JP2008007512A - 動脈狭窄の減弱方法 - Google Patents

Abstract

【課題】バルーン血管形成術後の狭窄を減弱するための医薬組成物の提供。
【解決手段】バルーン血管形成術後の被験体に生じる狭窄の程度を低下させるのに充分に有効な量の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）を含み、生理学的に許容される賦形剤により保持されている、非経口的に投与される医薬組成物。例えば、ＴＦＰＩは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇの量で、約３時間〜約２４時間の長時間投与される。ＴＦＰＩは（Ａｌａ^−１）−ＴＦＰＩ（１−２７７）又は天然ＴＦＰＩ（１−２７６）である。
【選択図】なし

Description

（発明の背景）
本発明は、動脈狭窄の新規な減弱方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、リポタンパク質結合凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）あるいは組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）としても知られている血液凝固インヒビターの投与により、バルーン血管形成術後の再狭窄を低下または阻害する方法に関する。

バルーン血管形成術は、動脈遮断の治療のために広く使用されている医学的方法である。しかし、イプ（Ｉｐ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１７，７７Ｂ−８８Ｂ（１９９１）、が報告しているように、患者の約５％に、治療された動脈の早期血栓性再閉塞が起きる。さらに、イプ（Ｉｐ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１７，７７Ｂ−８８Ｂ（１９９１）、フランクリン（Ｆｒａｎｋｌｉｎ）ら、Ｃｒｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉｓ．４．２３２−４２（１９９３）、が総説に記載しているように、血管形成術により再疎通に成功した動脈の最大５０％に３カ月以内に狭窄（動脈が細くなることまたは収縮すること）が起きる。従って、バルーン血管形成術後の再閉塞と再狭窄のために、多くの患者で再度血管形成術が必要である（ホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．５３，７７Ｃ（１９８４）、リンコフ（Ｌｉｎｃｏｆｆ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９，９２６−３５（１９９２））。従って、バルーン血管形成術後の狭窄を減弱する方法は、医療の現場で大いに有用であろう。

静脈内ヘパリンによる抗凝固療法は、血管形成術中およびその後の血栓形成を阻害するための標準的な臨床的手技である。ヘパリンはトロンビンを阻害する作用を有し、平滑筋を阻害するかも知れないという証拠があるにもかかわらず、ヘパリンは患者の再狭窄を減弱することはないようである（エリス（Ｅｌｌｉｓ）ら、Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．１１７，７７７−８２（１９８９））。同様に実験動物において、ギンプル（Ｇｉｍｐｌｅ）ら（Ｃｒｉｃｕｌａｔｉｏｎ ８６，１５３６−４６，１９９２）は、ヘパリンの慢性の皮下投与は、バルーン血管形成術後の絶対的な管腔直径を改良しなかったと報告している。

他の抗凝固剤も再狭窄の阻害について試験されているが、確定的な結果は得られていない。経口抗凝固剤のワーファリンの投与は、患者の再狭窄の比率を低下させなかった（ソーントン（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ６９、７２１−７（１９８４）、およびアーバン（Ｕｒｂａｎ）ら、Ｂｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．６０，４８５−８（１９８８））。サレンボック（Ｓａｒｅｍｂｏｃｋ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８４，２３２−４３（１９９１）によると、ウサギの腸骨動脈の血管形成術のわずか２時間後に投与した組換えデスルファトヒルジンによるトロンビンの直接阻害は、１カ月後に管腔狭窄を低下させた。しかし、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）ら（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８４，１１５８０，１９９１）は、ブタにおいてバルーンで動脈の損傷を引き起こした後、同じインヒビターを２週間注入しても、以後の管腔狭窄を減弱させなかったことを示した。

しかし、ハンケ（Ｈａｎｋｅ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８５，１５４８−８６（１９９２）、が報告したように、低分子量ヘパリンによるＸａ因子の阻害は、ウサギのバルーン血管形成術後の内膜増殖を低下させることが証明された。

他の提唱されている薬剤治療には、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａとして知られている血小板受容体を妨害する物質がある。セントルクス（ＣｅｎｔＲｘ）と呼ばれるこのような物質の１つ（７Ｅ３としても知られている）は、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｐｒｉｌ ７，１９９４、およびＴｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，Ａｐｒｉｌ ９，１９９４に記載されている。他の抗凝固剤（例えば、アルガトロバン（ａｒｇａｔｒｏｂａｎ）（ノバスタン（Ｎｏｖａｓｔａｎ）、米国特許第４，２４８，１９２号に記載されている）、およびヒルログ（Ｈｉｒｕｌｏｇ）（ヒルジンの類似体））も、再狭窄を防止すると言われている。米国特許第５，３０８，６２２号は、再狭窄の防止に塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とサポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）（リボゾーム不活性化物質）の結合体の使用を記載している。

血漿は、本明細書において組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）と呼ぶ多価クニッツタイプ（Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ）の凝固インヒビターを含有することは公知である。この名前は、１９９１年６月３０日アムステルダムでの国際血栓止血学会において認められている。ＴＦＰＩはまず、ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）から精製され（ブローゼとミレチチ（Ｂｒｏｚｅ ａｎｄ Ｍｉｌｅｔｉｃｈ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，１８８６−１８９０（１９８７））、次にヒト血漿（ノボトニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１８８３２−１８８３７（１９８９））、およびチャン肝細胞とＳＫ肝癌細胞（ウン（Ｗｕｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１６０９６−１６１０１（１９９０））から精製された。ＴＦＰＩ ｃＤＮＡは胎盤ｃＤＮＡおよび内皮ｃＤＮＡライブラリーから単離された（ウン（Ｗｕｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６００１−６００４（１９８８）；およびギラード（Ｇｉｒａｒｄ）ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５５，３７−５０（１９８９））。ｃＤＮＡ配列から推定されたＴＦＰＩの一次アミノ酸配列は、ＴＦＰＩは、強い陰性荷電のアミノ末端、３つの縦列のクニッツタイプの阻害ドメイン、および強い陽性荷電のカルボキシ末端を含有することを示している。ＴＦＰＩの第１のクニッツ−ドメインは、ＶＩＩａ因子／組織因子複合体の阻害に必要であり、ＴＦＰＩの第２のクニッツ−ドメインは、Ｘａ因子の阻害に関与し（ギラード（Ｇｉｒａｒｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８，５１８−５２０（１９８９））、第３のクニッツ−ドメインの機能は未知である。米国特許第５，１０６，８３３号も参照。ＴＦＰＩは、不活性化な、４成分からなるＸａ因子：ＴＦＰＩ：ＶＩＩａ因子：組織因子複合体を形成することにより、凝固の開始を制限するようにインビボで機能すると考えられている。ＴＦＰＩのさらなるバックグランド情報は、以下の文献中に総説がある：ラパポート（Ｒａｐａｐｏｒｔ）、Ｂｌｏｏｄ ７３、３５９−３６５（１９８９）；およびブローゼ（Ｂｒｏｚｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９、７５３９−７５４６（１９９０））。

組換えＴＦＰＩは、マウスＣ１２７細胞（デイ（Ｄａｙ）ら、Ｂｌｏｏｄ ７６、１５３８−１５４５（１９９０））、ベビーハムスター腎細胞（ペダーソン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１６７８６−１６７９３（１９９０））、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびヒトＳＫ肝癌細胞などの、哺乳動物細胞宿主を用いて、グリコシル化タンパク質として発現されている。Ｃ１２７ ＴＦＰＩは動物実験で使用されており、ウサギにおいて組織因子誘導性の血管内凝固の阻害（デイ（Ｄａｙ）ら、前出）、およびイヌにおいて血栓溶解後の動脈再閉塞の防止（ハスケル（Ｈａｓｋｅｌ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８４、８２１−８２７（１９９１））に有効であることが証明されている。

組換えＴＦＰＩはまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を用いて、タンパク質のインビトロの折り畳みによる非常に活性なＴＦＰＩを得ることにより、非グリコシル化タンパク質としても発現されている（米国特許第５，２１２，０９１号。この内容は参考のため本明細書に引用される）。またウン（Ｗｕｎ）ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔａｓ．６８，５４−５９（１９９２）も参照。

ＴＦＰＩのアミノ酸残基２７６個のタンパク質をコードするＴＦＰＩ ｃＤＮＡのクローニングは、さらにウン（Ｗｕｎ）ら、米国特許第４，９６６，８５２号（参考のため本明細書に引用される）に記載されている。

最近、米国特許第５，２１２，０９１号に開示されたように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現した組換えＤＮＡクローンを介して得られたＴＦＰＩが、微小血管吻合の血栓形成性を低下させるのに有用であることが記載された。米国特許第５，２７６，０１５号を参照（参考のため本明細書に引用される）。

（発明の簡単な説明）
本発明において、バルーン血管形成術後の狭窄を減弱するための新規な方法が提供される。本発明は、血管形成術後の温血哺乳動物に、狭窄の程度を低下させるのに有効な量の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）を、非経口投与することよりなる。

ＴＦＰＩは、組織因子とＶＩＩａ因子の複合体により合成されるＸａ因子と、血管の損傷後に誘導される複合体の活性をともに阻害するために、ＴＦＰＩは、単一部位のインヒビター（トロンビン（Ｘａ因子によるプロトロンビンの活性化の産物）またはＸａ因子のインヒビターを含む）に対して利点を有している。本明細書に記載の結果は、血管損傷後の狭窄の阻害のためのヘパリンと比較して、ＴＦＰＩの利点を示している。

アテローム発生性の食餌により誘導した高コレステロール血症を有するミニブタの、頸動脈のバルーン過膨張誘導性損傷後の、ＴＦＰＩの静脈内投与により、本発明を以下に例示する。

以下に本発明の方法を特にミニブタ種で例示するが、本方法は他の哺乳動物（例えば、ヒト）でも同様に有用であることを理解されるであろう。

本明細書に記載のように、ＴＦＰＩはグリコシル化されていてもまたはされていなくてもよい。

（発明の詳細な説明）
本明細書は、発明を構成すると考えられる主題を説明し特許請求をする請求の範囲で終了するが、添付の図面とともに以下の本発明の好適な態様の詳細な説明により、本発明の理解が一層容易になるであろう。

本発明をより詳細に例示するために、高脂血症ミニブタモデルを用いて以下の実施例を行なった。しかし、本発明は、この実施例やこの実施例の中の詳細に限定されない。

（材料と方法）
スティーブンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ）らが、すでにＡｎｎ．ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ ６、５５−６１（１９９２）に記載したように、ウサギで急速に複雑なプラーク様の病変を生成する方法であるアテローム発生性の食餌で誘導した高脂血症を有するミニブタの、頸動脈にバルーン過膨張誘導性損傷を起こした後、３時間（ｎ＝７）または２４時間（ｎ＝７）、ｐＨ７．２の３００ｍＭのアルギニンリン酸緩衝液中の組換えＴＦＰＩを静脈内に注入した（０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス、次に６ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ）。４週間後、損傷された血管をｉｎ ｓｉｔｕで潅流固定し、組織学的検査を行なった。

前記例で使用したＴＦＰＩは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現した組換えＤＮＡクローンにより得られた。これは、２７７アミノ酸のタンパク質であり、ウン（Ｗｕｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６００１−６００４（１９８８）、および米国特許第４，９６６，８５２号に記載されたように、２７６残基配列と、米国特許第５，２１２，０９１号に記載のようにＮ−末端に追加のアラニン残基が挿入されたものである。未分画ヘパリンは、エルキンス−シン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ）（チェリーヒル（Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌｌ）、ニュージャージー州）より購入した。

（結果）
上記のように処理した血管の組織学的検査は、ＴＦＰＩを３時間投与されたミニブタでは管腔狭窄は７３±１３（標準誤差）％であり、ヘパリンを３時間投与されたミニブタでは７０±１４％であった（図１、有意差無し）。ＴＦＰＩを２４時間投与したミニブタでは狭窄は、わずかに１３±１２％であった（図２、ＴＦＰＩの３時間に比較してｐ＝０．００８）。内部の弾性管腔の破裂（図４）が示すように重傷の血管損傷があるにもかかわらず、ＴＦＰＩを２４時間投与されたミニブタの内膜病変は無視できるほどであった。ヘパリン処理したミニブタで観察された、吸着性の血栓と泡沫細胞（図３）も、ＴＦＰＩを２４時間投与したミニブタでは無視できるほどであった。血漿試料に組織因子とカルシウムを加えて凝固形成の時間を終点として測定することにより凝固の外因系を評価しているプロトロンビン時間（ＰＴ）は、ＴＦＰＩの注入の間ベースラインの２．５倍を越えていた（図５）。しかし、凝固の内因系を測定する活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）では、変化は観察されなかった（図６）。すなわち、ＴＦＰＩの２４時間の投与は、バルーン誘導性動脈損傷後の狭窄を顕著に減弱させた（しかし、３時間投与では異なる）。これらのデータは、ＴＦ−介在血栓が、損傷血管の狭窄においてある役割を果たしており、これを長時間阻害することにより、バルーン血管形成術後の再狭窄を制限することができることを示している。

ＴＦＰＩの非経口投与は、好ましくは生理的に許容される賦形剤または担体（例えば、通常の食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝化食塩水、アルギニンリン酸緩衝液、またはヘペスのような他の薬剤学的に許容される緩衝液）との混合物から、ＴＦＰＩを静脈内投与して行われる。このような通常の賦形剤は公知であり、薬剤投与の分野の多くの教科書や論文に記載されている。例えば、レミントン薬剤学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アーサー・オソル（Ａｒｔｈｕｒ Ｏｓｏｌ）編、第１６版、１９８０、マック出版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルバニア州）。非経口投与されるＴＦＰＩの量は、狭窄の重傷度により大きく異なる。１時間あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約６．０ｍｇ／ｋｇの量を３〜２４時間の長時間投与することが好ましい。０時間と８時間に０．５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの範囲のＴＦＰＩの間欠的ボーラス投与（または、カテーテルに基づくドラッグデリバリーシステムを用いて、血管損傷後の決定的に重要な間隔で血管にＴＦＰＩを直接投与）を行うと、必要な薬剤の総量を低下させることができる。

当業者は本発明の開示後、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、種々の他の例が考えられるであろう。しかし、このような他の例も本発明の請求の範囲内に包含されると考えられる。

本発明はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより与えられた認可番号ＨＬ１７６４６をもって政府援助下になされた。政府は本発明について一定の権利を有する。

図１は、バルーン過膨張誘導性血管損傷を起こしたミニブタに、損傷の時から開始してヘパリン（１００Ｕ／ｋｇ／ｈ）またはＴＦＰＩ（０．５ｍｇ／ｋｇのボーラスおよび６ｍｇ／ｋｇ／ｈ）を３時間注入した場合の、バルーン過膨張誘導性損傷の４週間後の頸動脈の狭窄（％）を示す棒グラフである。 図２は、バルーンで損傷を誘導し、ＴＦＰＩを３時間または２４時間静脈内注入（０．５ｍｇ／ｋｇのボーラスおよび６ｍｇ／ｋｇ／ｈ）したミニブタの、損傷の４週間後の頸動脈の狭窄（％）の比較を示す棒グラフである。 図３は、バルーンで損傷を誘導したミニブタにヘパリンを投与した４週間後に得られたコラーゲンのマッソン３色染色法で染色した頸動脈の断面の顕微鏡写真である。管腔の狭窄は＞８０％であり、内膜病変は平滑筋細胞を含有する繊維性キャップ、組織化血栓の核、および病変の基部の泡沫細胞よりなっていた。平滑筋がコラーゲンにより置換されているため、媒質への重い損傷が明らかである。図３と図４の倍率は６０倍である。 図４は、ＴＦＰＩを２４時間投与したミニブタのバルーン損傷の４週間後に得られた弾性組織のヴァーヘフファンギーソン染色（Ｖｅｒｈｏｅｆｆ’ｓ Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ ｓｔａｉｎ）で染色した頸動脈断面の顕微鏡写真である。内部弾性膜に重症の血管損傷を示す切断があるが、内膜の増殖は小さく、管腔表面に血栓は見えない。 図５は、ＴＦＰＩを投与したミニブタのプロトロンビン時間（ＰＴ）を示すグラフである。ＰＴは、注入の間５０秒（凝固タイマーの最大の読み値）以上であった。 図６は、ＴＦＰＩを投与したミニブタの活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を示すグラフである。早期の増加は、ＴＦＰＩ投与の前にカテーテルで血栓形成を防止するための投与したヘパリンの静脈内注入を反映する。ヘパリンが循環血流から排除された後、しかしＴＦＰＩの注入を続けている間、ａＰＴＴはベースラインに戻った。

Claims (13)

1. バルーン血管形成術後の狭窄の程度を低下させるのに充分に有効な量のＴＦＰＩを含有する、温血哺乳動物のバルーン血管形成術後の狭窄を減弱するための医薬組成物。
2. ＴＦＰＩは、生理的ｐＨに緩衝化された通常の食塩水賦形剤中で保持される、請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
3. ＴＦＰＩは、０．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇの量で、約３時間〜約２４時間の長時間投与される、請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
4. バルーン血管形成術後の狭窄の程度を低下させるのに充分に有効な量のＴＦＰＩを含有し、長期間投与用である、温血哺乳動物のバルーン血管形成術後の狭窄を減弱するための医薬組成物。
5. 非経口投与用である、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 局所投与用である、請求項４に記載の医薬組成物。
7. ＴＦＰＩが生理学的に許容される賦形剤により保持されている、請求項４に記載の医薬組成物。
8. ＴＦＰＩを該生理学的に許容される賦形剤中で１時間当たり約０．５ｍｇ／ｋｇから約６ｍｇ／ｋｇの量で投与するための、請求項４に記載の医薬組成物。
9. 該ＴＦＰＩが（Ａｌａ^−１）−ＴＦＰＩ（１−２７７）又は天然ＴＦＰＩ（１−２７６）である、請求項４に記載の医薬組成物。
10. 該ＴＦＰＩが、該ＴＦＰＩの第一及び第二のクニッツ−ドメインである、請求項４に記載の医薬組成物。
11. 該ＴＦＰＩのＮ末端に追加のアラニンをさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
12. 該ＴＦＰＩが、該ＴＦＰＩの第一又は第二のクニッツ−ドメインである、請求項４に記載の医薬組成物。
13. 該長期間が、約３時間から約２４時間までである、請求項４に記載の医薬組成物。

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