ES2273703T3 - Derivados peptidos ciclicos como inhibidores derivados del alfa v y beta 6 de la integrina. - Google Patents
Derivados peptidos ciclicos como inhibidores derivados del alfa v y beta 6 de la integrina. Download PDFInfo
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Abstract
Los derivados de los péptidos de la fórmula I ciclo-(Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6-R1) I donde X1 es Ser, Gly o Thr, X2 es Leu, Ile, Nle, Val o Phe, X3 es Asp, Glu, Lys o Phe, X4 es Gly, Ala o Ser, X5 es Leu, Ile, Nle, Val o Phe, X6 es Arg, Har o Lys, R1 es uno o varios residuos de ácido omega-aminocarboxílico, presentando el o los residuos de ácido omega-aminocarboxílico una longitud de 500 a 2500 pm, que incluyen las formas D y L de los residuos aminoácidos ópticamente activos, así como sus sales y solvatos fisiológicamente compatibles.
Description
\global\parskip0.990000\baselineskip
Derivados peptídicos cíclicos como inhibidores
derivados del \alpha_{v} y \beta_{6} de la integrina.
La invención se refiere a los nuevos derivados
de péptidos de fórmula I
Iciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}-R^{1})
donde
- X^{1}
- es Ser, Gly o Thr,
- X^{2}
- es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,
- X^{3}
- es Asp, Glu, Lys o Phe,
- X^{4}
- es Gly, Ala o Ser,
- X^{5}
- es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,
- X^{6}
- es Arg, Har o Lys,
- R^{1}
- es uno o varios residuos de ácido \omega-aminocarboxílico, presentando el o los residuos de ácido \omega-aminocarboxílico una longitud de 500 a 2500 pm,
que incluyen las formas D y L de
los residuos aminoácidos ópticamente activos, así como sus sales y
solvatos fisiológicamente
compatibles.
La invención tenía por objetivo encontrar nuevos
compuestos con propiedades valiosas, en particular aquellos que
puedan utilizarse para la producción de medicamentos.
Se observó que los compuestos contemplados en la
invención y sus sales poseen propiedades farmacológicas muy
valiosas y una buena compatibilidad. Los péptidos contemplados en la
invención pueden utilizarse como inhibidores eficaces del receptor
de integrina \alpha_{v}\beta_{6} y, por consiguiente, para
el tratamiento de diversas enfermedades y diagnósticos
patólogicos.
La patente DE 19858857 y S. Kraft et al
en J. Biol. Chem. 274, 1979-85 (1999) describen
otros inhibidores de la integrina \alpha_{v}\beta_{6}. Los
compuestos contemplados en la invención deben considerarse como una
invención por selección en relación con la solicitud mencionada.
Las integrinas pertenecen a la familia de los
receptores transmembrana heterodímeros de clase 1, que desempeñan
un papel importante en numerosos procesos de adhesión entre célula y
matriz, y entre célula y célula (Tuckwell et al., 1996,
Symp. Soc. Exp. Biol. 47). Pueden dividirse en tres clases: las
integrinas \beta_{1} que son receptores para la matriz
extracelular, las integrinas \beta_{2} que pueden activarse en
leucocitos y se "disparan" durante los procesos inflamatorios,
y las integrinas \alpha_{v} que influyen sobre la respuesta
celular durante la curación de las heridas y otros procesos
patológicos (Marshall and Hart, 1996, Semin. Cancer Biol. 7,
191).
Las integrinas \alpha_{5}\beta_{1},
\alpha_{IIb}\beta_{3}, \alpha_{8}\beta_{1},
\alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{3},
\alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{8} y
\alpha_{v}\beta_{6} se unen a la secuencia de péptidos
Arg-Gly-Asp (RGD) para formar
ligandos naturales, como por ejemplo, la fibronectina o la
vitronectina. Los péptidos solubles que contienen RGD son capaces de
inhibir la interacción de cada una de estas integrinas con el
ligando natural correspondiente. La integrina
\alpha_{v}\beta_{6} es una integrina relativamente poco
común (Busk et al., 1992 J. Biol. Chem. 267(9), 5790),
que se forma durante los procesos de reparación del tejido
epitelial y se une con preferencia a las moléculas matriciales
naturales fibronectina y tenascina (Wang et al., 1996, Am.
J. Respir. Cell Mol. Biol. 15(5), 664). Las funciones
fisiológicas y patológicas de la integrina
\alpha_{v}\beta_{6} no se conocen aún con precisión, aunque
se supone que esta integrina desempeña un importante papel en los
procesos fisiológicos y enfermedades (como por ejemplo,
inflamaciones, curación de heridas, tumores) en los que participan
células epiteliales. Así, la integrina \alpha_{v}\beta_{6}
se expresa en los queratinocitos en las heridas (Haapasalmi et
al., 1996, J. Invest. Dermatol. 106(1), 42), por lo que
se supone que los agonistas o antagonistas de dicha integrina pueden
influir sobre otros episodios patológicos de la piel, como por
ejemplo soriasis, además de influir sobre los procesos de curación
de heridas e inflamaciones. Además, la integrina
\alpha_{v}\beta_{6} desempeña un papel en el epitelio de
las vías respiratorias (Weinacker et al., 1995, Am. J.
Respir. Cell Mol. Biol. 12(5), 547), de manera que los
correspondientes agonistas y/o antagonistas de esta integrina pueden
emplearse con éxito para el tratamiento de enfermedades de las vías
respiratorias, como la bronquitis, el asma, la fibrosis pulmonar y
los tumores de las vías respiratorias. Por último se sabe que la
integrina \alpha_{v}\beta_{6} también desempeña un papel en
el epitelio intestinal, de modo que es posible utilizar los
correspondientes agonistas y/o antagonistas de esta integrina para
el tratamiento de inflamaciones, tumores y heridas en el estómago y
el tracto intestinal.
P.C. Brooks, R.A. Clark y D.A. Cheresh señalan
en Science 264, 569-71 (1994) que la
aparición de la angiogénesis depende de la interacción entre las
integrinas vasculares y las proteínas matriciales
extracelulares.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Así pues era necesario encontrar, aparte de los
ligandos y anticuerpos naturales de alto peso molecular conocidos
hasta ahora, cuyo manejo terapéutico y diagnóstico resulta complejo,
ligandos de bajo peso molecular, potentes, específicos o selectivos
para la integrina \alpha_{v}\beta_{6}, de preferencia
péptidos, que pudiesen utilizarse para los ámbitos terapéuticos
mencionados, pero también como medio de diagnóstico o reactivo.
Se ha observado que los compuestos peptídicos
contemplados en la invención y sus sales en forma de moléculas
solubles ejercen un efecto sobre las células que llevan el receptor
mencionado o constituyen ligandos sintéticos para la adherencia
celular favorecida por la integrina \alpha_{v}\beta_{6}
cuando están unidos a superficies. En particular actúan como
inhibidores de la integrina \alpha_{v}\beta_{6} al impedir
especialmente las interacciones del receptor con otros ligandos,
como por ejemplo, el enlace con la fibronectina. Esta acción puede
demostrarse, por ejemplo, por medio del método que describen J.W.
Smith et al. en J. Biol. Chem. 265,
12267-12271 (1990).
Se ha observado asimismo que las nuevas
sustancias poseen propiedades farmacológicas muy valiosas y una
buena compatibilidad, por lo que pueden emplearse como
medicamentos. Este aspecto se describe con mayor detalle más
adelante.
Los compuestos peptídicos contemplados en la
presente invención pueden utilizarse también como medios de
diagnóstico para la detección y localización de estados patológicos
en el sistema epitelial, tanto in vivo como in vitro,
si están provistos de los marcadores correspondientes (por ejemplo,
el residuo biotinilo) que ya son conocidos por la técnica
actual.
La invención comprende igualmente combinaciones
con al menos otro principio activo y/o conjugados con otros
principios activos, como los principios activos citotóxicos, así
como conjugados con radiomarcadores para la terapia radiológica o
el diagnóstico PET, pero también proteínas de fusión con proteínas
marcadoras, como la GFP o anticuerpos, o proteínas terapéuticas,
como la IL-2.
Los compuestos especialmente eficaces son los de
fórmula I, en la cual una secuencia de octapéptidos
ciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}),
en que los residuos X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4}, X^{5} y
X^{6} tienen el significado ya indicado, se amplía con R^{1}.
El efecto de esta ampliación del anillo se muestra en el ejemplo del
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg)
[EMD 271588]. Como compuesto de comparación se utiliza
Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2}
[EMD 271293].
En la tabla siguiente se indican algunos
péptidos
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-R^{1}),
la distancia de R^{1} (calculada) y el valor Q
(IC_{50}[sustancia]/IC_{50}[EMD 271293]) y el
valor -log Q.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtienen compuestos especialmente eficaces
cuando la longitud del espaciador R^{1} ha alcanzado unos 500
pm.
Se prefieren en particular aquellos compuestos
de la fórmula I, en los que R^{1} presenta uno o varios residuos
ácido \omega-aminocarboxílico, teniendo dichos
ácidos \omega-aminocarboxílicos una longitud de
600 a 2500 pm, y en particular aquellos que tienen una longitud de
espaciador de 600 a 2000 pm.
Por residuo(s) de ácido
\omega-aminocarboxílico se entiende cualquier
ácido \omega-aminocarboxílico, entre los que se
prefieren los siguientes aminoácidos seleccionados del grupo Ala,
Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met,
Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y
H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-(CH_{2})_{n}-COOH,
- en los que m, n
- son igual a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12,
- \quad
- con la condición que m + n > 0.
De este modo, el objeto de la invención son de
preferencia los derivados peptídicos contemplados en la
reivindicación 1 de la fórmula I
Iciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}-R^{1})
donde
- X^{1}
- es Ser, Gly o Thr,
- X^{2}
- es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,
- X^{3}
- es Asp, Glu, Lys o Phe,
- X^{4}
- es Gly, Ala o Ser,
- X^{5}
- es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,
- X^{6}
- es Arg, Har o Lys,
- R^{1}
- son 1-10 aminoácidos seleccionados del grupo Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-(CH_{2})_{n}-COOH,
m, n son iguales a 0, 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 independientemente entre
sí,
- \quad
- con la condición que m + n > 0,
que incluyen las formas D y L de
los residuos aminoácidos ópticamente activos, así como sus sales
fisiológicamente
compatibles.
Algunos grupos de compuestos preferidos pueden
expresarse mediante las siguientes fórmulas parciales Ia a Ih, que
corresponden a la fórmula I y en las que los residuos no precisados
tienen el mismo significado que en la fórmula I, si bien
\vskip1.000000\baselineskip
- en {}\hskip3mm a)
- X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr;
\vskip1.000000\baselineskip
- en {}\hskip3mm b)
- X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,
- X^{2}
- significa Leu;
\vskip1.000000\baselineskip
- en {}\hskip3mm c)
- X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,
- X^{2}
- significa Leu,
- X^{3}
- significa Asp o D-Asp;
\vskip1.000000\baselineskip
- en {}\hskip3mm d)
- X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,
- X^{2}
- significa Leu,
\newpage
- X^{3}
- significa Asp o D-Asp,
- X^{4}
- significa Gly o Ala;
\vskip1.000000\baselineskip
- en {}\hskip3mm e)
- X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,
- X^{2}
- significa Leu,
- X^{3}
- significa Asp o D-Asp,
- X^{4}
- significa Gly o Ala,
- X^{5}
- significa Leu;
\vskip1.000000\baselineskip
- en {}\hskip3mm f)
- X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,
- X^{2}
- significa Leu,
- X^{3}
- significa Asp o D-Asp,
- X^{4}
- significa Gly, Ala o Ser,
- X^{5}
- significa Leu,
- X^{6}
- significa Arg;
\vskip1.000000\baselineskip
- en {}\hskip3mm g)
- X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,
- X^{2}
- significa Leu,
- X^{3}
- significa Asp o D-Asp,
- X^{4}
- significa Gly, Ala o Ser,
- X^{5}
- significa Leu,
- X^{6}
- significa Arg,
- R^{1}
- significa 1-10 aminoácidos seleccionados del grupo Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val and H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-(CH_{2})_{n}-COOH,
m, n son iguales a 0, 1, 2, 3, 4,
5, 0,6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 independientemente entre
sí,
- \quad
- y con la condición que m + n > 0;
\vskip1.000000\baselineskip
- en {}\hskip3mm h)
- X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,
- X^{2}
- significa Leu,
- X^{3}
- significa Asp o D-Asp,
- X^{4}
- significa Gly, Ala o Ser,
- X^{5}
- significa Leu,
- X^{6}
- significa Arg,
- R^{1}
- significa 1-6 aminoácidos seleccionados del grupo Gly, \beta-Ala, Abu o Aha;
así como sus
sales.
El objeto de la invención son en particular los
compuestos peptídicos seleccionados del grupo
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Ala-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha-Aha),
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha),
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aee),
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-\beta-Ala),
ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-\beta-Ala),
así como sus sales fisiológicamente
compatibles.
Las abreviaturas de residuos aminoácidos antes
mencionadas y que figuran a continuación representan residuos de
los siguientes aminoácidos:
- Abu
- ácido 4-aminobutírico
- Aee
- H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{2}-CH_{2}COOH
- Aha
- ácido 6-aminohexanoico, ácido 6-aminocaproico
- Aib
- ácido \alpha-aminoisobutírico
- Ala
- alanina
- Asn
- asparagina
- Asp
- ácido aspártico
- Arg
- arginina
- Bgl
- C-alpha-ter-butilglicina
- Cys
- cisteína
- Dab
- ácido 2,4-diaminobutírico
- Dap
- ácido 2,3-diaminopropiónico
- Gln
- glutamina
- Glp
- ácido piroglutámico
- Glu
- ácido glutámico
- Gly
- glicina
- Har
- homoarginina
- Hcy
- homocisteína
- His
- histidina
- homo-Phe
- homofenilalanina
- Hse
- homoserina
- Ile
- isoleucina
- Leu
- leucina
- Lys
- lisina
- Met
- metionina
- Nal
- naft-2-il-alanina
- Nle
- norleucina
- Orn
- ornitina
- Pen
- penicilamina
- Phe
- fenilalanina
- Phg
- fenilglicina
- 4-Hal-Phe
- 4-halógeno-fenilanina
- Pro
- prolina
- Ser
- serina
- Thr
- treonina
- TIS
- triisopropilsilano
- Trp
- triptófano
- Tyr
- tirosina
- Val
- valina.
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo, las siguientes abreviaturas tienen el
siguiente significado:
- Ac
- acetilo
- BOC
- ter-butoxicarbonilo
- BSA
- albúmina de suero bovino
- CBZ or Z
- benciloxicarbonilo
- DCCl
- diciclohexilcarbodiimida
- DCM
- diclorometano
- DIEA
- dietilamina
- DMF
- dimetilformamida
- EDCl
- N-etil-N,N^{1}-(dimetilaminopropil)-carbodiimida
- Et
- etilo
- FCA
- ácido fluoresceincarboxílico
- FITC
- isotiocianato de fluoresceína
- Fmoc
- 9-fluorenilmetoxicarbonilo
- FTH
- tiourea de fluoresceína
- HOBt
- 1-hidroxibenzotriazol
- Me
- metilo
- MBHA
- 4-metilbenzhidrilamina
- Mtr
- 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenil-sulfonilo
- HONSu
- N-hidroxisuccinimida
- OBut
- ter-butiléster
- Oct
- octanoilo
- OMe
- metiléster
- OEt
- etiléster
- Pbf
- 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-sulfonilo
- Pmc
- 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
- POA
- fenoxiacetilo
- Sal
- saliciloilo
- TBS++
- suero salino tri-tamponado con cationes divalentes
- TBSA
- TBS+BSA
- TBTU
- tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3-tetrametiluronio
- TFA
- ácido trifluoroacético
- Trt
- tritilo (trifenilmetilo).
En la medida que los aminácidos antes
mencionados puedan aparecer en varias formas enantioméricas,
anteriormente y a continuación se incluyen todas estas formas y
también sus mezclas (por ejemplo, las formas DL). Además, los
aminoácidos pueden estar provistos de los correspondientes grupos
protectores ya conocidos.
El objeto de la invención son igualmente los
hidratos y solvatos, por ejemplo los alcoholatos, de estos
compues-
tos.
tos.
En los compuestos contemplados en la presente
invención se incluyen también los denominados derivados
pro-fármaco, es decir, los compuestos
modificados, por ejemplo con grupos alquilo o acilo, azúcares u
oligopéptidos, que en el organismo se disocian rápidamente para
formar los compuestos activos contemplados en la presente invención.
Entre éstos se encuentran también los derivados biodegradables de
polímeros de los compuestos contemplados en la invención, como se
describe, por ejemplo, en Int. J. Pharm. 115,
61-67 (1995).
Los compuestos contemplados en la presente
invención incluyen, aparte de los compuestos de la fórmula I que se
unen mediante grupos \alpha-amino y
\alpha-carboxilo de forma de peptídica (unión
cabeza/cola), los compuestos cíclicos que, por ejemplo, en
presencia de una cadena lateral funcional, por ejemplo como un grupo
SH, se unen de la siguiente manera:
Lado/lado
\hskip0.5cmpor ejemplo, S-S (disulfuro),
Cabeza/lado
Lado/cola
Asimismo, los compuestos contemplados en la
presente invención incluyen derivados formados por los péptidos
objeto de la presente invención y compuestos marcadores conocidos
que permiten detectar fácilmente la presencia de péptidos. Algunos
ejemplos de estos derivados son los péptidos con marcadores
radiactivos, biotilinados o con marcadores fluorescentes.
Por residuos colorantes fluorescentes se
entiende preferiblemente el
7-acetoxicumarin-3-ilo,
el fluorescein-5-(y/o 6-)ilo, el
2',7'-diclorofluorescein-5-(y
6-)ilo, el
dihidrotetrametilrosamin-4-ilo, el
tetrametilrodamin-5-(y/o 6-)ilo, el
4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-etilo
o el
4,4-difluor-5,7-difenil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-etilo.
Los residuos colorantes fluorescentes
funcionalizados que pueden servir de reactivos para la producción de
los compuestos de la fórmula I contemplados en la presente
invención se describen, por ejemplo, en "Handbook of Fluorescent
Probes and Research Chemicals, 5ª edición,
1992-1994, de R.P. Haughland, Molecular Probes,
Inc.".
La invención comprende no sólo los péptidos
mencionados, sino también las mezclas y preparaciones que contienen
otros principios activos y adyuvantes farmacológicos junto con los
compuestos de la presente invención, que pueden influir de la forma
deseada sobre el efecto farmacológico primario de los péptidos
contemplados en la presente invención.
Por otra parte, los compuestos contemplados en
la presente invención y también las sustancias de partida para su
producción se preparan por medio de métodos conocidos y de frecuente
utilización, como los que se describen en la bibliografía
especializada (por ejemplo, en obras de consulta como
Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie,
Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart), en
condiciones de reacción conocidas y adecuadas para las
transformaciones mencionadas. Para ello también se pueden utilizar
variantes conocidas.
De preferencia, los péptidos según la invención
pueden prepararse mediante síntesis de fase sólida y posterior
disociación y purificación, como describen, por ejemplo Jonczyk y
Meienhofer (Peptides, Proc. 8th Am. Pept. Symp., Eds. V. Hruby
y D. H. Rich, Pierce Comp. III, p. 73-77, 1983, o
Angew. Chem. 104, 1992, 375) o según Merrifield (J. Am.
Chem. Soc. 94, 1972, 3102).
Los péptidos según la invención pueden
prepararse en fase sólida (de forma manual o en un sintetizador
automático) mediante una estrategia de Fmoc con grupos laterales
protectores inestables frente al ácido y purificarse mediante un
sistema RP-HPLC. La uniformidad del pico puede
medirse por medio de un sistema RP-HPLC y la
identidad de la sustancia puede determinarse mediante espectometría
de masas FAB-MS.
Además, los péptidos pueden prepararse con los
métodos habituales de síntesis de aminoácidos y péptidos, como los
descritos, por ejemplo, en Novabiochem - 1999 Catalog & Peptide
Synthesis Handbook der Calbiochem-Novabiochem GmbH,
D-65796 Bad Soden, en numerosas obras de consulta y
solicitudes de patente publicadas.
Pueden utilizarse progresivamente acoplamientos
y condensaciones de fragmentos. Pueden emplearse diversos grupos N
terminales, C terminales y grupos laterales protectores,
prefiriéndose los de disociación ortogonal. Las fases de
acoplamiento pueden llevarse a cabo con distintos reactivos de
condensación, como carbodiimidas, carbodiimidazol, los de tipo
uronio, como TBTU, métodos mixtos de anhídrido, así como los métodos
de halogenuros de ácido o de ésteres activos. Resulta conveniente
formar in situ los ésteres activados, por ejemplo mediante
adición de HOBt o N-hidroxisuccinimida.
Asimismo, con dichas reacciones de condensación
puede efectuarse la ciclización de una molécula precursora lineal
con grupos protectores laterales, como se describe, por ejemplo, en
la patente DE 43 10 643 o en Houben-Weyl, I.c.,
volumen 15/II, páginas 1 a 806 (1974).
En la síntesis de pétidos en fase sólida pueden
emplearse distintas resinas y funciones de anclaje. Las resinas
pueden estar basadas, por ejemplo, en poliestireno o poliacrilamida,
las funciones de anclaje, como Wang, o-clorotritilo
se emplean para la preparación de ácidos peptídicos, y el anclaje
aminoxantenoxi para la preparación, por ejemplo, de
peptidamidas.
Los péptidos o proteínas biotinilados o con
marcadores fluorescentes pueden prepararse igualmente mediante
métodos ya establecidos. (Por ejemplo, E.A. Bayer y M. Wilchek en
Methods of Biochemical Analysis Vol 26, The Use of the
Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular
Biology; y Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,
6ª edición, 1996, de R.P. Haugland, Molecular Probes, Inc.; o
también en la patente internacional WO 97/14716)
Por supuesto, los péptidos según la invención
también pueden liberarse mediante solvólisis, en particular
hidrólisis, o bien por medio de hidrogenólisis de sus derivados
funcionales. Las sustancias de partida preferidas para la
solvólisis o la hidrogenólisis son aquellas que, en lugar de uno o
varios grupos aminos y/o hidroxilo libres, contienen los
correspondientes grupos aminos y/o hidroxilo protegidos,
preferiblemente aquellos que en lugar de un átomo de H que está
unido con un átomo de N, llevan un grupo protector de aminos o que
en lugar del átomo de H de un grupo hidroxilo llevan un grupo
protector de hidroxilos. Otro tanto se aplica a los ácidos
carboxílicos, que pueden protegerse, por ejemplo, en forma de éster,
mediante la sustitución de su función hidroxilo
-CO-OH por un grupo
protector.
protector.
El término "grupo protector de aminos" es
ampliamente conocido y se refiere a los grupos capaces de proteger
(bloquear) a un grupo amino frente a transformaciones químicas, pero
que pueden eliminarse fácilmente realizando la reacción química
deseada en otras partes de la molécula. El término "grupo
protector de hidroxilos" también es ampliamente conocido y se
refiere a los grupos capaces de proteger a un grupo hidroxilo frente
a transformaciones químicas, pero que pueden eliminarse fácilmente
realizando la reacción química deseada en otras partes de la
molécula. La liberación de los compuestos a partir de sus derivados
funcionales puede efectuarse -dependiendo del grupo protector
utilizado- por ejemplo, convenientemente con ácidos fuertes, como
TFA o ácido perclórico, pero también con otros ácidos inorgánicos
fuertes, como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, ácidos
carboxílicos orgánicos fuertes, como el ácido tricloroacético o
ácidos sulfónicos, como el ácido benzoico o el ácido
p-toluensulfónico. Los grupos protectores que
pueden eliminarse mediante hidrogenólisis (por ejemplo, CBZ o
bencilo) pueden disociarse, por ejemplo, mediante un tratamiento
con hidrógeno en presencia de un catalizador (por ejemplo, un
catalizador de metales nobles, como paladio, convenientemente sobre
un soporte como carbono).
Los grupos protectores típicos para los grupos N
terminales y para los grupos amino laterales son Z, BOC, Fmoc, los
correspondientes a los grupos C terminales o a las cadenas laterales
de Asp o Glu son O-prim.-alquilo (por ejemplo, OMe
o OEt), O-ter.-alquilo (por ejemplo, OBut) u
Obencilo. Z, BOC, NO_{2}, Mtr, Pmc o Pbf son adecuados para la
función guanidino de Arg. Las funciones alcohólicas pueden
protegerse por medio de residuos bencilo, residuos
ter-alquilo o grupos tritilo.
Los grupos BOC, OBut y Mtr pueden disociarse
preferentemente con TFA en diclorometano o con aproximadamente HCl
3 a 5 N en dioxano a una temperatura de 15- 30°, el grupo FMOC con
una solución aproximadamente de 5 al 50% de dimetilamina,
dietilamina o piperidina en DMF a una temperatura entre 15 y
30°.
El grupo tritilo se utiliza, por ejemplo, para
proteger a los siguientes aminoácidos: histidina, asparagina,
glutamina y cisteína. La disociación tiene lugar, dependiendo del
producto final deseado, con TFA al 10% de tiofenol, que disocia el
grupo tritilo de todos los aminoácidos mencionados con TFA/anisol o
TFA/tioanisol, sólo se disocia el grupo tritilo de His, Asn y Gln,
permaneciendo el de la cadena lateral de Cys.
Los grupos protectores que pueden eliminarse
mediante hidrogenólisis (por ejemplo, CBZ o bencilo) pueden
disociarse, por ejemplo, mediante un tratamiento con hidrógeno en
presencia de un catalizador (por ejemplo, un catalizador de metales
nobles, como paladio, convenientemente sobre un soporte como
carbono). Como disolvente pueden utilizarse los antes mencionados,
en particular alcoholes como por ejemplo el metanol o el etanol, o
amidas como DMF. Por regla general, la hidrogenólisis se lleva a
cabo a temperaturas entre aproximadamente 0º y 100º y a presiones
entre aproximadamente 1 y 200 bar, preferiblemente a temperaturas
entre 20ºy 30º, y presiones entre 1 y 10 bar. En la hidrogenólisis
del grupo CBZ se obtienen buenos resultados, por ejemplo con una
solución de Pd/C en metanol del 5% al 10% o con formiato de amonio
(en lugar de hidrógeno) en Pd/C en metanol/DMF a
20º-30°.
20º-30°.
Como ya se ha mencionado, los péptidos según la
invención incluyen sus sales fisiológicamente compatibles, las
cuales pueden prepararse igualmente por medio de métodos ya
establecidos. De este modo, una base de un compuesto contemplado en
la presente invención con un ácido puede convertirse en la sal de
adición ácida correspondiente, por ejemplo, al reaccionar
cantidades equivalentes de la base y del ácido en un disolvente
inerte, como metanol, y mediante evaporación posterior. Para esta
reacción se utilizan sobre todo ácidos que ofrecen sales
fisiológicamente compatibles. De esta manera pueden utilizarse
ácidos inorgánicos, como ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácidos
hidrohalogenados, como ácido clorhídrico o ácido bromhídrico, ácidos
fosfóricos, ácido ortofosfórico, ácido sulfámico, así como ácidos
orgánicos, en particular ácidos carboxílicos, sulfónicos y
sulfúricos alifáticos, alicíclicos, aralifáticos, aromáticos o
heterocíclicos mono o polibásicos, como por ejemplo ácido fórmico,
ácido acético, ácido propiónico, ácido piválico, ácido
dietilacético, ácido malónico, ácido succínico, ácido pimélico,
ácido fumárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido
málico, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido
nicotínico, ácido isonicotínico, ácido metanosulfónico o ácido
etanosulfónico, ácido etanodisulfónico, ácido
2-hidroxietanosulfónico, ácido bencenosulfónico,
-acido p-toluenosulfónico, ácidos
naftalinmonosulfónicos y naftalindisulfónicos, ácido
laurilsulfúrico. Las sales fisiológicamente no compatibles, como
los picratos, pueden utilizarse para aislar y/o purificar los
compuestos contemplados en la presente invención. Por otra parte,
un ácido de los compuestos contemplados en la presente invención
puede transformarse por reacción con una base en una de sus sales
metálicas o de amonio fisiológicamente compatibles. A tal fin
pueden utilizarse en particular las sales de sodio, potasio,
magnesio, calcio y amonio, asimismo sales de amonio sustituidas,
como por ejemplo, las sales de dimetilamonio, dietilamonio
diisopropilamonio, sales de monoetanolamonio, dietanolamonio o
diisopropilamonio, sales de ciclohexilamonio y diciclohexilamonio,
sales de dibenciletilendiamonio, así como por ejemplo sales con
arginina o
lisina.
lisina.
Como ya se ha mencionado, los compuestos
peptídicos contemplados en la presente invención pueden utilizarse
como principios activos en medicina humana y veterinaria, en
particular para la prevención y/o terapia de enfermedades en las
que participan las células epiteliales. Cabe destacar especialmente
las enfermedades, inflamaciones o procesos de curación de heridas
de la piel, de los órganos de las vías respiratorias y del sistema
gastrointestinal, como por ejemplo, la apoplejía, la angina de
pecho, las enfermedades tumorales, las enfermedades osteolíticas
como la osteoporosis, las enfermedades angiogénicas patológicas,
como por ejemplo las inflamaciones, las fibrosis, en particular la
fibrosis pulmonar, las enfermedades oftalmológicas, la retinopatía
diabética, la degeneración macular, la miopía, la histoplasmosis
ocular, la artritis reumatoide, la osteoartritis, el glaucoma
rubeótico, la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn, la
arteriosclerosis, la soriasis, la restenosis tras angioplastia, en
caso de crisis nefríticas agudas, inflamación renal, infecciones
microbianas y esclerosis múltiple.
Por consiguiente, el objeto de la presente
invención son los compuestos peptídicos de las fórmulas definidas
anteriormente y a continuación, así como en las reivindicaciones,
incluyendo sus sales fisiológicamente compatibles en forma de
medicamentos, medios de diagnóstico o reactivos.
\newpage
En particular, el objeto de la presente
invención son los correspondientes medicamentos en forma de
inhibidores para combatir enfermedades relacionadas directa o
indirectamente con una expresión del receptor de integrina
\alpha_{v}\beta_{6}, en particular en enfermedades
angiogénicas patológicas, trombosis, infartos cardíacos,
enfermedades coronarias, arteriosclerosis, tumores, osteoporosis,
inflamaciones, infecciones, así como para influir sobre el proceso
de curación de las heridas.
Asimismo son objeto de la presente invención las
correspondientes preparaciones farmacéuticas que contienen al menos
un medicamento, así como dado el caso excipientes y/o coadyuvantes
de la fórmula I.
Además es objeto de la invención el empleo de
los compuestos peptídicos y/o sus sales fisiológicamente compatibles
según las reivindicaciones y la descripción para la preparación de
un medicamento para combatir enfermedades relacionadas directa o
indirectamente con una expresión del receptor de integrina
\alpha_{v}\beta_{6}, en particular en enfermedades
angiogénicas patológicas, trombosis, infartos cardíacos,
enfermedades coronarias, arteriosclerosis, tumores, osteoporosis,
inflamaciones, infecciones, así como para influir sobre el proceso
de curación de las heridas. Los medicamentos contemplados en la
invención y las preparaciones farmacéuticas que los contienen
pueden utilizarse en medicina humana o veterinaria. Como excipientes
pueden utilizarse sustancias orgánicas o inorgánicas adecuadas para
la administración enteral (por ejemplo, oral), parenteral o tópica,
o para la administración en forma de aerosol de inhalación, que no
reaccionen con los nuevos compuestos, como por ejemplo, agua,
aceites vegetales, alcoholes bencílicos, alquilenglicoles,
polietilenglicoles, triacetato de glicerina, gelatina,
carbohidratos, como la lactosa o el almidón, estearato de magnesio,
talco o vaselina. Para administración oral se utilizan en
particular los comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, polvos,
granulados, jarabes, jugos o gotas, para administración rectal
pueden emplearse supositorios, para administración parenteral se
pueden utilizar soluciones, de preferencia oleosas o acuosas, así
como suspensiones, emulsiones o implantes, para administración
tópica se pueden usar ungüentos, cremas o polvos. Los nuevos
compuestos también pueden someterse a liofilización y el producto
liofilizado obtenido puede emplearse, por ejemplo, para la
elaboración de preparaciones inyectables. Las preparaciones
mencionadas pueden esterilizarse y/o contener coadyuvantes, como
lubricantes, conservantes, estabilizadores y/o agentes
tensioactivos, emulsionantes, sales para influr sobre la presión
osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o varios principios
activos distintos, como por ejemplo, una o varias vitaminas.
Para la administración por inhalación pueden
utilizarse aerosoles que contengan el principio activo en solución
o suspensión en un gas propelente o una mezcla de gases propelentes
(como por ejemplo, CO_{2} o hidrocarburos clorofluorados). A tal
fin resulta conveniente utilizar el principio activo en forma
micronizada, estando presentes uno o varios disolventes adicionales
fisiológicamente compatibles, como por ejemplo el etanol. Las
soluciones para inhalar pueden administrarse con la ayuda de
inhaladores comunes.
En general, las sustancias contempladas en la
presente invención pueden administrarse de forma análoga a otros
péptidos conocidos disponibles comercialmente (por ejemplo, los
descritos en la patente US-A-4 472
305), de preferencia en dosis entre 0,05 y 500 mg, y especialmente
entre 0,5 y 100 mg por unidad de dosificación. La dosis diaria se
sitúa preferiblemente entre 0,01 y 20 mg/kg de peso corporal. No
obstante, la dosis específica para cada paciente depende de muy
diversos factores, como por ejemplo, la eficacia del compuesto
especial utilizado, la edad, el peso corporal, el estado de salud
en general, el género del paciente, la alimentación, el momento y
la vía de administración, la velocidad de eliminación, la
combinación de medicamentos y la gravedad de la enfermedad a la que
se aplica la terapia. Se prefiere la aplicación parenteral.
Además, los nuevos compuestos de la fórmula I
pueden utilizarse en biología analítica y biología molecular.
Los nuevos compuestos de la fórmula I, en la que
X representa un residuo colorante fluorescente a través de un
enlace con -CONH-, -COO-,
-NH-C(=S)-NH-,
-NH-C(=O)-NH-, -SO_{2}NH- o -NHCO-
pueden utilizarse como marcadores de diagnóstico en la técnica FACS
(Fluorescence Activated Cell Sorter) y en microscopía de
fluorescencia.
El empleo de compuestos marcados en microscopía
de fluorescencia es descrito, por ejemplo, por Y.-L. Wang y D. L.
Taylor en "Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture,
Part A + B, Academic Press, Inc. 1989".
Los nuevos compuestos contemplados en la
presente invención pueden utilizarse también como ligandos de
integrina para la fabricación de columnas para cromatografía de
afinidad para la preparación de integrinas en estado puro. El
complejo de un material de soporte derivatizado con avidina, por
ejemplo la sefarosa, y los nuevos compuestos se forma mediante
métodos ya conocidos (por ejemplo E.A. Bayer y M. Wilchek en Methods
of Biochemical Analysis Vol 26, The Use of the
Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular
Biology). Como materiales de soporte poliméricos pueden utilizarse
las fases sólidas poliméricas conocidas en la química de los
péptidos, preferiblemente con propiedades hidrófilas, por ejemplo,
los poliazúcares reticulados, como la celulosa, la sefarosa o el
Sephadex^{R}, la acrilamida, polímeros a base de polietilenglicol
o polímeros-Tentakel^{R}.
La invención comprende, por último, secuencias
de ADN recombinante, que contienen secciones que codifican áreas de
péptidos, que presentan los motivos estructurales peptídicos
contemplados en la presente invención.
Dicho ADN puede transmitirse a las células
mediante partículas, como se describe en Ch. Andree et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12188-12192 (1994), o
puede incrementarse la transferencia a células mediante otros medios
auxiliares, como liposomas (A.I. Aronsohn y J.A. Hughes J. Drug
Targeting, 5, 163-169 (1997)).
La transferencia de uno de estos ADN puede
utilizarse en levaduras, mediante virus Bacculo, o en células de
mamíferos para la producción de las sustancias peptídicas de esta
invención.
Si se infecta un organismo animal o humano con
dicho ADN recombinante, los péptidos según la invención formados
finalmente por las propias células infectadas pueden unirse
directamente al receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{6},
por ejemplo de células tumorales, y bloquearlo.
El correspondiente ADN recombinante, que puede
prepararse con técnicas conocidas y habituales, se encuentra
también en forma de ADN vírico, el cual contiene secciones que
codifican la proteína de la cápsula del virus. Infectando a un
organismo huésped con dichos virus recombinantes, preferiblemente
virus no patógenos, pueden atacarse de forma prioritaria las
células huésped que expresan la integrina
\alpha_{v}\beta_{6} (targetting).
Pueden utilizarse, por ejemplo, virus como las
especies de adenovirus que se han utilizado frecuentemente como
vectores para la introducción de genes ajenos en células de
mamíferos. Un gran número de propiedades los convierten en buenos
candidatos, como se desprende de lo expuesto por S.J. Watkins et
al., Gene Therapy 4, 1004-1012 (1997) (véase
igualmente J. Engelhardt et al. Hum. Gene Ther. 4,
759-769 (1993)).
Como señalan A. Fasbender et al. en J.
Clin. Invest. 102, 184-193 (1998), un problema común
de la terapia genética por medio de vectores víricos y no víricos
es la limitada eficiencia de la transferencia de los genes. Con la
secuencia de ligandos antes descrita para la integrina
\alpha_{v}\beta_{6} en las proteínas de la cápsula de los
adenovirus se puede conseguir una mejora de la transferencia, por
ejemplo, del cADN del Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance
Regulator (CFTR).
De forma a similar a los trabajos de T. Tanaka
et al. en Cancer Research 58, 3362-3369
(1998), en lugar del ADN para la angiostatina, puede emplearse el
ADN para las secuencias de la presente invención para las
transfecciones celulares mediante vectores retrovirales o
adenovirales.
Los péptidos contemplados en la presente
invención pueden utilizarse también, dentro de un complejo de
liposomas formado por lípido/péptido/ADN para una transfección de
cultivos celulares junto con un complejo de liposomas compuesto por
lípido/ADN (sin péptido) para su uso en terapia genética para seres
humanos. La producción de un complejo de liposomas formado por
lípido/ADN/péptido se describe, por ejemplo, en Hart S.L, et
al 1998: Lipid-Mediated Enhancement of
Transfection by a Non-Viral
Integrin-Targeting Vector. Human Gene Therapy
9,
575-585.
575-585.
Un complejo de liposomas formado por
lípido/péptido/ADN se ha obtenido, por ejemplo, a partir de las
siguientes soluciones: l \mug/\mul de lipofectina (mezcla
equimolar de DOTMA (= cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio)
y DOPE (Dioleilfosfatidiletanolamina)), 10 \mug/ml de ADN
plasmídico y 100 \mug/ml de péptido. Para ello se disuelven en un
medio de cultivo celular tanto el ADN como el péptido.
El complejo de liposomas se prepara mezclando
los tres componentes en una determinada proporción en peso (lípido:
ADN: péptido, por ejemplo, 0,75: 1: 4). Ya se han descrito complejos
liposómicos de ADN para terapia genética en seres humanos (Caplen
N.J., et al 1995: Liposome-mediated CFTR gene
transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis
Nature Medicine 1, 39-46).
De este modo, el objeto de la invención es
igualmente el empleo de ADN recombinante modificado de sistemas de
liberación de genes, en particular ADN vírico, para combatir
enfermedades relacionadas directa o indirectamente con la expresión
de un receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{6}, en
particular en enfermedades angiogénicas patológicas, trombosis,
infartos cardíacos, enfermedades coronarias, arteriosclerosis,
tumores, osteoporosis, inflamaciones, infecciones, así como para
influir sobre el proceso de curación de las heridas.
Todas las temperaturas indicadas anteriormente y
a continuación en el presente documento están en grados
centígrados.
Los análisis por HPLC (tiempo de retención Rt)
se llevaron a cabo en los siguientes sistemas:
Columna de 5 \mum de LichroSpher 60
RP-Select B (250-4), con un
gradiente durante 50 minutos de 0 a 80% de
2-propanol en agua/ácido trifluoroacético al 0,3%,
con un flujo de 1 ml/min y detección a 215 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
- Espectrometría de masas (MS):
- EI (ionización por colisión electrónica) M+
- \quad
- FAB (bombardeo con átomos rápidos) (M+H)^{+}
\newpage
Ejemplo
1
En principio, la preparación y purificación se
llevó a cabo mediante una estrategia Fmoc con protección de las
cadenas laterales inestables al ácido sobre resinas inestables al
ácido utilizando un sintetizador de péptidos comercial de "flujo
continuo", según las indicaciones de Haubner et al. (J.
Am. Chem. Soc. 118, 1996, 17703).
Se suspendieron 2,7 g de
Fmoc-Abu-OH (Bachem
B-1910) en 150 ml de cloruro de metileno, suspensión
que se disolvió en 10 ml de DMF. Se añadieron 5,6 ml de
diisopropiletilamina, la solución se vertió en 12,0 g de resina de
poliestireno-clorotritilcloruro (1,14 mmol/g, Bachem
D-196512) y el depósito se agitó a temperatura
ambiente.
Después de cinco horas se aspiró la resina y se
lavó con 300 ml de DCM/MeOH/DIEA = 17/2/1, DCM, DMF, DCM y MeOH.
Tras eliminar el disolvente se obtuvieron 14,55 g de resina de
aminoácido de Fmoc. Una triple medición de Fmoc arrojó en promedio
una carga de 541 \mumol/g de resina
Fmoc-Abu-O-oCITrt.
Se mezclaron 0,7 g de resina de poliestireno
Fmoc-Abu-O-oClTrt
sucesivamente mediante una técnica de doble acoplamiento 2x con
0,30 g de TBTU, 0,315 ml de etildiisopropilamina y aminoácido Fmoc
en 4,1 ml de DMF en un sintetizador comercial y se sometió a una
fase de acoplamiento en un procedimiento típico (dispositivo y
manual: Milligen 9050 PepSynthesizer^{TM}, 1987), durante 30
minutos cada vez. Se realizaron fases de lavado en DMF durante 10
minutos, fases de disociación en piperidina/DMF (1:4 vol) durante 5
minutos y se realizaron acetilaciones N-terminales
(capping) con anhídrido de ácido acético/piridina/DMF (2:3:15 vol)
durante 15 minutos.
Se utilizaron los aminoácidos
Fmoc-Arg(Pmc), a continuación
Fmoc-Leu, a continuación Fmoc-Ala, a
continuación
Fmoc-D-Asp(OBut), a
continuación Fmoc-Leu, a continuación
Fmoc-Asp(OBut), a continuación
Fmoc-Thr(But), a continuación
Fmoc-Arg(Pmc) y por último
Fmoc-Abu. Tras la disociación del grupo protector
Fmoc de la resina de poliestireno
Fmoc-Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-O-oCITrt
se realizó un lavado con DMF e isopropanol y, tras el secado al
vacío a temperatura ambiente se obtuvieron 0,9 g de resina de
poliestireno
Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-O-oCITrt.
Mediante el tratamiento de esta resina
peptidílica con 20 ml de trifluoretanol/diclorometano/ácido acético
(2:6:2 vol) durante 2 horas a temperatura ambiente, filtrado,
concentración por evaporación y extracción con dietiléter se
obtuvieron 0,19 g del péptido de cadena lateral protegida
Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-OH.
Mediante goteo de una solución de este producto
en DMF (100 mg de péptido/15 ml de DMF) en una solución agitada de
TBTU/HOBt/DIPEA (10:10:11 equivalente) en 50 ml de DMF/100 mg de
péptido en un plazo de 30 minutos y tras nueva agitación durante 1
hora se logró la ciclización. Tras concentración por evaporación y
precipitado en agua se obtuvieron 0,15 g de
ciclo-(Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-Abu)
crudo. Tras el tratamiento con ácido trifluoroacético/agua/TIS
(94:3:3 vol) durante 2 horas a temperatura ambiente, concentración
por evaporación y extracción con dietiléter apareció un sedimento de
85 mg de
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu).
La purificación del producto se realizó mediante
RP-HPLC en Lichrosorb RP 18 (250 - 25, 7 \mum,
Merck KGaA) en 0,3% de TFA con un gradiente de 4% a 24% de
2-propanol durante una hora a 10 ml/min y la
evaluación del eluido se efectuó mediante un fotómetro de paso de
rayos ultravioleta a 215 y 254 nm. Se obtuvieron 51 mg de producto,
FAB 1067; Rt 19,0.
De forma análoga se prepararon los siguientes
productos:
Nomenclatura para aminoácidos según Eur. J. Biochem. 138, 9-37 (1984) | |
letras minúsculas = D-aminoácido | |
n.m. = no medido |
Los compuestos 271312, 271578, 271579,
271586-271591,272970, 272971, 329393- 329400 no
forman parte de los compuestos de la presente invención, sino que
son compuestos de comparación.
Ejemplo
2
Los péptidos preparados según la invención se
unieron en solución junto con fibronectina de efecto competitivo,
sobre el receptor \alpha_{v}\beta_{6} inmovilizado y se
determinó el valor Q como medida de la selectividad del enlace
entre el péptido objeto de la ensayo y la
\alpha_{v}\beta_{6}. El valor Q se calcula a partir del
cociente de los valores IC_{50} del péptido de ensayo y un valor
de referencia. El valor de referencia fue
Ac-RTDLDSLR-NH_{2} lineal (Código
EMD 271293) (Lit./Patent, véase Pytela et al. Science 231,
1559, (1986)). El ensayo de enlace se realizó de las siguiente
manera:
La inmovilización del receptor soluble
\alpha_{v}\beta_{6} en placas de mitrotitulación se efectuó
mediante dilución de la solución de proteínas en TBS++ y posterior
incubación durante la noche a 4°C (100 \mul/cavidad). Se
bloquearon los puntos de unión no específicos mediante incubación (2
horas a 37°C) con 3% (p/v) de BSA en TBS++ (200 \mul/cavidad). El
BSA sobrante se eliminó mediante tres lavados con TBSA++. Los
péptidos se diluyeron en serie (1:10) en TBSA++ y se incubaron
junto con la fibronectina biotinilada (2 \mug/ml) con la
integrina inmovilizada (50 \mul de péptido + 50 \mul de ligando
por cavidad; durante 2 horas a 37°C). La fibronectina y los
péptidos no enlazados se eliminaron mediante tres lavados con
TBSA++. La detección de la fibronectina enlazada se realizó
mediante incubación (1 hora a 37ºC) con un anticuerpo antibiotín
acoplado a fosfatasa alcalina (Biorad) (1:20000 en TBSA++; 100
\mul/cavidad). Tras tres lavados con TBSA++ se efectuó la
detección colorimétrica mediante incubación (10-15
minutos a 25°C en oscuridad) con una solución de sustrato (5 mg de
fosfato de nitrofenilo, 1 ml de etanolamina, 4 ml de H_{2}O; 100
\mul/cavidad). La reacción enzimática se detuvo mediante la
adición de 0,4 M NaOH (100 \mul/cavidad). La intensidad cromática
se midió a 405 nm con un medidor ELISA y se comparó con el valor
cero. Se utilizaron como valor cero las cavidades no recubiertas
con el receptor. Se utilizó como valor de referencia
Ac-RTDLDSLR-NH_{2}. Los valores
IC_{50} para los péptidos sometidos al ensayo se obtuvieron de un
gráfico y a partir de éstos y del valor IC_{50} del péptido de
referencia se calculó el valor Q del péptido de la invención.
Valor Q = IC_{50} del péptido de
ensayo/IC_{50} de referencia
Se determinaron los valores Q mediante
repeticiones del ensayo.
Los resultados de los ensayos descritos se
resumen en la siguiente Tabla 1:
\newpage
Los ejemplos siguientes se refieren a
preparaciones farmacéuticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
A
Una solución de 100 g de
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)
y 5 g de hidrogenofosfato disódico en 3 L de agua doblemente
destilada se ajusta a pH 6,5 con ácido clorhídrico 2 N, se filtra en
condiciones estériles, y se introduce en ampollas inyectables, se
liofiliza bajo condiciones estériles y se precinta de forma
estéril. Cada ampolla inyectable contiene 5 mg de principio
activo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
B
Se funde una mezcla de 20 g de
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)
con 100 g de lecitina de soja y 1400 g de manteca de cacao, se
vierte el fundido en moldes y se deja enfriar. Cada supositorio
contiene 20 mg de principio activo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
C
Se prepara una solución de 1 g de
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),
9,38 g de NaH_{2}
PO_{4}, \cdot 2 H_{2}O, 28,48 g de Na_{2}HPO_{4} \cdot 12 H_{2}O y 0,1 g de cloruro de benzalconio en 940 ml de agua doblemente destilada. Se ajusta el pH a 6,8, se enrasa a 1 L y se esteriliza mediante irradiación. Esta solución puede utilizarse como colirio ocular.
PO_{4}, \cdot 2 H_{2}O, 28,48 g de Na_{2}HPO_{4} \cdot 12 H_{2}O y 0,1 g de cloruro de benzalconio en 940 ml de agua doblemente destilada. Se ajusta el pH a 6,8, se enrasa a 1 L y se esteriliza mediante irradiación. Esta solución puede utilizarse como colirio ocular.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
D
Se mezclan 500 mg de
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)
con 99,5 g de vaselina en condiciones asépticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
E
Se comprime por medios habituales una mezcla
formada por 1 kg de
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),
4 kg de lactosa, 1,2 kg de almidón de patata, 0,2 kg de talco y 0,1
kg de estearato de magnesio para formar comprimidos de forma que
cada uno de ellos contiene 10 mg de principio activo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
F
De forma análoga al ejemplo E se comprimen
comprimidos que a continuación se recubren mediante métodos
habituales con un recubrimiento de sacarosa, almidón de patata,
talco, goma de tragacanto y colorante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
G
Se envasan 2 kg de
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)
de forma habitual en cápsulas de gelatina rígida, de forma que cada
una de ellas contiene 20 mg de principio activo.
\newpage
Ejemplo
H
Una solución de 1 kg de
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)
en 60 L de agua doblemente destilada se somete a un filtrado de
esterilización, se envasa en viales, se liofiliza y se precinta en
condiciones estériles. Cada vial contiene 10 mg de principio
activo.
Ejemplo
I
Se disuelven 14 g de
ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)
en 10 L de solución isotónica de NaCl y esta solución se envasa en
aerosoles comerciales provistos de mecanismo de bomba. La solución
puede pulverizarse en la boca o la nariz. Una aplicación
(aproximadamente 0,1 ml) corresponde a una dosis de aproximadamente
0,14 mg.
Claims (9)
1. Los derivados de los péptidos de la fórmula
I
Iciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}-R^{1})
donde
- X^{1}
- es Ser, Gly o Thr,
- X^{2}
- es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,
- X^{3}
- es Asp, Glu, Lys o Phe,
- X^{4}
- es Gly, Ala o Ser,
- X^{5}
- es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,
- X^{6}
- es Arg, Har o Lys,
- R^{1}
- es uno o varios residuos de ácido \omega-aminocarboxílico, presentando el o los residuos de ácido \omega-aminocarboxílico una longitud de 500 a 2500 pm,
que incluyen las formas D y L de
los residuos aminoácidos ópticamente
activos,
así como sus sales y solvatos fisiológicamente
compatibles.
2. Los derivados de los péptidos mencionados en
la reivindicación 1 de la fórmula I
Iciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}-R^{1})
donde
- X^{1}
- es Ser, Gly o Thr,
- X^{2}
- es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,
- X^{3}
- es Asp, Glu, Lys o Phe,
- X^{4}
- es Gly, Ala o Ser,
- X^{5}
- es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,
- X^{6}
- es Arg, Har o Lys,
- R^{1}
- son 1-10 aminoácidos seleccionados del grupo Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-(C H_{2})_{n}-COOH,
m, n son iguales a 0, 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 independientemente entre
sí,
y con la condición que m + n > 0.
que incluyen las formas D y L de
los residuos aminoácidos ópticamente
activos,
así como sus sales y solvatos fisiológicamente
compatibles.
3. Compuestos peptídicos mencionados en las
reivindicaciones 1 ó 2, seleccionados del grupo
ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),
ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),
ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Ala-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),
ciclo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),
ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),
ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha-Aha),
ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha),
ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aee),
ciclo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),
ciclo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-\beta-Ala),
ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-\beta-Ala),
así como sus sales y solvatos
fisiológicamente
compatibles.
4. Compuestos peptídicos de la fórmula I
mencionados en las reivindicaciones 1 y 2, y compuestos mencionados
en la reivindicación 3, así como sus sales y solvatos
fisiológicamente compatibles en forma de medicamentos.
5. Medicamento mencionado en la reivindicación 4
en forma de inhibidor para combatir enfermedades relacionadas con
una expresión y función patológicas de los receptores de integrina
\alpha_{v}\beta_{6}.
6. Medicamento mencionado en la reivindicación 5
en forma de inhibidor para combatir enfermedades relacionadas con
una expresión y función patológicas de los receptores de integrina
\alpha_{v}\beta_{6}.
7. La preparación farmacéutica que contiene al
menos uno de los medicamentos mencionados en las reivindicaciones 5
a 6, así como excipientes y/o coadyuvantes, y otros principios
activos.
8. Empleo de compuestos peptídicos mencionados
en las reivindicaciones 1 a 3 y/o sus sales fisiológicamente
compatibles para la preparación de un medicamento para combatir
enfermedades relacionadas con una expresión y función patológicas
de los receptores de integrina \alpha_{v}\beta_{6}.
9. Empleo mencionado en la reivindicación 8 para
la preparación de un medicamento para el tratamiento de trombosis,
infartos cardíacos, enfermedades coronarias, arteriosclerosis,
tumores, osteoporosis, fibrosis, inflamaciones, infecciones,
soriasis, así como para influir sobre el proceso de curación de las
heridas.
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