MXPA04000564A - Composiciones y metodos para uso de agentes bioactivos derivados de aminoacidos sulfatados y sulfonados. - Google Patents
Composiciones y metodos para uso de agentes bioactivos derivados de aminoacidos sulfatados y sulfonados.Info
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Abstract
La solicitud describe ligandos para objetivos de enlace, los ligandos preferiblemente incluyen peptidos que tienen por lo menos un aminoacido sulfatado o sulfonado. El ligando preferiblemente enlaza especificamente los sitios de enlace de heparina de biomoleculas. Se describen composiciones, sistemas, y metodos para hacer y usar los ligandos.
Description
COMPOSICIONES Y METODOS PARA USO DE AGENTES BIOACTIVOS DERIVADOS DE AMINOACIDOS SULFATADOS Y SULFONADOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional norteamericana número 60/306,726, presentada el 20 de Julio del 2001, la cual es incorporada en la presente por referencia. CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona con métodos para hacer y usar agentes que afectan compuestos biológicos, especialmente agentes que contienen péptidos que tienen grupos sulfonados o • sulfatados. En particular, se describen métodos de química combinatoria y aplicaciones que implican tales agentes, especialmente agentes que enlazan a los sitios de enlace de heparina de las proteínas . ANTECEDENTES La heparina es una biomolécula que surge de manera natural que es utilizada para muchas aplicaciones médicas . Una aplicación toma ventaja del enlace de heparina a la biomolécula antitrombina III (AT III) . La heparina es introducida a la sangre de un paciente, donde ésta enlaza ATIII y de esta manea ayuda a impedir la coagulación de la sangre no deseada. La heparina enlaza a ATIII al interactuar con los sitios de enlace de heparina específicos sobre la ATIII. Los grupos sulfato y sulfonato negativamente cargados de heparina desempeñan una función v importante en este enlace . Muchas biomoléculas tienen sitios de enlace de heparina, pero la heparina se enlaza a éstas sólo débilmente o con poca especificidad. Sin la especificidad para un objetivo, la heparina dada a un paciente es captada por otras biomoléculas e impedida de que alcance su objetivo. Y si ésta alcanza su objetivo, un enlace débil puede ocasionar que tenga poco efecto. La heparina, de hecho, tiene muchas limitaciones concernientes con la especificidad, velocidad y resistencia de sus interacciones con otras moléculas . La química combinatoria es una tecnología que implica hacer muchas sustancias químicas y clasificarlas. La prueba de clasificación es utilizada para probar las sustancias químicas para determinar cuáles tienen una propiedad química útil con respecto a un objetivo dado. La química combinatoria ha sido utilizada exitosamente para hacer muchos fármacos. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención proporciona sistemas y métodos para hacer ligandos, especialmente ligandos que imitan algunas funciones de la heparina y mejoran la función de la heparina en algunas circunstancias . Los ligandos tienen grupos químicos sulfonados o sulfatados, y se prefieren aminoácidos sulfatados o sulfonados. Los sistemas para hacer compuestos heparinicos incluyen modalidades utilizando los procesos de química combinatoria que incorporan aminoácidos sulfonados o sulfatados. Una ventaja de utilizar los ligandos de la invención, es que se pueden adaptar a una aplicación dada. Por ejemplo, se puede hacer un ligando que imita a la heparina pero se degrada más rápido o más lento que la heparina. O puede ser deseable dirigir un subconjunto pequeño de proteina de enlace de heparina al adaptar un ligando para enlazar solamente al subconjunto dirigido. Los sistemas y métodos para hacer un ligando que imita un compuesto h'eparihicb ventajosamente permiten la producción rápida d ligandos que son dirigidos a una proteina. de enlace de heparina especifica. Una modalidad de la invención es un ligando para enlazar una biomolécula objetivo, el ligando que tiene un péptido con por lo menos un aminoácido sulfonado o sulfatado, con el ligando que tiene un enlace especifico para la biomolécula objetivo. El enlace especifico de preferencia tiene una D de menos de aproximadamente 600 uM en solución fisiológica. El péptido de preferencia también tiene por lo menos un aminoácido positivamente o neutralmente cargado. La biomolécula objetivo de preferencia tiene por lo menos un sitio de enlace de heparina. Otra modalidad de la invención es un método para hacer reaccionar una molécula biológica de enlace de ñeparina con un ligando, el '-método que comprende exponer el ligando al objetivo, en donde el ligando tiene por lo menos un aminoácido sulfonado o sulfatado y una KD para la biomolécula objetivo de menos de aproximadamente 600 uM en solución fisiológica . Otra modalidad de la invención es un método para generar un ligando que interactúa con un objetivo de enlace de heparina, el método que implica proporcionar un objetivo que comprende un sitio de enlace de heparina, proporcionar un conjunto que tiene elementos qué cada uno comprende un péptido que tiene por lo menos un aminoácido que está sulfonado o sulfatado, clasificar el conjunto con el objetivo para identificar por lo menos un elemento del conjunto que enlaza el objetivo e identificar el ligando al determinar ¦ la identidad química para el por lo menos un elemento del conjunto que enlaza el objetivo. El péptido de preferencia también tiene por lo menos un aminoácido positivamente o neutralmente cargado. Otras modalidades de la invención incluyen un ligando para un objetivo que tiene un péptido sulfonado o sulfatado que incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1-10 y 13-17 derivadas, y secuencias que tienen sustituciones conservativas de las mismas, en donde la derivación es la sulfonación o sulfatación de las tirosinas en las' secuencias. Otra modalidad és. un ligando para un objetivo, el ligando que tiene un péptido sulfonado o sulfatado que incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 11, 12 Y 17-24 derivadas, y secuencias que tienen sustituciones conservativas de las mismas, en donde la derivación es la sulfonación o sulfatación de las serinas en las secuencias . Los péptidos de preferencia también tienen por lo menos un aminoácido neutralmente o positivamente cargado .' BREVE DESCRIPCION DE XAS FIGURAS La Figura 1A representa ejemplos de aminoácidos sulfatados . La Figura IB representa ejemplos de aminoácidos sulfonados. La Figura 1C representa ejemplos de aminoácidos sulfatados y sulfonados . La Figura 2 lista algunos sitios de enlace heparínicos que son objetivos adecuados para ligandos de ciertas modalidades de la invención. La Figura 3 representa un esquema para realizar la química combinatoria. La Figura 4 representa un esquema de química combinatoria alternativo . La Figura 5 representa un histograma generado como parte de la clasificación de la biblioteca del Ejemplo 1.
La Figura 6 representa las Secuencias reportadas en la presente por la SEQ ID NO:. DESCRIPCION DETALLADA La utilidad de la heparina proviene en parte de la variedad de maneras en la cual ésta enlaza otras moléculas y la variedad de moléculas que ésta enlaza. Los grupos sulfato y sulfonato negativamente cargados de la heparina ayudan a crear enlaces con grupos positivamente cargados en otras moléculas. Estos enlaces típicamente implican interacciones electrostáticas. Otras interacciones pueden ser importantes incluyéndose aquellas inducidas por hidrofilicidad, ' hidrofobicidad y efectos de conformación. La interacción de carga a carga entre las moléculas cargadas es referida como una interacción electrostática y puede implicar fuerzas de enlace o repulsivas. Un agente de enlace es referido como un ligando. La molécula que un ligando enlaza es referida como un objetivo. Muchos procesos biológicos son realizados por un evento de enlace de ligando a objetivo. El evento de enlace puede tener una variedad de efectos, incluyéndose el bloqueo de otras moléculas del enlace al objetivo, causar que el objetivo sea activado de modo que se realice una nueva función, o desactivar el objetivo de modo que llega a ser inactivo . Muchos fármacos son ligandos . Algunos fármacos son agonistas que activan su objetivo. Otros fármacos son antagonistas que enlazan su objetivo'' e impiden a- otras biomoléculas que interactúen con el objetivo. Otros fármacos son agentes de enlace de afinidad que enlazan a un objetivo y fijan el objetivo a un soporte. La heparina es utilizada como un fármaco que enlaza a antitrombina III y de esta manera ocasiona que la antitrombina III desactive la trombina. La trombina ayuda a la sangre a coagular de modo que la desactivación mediante la administración de heparina ocasiona que el paciente sea menos susceptible a coágulos de sangre. Todos estos eventos de enlace de ligando-objetivo son mediados por interacciones electrostáticas . Las interacciones electrostáticas son usualménte importantes en el enlace biológico y son frecuentemente útiles para hacer agentes bioactivos como marcadores, agonistas, antagonistas y agentes de enlace de afinidad. Los sulfatos y sulfonatos median algunos eventos de enlace. Ellos son negativamente cargados y electrostáticamente interactúan con las cargas positivas sobre moléculas biológicas. Su hidrofilicidad o hidrofobicidad y conformación también pueden participar en él evento de enlace. En la naturaleza, las moléculas biológicas más comunes que tienen sulfatos y sulfonatos son estructuras similares a sacáridos; por ejemplo, heparina, sulfato de heparina y sulfato de cóndroitina. La naturaleza emplea sulfatos en proteinas a un grado mucho menor: la sulfatación de aminoácidos es una modificación de '¦'pos-traducción rara, aunque importante. Una célula hace proteínas al unir aminoácidos en cadenas . El aminoácido de esta manera es un monómero y la cadena es un polímero. Un péptido tiene por lo menos dos aminoácidos, y los aminoácidos pueden estar contiguos o separados . Un péptido de aminoácidos puede ser descrito al menos en parte al describir su secuencia. Una modificación de pos-traducción es generalmente un cambio al polímero de aminoácidos que ocurre después de que una célula polimeriza los aminoácidos en un polímero. Los aminoácidos que se han hecho reaccionar para formar una porción de un p'olipéptido son referidos en la presente como aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos unidos a otros aminoácidos por medio de enlaces de péptido son referidos como aminoácidos aunque algunos aspectos de su estructura son de esta manera cambiados. Los péptidos que incorporan aminoácidos sulfatados y/o sulfonados pueden ser moléculas altamente cargadas y por lo tanto típicamente muestran fuerte enlace a un número de entidades biológicas que tienen la estructura correspondiente apropiada. Por lo tanto, los péptidos que tienen grupos sulfatados y/o sulfonados son útiles, por ejemplo, para enlazar una variedad de objetivos. Los objetivos preferidos son aquellos que enlazan heparina. Estos objetivos tienen dominios de enlace de heparina. El enlace, como es utilizado en las ciencias biológicas, significa é*l enlace, especifico. El enlace especifico generalmente implica una pluralidad de interacciones no covalentes,- tales como interacciones electrostáticas, interacciones de van der Waals, unión de hidrógeno y similares . Las interacciones de enlace especifico caracterizan el enlace de anticuerpo-antigeno, el enlace de enzima-sustrato y las interacciones de enlace de proteína-receptor específicamente. Una ventaja de un sulfato o un sulfonato comparado con un ácido carboxílico es que el ácido carboxílico usualmente tiene menos especificidad para un sitio de enlace de heparina . Los procedimientos por otros investigadores 'hacia la preparación de sustancias miméticas de heparina han sido dirigidos hacia el uso de polisacáridos . Los polisacáridos son azúcares. Estos otros investigadores han utilizado un polisacárido para imitar a un polisacárido . Las sustancias miméticas especialmente útiles son encontradas en una clase de medicaciones referidas como pentasacáridos. Además, algunos de estos investigadores han utilizado polisacáridos sulfonados. Algunos investigadores han utilizado dextranos, que son polisacáridos (de Raucourt y colaboradores (1998)). Ejemplos y revisiones del uso de polisacáridos como sustancias miméticas de heparina son descritos en, por ejemplo: Herbert- y colaboradores (1998), Herbert y colaboradores (1996), Logeart-Avamoglou y Jozefonvxcz 1998), Feret (200*1), van Boeckel y Petitoir (1993), Folkman y colaboradores (1989), Zugmaier y colaboradores (1992) y Parish y colaboradores (1999) . Otros investigadores han reportado varias sustancias miméticas de heparina. Un ejemplo son los polímeros de ingeniería que tienen grupos de ácido sulfónico (por ejemplo, Liekens y colaboradores, 1999) . Este grupo de polímeros se dirigió contra el factor-2 de crecimiento de fibroblasto (FGF-2) . Los polímeros de ingeniería carecen de las ventajas de utilizar ligandos que incorporan un aminoácido, incluyéndose la adaptabilidad de péptidos para la síntesis combinatoria. Además', los péptidos tienen propiedades de degradación de evacuación generalmente superiores que los polímeros de ingeniería. Los péptidos sulfatados dirigidos a las biomoléculas han sido descritos, por ejemplo, Muramatsu y colaboradores (1997) . Muramatsu y colaboradores describieron un decapéptido sulfatado dirigido al exositio de enlace de anión de la trombina, un sitio que es la distancia del dominio de enlace de heparina de la trombina. Muramatsu y colaboradores no describen el uso del procedimiento de química combinatoria utilizando péptidos para desarrollar su ligando para trombina. Bentolila y colaboradores (1999) describieron un polímero poli(N-acril aminoácido) que incluye ciertos polímeros con hidroxiprollnas sulfatadas. Bentolila, sin embargo, describe que todos los polímeros activos como sustancias mi-méticas de heparina tienen una . densidad de carga negativa de por lo menos uno por residuo de aminoácido. En contraste, las modalidades que describen ligandos que son sustancias miméticas de heparina efectivas que tiene una densidad de carga menor que uno por residuo de aminoácido son reportadas en la presente. Miao y colaboradores (1997) reportaron un compuesto polianiónico no sulfatado dirigido contra FGF-2. La síntesis combinatoria con polisacáridos es descrita, por ejemplo, en la solicitud de patente No. 09926956. En contraste, estas solicitudes describen métodos y composiciones que no usan polisacáridos para imitar á la heparina. Ciertas modalidades utilizan bibliotecas combinatorias de aminoácidos sulfatados y/o sulfonados para producir péptidos para interactuar con las biomoléculas . La naturaleza usa aminoácidos sulfatados en el reconocimiento biológico; sin embargo, casi siempre usa sitios de sulfato individuales o aislados. Los Ejemplos demuestran que los ligandos que tienen interacciones de muy alta afinidad, especificas con objetivos adecuados pueden ser obtenidos al - diseñar bibliotecas que tienen múltiples sitios de sulfatación o sulfonación. De preferencia, las bibliotecas tienen elementos que tiene aminoácidos sulfatados y/o sulfonados en combinación con aminoácidos hidrofóbicos . De preferencia, las bibliotecas también tienen aminoácidos con funcionalidades hidrofóbicas y/o de ácido y/o de alcohol. El uso de aminoácidos tiene muchas ventajas, incluyéndose la habilidad para utilizar métodos de alto rendimiento robustos para crear péptidos de alta, pureza. Los péptidos sulfatados y sulfonados sintetizados por un procedimiento de biblioteca combinatoria son preferibles para hacer péptidos que enlazan objetivos adecuados. Una biblioteca combinatoria de péptidos es un conjunto de péptidos. Cada péptido en la biblioteca puede ser único o algunos péptidos pueden ser duplicativos entre si. La biblioteca puede ser probada contra un objetivo para determinar que elementos dé la biblioteca interactúan 'más favorablemente con el objetivo. Asi, los ligandos que interactúan con la molécula objetivo, por ejemplo, mediante enlace, son identificados y generados de esta manera. Luego, .los ligandos pueden ser producidos en masa utilizando métodos comúnmente conocidos. Un ligando es la molécula que enlaza el objetivo. El objetivo típicamente tiene una porción llamada un sitio de enlace o un dominio de enlace que es más activo en la interacción con el ligando. Un método de producción que implica una biblioteca combinatoria es preferible debido a que el tamaño de biblioteca, tamaño de compuesto y la composición pueden ser fácilmente manipulados para obtener moléculas con diferentes propiedades químicas y biológicas .
Modalidades que son sistemas y métodos para producir ligandos que enlazan a dominios de enlace de heparina son descritas en la presente. Ciertas modalidades ¦ del uso de estos sistemas y métodos son expuestas en los Ejemplos. Los sistemas y métodos de la invención, sin embargo, no están limitados a los ejemplos. Además, los ligandos y objetivos específicos son contemplados y expuestos en la presente, por ejemplo, las Figuras 1 y 2. Los métodos para hacer y usar los sistemas y métodos de la invención son ' expuestos, incluyéndose ligandos adecuados, objetivos tales como biomoléculas y porciones de sitio de enlace de heparina y procedimientos combinatorios . Ligandos para la interacción con moléculas objetivo. Los ligandos preferidos incluyen grupos sulfatados y/o sulfonados dispuestos sobre un aminoácido. El término sulfonado o sulfatado, como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo químico que es ya sea sulfatado, sulfonado o ambos . Este aminoácido o péptido sulfonado o sulfatado es un aminoácido o péptido que es sulfatado, sulfonado, o tanto sulfatado como sulfonado. Los grupos sulfatados y sulfonados son intercambiables en la mayoría de los circunstacias en términos de su actividad de enlace . El péptido sulfonado o sulfatado de preferencia es Tyr, Ser, Thr o Lys (Figura 1A) . Otros péptídos sulfonados o sulfatados pueden ser utilizados, ver por ejemplo, las Figuras 1A-1C. Las abreviaciones de una y tres letras estándares para aminoácidos son utilizadas (por ejemplo, Tyr o Y. para tirosina) . Estas abreviaciones son incluidas en Alberts y colaboradores, Molecular Bíology of the Cellf 2nd ed., la cual es incorporada en la presente por referencia para todos los propósitos. X o XXX se establece para cualquier aminoácido, como sea apropiado en el contexto. Como es descrito en Stryer, Biochemistry, 3rd ed., los aminoácidos hidrofóbicos son: Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Tyr y Trp y los aminoácidos sintéticos que son similares a éstos con respecto a su solubilidad en solución acuosa. Una sustitución de aminoácido conservativa es una sustitución en donde un aminoácido idrofóbico es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico, y de manera similar, en donde hidrofilíco es sustituido por hidrofílico, básico es sustituido por básico, acidico es sustituido por acidice Ademásr la sustitución de un sulfato por u sulfonato y viceversa, es una sustitución conservativa. Cualquier aminoácido que puede ser sulfatado antes o después de la polimerización en un péptido puede ser utilizado. Estos incluyen los 20 aminoácidos que surgen de manera natural asi como aminoácidos sintéticos y versiones verificadas de los mismos . Las bibliotecas peptidicas son de preferencia generadas de aminoácidos naturales que incluyen aquellos con funcionalidad de sulfato. Los Ejemplos, después, exponen síntesis de bibliotecas realizadas utilizando tírosina sulfatada (Tyr(S03)), serina sulfatada (Ser(S03)) y lisina sulfatada (Lys(S03)). Ciertos péptidos sulfatados y sulfonados con comercialmente disponibles y se pueden obtener dé fuentes comercialmente conocidas, por ejemplo BACHEM. Además, la preparación de aminoácidos sulfatados es descrita en la literatura, por ejemplo en Campos y colaboradores (2002). Los ligandos son de preferencia péptidos. Los péptidos o ligandos, sin embargo, pueden ser asociados con una estructura más grande. La asociación es útil para suministrar los ligandos o modificar los usos. Ejemplos de tal asociación incluyen los enlaces covalentes y no covalentes . Tal estructura puede ser referida, por ejemplo, como una estructura que lleva ligando. La estructura más grande es cualquier estructura biocompatible, por ejemplo un polímero sintético, proteína, glicosaminoglicano, proteoglicano, biomolécula natural o sintética, dispositivo médico y un dispositivo médico implantable. Como ejemplos adicionales, tales estructuras incluyen liposomas, cápsulas, geles, hidrogeles, polímeros hidrofóbicos, polímeros hidrofílicos, óxido de polietileno, superficies de dispositivo médico, catéteres, implantes de cadera, stents, injertos vasculares, matrices de diseño para tejido, marcapasos, desfibr.iladores, guías o alambres para dispositivos implantables . Además, os ligandos pueden
• incluir múltiples aminoácidos que realizan la función de enlace del ligando. Por ejemplo, dos aminoácidos sobre un ligando pueden ser separados por un espaciador no de aminoácido corto, por ejemplo, un polímero sintético. Ejemplos de polímeros son descritos en el Polymer Hanbook, 4th Edition, by J. Brandrup, E.H. Immergut, E.A. Grulke, Akihiro Abe, and D. Bloch (Eds.), la cual es incorporada en la presente por referencia. Los ligandos se utilizan como parte de estructuras más grandes para impartir propiedades adicionales deseables a los ligandos. El término ligando es
• útilizado ampliamente y puede incluir no solamente aquellas' porciones químicas que directamente participan en un evento de enlace sino también una molécula que tiene una porción de enlace. Los ligandos son de preferencia pequeños en tamaño, no tóxicos, y no producen una respuesta inmune después de la inyección a un paciente. Los ligandos generalmente pueden ser de cualquier tamaño, pero un tamaño preferido para un ligando de molécula pequeña es menor que aproximadamente 5000 Da. Un tamaño más preferido es menor que aproximadamente 2500 Da. Los ligando peptídicos de varios tamaños pueden ser rápidamente generados utilizando los métodos descritos en la presente. Los tetrapéptidos y decapéptidos son descritos en los ejemplos, pero la longitud apropiada de los péptidos puede ser ádaptada a cada aplicación, ios ligandos pequeños típicamente son ventajosos debido a que pueden ser fácilmente introducidos a la célula de un paciente. Los ligandos que tienen estructuras lipofilicas, aromáticas o heterocíclicas que les permite cruzar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica son usualmente preferibles . Una ventaja de adicionar aminoácidos neutros o cargados a un ligando es que la solubilidad y la carga total del ligando es afectada de esta manera. La solubilidad tiene un efecto importante en el procesamiento y la fabricación de los ligandos puesto que la elección de los solventes comerciales no está sin limite y algunos solventes son menos seguros o menos costosos de utilizar que otros. La carga total del péptido y/o ligando también afecta la habilidad de una célula para captar el ligando, un proceso que es importante cuando los objetivos están dentro de células. El glicocáliz de la variedad de las células está altamente cargado negativamente de modo que la presencia de cargas neutras o positivas puede aumentar la captación en algunos casos . Además un ligando con una alta carga positiva o negativa puede tender a mostrar el enlace no especifico no deseado, por ejemplo, después de- la inyección a un paciente. Una ventaja de utilizar péptidos sulfatados (pero no sulfonados) es que los péptidos sulfatados gradualmente se desulfatan in vivo y de esta manera gradualmente pierden su fuerte afinidad de enlace, que puede ser - útil en sistemas de suministro así como de evacuación del cuerpo. Además, los péptidos sulfatados pueden ser desulfatados por medios químicos y fácilmente evaluados por técnicas de secuenciacion estándares, una ventaja adicional de los péptidos sulfatados. Por otra parte, una ventaja de los ligandos sulfonados es que los grupos sulfonados son más estables que los grupos sulfatados, una característica es que es útil en algunas circunstancias . Los ligandos que incorporan péptidos o no péptidos sintéticos también son contemplados. Sintético significa aquello que no es encontrado a la naturaleza. Ejemplos incluyen peptoides (Simón y colaboradores, 1992), oligocarbamato (Cho y colaboradores, 1993) , oligoureas
(Burgess y colaboradores, 1995), péptidos de sulfonilo vinílogos (Gennari y colaboradores, 1995) , peptidosulfonamidas (de Bont y colaboradores, 1996) , azatidas
(Han and Janda, 1996) , cetidos (Khosla y Za ada, 1996) , y péptidos sulfatados (Muramatsu y colaboradores, 1997) . Además, los ligandos pueden ser rígidos, flexibles, lineales, ramificados, dendríticos, ciclizados o mostrar propiedades especificas físicas, químicas o estructurales que son más favorables terapéuticamente. Son preferibles los aminoácidos naturales perc los D-aminoácidos y otros aminoácidos sintéticos, especialmente aquellos con sulfonato u otra funcionalidad pueden ser utilizados. LÓs péptidos descritos en los Ejemplos tienen una terminación de amida (CONH2) . Otras terminaciones pueden ser sustituidas, incluyéndose extremos para ciclización. También es posible, cuando es deseable, dirigir un subconjunto pequeño de proteínas de enlace de heparina al adaptar un ligando para enlazar solamente al subconjunto dirigido. La dirección al objetivo puede ser alcanzada al clasificar ligandos', como es descrito en la presente, contra objetivos en la presencia de moléculas que compiten con el ligando o que no suponen que enlazan al ligando. Por ejemplo, un ligando péptidico dirigido contra Antitrombina III (ATIII) puede ser clasificado en la presencia de heparina de modo que el ¦ ligando enlazará ATIII más fuertemente que a la heparina (ver los Ejemplos) . Alternativamente, un conjunto de ligandos para el objetivo podría ser generado y los ligandos podrían ser clasificados al determinar su destino en el sistema donde serán utilizados. Por ejemplo, un ligando peptídico contra ATIII podría ser marcado e inyectado en un animal o en un paciente humano. El marcador podría ser utilizado para determinar qué ligandos más efectivamente enlazan ATIII opuesto a otros sustratos . La síntesis de péptidos es realizada de acuerdo a los protocolos conocidos por aquellos expertos en esta técnica. La síntesis en fase sólida típicamente implica hacer reaccionar una superficie sólida, típicamente una cuenta o glóbulo, con un primer aminoácido. Los aminoácidos subsecuentes se hacen reaccionar con el primer aminoácido para construir un péptido. Los procesos de reacción frecuentemente requieren que algunos grupos funcionales sobre los aminoácidos sean protegidos por grupos protectores. Los grupos protectores son adicionados o retirados como sea necesario. La síntesis de bibliotecas pépticas es descrita en la literatura, por ejemplo, en Thompson y Ellmah (1996) . La síntesis que implica la biocatálisis combinatoria es descrita/ por ejemplo, en Khosla y Zawada (1996) y Khmelnitsky (1996) . Moléculas objetivo para la interacción con ligandos Las moléculas objetivo adecuadas son biomoléculas , particularmente biomoléculas que tienen un dominio de enlace de heparina o que enlazan a la heparina o sulfato de heparano. Los ligandos se pueden hacer de cualquier dominio de enlace de heparina de acuerdo con los métodos de producción descritos en la presente. Además, los ligandos se pueden hacer en un alto grado de especificidad y/o resistencia de enlace para la molécula objetivo. Un método para alcanzar estas propiedades es clasificar bibliotecas de péptidos para las propiedades deseadas . Las moléculas objetivo incluyen, pero no están limitadas a, péptidos, proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, anticuerpos, enzimas y receptores sobre o en partículas de virus, bacterias, hongos y células. Las modalidades del método para producir ligandos para moléculas objetivo son expuestas en los Ejemplos, después, con los objetivos que son el factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF) y ATIII. ATIII es un ejemplo de un objetivo adecuado. El término ATIII se refiere a todas las variaciones, mutantes, derivados e isoformas de antitrombina III humana. ATIII es un inhibidor de serina proteasa en la familia de serpina que desempeña una función importante en la coagulación de la sangre intrínseca. Cuando la heparina enlaza ATIII, la ATIII cambia su forma y llega a ser activada. La ATIII activada- es capaz de inhibir el factor Xa o trombina. La inhibición de uno de estos factores en la sangre ocasiona que la sangre tenga menos actividad de coagulación. Solamente una estructura unitaria de pentasacárido de heparina es. necesario para el enlace de la antitrombina III para ocasionar inhibición del factor Xa. Sin embargo, una parte mucho más larga de heparina debe enlazar a la antibrombina III para ocasionar la inhibición de la trombina. Los fármacos antitrómboticos son útiles para muchas aplicaciones clínicas. Puesto que la ATIII está normalmente presente en la sangre, los fármacos que ocasionan que sea activada serían útiles. Las sustancias miméticas de heparina solamente reportadas aparentemente se han basado en sacáridos, por ejemplo, peritasacárido sulfatado sintético o polímeros, por ejemplo, sulfato de dextrano o poliestireno sulfonado. Sin embargo, la presente solicitud describe sistemas y métodos para hacer péptidos sulfatados que enlazan a los dominios de enlace de heparina de los objetivos tal como ATIII. Además, la presente solicitud describe ligandos basados en péptido específicos que utilizan aminoácidos sulfatados para enlazar el dominio de enlace de heparina de la ATIII. VEGF, factor de crecimiento de fibroblasto básico
(bGFG) y factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) también son ejemplos de objetivos adecuados. La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos de los ya existentes; está implicada en la sanación de heridas, así como en la patogénesis de una variedad de enfermedades que incluyen retinopatías, artritis reumatoide y cáncer. El proceso es controlado por un número de factores de crecimiento tales como VEGF, bFGF y PDGF. Cada uno de estos factores de crecimiento tiene una actividad biológica que puede ser potenciada o inhibida al enlazar al polisacárido sulfatado, heparina. Las moléculas que imitan a la heparina mediante el enlace a estas proteínas y la actividad de modulación son útiles. Tales sustancias miméticas de heparina son de preferencia pequeñas, bien definidas, específicas y no tóxicas .
Los factores de crecimiento son objetivos adecuados, incluyéndose la familia del factor de crecimiento de fibroblasto, el factor de crecimiento epidérmico de enlace de heparina, la familia del factor de crecimiento endotelial vascular, la superfamilia de factor beta de crecimiento de transformación, el factor de crecimiento similar a insulina, proteínas morfogenéticas óseas (BMPs), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , leiotrofina, factores de crecimiento de nervio y factor-1 que promueve el crecimiento de neurita NEGFI) . Otros objetivos adecuados son las moléculas de matriz extracelular, por ejemplo, fibrin (ogeno) , . laminina y fibronectina . Los componentes del sistema' sanguíneo,' incluyéndose la cascada intrínseca e extrínseca son objetivos adecuados. Los receptores de la superficie celular que enlazan heparina son objetivos adecuados, por ejemplo, integrinas, moléculas de adhesión celular y moléculas de adhesión célula-célula. Otros objetivos adecuados son las proteasas e inhibidores de proteasas, incluyéndose heparina, heparinasa y heparinasa. Las sustancias miméticas de heparina pueden ser utilizadas para modular la actividad angiogénica de los factores de crecimiento de enlace de heparina. La heparina por sí misma se ha empleado hacia este fin, pero la actividad variable de diferentes preparaciones debido a su composición heterogénea, toxicidad debido a su actividad anticoagulante y baja afinidad ( D de aproximadamente 5.5- M) son desventajas para utilizar el polisacárido . Estas desventajas han conducido al estudio de otras moléculas naturales y sintéticas que imitan a la heparina. Sin embargo, muchas de tales sustancias miméticas demuestran alta toxicidad y bajos índices terapéuticos, son no específicas o dan resultados inconsistentes, por ejemplo, los azúcares tal como polisulfato de pentosano (PPS), polisacáridos sulfatados diferentes a la heparina, y ciclodextrinas se pueden utilizar como sustitutos de heparina pero ' demuestran problemas similares como la heparina . El compuesto sulfatado suramin y •análogos también inhiben la angiogénesis inducida pór el factor de crecimiento. Sin embargo estos compuestos en muchas circunstancias no son específicos, muestran toxicidad grave y tienen bajos índices terapéuticos. El diseño, la síntesis y la implementación de métodos y combinaciones para producir péptidos sulfatados que enlazan con alta afinidad al dominio de enlace de heparina de VEGF es descrito en los ejemplos. VEGF inicia la angiogénesis al activar los receptores que estimulan la proliferación y migración de la célula endotelial vascular (EC) . Distinto a otros factores de crecimiento angiogénicos, tal como bFGF, la actividad de VEGF es altamente específica a las células endoteliales . VEGF es caracterizado como un factor de crecimiento de enlace de heparina. La heparina encontrada en las superficies celulares como proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPGs) es aparentemente necesaria para que ocurra la actividad angiogénica inducida para el factor de crecimiento. Existe mucha evidencia que sugiere que los HSPGs de la superficie celular estabilizan el enlace de VEGF a sus receptores, estimulando de esta manera la actividad angiogénica. Consistente con esto, dependiendo del tamaño y la "concentración de heparina, las heparinas exógenas potencian o inhiben el enlace de VEGF a sus receptores de superficie celular. Asi, los ligandos sulfatados o sulfonados, especialmente ligandos peptidicos que imitan a la heparina, pueden ser utilizados para modular la actividad de VEGF. Adicionalmente, tales ligandos son útiles para aplicaciones de enlace y liberación. Las moléculas objetivo adecuadas frecuentemente tienen sitios de enlace de heparina. Muchos de tales sitios son conocidos como es descrito en, por ejemplo, Fromm y colaboradores, 1997. La Figura 2 expone algunos de los sitios conocidos. Un sitio de enlace de heparina es un término biológico que incluye moléculas que enlazan heparina asi como variantes naturales de heparina, por ejemplo, heparano. Constantes de disociación entre ligandos y sitios de enlace Los ligandos frecuentemente están compitiendo con otros ligandos para un sitio de enlace en un conjunto fisiológico. Los ligandos enlazan el sitio de enlace pero periódicamente llegan a ser desunidos El tiempo que los ligandos permanecen unidos al sitio de enlace es largo si el ligando tiene una alta afinidad de enlace para el sitio. La constante de disociación, Kd, es una medición cuantitativa de la afinidad de enlace de un ligando para un sitio de enlace particular. Para una reacción de T + L TL donde L es la concentración de ligando, T es la concentración del objetivo que el ligando enlaza y TL es el complejo formado por el ligando y objetivo, Kd es calculada al dividir el producto de las concentraciones de los reactivos entre la concentración del producto: Kd = [T] [L]/[TL]. La constante de disociación 'Kd' es típicamente reportada en la concentración donde [TL] / ( [TL] + [T] ) = 0.5, y es representada como KD, también referida en la presente como la constante de disociación de media saturación. Asi KD representa la concentración de ligando requerida para saturar exactamente la mitad de los sitios de enlace disponibles en T. Ün alto valor de KD representa una débil afinidad de enlace pero un bajo valor de KD representa una fuerte afinidad de enlace entre el objetivo y el ligando . El método usual para calcular las constantes de disociación implica utilizar la pendiente de una linea sobre una gráfica de Scatc ard generada para concentraciones múltiples. Este proceso y variaciones de este proceso son conocidos para aquellos expertos en estas técnicas, por ejemplo, para acomodar múltiples ligandcSs o múltiples · sitios de enlace sobre un objetivo. En la presente solicitud/ las constantes de disociación son medidas en una solución que refleja soluciones fisiológicas con una molaridad de aproximadamente 300-330 mOsmolar y un pH de entre 7.0 y 7.4. Los ligandos de preferencia tienen una KD de menos de aproximadamente 600 µ? para el objetivo. Más de preferencia, la KD es de menos de aproximadamente 60 uM, aun más de preferencia de menos de aproximadamente 6 uM, todavía más de preferencia menos de aproximadamente 0.6 µ?, y aún además más de preferencia menos de aproximadamente 0.06 uM. Química combinatoria Existen por lo menos cinco técnicas comunes para _ realizar la producción de biblioteca combinatoria que son aplicables a la producción de los ligandos, ver Lam (1997), ver también Al-Obeidi y colaboradores (1998), ver las patentes norteamericanas Nos.. 5,424,186; 5,449,754; 5,503,805; 5, 650, 489; 5, 962,736; 6,042,789; 6,051,439; 6,083, 682; 6,117,397; 6,168,913; 6,168,914 y 6,355,490. Las técnicas comunes son bibliotecas biológicas, bibliotecas en solución de fase sólida o paralelas espacialmente dirigibles, métodos de bibliotecas ' sintéticas que requieren desconvolución, un método de una cuenta, un compuesto, y métodos de biblioteca sintéticas utilizando la selección de cromatografía de afinidad. En generál, las técnicas de producción de bibliotecas combinatorias implican: generar un conjunto de péptidos (también referido como una biblioteca) de aminoácidos, típicamente utilizando un algoritmo aleatorio o semialeatorio para arreglar las secuencias de los péptidos; clasificar rápidamente el conjunto para una propiedad biológica específica, típicamente al determinar qué péptidos enlazan a un objetivo; e identificar los péptidos que tienen la propiedad biológica. La identificación de los péptidos es típicamente realizada por un método de desconvolución, por análisis químico directo o por análisis de la secuencia de aminoácidos . Los tipos generales de métodos de producción combinatorios para los ligandos tienen varias modalidades. Las bibliotecas en fase de solución o en fase sólida paralelas espacialmente dirigibles incluyen, por ejemplo, la tecnología de multiperno, membrana SPOTs, síntesis de péptido dirigida con luz sobre microplaquitas y la tecnología de diversómero . Las bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución incluyen un procedimiento iterativo, exploración de posición, desconvulción recursiva y procedimientos de partición ortogonales. Las bibliotecas combinatorias de péptidos se limitaron a unos cuantos cientos de compuestos cuando primero se introdu eron, por ejemplo, alrededor de 1984. Pero la preparación* la clasificación de muchosv millones de péptidos es actualmente factible, especialmente cuando se utiliza el procedimiento biológico (por ejemplo, Devlin y colaboradores, 1990) un procedimiento iterativo a las bibliotecas de péptido en fase de solución (por ejemplo Houghton y colaboradores, 1991), un procedimiento de una cuenta y un compuesto (por ejemplo, Lam y colaboradores, 1991) o un procedimiento iterativo de acumulación dividida. La biblioteca biológica implica el uso de células, fagos, plásmidos y/o polisomas para generar péptidos. El procedimiento de fago es ejemplificado por Parmley y Smith, 1988. El procedimientos de plásmido es ejemplificado por Schatz, 1993. El procedimiento de polisomas en ejemplificado' por Kawasaki, 1991. El procedimiento biológico es particularmente útil cuando se desean ligandos grandes o compuestos biológicos que llevan ligandos . Las bibliotecas en fase de solución o sólida paralelas espacialmente dirigibles se hacen al sintetizar péptidos sobre un soporte de fase sólida, de modo que los péptidos pueden ser dirigidos espacialmente y la secuencia de cada uno de los péptidos es conocida o las secuencias son predeterminadas. Típicamente, la secuencia de cada péptido es predeterminada de modo que la secuencia del péptido es averiguada meramente al determinar su posición. El procedimiento de multi-perno es e emplificado por Geysen y colaboradores (1984) . El procedimiento Ue membrana SPOTS es ejemplificado por Frank (1992). El procedimiento de síntesis de péptido dirigida con luz sobre microplaquitas es ejemplificado por Fodor y colaboradores (1991) . El procedimiento de diversómero es ejemplificado por DeWitt y colaboradores (1993) . Las bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución incluyen una técnica iterativa. La técnica iterativa es ejemplificada por Blondelle y colaboradores (1995) . Esta técnica implica múltiples etapas de síntesis de péptido, especificación y análisis. Por ejemplo, para un procedimiento utilizando 20 aminoácidos y lin ligando de diez aminoácidos en longitud, se hacen múltiples mezclas de péptido que tiene la primera posición y la segunda posición de ligando como un conocido, con cada combinación posible de los dos péptidos que están presentes . Las posiciones restantes son aminoácidos aleatorios. Así cada combinación de dos péptidos conocidos en las primeras dos posiciones da por resultado un total de 400 mezclas. Las mezclas múltiples son clasificadas para la actividad biológica y es seleccionada la mezcla más activa. Se hace un nuevo conjunto de mezclas que tiene las primeras dos posiciones fijadas y la tercera posición sistemáticamente variada. Así se hacen 20 nuevas mezclas que tiene cada una de las primeras exposiciones . como conocidas . Las '-"mezclas luego son clasificadas para una propiedad biológica y el proceso es repetido . Un método de desconvolución relacionado es el método de exploración de posición ejemplificado por Dooley y Houghten (1993) . Como un ejemplo para un ligando de hexapéptido y 20 aminoácidos, se hacen 120 mezclas con cada mezcla que tiene un aminoácido conocido en una de las seis posiciones. Las mezclas son clasificadas y las mezclas que son activas pueden ser utilizadas para ensamblar el ligando. Otra técnica iterativa relacionada es la técnica de síntesis de división, ejemplificada- por Erb y colaboradores (1994) . La Figura 3 representa el algoritmo para este procedimiento, los péptidos que son sintetizados mediante la síntesis de fase sólida en donde las cuentas son preparadas con un aminoácido unido y los péptidos son construidos al enlazar secuencialmente aminoácidos adicionales. Con referencia a la Figura 3, se hacen" mezclas que tienen una pluralidad de cuentas que tiene cada una un aminoácido A, B o C conocido. Las cuentas son combinadas en ina mezcla y luego divididas en tres mezclas idénticas (puesto que hay tres aminoácidos conocidos) . Cada mezcla tiene un aminoácido conocido A, B o C unido para hacer cada combinación posible de dimeros de aminoácido que se pueden hacer con A, B y C. Las mezclas luego son combinadas y divididas en nueve mezclas idénticas (puesto que- hay nueve combinéfciones diferentes de dimeros) . Cada mezcla se hace reaccionar con A, B, C, se combina y se divide en 27 mezclas idénticas. El procedo se repite como sea necesario para alcanzar la longitud deseada. Con referencia a la Figura 3, cada cuenta finalmente lleva un péptido único, individual. Una sola etapa de clasificación es de preferencia realizada después de que se han hecho todas las combinaciones . Otra técnica iterativa relacionada para hacer los ligandos es la técnica de partición octagonal, ejemplificada por Deprez y colaboradores (1995) y Pirrung y Chen (1995). Esta técnica combina la síntesis de división y ' el procedimiento de exploración de posición. Otra técnica iterativa relacionada para hacer los ligandos es la técnica de una cuenta y un compuesto, como es descrito por Lam y Lebl (1996) y Lam y colaboradores (1997) . Un procedimiento particularmente efectivo de esta técnica utiliza el método de síntesis de división. Con referencia a la Figura 4, las cuentas, representadas por "O" son cubiertas por un solo aminoácido. Las cuentas son divididas en grupos y cada cuenta luego es reaccionada con cada aminoácido que va a ser utilizado. Los grupos son combinados, divididos y reaccionados con un aminoácido adicional. En el caso de 2Q aminoácidos, las cuentas están inicialmente en grupos y cada cuenta recibe un aminoácido único. Las resinas luego son mezcladas, 'desprotegidas y hechas porciones en 20 grupos. Cada grupo recibe un aminoácido adicional . Una biblioteca de pentapéptido con 20 aminoácidos en cada ciclo de acoplamiento tiene 205 (3.2 millones) de permutaciones. Tal biblioteca puede ser rápidamente generada en un aparato modesto en un equipo de universidad en 2-3 días, ver Lam, 1997. Equipos comerciales típicos podrían producir tal biblioteca mucho más rápidamente . Un método de biblioteca sintético que utiliza la selección de cromatografía de afinidad también es útil para producir los ligandos. Este método típicamente implica generar una biblioteca en fase sólida, usualmente' mediante un método de síntesis de división utilizando cuentas . Los péptidos son retirados de las cuentas y en solución con los péptidos presentes en cantidades equimolares . La solución luego es pasada a través de una columna de cromatografía de afinidad que lleva una molécula objetivo inmovilizada. Después de las etapas de lavado apropiadas, los péptidos son diluidos de la column y secuenciados para determinar qué péptidos enlazan el objetivo. Existen muchas variaciones de esta técnica, por ejemplo, los péptidos enlazados pueden ser diluidos utilizando lavados sucesivos de concentración incrementada de modo que los péptidos de diferentes afinidades de enlace son capturados en diferentes fracciones de elusión. Reportes ejemplares de esta técnica están en Son'gyang y colaboradores (1993 y 1995) . Algunos de los métodos combinatorios requieren una etapa para determinar la estructura de ligando biológicamente activo, por ejemplo el método de una cuenta - un compuesto. La secuenciacion automática mediante la degradación de Edman es preferible puesto que este proceso actualmente tiene una sensibilidad de detección de mejor que 1 pmol. Sin embargo, procedimientos alternativos incluyen la espectroscopia de masas, la espectroscopia de masas de ionización por desorción de . láser asistida con matriz (MALDI) , la espectroscopia de masas por ionización, o técnicas MS-MS y el uso de residuos, especialmente residuos químicos . una multiplicidad de estrategias de clasificación está disponible. Un procedimiento es el uso de una prueba de fase sólida. Los ligandos son unidos a un soporte sólido, por ejemplo, una microplaquita, perno, cuenta, hoja de plástico, vidrio, fago filamentoso. El objetivo es adicionado al soporte y los ligandos son examinados para la actividad biológica. Tal actividad puede incluir por ejemplo, el enlace, o una prueba funcional tal como la proteólisis o fosforilación. El enlace es convenientemente medido directamente (por ejemplo, mediante la visualización de un tinte sobre el objetivo) o indirectamente , (por ejemplo, mediante un grupo reportador tal como una enzima) .
Otro método de clasificación implica las pruebas en fase de solución. Los ligandos están en una solución que es expuesta al objetivo. La interacción entre el ligando y el objetivo es detectada y el ligando es aislado. Ejemplos de tales técnicas incluyen las pruebas de enlace de receptor competitivo con un objetivo o ligando radiomarcado conocido, la prueba de ELISA competitiva utilizando antigenos recubiertos en placa, pruebas enzimáticas tal como la prueba proteolitica utilizando un sustrato fluorogénico, pruebas antibacterianas y pruebas de señal basadas en la células . Los procedimientos de síntesis combinatoria de desconvolución iterativa y de división de acumulación son preferidos para hacer ligandos que tiene aminoácidos sulfatados; sin embargo, otras técnicas también pueden ser aplicadas, incluyéndose la exploración de posición, síntesis de arreglo, estrategias no lineales, dobles y ortogonales. Las bibliotecas de preferencia son clasificadas sobre soportes sólidos, pero también pueden ser fácilmente clasificadas por otras técnicas, por ejemplo, en solución utilizando el método de multiperno. La química combinatoria es una modalidad preferida del método para producir ligandos. Otras técnicas, sin embargo, son adecuadas. Los peptidométicos en amínopéptidos sulfatados y sulfonados también " pueden ser ya sea descubiertos directamente y/o mediante diseño racional.
Usos y Aplicación v Los ligandos que son sulfatados o sulfonados pueden ser producidos para objetivos que tienen dominios de enlace de heparina. Los ligandos son útiles para muchas aplicaciones, incluyéndose aquellas que requieren una etapa de enlace del objetivo. Estas aplicaciones incluyen el trabajo tanto in vitro como in vivo. Ejemplos de tales aplicaciones para estos ligandos incluyen usos, agonistas, antagonistas, agentes de enlace de afinidad, marcadores y vehículos de suministro. Un ejemplo de un agonista es un ligando que enlaza su objetivo y de esta manera imita el • efécto que algún otro ligando habría producido del objetivo/ Otro ejemplo de un agonista es un péptido que actúa como una sustancia mimética de heparina que enlaza a ATIII e induce un cambio de conformación a la proteína de una manera similar a aquélla hecha por la heparina, induciendo de esta manera la actividad de inhibición de trombina de la ATIII. Los ligandos son útiles en la biotecnología y medicina, por ejemplo, como marcadores, agonistas, antagonistas y agentes de enlace de afinidad específica. Un ejemplo de un antagonista es un ligando que enlace a un objetivo y de esta manera detiene o reduce la actividad biológica del objetivo. Otro ejemplo es un péptido que enlaza a un factor de crecimiento por medio de su dominio de enlace de heparina sólo o en combinación con otros sitios sobre la proteína, para bloquear el énlace del factor de crecimiento a otras moléculas . En el caso de VEGF, su enlace puede ser bloqueado a sus receptores de superficie celular de baja afinidad o de alta afinidad. El enlace del factor de crecimiento de los receptores de la superficie celular, especialmente los receptores de superficies celular de baja afinidad, implica el sitio de enlace de afinidad de heparina, y el bloqueo de este sitio puede ser utilizado para bloquear la actividad biológica de VEGF. Un ejemplo de un agente de enlace de afinidad es un ligando que enlaza una biomolécula la cual luego es inmovilizada. Cuando es inmovilizada sobre un soporte" de purificación, la afinidad entre el péptido y, por ejemplo, un factor de crecimiento, es utilizada para purificar el factor de crecimiento de las mezclas biológicas o de fermentación complejas. Cuando es inmovilizado sobre una matriz de suministro de fármaco o dispositivo implantable, el factor de crecimiento es retenido para la acción biológica cerca del dispositivo o es liberado desde el dispositivo. Un ejemplo de un marcador es un ligando que se hace completo con un agente de modo que se marca una interacción entre el ligando y el objetivo. Ejemplos incluyen ligandos formados en complejo .con moléculas fluorescentes, tintes, avidina, biotina, anticuerpos, enzimas que son utilizadas para crear una tintura, peroxidasa, rábano picante y marcas radioactivas. Otros ejemplos incluyen DNA, proteínas,-proteína fluorescente verde, emisores de radioondas, agentes de contraste y nanopartículas . Las moléculas biológicas pueden servir como objetivos y ser marcadas. Los marcadores muestran como los objetivos son' expresados y la función. La necesidad para marcadores es más precisa desde la completación del proyecto de genoma humano puesto que muchas moléculas que se han descubierto que tienen expresión y función conocidas. Así cualquier ligando que enlaza una biomolécula es útil como un marcador. Los marcadores pueden ser originados in vitro o in vivo. Los' usos, in vitro incluyen manchas para histología y' como herramientas de visualización para un microscopio fluorescente. Los usos in vivo incluyen la marcación de un objetivo para averiguar su concentración, distribución o movimiento. Por ejemplo, la concentración de un factor de crecimiento en el hígado y su tiempo de evacuación pueden ser inspeccionados al inyectar el hígado con un marcador que tiene un ligando para el factor de crecimiento. El marcador puede ser detectado para determinar el destino del factor de crecimiento. Muchos marcadores actualmente utilizados para el uso in vivo pueden ser adaptados para el uso con un ligando por ejemplo, al adicionar el ligando a un marcador o al reemplazar el ligando del marcador con un ligando hecho como es descrito en la presente.
Las modalidades incluyen ligandos que tienen un periodo de vida media controlado por degradación, especialmente degradación de sulfatos. Por ejemplo, un ligando puede tener múltiples sulfataciones que interactúan como un sitio de enlace. La degradación progresiva de los ligandos da por resultado un ligando que tiene progresivamente menos afinidad para el objetivo. Alternativamente, el ligando puede tener un número determinado de sulfataciones y tener una actividad que desciende a niveles esencialmente antecedentes cuando es degradada a la sulfatación. Un periodo de vida media limitado es útil para controlar la liberación de factores "enlazados. Por ejemplo, un factor de crecimiento enlazado ' a un dispositivo médico por un ligando podría ser liberado mediante la degradación de ligando. La degradación de un sulfato puede ser influenciada por factores tal y como el impedimento estérico, pH local y plegamiento. Los ligandos pueden ser diseñados con estos factores para controlar la degradación de sulfato. Otro uso de un ligando degradable es para controlar el periodo de vida media en el ligando del paciente. Por ejemplo, un ligando de periodo de vida media corto que inhibe la coordinación de la sangre podría ser administrado a un paciente. El ligando luego se degradaría y e itaría cualquier necesidad para administrar un agente que restauraría al paciente a un estado de coagulación normal.
Los ligandos que enlazan y activan ATIII pueden ser utilizados, por ejemplo, para inhibir la coagulación de la sangre. Los ligandos de enlace de ATIII pueden ser introducidos a un paciente a la concentración requerida para alcanzar el nivel deseado de inhibición. Los ligandos que enlazan a VEGF e inhiben su actividad pueden ser utilizados, por ejemplo, para inhibir la angiogénesis . Asi, los ligandos pueden ser útiles para la terapia de tumor, tratamiento de artritis reumatoide, angiopatia diabética, desórdenes oculares tal como la hiperplasia retinal y la enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por hipoxia u otras enfermedades caracterizadas por angiogénesis no controlada. Un ejemplo de un vehículo de suministro es un ligando utilizado para suministrar algún otro agente a una ubicación deseada o un objetivo deseado. Por ejemplo, un ligando formado en complejo con un veneno podria ser utilizado para suministrar el veneno podria ser utilizado para suministrar el veneno al objetivo de ligando, por ejemplo, un receptor de dolor, célula T o célula cancerígena. O un .ligando podria ser unido a un.liposoma de modo que el liposoma se unirla al objetivo de ligando, por ejemplo, un tipo de célula particular. Asi, tecnologías existentes que utilizan ligandos para interactuar con objetivos pueden ser adaptadas para el uso con los ligandos como son descritos" en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos utilizados para suministrar enzimas como es descrito en la patente norteamericana No. 5,851,527 podrían ser reemplazados con ligandos hechos como son descritos en la presente. O el procedimiento basado en anticuerpo utilizado para neutralizar factores de crecimiento como es descrito en la patente norteamericana No. 5,662,904 podría ser adaptado para el uso con ligandos que son descritos en la presente. Suministro Los ligandos pueden ser suministrados por un medio adecuado adaptado para la aplicación. Ejemplos de suministró de un ligando incluyen por medio de la inyección, incluyéndose intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente y en una solución farmacéuticamente aceptable y vehículos estériles, como soluciones reguladoras fisiológicas (por ejemplo, solución salina o suero de glucosa) . Los ligandos también pueden ser administrados oralmente o rectalmente, cuando son combinados con excipientes sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables . Los ligandos también pueden ser administrados externamente, por ejemplo, . en la forma de un aerosol con un vehículo adecuado, apropiado para este modo de administración, por ejemplo, nasalmente. Además, el suministro a través de un catéter u otra tubería quirúrgica es posible. Las rutas alternativas, incluyen tabletas, cáp-sulas y similares, nebulizadores para formulaciones líquidas e inhaladores para ligandos liofilizados o aerosolizados . Muchos aspectos del suministro de ligando son descritos en la presente. El suministro de un ligando puede ocasionar el suministro del ligando mismo o el suministro del ligando así como estructuras o compuestos con los cuales los ligandos están unidos o asociados . Los métodos actualmente conocidos para suministrar moléculas in vivo e in vitro, ' especialmente moléculas o péptidos pequeños, pueden ser utilizados para los ligandos. Tales métodos incluyen microesferas, liposomas, u otros vehículos de micropartículas o formulaciones de liberación controlada colocadas en ciertos tejidos, incluyéndose la sangre. Ejemplos de portadores "de liberación controlada incluyen matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos conformados, por ejemplo, supositorios o microcápsulas . Una variedad de métodos de suministros adecuados son expuestos en, por ejemplo, Senel. y colaboradores (2001), Cleland (1997), Okada H y Toguchi
(1995) , Leh (1994), Jabbal-Gill y colaboradores (2001), Vix
(1996) , Duncan (1992), Langer y Moses (1991), Sanders (1990) Eppstein (1988), Hyon (2000), Verma y colaboradores (2000), Haroun y rem (2000), Meers (2001), Brandl (2001), Benerjee (2.001), Ravi (2000), Hatefi an sden (2002, Vandamme (2002), Lavasanifar y colaboradores (2002), Vefma y Krishna (2002), Sood y Panchagnula (2001), Zimmer y Ashburn (2001), Bussemer y colaboradores (2001), Rgar y colaboradores (2001), Lo y colaboradores (2001), Qiu y colaboradores (2991), Grabow y colaboradores (2001), Torchilin (2001), Pillai y colaboradores (2001), Vyas y colaboradores (2001), Krafft (2001), Groothuis (2000), Soppimath y colaboradores ¦ (2001) , Muller (2000), Sinha y Kaur (2000), Kumar (2000), Hussain (2000), Ettenson y Edelman (2000), Chorny y colaboradores (2000), Gonda (2000), Haroun y Brem (2000) y las patentes norteamericanas Nos . 5, 626, 877; 5,891, 108 5, 972, 027
6", 041,252 6,071, 305 6, 074, 673; 6,083,996 6, 086, 582 6, 08'6, 912 6,110,498 6,126,919, 6,132,765 6,136,295 6, 142, 939 6,235, 312 6,235,313; 6,245, 349 6, 251, 079 6, 283, 947 6,283, 949 6, 287, 792; 6,296, 621 6, 309, 370 6, 309, 375 6, 309, 380 6, 309, 410; 6,317,629 6, 346, 272; 6,350,780 6,379,382; 6, 387,124; 6,387,397 y 6,296,832. Métodos adicionales de suministro son descritos en las solicitudes de patentes norteamericanas copendientes, números de serie- 10/021,508, presentada el 22 de octubre del 2001; 10/035', 625 presentada el 28 de Diciembre del 2001; 09/811, 901 presentada el.19 de marzo del 2001; 09/738,961 presentada el 15 de Diciembre del 2000; 09/772,174 presentada el 28 de Enero del 2001; 09/798,338 presentada el 2 de Marzo del 2001 y 09/586,937, intitulada "Conjúgate addition reactions for the controlled delivery of phar¾iaceutically .active compounds", presentada el 6 de Febrero del 2000. Los sistemas y métodos descritos en la presente son ejemplos de la invención y no se proponen para limitar su alcance y espíritu. Personas expertas en estas técnicas apreciarán variaciones en las modalidades de la invención después de la lectura de esta descripción. Todas las publicaciones citadas o de otra manera referenciadas en la presente, incluyéndose libros, artículos de revistas, solicitudes de patentes y patentes, son incorporadas en la presente por referencia. •EJEMPLO 1. PRODUCCION DE LIGAND05 PARA EL OBJETIVO VEGF." Los péptidos sulfatados ensamblados en una biblioteca de acuerdo con un procedimiento de síntesis de división de acumulación se utilizaron para producir ligandos que enlazan a VEGF. La síntesis fue semialeatoria, con una porción, de las secuencias en la biblioteca que es racionalmente seleccionada para hacer péptidos que enlazan con alta afinidad a VEGF. Síntesis de la Biblioteca La resina Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-PEGA se preparó mediante la síntesis de péptido en fase sólida de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) manual, estándar al someter la resina aminopolietilenglicol acrilamida (PEGA) (3.6 g, 0.22 mmol) a Fmoc-Gly-OH (0.26 g, 0.86 mmol) , 1-hidroxibenzótriazol (HOBT, 0.12 '¦" g, ' 0.86 .rnmol) , hexafluorofosfato de 2- ( 2-ff-benzotriazol-l-il) -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio (HBTU, 0.33 g, 0.86 mmol) y ?,?-disopropiletilaminaO (DIEA, 0.3 mL, 1.7 mmol) un total de cuatro veces. La resina Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-PEGA (0.22 mmol) luego se dividió en 9 porciones iguales y se cargó en 9 cavidades de una placa aglomerada, de 48 cavidades. La resina se hinchó durante una hora con DMF y se enjuagó como DMF (3 x 4 mL) . Los grupos Fmoc luego se retiraron utilizando piperidina al 20% en DMF (2 x 4 mL x 10 min por cavidad) y la resina se enjuagó como DMF (3 x mL) . A un frasquito que contiene HOBT' (0.12 g, 0.86 mol) y HBTU (0.33· mg, 0.86 mmol) se adicionaron 18 mi de DMF y el frasquito se agitó hasta que se disolvieron los sólidos. La solución se dividió en 9 porciones iguales y se adicionó a 9 frasquitos que contienen 0.096 mmol de Fmoc-Tyr (S03)-OH, Fmoc-Asp) tBu) -OH, ' Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ile-OH o Fmoc-Phe-OH. Los frasquitos se agitaron hasta que los sólidos se disolvieron antes de que se adicionara DIEA (34 µL, 0.19 mmol por frasquito) . Cada frasquito se adicionó a una porción, de resina, la placa se selló y se agitó mecánicamente durante 1 hora. La resina luego se enjuagó con DMF (5 x 4m L) , se recolectó, se mezcló completamente y se dividió en 9 porciones iguales. El procedimiento se repitió 3 veces más, antes de que se acumulara la resina, se enjuagó con DMF*-* {5 x 5 mL) , DCM (5 x 4 mL) y MeOH (5 x mL) . Para retirar los grupos protectores, 33 mL de TFA:TIS:H20 (95:2.5:2.5) que se ha enfriado a 4°C se adicionaron a la resina y la mezcla se mantuvo a 4°C durante 2 horas antes de la remoción de la solución y el lavado de la resina con TFA frío (20 mL) seguido por MeOH (400 mL) . La biblioteca desprotegida que contiene muchas copias de aproximadamente 6, 600 péptidos diferentes se almacenó hinchada en MeOH a -20°C hasta el uso. La síntesis manual de fase sólida, Fmoc estándar de la biblioteca se llevó a cabo utilizando HBTU, HOBT y DIEA en DMF como agentes de acoplamiento. Se emplearon cuentas- de amino-PEGA, NOVA-biochem basado en Poli (etilenglicol) debido al bajo fondo de fluorescencia y las características de hinchamiento favorables de esta resina en agua . Puesto que el proceso de clasificación implica identificar las cuentas que tienen fluorescencia, es importante una señal de bajo fondo. La resina TENTAGEL estándar dio una fluorescencia de fondo no homogénea cuando se visualizó a través de _ fluoresceína o filtros Dapi. Un espacio de tetraglicina se insertó entre la fijación de la resina y el extremo carboxilo de la biblioteca para incrementar la accesibilidad a VEGF del proceso de clasificación y para ayudar en la caracterización de la biblioteca. La tetraglicina se cree que no enlaza específicamente VEGF puesto que la mayoría de los péptidos en la biblioteca que tuvieron tetraglicina carecieron de actividad específica. Los grupos protectores de los péptidos se retiraron utíÜ2ando RFA a 4°C para venir la desulfatación de la tirosina. De esta manera, se sintetizaron muchas copias de los 6,600 elementos de la biblioteca. La elección racional de las porciones en la secuencia se basó en un examen de la funcionalidad de heparina y el sitio de enlace de heparina de VEGF. El paso de elección racional es opcional y se empleó por conveniencia de modo que el tamaño de la biblioteca podría ser reducido. En este caso, la molécula objetivo VEGF se conoció que tiene aminoácidos básicos, arginina y licina, en un dominio- .de enlace de heparina putativo . " Puesto que cuatro aminoácidos es la longitud de péptido mínimo que podría ext nder la región más pequeña de este dominio de enlace de heparina, la longitud de los péptidos · en la biblioteca se ajustó a cuatro. La heparina se conoce que contiene grupo sulfato carboxílico hidroxilo. Por lo tanto, una tirosina sulfatada, ácido aspártico, ácido glutámico y serina se incluyeron como aminoácidos para los péptidos en la biblioteca. Además, puesto- que las interacciones .hidrofóbicas se cree que ayudan en el enlace de la heparina, también se emplearon aminoácidos hidrofóbicos glicina, alanina, valina, isoleucina y fenilalanina . Así la biblioteca de tetrapéptido se ensambló de nueve aminoácidos para hacer 94 o aproximadamente 6, 600 compuestos." Alternativamente, por ejemplo, todos Los 20 aminoácidos naturales podrían haber sido utilizados para hacer una biblioteca de 204 a aproximadamente 160,000 compuestos . Clasificación de la Biblioteca Las cuentas (aproximadamente 10 copias de la biblioteca) se hincharon en ¾0 durante 1 hora. La mezcla se sometió a centrifugación y el agua se retiró. La solución de cumerina-VEGF en TBS se adicionó (-0.1 mg/mL) a las cuentas durante 1 hora antes de la división de las cuentas de 6 porciones y al colocarlas en una placa de 6 cavidades . Las cuentas luego . se agitaron durante 16 horas a- temperatura ambiente antes de que se removiera la solución de VEGF-cumerina. Como controles, resina de PEGA no sustituida (10 mg) y agarosa de heparina (10 mg) también se incubaron con la cumerina-VEGF. Las cuentas y los controles luego se observaron a través de un microscopio de disección equipado con una lámpara negra de UV. Las cuentas y los controles se lavaron con TBS hasta que las cuentas de control de PEGA no fueron fluorescentes. Las cuentas de la biblioteca y las cuentas de heparina-agarosa luego se sometieron a los lavados con Tris 20 mM a pH 7.6 que contiene NaCl 0.25 M (2x) , seguido por NaCl 0.5 M (3x), 1 M (lOx) y 2 M (2x) . Mientras que se visualiza con el microscopio de disección y la lámpara negra de UV, se utilizó una micropipeta para recuperar las cuentas individuales (288' en total) que '-fueron más brillantes que las cuentas de fondo, y cada cuenta se colocó en una carga individual de una placa de 96 cavidades. Las placas luego se almacenaron a 4°C. Ordenamiento de las Cuentas La señal fluorescente de cada cuenta se cuantificó al formar en imagen cada cuenta individual (conservando la ganancia consistente y el equilibrio blanco ajustado a cero) sobre un microscopio invertido equipado con un filtro Dapi. El radio (r) y la suma de los pixeles (? Pix) de cada cuenta se determinaron después de convertir cada imagen a escala ¦gris sobre MATROX INSPECTOR. Utilizando INTERAC IVIDAD DATA LANGUAGE y EXCEL, se realizaron minimizaciones X2 sobre la suma de los pixeles contra el radio y el mejor ajuste se determinó que es de 2.35 (Apéndice 1). Cada cuenta luego se ordenó de acuerdo con ? Pix/r2"35 (Apéndice 2) . Análisis de las Cuentas Para facilitar el análisis y retirar la cumerina-VEGF, los residuos de Tyr(S03) se desulfataron. Las cuentas se lavaron con ¾0 (1 x 0.2 mL) y el agua se retiró. A cada cavidad se adicionó TFA al 30% en agua (0.1 mL) y las placas se. calentaron en un horno ajustado a 60°C durante 1 hora. Las soluciones de TFA se retiraron y cada cuenta se lavó con ¾0 (4 x 0.1 mL) . Las cuentas se almacenaron en 0.1 mL de agua a . 4°C hasta el uso. Las cuentas que se seleccionaron para el análisis adiciona'! se sometieron a la microsecuenciación. Expresión y Purificación de -VEGF16S Los huéspedes de expresión de E. coli AD494 (DE3.)pLysS se transformaron con un plásmido pRSET-VEGFi65. La proteina VEGF recombinante que se expresó y se aisló de los cuerpos de inclusión .como es descrito previamente. El replegamiento y la dimerízación del VEGF se alcanzó mediante la diálisis secuencial contra la solución reguladora Tris 20 mM pH 7.6 con urea 4M y EDTA 1 mM (2x 1L) , seguido por la solución reguladora que contiene urea 2M (2x2L) , urea Í (2X4L) y finalmente solución reguladora (2x4L) . La dimerización se confirmó mediante SDS-PAGE y el manchado de coomassie bajo condiciones no reductoras. La proteina luego se purificó mediante la cromatografía de heparina-agarosa utilizando un gradiente de NaCl 0.25 a 2M en solución reguladora de Tris 20 mM pH 7.6. La proteina final se dializó contra Tris 20 mM y NaCl 150 mM (TBS) a pH 7.6 y se almacenó a -80°C hasta el uso. Una producción tipica de 8 mg/L de cultivo bacteriano de VEGFi65 se obtuvo. Marcación de VEGF16s Aproximadamente 1.2 mg de EGF165 se cargaron sobre una columna de heparina-agarosa y la columna se lavó con NaHCC>3 0.1 M varias veces. Ester succinimidilico de ácido 6-( (7-amino-4-metilcumarin-3-acetil) amino) hexanoico se diluyó de una solución de DMSO en NaHCCb 0.1 MV 130 µg de cumerina en 1.3 mL de solución reguladora se cargaron sobre la columna y se incubaron el VEGFies durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por 23 horas a 4°C. La cumerina en exceso luego se retiró al lavar completamente la columna con TBS antes de la elusión de la proteina con Tris 20 M en NaCl 1 M a pH 7.6. La marcación de VEGF165 se confirmó mediante manchas brillantes con UV sobre el SDS-PAGE que correspondieron a la proteina visualizada con el manchado de Coomassie. La proteina final de concentró y se desalificó mediante centrifugación utilizando tubos VIVAspin con un MWCO de 5, 000 y se almacenó a 4°C hasta el uso. De- esta manera, la cantidad típica de marcación, estimada por las mediciones de UV, fue de 4 cumarinas/VEGFi65. La clasificación de la biblioteca se llevó a cabo mediante la incubación de las cuentas con EGF165 marcado con cumarina, la isoforma más común de VEGF. El término VEGF influye todas las formas, isoformas, variaciones, imitantes y versiones derivadas de VEGF humano. VEGF165 se expresó de E. coli y se replegó correctamente a la forma' dimérica. El éster succinimidilico de ácido 7-amino-4-metilcumarin-3-acético (AMCA-NHS), que tuvo una estabilidad pronunciada a los efectos de fotoapagado, se conjugó a VEGFi65 que fue preabsorbida a una columna de heparina-agarosa. VEGFi65 es retenido en esta columna a través de la interacción del dominio de enlace de heparina con hepafina. la reacción del AMCA-NHS con VEGF de esta manera asegura que los residuos básicos del dominio de enlace de heparina no reaccionan con el éster succinimidilico . También, la producción del producto es fácil puesto que el VEGF es solamente liberado de la columna cuando se utilizan soluciones de NaCl > 0.5 M. AMCA-NHS residual se retiró con una solución reguladora de bajo contenido de sal antes de la' elusión de la proteina, el grado de marcación se estimó que es de 5 cumarinas por VEGF. El grado de marcación se determinó de las mediciones de absorbencia del complejo de proteina-cumarina .
Aproximadamente 0.1 mg/mL del VEGF155 marcado en TBS se incubó con ~10 copias de la biblioteca, las cuentas de amino-PEGA que no contienen péptido, y las cuentas de heparina-agarosa durante 16 horas bajo condiciones de agitación. Los dos últimos sirvieron como "los controles. Las cuentas y la heparina-agarosa se lavaron con TBS para retirar el EGF165 no enlazado hasta que las cuentas de amino-PEGA que no contienen péptido no fueron fluorescentes. La biblioteca y las cuentas de heparina-agarosa luego se lavaron sucesivamente con Tris 20 mM a pH 7.6 que contiene NaCl 0.25 M (2x), 0.5 M (3x), 1 M (lOx), y 2 M (2x) . EGF165 no fluorescentemente marcado se observó en las cuentas de control de heparina-agarosa después de los lavados ccn la solución reguladora de NaCl 1.0 M. Utilizando un microscopio de disección en la lámpara negra de UV para visualizar la biblioteca, las cuentas fluorescentes se recolectaron de un fondo de cuentas no fluorescentes con una micropipeta e individualmente se colocaron en cavidades de una placa de 96 cavidades. De esta manera, se seleccionaron 288 cuentas para el análisis adicional. Puesto que el VEGFi65 es liberado de las cuentas de heparina agarosa con NaCl 0.5-1.0 M se supuso que las cuentas que fluorescen después del lavado con NaCl 2 M fuertemente enlazan VEGF. La fluorescencia de cada cuenta se cuantificó al formar en imagen cada cuenta individual sobre un microscopio invertido' equipado con un filtro Dapi. El radio (r) y la sum de los pixeles (? Pix) de cada cuenta se determinó después de -la conversión de las imágenes, a escala sobre el Matrox Inspector. Las cuentas se ordenaron de acuerdo con el ? Pix/r2'35. La potencia se determinó al graficar la suma de los pixeles contra el radio y al realizar una minimización X2 para obtener un mejor ajuste. La división entre el radio al 2.35 fue necesario para tener en cuenta las diferencias en el tamaño de la cuenta y las diferencias artificiales correspondientes en la suma de intensidades de pixeles. El histograma de. las cuentas seleccionadas (Figura 5) revela que el valor promedio de ? Pix/r2'35 fue de 28, mientras que varias cuentas fueron significativamente más brillantes que el resto con ? Pix/r2-35 de más de 60. Las cuentas más brillantes (? Pix/r2'35 de por lo menos1' 60), varias cuentas con valores de ? Pix/r2-35 52 y 46, las cuentas con el ? Pix/r2"35 promedio de 28 y una cuenta no fluorescente se seleccionan para el análisis mediante la microsecuenciación. Antes de la microsecuenciación, las cuentas se desulfataron mediante el calentamiento a 60°C en TFA al 30% durante 1 hora para facilitar el análisis. El VEGFi65 se retiró durante este proceso, proporcionando evidencia de que los grupos sulfatos son importantes para el enlace. La cumarina no fue simplemente apagada durante la desulfatación puesto que las cuentas de PEGA marcadas con cumarina retuviero la fluorescencia después "de este proceso. Las cuentas luego se microsecuenciaron. Los ligandos que se produjeron como es mostrado en la Tabla 1, con los ligandos que son ordenados de acuerdo con la afinidad como es medido determinando la suma de los pixeles y el radio de la formación de imagen de fluorescencia de las cuentas que produjeron los ligandos. Una cuenta que no retiene fluorescencia después del lavado con la sal también se secuenció como un control negativo (mostrado como 0 en la Tabla 1) . Tabla 1. Ligandos para VEGF ?J Pix/r2'35 Secuencia Ver la SEQ ID NO:
64 Ser-Tyr (S03) -Asp- 2 Tyr (S03) 61 Ser-Tyr (S03) -Asp- 2 Tyr(S03) 60 Ala-Tyr ( S03 ) -Asp- 3 Tyr(S03) 52 Ser(Gly)-Tyr (S03)- 4,5 Tyr (S03)-Phe* 51 Ser-Tyr (S03) -Ala- 6 Tyr (S03) 46 Gly-Tyr (S03) -Ala- 7 Tyr (S03) 28 Gly-Tyr (so3) - al-Glu 8 28 Asp-Tyr (S03) - 9 Tyr(S03)-Tyr (S03) 28 Gly-Tyr (S03) -Ser-Glu 10 0 Asp-Ile-Asp-Phe — *E1 primer aminoácido en esta secuencia fue incierto y podría ser ya sea serina o glicina. Las dos cuentas ordenadas más activas fueron las mismas, SY(S03)DY(S03) (Ver la SEQ ID NO: 2) y contuvieron los grupos también encontrados en heparina, específicamente la funcionalidad sulfato, carboxilo e' hidroxilo. la tercera cuenta ordenada tuvo una porción similar, Y(S03) -D-Y(S03) (Ver la SEQ ID NO:l) con una alanina en lugar de serina en la , terminación de amina. La cuenta con un ? Pix/r2"35 de 52 tuvo S-A-Y(S03) (VER LA SEQ ID NO: 3) y aquellas con valores de 51 y 46 fueron muy similares entre si (ya'^sea serina o glicina seguido por Y(S03)-A-Y (S03) . De las tres cuentas con fluorescencia promedio que se secuenciaron, dos contuvieron una tirosina sulfatada y una contuvo tres. El control negativo fue DIDF. Todas ' las cuentas secuenciadas que fueron fluorescentes después del lavado con NaCl 2 M contuvieron por lo menos una tirosina sulfatada. Sin embargo, el control negativo, aunque tiene dos ácidos aspárticos negativamente cargados, no enlaza BEGF 65 fuertemente, indicando que el grupo sulfato per se, opuesto a la carga, aumenta el enlace'. Este es un resultado sorprendente. Este resultado es además evidenciado por las observaciones de que la desulfatación de los péptidoS fue necesaria para retirar la VEGF de las cuentas. Este dato es consistente con la hipótesis de que VEGFi65 está enlazado en los péptidos a través del dominio de enlace de heparina. No obstante, la invención no es dependiente de alguna teoria de operación en particular. Todas las seis cuentas más activas que se secuenciaron contuvieron dos tirosinas. sulfatadas; en cinco de estas cuentas estas estuvieron en la segunda y . la cuarta posición. Esto indica que las tirosinas sulfatadas en la segunda y la cuarta posición de un tetrapéptido son porciones para el enlace fuerte. Todas las cuentas fluorescentes que se analizaron tuvieron una tirosina sulfatada de la segunda posición sugiriendo que un grupo sulfató" en esta posición es una porción para el enlace de los péptidos VEGFi65. Además, puesto que las cuentas que tienen una s.eñal de fluorescencia promedio ya sea que contuvieron un sulfato o tres grupos sulfato contra dos. El número de sulfatos asi como su porción puede ser una porción importante . Los tetrapéptidos sulfatados que enlazan VEGF han sido inventados . Los péptidos que enlazan VEGF fuertemente en la clasificación de la biblioteca contuvieron dos tirosinas sulfatadas y, típicamente, estas fueron localizadas en las posiciones dos y cuatro de la secuencia. Todas las cuentas que se . analizaron tuvieron un grupo sulfato en la segunda posición de aminoácido, sugiriendo que la colocación en este grupo es* útil para el enlace de VEGF. Estos péptidos pueden modular la actividad VEGF ya sea al inhibir o al potenciar la actividad del factor de crecimiento. Además, estos péptidos pueden ser incorporados en geles o polímeros para secuestrar o facilitar la liberación controlada de VEGF. Este ejemplo demuestra que péptidos sulfatados pequeños que enlazan a VEGF pueden ser producidos por una modalidad empleando un procedimiento de síntesis · de biblioteca combinatoria. El mismo método utilizando la misma biblioteca puede ser utilizada en combinación con clasificaciones para aglomerantes a otros objetivos adecuados, incluyéndose factores de crecimiento de enlace de heparina tales como VEGF y PDGF. EJEMPLO 2. PRODUCCION DE LIGANDOS PARA EL ENLACE DE ATIII. Los péptidos sulfatados ensamblados en una biblioteca hecha de acuerdo con una estrategia de desconvolución se utilizaron para producir ligandos que enlazan a ATIII. Este ejemplo demuestra que los péptidos sulfatados pequeños que enlazan a ATIII pueden ser producidos por una modalidad empleando un procedimiento de síntesis de biblioteca combinatoria. Varias posiciones no se variaron durante el procedimiento de síntesis de biblioteca por cuestión de conveniencia. Síntesis de la biblioteca La síntesis de las bibliotecas de decapéptidos sulfatados se realizó en un bloque de reactor de 96 cavidades FLEXCHEM (Robinson Scientific) . La estrategia de protección con Fmoc/ter-Butílo o Fmoc/Boc se utilizó en una PEGA-resina (NOVABIOCHEM) ) , una resina basada en PEG con un fondo de fluorescencia muy bajo y bien permeable para macromoléculas similares a proteínas. Los métodos del Ejemplo 1 fueron seguidos a menos que se indique de otra manera. Después de la remoción de . Fmoc final, el N-terminal fue acetilado utilizando anhídridos de ácido acético, 1-hidroxibenzotrizol (HOBt) y iV,N-disopropiletilamina (DIPEA) . Los grupos protectores se retiraron utilizando ácido trifluoroacético (TFA) y agua seguido por la sulfatación de los .grupos hidroxilo de los residuos L-serina y L-tirosina o el grupo amina de los residuos L-lisina con el complejo de sulfurtrióxido-piridina. Tres bibliotecas de decapéptido sulfatado se sintetizaron, con cada una que contiene sólo un tipo de residuo sulfatado: Ser(S03), Tyr(S03) o Lys(S03). Cada biblioteca consistió de cuatro bloques de construcción: tres aminoácidos hidrofóbicos con L-glicina, L-fenilalanina, L-valina y de los residuos sulfatados. Debido al espaciamiento hidrofóbico entre los aminoácidos positivamente cargados en los dominios de enlace de heparina descritos por Fromm y colaboradores, se hizo un decapéptido. Además, los aminoácidos en las posiciones 2, 6 y 10 de la resina de peptidilo en los decapéptidos que imitan a la heparina se fijaron para ser el residuo de sulfatado. Las posiciones 1-5 de la resina de peptidilo se rellenaron con péptidos en un proceso de división, acoplamiento y mezclado de modo que las posiciones 1, 3, 4 y 5 cada urto tuvo cada posible combinación de los cuatro botes de construcción, de modo que se hicieron 44 péptidos diferentes (256) . Los péptidos en la resina de peptidilo se acumularon y se dividieron sobre 64 cavidades de síntesis de bloque de reactor. Las últimas 5 posiciones en los aminoácidos de la resina de peptidilo se rellenaron con aminoácidos, con las posiciones 7, 8 y 9 que son rellenadas con cada combinación posible de los bloques de construcción, para un total de 43 ( 6 ) combinaciones . Cada biblioteca asi se hizo con 64 x 256 = 16,384 decapéptidos sulfatados diferentes, cada una de las bibliotecas que tiene la secuencia de los cinco aminoácidos más cercanos al iV-terminal como es conocido. Estas bibliotecas se clasificaron y la mejor sub-biblioteca se recolectó. La mejor sub-biblioteca fue Ac-Ser (S03) -Val-Phe-Val-Ser (S03) -Xxx Xxx Xxx-Ser (S03) - ?- PEGA (VER LA SEQ ID NO : 11 ) . Esta secuencia, que tiene los cinco aminoácidos del
N- erminal de la mejor sub-biblioteca de enlace, se utilizó •para sintetizar una segunda biblioteca, con las posiciones 2 y 6-10 que son fijadas y las posiciones 1 y 3-5 que son variadas. Esta segunda biblioteca se clasificó, en la presencia de un exceso de heparina, para determinar las secuencias óptimas . La secuencia óptima fue la secuencia Ac- Ser (S03) -Val-Phe-Val-Ser (S03) -Ser (S03) -Val-Val-Ser (S03) - i Ser (S03')-PEGA (VER LA SEQ ID NO:12) . Clasificación La clasificación de las bibliotecas se llevó a cabo utilizando un péptido fluorescentemente marcado, que representa el dominio de enlace de heparina de la antitrombina III. La síntesis de este péptido, iV-Dansil-Gly-Lys-pAla-Phe-Ala-Lys-Ala-Ala-Arg-Len-Tyr-Arg-Lys-Ala-NH2, fue realizado sobre un PIONNER PEPTIDE SYNTHESIZER (PERCEPTIVE BIOSYSTEMS," ahora APPLIED BIOSYSTEMS) utilizando la química de Fmoc estánda . De cada una de las 3 sub-bibliotecas se tomó 2 mg de resina (~120 mmol de péptido) y se transfirió en placas de 96 cavidades de filtro que contienen 100 µ? de solución reguladora de PBS pH 7.4. La resina PEGA y la resina de heparina-agarosa de utilizaron como control para el enlace no especifico y como referencia. A cada cavidad se adicionó una solución molar igual del péptido fluorescentemente marcado y la resina se incubó durante la noche bajo agitación continua. Después de la remoción de la solución de incubación por filtración, la resina se lavó extensivamente hasta que la señal de la fluorescencia de las cavidades con resina PEGA no modificada fue similar a aquella antecedente. Las mediciones de fluorescencia se realizaron utilizando un espectrómetro de luminiscencia al LS-50B ( ERKIN-ELMER) con un lector de placa de cavidades a una longitud de onda de excitación de 340 mM de una longitud de onda de emisión de 340 nía. Luego la resina se incubó durante la noche con solución reguladora de PBS pH 7.4 que contiene un exceso molar de 5 veces de heparina (600 mmol por cavidad) y nuevamente la resina se lavó extensivamente. La incubación con heparina dio por resultado una disminución en la señal de fluorescencia de la resina de heparina-agarosa utilizada como un control al nivel antecedente. Por el contrario, para ciertas cavidades con resina de " PEGA de peptidilos sulfatada una señal de fluorescencia significantes se observó, indicando un fuerte enlace del péptido de dominio de enlace de heparina de la antitrombina III. La segunda clasificación de biblioteca se realizó como es descrito en lo anterior, pero 1 mg de resina por cavidad se utilizó y la resina se incubó con el péptido de dominio de enlace de heparina fluorescentemente marcado de la antitrombina III en la presencia de un exceso molar de 10 veces de heparina. Asi los ligandos peptidicos hep'arínicos tienen que competir con la heparina para enlazar al dominio • de ' enlace de heparina de la ATIII. Los ligandos de decapéptido descritos en este Ejemplo enlazaron el dominio de enlace de heparina en la presencia de un exceso molar de 10 veces de heparina, indicando que estos péptidos tienen ligandos de alta afinidad para el dominio del enlace de heparina de la antitrombina III. El enlace más fuerte se encontró para el decapéptido con la secuencia Ac-Ser (S03) -Val-Phe-Val- Ser (S03)-Ser (S03)-Val-Val-Ser (S03) -Ser (S03) -PEGA (VER LA SEQ ID NO: 12) . Otros péptidos de enlace de ATIII son expuestos en la Tabla 2. La característica que imita la heparina de este decapéptido sulfatado o sus análogos sulfatados son una nueva clase de agentes antitrombóticos .
Tabla 2 : Secuencias adicionales que tiene enlace especifico a
EJEMPLO 3: LIGANDOS PARA VEGF Este ejemplo demuestra que las modalidades utilizando péptidos sulfatados en los sistemas y métodos de la invención producen ligandos que enlazan con altas afinidades al VEGF objetivo, un mitógefío celular endotelial importante. Este Ejemplo sigue los métodos del Ejemplo 1 a menos que se establezca de otra manera. Síntesis de biblioteca combinatoria Una bilioteca de péptidos que tienen 7 posiciones de aminoácidos se sintetizó. Los primeros tres aminoácidos se variaron utilizando los mismos 9 aminoácidos utilizados en el Ejemplo 1. Los otros cuatro aminoácidos de las 7 posiciones se fijaron para ser Gly-Tyr (SO;,) Asp-Tyr (SO3) , una secuencia seleccionada de los resultados de la biblioteca del Ejemplo 1. Los mismos aminoácidos y condiciones se utilizaron para sintetizar esta biblioteca como para la biblioteca del Ejemplo 1, con la excepción de que Fmoc-Gly-Tyr (SO3) Asp-Tyr (SO3) -Gly-Gly-Gly-Gly-PEGA se utilizó como la resina de partida y el acoplamiento se repitió un total de 3 veces . La síntesis dió por resultado muchas copias de 93 o 729 péptidos diferentes. Proceso de clasificación Una prueba colorimética se utilizó para seleccionar la biblioteca. La. prueba empleó dos tintes de revelado, precipitantes, diferentes. De esta manera, las cuentas que enlazan VEGF165 selectivamente y a través de la funcionalidad de sulfato podrían ser determinadas. Una porción de la biblioteca (2-3 copias) se hinchó con H20 y se enjuagó 3 veces con TBS. La resina se sometió, durante la noche a albúmina al 0.1% y Tween al 0.2% en solución salina regulada de Tris (TBS, solución reguladora de bloqueo) y luego se enjuagó con TBS (2x) antes de adicionar 1 mL fosfatasa alcalina de estreptavidina (diluida a 1:1000 de una solución de 1 mg/mL) y la agitación durante 2 horas. La resina se enjuagó con TBS(5x) y 200 µ?, de reactivo de sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato p-toluidina/cloruro de tetrasolio de azul nitro (BCIP/NBT) se adicionaron para revelar un color azul/negro donde estuvo presente la fosfatasa alcalina de estreptavidina. La absorción no especifica de la fosfatasa alcalina de estreptavidina se detectó como las cuentas ¦manchadas como azul/negro. Después de 15 minutos, la resina se enjuagó con TBS (5x) antes de adicionar 100 L de aproximadamente 0.25 nM de VEGF165 biotinilado en la presencia o ausencia de uno o dos equivalentes de sal sódica de heparina (aislada de la mucosa intestinal porcina) en 400 µL de solución reguladora de bloqueo. La mezcla se agitó durante la noche, la solución se retiró, la resina se lavó con TBS (6x) y se adicionó 1 mL de fosfatasa alcalina de estreptavidina (diluida a 1:1000 de una solución 1 mg/mL). La fosfatasa alcalina de estreptavidina preferencialmente se unió a las cuentas que tienen VEGF, puesto que el VEGF se unió a la biotina, que es un ligando para la estreptavidina sobre la fosfatasa alcalina de . estreptavidina. Después de 2 horas, la solución se retiró y se enjuagó con TBS (5x) y sustrato Rojo Firme (PIERCE) para hacef' la presencia- de la fosfatase alcalina visible al hacer un color rojo. Las cuentas positivas fueron aquellas que se mancharon de rojo. Las cuentas rojas se seleccionaron y se sometieron a guanidina-HCl, de pH = 1.4 durante 20 minutos antes del enjuague con ¾0 (3x) y DMF hasta que se retiró el color residual. La desulfatación de los péptidos se realizó al someter la resina TFA al 30% a 60°C durante 1 hora. Las cuentas seleccionadas se enjuagaron completamente con ¾0 y se revelaron mediante la sujeción a la fosfatasa alcalina de estreptavidina seguida por el Rojo Firme como es descrito en lo anterior. Las cuentas que permanecieron incoloras después de la sulfatación se seleccionaron y se sometieron a la microsecuenciación. Inicialmente se utilizó una concentración muy baja de VEGFi65 biotinilado (aproximadamente 0.25 nM) para analizar la biblioteca para seleccionar los enlazadores más fuertes. A pesar de esto, los resultados indicaron que aproximadamente 5-8% de la biblioteca enlazó VEGFi65- Por lo tanto, se condujo una. prueba competitiva utilizando la misma baja concentración de VEGFi6s biotilinado en la presencia de 1 o 10 equivalentes de heparina. Cuando se empleó un equivalente de heparina, 6 cuentas que enlazaron con VEGFiss y a. la funcionalidad de sulfato fueron descubiertas; de estas 3 fueron secuenciadas . Cuando 10 eq. de heparina se utilizaron, solamente 3 cuentas se seleccionaron; todas estas se secuenciaron. Los resultados de la microsecuenciación se dan en la Tabla 3. Los resultados demuestran que en la presencia de heparina, VEGFiss enlazó a la cuenta sustituida con el péptido Y(S03) Y(S03)GGY (S03)DY(S03) (VER LA SEQ ID NO:14). Tabla 3. Ligandos para el enlace a VEGF
*E1 primer aminoácido es ya sea A o Y(S03). La secuencia de la cuenta ordenada más alta de la primera biblioteca del Ejemplo 1, se sintetizó como SY(S03)DY(S03)G (VER LA SEQ ID NO:17), y el péptido Y(S03) Y(SO3)GGY(SO3)DY(S03) (VER LA SEQ ID NO: 14) de la biblioteca de este ejemplo ambos fueron sintetizados independientemente y la constante de disociación (KD) se determinó mediante la resonancia de plasma de superficie (SPR) . Los péptidos se compararon con suramin, una sustancia mimética de heparina conocida que inhibé la angiogénesis . La SPR permite la comparación directa de las afinidades de los tres compuestos, los resultados se dan en la Tabla 4. Los resultados demuestran que tanto SY (S03) DY (S03) G (VER LA SEQ ID NO: 17) como Y (S03) Y (S03) GGY (S03) DY (S03) (VER LA SEQ ID NO:14) enlazan a VEGF con mucha más alta afinidad que suramin, con este último que es el enlazador más fuerte. Utilizando la SPR, no hubo enlace detectable de los péptidos desulfatados análogos a VEGF. Tabla 4 Constantes de Disociación (KD escrita como ± desviación estándar) .
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Claims (1)
- KEIVrNDICACIO ES 1. Un ligando para enlazar una biomolécula objetivo, el ligando caracterizado porque comprende: un péptido que tiene por lo menos un aminoácido sulfonado o sulfatado y por lo menos un aminoácido seleccionado de un grupo que consiste de aminoácidos neutros y positivamente cargados; en donde el ligando tiene una KD para la biomolécula objetivo de menos de aproximadamente 600 uM en solución fisiológica y la biomolécula objetivo tiene por lo menos un sitio de enlace de heparxna que enlaza el ligando. 2. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la Kd es menor que aproximadamente 60 uM. 3. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende por lo menos dos aminoácidos sulfonados o sulfatados. . El ligando de conformxdad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene por lo menos un aminoácido hidrofóbico . 5. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende una secuencia que incluye la SEQ ID NO:l derivada, en donde las tirosinas de la SEQ ID NO:l derivada, están ya sea sulfonadas o sulfatadas. 6. El ligando de conformidad 'con la reivindicación 5, caracterizado porque el por lo menos un aminoácido de la SEQ ID N0:1 derivada es conservativamente sustituido. 7. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 2 derivada, SEQ ID NO: 3 derivada, SEQ ID NO: 4 derivada, SEQ ID NO: 5 deriváda, SEQ ID NO: 6 derivada, SEQ ID NO: 7 derivada, SEQ ID NO: 8 derivada, SEQ ID NO: 9 derivada, SEQ ID NO: 10 derivada, SEQ ID NO: 13 derivada, SEQ ID NO: 14 derivada, SEQ ID NO:15 derivada, SEQ ID NO: 16 derivad y SEQ ID NO: 17 • derivada, en donde las tirosinas de las secuencias derivadas están sulfonadas o sulfatadas . 8. El ligando de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las secuencias derivadas tienen por lo menos una sustitución conservativa . 9. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia que tiene por lo menos 80% de homología con un elemento del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 2 derivada, SEQ ID NO: 3 derivada, SEQ ID NO: 4 derivada, SEQ ID NO: 5 derivada, SEQ ID NO: 6 derivada, SEQ ID NO: 7 derivada, SEQ ID NO: 8 derivada, SEQ ID NO: 9 derivada, SEQ ID NO: 10 derivada, SEQ ID NO: 13 derivada, SEQ ID NO: 14 derivada, SEQ ID NO: 15 derivada, SEQ ID NO:16 derivada, y SEQ ID NO:17 derivada, en donde las tirosinas de las secuencias derivadas · están sulfonadas o sulfatadas. 10. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el objetivo del ligando es VEGF. 11. El ligando de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el péptido comprende un elemento del grupo que consiste de los derivados sulfonados o sulfatados de 3er, Tyr, Thr y Lys . 12. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el objetivo del ligando es ATIII. 13. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido además comprende' un elemento del grupo que consiste de derivados sulfonados o sulfatados de Ser, Tyr, Thr y Lys. 14. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 11 derivada, SEQ ID NO: 12 derivada, SEQ ID NO: 18 derivada, SEQ ID NO: 19 derivada, SEQ ID NO: 20 derivada, SEQ ID NO: 21 derivada, SEQ ID NO: 22 derivada, SEQ ID NO: 23 derivada y SEQ ID NO: 24 derivada, en donde las serinas de las secuencias derivadas están sulfonadas o sulfatadas. 15. El ligando de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las secuencias derivadas tienen por lo menos una sustitución conservativa. 16. El ligando de conformidad '"con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia que tiene por lo menos 80% de homología con un elemento del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 11 derivada, SEQ ID NO: 12 derivada, SEQ ID NO: 18 derivada, SEQ ID NO: 19 derivada, SEQ ID NO: 20 derivada, SEQ ID NO: 21 derivada, SEQ ID NO: 22 derivada, SEQ ID NO: 23 derivada y SEQ ID NO: 24 derivada, en donde las serínas de las secuencias derivadas están sulfonadas o sulfatadas . 17. El ligando de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando está asociado con un vehículo ' de suministro para suministrar el ligando a u paciente. 18. El ligando de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el vehículo de suministro es un liposoma. 19. Un método para enlazar un objetivo biológico de enlace de heparina con un ligando, el método caracterizado porque comprende exponer el ligando al objetivo, en donde el ligando' tiene por lo menos un aminoácido sulfonado o sulfatado y tiene por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos neutros y positivamente cargados, en donde el ligando tiene una KD para el objetivo de menos de aproximadamente 600 uM en solución fisiológica. 20. El método de conformidad '6on la reivindicación 19, caracterizado porque la exposición es realizada al inyectar el ligando a un paciente. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la inyección es seleccionada del grupo de inyecciones que consisten de ' aplicación subdérmica, intramuscular y peritoneal. 22. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque además comprende asociar el ligando con un vehículo de suministro. 23. Un método para generar un ligando que se enlaza específicamente con un objetivo de enlace de heparina, el método caracterizado porque comprende: proporcionar un objetivo que comprende un sitio de enlace de heparin , proporcionar un conjunto que tiene elementos que cada uno comprende un péptido, los péptidos que tienen por lo menos un aminoácido que está sulfonado o sulfatado y por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos neutros y positivamente cargados, clasificar el conjunto para identificar por lo menos un elemento del conjunto que específicamente enlaza el objetivo e ?· identificar el ligando al determinar una identidad química para el por lo menos un elemento del conjunto que específicamente enlaza el objetivo. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el conjunto es generado por química combinatoria . 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque los elementos son péptidos. 26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además" comprende - seleccionar el ligando para comprender un péptido que tiene por lo menos dos aminoácidos sulfonados o sulfatados. 27. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el ligando comprende por lo menos un aminoácido hidrofóbico. 28. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el objetivo es un factor de crecimiento. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el factor de crecimiento es seleccionado del conjunto que consiste de la familia del factor de crecimiento de fibroblasto, factor de crecimiento epidérmico de enlace de heparina, familia de factor de crecimiento endotelial vascular, superfamilia de factor beta de crecimiento de transformación, factor de crecimiento similar a insulina, proteínas morfogenéticas óseas, factor de crecimiento de hepatocito, leiotrofina, factor de crecimiento de nervio, factor-1 de promotor de crecimiento de neurita, VEGF, ATIII, bFGF y PDGF. 30. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el ligando es clasificado para tener una KD de menos de aproximadamente 600 uM. 31. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el ligando comprende una secuencia ' de' la SEQ ID NO : 1 - ' · 32. El método .de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la secuencia tiene por lo menos una sustitución conservativa. 33. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque los péptidos comprenden por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 2 derivada, SEQ ID NO: 3 derivada, SEQ ID NO: 4 derivada, SEQ ID NO:5 derivada, SEQ ID NO: 6 derivada, SEQ ID NO: 7 derivada, SEQ ID NO: 8 derivada, SEQ ID NO: 9 derivada, SEQ ID NO: 10 derivada, SEQ ID NO: 13 derivada, SEQ ID NO: 14 derivada, SEQ ID NO: 15 derivada, SEQ ID NO: 16 derivada y SEQ ID NO: 17 derivada, en donde las tirosinas de las secuencias derivadas están sulfonadas o sulfatadas. 34. El método de conformidad '6on la reivindicación 33, caracterizado porque las secuencias ' derivadas tienen por lo menos una sustitución conservativa. 35. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque los péptidos comprenden por lo menos una secuencia que tiene por lo menos 80% de homología con un elemento del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 2 derivada, SEQ ID NO: 3 derivada, SEQ ID NO: 4 derivada, SEQ ID NO: 5 derivada, SEQ ID NO: 6 derivada, SEQ ID NO:7 derivada, SEQ ID NO: 8 derivada, SEQ ID NO: 9 derivada, SEQ ID NO: 10 derivada, SEQ ID NO: 13 derivada, SEQ ID NO:14 derivada, SEQ ID NO: 15 derivada, SEQ ID NO: 16 derivada y SEQ ID NO:17 derivada,' en donde las tirosinas de las secuencias derivadas están sulfonadas o sulfatadas. ' 36. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el objetivo del ligando es VEGF. 37. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 11 derivada, SEQ ID NO: 12 derivada, SEQ ID NO: 18 derivada, SEQ. ID NO:19 derivada, SEQ ID NO:20 derivada, SEQ ID NO: 21 derivada, SEQ ID NO: 22 derivada y SEQ ID NO: 24 derivada, en donde las serinas de las secuencias derivadas están sulfonadas o sulfatadas . 38. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las secuencias derivadas tienen por lo menos una sustitución conservativa. 39. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia que tiene por lo menos 80% de homología con un elemento del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 11 derivada, SEQ ID NO: 12 derivada, SEQ ID NO: 18 derivada, SEQ ID NO: 19 derivada, SEQ ID NO:20 derivada, SEQ ID NO:21 derivada, SEQ ID NO: 22 derivada, SEQ ID NO: 23 derivada y SEQ ID NO: 24 derivada, en donde las serinas de las secuencias derivadas éstán sulfonadas o sulfatadas. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la SEQ ID NO:12 comprende una serina que no está sulfonada o sulfatada. 41. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el objetivo del ligando es ATIII. 42. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el objetivo es seleccionado del grupo que consiste de biomoléculas de enlace de heparina naturales o sintéticas y secuencias de enlace de heparina naturales o sintéticas. 43. El- método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el conjunto es seleccionado para comprender un péptido que tiene por lo menos un elemento del grupo que .consiste de Ser sulfonada o sulfatada, Thr sulfonada o sulfatada, Tyr sulfonada o sulfatada, Lys sulfonada o sulfatada, y sustitución conservativa de las mismas . 44. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el ligando está asociado con un vehículo de suministro para suministrar el ligando a un paciente. 45. Un ligando para un objetivo, el ligando caracterizado porgue comprende un péptido que tiene por lo menos un aminoácido sulfonado o sulfatado y por lo menos un aminoácido- seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos neutros y positivamente cargados, en donde el ligando es sintético y tiene enlace especifico para un sitio de enlace de heparina sobre el objetivo. 46. El ligando de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el objetivo es VEGF. 47. El ligando de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el objetivo es ATIII. 48. Un ligando para enlazar un objetivo, el ligando caracterizado porque comprende un péptido que tiene por lo menos un aminoácido sulfonado o sulfatado, con el objetivo que es seleccionado del grupo que consiste del factor de crecimiento epirdérmico de enlace de heparina, familia del factor de crecimiento endotelial vascular, superfamilia de factor beta- de crecimiento de transformación, factor de crecimiento similar a insulina, proteínas morfogenéticas óseas, factor de crecimiento de hepatocito, leiotrofina, factor de crecimiento de nervio, factor-1 de promotor de crecimiento de neurita, VEGF, ATIII y PDGF. 49. El ligando de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el objetivo es VEGF. 50. El ligando de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 2 derivada, SEQ ID NO: 3 derivada, SEQ ID NO: 4 derivada, SEQ. ID NO: 5 derivada, SEQ ID NO: 6 derivada, SEQ ID NO: 7 derivada, SEQ ID NO:8 derivada, SEQ ID NO: 9 derivada, SEQ ID NO:10 derivada, SEQ ID NO:13 derivada, SEQ ID NO:14 derivada, SEQ ID NO: 15 derivada, SEQ ID NO: 16 derivada y SEQ ID NO: 17 derivada, en donde las tirosinas de las secuencias derivadas están sulfonadas o sulfatadas. 51. El ligando de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque las secuencias derivadas tienen por lo menos una sustitución conservativa. 52. El ligando de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia que tiene por lo menos 80% de homología con un elemento del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 2 derivada, SEQ ID NO: 3 derivada, SEQ ID NO: 4 derivada, SEQ ID NO: 5 derivada, SEQ ID NO: 6 derivada, SEQ ID ?G?:7 derivada, -SEQ ID NO: 8 derivada, SEQ ID NO: 9 derivada, SEQ ID NO: 10 derivada, SEQ ID NO: 13 derivada, SEQ ID NO: 14 derivada, SEQ ID NO: 15 derivada, SEQ ID NO: 16 derivada y SEQ ID NO: 17 derivada, en donde las tirosinas de las secuencias derivadas están sulfonadas o sulfatadas. 53. El ligando de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el objetivo es ATIII. 54. El ligando de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID • NO: 11 derivada, SEQ ID NO: 12 derivada, SEQ ID NO:18 derivada; SEQ ID NO:19 derivada, SEQ ID NO:20 derivada, SEQ ID NO: 21 derivada, SEQ ID NO:22 derivada, SEQ ID NO:23 derivada y SEQ ID NO:24 derivada, en donde las serinas de las secuencias derivadas están sulfonadas o sulfatadas. 55. El ligando de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque las secuencias derivadas tienen por lo menos una sustitución conservativa. 56. El ligando de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el péptido comprende por lo menos una secuencia, que tiene por lo menos 80% de homología con un elemento del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 11 derivada, SEQ ID NO:12 derivada, SEQ ID NO: 18 derivada, SEQ ID NO: 19 derivada', SEQ ID NO: 20 derivada, SEQ ID NO: 21 derivada, SEQ
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