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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung beansprucht die Verwendung
nach Anspruch 1. Sie betrifft ein neues Verfahren zur Verminderung
der arteriellen Stenose. Insbesondere betrifft die Erfindung die
Verwendung nach Anspruch 1 bei einem Verfahren zur Reduktion oder Inhibierung
der nach Ballonangioplastie folgenden Restenose durch Verabreichung
eines als Lipoprotein assoziierten Koagulationsinhibitors bzw. Antikoagulans
(LACI) und alternativ als Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
bekannten Antikoagulans.
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Diese Erfindung wurde mit vom National
Institut of Health unter Forschungsmittelerteilungs-Nr. HL 17464
gewährter
Regierungsunterstützung
gemacht. Die Regierung hat gewisse Rechte an der Erfindung.
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Ballonangioplastie ist ein allgemein
verwendetes medizinisches Verfahren zur Behandlung arterieller Blockaden.
Jedoch treten bei etwa 5% der Patienten frühe thrombotische Wiederverschlüsse der behandelnden
Arterien auf, wie von Ip et al., J. Am. Col. Cardiol 17, 77B–88B (1991)
berichtet. Außerdem
tritt bei bis zu 50% der Arterien, die durch Angioplastie erfolgreich
rekanalisiert wurden, innerhalb von drei Monaten erneut eine Stenose,
das heißt
eine Verengung oder Striktur einer Arterie auf, wie von Ip et al.,
J. Am. Col. Cardio. 17, 77B–88B
(1991) und von Franklin et al., Coronary Artery Dis. 4, 232–242 (1993)
besprochen. Wiederverschluss und Restenose nach Ballonangioplastie
erfordern daher bei vielen Patienten eine wiederholte Angioplastie
wie von Holmes et al., Am. J. Cardiol. 53, 77C (1984) und Lincoff et
al., J. Am. Col. Cardiol. 19, 926–935 (1992) beschrieben. Demgemäß würde ein
Verfahren zur Verminderung der Stenose nach Ballonangioplastie von bedeutendem
Nutzen für
die medizinische Praxis sein.
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Antikoagulans-Behandlung mit intravenös verabreichtem
Heparin ist zur Thrombosehemmung während und nach Angioplastie
klinische Standardpraxis. Trotz dessen Thrombin hemmender Wirkung und
Anhaltspunkten, dass es die Proliferation glatter Muskelzellen hemmen
könnte,
scheint Heparin die Restenose bei Patienten nicht zu vermindern,
wie von Ellis et al., Am. Heart J. 117, 777–782 (1989) berichtet. Gimple
et al (Circulation 86, 1536–1546, 1992)
haben berichtet, dass in ähnlicher
Weise bei Versuchstieren durch anhaltende subkutane Verabreichung
von Heparin der absolute Lumendurchmesser nach Ballonangioplastie
nicht verbessert wurde.
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Andere Antikoagulantien wurden zur
Hemmung der Restenose getestet, aber die Ergebnisse sind nicht überzeugend.
Die Verabreichung des oralen Antikoagulans Warfarin verminderte
das Restenose-Ausmaß bei
Patienten nicht, wie von Thornton et al., Circulation 69, 721–727 (1984)
und Urban et al., Br. Heart J. 60, 485–488, (1988) beschrieben. Direkte
Hemmung des Thrombins mit rekombinantem Desulfatohirudin, das nur
während
zwei Stunden nach Angioplastie der Arteriae iliacae bei Kaninchen verabreicht
wurde, verminderte die Stenose des Lumens einen Monat später nach
Sarembock et al., Circulation 84, 232–243 (1991). Jedoch haben Webster et
al. (Circulation 84, II580, 1991) gezeigt, dass derselbe Inhibitor
nach kontinuierlicher Infusion während 2
Wochen nach balloninduzierter arterieller Verletzung bei Schweinen
eine darauffolgende Stenose des Lumens nicht verminderte. Dennoch
wurde gezeigt, dass die Inhibierung des Faktors Xa mit
niedermolekularem Heparin die Proliferation der Intima nach Ballonangioplastie
bei Kaninchen herabsetzt, wie von Hanke et. al., Circulation 85,
1548–1556 (1992)
berichtet.
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Andere vorgeschlagene medikamentöse Behandlungsverfahren
beinhalten als Glycoprotein IIb/IIIa bekannte Agentien, die den
Plättchenrezeptor blockieren.
Eines dieser als CentoRx bezeichneten Agentien, (auch bekannt als
7E3), wird im The New England Journal of Medicine vom 7. April 1994
und in The Lancet vom 9. April 1994 beschrieben. Andere Antithrombotika,
z. B. Argatroban (Novastan), beschrieben im US-Patent 4 248 192,
und Hirulog, ein Hirudin-Analogon, sind ebenfalls zur Verhinderung der
Restenose vorgeschlagen worden. Das US-Patent 5 308 622 beschreibt
die Verwendung eines Konjugats von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF)
und Saporin (ein Ribosomen inaktivierendes Agens) zur Verhinderung
der Restenose.
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Es ist bekannt, dass Plasma einen
multivalenten Koagulations-Inhibitor vom Kunitz-Typ enthält, auf den hierin folgend
als TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor/ Gewebsthromboplastin-Inhibitor)
Bezug genommen wird. Diese Bezeichnung ist von der internationalen
Gesellschaft für
Thrombose und Hämostase
am 30. Juni 1991 in Amsterdam akzeptiert worden. TFPI wurde zuerst
aus einer menschlichen Hepatom-Zell-Linie
Hep G2, wie von Broze und Miletich in Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84, 1886–1890 (1987)
beschrieben, gereinigt und nachfolgend aus menschlichem Plasma wie
von Novotny et al., J. Biol. Chem. 264, 18832–18837 (1989) berichtet und
aus Chang-Leber- und SK-Hepatomzellen wie von Wun et al., J. Biol.
Chem. 265, 16096–16101
(1990) offenbart. TFPI-cDNA wurde aus Placenta- und Endothel-cDNA-Genbanken isoliert,
wie von Wun et al., J. Biol. Chem. 263, 6001–6004 (1988) und Girard et
al., Thromb. Res. 55, 37–50
(1989) beschrieben. Die Aminosäureprimärsequenz
von TFPI zeigt, wie von der cDNA abgeleitet, dass TFPI einen stark
negativ geladenen N-Terminus, drei Tandem-Inhibitor-Domänen vom
Kunitz-Typ und einen stark positiv geladenen C-Terminus hat. Die
erste Kunitz-Domäne
von TFPI ist zur Inhibierung eines Komplexes aus Faktor VIIa/Gewebefaktor erforderlich und die zweite
Kunitz-Domäne
von TFPI ist, nach Girard et al., Nature 328, 518–520 (1989),
für die
Inhibierung von Faktor Xa verantwortlich,
während
die Funktion der dritten Kunitz-Domäne bisher unbekannt ist, siehe
auch US-Patent 5 106 833. Von TFPI wird angenommen, dass seine in
vivo Funktion darin besteht, die Koagulationseinleitung durch Bildung
eines inerten, quaternären
Komplexes aus Faktor Xa/TFPI/Faktor VIIa und Gewebefaktor (tissue factor/TF) zu
begrenzen. Weitere Hintergrundinformation über TPFI ist unter Bezugnahme
auf unlängst
erschienene Übersichtsartikel
von Rapaport, Blood 73, 359–365
(1989) und Broze et al., Biochemistry 29, 7539–7546 (1990) erhältlich.
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Rekombinanter TFPI ist als glykosiliertes Protein
unter Verwendung von Säugerzellen
einschließlich
Maus-C127 Zellen, wie von Day et al., Blood 76, 1538–1545 (1990)
offenbart, Babyhamster-Nieren-Zellen, wie von Pedersen et al., J.
Biol. Chem. 265, 16786–16793
berichtet, CHO(Chinese hamster ovan)-Zellen und menschlichen SK-Hepatom-Zellen
exprimiert worden. Der aus C127-Zellen isolierte TFPI wurde in Tierexperimenten
verwendet und seine Wirksamkeit bei der Inhibierung der TF- induzierten intravaskulären Koagulation
in Kaninchen nach Day et al., wie oben zitiert, und bei der Vorbeugung
des arteriellen Wiederverschlusses nach Thrombolyse in Hunden, wie
von Haskel et al., Circulation 84, 821–827 (1991) beschrieben, gezeigt.
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Rekombinantes TFPI wurde auch unter
Verwendung von E. coli-Wirtszellen als nichtglykosiliertes Protein
exprimiert, wobei nach in vitro-Faltung des Proteins ein TFPI mit
hoher Aktivität,
wie in US-Patent 5 212 091 beschrieben, siehe hierzu auch Wun et
al., Thromb. Hemostas. 68, 54–59
(1992), erhalten wurde.
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Die Klonierung der TFPI-cDNA, die
für die 276
Aminosäurereste
des TFPI-Proteins kodiert, ist in Wun et al, US-Patent 4 966 852,
näher beschrieben.
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Unlängst wurde, wie in US-Patent
5 212 091 offenbart, mit Hilfe rekombinanter, in E. coli exprimierter
DNA-Klone erhaltener TFPI als nützlich
zur Reduktion der Thromboseentstehung bei der mikrovaskulären Anastomose
beschrieben, vergleiche US-Patent 5 276 015.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Erfindungsgemäß wird die Verwendung nach Anspruch
1 beansprucht. Ein neues Verfahren zur Verminderung der Stenose
nach Ballonangioplastie wird bereitgestellt. Das Verfahren sieht
bei einem warmblütigen
Säuger
im Anschluss an die Ballonangioplastie die parenterale Verabreichung
einer wirksamen Menge des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
vor, die zur Reduktion des Stenoseausmaßes ausreichend ist.
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Da TFPI sowohl den Faktor Xa, der aus dem Komplex von TF (tissue factor)
und Faktor VII entsteht, als auch die Aktivität dieses Komplexes, der nach
Gefäßverletzung
induziert wird, hemmt, wird von TFPI angenommen, das er Inhibitoren überlegen ist,
die nur einen einzigen Wirkungsort haben einschließlich solcher
wie Thrombin (das Produkt der Aktivierung des Prothrombins durch
den Faktor Xa) oder Faktor Xa.
Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen den Vorteil von TFPI bei
der Stenose-Inhibierung nach Gefäßverletzung
im Vergleich zu Heparin.
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Die Erfindung wird im Folgenden insbesondere
durch die intravenöse
Verabreichung von TFPI nach durch Ballonüberblähung induzierter Verletzung der
Carotis bei Zwergschweinen mit durch atherogene Fütterung
verursachter Hypercholesterinämie
veranschaulicht.
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Es soll betont werden, dass, obwohl
das erfindungsgemäße Verfahren
hier insbesondere an einer Zwergschweinart veranschaulicht wird,
es auch für
andere warmblütige
Säuger,
wie zum Beispiel den Menschen, in analoger Weise nützlich ist.
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Wie hier definiert, kann TFPI entweder
glykosiliert oder nicht-glykosiliert sein.
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DETAILIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Obwohl die Beschreibung mit Ansprüchen abschließt, die
das, was als der die Erfindung ausmachende Gegenstand angesehen
wird, speziell darlegen und beanspruchen, wird davon ausgegangen, dass
die Erfindung aus der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung in Verbindung mit den beliegenden Zeichnungen besser
verstanden wird, in denen
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1 ein
Balkendiagramm ist, das die Stenose (in %) des Lumens der Carotisarterien
4 Wochen nach durch Ballonüberblähung induzierter
Verletzung bei Zwergschweinen zeigt, denen intravenöse Infusionen
entweder mit Heparin (100 U/kg/h) oder TFPI (0,5 mg/kg als Bolus
und 6 mg/kg/h) während
3 h beginnend mit dem Zeitpunkt der Verletzung gegeben wurden.
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2 ein
Balkendiagramm ist, das die Stenose (in %) der Carotis 4 Wochen
nach balloninduzierter Verletzung bei Zwergschweinen vergleicht, denen
TFPI als intravenöse
Infusion (0,5 mg/kg als Bolus und 6 mg/kg/h) beginnend mit dem Zeitpunkt der
Gefäßverletzung
entweder während
3 h oder während
24 h gegeben wurde.
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3 eine
Mikrofotografie des mit Masson's Trichrom
für Kollagen
gefärbten
Carotisquerschnitts ist, die 4 Wochen nach der balloninduzierten
Verletzung bei einem Zwergschwein aufgenommen wurde, dem Heparin
gegeben wurde. Die Stenose des Lumens ist >80% mit einer Läsion der Intima, die aus einer
fibrösen
Kappe, die glatte Muskelzellen enthält, einem Kern eines sich bildenden
Thrombus und Schaumzellen an der Basis der Läsion besteht. Die schwere Schädigung der
Media wird durch den Austausch glatter Muskelzellen durch Bindegewebe
(Kollagen) offensichtlich. Die Vergrößerung in 3 und 4 ist
60-fach.
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4 eine
Mikrofotografie des mit Verhoeff-van-Gieson-Farbstoff für elastisches
Gewebe gefärbten
Carotisquerschnitts ist, die 4 Wochen nach der Ballonverletzung
bei einem Zweigschwein aufgenommen wurde, dem während 24 h TFPI gegeben wurde.
Trotz eines Risses in der inneren elastischen Schicht (Pfeil) als
Hinweis auf eine schwere Gefäßverletzung
ist die Proliferation der Intima minimal und gibt es keinen sichtbaren
Thrombus auf der Oberfläche
des Lumens.
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5 eine
graphische Darstellung ist, die die Prothrombin-Zeit (PT) bei einem
Zweigschwein zeigt, dem TFPI gegeben wurde. Die PT war ≥ 50 sec (maximale
Ablesung auf dem Koagulationszeitmesser) während der Infusion.
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6 eine
graphische Darstellung ist, die die aktivierte partielle Thromboplastinzeit
(aPTT) bei Zwergschweinen, denen TFPI gegeben wurde, zeigt. Der
frühe Anstieg
entspricht der intravenösen
Heparin-Injektion, die zur Verhinderung von Gerinnselbildung in
den Kathetern vor Verabreichung des TFPI gegeben wurde. Nach Abbau
des Heparins im Kreislauf, aber während fortgesetzter TFPI-Infusion,
fiel aPTT auf die Grundlinienwerte zurück.
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Um die Erfindung in weiteren Einzelheiten
zu veranschaulichen, wurde das folgende Illustrationsbeispiel unter
Verwendung des Modells von Zwergschweinen mit Hyperlipidämie durchgeführt. Es
soll betont werden, dass die Erfindung nicht auf diese beispielhafte
Arbeit oder spezielle in diesem Beispiel dargelegte Einzelheiten
beschränkt
ist.
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BEISPIEL
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Material und Methoden
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Rekombinanter TFPI in 300 mM Argininphosphat-Puffer,
pH 7,2 wurde Zwergschweinen mit durch atherogene Fütterung,
ein Verfahren, das rasch komplexe plaque-ähnliche Läsionen ergibt, wie zuvor für Kaninchen
von Stevens et al., Ann. of Vasuclar Surgery 6, 55–61 (1992)
berichtet, verursachter Hypercholesterinämie nach durch Ballonüberblähung induzierter
Verletzung der Carotiden intravenös (0,5 mg/kg als Bolus gefolgt
von 6 mg/kg/h) während 3
h (n = 7) oder während
24 h (n = 7) infundiert. Nach 4 Wochen wurden die verletzten Gefäße in situ
durch Perfusion fixiert und histologisch untersucht.
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Der im vorstehenden Beispiel verwendete TFPI
wurde mit Hilfe von in E. coli exprimierten, rekombinanten DNA-Klonen
erhalten. TFPI ist ein Protein mit 277 Aminosäuren, das aus den 276 von Wun et
al., J. Biol. Chem. 263, 6001–6004
(1988) und in US Patent 4 966 852 beschriebenen Aminosäureresten
besteht, mit einem zusätzlichen,
am N-Terminus eingeführten
Alanin-Rest, wie in US-Patent 5 212 091 beschrieben. Unfraktioniertes
Heparin wurde von Elkins-Sinn, Cherry Hills, NJ gekauft.
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Ergebnisse
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Die histologische Untersuchung der
oben behandelten Gefäße ergab,
dass luminale Stenose bei 73 ± 13%
(Standardabweichung) der Zwergschweine auftrat, denen TFPI gegeben
worden war, und bei 70 ± 14%
derjenigen, denen während
3 h Heparin gegeben worden war (1,
p = NS). Bei den Zwergschweinen, denen TFPI während 24 h gegeben worden war,
trat nur bei 13 ± 12%
Stenose auf (2, p =
0,008 verglichen mitdreistündiger
Gabe von TFPI). Die Läsionen
der Intima bei den Versuchstieren, die TFPI während 24 h erhalten hatten,
waren trotz der durch Ruptur der inneren elastischen Schicht erkennbaren
schweren Gefäßverletzung
vernachlässigbar
(4). Adhärente Thromben
und Schaumzellen, wie sie in den mit Heparin behandelten Versuchstieren
beobachtet wurden, waren bei denen, die während 24 h TFPI erhielten,
ebenfalls vernachlässigbar.
Die Prothrombinzeit (PT), die der Bewertung des extrinsischen Gerinnungsablaufs durch
Zugabe von TF (tissue factor) und Calcium zu einer Plasmaprobe mit
Messung der Zeit der Gerinnselbildung als Endpunkt dient, war während der
gesamten Infusion von TFPI >2,5-fach über Grundlinie erhöht (5). Es wurden jedoch keine
Veränderungen
der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) beobachtet,
die ein Maß für den intrinsischen Gerinnungsablauf
ist (6). Daher verminderte eine
24-stündige,
aber nicht eine dreistündige TFPI-Infusion
deutlich die Stenose nach balloninduzierter arterieller Verletzung.
Diese Daten zeigen, dass TF-vermittelte Thrombose bei der Stenose
verletzter Gefäße eine
Rolle spielt und dass dessen ausgedehnte Inhibierung die Restenose
nach Ballonangioplastie limitieren kann.
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Die parenterale Verabreichung von
TFPI wird vorzugsweise durch intravenöse Verabreichung von TFPI unter
Beimischung eines physiologisch annehmbaren Transportmittels oder
Trägersubstanzen, z.
B. physiologische Kochsalzlösung
oder gepufferte Kochsalzlösung,
wie phosphatgepufterte Kochsalzlösung
(PBS), Argininphosphat-Puffer oder anderen derartigen pharmazeutisch
annehmbaren Puffern, z. B. HEPES, durchgeführt. Solche herkömmlichen Transportmittel
sind gut bekannt wie unter Bezugnahme auf zahlreiche Texte und Abhandlungen
auf dem Gebiet der Arzneimittelverabreichung, z. B. Remington's Pharmaceutical
Sciences, ed. Arthur Osol, 16th ed., 1980,
Mack Publishing Co., Eston, PA., ersichtlich ist. Die Menge des
parenteral verabreichten TFPI kann in Abhängigkeit von dem Grad oder
der Schwere der Stenose stark variieren. Dosen von etwa 0,5 mg/kg
bis etwa 6,0 mg/kg pro h bei ausgedehnter Verabreichung über 3 bis
24 h sind bevorzugt. Zwischenzeitliche Bolus-Injektionen von TFPI im
Bereich von 0,5 mg/kg bis 1,0 mg/kg (oder direktes Freisetzen des
TFPI in dem Gefäß unter
Verwendung eines mit Hilfe eines Katheters operierenden Arzneimittel-Freisetzungssystems
in kritischen Intervallen nach Induktion der vaskulären Verletzung)
bei z. B. 0 und 8 h könnte
die Gesamtmenge an erforderlichem Arzneimittel reduzieren.