ES2273703T3

ES2273703T3 - Derivados peptidos ciclicos como inhibidores derivados del alfa v y beta 6 de la integrina.

Info

Publication number: ES2273703T3
Application number: ES00943971T
Authority: ES
Inventors: Alfred Jonczyk; Beate Diefenbach; Simon Goodman; Ulrich Groth; Gunther Zischinsky
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-03
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2020-07-03
Also published as: HK1048641A1; SK262002A3; TWI226890B; BR0012418A; PL354363A1; ZA200201275B; HUP0201925A2; DE19933173A1; CN1361792A; JP2003505395A; KR20020010928A; MXPA02000465A; PT1196433E; WO2001005810A3; EP1754714A1; NO20020176L; NO20020176D0; AU772782C; DE50013525D1; EP1196433A2

Abstract

Los derivados de los péptidos de la fórmula I ciclo-(Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6-R1) I donde X1 es Ser, Gly o Thr, X2 es Leu, Ile, Nle, Val o Phe, X3 es Asp, Glu, Lys o Phe, X4 es Gly, Ala o Ser, X5 es Leu, Ile, Nle, Val o Phe, X6 es Arg, Har o Lys, R1 es uno o varios residuos de ácido omega-aminocarboxílico, presentando el o los residuos de ácido omega-aminocarboxílico una longitud de 500 a 2500 pm, que incluyen las formas D y L de los residuos aminoácidos ópticamente activos, así como sus sales y solvatos fisiológicamente compatibles.

Description

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Derivados peptídicos cíclicos como inhibidores derivados del \alpha_{v} y \beta_{6} de la integrina.

La invención se refiere a los nuevos derivados de péptidos de fórmula I

Iciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}-R^{1})

donde

X^{1}: es Ser, Gly o Thr,

X^{2}: es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,

X^{3}: es Asp, Glu, Lys o Phe,

X^{4}: es Gly, Ala o Ser,

X^{5}: es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,

X^{6}: es Arg, Har o Lys,

R^{1}: es uno o varios residuos de ácido \omega-aminocarboxílico, presentando el o los residuos de ácido \omega-aminocarboxílico una longitud de 500 a 2500 pm,

que incluyen las formas D y L de los residuos aminoácidos ópticamente activos, así como sus sales y solvatos fisiológicamente compatibles.

La invención tenía por objetivo encontrar nuevos compuestos con propiedades valiosas, en particular aquellos que puedan utilizarse para la producción de medicamentos.

Se observó que los compuestos contemplados en la invención y sus sales poseen propiedades farmacológicas muy valiosas y una buena compatibilidad. Los péptidos contemplados en la invención pueden utilizarse como inhibidores eficaces del receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{6} y, por consiguiente, para el tratamiento de diversas enfermedades y diagnósticos patólogicos.

La patente DE 19858857 y S. Kraft et al en J. Biol. Chem. 274, 1979-85 (1999) describen otros inhibidores de la integrina \alpha_{v}\beta_{6}. Los compuestos contemplados en la invención deben considerarse como una invención por selección en relación con la solicitud mencionada.

Las integrinas pertenecen a la familia de los receptores transmembrana heterodímeros de clase 1, que desempeñan un papel importante en numerosos procesos de adhesión entre célula y matriz, y entre célula y célula (Tuckwell et al., 1996, Symp. Soc. Exp. Biol. 47). Pueden dividirse en tres clases: las integrinas \beta_{1} que son receptores para la matriz extracelular, las integrinas \beta_{2} que pueden activarse en leucocitos y se "disparan" durante los procesos inflamatorios, y las integrinas \alpha_{v} que influyen sobre la respuesta celular durante la curación de las heridas y otros procesos patológicos (Marshall and Hart, 1996, Semin. Cancer Biol. 7, 191).

Las integrinas \alpha_{5}\beta_{1}, \alpha_{IIb}\beta_{3}, \alpha_{8}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{8} y \alpha_{v}\beta_{6} se unen a la secuencia de péptidos Arg-Gly-Asp (RGD) para formar ligandos naturales, como por ejemplo, la fibronectina o la vitronectina. Los péptidos solubles que contienen RGD son capaces de inhibir la interacción de cada una de estas integrinas con el ligando natural correspondiente. La integrina \alpha_{v}\beta_{6} es una integrina relativamente poco común (Busk et al., 1992 J. Biol. Chem. 267(9), 5790), que se forma durante los procesos de reparación del tejido epitelial y se une con preferencia a las moléculas matriciales naturales fibronectina y tenascina (Wang et al., 1996, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15(5), 664). Las funciones fisiológicas y patológicas de la integrina \alpha_{v}\beta_{6} no se conocen aún con precisión, aunque se supone que esta integrina desempeña un importante papel en los procesos fisiológicos y enfermedades (como por ejemplo, inflamaciones, curación de heridas, tumores) en los que participan células epiteliales. Así, la integrina \alpha_{v}\beta_{6} se expresa en los queratinocitos en las heridas (Haapasalmi et al., 1996, J. Invest. Dermatol. 106(1), 42), por lo que se supone que los agonistas o antagonistas de dicha integrina pueden influir sobre otros episodios patológicos de la piel, como por ejemplo soriasis, además de influir sobre los procesos de curación de heridas e inflamaciones. Además, la integrina \alpha_{v}\beta_{6} desempeña un papel en el epitelio de las vías respiratorias (Weinacker et al., 1995, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12(5), 547), de manera que los correspondientes agonistas y/o antagonistas de esta integrina pueden emplearse con éxito para el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias, como la bronquitis, el asma, la fibrosis pulmonar y los tumores de las vías respiratorias. Por último se sabe que la integrina \alpha_{v}\beta_{6} también desempeña un papel en el epitelio intestinal, de modo que es posible utilizar los correspondientes agonistas y/o antagonistas de esta integrina para el tratamiento de inflamaciones, tumores y heridas en el estómago y el tracto intestinal.

P.C. Brooks, R.A. Clark y D.A. Cheresh señalan en Science 264, 569-71 (1994) que la aparición de la angiogénesis depende de la interacción entre las integrinas vasculares y las proteínas matriciales extracelulares.

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Así pues era necesario encontrar, aparte de los ligandos y anticuerpos naturales de alto peso molecular conocidos hasta ahora, cuyo manejo terapéutico y diagnóstico resulta complejo, ligandos de bajo peso molecular, potentes, específicos o selectivos para la integrina \alpha_{v}\beta_{6}, de preferencia péptidos, que pudiesen utilizarse para los ámbitos terapéuticos mencionados, pero también como medio de diagnóstico o reactivo.

Se ha observado que los compuestos peptídicos contemplados en la invención y sus sales en forma de moléculas solubles ejercen un efecto sobre las células que llevan el receptor mencionado o constituyen ligandos sintéticos para la adherencia celular favorecida por la integrina \alpha_{v}\beta_{6} cuando están unidos a superficies. En particular actúan como inhibidores de la integrina \alpha_{v}\beta_{6} al impedir especialmente las interacciones del receptor con otros ligandos, como por ejemplo, el enlace con la fibronectina. Esta acción puede demostrarse, por ejemplo, por medio del método que describen J.W. Smith et al. en J. Biol. Chem. 265, 12267-12271 (1990).

Se ha observado asimismo que las nuevas sustancias poseen propiedades farmacológicas muy valiosas y una buena compatibilidad, por lo que pueden emplearse como medicamentos. Este aspecto se describe con mayor detalle más adelante.

Los compuestos peptídicos contemplados en la presente invención pueden utilizarse también como medios de diagnóstico para la detección y localización de estados patológicos en el sistema epitelial, tanto in vivo como in vitro, si están provistos de los marcadores correspondientes (por ejemplo, el residuo biotinilo) que ya son conocidos por la técnica actual.

La invención comprende igualmente combinaciones con al menos otro principio activo y/o conjugados con otros principios activos, como los principios activos citotóxicos, así como conjugados con radiomarcadores para la terapia radiológica o el diagnóstico PET, pero también proteínas de fusión con proteínas marcadoras, como la GFP o anticuerpos, o proteínas terapéuticas, como la IL-2.

Los compuestos especialmente eficaces son los de fórmula I, en la cual una secuencia de octapéptidos ciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}), en que los residuos X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4}, X^{5} y X^{6} tienen el significado ya indicado, se amplía con R^{1}. El efecto de esta ampliación del anillo se muestra en el ejemplo del ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg) [EMD 271588]. Como compuesto de comparación se utiliza Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2} [EMD 271293].

En la tabla siguiente se indican algunos péptidos ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-R^{1}), la distancia de R^{1} (calculada) y el valor Q (IC_{50}[sustancia]/IC_{50}[EMD 271293]) y el valor -log Q.

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1

Se obtienen compuestos especialmente eficaces cuando la longitud del espaciador R^{1} ha alcanzado unos 500 pm.

Se prefieren en particular aquellos compuestos de la fórmula I, en los que R^{1} presenta uno o varios residuos ácido \omega-aminocarboxílico, teniendo dichos ácidos \omega-aminocarboxílicos una longitud de 600 a 2500 pm, y en particular aquellos que tienen una longitud de espaciador de 600 a 2000 pm.

Por residuo(s) de ácido \omega-aminocarboxílico se entiende cualquier ácido \omega-aminocarboxílico, entre los que se prefieren los siguientes aminoácidos seleccionados del grupo Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-(CH_{2})_{n}-COOH,

en los que m, n: son igual a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12,

\quad: con la condición que m + n > 0.

De este modo, el objeto de la invención son de preferencia los derivados peptídicos contemplados en la reivindicación 1 de la fórmula I

Iciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}-R^{1})

donde

X^{1}: es Ser, Gly o Thr,

X^{2}: es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,

X^{3}: es Asp, Glu, Lys o Phe,

X^{4}: es Gly, Ala o Ser,

X^{5}: es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,

X^{6}: es Arg, Har o Lys,

R^{1}: son 1-10 aminoácidos seleccionados del grupo Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-(CH_{2})_{n}-COOH,

m, n son iguales a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 independientemente entre sí,

\quad: con la condición que m + n > 0,

que incluyen las formas D y L de los residuos aminoácidos ópticamente activos, así como sus sales fisiológicamente compatibles.

Algunos grupos de compuestos preferidos pueden expresarse mediante las siguientes fórmulas parciales Ia a Ih, que corresponden a la fórmula I y en las que los residuos no precisados tienen el mismo significado que en la fórmula I, si bien

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en {}\hskip3mm a): X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr;

\vskip1.000000\baselineskip

en {}\hskip3mm b): X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,

X^{2}: significa Leu;

\vskip1.000000\baselineskip

en {}\hskip3mm c): X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,

X^{2}: significa Leu,

X^{3}: significa Asp o D-Asp;

\vskip1.000000\baselineskip

en {}\hskip3mm d): X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,

X^{2}: significa Leu,

\newpage

X^{3}: significa Asp o D-Asp,

X^{4}: significa Gly o Ala;

\vskip1.000000\baselineskip

en {}\hskip3mm e): X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,

X^{2}: significa Leu,

X^{3}: significa Asp o D-Asp,

X^{4}: significa Gly o Ala,

X^{5}: significa Leu;

\vskip1.000000\baselineskip

en {}\hskip3mm f): X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,

X^{2}: significa Leu,

X^{3}: significa Asp o D-Asp,

X^{4}: significa Gly, Ala o Ser,

X^{5}: significa Leu,

X^{6}: significa Arg;

\vskip1.000000\baselineskip

en {}\hskip3mm g): X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,

X^{2}: significa Leu,

X^{3}: significa Asp o D-Asp,

X^{4}: significa Gly, Ala o Ser,

X^{5}: significa Leu,

X^{6}: significa Arg,

R^{1}: significa 1-10 aminoácidos seleccionados del grupo Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val and H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-(CH_{2})_{n}-COOH,

m, n son iguales a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 0,6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 independientemente entre sí,

\quad: y con la condición que m + n > 0;

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en {}\hskip3mm h): X^{1} {}\hskip5mm significa Gly o Thr,

X^{2}: significa Leu,

X^{3}: significa Asp o D-Asp,

X^{4}: significa Gly, Ala o Ser,

X^{5}: significa Leu,

X^{6}: significa Arg,

R^{1}: significa 1-6 aminoácidos seleccionados del grupo Gly, \beta-Ala, Abu o Aha;

así como sus sales.

El objeto de la invención son en particular los compuestos peptídicos seleccionados del grupo

ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),

ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),

ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Ala-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),

ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),

ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),

ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha-Aha),

ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha),

ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aee),

ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),

ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-\beta-Ala),

ciclo-(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-\beta-Ala),

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

Las abreviaturas de residuos aminoácidos antes mencionadas y que figuran a continuación representan residuos de los siguientes aminoácidos:

Abu: ácido 4-aminobutírico

Aee: H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{2}-CH_{2}COOH

Aha: ácido 6-aminohexanoico, ácido 6-aminocaproico

Aib: ácido \alpha-aminoisobutírico

Ala: alanina

Asn: asparagina

Asp: ácido aspártico

Arg: arginina

Bgl: C-alpha-ter-butilglicina

Cys: cisteína

Dab: ácido 2,4-diaminobutírico

Dap: ácido 2,3-diaminopropiónico

Gln: glutamina

Glp: ácido piroglutámico

Glu: ácido glutámico

Gly: glicina

Har: homoarginina

Hcy: homocisteína

His: histidina

homo-Phe: homofenilalanina

Hse: homoserina

Ile: isoleucina

Leu: leucina

Lys: lisina

Met: metionina

Nal: naft-2-il-alanina

Nle: norleucina

Orn: ornitina

Pen: penicilamina

Phe: fenilalanina

Phg: fenilglicina

4-Hal-Phe: 4-halógeno-fenilanina

Pro: prolina

Ser: serina

Thr: treonina

TIS: triisopropilsilano

Trp: triptófano

Tyr: tirosina

Val: valina.

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Asimismo, las siguientes abreviaturas tienen el siguiente significado:

Ac: acetilo

BOC: ter-butoxicarbonilo

BSA: albúmina de suero bovino

CBZ or Z: benciloxicarbonilo

DCCl: diciclohexilcarbodiimida

DCM: diclorometano

DIEA: dietilamina

DMF: dimetilformamida

EDCl: N-etil-N,N^{1}-(dimetilaminopropil)-carbodiimida

Et: etilo

FCA: ácido fluoresceincarboxílico

FITC: isotiocianato de fluoresceína

Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo

FTH: tiourea de fluoresceína

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol

Me: metilo

MBHA: 4-metilbenzhidrilamina

Mtr: 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenil-sulfonilo

HONSu: N-hidroxisuccinimida

OBut: ter-butiléster

Oct: octanoilo

OMe: metiléster

OEt: etiléster

Pbf: 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-sulfonilo

Pmc: 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo

POA: fenoxiacetilo

Sal: saliciloilo

TBS++: suero salino tri-tamponado con cationes divalentes

TBSA: TBS+BSA

TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3-tetrametiluronio

TFA: ácido trifluoroacético

Trt: tritilo (trifenilmetilo).

En la medida que los aminácidos antes mencionados puedan aparecer en varias formas enantioméricas, anteriormente y a continuación se incluyen todas estas formas y también sus mezclas (por ejemplo, las formas DL). Además, los aminoácidos pueden estar provistos de los correspondientes grupos protectores ya conocidos.

El objeto de la invención son igualmente los hidratos y solvatos, por ejemplo los alcoholatos, de estos compues-
tos.

En los compuestos contemplados en la presente invención se incluyen también los denominados derivados pro-fármaco, es decir, los compuestos modificados, por ejemplo con grupos alquilo o acilo, azúcares u oligopéptidos, que en el organismo se disocian rápidamente para formar los compuestos activos contemplados en la presente invención. Entre éstos se encuentran también los derivados biodegradables de polímeros de los compuestos contemplados en la invención, como se describe, por ejemplo, en Int. J. Pharm. 115, 61-67 (1995).

Los compuestos contemplados en la presente invención incluyen, aparte de los compuestos de la fórmula I que se unen mediante grupos \alpha-amino y \alpha-carboxilo de forma de peptídica (unión cabeza/cola), los compuestos cíclicos que, por ejemplo, en presencia de una cadena lateral funcional, por ejemplo como un grupo SH, se unen de la siguiente manera:

Lado/lado

\hskip0.5cm

por ejemplo, S-S (disulfuro),

Cabeza/lado

Lado/cola

Asimismo, los compuestos contemplados en la presente invención incluyen derivados formados por los péptidos objeto de la presente invención y compuestos marcadores conocidos que permiten detectar fácilmente la presencia de péptidos. Algunos ejemplos de estos derivados son los péptidos con marcadores radiactivos, biotilinados o con marcadores fluorescentes.

Por residuos colorantes fluorescentes se entiende preferiblemente el 7-acetoxicumarin-3-ilo, el fluorescein-5-(y/o 6-)ilo, el 2',7'-diclorofluorescein-5-(y 6-)ilo, el dihidrotetrametilrosamin-4-ilo, el tetrametilrodamin-5-(y/o 6-)ilo, el 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-etilo o el 4,4-difluor-5,7-difenil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-etilo.

Los residuos colorantes fluorescentes funcionalizados que pueden servir de reactivos para la producción de los compuestos de la fórmula I contemplados en la presente invención se describen, por ejemplo, en "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5ª edición, 1992-1994, de R.P. Haughland, Molecular Probes, Inc.".

La invención comprende no sólo los péptidos mencionados, sino también las mezclas y preparaciones que contienen otros principios activos y adyuvantes farmacológicos junto con los compuestos de la presente invención, que pueden influir de la forma deseada sobre el efecto farmacológico primario de los péptidos contemplados en la presente invención.

Por otra parte, los compuestos contemplados en la presente invención y también las sustancias de partida para su producción se preparan por medio de métodos conocidos y de frecuente utilización, como los que se describen en la bibliografía especializada (por ejemplo, en obras de consulta como Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart), en condiciones de reacción conocidas y adecuadas para las transformaciones mencionadas. Para ello también se pueden utilizar variantes conocidas.

De preferencia, los péptidos según la invención pueden prepararse mediante síntesis de fase sólida y posterior disociación y purificación, como describen, por ejemplo Jonczyk y Meienhofer (Peptides, Proc. 8th Am. Pept. Symp., Eds. V. Hruby y D. H. Rich, Pierce Comp. III, p. 73-77, 1983, o Angew. Chem. 104, 1992, 375) o según Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 94, 1972, 3102).

Los péptidos según la invención pueden prepararse en fase sólida (de forma manual o en un sintetizador automático) mediante una estrategia de Fmoc con grupos laterales protectores inestables frente al ácido y purificarse mediante un sistema RP-HPLC. La uniformidad del pico puede medirse por medio de un sistema RP-HPLC y la identidad de la sustancia puede determinarse mediante espectometría de masas FAB-MS.

Además, los péptidos pueden prepararse con los métodos habituales de síntesis de aminoácidos y péptidos, como los descritos, por ejemplo, en Novabiochem - 1999 Catalog & Peptide Synthesis Handbook der Calbiochem-Novabiochem GmbH, D-65796 Bad Soden, en numerosas obras de consulta y solicitudes de patente publicadas.

Pueden utilizarse progresivamente acoplamientos y condensaciones de fragmentos. Pueden emplearse diversos grupos N terminales, C terminales y grupos laterales protectores, prefiriéndose los de disociación ortogonal. Las fases de acoplamiento pueden llevarse a cabo con distintos reactivos de condensación, como carbodiimidas, carbodiimidazol, los de tipo uronio, como TBTU, métodos mixtos de anhídrido, así como los métodos de halogenuros de ácido o de ésteres activos. Resulta conveniente formar in situ los ésteres activados, por ejemplo mediante adición de HOBt o N-hidroxisuccinimida.

Asimismo, con dichas reacciones de condensación puede efectuarse la ciclización de una molécula precursora lineal con grupos protectores laterales, como se describe, por ejemplo, en la patente DE 43 10 643 o en Houben-Weyl, I.c., volumen 15/II, páginas 1 a 806 (1974).

En la síntesis de pétidos en fase sólida pueden emplearse distintas resinas y funciones de anclaje. Las resinas pueden estar basadas, por ejemplo, en poliestireno o poliacrilamida, las funciones de anclaje, como Wang, o-clorotritilo se emplean para la preparación de ácidos peptídicos, y el anclaje aminoxantenoxi para la preparación, por ejemplo, de peptidamidas.

Los péptidos o proteínas biotinilados o con marcadores fluorescentes pueden prepararse igualmente mediante métodos ya establecidos. (Por ejemplo, E.A. Bayer y M. Wilchek en Methods of Biochemical Analysis Vol 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology; y Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6ª edición, 1996, de R.P. Haugland, Molecular Probes, Inc.; o también en la patente internacional WO 97/14716)

Por supuesto, los péptidos según la invención también pueden liberarse mediante solvólisis, en particular hidrólisis, o bien por medio de hidrogenólisis de sus derivados funcionales. Las sustancias de partida preferidas para la solvólisis o la hidrogenólisis son aquellas que, en lugar de uno o varios grupos aminos y/o hidroxilo libres, contienen los correspondientes grupos aminos y/o hidroxilo protegidos, preferiblemente aquellos que en lugar de un átomo de H que está unido con un átomo de N, llevan un grupo protector de aminos o que en lugar del átomo de H de un grupo hidroxilo llevan un grupo protector de hidroxilos. Otro tanto se aplica a los ácidos carboxílicos, que pueden protegerse, por ejemplo, en forma de éster, mediante la sustitución de su función hidroxilo -CO-OH por un grupo
protector.

El término "grupo protector de aminos" es ampliamente conocido y se refiere a los grupos capaces de proteger (bloquear) a un grupo amino frente a transformaciones químicas, pero que pueden eliminarse fácilmente realizando la reacción química deseada en otras partes de la molécula. El término "grupo protector de hidroxilos" también es ampliamente conocido y se refiere a los grupos capaces de proteger a un grupo hidroxilo frente a transformaciones químicas, pero que pueden eliminarse fácilmente realizando la reacción química deseada en otras partes de la molécula. La liberación de los compuestos a partir de sus derivados funcionales puede efectuarse -dependiendo del grupo protector utilizado- por ejemplo, convenientemente con ácidos fuertes, como TFA o ácido perclórico, pero también con otros ácidos inorgánicos fuertes, como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, ácidos carboxílicos orgánicos fuertes, como el ácido tricloroacético o ácidos sulfónicos, como el ácido benzoico o el ácido p-toluensulfónico. Los grupos protectores que pueden eliminarse mediante hidrogenólisis (por ejemplo, CBZ o bencilo) pueden disociarse, por ejemplo, mediante un tratamiento con hidrógeno en presencia de un catalizador (por ejemplo, un catalizador de metales nobles, como paladio, convenientemente sobre un soporte como carbono).

Los grupos protectores típicos para los grupos N terminales y para los grupos amino laterales son Z, BOC, Fmoc, los correspondientes a los grupos C terminales o a las cadenas laterales de Asp o Glu son O-prim.-alquilo (por ejemplo, OMe o OEt), O-ter.-alquilo (por ejemplo, OBut) u Obencilo. Z, BOC, NO_{2}, Mtr, Pmc o Pbf son adecuados para la función guanidino de Arg. Las funciones alcohólicas pueden protegerse por medio de residuos bencilo, residuos ter-alquilo o grupos tritilo.

Los grupos BOC, OBut y Mtr pueden disociarse preferentemente con TFA en diclorometano o con aproximadamente HCl 3 a 5 N en dioxano a una temperatura de 15- 30°, el grupo FMOC con una solución aproximadamente de 5 al 50% de dimetilamina, dietilamina o piperidina en DMF a una temperatura entre 15 y 30°.

El grupo tritilo se utiliza, por ejemplo, para proteger a los siguientes aminoácidos: histidina, asparagina, glutamina y cisteína. La disociación tiene lugar, dependiendo del producto final deseado, con TFA al 10% de tiofenol, que disocia el grupo tritilo de todos los aminoácidos mencionados con TFA/anisol o TFA/tioanisol, sólo se disocia el grupo tritilo de His, Asn y Gln, permaneciendo el de la cadena lateral de Cys.

Los grupos protectores que pueden eliminarse mediante hidrogenólisis (por ejemplo, CBZ o bencilo) pueden disociarse, por ejemplo, mediante un tratamiento con hidrógeno en presencia de un catalizador (por ejemplo, un catalizador de metales nobles, como paladio, convenientemente sobre un soporte como carbono). Como disolvente pueden utilizarse los antes mencionados, en particular alcoholes como por ejemplo el metanol o el etanol, o amidas como DMF. Por regla general, la hidrogenólisis se lleva a cabo a temperaturas entre aproximadamente 0º y 100º y a presiones entre aproximadamente 1 y 200 bar, preferiblemente a temperaturas entre 20ºy 30º, y presiones entre 1 y 10 bar. En la hidrogenólisis del grupo CBZ se obtienen buenos resultados, por ejemplo con una solución de Pd/C en metanol del 5% al 10% o con formiato de amonio (en lugar de hidrógeno) en Pd/C en metanol/DMF a
20º-30°.

Como ya se ha mencionado, los péptidos según la invención incluyen sus sales fisiológicamente compatibles, las cuales pueden prepararse igualmente por medio de métodos ya establecidos. De este modo, una base de un compuesto contemplado en la presente invención con un ácido puede convertirse en la sal de adición ácida correspondiente, por ejemplo, al reaccionar cantidades equivalentes de la base y del ácido en un disolvente inerte, como metanol, y mediante evaporación posterior. Para esta reacción se utilizan sobre todo ácidos que ofrecen sales fisiológicamente compatibles. De esta manera pueden utilizarse ácidos inorgánicos, como ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácidos hidrohalogenados, como ácido clorhídrico o ácido bromhídrico, ácidos fosfóricos, ácido ortofosfórico, ácido sulfámico, así como ácidos orgánicos, en particular ácidos carboxílicos, sulfónicos y sulfúricos alifáticos, alicíclicos, aralifáticos, aromáticos o heterocíclicos mono o polibásicos, como por ejemplo ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido piválico, ácido dietilacético, ácido malónico, ácido succínico, ácido pimélico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido nicotínico, ácido isonicotínico, ácido metanosulfónico o ácido etanosulfónico, ácido etanodisulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido bencenosulfónico, -acido p-toluenosulfónico, ácidos naftalinmonosulfónicos y naftalindisulfónicos, ácido laurilsulfúrico. Las sales fisiológicamente no compatibles, como los picratos, pueden utilizarse para aislar y/o purificar los compuestos contemplados en la presente invención. Por otra parte, un ácido de los compuestos contemplados en la presente invención puede transformarse por reacción con una base en una de sus sales metálicas o de amonio fisiológicamente compatibles. A tal fin pueden utilizarse en particular las sales de sodio, potasio, magnesio, calcio y amonio, asimismo sales de amonio sustituidas, como por ejemplo, las sales de dimetilamonio, dietilamonio diisopropilamonio, sales de monoetanolamonio, dietanolamonio o diisopropilamonio, sales de ciclohexilamonio y diciclohexilamonio, sales de dibenciletilendiamonio, así como por ejemplo sales con arginina o
lisina.

Como ya se ha mencionado, los compuestos peptídicos contemplados en la presente invención pueden utilizarse como principios activos en medicina humana y veterinaria, en particular para la prevención y/o terapia de enfermedades en las que participan las células epiteliales. Cabe destacar especialmente las enfermedades, inflamaciones o procesos de curación de heridas de la piel, de los órganos de las vías respiratorias y del sistema gastrointestinal, como por ejemplo, la apoplejía, la angina de pecho, las enfermedades tumorales, las enfermedades osteolíticas como la osteoporosis, las enfermedades angiogénicas patológicas, como por ejemplo las inflamaciones, las fibrosis, en particular la fibrosis pulmonar, las enfermedades oftalmológicas, la retinopatía diabética, la degeneración macular, la miopía, la histoplasmosis ocular, la artritis reumatoide, la osteoartritis, el glaucoma rubeótico, la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn, la arteriosclerosis, la soriasis, la restenosis tras angioplastia, en caso de crisis nefríticas agudas, inflamación renal, infecciones microbianas y esclerosis múltiple.

Por consiguiente, el objeto de la presente invención son los compuestos peptídicos de las fórmulas definidas anteriormente y a continuación, así como en las reivindicaciones, incluyendo sus sales fisiológicamente compatibles en forma de medicamentos, medios de diagnóstico o reactivos.

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En particular, el objeto de la presente invención son los correspondientes medicamentos en forma de inhibidores para combatir enfermedades relacionadas directa o indirectamente con una expresión del receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{6}, en particular en enfermedades angiogénicas patológicas, trombosis, infartos cardíacos, enfermedades coronarias, arteriosclerosis, tumores, osteoporosis, inflamaciones, infecciones, así como para influir sobre el proceso de curación de las heridas.

Asimismo son objeto de la presente invención las correspondientes preparaciones farmacéuticas que contienen al menos un medicamento, así como dado el caso excipientes y/o coadyuvantes de la fórmula I.

Además es objeto de la invención el empleo de los compuestos peptídicos y/o sus sales fisiológicamente compatibles según las reivindicaciones y la descripción para la preparación de un medicamento para combatir enfermedades relacionadas directa o indirectamente con una expresión del receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{6}, en particular en enfermedades angiogénicas patológicas, trombosis, infartos cardíacos, enfermedades coronarias, arteriosclerosis, tumores, osteoporosis, inflamaciones, infecciones, así como para influir sobre el proceso de curación de las heridas. Los medicamentos contemplados en la invención y las preparaciones farmacéuticas que los contienen pueden utilizarse en medicina humana o veterinaria. Como excipientes pueden utilizarse sustancias orgánicas o inorgánicas adecuadas para la administración enteral (por ejemplo, oral), parenteral o tópica, o para la administración en forma de aerosol de inhalación, que no reaccionen con los nuevos compuestos, como por ejemplo, agua, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, alquilenglicoles, polietilenglicoles, triacetato de glicerina, gelatina, carbohidratos, como la lactosa o el almidón, estearato de magnesio, talco o vaselina. Para administración oral se utilizan en particular los comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, polvos, granulados, jarabes, jugos o gotas, para administración rectal pueden emplearse supositorios, para administración parenteral se pueden utilizar soluciones, de preferencia oleosas o acuosas, así como suspensiones, emulsiones o implantes, para administración tópica se pueden usar ungüentos, cremas o polvos. Los nuevos compuestos también pueden someterse a liofilización y el producto liofilizado obtenido puede emplearse, por ejemplo, para la elaboración de preparaciones inyectables. Las preparaciones mencionadas pueden esterilizarse y/o contener coadyuvantes, como lubricantes, conservantes, estabilizadores y/o agentes tensioactivos, emulsionantes, sales para influr sobre la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o varios principios activos distintos, como por ejemplo, una o varias vitaminas.

Para la administración por inhalación pueden utilizarse aerosoles que contengan el principio activo en solución o suspensión en un gas propelente o una mezcla de gases propelentes (como por ejemplo, CO_{2} o hidrocarburos clorofluorados). A tal fin resulta conveniente utilizar el principio activo en forma micronizada, estando presentes uno o varios disolventes adicionales fisiológicamente compatibles, como por ejemplo el etanol. Las soluciones para inhalar pueden administrarse con la ayuda de inhaladores comunes.

En general, las sustancias contempladas en la presente invención pueden administrarse de forma análoga a otros péptidos conocidos disponibles comercialmente (por ejemplo, los descritos en la patente US-A-4 472 305), de preferencia en dosis entre 0,05 y 500 mg, y especialmente entre 0,5 y 100 mg por unidad de dosificación. La dosis diaria se sitúa preferiblemente entre 0,01 y 20 mg/kg de peso corporal. No obstante, la dosis específica para cada paciente depende de muy diversos factores, como por ejemplo, la eficacia del compuesto especial utilizado, la edad, el peso corporal, el estado de salud en general, el género del paciente, la alimentación, el momento y la vía de administración, la velocidad de eliminación, la combinación de medicamentos y la gravedad de la enfermedad a la que se aplica la terapia. Se prefiere la aplicación parenteral.

Además, los nuevos compuestos de la fórmula I pueden utilizarse en biología analítica y biología molecular.

Los nuevos compuestos de la fórmula I, en la que X representa un residuo colorante fluorescente a través de un enlace con -CONH-, -COO-, -NH-C(=S)-NH-, -NH-C(=O)-NH-, -SO_{2}NH- o -NHCO- pueden utilizarse como marcadores de diagnóstico en la técnica FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) y en microscopía de fluorescencia.

El empleo de compuestos marcados en microscopía de fluorescencia es descrito, por ejemplo, por Y.-L. Wang y D. L. Taylor en "Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part A + B, Academic Press, Inc. 1989".

Los nuevos compuestos contemplados en la presente invención pueden utilizarse también como ligandos de integrina para la fabricación de columnas para cromatografía de afinidad para la preparación de integrinas en estado puro. El complejo de un material de soporte derivatizado con avidina, por ejemplo la sefarosa, y los nuevos compuestos se forma mediante métodos ya conocidos (por ejemplo E.A. Bayer y M. Wilchek en Methods of Biochemical Analysis Vol 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology). Como materiales de soporte poliméricos pueden utilizarse las fases sólidas poliméricas conocidas en la química de los péptidos, preferiblemente con propiedades hidrófilas, por ejemplo, los poliazúcares reticulados, como la celulosa, la sefarosa o el Sephadex^{R}, la acrilamida, polímeros a base de polietilenglicol o polímeros-Tentakel^{R}.

La invención comprende, por último, secuencias de ADN recombinante, que contienen secciones que codifican áreas de péptidos, que presentan los motivos estructurales peptídicos contemplados en la presente invención.

Dicho ADN puede transmitirse a las células mediante partículas, como se describe en Ch. Andree et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12188-12192 (1994), o puede incrementarse la transferencia a células mediante otros medios auxiliares, como liposomas (A.I. Aronsohn y J.A. Hughes J. Drug Targeting, 5, 163-169 (1997)).

La transferencia de uno de estos ADN puede utilizarse en levaduras, mediante virus Bacculo, o en células de mamíferos para la producción de las sustancias peptídicas de esta invención.

Si se infecta un organismo animal o humano con dicho ADN recombinante, los péptidos según la invención formados finalmente por las propias células infectadas pueden unirse directamente al receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{6}, por ejemplo de células tumorales, y bloquearlo.

El correspondiente ADN recombinante, que puede prepararse con técnicas conocidas y habituales, se encuentra también en forma de ADN vírico, el cual contiene secciones que codifican la proteína de la cápsula del virus. Infectando a un organismo huésped con dichos virus recombinantes, preferiblemente virus no patógenos, pueden atacarse de forma prioritaria las células huésped que expresan la integrina \alpha_{v}\beta_{6} (targetting).

Pueden utilizarse, por ejemplo, virus como las especies de adenovirus que se han utilizado frecuentemente como vectores para la introducción de genes ajenos en células de mamíferos. Un gran número de propiedades los convierten en buenos candidatos, como se desprende de lo expuesto por S.J. Watkins et al., Gene Therapy 4, 1004-1012 (1997) (véase igualmente J. Engelhardt et al. Hum. Gene Ther. 4, 759-769 (1993)).

Como señalan A. Fasbender et al. en J. Clin. Invest. 102, 184-193 (1998), un problema común de la terapia genética por medio de vectores víricos y no víricos es la limitada eficiencia de la transferencia de los genes. Con la secuencia de ligandos antes descrita para la integrina \alpha_{v}\beta_{6} en las proteínas de la cápsula de los adenovirus se puede conseguir una mejora de la transferencia, por ejemplo, del cADN del Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR).

De forma a similar a los trabajos de T. Tanaka et al. en Cancer Research 58, 3362-3369 (1998), en lugar del ADN para la angiostatina, puede emplearse el ADN para las secuencias de la presente invención para las transfecciones celulares mediante vectores retrovirales o adenovirales.

Los péptidos contemplados en la presente invención pueden utilizarse también, dentro de un complejo de liposomas formado por lípido/péptido/ADN para una transfección de cultivos celulares junto con un complejo de liposomas compuesto por lípido/ADN (sin péptido) para su uso en terapia genética para seres humanos. La producción de un complejo de liposomas formado por lípido/ADN/péptido se describe, por ejemplo, en Hart S.L, et al 1998: Lipid-Mediated Enhancement of Transfection by a Non-Viral Integrin-Targeting Vector. Human Gene Therapy 9,
575-585.

Un complejo de liposomas formado por lípido/péptido/ADN se ha obtenido, por ejemplo, a partir de las siguientes soluciones: l \mug/\mul de lipofectina (mezcla equimolar de DOTMA (= cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio) y DOPE (Dioleilfosfatidiletanolamina)), 10 \mug/ml de ADN plasmídico y 100 \mug/ml de péptido. Para ello se disuelven en un medio de cultivo celular tanto el ADN como el péptido.

El complejo de liposomas se prepara mezclando los tres componentes en una determinada proporción en peso (lípido: ADN: péptido, por ejemplo, 0,75: 1: 4). Ya se han descrito complejos liposómicos de ADN para terapia genética en seres humanos (Caplen N.J., et al 1995: Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis Nature Medicine 1, 39-46).

De este modo, el objeto de la invención es igualmente el empleo de ADN recombinante modificado de sistemas de liberación de genes, en particular ADN vírico, para combatir enfermedades relacionadas directa o indirectamente con la expresión de un receptor de integrina \alpha_{v}\beta_{6}, en particular en enfermedades angiogénicas patológicas, trombosis, infartos cardíacos, enfermedades coronarias, arteriosclerosis, tumores, osteoporosis, inflamaciones, infecciones, así como para influir sobre el proceso de curación de las heridas.

Todas las temperaturas indicadas anteriormente y a continuación en el presente documento están en grados centígrados.

Los análisis por HPLC (tiempo de retención Rt) se llevaron a cabo en los siguientes sistemas:

Columna de 5 \mum de LichroSpher 60 RP-Select B (250-4), con un gradiente durante 50 minutos de 0 a 80% de 2-propanol en agua/ácido trifluoroacético al 0,3%, con un flujo de 1 ml/min y detección a 215 nm.

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Espectrometría de masas (MS):: EI (ionización por colisión electrónica) M+

\quad: FAB (bombardeo con átomos rápidos) (M+H)^{+}

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Ejemplo 1

Preparación y purificación de los péptidos de la invención

En principio, la preparación y purificación se llevó a cabo mediante una estrategia Fmoc con protección de las cadenas laterales inestables al ácido sobre resinas inestables al ácido utilizando un sintetizador de péptidos comercial de "flujo continuo", según las indicaciones de Haubner et al. (J. Am. Chem. Soc. 118, 1996, 17703).

Ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) [EMD 272914]

Se suspendieron 2,7 g de Fmoc-Abu-OH (Bachem B-1910) en 150 ml de cloruro de metileno, suspensión que se disolvió en 10 ml de DMF. Se añadieron 5,6 ml de diisopropiletilamina, la solución se vertió en 12,0 g de resina de poliestireno-clorotritilcloruro (1,14 mmol/g, Bachem D-196512) y el depósito se agitó a temperatura ambiente.

Después de cinco horas se aspiró la resina y se lavó con 300 ml de DCM/MeOH/DIEA = 17/2/1, DCM, DMF, DCM y MeOH. Tras eliminar el disolvente se obtuvieron 14,55 g de resina de aminoácido de Fmoc. Una triple medición de Fmoc arrojó en promedio una carga de 541 \mumol/g de resina Fmoc-Abu-O-oCITrt.

Se mezclaron 0,7 g de resina de poliestireno Fmoc-Abu-O-oClTrt sucesivamente mediante una técnica de doble acoplamiento 2x con 0,30 g de TBTU, 0,315 ml de etildiisopropilamina y aminoácido Fmoc en 4,1 ml de DMF en un sintetizador comercial y se sometió a una fase de acoplamiento en un procedimiento típico (dispositivo y manual: Milligen 9050 PepSynthesizer^{TM}, 1987), durante 30 minutos cada vez. Se realizaron fases de lavado en DMF durante 10 minutos, fases de disociación en piperidina/DMF (1:4 vol) durante 5 minutos y se realizaron acetilaciones N-terminales (capping) con anhídrido de ácido acético/piridina/DMF (2:3:15 vol) durante 15 minutos.

Se utilizaron los aminoácidos Fmoc-Arg(Pmc), a continuación Fmoc-Leu, a continuación Fmoc-Ala, a continuación Fmoc-D-Asp(OBut), a continuación Fmoc-Leu, a continuación Fmoc-Asp(OBut), a continuación Fmoc-Thr(But), a continuación Fmoc-Arg(Pmc) y por último Fmoc-Abu. Tras la disociación del grupo protector Fmoc de la resina de poliestireno Fmoc-Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-O-oCITrt se realizó un lavado con DMF e isopropanol y, tras el secado al vacío a temperatura ambiente se obtuvieron 0,9 g de resina de poliestireno Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-O-oCITrt.

Mediante el tratamiento de esta resina peptidílica con 20 ml de trifluoretanol/diclorometano/ácido acético (2:6:2 vol) durante 2 horas a temperatura ambiente, filtrado, concentración por evaporación y extracción con dietiléter se obtuvieron 0,19 g del péptido de cadena lateral protegida Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-OH.

Mediante goteo de una solución de este producto en DMF (100 mg de péptido/15 ml de DMF) en una solución agitada de TBTU/HOBt/DIPEA (10:10:11 equivalente) en 50 ml de DMF/100 mg de péptido en un plazo de 30 minutos y tras nueva agitación durante 1 hora se logró la ciclización. Tras concentración por evaporación y precipitado en agua se obtuvieron 0,15 g de ciclo-(Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-Abu) crudo. Tras el tratamiento con ácido trifluoroacético/agua/TIS (94:3:3 vol) durante 2 horas a temperatura ambiente, concentración por evaporación y extracción con dietiléter apareció un sedimento de 85 mg de ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu).

La purificación del producto se realizó mediante RP-HPLC en Lichrosorb RP 18 (250 - 25, 7 \mum, Merck KGaA) en 0,3% de TFA con un gradiente de 4% a 24% de 2-propanol durante una hora a 10 ml/min y la evaluación del eluido se efectuó mediante un fotómetro de paso de rayos ultravioleta a 215 y 254 nm. Se obtuvieron 51 mg de producto, FAB 1067; Rt 19,0.

De forma análoga se prepararon los siguientes productos:

2

3

	Nomenclatura para aminoácidos según Eur. J. Biochem. 138, 9-37 (1984)
	letras minúsculas = D-aminoácido
	n.m. = no medido

Los compuestos 271312, 271578, 271579, 271586-271591,272970, 272971, 329393- 329400 no forman parte de los compuestos de la presente invención, sino que son compuestos de comparación.

Ejemplo 2

Ensayo de enlace del receptor \alpha_{v}\beta_{6}/fibronectina

Los péptidos preparados según la invención se unieron en solución junto con fibronectina de efecto competitivo, sobre el receptor \alpha_{v}\beta_{6} inmovilizado y se determinó el valor Q como medida de la selectividad del enlace entre el péptido objeto de la ensayo y la \alpha_{v}\beta_{6}. El valor Q se calcula a partir del cociente de los valores IC_{50} del péptido de ensayo y un valor de referencia. El valor de referencia fue Ac-RTDLDSLR-NH_{2} lineal (Código EMD 271293) (Lit./Patent, véase Pytela et al. Science 231, 1559, (1986)). El ensayo de enlace se realizó de las siguiente manera:

La inmovilización del receptor soluble \alpha_{v}\beta_{6} en placas de mitrotitulación se efectuó mediante dilución de la solución de proteínas en TBS++ y posterior incubación durante la noche a 4°C (100 \mul/cavidad). Se bloquearon los puntos de unión no específicos mediante incubación (2 horas a 37°C) con 3% (p/v) de BSA en TBS++ (200 \mul/cavidad). El BSA sobrante se eliminó mediante tres lavados con TBSA++. Los péptidos se diluyeron en serie (1:10) en TBSA++ y se incubaron junto con la fibronectina biotinilada (2 \mug/ml) con la integrina inmovilizada (50 \mul de péptido + 50 \mul de ligando por cavidad; durante 2 horas a 37°C). La fibronectina y los péptidos no enlazados se eliminaron mediante tres lavados con TBSA++. La detección de la fibronectina enlazada se realizó mediante incubación (1 hora a 37ºC) con un anticuerpo antibiotín acoplado a fosfatasa alcalina (Biorad) (1:20000 en TBSA++; 100 \mul/cavidad). Tras tres lavados con TBSA++ se efectuó la detección colorimétrica mediante incubación (10-15 minutos a 25°C en oscuridad) con una solución de sustrato (5 mg de fosfato de nitrofenilo, 1 ml de etanolamina, 4 ml de H_{2}O; 100 \mul/cavidad). La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 0,4 M NaOH (100 \mul/cavidad). La intensidad cromática se midió a 405 nm con un medidor ELISA y se comparó con el valor cero. Se utilizaron como valor cero las cavidades no recubiertas con el receptor. Se utilizó como valor de referencia Ac-RTDLDSLR-NH_{2}. Los valores IC_{50} para los péptidos sometidos al ensayo se obtuvieron de un gráfico y a partir de éstos y del valor IC_{50} del péptido de referencia se calculó el valor Q del péptido de la invención.

Valor Q = IC_{50} del péptido de ensayo/IC_{50} de referencia

Se determinaron los valores Q mediante repeticiones del ensayo.

Los resultados de los ensayos descritos se resumen en la siguiente Tabla 1:

TABLA 1 Resultados del ensayo de enlace del receptor \alpha_{v}\beta_{6}/fibronectina

5

6

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Los ejemplos siguientes se refieren a preparaciones farmacéuticas.

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Ejemplo A

Ampollas inyectables

Una solución de 100 g de ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) y 5 g de hidrogenofosfato disódico en 3 L de agua doblemente destilada se ajusta a pH 6,5 con ácido clorhídrico 2 N, se filtra en condiciones estériles, y se introduce en ampollas inyectables, se liofiliza bajo condiciones estériles y se precinta de forma estéril. Cada ampolla inyectable contiene 5 mg de principio activo.

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Ejemplo B

Supositorios

Se funde una mezcla de 20 g de ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) con 100 g de lecitina de soja y 1400 g de manteca de cacao, se vierte el fundido en moldes y se deja enfriar. Cada supositorio contiene 20 mg de principio activo.

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Ejemplo C

Solución

Se prepara una solución de 1 g de ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), 9,38 g de NaH_{2}
PO_{4}, \cdot 2 H_{2}O, 28,48 g de Na_{2}HPO_{4} \cdot 12 H_{2}O y 0,1 g de cloruro de benzalconio en 940 ml de agua doblemente destilada. Se ajusta el pH a 6,8, se enrasa a 1 L y se esteriliza mediante irradiación. Esta solución puede utilizarse como colirio ocular.

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Ejemplo D

Ungüento

Se mezclan 500 mg de ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) con 99,5 g de vaselina en condiciones asépticas.

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Ejemplo E

Comprimidos

Se comprime por medios habituales una mezcla formada por 1 kg de ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), 4 kg de lactosa, 1,2 kg de almidón de patata, 0,2 kg de talco y 0,1 kg de estearato de magnesio para formar comprimidos de forma que cada uno de ellos contiene 10 mg de principio activo.

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Ejemplo F

Grageas

De forma análoga al ejemplo E se comprimen comprimidos que a continuación se recubren mediante métodos habituales con un recubrimiento de sacarosa, almidón de patata, talco, goma de tragacanto y colorante.

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Ejemplo G

Cápsulas

Se envasan 2 kg de ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) de forma habitual en cápsulas de gelatina rígida, de forma que cada una de ellas contiene 20 mg de principio activo.

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Ejemplo H

Viales

Una solución de 1 kg de ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) en 60 L de agua doblemente destilada se somete a un filtrado de esterilización, se envasa en viales, se liofiliza y se precinta en condiciones estériles. Cada vial contiene 10 mg de principio activo.

Ejemplo I

Aerosol para inhalación

Se disuelven 14 g de ciclo-(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) en 10 L de solución isotónica de NaCl y esta solución se envasa en aerosoles comerciales provistos de mecanismo de bomba. La solución puede pulverizarse en la boca o la nariz. Una aplicación (aproximadamente 0,1 ml) corresponde a una dosis de aproximadamente 0,14 mg.

Claims

1. Los derivados de los péptidos de la fórmula I

Iciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}-R^{1})

donde

X^{1}: es Ser, Gly o Thr,

X^{2}: es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,

X^{3}: es Asp, Glu, Lys o Phe,

X^{4}: es Gly, Ala o Ser,

X^{5}: es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,

X^{6}: es Arg, Har o Lys,

que incluyen las formas D y L de los residuos aminoácidos ópticamente activos,

así como sus sales y solvatos fisiológicamente compatibles.

2. Los derivados de los péptidos mencionados en la reivindicación 1 de la fórmula I

Iciclo-(Arg-X^{1}-Asp-X^{2}-X^{3}-X^{4}-X^{5}-X^{6}-R^{1})

donde

X^{1}: es Ser, Gly o Thr,

X^{2}: es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,

X^{3}: es Asp, Glu, Lys o Phe,

X^{4}: es Gly, Ala o Ser,

X^{5}: es Leu, Ile, Nle, Val o Phe,

X^{6}: es Arg, Har o Lys,

R^{1}: son 1-10 aminoácidos seleccionados del grupo Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Hcy, His, Hse, Ile, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-(C H_{2})_{n}-COOH,

y con la condición que m + n > 0.

así como sus sales y solvatos fisiológicamente compatibles.

3. Compuestos peptídicos mencionados en las reivindicaciones 1 ó 2, seleccionados del grupo

ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),

ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),

ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Ala-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),

ciclo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),

ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),

ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha-Aha),

ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha),

ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aee),

ciclo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu),

ciclo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-\beta-Ala),

ciclo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-\beta-Ala),

así como sus sales y solvatos fisiológicamente compatibles.

4. Compuestos peptídicos de la fórmula I mencionados en las reivindicaciones 1 y 2, y compuestos mencionados en la reivindicación 3, así como sus sales y solvatos fisiológicamente compatibles en forma de medicamentos.

5. Medicamento mencionado en la reivindicación 4 en forma de inhibidor para combatir enfermedades relacionadas con una expresión y función patológicas de los receptores de integrina \alpha_{v}\beta_{6}.

6. Medicamento mencionado en la reivindicación 5 en forma de inhibidor para combatir enfermedades relacionadas con una expresión y función patológicas de los receptores de integrina \alpha_{v}\beta_{6}.

7. La preparación farmacéutica que contiene al menos uno de los medicamentos mencionados en las reivindicaciones 5 a 6, así como excipientes y/o coadyuvantes, y otros principios activos.

8. Empleo de compuestos peptídicos mencionados en las reivindicaciones 1 a 3 y/o sus sales fisiológicamente compatibles para la preparación de un medicamento para combatir enfermedades relacionadas con una expresión y función patológicas de los receptores de integrina \alpha_{v}\beta_{6}.

9. Empleo mencionado en la reivindicación 8 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trombosis, infartos cardíacos, enfermedades coronarias, arteriosclerosis, tumores, osteoporosis, fibrosis, inflamaciones, infecciones, soriasis, así como para influir sobre el proceso de curación de las heridas.