JP6530394B2 - 混入物除去方法 - Google Patents

Description

本発明は、アポリポタンパク質を精製するための、特に、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）含有溶液からウイルス病原体を除去するための方法と、Ａｐｏ Ａ−Ｉ調製物を提供することとに関する。

アポリポタンパク質は、可溶性リポタンパク質複合体の主要構成成分であり、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子の主要タンパク質成分である。

アポリポタンパク質のＡ、ＣおよびＥファミリーは、共通の祖先遺伝子から進化し、構造的に類似している。これらのタンパク質分子は、プロリン残基によってしばしば隔てられた一連の２２−アミノ酸タンデム反復を一般に含む。反復２２−アミノ酸セグメントは、両親媒性α−へリックスを形成しており、脂質表面と水表面の両方に結合することができる。ヒトＡｐｏ Ａ−Ｉ（２４３アミノ酸；２８．１ｋＤａ）の場合には、８つの２２マーおよび２つの１１マー両親媒性へリックスがある（非特許文献１）。アポリポタンパク質の両親媒性α−へリックスは、リポタンパク質の安定化に重要な役割を果たす。この安定化は、アポリポタンパク質を、主要な疎水性へリックス面が複合体内の疎水性脂質と相互作用できるように配向させ、一方で反対側のアポリポタンパク質の主要な親水性面が周囲の水性環境と相互作用するように配向させることにより行われる。しかしながら、これらのタンパク質は、脂質成分から分離されると、疎水性アミノ酸残基の水性環境への露出により、操作が困難になる場合がある。特にα−へリックスの疎水性面は自己会合する傾向があり、その結果凝集物を形成し、条件によっては沈殿を生ずる。例えば、Ａｐｏ Ａ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏを含有する１ｍｇ／ｍＬの溶液では、５０ｍＭのリン酸緩衝液中ｐＨ７．４で保存するとき、８０％のタンパク質が凝集形態で含まれると考えられる（非特許文献２）。

Ａｐｏ Ａ−Ｉは、肝臓および腸で合成され、血液中のＨＤＬの生理機能；「コレステロール逆転送」（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ、ＲＣＴ）として知られる機構によって、末梢組織からコレステロールを取り除き、肝臓または他のリポタンパク質のいずれかに戻す生理機能における役割を担う。結果として、ＨＤＬ粒子は血漿中に一連の大きさで存在し、このＲＣＴ脂質輸送作用によって絶えず再構築されている。したがってＨＤＬ粒子は高い密度（＞１．０６３ｇ／ｍｌ）と約５〜２０ｎｍ（Ｓｔｏｋｅ径）の範囲の大きさとによって特徴づけられる。高レベルの血清コレステロールと冠性心疾患（ＣＨＤ）の発症との明らかな相関関係が、疫学的および長期的研究に基づいて繰り返し確認されてきた。ＨＤＬ中のＡｐｏ Ａ−Ｉは、抗炎症機能を有し、ＣＨＤの発生と発症とを抑制すると考えられる。さらに、Ａｐｏ Ａ−Ｉは、血液中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のレベルを低下させることが示されており、さらにリポ多糖またはエンドトキシンに結合することが知られており、したがってＨＤＬの抗エンドトキシン機能において主要な役割を担う。ＨＤＬおよび主要タンパク質成分としてのＡｐｏ Ａ−Ｉの「保護」作用がいくつかの研究で確認されてきた。Ａｐｏ Ａ−Ｉの高い血漿レベルは、ＣＨＤのリスクおよび冠状動脈病変の減少に関与している。したがって、Ａｐｏ Ａ−Ｉは、急性冠状動脈症候群、アテローム性動脈硬化症処置、抗炎症処置、抗毒素処置、肝臓標的薬などの用途に対する再構成ＨＤＬ（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ＨＤＬ）などの薬物への応用が期待される。

組み換えによるまたは血漿由来の生物学的治療薬は一般に、ウイルスなどの病原体が本質的に混入（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ）している生物学的供給原料を使用して製造される。さらに、いくつかの製造プロセスは、その性質上、外来の病原体の混入を受け易い。したがって、生物学的治療薬の製造者は、十分なウイルスクリアランス工程を製造プロセスに導入して製品が確実に混入物を含まないようにする必要がある。

バイオテクノロジー製品（典型的にはタンパク質またはＤＮＡ）は、細胞培養、遺伝子導入動物、または遺伝子導入植物における組換えＤＮＡを用いて製造される。製造に使用される一般的な細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、大腸菌、および酵母が挙げられる。細胞ベースの製造システムは、典型的には２つまたはそれ以上のバッチモードで行われ、一部では潅流システムも使用される。最終的な商業的規模の発酵は、１，０００〜１００，０００Ｌスケールで実施され、大半のＣＨＯベースの発酵槽は８，０００〜２５，０００Ｌスケールである。

ヒト血漿は、今日では、大量に採取され（例えば、推計では２０１０年に世界中で３千万リットルの血漿が採取された）、個々の分画へと処理される；これらの分画のいくつかはアポリポタンパク質Ａｐｏ Ａ−Ｉを含んでいる。そのような血漿分画の例として、Ｃｏｈｎ上清Ｉ、Ｃｏｈｎ分画ＩＩ＋ＩＩＩ、およびＣｏｈｎ分画ＩＶ（例えば、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ−１）またはそれらの変種（例えば、Ｋｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ分画ＩＶ）が挙げられる。血液および血漿は潜在的に輸液移行送性の病原体を含むため、そのような病原体、特にウイルスは、治療薬または治療薬送達のためのビヒクルとして血液または血漿由来成分を使用するとき、除去または不活化しなければならない。しかしながら、ウイルスは容易に除去できず、高度に精製した場合でさえ、依然として血漿由来製品に存在する場合がある。特に、小型のノンエンベロープウイルス、例えば約２７〜３２ｎｍの大きさを有するピコルナウイルス科ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス）および約１８〜２６ｎｍの大きさを有するパルボウイルスが懸念される。その理由は、これらがいずれも小型であり、生理学的安定性が高いためである。したがって、血漿由来タンパク質治療薬を効率的にウイルス除去および不活化する方法の開発が引き続き必要とされている。

一般的なウイルス不活化技術としては、例えば、古典的低温殺菌方法（６０℃で１０時間加熱）、短波長紫外線光照射またはγ線照射などの物理的方法、および、溶解作用を有する界面活性剤または低ｐＨインキュベーションなどの化学的方法が挙げられる。ウイルス除去技術としては、しばしばナノ濾過と称されるウイルス濾過などのサイズ排除方法が挙げられる。これらのウイルス濾過方法は、タンパク質溶液からウイルスを除去するために効果的な方法であることが示されてきた。

ウイルス濾過は、タンパク質溶液からウイルスを除去するための穏やかな方法であり、一般的に高レベルのタンパク質回収が可能で、タンパク質の生物学的活性が完全に保存されるという利点を有する。最適なウイルスフィルターは、容量（ｃａｐａｃｉｔｙ）、処理能力（ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）、および選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を最大限にするものである。ウイルスフィルターの容量は、定圧濾過において流束が許容できない値に低下するまでに処理可能な、フィルター表面積１ｍ^２当たりの濾液の合計体積である。処理能力は、供給物を濾過することができる速度（持続可能な最大透過流束）を指す。選択性は、高い生成物回収率と高いウイルス粒子保持を得る能力を指す。これらのフィルターは、許容される濾過流束で大量の供給物全体を処理し、ウイルス粒子を除去し、タンパク質の通過を最大限にしなければならない。ウイルス濾過の間のファウリング（ｆｏｕｌｉｎｇ）は、通常、タンパク質凝集物、ＤＮＡ、部分変性産物、または他のデブリによって占められる。

フィルター製造業者は、しばしば市販フィルターに公称または平均孔径格付などの用語を付しているが、これらは、実際の孔径の幾何学的大きさではなく、粒子または微生物に対する一定の保持基準に合致するものであることを一般に示している。

ウイルスクリアランスにおいて、濾過は、除去すべきウイルスの有効径よりも公称孔径が小さい濾過膜を通して実施する。ほんの少数でも異常に大きな孔が存在すると（３００ｋＤａまたはそれ以上の公称分子量カットオフ、ＮＭＷＣＯ）、過度のウイルス漏出を許すことになる。したがって、ウイルスフィルターは全てのマクロの欠陥が除去されるように製造されなければならない。これは一般的にウイルス保持能と機械的安定性の必要な組合せを提供する複合膜の使用により達成される。ウイルス除去濾過膜は、一般に、再生セルロース、例えば銅アンモニア再生セルロース、または非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６に記述されている親水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）もしくは親水性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）のような合成ポリマー材料などから作られる。

記載されているウイルス濾過方法としては、特許文献１が挙げられる。この文献は、溶液に少なくとも０．２Ｍのレベルまで塩を添加することによる、高分子（つまり、タンパク質）を含む溶液をウイルス濾過する方法に関する。この文献の出願人は、高価格品のホフマイスター・シリーズに特徴的な高塩析効果を示す塩類の使用、特にシトレート、タートレート、サルフェート、アセテートまたはホスフェートアニオン、およびナトリウム、カリウム、アンモニウムまたはカルシウムカチオンの使用を推奨している。塩化ナトリウムが特に好ましく、低い塩析効果を示す一連の低価格品（例えば、ＧｕＨＣｌ）は使用されない。

特許文献１と整合することには、Ｋｉｍら（非特許文献７）は、塩化ナトリウム（２５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８）の存在下でのＡｐｏ Ａ−Ｉのウイルス濾過を記述している。この工程は、ＤＥＡＥ−ＦＦカラムから溶出後すぐに実施される。しかしながら、Ａｐｏ Ａ−Ｉの凝集する性質により製造限界があり、理想的に濾過工程はＡｐｏ Ａ−Ｉがカラムから溶出されるときに完了する必要があるか、代替的にＡｐｏ Ａ−Ｉを非常に低いタンパク質濃度（例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ）で塩の存在下で保存する必要がある。この後者の手法では、過剰な濾過体積が必要になるという欠点がある。ウイルスフィルターの費用は相当になる。このように、アポリポタンパク質の凝集などによる濾過容量の減少または過剰の濾過体積により、商業的規模において処理費用が非常に高くなる可能性がある。

特許文献２は、ポリオール糖または糖アルコール（つまりスクロースおよびソルビトール）などのクラスレート修飾物の使用に関する。特許文献２は、濾過膜表面の疎水性を増加させ、タンパク質の流体力学的半径を減少させること、ならびに濾過されることが望ましいタンパク質の自己会合傾向を減少させることを目的としている。

特許文献３は、フィブリノーゲン（３４０ｋＤａ）のような高分子量タンパク質の溶液からナノ濾過によってウイルスを除去する方法に関する。

比較的小さい（２８ｋＤａ）Ａｐｏ Ａ−Ｉのようなアポリポタンパク質は、容易にウイルス濾過を適用できるはずである。しかしながら、既に上述したように、疎水性作用と凝集物形成という不適当な性質により、フィルター表面上でタンパク質クラスターの形成が促進され、フィルターの孔を閉塞させる。フィルターの観点からみると、膜の上流側の表面で、孔の閉塞および／またはケーキもしくは沈殿物の形成が生じる可能性があり、膜の孔構造内で生じる可能性もある。ファウリングは、定圧操作での流速の低下を引き起こし、一定濾液流束で操作するための圧力を増加させる。フィルターのファウリングの結果として、濾過の選択性の低下が生じ、結果的にタンパク質回収率の低下および／またはウイルス保持能の低下に至る。さらに、フィルターのファウリングは、容量および処理能力を低下させ、濾過時間の延長および／またはフィルター面積増加の必要性を生じさせる。さらに、アポリポタンパク質の可溶性の維持と凝集抑制に最適な操作条件は、高いウイルスクリアランスを確実にするのに最適な条件とは異なる可能性がある。特にアポリポタンパク質を溶解させるために使用されるカオトロピック物質は、病原体（例えば、ウイルス）の濾過性能およびおそらくは濾過膜の性能を変化させる。結果として、特定濃度でのカオトロピック物質の存在は、所望しないウイルスが濾過膜を通過することを許し、アポリポタンパク質を含む溶液を処理する工程の有用性を失わせる可能性がある。

国際公開第９６／００２３７号 国際公開第０３／１０５９８９号 米国特許出願公開第２００３／２３２９６９（Ａ１）号

Ｌｕｎｄ−Ｋａｔｚ ＆ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、２０１０、Ｓｕｂｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５１、１８３−２２７頁 Ｓｕｕｒｋｕｕｓｔ ＆ Ｈａｌｌｅｎ、２００２、Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ １６、１９９−２０６頁 Ｍａｎａｂｅ．Ｓ、Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．、（１９９６）８８：８１−９０頁 Ｂｒａｎｄｗｅｉｎ Ｈら、Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｒｅｍｏｖａｌ．、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（Ｂａｓｅｌ）．、（２０００）１０２：１５７−６３頁 Ａｒａｎｈａ−Ｃｒｅａｄｏら、Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ＰＶＤＦ ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ．、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．（１９９８）６月；２６（２）：１６７−７２頁 Ｍｏｃｅ−Ｌｌｉｖｉｎａら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ｓｕｌｆｏｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、（２００３）４月、１０９巻、１号、９９−１０１頁 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１１、１６、７８５−７９２頁

したがって、本発明の目的は、ウイルス、特にパルボウイルス科ウイルスなどの小型のノンエンベロープウイルスを安全に除去するための濾過方法であって、Ａｐｏ Ａ−Ｉなどのアポリポタンパク質を含む溶液に対して好適で、産業的用途にも適した前記濾過方法を提供することである。

本発明の目的は、概して、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）を精製するための方法であって、Ａｐｏ Ａ−Ｉと塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）とを含む溶液を、適切な孔径を有するフィルターを通して濾過する工程を含む方法によって達成される。

本発明の一態様では、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）を精製するための方法であって、ａ）Ａｐｏ Ａ−Ｉと塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）とを含む溶液を用意する工程；および、ｂ）該溶液を１５ｎｍ〜３５ｎｍの範囲の孔径を有するフィルターを通して濾過する工程を含む前記方法を提供する。

一実施形態において、本方法は、Ａｐｏ Ａ−Ｉにおけるウイルス混入を減少させるための方法である。本発明のいくつかの実施形態において、本方法は、Ａｐｏ Ａ−Ｉにおけるパルボウイルスを含むウイルス混入を減少させるための方法である。特定の実施形態において、パルボウイルスは、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）である。本発明のいくつかの実施形態において、本方法は、Ａｐｏ Ａ−Ｉにおけるピコルナウイルス科ウイルスを含むウイルス混入を減少させるための方法である。特定の実施形態において、ピコルナウイルス科ウイルスは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはＡ型肝炎ウイルスである。

好ましい実施形態において、溶液は、５〜３０ｇ／Ｌの範囲内、特に５〜２０ｇ／Ｌの範囲内、例えば７〜１２ｇ／Ｌの範囲内のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度を含む。

好ましい実施形態において、溶液は、Ａｐｏ Ａ−Ｉの凝集を減少させるまたは阻害するＧｕＨＣｌ濃度を含む。溶液は、特に１．３〜３．２Ｍの範囲内、特に１．５〜２．０Ｍの範囲内のＧｕＨＣｌ濃度を含む。より好ましくは、溶液中のＧｕＨＣｌ濃度は１．７Ｍである。

一実施形態において、溶液のｐＨは、７．１〜７．５の範囲内、例えば７．３である。

一実施形態において、溶液は、１）Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物を４．０〜４．６ＭのＧｕＨＣｌに懸濁する工程；ならびに／または２）該懸濁物を５〜３０ｇ／Ｌの範囲内のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度および／もしくは１．３Ｍ〜３．２Ｍの範囲内のＧｕＨＣｌ濃度に希釈する工程の１つまたはそれ以上によって調製される。

一実施形態において、工程ｂ）の後に、ウイルス不活化のために熱処理工程が実行される。熱処理は、溶液のｐＨを６．６〜８．０の範囲内に調節する工程；および続けて該溶液を５５〜６１℃の温度で約３０分〜約４時間加熱する工程を含む。

代替的実施形態において、工程ａ）の前に、ウイルス不活化のために熱処理工程が実行される。熱処理は、ＧｕＨＣｌとＡｐｏ Ａ−ＩをｐＨ６．６〜８．０の範囲内で含む溶液を用意する工程；および続けて該溶液を５５〜６１℃の温度で約３０分〜約４時間加熱する工程を含む。

好ましい実施形態において、ｐＨが６．６〜８．０の範囲内である溶液は、２．７〜３．９Ｍの範囲内、より好ましくは３．５ＭのＧｕＨＣｌ濃度を含む。

本発明の一実施形態において、ｐＨが６．６〜８．０の範囲内である溶液のｐＨは、好ましくは７．０〜８．０の範囲内である。特定の実施形態において、ｐＨは７．３である。

本発明の一態様は、本発明の方法により精製されたＡｐｏ Ａ−Ｉも提供する。

本発明の一態様は、パルボウイルスに対して少なくとも１２ｌｏｇ ＬＲＶ（ｌｏｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ、対数減少値）；および／またはノンエンベロープウイルスに対して少なくとも９ｌｏｇ ＬＲＶ；および／または脂質エンベロープウイルスに対して少なくとも８．５ｌｏｇ ＬＲＶを有するＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物も提供する。特定の実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉ調製物は、医薬用途に適している。

別の態様において、本発明は、前記態様によるＡｐｏ Ａ−ＩまたはＡｐｏ ＡＩ調製物を、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、医薬組成物を製造する方法であって、前記態様に記載の方法によりＡｐｏ Ａ−Ｉを製造する工程、およびＡｐｏ Ａ−Ｉを医薬的に許容される担体または希釈剤と組み合わせ；または前記態様に記載のＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物を医薬的に許容される担体または希釈剤と組み合わせ；それにより医薬組成物を製造する工程を含む、医薬組成物の前記方法を提供する。

本発明のさらなる態様は、前記態様に記載のＡｐｏ Ａ−ＩまたはＡｐｏ−ＡＩ調製物を脂質と共に含むｒＨＤＬ製剤を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、再構成ＨＤＬ製剤を製造する方法であって、前記態様に記載の方法によりＡｐｏ Ａ−Ｉを製造する工程、およびＡｐｏ Ａ−１を脂質と組み合わせ；または前記態様に記載のＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物を脂質と組み合わせ；それにより再構成ＨＤＬ製剤を製造する工程を含む、再構成ＨＤＬ製剤の前記方法を提供する。

さらなる本発明の態様は、哺乳動物における疾患、障害または状態を処置または予防する方法であって、前記態様のいずれかによるＡｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ１調製物、医薬組成物、またはｒＨＤＬ製剤を哺乳動物に投与し、それにより疾患、障害または状態を処置または予防する工程を含む前記方法を提供する。

３．２ＭのＧｕＨＣｌ、１９．７ｇ／Ｌのタンパク質の条件下でのナノ濾過における溶液の処理能力［ｋｇ／ｍ^２］を示す図である。 １．７ＭのＧｕＨＣｌ、８．９ｇ／Ｌのタンパク質の条件下でのナノ濾過における溶液の処理能力［ｋｇ／ｍ^２］を示す図である。 １．７ＭのＧｕＨＣｌ、５．８ｇ／Ｌのタンパク質の条件下でのナノ濾過における溶液の処理能力［ｋｇ／ｍ^２］を示す図である。 ナノ濾過全体にわたる負荷と流束を示す図である。

本明細書を通して、他に断りがない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、示した要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を包含するが、任意の他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を排除するものではないことを意味すると理解される。

本明細書における任意の先行刊行物（もしくはそれに基づく情報）または公知の任意の物質についての言及は、その任意の先行の刊行物（もしくはそれに基づく情報）または公知の任意の物質が、本明細書と関連して検討した分野の共通の一般的知識の一部を形成することの認識もしくは承認または何らかの形の示唆ではなく、さらにそのような認識もしくは承認または何らかの形の示唆と解釈されるべきでない。

本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示していない限り、複数の態様を含むことに留意が必要である。したがって、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」という言及は、１つのタンパク質だけでなく２つまたはそれ以上のタンパク質を含む。

数値ｘに関連した用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

本発明の複数の連続する工程を含む方法の提供において、本発明は、総数より少ない工程を含む方法も提供する。異なった工程を、異なる人により、異なる場所で（例えば異なる国で）、多様な時間において実施することができる。

特別に示さない限り、２つまたはそれ以上の成分の混合工程を含むプロセスは、特定の混合順序を何ら必要とするものではない。したがって成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分がある場合、２つの成分を互いに組み合わせ、次いで３番目の成分を組み合わせることなどが可能である。

フィルターの内容において用語「孔径」は、通常、フィルターの孔の大きさを意味する。典型的には、孔径は、フィルターにより除去することができる最小のウイルスのサイズより小さいまたはそれ未満である。この内容において、本発明の一定の実施形態は孔径の幾何学的特性（例えば、直径）に言及することもあるが、以下でさらに詳述されるように、孔径が機能的に定義できることも理解される。

驚くべきことに、本発明にしたがって塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）（塩化グアニジンと呼ばれることもあり、ＧｄＨＣｌ、ＧｄｍＣｌまたはＧｎｄＣｌと略されることもある）を使用するとき、Ａｐｏ Ａ−Ｉ溶液が、孔径１５ｎｍ〜３５ｎｍの範囲の孔を有するフィルターを通じて濾過され、実質的または完全なウイルスクリアランスを、タンパク質の凝集およびフィルターの閉塞なく達成できることを見出した。特定の実施形態において、フィルターは、１５ｎｍ〜３５ｎｍ；または１５ｎｍ〜３５ｎｍ未満；または１５ｎｍ〜３０ｎｍ；または１５ｎｍ〜２５ｎｍ；または１５ｎｍ〜２０ｎｍ；または２０ｎｍ〜２５ｎｍ；または１８ｎｍ〜２３ｎｍ；または１５ｎｍ〜２６ｎｍ；または１８ｎｍ〜２６ｎｍ；または２７ｎｍ〜３２ｎｍ；または２５ｎｍ〜３０ｎｍ；または２０ｎｍ〜３０ｎｍの範囲の孔径を有する。

本発明の実施形態において、１５ｎｍ〜３５ｎｍの範囲の孔径を有するフィルターは、１５ｎｍ〜３５ｎｍの範囲の平均孔径を有する。いくつかの実施形態において、フィルターは、１５ｎｍ〜３５ｎｍ未満；または１５ｎｍ〜３０ｎｍ；または１５ｎｍ〜２６ｎｍ；または１８ｎｍ〜２６ｎｍ；または１５ｎｍ〜２５ｎｍ；または１５〜２０ｎｍ；または２０ｎｍ〜２５ｎｍ；または１８ｎｍ〜２３ｎｍ；または２７ｎｍ〜３２ｎｍ；または２５ｎｍ〜３０ｎｍ、または２０ｎｍ〜３０ｎｍの範囲の平均孔径を有する。特定の実施形態において、平均孔径は、約１５ｎｍ；または約２０ｎｍ；または約２５ｎｍ；または約３０ｎｍ；または約３５ｎｍである。

ＧｕＨＣｌの使用は、以下の２つの点から有利である：１）カオトロピック特性により、ＧｕＨＣｌは、抗凝集剤として機能し、例えば、溶液中のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質の凝集クラスターの形成を阻害する；２）一方で、アポリポタンパク質構造に不可逆的影響はなく、したがってＧｕＨＣｌが除去されると、Ａｐｏ Ａ−Ｉへリックスが再形成され、タンパク質は脂質と結合して、再構成ＨＤＬのような粒子を形成する。さらにアポリポタンパク質はその生物学的活性を維持している。このことは生成物をさらに医薬物質として使用するために極めて重要である。

本発明の利点は、流速を上げ、液体体積ならびに濾過に必要なフィルター面積および処理時間を減少させることが可能となることである。結果として、より大量のＡｐｏ Ａ−Ｉ溶液を、短時間で濾過することができ、処理の効率を大幅に向上させることができる。

本発明で効率的に除去することができるウイルスは、約３００ｎｍより小さいサイズを有する。適切に除去することができるウイルスのサイズは約２００ｎｍより小さい。そのようなウイルスの例としては、サイトメガロウイルス（約１８０〜２００ｎｍ、血漿製品）；単純ヘルペスウイルス（約１５０〜２００ｎｍ、組み換え製品）；およびエプスタインバー・ウイルス（約１２０〜２００ｎｍ、組み換え抗体製品）を挙げることができる。除去することのできるウイルスのサイズは好ましくは約１２０ｎｍより小さい。そのようなウイルスの例としてはＨＩＶ（約８０〜１２０ｎｍ、血漿由来製品）が挙げられる。通常、除去することのできるウイルスは、約２０ｎｍ、つまりパルボウイルス（１５〜２６ｎｍ、血漿および組換え由来製品）のおよそのサイズより大きい。サイズが約１８〜２６ｎｍのＢ１９（血漿製品）のようなパルボウイルスは、治療タンパク質源から除去することが困難である。よって、パルボウイルスの既知のサイズに近い２０ｎｍ領域のフィルター孔径を使用するときのナノ濾過がウイルスクリアランスを評価するための重要な製造工程と一般にみなされる。しかしながら、本発明のプロセスは、小さいウイルス、例えば、パルボウイルスファミリーのメンバー、ならびにＡ型肝炎ウイルス（約２７〜３２ｎｍ、血漿製品）、Ｂ型肝炎ウイルス（約４２ｎｍ、血漿製品）、Ｃ型肝炎ウイルス（約３０〜６０ｎｍ、血漿製品）および脳心筋炎ウイルス（約２５〜３０ｎｍ；組み換え製品）の安全で効率的な除去を可能にする。このことは特に注目すべきであり、その理由は、当該分野の技術水準によれば、タンパク質の凝集やフィルターの閉塞を防ぐために過剰な量の希釈液が必要となり、これにより、しばしば小型ウイルスの流出がもたらされるためである。

本発明の特定の実施形態において、フィルターは、Ａｐｏ Ａ−Ｉと塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）とを含む溶液からパルボウイルス、例えばＭＶＭまたはＢ１９；および／またはＡ型肝炎ウイルス；および／またはピコルナウイルス科ウイルス、例えば脳心筋炎ウイルスを除去することができる孔径を有する。

ウイルス保持能は、適切には、供給物中のウイルス濃度対濾液中のウイルス濃度の比率の対数（底は１０）として定義される対数減少値（ＬＲＶ）：ＬＲＶ＝−ｌｏｇ１０Ｓによって特徴づけられる；ここでＳは、ウイルスの篩係数である。必要とされるＬＲＶの合計は、出発物質のウイルス混入の性質と潜在性に依存する。ウイルス濾過工程は、通常、最小でも４−ｌｏｇのウイルス除去（ＬＲＶ）が得られるように設計される。ウイルスクリアランス試験は、高力価の感染性ウイルス（異なる物理学的特性を有する）をスケールダウンしたモジュールにスパイクし、ＬＲＶを評価することによって達成される。エンベロープおよびノンエンベロープウイルスの両方の除去を実施することもできる。一般的なモデルウイルスとしては、動物パルボウイルス（例えば、ＭＶＭ、Ｂ１９）、ポリオウイルス（非特異性モデルウイルス）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ａ型肝炎などのピコルナウイルス科ウイルスについてのモデル）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０、非特異性モデルウイルス）、シンドビスウイルス（Ｃ型肝炎についてのモデル）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ、Ｃ型肝炎などのフラビウイルス科ウイルスについてのモデル）、アヒルＢ型肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎についてのモデル）、日本脳炎ウイルス（Ｃ型肝炎についてのモデル）およびレオウイルス（非特異性モデルウイルス）が挙げられる。初期設計試験も、はるかに高純度および高力価での取得が可能で分析がより容易な（およびより安価な）バクテリオファージを用いて実施することができる。

ウイルス濾過の妥当性試験は、典型的には１３〜４７ｍｍのディスクを備えた自給式装置を使用して小規模で通常実施される。全てのプロセスパラメータを線形的に規模縮小し、ウイルスクリアランスに関して最悪である条件を示すべきである。最悪のプロセス条件下での妥当性を保証するために、産業的規模のプロセス設計と比較して表面積当たりより大量の供給流を処理することも重要である。ウイルスクリアランスは、いくつかの分画で測定されるべきである。いくつかの最近の研究から、ウイルスクリアランスにより、パルボ型ウイルスフィルター（２０ｎｍ孔径）を用いるときの膜ファウリング（透過性減少）の程度を低減できることが実証された。

本発明の方法は、ウイルスの不活化および／または除去のための非常に効率的な方法を提供する。原理的に、そのような高ウイルス濃度が実際に存在することを想定して、本発明は、パルボウイルスなどの特に小型のノンエンベロープウイルスの含有量を、少なくとも３ｌｏｇ ＬＲＶ（ウイルスの数を１，０００分の１に低下）、適切には少なくとも４ｌｏｇ ＬＲＶ（１０，０００分の１に低下）、好適には少なくとも５ｌｏｇ ＬＲＶ（１００，０００分の１に低下）、好ましくは少なくとも６ｌｏｇ ＬＲＶ（ウイルスの数を１，０００，０００分の１に低下）に低下することを可能にする。

さらに、本発明の濾過方法は、ウイルスをさらに減少させることを確実にするための他のウイルス除去または不活化手法、例えば熱処理工程と、容易に組み合わせることができる。

場合により、前濾過（ｐｒｅ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または清澄濾過（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）工程は、マクロサイズの粒子を除去するために、ウイルス濾過の前に実施することができる。そのような前濾過は、ウイルス除去膜よりも大きい孔径を有する膜を含むフィルターを用いて実施することもできる。本発明の一実施形態において、前置フィルターは、０．０５〜０．５μｍの範囲の孔径を有する。特定の実施形態において、前置フィルターは、Ｐａｌｌ Ｎｙｌｏｎ膜フィルター（ＳＫＬ７００２ ＮＴＰ０．１μｍもしくはＦＴＫＮＩ）またはＳａｒｔｏｐｏｒｅ２フィルターから選択される。特定の実施形態において、前置フィルターの大きさは、出発原料Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物１ｋｇ当たり少なくとも０．０２５ｍ^２のフィルター表面積を使用するように選択される。他の実施形態において、前置フィルターの大きさは、出発原料Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物１ｋｇ当たり少なくとも０．０１４ｍ^２のフィルター表面積を使用するように選択される。特定の実施形態において、前置フィルターの大きさは、出発原料Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物１ｋｇ当たり約０．０１４ｍ^２〜約０．０３５ｍ^２の範囲のフィルター表面積を使用するように選択される。前濾過は、ウイルスフィルターに対して直列的にまたはウイルスフィルターに対して系外のいずれかで実施することができる。特定の実施形態において、前濾過は、ウイルスフィルターに対して直列的に実施される。特定の実施形態において、前置フィルターは、ウイルス除去フィルターと同じ膜材料で作られる。

本発明のウイルス濾過方法のために好適なフィルターは市販されており、例えば特に、プラノバＢｉｏＥｘ（旭化成株式会社）などの名称下で、購入することができる。そのようなフィルターは「小型ウイルス」除去フィルターと呼ばれることもある。

特定の実施形態において、ウイルス除去フィルターは、銅アンモニア再生セルロース、親水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ＰＶＤＦ複合体、表面修飾ＰＶＤＦ、ナイロンおよびポリエーテルスルホンから選ばれる１つまたはそれ以上の材料から製造される膜を含む。

本発明の実施形態において、濾過膜はフラットシートまたは中空繊維膜である。フラットシート膜の例としては、親水性化ＰＶＤＦ濾過膜、例えば、Ｐｅｇａｓｕｓ（商標）グレードＳＶ４小型ウイルス除去フィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。実施形態において、フィルターは、ＰＶＤＦフラットシート膜を含む。実施形態において、フィルターは、親水性ＰＶＤＦフラットシート膜、複合ＰＶＤＦフラットシート膜、または表面修飾ＰＶＤＦフラットシート膜を含む。特定の実施形態において、フィルターは、Ｐｅｇａｓｕｓ（商標）グレードＳＶ４である。

他の実施形態において、フィルターは中空繊維膜である。中空繊維膜フォーマットは、典型的には、一束のストロー状中空繊維を、各中空繊維の壁が微細毛細管によって相互に連結した空間で構成された孔の３次元ウェブ構造を含有している状態で含有している。中空繊維フィルターの例としては、親水性修飾ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）が中空繊維膜フォーマットに組み込まれたプラノバ（商標）ＢｉｏＥＸフィルター（旭化成株式会社）が挙げられる。一実施形態において、フィルターは、中空繊維膜フォーマットのＰＶＤＦ膜を含む。一実施形態において、フィルターは、親水性ＰＶＤＦ中空繊維膜フォーマットを含み、またはＰＶＤＦ中空繊維膜フォーマットを含み、または表面修飾ＰＶＤＦ中空繊維膜フォーマットを含む。特定の実施形態において、フィルターは、プラノバ（商標）ＢｉｏＥＸである。

非常に異なる構造を有する濾過膜を比較するために、顕微鏡検査のような視覚的方法を使用して孔径を調べることは適切でない。したがって、本明細書での孔径への言及は、視覚的方法ではなく、機能的方法で評価したフィルターの構造特性について記述する。フィルター孔径の評価は、機能的方法を使用して行うことができる。そのような方法としては、バブルポイント測定、液−液ポロシティ、圧入ポロシメトリー、高分子（例えば、バクテリアファージ）の篩分け、および／または既定した大きさの粒子が挙げられる。

平均フローバブルポイントは、ＡＳＴＭ Ｅ１２９４−８９にしたがって測定することができる（「膜フィルターの孔径特徴に対する自動化液体ポロシメータを用いる標準試験法（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｏｒｅ Ｓｉｚｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｅｒ）」）。簡単には、この方法は、パーフルオロヘキサン（例えば、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）ＦＣ−７２）を含むフィルターを湿らせて、次いで異なる空気圧力を適用して流体を除去することを含む。湿性フローが、乾性フロー（濡れ性溶媒の無いフロー）の２分の１に等しい点での圧力差を使用して平均フロー孔径が計算される。

本発明の特定の実施形態において、フィルターは、１００ｐｓｉを超える、または１２０ｐｓｉを超えるパーフルオロヘキサンを用いて測定した平均フローバブルポイントを有する。

本発明の他の実施形態において、フィルターの孔径は、コロイド金粒子溶液をフィルターにかけること（例えば、ＡＧＰＴＳ−旭化成金粒子テストシステム）によって評価することができる。試験の開始前にインラインの視覚的波長分光計で初期吸光度を測定する。金粒子溶液がフィルターを通過するとき、第２の吸光度読取により、金粒子除去率が評価され、孔径分布結果が、吸光度値のＬＲＶ計算に基づき決定される。

アポリポタンパク質は、天然のＨＤＬまたは再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の機能的な生物学的に活性な成分である任意のアポリポタンパク質である。特定のアポリポタンパク質としては、Ａ、ＣおよびＥファミリーのメンバーが含まれる。典型的には、アポリポタンパク質は、血漿由来または組換えアポリポタンパク質、例えばＡｐｏ Ａ−Ｉ、Ａｐｏ Ａ−ＩＩ、Ａｐｏ Ａ−Ｖ、ｐｒｏ−Ａｐｏ Ａ−Ｉ、またはＡｐｏ Ａ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏなどの変異体もしくは４ＷＦなどのいわゆる酸化耐性形態である。特定の実施形態において、アポリポタンパク質はＡｐｏ Ａ−Ｉである。いくつかの実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉは血漿由来である。他の実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉは組換えＡｐｏ Ａ−Ｉである。好ましくは、Ａｐｏ Ａ−Ｉは、野生型配列またはＭｉｌａｎｏ配列を含めて組換え的に誘導されるかまたはヒト血漿から精製される。Ａｐｏ Ａ−Ｉは、単量体、二量体、三量体、もしくは多量体、またはそれらの混合物の形態である。アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の生物学的に活性な断片の形態であることもある。そのような断片は、天然物、化学的合成物または組換え体であることもある。例示として、Ａｐｏ Ａ−Ｉの生物学的に活性な断片は、好ましくは、Ａｐｏ Ａ−Ｉのレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）刺激活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％〜１００％、さらには１００％超を有する。

Ａｐｏ Ａ−Ｉのようなアポリポタンパク質を含む出発物質は、例えばＫｉｓｔｌｅｒ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ分画法に従った沈殿物ＩＶに由来し、例えば冷エタノール沈殿によりさらに精製されたものであってよい。代替的実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉなどのアポリポタンパク質を含む出発物質は、細胞培養物／発酵抽出物である。複数の実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉは、大腸菌宿主／ベクター系または哺乳動物宿主細胞、例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（例えば、ＣＨＯ−ＫＩまたはＣＨＯ−Ｓ）、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＢＨＫ５７０、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−Ｉ、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＰＣ１２およびＷ１３８、またはミエローマ細胞もしくは細胞株（例えば、マウスミエローマ細胞または細胞株）で細胞培養することによって産生される。特定の実施形態において、細胞培養物は、無血清培地で培養されたものである。特定の実施形態において、細胞培養物は、動物由来成分を欠如させた無血清培地で培養されたものである。

使用前にＡｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物は−２０℃未満の温度で冷凍庫に保存しておくことができる。

Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物の懸濁について、Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物の溶液に対する比率は、１：２〜１：５の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物の溶液に対する体積比は、１：３〜１：４の範囲である。特定の実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物の溶液に対する体積比は、１：３、または１：３．１、または１：３．２、または１：３．３、または１：３．４、または１：３．５である。

再懸濁を容易にするために、凍結Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物は、ポリエチレン袋の内部で例えばｐｈａｒｍａハンマーを使用して、小片（直径＜５ｃｍ）に破砕した後に溶液に添加することができる。

懸濁は、溶液中のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度およびＧｕＨＣｌ濃度を所望の範囲に調節するために、ＷＦＩ（注射用水）で連続的に希釈することができる。

いくつかの実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉと塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）とを含む溶液は、ＰＣＴ／ＡＵ２０１４／０００５８４で記載された精製Ａｐｏ Ａ−Ｉに由来するものである。

本発明の文脈において、表現「５〜３０ｇ／ＬのＡｐｏ Ａ−Ｉ」および同様の表現は、５〜３０ｇのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）タンパク質が１Ｌの溶液に溶解されていることを意味する。濾過工程についてのアポリポタンパク質濃度は、典型的には、０．５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの範囲である。特定の実施形態において、工程ａ）の溶液のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度は、５〜２５ｇ／Ｌ；または５〜２０ｇ／Ｌ；または５〜１５ｇ／Ｌ；または５〜１２ｇ／Ｌ；または７〜１２ｇ／Ｌ；または５〜１１ｇ／Ｌ；または７〜１１ｇ／Ｌ；または５〜１０ｇ／Ｌ；または７〜１０ｇ／Ｌの範囲である。本発明のいくつかの実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉと塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）とを含む溶液のタンパク質濃度は、２８０ｎｍで吸光度を測定し、次いで実施例１に記載のようにタンパク質濃度を計算することによって決定される。いくつかの実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉと塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）とを含む溶液のタンパク質濃度は、比濁分析または高性能キャピラリー電気泳動（実施例１に記載の方法を使用）によって測定することができる。

工程ａ）の溶液のＧｕＨＣｌ濃度は１．３〜３．２Ｍの範囲内であることが特に好ましい。特定の実施形態において、ＧｕＨＣｌ濃度は、１．３〜３．０Ｍ；または１．３〜２．７５Ｍ；または１．３〜２．５Ｍ；または１．５〜３．０Ｍ；または１．５〜２．７５Ｍ；または１．５〜２．５Ｍ；または１．５〜２．２５Ｍ；または１．５〜２．０Ｍ；または１．５〜１．９Ｍの範囲内である。より好ましくは、ＧｕＨＣｌ濃度は１．６〜１．９Ｍの範囲内であり、最も好ましくは、ＧｕＨＣｌ濃度は１．７Ｍである。この濃度は、溶液中のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質の凝集形成を抑制し、濾過性（つまり容量および処理能力）を改善し、濾過膜（つまり選択性）中のウイルスの最大保持能を確実にするために理想的である。本発明の実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉと塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）とを含む溶液中のＧｕＨＣｌ濃度は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して決定される。本発明の特定の実施形態において、グアニジンの含有量は、適切な陽イオン交換カラム（例えば、ＩｏｎＰａｃ ＣＳ１９分析カラム、４×２５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｉｏｎｅｘ））を有するイオンクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて実施される。Ｄｉｏｎｅｘ ＩｏｎＰａｃ ＣＳ１９カラムは、伝導度検出を伴った自動的メタンスルホン酸（ＭＳＡ）溶離生成および電解質溶離抑制のためのＲｅａｇｅｎｔ−Ｆｒｅｅ（商標）イオンクロマトグラフィー（ＲＦＩＣ（商標））システムと共に使用することができる。このようにして、移動相からのイオン（例えば、メタンスルホン酸、ＭＳＡ）によるバックグラウンドを抑制して、伝導度測定によりグアニジンの検出を実施することができる。Ａｐｏ Ａ−Ｉおよびグアニジンを含む試料は、内部標準（例えば、酢酸ホルムアミジン）と混合し、グアニジン濃度が約０．１〜２．０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈することもできる。クロマトグラフィーは均一濃度または勾配モードのいずれかで実行することができる。定量は、５点較正（０．１〜２．０ｍｇ／ｍＬ）を用いたピーク面積および内部標準に基づいて行うことができる。

一実施形態において、ウイルス濾過工程前の溶液のｐＨは、約７〜約１０；または約７〜約９；または約７〜約８の範囲内である。特定の実施形態において、ウイルス濾過工程前の溶液のｐＨは、７．１〜７．５の範囲内である。さらなる実施形態において、ウイルス濾過工程前の溶液のｐＨは７．３である。このｐＨ範囲は、生理学的ｐＨ（約７．３５〜７．４５）またはほぼ生理学的ｐＨである。理想的にはｐＨはアポリポタンパク質の等電点から少なくとも１ｐＨ単位離れている。特定の実施形態において、ｐＨはアポリポタンパク質の等電点から少なくとも１ｐＨ単位離れている。ヒトＡｐｏ Ａ−Ｉおよびその変異体の場合において、等電点は、典型的には、約ｐＨ５．２〜５．８の範囲である。アポリポタンパク質の等電点は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、例えば、Ｃｏｎｔｉｅｒｏら、（１９９７）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８（１）、１２２−１２６頁に記載されるような方法によって、測定することができる。複数のアポリポタンパク質アイソフォームピークがＩＥＦプロフィールに存在するとき、平均等電点を使用することができる。

本発明の文脈において、溶液が所与のｐＨ範囲内、例えば７．１〜７．５の範囲内にあるときは、溶液がそのｐＨ、例えば７．１〜７．５の範囲のｐＨを「有する」ことを意味する。このことは、溶液がｐＨ７．１〜７．５で形成されるか、または溶液の形成後にｐＨを７．１〜７．５とすることを意味する。

一般的には、ｐＨは、Ａｐｏ Ａ−Ｉタンパク質を前記溶液に添加する前の溶液；またはＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質と溶液とを混合した直後の溶液のいずれかで測定される。典型的には、工程ａ）の溶液のｐＨは、前駆体成分を混合した直後に測定される。代替的に、混合物のｐＨは、混合物の成分の計画された量および濃度に基づく計算によって決定することもできる。

本発明において、溶液は、場合により１つまたはそれ以上の溶媒、例えばメタノールまたはエタノールを含む少なくとも５０重量％の水を含む溶液を指す。溶媒は、任意の薬学的グレードの溶媒であってよい。本発明の特定の実施形態において、溶媒は、エタノール、例えば９５％の薬学的グレードのエタノール（例えば５％メタノールを含む３Ａ）である。さらなる実施形態において、溶液は約２０％のエタノールを含む。

場合により、工程ａ）で使用されるフィルターは、溶液を濾過する前にＷＦＩおよび／またはＧｕＨＣｌ溶液で予洗（ｐｒｅｗａｓｈ）される。この予洗工程は、フィルターを通過するタンパク質の透過性を向上させる。特定の実施形態において、フィルターは、１．３〜２．０ＭのＧｕＨＣｌで予洗される。

ウイルス濾過全体にわたるタンパク質の損失を最小化するために、いくつかの実施形態において、濾過後にフィルターはＧｕＨＣｌで後洗浄（ｐｏｓｔ−ｗａｓｈ）される。特定の実施形態において、フィルターは１．３〜２．０ＭのＧｕＨＣｌで後洗浄される。

ウイルス濾過は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）または「デッドエンド」濾過（全量濾過またはダイレクトフロー濾過としても知られる）のいずれかを用いて実施することができる。ウイルスフィルターは、供給物が非対称膜の上部表層と隣接して流れるＴＦＦで使用するためにもともとは設計されたものである。ＴＦＦは、膜表面を一掃して濃度分極およびファウリングを減少させる高流束を提供する。一方、デッドエンド濾過は簡便で資本価格が低いため、デッドエンド濾過のために特別に設計されたウイルスフィルターが広範囲に使用されている。ＴＦＦとは対照的に、これらのデッドエンドフィルターは通常、膜の供給流に面した開放的な側で操作され、タンパク質凝集物および他の大きな混入物質がマクロ多孔質構造内に捕捉され、それによりウイルス保持表面層が保護される。単回使用のデッドエンドフィルターを使用することの利点としては、システム設計と妥当性検査の両方が簡便で、作業と資本価格が軽減されることが挙げられる。

デッドエンド濾過は、典型的には、流体を表面から膜に押し出すための単一のポンプの使用を含む。

タンジェンシャル濾過は、一般的に、濾過膜の表面で流速を維持するための第１のポンプと、膜の裏側で負の圧力を生じさせてタンパク質を膜へ引き出す第２のポンプとを必要とする。

特定の実施形態において、濾過はデッドエンド濾過で実行される。

特定の実施形態において、デッドエンド濾過プロセスは、定圧濾過あるいは等速濾過のいずれかを使用して行われる。特定の実施形態において、デッドエンド濾過処理は、定圧濾過を使用して行われる。

濾過は、本明細書で使用されるウイルス除去膜の材料に依存して、膜が耐えられるレベルと同じまたはそれ未満の濾過圧、例えば約０．２〜約３．４バールの圧力で実施される。特定の実施形態において、濾過圧は、約０．２バール〜約３．４バールで維持される。複数の実施形態において、濾過圧は、約１〜約３バール；または約１．５〜約３バール；または約１．７〜約３バール；または約２〜約３バール；または約２．２〜約３バール；または約２．２〜約２．７バールで維持される。いくつかの実施形態において、濾過圧は、約１．７バール〜約２．４バール；または約２．２バール〜約２．４バールで維持される。

温度は、タンパク質溶液の粘度に影響し、さらにウイルス除去膜の濾過に対する流束にも影響を与える。濾過工程で使用される溶液は、０℃からタンパク質が変性する温度までの温度を有するべきである。溶液の温度は適切には、約１０℃〜約５０℃までの範囲内である。特定の実施形態において、溶液の温度は、約１８℃〜約３５℃までの範囲内である。いくつかの実施形態において、溶液は、約１８℃〜約２６℃の室温で濾過される。

特定の実施形態において、２つまたはそれ以上のフィルターが直列で使用される。特定の実施形態において、濾過は、１５ｎｍ〜３５ｎｍの範囲の孔径を有する２つのフィルターを直列で使用して行われる。いくつかの実施形態において、２つまたはそれ以上のフィルターは、１５ｎｍ〜３５ｎｍ未満；または１５ｎｍ〜３０ｎｍ；または１５ｎｍ〜２５ｎｍ；または１５〜２０ｎｍ；または２０ｎｍ〜２５ｎｍの範囲の孔径を有する。特定の実施形態において、２つまたはそれ以上のフィルターは、約１５ｎｍ；または約２０ｎｍ；または約２５ｎｍ；または約３０ｎｍ；または約３５ｎｍの群から選択される平均孔径を有する。

本発明の実施形態において、ウイルスフィルター性能は、フィルター表面積１ｍ^２当たり、少なくとも２００ｋｇ、または少なくとも３００ｋｇ、または少なくとも３４０ｋｇ、または少なくとも５００ｋｇ、または少なくとも７５０ｋｇ、または少なくとも１０００ｋｇのＡｐｏ Ａ−ＩおよびＧｕＨＣｌを含む溶液を有する。

工程ａ）の溶液は、Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物を４．０〜４．６ＭのＧｕＨＣｌを含む溶液に懸濁させ、続けて懸濁液を５〜３０ｇ／Ｌの範囲内の所望のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度および１．３〜３．２Ｍの範囲内の所望のＧｕＨＣｌ濃度に希釈することによって調製することができる。

本発明の特定の実施形態において、アポリポタンパク質（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）を精製するための方法は、５〜３０ｇ／ＬのＡｐｏ Ａ−Ｉを約７〜約８のｐＨで含み、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を１．３〜３．２Ｍの濃度で含む溶液を濾過することを含む。ここで、フィルターは、１５ｎｍ〜３５ｎｍの範囲の孔径を有し、濾過は、圧力が約１〜約３バールで温度が約１８℃〜約３５℃のデッドエンド濾過である。

本発明の特定の実施形態において、アポリポタンパク質（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）を精製するための方法は、５〜２０ｇ／ＬのＡｐｏ Ａ−Ｉを約７〜約８のｐＨで含み、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を１．５〜３．０Ｍの濃度で含む溶液を濾過することを含む。ここで、フィルターは１５ｎｍ〜３５ｎｍ未満の範囲の孔径を有し、濾過は圧力が約１〜約３バールで温度が約１８℃〜約３５℃のデッドエンド濾過である。

本発明の特定の実施形態において、アポリポタンパク質（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）を精製するための方法は、５〜２０ｇ／ＬのＡｐｏ Ａ−Ｉを約７〜約８のｐＨで含み、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を１．５〜２．０Ｍの濃度で含む溶液を濾過することを含む。ここで、フィルターは、１５ｎｍ〜２６ｎｍの範囲の孔径を有し、濾過は、圧力が約１〜約３バールで温度が約１８℃〜約３５℃のデッドエンド濾過である。

常套手段として、ウイルスフィルターには、フィルターが要求された性能レベルを確実に達成するように、使用前および使用後に完全性試験が行なわれる。この試験を容易にするために、フィルター製造業者は、様々な破壊性および非破壊性物理的完全性試験を発展させた。これらの物理的完全性試験の目的は：（１）ウイルスフィルターが適切に設置されていること；（２）フィルターに欠陥および破損が無いこと；ならびに（３）フィルターの性能が製造業者の仕様書およびエンドユーザーのウイルス保持能試験の両方と一致していること、を確認することである。最も一般的に使用される非破壊性試験としては、バブルポイント試験、拡散流量試験（例えば、Ｐａｌｌｔｒｏｎｉｃ Ｆｌｏｗｓｔａｒ ＸＣ（Ｐａｌｌ））、水侵入試験、およびバイナリーガス試験が挙げられる。バブルポイント試験および拡散流量試験のいずれもガスの自由流動に対する障壁として濡れた膜を評価する。水侵入試験は、ＨｙｄｒｏＣｏｒｒ試験とも称され、水、非濡れ性流体の自由流動に対する障壁として乾燥疎水性膜を使用する。バイナリーガス試験は、透過性が大きく異なる２種のガスの混合物を使用し、この試験は水で濡れた膜の上流および下流のガス混合物の組成を測定することに基づく。金粒子試験、プラノバ（旭化成株式会社）フィルターを用いる使用後完全性試験は、破壊性完全性試験である。一般的には、初回試験が失敗した場合にフィルターの完全性を再試験する選択肢を考慮して、非破壊性試験が使用される。使用後完全性試験および再試験が不合格である場合、再濾過がウイルス濾過工程のために一般的に実施される。これらの試験は上述のように、フィルター孔径を推定するために使用することもできる。

本発明の特定の実施形態によれば、本方法は、ウイルスをさらに減少させるための熱処理工程をさらに含む。好ましい実施形態において、熱処理工程は、工程ａ）の前に実施される（オプションＩ）。代替的実施形態において、熱処理工程は、工程ｂ）の後に実施される（オプションＩＩ）。

熱不活化工程に対するアポリポタンパク質濃度は、典型的には０．５〜５０ｇ／Ｌの範囲である。特定の実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度は、５〜３０ｇ／Ｌの範囲内である。

上記実施形態のオプションＩによれば、熱処理工程は、工程ａ）の前、したがってウイルス濾過の前に実施される。この場合、例えば２．７〜３．９Ｍの濃度でＧｕＨＣｌを含み、ｐＨ６．６〜１０．０、特定の実施形態ではｐＨ６．６〜８．０でＡｐｏ Ａ−Ｉを含む溶液が、第１の工程で用意される。次いで溶液は、溶液中に依然として存在している可能性のあるウイルスを不活化するために、５５〜６１℃の温度で約３０分〜約４時間加熱される。

上記実施形態のオプションＩＩによれば、熱処理工程は、工程ｂ）の後、したがってウイルス濾過後に行われる。この場合、工程ｂ）後の溶液中のＧｕＨＣｌ濃度は、ＧｕＨＣｌを例えば２．７〜３．９Ｍの濃度およびｐＨ６．６〜８．０で含む溶液が用意されるように調節される。次いで溶液は、溶液中に依然として存在している可能性のあるウイルスを不活化するために、５５〜６１℃の温度で約３０分〜約４時間加熱される。

オプションＩおよびオプションＩＩの両方において、ｐＨ６．６〜８．０を有する溶液中のＧｕＨＣｌ濃度は、好ましくは３．０〜３．９Ｍの範囲内であり、最も好ましくは３．５Ｍである。この濃度範囲内では、溶液中のタンパク質の凝集形成が抑制される。

一実施形態において、ｐＨ６．６〜８．０を有する溶液のｐＨは、７．０〜８．０の範囲内である。特定の実施形態において、溶液のｐＨは、７．３または約７．３である。このことは本発明による方法が生理学的（約７．３５〜７．４５）またはほぼ生理学的なｐＨで実施され、標的タンパク質が脱変性および生理学的活性を損失するリスクを減少させることを意味する。

熱処理工程がウイルス濾過の前に実施されるオプションＩの場合において、ｐＨ６．６〜８．０の溶液は、好ましくは、Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物を４．０〜４．６ＭのＧｕＨＣｌに懸濁させ、続けてＧｕＨＣｌを２．７〜３．９Ｍの範囲内の濃度およびｐＨを６．６〜８．０の範囲内に例えば希釈により調節することにより調製される。ＧｕＨＣｌの濃度は特に２．７〜３．５Ｍの範囲内である。

熱処理後、工程（ａ）の溶液は、ｐＨが６．６〜８．０の範囲内である溶液から、例えばＷＦＩを含む溶液で希釈することによりＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度およびＧｕＨＣｌの濃度を溶液（Ａ）の所望の範囲に調節することによって調製される。

ウイルス濾過後に熱処理工程が実施されるオプションＩＩの場合において、ｐＨ６．６〜８．０の溶液は、好ましくは、工程ｂ）後の溶液から、溶液中のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度を５〜３０ｇ／Ｌの範囲内およびＧｕＨＣｌ濃度を１．３〜３．２Ｍの範囲内に調節することによって調製される。

溶液がＧｕＨＣｌを含むことと６．６〜８．０の範囲内のｐＨを有することとの特定の組合せにより、ウイルスクリアランスが従来既知の低温殺菌手法よりも非常に早くなる、つまり確立された１０時間の方法に対してウイルスクリアランスが６０℃で約３０分〜約４時間以内となる。

ウイルスクリアランスを達成するために必要な時間の減少により、本発明の方法は、時間が重要な要素となる産業的用途での使用において特に好適である。

さらに、標的タンパク質が高温に曝される時間が短縮されることにより、安定化剤を添加せずとも、したがってタンパク質の機能低下のリスクなしに、タンパク質が不可逆的に変性されるリスクが大幅に減少する。このため本発明の方法は、治療的使用を目的とする、または治療薬送達媒体とすることを目的とするタンパク質からウイルスを除去するための方法として特に適した方法となる。

上記熱処理方法が好ましい一方で、熱処理工程は、Ａｐｏ Ａ−Ｉ溶液を６０℃で少なくとも１０時間加熱するなどの従来的方法を伴ってもよいことが認識される。

熱処理工程および濾過工程の組合せは、ＭＶＭなどのパルボウイルスに対して少なくともＬＲＶ１２ｌｏｇ ＬＲＶ、ＥＭＣＶなどのノンエンベロープウイルスに対して少なくともＬＲＶが９ｌｏｇ、およびＢＶＤＶなどの脂質エンベロープウイルスに対して少なくともＬＲＶが８．５ｌｏｇである。

本発明はパルボウイルスに対して少なくとも１２ｌｏｇ ＬＲＶ（対数減少値）；および／またはノンエンベロープウイルスに対して少なくとも９ｌｏｇ ＬＲＶ；および／または脂質エンベロープウイルスに対して少なくとも８．５ｌｏｇ ＬＲＶを有するＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物を提供する。本発明のいくつかの実施形態において、パルボウイルスに対して少なくとも１２ｌｏｇ ＬＲＶ（対数減少値）；および／またはノンエンベロープウイルスに対して少なくとも９ｌｏｇ ＬＲＶを有するＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物も提供する。本発明のいくつかの実施形態において、パルボウイルスに対して少なくとも１２ｌｏｇ ＬＲＶ（対数減少値）を有するＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物も提供する。特定の実施形態において、パルボウイルスはＭＶＭである。特定の実施形態において、ノンエンベロープウイルスは、ピコルナウイルス科ウイルス、例えばＥＭＣＶである。特定の実施形態において、脂質エンベロープウイルスは、フラビウイルス科ウイルスである。特定の実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉ調製物は、医薬用途に適している。本発明の特定の実施形態において、Ａｐｏ Ａ−Ｉ調製物についてのＭＶＭおよび／またはＥＭＣＶ ＬＲＶは、実施例６に記載の方法によって決定される。

本発明で使用される溶液は、添加剤、例えばＥＤＴＡをさらに含むことができる。特定の実施形態において、ＥＤＴＡは、約１ｍＭの濃度で添加される。

本発明の方法は実験室規模で実施することができる一方、条件をそれほど変化させることなく産業的規模へスケールアップすることもできる。したがって、本明細書に開示の実施形態において、本発明の方法は、産業的または商業的規模で実施される。好ましくは、本発明の方法は、ヒトアポリポタンパク質Ａ−１（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）の商業的規模の製造のために適切である。例えば、本発明の方法において血漿分画を使用するとき、商業的規模での製造では、少なくとも約５００ｋｇの血漿から誘導される血漿分画の使用を含むことができる。より好ましくは、開始血漿分画は、バッチ当たり少なくとも約５，０００ｋｇ、７，５００ｋｇ、１０，０００ｋｇおよび／または１５，０００ｋｇの血漿から誘導される。

精製されたアポリポタンパク質は、続いて、医薬組成物、例えば再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）を作製するために、他の成分と共に製剤化される。したがって本発明の方法は、精製されたアポリポタンパク質を脂質と混合してｒＨＤＬ製剤を作製するためのさらなる工程を含むことができる。本明細書で使用するとき、ｒＨＤＬ製剤は、血漿中に通常存在する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と機能的に同様である、類似する、一致する、または模倣物である任意の人工的に製造されたアポリポタンパク質製剤または組成物である。ｒＨＤＬ製剤には、その範囲内に「ＨＤＬ模倣物」および「合成ＨＤＬ粒子」も含まれる。適切には、ｒＨＤＬ製剤には、アポリポタンパク質、脂質、および場合により、界面活性剤が含まれる。

本発明のｒＨＤＬ製剤は、さらにコレステロールを含むことができる。製剤は、有機溶媒を使用して製造することができ、いくつかの場合において、例えば米国特許第５，６５２，３３９号に記載のように製剤を製造するときに、有機溶媒が脂質成分（例えば、ホスファチジルコリン）を溶解するために使用される。しかしながら、アポリポタンパク質製剤は、有機溶媒の非存在下で製造されることが好ましい。

適切には、アポリポタンパク質は、約５〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌの濃度である。この濃度には、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５および１００ｇ／Ｌ、ならびにこれらの量の間の任意の範囲が含まれる。他の実施形態において、アポリポタンパク質は、約５〜２０ｇ／Ｌ、例えば約８〜１２ｇ／Ｌの濃度である。

脂質は、天然ＨＤＬまたは再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の成分である任意の脂質である。そのような脂質には、リン脂質、コレステロール、コレステロール−エステル、脂肪酸、および／またはトリグリセリドが含まれる。好ましくは、脂質はリン脂質である。リン脂質の非限定的な例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（レシチン）、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（セファリン）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）、スフィンゴシン−１ホスフェートまたは天然もしくは合成のそれらの誘導体が挙げられる。天然誘導体としては、卵ＰＣ、卵ＰＧ、大豆ＰＣ、水添大豆ＰＣ、大豆ＰＧ、脳ＰＳ、スフィンゴ脂質、脳ＳＭ、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、セファリン、カルディオリピン、およびジアセチルホスフェートが挙げられる。合成誘導体としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジラウリルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＭ）およびジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＭ）が挙げられる。リン脂質は、上記リン脂質のいずれかの誘導体または類似体であることもできる。

いくつかの実施形態において、ｒＨＤＬの脂質成分は、少なくとも２種の異なるホスファチジルコリンを含む。特定の実施形態において、少なくとも２種のホスファチジルコリンは、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）およびジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である。特定の実施形態において、本発明の再構成ＨＤＬ製剤は、ＰＯＰＣおよびＤＰＰＣを含む。特定の実施形態において、ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣの比率は、約７５：２５または約５０：５０である。

他の特別の実施形態において、脂質は、スフィンゴミエリンと負に荷電されたリン脂質、例えばホスファチジルグリセロール（例えば、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（ｌ−グリセロール））との組合せであるまたはそれを含む。スフィンゴミエリンとホスファチジルグリセロール（特に１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（ｌ−グリセロール））との組合せは、脂質として使用することを特に企図したものである。これらの実施形態において、スフィンゴミエリンとホスファチジルグリセロールとは、任意の適切な比率、例えば、９０：１０〜９９：１（ｗ：ｗ）、典型的には９５：５〜９８：２、および最も典型的には９７：３で存在する。

好ましくは、リン脂質は、ホスファチジルコリン単独またはホスファチジルコリンと１つもしくはそれ以上の他のリン脂質との組合せであるまたはホスファチジルコリン単独またはホスファチジルコリンと１つもしくはそれ以上の他のリン脂質との組合せを含む。別のリン脂質の例はスフィンゴミエリンである。いくつかの実施形態において、アポリポタンパク質製剤は、界面活性剤を含む。

典型的には、排他的ではないが、脂質は１０〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは３０〜６０ｇ／Ｌの濃度で存在する。

界面活性剤は、ｒＨＤＬ製剤で使用することが適切な任意のイオン性（例えば、陽イオン性、陰イオン性、両イオン性）界面活性剤または非イオン性界面活性剤であってよく、例えば胆汁酸およびその塩が挙げられる。イオン性界面活性剤としては、胆汁酸およびその塩、ポリソルベート（例えば、ＰＳ８０）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、セチルトリメチル−アンモニウムブロミド、ラウロイルサルコシン、ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートおよび４’−アミノ−７−ベンゾアミドタウロコール酸が挙げられる。

胆汁酸は、典型的には、２４個の炭素を有するジヒドロキシル化またはトリヒドロキシル化ステロイドであり、例えばコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸またはウルソデオキシコール酸である。好ましくは、界面活性剤は、胆汁酸塩、例えば、コール酸塩、デオキシコール酸塩、ケノデオキシコール酸塩またはウルソデオキシコール酸塩である。特に好ましい界面活性剤はコール酸ナトリウムである。

しかしながら、高レベルの界面活性剤が、いくつかの系、例えば、０．３ｇ／ｇのレベルのＡｐｏ−ＡＩまたは６ｇ／ＬのレベルのｒＨＤＬ製剤（２０ｇ／ＬのＡｐｏ−ＡＩ）で肝毒性に関わることが示されている。したがって、５〜１０％のレベルの界面活性剤が、本発明、つまり０．０１５〜０．０３ｇ／ｇのＡｐｏ−ＡＩまたは０．５〜０．９ｇ／ＬのｒＨＤＬ製剤（３０ｇ／ＬのＡｐｏ−ＡＩ）で使用するために好ましい。界面活性剤の「レベル」は、界面活性剤の絶対量、界面活性剤の濃度（例えばｒＨＤＬ製剤の単位体積当たりの量）、および／または別の一定量のアポリポタンパク質製剤の成分の量または濃度と比較した界面活性剤の量または濃度の比率とすることができる。これは例にすぎないが、界面活性剤のレベルは、ｒＨＤＬ製剤中に存在するアポリポタンパク質（例えば、Ａｐｏ−ＡＩ）の総量に換算して表すこともできる。３０ｇ／Ｌのアポリポタンパク質を有するｒＨＤＬ製剤の約０．４５ｇ／Ｌ未満の界面活性剤濃度は、安定性および非毒性の両方の点で好ましい。安定性は、当該分野で公知の任意の手法により都合よく測定することができるが、ｒＨＤＬ製剤の濁度が好ましい測定尺度である。特定の実施形態において、界面活性剤の濃度は、ｒＨＤＬ製剤中０．５〜１．５ｇ／Ｌである。界面活性剤の濃度は比色定量分析を使用して決定することができる。例えば、Ｇａｌｌｓａｕｒｅｎ試験キットおよびＧａｌｌｓａｕｒｅｎ Ｓｔｏｐｐｒｅａｇｅｎｓを用いて血漿と共に反応バイアルに添加する（１ｍＬの反応体積に１２５μＬの血漿）。

より一般的には、本発明のｒＨＤＬ製剤中に存在するときの界面活性剤のレベルは、肝毒性を示すレベルの約５〜３５％である。この範囲には、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％および３５％が含まれる。より好ましくは、界面活性剤のレベルは、肝毒性を示すレベルの約５〜２０％である。有利には、界面活性剤のレベルは肝毒性を示すレベルの約５〜１０％である。好ましくは、これらのレベルは、肝毒性を示す界面活性剤の最小または閾値レベルによって表される。肝毒性は、インビトロおよびインビボモデルにおいて様々に評価することができる。インビトロモデルの一例ではＨＥＰ−Ｇ２細胞を使用する。この場合、ＨＥＰ−Ｇ２細胞を対数期に成長させることを含む。次いで細胞を培養培地から除去し、ＰＢＳで洗浄してトリプシン処理し、１０ｍＬの培養培地（９０％ＤＭＥＭ、１０％不活性化ＦＣＳ、１％非必須アミノ酸、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で再懸濁する。細胞成長および生存率は、Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計数計およびトリパンブルー染色を使用して観察する。続けて、１０×１０^４Ｃ／ｍＬを含む１００μＬのアリコートを、９６ウェルＦ底プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％Ｈ_２Ｏで一晩インキュベートする。試験品（例えば、ｒＨＤＬ製剤）を含む試料（７００μＬ）を、培養培地を添加して調製する。ウェルの第１列から培地を除去し、２００μＬの試験品溶液を添加する。１：２連続希釈をプレート上で完了させる。プレートを次いで７２時間、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％Ｈ_２Ｏでインキュベートする。その後、細胞生存性を測定する。この測定は、５０μＬの３×Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ溶液（１００ｍＬのＰＢＳ中、７０ｍｇのＮｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ）を各ウェルに添加することにより行うことができる。このプレートを、２時間、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％Ｈ_２Ｏでインキュベートし、ウェルを２００μＬのＰＢＳで１回洗浄する。この後、１００μＬのエタノールを各プレートに添加し、２０分振盪させてから、５４０ｎｍで測定を行う。インビボ肝毒性モデルの例は、意識下ウサギモデルである。モデルは、拘束装置（ウサギ用ホルダー）に入れ、ｉ．ｖ．カテーテルを耳静脈に挿入したウサギを使用する。試験物質は、４０分間、ｉ．ｖ．注入して与える。血液試料は、耳の動脈から採り、血清およびストレプトキナーゼ−血漿（５％）バイアルに回収する。血液試料を血清と血漿に処理し、血清は−２０℃で保存し、血漿は−８０℃で保存する。次いで試料は、商業的に利用可能な酵素光度測定試験キット（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）を使用して、ＡＬＴおよびＡＳＴ活性のレベルについて評価することができる。一方で、ヒトＡｐｏ Ａ−Ｉレベルについて、比濁分液または高性能キャピラリー電気泳動を使用して測定することができる。

さらに好ましい実施形態において、ｒＨＤＬ製剤は、肝毒性を生じないレベルで脂質を含む。適切には脂質のレベルは肝毒性を引き起こさないまたは肝毒性に関連しないレベルの約２０〜７０％である。特定の実施形態において、脂質のレベルは肝毒性を引き起こさないまたは肝毒性に関連しないレベルの約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％、またはこれらの量の間の任意の範囲であることが好ましい。好ましくはこれらのレベルは、肝毒性を示す脂質の最小または閾値レベルによって表される。例として、肝毒性との関係が示された脂質のレベルは８４ｇ／Ｌである。したがって脂質は好ましくは約３０〜６０ｇ／Ｌの濃度である。このレベルは、３０、３５、４０、４５、５０、５５および６０ｇ／Ｌならびにこれらの量の間の任意の範囲を含む。特に有利な脂質の濃度は、約３０〜５０ｇ／Ｌ、または一定の実施形態では約３４もしくは４７ｇ／Ｌである。脂質の「レベル」は、脂質の絶対量、脂質の濃度（例えばｒＨＤＬ製剤の単位体積当たりの量）、および／または別の一定量のアポリポタンパク質製剤の成分の量または濃度と比較した脂質の量または濃度の比率とすることができる。これは例にすぎないが、脂質のレベルは、一定用量のｒＨＤＬ製剤中に存在するアポリポタンパク質（例えば、Ａｐｏ−ＡＩ）のモル比に換算して表すこともできる。

好ましい一実施形態において、本発明のｒＨＤＬ製剤のアポリポタンパク質：脂質のモル比は、１：２０〜１：１００の範囲である。この範囲には、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０および１：９０などのモル比が含まれる。より好ましくは、アポリポタンパク質：脂質のモル比は、１：４０〜１：８０；または１：４０〜１：７５；または１：４５〜１：７０；または１：４０〜１：６５；または１：４０〜１：６０；または１：４０〜１：５５；または１：４０〜１：５０；または１：４５〜１：８０；または１：４５〜１：７５；または１：４５〜１：７０；または１：４５〜１：６５；または１：４５〜１：６０；または１：４５〜１：５５；または１：５０〜１：８０；または１：５０〜１：７５；または１：５０〜１：６５；または１：５０〜１：６０の範囲である。アポリポタンパク質：脂質の特に有利な比率は、約１：４０；または約１：４５；または約１：５０；または約１：５５；または約１：６０である。

他の実施形態において、本発明のｒＨＤＬ製剤におけるアポリポタンパク質：脂質のモル比は、約１：８０〜約１：１２０の範囲である。例えば、その比は、１：１００〜１：１１５、または１：１０５〜１：１１０である。これらの実施形態において、モル比は、例えば、１：８０〜１：９０、１：９０〜１：１００、または１：１００〜１：１１０である。

特定の実施形態において、本発明は、本発明の方法によって得られたｒＨＤＬ製剤を提供する。

特定の実施形態において、本発明はパルボウイルスに対して少なくとも１２ｌｏｇ ＬＲＶ（対数減少値）；および／またはノンエンベロープウイルスに対して少なくとも９ｌｏｇ ＬＲＶ；および／または脂質エンベロープウイルスに対して少なくとも８．５ｌｏｇ ＬＲＶを有する、Ａｐｏ Ａ−Ｉ調製物を含むｒＨＤＬ製剤を提供する。本発明のいくつかの実施形態において、パルボウイルスに対して少なくとも１２ｌｏｇ ＬＲＶ（対数減少値）；および／またはノンエンベロープウイルスに対して少なくとも９ｌｏｇ ＬＲＶを有するＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物を含むｒＨＤＬ製剤が提供される。本発明のいくつかの実施形態においては、パルボウイルスに対して少なくとも１２ｌｏｇ ＬＲＶ（対数減少値）を有するＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物が提供される。特定の実施形態において、パルボウイルスはＭＶＭである。特定の実施形態において、ノンエンベロープウイルスは、ＥＭＣＶなどのピコルナウイルス科ウイルスである。特定の実施形態において、脂質エンベロープウイルスは、フラビウイルス科ウイルスである。本発明の特定の実施形態において、ｒＨＤＬ製剤に含まれるＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物についてのＭＶＭおよび／またはＥＭＣＶ ＬＲＶは、実施例６に記載の方法によって決定される。特定の実施形態において、ｒＨＤＬ製剤は医薬用途に適している。

当業者であれば、ウイルス濾過および加熱不活化の２つの特に設計されたウイルス減少工程に、精製／分離工程を追加することにより、本発明のＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物およびｒＨＤＬ製剤にさらなるレベルのウイルスクリアランスがもたらされることを理解する。例えば、血漿からＡｐｏ Ａ−Ｉ濃縮分画を得るときしばしば使用される高エタノール濃縮液は、ウイルスを不活化することが示されている（Ｈｅｎｉｎら、１９８８、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ． ５４（２）：７８−８３頁）。そのような状況において、これらの工程のＬＲＶは、本発明のＡｐｏ Ａ−Ｉ調製物またはｒＨＤＬ製剤についての全ＬＲＶに加えることができる。

上述の精製Ａｐｏ Ａ−Ｉは、医薬組成物、例えば治療的使用のための再構成ＨＤＬ（上述のものを含む）に製剤化することができる。そのような医薬組成物は、医薬的に許容される担体または希釈剤を含むことができる。医薬的に許容される担体または希釈剤の非限定的な例としては、水、乳化剤、結合剤、充填剤、界面活性剤、緩衝剤、安定化剤、塩、アルコールおよびポリオール、界面活性剤、タンパク質およびペプチド、脂質、ガム、糖および他の炭水化物が挙げられるが、これらに限定されない。

再構成ＨＤＬは、Ａｐｏ−ＡＩに加えて、限定されないが、１つまたは複数の脂質、界面活性剤および安定化剤を含むことができる。脂質の非限定的な例には、リン脂質、コレステロール、コレステロール−エステル、脂肪酸および／またはトリグリセリドが含まれる。好ましくは、脂質はリン脂質である。リン脂質の非限定的な例には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（レシチン）、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（セファリン）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）または天然もしくは合成のそれらの誘導体が挙げられる。安定化剤は、砂糖（例えばスクロース）または糖アルコール（例えばマンニトールもしくはソルビトール）のような炭水化物が挙げられるが、これらに限定されない。存在させる場合、界面活性剤は、任意のイオン性（例えば、陽イオン性、陰イオン性、両イオン性）界面活性剤または非イオン性界面活性剤であってよく、例えば胆汁酸およびその塩、例えばコール酸ナトリウムが挙げられる。

特定の実施形態において、医薬組成物は、国際公開第２０１４／０６６９４３号に記載されている。

本発明は、哺乳動物における疾患、障害または状態を処置または予防する方法であって、前記態様のいずれかによるＡｐｏ−Ａ１、Ａｐｏ−Ａ１調製物、医薬組成物、またはｒＨＤＬ製剤を哺乳動物に投与し、それにより疾患、障害または状態を処置または予防する工程を含む前記方法も提供する。

Ａｐｏ Ａ−１および／または再構成ＨＤＬ製剤の治療的用途には、心血管疾患（例えば、急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）、アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞）、またはＡＣＳが素因となる糖尿病、脳卒中および心筋梗塞などの疾患、障害もしくは状態、高コレステロール血症（例えば、高血清コレステロールもしくは高ＬＤＬコレステロール）ならびに高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のレベル減少から生じる低コレステロール血症、例えば、タンジール（Ｔａｎｇｉｅｒ）疾患症候の処置または予防が挙げられる。

本発明の特定の実施形態を以下に実施例を参照して説明するが、これらの実施例は例示のみを目的とし、上述の一般的記載の範囲を限定することを意図するものではない。

以下の実施例では、本発明によるプロセスの好ましい実施形態に従った連続的プロセス工程手順を記述する。このプロセスでは、出発材料に由来する分画ＩＶ沈殿物を、ＧｕＨＣｌの存在下で溶解し、濾過して濾過助剤を除去した後、ｐＨ調節、熱処理、希釈およびウイルス濾過工程を含む。熱処理工程は代替的にウイルス濾過工程後に実施することもできる。

方法および材料
Ａｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度
概略するに、溶液中のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度は、希釈剤としてＷＦＩ（注射用水）を典型的には５〜３０ｇ／Ｌで使用し、２８０ｎｍの吸光度を決定することによって測定した。タンパク質の計算は以下に従った：

代替的にＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度は、比濁分析または高性能キャピラリー電気泳動を使用して測定できる（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ３Ｄ ＣＥ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。簡潔には高性能キャピラリー電気泳動に関連する方法は以下の工程を含んだ：およそ２〜３ｍｇ／ｍＬのＡｐｏ Ａ−Ｉ（場合により水で希釈）を含む試料（１５０μＬ）を、１６％のＳＤＳ（２５μＬ）およびフェニルアラニン（２５μＬ、４ｍｇ／ｍＬ）を用いて調製した。次いで試料を水浴中で３分間インキュベートした後、電気泳動バッファー（５０ｍＭのホウ酸ナトリウム、０．２％ＳＤＳ、３００μＬ）で希釈して濾過した（０．４５μｍ）。次いで、試料を、溶融シリカキャピラリー（５６ｃｍ×５０μｍ内径、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ１６００−６１２３２）に充填した。電気泳動を２５ｋＶで実施した。使用した標準液は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｐｏ Ａ−Ｉ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＣＲ−３９３）であった。この方法は、Ａｐｏ Ａ−Ｉが再構成ＨＤＬの一部であるとき、特に有用である。

４．６Ｍの塩酸グアニジン溶液
１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ）を含む４．６ＭのＧｕＨＣｌ溶液を、ＷＦＩ（注射用水）、ＧｕＨＣｌ塩およびＥＤＴＡから調製した。４．６ＭのＧｕＨＣｌ溶液のｐＨをＮａＯＨでｐＨ７．２〜７．４に調節した。

１．７Ｍの塩酸グアニジン
１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ）を含む１．７ＭのＧｕＨＣｌ溶液は、ＷＦＩ（注射用水）、ＧｕＨＣｌ塩およびＥＤＴＡから調製した。１．７ＭのＧｕＨＣｌ溶液のｐＨはＮａＯＨでｐＨ７．２〜７．４に調節した。

１０ｍＭのＮａＣｌ透析濾過溶液
透析濾過溶液は、ＷＦＩおよびＮａＣｌから調製した。透析濾過溶液の伝導度は１．０〜１．２ｍＳ／ｃｍであった。

実験手順
Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物の溶解
Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物を、４．６Ｍの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）に溶解し、均質化し、ｐＨを７．３±０．１に調節した。

清澄濾過
濾過溶液を、深層濾過で清澄化して、残余の濾過助剤を除去した。フィルターを注射用水（ＷＦＩ）で予洗し、４．６ＭのＧｕＨＣｌ溶液で後洗浄した。後洗浄物と濾過物を組み合わせて、濾液中のＧｕＨＣｌ濃度は約３．５Ｍに達した。組み合わせた濾液を回収し、０〜３０ｇ／Ｌの範囲のＡｐｏ Ａ−Ｉ濃度を得た。

ウイルス濾過工程の前に、熱処理工程を行ってウイルスを不活化した。

熱処理
熱処理ではｐＨを７．１〜７．５に調節した。ＧｕＨＣｌ濃度を以下の式にしたがって計算し、少なくとも３．０Ｍに調節した。
ＧｕＨＣｌ＝−４１．４−（０．０１７０×タンパク質［ｇ／Ｌ］）＋（４１．５×密度［ｇ／ｃｍ^３］）

次いで混合物を約６０．０℃の温度で約３０分〜約４時間インキュベートした。混合物を室温に戻し、希釈して、ウイルス濾過工程を施した。

希釈工程
ウイルス濾過工程の前に、混合物をＷＦＩで希釈して、最終ＧｕＨＣｌ濃度を１．５〜２．０Ｍ、Ａｐｏ Ａ−Ｉ濃度を０〜３０ｇ／Ｌの範囲とした。

ウイルス濾過
ウイルス濾過工程の目的は、物理的にウイルス粒子を除去することであった。

前濾過は、ＰＡＬＬ ＳＫＬ７００２ ＮＴＰ０．１μｍ（Ｎｙｌｏｎ）を使用して行った。次いで、１ｍ^２のフィルター面積を有する滅菌プラノバＢｉｏＥｘナノフィルター（旭化成株式会社）を濾過工程に使用した。ＢｉｏＥｘフィルターは、フィルター表面積１ｍ^２当たり少なくとも３４０ｋｇの溶液を通した。前置フィルターおよびウイルス除去フィルターの両方を、室温で１．７ＭのＧｕＨＣｌでフラッシュした。デッドエンドウイルス濾過工程は、室温で実施した。圧力は３．４バール未満を維持した。濾過の完了後、フィルターを１．７ＭのＧｕＨＣｌで、後フラッシュした（ｐｏｓｔ−ｆｌｕｓｈｅｄ）。工程全体にわたるＡｐｏ Ａ−Ｉの除去率は良好で、９５％を上回り、典型的には約１００％であった。

様々なＧｕＨＣｌ（１．７Ｍ＆３．２Ｍ）およびＡｐｏ Ａ−Ｉ濃度（５．８、８．９、１９．７ｇ／Ｌ）の存在下でＢｉｏＥｘフィルターを用いた濾過の比較を行った（図１〜３）。上記実施例１と同様の方法で、ウイルス濾過工程を行った。

さらなる濾過試験により、ＧｕＨＣｌ（１．０Ｍ＆１．３Ｍ）の濃度がより低くなると、この系でフィルター閉塞を引き起こす不安定な溶液が生じることが実証された。これらの結果から、ウイルス濾過を容易にするためにＧｕＨＣｌ濃度を最適化することの利点が強調される。

Ａｐｏ Ａ−Ｉ試料にＭＶＭを１：１０００の比率でスパイクした。スパイクした試料を、１０〜１２ｇ／Ｌのタンパク質濃度で、プラノバＢｉｏＥＸウイルス除去フィルターを用いて、デッドエンド様式で、約２．４バールの圧力で濾過した。濾液中の試料を取り出し、残存ウイルスの感染力について評価した（表１）。結果は、完全なウイルス保持能が、ＧｕＨＣｌの濃度範囲全体にわたって達成されたことを実証する。ＧｕＨＣｌ濃度が低くなると、ＭＶＭ対数減少値（ＬＲＶ）が増加した。

同様の条件下で実施したさらなるウイルス濾過試験では、ＭＶＭウイルスの漏出が３．４ＭのＧｕＨＣｌの存在下で観察された。したがって、約３．０Ｍ未満のＧｕＨＣｌ濃度は、Ａｐｏ Ａ−Ｉ調製物の製造においてウイルス除去フィルター（ＢｉｏＥｘなど）を使用することによる、およそ２０ｎｍの直径を有するウイルス（例えばパルボウイルス）の除去を改善すると考えられる。

この試験は、Ａｐｏ Ａ−Ｉの製造におけるウイルス濾過が出発材料からＭＶＭを除去する有効性の決定を目的とした。ＭＶＭは、Ｂ１９Ｖなどの非常に強健な小型のノンエンベロープウイルスのモデルウイルスとして使用した。

試験設計
Ａｐｏ Ａ−Ｉ試料にＭＶＭを１０００：１の比率でスパイクした。スパイクした試料を、プラノバＢｉｏＥＸウイルス除去フィルターに通して濾過した。様々な時間点で濾液の試料を取り出し、残存ウイルス感染力について評価した。

≧１１５ｇの濾液を回収すると、試験系にＭＶＭを１００：１の比率で再びスパイクした。その後、濾過を続け、≧８ｇの濾液が回収されたときに停止した。濾液を残存ウイルス感染性について分析した。最後にフィルターを少なくとも１２ｇの１．７ｍｏｌ／ＬのＧｕＨＣｌ溶液で後洗浄した。後洗浄分画を別個に回収し、ウイルス感染性も分析した。

各実験において：
− 試験系の細胞毒性を測定した。
− ウイルスストックの力価を測定した。
− ウイルスの安定性を測定した。
− 干渉を測定した。
− クリアランスを測定した。

細胞毒性効果の評価
細胞毒性は、ウイルス不含試験系を使用して、細胞培養培地で連続希釈して、試料中の最終細胞毒性効果を測定する非放射活性細胞生存性分析により分析した。増殖活性がポジティブコントロールの６０％未満に至った試料を、細胞毒性を有するとみなした。

ウイルス干渉分析
ウイルス干渉は、ウイルス不含試験系の非細胞毒性濃度を、ストックウイルスの連続希釈に用いることによって、ＴＣＩＤ５０エンドポイントタイトレーションにより実施した。干渉は、干渉アッセイで得られたウイルス力価と、培養培地で実施したストックウイルスの標準ＴＣＩＤ５０分析で得られたウイルス力価とを直接比較して分析した。

ウイルス力価測定（ＴＣＩＤ５０）
ウイルス力価は、ＴＣＩＤ５０（組織培養感染用量５０％）により決定した。脱塩試料の３倍連続希釈物を使用した。ウイルス感染力は、９６ウェルプレート中の指標細胞のエンドポイントタイトレーションによって分析した。

バルク分析（Ｂｕｌｋ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＢＡ）
ＢＡを使用してウイルス測定分析の検出限界を低下させた。ウイルス感染性は、元試料の３ｍｌに相当する９ｍｌの各脱塩試料を、２つの９６ウェルプレート上で指標細胞に分配させて分析した。

データ処理
マイクロタイタープレート上でＴＣＩＤ５０により計算されたウイルス力価の計算
ウイルス力価およびその誤差を、Ｓｐｅａｒｍａｎ＆Ｋａｒｂｅｒの方法（Ｅｘｃｅｌ Ｍａｋｒｏ：ｋａｅｒｂｅｒ３＿１１１．ｘｌｓ）を使用して計算した。インプット数は、力価測定から得た。

減少率（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）の計算
このプロセスのウイルス減少率（ＬＲＦ）は、「Ｖｉｒｕｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ： ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ、ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｕｄｉｅｓ ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ」（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６８／９５／Ｆｉｎａｌ；１９９６年２月１４日）およびｔｈｅ Ｂｕｎｄｅｓｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔｓａｍｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐａｕｌ−Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｕｎｄｅｓａｍｔ ｆｕｒ Ｓｅｒａ ｕｎｄ Ｉｍｐｆｓｔｏｆｆｅ（１９９４年５月４日）の要件にしたがって、計算した。

結果
細胞毒性
細胞毒性は、ウイルス不含試験系のいずれのロットでも観察されなかった。

干渉分析

干渉は観察されなかった。

バルク分析
３ｍｌの試料を用いたバルク分析により、検出限界を、≦−０．０００６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（９５％信頼限界）まで低下させた。試験した全ての試料は、ウイルス感染性が陰性であった。したがって、ＭＶＭの完全な除去が両方の実験の濾過を通して達成された。

議論および結論
この試験は、ウイルス濾過が試験物質からＭＶＭを除去する有効性の決定を目的とした。ＭＶＭを、非常に強健な小型のノンエンベロープウイルスおよびＢ１９Ｖについてのモデルウイルスとして使用した。

プラノバＢｉｏＥＸウイルス除去フィルターによりＭＶＭの完全なクリアランスが観察され、≧６．２１±０．１１の平均ＬＲＦが得られた。試験系への細胞毒性は観察されず、ウイルス感染の干渉も観察されなかった。

Ａｐｏ Ａ−Ｉ溶液に対する熱処理工程（実施例１、熱処理の項目に記載の通り）の効果を調べるために、６０±１℃へ加熱し、ＭＶＭを１００：１の比率でスパイクした。

スパイクした試験系をその温度で３時間維持した。試料を様々な時間点で回収し、ウイルス感染性を分析して、プロセスを通じたウイルス減少と不活化動態を観察した。

試験系の試料を、６０±１℃に温め、試験全体を通してこの温度で維持した。温度を監視し、実験の間、記録した。標的温度に達した後、試験系に０．１μｍの濾過ＭＶＭを１００：１の比率にてスパイクした。試料１はスパイク後すぐに取り出した。さらなる試料は１、５、１０、１５、３０、６０、１２０および１８０分後に取り出した。全ての試料を、氷冷細胞培養培地で１：１０に希釈し、さらに処理するまで氷上で保存した。次いで、１ｍｌの希釈試料を、ＰＤ−１０サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、ＧｕＨＣｌを除去した。簡潔には、１ｍｌの試料をカラムにかけ、フロースルーを廃棄した。次いで、カラムを１ｍｌのＰＢＳで濯ぎ、フロースルーを廃棄した。最後に、３ｍｌのＰＢＳをカラムにかけたところ、脱塩画分（ｄｅｓａｌｔｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎ）は３ｍｌの体積で回収された；この結果、さらに１対３希釈された。次いで、脱塩試料中のウイルス力価をエンドポイントタイトレーション（ＴＣＩＤ５０）により測定した。さらなる試料をバルク分析（ＢＡ）のために３０、６０、１２０および１８０分で取り出し、さらなる処理まで氷冷上で保存した。各試料から３回、１ｍｌを上記のように脱塩した。合計で９ｍｌの脱塩画分が回収された。次のパラメータを、上記実施例４で記載した方法ごとに評価した：
− 試験系の細胞毒性
− ウイルスストックの力価
− 干渉
− クリアランス

全ての試験試料において、細胞毒性もウイルス感染の干渉も観察されなかった。不活化動態は急速で、３０分以内にＭＶＭが完全に不活化されるのが観察された。得られた≧６．０３±０．１２ｌｏｇの平均ＬＲＦは、６０℃で３０分以内の熱処理の間の効率的なＭＶＭのクリアランスを示した。

この試験は、２つの特別に設計されたウイルス減少工程、ウイルス濾過および加熱処理工程がＡｐｏ Ａ−Ｉ溶液からウイルスを取り除く有効性の決定を目的とした。従った製造プロセススキームは実施例１に記載されたものと同様であり、スパイク試験は、実施例４（ウイルス濾過）および実施例５（熱処理）と同様の方法で実施した。試験は、以下のようなウイルスレベルの減少を示した：

したがって、本発明の方法は、Ａｐｏ Ａ−Ｉを、ＭＶＭなどのパルボウイルスに対して少なくとも１２ｌｏｇ ＬＲＶ、ＥＭＣＶなどのノンエンベロープウイルスに対して少なくとも９ｌｏｇ ＬＲＶ、およびＢＶＤＶなどの脂質エンベロープウイルスに対して少なくとも８．５ｌｏｇ ＬＲＶで製造することを可能にする。

当業者であれば、本明細書に記載の発明が、詳細に説明されたもの以外の変形または改変も受けることを理解する。本発明は、本発明の趣旨および範囲内のそのような全ての変形および改変を包含すると理解されるべきである。さらに本発明は、本明細書で参照または示された全ての工程、特徴、組成物および組合せを個別にまたは集約的に含み、ならびにそれらの２つまたはそれ以上の工程または特徴の任意のまたは全ての組合せを含む。

Claims (13)

1. アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）を精製するための方法であって、
   ａ）Ａｐｏ Ａ−Ｉと塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）とを含む溶液を用意する工程；および
   ｂ）該溶液を１５ｎｍ〜３５ｎｍの範囲の孔径を有するフィルターを通して濾過する工程
   を含み、
   ここで、該溶液は、１．３〜３．０Ｍの範囲内の濃度でＧｕＨＣｌを含む前記方法。
2. 溶液は、５〜３０ｇ／Ｌ、または５〜２０ｇ／Ｌ、または７〜１２ｇ／Ｌの範囲内のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度を含む、請求項１に記載の方法。
3. 溶液は、Ａｐｏ Ａ−Ｉの凝集を減少させるまたは阻害する濃度でＧｕＨＣｌを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 溶液は、１．５〜２．０Ｍの範囲内の濃度でＧｕＨＣｌを含む、請求項３に記載の方法。
5. 溶液のｐＨは、７．１〜７．５の範囲内である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 濾過は、０．２〜３．４バールの範囲内の圧力、および１８〜２６℃の範囲内の温度で実行される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 溶液は、
   １）Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物を４．０〜４．６ＭのＧｕＨＣｌに懸濁する工程；ならびに／または
   ２）該懸濁物を５〜３０ｇ／Ｌの範囲内のＡｐｏ Ａ−Ｉタンパク質濃度および／もしくは１．３Ｍ〜３．０Ｍの範囲内のＧｕＨＣｌ濃度に希釈する工程
   の１つまたはそれ以上によって調製される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 工程ａ）の前に、ウイルス不活化のために熱処理工程が実行される、または工程ｂ）の後に、ウイルス不活化のために熱処理工程が実行される、請求項１または７に記載の方法。
9. 熱処理は、
   溶液のｐＨを６．６〜８．０の範囲内に調節する工程；および続けて
   該溶液を５５〜６１℃の温度で３０分〜４時間加熱する工程
   を含む、請求項８に記載の方法。
10. ｐＨが６．６〜８．０の範囲内である溶液は、２．７Ｍ〜３．９Ｍの範囲内の濃度のＧｕＨＣｌを含む、請求項９に記載の方法。
11. ｐＨが６．６〜８．０の範囲内である溶液のｐＨは、７．０〜８．０の範囲内である、請求項９または１０に記載の方法。
12. ｐＨが６．６〜８．０の範囲内である溶液は、
    １）Ａｐｏ Ａ−Ｉ沈殿物を４．０〜４．６ＭのＧｕＨＣｌに懸濁する工程；ならびに
    ２）ＧｕＨＣｌ濃度を２．７Ｍ〜３．９Ｍの範囲内に、およびｐＨを６．６〜８．０の範囲内に調節する工程
    によって調製される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 再構成ＨＤＬ製剤を製造する方法であって、
    請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によりＡｐｏ Ａ−Ｉを製造する工程；および
    Ａｐｏ Ａ−１を脂質と組み合わせ；それにより再構成ＨＤＬ製剤を製造する工程
    を含む前記方法。

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