MXPA04002848A - Prevencion y tratamiento de restenosis por administracion local de medicamento. - Google Patents

Abstract

La apolipoproteina A-I (ApoA-I), de preferencia una forma variante como apolipoproteina A-I Milano (ApoA-IM), sola o mas preferentemente en combinacion con un portador lipido como los fosfolipidos u otro medicamento, puede administrarse en forma local antes o durante la cirugia de derivacion o bypass en arterias coronarias, perifericas y cerebrales coronarias enfermas, cirugia para implantar injertos u organos trasplantados o angioplastia, o para estabilizar placas inestables en una modalidad alternativa, la apolipoproteina no se proporciona directamente, sino que se proporciona el gen que codifica la apolipoproteina. El gen se introduce en el vaso sanguineo en una forma similar a la que se utiliza para la proteina, donde la proteina luego se expresa. La tecnica tambien puede utilizarse para suministrar genes para el tratamiento o prevencion o restenosis u otras enfermedades cardiovasculares. En todavia otra modalidad los stents se recubren con las apolipoproteinas solas, las apolipoproteinas formulada con Iipidos, celulas geneticamente manipuladas que expresen las apolipoproteinas, DNA desnudo que codifique para una apolipoproteina, u otros medicamentos como los anti-proliferativos para suministro local en un sitio de lesion. En una modalidad preferida, el sistema se utiliza con terapia en combinacion, para suministro local de un agente como una apolipoproteina en combinacion con terapia antihipertension, sistemica, terapia antiinflamatoria regulacion de lipidos y/o terapia anticoagulacion. Estos tratamientos pueden comenzar antes de, al mismo tiempo con o despues del suministro local.

Description

PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE RESTENOSIS POR ADMINISTRACIÓN LOCAL DE MEDICAMENTO Antecedentes de la invención Esta solicitud reclama prioridad ante la serie US No. 60/326379 presentada el 28 de Septiembre de 2001.

La presente invención es, en general, en el área de los métodos y las composiciones para reducir la restenosis después de revascularización de arterias coronarias, periféricas y cerebrales enfermas, y estenosis o restenosis de injertos de derivación y bypass colocados por cirugía u órganos transplantados, específicamente por la administración local de un agente como la apolipoproteína A-I milano sola o en combinación con formulaciones de lipidos u otros agentes reductores de colesterol o agentes reguladores de los lipidos.

La angioplastia, cirugía u otras intervenciones vasculares se complican por una arteriopatía acelerada caracterizada por el rápido crecimiento de las células dentro de la luz en un lapso corto. Este crecimiento suele ser tan grave que compromete el flujo sanguíneo hacia los órganos distales.

La cirugía vascular de bypass se ha utilizado extensamente para tratar vasos sanguíneos estenósicos y ocluidos, como cuando se desarrollan placas sobre la superficie de los vasos sanguíneos en la aterosclerosis . En la cirugía de bypass, se injerta uno o más vasos sanguíneos sanos en los vasos estenósicos/ocluidos más allá del sitio de la estenosis u oclusión para interrumpir la sangre alrededor del vaso estenósico u ocluido con el fin de restablecer un suministro sanguíneo suficiente al tejido cuyo abastecimiento sanguíneo peligra por la estenosis u oclusión. Esta cirugía suele revascularizar con muy buenos resultados el tejido comprometido .

Se ha desarrollado la angioplastia como tratamiento alternativo a la cirugía de bypass, en especial en pacientes que han sido diagnosticados tempranamente en el desarrollo de estenosis u oclusión de los vasos sanguíneos por el depósito normal de placas sobre la pared luminar de un vaso sanguíneo. La angioplastia por lo regular implica guiar un catéter que por lo regular se ajusta con un balón o malla metálica extensible hasta una región de arterias de la estenosis u oclusión y la inflación breve, una o más veces, del balón o malla de alambre para empujar el material intravascular que obstruye o placa contra la pared endotelial del vaso, comprimiendo y/o rompiendo de este modo la placa y restableciendo el flujo sanguíneo. No obstante, el tratamiento con angioplastia puede lesionar el vaso, en especial cuando se infla en exceso el balón o se extiende en exceso la malla, provocando una variedad de resultados deseados como denudación (eliminación) de la capa de células endoteliales en la región de la angioplastia, la disección de una parte de la pared interna del vaso del resto del vaso con la oclusión resultante del vaso, o ruptura de la capa de la túnica íntima del vaso.

La lesión de las arterias en animales induce un proceso de reparación vascular que finalmente hace que la arteria se haga angosta. Dentro del vaso sanguíneo crece una nueva capa gruesa, o neoíntima, de células de músculo liso y células inflamatorias, invadiendo el lumen. En animales, este proceso representa lo que sucede clínicamente después de angioplastia, implante de stent endovascular, transplante de órganos o cirugía de bypass, que limita en gran medida los buenos resultados a largo plazo de estas técnicas para tratar arteriopatías obstructivas. Los modelos en animales de la lesión arterias e hiperplasia neointimal se han utilizado para utilizar sucesós celulares que den origen a la restenosis en humanos, con el fin de idear estrategias de tratamiento para suprimir el crecimiento del tejido en un intento para reducir la restenosis y mejorar los resultados clínicos a largo plazo. Los cerdos son particularmente útiles como modelo animal para restenosis en humanos.

Los intentos para limitar la estenosis o restenosis de los vasos sanguíneos después de revascularización han incluido la administración de agentes farmacológicos y enfoques técnicos. Ningún agente farmacéutico ha sido aprobado clínicamente para la indicación de prevenir restenosis en humanos. Un enfoque técnico, la colocación endovascular de un stent ha demostrado que reduce parcialmente la restenosis en humanos tras intervención arterial coronaria, según lo reporta Serruys y col., N. E. J. Med 1994, 331:489-495 y Fischman, y col., N. E. J. Med 1994; 331:496-501. No obstante, los propios stents siguen siendo susceptibles a restenosis importante en un 20-30% de los casos.

El creciente conocimiento de los mecanismos que subyacen en la reparación vascular ha conducido a propuestas innovadoras de agentes que limitan las arteriopatías aceleradas. Se sabe que los leucocitos circulatorios, incluidos los monocitos, se encuentran entre las primeras células reclutadas en los vasos sanguíneos cuando comienza la arterosclerosis . Una vez que están dentro de las paredes arteriales enfermes, estas células pueden absorber colesterol u otros lipidos, y también pueden producir substancias que atraen a otras células, hacer que otras células proliferen o degradar los componentes de la matriz. Cada uno de estos efectos secundarios puede a su vez favorecer un mayor engrosamiento intimo y estrechamiento más grave u oclusión de la luz arterial. En la restenosis después de revascularización no se ha demostrado una función similar para los leucocitos. Aunque la activación de los leucocitos se ha asociado con la restenosis en humanos (Pietersma, y col., Circulation 1995; 91: 1320-1325; Mickelson, y col., 1996 JACC 28 (2): 345-353; Inoue, y col., 1996 JACC 28 (5): 1127-1133), la amplia inhibición de la inflamación, por ejemplo, con glucocorticoides, después de revascularización no ha reducido la restenosis en humanos (Pepine y col., Circulation 1990; 81: 1753-1761) . Recuerda los estudios que utilizan tratamientos con actividad muy amplia y muy específicamente dirigidos para prevenir restenosis. Los tratamientos amplios, por ejemplo, con heparina, han sido limitados por toxicidades sistémicas y limitaciones en la dosis. Los tratamientos específicos, por ejemplo, con estrategias moleculares, han fracasado para inhibir todas las vías celulares y moleculares redundantes que activan y potencian los procesos de reparación vascular.

Ameli, y col., Circulation 90 (4): 1935-41 (1994) reportaron que algunos estudios epidemiológicos han mostrado una relación inversa entre niveles de colesterol lipoproteína de alta densidad (HDL) y cardiopatías coronarias, y una relación inversa similar entre HDL y restenosis tras angioplastia coronaria de balón. Ellos realizaron un estudio para determinar si la HDL influye directamente en la formación de la neoíntima, investigando el efecto de la apoA-I milano recombinante (apoA-IM, una variante de la apoA-I humana con sustitución de Arg-173 por Cys) , en el engrosamiento íntimo después de lesión de balón en conejos alimentados con colesterol. Los conejos recibieron inyecciones intravenosas de 40 mg de apoA-IM unida a un portador de fosfolípidos en vías alternos, comenzando cinco días antes y continuando durante cinco días después de la lesión de balón de arterias femoral e iliaca (una dosis total de 200 mg/animal, aproximadamente 11.-4 mg/kg/dosis) . Tres semanas después de la lesión de balón, los conejos tratados con apoA-IM tuvieron engrosamiento intimo muy reducido en comparación con los dos grupos testigo. La relación intima a media también se redujo significativamente por apoA-IM por ANOVA en comparación con los dos testigos. La fracción de la lesión intimal recubierta por macrofagos, según se identificó por inmunohistoquimica utilizando un anticuerpo monoclonal especifico de macrofagos, fue significativamente menor en los conejos tratados con apoA-IM en comparación con los animales tratados con el portador (25.3 + 17% contra 59.4 ± 12.3%, P < 0.005). El contenido de colesterol aórtico no fue muy diferente entre los animales tratados con apoA-IM y los testigos tratados solo con el portador. Por desgracia, a diferencia de los cerdos donde las lesiones son más parecidas a las humanas, los resultados obtenidos en conejos no han podido predecir los resultados en humanos .

Por consiguiente, existe la necesidad de composiciones y métodos para favorecer la curación del tejido vascular y controlar la proliferación de células del músculo vascular (hiperplasia) para prevenir restenosis de los vasos sanguíneos después de angioplastia, bypass vascular, transplante de órganos, o enfermedades vasculares, con riesgo mínimo de reoclusión rápida.

Por tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un u.étodo y las composiciones para reducir la restenosis tras revascularización de arterias coronarias, periféricas y cerebrales enfermas y estenosis o restenosis de injertos de bypass colocados con cirugía u órganos transplantados.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método que sea un medio sencillo y eficaz de transferencia de genes.

Compendio de la invención La apolipoproteína A-I (apoA-I) , de preferencia una forma variante como la apolipoproteína A-I milano (apoA-IM) , sola o con mayor preferencia en combinación con un portador de lípidos como los fosfolípidos u otros medicamentos, pueden administrarse en forma local antes o durante cirugía de bypass en arterias coronarias periféricas y cerebrales enfermas, cirugía para implantar injertos u órganos transplantados, o angioplastia, o para estabilizar placas inestables. En la modalidad, la apoA-IM se administra utilizando un INFILTRADOR, un dispositivo de suministro intramural y/u otro medio de liberación sostenida, controlada, para la administración de apoA-IM, de modo que se administre una dosis eficaz en el sitio de la lesión. Con base en el modelo de cerdos utilizando apoA-IM, una dosis eficaz para el tratamiento o prevención de restenosis es en el intervalo desde 0.2 hasta 0.4 mg de apoA-IM/kg suministrados en el sitio que va a ser tratado, más específicamente, entre 4 y 6 mg de apoA-IM/vaso que va a ser tratado. La dosis superior para la administración intramural mediante el INFILTRADOR se limita por la viscosidad de la solución. Por ejemplo, no es posible utilizar el método con una solución de apoA-IM que sea demasiado viscosa para pasar a través de los poros de un INFILTRADOR. Como se demuestra en los ejemplos, una cantidad eficaz es en el intervalo de 0.3 a 0.4 mL de una solución de 14 mg/mL de apoA-IM (que es equivalente a entre 4 y 6 mg en una dosis individual/segmento de vaso o aproximadamente una dosis de alrededor de 0.2 mg/kg para cada vaso tratado en un cerdo de 25 kg) , de preferencia administrada en combinación con l-palmitoil-2-oleil fosfatidilcolina (POPC) en una relación de aproximadamente 1:1 en peso.

En otra modalidad, la apolipoproteína no se proporciona directamente, sino que se proporciona el gen que codifica la apolipoproteína. El gen se introduce en el vaso sanguíneo en una forma semejante a la que se utiliza para la proteína, donde luego se expresa la proteina. La técnica también puede utilizarse para suministrar genes para el tratamiento o prevención de restenosis u otras cardiovasculopatias .

En todavía otra modalidad, los stents se recubren con apolipoproteinas solas, apolipoproteínas formuladas con lipidos, células genéticamente manipuladas que expresen las apolipoproteínas, DNA desnudo que codifique para una apolipoproteí a, u otros medicamentos como los anti-proliferativos para suministro local en un sitio lesionado. Esta modalidad también incluye casos mediante los cuales se adicionan recubrimientos en combinación con stents para permitir mayor eficacia. En una modalidad preferida, el sistema se utiliza con terapia en combinación, para el suministro local de un agente como una apolipoproteína en combinación con terapia de antihipertensión sistémica, regulación de lipidos y/o terapia anticoagulación. Los ejemplos de los medicamentos que pueden utilizarse incluyen los agentes reguladores de lipidos como niacina, estatinas y fibratos; los agentes para control glicérico; agentes antihipertensivos y agentes que previenen o retardan la coagulación sanguínea o la agregación plaquetaria como aquellos en los que el agente es aspirina, inhibidores Ilb/IIIb, cloprigel o heparina. El beneficio máximo puede obtenerse utilizando terapia de suministro local con más de una combinación, por ejemplo, el suministro local más anticoagulación más regulación de lipidos. Estos tratamientos pueden comenzar antes, al mismo tiempo con o después del suministro local. De preferencia, los tratamientos sistémicos comenzarían antes del procedimiento de suministro local.

Descripción detallada de los dibujos Las Figuras 1-4 se refieren a las pruebas en las que se trató a 10 cerdos domésticos, una vez con una sola infusión intravenosa desde 100 mg/kg de ETC-216, un complejo apoA-IM/POPC (aproximadamente 1/1 en peso) (n = 5) o salina (n = 5) . Los agentes de prueba se administraron por vía intravenosa durante aproximadamente 3 horas practicando al mismo tiempo angioplastia coronaria transluminal, percutánea, de extensión excesiva con despliegue del stent en dos vasos coronarios por animal. La dosis se vaso en el peso del componente proteínico del complejo. Se sacrificó los animales durante el día 28 (8 animales) el día 29 (un animal) después de angioplastia coronaria cuantitativa y ultrasonido intravascular (IVUS) , se perfundieron y fijaron las arterias coronarias para el análisis histomorfométrico. ün animal testigo murió el día 27, y solo se recopilaron datos histomorfométricos de este animal .

Las Figuras la y Ib son gráficas de los datos angiográficos coronarios cuantitativos (QCA) , que se determinaron en tres puntos del tiempo, antes de la lesión coronaria, inmediatamente después de las lesiones coronarias y despliegue del stent y antes del sacrificio, y se basan en las mediciones del diámetro (mm) hechas en un segmentos sin stent próximo al stent, en la sección próxima al stent, un área promedio a lo largo del stent, en la sección distante del stent y en un segmento sin stent distante del stent. De estos datos se determinó el diámetro máximo y el diámetro mínimo de las áreas con stent. La estimación de los QCA de la ganancia de luz (diámetro luminal después de la lesión menos antes de la lesión) y la pérdida de luz (diámetro luminal postericr a la lesión menos el seguimiento de 28-29 días) se determinaron en los segmentos con stent y los segmentos sin stent adyacentes. Los datos QCA para todos ios vasos (es decir, la arteria coronaria derecha (RCA) y la arteria descendente anterior izquierda LAD) combinados) se muestran en la Figura la y para el tipo de vaso (es decir, RCA b LÁD) en la Figura Ib.

Las Figuras 2a y 2b son gráficas de los datos del ultrasonido intravascular (IVüS) para determinar el área del stent y la luz en la región distal, media y proximal de cada vaso coronario con stent antes del sacrificio (después de 28-29 días de la cirugía) . La diferencia entre estas mediciones es el área neoíntima. La Figura 2a es para todos los vasos (es decir, RCA y LAD combinados) y la Figura 2b es para el tipo de vaso (es decir, el RCA o el LAD) .

Las Figuras 3a y 3b son el análisis histomorfométrico de las arterías con stent utilizadas para determinar las áreas transversales promedio de la capa limítrofe adventicia (ABL) , la lámina elástica externa (EEL) , la lámina elástica interna (IEL) , la luz (L) , la adventicia (A), la media (M) , la íntima (I), la relación íntima a media (I/M) y un registro de la lesión. El registro de la lesión es el promedio de 36 determinaciones de la lesión consistentes en 12 determinaciones en cada uno de los segmentos proximal (a) , medio (b) y distal (c) en los sitios apuntalados del vaso con stent. Se registraron las lesiones con 0, 1 2 ó 3, el 0 indicando una IEL intacta (es decir, sin lesión, y 3 indica una IEL rota con exposición de la adventicia (es decir, la lesión más grave) . La Figura 3a representa los datos histomorfométricos para todos los vasos (es decir, la RCA o la LAD) .

La Figura 4 muestra las correlaciones elegidas entre las variables histomorfométricas e IVUS.

Las Figuras 5a y b muestran los datos histomorfométricos recolectados de cerdos domésticos a los que se administró una solución de 0.3-0.4 mL conteniendo 4-6 mg de proteína/vaso de ETC-216, un complejo apoA-IM/POPC (~ 1/1 en peso) (n = 6 cerdos) o el vehículo sacarosa-manitol (n = 6 cerdos) utilizando un INFILTRADOR®, un dispositivo de suministro intramural, con angioplastia coronaria transluminal percutánea con estiramiento excesivo subsiguiente, con despliegue de stent en dos pasos coronarios por animal. La dosis representa el peso del componente proteína en el complejo. Se muestran los análisis histomorfométricos de las arterias con stent utilizadas para determinar las áreas transversales promedio de la capa limítrofe adventicia (ABL) , la lámina elástica externa (EEL) , la lámina elástica interna (IEL) , la luz (L) , la adventicia (A), la media (M) , la íntima (I), la relación íntima a media (I/M) y el registro de la lesión. El registro de la lesión es el promedio de 36 determinaciones de la lesión que consisten en 12 determinaciones en cada uno de los segmentos proximal (a) , medio (b) y distal (c) en los sitios apuntalados del vaso con stent. Las lesiones se registraron con 0, 1, 2 ó 3, el 0 indica una IEL intacta (es decir, sin lesión, y 3 indica una EEL rota con exposición de la adventicia (es decir, la lesión más grave) . Los datos histomorfométricos de todos los vasos (es decir, la RCA LCX o la LAD) se muestran en la Figura 5b.

Descripción de la invención El sistema que se ha desarrollado se enfoca en la aplicación local de un material útil en el tratamiento o prevención de restenosis, en forma local antes o durante cirugía de bypass en arterias coronarias, periféricas y cerebrales enfermas, cirugía para implantar injertos u órganos transplantados, o angioplastia, o para estabilizar placas inestables. La administración local preferentemente se logra utilizando dispositivo que incluye un reservorio que libera lentamente el medicamento durante un tiempo. En reservorio puede ser una parte del dispositivo, como puede ser un stent, o puede ser creado por inyección en un tejido u órgano específico, per ejemplo, por administración intrapericardial o por 1NFILTRATOR. Esto se puede hacer utilizando los catéteres disponibles en el comercio.

Las composiciones que han de administrarse pueden ser colesterol y agentes eliminadores de lipidos oxidados (como las apolipoproteinas en combinación con fosfolípidos, estatinas, fibratos) , DNA que codifique estos agentes (por ejemplo que codifique las apolipoproteinas) u otras proteínas como enzimas involucradas en la generación de óxido nítrico, y/o medicamentos como los compuestos antiproliferativos como rapamicina, paclitaxel o anticuerpos como tirofibano y abciximab .

La terapia en combinación también puede utilizarse cuando el medicamento como la apoA-IM se administre en forma local y otro medicamento se administre en forma sistémica, por ejemplo, la terapia de antihipertensión sistémica, terapia para regulación de lipidos y/o anticoagulación. Los ejemplos de los medicamentos que pueden utilizarse incluyen agentes reguladores de lipidos como miacina, estatinas y fibratos; agentes para el control glicémico; agentes antihipertensivos ; y agentes que prevengan o retarden la coagulación sanguínea o la agregación de plaquetas como pueden ser donde el agente es aspirina, inhibidores de Ilb/IIIa, clopidogrel o heparina .

I . Agentes moduladores de lipidos Formulaciones de las apolipoprotelnas Los compuestos que funcionan como HDL incluyen HDL sintético que contiene lipidos como fosf tidilcolina, fosfatidil serina, fosfatidil etanolamina, u otros fosfolipidos en combinación con proteínas asociadas con HDL, como la apoA-I o variantes de estas que incluyen apoA-I milano y los péptidos con actividad biológica procedentes de estos, péptidos para el transporte inverso de lipidos (RLT) , enzimas asociadas con HDL como paraoxonasa, y apo E, solos o formulados en combinación con liposomas o emulsiones. Cuando se utiliza en la presente, proteínas asociadas con HDL incluyen las secuencias presentes en las proteínas asociadas con HDL que se asocian con HDL, y péptidos sintéticos que tengan características de unión o funcionales equivalentes. Los compuestos que mejoran la función HDL incluyen los liposomas, donde el HDL actúa como lanzadera de las células al liposoma. Las formulaciones liposomales convenientes están descritas en WO 95/23592 por la Universidad de Columbia Británica.

Las formulaciones descritas en esta por lo regular consisten en una proteína alfa helicoidal como una apoA-I, un lípido, y un portador. apoA-I y apoA-IM son composiciones representantes que pueden utilizarse para tratar o prevenir estenosis que surja como resultado de cirugía de bypass en arterias coronarias, periféricas y cerebrales enfermas, cirugía para implantar injertos u órganos transplantados, o angioplastia .

La apoA-1 plasmática es una cadena polipeptídica individual de 243 aminoácidos cuya secuencia primaria es conocida (Brewer y col., Biochem. Biop ys. Res. Commun. 80: 623-630 (1978)). La apoA-I se sintetiza como un precursor de 267 aminoácidos en la célula. Esta preproapolipoproteína A-I primero se procesa intracelularmente por la disociación N-terminal de 18 aminoácidos para producir proapolipoproteína A-I, y luego otra vez se disocia de 6 aminoácidos en plasma o la linfa por la actividad de proteasas específicas para producir la apolipoproteína A-I. El requisito estructural principal de la molécula de apolipoproteína A-I, según se cree, es la presencia de unidades repetidas de 11 ó 22 aminoácidos, que se supone, existen en conformación helicoidal antipática (Segrest y col., FEBS Lett 38: 247-253 (1974)). Esta estructura toma en cuenta las actividades biológicas principales de apoA-I, es decir, la unión a lípidos y la activación de la lecitina: colesterol aciltransferasa (LCAT) .

La apolipoproteina A-I milano (apoA-IM) es una variante natural de la apoA-I (Weisgraber y col., J. Clin. Invest 66: 901-907 (1980)). En la apoA-IM el aminoácido Arg 173 es sustituido por el aminoácido Cys 173. Puesto que la apoA-IM contiene un residuo de Cys por cadena polipeptidica, puede existir en una forma monomérica, homodimérica ó heterodimérica. Estas formas son químicamente intercambiables, y el término apoA-IM, en el contexto presente, no discrimina entre estas formas . A nivel del DNA la forma variante resulta de una sustitución CAT en la secuencia génica, es decir, el codón CGC cambio a TGC, permitiendo la traducción de una Cys en lugar de Arg en la posición del aminoácido 173. No obstante, esta variante de apoA-I es una de las variantes más interesantes, en cuanto a que los individuos apoA-IM se caracterizan por una reducción notable en el nivel de colesterol CDL, pero sin un riesgo ha aumentado aparente de enfermedad arterial (Franceschini y col., J. Clin. Invest 66: 892-900 (1980)).

Otra variante útil de apoA-I es la variante París, donde la arginina 151 es sustituida con una cisterna.

La función sistémica de apoA-I sola (Miyazaki y col., Arterioscler Thromb Vasc Bíol 15: 1882-1888 (1995) o de HDL (Badimon y col., Lab Invest. 60: 455-461 (1989) y J. Clin. Invest. 85: 1234-1241 (1990)) los estudios clínicos experimentales en animales y humanos iniciales (Nanjee y col., Arterisocler Thromb Vasc Biol. 19: 979-989 (1999) y Eriksson y col., Circulation. 100: 594-598 (1999) ) según se ha demostrado ejerce cambios bioquímicos importantes, así como reduce el grado y gravedad de la lesión aterosclerótica . Ahora se ha descubierto que puede administrarse en forma local en un sitio lesionado, y reducir significativamente la estenosis y restenosis, como se describe con mayor detalle más adelante, y se demuestra por los ejemplos siguientes.

Es posible utilizar otras apolipoproteínas asociadas con HDL con características alfa helicoidales. Los ejemplos incluyen apo E, proApoA-I, ApoA-I parís, ApoA-II, proApoA-II, ????-IV, ApoC-I, ApoC-II, y ApoC-III, las secuencias alfa helicoidales en estas proteínas, y las apolipoproteínas modificadas para incluir uno o más grupos sulfhidral, como esta descrito por Bielicki y Oda, Biochemistry 41: 2089-2096 (2002) es posible utilizar proteínas asociadas con HDL adicionales. Los ejemplos incluyen paraoxonasa, la proteína de transferencia del éster colesterílico, LCAT y la proteína de transferencia de fosfolípidos . Las proteínas anteriores pueden utilizarse solas, en combinación, acomplejadas solas a lípidos o acomplejadas en combinación a lipidos. Además, las mezclas de los compuestos pueden ser útiles. Un ejemplo es los complejos compuestos de apoA-I con lipidos y complejos compuestos de paraoxonasa con lipidos administrados como una mezcla. Otro ejemplo son los complejos compuestos de más de un componente proteinico. Por ejemplo, los complejos compuestos de apoA-I, paraoxonasa y lipido son útiles.

Lipidos Los lipidos forman un complejo con la apoA-I que mejora su eficacia. Por lo regular el lipido se mezcla con la apoA-I antes de la administración. La apolipoproteina y los lipidos se mezclan en una solución acuosa en relaciones adecuadas y pueden acomplejarse por los métodos conocidos en la técnica que incluyen secado por congelamiento, solubilización detergente seguido por diálisis, microfluidificación, sonicación y homogeneización . La eficacia del complejo puede optimizarse, por ejemplo, variando la presión, la frecuencia ultrasónica o la concentración del detergente, un ejemplo de un detergente que se utiliza comúnmente para preparar los complejos apolipoproteina-lipido es colato de sodio.

En algunos casos puede ser necesario mezclar el lipido y la apolipoproteina antes de la administración. Los lipidos pueden estar en solución en forma . de liposomas o emulsiones formados utilizando las técnicas normales como la sonicación o extrusión. Por lo regular se realiza sonificación con un sonificador de punta, como un sonificador de punta Branson, en un baño de hielo. Por lo regular, la suspensión se somete a varios ciclos de sonicación. La extrusión puede llevarse a cabo por extrusores de biomembrana, como el extrusor Lipez Biomembrane Extruder. El tamaño definido de los poros en los filtros para extrusión puede generar vesículas unilamelares liposomales de tamaños específicos. Los liposomas también pueden formarse por extrusión mediante un filtro cerámico asimétrico como el Ceraflow Microfilter, disponible en el comercio de Norton Company, Worcester Mass, o mediante un filtro de policarbonato u otros tipos de materiales polimerizados (es decir, plásticos), comúnmente conocidos.

En algunos casos se prefiere administrar la apolipoproteina sola, principalmente libre de lipidos, para tratar la arteria lesionada. La solución estéril, acuosa, se adiciona a la apolipoproteina. La apolipoproteina en solución puede administrarse para tratar una arteria lesionada. La preparación secada por congelamiento, alternativa, de los complejos puede hidratarse con una solución acuosa antes de la administración. En otros casos, preparaciones congeladas de los complejos en solución acuosa se descongelan hasta que se obtiene una solución homogénea antes de la administración a un vaso lesionado.

Los lipidos preferidos son fosfolipidos, con mayor preferencia incluyen al menos un fosfolipido, por lo regular fosfatidil colina de soya, fosfatidil colina de huevo, fosfatidil glicerol de soya, fosfatidil glicerol de huevo, palmitoil-oleil-fosfatidil colina, diestearoil fosfatidil colina o diestearoil fosfatidil glicerol. Otros fosfolipidos útiles incluyen, por ejemplo, fosfatidil colina, fosfatidil glicerol, esfingomielina, fosfatidil serina, ácido fosfatidico, cloruro de N-2,3-di (9- (Z) -octadeceniloxi) ) -prop-l-il-N, N, , -trimetilamonio, fosfatidil etanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, cefalina, cardiolipina, cerebrósidos , dicetilfosfato, dioleil fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilglicerol, dioleilfosfatidilglicerol, estearoilpalmitoil fosfatidilcolina, 'di-palmitoil-fosfatidiletanolamina, diestearoilfosfatidiletanolamina, dimiristoil-fosfatidilserina y dioleil fosfatidilcolina . También es posible utilizar lipidos que no contengan fósforo como estearilamina, dodecilamina, palmitato de acetilo y amidas de ácidos grasos.

Otros lipidos convenientes para uso son bien conocidos para las personas expertas en la técnica y se mencionan en una variedad de fuentes bien conocidas, por ejemplo, McCutcheon' s Detergents and Emulsifiers and McCutcheon' s Functional Materials, Allured Publishing Co., Ridgewood, N. J. En general, se desea que los lipidos sean liquido-cristalinos a 37°C, 35°C ó 32°C. Los lipidos en el estado liquido cristalino por lo regular aceptan más eficientemente colesterol en comparación con los lipidos en el estado de gel. En vista de que los pacientes por lo regular tienen una temperatura central de aproximadamente 37 °C, los lipidos que sean líquidos cristalinos a 37 °C por lo regular se encuentran en un estado líquido cristalino durante el tratamiento.

La concentración del lipido en la formulación puede variar. Las personas expertas pueden modificar estas concentraciones para llevar al óptimo el tratamiento con diferentes componentes lipidíeos o de pacientes específicos. La apoA-I se combina con los lipidos en una relación en peso de entre 1:0.45 a 1:3, siendo más preferido el lipido para aclaramiento del colesterol. Una relación de alrededor de 1:1 se prefiere para producir la población más homogénea y para propósitos de producir lotes estables y reproducibles .

Otros medicamentos que modulan los lípidos Los compuestos también pueden administrarse con compuestos que aumentan las concentraciones de HDL específicamente (es decir, no como subproducto de la disminución del LDL ) , y por tanto que mejoren la relación colesterol HDL a colesterol total, y la administración de combinaciones de cualquiera de estos que sean eficaces para mejorar la HDL para las concentraciones de colesterol en sangre total.

Los ejemplos de medicamentos incluyen agentes reguladores de lípidos como niacina, estatinas y fibratos .

Medicamentos antiproliferativos Es posible también utilizar el infiltrador para el suministro de agentes como los antiproliferativos tipo paclitaxel y topotecan {Biochemical Phar acology, 2001; 61 (1) : 119-127) .

Suministro génico En una modalidad alternativa, es posible administrar genes que codifiquen una proteina que sea suministrada en lugar de la proteina. La transferencia génica puede obtenerse utilizando transferencia directa del material genético, en un vector plasmidico o viral, o por transferencia del material genético en células o portadores como los liposomas catiónicos. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse fácilmente para utilizarlos en terapias de toxinas mediadas por genes descritas en la presente. Como lo revisó Francis y col., Am. J. Pharmacogenomics 1 (1): 55-66 (2001) , la terapia génica ofrece un enfoque novedoso para la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Los avances técnicos en sistemas de vectores virales y el desarrollo de vectores de liposomas fusigénicos han sido cruciales para desarrollar estrategias de terapia génica eficaz dirigidas a la vasculatura y miocardio en modelos animales. Las técnicas de transferencia génica están siendo evaluadas como alternativas potenciales de tratamiento para enfermedades vasculares genéticas (hipercolesterolemia familiar) y oclusivas, adquiridas (aterosclerosis, restenosis, trombosis arterial) asi como para desórdenes cardiacos que incluyen falla cardiaca, isquemia de miocardio, arteriesclerosis coronaria por injerto e hipertensión. Véase también Teiger y col., J. Cardiovasc. Pharmacol. 33 (5): 726-732 (1999).

Los estudios de Wolf y col., Biotechniques 11: 474- 85 (1991) , demuestran que la inyección de DNA desnudo en músculo permite niveles de expresión bajos y de largo plazo de las proteínas codificadas para dentro de la secuencia del DNA. La administración de DNA desnudo a las capas de músculo liso puede lograrse mediante el uso de un dispositivo intramural como un INFILTRATOR® y permite la expresión de las proteínas y sus dominios alfa helicoidales para tratar el vaso lesionado. Los vectores de transferencia pueden ser cualquier construcción de nucleótidos utilizada para suministrar genes a las células (por ejemplo un plásmido) o como parte de una estrategia general para suministrar genes, por ejemplo, como parte de retrovirus o adenovirus recombinante (Ram y col., Cáncer Res. 53: 83-88, (1993)). Los medios adecuados para la transfección, incluidos los vectores virales, transfectantes químicos o métodos fisicomecánicos como la electroporación y la difusión directa del DNA, están descritos por ejemplo en Wolf, J. A., y col., Science, 247, 1465-1468, (1990); y Wolf J. A., y col. Nature 352, 815-818 (1991). Cuando se utiliza en la presente, los vectores plasmídicos o virales son agentes que transportan el gen hacia una célula sin degradación e incluye un promotor que produce la expresión del gen en la célula hacia la cual es suministrado. En una modalidad preferida, los vectores se obtienen de un virus o un retrovirus. Los vectores virales preferidos son adenovirus, virus adenorelacionados, virus de herpes, virus de vacuna, poliovirus, virus del SIDA, virus trófico neuronal, Sindbis y otros virus de RNA, incluidos aquellos virus con el esqueleto del VIH. También se prefieren algunas familias virales que comparten las propiedades de estos virus y que los hacen convenientes para utilizarlos como vectores. Los retrovirus preferidos incluyen el virus de leucemia murina de Maloney, MMLV, y los retrovirus que expresan las propiedades deseadas del MMLV como vector.

Los vectores retrovirales pueden llevar una carga genética útil más grande, es decir, un transgen o gen marcador, en comparación con los vectores virales, y por esta razón son un vector que se utiliza comúnmente. No obstante, estos no son útiles en células que no proliferan. Un retrovirus es un virus animal que pertenece a la familia de virus de Retroviridae, que incluye cualquiera de los tipos, subfamilias, género o tropismos. Los vectores retrovirales , en general, están descritos por Verma, I. M. Retroviral vectors, for gene transfer en ICROBIOLOGY-1985 , American Society for Microbiology pp. 229-232, Washington, (1985). Los ejemplos de los métodos para utilizar vectores retrovirales para terapia génica están descritos en las Patentes US Nos. 4,868,116 y 4,980,286; las Solicitudes PCT WO 90/02806 y WO 89/07136; y Mulligan, (Science 260: 926-932 (1993)).

Los vectores adenovirus son relativamente estables y es sencillo trabajar con ellos, tienen títulos elevados y pueden ser suministrados en formulación en aerosol y pueden transfectar células no en división. La construcción de adenovirus con defecto en la replicación se ha descrito (Berkner y col., J. Virology: 61: 1213-1220 (1987); Massie y col., Mol. Cell . Biol . 6: 2872-2883 (1986); Haj-Ahmad y col., J. Virology 57: 267-274 (1986); Davidson y col., J. Virology 61: 1226-1239 (1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis "BioTechniques 15: 868-872 (1993)). El beneficio de utilizar estos virus como vectores es que se limitan en el grado en el gue se pueden dispersar a otros tipos de células, puesto que pueden replicarse dentro de una célula infectada inicial, pero no pueden formar nuevas partículas virales infecciosas. Se ha demostrado que los adenovirus recombinantes logran transferencia génica con elevada eficiencia después del suministro directo in vivo al epitelio de las vías aéreas, los hepatocitos, el endotelio vascular, el parénquima del SNC y algunos otros sitios titulares (Morsy, J. Clin. Invest. 92: 1580-1586 (1993); Kirshenbaum. J. Clin Invest. 92: 381-387 (1993); Roessler, J. Clin Invest. 92: 154-159 (1993); La Salle, Science 259: 988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267: 25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4: 461-476 (1993), Zabner, Nature Genectics 6: 75-83 (1994); Circulation Research 73: 1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994); Zabner, Cell. 75: 207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5: 1287-1291 (1993); y Ragot, J. Gen. Viroloqy 74: 501-507 (1993) ) .Los adenovirus recombinantes logran la transducción génica mediante la unión a los receptores de superficie de las células específicas, después de lo cual el virus se internaliza por endocitosis mediada por los receptores, en la misma forma que el adenovirus tipo nativo o el que tiene defecto en la replicación (Chardonnet y Dales, Virology 40: 462-477 (1970); Brown y Burlingham, J. Vilorogy 12: 386-396 (1973); Svensson y Persson, Viroloqy.55: 442-449 (1985); Seth, y col., J. Virology 51: 650-655 (1984); Seth, y col., Mol. Cell . Biol . 4: 1528-1533 (1984); Varga y col., J Viroloqy 65: 6061-6070 (1991); Wickham y col., Cell 73: 309-319 (1993)).

Los vectores virales Pox son grandes y tienen diversos sitios para insertar genes, son termoestables y pueden almacenarse a temperatura ambiente. En una modalidad preferida es un vector viral que se ha manipulado para suprimir la respuesta inmunitaria del organismo hospedero, producida por los antigenos virales. Los vectores preferidos de este tipo llevarán regiones codificantes para interleucina '8 ó 10.

Los vectores virales tienen mayores habilidades de transacción (habilidad para introducir genes) que la mayoría de los métodos químicos o físicos para introducir genes en las células. Por lo regular, los vectores virales contienen genes tempranos no estructurales, genes tardíos estructurales y transcrito de la RNA polimerasa III, repeticiones terminales invertidas necesarias para la replicación y encapsulación, y promotores para controlar la transcripción y replicación del genoma viral. Cuando se manipulan como vectores, los virus por lo regular tienen uno o más de los genes tempranos removidos y un gen o cásete gen/promotor se inserta en el genoma viral en lugar del DNA viral removido. Las construcciones de este tipo pueden llevar hasta aproximadamente 8 kb de material genético ajeno. Las funciones necesarias de los genes tempranos removidos por lo regular se suministran por las lineas de células que se han manipulado para expresar los productos génicos de los genes tempranos en trans.

Los genes insertados en virus y retrovirus por lo regular contienen promotores y/o potenciadores para ayudar a controlar la expresión del producto génico deseado. Por lo común, un promotor es una secuencia o secuencias de DNA que funcionan cuando están en un lugar relativamente fijo con respecto al sitio de inicio de la transcripción. Un promotor contiene elementos centrales necesarios para la interacción básica de la RNA polimerasa y los vectores de transcripción, y puede contener elementos corriente arriba y elementos de respuesta. Los promotores preferidos que regulan la transcripción a partir de los vectores en las células hospederas de mamífero pueden obtenerse de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de los virus como: polioma, virus 40 de simio (SV40) , adenovirus, retrovirus, virus de hepatitis B y con mayor preferencia citomegalovirus, o de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo el promotor beta actina. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40 (Fiers y col., Nature 273: 113 (1978)). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como fragmento de restricción HindIIIE (Greenway, P. J. y col., Gene 18: 355-360 (1982)). Desde luego, también son útiles en este caso los promotores de la célula hospedera o especies relacionadas.

Potenciador por lo regular se refiere a una secuencia de DNA que funciona a una distancia no fija desde el sitio de inicio de la transcripción y puede ser 5' (Laiminis, L y col., Proc. Nati. Acad. Sci 78: 993 (1981)) o 3' (Lusky, M. L. y col., Mol. Cell. Bio. 3: 1108- (1983)) para la unidad de transcripción. Además, los potenciadores pueden estar dentro de un intrón (Banerji, J. L. y col., Cell 33: 729 (1983)) así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne, T. F. y col., Mol . Cell. Bio. 4: 1293 (1984)). Estos por lo regular tienen una longitud entre 10 y 300 pb, y funcionan en cis. Los potenciadores funcionan para aumentar la transcripción desde promotores cercanos. Los potenciadores también suelen contener elementos de respuesta que median la regulación de la transcripción. Los promotores también pueden contener elementos de respuesta que median la regulación de la transcripción. Los potenciadores suelen determinar la regulación de la expresión de un gen. Aunque ahora se conocen muchas secuencias potenciadotas de genes mamíferos (globina, elastasa, albúmina, ct~ fetoproteína e insulina) , por lo regular se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos preferidos son el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270 pb) , el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus .

El promotor y/o potenciador puede activarse específicamente por luz o sucesos químicos específicos que activen su función. Los sistemas pueden regularse con reactivos como tetraciclina y dexametasona . También hay modos para mejorar la expresión génica del vector viral por exposición a radiación como radiación gama, o medicamentos quimioterapéuticos alquilantes.

Se prefiere que la región promotora y/o potenciadora actúe como un promotor y/o potenciador constitutivo para aumentar al máximo la expresión de la región de la unidad de transcripción que se va a transcribir. Además se prefiere que la región promotora y/o potenciadota sea activa en todos los tipos de células eucarióticas . Un promotor preferido de este tipo es el promotor CMV (650 bases) . Otros promotores preferidos son los promotores de SV40, citomegalovirus (promotor de longitud completa) y el vector retroviral LTF. Se ha demostrado que todos los elementos reguladores específicos pueden clonarse y utilizarse para constructor vectores de expresión que se expresen a elección en tipos de células específicos.

Los vectores de expresión que se utilizan en células hospederas eucarióticas pueden contener también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que puedan afectar la expresión del mRNA. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica la proteína del factor tisular. Las regiones 3' no traducidas también incluyen sitios de terminación de la transcripción. Se prefiere que la unidad de transcripción también contenga una región de poliadenilación . Un beneficio de esta región es que aumenta la probabilidad de que la unidad transcrita sea procesada y transportada como mRNA. La identificación y uso de las señales de poliadenilación en las construcciones de expresión están bien establecidos. Se prefiere que las señales de poliadenilación homologas sean utilizadas en las construcciones transgénicas . En una modalidad preferida de la unión de transcripción, la región de poliadenilación se obtiene de la señal de poliadenilación temprana de SV40 y consiste en aproximadamente 400 bases. También se prefiere que las unidades transcritas contengan otras secuencias normales solas o en combinación con las secuencias anteriores que mejoran la expresión o estabilidad de la construcción .

Los vectores virales pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos que codifican un producto marcador. Este producto marcador se utiliza para determinar si el gen ha sido suministrado a la célula y si una vez suministrado se expresa. Los ejemplos de los marcadores selectivos convenientes para células mamiferas son dihidrofolato reductasa (DHFR) , timidina cinasa, neomicina, el análogo de neomicina G418, hidromicina y puromicina . Cuando marcadores selectivos como estos se transfieren exitosamente en una célula hospedera de mamífero,, la célula hospedera de mamífero transformada puede sobrevivir si se coloca bajo presión selectiva.

En una modalidad preferida, el suministro intramural del DNA que codifica para apoA-I, apoA-IV, apoE, paraoxonasa o las regiones alfa-helicoidales dentro de estas proteínas se suministran a una arteria con o sin lípido para tratar vasos sanguíneos lesionados.

El DNA que codifica diferentes proteínas también puede suministrarse. Por ejemplo, como se describe por Chen y col., Jpn. J. Pharmacol. 89 (4):327-336 (2002), la transferencia génica cardiovascular no es solo una técnica poderosa para estudiar la función de genes específicos en la biología y patobiología cardiovascular, sino también una estrategia promisoria para tratar enfermedades cardiovasculares. Desde mediados de 1990, la óxido nítrico sintasa (NOS) , la enzima que cataliza la formación de óxido nítrico (NO) a partir de L-arginina, ha recibido considerable atención como un candidato potencial para la terapia génica cardiovascular, por que el NO ejerce funciones cruciales y diversas en el sistema cardiovascular, y las anomalías en la biología del NO son evidentes en diferentes procesos de enfermedades cardiovasculares, incluido el vaso espasmo cerebral, aterosclerosis, restenosis posterior a angioplastia, vasculopatía de transplantes, hipertensión, diabetes mellitus, impotencia y curación de heridas retardadas.

Existen tres isoformas de la NOS, es decir, endotelial (eNOS) neuronal (nNOS) e inducible (iNOS) . Las tres isoformas de la NOS se han utilizado en estudios de transferencia génica cardiovascular con resultados estimulantes.

Kipshidze y col., J. Am. Col. Cardio. 39 (10): 1686-1691 (2002) describe la disminución de la formación de la neointima por suministro intramural de oligonucleótidos antisentido.

Turunen y col., Mol Ther 6 (3): 306 (2002), describe la terapia génica con adenovirus que codifican lacZ y TIMP-l dirigidos al núcleo que fueron acoplados a un motivo péptido (HWGF) que pueden unirse a la matriz metaloproteinasa (MMP) -2 y MMP-9. In vivo, la transferencia génica mediada por catéter intravascular local de un adenovirus que codifica TIMP-l con orientación HWGF (AdTIMP-1 (HWGF) ) redujo significativamente el engroSarniento íntimo en un modelo de denudación con balón, aórtico en conejo en comparación con el adenovirus control.

La ventaja del método descrito en la presente es que se encarga de suministro y liberación durante un plazo mucho más prolongado en el sitio que necesita el tratamiento .

Medicamentos para tratamiento sistémico Una variedad de medicamentos diferentes pueden administrarse en forma sistémica y/o local. Estos incluyen agentes para control glucémico; agentes antihipertensivos ; agentes anti-inflamatorios como los agentes anti-inflamatorios esferoides, inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) , como Celebrex, VIOXX, e inhibidores de ciclo oxigenasa tipo ibuprofeno y otros agentes anti-inflamatorios no esferoides, y agentes que previenen o retardan la coagulación sanguínea o la agregación de las plaquetas como cuando el agente es aspirina, inhibidores de Ilb/IIIa, clopidogrel o heparina .

Revestimientos del stent Los stents pueden ser también revestidos con apolipoproteínas solas, apolipoproteínas formuladas con lípidos, células que expresen las apolipoproteínas u otras proteínas, DNA que codifique las proteínas terapéuticas, o medicamentos que tengan un efecto local como paclitaxel, rapamicina u otros compuestos antiproliferativos . Los revestimientos entonces liberan el medicamento en el sitio de la lesión, placa o área que ha de ser tratada.

Portadores aceptables para uso farmacéutico Las composiciones farmacéuticas por lo regular incluyen un portador aceptable para uso farmacéutico. Pueden emplearse múltiples portadores aceptables para uso farmacéutico. Los ejemplos utilizan sacarosa-manitol . En general, se empleará salina normal como el portador farmacéutico aceptable. Otros portadores convenientes incluyen glucosa, trealosa, sacarosa, agua estéril, agua amortiguada, salina al 0.4% y glicina al 0.3%, y además pueden incluir glucoproteinas para mejorar la estabilidad, como albúmina, apolipoproteina, lipoproteina, lipoproteina, globulina, etcétera. Estas composiciones pueden ser esterilizadas por las técnicas de esterilización tradicionales, bien conocidas. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para utilizarlas o filtrarlas en condiciones asépticas y liofilizadas, la preparación liofilizada se combina con una solución acuosa estéril antes de su administración. Las composiciones pueden contener las sustancias auxiliares aceptables para uso farmacéutico según sea necesario para aproximar las condiciones fisiológicas como el ajuste del pH y agentes amortiguadores, y los agentes para ajustar la tonicidad, por ejemplo acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio y cloruro de calcio.

En otra modalidad, la apoA-I se administra en un gel, o una solución polimérica que forme un gel en el sitio de administración. En una modalidad, el alginato de calcio y algunos otros polímeros pueden formar hidrogeles iónicos que son maleables. Por ejemplo, el hidrogel puede producirse por enlace cruzado de la sal aniónica del ácido alginico, un polímero carbohidrato aislado de algas marinas, con cationes de calcio, cuya fuerza aumenta con concentraciones crecientes de los iones de calcio o alginato. La solución de alginato se mezcla con la apoA-I para formar una suspensión de alginato que se inyecta directamente en un paciente antes del endurecimiento de la suspensión. La suspensión entonces se endurece durante un tiempo corto debido a la presencia de las concentraciones fisiológicas in vivo de los iones de calcio. Los derivados de alginato modificados, por ejemplo, los que pueden degradarse con mayor rapidez o que se obtienen con cadenas hidrofóbicas, hábiles en el agua, por ejemplo, los oligómeros de (-caprolactona [sic] , pueden sintetizarse y tienen una mejor habilidad para formar hidrogeles. Además, les polisacáridos cuyo gel por exposición a cationes monovalentes, incluidos los polisacáridos bacterianos como goma de gelano, y los polisacáridos de plantas como las carrageninas , pueden formar enlaces cruzados para formar un hidrogel utilizando los métodos semejantes a los disponibles para la reticulación de alginatos descritos antes. Los ejemplos adicionales de los materiales que pueden utilizarse para formar un hidrogel incluyen polifosfazinas y poliacrilatos , que son copol meros en bloque iónicamente reticulados como PluronicsTM o TetronicsTM, copolimeros en bloques de óxido de polietileno-polipropilen glicol que se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. Otros materiales incluyen polímeros como polivinilpirrolidona, ácido hialurónico y colágeno. Los polímeros como los polisacáridos que son líquidos muy viscosos o son tixotrópicos y forman un gel con el tiempo por la lenta evolución de la estructura, también son útiles. Por ejemplo, es posible utilizar el ácido hialurónico que forma un gel inyectable con una consistencia tipo gel para el cabello. Son particularmente útiles los derivados del ácido hialurónico modificado. También es posible utilizar mezclas de polímeros. Por ejemplo, puede utilizarse una mezcla de óxido de polietileno y ácido poliacrilico que al mezclarlos gelifican con uniones de hidrógeno. En una modalidad, una mezcla de una solución al 5% p/p de ácido poliacrilico con un óxido de polietileno al 5% p/p (polietilen glicol, polioxietileno) 100,000 pueden combinarse para formar un gel con el paso del tiempo, por ejemplo tan rápido como en algunos segundos.

Los precursores de los hidrogeles que pueden formar enlaces cruzados o reticularse en forma covalente también son útiles. Por ejemplo, una poliamina soluble en agua como quitosana, puede reticularse con un diisotiocianato soluble en agua como el diisotiocianato de polietilen glicol. Los isotiocianatos reaccionaran con las aminas para formar un gel con enlaces químicos cruzados. Las reacciones de aldehidos con aminas, por ejemplo, con polietilen glicol dialdehído también pueden utilizarse. También puede utilizarse un polímero hidroxilado soluble en agua.

De otro modo, es posible utilizar polímeros que incluyan sustituyentes que se reticulen por una reacción por radicales tras el contacto con un iniciador de radicales. Por ejemplo, pueden utilizarse los polímeros que tienen grupos con instauraciones etilénicas y que pueden ser reticulados fotoquímicamente, como esta descrito en WO 93/17669. Además, pueden utilizarse polímeros solubles en agua que incluyan grupos sinamoilo que pueden reticularse fotoquímicamente, como esta descrito en atsuda y col., ASAID Trans . , 38: 154-157 (1992) .

El material gel se aplica por aspersión (en un procedimiento abierto) o mediante el uso del INFILTRATOR o catéter (durante un procedimiento cerrado) . Por lo regular, la apoA-I sola, la apoA-I en combinación con el lípido o la apoA-I acomplejada con lípidos se mezcla con estos geles en el momento de la solidificación o polimerización, y luego se difunde lentamente a la superficie del vaso que va a ser tratado.

En otra modalidad, el portador aceptable para uso farmacéutico se recubre sobre un stent. El portador puede ser elegido para liberar la invención en un modo dependiente del tiempo. Las personas expertas pueden cambiar los portadores para obtener recubrimientos de stent modificados para lograr liberación dependiente del tiempo de la invención a partir del stent.

II . Métodos de tratamiento En la modalidad principal, los agentes reductores de colesterol como la apolipoproteina A-I (apoA-I) , preferentemente una forma variante como la apolipoproteina A-I milano (apoA-IM) , sola o con mayor preferencia en combinación con un portador lipido como los fosfolipidos u otro medicamento, se administra en forma local utilizando un depósito reservorio como un INFILTRATOR® antes o durante la cirugía de bypass en arterias coronarias, periféricas y cerebrales enfermas, cirugía para implantar injertos u órganos transplantados, o angioplastia, o para estabilizar placas inestables, de modo que se administre una dosis eficaz en el sitio de la lesión. En otras modalidades, las mimas técnicas y materiales se administran para reducir la consecuencia de la ruptura de las placas que incluye la formación de trombos e isquemia.

En otras modalidades preferidas, se inicia terapia local en combinación con terapia sistémica, por ejemplo, en combinación con agentes para reducir restenosis, disminuir o prevenir la ruptura de la placa, reducir el colesterol en sangre, reducir el colesterol en la lesión aterosclerótica, reducir la coagulación sanguínea, regular uno o más de los lípidos en sangre (por ejemplo, el agente regulador de lípidos) , reducir inflamación o controlar la presión arterial. Los ejemplos de los medicamentos que pueden utilizarse incluyen agentes reguladores de lípidos como míacina, estatinas y fibratos; agentes para el control glicémico; agentes antihipertensivos ; y agentes que previenen o retrasan la coagulación sanguínea o la agregación de plaquetas como cuando el agente es aspirina, inhibidores de Ilb/IIIa, clopridogel o heparina. Estos agentes adicionales por lo regular se administrarán en forma sistémica a sus dosis terapéuticas normales.

Puede obtenerse beneficio máximo utilizando terapia de suministro local con más de una combinación, por ejemplo, suministro local más anticoagulación más regulación de lípidos. Estos tratamientos pueden comenzar antes, al mismo tiempo con o después del suministro local. Preferentemente, los tratamientos sistémicos comenzarían antes del procedimiento de suministro local.

En la modalidad preferida, se administra una formulación de apoA-I por medio de un dispositivo de suministro intramural como el INFILTRATOR disponible de Intraventional Technologies, Inc, San Diego CA, ahora propiedad de Boston Scientific. Otro dispositivo útil esta descrito por Pavlides y col., Cathet. Cardiovasc. Diagn, 41 (3) : 287-292 (1997) . Otro medio de suministro puede utilizar catéteres que suministren el medicamento de un reservorio, antes de la angioplastia, durante o después de inflar el balón.

En la modalidad más preferida, se administra una formulación de apoA-IM en una sola dosis antes de o en el momento del tratamiento. Los tratamientos incluyen angioplastia, cirugía de bypass de arterias coronarias, periféricas o cerebrales enfermas, implante de stents vasculares, implante de órgano o tejidos transplantados y estabilización de placas.

La dosis preferida se determina por estudios experimentales, como se hizo en los ejemplos siguientes para apoA-IM. Las dosis para - otras apolipoproteinas pueden calcularse fácilmente con base en las dosis para apoA-IM, tomando en cuenta las diferencias en la eficacia de la eliminación del colesterol, las vidas medias y otros parámetros farmacocinéticos pertinentes. De' otro modo, la dosis para otras apolipoproteinas puede calcularse fácilmente tomando en cuenta las diferencias en la eficacia de las propiedades antioxidantes, anti-inflamatorias y antitrombóticas de las preparaciones. La presencia y cantidad de lipidos puede determinarse similarraente para las diferentes formulaciones basándose en los datos experimentales obtenidos para apoA-IM.

En general, la formulación se administra en el sitio de tratamiento. La dosis total real cuando se suministra en forma local es mucho menor que la dosis que tendría que administrarse en forma sistémica para alcanzar la misma dosis local, no obstante, la concentración local es mucho mayor que los estudios anteriores en los que se administraba apoA-I en forma sistémica. Como ya se mencionó, las dosis preferidas para apoA-IM están entre 4 y 6 mg de apoA-IM/vaso (por lo regular hasta 3 segmentos se tratan con una dosis total de aproximadamente 4 a 18 mg de apoA-IM) , o entre aproximadamente 0.05 y 0.3 mg de apoA-IM/kg de peso corporal en un mamífero de 70 kg. La relación preferida de proteína a lípido es entre 1:0.5 a 1:3, prefiriendo más el lípido para el aclaramiento del colesterol, pero se prefiere una cantidad más equivalente de proteína a lípido para propósitos de estabilidad y consistencia de las preparaciones para aprobaciones regulatorias . Las relaciones de proteína a lípido para las preparaciones diferentes de las que contienen apoA-IM se prueba en diferentes relaciones de proteína a lípido y la estabilidad y consistencia, y para la aprobación regulatoria se determinan las características (como el tamaño del complejo y la capacidad de el flujo del colesterol) .

Aunque se ha demostrado que es eficaz una sola administración, pueden administrarse múltiples dosis. Por ejemplo, la administración intravenosa el día -1, 0, 1, 2 ó 3 de 20 mg de apoA-IM/kg de peso corporal dio como resultado que todos los vasos lesionados con balón sobre extendido mostraran un área aumentada de la luz en relación con los controles cuatro semanas después del procedimiento .

La presente invención además se comprenderá haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Las intervenciones coronarias percutáneas ahora son un método importante para aumentar la luz de los vasos sanguíneos estrechados en pacientes con isquemia coronaria. Estos procedimientos se realizan por angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) , normalmente se conocen como "paso de balón". En la mayoría de los casos el procedimiento se completa con el despliegue de un stent en el área dilatada con el objetivo de aumentar el diámetro del vaso sanguíneo para aumentar el flujo sanguíneo y aliviar la isquemia. Una desventaja importante es el cierre de la luz del vaso sanguíneo después del procedimiento y que se conoce como restenosis. En ausencia de stents, la incidencia posterior al procedimiento de retroceso temprano y trombosis son problemáticos, y por tanto, en la mayoría de los procedimientos de balón actuales también incluyen el despliegue de un stent. Aunque la colocación del stent mejora el resultado, el crecimiento neointimal posterior al procedimiento de un vaso con el stent puede provocar restenosis e isquemia recurrente u otros episodios coronarios, incluido el infarto de miocardio. Por tanto, se desean los métodos para prevenir el crecimiento de la neoíntima de los vasos sanguíneos con balón y stents para mejorar el resultado del procedimiento. Se eligió el modelo porcino como el sistema de pruebas adecuado para el propósito de este estudio. La evidencia en la literatura sugiere que la dilatación arterial y restenosis en el modelo porcino es semejante al de restenosis humana. De aquí que este modelo puede utilizarse para evaluar los agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de restenosis clínica.

Ejemplo 1 : Efecto del suministro intravenoso de una sola dosis alta de ETC-216, una preparación que contiene complejos compuestos de apoA-IM y palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) en restenosis en angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) sobre extendida con despliegue del stent en las arterias coronarias de cerdos . El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de un suministro único de medicamento intravenoso de ETC-216 durante PTCA coronaria y colocación de stents en restenosis en un modelo porcino de lesión vascular.

Materiales y métodos Animales experimentales Se eligió el modelo porcino como el sistema de pruebas adecuado para los propósitos de este estudio. La evidencia en la literatura sugiere que la dilatación y restenosis arterial en el modelo porcino es semejante a la de la restonosis humana. De aquí que el modelo puede utilizarse para la evaluación de agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de restenosis. Los animales se aclimataron al ambiente de laboratorio durante un mínimo de 7 días y se examinaron antes de iniciar el estudio para garantizar que estuvieran sanos.

Durante la cuarentena y antes de la cirugía, los animales estuvieron alojados individualmente en jaulas. Los alojamientos de los animales se limpiaron dos veces al día. Se controlo la temperatura y humedad en los cuartos de los animales (70-78°F; 30-80% HR) para mantener un intervalo elegido de 70-80 °C [sic] y 30-80% de humedad relativa. El flujo de aire en el cuarto fue suficiente para proporcionar algunos cambios por hora con 100% de aire filtrado fresco. Un dispositivo cronometrado automático proporcionó un ciclo alterno de 12 horas de luz y oscuridad. Después de la cirugía los animales se recuperaron en la sala de recuperación, después regresaron a sus guaridas. Los animales se alimentaron una vez al día con alimento para cerdos (dieta de Southwest Farms Hog Finisher) obtenida de Newco (Rancho Cucamonga, CA) durante el tiempo de experimentación menos el día de la cirugía, cuando los animales estuvieron en ayunas durante la noche. El agua fresca se suministró a voluntad por un sistema de riego automático.

Los animales fueron elegidos al azar y asignados a dos grupos de estudio. Se ordenaron otros animales para el estudio en el caso de que un animal muriera o tuviera que se sacrificado por el procedimiento quirúrgico o complicaciones consideradas resultado del procedimiento quirúrgico .

La sustancia a prueba consistió en ETC-216, un complejo de apolipoproteina A-I milano recombinante/1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilcolina (POPC) proporcionada por Esperion Therapeutics, Inc., como una solución lista para inyección o salina. Las soluciones ETC-216 contienen la proteina apoA-I en aproximadamente 14 mg/mL con una relación proteina a POPC de aproximadamente 1 a 1 en peso .

Para este estudio se eligió la administración intravenosa, por que es la via propuesta para uso éri estudios clínicos humanos. La selección de la dosis se basó en el peso corporal del animal. La sustancia a prueba se administró en una dosis de 100 mg/kg de peso corporal. Esta dosis se basó en el contenido de apolipoproteina del complejo. Así pues, en promedio un cerdo en el estudio recibiría aproximadamente 3000-3500 mg del fármaco. Los animales testigo recibieron salina.

Las cirugías se realizaron en cerdos domésticos adultos (con un peso aproximado de 30-35 kg, con un animal de 50 kg) . Los animales se alimentaron con dieta normal y se alojaron en el vivario. Los cerdos estuvieron en ayunas durante la noche y fueron pretratados con aspirina oral, 325 mg comenzando tres dias antes de la cirugía y diario después hasta la eutanasia. Se proporcionó ticlopidina (250 mg) a los animales comenzando tres dias antes de la cirugía y diario durante 14 días después de cirugía. Tras un ayuno de 16 horas durante la noche, los animales fueron inmovilizados por una inyección intramuscular (IM) de acepromazina (0.5 mg/kg) , quetamina (20 mg/kg) , y atropina (0.05 mg/kg) ; se indujo la anestesia con tiopental (5-8 mg/kg) intravenoso (IV) ; y se mantuvo por isoflorane al 1-2% después de la intubación endotraqueal . Durante el procedimiento se realizó ventilación mecánica, supervisión de la presión arterial (BP) y electrocardiograma continuo (ECG) . Los animales resistieron cardizem (120 mg) diario durante 2 días después de la cirugía.

El procedimiento quirúrgico consistió en la exposición de una arteria carótida seguido por la inserción de una funda 8F en la arteria carótida. Los animales recibieron tosilato de bretilo (250 mg IV) , inderal (1 mg) y heparina (10, 000 ü IV) antes de la instrumentación de la coronaria. Se administró ETC-216 o salina como una infusión IV comenzando 90 minutos antes del procedimiento quirúrgico de modo que toda la dosis fuera administrada durante aproximadamente 3 horas. Se hizo avanzar un catéter guia 8F AL-0.75 hasta la ostia de las arterias coronarias bajo guia fluoroscópica . Después de la administración de nitroglicerina intracoronaria (200 mcg) , se realizó la angiografia para estimar el tamaño del vaso. Se realizó la lesión sobre extendiendo el stent en el primer vaso, y luego se repitió en el segundo vaso. En todos los casos, los stents fueron desplegados en la LAD y RCA. Los stents fueron desplegados en la LAD y la RAC en segmentos que promediaban 2.7 a 3.0 mm de diámetro utilizando la ubicación de ramificaciones diagonales o septales como referencia anatómica. Todos los stents fueron desplegados utilizando un balón que se infló de 1 a 3 veces hasta 6-8 atmósferas durante 30 segundos para obtener una relación final stent: arteria de ~1.3:1. La angiografia se realizó inicialmente para elegir el sitio del stent y se repitió para confirmar la lesión en el sitio de despliegue del stent como evidencia por uná "elevación" obvia y un "descenso" del segmento lesionado. Los catéteres fueron retirados, la arteria carótida se ligó y se cerró la incisión de la piel. Como profilaxis contra infección, todos los animales recibieron antibióticos al término del procedimiento. Los animales se recuperaron de la anestesia, regresaron al vivario, se alimentaron con una dieta normal con medicamentos adicionados como ya se describió .

Mediciones angiográficas e IVUS La angiografía coronaria cuantitativa (QCA) se utilizó para valorar el diámetro luminal promedio y mínimo en diferentes puntos del tiempo, es decir, antes de la lesión, inmediatamente después de la lesión y a los 28-29 días de seguimiento antes de la eutanasia.

Definición de los términos utilizados durante la angiografía coronaria cuantitativa.

MLD = diámetro promedio de la luz Ri = segmento de referencia para el segmento proximal (sin stent) Prox.= segmento proximal de la arteria con Stent. Mid. = segmentos medio de la arteria con stent. Dist. = segmentos distal de la arteria con stent. R2 = segmento de referencia para el segmento distal (sin stent) Max = diámetro luminal máximo a lo largo del segmento del stent . in. = diámetro luminal mínimo a lo largo del segmento con stent Ganancia de la luz = diámetro luminal posterior a la lesión menos anterior a la lesión. Pérdida de luz = diámetro luminal posterior a la lesión menos seguimiento de 28 días.

El porcentaje de estenosis de los segmentos lesionados se calculó utilizando los segmentos no lesionados como referencia. Mediante ultrasonido intravascular (IVUS) se midieron los parámetros área del stent, área de la luz, área de la neoíntima, porcentaje del área de la estenosis.

La pérdida tardía de la luz se calculó como la diferencia en MLD inmediatamente después de la lesión con el balón y en el seguimiento de 28-29 días, y el índice de remodelaje se calculó como pérdida luminal tardía dividida entre MLD posterior a la lesión.

Análisis de las arterias coronarias en el seguimiento Después de 28 (n = 8) ó 29 (n = 1) días, los animales ayunaron durante la noche, se prepararon para cirugía como en lo anterior, para la angiografía de seguimiento. (En un animal testigo tratado con salina, que expiró durante el día 27, solo se realizó histología) . Además, en el seguimiento se desplegó un catéter IVUS en las arterias coronarias con stent para estudio IVUS de cada arteria con stent. Los animales fueron entonces sacrificados con anestesia con pentobarbital IV 90 mg/kg, y los corazones fueron escindidos después de toracotomía. Las arterias coronarias fueron perfundidas con salina para aclarar la sangre y luego se fijaron con perfusión con paraformaldehído al 2% durante 15 minutos seguido por inmersión en paraformaldehído al 4% en buffer de fosfatos (pH 7.4) durante 4 horas y por último se almacenaron en etanol al 70%. Para preservar la integridad de los tejidos adventicios y perivasculares, las arterias coronarias se retiraron cuidadosamente junto con tejidos adyacentes (el tejido adiposo y el miocardio) . Para segmentos con stent, se realizaron procesamientos histológicos especiales para mantener la arquitectura vascular con puntales metálicos in situ. Los bloques de tejidos son incrustados en metacrilato de metilo y cortados con una cuchilla de oblea de diamante. Se cortaron tres secciones transversales radiales que contenían 12 puntales: uno del tercio proximal, uno del medio y uno del tercio distal de cada stent. Las secciones fueron rectificadas hasta un espesor de aproximadamente 50 µp?, se pulieron ópticamente y se tiñeron con azul de toluidina (tinción de paragon) .

Análisis histomorfométrico Se utilizo un sistema formador de imágenes computarizado (Image Pro Plus 4.0) para las mediciones histomorfométricas de: 1. El área transversal promedio y el espesor de la luz (el área circunscrita por el borde luminal intima/neointima) ; la neointima (área entre la luz y la lámina elástica interna, IEL, y cuando falta la IEL, el área entre la luz y el resto de la media o la lámina elástica externa, EEL) ; media (área entre la IEL y la EEL) ; el tamaño de los vasos (área circunscrita por la EEL pero que excluye el área adventicia) ; y la adventicia (área entre los tejidos periadventicios, el tejido adiposo y el miocardio, y EEL) . 2. Registro de la lesión. Para cuantificar el grado de lesión vascular, se utilizo un registro basado en la cantidad y longitud de rasgado de las diferentes estructuras parietales. El grado de lesión se calculó como sigue: 0 = IEL intacta 1 = IEL rota con exposición de las capas medias superficiales . 2- IEL rota con exposición de las capas medias más profundas (disección media) . 3 = EE1 rota con exposición de la adventicia Resultados Cinco cerdos domésticos tratados con salina o cinco cerdos tratados con ETC-216 (cuatro cerdos machos y una hembra/grupo) fueron evaluados para restenosis posterior al tratamiento después de 27-29 días.

La sangre se obtuvo de algunos, pero no todos los animales durante el transcurso del estudio para la determinación de la cuenta de células sanguíneas blancas, la cuenta de células sanguíneas rojas, contenido de hemoglobina en sangre, por ciento de hematocrito, cuentas de plaquetas sanguíneas. En todos los casos donde se determinaron variables sanguíneas, los valores posteriores al tratamiento no se modificaron apreciablemente a partir de los valores de la línea base. Es decir, todos estuvieron dentro del intervalo normal.

La frecuencia cardiaca y presión arterial se determinaron para todos los animales ingresados en el estudio en la linea base. La frecuencia cardiaca y la presión arterial también se determinaron periódicamente en la mayor parte de los animales durante los procedimientos quirúrgicos, y antes del sacrificio. Para los animales introducidos en el estudio estas variables no se modificaron apreciablemente respecto a los valores de la linea base debido al procedimiento quirúrgico o los tratamientos .

La Angiografia Coronaria Cuantitativa (QCA) se determinó en tres puntos del tiempo, antes de la lesión coronaria, inmediatamente después de las lesiones coronarias y al despliegue del stent y antes del sacrificio (Figura la y Figura Ib) . Se hicieron mediciones del diámetro (mm) en un segmento sin stent proximal al stent (Rl) , en la sección proximal del stent (prox) , un área promedio a lo largo del stent (Aver) , en la sección distal del stent (Dist) y en un segmento sin stent distal para el stent (R2) . Además, se determinó el diámetro máximo (Max) y el diámetro mínimo (Min) de la región con stent. La estimación mediante QCA de la ganancia de luz y la pérdida de luz se determinaron en los segmentos con stent y sin stent adyacentes. Se determinaron los índices para el máximo (índice Max de pérdida de luz) y mínimo (índice Min de pérdida de luz) de los vasos con stent . Los datos angiográficos coronarios cuantitativos para todos los vasos (es decir, la RCA y LAD combinados) o el tipo de vaso (es decir, la RCA o la LAD) se muestran gráficamente en las Figuras la y Ib, respectivamente.

Se utilizó ultrasonido intravascular (IVUS) para determinar el área del stent y la luz en la región distal, media y proximal de cada vaso coronario con stent antes del sacrificio. La diferencia entre estas mediciones es el área de la neoíntima. Los promedios del área del stent, la luz y la neoíntima para cada animal y segmento se determinaron y se utilizaron para determinar los promedios para los grupos de tratamiento de los vasos coronarios combinados (LAD más RCA) o individuales (LAD o RCA) . Un cerdo tratado con testigo murió un día antes de su procedimiento programado (es decir, el día 27) y por tanto solo se hicieron mediciones histomorfométrícas en sus vasos coronarios con stent. Los datos de ultrasonido intravascular para todos los vasos (es decir, la RCA y LAD combinadas) y para el tipo de vaso (es decir, la RCA o la LAD) se muestran gráficamente en las Figuras 2a y 2b, respectivamente.

El análisis histomorfométrico de las arterias con stent se utilizó para determinar las áreas transversales promedio de la capa limítrofe adventicia (ABL) , la lámina elástica externa (EEL) , la lámina elástica interna (IEL) , la luz (L) , la adventicia (?) , la media (M) , la íntima (I) , la relación íntima a media (I/M) y el registro de las lesiones. El registro de la lesión es el promedio de 36 determinaciones de lesión consistentes en 12 determinaciones en cada uno de los segmentos proximal (a) , medio (b) y distal (c) en los sitios apuntalados de los vasos con stent. Las lesiones fueron registradas como 0, 1, 2 ó 3, siendo 0 una IEL intacta (es decir, sin lesión, y 3 indica una EEL rota con exposición para la adventicia (es decir, lesión más grave) .

El tratamiento con ETC-216 reduce significativamente la relación íntima a media (I/M) en los vasos coronarios en 32% (RCA y LAD combinadas) . Este efecto se debe en gran medida a una reducción significativa de 38% de la relación I/M de la LAD y en menor grado una reducción de 22% (no significativo) en la RCA. Se debe señalar que la RCA fue significativamente más resiliente a la lesión (registro de lesión = 1.87 ± 1.87 + 0.54) en comparación con LAD (registro de la lesión = 2.57 ± 0.34). Los datos histomorfométricos para todos los vasos (es decir, la RCA y LAD combinadas) y para el tipo de vaso (es decir, la RCA o la LAD) se muestran como una gráfica en las Figuras 3a y 3b, respectivamente. La correlación elegida entre las variables histomorfométrica e IVUS se muestra en la Figura 4.

E emplo 2 : Efecto del suministro intramural con INFILTRATOR de ETC-216, una preparación que contiene complejos compuestos de apoA-IM y palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) en restenosis en angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) sobre extendida con despliegue del stent en las arterias coronarias de cerdos .

Materiales y métodos Los experimentos se realizaron en cerdos domésticos adultos que pesaban de 25-30 kg. Los animales se alimentaron con dieta normal para cerdos y se alojaron en los vivarios. Los cerdos estuvieron en ayuno durante la noche y fueron pretratados con aspirina oral, (325 mg) comenzando tres dias antes de la cirugía y diariamente después hasta la eutanasia. Se administro ticlopidina (250 mg) a los animales comenzando tres dias antes de la cirugía y diario durante 14 días, después de cirugía y diario durante 14 después de cirugía. Se proporcionó Cardizem a los animales (120 mg) diario durante dos dias después de cirugía.

Después de ayuno de 16 horas durante la noche, los animales fueron inmovilizados por una inyección intramuscular (IM) de acepromazina (0.5 mg/kg), quetamina (20 mg/kg), y atropina (0.05 mg/kg); se indujo la anestesia con ticpental (5-8 mg/kg) intravenoso (IV) ; y se mantuvo por isoflorane al 1-2% después de intubación endotraqueal . A lo largo del procedimiento se realizó ventilación mecánica, se supervisó la presión arterial (BP) y electrocardiograma continuo (ECG) .

El procedimiento quirúrgico consistió en exponer una arteria carótida y una vaina de 8F insertada en la arteria carótida. Los animales recibieron tosilato de bretilo (250 mg IV), inderal (1 mg IV) y heparina (8,000 U IV) antes de la instrumentación de la coronaria. Se avanzó un catéter guía 8F AL-0.75 hasta la ostia de las arterias coronarias bajo guía fluoroscópica. Después de la administración de nitroglicerina (200 mg) intracoronaria, se realizó la angiografía coronaria cuantitativa para todas las tres arterias coronarias con el fin de estimar el tamaño de los vasos . Los dos vasos más grandes fueron elegidos para el procedimiento. Se administró intramuralmente ETC-216 o vehículo sacarosa-manitol a través del INFILTRATOR durante el procedimiento quirúrgico antes de PTCA con despliegue del stent. El catéter del INFILTRATOR se introdujo para el suministro de ETC-216 o el vehículo de sacarosa-manitol en una dosis baja muy baja a la pared del vaso coronario para llevar al mínimo la pérdida del agente hacia la circulación. Dos arterias de cada animal fueron infiltradas con 4-6 mg de ETC-216 o vehículo sacarosa-manitol cada uno en un volumen de dosis de 0.3-0.4 mL. así pues, cada animal recibió una dosis total de aproximadamente 8-12 mg de ETC-216 localizado para dos segmentos de arteria. Cada arteria fue sometida al procedimiento de infiltración infiltrando el balón unido una vez a 1.5-2 atmósferas de presión durante el suministro de ETC-216 o vehículo de sacarosa-manitol antes de la sobre inflación del balón con despliegue del stent. Después del procedimiento de infiltración, los stent fueron desplegados precisamente en los segmentos infiltrados de LAD, RCA y LCX, utilizando la ubicación de las ramificaciones diagonales o septales como referencia anatómica. Todos los stent fueron desplegados utilizando un balón que fue inflado 1 a 3 veces a 6-8 atmósferas durante 30 segundos para obtener una relación stent: arteria final de ~ 1.3:1. La angiografía se realizó inicialmente para elegir el sitio del stent y se repitió para confirmar la lesión en el sitio de despliegue del stent como se evidenció por una "elevación" obvia y un "descenso" del segmento lesionado. Los catéteres fueron retirados, la arteria carótida se ligó y se cerró la incisión de la piel. Como profilaxis contra infección, todos los animales recibieron antibióticos al término del procedimiento. Los animales se recuperaron de la anestesia, regresaron al vivario, se alimentaron con una dieta normal y con la adición de medicamentos como ya se describió.

Mediciones angíográficas e IVÜS La angiografía coronaria cuantitativa (QCA) se utilizó para valorar el diámetro luminal promedio y mínimo en diferentes puntos del tiempo, es decir, antes de la lesión, inmediatamente después de la lesión y a los 28-29 dias de seguimiento antes de la eutanasia. Se calculó la pérdida nominal tardía como la diferencia en MLD inmediatamente después de la lesión con balón y en el seguimiento de 28 días, y se calculó el índice de remodelado como la pérdida luminal tardía dividida entre la MLD después de la lesión.

Definición de los términos utilizados durante la angiografía coronaria cuantitativa.

Ri = segmento de referencia para el segmento proximal (sin stent) Prox.= segmento proximal de la arteria con Stent. Mid. = segmentos medio de la arteria con stent. Dist. = segmentos distal de la arteria con stent. R2 = segmento de referencia para el segmento distal (sin stent) Max = diámetro luminal máximo a lo largo del segmento del stent. Min. = diámetro luminal minimo a lo largo del segmento con stent Ganancia de la luz = diámetro luminal posterior a la lesión menos anterior a la lesión. Pérdida de luz = diámetro luminal posterior a la lesión menos seguimiento de 28 dias.

El porcentaje de estenosis de los segmentos lesionados se calculó utilizando los segmentos no lesionados como referencia. Mediante ultrasonido intravascular (IVUS) se midieron los parámetros área del stent, área de la luz, área de la neoíntima, porcentaje del área de la estenosis.

Análisis de las arterias coronarias en el seguimiento Después de 28 (n = 8) ó 29 (n = 1) días, los animales ayunaron durante la noche, se prepararon para cirugía como en lo anterior, para la angiografía de seguimiento. Además, en el seguimiento se desplegó un catéter IVUS en las arterias coronarias con stent para estudio IVUS de cada arteria con stent. Los animales fueron entonces sacrificados con anestesia con pentobarbital IV 90 mg/kg, y los corazones fueron escindidos después de toracotomía. Las arterias coronarias fueron perfundidas con salina para aclarar la sangre y luego se fijaron con perfusión con paraformaldehído al 2% durante 15 minutos seguido por inmersión en paraformaldehído al 4% en buffer de fosfatos (pH 7.4) durante 4 horas y por último se almacenaron en etanol al 70%. Para preservar la integridad de los tejidos adventicios y perivasculares , las arterias coronarias se retiraron cuidadosamente junto con tejidos adyacentes (el tejido adiposo y el miocardio) . Para segmentos con stent, se realizaron procesamientos histológicos especiales para mantener la arquitectura vascular con puntales metálicos in situ. Los bloques de tejidos son incrustados en metacrilato de metilo y cortados con una cuchilla de oblea de diamante. Se cortaron tres secciones transversales radiales que contenían 12 puntales: uno del tercio proximal, uno del medio y uno del tercio distal de cada stent. Las secciones fueron rectificadas hasta un espesor de aproximadamente 50 µ??, se pulieron ópticamente y se tiñeron con azul de toluidina (tinción de paragon) .

Análisis histomorfométrico Se utilizó un sistema formador de imágenes computarizado (Image Pro Plus 4.0) para las mediciones histomorfométricas de: 1. El área transversal promedio y el espesor de la luz (el área circunscrita por el borde luminal íntima/neoíntima) ; la neoíntima (área entre la luz y la lámina elástica interna, IEL, y cuando falta la IEL, el área entre la luz y el resto de la media o la lámina elástica externa, EEL) ; media (área entre la IEL y la EEL) ; el tamaño de los vasos (área circunscrita por la EEL pero que excluye el área adventicia) ; y la adventicia (área entre los tejidos periadventicios, el tejido adiposo y el miocardio, y EEL) . 2. Registro de la lesión. Para cuantificar el grado de lesión vascular, se utilizó un registro basado en la cantidad y longitud de rasgado de las diferentes estructuras parietales. El grado de lesión se calculó como sigue: 0 = IEL intacta 1 = IEL rota con exposición de las capas medias superficiales . 2= IEL rota con exposición de las capas medias más profundas (disección media) . 3 = EEl rota con exposición de la adventicia Resultados Dos arterias coronarias, cada una de cuatro cerdos domésticos, fueron tratadas con vehículo de sacarosa-manitol (testigo) o 4-6 mg de ETC-216 (n = 7 por grupo) . La angiografía coronaria cuantitativa (QCA) de las arterias coronarias descendente anterior izquierda (LAD) , la circunfleja izquierda (LCX) y la derecha (RCA) se realizó para estimar el tamaño de cada vaso; las dos arterias más grandes fueron elegidas para el procedimiento. En cada arteria, el medicamento se suministró intramuralmente por el INFILTRATOR seguido por angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) sobre extendida con despliegue del stent en el sitio del suministro del fármaco. Este procedimiento quirúrgico indujo una lesión vascular en la que se desarrolla inflamación, hiperplasia de la neointima y restenosis. Las arterias con stent de todos los animales fueron sometidas A QCA antes, inmediatamente después de introducción del stent y poco antes del sacrificio en el día 28. Además, se utilizó IVUS para determinar el área del stent y la luz para estimar el área de la neointima justo antes del sacrificio. Después del sacrificio, se obtuvieron los segmentos de las arterias con stent para las mediciones histomorfométricas para evaluar el grado de lesión por sobre extensión, la cantidad de hiperplasia neointimal y la restenosis. Los vasos coronarios de un cerdo tratado con vehículo que expiró 9 días antes de sus procedimientos QCA e IVUS programados solo se analizaron por los métodos histológicos. Un cerdo tratado con ETC-216 fue sacrificado 6 días después de los procedimientos programados a los 28 días debido a un error en el programa de la instalación. Para suponer una comparación clara, los datos recolectados de estos dos cerdos fueron excluidos del análisis.

Además, dos animales fueron tratados con aproximadamente una preparación tres veces concentrada de ETC-216 suministrado mediante el INFILTRATOR. Se observó que la preparación estaba demasiado viscosa para suministrar eficazmente el agente de prueba a través del dispositivo y se encontró que causa daño al dispositivo balón y por tanto una cantidad aumentada de lesión a las arterias limitando el uso del dispositivo con soluciones viscosas .

La sangre se obtuvo de todos los animales durante el transcurso del estudio para la determinación de la cuenta de células sanguíneas blancas, la cuenta de células sanguíneas rojas, contenido de hemoglobina en sangre, por ciento de hematocrito, cuentas de plaquetas sanguíneas. En todos los casos donde se determinaron variables sanguíneas, los valores posteriores al tratamiento no se modificaron apreciablemente a partir de los valores de la línea base. Es decir, todos estuvieron dentro del intervalo normal. Se determinó la frecuencia cardiaca y la presión arterial para todos los animales ingresados en el estudio en la línea base. La frecuencia cardiaca y la presión arterial también se determinaron periódicamente en la mayoría de los animales durante los procedimientos quirúrgicos, y antes del sacrificio. Para los animales introducidos en el estudio estas variables no se modificaron apreciablemente respecto a los valores de la línea base debido al procedimiento quirúrgico o los tratamientos .

La Angiografia Coronaria Cuantitativa (QCA) se determino en tres puntos del tiempo, antes de la lesión coronaria, inmediatamente después de las lesiones coronarias y al despliegue del stent y antes del sacrificio. Se hicieron mediciones del diámetro (mm) en un segmento sin stent proximal al stent (Rl) , en la sección proximal del stent (prox) , un área promedio a lo largo del stent (Aver) , en la sección distal del stent (Dist) y en un segmento sin stent distal para el stent (R2) . Se utilizó ultrasonido intravascular (IVUS) para determinar el área del stent y la luz en la región distal, media y proximal de cada vaso coronario con stent antes del sacrificio. La diferencia entre estas mediciones es el área de la neointima.

El análisis histomorfométrico de las arterias con stent se utilizó para determinar las áreas transversales promedio de la capa limítrofe adventicia (ABL) , la lámina elástica externa (EEL) , la lámina elástica interna (IEL) , la luz (L) , la adventicia (A) , la media (M) , la intima (I), la relación íntima a media (I/ ) y el registro de las lesiones. El registro de la lesión es el promedio de 36 determinaciones de lesión consistentes en 12 determinaciones en cada uno de los segmentos proximal (a), medio (b) y distal (c) en los sitios apuntalados de los vasos con stent. Las lesiones fueron registradas como 0, 1, 2 ó 3, siendo 0 una IEL intacta (es decir, sin lesión, y 3 indica una EEL rota con exposición para la adventicia (es decir, lesión más grave) .

El tratamiento intramural con ETC-216 suministrado por el INFILTRATOR redujo significativamente la relación intima a media en los vasos coronarios un 35% (LAD, LCX, y RCA combinadas) . Este efecto se debe en gran medida a las reducciones significativas de la relación I/M de la RCA (-42%, p = 0.002), LCX (-38%) y LAD (-29%). Los datos histomorfométricos para todos los vasos (es decir, la RCA, LCX y LAD combinadas) y para el tipo de vaso (es decir, la RCA ó la LAD) se muestran gráficamente en las Figuras 5a y 5b, respectivamente.

Claims (34)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar o prevenir antes o durante cirugía de derivación en arterias coronarias, periféricas y cerebrales enfermas, cirugía para implantar injertos u órganos transplantados, angioplastia, que consiste en administrar localmente en el sitio de la lesión a un vaso una cantidad eficaz de medicamento modular de lípidos para prevenir o reducir la estenosis o la restenosis o estabilizar una placa.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que el medicamento antiproliferativo es una apolipoproteína alfa helicoidal o proteína que asocia HDL.

3. El método de la reivindicación 2, caracterizado por que la apolipoproteína o proteína asociada con HDL se elige del grupo que consiste en apolipoproteína A-I, apolipoproteína A-I milano apolipoproteína A-I París, apolipoproteína E, proapoliproteína A-I, apolipoproteína A-II, preproapoliproteína A-II, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína para incluir uno o más grupos sulfhidral, apolipoproteína C-I, apolipoproteína C-II y apolipoproteína C-III, las secuencias alfa helicoidales dentro de estas apolipoproteínas, paraoxonasa, proteína de transferencia del éster colesterílico, LCAT y proteina de transferencia de fosfolipidos .

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que la apolipoproteina es apolipoproteina A-I milano.

5. El método de la reivindicación 2, que consiste en administrar la apolipoproteina asociada con HDL en combinación con lipido.

6. El método de la reivindicación 5, caracterizado por que la apolipoproteina se administra en combinación con lipido y proteínas asociadas con HDL.

7. El método de la reivindicación 5, caracterizado por que la relación de la apolipoproteina A lipido en peso es entre aproximadamente 1:0.5 y 1:3.

8. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que el agente modulador de lípidos se administra por un dispositivo para infiltración intramural.

9. El método de la reivindicación 2, caracterizado por que la apolipoproteina o la proteína asociada con HDL se administra con un catéter.

10. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que la apolipoproteina se administra en un gel .

11. El método de la reivindicación 4, caracterizado por que la apolipoproteina es apolipoproteina A-I milano administrada en combinación con fosfolipido en una relación de entre aproximadamente 1:0.5 y 1:3, en peso, en una dosis de entre 0.05 y 0.3 mg de apolipoproteina ?-? milano/kg o entre 4 y 6 mg de apolipoproteina A-I milano/segmento de vaso que ha de ser tratado.

12. El método de la reivindicación 2, caracterizado por que la apolipoproteina o la proteina asociada con HDL se administra en un intervalo de dosis entre 0.05 mg de apolipoproteina/kg y una dosis limitada por la viscosidad o el volumen del dispositivo/segmento del vaso coronario.

13. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que la apolipoproteina se administra en un intervalo de dosis entre 0.3 mg de apolipoproteina/kg y una dosis limitada por la viscosidad o el volumen del dispositivo/segmento del vaso coronarios.

14. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que se suministran moléculas de ácido nucleico por una infiltración intramural.

15. El método de la reivindicación 14, caracterizado por que las moléculas del ácido nucleico codifican una apolipoproteina alfa helicoidal o proteina asociada con HDL.

16. El método de la reivindicación 14, caracterizado por que las moléculas de ácido nucleico son oligonucleótidos.

17. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que el medicamento modulador de lipidos se administra en una dosis eficaz única.

18. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que el medicamento modulador de lipidos se administra en dosis múltiples.

19. El método de la reivindicación 1, además comprende el suministro sistémico de un medicamento seleccionado del grupo que consiste en compuestos antiproliferativos, compuestos anti-inflamatorios, compuestos antihipertensivos, anticoagulantes y agentes reguladores de lipidos.

20. El método de la reivindicación 19, caracterizado por que la terapia sistémica comienza antes de la terapia local.

21. El método de la reivindicación 19, caracterizado por que los agentes reguladores de lipidos se eligen del grupo que consiste en niacina, estatinas y fibratos.

22. El método de la reivindicación 19, caracterizado por que los agentes antiproliferativos se eligen del grupo que consiste en paclitaxel, rapamicina, tirofiban AP-17 y abciximab .

23. El método de la reivindicación 19, caracterizado por que los agentes que previenen o retardan la coagulación sanguínea o la agregación de plaquetas se eligen del grupo que consiste en aspirina, inhibidores de Ilb/IIIa, clopidogrel, heparina y fragmentos de heparina.

24. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que el suministro local es a través de la liberación desde un catéter hacia el espacio pericardial.

25. El método de la reivindicación 2, caracterizado por que la liberación se logra a través de uso de stents recubiertos.

26. El método de la reivindicación 1, para prevenir o tratar restenosis.

27. El método de la reivindicación 1, para estabilizar placa.

28. El método de la reivindicación 27, para reducir la consecuencia de ruptura de placa que incluye formación de trombos e isquemia.

29. Un equipo para tratar o prevenir antes o durante cirugía de derivación en arterias coronarias, periféricas y cerebrales, enfermas, cirugía para implantar injertos u órganos transplantados, angioplastia o estabilización de placas, que contiene los medios para la liberación local prolongada de una cantidad eficaz de medicamento modulador de lípidos para prevenir o reducir estenosis o restenosis o estabilizar una placa.

30. El Equipo de la reivindicación 29 que comprende un dispositivo para infiltración intramural.

31. El Equipo de la reivindicación 29 que comprende catéter en combinación con un reservorio para apolipoproteína y/o lípido.

32. El equipo de la reivindicación 29 que comprende un medio para la administración de moléculas de ácido nucleico .

33. El equipo de la reivindicación 29 caracterizado por que el medicamento reductor del colesterol se elige del grupo que consiste en del grupo que consiste en apolipoproteina A-I, apolipoproteína A-I milano apolipoproteina A-I Paris, apolipoproteina E, proapolipoproteina A-I, apolipoproteina ?-??, proapolipoproteina A-II, apolipoproteina A-IV, apolipoproteinas modificadas para incluir uno o más grupos sulfhidral, apolipoproteina C-I, apolipoproteina C-II y apolipoproteina C-III, las secuencias alfa helicoidales dentro de estas apolipoproteinas, paraoxonasa, proteina de transferencia del éster colesterilico, LCAT y proteina de transferencia de fosfolipidos .

34. ün Stent recubierto con un material que será liberado en un sitio que ha de ser tratado, seleccionado del grupo que consiste en apolipoproteina alfa helicoidal o proteina asociada con HDL solas o formuladas con lipidos, células que expresen los genes que codifican la apolipoproteina alfa helicoidal o la proteina asociada RESUMEN DE LA INVENCIÓN La apolipoproteína A-I (ApoA-I) , de preferencia una forma variante como apolipoproteína A-I Milano ( poA-IM) , sola o más preferentemente en combinación con un portador lipido como los fosfolípidos u otro medicamento, puede administrarse en forma local antes o durante la cirugía de derivación o bypass en arterias coronarias, periféricas y cerebrales coronarias enfermas, cirugía para implantar injertos u órganos trasplantados o angioplastia, o para estabilizar placas inestables en una modalidad alternativa, la apolipoproteína no se proporciona directamente, sino que se proporciona el gen que codifica la apolipoproteína. El gen se introduce en el vaso sanguíneo en una forma similar a la que se utiliza para la proteína, donde la proteína luego se expresa. La técnica también puede utilizarse para suministrar genes para el tratamiento o prevención o restenosis u otras enfermedades cardiovasculares. En todavía otra modalidad los stents se recubren con las apolipoproteínas solas, las apolipoproteínas formulada con lípidos, células genéticamente manipuladas que expresen las apolipoproteínas, DNA desnudo que codifique para una apolipoproteína, u otros medicamentos como los anti-proliferativos para suministro local en un sitio de lesión. En una modalidad preferida, el sistema se utiliza con terapia en combinación, para suministro local de un agente como una apolipoproteina en combinación con terapia antihipertensión, sistémica, terapia antiinflamatoria regulación de lipidos y/o terapia anticoagulación. Estos tratamientos pueden comenzar antes de, al mismo tiempo con o después del suministro local.