ES2309487T3

ES2309487T3 - Sulfonamidas peptidicas.

Info

Publication number: ES2309487T3
Application number: ES04701939T
Authority: ES
Inventors: Alfred Jonczyk; Ulrich Groth; Gunther Zischinsky
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2004-01-14
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2024-01-14
Also published as: WO2004069861A1; EP1590366B1; DE502004007051D1; MXPA05008313A; US7759302B2; ATE394415T1; CN1747966A; EP1590366A1; AU2004208865B2; ZA200507116B; PL377560A1; AU2004208865A1; CA2515127A1; BRPI0407267A; RU2005127668A; US20060148716A1; KR20050102634A; JP2007523835A

Abstract

Compuestos peptídicos de fórmula I R 1 - Arg - X - Asp - Leu - Asp - Ser - Leu - Arg - R 2 I en la que R 1 representa H, acetilo o acilo y R 2 representa -OH, OR 3 NH2,NHR 3 , N(R 3 )2 R 3 representa alquilo, aralquilo, arilo, Het y X representa un aminoácido de fórmula II (Ver fórmula) en la que A representa representa (CH2)n R 4 representa aralquilo o arilo y n representa 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y el aminoácido de fórmula II está unido mediante un enlace peptídico del grupo alfa-amino con la Arg contigua y mediante un enlace peptídico del grupo alfa-carboxilo con el grupo alfa-amino de la Asp contigua, así como sus compuestos de utilidad farmacéutica a) profármacos, seleccionados entre compuestos de fórmula I modificados con grupos alquilo o acilo, azúcares u oligopéptidos, b) derivados, seleccionados entre N-metil-, N-etil-, N-propil-, N-bencil- y Calfa-metilderivados, así como derivados que llevan grupos acetilo N-terminales o en los que los grupos acetilo se sustituyen por otra función acilo, seleccionada entre propionilo, butirilo y benzoilo, c) solvatos, d) estereoisómeros y e) sales de estos, incluyendo sus mezclas en todas las proporciones.

Description

Sulfonamidas peptídicas.

La invención se refiere a péptidos de fórmula I

IR^{1}-Arg-X-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-R^{2}

en la que

R^{1}: representa H, acetilo o acilo y

R^{2}: representa -OH, OR^{3} NH_{2},NHR^{3}, N(R^{3})_{2}

R^{3}: representa alquilo, aralquilo, arilo, Het y

X: representa un aminoácido de fórmula II

1

en la que

A: representa (CH_{2})_{n}

R^{4}: representa aralquilo o arilo y

n: representa 1, 2, 3, 4, 5 o 6

y el aminoácido de fórmula II está unido mediante enlace peptídico del grupo \alpha-amino con la Arg contigua y mediante enlace peptídico del grupo \alpha-carboxilo con el grupo \alpha-amino de la Asp contigua.

También son objeto de la presente invención los compuestos de aplicación farmacéutica

a): profármacos, seleccionados entre compuestos de fórmula I modificados con grupos alquilo o acilo, azúcares u oligopéptidos,

b): derivados, seleccionados entre N-metil-, N-etil-, N-propil-, N-bencil- y C_{\alpha}-metilderivados, así como derivados que llevan grupos acetilo N-terminales o en los que los grupos acetilo se sustituyen por otra función acilo, seleccionada entre propionilo, butirilo y benzoilo,

c): solvatos,

d): estereoisómeros y

e): sales

de ello, incluidas sus mezclas en todas las proporciones.

La invención tiene por objeto encontrar compuestos con propiedades valiosas, especialmente aquellas que puedan emplearse para la preparación de medicamentos.

Se ha encontrado que los compuestos de fórmula I según la invención y sus sales poseen propiedades farmacológicas muy valiosas, porque son bien tolerados.

Los compuestos de fórmula I según la invención son ligandos de la integrina plaquetaria GPIIbIIIa y de las \alpha_{v}-integrinas, de preferencia las \alpha_{v}\beta_{6} y \alpha_{v}\beta_{3} integrinas y por consiguiente, se utilizan como agonistas y/o antagonistas para el tratamiento de diferentes enfermedades y estados patológicos. Además, se utilizan para el diagnóstico o como reactivos.

Otros inhibidores de la integrina \alpha_{v}\beta_{6} son los contemplados en las patentes DE 19858857, DE 19929410 y WO 00/37487, y descritos por S.Kraft et al. en J. Biol. Chem. 274, 1979-85 (1999).

Las integrinas pertenecen a la familia de los receptores transmembrana heterodiméricos clase I, que juegan un papel importante en numerosos procesos de adhesión célula-matriz o célula-célula (Tuckwell et al., 1996, Symp. Soc. Exp. Biol. 47). Se pueden dividir en tres clases principales: las \beta_{1}-integrinas, que representan los receptores para la matriz extracelular, las \beta_{2}-integrinas, que se pueden activar sobre los leucocitos y se "disparan" durante los procesos inflamatorios, y las \alpha_{v}-integrinas, que tienen influencia sobre la respuesta celular en la curación de heridas y otros procesos patológicos (Marshall y Hart, 1996, Semin. Cancer Biol. 7, 191).

Todas las integrinas \alpha_{5}\beta_{1}, \alpha_{IIb}\beta_{3}, \alpha_{8}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{8} y \alpha_{v}\beta_{6} se unen a la secuencia peptídica Arg-Gly-Asp (RGD) formando ligandos naturales, como por ejemplo, fibronectina o vitronectina. Los péptidos solubles que contienen RGD son capaces de inhibir la interacción de cada una de estas integrinas con los correspondientes ligandos naturales.

\alpha_{v}\beta_{6} es una integrina relativamente rara (Busk et al., 1992 J. Biol. Chem. 267(9), 5790; Breuss et al., 1993, J. Histochem. Cytochem. 41(10), 1521), que se forma en abundancia en los procesos de reparación del tejido epitelial y que se une con preferencia a las moléculas naturales de la matriz, fibronectina y tenascina (Wang et al., 1996, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15(5), 664; Huang et al., 1998, J. Cell Sci. 111, 2189). Las funciones fisiológicas y patológicas de \alpha_{v}\beta_{6} aún no se conocen con exactitud, aunque se supone que esta integrina desempeña un papel importante en los procesos fisiológicos y enfermedades (por ejemplo, inflamaciones, curación de heridas, tumores), en los que participan células epiteliales (Breuss et al., 1995, J. Cell Sci. 108, 2241). De este modo, \alpha_{v}\beta_{6} se expresa en queratinocitos en las heridas (Haapasalmi et al., 1996, J. Invest. Dermatol. 106(1), 42; Cass et al., 1998, J. Pediatr. Surg. 33(2), 312), de lo que se deduce que, además de los procesos de curación de heridas y las inflamaciones, también otras manifestaciones patológicas de la piel, como por ejemplo, la soriasis, pueden ser influenciadas por agonistas o antagonistas de la integrina mencionada.

Además, las trastornos de queratinización de la piel, las llamadas leucoplasias, en la mucosa de la cavidad bucal, en los labios, la lengua, así como en los genitales, muestran un aumento de la expresión de la integrina \alpha_{v}\beta_{6}, al contrario que los tejidos comparativos normales. También se ha demostrado que la frecuencia y la cantidad de expresión de las leucoplasias aumenta desde liquen plano hasta carcinoma epitelial plano (carcinoma de células escamosas), de modo que también la expresión de \alpha_{v}\beta_{6} puede estar relacionada con la transformación maligna de las leucoplasias (Hamidi et al., 2000, Br. J. Cancer. 82(8), 1433; Ramos et al., 1997, Int. J. Cancer. 72(2), 369; Thomas et al., 2001, J. Inv. Dermatol. 117(1), 67; Koivisto et al., 2000, Exp. Cell Res. 255(1), 10).

Además, \alpha_{v}\beta_{6} desempeña un papel importante en el epitelio de las vías respiratorias (Weinacker et al., 1995, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12(5), 547), de manera que los agonistas/antagonistas correspondientes de esta integrina se podrían usar con éxito en enfermedades de las vías respiratorias, como bronquitis, asma, fibrosis pulmonar y tumores de las vías respiratorias (Huang et al., 1998, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19(4), 636; Pilewski et al., 1997, Am. J. Physiol. 273, L256; Kaminski et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97(4), 1778).

Las fibrosis no se conocen sólo en los pulmones (bronquios), sino que se encuentran igualmente en otros órganos, de manera que la integrina \alpha_{v}\beta_{6} también desempeña en ellos un papel importante. Son ejemplos de ello las proliferaciones de tejido conjuntivo, por ejemplo, de la piel, del hígado (hasta la cirrosis), de los riñones y la vejiga, del corazón y del páncreas (mucoviscidosis) (Mutsaers et al.,1997, J. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29(1), 5; Dalton, S.L. 1999, J. Am. Acad. Dermatol. 41, 457; Kropf et al., 1991, Z. Med. Laboratoriumsdiagn. 32(3/4), 150; Schnee et al., 2000, Cardiovasc. Res. 46(2), 264; Sime, P.J. 1999 Curr. Opin. Anti-Inflammatory Immunomodulatory Invest. Drugs 1(5), 423; Housset et al., 1999, J. Pathol. Biol. 47(9), 886; Norman et al., 1999, Exp. Nephrol. 7(2), 167; Nahas et al., 1997, Int. J. Biochem. Cell Biol. 29(1), 55).

Asimismo, se sabe que \alpha_{v}\beta_{6} también desempeña un papel importante en el epitelio intestinal, de manera que los agonistas/antagonistas correspondientes de esta integrina se podrían usar con éxito para el tratamiento de inflamaciones, tumores y heridas del tracto gastrointestinal. Hay indicios de que la integrina \alpha_{v}\beta_{6} influye también en la secreción de metaloproteasas de matriz, como por ejemplo, la gelatinasa B (MMP-9) (Agrez et al., 1994, J.Cell. Biol. 127(2), 547; Niu et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 249(1), 287).

El control de la actividad MMP (posiblemente de diferentes MMP) por células tumorales dependiendo de su densidad es también un mecanismo que permite a las células, durante el crecimiento de una masa tumoral, conseguir un nuevo lugar para la proliferación y migración mediante proteólisis de la matriz circundante. En la bibliografía (Niu et al., 2001, Int. J. Cancer 92(1), 40; Agrez et al., 1999 Int. J. Cancer 81(1), 90; Thomas et al., 2001, J. Inv. Dermatol. 116(6), 898; Thomas et al., 2001 Int. J. Cancer 92(5), 641) se hace referencia a este relación entre la expresión de \alpha_{v}\beta_{6}, la densidad celular y la actividad MMP.

Puesto que la integrina \alpha_{v}\beta_{6} también desempeña un papel importante en los procesos infecciosos, sus agonistas/antagonistas se pueden emplear en infecciones microbianas (protozoos, micrófitos; bacterias, virus, levaduras, hongos). Se conocen ejemplos para el virus Coxsackie y para el ataque de células huésped con el virus de la fiebre aftosa (FMDV), que son dependientes de \alpha_{v}\beta_{3}, aunque también pueden depender de \alpha_{v}\beta_{6} (Agrez et al., 1997, Virology. 239(1), 71; Jackson et al., 2000, J. Virol. 74(11), 4949; Miller et al., 2001, J. Virol. 75(9), 4158; Neff et al., 2001, J. Virol. 75(1), 527; Neff et al., 1998, J. Virol. 72(5), 3587; Jackson et al., 1997 J. Virol. 71(11), 8357).

La infección por VIH (SIDA) también depende de integrinas \alpha_{v}-\beta, como se demostró hace años (Ruoslahti et al., WO 92/14755).

Según descubrimientos recientes, la bacteria Bacillus anthracis secreta una toxina que se compone de 3 proteínas, de las cuáles una de ellas, la denominada PA o antígeno protector, se une a receptores que se encuentran en la membrana celular, y el receptor ATR (del inglés, Anthax Toxin Receptor, receptor de la toxina del ántrax) representa una proteína de membrana tipo I con un dominio extracelular del tipo del Factor A de von Willebrandt. Las integrinas también contienen dichos dominios vWFA. Esto se puede observar mediante un estudio de homología en la base de datos Swiss Prot, tanto para la integrina \alpha_{v}\beta_{6} (http://www.expasy.ch/cgi-bin/niceprot.pl?P18564; en este caso la secuencia \beta_{6} (131-371)), como para la \alpha_{v}\beta_{3} (http://www.expasy.ch/cgi-bin/niceprot.pl?P05106; \beta_{3} (135-377)). Por consiguiente, los agonistas/antagonistas según la invención también se pueden utilizar en los casos de ántrax (ántrax de la lengua, la piel y el intestino) (Bradley et al., 2001, Nature 414, 225; Tuckwell, 1999, Biochem. Soc. Trans. 27(6), 835).

El hecho de que el ataque a las células huésped dependa de sus receptores de adhesión ya fue descrito en el caso de las bacterias y levaduras (hongos por gemación, Candida) (Kerr, JR. 1999 Medical Microbiology, Manchester Royal Infirmary, UK, MOLECULAR PATHOLOGY, 52(4), 220; Dehio et al., 1998, FEBS LETT. 424(1-2), 84; Stockbauer et al., 1999 Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 96(1), 242; Santoni et al., 2001 Microbial Pathogen. 31(4), 159).

Se ha podido demostrar la interacción de la integrina \alpha_{v}\beta_{6} con TGF-\beta y la activación obtenida de este modo (Dalton, SL. 1999, J. Am. Acad. Dermatol 41, 457; Munger et al., 1999 Cell 96, 319).

Se ha publicado que TGF\beta1 latente (es decir, una de las pro-formas) se une a integrina \alpha_{v}\beta_{6} y entonces se activa mediante proteólisis. Los compuestos según la invención podrían inhibir el enlace de TGF-\beta (pro-formas, LAP-péptido, LAP-TGF\beta, TGF latente) con la integrina y, por consiguiente, los agonistas/antagonistas de la integrina \alpha_{v}\beta_{6} podrían impedir la activación de TGF-\beta1 y otros subtipos. Por tanto, sería posible una modulación de TGF\beta.

Hasta ahora se han descubierto 3 isoformas de la TGF\beta humana, a las que se atribuye un papel importante en diversos procesos de crecimiento y diferenciación, aunque especialmente en procesos inflamatorios, fibrosis, curación de heridas, crecimiento óseo, modulación de funciones inmunitarias, angiogénesis y la metástasis de tumores (Rifkin et al., 1993, 70, 177; Hata et al., 1998, Mol. Med. Today 257; Sheppard,D. 2001, Chest. 120(1 Suppl), 49S; Wickstom et al. 1998, Prostate 37, 19). Cabe suponer que los compuestos según la invención también tienen utilidad como agonistas/antagonistas de \alpha_{v}\beta_{6} en estos procesos.

Otro trabajo que destaca el papel de \alpha_{v}\beta_{6} en los procesos inmunológicos, describe la influencia de los neutrófilos tras una lesión química de los pulmones (Miller et al., 2001, J. Histochem. Cytochem. 49(1), 41).

P.C. Brooks, R.A. Clark y D.A. Cheresh en Science 264, 569 (1994) describen la dependencia entre el origen de la angiogénesis y la interacción entre integrinas vasculares y proteínas extracelulares de la matriz.

Por tanto, además de los ligandos y anticuerpos naturales conocidos hasta ahora, que tienen un elevado peso molecular y se manipulan con dificultad a nivel terapéutico y diagnóstico, el objetivo es encontrar ligandos peptídicos de bajo peso molecular, potentes, específicos o selectivos, para la integrina plaquetaria GPIIbIIIa y para las integrinas \alpha_{v}, de preferencia para \alpha_{v}\beta_{6} y \alpha_{v}\beta_{3}, que se puedan emplear en los ámbitos terapéuticos mencionados, pero también como agentes de diagnóstico o reactivos.

Se ha descubierto que los compuestos peptídicos según la invención y sus sales ejercen un efecto sobre la integrina plaquetaria GPIIbIIIa y las integrinas \alpha_{v}, de preferencias sobre las integrinas \alpha_{v}\beta_{6} y \alpha_{v}\beta_{3}, o sobre células que llevan estas integrinas, o bien, cuando están unidas a superficies, representan ligandos artificiales para el enlace de las GPIIbIIIa aisladas o de las integrinas \alpha_{v} aisladas, de preferencia las integrinas \alpha_{v}\beta_{6} y \alpha_{v}\beta_{3} o funciones celulares mediadas por GPIIbIIIa o \alpha_{v}. Sobretodo actúan como inhibidores de integrina GPIIbIIIa, integrina \alpha_{v}, de preferencia \alpha_{v}\beta_{6}- y/o \alpha_{v}\beta_{3}, inhibiendo especialmente la interacción del receptor con otros ligandos, como por ejemplo el enlace de fibronectina. Este efecto se puede describir, por ejemplo, mediante el método que Smith et al. exponen en J. Biol. Chem. 265, 12267-12271 (1990).

Además, se ha descubierto que las sustancias según la invención poseen propiedades farmacológicas muy valiosas, ya que son bien toleradas y se pueden emplear como medicamentos. Este aspecto se describe con más detalle a continuación. Estas propiedades se mantienen también cuando se reemplazan los aminoácidos que no se encuentran en posición X y/o se ciclan los compuestos lineales, como se describe en las patentes WO 01/00660 y WO 01/05810.

Además, se describe que los compuestos peptídicos según la invención se pueden emplear como agentes de diagnóstico para la detección y localización de estados patológicos en sistemas epiteliales in vivo, cuando van equipados con las correspondientes moléculas marcador de acuerdo con las técnicas más avanzadas. Para ello son apropiadas, por ejemplo, la biotina (por ejemplo, con finalidades de afinidad), o diferentes marcas de fluorescencia o complejos de radioisótopos para el diagnóstico y el procedimiento de generación de imágenes. Los compuestos según la invención pueden poseer también funciones de anclaje, para acoplarse covalentemente a superficies de piezas, como por ejemplo bioimplantes, placas de microtitulación o partículas.

La invención describe igualmente combinaciones con al menos otro principio activo y/o conjugados con otros principios activos, como principios activos citotóxicos, así como conjugados con radiomarcadores para terapia de rayos X o diagnóstico PET, aunque también proteínas de fusión con proteínas marcador, como GFP, o anticuerpos, o bien proteínas terapéuticas, como IL-2.

En el marco de la presente invención, alquilo representa un resto alquilo lineal o ramificado o cíclico con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 átomos de C, que puede estar sustituido, por ejemplo, halogenado, hidroxilado, animado, parcialmente insaturado o interrumpido por heteroátomos como N, S u O. Cuando un resto alquilo está sustituido por halógeno, presenta de preferencia 1, 2, 3, 4 o 5 átomos de halógeno, dependiendo del número de átomos de carbono del resto alquilo. Así, por ejemplo, un grupo metilo puede estar sustituido con halógeno 1, 2 o 3 veces y un grupo etilo 1, 2, 3, 4 o 5 veces. Se prefieren como alquilos, el metilo, el etilo, el trifluorometilo, el pentafluoroetilo o el propilo, especialmente el isopropilo, el butilo, el isobutilo, el sec-butilo o el ter-butilo, aunque también el n-pentilo, el neo-pentilo o el isopentilo.

La expresión "arilo" representa un resto hidrocarburo aromático monocíclico, bicíclico o tricíclico, no sustituido o monosustituido o polisustituido, como por ejemplo un anillo benceno o un sistema de anillos de antraceno, fenantreno o naftaleno. Los ejemplos de sustituyentes apropiados comprenden NO_{2}-, F, Cl-, Br-, J-, HO-, H_{2}N-, R^{3}HN-, (R^{3})_{2}N-, alquilo-, alquilo-O-, CF_{3}-O-, alquilo-CO-, arilo-, arilo-O-, arilo-CO-, arilo-CONH-, ariloSO_{2}-, ariloSO_{2}-HN-, pudiendo aparecer los sustituyentes 0 a 5 veces, siendo independientes entre sí.

La expresión "Het" representa un resto heterocíclico monocíclico, bicíclico o tricíclico, saturado, insaturado o aromático, no sustituido o monosustituido o polisustituido. Como heteroátomos pueden aparecer S, N u O de una a tres veces. Los ejemplos de sustituyentes apropiados comprenden NO_{2}-, F-, Cl-, Br-, J-, HO-, H_{2}N-, R^{3}HN-, (R^{3})_{2}N-, alquilo-, alquilo-O-, CF_{3}-O-, alquilo-CO-, arilo-, arilo-O-, arilo-CO-, arilo-CONH-, ariloSO_{2}-, ariloSO_{2}-HN-, pudiendo aparecer los sustituyentes 0 a 5 veces, siendo independientes entre sí.

La expresión "aralquilo" representa de preferencia un resto arilo como el descrito más arriba, unido a un resto alquilo como el descrito más arriba. Los ejemplos de restos aralquilo comprenden, entre otros, bencilo, fenilpropilo, fenilbutilo y similares.

La expresión \alpha_{v}-integrina comprende en la presente invención las integrinas \alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{6} y \alpha_{v}\beta_{8}, aunque de preferencia las integrinas \alpha_{v}\beta_{6} y \alpha_{v}\beta_{3}.

Son objeto de la invención especialmente los compuesto peptídicos seleccionados del grupo de las fórmulas I a) - I n)

I a): Ac-Arg-Dap(Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I b): Ac-Arg-Dap(F5-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I c): Ac-Arg-Dap(2-NO_{2}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I d): Ac-Arg- Dap(4-NO_{2}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I e): Ac-Arg- Dap(2,4-NO_{2}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I f): Ac-Arg-Dap(6-OMe-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I g): Ac-Arg-Dap(2-CF_{3}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I h): Ac-Arg-Dap(3-CF_{3}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I i): Ac-Arg-Dap(Me_{5}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I j): Ac-Arg-Dap(4-tBu-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I k): Ac-Arg-Dap(BSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I l): Ac-Arg-Dap(1-Nap)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I m): Ac-Arg-Dap(2-Nap)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

I n): Ac-Arg-Dap(4-Ph-Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

así como sus profármacos, derivados, solvatos y estereoisómeros útiles farmacéuticamente, así como sus sales, incluyendo sus mezclas en cualquier proporción; las abreviaturas usadas entre paréntesis en las fórmulas I a) a I n) representan los restos siguientes:

Psa: resto fenilsulfonilo

F5-PSA: resto pentafluorofenilsulfonilo

2-NO_{2}-PSA: resto 2-nitro-fenilsulfonilo

4-NO_{2}-PSA: resto 4-nitro-fenilsulfonilo

2,4-NO_{2}-PSA: resto 2,4-dinitro-fenilsulfonilo

6-OMe-PSA: resto 6-metoxi-fenilsulfonilo

2-CF_{3}-PSA: resto 2-trifluorometilo-fenilsulfonilo

3-CF_{3}-PSA: resto 3-trifluorometilo-fenilsulfonilo

Me_{5}-PSA: resto pentametilfenilsulfonilo

4-tBu-PSA: resto 4-ter-butil-fenilsulfonilo

Bsa: resto bencilsulfonilo

1-Nap: resto 1-naftil-sulfonilo

2-Nap: resto 2-naftil-sulfonilo

4-Ph-Psa: resto 4-fenil-fenilsulfonilo

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Las abreviaturas de los restos aminoácido indicadas en el presente documento representan los restos de los aminoácidos siguientes:

Asp o D: ácido asparagínico

Arg o R: arginina

Dap: ácido 2,3-diaminopropiónico

Leu o L: leucina

Ser o S: serina

Thr o T: treonina

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Además, en el presente documento representan:

Ac: acetilo

BOC: ter-butoxicarbonilo

BSA: albúmina sérica bovina

CBZ o Z: benciloxicarbonilo

DCCI: dicilohexilcarbodiimida

DCM: diclorometano

DIEA: diisopropilamina

DMA: N,N-dimetilacetamida

DMF: dimetilformamida

EDCI: N-etil-N,N'-(dimetilaminopropil)-carbodiimida

Et: etilo

FCA: ácido fluoresceincarboxílico

FITC: fluoresceinisotiocianato

Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo

Fmoc-Dap(ivDde): ácido N-\alpha-Fmoc-N-\gamma-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutil-diaminopropiónico

FTH: fluoresceintiourea

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol

Me: metilo

MBHA: 4-metil-benzhidrilamina

Mtr: 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenil-sulfonilo

NMP: N-metilpirrolidona

HONSu: N-hidroxisuccinimida

OBut: éster ter-butílico

vOct: octanoilo

OMe: éster metílico

OEt: éster etílico

Pbf: 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-sulfonilo

Pmc: 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo

POA: fenoxiacetilo

Sal: saliciloilo

TBS++: solución salina tris-tamponada con cationes divalentes

TBSA: TBS+BSA

TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3- tetrametiluronio

TFA: ácido trifluoroacético

TIS: triisopropilamina

Trt: tritilo (trifenilmetilo).

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Como los aminoácidos mencionados anteriormente pueden aparecer en varias formas enantioméricas, se incluyen todas mencionadas en el presente documento, así como sus mezclas (por ejemplo, las formas DL). Además, los aminoácidos pueden estar provistos de los correspondientes grupos protectores conocidos.

En los compuestos según la invención se incluyen también los llamados derivados profármacos, es decir, compuestos modificados con grupos alquilo o acilo, azúcares u oligopéptidos, que en el organismo se transforman rápidamente en los compuestos eficaces según la invención. Se mencionan también derivados poliméricos biodegradables de los compuestos según la invención, como por ejemplo, los descritos en Int. J. Farm. 115, 61-67 (1995).

Los aminoácidos y restos de aminoácidos mencionados, como por ejemplo, las funciones NH o la función amida C terminal, también pueden estar derivatizados, seleccionándose los derivados N-metilo-, N-etilo-, N-propilo-, N-bencilo- o C_{\alpha}-metilo. Además, se describen derivados de Asp, especialmente aquellos con ésteres de metilo, etilo, propilo, butilo, ter-butilo, neopentilo o bencilo de los grupos carboxilo de las cadenas laterales, también derivados de Arg, que puede estar sustituida en el grupo -NH-C(=NH)-NH_{2} por un resto acetilo, benzoilo, metoxicarbonilo o etoxicarbonilo.

En los compuestos según la invención, además de los compuestos de fórmula I que llevan un grupo acetilo N terminal, se incluyen aquellos compuestos en los que Ac está sustituido por otra función acilo, seleccionada entre propionilo, butirilo y benzoilo.

Además, con los compuestos según la invención se describen también derivados que constan de los propios compuestos según la invención, derivatizados con moléculas marcador conocidas, las cuáles permiten detectar fácilmente los péptidos. Algunos ejemplos de tales derivados son los péptidos con marcadores radioactivos, biotinilados, o con marcadores de fluorescencia.

Un resto colorante fluorescente es representado de preferencia por 7-acetoxicumarin-3-ilo, fluorescein-5-(y/o
6-)ilo, 2',7'-diclorofluorescein-5-(y 6-)ilo, dihidrotetrametilrosamin-4-ilo, tetrametilrodamin-5-(y/o 6-)ilo, 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-etilo o 4,4-difluoro-5,7-difenil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-etilo.

Los restos colorantes fluorescentes funcionalizados apropiados que se pueden emplear como reactivos para la preparación de los compuestos de fórmula I según la invención, se describen, por ejemplo, en "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5th Edition, 1992-1994, por R.P. Haughland, Molecular Probes, Inc.".

En general, los péptidos según la invención son lineales, aunque también pueden estar ciclados. La invención no sólo comprende los péptidos mencionados, sino también mezclas y preparaciones que además de estos compuestos según la invención contienen también otros principios activos o adyuvantes farmacológicos que pueden influir del modo deseado en el efecto farmacológico primario de los péptidos según la invención.

Los compuestos según la invención y también los productos de partida para su preparación se fabrican según métodos conocidos y empleados habitualmente, como los que se describen en la bibliografía (por ejemplo, en las obras de referencia como Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart), y en condiciones de reacción conocidas y apropiadas para las reacciones mencionadas. También se puede hacer uso de las variantes conocidas.

Los péptidos según la invención se pueden preparar de preferencia mediante síntesis en fase sólida y posterior separación y purificación, como describe, por ejemplo, Jonczyk y Meienhofer (Peptides, Proc. 8th Am. Pept. Symp., Eds. V. Hruby y D.H.Rich, Pierce Comp. III, pág. 73-77, 1983, o Angew. Chem. 104, 1992, 375) o según Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 94, 1972, 3102).

Los péptidos según la invención se pueden preparar en fase sólida (manualmente o en un equipo de síntesis automática) en una estrategia Fmoc con grupos protectores laterales lábiles frente a ácido y mediante purificación con RP-HPLC. La homogeneidad del pico se puede medir por RP-HPLC y la identidad de la sustancia mediante FAB-MS.

En general, los péptidos se pueden preparar según los métodos habituales de síntesis de péptidos y aminoácidos, como los que se conocen, por ejemplo, a partir de Novabiochem - 1999 Catalog & Peptide Synthesis Handbook de Calbiochem-Novabiochem GmbH, D-65796 Bad Soden, a partir de numerosas obras de consulta y solicitudes de patente publicadas.

Se pueden emplear también acoplamientos paso a paso y condensaciones de fragmentos. También pueden ser útiles diferentes grupos protectores laterales, N-terminales y C-terminales, que se seleccionan de preferencia por poderse escindir ortogonalmente. Los pasos de acoplamiento se pueden realizar con diferentes reactivos de condensación, como carbodiimidas, carbodiimidazol, de tipo uronio como TBTU, mediante métodos anhidro mezclados, así como métodos de halogenuro de ácido o éster activo.

Una ciclación de una molécula precursora lineal con grupos protectores laterales se realiza igualmente con dichas reacciones de condensación, como se describe, por ejemplo, en la patente DE 43 10 643 o en Houben-Weyl, l.c., Vol 15/II, páginas 1 a 806 (1974).

En la síntesis de péptidos de fase sólida son útiles diferentes resinas y funciones de anclaje. Las resinas, por ejemplo, se pueden basar en poliestireno o poliacrilamida, las funciones de anclaje, como Wang o-clorotritilo, son útiles para la preparación de ácidos peptídicos, anclajes aminoxantenoxi, por ejemplo para la preparación de peptidamidas (véase, Principles of Peptide Synthesis, ed. M. Bodansky, Springer Verlag Berlín 1984; Houben Weyl Methoden der organischen Chemie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart; Calbiochem/Novabiochem Catalogue and Synthesis Handbook 1999, Synthesis Notes; Peptide Synthesis Protocols eds. M.W. Pennington y B.M. Dunn en Methods in Molecular Biology Vol 35, Humana Press Totowa N.J. 1994).

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Los péptidos/proteínas biotinilados o con marcadores de fluorescencia también se pueden fabricar según métodos estándar (por ejemplo, E.A. Bayer y M. Wilchek en Methods of Biochemical Analysis Vol 26 The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology; y Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6^{th} Edition, 1996, de R.P. Haugland, Molecular Probes, Inc.; o también la patente WO 97/14716).

Naturalmente, los péptidos según la invención también pueden liberar sus derivados funcionales mediante solvólisis, especialmente hidrólisis o mediante hidrogenólisis. Los productos de partida preferibles para la solvólisis o la hidrogenólisis son aquellos que, en lugar de uno o varios grupos hidroxilo y/o amino libres, contienen los correspondientes grupos amino y/o hidroxilo protegidos, de preferencia aquellos que en lugar de un átomo de H unido con un átomo de N, llevan un grupo amino protector o en lugar del átomo de H de un grupo hidroxilo llevan un grupo hidroxilo protector. Otro tanto sucede con los ácidos carboxílicos que se pueden proteger mediante sustitución de su función hidroxilo -CO-OH mediante un grupo protector, por ejemplo, protegidos como éster.

La expresión "grupo amino protector" es de conocimiento general y se refiere a los grupos apropiados para proteger (bloquear) frente a transformaciones químicas, pero que se pueden eliminar fácilmente una vez que se ha llevado a cabo la reacción química deseada en otros lugares de la molécula. La expresión "grupo hidroxilo protector" también es de conocimiento general y se refiere a grupos que protegen un grupo hidroxilo contra transformaciones químicas, pero que se pueden eliminar fácilmente una vez se ha llevado a cabo la reacción química deseada en otros lugares de la molécula. La puesta en libertad de los compuestos a partir de sus derivados funcionales da buen resultado -según los grupos protectores utilizados- por ejemplo, con ácidos fuertes, recomendándose TFA, HBr o ácido perclórico, pero también con otros ácidos inorgánicos fuertes, como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, ácidos carboxílicos orgánicos fuertes, como ácido tricloroacético o ácidos sulfónicos como ácido bencenosulfónico o p-toluenosulfónico. Los grupos protectores que se pueden eliminar por hidrogenolísis (por ejemplo, CBZ o bencilo) se pueden separar, por ejemplo, mediante el tratamiento con hidrógeno en presencia de un catalizador (por ejemplo, un catalizador de metal noble, como paladio, de forma apropiada sobre un soporte como carbón).

Los grupos protectores típicos para grupos amino N-terminales y laterales son Z, BOC, Fmoc, para C-terminales o cadenas laterales Asp son O-alquilo primario (por ejemplo, OMe o OEt), O-alquilo terciario (por ejemplo, OBut) o OBencilo. Para la función guanidino de Arg, son apropiados, por ejemplo, Z, BOC, NO_{2}, Mtr, Pmc o Pbf. Las funciones alcohólicas se pueden proteger mediante restos ter-alquilo, restos bencilo o grupos tritilo.

Los grupos BOC, OBut y Mtr se pueden separar, por ejemplo, de preferencia con TFA en diclorometano o con HCl 3 a 5N en dioxano a una temperatura entre 15º y 30º, los grupos FMOC con una disolución del 5% al 50% aproximadamente de dimetilamina, dietilamina o piperidina en DMF a una temperatura entre 15º y 30º.

Los grupos protectores que se pueden eliminar por hidrogenólisis (por ejemplo, CBZ o bencilo) se pueden separar, por ejemplo, mediante el tratamiento con hidrógeno en presencia de un catalizador (por ejemplo, un catalizador de metal noble, como paladio, de forma apropiada sobre un soporte como carbón). Son apropiados como disolventes los arriba indicados, especialmente, por ejemplo, alcoholes como metanol o etanol, éteres como THF o dioxano o amidas como DMF, DMA o NMP. La hidrogenólisis se realiza por regla general a temperaturas entre aproximadamente 0 y 100º y presiones entre 1 y 200 bar aproximadamente, de preferencia a una temperatura entre 20º y 30º y de 1 a 10 bar. Una hidrogenólisis del grupo CBZ se realiza con éxito, por ejemplo, en Pd/C al 5 a 10% en metanol o con formiato amónico (en lugar de hidrógeno) en Pd/C en metanol/DMF a 20-30º.

Como ya se ha mencionado, están comprendidas también las sales de los compuestos según la fórmula I y las sales de los profármacos empleados, derivados, solvatos y estereoisómeros de los compuestos según la fórmula I. Estas se pueden preparar según métodos estándar. De este modo, una base de un compuesto según la invención en presencia de un ácido se puede transformar en la correspondiente sal de adición de ácido, por ejemplo mediante reacción de cantidades equivalentes de la base y del ácido en un disolvente inerte como etanol y a continuación evaporación al vacío. Para esta reacción se tienen en consideración especialmente ácidos que dan lugar a sales fisiológicamente seguras. De este modo se pueden usar ácidos inorgánicos, por ejemplo ácido sulfúrico, ácido nítrico, hidrácidos halogenados como ácido clorhídrico o ácido bromhídrico, ácidos fosfóricos como ácido ortofosfórico, ácido sulfámico, otros ácidos orgánicos, especialmente ácidos carboxílicos, sulfónicos o sulfúricos alifáticos, alicíclicos, aralifáticos, aromáticos o heterocíclicos, mono o polibásicos, por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido pivalínico, ácido dietilacético, ácido malónico, ácido succínico, ácido pimélico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido nicotínico, ácido isonicotínico, ácido metano- o etanosulfónico, ácido etanodisulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácidos naftalen-mono- y naftalen-disulfónico, ácido laurilsulfúrico. Las sales con ácidos no seguros fisiológicamente, como por ejemplo, picratos, se pueden emplear para el aislamiento y/o purificación de los compuestos según la invención. Por otro lado, un ácido de los compuestos según la invención se puede convertir, mediante reacción con una base, en una de sus sales de amonio o metálicas fisiológicamente seguras. Como sales pueden utilizarse en particular las sales de sodio, potasio, magnesio, calcio y amonio, también las sales de amonio sustituidas, por ejemplo las sales de dimetilamonio, dietilamonio o diisopropilamonio, sales de monoetanolamonio, dietanolamonio o diisopropilamonio, sales de ciclohexilamonio, diciclohexilamonio, dibenciletilendiamonio, además, por ejemplo, sales con arginina o lisina.

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Como ya se ha indicado, los compuestos peptídicos según la invención pueden emplearse como principios activos farmacéuticos en medicina humana o veterinaria, para prevención y/o terapia. Destacan especialmente las enfermedades del sistema circulatorio, embolias pulmonares, trombosis, especialmente trombosis venosas profundas, infartos cardiacos, arteriosclerosis, aneurisma disecante, ataques isquémicos pasajeros, apoplejías, anginas de pecho, especialmente anginas de pecho inestables, proliferaciones patológicas de tejido conjuntivo en órganos o fibrosis, especialmente fibrosis pulmonar, pero también mucoviscidosis, fibrosis dérmica, fibrosis hepática, cirrosis hepática, fibrosis de salida de la vejiga, fibrosis renal, fibrosis cardiaca, fibrosis endocárdica infantil, fibrosis pancreática, trastornos de queratinización de la piel, leucoplasias, liquen plano y carcinomas del epitelio escamoso, enfermedades tumorales, como desarrollo de tumores, angiogénesis de tumores o metástasis de tumores, también tumores sólidos y de la sangre o del sistema inmune, por ejemplo, tumores de piel, carcinoma de epitelio escamoso, tumores de los vasos sanguíneos, del tracto gastrointestinal, de los pulmones, de mama, de hígado, de riñón, de bazo, de glándulas pancreáticas, de cerebro, de testículos, de ovarios, de útero, de vagina, de la musculatura, de los huesos, y los de la zona de cabeza y cuello, enfermedades osteolíticas, como osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget, hipercalcemia maligna, inflamaciones, enfermedades oftalmológicas, como por ejemplo retinopatía diabética, degeneración macular, miopía, trasplante de córnea, glaucoma rubeótico, histoplasmosis ocular, artritis reumática, osteoartritis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, ateroesclerosis, soriasis, restenosis, especialmente tras angioplastia, esclerosis múltiple, para fallo renal agudo y para la curación de heridas, para dar soporte a los procesos de curación.

Asimismo son objeto de la invención los compuestos peptídicos de arriba y de abajo, así como las fórmulas definidas en las reivindicaciones, incluyendo sus sales fisiológicamente seguras como medicamentos, agentes de diagnóstico o reactivos.

Son objeto de la invención, en particular, los medicamentos correspondientes, como inhibidores para combatir las enfermedades mencionadas anteriormente, en los que GPIIbIIIa, \alpha_{v}-integrinas, de preferencia \alpha_{v}\beta_{6}- y/o \alpha_{v}\beta_{3}-integrina juegan un papel importante, especialmente también en enfermedades del sistema circulatorio, proliferaciones patológicas de tejido conjuntivo en órganos y fibrosis, trastornos de queratinización, enfermedades tumorales, enfermedades osteolíticas, enfermedades angiogénicas patológicas, infecciones, así como para influir sobre los procesos de curación de heridas.

También son objeto de la invención las preparaciones farmacéuticas correspondientes que contienen al menos un compuesto de fórmula I o un profármaco, derivado, solvato o estereoisómero fisiológicamente seguros o una de sus sales, así como, en su caso, excipientes y/o coadyuvantes.

Igualmente es objeto de la invención un kit compuesto de envases separados de

(a): una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I y/o sus derivados, solvatos y estereoisómeros útiles farmacéuticamente y sus sales, incluidas sus mezclas en cualquier proporción, y

(b): una cantidad eficaz de otro principio activo para medicamentos.

El kit contiene recipientes apropiados, como cajas o cartones, botellas, bolsas o ampollas individuales. El kit también puede contener, por ejemplo, ampollas separadas en las que se encuentra disuelta o en forma liofilizada una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I y/o sus derivados, solvatos y estereoisómeros útiles farmacéuticamente y sus sales, incluidas sus mezclas en cualquier relación, y una cantidad eficaz de otro principio activo para medicamentos.

Además, es objeto de la invención el uso de compuestos de fórmula I, así como los profármacos, derivados, solvatos y estereoisómeros útiles farmacéuticamente de los compuestos de fórmula I, así como sus sales, incluyendo sus mezclas en cualquier relación, para la preparación de un medicamento para combatir las enfermedades antes mencionadas, en las que GPIIbIIIa, \alpha_{v}-integrinas, de preferencia \alpha_{v}\beta_{6}- y/o \alpha_{v}\beta_{3}-integrina, desempeñan un papel importante, especialmente en enfermedades del sistema circulatorio, proliferaciones patológicas de tejido conjuntivo en órganos y fibrosis, trastornos de queratinización, enfermedades tumorales, enfermedades osteolíticas, enfermedades angiogénicas patológicas, infecciones, así como para influir sobre procesos de curación de heridas.

Los medicamentos según la invención o las preparaciones farmacéuticas que los contienen se pueden usar en medicina humana o veterinaria. Se pueden administrar de forma local o sistémica, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, transdérmica, nasal, bucal o iontoforética, incluyendo formulaciones en suspensiones, emulsiones o disoluciones, liposomas, pomadas, pastas, polímeros biodegradables o como nanopartículas, comprimidos, cápsulas o píldoras, granulados o polvo, como aerosol para inhalar, gotas intranasales o aerosoles. También pueden combinarse con otras técnicas, como cirugía, irradiación, diagnóstico, radioterapia, terapia fotodinámica y terapia génica, así como con otros medicamentos. Dichos medicamentos pueden proceder, por ejemplo, de los ámbitos del sistema circulatorio cardiaco, el sistema nervioso central o la oncología. Pueden ser agentes antitumorales, como inhibidores de la angiogénesis o citostáticos, quimioterapéuticos de los grupos de agentes alquilantes, antibióticos, antimetabolitos, agentes biológicos e inmunomoduladores, hormonas y sus antagonistas, derivados de gas mostaza, alcaloides y otros, pudiendo ser estas sustancias de bajo o de alto peso molecular. Pueden ser lípidos, hidratos de carbono y proteínas. Entre ellos se encuentran, entre otros, citoquinas, toxinas, proteínas de fusión, anticuerpos monoclonales y vacunas.

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Pueden utilizarse como excipientes de las preparaciones farmacéuticas según la invención, sustancias orgánicas o inorgánicas que sean apropiadas para la aplicación enteral (por ejemplo, oral), parenteral, tópica o para una aplicación en forma de un aerosol de inhalación y que no reaccionan con los nuevos compuestos, por ejemplo, agua, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, alquilenglicoles, polietilenglicoles, triacetato de glicerina, gelatina, carbohidratos, como lactosa o almidón, estearato magnésico, talco, vaselina. Para la aplicación oral se emplean especialmente comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, polvos, granulados, jarabes, zumos o gotas, para la aplicación rectal supositorios, para la aplicación parenteral disoluciones, de preferencia disoluciones oleosas o acuosas, otras suspensiones, emulsiones o implantes, para la aplicación tópica pomadas, cremas o polvos. Los nuevos compuestos también se pueden liofilizar y los liofilizados obtenidos se pueden emplear, por ejemplo, para la preparación de preparados inyectables. Las preparaciones indicadas pueden ser estériles y/o contener coadyuvantes como agentes lubricantes, conservantes, estabilizantes y/o reticulantes, emulsionantes, sales para influir sobre la presión osmótica, sustancias tampón, colorantes, edulcorantes y/o uno o varios principios activos diferentes, por ejemplo, una o varias vitaminas.

Para la aplicación como aerosol inhalador se pueden emplear aerosoles que contengan el principio activo disuelto o suspendido en un gas propelente o una mezcla de gases propelentes (por ejemplo, CO_{2} o hidrocarburos clorofluorados). En la práctica, el principio activo se emplea en forma micronizada, pudiéndose añadir uno o varios disolventes adicionales fisiológicamente compatibles, por ejemplo, etanol. Las disoluciones de inhalación se pueden administrar con ayuda de los inhaladores habituales.

Por regla general, las sustancias según la invención se pueden administrar, de forma análoga a otras sustancias conocidas, en péptidos disponibles comercialmente (por ejemplo, descritos en el documento US-A-4 472 305), administrándose por ejemplo en dosificaciones entre aproximadamente 0,05 y 500 mg, especialmente entre 0,5 y 100 mg por unidad de dosificación. La dosis diaria se sitúa de preferencia entre 0,01 y 20 mg/kg de peso corporal. Sin embargo, la dosis especial para cada paciente depende de factores muy diversos, por ejemplo, de la eficacia de los compuestos especiales empleados, de la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la alimentación, el punto y la vía de administración, la velocidad de eliminación, la combinación de medicamentos y la gravedad de la enfermedad para la cuál se aplica la terapia. Se prefiere la aplicación parenteral.

Además, los nuevos compuestos de fórmula I se pueden emplear en biología analítica y biología molecular.

Los compuestos de fórmula I que contienen un resto colorante fluorescente se pueden emplear como marcadores diagnósticos en la técnica FACS (del inglés Fluorescence Activated Cell Sorter, separación de células activadas por fluorescencia) y microscopia de fluorescencia in vitro e in vivo.

El empleo de compuestos marcados en microscopia de fluorescencia es descrito, por ejemplo, por Y.-L. Wang y D. L. Taylor en "Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part A + B, Academic Press, Inc. 1989". Otro ejemplo para la aplicación in vivo aparece en M. Dellian et al. Am. J. Pathol. 149, 59-71 (1996).

Los compuestos según la invención se pueden usar también como ligandos de integrina para la preparación de columnas para cromatografía de afinidad para la purificación preparativa de integrinas. El complejo de un material de soporte derivatizado con avidina, por ejemplo, sefarosa y los nuevos compuestos, se forma según métodos conocidos (por ejemplo, E.A. Bayer y M. Wilchek en Methods of Biochemical Analysis Vol 26 The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology). Pueden utilizarse como materiales de soporte poliméricos las fases sólidas poliméricas conocidas en la química de péptidos, de preferencia con propiedades hidrófilas, por ejemplo poliazúcares ramificados transversalmente, como celulosa, sefarosa o Sefadex^{R}, acrilamida, polímeros de base polietilenglicol o polímeros Tentakel^{R}.

Ejemplos

En el presente documento, todas las temperaturas se expresan en ºC.

Los análisis por HPLC (tiempo de retención tr) se realizaron en los sistemas siguientes:

Columna 5 \mum LichroSfer 60 RP-Select B (250-4), con un gradiente de 50 minutos de 0 a 80% de acetonitrilo en agua/ácido trifluoroacético 0,1%, a flujo 1 ml/min y detección a 215 nm.

Espectrometría de masas (MS):: EI (ionización por impacto electrónico) M^{+}

\quad: FAB (bombardeo por átomos rápidos) (M+H)^{+}

Ejemplo 1 Síntesis de Ac-Arg-Dap-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2}

a): Se empapa 1 g de resina amino-xantenilo (Novabiochem) con Fmoc-Arg(Pbf)/HOBt/DIC en 10 ml DMF y se agita durante 2 horas a TA. Para el procesado se filtra la fase sólida, se lava 3 veces con diclorometano, DMF, diclorometano y metanol y se seca al vacío.

b): La fase sólida se suspende con DMF y a continuación se añade una disolución al 50% de piperidina en DMF y se agita durante 15 min a TA. A continuación se filtra de la fase sólida y se repite dos veces el mismo proceso. Después la fase sólida se lava 3 veces con DMF, diclorometano y metanol y se seca al vacío a TA.

c): La resina Arg(Pbf)-NH-xantenilo se obtiene después de los procedimientos a y b para los derivados de aminoácido 1. Fmoc-Leu, Fmoc-Ser(But), Fmoc-Asp(OBut), Fmoc-Leu, Fmoc-Asp(OBut), Fmoc-Dap(Boc) y 7. Fmoc-Arg(Pbf). Así se obtiene la resina Arg(Pbf)-Dap(Boc)-Asp(OBut)-Leu-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pbf)-NH-xantenilo.

d): La resina peptídica se empapa en 10 ml DMF/piridina/anhídrido acético (15:3:2 vol) y se filtra a TA 15 min después. Para el procesado se lava 3 veces con DMF, diclorometano y metanol y se seca al vacío durante la noche. De este modo se obtiene la resina Ac-Arg(Pbf)-Dap(Boc)-Asp(OBut)-Leu-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pbf)-NH-xantenilo.

e): A la resina peptídica con las cadenas laterales protegidas, acetilada en posición N-terminal se le añaden 20 ml de una solución al 98% de TFA en agua y se agita durante 3 horas a TA. La fase sólida se elimina por filtración y el filtrado se evapora al vacío a 37ºC hasta sequedad y tras recogerlo en agua se liofiliza.

\quad: Se obtiene el producto deseado Ac-Arg-Dap-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2} en forma de sólido esponjoso.

f): Se consigue una purificación del producto crudo de 1e) mediante RP-HPLC en Lichroprep RP18 en agua/ TFA 0,1% con un gradiente de 1-80% de 2-propanol. El producto deseado tiene una gran pureza y la masa esperada de (M+H)+ = 1001 g/mol.

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Ejemplo 2 Síntesis de Ac-Arg-Dap(Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2}

Se separó Fmoc de la resina Asp(OBut)-Leu-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pbf)-NH-xantenilo y se acopló Fmoc-Dap(ivDde) (de Novabiochem) en acoplamiento doble (2/1 equ.; 20/40 min). Después del capping (sellado) y el lavado, el grupo protector Fmoc se separó mediante morfolina/DMF (1:1) (100 ml en 25 min) y se acopló Fmoc-Arg(Pbf) de la forma ya descrita.

Fmoc se separó de la forma normal, se selló (acetilado) y se lavó. El ensayo Kaiser fue negativo. El grupo protector ivDde se separó durante 10 min (10 ml/min) con hidracina al 2% en DMF: el ensayo Kaiser fue positivo. Se lavó y se secó; el rendimiento fue 2,19 g.

La resina Ac-Arg(Pbf)-Dap-Asp(OBut)-Leu-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pbf)-NH-xantenilo con los grupos laterales parcialmente protegidos se dividió en 16 alícuotas de 130 mg, que se empaparon brevemente en DCM.

El correspondiente cloruro de sulfonilo se disolvió en DCM en matraces Eppendorf y se añadieron 5 equ. DIEA. Las disoluciones se añadieron a la resina. En vista de que, transcurrida 1 hora, el ensayo de Kaiser aún era ligeramente positivo, se filtró, se lavó y se acopló de nuevo con la misma técnica. Se lavó a fondo con DMF, DCM e isopropanol y se secó.

Mediante una separación de 2 horas con 6 ml TFA/agua/TIS (94/3/3), filtración y purificación por RP-HPLC se obtienen los derivados peptídicos libres; por ejemplo, usando cloruro de fenilsulfonilo, se obtiene el producto Ac-Arg-Dap(Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2}.

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Ejemplo 3

De forma análoga al ejemplo 2 se prepararon, entre otros, los siguientes productos, pudiéndose obtener el aminoácido X en posición 2 del péptido Ac-Arg-X-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2 empleando los correspondientes derivados Fmoc-aminoácido en lugar de Fmoc-Dap(ivDde), y los correspondientes reactivos de acilación en lugar de cloruro de fenilsulfonilo.

También se pueden representar mediante el empleo de los derivados de aminoácido prefabricados, como Fmoc-Dap(SO_{2}F)-OH (y los análogos) en síntesis de péptidos.

2

Nomenclatura para aminoácidos según Eur.J.Biochem. 138, 9-37 (1984)

^{D}:: Sistema HPLC: Disolvente: A = TFA 0,1%; B = 80% acetonitrilo/ TFA 0,1%; Gradiente: 1% B a 99% B en 50 min; Columna: Merck, LiChrosphere 60 250-4, RP-select B: 5 \mum; flujo: 1 ml/min; detección: 215 nm.

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Ejemplo 4 Influencia de las sustancias solubles sobre el enlace de fibronectina biotinilada en \alpha_{v}\beta_{6}

Los péptidos preparados según la invención se unieron en disolución junto con fibronectina de eficacia competitiva sobre el receptor \alpha_{v}\beta_{6} inmovilizado y se determinó el valor Q como medida para la selectividad del enlace del péptido a ensayar sobre \alpha_{v}\beta_{6}. Así, el valor Q se calcula a partir de los cocientes del valor IC_{50} del péptido de ensayo y un estándar. Como estándar se empleó Ac-RTDLDSLR-NH_{2} lineal (patente WO01/00660; Pytela et al., 1986, Science 231, 1559). El ensayo de enlace se realizó de la siguiente forma:

La inmovilización de \alpha_{v}\beta_{6} en placas de microtitulación se realizó mediante dilución de la disolución de proteínas en TBS++ y a continuación incubación durante toda la noche a 4ºC (100 \mul/pocillo). Los sitios de unión no específicos se bloquearon mediante incubación (2 h; 37 ºC) con BSA 3% (p/v) en TBS++ (200 \mul/pocillo). El exceso de BSA se eliminó mediante lavado triple con TBSA++. Los péptidos se diluyeron en serie (1:10) en TBSA++ y se incubaron junto con fibronectina biotinilada (2 \mug/ml) con la integrina inmovilizada (50 \mul péptido + 50 \mul ligando por pocillo; 2 h; 37ºC).

La fibronectina no enlazada y los péptidos se eliminaron mediante un lavado triple con TBSA++. La detección de la fibronectina enlazada se realizó mediante incubación (1 h; 37ºC) con un anticuerpo anti-biotina acoplado a fosfatasa alcalina (1:20000 en TBSA++; 100 \mul/pocillo). Tras un triple lavado con TBSA++ se realizó la detección colorimétrica mediante incubación (10-15 min; 25ºC; en oscuridad) con solución sustrato (5 mg nitrofenilfosfato, 1 ml etanolamina, 4 ml H_{2}O (100 \mul/pocillo)). La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de NaOH 0,4 M (100 \mul/pocillo). La intensidad del color se determinó a 405 nm en un medidor ELISA y se comparó con un valor cero. Como valor cero se utilizaron pocillos no recubiertos con receptor.

Como estándar se empleó en cada ensayo Ac-RTDLDSLR-NH2, con un valor IC_{50}< 100 nM.

Los valores IC_{50} para los péptidos ensayados se leyeron de un gráfico y se determinaron junto con el valor IC_{50} del estándar del valor Q del péptido.

Estos ensayos pusieron de manifiesto que un gran número de compuestos sintetizados poseen afinidad submicromolar hasta nanomolar frente a la integrina \alpha_{v}\beta_{6} (véase Tab. 1).

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TABLA 1

4

Valor Q = IC_{50} péptido de ensayo/IC_{50} estándar

Se determinaron los valores Q a partir de repeticiones del ensayo

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Los siguientes ejemplos se refieren a preparaciones farmacéuticas:

Ejemplo A

Viales inyectables

Se ajusta una solución de 100 g del compuesto de fórmula I según la invención y 5 g de hidrogenofosfato disódico en 3 l de agua desionizada con ácido clorhídrico 2 N a pH 6,5, se filtra de forma estéril, se introduce en viales inyectables, se liofiliza bajo condiciones estériles y se cierra de forma estéril. Cada vial inyectable contiene 5 mg de principio activo.

Ejemplo B

Supositorios

Se funde una mezcla de 20 g del compuesto de fórmula I según la invención con 100 g de lecitina de soja y 1400 g de manteca de cacao, se introduce en moldes y se deja enfriar. Cada supositorio contiene 20 mg de principio activo.

Ejemplo C

Disolución

Se prepara una solución de 1 g del compuesto de fórmula I según la invención, 9,38 g de NaH_{2}PO_{4} \cdot 2 H_{2}O, 28,48 g Na_{2}HPO_{4} \cdot 12 H_{2}O y 0,1 g cloruro de benzalconio en 940 ml de agua desionizada. Se ajusta el pH a 6,8, se enrasa a 1 l y se esteriliza por radiación. Esta disolución se puede emplear en forma de gotas oculares.

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Ejemplo D

Pomada

Se mezclan 500 mg del compuesto de fórmula I según la invención con 99,5 g de vaselina en condiciones asépticas.

Ejemplo E

Comprimidos

Una mezcla de 1 kg del compuesto de fórmula I según la invención formada por 4 kg de lactosa, 1,2 kg de almidón de patata, 0,2 kg de talco y 0,1 kg de estearato magnésico se comprime de la forma habitual para hacer comprimidos, de manera que cada comprimido contenga 10 mg de principio activo.

Ejemplo F

Grageas

De forma análoga al Ejemplo E, se prensan comprimidos que a continuación se recubren de la forma habitual con un recubrimiento de sacarosa, almidón de patata, talco, tragacanto y colorante.

Ejemplo G

Cápsulas

Se introducen 2 kg del compuesto de fórmula I según la invención de la forma habitual en una cápsula de gelatina dura, de manera que cada cápsula contenga 20 mg de principio activo.

Ejemplo H

Ampollas

Se filtra una solución de 1 kg del compuesto de fórmula I según la invención en 60 l de agua desionizada de forma estéril, se introduce en ampollas, se liofiliza bajo condiciones estériles y se cierra de forma estéril. Cada ampolla contiene 10 mg de principio activo.

Ejemplo I

Aerosol de inhalación

Se disuelven 14 g del compuesto de fórmula I según la invención en 10 l de solución isotónica de NaCl y la solución se introduce en recipientes de pulverización comerciales con mecanismo de bombeo. La disolución se puede pulverizar en la boca o la nariz. Cada pulverización (aprox. 0,1 ml) corresponde a una dosis de aprox. 0,14 mg.

<110> Merck Patent GmbH

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<120> Sulfonamida peptídica

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<130>

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<140> PCT/EP2004/000211

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<141> 2004-01-14

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<160> 1

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Todos los péptidos están acetilados (Ac-) en el extremo N y amidados (-NH2) en el extremo C (o carboxi-terminal)

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (2)..(2)

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<223> Xaa en posición 2 es Dap(Psa) pero también se consideran Dap(F5-Psa), Dap(2-NO2-Psa),Dap(4-NO2-Psa), Dap(2,4-NO2-Psa), Dap(6-OMe-Psa), Dap(2-CF3-Psa), Dap(3-CF3-Psa), Dap(Me5-Psa), Dap(4-tBu-Psa), Dap(Bsa), Dap(iPrs), Dap(1-Nap), Dap(2-Nap) y Dap(4-Ph-Psa).

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<400> 1

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\sa{Arg Xaa Asp Leu Asp Ser Leu Arg}

Claims

1. Compuestos peptídicos de fórmula I

IR^{1}-Arg-X-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-R^{2}

en la que

R^{1}: representa H, acetilo o acilo y

R^{2}: representa -OH, OR^{3} NH_{2},NHR^{3}, N(R^{3})_{2}

R^{3}: representa alquilo, aralquilo, arilo, Het y

X: representa un aminoácido de fórmula II

5

en la que

A: representa representa (CH_{2})_{n}

R^{4}: representa aralquilo o arilo y

n: representa 1, 2, 3, 4, 5 o 6

y el aminoácido de fórmula II está unido mediante un enlace peptídico del grupo \alpha-amino con la Arg contigua y mediante un enlace peptídico del grupo \alpha-carboxilo con el grupo \alpha-amino de la Asp contigua, así como sus compuestos de utilidad farmacéutica

c): solvatos,

d): estereoisómeros y

e): sales

de estos, incluyendo sus mezclas en todas las proporciones.

2. Compuestos peptídicos según la reivindicación 1 seleccionados del grupo

Ac-Arg-Dap(Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(F5-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(2-NO_{2}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg- Dap(4-NO_{2}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg- Dap(2,4-NO_{2}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(6-OMe-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(2-CF_{3}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(3-CF_{3}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(Me_{5}-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(4-tBu-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(BSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(1-Nap)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(2-Nap)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

Ac-Arg-Dap(4-Ph-Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_{2},

así como sus profármacos útiles farmacéuticamente y derivados como los definidos en la reivindicación 1, solvatos, estereoisómeros y sales de ellos, incluyendo sus mezclas en cualquier proporción.

3. Compuesto de fórmula I según una de las reivindicaciones 1 o 2 para su uso como medicamento.

4. Medicamento que contiene una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I según una de las reivindicaciones 1 o 2, junto a uno o varios excipientes inertes, coadyuvantes y/o diluyentes, según el caso.

5. Medicamento según la reivindicación 4, que se caracteriza porque contiene al menos otro principio activo para medicamentos.

6. Procedimiento para la preparación de un medicamento según la reivindicación 4 o 5, que se caracteriza porque mediante vías no químicas se obtiene un compuesto de fórmula I según una de las reivindicaciones 1 o 2 y dado el caso otro principio activo para medicamentos en uno o varios excipientes y/o diluyentes inertes.

7. Uso de los compuestos de fórmula I según una de las reivindicaciones 1 o 2 para la preparación de un medicamento para prevenir y/o combatir enfermedades, seleccionadas del grupo que comprende enfermedades del sistema circulatorio, fibrosis, mucoviscidosis, cirrosis hepática, enfermedades tumorales, enfermedades osteolíticas, inflamaciones, enfermedades oftalmológicas, artritis reumática, osteoartritis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, ateroesclerosis, soriasis, restenosis, esclerosis múltiple y fallo renal agudo.

8. Uso según la reivindicación 7, que se caracteriza porque las enfermedades del sistema circulatorio se seleccionan del grupo que comprende embolias pulmonares, trombosis, infarto cardiaco, arteriosclerosis, aneurisma disecante, ataques isquémicos pasajeros, apoplejía y angina de pecho.

9. Uso de los compuestos de fórmula I según una de las reivindicaciones 1 o 2 para la preparación de un medicamento para influir en los procesos de curación de heridas.

10. Kit de medicamentos compuesto por envases separados de

a): una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I según una de las reivindicaciones 1 o 2 y

b): una cantidad eficaz de otro principio activo para medicamentos.