM、10％灭活的FCS、1％非必需氨基酸、1％Pen/Strep)。使用Neubauer血细胞计数器和台盼蓝染色监测细胞生长和存活力。随后将100μL含有10x10⁴C/mL的等份接种至平底96孔板并在37℃、5％CO₂、95％H₂O温育过夜。通过加入培养基制备含有测试品(例如rHDL制剂)的样品(700μL)。去除第一排孔的培养基并加入200μL测试品溶液。在板上完成一系列1:2的连续稀释。然后将板在37℃、5％CO₂、95％H₂O温育72小时。之后测定细胞存活力。这可以通过向每个孔加入50μL的3x中性红溶液(70mg中性红溶于100mL PBS)完成。将板在37℃、5％CO₂、95％H₂O温育2小时，并将孔用200μL PBS洗涤一次。之后，向每个板加入100μL乙醇，将板振动20分钟，之后在540nm进行读取。体内肝脏毒性模型的实例是清醒兔模型。该模型使用兔，其已经被置于约束装置(兔固定架)并i.v.导管插入它们的耳静脉。测试品以40分钟i.v.输注的形式进行给予。从耳动脉取血液样品并收集入血清和链激酶-血浆(5％)的小瓶。将血液样品加工成血清，存储于-20℃，并加工成血浆并存储于-80℃。然后，可以使用市售可得的酶法测光测试试剂盒(Greiner Biochemica)评估样品的ALT和AST活性水平。同时可以使用比浊法或高效毛细管电泳测定人Apo A-I水平。

在又一个优选实施方案中，rHDL制剂包含不会导致肝脏毒性的水平的脂质。适当地，脂质水平为其导致肝脏毒性或与肝脏毒性有关的水平的大约20-70％。在特定实施方案中，脂质水平优选为其导致肝脏毒性或与肝脏毒性有关的水平的大约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％，以及在这些量之间的任何范围。优选地，根据呈现肝脏毒性的脂质的最小水平或阈值水平来表示这些水平。作为实例，已经显示与肝脏毒性有关的脂质水平是84g/L。因此，脂质浓度优选为大约30-60g/L。这包括30、35、40、45、50、55和60g/L以及这些量之间的任何范围。特别有利的脂质浓度是大约30-50g/L，或者在某些实施方案中，大约34或47g/L。脂质“水平”可以是脂质的绝对量、脂质的浓度(例如质量/单位体积的rHDL制剂)和/或脂质的量或浓度相对于固定剂量载脂蛋白制剂中另一组分的量或浓度的比。仅作为实例，可以根据固定剂量rHDL制剂中存在的载脂蛋白(例如Apo-AI)的摩尔比来表示脂质水平。

在一个优选的实施方案中，本发明的rHDL制剂中载脂蛋白:脂质的摩尔比的范围为1:20至1:100。该范围包括以下摩尔比，诸如1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80和1:90。更优选地，载脂蛋白:脂质的摩尔比的范围为1:40至1:80；或1:40至1:75；或1:45至1:70；或1:40至1:65；或1:40至1:60；或1:40至1:55；或1:40至1:50；或1:45至1:80；或1:45至1:75；或1:45至1:70；或1:45至1:65；或1:45至1:60；或1:45至1:55；或1:50至1:80；或1:50至1:75；或1:50至1:65；或1:50至1:60。特别有利的载脂蛋白:脂质的摩尔比为大约1:40；或大约1:45；大约1:50；或大约1:55；大约1:60。

在其他实施方案中，本发明的rHDL制剂中载脂蛋白:脂质的摩尔比的范围为大约1:80至大约1:120。例如，该比可以为1:100至1:115，或1:105至1:110。在这些实施方案中，摩尔比可以是例如1:80至1:90，1:90至1:100或1:100至1:110。

在一个特定实施方案中，本发明提供由本发明的方法获得的rHDL制剂。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种rHDL制剂，其包含Apo A-I制备物，所述Apo A-I制备物针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)；和/或针对无包膜病毒具有至少9log的LRV；和/或针对脂质包膜病毒具有至少8.5log的LRV。在一些实施方案中，本发明提供一种rHDL制剂，其包含Apo A-I制备物，所述Apo A-I制备物针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)；和/或针对无包膜病毒具有至少9log的LRV。在一些实施方案中，本发明提供一种rHDL制剂，其包含Apo A-I制备物，所述Apo A-I制备物针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)。在特定实施方案中，细小病毒是MVM。在特定实施方案中，无包膜病毒是小核糖核酸病毒科病毒，如EMCV。在特定实施方案中，脂质包膜病毒是黄病毒科病毒。在本发明的特定实施方案中，通过实施例6的方法测定包含在rHDL制剂中的Apo A-I制备物的MVM和/或EMCV的LRV。在特定实施方案中，rHDL制剂适用于药物用途。

本领域技术人员将理解的是，除了两个专门的病毒减少步骤(病毒过滤和热灭活)之外的纯化/分级步骤可以潜在地给本发明的Apo A-I制备物和rHDL制剂提供进一步水平的病毒清除。例如，已经显示高浓度乙醇(当从血浆获得富含Apo A-I的级分时其通常被使用)灭活病毒(Hénin等人,1988,Vox Sang.54(2):78-83)。在这样的情况下，可以向本发明的Apo A-I制备物或rHDL制剂的总LRV加入这些步骤的LRV。

可以将本文之前所述的纯化的Apo A-I配制成药物组合物，诸如配制成用于药物用途的重构的HDL(包括如上文所述的那些)。这样的药物组合物可以包括药学上可接受的载体或稀释剂。药学上可接受的载体或稀释剂的非限制性的实例包括水、乳化剂、粘合剂、填充剂、表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、盐、醇和多元醇、去污剂、蛋白质和肽、脂质、胶(gum)、糖和其他碳水化合物，但是并不限于此。

除了Apo-AI之外，重构的HDL可以包含脂质、去污剂和稳定剂中的一种或多种，但是并不限于此。脂质的非限制性实例包括磷脂、胆固醇、胆固醇酯、脂肪酸和/或甘油三酯。优选地，脂质是磷脂。磷脂的非限制性的实例包括磷脂酰胆碱(PC)(卵磷脂)、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)(脑磷脂)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)或其天然或合成的衍生物。稳定剂可以是碳水化合物，诸如糖(例如蔗糖)或糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)，但是并不限于此。如果存在，则去污剂可以是任何离子型(例如阳离子、阴离子、两性离子)去污剂或非离子型去污剂，包括胆汁酸及其盐，诸如胆酸钠。

在特定实施方案中，药物组合物被描述于WO2014/066943中。

本发明还提供治疗或预防哺乳动物的疾病、紊乱或病况的方法，包括向哺乳动物施用根据前述任意方面的哺乳动物Apo-A1、Apo-A1制备物、药物组合物或rHDL制剂的步骤，由此治疗或预防所述疾病、紊乱或病况。

Apo A-1和/或重构的HDL制剂的治疗性用途可以包括治疗或预防心血管疾病(例如急性冠脉综合征(ACS)、动脉粥样硬化和心肌梗塞)或易患ACS的疾病、紊乱或病况诸如糖尿病、中风或心肌梗塞，高胆固醇血症(例如升高的血清胆固醇或升高的LDL胆固醇)和由高密度脂蛋白(HDL)水平降低产生的低胆固醇血症(hypocholesterolaemia)，诸如谈基病(Tangier disease)症状发生。

现在将参考以下实施例描述本发明的某些实施方案，这些实施例仅用于说明的目的，而不旨在限制本文之前所述的一般性的范围。

实施例

实施例1：

以下实施例描述了根据本发明的方法的一个优选实施方案的方法步骤的顺序排列。该方法包括级分IV沉淀物来源的原料在GuHCl的存在下被溶解，被过滤以去除助滤剂，之后进行pH调整，热处理，稀释和病毒过滤。备选地，热处理也可以在病毒过滤步骤之后进行。

方法与材料

Apo A-I蛋白浓度

一般通过使用WFI(注射用水)作为稀释剂测定280nm的吸光度测量Apo A-I蛋白浓度，并且其通常为5至30g/L。蛋白质计算如下：

备选地，可以使用比浊法或高效毛细管电泳(Hewlett Packard 3DCE,AgilentTechnology)测定Apo A-I蛋白浓度。简而言之，对于高效毛细管电泳，该方法包括以下步骤——用16％SDS(25μL)和苯丙氨酸(25μL，4mg/mL)制备含有大约2-3mg/mL Apo A-I(必要时用水稀释)的样品(150μL)。然后，将样品在水浴中温育3分钟，之后稀释于电泳缓冲液(50mM硼酸钠，0.2％SDS，300μL)并过滤(0.45μm)。然后，将样品上样至熔融石英毛细管柱(56cm×50μm id，Agilent G1600-61232)。在25kV进行电泳。所使用的标准是国际Apo A-I标准(BCR-393)。当Apo A-I是重构的HDL的一部分时，这一方法尤其有用。

4.6M盐酸胍溶液

用WFI(注射用水)、GuHCl盐和EDTA制备含有1mM EDTA(Titriplex)的4.6M GuHCl溶液。用NaOH将4.6M GuHCl溶液的pH调整为pH 7.2至7.4。

1.7M盐酸胍溶液

用WFI(注射用水)、GuHCl盐和EDTA制备含有1mM EDTA(Titriplex)的1.7M GuHCl溶液。用NaOH将1.7M GuHCl溶液的pH调整为pH 7.2至7.4。

10mM NaCl渗滤溶液

由WFI和NaCl制备该渗滤溶液。经测定，该渗滤溶液的电导率为1.0至1.2mS/cm。

实验步骤

Apo A-I沉淀物的增溶

将Apo A-I沉淀物溶解于4.6M盐酸胍(GuHCl)，均质化，并且将pH调整为pH 7.3±0.1。

澄清过滤

通过深层过滤澄清过滤溶液以去除残留的助滤剂。用注射用水(WFI)预洗涤过滤器并用4.6M GuHCl溶液进行后洗涤。将后洗涤液与滤液合并，在滤液中实现大约3.5M的GuHCl浓度。收集合并的滤液，并且该合并的滤液具有范围为0至30g/L的Apo A-I浓度。

在病毒过滤步骤之前，进行热处理步骤以提供病毒灭活。

热处理

对于热处理，将pH调整为7.1至7.5。根据下面的公式计算GuHCl浓度并调整为至少3.0M。

GuHCl[M]＝-41.4-(0.0170×蛋白[g/L])+(41.5×密度[g/cm3])

然后，将混合物在大约60.0℃的温度温育大约30分钟至大约4小时。在经受病毒过滤步骤之前将混合物返回至室温并稀释。

稀释步骤

在病毒过滤步骤之前，将混合物用WFI稀释至GuHCl终浓度为1.5-2.0M并且Apo A-I浓度范围为0至30g/L。

病毒过滤

病毒过滤步骤的目的是物理去除病毒颗粒。

使用PALL SKL 7002NTP 0.1μm(Nylon)进行预过滤。然后，具有1m²过滤面积的无菌Planova BioEx纳米过滤器(Asahi Kasei Corporation)被用于过滤步骤。BioEx过滤器允许每m²过滤器表面积至少340kg溶液。预过滤器和病毒去除过滤器均在室温下用1.7MGuHCl进行冲洗。在室温下进行死端病毒过滤方法。维持压力低于3.4巴。过滤完成之后，过滤器用1.7M GuHCl进行后冲洗。在该步骤内Apo A-I的回收是优秀的，值大于95％并且通常大约为100％。

实施例2

在存在不同GuHCl浓度(1.7M&3.2M)和Apo A-I浓度(5.8、8.9、19.7g/L)的情况下使用BioEx过滤器对过滤进行比较(图1至3)。如上文实施例1中所述的类似的方式进行病毒过滤过程。

额外的过滤研究证实，更低浓度的GuHCl(1.0M&1.3M)可能导致溶液不稳定，其引起该系统的过滤器堵塞。这些结果强调了优化GuHCl的浓度水平以促进病毒过滤的益处。

实施例3：

将Apo A-I样品与MVM以1:1000的比例进行加标(spike)。加标的样品在10至12g/L的蛋白质浓度通过Planova BioEX病毒去除过滤器以死端模式在大约2.4巴的压力下进行过滤。取出滤液的样品并测定其残留的病毒感染性(表1)。结果证实，在GuHCl浓度范围内实现了完全的病毒保留。更低的GuHCl浓度导致MVM的对数减少值(LRV)增加。

表1

在又一个在类似条件下进行的病毒过滤研究中，在3.4M GuHCl存在下观察到MVM病毒穿透。因此，低于大约3.0M GuHCl的浓度被认为在Apo A-I制备物的制造中使用病毒去除过滤器(诸如BioEx)改善直径大约为20nm的病毒(例如细小病毒)的去除。

实施例4

该研究旨在确定在Apo A-I的制造中病毒过滤从原料清除MVM的有效性。MVM用作非常强有力的、小的无包膜病毒(包括B19V)的模型病毒。

研究设计

将Apo A-I样品与MVM以1000:1的比例进行加标。加标的样品通过Planova BioEX病毒去除过滤器进行过滤。在不同的时间点，取出滤液的样品并测定其残留的病毒感染性。

当收集≥115g滤液时，将测试系统与MVM以100:1的比例再次加标。然后继续过滤，当收集≥8g滤液时停止过滤。测定滤液残留的病毒感染性。最后，过滤器用至少12g的1.7mol/L GuHCl溶液进行后洗涤。分开收集后洗涤级分，并分析其病毒感染性。

在每个实验中：

-测定测试系统的细胞毒性

-测定病毒原液的滴度

-测定病毒的稳定性

-测定干扰

-测定清除率

评估细胞毒性作用

使用无病毒的测试系统通过非放射性细胞存活力测定来测定细胞毒性，其在细胞培养基中进行系列稀释以测定样品的最终细胞毒性作用。导致阳性对照的增殖活性小于60％的样品被认为具有细胞毒性。

病毒干扰测定

利用无病毒的测试系统的非细胞毒性浓度对病毒原液进行系列稀释通过TCID50终点滴定法进行病毒干扰测定。在培养基中对病毒原液通过将干扰测定中获得的病毒滴度与标准TCID50测定中获得的病毒滴度进行直接比较评估干扰。

病毒滴度测定(TCID50)

通过TCID50(50％组织培养感染剂量)测定病毒滴度。使用三倍系列稀释的脱盐样品。通过对96孔板的指示细胞进行终点滴定测定病毒感染性。

全分析(Bulk Analysis，BA)

BA被用于降低病毒测定的检测限。通过将9ml的脱盐样品(对应于3ml的原始样品)各自分配到96孔板上的指示细胞上测定病毒感染性。

数据处理

计算在微量滴定板上通过TCID50测定的病毒滴度

使用Spearman&

的方法计算病毒滴度及其误差(Excel Makro：kaerber3_111.xls)。输入的数字是来自滴度测定的结果。

计算减少因子

根据“病毒验证研究：验证病毒的灭活和去除的研究的设计、贡献和解释”(“Virusvalidation studies:the design,contribution and interpretation of studiesvalidating the inactivation and removal of viruses”)(CPMP/BWP/268/95/Final；1996年2月14日)和德国联邦卫生部(Bundesgesundheitsamt)和血清和疫苗联邦机构保罗-埃尔利希研究所(Paul-Ehrlich-Institute,Bundesamt für Sera und Impfstoffe)的要求(1994年5月4日)计算该方法的病毒减少因子(LRF)。

结果

细胞毒性

在两个批次的无病毒测试系统中均未观察到细胞毒性。

干扰测定

没有观察到干扰。

全分析

用3ml样品的全分析将检测限降低至≤-0.0006log TCID50/ml(95％可信限)。所有样品对于感染性病毒测试为阴性。因此，在两个实验中的整个过滤实现了MVM的完全去除。

讨论和结论

本研究旨在确定病毒过滤从原料清除MVM的有效性。MVM用作非常强有力的、小的无包膜病毒和B19V的模型病毒。

观察到Planova BioEX病毒去除过滤器对MVM的完全清除，得到平均LRF为≥6.21±0.11。没有观察到测试系统的细胞毒性和对病毒感染性的干扰。

实施例5

为了研究热处理步骤对Apo A-I溶液的作用(如实施例1的热处理小节所述)，将所述溶液加热至60±1℃并与MVM以100:1的比例进行加标。

将加标的测试系统保持在该温度3小时。在不同的时间点收集样品并分析其病毒感染性，以监测整个过程中的病毒减少和灭活动力学。

将测试系统的样品升温至60±1℃并在整个完整实验中保持在该温度。在实验过程中监测并记录温度。已经达到目标温度之后，将测试系统与0.1μm过滤的MVM以100:1的比例进行加标。加标之后立即取样品1。在1、5、10、15、30、60、120和180分钟之后取其他样品。所有样品用冰冷的细胞培养基1:10稀释并将其存储于冰上直至进一步处理。然后，为了去除GuHCl，将1ml稀释的样品通过PD-10尺寸排阻柱(GE Healthcare)。简而言之，将1ml样品上样到柱上，弃去流穿液。然后，用1ml PBS冲洗柱，弃去流穿液。最后，将3ml PBS上样到柱上并收集3ml体积的脱盐级分；得到另一个1至3的稀释。然后，通过终点滴定(TCID50)测定脱盐样品中的病毒滴度。在30、60、120和180分钟另外取样品用于全分析(BA)并将其存储于冰上直至进一步处理。如前所述，从每个样品进行三次1ml脱盐。总共收集9ml脱盐级分。按照上文实施例4中所述的方法测定以下参数：

-测试系统的细胞毒性

-病毒原液的滴度

-干扰

-清除率

所有测试样品均未观察到细胞毒性和对病毒感染性的干扰。观察到在30分钟内MVM完全灭活的快速灭活动力学。所获得的≥6.03±0.12log的平均LRF表明在30分钟内在60℃热处理的过程中MVM的有效清除。

实施例6

这些研究旨在确定两个专门的病毒减少步骤(过滤和热处理步骤)从Apo A-I溶液清除病毒的有效性。所遵循的制造方法方案如实施例1中所述，并且以如实施例4(病毒过滤)和实施例5(热处理)中所述的类似的方式进行加标研究。研究证实以下病毒的减少水平：

因此，本发明的方法能够使得所制造的Apo A-I针对细小病毒(如MVM)具有至少12log的LRV，针对无包膜病毒(如EMCV)具有至少9log的LRV，和针对脂质包膜病毒(如BVDV)具有至少8.5log的LRV。

本领域技术人员将理解的是，本文所述的发明能容许不同于所具体描述的那些内容的变化和修改。应当理解的是，本发明包括落入本发明精神和范围的所有此类变化和修改。本发明还包括在本说明书中个别地或整体地提到或指出的步骤、特征、组合物和化合物的所有内容，以及任意两个或更多个所述步骤或特征的任意和所有的组合。

Claims (16)

1.一种重构的HDL(rHDL)制剂，其包含纯化的载脂蛋白A-I(Apo A-I)、脂质、和药学上可接受的载体或稀释剂，其中

所述纯化的Apo A-I通过以下方法获得，所述方法包括：通过具有15nm至35nm的孔径范围的过滤器过滤包含Apo A-I和盐酸胍(GuHCl)的溶液，其中所述GuHCl以有效抑制所述ApoA-I聚集的浓度存在于所述溶液中，

所述脂质是鞘磷脂和磷脂酰甘油的混合物，

所述纯化的Apo A-I和所述脂质之间的摩尔比在1:80和1:120之间，并且

所述制剂以90:10至99:1的重量比包含鞘磷脂和磷脂酰甘油。

2.根据权利要求1所述的rHDL制剂，其中进行过滤以获得纯化的ApoA-I的所述溶液包含浓度在5至30g/L的Apo A-I和浓度在1.5至3.2M的GuHCl。

3.根据权利要求1所述的rHDL制剂，其中进行过滤以获得纯化的ApoA-I的所述溶液具有7.1至7.5的pH。

4.根据权利要求1所述的rHDL制剂，其中在0.2至3.4巴的压力进行过滤以获得纯化的ApoA-I。

5.根据权利要求1所述的rHDL制剂，其中在18至26℃的温度进行过滤以获得纯化的ApoA-I。

6.根据权利要求1所述的rHDL制剂，其中通过死端过滤进行过滤以获得纯化的ApoA-I。

7.根据权利要求1所述的rHDL制剂，其中获得纯化的ApoA-I的方法进一步包括，在过滤之前或之后，将包含ApoA-I和GuHCl的溶液进行用于病毒灭活的热处理。

8.根据权利要求7所述的rHDL制剂，其中进行热处理的溶液具有6.6至8.0的pH。

9.根据权利要求7所述的rHDL制剂，其中热处理包括在55至61℃的温度将所述溶液加热30分钟±3分钟至4小时±24分钟。

10.根据权利要求7所述的rHDL制剂，其中进行热处理的溶液具有6.6至8.0的pH并包含浓度为2.7M至3.9M的GuHCl。

11.根据权利要求10所述的rHDL制剂，其中进行热处理的溶液具有7.0至8.0的pH。

12.根据权利要求1所述的rHDL制剂，其还包含去污剂。

13.根据权利要求12所述的rHDL制剂，其中所述去污剂是胆酸钠。

14.权利要求1～13之任一项所述的rHDL制剂在制备药物中的用途，所述药物用于施用于需要rHDL的哺乳动物受试者。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述受试者患有选自以下的一种或多种病况或存在发生选自以下的一种或多种病况的风险：心血管疾病、糖尿病、升高的血清胆固醇、升高的低密度脂蛋白胆固醇和降低的血清高密度脂蛋白。

16.根据权利要求14所述的用途，其中所述受试者患有选自以下的一种或多种病况或存在发生选自以下的一种或多种病况的风险：中风和心肌梗塞。

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