CN1870894B - 用于治疗和预防急性冠状动脉综合征的药物制剂、方法和给药方案 - Google Patents
用于治疗和预防急性冠状动脉综合征的药物制剂、方法和给药方案 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于治疗和预防急性冠状动脉综合征的方法和制剂。本发明的方法提供了用于降低和稳定动脉粥样硬化斑块的载脂蛋白A-I Milano：磷脂复合体的安全有效剂量。还提供了Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物制剂。
Description
1.技术领域
本发明提供了用于治疗或预防急性冠状动脉综合征的新制剂和方法。在一个优选的实施方案中，该制剂是具有所指定pH、重量摩尔渗透压浓度和纯度的单一单位剂量。在一种优选的方法中，该制剂以每次给药约1mg/kg至约100mg/kg的剂量范围被每周、每月或每年给药一次。此外，还公开了一些剂量和给药方案以及可以使用所说剂量或给药方案的特定疾病。所说的制剂和方法使用一种载脂蛋白A-IMi lano：磷脂复合体。
2.背景技术
自从20世纪的前50年以来，心肌梗死的控制和治疗已经发生了很大的改变，从卧床休息和观察发展到强调技术(包括血液动力学监测和气囊式导管)，到越来越着重于血栓溶解疗法。(Antman和Braunwald，心脏疾病中的“急性心肌梗死”(“Acute Myocardial Infarction”in Heart Disease)，一本心血管医学中的教科书，第6版，第2卷，Braunwald等人主编，2001，W.B.Saunders Company，费城)。在最近100年中，治疗心血管疾病的疗法取得了长足进展，同时对其病理学基础也也有了更透彻的了解。
几乎全部心肌梗死都是由通常伴有并发的冠状动脉血栓形成的冠状动脉粥样硬化产生的。由于形成了一些侧副管，所以缓慢积聚的一些斑块是无症状的。但是，动脉粥样硬化斑块，尤其是这些富含脂质的斑块易于突然发生斑块破裂。斑块破裂和相关的内皮损伤造成了诸如血栓烷A2、血清素、二磷酸腺苷、凝血酶、血小板活化因子、组织因子和得自氧的自由基之类介质的释放。这些介质促进了血小板聚集和机械梗阻，其常常导致了干扰血流和供氧的血栓形成。持续和严重 的干扰心肌供氧可导致急性心肌梗死。(见，Rioufo l等人，2002，Circulation106：804，Timmis，2003，Heart 89：1268-72)。
动脉粥样硬化药物疗法的主流一直是用于预防或减缓粥样硬化斑块形成的长期疗法，其主要着眼于将降低LDL或“不良的胆固醇”作为治疗终点。例如它汀(Statin)疗法可以大大改善心血管健康；但是，不利作用如横纹肌溶解仍然是一种障碍。此外，它汀类物质在急性情况中几乎没有作用，例如几乎不能降低局部缺血发作期间易受影响的不稳定的动脉粥样硬化斑块。急性治疗多依赖于血栓溶解剂(如tPA)和手术干预如经皮经腔冠状血管成型术(PTCA)和冠状动脉旁路搭桥术(CABG)。虽然血栓溶解剂通过降低或消除阻碍血流的血栓而提供了缓解作用，但是其并不能改变疾病的病理学基础。一些干预手段如PTCA本身具有一些风险并常常不适用于患有急性情况的患者。因此，一旦不稳定的斑块成为危险时，目前的药理学疗法对患者几乎没有帮助。(见，Newton and Krause 2002，AtherosclerosisS3：31-38)。
HDL疗法是正在形成的一种治疗血脂障碍和动脉粥样硬化的新范例。同上。由于出乎意料地发现载脂蛋白A-I Milano(Apo A-I Milano)变型的载体具有低HDL(“良好的胆固醇”)水平和降低了心血管疾病的风险，所以一直对这种载脂蛋白感兴趣。(见，Franceschini等人，1980，J.Clin.Invest.66：892-900，Weisgraber等人，1983，J.Biol.Chem.258：2508-2513，Franceschini等人，1985，Atherosclerosis58：159-174，Franceschini等人，1987，Arteriosclerosis7：426-435)。发现Apo A-I Milano同型二聚体降低了喂食胆固醇的兔子体内的内膜增厚(Ameli等人，1994，Circulation，90：1935-41和Soma等人，1995，Cir.Res.76：405-11)。在ApoE不足的小鼠中，通过多次给予低剂量和单次给予高剂量Apo A-I Milano：脂质复合体降低了动脉粥样硬化损害(Shah等人，1998，Circulation97：780-85和Shah等人，2001，Circulation103：3047-50)。还证明以每只兔子500mg和1000mg蛋白的剂量单次局部输入Apo A-I Milano：磷脂复合体可使得兔子的斑块消退。(Chiesa等人，2002，Cir.Res.90： 974-80)。在兔子模型中诱导的损害大部分都包括巨噬细胞并且不能代表人的更复杂的损害。因此，不能确定类似的治疗是否对人动脉粥样硬化中所发现的复杂斑块有效(Li等人，1999，ArterioscierThrombVasc Biol 19：378-383和Shah等人，2001，Circulation103：3047-50)。
尽管对心肌梗死病理生理学的了解日益深入并且HDL疗法取得了一些进展，但是对于Apo A-I Mliano或Apo A-I Milano：脂质复合体用于人的治疗和预防应用而言仍然希望有一些安全、有效的剂量、给药方案和药物制剂。
3.本发明的概述
本发明提供了一些用于治疗和预防心血管疾病或相关病症(包括动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、局部缺血、局部缺血性再灌注损伤、心绞痛和心肌梗死)和减少或稳定动脉粥样硬化斑块、减少闭合血管中的斑块以及促进胆固醇流出(cholesterol efflux)的方法。因此，本发明包括用于治疗或预防心血管疾病或相关病症(包括动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、局部缺血性再灌注损伤、心绞痛和心肌梗死)和减少或稳定动脉粥样硬化斑块、降低闭合血管中的斑块以及促进胆固醇流出的用于Apo A-I Milano：磷脂复合体的应用的剂量和给药方案以及Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物制剂。这里所述的方法和制剂使得不稳定的动脉粥样硬化斑块迅速减少或稳定，而如果不用或者用常规方法对所说的斑块进行治疗时，其可能会破裂并导致包括急性冠状动脉综合征在内的局部缺血性事件。
申请人已经确定了外源性产生的HDL类似物如Apo A-I Milano(优选地为Apo A-I Milano：磷脂复合体形式)，提供了一种治疗和预防心血管疾病或相关病症的独特方法；该类病症非限制性地包括动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、局部缺血、局部缺血性再灌注损伤、心绞痛和心肌梗死、或减少或稳定狭窄或闭合血管中的动脉粥样硬化斑块。本发明的包括剂量和给药方案的方法以及药物制剂提供了一种安全有效的非手术治疗，其迅速促进了从动脉粥样硬化斑块的胆固醇流 出和活动。迅速促进胆固醇流出降低了一根或多根受影响血管中的粥样斑体积。降低粥样斑(动脉粥样硬化血管中变质的增厚了的动脉内膜斑的质量)使得血液可以更块地流动并降低了局部缺血的风险，包括降低了不稳定心绞痛、心肌梗死和急性冠状动脉综合征的风险。
在本发明提供用于治疗和预防心血管疾病(包括急性冠状动脉综合征、动脉粥样硬化、心绞痛、心肌梗死、和局部缺血性再灌注损伤)的ApoA-I M药物制剂和特定的剂量之前，常规的动脉粥样硬化疗法着重于将降低LDL或“不良的胆固醇”作为治疗终点。这些常规的LDL疗法例如用它汀类物质进行的治疗可能需要数月治疗才能降低患者的LDL血清水平。在急性或突然发作的心血管病症中，常规疗法大多依赖于手术干预如经皮冠状动脉腔内血管成型术(PTCA)和冠状动脉旁路搭桥术(CABG)。但是，在突发情况中的一些患者，特别是总体健康情况较差的患者常常不能实施手术干预。此外，这些常规方法在急性情况中不能提供有效非手术性药物学治疗。此外，常规疗法着重于治疗心血管疾病和急性冠状动脉综合征的症状，尤其是循环系统中的症状。上述和在下面进行了更详细描述的常规疗法着重于降低LDL胆固醇、降低血块形成和降低血压，其不能治疗或预防心血管疾病和急性冠状动脉综合征的基本原因、稳定、降低和改变血管内的斑块。
本文所提供的药物制剂和包括剂量和给药时间表在内的方法安全有效并且可迅速起效来降低或稳定动脉粥样硬化斑块。这里所述的剂量可迅速起效，从而用很少几周的时间就通过促进胆固醇活动而降低了动脉粥样硬化斑块。在某些实施方案中，可以用这里所述的剂量来治疗患有急性冠状动脉综合征或与局部缺血或血管闭合有关的病症的患者。在某些实施方案中，对患者来说一旦动脉粥样硬化斑块存在风险，可以用这里所述的剂量来预防疾病进程。所防止的疾病进程还可是血管闭合，或者可以预防可导致局部缺血性情况(包括急性冠状动脉综合征和局部缺血性再灌注损伤)的不稳定的动脉粥样硬化斑块破裂。
这里所提供的方法和药物制剂的有效性使得45mg/kg的单剂量可刺激胆固醇从动脉粥样硬化斑块上松动下来。在某些实施方案中，可 以将高单剂量例如约45mg/kg的Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂给药于个体。在某些实施方案中，可以将Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂的一个或多个高剂量给药于个体，然后给予患者一个或多个相同剂量(45mg/kg)或更低剂量，例如约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg或约15mg/kg。例如，可以给个体使用两个45mg/kg的剂量，然后再给予其10mg/kg的剂量。还可以使用相反的方案--先给予低剂量，然后给予高剂量。当然，对于急性疾病情况而言，优选地首先使用较高的剂量。在某些实施方案中，可以用Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂每周一次地对个体治疗几周，然后根据需要对患者间歇治疗以维持开放的不闭合血管和降低斑块破裂的风险以及不利的血管事件，例如然后可以每年给药两次、每年给药一次或每两年给药一次。
在某些实施方案中，治疗或预防急性冠状动脉综合征的方法包括约每天、约每隔一天、约每3天、约每4天、约每5天、约每6天、约每7天、约每8至10天或约每11至14天地给需要其的个体使用ApoA-1 Milano：磷脂复合体或其药物制剂。在一个优选的实施方案中，ApoA-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂被约每7天给药一次。在某些实施方案中，Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂的给药可以是一次性给药。在某些实施方案中，可以连续给药约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7-12周、约13-24周或约25-52周。在某些优选的实施方案中，Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂的给药为约每7天给药一次给药约5周。在某些实施方案中，在例如约5周后可以间歇给药。例如，可以每周一次地对个体治疗约5周，然后在次年治疗约3至约4次。在某些实施方案中，这里所述的药物制剂可以被间歇给药于个体以维持血管的开放。例如，可以将约15mg/kg的剂量给药于约每10天给药一次的药物制剂中给药约7周，然后例如约26周后或约52周后再进行治疗。在下面对包括给药时间表和与常规药物疗法和手术干预联用方法的应用的其它实施方案进行了描述。
本发明提供了用于将载脂蛋白A-I Milano(Apo A-I Milano)给药来治疗或预防急性冠状动脉综合征和局部缺血性再灌注损伤的药物制剂。在一个优选的实施方案中，对于这里所述的方法而言，所说的ApoA-I Milano与脂质复合。例如，所说的脂质可以是磷脂，优选地是1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(也被称为1-棕榈酰-2-油酰基-磷脂酰胆碱或POPC)。在一个最优选的实施方案中，所说的Apo A-IMilano：POPC复合体可以是一种药物制剂。在另一个优选的实施方案中，可以以约1mg蛋白/kg至约100mg蛋白/kg的剂量将所说的ApoA-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂对需要其的个体进行给药。
在某些实施方案中，该方法包括给予一些Apo A-I Milano：磷脂复合体或其可注射或液体药物制剂的剂量来治疗急性冠状动脉综合征。在一个优选的实施方案中，所说的ApoA I M：磷脂复合体或其药物制剂可以以约1mg(蛋白)/kg至约100mg(蛋白)/kg的剂量被给药于需要其的个体。在某些实施方案中，该方法包括通过以静脉内输入的形式给予Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂来治疗或预防急性冠状动脉综合征。在某些实施方案中，该方法包括以静脉内推注形式进行给药。静脉内推注指的是Apo A-I Milano：磷脂或其药物制剂在短时间内例如在高至5分钟，例如2-5分钟内被静脉内给药。在某些实施方案中，Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂的给药包括连续静脉内输入。连续静脉内输入指的是在高于2-5分钟，例如30分钟至约3小时的时间内连续给药。可以在输液泵或输入装置的帮助下来进行连续静脉内输入。在某些实施方案中，Apo A-I Milano：磷脂或其药物制剂的给药可以是Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂连续静脉内输入和静脉内推注(“快速注射”)的组合。所述快速注射可以在连续输注之前、之后或期间给药。在某些实施方案中，Apo A-IMilano或脂质复合体或其药物制剂的给药可以与治疗或预防心血管疾病、相伴或comorbid疾病或缓解症状的其它药物联合进行。其它药物的给药可以同时进行或相继进行。
所说的方法提供了这里所述药物制剂的静脉内给药。可以用任何适 宜的血管来进行输入，所说的血管包括外周血管如胳膊肘前窝中的血管或进入胸部的重要血管。在优选的实施方案中，所说的药物制剂被输入到个体胳膊肘前窝处的头侧或前臂正中的血管中。
在某些实施方案中，该方法包括以高或低剂量或其组合给患者使用Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物制剂。如下文所述的那样，在短的给药时间间隔内给予所说药物制剂的高剂量可安全有效地降低血管被部分或完全闭合的个体的粥样斑体积。在某些实施方案中，可以在手术干预如PTCA之前、期间或之后将所说的药物制剂给药以打开被闭合的血管。在某些实施方案中，可以给患者使用一个或多个间歇剂量以维持之前被闭合血管的开放性(“维持剂量”)。
本发明提供了一种治疗或预防局部缺血性再灌注损伤的新方法，即，使用这里所述的Apo A-I Milano复合体的药物制剂或剂量来治疗局部缺血性再灌注。用于这种治疗的剂量包括将高至100mg/kg的ApoA-I Milano：磷脂复合体给药于需要其的个体。在某些实施方案中，该方法包括以约1mg/kg个体体重至约100mg/kg个体体重的剂量将ApoA-I Milano：磷脂复合体的药物组合物进行给药。在特定的实施方案中，该方法包括以约10mg/kg至约50mg/kg的剂量将Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物组合物进行给药。在一个优选的实施方案中，该方法包括以约15mg/kg的特定剂量将Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物组合物进行给药。在另一个优选的实施方案中，该方法包括以约45mg/kg的特定剂量将Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物组合物进行给药。本发明还优选地包括单独使用15mg/kg或与45mg/kg的剂量联用。同样，对于局部缺血性再灌注损伤的治疗而言，可以单独使用45mg/kg的剂量或者与15mg/kg的剂量联用。
这里所提供的药物制剂包含适宜pH、重量摩尔渗透压浓度、张度、纯度以及无菌性的Apo A-I Milano：磷脂复合体从而使得其可以安全地被给药于个体。该药物制剂可以被制备成用于单一的一次性应用的制剂或者被制备成可提供适于多次给药的药物制剂的下述包含抗菌赋形剂的制剂。在某些实施方案中，该药物制剂可以位于可以被冷冻或 冷藏的无菌预填充的注射器中或者无菌预填充的袋中。在优选的实施方案中，所说的Apo A-I Milano：脂质复合体是Apo A-I Milano：磷脂复合体。在更优选的实施方案中，所说的Apo A-I Milano：磷脂复合体是Apo A-I Milano：POPC。
在某些实施方案中，该药物制剂可以是单位剂量或应用单位(unit-of-use)包装。正如本领域技术人员已知的那样，单位剂量包装将单剂量药物传递给个体。本发明的方法为包含例如每个包装包含1050mg Apo A-I Milano蛋白的药物制剂提供了一种单位剂量包装。例如，1050mg Apo A-I Milano蛋白是以15mg/kg Apo A-I Milano的剂量给药于70kg个体的数量。该单位可以是例如无菌的单次应用的小瓶、无菌预填充的注射器、无菌预填充的袋(即piggybacks)等。
在某些实施方案中，该药物制剂可以是应用单位包装。正如本领域技术人员已知的那样，应用单位剂量包装是由提供健康护理的人直接派给的具有处方大小的患者可以方便容易地使用的标注单位。应用单位包装包含给定适应症典型的治疗时间间隔和持续时间所必需数量的药物制剂。本发明的方法提供了一种包含例如足以以15mg/kg Apo A-IMilano蛋白的数量在五周的时间中每周一次静脉内给药于平均体形大小的成年男性或女性来对其进行治疗数量的Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物制剂的应用单位包装。因此，上述应用单位包装具有五个Apo A-I Milano：磷脂复合体剂量(在小瓶或预填充注射器中被获得)。在一个实施方案中，该应用单位剂量包括一种以足以以15mg/kg或45mg/kg剂量在六周的时间中每周一次给药于平均体形大小的成年男性或女性来对其进行治疗数量的Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物制剂。对本领域技术人员显而易见得是，这里所述的剂量是以个体的体重为基础的。
可以对该药物制剂进行标记并且其具有所附的用于确定其中所包含的制剂和可为健康护理提供者和个体用于治疗急性冠状动脉综合征的其它信息的标签，所说的信息非限制性地包括使用说明、剂量、给药时间间隔、持续时间、适应症、禁忌症、警告、预防措施、处理和 储存指导等。
4.附图简要说明
图1提供了ETC-216的单剂量对正常男性个体血清HDL的急性作用；
图2(A)提供了在远侧信托分枝(fiduciary branch)(部位C)处开始和在近枝(部位A)处结束的IVUS成像导管的motorized pullback。在该血管造影照片中说明了该导管的路径；
图2(B)提供了每0.5mm直至达到近枝处时获得的血管的典型横截面；
图2(C)提供了血管的中间横截面；
图2(D)提供了IVUS图像中的远枝；
图3(A)提供了分析用的横截面；
图3(B)提供了外弹性膜(EEM)；
图3(C)提供了腔面积；
图3(D)提供了通过从EEM的区域中减去该腔的横切面面积测量的最大粥样斑厚度的计算；
图4(A)提供了患者在接受ETC-216前血管的基础影像；和
图4(B)提供了患者在接受ETC-216后随访时血管的影像。粥样斑面积从8.1降低至5.35mm3，同时管腔面积实际上没有变化。
图5提供了一种方案的实例，其中在局部缺血发作前用基质或本发明的蛋白/脂质复合体(ETC-216)对离体兔心脏进行处理；
图6提供了冠状静脉流出物中的肌酸激酶活性；
图7提供了在Langendorff装置中由基质和ETC-216处理的离体兔心脏收集的心脏功能的实时监测；
图8提供了在全心缺血抑制30分钟和再灌注的60分钟之前、期间和之后离体兔心脏中左心室形成压(LVDP)的瞬时改变；
图9提供了在全心缺血抑制30分钟和再灌注的60分钟之前、期间和之后离体兔心脏中左心室末期舒张压(LVEDP)的瞬时改变；
图10提供了在全心缺血抑制30分钟和再灌注的60分钟之前、期 间和之后离体兔心脏中冠状动脉灌注压(CPP)的瞬时改变；
图11提供了由全心缺血抑制30分钟，然后再灌注60分钟的基质和ETC-216处理的兔心脏获得的组织匀浆中的过氧化氢脂质含量；
图12提供了由基质和ETC-216处理的兔心脏获得的心肌样品的电子显微镜影像；
图13提供了另一种本发明的方案，其中在急性给药组中在开始局部缺血前使用一种预处理和在长期给药组中在开始局部缺血前进行两次预处理；
图14提供了一种测定梗死大小的方案；
图15提供了用ETC-216(100mg/kg)或等体积的基质处理一次(即急性处理)或处理两次(即长期处理)的兔有风险面积的梗死百分比、左心室的梗死百分比、和左心室有风险的面积百分比；
图16提供了另一种本发明的方案，其中在开始局部缺血前用基质(组1)或10、3或1mg/kg ETC-216(组2)对兔子进行预处理；
图17提供了各组用10、3或1mg/kg ETC-216或等体积的蔗糖-甘露醇基质处理一次(即急性处理)时在兔体内测得的有风险面积的梗死百分比、左心室的梗死百分比、和左心室中有风险的面积百分比；
图18提供了脂蛋白未酯化胆固醇的瞬时变化；
图19提供了另一种本发明的方案，其中在30分钟局部缺血期的最后5分钟用基质或ETC-216进行单次处理；和
图20提供了在兔体内测得的有风险面积的梗死百分比、左心室的梗死百分比、和左心室中有风险的面积百分比。
5.本发明的详细描述
5.1.定义
这里所用的下面的术语具有下面的含义：
术语“治疗”指的是一种缓解或消除疾病、病症和/或其症状的方法。
术语“治疗有效量”指的是足以在一定程度上缓解被治疗情况或病症的一种或多种症状的Apo A-I Milano或脂质复合体或其药物制剂的 数量。
术语“预防”指的是一种使患者不出现疾病、病症和/或其症状的方法。在某些实施方案中，术语“预防”指的是一种降低患有疾病、病症和/或其症状的风险的方法。
术语“预防有效量”指的是足以预防被治疗情况或病症的一种或多种症状的发作或复发的Apo A-I Milano或脂质复合体或其药物制剂的数量。
术语“急性冠状动脉综合征”指的是局部缺血性病症如不稳定心绞痛、Q波和非-Q波心肌梗死或者International Classification ofDisease，第9版(ICD-9)(其将被第10版(ICD-10)代替)中所提供的病症。心肌梗死在心电图中可能表现出或不表现出ST-段升高。
术语“局部缺血”指的是由于机械或生物学原因例如痉挛、血栓形成、血液供给的狭窄性梗阻(主要是动脉狭窄或破裂)诱导的局部贫血。术语“心肌局部缺血”指的是血液向心肌的循环不足，其通常是由于冠状动脉疾病导致的。
术语“局部缺血性再灌注”指的是增加量的氧合血液向组织供血的重新建立。
术语“心血管疾病”指的是心脏、血管和血液循环疾病如心肌梗死、急性冠状动脉综合征、动脉粥样硬化、心绞痛、局部缺血性再灌注损伤和相关病症。
这里所用的术语“手术干预”指的是手动的非药物性或者手术方法。手术干预可用于诊断、放射学、预防或治疗目的。
术语“不稳定心绞痛”指的是慢性稳定心绞痛的症状在频次、严重程度或持续时间方面的改变，如向颌部和手臂发散的胸部疼痛或上腹部疼痛。慢性稳定心绞痛是由运动、进食和/或应激导致的并且可以通过休息得到缓解的可能向个体的颌部和手臂发散的胸部疼痛(个体产生症状所需活动的频率或严重程度没有变化)。
术语“药物制剂”指的是一种适于给药于个体的包含Apo A-IMilano或Apo A-I Milano：脂质复合体和适宜稀释剂、载体、基质、 或赋形剂的组合物。这种术语非限制性地包括下述的口服、胃肠外和局部组合物。
术语“约”指的是表示其所涉及的标称值加或减20％的近似值的相对术语。对于本文所属领域而言，除非特定说明需要严格范围，否则这种近似的水平都是适宜的。
术语“标签”指的是一种位于一件物品的直接容器上的文字、印刷或图形物质的表现形式，例如，位于包含药学活性剂的小瓶上所显示的文字材料。
术语“标记”指的是位于任何物品或其任何容器或包裹物或该类物品附件上的所有标签和其它文字、印刷或图形物质，例如，包装内插物、指导性录像带或指导性DVDs附件或者与药学活性剂的容器有关的物质。
5.2.治疗方法
本发明提供了一些治疗或预防急性冠状动脉综合征(包括不稳定心绞痛、ST-段升高性心肌梗死和非Q波心肌梗死)的方法和制剂。本申请确定了这里所述药物制剂用于治疗和预防急性冠状动脉综合征的安全有效剂量。
根据目前的理解，提出了一种公认临床形式的参照标准，现在被称为急性冠状动脉综合征(“ACS”)。Id.急性冠状动脉综合征包括不稳定心绞痛、Q波和非ST-段升高性心肌梗死并且是发病率和致死率的主要原因，尤其是在出现后前24小时内发病率和死亡率的主要原因。(Schoenhagen等人，2000，Circulation101：598-603)。ACS是在心电图中不出现ST段升高的局部缺血性不适。该局部缺血常常发展成不稳定心绞痛、Q波和非-Q波心肌梗死。(Antman and Braunwald，心脏病中的“急性心肌梗死”--心血管医学中的教科书，第6版，第2卷，Braunwald等人编辑，2001，W.B.Saunders Company，费城)。
本发明的方法和制剂提供了治疗动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征的独特有效的方法。在本发明的方法中，Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂提供了一种可以逆转疾病的病理生理学基础而不是 缓解症状的非手术疗法。本发明的方法提供了Apo A-I Milano，ApoA-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂的给药，其提供了促进胆固醇流出、逆转胆固醇转运和降低动脉粥样硬化斑块的HDL疗法。不受任何理论束缚，相信Apo A-I Milano、Apo A-I Milan：磷脂复合体或其药物制剂摹拟了HDL功能，其促进了胆固醇流出和逆转了胆固醇转运、降低了粥样斑体积并且可以稳定动脉粥样硬化斑块。
本发明提供了治疗急性冠状动脉综合征的方法。在优选的实施方案中，如下所述的那样，Apo A-I Milan：磷脂复合体或其药物制剂可以以约1mg(蛋白)/kg至约100mg(蛋白)/kg的剂量，优选1mg(蛋白)/kg至50mg(蛋白)/kg的剂量，最优选15mg/kg或45mg/kg的剂量被给药。申请人已经证明这些剂量是安全有效的并且可以被患有或者有患这里进行了详细描述的急性冠状动脉综合征风险的患者很好地耐受。
本发明提供了治疗或预防急性冠状动脉综合征(包括缓解或改善急性冠状动脉综合征的体征或症状)的方法。在某些实施方案中，该方法治疗或降低了冠状动脉粥样硬化。在某些实施方案中，该方法促进了胆固醇从受影响的血管中流出。在某些实施方案中，该方法促进了胆固醇转运的逆转。在一个实施方案中，该方法降低了受影响血管中的粥样斑体积。在某些实施方案中，受影响的血管是冠状动脉。如这里所述的这样，可以用血管内超声(IVUS)来测定粥样斑体积。在某些实施方案中，该方法降低了受影响血管的总斑块体积。在某些实施方案中，该方法降低了受影响血管中平均最大斑块厚度。在某些实施方案中，该方法降低了平均最大粥样斑厚度。在某些实施方案中，该方法降低了最小百分比斑块区域中的斑块体积。在某些实施方案中，该方法降低了最大百分比斑块面积。在某些实施方案中，该方法增加了受影响血管中的平均冠状血管管腔直径。在某些实施方案中，与没有接受本发明方法和制剂的个体相比，接受了本发明方法和制剂的个体的血管造影损害降低。在某些实施方案中，该方法使得之前存在的损害消退。在某些实施方案中，该方法和药物制剂使得被闭合的血管开放或者维持了被闭合血管的开放。
在某些实施方案中，约15mg/kg至约45mg/kg的Apo A-I Milan：磷脂复合体剂量使得平均百分比粥样斑体积降低了约2％、约1％或约0.05％。在某些实施方案中，约15mg/kg至约45mg/kg的Apo A-IMilano：磷脂复合体剂量使得粥样斑体积降低了约20mm3、约15mm3、约10mm3或约5mm3。在某些实施方案中，约15mg/kg至约45mg/kg的Apo A-I Milano：磷脂复合体剂量使得平均最大粥样斑厚度降低了约-0.039mm至-0.044mm。
在一个实施方案中，该方法提供对有急性冠状动脉综合征体征或症状的个体的急性冠脉综合征的治疗。在一个实施方案中，个体具有心肌局部缺血的体征和/或症状，例如胸部、颌、胳膊、或上腹部区域疼痛、心悸、呼吸短促、出汗、恶心和/或呕吐。在另一实施方案中，该方法为表现出急性冠状动脉综合征的体征和症状并且在心电图(“ECG”或“EKG”)中有变化例如ST段升高、T波改变如反转、肌酸激酶部分、肌钙蛋白I或C-反应蛋白增加的个体提供了治疗。
在一个实施方案中，该方法提供有形成急性冠状动脉综合征风险的个体的急性冠状动脉综合征的预防。有风险的个体包括各种年龄(例如18-24、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80或约90岁)的个体、有家族心血管疾病史或心血管疾病遗传素质的个体、患有糖尿病、高血压、多血管或left-mainstem疾病的个体或者之前出现过心肌梗死的个体。
本领域技术人员清楚的是，本发明制剂的实际剂量可随着个体的身高、体重、年龄、疾病的严重程度、存在并发的医学病症等来进行变化。例如，可以用较低范围的约1mg/kg(例如0.8mg/kg或0.9mg/kg)的剂量用Apo A-I Milano：脂质复合体对肾或肝功能受损的老年个体进行治疗。可以用较高范围的约100mg/kg(例如，120mg/kg、119mg/kg、118mg/kg、115mg/kg等)的剂量用Apo A-I Milano：脂质复合体对患有严重急性冠状动脉综合征的肝肾功能良好的肥胖个体进行治疗。已经表明这里所述制剂的剂量可以有效达到所需目的。这些剂量达到了循环浓度范围(包括具有可接受的风险效益比的有效剂量)。
本发明提供了用足以治疗急性冠状动脉综合征的给药时间表来治疗或预防需要该类治疗的患者的急性冠状动脉综合征的方法。在某些实施方案中，下述的Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂可以被约每天给药、约每隔一天、约每3天、约每4天、约每5天、约每6天、约每7天、约每8-10天或约每11-14天给药。这些时期也被称为给药间隔或时间间隔。在某些实施方案中，该给药间隔可以是每一个月、每六个月、每12个月、每18个月或每24个月进行给药。在优选的实施方案中，所说Apo A-I Milano、脂质复合体或其药物制剂的给药可以是约每7天进行一次。在某些实施方案中，Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂的给药可以是一种一次性给药。在某些实施方案中，持续给药约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7-12周、约13-24周、约52周或者个体终生给药。这种时期也被称为给药期、治疗期或持续时间。因此，一种给药时间表是例如每7天进行一次Apo A-I Milano：磷脂复合体药物制剂的给药，给药约6周。在某些实施方案中，在约52周后可以间歇性继续该给药间隔。例如，可以每周一次地对个体治疗约52周，次年治疗约3至约4次。在某些优选的实施方案中，约每7天进行一次包含Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物制剂的给药，给药约5周。使用各种给药间隔和持续时间的其它给药时间表也在这里所述的本发明的范围内。
在治疗期内Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂的剂量可以发生变化。例如，可以每周一次以45mg/kg Apo A-I Milano：磷脂复合体药物制剂的剂量对个体治疗3周，然后以15mg/kgApo A-I Milano：磷脂复合体药物制剂的剂量每四个月或每年一次对患者进行终生治疗。可以用该类间歇给药来维持血管的开放。为了维持降低的粥样斑体积和增加血管管腔而对个体终生间歇给药在本发明的范围内。
本发明的方法和制剂可以与手术干预联用，即可以在手术前、手术期间或手术后进行应用。手术干预可包括血管成形术、血管内超声、冠状动脉旁路搭桥术(CABG)、冠状动脉血管造影术、血管斯滕特氏固定模的移植、冠状血管经皮干预(PCI)和/或斑块的稳定。在某些实施 方案中，该方法在手术干预前或手术干预后进行Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂的给药以打开闭合的血管或降低血管中的动脉粥样硬化斑块。手术干预指的是用于对疾病或情况的诊断、成像(放射学)预防或治疗的手动的、非药物学或操作性方法。例如，血管内超声(IVUS)和冠状动脉血管造影术是可以为所负担的斑块提供定量评估(诊断目的)的方法，血管造影术可以提供血管的影像(放射学目的)，血管成形术可以打开闭合的血管(治疗目的)。其都包括在这里所用的手术干预内。
5.3.载脂蛋白A-I Milano
一方面，本发明提供了一些通过使用包含Apo A-I Milano的制剂来用于治疗、降低或预防由急性冠状动脉综合征导致的损伤的方法和制剂。在某些实施方案中，可以将Apo A-I Milano(Apo A-I Milano)与脂质复合。
人Apo A-I Milano是ApoA-1的天然变型(Weisgraber等人，1980，J.Clin.Inves t.66：901-907)。在Apo A-I Milano中，氨基酸精氨酸(Arg 173)被氨基酸半胱氨酸(Cys 173)代替。因为Apo A-I Milano每根多肽链包含一个半胱氨酸残基，所以其可以以单体、同型二聚体、或杂二聚体(heterodimeric)形式存在。(见，US专利5,876,968，其在这里被全部引入作为参考)。这些形式可以化学相互转化，且术语Apo A-I Milano在这些形式之间没有差异。在DNA水平上，该变型形式是在基因序列中通过从C至T取代，即密码子CGC变成TGC，从而使得半胱氨酸(Cys)代替第173位氨基酸的精氨酸(Arg)进行转录来产生的。
在某些实施方案中，该Apo A-I Milano可以是一种变型或保守取代的Apo A-I Milano。保守取代指的是Apo A-I Milano的某些氨基酸残基可以在不会显著对该蛋白的活性产生有害影响的情况下被其它氨基酸残基代替。因此，本发明还考虑其中该结构中至少一个确定的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的Apo A-I Milano的改变或被取代形式。为了确定保守氨基酸取代，可以方便地主要根据该氨基酸侧 链的物理-化学特性将该氨基酸分类成两种主要的类型--亲水性和疏水性。可以将这两种主要类型进一步分成一些小类，这些小类对该氨基酸侧链进行了更明确的定义。例如，亲水性氨基酸可以进一步被细分为酸性、碱性和极性氨基酸。疏水性氨基酸可以进一步被细分为非极性和芳族氨基酸。定义了结构(I)的各种氨基酸类的定义如下：
“亲水性氨基酸”指的是根据Eisenberg等人，1984，J.Mol.Biol179：125-142的标准化一致性疏水性标度(normalized consensushydrophobility scale)表现出小于零的疏水性的氨基酸。遗传上编码的亲水性氨基酸包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。
“酸性氨基酸”指的是具有小于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于失去了氢离子，所以酸性氨基酸在生理学pH下通常具有荷负电的侧链。遗传上编码的酸性氨基酸包括Glu(E)和Asp(D)。
“碱性氨基酸”指的是具有高于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于缔合了水合氢离子，所以碱性氨基酸在生理学pH下通常具有荷正电的侧链。遗传上编码的碱性氨基酸包括His(H)、Arg(R)和Lys(K)。
“极性氨基酸”指的是在生理学pH下不带电，但是具有至少一种其中两个原子共享的电子对离其中一个原子更近的键的亲水性氨基酸。遗传上编码的极性氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)Ser(S)和Thr(T)。
“疏水性氨基酸”指的是根据Eisenberg，1984，J Mol.Biol.179：125-142标准化一致性疏水性标度表现出高于零的疏水性的氨基酸。遗传上编码的疏水性氨基酸包括Pro(P)、Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)和Tyr(Y)。
“芳族氨基酸”指的是具有有至少一个芳族或杂芳族环的侧链的疏水性氨基酸。所说的芳族或杂芳族环可以包含一个或多个取代基如--OH、--SH、--CN、--F、--Cl、--Br、--I、--NO2、--NO、--NH2、--NHR、--NRR、--C(O)R、--C(O)OH、--C(O)OR、--C(O)NH2、--C(O)NHR、--C(O)NRR等，其中各R独立地是(C1-C6)烷基、被取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)链烯基、被取代的(C1-C6)链烯基、(C1-C6)炔基、被取代的(C1-C6) 炔基、(C5-C20)芳基、被取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、被取代的(C6-C26)烷芳基、5-20员杂芳基、被取代的5-20员杂芳基、6-26员烷基杂芳基或被取代的6-26员烷基杂芳基。遗传上编码的芳族氨基酸包括Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
“非极性氨基酸”指的是具有在生理学pH条件下不带电荷和具有其中两个原子共享的成对电子被两个原子各自相等地持有的键的侧链的疏水性氨基酸(即，该侧链是非极性的)。遗传上编码的非极性氨基酸包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。
“脂族氨基酸”指的是具有脂族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传上编码的脂族氨基酸包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。
氨基酸残基Cys(C)不常见，这是因为其可以与其它Cys(C)残基或其它包含硫烷基的氨基酸形成双硫桥。Cys(C)残基(和其它具有包含--SH侧链的氨基酸)以还原的游离--SH或被氧化的双硫桥形式在肽中存在的能力影响着Cys(C)残基对于肽贡献净疏水性还是亲水性特性。虽然根据Eisenberg(Eisenberg，1984，同上)的标准化一致性标度Cys(C)表现出0.29的疏水性，但应当清楚的是对于本发明的目的而言，尽管上面定义了其一般性分类，但是Cys(C)在本发明中被归类为极性亲水性氨基酸。
正如本领域技术人员将意识到的那样，上述分类并不是要相互排除。因此，具有表现出两种或多种物理-化学性质的侧链的氨基酸可以被包括在多类中。例如，具有被极性取代基诸如Tyr(Y)进一步取代的芳族部分的氨基酸侧链可能既表现出芳族的疏水性又表现出极性或亲水性，因此既可以被包括在芳族类氨基酸中又可以被包括在极性氨基酸中。任何氨基酸的适宜分类对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且尤其是根据这里提供的详细公开将是显而易见的。在某些实施方案中，Apo A-I Milano被取代的或被改变的形式不是Apo A-I。
本发明所用的Apo A-I Milano可以得自任何可获得的来源。例如，该Apo A-I Milano可以是重组、合成、半合成或精制Apo A-I Milano。在一个优选的实施方案中，该Apo A-I Milano可以是US专利US 5,721,114和欧洲专利EP 0 469 017和EP 0 267 703(其在这里被全部引入作为参考)中所述的在酵母菌或大肠杆菌表达的重组蛋白(rApoA-I Milano)。获得本发明所用Apo A-I Milano的方法是现有技术中众所周知的方法。例如，Apo A-I Milano可以分离自血浆，例如通过密度梯度离心法，然后通过脂蛋白的脱脂、还原、变性和凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、疏水性例如苯基琼脂糖相互作用色谱法或免疫亲合色谱法来进行分离或者可以合成、半合成制备或者用本领域技术人员已知的重组DNA技术和随后进行现有技术人员熟悉的纯化来进行制备。(见，例如，US专利6,107,467；6,559,284；6,423,830；6,090,921；5,834,596；5,990,081；6,506,879，Mulugeta等人，1998，J.Chromatogr.798(1-2)：83-90；Chung等人，1980，J.Lipid Res.21(3)：284-91；Cheung等人，1987，J.LipidRes.28(8)：913-29；Persson，等人，1998，J.Chroma togr.711：97-109；US专利5,059,528、5,834,596、5,876,968和5,721,114；以及PCT公开物WO 86/04920和WO 87/02062)。
如果所说的Apo A-I Milano是由天然来源获得的，则其可以得自任何种属的任何动物来源。在某些实施方案中，Apo A-I Milano可以得自哺乳动物来源。在某些实施方案中，Apo A-I Milano可以由人获得。在本发明优选的实施方案中，Apo A-I Milano得自与Apo A-IMilano被给药的个体的种属相同的种属。在一个优选的实施方案中，Apo A-I Milano是重组的Apo A-I Milano蛋白(rApo A-I Milano)。
5.4.给药方法
所说的Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂可以用本领域技术人员已知的可以确保其在循环中的生物利用度的任何适宜途径来进行给药。可以使用提供了治疗有效量本发明制剂的任何给药途径。给药途径可以由药物制剂的类型来表明。例如，可注射的制剂可以被胃肠外给药，非限制性地包括静脉内(IV)、肌内(IM)、真皮内、皮下(SC)、冠状动脉内、动脉内、心包、关节内和腹膜内(IP)注射。(见，例如，Robinson等人，1989，药物疗法：一种病理生理疗法，第2章，第15-34 页，其在这里被全文引入作为参考。)
在一个优选的实施方案中，所说的Apo A-I Milano：磷脂复合体或其药物制剂可以被胃肠外给药。在一个更优选的实施方案中，所说的胃肠外给药是静脉内给药。静脉内给药可以为推注形式，例如在约2-3分钟内被给药或者可以为连续输入的形式，例如在约1小时内通过一种泵来进行给药，或者可以在约24小时内连续输入。在一个优选的实施方案中，输入时间为约1至约3小时。
所说的方法提供了这里所述药物制剂的静脉内输入。可以用任何适宜的血管作为输入部位，包括外周血管如手臂肘前窝处的血管或进入胸部的中线处的血管。
在优选的实施方案中，该药物制剂被输入到个体手臂肘前窝处头侧或正中的肘血管中。
在某些实施方案中，可以通过一种机械泵或传递装置，例如，心包传递装置( 
)或心肺分流机来进行给药。
5.5.脂质复合体
在某些实施方案中，本发明的方法包括给予Apo A-I Milano的脂质复合体。在某些实施方案中，本发明提供了Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物制剂。可以通过将脂质与Apo A-I Milano复合来增强功效。典型地在给药前将脂质与Apo A-I Milano混合。可以将Apo A-IMilano和脂质以适宜的比例在水溶液中进行混合并且可以用现有技术中已知的方法来对其进行复合，所说的方法包括冷冻干燥，清洁剂增溶然后透析、微流化、声处理、和匀化。可以通过例如改变压力、超声频率、或清洁剂浓度来对复合效率进行优化。制备Apo A-I Milano：磷脂复合体的常用清洁剂实例是胆酸钠。
在一些情况中，优选地在基本不含脂质的情况下单独给予Apo A-IMilano来治疗或预防急性冠状动脉综合征。在优选的实施方案中，将Apo A-I Milano：脂质复合体给药于需要其的个体。
在一个实施方案中，该Apo A-I Milano：磷脂复合体是具有适宜药用稀释剂的溶液。在另一些实施方案中，在给药前用适宜的药用稀释 剂对Apo A-I Milano：磷脂复合体的冷冻干燥或冻干制剂进行水合或重组。在另一实施方案中，Apo A-I Milano：脂质复合体是一种冷冻制剂，在被给药于需要其的个体前对其进行解冻直至获得一种均匀的溶液。
所说的脂质可以是本领域技术人员已知的任何适宜脂质。可以使用不含磷的脂质，包括硬脂酰胺、十二烷胺、棕榈酸乙酰酯、(1，3)-D-甘露糖基(mannosyl)-(1，3)甘油二酯、氨基苯基糖苷、3-胆甾醇基-6′-(葡硫基)己基醚糖脂、氯化N-(2，3-二(9-(Z)-十八烯氧基))-丙-1-基-N，N，N-三甲基铵和脂肪酸酰胺。在优选的实施方案中，所说的脂质是磷脂。
所说的磷脂可以得自本领域技术人员已知的任何来源。例如，所说的磷脂可以得自商业来源、天然来源或者可以用本领域技术人员已知的合成或半合成方法来获得(Me l′nichulc等人，1987，Ukr.Biokhim.Zh.59(6)：75-7；Mel′nichuk等人，1987，Ukr.Biokhim.Zh.59(5)：66-70；Ramesh等人，1979，JAm.OilChem.Soc.56(5)：585-7；Patel和Spa rr ow，1978，J.Chromatogr.150(2)：542-7；Kaduce等人，1983，J.Lipid Res.24(10)：1398-403；Schlueter等人，2003，Org.Lett.5(3)：255-7；Tsuji等人，2002，NipponYakurigaku Zasshi120(1)：67P-69P)。
在优选的实施方案中，所说的脂质可以是磷脂。该磷脂可以是本领域技术人员已知的任何磷脂。例如，该磷脂可以是小烷基链的磷脂、磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二月桂基磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、1-油酰基-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、二肉 豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、鞘脂类、脑鞘磷脂、二棕榈酰基鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、半乳糖脑苷脂、神经节苷脂、脑苷脂、磷脂酰甘油、磷脂酸、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、脑磷脂、心磷脂、磷酸二鲸蜡酯、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺和胆固醇以及其衍生物。
该磷脂还可以是上述任何一种磷脂的衍生物或类似物。在某些实施方案中，该Apo A-I Milano：磷脂复合体可包含两种或多种磷脂的组合。
在优选的实施方案中，本发明的方法提供了Apo A-I Milano：磷脂复合体的给药。在一个更优选的实施方案中，所说的脂质是磷脂，优选地是1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(“POPC”)或(“1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱”)。还是在一个更优选的实施方案中，所说的Apo A-I Milano：POPC复合体包含重量比约1∶1的Apo A-IMilano∶POPC。在一个最优选的实施方案中，所说的Apo A-I Milano：POPC复合体是一种药物制剂。所说的Apo A-I Milano：POPC复合体被称为ETC-216。
包含Apo A-I Milano和脂质的复合体可以包含可有效治疗或预防急性冠状动脉综合征的任何数量的脂质(优选磷脂)和任何数量的ApoA-I Milano。在某些实施方案中，该Apo A-I Milano可以包含重量比为约1∶约1的Apo A-I Milano和磷脂的复合体。但是，该Apo A-IMilano可以包含具有其它磷脂：Apo A-I Milano比例如约100∶1、约10∶1、约5∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶5、约1∶10和约1∶100(蛋白重量/脂质重量)的复合体。优选用约1∶0.5至约1∶3(蛋白重量/脂质重量)，更优选约1∶0.8至约1∶1.2(蛋白重量/脂质重量)的比例来制备最同质的群体和制备稳定和可再现的批次。在一个更优选的实施方案中，Apo A-I Milano与磷脂的比例为 1∶0.95(蛋白重量/脂质比例)。
可用于本发明方法的另外的脂质是本领域技术人员众所周知的并且在许多众所周知的资料中对其进行了列举，所说的资料例如McCutcheon′s清洁剂和乳化剂以及McCutcheon′s的功能性材料，Allured Publishing Co.，Ridgewood，N.J.，其在这里都被引入作为参考。
通常希望所说的脂质在37℃、35℃、或32℃下是液晶态。液晶态中的脂质通常可以比凝胶态的脂质更有效地接受胆固醇。因为个体的体内温度通常为约37℃，所以在37℃下为液晶态的脂质在治疗期间通常为液晶态。
5.6.脂质复合体的制备
所说的Apo A-I Milano：脂质复合体可以用本领域技术人员众所周知的方法来进行制备。在一些情况中，希望在给药前将脂质与Apo A-IMilano进行混合。脂质可以是溶液形式或者用标准技术如匀化、声处理或挤出形成的脂质体或乳剂形式。通常用tip超声波仪如Bransontip超声波仪在冰浴上来进行声处理。通常将混悬液进行几次声处理循环。可以用生物膜挤出机，如Lipex Biomembrane ExtruderTM(LipexBiomembrane Extruder，Inc.Vancouver，加拿大)来进行挤出。挤出滤器中确定的孔径可以产生特定大小的单层脂质体囊。还可以通过将其由不对称的陶瓷滤器，如通过商业途径得自Norton Company，Worcester Mass的Ceraflow MicrofilterTM或者通过聚碳酸酯滤器或本领域技术人员已知的其它类型的聚合材料(即塑料)挤出来形成脂质体。
Apo A-I Milano：脂质复合体可以被制备成许多形式，非限制性地包括囊泡、脂质体或脂蛋白体。可以用许多本领域技术人员众所周知的方法来制备Apo A-I Milano：脂质复合体。可以用许多可获得的技术来制备脂质体或脂蛋白体。例如，可以将Apo A-I Milano与适宜的脂质一起超声(使用一种浴或探针超声波仪)来形成脂质复合体。在某些实施方案中，可以将Apo A-I Milano与预先形成的脂质囊结合到一 起，从而自发形成载脂蛋白：脂质复合体。在另一实施方案中，还可以用清洁剂透析法来制备Apo A-I Milano；例如，可以对Apo A-IMilano、脂质和清洁剂如胆酸盐的混合物透析以除去所说的清洁剂，然后将其重组以制备所说的脂质复合体。(见，例如，Jonas等人，1986，Methods Enzymol.128，553-82)。
在另一些实施方案中，可以用US专利6,287,590和6,455,088所述的共冷冻干燥来制备所说的脂质复合体，两篇专利的内容在这里都被全部引入作为参考。在例如US专利6,004,925、6,037,323和6,046,166(其在这里都被全部引入作为参考)中公开了其它方法。制备Apo A-I Milano：脂质复合体的其它方法对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
在一个优选的实施方案中，所说的脂质复合体是通过匀化来进行制备的。在优选的实施方案中，当用注射用水将重组Apo A-I Milano稀释至15mg/ml的浓度时开始形成Apo A-I Milano：脂质复合体。向其中加入磷酸钠至9-15mM磷酸盐的终浓度并将其pH调至约7.0至约7.8。向其中加入甘露醇至约0.8％至约1％甘露醇(w/v)的终浓度。然后，向其中加入POPC从而得到一种约1：0.95(蛋白重量/脂质重量)的Apo A-I Milano二聚体：POPC混合物。在将其温度维持在37℃至43℃之间时用高架螺旋桨和Ultra Turrax将该混合物在5000rpm下搅拌约20分钟。在将其温度维持在32℃至43℃之间的同时用串联热交换器(Avestin，Inc.)将饲料容器在300rpm下连续搅拌。首先，在50MPa(7250psi)下匀化30分钟，其后，将其压力维持在80-120MPa(11600-17400psi)下直至用凝胶渗透色谱法在进行中进行分析时证明与蛋白标准品之间的％AUC＞70％。该复合体还可以被制备为10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml和14mg/ml的制剂，其中的重量是蛋白的重量。
5.7.联合治疗
在本发明的方法中，所说的Apo A-I Milano或脂质复合体或其药物制剂可以单独使用或者与其它干预联合进行治疗。该类疗法非限制 性地包括与其它药物同时或顺序给药。
在某些实施方案中，可以将本发明的方法和制剂与其它药物联用从而完成这里所提供的方法。共同给药的其它药物可用于治疗、预防或改善并发的疾病、情况、病症或症状，例如用抗心律失常药来治疗共存的心律失常。在某些实施方案中，所说的方法提供了用于治疗或预防伴有疼痛的急性冠状动脉综合征的共同给药。
如上所述的那样，用于包括心肌梗死、心绞痛和急性冠状动脉综合征在内的局部缺血性事件的常规疗法不是靶向于破裂或不稳定的动脉粥样硬化斑块的基础病理学。例如，出现心脏胸部不适或其它局部缺血性症状的个体可以用抗凝药或抗血栓形成药来准备突发的冠状血管经皮干预(PCI)，所说的药物如阿司匹林、氯吡格雷、肝素、依替巴肽或阿昔单抗。可以用β-肾上腺素能阻滞剂(β-阻滞剂)来降低心率。推荐给患有充血性心衰(CHF)或左心室(LV)机能障碍并发症的个体使用血管紧张素转化酶抑制剂(ACE抑制剂)。对于已经从突然的心源性死亡中复生的个体而言，推荐给其使用胺碘酮。常常给患者供氧，通常通过面罩或鼻套管来供氧，并对其生命体征密切进行监测，包括通过脉搏血氧定量法对氧饱和度进行监测。对于长期治疗而言，常常给该个体使用HMGCoA还原酶抑制剂类的它汀类物质(statins)以降低其LDC水平。
例如，可以将该Apo A-I Milano或脂质复合体或其药物制剂与其它药学活性药物一起给药，所说的其它药学活性药物非限制性地包括α/β肾上腺素能拮抗剂、肾上腺素能阻断剂、α-1肾上腺素能拮抗剂、β肾上腺素能拮抗剂、AMP激酶活化剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、抗心律失常药、血管舒张药、硝酸盐类、血管加压药、影响肌力药、利尿剂、抗凝剂、抗血小板聚集药、血栓溶解剂、治疗糖尿病的药物、抗氧剂、抗炎剂、胆汁酸螯合剂、它汀类、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、胆固醇还原剂/脂质调节剂、阻断花生四烯酸转化的药物、雌激素替代疗法、脂肪酸类似物、脂肪酸合成抑制剂、贝特类物质(fibrates)、组氨酸、 烟酸衍生物、过氧化物酶体增殖子活化剂受体激动剂或拮抗剂、脂肪酸氧化抑制剂、沙利度胺或噻唑烷二酮类(Drug Facts andComparisons，每月更新，2003年1月，Wolters Kluwer Company，St.Louis，MO；Physicians Desk Reference(第56版，2002)MedicalEconomics)。
可以与Apo A-I Milano、其脂质复合体或药物制剂的益处加和或协同起效的单独或联合使用的其它药物非限制性地包括：α/β肾上腺素能拮抗剂(“β-阻滞剂”)如carvediol 
拉贝洛尔HCl 
肾上腺素能阻断剂如胍那决尔 
胍乙啶 利血平、可乐定，( 
和Catapres- 
)；胍法辛 
胍那苄 
甲基多巴和甲基多巴乙酯(methyldopate) α-1肾上腺素能拮抗剂如多沙唑嗪 
哌唑嗪 
特拉唑嗪 和酚妥拉明 
β肾上腺素能拮抗剂如索他洛尔( 和 
)；噻吗洛尔 
普萘洛尔( 
和 
)；倍他洛尔 醋丁洛尔 
阿替洛尔 美托洛尔( 
和 
)；比索洛尔 卡替洛尔 艾司洛尔 
naldolol 
喷布洛尔 
和吲哚洛尔 
AMP激酶活化剂如ESP 31015(ETC-1001)；ESP 31084，ESP31085，ESP 15228，ESP 55016和ESP 24232；gemcabene(PD 72953和CI-1027)；和MEDICA 16；血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂如喹那普利 贝那普利 
卡托普利 
依那普利 雷米普利 
福辛普利 
莫昔普利 
赖诺普利( 和 
)；群多普利 培哚普利 
和血管紧张素II受体拮抗剂如candesaartan 
依贝沙坦 
氯沙坦 
缬沙坦 替米沙坦 
依普沙坦 
和奥美沙坦 
钙通道阻滞剂如硝苯地平( 
和Procardia )；维拉帕米( Covera- 
和 
)；地尔硫卓( 
和 )；尼莫地平 
氨氯地平 非洛地平 尼索地平 
苄普地尔 
依拉地平 
和尼卡地平 
抗心律失常药如各种奎尼丁类物质；普鲁卡因酰胺( 和 
)；利多卡因 
mexilitine 
妥卡尼 氟卡尼 
普罗帕酮 
莫雷西嗪 伊布利特 丙吡胺 
溴苄胺 胺碘酮 腺苷 多非利特 和地高辛 
血管舒张药如二氮嗪 肼屈嗪 
非诺多泮 
米诺地尔 和硝普盐 
硝酸盐类如硝酸异山梨醇酯；( 
和 
)；单硝酸异山梨醇酯( 
和 
)；硝酸甘油糊 
各种硝酸甘油贴剂；硝酸甘油SL 
Nitrolingual喷雾；和硝酸甘油IV 
血管加压药如去甲肾上腺素 
和苯福林(Neo- 
)；影响肌力药如氨力农 
多巴胺 
多巴酚丁胺 肾上腺素 
isoproternol 
米利酮 利尿剂如螺内酯 托塞米 
氢氟噻嗪 氯噻嗪 依他尼酸 氢氯噻嗪( 
和 )；阿米洛利 氯噻酮( 
和 
)；布美他尼 
呋塞米 
吲达胺 
美托拉宗 
氨苯蝶啶 
以及氨苯蝶啶和氢氯噻嗪( 
和 )的混合物；抗血栓形成药/抗凝剂/抗血小板药如比伐卢定 来匹卢定 各种肝素；达那肝素 
各种低分子量的肝素；dalteparin 依诺肝素 
tinzaparin 华法林 双香豆素 
茴茚二酮 
阿司匹林；阿加曲班 
阿昔单抗 
依替巴肽 替罗非班 氯吡格雷 噻氯匹定 
和双嘧达莫 血栓溶解剂如阿替普酶 
组织纤溶酶原活化剂(TPA) 阿尼普酶，APSAC 瑞替普酶，rPA 
链激酶，SK 
尿激酶 
治疗糖尿病药如甲福明 
格列吡嗪 
氯磺丙脲 醋磺己脲 妥拉磺脲 
glimepride 
格列本脲( 
和 
)；阿卡波糖 
米格列醇 
repaflinide 那格列奈 
罗格列酮 
和吡咯列酮 抗氧剂和抗炎剂；胆汁酸螯合剂如消胆胺( 和 
)；考来替泊 和考来维仑 它汀类物质(抑制HMGCoA还原酶的药物)如rovastatin 
氟伐它汀 
阿伐它汀 
洛伐它汀 
普伐他汀 
和辛伐它汀 
CETP抑制剂；阻断花生四烯酸转化的药物：雌激素替代疗法；脂肪酸类似物如PD 72953、MEDICA 16、ESP 24232、和ESP 31015；脂肪酸合成抑制剂；脂肪酸合成抑制剂；脂肪酸氧化抑制剂，雷诺嗪 
贝特类物质如氯贝特(Atromid- )；吉非罗齐 
微粉化非诺贝特胶囊 苯扎贝特和环丙贝特；组氨酸；烟酸衍生物如烟酸长效释放片剂 
过氧化物酶体增殖子活化剂受体激动剂和拮抗剂；沙利度胺 
和在US专利6,459,003、6,506,799和公开号为20030022865、20030018013、20020077316、以及20030078239的美国专利申请(它们在这里都被引入作为参考)中所述的化合物。
可以与Apo A-I Milano或其脂质复合体或其药物制剂的有益作用加和或协同的其它单独或联用的药物包括例如抗增生药如紫杉醇和托泊替康(Brehm等人，2001，Biochemical Pharmacology，61(1)： 119-127)和抗炎药如甾族和非甾族抗炎剂(包括环氧合酶-2(COX-2)抑制剂)。
5.8.药物制剂
本发明一方面提供了一些通过使用包含Apo A-I Milano的药物制剂来用于治疗、降低或预防由急性冠状动脉综合征造成的损伤的制剂。在优选的实施方案中，将Apo A-I Milano(Apo A-I Milano)与脂质复合。在一个更优选的实施方案中，将Apo A-I Milano与POPC复合。
可以以药物制剂的形式将Apo A-I Milano或其脂质复合体进行给药。这里所述的药物制剂包含加入的例如可药用的稀释剂、赋形剂、基质或载体。如现有技术中已知的那样，加入一种或多种稀释剂、赋形剂、基质或载体可以提供适于给药于个体的制剂并且其还可提供其它有利性质如延长保存期。
该药物制剂典型地包含可药用的载体或基质。可以使用许多可药用的载体或基质。这里所述的实例利用了蔗糖-甘露醇。常常用生理盐水作为药用载体或基质。其它适宜的载体或基质包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖、无菌水、进行了缓冲的水、0.45％盐水(半生理盐水)、和0.3％甘氨酸，并且还可包括用于增强稳定性的糖蛋白，如白蛋白。可以用众所周知的常规灭菌技术对这些制剂进行灭菌。可以将所得的水溶液在无菌条件下进行包装以便应用或将其过滤并将其冷冻干燥(冻干)。然后在给药前将该冷冻干燥制剂与无菌水溶液相结合。
该药物制剂还可根据需要包含可药用的赋形剂以接近生理学条件，如pH调节剂和缓冲剂，和张度调节剂，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、和氯化钙。可以向其中加入抗菌剂例如苯酚、苯扎氯铵或苄索氯铵以维持产品的无菌性，对用于多剂量胃肠外应用的药物制剂而言尤其如此。在本发明的制剂中还可以使用混悬液、稳定和/或分散剂。
该药物制剂还可以包含盐形式的载脂蛋白(Apo A-I Milano)。例如，因为这些蛋白可能包含酸性和/或碱性末端和/或侧链，所以药物制剂中的Apo A-I Milano可以为游离酸或碱形式或者可以为可药用盐形式。可药用的盐可包括能与Apo A-I Milano形成盐的适宜酸例如无机 酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸等；和有机酸如甲酸、醋酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸等。能与Apo A-I Milano形成盐的适宜碱可包括例如无机碱如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等；和有机碱如单-、二-和三-烷基胺(例如三乙胺、二异丙基胺、甲胺、二甲胺等)和任选地被取代的乙醇胺类(例如乙醇胺、二乙醇胺等)。
该药物制剂可以为适于任何给药途径的各种形式，非限制性地包括胃肠外、肠内、局部或吸入给药。胃肠外给药指的是不通过消化道的任何给药途径，非限制性地包括注射给药(即这里所述的静脉内、肌内等)。肠内给药指的是使用消化道、口腔或直肠的任何给药途径，非限制性地包括这里所述的片剂、胶囊、口服溶液、混悬液、喷雾剂等。对于本申请的目的而言，本文中的肠内给药还涉及阴道给药。局部给药指的是通过皮肤进行的任何给药途径，非限制性地包括乳膏、软膏、凝胶和经皮贴剂(还可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro等人编辑)Mack Printing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。
本发明的胃肠外药物制剂可以通过注射例如注射到静脉(静脉内)、动脉(动脉内)、肌肉(肌内)内、皮肤下(皮下或储库制剂)、心包中、冠状动脉内来进行给药。可注射的药物制剂可以是可直接给药于心脏、心包或冠状动脉内的适宜药用的制剂。在优选的实施方案中，该药物制剂被输入到个体的外周血管中，例如被输入到手臂或肘前窝处的血管中。
可注射的药物制剂可以是无菌的位于水性或油性基质中的混悬液、溶液或乳剂。注射用制剂可以以单位剂型形式存在，例如存在于安瓿中或多剂量容器中，并且可以包含所加入的防腐剂。胃肠外药物制剂优选的缓冲剂有磷酸盐、枸橼酸盐和醋酸盐。
在另一些实施方案中，该药物制剂可以为在使用前用适宜基质重组的粉末形式，所说的适宜基质非限制性地包括无菌无热源的水、盐水 或葡萄糖。为此，可以如上所述的那样根据适宜的情况将Apo A-IMilano冷冻干燥或者将其与脂质一起冷冻干燥。在另一实施方案中，该药物制剂可以以单位剂型形式被供给并在使用前被重组。
对于长期传递而言，该药物制剂可以以储库制剂的形式被提供，用于通过植入；例如通过皮下、真皮内、或肌内注射被给药。因此，例如，可以用适宜的聚合或疏水性材料来对该药物制剂进行制备(例如将其制备为位于可接受油中的乳剂形式)或者用离子交换树脂对其进行配制，或者将其制备成微溶的衍生物；例如Apo A-I Milano微溶的盐形式或Apo A-I Milano：脂质复合体。
在另一些实施方案中，该药物制剂是一种被制造为可以缓慢释放活性成分进行经皮吸收的粘着的圆盘或贴剂形式的经皮传递系统。在这种实施方案中，可以用渗透促进剂来促进Apo A-I Milano的经皮渗透。在另一实施方案中，该经皮药物制剂还可包含用于心绞痛患者的硝酸甘油。
对于吸入给药而言，该药物制剂可以通过气雾剂喷雾由加压包装或使用适宜推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体的雾化器被传递。在加压气雾剂的情况中，可以通过提供一种传递计量数量的阀，例如计量剂量的吸入器来确定该剂量单位。例如用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和药筒可被制备成包含Apo A-I Milano和适宜粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
如果需要的话，该制剂可以存在于包含一种或多种含有Apo A-IMilano药物制剂的单位剂型的包装或分配装置中。该包装例如可包括金属或塑料箔，例如水疱眼包装。所说的包装或分配装置可以伴有用于说明如何进行给药的说明或标签。
在某些实施方案中，ApoAI-M or Apo A-I Milano：脂质复合体的药物制剂可包含浓度足以对需要其的个体进行治疗的Apo A-IMilano。在某些实施方案中，Apo A-I Milano或Apo A-I Milano：脂质复合体的药物制剂可包含浓度为约5mg/ml至约50mg/ml的Apo A-IMilano。在优选的实施方案中，该制剂包含的Apo A-I Milano浓度为 约10mg/ml至约20mg/ml。在一个更优选的实施方案中，该制剂包含的Apo A-I Milano浓度为约13mg/ml至约16mg/ml。可以用本领域技术人员已知的任何适宜技术来确定Apo A-I Mi lano的浓度。在某些实施方案中，用分子排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)来确定Apo A-IMilano的浓度。
在某些实施方案中，ApoAI-M或Apo A-I Milano：脂质复合体的药物制剂可包含浓度足以与Apo A-I Milano形成复合体的脂质。在某些实施方案中，该脂质是磷脂。在优选的实施方案中，该脂质是POPC。在某些实施方案中，Apo A-I Milano或Apo A-I Milano：脂质复合体的药物制剂可包含浓度为约1mg/ml至约50mg/ml的POPC。在优选的实施方案中，这些制剂中POPC的浓度为约5mg/ml至约25mg/ml。在一个更优选的实施方案中，该制剂中POPC的浓度为约10mg/ml至约20mg/ml。在一个更优选的实施方案中，制剂的POPC浓度为约11mg/ml至约17mg/ml。可以用本领域技术人员已知的任何适宜技术来确定POPC的浓度。在某些实施方案中，用高效液相色谱法来确定POPC的浓度。
在优选的实施方案中，Apo A-I Milano：脂质复合体的药物制剂包含数量足以制备适宜药用的Apo A-I Milano或Apo A-I Milano：脂质复合体制剂的蔗糖。在某些实施方案中，该药物制剂包含约0.5％至约20％的蔗糖。在某些实施方案中，该药物制剂包含约3％至约12％的蔗糖。在某些实施方案中，该药物制剂包含约5％至约7％的蔗糖。在优选的实施方案中，该药物制剂包含约6.0％至约6.4％的蔗糖。在一个最优选的实施方案中，该药物制剂包含6.2％的蔗糖。
在优选的实施方案中，Apo A-I Milano：脂质复合体的药物制剂包含数量足以制备适宜药用的Apo A-I Milano或Apo A-I Milano：脂质复合体制剂的甘露醇。在某些实施方案中，该药物制剂包含约0.01％至约5％的甘露醇。在某些实施方案中，该药物制剂包含约0.1％至约3％的甘露醇。在某些实施方案中，该药物制剂包含约0.5％至约2％的蔗糖。在优选的实施方案中，该药物制剂包含约0.8％至约1％的甘 露醇。在一个最优选的实施方案中，该药物制剂包含0.9％的甘露醇。
在某些实施方案中，Apo A-I Milano：脂质复合体的药物制剂包含数量足以制备适宜药用的Apo A-I Milano或Apo A-I Milano：脂质复合体制剂的缓冲剂。在某些实施方案中，该药物制剂包含磷酸盐缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂浓度为约3mM至约25mM。在某些实施方案中，缓冲剂浓度为约5mM至约20mM。在优选的实施方案中，缓冲剂浓度为约8mM至约15mM。在某些实施方案中，向其中加入适宜的缓冲剂以将药物制剂的pH调节至适于给药于个体的范围内。在某些实施方案中，该药物制剂具有约6.8至约7.8的pH。在某些实施方案中，该药物制剂具有约7.0至约7.8的pH。在某些实施方案中，该药物制剂具有约7.2至约7.5的pH。在优选的实施方案中，该药物制剂具有约7.5的pH。
在某些实施方案中，Apo A-I Milano：脂质复合体的药物制剂具有适于给药于个体的重量摩尔渗透压浓度。在某些实施方案中，该制剂的重量摩尔渗透压浓度为约200至约400mOsm。在某些实施方案中，该药物制剂的重量摩尔渗透压浓度为约220至约380mOsm。在某些实施方案中，该药物制剂的重量摩尔渗透压浓度为约260mOsm至约340mOsm。在优选的实施方案中，该药物制剂的重量摩尔渗透压浓度为约280mOsm至约320mOsm。在一个最优选的实施方案中，该药物制剂的重量摩尔渗透压浓度为约290mOsm。
本发明的制剂提供了具有使得可以给药于个体的足够纯的Apo A-IMilano：脂质复合体。在某些实施方案中，该药物制剂以约98％或更高、约96％或更高、约95％或更高、约93％或更高、约91％或更高或约90％或更高的纯度包含Apo A-I Milano。在优选的实施方案中，Apo A-I Milano的纯度为约90％或更高。可以用本领域技术人员已知的任何适宜技术来确定Apo A-I Milano的纯度。在某些实施方案中，可以用分子排阻HPLC来确定Apo A-I Milano的纯度。
本发明的制剂提供了一种具有使得可以给药于个体的足够纯的POPC的Apo A-I Milano：脂质复合体。在某些实施方案中，该药物制 剂以约98％或更高、约96％或更高、约95％或更高、约93％或更高、约91％或更高或约90％或更高的纯度包含POPC。在一个优选的实施方案中，POPC的纯度高于约90％。可以用本领域技术人员已知的任何适宜技术来确定POPC的纯度。在某些实施方案中，可以用HPLC来确定POPC的纯度。
在某些优选的实施方案中，该Apo A-I Milano：脂质复合体具有约10％或更低、约8％或更低、约6％或更低、约4％或更低、约2％或更低、约1％或低于氧化亚铁/二甲苯酚橙色分析(Jiang，等人，1992，Anal.Biochem 202：384-389)的检测限的过氧化氢脂质数量。在某些实施方案中，在用凝胶渗透色谱法测定时，该Apo A-IM：POPC复合体具有高于85％的纯度(以总峰面积％的形式测定的)。在某些实施方案中，该制剂几乎没有或没有内毒素。在优选的实施方案中，该制剂的内毒素＜0.04EU/mg Apo A-I Milano。
在某些实施方案中，在用不透光度进行测定时，该制剂粒度高于10μm的微粒的数量为每个50mL的小瓶＜约6,000个。在某些实施方案中，在用不透光度进行测定时，高于25μm的微粒的数量为每个50mL的小瓶＜约600个。
在一个优选的实施方案中，该Apo A-I Milano：脂质复合体药物制剂是通过用注射用水将rApo A-I Milano稀释至15mg/ml的浓度来进行制备的。向其中加入磷酸钠至9-15mM磷酸盐的终浓度并且将其pH调至约7.0至约7.8。向其中加入甘露醇至约0.8％至约1％的甘露醇(w/v)浓度。然后，向其中加入POPC，从而使得Apo A-I Milano二聚物与POPC的比例为1∶0.95(蛋白重量/脂质重量)。在将其温度维持在37℃至43℃的同时，用高架螺旋桨和Ultra Turrax在5000rpm下将该混合物搅拌约20分钟。在将其温度维持在32℃至43℃之间的同时用串联热交换器(Avestin，Inc.)将饲料容器在300rpm下连续搅拌。首先，在50MPa(7250psi)下匀化30分钟，其后，将其压力维持在80-120MPa(11600-17400psi)下直至用凝胶渗透色谱法在进行中进行分析时证明与蛋白标准品之间的％AUC＞70％。然后，通过加入 6.0％至6.4％的蔗糖来将该复合体的重量摩尔渗透压浓度调节至约。然后，通过用0.22μM滤器过滤来对该Apo A-I Milano：POPC复合体的药物制剂进行灭菌。
在另一个优选的实施方案中，该药物制剂包含约12至约18mg/ml重组的Apo A-I Milano、约11至约17mg/ml 1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(pH 7.4)、6.2％的蔗糖和0.9％的甘露醇，其重量摩尔渗透压浓度为约280mOsm至约320mOsm。该药物制剂具有纯度为约90％的rAPO A-I-M、纯度为约97％的POPC。在某些实施方案中，没有任何一种杂质的纯度高于约2％。
该药物制剂可以被冷冻储存(约-15℃至约-25℃)。在某些实施方案中，该制剂可以是冷溶液、被冷冻的溶液或被冷冻干燥的溶液。优选地在给药于个体前将该类制剂解冻并使之加温至室温。建议温和解冻和加温以避免蛋白变性。
在另一个优选的实施方案中，该制剂位于约2mL至约250mL，优选约10mL至约100mL，最优选约50mL的无菌玻璃小瓶中，所说的小瓶包含含有Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物制剂。在某些实施方案中，该药物制剂以每个小瓶约39至41ml的最终填充体积包含约10mg/mL至约15mg/mL的Apo A-I Milano：磷脂复合体。Apo A-IMilano：磷脂复合体的数量可以为每个50ml的小瓶约500mg至750mg。
该药物制剂可用于单独、一次应用或者可如上所述那样包含抗菌剂，从而使得该药物制剂适于多次应用，例如一种多次应用小瓶。在某些实施方案中，该药物制剂可以是应用单位包装。正如本领域技术人员公知的那样，应用单位包装是一种标明由提供健康护理的人直接分配的具有方便的处方大小的患者可以容易应用的单位。应用单位包装包含对于给定适应症而言典型治疗时间间隔和持续时间所必需数量的药物制剂。本发明的方法和制剂提供了包含以15mg/kg的剂量每周给药一次给药5周对平均尺度的成年男性或女性进行治疗时足够的Apo A-I Milano：磷脂复合体数量的药物制剂的应用单位包装。在一个 实施方案中，该应用单位包装包含含有数量足以以45mg/kg的剂量每周治疗一次对平均尺度的成人个体治疗6周的Apo A-I Milano：磷脂复合体的药物制剂。对本领域技术人员显而易见的是这里所述的剂量是以个体的体重为基础的。
可以给该药物制剂贴标签并且其可具有用于确定包含于其中的制剂和在心血管和血管病症、急性冠状动脉综合征、局部缺血性病症的治疗和预防以及用于对斑块进行稳定时对提供健康护理的人和个体有用的其它信息的伴随标签，所说的其它信息非限制性地包括使用说明、剂量、给药间隔、持续时间、适应症、禁忌症、警告、预防措施、处理和储存说明等。
在另一些实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防心血管和血管病症、急性冠状动脉综合征、局部缺血性病症和用于稳定斑块的试剂盒。该试剂盒包含一种或多种Apo A-I Milano或Apo A-I Milano：脂质复合体或其药物制剂的有效剂量，还具有一种标签或贴标签，在所说的标签上表明了根据本发明的方法将Apo A-I Milano或Apo A-IMilano：脂质复合体或其药物制剂用于治疗或预防急性冠状动脉综合征。在某些实施方案中，所说的试剂盒可包含用于进行所说方法的组分，如用于传递Apo A-I Milano或Apo A-I Milano：脂质复合体或其药物制剂的装置和用于对这些装置安全进行处理的组分，例如锋利的(sharps)容器。在某些实施方案中，所说的试剂盒在预填充的注射器、单位剂量或应用单位包装中包含ApoA-I Milano或Apo A-I Milano：脂质复合体或其药物制剂。
6.实施例
通过参考下面非限制性的实施例可以进一步理解本发明。
6.1.实施例1：ETC-216的耐受性
本实施例在健康志愿者中证明了ETC-216的安全性和耐受性。
进行一种双盲安慰剂对照研究来确定Apo A-I Milano和磷脂的安全性和耐受性。以1∶1的重量比将Apo A-I Milano与磷脂(POPC)复合，其被称为ETC-216。该研究用健康男性志愿者对ETC-216单次静脉内 输入的五个逐步增加的剂量的安全性和耐受性进行了评估并用健康的女性志愿者在两个不同剂量下对安全性和耐受性进行了评估。在研究前所有的志愿者都表示同意进行研究。
用ETC-216对年龄为18-50岁的32名健康志愿者(“个体”)进行静脉内给药。对男性个体而言，给药剂量高至并包括100mg/kg。对女性个体而言，给药剂量高至并包括50mg/kg。个体的性别、剂量和速率如下面的表1所示。
表1.
| 剂量 (mg蛋白/kg体重) | 个体数目 | 性别 | 输入速率 (mg/kg/min) |
| 0(安慰剂) | 3 | 男 | 1.67 |
| 0(安慰剂) | 2 | 男 | 1.25 |
| 5 | 3 | 男 | 1.67 |
| 15 | 3 | 男 | 1.67 |
| 50 | 3 | 男 | 1.67 |
| 75 | 3 | 男 | 1.25 |
| 100 | 3 | 男 | 1.25 |
| 0(安慰剂) | 1 | 女 | 1.67 |
| 0(安慰剂) | 2 | 女 | 0.83 |
| 15 | 3 | 女 | 1.67 |
| 15 | 3 | 女 | 0.83 |
| 50 | 3 | 女 | 0.83 |
不良事件监测包括临床实验室评估、医生检查和生命体征。在给药后对个体监测27天。
本研究的32名个体中有20名报告了不良事件，这些不良事件都是轻微至中度的不良事件。认为在两名或多名个体中发生的不良作用可能与研究药物的治疗有关。经历这些不良事件个体的这些不良事件和数目为淋巴细胞减少(11名个体)、白细胞增多(10名个体)、恶心(6名个体)、头痛和腹泻(4名个体)、呕吐(3名个体)以及腹痛和高甘油 三酯血症(2名个体)。大多数可能相关的不利事件(胃肠和白细胞病症)是男性个体在输入50mg/kg或100mg/kg ETC-216后报道的。认为用安慰剂进行处理的个体中发生的两种不利事件(低蛋白血症和肝功能异常)可能与研究治疗有关。没有死亡、严重的不利事件或由于不利事件而导致撤出。
如图1所示，在以15mg/kg和更高剂量给予ETC-216的单剂量后30分钟男性个体体内HDL未酯化的胆固醇血清水平升高。
在输入前到输入后高至27天内对血清中Apo A-I Milano的抗体滴度进行分析。在单剂量给药后在任何个体体内都没有显著的抗体应答。
约100小时的末端半衰期支持了用每7天的给药方案用人进行的初始多剂量研究的基本原理。
这些结果表明ETC-216在所有的剂量下都是安全的并且可以被良好耐受，而且没有发生严重的不利事件。
6.2.实施例2：ETC-16的不同剂量在动脉粥样硬化消退中的功效
本实施例证明了ETC-21615mg/kg和45mg/kg的剂量在消退患有急性冠脉综合征个体的冠状动脉粥样硬化中的功效。
这种研究是一种随机双盲安慰剂对照的多剂量研究，其通过用血管内超声进行评估对ETC-216对患有急性冠状动脉综合征个体的功效和安全性进行了评估。在开始任何特定的研究操作前，所有的个体都得到了Institutional Review Board(IRB)批准用于各参与机构的试服志愿书并表示同意。
合格的个体是这些在进行筛选前14天内被诊断患有急性冠状动脉综合征(不稳定心绞痛、非Q波心肌梗死或ST升高的心肌梗死)的个体并且其被安排进行了冠状动脉血管造影术和/或冠状血管经皮干预(PCI)并且在该操作后预期停留24-小时。如果主治医师认为其疾病过程很紧迫和/或认为有高风险的急性并发症，则将符合这种标准的个体排除在外。
第一功效终点是用血管内超声(IVUS)进行评估的一根目标(被成像 的)冠状动脉的30-80mm片段内粥样斑体积百分比的变化(治疗终点减预处理)。阳性结果被定义为用不包括零的置信区间(CIs)时粥样斑体积百分比的阴性变化。
第二功效终点是总粥样斑体积和平均最大粥样斑厚度的平均变化。用IVUS和血管造影术来确定第二功效终点。对IVUS而言，第二功效终点为：
1)用目标冠状动脉解剖学相当片段的所有切片的平均斑块面积测得的总斑块“体积”的标称变化(Nominal change)(治疗终点减预处理)；
2)目标冠状动脉解剖学相当片段的所有切片的平均最大斑块厚度的标称变化(治疗终点减预处理)；
3)最轻微和最严重疾病片段的“体积”：
a)斑块区域百分比最低的基准(被定义为疾病最轻微的片段)上10mm邻近切片的片段斑块“体积”的标称变化(治疗终点减预处理)；
b)斑块区域百分比最高的基准(被定义为疾病最严重的片段)上10mm邻近切片的片段斑块“体积”的标称变化(治疗终点减预处理)。
血管造影术的第二功效终点为：
1)所测量的所有冠状动脉片段中的平均冠状动脉管腔直径；
2)各治疗亚组中新血管造影损害的数目；
3)在治疗结束时出现一处或多处新血管造影冠状动脉损害的个体的比例；
4)预先存在的损害消退的部位的数目；
5)预先存在的损害发展的部位的数目；
6)任何预先存在的损害处表现出消退的个体的比例；
7)所有预先存在的损害都表现出“发展或没有变化”的个体的比例；
8)所有预先存在的损害都表现出“消退或没有变化”的个体的比例。
IVUS方法的分析如Nissen2001，Am.J.Cardiol.87：15A-20A(其在这里被全部引入作为参考)所述。简单地说，操作者将该IVUS录像带数字化，回顾该pullback并选择最远侧-分支的端点作为开始点来 进行分析，如图2(A)所示。随后，每30幅图像选择第30幅图象进行分析，其表示距离恰好为0.5mm的一系列横截面。最后进行分析的横截面是该序列中最接近冠状动脉左总干或冠状动脉右口的图象(临近的fiduciary部位)，如图2(B)-2(D)所示。在随访检查中用相同的界标重复该操作以确保在两个时间点对相同的片段进行分析。
进行直接的和衍生的I VUS测量。根据American College ofCa rdiology and European Society of Cardiology(Mintz等人，2001，J.Am.Coll.Cardiol.37：1478-92，其在这里被全部引入作为参考)的标准进行直接IVUS测量。使用National Institute of HealthImage 1.62(NIH public domain software)，操作者通过用扫描仪测量在IVUS图象中编码的1-mm网格标记来进行校准。对于各横截面而言，操作者手动测定面积以描绘血管管腔的前沿和外弹性膜边界(图3(A)-3(D))。还可以直接测量最大粥样斑厚度。之前已经对这些方法的精度和再现性进行了报道，证明在校准后，对于范围为3.24mm2至27.99mm2的精确钻孔的Lucite phantoms而言，平均IVUS横截面积测量在0.5％的实际大小内(Schoenhagen等人，2003，J.AmSoc.Echocardiogr.16：277-84，其在这里被全部引入作为参考)。多位观察者进行的测量的变异性表现出的标准偏差为2.9％。
衍生的IVUS测量包括以外弹性膜(EEM)面积减去管腔面积的形式来计算粥样斑面积。因为图象的横截面是以0.5-mm的间隔获得的，所以可以用Simpson法则计算总粥样斑体积，其是通过用平均粥样斑面积乘以单位为毫米的pullback长度来进行计算的。粥样斑体积百分比被计算为：(∑粥样斑面积/∑EEM面积)×100(见，例如Nissen等人，2003，JAMA 290：2292-2300)。在Cleveland Clinic Foundation在中心实验室用被设计用来降低测量变异性的标准方法来对冠状动脉血管造影术进行分析。通过将血管造影导管尖端的直径与其已知尺寸进行比较来对该系统进行校准。血管造影的终点是随后平均冠状动脉管腔直径与基准相比的变化。
57名个体每个第7天(±1天)随机接受15mg/kg ETC-216、45mg/kg ETC-216或体积相配的安慰剂，最多高至5次静脉内给药。以2∶2∶1的比例将个体随机分为15mg/kg ETC-216、45mg/kg ETC-216或安慰剂组。57名个体都完成了研究。
在约50分钟内静脉内输入15mg/kg的剂量并且在约150分钟内静脉内输入45mg/kg的剂量。由于出现了恶心，所以对于一些个体而言增加输入速率。所有的静脉内输入都是外周给予的。
用一些临床实验室参数对个体进行监测，所说的参数包括ETC-216的抗体水平、身体检查、生命体征、心电图(EKGs)和临床不利事件的频率和强度。每名患者进行两次血管造影术和IVUS。第一次是在完成最初的筛选检查后，第二次是在给予最后一次研究药物约2周(±7天)进行。
第一功效终点获得的阳性结果如下面的表2所述。在联合治疗组(患者接受15mg/kg或45mg/kg的ETC-216)，粥样斑体积百分比变化的均值(标准偏差或SD)为-1.06％(3.17％)。中值为-0.81％(95％CI，-1.53％至-0.34％；与基准相比p＝0.02。安慰剂组的该均值(SD)变化为0.14％(3.09％)。中值为0.03％(95％CI，-1.11％至1.43％；与基准相比p-0.97)
表2.目标冠状动脉片段中粥样斑体积百分比
1标准偏差。
2Interquartile范围。
3置信区间。
4Wilcoxon符号秩检验的组内比较P值。对于ETC-216的组间比较而言，将Apo A-I Milano：POPC联合与安慰剂进行比较，该比较是由与基准相比改变的秩的协方差进行分析进行的，用基准值作为共变量，p＝0.029。
5预定(Prespecified)的第一功效终点。
对第二终点而言，也获得了一些阳性结果，结果如下面的表3所示。与基准相比，联合治疗组总粥样斑体积的均值(SD)变化为-14.1mm3(39.5mm3；中值为-13.3mm3；95％CI，-20.7至-7.2；p＜0.001)。对于安慰剂组而言，相应的变化为-2.9mm3(23.3mm3)。该中值为-0.2mm3(23.3mm3)。该中值为-0.2mm3；95％CI，-8.6至8.2；p＝0.97)。联合治疗组相对于基准而言最大粥样斑厚度的变化均值(SD)为-0.042mm(0.080mm)。该中值为-0.035mm(95％CI，-0.058至-0.020；p＜0.002)。对安慰剂组而言，相应的变化为-0.008mm(0.061mm；中值-0.009(95％CI，-0.035至0.026；p＝0.83)。见下面的表4。
表3.目标冠状动脉片段中的总粥样斑体积
1Wilcoxon符号秩检验的组内比较P值。对于ETC-216的组间比较而言，将Apo A-I Milano：POPC联合与安慰剂进行比较，该比较是由 与基准相比改变的秩的协方差进行分析进行的，用基准值作为covariate，p＝0.018。
2预定(Prespecified)的第一功效终点。
表4.目标冠状动脉片段内的平均最大粥样斑厚度
1Wilcoxon符号秩检验的组内比较P值。对于ETC-216的组间比较而言，将Apo A-I Milano：POPC联合与安慰剂进行比较，该比较是由与基准相比改变的秩的协方差进行分析进行的，用基准值作为covariate，p＝0.023。
2预定(Prespecified)的第一功效终点。
这些结果表明ETC-216可有效降低斑块大小。在两个治疗组都证明动脉粥样硬化发生了统计学显著的消退。
6.7.实施例3：活体外Langendorff
本实施例证明了ETC-216在再灌注的局部缺血性离体兔心脏中预防性的心脏保护作用。在本研究中使用得自Charles River的重约2-3kg的雄性新西兰白兔。选择雄性新西兰白兔作为本研究的适宜试验系统。用局部缺血-再灌注的离体兔心脏作为人心肌梗死模型。在送抵时，给动物指定独特的识别号码。
根据University of Michigan Committee on the Use and Careof Animals的指导方针将动物饲养在不锈钢笼子中。兽医护理是由 University of Michigan Unit for the Laboratory Animal Medicine提供的。American Association of Accreditation of LaboratoryAnimal Health Care认可了University of Michigan，并且用动物护理应用程序与Guide for the Care and use of Laboratory Animals，DHEW(NIH)Publ.No.86-23中的标准相一致。
ETC-216是重量比为1∶1的重组载脂蛋白A-I Milano/1-棕榈酰-2-油酰基磷脂酰胆碱复合体。ETC-216的储备液在每ml蔗糖甘露醇缓冲剂中包含14mg蛋白。因为蔗糖-甘露醇缓冲剂与Krebs-Henseleit缓冲剂不相容并且控制了单独使用甘露醇的任何独立作用，所以对ETC-216进行透析从而得到由2％葡萄糖的4mM磷酸盐(pH 7.4)溶液组成的背景缓冲剂。用Krebs-Henseleit缓冲剂对ETC-216进行稀释，从而使得药物浓度为0.45mg/ml。相似地对基质进行稀释。
剂量选择是以在Esperion′s人I期单剂量安全性临床试验中所用剂量的历史数据为基础的，在所说的试验中将高至100mg/kg的ETC-216给药于人。对于本方案中所概括的研究而言，0.5mg/ml的浓度大约等于给药于人的25mg/kg的静脉内剂量。
这些实验是用Langendorff装置对兔心脏进行灌注来进行的。通过颈脱位法使兔子丧失意识并迅速取出其心脏并将其连接到一根套管上以通过主动脉对其进行灌注。灌注介质由循环的Krebs-Henseleit缓冲剂(pH 7.4，37℃；“KH”)组成，使其与95％O2/5％CO2的混合物连续进行接触并以20-25ml/min的恒定速率对其进行传递。在该方案中通过与右心房相连的电极使心脏节奏均匀地跳动。起搏刺激是由实验室矩形波发生器(高于生理性起搏10％，持续时间为1msec，Grass588，Quincy，MA)传递的。向肺动脉中插入SilasticTM管以帮助收集肺动脉流出物(其代表了返回冠状窦中的冠状静脉情况)。将上腔静脉和下腔静脉以及肺静脉结扎以防止灌注液从该另外断开的血管流失。将左心室引流、热敏电阻探针、和乳胶气球通过左心房插入到其中并将其定位到左心室中。将填充了液体的乳胶气球与刚性管一起连接到 Miller Catheter压力传感器中从而使得可以测量左心室形成压。用蒸馏水扩大心室内的气球以得到约10mmHg的初始的左心室末期舒张压基准。用与主动脉插管侧枝相连的压力传感器来测量冠状动脉灌注压。因为冠状动脉灌注速率被维持恒定，所以把冠状动脉灌注压的改变作为冠状动脉阻力变化的指示剂。用与Polyview Software DataAcquisition System相接的多道记录仪如Grass Polygraph79D(Quincy，MA)来连续对所有的血液动力学参数进行监测。在实验期间，通过将心脏装入到温度受控的双腔玻璃室中并使灌注介质通过一种热储库和传递系统而将心脏温度维持在37℃。
该实验操作使用两个如下所示的治疗组。
组 治疗 实验物质 浓度(mg/ml)
1 局部缺血&再灌注 基质 0
2 局部缺血&再灌注 ETC-216 0.45
如图5所示那样对心脏进行实验处理。在诱导全心局部缺血前将离体心脏在含氧量正常(正常氧气水平)的条件下稳定20分钟。在这时，在最初10分钟内，使心脏与KH缓冲剂单独接触，然后将其再与包含基质(组1)或ETC-216(组2)的KH缓冲剂接触10分钟。然后，使心脏经历30分钟的局部缺血期，然后用包含基质(组1)或ETC-216(组2)的KH缓冲液对心脏再灌注60分钟。通过停止流入到心脏中的灌注液来诱导全心局部缺血，并通过打开泵恢复最初的流速来完成对心脏的再灌注。
在基准时(局部缺血前)所有组都从心脏收集肺静脉流出物的等分试样，并且从最初每分钟到高至每5分钟收集，和其后在再灌注期间每5分钟进行收集。对流出物的肌酸激酶浓度--一种组织损伤指数进行分析(图6)。肌酸激酶是由被不可逆损伤的细胞释放的细胞溶质酶。连续对心脏功能进行监测(图7)。
进行心脏终点测定：
1-心电图-心率(节奏均匀的)以探测是否存在心律失常；
2-左心室形成压(图8)(数据被表示为各组中所示数目心脏的均值 ±均值的平均标准误差)；
3-左心室dP/dt
4-左心室末期舒张压(图9)(数据被表示为各组中所示数目心脏的均值±均值的平均标准误差)；
5-冠状动脉灌注压(图10)(数据被表示为各组中所示数目心脏的均值±均值的平均标准误差)；
6-收集淋巴导液以测定再灌注前和再灌注后的组织肌酸激酶释放(图6)
在对实验方案进行总结时，将从各治疗组高至5个心脏获得的心脏活组织检查物立即浸入到液氮中并将其储存在-80℃下以用其进行随后的过氧化氢脂质分析。在对脂质过氧化物进行分析前将这些匀浆样品标准化成蛋白含量(图11)。
在此实施例中，ETC-216将心脏过氧化氢脂质降低了46％。
在完成指定的方案时，用2.5％戊二醛和1％LaCl3的0.1M sodiumcalcodylate缓冲剂(pH 7.4)将各组的两个心脏灌注3分钟。该趋渗的LaCl3在正常条件下被保留在血管腔系中被束缚到血管壁上并作为血管完整性的指示剂。通过LaCl3向血管外空间中的外渗来表明存在血管损伤。从左心室心肌上取下一些组织样品并将其切割成一些片段，并在侧面上约1mm进行测量。将这些样品在4℃下在上述缓冲剂中再固定2小时。其后，将这些样品在一系列乙醇中脱水并将其植入到EMbed-812(Electron Microscopy Sciences，Ft，华盛顿，PA)中。用Reichert超薄切片机将这些组织团(blocs)切片并将其放到formvar-涂覆的铜载网上，然后用4％醋酸双氧铀对其进行染色。用PhillipsCM-10电子显微镜对这些切片进行观察。
用透射电子显微镜检查来对得自各研究组的心肌样品进行检查。图象表明基质处理的心脏肌节结构被消灭并且存在一些痉挛区带。线粒体显著膨胀，同时具有一些断裂的晶体和趋渗包涵体。在ETC-216治疗的心脏中，肌节结构相对正常并且线粒体显得相对完整，其仅具有最小程度的膨胀。实际上不存在收缩带也与在对照心脏中观察到的这 些情况显著相反。ETC-216防止收缩区坏死的能力与观察到用ETC-216进行了预处理的心脏在再灌注时没有表现出LVEDP增加的观察结果相一致。收缩带坏死和LVEDP持续增加都与细胞内钙过载增加和不可逆的细胞损伤有关。出现Z-带的肌原纤维模糊和肌纤维结构的破裂是广泛损害的象征。预期到的其它形态学损害包括线粒体的嵴和基体破裂以及线粒体中大的电子密集体。两幅显微照片中的放大因子都是7900x(图12)。
肌酸激酶浓度分析(图6)表明在再灌注时存在酶释放到静脉流出物中的快相。与用ETC-216处理的心脏相比，对照心脏(用基质处理的心脏)表现出显著的肌酸激酶释放。此外，与对照心脏相比，ETC-216处理的心脏的左心室末期舒张压降低(图7和9)、左心室形成压升高(图8)、冠状动脉灌注压降低(图10)和过氧化氢脂质(LHP)降低(图11)。此外，ETC-216保护对抗了心肌中的形态变化(图12)。这些结果证明了当在局部缺血性事件前被给药时ETC-216的心脏保护作用。
6.4.实施例4：在LAD闭合的再灌注兔心脏中在100mg/kg的剂量下的急性和长期给药
本实施例证明了ETC-216在局部心肌缺血和再灌注的体内模型中的心脏保护作用。用选择雄性新西兰白兔作为本研究的适宜试验系统，因为这种兔子没有向心脏的侧支血液供应，从而使得其不必需使用心肌血流测定。在本研究中，在不同的兔子(通过冠状动脉结扎和再灌注而经历了30分钟的局部心肌缺血)组中使用不同的给药方案。使用两种给药方案。在第一种方案中，用ETC-216作为单一预处理进行了试验，其中就在开始局部缺血前，使心脏与100mg/kg的活性剂进行接触，而在第二个方案中，进行两次100mg/kg的预处理，一次在开始局部缺血前一天和一次在开始局部缺血前立即进行。这些方案如(图13)所示。本研究着眼于作为心脏保护剂的ETC-216在其中使兔心脏局部心肌缺血30分钟，然后再灌注最少4小时的体内研究中的作用。本实施例证明了当在局部缺血性事件后被给药时ETC-216是一种心脏保护剂。
本研究中所用的方法与University of Michigan Committee on theUse and Care of Animals的指导方针相一致。兽医护理是由University of Michigan Unit for Laboratory Animal Medicine提供的。American Association of Accreditation of LaboratoryAnimal Health Care许可了University of Michigan，并且动物护理应用程序与Guide for the Care and use of Laboratory AnimalsDHEW(NIH)Publ.No.86-23的标准相一致。
在本研究中使用得自Charles River的重约2-3kg的雄性新西兰白兔。在抵达时，给这些动物指定独特的识别号码。通过肌内给予甲苯噻嗪(3.0mg/kg)和氯胺酮(35mg/kg)的混合物，然后静脉内注射戊巴比妥钠(30mg/kg)来将兔子麻醉。通过静脉内注射戊巴比妥钠(30mg/ml)来维持麻醉。插入胶管管头的气管内插管，并将动物放到与室内空气通风换气的正气通气中。分离出右颈静脉并对其插管以进行ETC-216或匹配体积基质的给药。分离出右颈动脉并将其与MillarTM导管micro-tip压力传感器相连，所说的传感器就被放在主动脉瓣上以监测主动脉血压和获得压脉的第一导数(dP/dt)。在实验期间对lead II心电图进行监测。进行左胸廓切开术和心包切开术，然后确定左前降支(LAD)冠状动脉。将一根缝合丝线(3.0；Deknatel，FallRiver，MA)从该动脉下穿过来并将该缝合线的两端插入到一根短聚乙烯管中。在该缝合线的游离端上施加上拉张力时在该聚乙烯管上向下的压力压缩下面的冠状动脉，从而闭合了血管和产生了局部心肌缺血。将该闭合维持30分钟，其后释放该缝合线上的张力并抽出该聚乙烯管从而使得发生再灌注。通过在闭合血管分布区中存在一种区域和与存在透壁局部心肌缺血(ST-段升高)相一致的心电图改变来证实局部心肌缺血。
主要终点测定包括测量梗死大小占左心室的百分比和有风险面积的百分比(图14和15)。在对该研究进行总结时，给予被麻醉的兔子肝素(1,000U静脉内给药)，其后将其安乐死。将心脏切下来，然后将其制备成在Langendorff装置上用Krebs-Henseleit Buffer缓冲剂 以22-24ml/min的恒定速率通过主动脉进行灌注。用缓冲剂将这些心脏洗涤10分钟以确保该组织是清洁的。使45毫升1％氯化三苯基四唑鎓(TTC)在磷酸缓冲剂(pH 7.4)中的溶液通过心脏进行灌注。TTC用砖红色在有风险的区域中区别出了没有梗死的心肌，表明存在由于有活力的心肌组织中存在的辅酶对TTC还原所产生的甲腊沉淀。缺乏细胞溶质脱氢酶的被不可逆损伤的组织不能形成甲腊沉淀并且显现出淡黄色。在等同于诱导局部心肌缺血过程中被结扎面积的位置将左前降支(LAD)动脉结扎。停止灌注泵并通过与主动脉插管相连的侧枝口缓慢注射2ml 0.25％伊文思蓝的溶液。使该染料通过心脏10秒钟以确保染料相等分布。与有风险的区域相反，用出现伊文思蓝来区分没有出现局部缺血的左心室组织。将心脏从该灌注装置上取下来并在与垂直轴成将直角的方向上将其切成横切片。弃去右心室、尖端、和房组织。在透明的醋酸盐薄片上对各横切片的两面进行描绘。将该图象影印并放大。对这些影印本进行扫描并将其下载到Adobe PhotoShop(AdobeSystems Inc.，Seattle，WA)中。通过用Adobe Photo Shop Software计算占据各面积的象素数来确定正常左心室(NLV)无风险区域的面积、有风险区域的面积、和梗死面积。将有风险的总面积以占左心室百分比的形式进行表示。将梗死面积表示为有风险面积(ARR)的百分比(图14和15)。
用ETC-216(100mg/kg)或等体积的基质治疗一次(即急性治疗)或治疗两次(即长期治疗)的兔子左心室有风险区域的梗死百分比、左心室的梗死百分比、和左心室有风险区域的百分比。数据是均值±均值的平均标准误差，每组n＝6只动物。图14中的星号表示与相应对照有显著差异。
进行了其它终点测定。可以通过增加或降低心肌的氧利用量来影响最终的梗死面积。心肌氧代偿的两个重要决定因素是心率和压力负荷。心率-收缩压乘积(心率×平均动脉血压)提供了心脏心肌氧需求改变的近似值。因此，可以计算心率-收缩压乘积来确定观察到的梗死面积降低是否与该心率-收缩压乘积改变相关。在实验方案中连续对心率和 平均主动脉压进行监测并用这些数据来计算本研究中各实验组在特定时间点的心率-收缩压乘积。
与对照相比，在急性和慢性给药中，在用ETC-216处理的心脏中左心室的风险面积降低，但是，该结果在统计学上不显著。与对照相比，对急性和长期给药而言，在用ETC-216处理的心脏中，左心室有风险区域的梗死百分比和梗死百分比都被显著降低。这些结果表明当被急性和长期给药时，ETC-216都具有心脏保护作用。
可以对有风险和没有风险区域中心肌组织的肌酸激酶活性进行比较。该试验的原理是由于NAD等克分子还原成NADH而使得反应混合物在340nm下的吸收增加。吸收的改变速度直接与肌酸激酶活性成比例。在该试验操作的条件下每分钟产生一微摩尔NADPH的酶数量被定义为一个单位。
没有进行再灌注的长期缺乏血流(局部缺血)的心肌组织将发生形态学变化，特征为坏死同时出现炎症细胞。局部缺血诱导的细胞死亡的形态外观与由于再灌注而导致的细胞死亡的外观不同。后者的特征为有一些收缩带并且被称为收缩带坏死。保留得自各组的心脏组织并对其进行制备以对其进行电子显微镜检查。
局部缺血性再灌注损伤与有风险区域中的炎症细胞--主要是嗜中性白细胞积聚有关。髓过氧化物酶(MPO)是一种几乎仅存在于嗜中性白细胞中的酶(Liu等人，，J.Pha rmacol.Exp.Ther.287：527-537，1998)。因此，预期可以对得自心脏各区域的组织的MPO活性进行分析以表明其是否出现损伤。还预期与得自没有进行治疗的动物的风险区域的心脏组织相比，能降低炎性响应的干预将与再灌注的有风险区域中的MPO活性的降低有关。因此，与用基质处理的对照心脏相比，在用药物处理的心脏中将降低MPO活性的百分比(有风险的区域/无风险的区域)变化。
在该实验结束时，在一种初步的未进行控制的未进行校正的试验中测定了组织髓过氧化物酶(MPO)活性。从有风险的区域和无风险区域获得一些心脏组织样品，将其在0.5％溴化十六烷基三甲铵中匀化并将 其溶解于50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)中(还可参见Liu等人，，1998，J.Pha rmacol.Exp.Ther.287：527-537)。将该组织匀浆在4℃下在12,500g下离心30分钟。收集上清液并将其与位于50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)中的0.167mg/ml邻-联二茴香胺二盐酸盐(Sigma)和0.0005％H2O2进行反应。用分光光度法在460nm下测量吸收度的变化。将在25℃下每分钟水解1mmol H2O2的酶数量定义为MPO的一个单位。在这里没有给出的得自这种初步实验的结果表明用ETC-216处理和用基质处理的心脏在局部缺血性再灌注损伤方面没有差异，但是，该结果还需验证，例如通过与局部缺血性再灌注损伤前MPO水平进行比较来进行验证。
正如左心室有风险区域的梗死百分比和梗死百分比降低所证明的那样，用ETC-216处理的心脏被保护不受局部缺血性再灌注损伤的影响。两种给药方案都可产生心脏保护作用，所说的两种给药方案即在开始局部缺血前将ETC-216以100mg/kg的单剂量进行给药或者给予两个100mg/kg剂量的ETC-216，一个剂量在开始局部缺血前一天给药，和在局部缺血前立即给予第二个剂量。
6.5.实施例5：LAD闭合-再灌注兔心脏中急性给药最小有效剂量的确定
本实施例证明了当就在开始局部缺血前进行单次预处理时各种剂量ETC-216的预防功效。实施例2中的研究着眼于ETC-216在体内研究(其中使兔心脏局部缺血30分钟，然后将其在再灌注至少4小时)中作为心脏保护剂的作用。使用两种给药方案。在第一种方案中，以单次预处理的形式对ETC-216进行试验，其中就在开始局部缺血前使体循环中出现100mg/kg的该活性剂，而在第二种方案中，在开始局部缺血前一天和开始前立即以100mg/kg的剂量进行两次预处理。两种方案表明用100mg/kgETC-216处理一次或两次都具有心脏保护作用。
因此，以单次处理形式对ETC-216进行试验，其中就在开始局部缺血前使心脏与单剂量的活性剂或等体积的基质相接触以确定对心脏保 护的影响。用与实施例2中所用方法相同的方法对心脏进行分析。此外，还可用这种方案来发现治疗兔心脏保护其不受局部缺血影响的ETC-216的最小有效剂量。
为了确定ETC-216的最小有效剂量，使用与急性处理的方案相同的方案(见图13)，其中动物接受10、3或1mg/kg ETC-216或等体积基质的单次治疗，如图16所示。在10mg/kg治疗组中，对照组和治疗组中被表示为总左心室百分比的有风险区域(AAR)或局部缺血性区域相似(图17)。与用基质处理的兔子相比，用10mg/kgETC-216处理的兔子形成的梗死(被表示为AAR的百分比)更少(p＜0.0005)(图18)。当将该数据表示为总左心室百分比形式时也观察到了心肌梗死尺寸降低(p＜0.0001)(图17)。
用3mg/kg的剂量观察到了相似的结果。被表示为总左心室百分比形式的AAR在ETC-216处理和基质处理组之间是相似的(图17)。与用基质处理的兔子相比，用3mg/kg ETC-216处理的兔子形成的被表示为有风险区域百分比形式的梗死更少(p＜0.05)(图17)。当将该数据表示为总左心室百分比形式时观察到了心肌梗死尺寸降低(p＜0.05)(图17)。
剂量为1mg/kg时，注意到ETC-216和基质在用左心室百分比形式表示的AAR大小方面没有显著差异(图17)。在1mg/kg下，注意到这些组之间的AAR百分比(图17)和被表示为总左心室百分比形式的心肌梗死尺寸之间没有显著差异(图17)。
在图17中对由四个急性治疗组(即100、10、3和1mg/kg)的各组以及其各自的对照组获得的数据进行了概述。在这四组中各自梗死的AAR相似。在这四个给药方案中，与各对照相比，不管是用有风险区域百分比还是用左心室百分比的形式表示的，在100、10和3mg/kg的ETC-216剂量下梗死面积都有降低。相反，接受1mg/kg剂量的动物组中的梗死面积与各基质处理组中观察到的没有差异。
图18表示脂蛋白未酯化胆固醇瞬时变化的实施例。就在给予1、3、10或100mg/kg的ETC-216或基质前和给药后定期获取血样。表 示了有代表性的瞬时血清样品种获得的未酯化的胆固醇水平，其中用在线未酯化胆固醇分析通过一定尺度的凝胶过滤色谱法将血清脂蛋白分离出来。注意到在给予ETC-216后，尤其是以100mg/kg的剂量给药后45分钟时高密度胆固醇未酯化胆固醇升高并且尽管在静脉内给予ETC-216试验剂后实际上不存在未酯化的胆固醇，但是在10mg/kg下也有小幅度升高。还注意到在以10mg/kg或100mg/kg的ETC-216剂量给药后210和270分钟，极低密度脂蛋白未酯化胆固醇延迟性显著升高。还注意到在所评估的时间点，用3mg/kgETC-216剂量处理时脂蛋白未酯化胆固醇变化并不明显，但是，如图17所示，这种剂量也有心脏保护作用。
这些结果证明100mg/kg、10mg/kg和3mg/kg的剂量是ETC-216有效的预防剂量。
6.6.实施例6：在闭合-再灌注兔心脏中在开始LAD闭合后被给药时ETC-216防止了局部缺血-再灌注损伤
本实施例证明了在局部缺血性或闭合事件后被给药时ETC-216预防或降低局部缺血性再灌注损伤的功效。实施例2和3中的研究说明了在开始局部缺血前对心肌进行处理的预防益处。因此，为了确定ETC-216是否能在局部缺血后保护心肌，在给予试验物质或基质前将LAD闭合。在这种方案中，以单次处理形式对ETC-216进行试验，其中在局部缺血的最后5分钟期间进行给药和在再灌注的最初55分钟内进行给药使心脏与10mg/kg的活性剂或等体积的基质进行接触(图19)。对10mg/kg的治疗组而言，表示为总左心室百分比形式的AAR或局部缺血性区域与对照组相似(图20)。用ETC-216处理的兔子形成的梗死(以AAR百分比表示的)比用基质处理的兔子少(图20)。当将该数据表示为总左心室百分比时也观察到心肌梗死面积降低(p＜0.0005)(图20)。
本实施例证明在局部缺血性事件后单次给药治疗减轻或降低了局部缺血性再灌注损伤。
已经对本发明的各种实施方案进行了描述。说明书和实施例是为了 对本发明进行说明而不是要对其进行限制。实际上，对本领域技术人员显而易见的是可以对本发明所述的各种实施方案进行不脱离本发明精神或下述所附权利要求的范围的改变。
这里所列举的所有参考资料在这里都被全部引入作为参考。
Claims (74)
1.Apo A-IM:POPC复合体在制备抗急性冠状动脉综合征的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所说的Apo A-IM:POPC复合体以15mg/kg的剂量含在药物中。
3.如权利要求1所述的用途，其中所说的Apo A-IM:POPC复合体以45mg/kg的剂量含在药物中。
4.如权利要求1所述的用途，其中所说的Apo A-IM:POPC复合体以15mg/此至45mg/kg的剂量含在药物中。
5.如权利要求1所述的用途，其中所说的Apo A-IM是重组的Apo A-IMilano。
6.如权利要求1所述的用途，其中所说的Apo A-IM:POPC复合体由载脂蛋白A-1 Milano和1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱所组成，蛋白/脂质的重量比为1∶1。
7.如权利要求1所述的用途，其中所说的Apo A-IM:POPC复合体是一种无菌的液体药物制剂。
8.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂以15mg/kg的剂量被给药于个体。
9.权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂以45mg/kg的剂量被给药于个体。
10.如权利要求7所述的用途，其中每周一次地将所说的药物制剂给药于个体，给药6个月、5个月、4个月、3个月、2个月或1个月。
11.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂大被每天给药于个体给药1个月。
12.如权利要求7所述的用途，其中每3天将所说的药物制剂给药于给体给药1个月至6个月。
13.如权利要求7所述的用途，其中每10天将所说的药物制剂给药于给体给药1个月至6个月。
14.如权利要求7所述的用途，其中每14天将所说的药物制剂给药于给体给药1个月至6个月。
15.如权利要求1所述的用途，其还包括手术干预。
16.如权利要求15所述的用途，所说的手术干预包括经皮冠状动脉腔内血管成型术或冠状动脉旁路搭桥术。
17.如权利要求1所述的用途，其还包括使用用于治疗、预防或改善与急性冠状动脉综合征有关的疾病、病症、症状或疼痛的另外的药物。
18.如权利要求1所述的用途，其中个体受影响血管中的粥样斑体积百分比被降低了-0.73％至-1.29％。
19.如权利要求1所述的用途，其中所述个体目标血管中的总粥样斑体积被降低了-15.1mm3至-12.6mm3。
20.如权利要求1所述的用途，其中所述个体目标冠状动脉部分中的平均最大粥样斑厚度被降低了-0.039mm至-0.044mm。
21.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂被静脉内给药。
22.如权利要求21所述的用途，其中所说的药物制剂被给药经历1小时。
23.如权利要求21所述的用途，其中所说的药物制剂被给药经历3小时。
24.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂包含Apo A-IMilano、POPC、蔗糖-甘露醇载体和磷酸盐缓冲剂。
25.如权利要求24所述的用途，其中所说的蔗糖-甘露醇载体由6.0％至6.4％的蔗糖和0.8％至1％的甘露醇组成。
26.如权利要求25所述的用途，其中所说的蔗糖-甘露醇载体由6.2％的蔗糖和0.9％的甘露醇组成。
27.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂具有7.0至7.8的pH。
28.如权利要求27所述的用途，其中所说的pH为7.5。
29.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂包含12mg/ml至18mg/ml Apo A-I Milano。
30.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂包含11mg/ml至17mg/ml的POPC。
31.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂每50mL包含小于6,000个粒度高于10μm的微粒。
32.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂每50mL包含小于600个粒度高于25μm的微粒。
33.如权利要求7所述的用途，其中所说的药物制剂具有280至320mOsm的重量摩尔渗透压浓度。
34.如权利要求33所述的用途，其中所说的药物制剂具有290mOsm的重量摩尔渗透压浓度。
35.重组的Apo A-I Milano:POPC复合体在制备降低动脉粥样硬化斑块的药物中的用途。
36.如权利要求35所述的用途，其中所说的重组Apo A-I Milano：POPC复合体每周、每月或每年给药一次。
37.如权利要求35所述的用途，其中该重组的Apo A-I Milano:FOPC复合体被每周给药一次给药3-5周。
38.如权利要求35所述的用途，其还包括以15mg/此的剂量将重组Apo A-I Milano:POPC复合体给药于个体至少一次。
39.如权利要求38所述的用途，其中所说的复合体被每周、每月或每年给药一次。
40.如权利要求35所述的用途，其中还用另外的药物对所说个体进行治疗以治疗、预防或改善与急性冠状动脉综合征有关的疾病、病症、症状或疼痛。
41.如权利要求40所述的用途，其中所说的药物是它汀、β-阻滞剂、ACE抑制剂、抗血栓形成药、血管舒张药或其组合。
42.一种液体药物制剂，其在缓冲液中包含重组的Apo A-IMilano/1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱复合体，所说的缓冲剂包含6.0％至6.4％的蔗糖，还包含0.8至1％的甘露醇，所说的缓冲液具有7.0至7.8的pH。
43.如权利要求42所述的药物制剂，其包含6.2％的蔗糖。
44.如权利要求42所述的药物制剂，其包含0.9％的甘露醇。
45.如权利要求42所述的药物制剂，其中所说的pH为7.5。
46.如权利要求42所述的药物制剂，其中rApo A-I Milano的浓度为每ml所说的缓冲液12mg至18mg。
47.一种药物制剂，其包含与1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱复合的重组的Apo A-I Milano和pH为7.0至7.8的磷酸盐缓冲液，所说的缓冲液包含2％的葡萄糖和4mM的磷酸钠。
48.如权利要求47所述的药物制剂，其包含磷酸盐缓冲液以达到7.5的pH。
49.如权利要求42或47所述的药物制剂，其中所说的重组的ApoA-I Milano是保守取代的Apo A-I Milano。
50.如权利要求42或47所述的药物制剂，其中所说的重组的ApoA-I Milano和POPC以1∶0.95的重组Apo A-I Milano∶POPC重量比例被复合。
51.如权利要求42或47所述的药物制剂，其每50mL包含小于6,000个粒度高于10μm的微粒。
52.如权利要求42或47所述的药物制剂，其每50mL包含小于600个粒度高于25μm的微粒。
53.如权利要求42或47所述的药物制剂，其中所说的重量摩尔渗透压浓度为280至320mOsm。
54.如权利要求53所述的药物制剂，其中所说的重量摩尔渗透压浓度为290mOsm。
55.如权利要求42或47所述的药物制剂，其是无菌的。
56.如权利要求42或47所述的药物制剂，其是冷冻的。
57.如权利要求42或47所述的药物制剂，其位于无菌小瓶、无菌预填充的袋或预填充的注射器中。
58.-种冷冻干燥的药物制剂，其包含：
a)与1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱复合的重组ApoA-I Milano；
b)6.0％至6.4％的蔗糖；和
c)0.8至1％的甘露醇。
59.如权利要求58所述的药物制剂，其包含6.2％的蔗糖。
60.如权利要求58所述的药物制剂，其包含0.9％的甘露醇。
61.如权利要求58所述的药物制剂，其还包含缓冲液，所说的缓冲液具有7.5的pH。
62.如权利要求58所述的药物制剂，其中所说的重组Apo A-IMilano是保守取代的Apo A-I Milano。
63.如权利要求58所述的药物制剂，其中POPC的浓度为11mg/ml至17mg/ml。
64.如权利要求58所述的药物制剂，其中重组的Apo A-I Milano和POPC是以1∶0.95重组的Apo A-I Milano∶POPC重量比例复合的。
65.如权利要求58所述的药物制剂，其每50mL包含小于6,000个粒度高于10μm的微粒。
66.如权利要求58所述的药物制剂，其每50mL包含小于600个粒度高于25μm的微粒。
67.如权利要求58所述的药物制剂，其中其重量摩尔渗透压浓度 为280至320mOsm。
68.如权利要求67所述的药物制剂，其中所说的重量摩尔渗透压浓度为290mOsm。
69.如权利要求58所述的药物制剂，其是无菌的。
70.如权利要求58所述的药物制剂，其位于无菌小瓶、无菌预填充的袋或预填充的注射器中。
71.15mg蛋白/kg的Apo A-IM:POPC复合体在制备治疗局部缺血性再灌注的药物中的用途。
72.45mg蛋白/kg的Apo A-IM:POPC复合体在制备治疗局部缺血性再灌注的药物中的用途。
73.如权利要求2、8或71所述的用途，其中所说的药物还包含45mg蛋白/kg。
74.如权利要求3、9或72所述的用途，其中所说的药物还包含15mg蛋白/kg。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1093869 Country of ref document: HK |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1093869 Country of ref document: HK |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110810 Termination date: 20171019 |