SK262002A3

SK262002A3 - Cyclic peptide derivatives as inhibitors of integrin alpha'v'beta'6'

Info

Publication number: SK262002A3
Application number: SK26-2002A
Authority: SK
Inventors: Alfred Jonczyk; Beate Diefenbach; Simon Goodman; Ulrich Groth; Gunther Zischinsky
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-03
Publication date: 2002-07-02
Also published as: HUP0201925A2; PT1196433E; CN1361792A; ZA200201275B; NO20020176L; ATE340803T1; HUP0201925A3; AR024742A1; EP1754714A1; EP1196433B1; KR20020010928A; DK1196433T3; BR0012418A; AU772782B2; AU772782C; PL354363A1; AU5823600A; MXPA02000465A; TWI226890B; ES2273703T3

Description

Vynález sa týka nových peptídov obecného vzorca I cyklo(Arg-X¹-Asp-X²-X³-X⁴-X^s-X⁶-R¹) (I) kde znamená

X¹ Ser, Gly alebo Thr,

X² Leu, íle, Nie, Val alebo Phe,

X³ Asp, Glu, Lys alebo Phe,

X⁴ Gly, Ala alebo Ser,

X^s Leu, íle, Nie, Val alebo Phe,

X^e Arg, Har alebo Lys,

R¹ chýba alebo znamená jeden alebo niekoľko zvyškov· ál-aminokarboxylovej kyseliny, pričom zvyšok -aminokarboxylovej kyseliny má dĺžku 500 až 2500 pm, pričom uvedené aminokyseliny môžu byť tiež derivatizované, vrátane D a L foriem a opticky aktívnych aminokyselinovaných zvyškov a ich fyziologicky prijateľných solí a solvátov.

Vynález je založený na objave nových zlúčenín, ktoré majú hodnotné vlastnosti a môžu byť použité na výrobu liečiv.

Zistilo sa, ' že zlúčeniny podľa vynálezu a ich soli majú veľmi hodnotné farmakologické vlastnosti spolu s dobrou znášanlivosťou.

Peptídy podľa vynálezu sa môžu používať ako účinné inhibítory integrínového receptoru a tým k ošetrovaniu rôznych chorôb a patologických nálezov.

Doterajší stav techniky

Iné inhibítory integrínu /5 sú popísané v nemeckom patentovom spise číslo DE 19858857 a ďaľšie takéto typy tiež popísal S. Kraft a kol. (J. Biol., Chem. 274, str. 1979 až 1985, 1999). Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu považovať za výberový vynález so zreteľom na vyššie uvedenú literatúru.

Integríny patria do rodiny heterodimernej triedy I trans-membránových receptorov, ktoré majú významnú úlohu v mnohých adhezných procesoch bunka - matrica poprípade bunka bunka (Tuckwell a kol., 1996, Symp. Soc. Ex. Biol. 47). Približne sa môžu deliť do troch tried :

- integríny, ktoré predstavujú receptory pre extracelulárnu matricu,

- integríny, ktoré sú aktivovateľné na leukocytoch, a sú spúšťané pri zápalových procesoch, ako tiež

- integríny, ktoré ovplyvňujú bunečnú odpoveď pri hojení rán a pri iných patologických procesoch (Marshall a Hart, Semin. Cancer Biol. 7, str. 191, 1996).

Integríny , v prírodných ligandoch, ako

oí /2> , «y /3 _t oC Z3 a

V 3 -v S v e sú napríklad fibronektín alebo vitronektín. Rozpustné RGD-obsahujúce peptídy sú schopné inhibovať interakciu každého tohoto integrínu so zodpovedajúcimi prírodnými ligandami. Integrín je pomerne vzácny integrín (Busk a kol., J. Biol. Chem. 267(9), str. 5790, 1992), ktorý sa pri procesoch opravy epitelových tkanív vo väčšom množstve vytvára a prednostne viaže prirodzené matricové molekuly fibronetín a tenascín (Want a kol., Am. J. Respir. Celí Mol. Biol. 15(5), str. 664, 1996). Fyziologické a patologické funkcie nie sú doposiaľ dokonale známe, existuje však názor, -že tento integrín má dôležitú úlohu pri fyziologických pochodoch a chorobách (napríklad zápaly, hojenie rán, nádory), na ktorých sa podieľajú epitelové bunky. Tak sa Invest. Dermatol. 106(1), str. 42, 1996), z toho sa dá usudzovať, že agonistami a antagonistami tohoto integrínu sú ovplyvňované vedľa procesov hojenia rán a zápalov aj iné patologické javy pokožky, ako napríklad psoriáza. Okrem toho má Respir. Celí Mol. Biol. 12(5), str. 547, 1995), takže by sa mohli úspešne nasadzovať zodpovedajúce agonisty/antagonisty tohoto integrínu pri ochoreniach dýchacích ciest, ako sú bronchitída, astma, pľúcna fibróza a nádory dýchacích ciest. Je tiež známe, že οζ^/3 majú význam pre črevný epitel, takže by bolo možné používať zodpovedajúce integrínové agonisty/antagonisty pri ošetrovaní zápalov, nádorov a poranení žalúdočného a črevného traktu.

Závislosť vytvárania angiogenézie na vzájomnom pôsobení vaskulárnych integrínov a extracelulárriych matricových proteínov popísal P.C. Brooks, R.A. Clark a D.A. Cheresh (Science 264, str. 569 až 571, 1994).

Úlohou vynálezu je preto prídavné k už známym prírodným vysokomolekulárnym ligandom a protilátkam, s ktorými sa terapeuticky a diagnosticky ťažko pracuje, nájsť mocné, špecifické a selektívne nízkomolekulárne ligandy prec/^/3, s výhodou peptídy, ktoré by sa mohli používať pre uvedené terapeutické oblasti, avšak tiež ako diagnostické alebo reakčné činidlá.

Podstata vynálezu

Zistilo sa, že vyššie charakterizované peptídové zlúčeniny podľa vynálezu a ich soli ako rozpustné molekuly pôsobia na bunky, ktoré majú uvedený receptor, alebo keď sa viažu na povrchy, predstavujú umelé ligandy pre sprostredkovávané uľpievanie buniek. Predovšetkým pôsobia ako inhibítory ΑΆ integrínu, pričom predovšetkým brzdia vzájomné pôsobenie receptoru s inými ligandami, napríklad väzbu fibronektínu. Toto pôsobenie sa dá doložiť napríklad spôsobom, ktorý popísal J.W. Smith a kol. (J. Biol. Chem. 265, str. 12267 až 12271, 1990).

Okrem toho sa zistilo, že nové zlúčeniny majú veľmi hodnotné farmakologické vlastnosti spolu s dobrou znášanlivosťou a môžu sa používať ako liečivá. Táto skutočnosť bude ešte presnejšie popísaná.

Peptidické zlúčeniny podľa vynálezu sa používať ako diagnostiká na detekciu patologických stavov v epitelovom systéme in okrem toho môžu a lokalizáciu vivo a in vitro, pokiaľ sú vybavené vhodnými markermi (napríklad biotinylovým zvyškom) podľa stavu techniky.

Vynález zahrnuje tiež kombinácie s aspoň jednou inou účinnou zlúčeninou alebo konjugáty s inými účinnými látkami, ako sú cytotoxicky účinné látky, ako tiež konjugáty s radioznačením pre rentgenovú terapiu alebo pre PET diagnózu alebo také fúzne proteíny s proteínovými markermi, ako sú GFP alebo protilátky, alebo terapeutické proteíny, ako je IL-2.

Osobitne účinné sú zlúčeniny obecného vzorca I, v ktorých je oktapeptídová sekvencia cyklo(Arg-X¹-Asp-X³-X³-X⁴-X⁵-X⁶) a kde X², X³, X⁴, X⁵, a X⁶ majú vyššie uvedený význam, rozšírená skupinou R^x. Vplyv expanzie kruhu je ukázaný na obr. 1 na príklade cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg) [EMD 271588]. Ako porovnávacia · . zlúčenina ’ sa' uvádza ·

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH^ [EMD cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-R¹)

2711293]. Niektoré peptídy majú vzdialenosť od R¹ (vyrátanú) a hodnotu Q (IC [zlúčeniny]/IC_s [EMD 271293] a - log Q uvedenú v tabuľke.

R^x	Dištancia [pm]	Q	- log Q
0	0	47	-1,672
Gly	370	2,1	-0,322
Abu	617	0,028	1,553
Gly-Gly	740	0,05	1,301
Aha	870	0,036	1,444
Aee	1078	0,038	1,420
Gly-Gly-Gly	1110	0,03	1,523
Abu-Abu	1235.	0,03	1,523
Gly-Gly-Gly-Gly	1480	0,033	1,481
Aha-Aha	1740	0,036	1,444
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly	1850	0,046	1,337
Gly-(Gly)₄-Gly	2220	0,05	1,301

Grafické znázornenie je zrejmé z obr. 1. Osobitne aktívne zlúčeniny sa získajú vtedy, ak dĺžka medzerníku R¹ dosiahne približne 500 pm.

Osobitne výhodnými zlúčeninami sú zlúčeniny obecného vzorca I, kde R¹ znamená jeden alebo niekoľko zvyškov A)-aminokarboxylovej kyseliny, pričom zvyšok fo a.minokarboxylovej kyseliny má dĺžku 600 až 2000 pm.

Zvyškami -aminokarboxylovej kyseliny sa chápu zvyšky hociktorej -aminokarboxylovej kyseliny, pričom osobitne výhodné aminokysleiny sa volia zo súboru zahrnujúceho Ala, Asn, Asp,

I

Arg, Cys, Gin, Glu, Hcy, His, Hse, íle, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val a H N-(CH CH 0) -(CH ) -COOH, kde

2 2 m 2 n m, n vždy na sebe nezávisle 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, alebo 12, za podmienky, že m+n je väčšie ako 0.

Vynález sa teda týka najmä derivátov peptídov obecného vzorca I cyklo (Arg-X^a--Asp-X²-X³-X⁴-X^s-X⁶-R¹) (I) kde znamená

X¹ Ser, Gly alebo Thr,

X² Leu, íle, Nie, Val alebo Phe,

X³ Asp, Glu, Lys alebo Phe,

X⁴ Gly, Ala alebo Ser,

X^s Leu, íle, Nie, Val alebo Phe,

X⁶ Arg, Har alebo Lys,

R¹ chýba alebo znamená 1 až 10 aminokyselín volených zo súboru zahrnujúceho Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Hcy, His,

Hse, íle, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr,

Val a H N-(CH CH 0) -(CH ) -COOH, kde znamená

2 2 m 2 n m, n vždy na sebe nezávisle 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, alebo 12, za podmienky, že m+n je väčšie ako 0.

pričom uvedené aminokyseliny môžu byt tiež derivatizované, vrátane D a L foriem a opticky aktívnych aminokyselinových zvyškov a ich fyziologicky prijateľných solí a solvátov.

‘ I

Niektorými výhodnými skupinami zlúčenín obecného vzorca I sú nasledujúce zlúčeniny podvzorcov la až Ih, kde najmä neuvedené symboly majú význam uvedený u obecného vzorca I, pričom znamená v obecnom vzorci

a	)	X¹	Gly	alebo	Thr,
b	)	X¹	Gly	alebo	Thr,
		X²	Leu,
c	)	X¹	Gly	alebo	Thr,
		X²	leu,
		x³	Asp	alebo	D-Asp,
d	)	X¹	Gly	alebo	Thr,
		X²	Leu,
		x³	Asp	alebo	D-Asp,
		x⁴	Gly	alebo	Ala,
e	)	X¹	Gly	alebo	Thr,
		X²	Leu,
		x³	Asp	alebo	D-Asp,
		x⁴	Gly	alebo	Ala,
		x^s	Leu,
f	)	x¹	Gly	alebo	Thr,
		x²	Leu,
		x³	Asp	alebo	D-Asp,
		x⁴	Gly,	Ala alebo Ser,
		Χ^Ξ	Leu,
		x⁶	Arg,

g) X¹ Gly alebo Thr,

X² Leu,

X³ Asp alebo D-Asp, , <

X⁴ Gly, Ala alebo Ser,

X⁵ Leu,

X⁶ Arg,

R¹ 1 až 10 aminokyselín volených zo súboru zahrnujúceho Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Hcy, His, Hse, íle, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val a H N-(CH CH 0) -(CH ) -COOH, kde znamená z ' 2 2 ' xn ' 2 ' n ⁹ m, n vždy na sebe nezávisle 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, alebo 12, za podmienky, že m+n je väčšie ako 0.

h) X¹ Gly alebo Thr,

X² Leu,

X³ Asp alebo D-Asp,

X⁴ Gly, Ala alebo Ser,

X⁵ Leu,

X^e Arg,

R¹ 1 až 6 aminokyselín volených zo súboru zahrnujúceho Gly, /3-Ala, Abu alebo Aha, a ich soli.

Vynález sa, najmä týka peptídových zlúčenín vybraných zo súboru zahrnujúceho cyklo (Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), cyklo (Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), cyklo (Arg-Gly-Asp-Leu-D-Ala-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly) , cyklo (Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly),' cyklo (Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu- Abu), cyklo (Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha-Aha), cyklo (Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha) , cyklo (Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aee) , cyklo (Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), cyklo (Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg- $-Ala), cyklo (Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg- #-Ala), a ich fyziologicky prijetaľné soli.

Uvádzané skratky zvyškov aminokyselín znamenajú zvyšky nasledujúcich aminokyselín :

Abu	4-aminomaslová kyselina
Aee	H N-(CH CH 0) -CH -COOH 2 ^x 2 2 ⁹ 2 2
Aha	6-aminohexanová kyselina, 6-aminokapronová kyselina
Aib	alfa-aminoizomaslová kyselina
Ala	alanin
Asn	asparagin
Asp Arg Bgl	asparagová kyselina arginín C-alfa-terc-butylglycín

Cys cysteín

Dab	2,4-diaminoizomaslová kyselina
Dap Gin	2,3—diaminopropionová kyselina glutamin
Glp Glu	pyroglutamová kyselina glutamová kyselina
Gly Har	glycín homoarginín
Hcy	homocysteín

His	histidín
homo-Phe	homo-fenylalanin
Hse	homo-serin
íle .	izoleycín
Leu	leucín
Lys	lyzín
Met	metionin
Nal	naft-2-ylalanin
Nie	norleucín
Orn	ornitín
Pen	penicilamin
Phe	fenylalanin
Phg	fenylglycín
4-Hal-Phe	4-halogenfenylalanin
Pro	prolín
Ser	serín
Thr	treonín
TIS	triizopropylsilan [sic]
Trp	tryptofan
Tyr	tyrozín
Val	valin

Okrem toho sa ešte uvádzajú skratky, ktoré majú

nasledujúci	význam :
Ac	acetyl
Boe	terc-butoxykarbonyl
BSA	albumín hovädzieho séra
CBZ alebo Z	benzyloxykarbonyl
DCC1	dicyklohexylkarbodiimid
DCM .	dichlormetan
DIEA	dietylamin
DMF	dimetylformamid
EDC1	N-etyl-N,N'-(dimetylaminopropyl)karbodiimid
Et	etyl
FCA	fluoresceinkarboxylová kyselina

FITC	fluorosceinizotiokyanát
Fmoc	9-fluorenylmetoxykarbonyl
FTH	fluoresceintiomočovina
HOBt	1-rhydroxybenzotriazol . '
HONSu	N-hydroxysukcinimid
Me	metyl
MBHA	4-metylbenzhydrylamin
Mtr	4-metoxy-2,3,6-trimetylfenylsulfonyl
OBut	terc-butylester
Oct	oktanoyl
OMe	metylester
OEt	etylester
Pbf	2,2,4,6,7-pentametyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
Pmc	2,2,5,7,8-pentametylchroman-6-sulfonyl
POA	fenoxyacetyl
Sal	salicyloyl
TBS++	tris pufrovaná solanka s dvojmocným kationtom
TBSA	TBS + BSA
TBTU	2-(lH-benzotriazol-1-yl)-1,1,3-tetrametyluroniumtetrafluórborát
TFA	trifluoroctová kyselina
Trt	trityl (trifenylmetyl).

Pokiaľ vyššie uvedené aminokyseliny môžu byť v niekoľkých enantiomerných formách, všetky tieto formy a tiež ich zmesi (napríklad DL formy) vynález zahrnuje. Okrem toho môžu byť aminokyseliny chránené o sebe známymi chrániacimi skupinami.

Vynález sa tiež týka hydrátov a solvátov, napríklad alkoholátov zlúčenín obecného vzorca I.

Zlúčeniny podľa vynálezu zahrnujú tiež tak nazývané prodrogové deriváty, acylovými skupinami, to znamená napríklad alkylovými alebo cukrami alebo oligopeptídami obmenené zlúčeniny obecného vzorca I, ktoré sa v organizme rýchlo štiepia na účinné zlúčeniny podľa vynálezu. Do tejto skupiny patria tiež biologicky odbúrateľné polymérne deriváty zlúčenín podľa vynálezu popísané v literatúre (napríklad J. Pharm. 115, , . ’ · str.'61 až 67, 1995).

Uvedené aminokyseliny alebo aminokyselinové zvyšky, napríklad skupiny NH alebo koncové amidové skupiny, môžu byť tiež derivatizované, pričom sú výhodnými N-metylové, N-etylové, N-propylové, N-benzylové alebo Ccf-metylové deriváty. Deriváty Asp a Glu sú najmä metyl-, etyl-, propyl-, butyl-, terc-butyl-, neopentyl- alebo benzylestery postranných karboxylových skupín a prídavné sú výhodnými derivátmi Arg, ktoré môžu byť substituované na skupine -NH-C(=NH)-NH₂ -skupinou acetylovou, benzoylovou, metoxykarbonylovou alebo etoxykarbonylovou.

Vynález zahrnuje tiež zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré sú navzájom viazané peptídovým spôsobom prostredníctvom alfa-aminoskupín a alfa-karboxylových skupín (väzba hlava chvost) a sú cyklickými zlúčeninami, ktoré majú funkčný vedľajší reťazec napríklad skupinu SH a sú viazané nasledujúcim spôsobom vedľajší - vedľajší napríklad S-S (disulfidická) hlava - vedľajší vedľajší - chvost

Vynález zahrnuje tiež deriváty obsahujúce známe markery, ktoré detekciu peptídov uľahčujú. Ako príklady takýchto derivátov sa uvádzajú rádioaktívne značené, biotinylovarié alebo fluorescenčné značené peptídy.

Fluorescenčné farbivové skupiny sú s výhodou skupina 7-acetoxykumarin-3-ylová, fluoresceín-5-(alebo 6-)ylová, 2',7'-dichlorfluoresceín-5-(a 6-)ylová, dihydrotetrametylrodamin-

4-ylová, tetrametylrodamin-5-(a 6-)ylová, 4,4-difluor-5,7-dimetyl-

4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-etylová alebo 4,4-difluór-5,7difenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-etylová skupina.

Vhodné skupiny funkcionalizovaných fluorescenčných farbív, ktoré sa môžu používať ako reakčné činidlá pri príprave zlúčenín obecného vzorca I podľa vynálezu, sú popísané napríklad v publikácii Handbook' of Fluorescent probes and Research Chemicals”, 5. vydanie, 1992 až 1994, R. P. Haughland Molecular Probes Inc.

Vynález zahrnuje nielen vyššie charakterizované peptídy, ale tiež zmesi a prostriedky, ktoré vedľa zlúčenín podľa vynálezu obsahujú také iné farmakologicky aktívne zlúčeniny alebo pomocné prísady, ktoré môžu priaznivo ovplyvňovať primárne farmakologické pôsobenie peptídov podľa vynálezu.

Zlúčeniny obecného vzorca I a východzej látky na ich prípravu sa pripravujú o sebe známymi spôsobmi, ktoré sú popísané v literatúre (napríklad v štandardných publikáciách ako Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme Verlag, Stuttgart), a to za reakčných podmienok, ktoré sú pre menované reakcie známe a vhodné. Pritom sa môže tiež používať o sebe známych, tu bližšie nepopisovaných variantov.

S výhodou sa peptídy podľa vynálezu pripravujú spôsobom používajúcim pevnú fázu s nasledovným oddelením a čistením, ako popísal napríklad Jonczyk a Meienhofer (Peptides, proc. 8^ Am. Pept. Symp. Eds. V. Hrubý a D.H.Rich, Pierce Comp. III, str. 73 až 77, 1983; alebo Angew. Chem. 104, str. 375, 1992) alebo Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 94, str. 3102, 1972).

Peptídy podľa vynálezu sa môžu pripravovať na pevnej fázi (ručne alebo použitím automatizovaných syntetizérov) stratégiou Fmoc využívajúcou v kyselom prostredí labilných vedľajších chrániacich skupín a čistením chromatografiou

RP-HPLC. Piková homogenita sa môže merať chromatografiou

RP-HPLC a identita zlúčenín využitím FAb-MS.

Peptidy sa tiež môžu pripravovať o sebe známymi spôsobmi prípravy aminokyselín a peptídov, ktoré sú známe z literatúry (napríklad Novabiochem - 1999 Catalog and Peptide Synthesis Handbook of Calbiochem-Novabiochiem GmbH, D-65796 Bad Soden) a z mnohej štandardnej literatúry a zo zverejnených patentových spisov.

Používať sa môžu postupné kopulácie a kondenzácie fragmentov. Používať sa môžu rôzne N-koncové a C-koncové a vedľajšie chrániace skupiny, ktoré sa s výhodou volia tak, aby boli orotogonálne odštiepiteľné. Kopulačné stupne sa môžu vykonávať za použitia rôznych kondenzačných činidiel, ako sú karbodiimidy, karbodiimidazoly, činidlá uroniového typu ako TBTU, použitím spôsobov zmesných anhydridov a halogenidov kyselín alebo aktívnych esterov. Aktivované estery sa výhodne vytvárajú in situ, napríklad adíciou HOBt alebo N-hydroxysukcinimidu.

Cyklizácia lineárnej prekurzorovej molekuly, ktorá má vedľajšie chrániace skupiny, sa podobne môže vykonávať za použitia konenzačných reakcií, ktoré sú popísané v literatúre (napríklad nemecký patentový spis číslo DE 43 10 643; alebo Houben-Weyl, l.c., zväzok 15/11, str. 1 až 806, 1974).

Pri príprave za použitia pevnej fáze sa môžu používať rôzne živice a kotviace funkcie. Živice môžu byť napríklad na bázi polystyrénu alebo polyakrylamidu; ako kotviace funkcie prichádzajú do úvahy Wang, o-chlortrityl na prípravu peptídových kyselín, aminoxantenoxykotvy, napríklad na prípravu peptídových aminov.

Biotynylované alebo fluorescenčné značené peptídy/proteíny sa podobne môžu pripravovať o sebe známymi spôsobmi (napríklad

E.A. Bayer a M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, zväzok 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in

Molecular Biology; a Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6. vydanie, 1996, R.P. Haugland Milecular Probes Inc.;' alebo svetový patentový spis číslo WO 97/14716).

. f

Zlúčeniny obecného vzorca I sa ďalej môžu pripravovať uvoľnením zo svojich funkčných derivátov solvolýzou, najmä hydrolýzou alebo hydrogenolýzou. Pre solvolýzu alebo pre hydrogenolýzu sú ako východzie látky vhodné zlúčeniny, ktoré « majú miesto jednej alebo niekoľkých voľných aminoskupin alebo hydroxylových skupín zodpovedajúce chránené aminoskupiny alebo hydroxylové skupiny, s výhodou zlúčeniny, ktoré miesto jedného H-atómu, ktorý je spojený s N-atómom majú skupinu chrániacu aminoskupinu, alebo ktoré miesto atómu vodíku v hydroxylovéj skupine majú skupinu chrániacu hydroxylovú skupinu. To isté platí pre karboxylové kyseliny, ktoré môžu byť chránené tak, že sa nahradí ich -CO-OH hydroxylová skupina chrániaca skupinou napríklad esterovou skupinou.

Výraz skupina chrániaca aminoskupinu je ide o skupiny, ktoré sú vhodné k ochrane aminoskupiny pred chemickými reakciami, ktoré odstrániteľné, keď je žiadúca chemická reakcia obecne známy a (k blokovaniu) sú však ľahko na inom mieste molekuly uskutočnená. Výraz skupina chrániaca hydroxylovú skupinu je podobne obecne známy a ide o skupiny, ktoré sú vhodné k ochrane (k blokovaniu) hydroxylovéj skupiny pred chemickými reakciami, ktoré sú však ľahko odstrániteľné, keď je žiadúca chemická rekacia na inom ,mieste molekuly uskutočnená. Uvoľňovanie zlúčenín obecného vzorca I z ich funkčných derivátov sa darí - podľa použitej chrániacej skupiny - napríklad silnými kyselinami, ako je najmä kyselina trifluoroctová a chloristá, avšak tiež inými silnými anorganickými kyselinami, ako je kyselina chlorovodíková alebo sírová, silnými organickými karboxylovúmi kyselinami, ako je trichloroctová kyselina alebo kyselina benzesulfonová sulfonovými kyselinami, ako je alebo p-toluensulfonová.

Hydrogenolyticky odstrániteľné chrániace skupiny (napríklad skupiny CBZ alebo skupina benzylová) sa môžu odštiepovať napríklad spracovaním vodíkom za prítomnosti katalyzátoru (napríklad katalyzátoru na bázi .ušľahctilého kovu, ako palládium, účelne na nosiči, ako na uhlí).

Typické chrániace skupiny pre N-koncové skupiny a pre vedľajšie aminoskupiny sú skupina Z, BOC, Fmoc, pre koncové

C-skupiny alebo pre Asp alebo Glu O-prim-alkylové skupiny (napríklad etoxyskupina), skupiny O-terc-alkylové vedľajšie reťazce sú metoxyskupina alebo (napríklad OBut) alebo

O-benzylová skupina. Pre chránenie guanidin-podielu skupiny Arg sú vhodné napríklad skupina Z, BOC, N0₂, Mtr, Pmc alebo Pbf. Alkoholové skupiny sa môžu chrániť terc-alkylovými alebo tritylovými skupinami.

Skupina BOC, OBut a Mtr sa môže napríklad s výhodou odštiepovať kyselinou trifluoroctovou v dichlórmetáne alebo približne 3 až 5 N kyselinou chlorovodíkovou v dioxáne pri teplote 15° až 30° C, zatiaľ kým skupina Fmoc [sic] približne 5 až 50 % roztokom dimetylaminu, dietylaminu alebo piperidínu v dimetylformamidu pri teplote 15° až 30° C.

Tritylová skupina histidín, asparagín, sa používa ku chráneniu aminokyselín glutamin a cysteín. Odštiepovanie chrániacej skupiny sa uskutoční produktu systémom trifluóroctová podľa žiadúceho konečného kyselina/10 % tiofenolu, pričom sa tritylová skupina od uvedených aminokyselín odštiepi.

Pri použití systému trifluóroctová kyselina/anizol alebo trifluóroctová kyselina/tianizol sa odštiepi iba tritylová skupina z histidínu, asparagínu a glutamínu, ostáva však na vedľajšom reťazci Cys.

Hydrogenolyticky odstrániteľné chrániace skupiny (napríklad skupiny CBZ alebo skupina benzylová) sa môžu odštiepovať napríklad spracovaním vodíkom za prítomnosti katalyzátoru (napríklad katalyzátoru na bázi ušľachtilého kovu, ako palládium, účelne na nosiči, ako na uhlí). Ako rozpúšťadlo sa hodia vyššie uvedené rozpúšťadlá, najmä napríklad alkoholy, ako metanol alebo etanol alebo amidy ako dimetylformamid.

Hydrogenolýza sa zvyčajne uskutočňuje pri teplote približne 0° až 100° C, za tlaku približne 0,1 až 20 MPa, s výhodou pri teplote 20° až 30° C, za tlaku približne 0,1 až 1 MPa. Hydrogenolýza CBZ skupiny sa darí napríklad dobre na 5 až 10 % palládiu na uhlí v metanolu alebo za použitia amoniumformiátu (miesto vodíku) na palládiu na uhlí . v systéme metanol/dimetylformamid pri teplote 20° až 30° C.

Ako je vyššie uvedené, zahrnujú tiež svoje fyziologicky prijateľné peptídy podľa soli,, ktoré vynálezu sa môžu pripravovať o sebe známymi spôsobmi. Zásada obecného vzorca I sa môže kyselinou previesť na príslušnú adičnú soľ s kyselinou, napríklad reakciou evivalentného množstva zásady a kyseliny v inertnom rozpúšťadle, ako je napríklad etanol a nasledovným odparením rozpúšťadla. Pre túto reakciu prichádzajú do úvahy najmä kyseliny, ktoré poskytujú fyziologicky prijateľné soli.

Môžu sa používať anorganické kyseliny, ako sú kyselina sírová, dusičná, halogenovodíkové kyseliny, ako chlorovodíková alebo bromovodíková, fosforečné kyseliny, ako kyselina ortofosforečná, sulfaminová kyselina a organické kyseliny, najmä alifatické, alicyklické, aralifatické, aromatické alebo heterocyklické jednonasýtené alebo sulfonové alebo sírové kyseliny, octová, propionová, pivalová, viacenasýtené karboxylové, ako sú kyselina formiová, dietyloctová, malonová, jantárová, pimelová, fumarová, maleínová, mliečna, vinná, jablčná, citrónová, glukonová, askorbová, nikotínová, izonikotínová, metansulfonová, etansulfonová, etandisulfonová,

2-hydroxyetansulfonová, benzensulfonová, p-toluensulfonová, nafúalensulfonová a naftalendisulfonová a laurylsírová kyselina. Solí s fyziologicky nevhodnými kyselinami, napríklad pikráty, sa môžu používať k izolácii alebo čisteniu zlúčenín obecného vzorca I.

Na druhej strane sa kyseliny zlúčenín obecného vzorca I reakciou so zásadou môžu prevádzať na svoje fyziologicky prijateľné soli kovové alebo amoniové. Ako soli prichádzajú do úvahy osobitne soli sodné, draselné, horečnaté, vápenaté a amoniové, ďalej substituované amoniové soli, napríklad dimetylamoniové, dietylamonióvé, diizopropylamoniové, monoetanolamoniové, dietanolamoniové, alebo diizopropylamoniové, cyklohexylamoniové, dicyklohexylamoniové, dibenzyletylendiamoniové, ďalej napríklad soli s arginínom alebo s lyzínom.

Peptídové zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu používať, ako vyššie uvedené, ako farmaceutický účinné zlúčeniny v humánnej a vo veterinárnej medicíne najmä na profylaxiu alebo terapiu porúch, na ktorých sa podieľajú epitelové bunky. Osobitne na ošetrovanie zápalov, na hojenie rán pokožky, na ošetrovanie orgánov rešpiračného traktu a na ošetrovanie žalúdku a čriev, napríklad na ošetrovanie apoplexie, anginy pectoris, nádorov, osteolytických chorôb ako osteoporózy, patologických angiogenných chorôb, ako fibrózy, oftalmologických degeneratívnych škvŕn, napríklad zápalov, pulmonárnej chorôb, diabetickej retinopatie, myopie, očnej histoplazmózy, reumatoidnej artritídy, osteoartritídy, rubeotického glaukomu, vredovítej kolitídy, psoriázy, restenózy obličiek, nefritídy,, sklerózy.

Vynález sa týka

Krohnovej choroby, aterosklerózy, po angioplastii, akútneho zlyhania mikrobiálnej infekcie a roztrúsenej peptídových zlúčenín vyššie uvedeného obecného vzorca I a ich fyziologicky prijateľných solí ako liečiv, diagnostických a reakčných činidiel.

Vynálezom sú najmä zodpovedajúce liečiva ako inhibítory na ošetrovanie chorôb, ktoré sú bezprostredne alebo nie bezprostredne spôsobené expresiou integrinových receptorov, najmä patogénnych angiogenných chorôb, trombóz, srdcového infarktu, koronárnych ochorení srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, zápalov, infekcií ako aj tiež k ovplyvňovaniu procesov hojenia rán.

Vynález sa tiež týka vhodných farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú aspoň jedno liečivo obecného vzorca I a poprípade nosič alebo excipienty.

Vynález sa ďalej tiež týka použitia peptídových zlúčenín alebo ich fyziologicky prijateľných solí podľa vynálezu a návodu na výrobu liečiv pre liečenie porúch,, ktoré sú nepriamo alebo priamo založené na expresii /^/3 integrinového receptoru, čo platí najmä pre patologické angiogénne poruchy, trombózy, srdcový infarkt, koronárne poruchy srdca, artériosklerózu, nádory, osteoporézu, zápal, infekcie a na ovplyvňovanie liečenia rán.

Liečivá podľa vynálezu poprípade farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú, sa môžu používať v humánnej a vo veterinárnej medicíne. Ako nosiče prichádzajú do úvahy anorganické alebo organické látky, ktoré sú vhodné na enterálne (napríklad orálne) alebo na parenterálne alebo topické podávanie alebo na podávanie vo forme inhalačných sprejov a ktoré nereagujú so zlúčeninami obecného vzorca I, ako sú napríklad voda, rastlinné oleje, benzylalkoholy, alkylenglykoly, polyetylénglykoly, glycerintriacetát, želatína, uhľohydráty, ako laktóza alebo škroby, stearát horečnatý, mastenec a vazelína. Na orálne použitie sa hodia najmä tablety, pilulky, potiahnuté tablety, kapsule, prášky, granule, sirupy, šťavy alebo kvapky, na rektálne použitie čipky, na parenterálne použitie roztoky, najmä olejové alebo vodné roztoky, ďalej suspenzie, emulzie alebo implantáty, na topické použitie masti, krémy alebo púdre. Zlúčeniny podľa vynálezu sa tiež môžu lyofilizovat a získané lyofilizáty sa môžu napríklad používať na prípravu vstrekovateľných prostriedkov., Prostriedky sa môžu sterilizovať alebo môžu obsahovať pomocné látky, ako sú klzné činidlá, konzervačné, stabilizačné činidlá alebo zmáčadlá, emulgátory, soli k ovplyvneniu osmotického tlaku, pufre, farbivá, chuťové prísady alebo ešte jednu ďalšiu alebo ešte niekoľko ďalších účinných látok, ako sú napríklad vitamíny.

Na podávanie vo forme inhalačných sprejov sa účinná látka rozpúšťa alebo suspenduje v hnacom plyne alebo v zmesi hnacích plynov (ako sú napríklad oxid uhličitý alebo fluórchlórované uhľovodíky). V takom prípade sa pritom používajú účinné látky v mikronizovanej forme, pričom sa môže pridávať aspoň jedno fyziologické kompatibilne rozpúšžadlo, napríklad etanol. Inhalačné roztoky sa môžu podávať za použitia o sebe známych zariadení k tomuto účelu.

Zlúčeniny obecného vzorca I podľa vynálezu sa spravidla používajú v dávkach podobných ako obchodne známe peptídy, najmä obdobne ako zlúčeniny podľa amerického patentového spisu číslo 4 472305, s výhodou v dávke približne 0,05 až 500 mg, najmä 0,5 až 100 mg na dávkovaciu jednotku. Denná dávka je s výhodou približne 0,01 až 20 mg/kg telesnej hmotnosti. Určitá dávka pre každého jendotlivého jedinca závisí na najrôznejších faktoroch, napríklad na účinnosti určitej použitej zlúčeniny, na veku, telesnej hmotnosti, všeobecnom zdravotnom stave, pohlaví, strave, na okamihu a ceste podania, na rýchlosti vylučovania, na kombinácii liečiv a na závažnosti určitého ochorenia. Výhodné je parenterálne podávanie.

Vynález sa tiež týka zlúčenín obecného vzorca I, ktoré sa môžu používať v analytickej biológii a v molekulárnej biológii.

Nové zlúčeniny obecného vzorca I, kde znamená X skupinu fluorescenčného farbiva, viazanú prostredníctvom -CONH, -C00, -NH-C (=S)-NH, -NH-C(=0)-NH, -SO_sNH alebo -NHCO väzbou, sa môžu používať ako diagnostické markery'v technike FACS .(Fluorescence Activad Celí Sorter) a vo fluorescenčnej mikroskopii.

Použitie značených zlúčenín vo fluorescenčnej mikroskopii je popísané v literatúre (napríkla Y.-L.Wang a D.L. Taylor Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, časť A+B, Academic Press, Inc. 1989).

Nové zlúčeniny podlá vynálezu sa tiež môžu používať ako integrínové ligandy k výrobe stĺpcov pre afinitnú chromatografiu k výrobe čistených integrínov. Komplex Avidinem deŕivatizovaného nosiča, napríklad Sepharose, a nových zlúčenín obecného vzorca I sa vytvára o sebe známym spôsobom (ako popisuje napríklad E.A. Bayer a M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, zväzok 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology). Ako polymérne nosičové materiály sú na tento účel vhodné polymérne pevné fáze známe z chémie peptídov s výhodou s hydrofilnýrni vlastnosťami, napríklad zosieťované polycukry, ako sú celulóza, Sepharose alebo Sephadex^R, akrylamidy, polymér na polyetylénglykolovej bázi alebo Tentakelpolymérý¹*.

Vynález zahrnuje tiež rekombinantné DNA-sekvencie, ktoré obsahujú úseky, ktoré kódujú oblasti peptídov majúcich i ·’ peptídové štrukturálne motívy podľa vynálezu.

Takéto DNA sa môžu prenášať časticami na bunky, ako popisuje Ch. Andree a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. 91, str.

12188 až 12192, 1994) alebo môžu zvyšovať transfer na bunky inými pomocnými činiteľmi, ako sú lipozómy (A.I. Aronsohn a

J.A. Hughes, J. Drug Targeting 5, str. 163 až 169, 1997).

Transfér takejto DNA by sa preto mohol použiť v kvasniciach prostredníctvom Bacculovírusov alebo v bunkách cicavcov na produkciu peptidických látok.

Pokiaľ i sa infikuje ₍živočíšny alebo ľudský organizmus uvedenou rekombinantnou DNA, môžu sa viazať infikovanými bunkami nakoniec vytvorené peptídy podľa vynálezu bezprostredne na -integrínový receptor, napríklad na nádorové bunky a môžu ich blokovať.

Zodpovedajúca rekombinantná DNA, ktorá sa môže pripraviť o sebe známymi a bežnými spôsobmi, môže byť však tiež napríklad vo forme vírusovej DNA, ktorá obsahuje úseky, ktoré kódujú vírusový obalQvý protein. Infekciou hostiteľského organizmu takýmito rekombinantnými, najmä nepatogénnymi vírusmi, sa môžu hostiteľské bunky, ktoré expresujú integrin s výhodou napadať (cieľovanie).

Vhodnými vírusmi sú napríklad adenovírusy, ktoré sa často používajú ako vektory pre cudzie gény v bunkách cicavcov. Pre svoje mnohé vlastnosti sa hodia na génovú terapiu, ako uvádza

S.J. Watkins a kol. (Gene Therapy 4, str. 1004 až 1012, 1997) a tiež J. Engelhard a kol. (Hum. gene Ther, 4, str. 759 až 769, 1993). Ako uvádza A. Fasbender a kol. (J. Clin. Invest. 102, str. 184 až 193, 1998), je spoločným problémom génovej terapie vírusovými a nevírusovými vektormi obmedzená účinnosť transferu génu. Vyššie popísanou prídavnou ligandovou sekvenciou pre integrin, v obalovom proteíne adenovírusov sa môže dosiahnuť zlepšenia transferu napríklad cystický fibrózový transmembránový vodivostný regulátor (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulátor, CFTR) cDNA.

Podobne ako popisuje T. Tanaka a kol. (Cancer Research 58, str. 3362 až 3369, 1998) sa môžu využiť miesto DNA pre angiostatin tiež DNA pre sekvencie podľa vynálezu pre transfekciu buniek prostredníctvom retrovírusových alebo adenovírusových vektorov.

Peptídy podľa vynálezu sa môžu používať tiež v komplexe lipozómov zo systému lipid/peptíd/DNA vyrobenom pre transfekciu bunečných kultúr z lipozómového komplexu pozostávajúceho zo systému lipid/DNA (bez peptidu), na použitie v génovej terapii ľudí. Prípravu komplexu lipozómov zo systému lipid/DNA/peptíd popísal napríklad S.L. Hart a kol. (Lipid-Mediated Enhancement of Transfection by a Non-Viral Integrin-Targeting Vector, Human Gene Therapy 9, str. 575 až 585, 1998).

Môže sa pripravovať lipozómový komplex lipid/peptíd/DNA napríklad z nasledujúcich zásobných roztokov : 1 jug/ul lipofektínu (ekvimolárna zmes DOTMA (=N-[l-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-trimetylamoniumchlorid) a DOPE (dioleylfosfatidyl etanolamin), 10 jug/ul plazmidu DNA a 100 jjg/ml peptidu. Za týmto účelom sa ako DNA tak peptid rozpúšťajú v bunečnom kultivačnom prostredí.

Komplex lipozómov sa pripraví zmiešaním týchto troch zložiek v určitom hmotnostnom pomere (lipid : DNA : peptid napríklad 0,75 : 1 : 4). Komplex lipozómov a DNA je už popísaný pre génovú terapiu ľudí (Caplen N.J. a kol., Liposomé-Mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis, Náture Medicíne 1, str. 39 až 46, 1995).

Vynález sa preto tiež týka použitia zodpovedajúcim spôsobom modifikovanej rekombinantnej DNA z gén uvoľňujúcich systémov, najmä zo systému vírus-DNA, k ošetrovaniu chorôb, ktoré sú bezprostredne alebo nie bezprostredne spôsobené expresiou «£^/3 integrinových receptorov, najmä patogénnych angiogénnych chrôb, trombóz, srdcového infarktu, koronárnych ochorení srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, zápalov, infekcií ako tiež k ovplyvňovaniu procesov hojenia rán.

Vynález objasňujú, nijako však neobmedzujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia. Teploty sa uvádzajú vždy v stupňoch Celzia.

Chromatografická HPLC analýza (retenčná doba R.) sa uskutoční za použitia nasledujúcich systémov :

Stĺpec 5 um LichroSpher 60 RP-Select B (250-4) s 50-minútovým gradientom od 0 do 80 % 2-propanolu vo vode/0,3 % trifluóroctovej kyseliny za prietoku 1 ml/min a za detekcie., pri 215 nm.

Hmotová špektrometria (MS) : EI (elektrónová rázová ionizácia) M*·;

FAB (bombardovanie rýchlymi atómami) (M+H)Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava a čistenie peptídoy podľa vynálezu t

Peptídy podľa vynálezu sa v podstate pripravujú a čistia za pomoci Fmoc-stratégie za chránania ku kyseline labilných vedľajších reťazcov na živiciach labilných ku kyseline za využitia obchodne dostupných kontinuálnych (continuous flow) syntetizérov peptídov podľa popisu Haubnera a kol. (J. Am. Chem. Soc. 118, str. 17703, 1996).

Cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) [EMD 272914]

Suspenduje sa [sic] 2,7 g Fmoc-Abu-OH (Bachem B-1910) vo [sic] 150 ml dichlórmetánu a rozpustí sa do čírosti za použitia ml dimetylformamidu. Pridá sa 5,6 ml diizopropyletylaminu.

Roztok sa neleje na 12,0 g o-chlórtritylchloridpolystyrénovej živice (1,14 mmol/g, Bachem D-196512) a dávka sa pretrepe pri izbovej teplote.

Po piatich hodinách sa živica odfiltruje za odsávania a premyje sa vždy 300 ml DMC/MeOH/DIEA v pomere 17/2/1, DCM, DMF, DCM a MeOH. Po odstránení rozpúšťadiel sa získa 14,55 g Fmóc-aminokyseliny ná živici. Trikrát Fmoc stanovenie dokladá stredné zaťaženie 541 Aimol/g Fmoc-Abu-O-oCITrt-živice.

Postupne sa podrobuje 0,7 g

Fmoc-Abu-O-oCITrt-polystyrénovej živice kopulačnému stupňu podvojnou kopulačnou technikou 2 x vždy s 0,30 g TBTU, 0,315 ml etyldiizopropylaminu a Fmoc-aminokyseliny v 4,1 ml dimetylformamidu za použitia obchodne dostupnej syntéznej aparatúry a o sebe známym spôsobom (aparatúra a príručka Milligen 9050 PpeSynthetizer™, 1987)· v každom prípade po dobu 30 minút. Premytie sa uskutoční v dimetylformamidu po dobu 10 minút, štiepenie v systéme piperidin/dimetylformamid (objemové 1:4) po dobu 5 minút a N-koncová acetylácia (uzavretie) sa uskutoční za použitia systému acetanhydrid/pyridín/dimetylformamid (objemové 2:3:15) po dobu 15 minút.

Používajú sa aminokyseliny Fmoc-Arg(Pmc), potom Fmoc-Leu, potom Fmoc-Ala, potom Fmoc-D-Asp(oBut), potom Fmoc-Leu, potom Fmoc-Asp(OBut), potom Fmoc-Thr(But), potom Fmoc-Arg(Pmc) nakoniec potom Fmoc-ABu. Po odstránení chrániacej skupiny Fmoc zo Fmoc-Abu-Arg- (Pmc) -Thr (But) -Asp (OBut) -Leu-D-Asp(OBut) -AlaLeu-Arg(Pmc)-Abu-0—oCITrt-polystyrénovej živice sa po premytí dimetylformamidom a izopropanolom a nasledovnom vysušení vo vákuu pri izbovej teplote 2: íska 0,9 g

Abu-Arg (Pmc) -Thr (But) -Asp (OBut) -Leu-D-Asp (OBut) -Ala-Leu-Arg (Pmc)-Abu-O-oClTrt-polystyrénovej živice.

Spracovaním tejto peptidylovej živice 20 ml systému trifluoretanol/dichlórmetan/kyselina octová (objemové 2:6:2) po dobu dvoch hodín pri izbovej teplote, filtrácii, skoncentrovaním vo vákuu a trituráciou s dietyléterom sa získa

0,19 g na vedľajšom reťazci chráneného

Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg (Pmc)-Abu-OH.

i ¹ Pridávaním po kvapkách roztoku tohoto produktu v dimetylformamidu (100 mg peptídu/15 ml DMF) do miešaného roztoku TBTU/HOBt/DIPEA (10:10:11 ekvivalentov) v 50 ml dimetylformamidu/100 mg peptidu v priebehu 30 minút a ďaľším miešaním po dobu jednej hodiny sa dosiahne cyklizácia. Po skoncentrovaní a vyzrážaní vodou sa získa, 0,15 g surového cyklo(Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala- Leu-Arg (Pmc)-Abu-Abu). Spracovávaním systémom trifluoroctová kyselina/voda/TIS (objemovo 94:3:3) po dobu dvoch hodín pri izbovej teplote, skoncentrovávaním vo vákuu a tritúrovaním s dietyléterom sa získa zrazenina 85 mg cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu).

Produkt sa čistí chromatografiou RP-HPLC na Lichrosorbe RP 18 (250-25,7 jim, Merck KGaA) v 0,3 % trifluoroctovéj kyseline za použitia gradientu 4 % až 24 % 2-propanolu v priebehu jednej hodiny pri prietoku 10 ml/mih a eluát sa hodnotí UV prietokom fotometrom pri 215 a 254 nm. Získa sa 51 mg produktu ; FAB 1067; Rt [sic] 19,0.

Podobne sa pripravia nasledujúce zlúčeniny :

Kód (EMD)	Sekvencia	ΜΟ1. hmôtn. (g/mol)	FAB	Rt [sic]
271312	cyklo	(RTDLDSLR)	957,1	958	15,10
271578	cyklo	(RTDLdSLR)	957,1	957	17,51
271579	cyklo	(RTDLČLALR)	941,1	941	16,64
271586	cyklo	(RGDLDSLR)	913,0	913	17,95
271587	cyklo	(RGDLdSLR)	913,0	913	17,24

271588	cyklo	(RGDLdALR)	897,0	897	19,60
271589	cyklo	(RGDLdGLR)	882,9	883	16,68
271590	cyklo	(RGDLd-^Ala-LR)	897,0 ,	897	15,47
271591	cyklo	(RGDLdALRG)	954,1	954	16,79
271592	cyklo	(RGDLdALRGG)	1011,1	1011	17,83
271593	cyklo	(RGDLdALRGGG)	1068,2	1068	17,79
271594	cyklo	(RGDLdALRGGGGGG)	1239,3	1239	17,30
272914	cyklo	(RGDLdALR-Abu-Abu)	1067,2	1067	19,00
272966	cyklo	(RTDLdALRGGG)	1112,2	1113	17,14
272967	cyklo	(RTDLdGLRGGG)	1098,2	1099	19,00
272968	cyklo	(RTDLDALRGGG)	1112,2	1113	17,39
272969	cyklo	(RTDLDGLRGGG)	1098,2	1099	18,88
272970	cyklo	(RGDLDALRG)	954,1	955	17,32
272971	cyklo	(RaDLdALRGGGj	1082,2	1083	18,26
272972	cyklo	(RGDLaALRGGG)	1082,2	1083	18,23
272958	cyklo	(RGDLdALR-Aha-Aha)	1123,3	1123	19,38
272959	cyklo	(RGDLdALR-Aha)	1010,2	1010	20,63
272960	cyklo	(RGDLdAĽR-Aee)	1042,2	1042	18,92
272961	cyklo	(RGDLdALRGGGG)	1125,2	1125	17,56
272962	cyklo	(RGDLdALRGGGGG)	1182,3	1182	17,52
272963	cyklo	(RGDLdGLRGGG)	1054,1	1054	15,59
272964	cyklo	(RGDLDALRGGG)	1068,2	1069	16,84
272965	cyklo	(RGDLDGLRGGG)	1054,1	1055	16,03
273028	cyklo	(RTDLdALR-Aha)	1072,2	n.d.	19,30
273033	cyklo	(RTDLČLALR-Abu)	1044,2	n.d.	16,72
273035	cyklo	(RGDLdALR-Abu)	1000,1	n.d.	16,96
273038	cyklo	(RTDLdALR-Aha-Aha)	1185,4	n.d.	20,46
273040	cyklo	(RTĎLdALR-ABU-Abu)	1111,3	n.d.	18,75

X 2 TFA

304219	cyklo	(RTDLdALR-^Ala)	1012,1	1012	19,4
304218	cyklo	(RGDLdALR-/3Ala)	968,1	968	18,7
329400	cyklo	(RGDLdALR)	811,9	812	21,15
329412	cyklo	(RTDLdALR-Abu-Abu)	1111,3	1112	20,31
329402	cyklo	(RGDLdALAGGG)	983,1	984	20,48

329399	cyklo (NMeArg- GDLaALRGGG)	1038,2	1039	19,66
329398	cyklo (R-NMeGly- DLaALRGGG)	1038,2	1039	19,76
329397	cyklo (RGD-NMeLeuaALRGGG)	1038,2	1039	20,22
329396	cyklo (RGDL-[D-NMeAla]- ALRGGG)	1038,2	1039	20,55
329395	cyklo (RGDLa-NMeAla LRGGG)	1038,2	1039	21,35
329394	cyklo (RGDLaA-NMeLeu- RGGG)	1038,2	1039	18,87
329393	cyklo (RGDLaLA-NMeArg-	1038,2	1039	20,64

GGG) cyklo (RGDLdAAR) cyklo (RGDLdAARGGG)

Nomenklatúra aminokyselín sa riadi smernicou Eur. J. Biochem. 138, Str. 9 až 37, 1984.

index = D-aminokyselina

n.d. = nestanovené

Príklad 2

Test receptorového viazania systémucé^/^/f ibronektin ₍ Vyrobené peptídy podľa vynálezu sa viažu v roztoku spolu s konkurenčne pôsobiacim fibronektínom na imobilizovaný receptora zisťuje sa hodnota Q ako miera selektivity viazania testovaného peptidu na ó Hodnota Q sa vypočítava z kvocientu hodnoty IC_sq testovaného peptidu a štandardy. Ako štandardy sa použilo lineárne Ac-RTDLDSLR-NH₂ (kód EMD 271293) (lit./patent porovnaj Pytela a kol·, Science 231, str. 1559, 1986).

Skúška viazania sa uskutoční nasledujúcim spôsobom :

l

Imobilizácia rozpustného receptoru na mikrotitračných doštičkách prebieha po zriedení proteínového roztoku v TBS++ a nasledovnej inkubácii cez noc pri teplote 4° C (100 ,ul/jamka). Nešpecifické miesta viazania sa blokujú inkubáciou (dve hodiny pri teplote 37° C) s 3 % (hmotn./objem) BSA v TBS++ (200 >11/jamka) . Prebytok BSA sa odstráni trikrát premytím TBSA++. Peptídy sa sterilné (1:10) v TBSA++ zriedi a inkubujú sa s imobilizovaným integríhom (50 ;ul peptídu + 50 jul ligandu na jamku; dve hodiny pri teplote 37° C) spolu s biotinylovaným fibronektinom 2 ;ug/ml. Neviazaný fibronektin a peptídy sa odstránia trikrát premytím TBSA++. Detekcia viazaného fibronektínu sa uskutoční inkubáciou (jednu hodinu pri teplote 37° C) s alkalickou fosfatázou kopulovanou s antibiotinovou protilátkou (Biorad) (1:20000 v TBSA++; 100 ,ul/jamka). Po trikrát premytí TBSA++ sa uskutoční kolorimetrické zistenie inkubácií (10 až 15 minút pri teplote 25° C v tme) s roztokom substrátu (5 mg nitrofenylfosfátu, 1 ml etanolamínu, 4 ml vody; 100 jul/jamka). Enzýmová reakcia sa ukončí pridaním 0,4 M roztoku hydroxidu sodného (100 >11/jamka). Farebná intenzita sa stanovuje pri 405 nm v meracom zariadení ELISA a porovnáva sa s nulovou hodnotou. Ako nulová hodnota sa používajú jamky nepovlečené receptorom. Ako štandardu sa používa Ac-RTDLDSLR-NH₂. Hodnoty IC_so pre testované peptídy sa odrátajú z grafu a z nich spolu s IC_so hodnotou štandardného peptídu sa zisťuje hodnota Q peptídu podľa vynýálezu.

Hodnota Q = IC_so testovaného peptídu/IC_so štandardu. Hodnota Q sa vyráta ako stred opakovaných testov.

Výsledky popísaného testu sú v nasledujúcej tabuľke.

Tabuľka II

Výsledky ibronektinového receptorového testu viazania

Kód (EMD)	Sekvencia	Q hodnota = IC 50 testovaný peptid IC EMD 271293 50
271293	Ac-RTDLDSLR-NH 2	1,00 (=75 nM)
271586	cyklo (RGDLDSLR)	26
271587	cyklo (RGDLdSLR)	88
271588	cyklo (RGDLdALR)	47
271589	cyklo (RGDLdGLR)	19
272970	cyklo (RGDLDALRG)	6,7
272964	cyklo (RGDLDALRGGG)	0,037
272965	cyklo (RGDLDGLRGGG)	0,16
272972	cyklo (RGDLaALRGGG)	0,05
271593	cyklo (RGDLdALRGGG)	0,03
272963.	cyklo (RGDLdGLRGGG)	' 0,084
271590	cyklo (RGDLd-/3Äla-LR)	233
271591	cyklo (RGDLdALRG)	2,1.
271592	cyklo (RGDLČLALRGG)	0,05
271594	cyklo (RGDLdALRGGGGGG)	0,Ó5
272914	cyklo (RGDLdALR-Abu-Abu)	0,03
272958	cyklo (RGDLdALR-Aha-Aha)	0,036
272959	cyklo (RGDLdALR-Aha)	0,036
272960	cyklo (RGDLdALR-Aee)	0,038
272961	cyklo (RGDLdALRGGGG)	0,033
272962	cyklo (RGDLdALRGGGGG)	0,046
273035	cyklo (RGDLdALR-Abu)	0,028
271312	cyklo (RTDLDSLR)	8
271578	cyklo (RTDLdSLR)	104
271579	cyklo (RTDLdALR)	12
272966	cyklo (RTDLdALR-GGG)	0,05

272967	cyklo	(RTDLdGLR-GGG)	0,15
272968	cyklo	(RTDLDALR-GGG)	0,14
272969	cyklo	(RTDLDGLR-GGG)	0,18
273028	cyklo	(RTDLdALR-Aha)	0,015
273033	cyklo	( RTDLdALR-Abu)	0,043
273038	cyklo	(RTDLdALR-Aha-Aha)	0,015
273040	cyklo	(RTDLdALR-Abu-Abu)	0,014
272971	cyklo	(RaDLdALR-GGG)	8,2

Nasledujúce príklady objasňujú farmaceutické prostriedky :

Príklad A.

Injekčné ampulky

Roztok 100 g cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu -Abu) a 5 g dinatriumhydrogénfosfátu v 3 1 dvakrát destilovanej vody aa nastaví 2n kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 6,5, sterilné sa šfiltruje a plní sa do injekčných ampuliek, lyofilizuje sa za sterilných podmienok a sterilné sa ampulky uzavrú. Každá injekčná ampulka obsahuje 5 mg účinnej látky.

Príklad B.

čipky ,

Roztaví sa zmes 20 g cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-LeuArg-Abu-Abu) s 100 g sójového lecitínu a 1400 g kakaového masla, vleje sa do formičiek a nechá sa vychladnúť. Každý čípok obsahuje 20 mg účinnej látky.

- 32 Príklad C.

Roztok

Pripraví sa roztok 1 g cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-AlaLeu-Arg-Abu-Abu), 9,38 g dihydrátu natriumdihydrogenfosfátu,

28,48 g dinatriumhydrogénfosfátu s 12 molekulami vody a 0,1 g benzalkonium-chloridu v 940 ml dvakrát destilovanej vody. Hodnota pH roztoku sa upraví na 6,8, doplní sa na jeden liter a steriluje sa ožiarením. Tento roztok sa môže používať ako očné kvapky.

Príklad D.

Masť

Zmieša sa 500 mg cyklo(Arg-Thr-Äsp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-ArgAbu-Abu) s 99,5 g vazelíny za aseptických podmienok.

Príklad E.

Tablety

Zo zmesi 1 kg cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-ArgAbu-Abu), 4 kg laktózy, 1,2 kg zemiakového škrobu, 0,2 kg mastenca a 0,1 kg stearátu horečnatého sa zvyčajným spôsobom vylisujú tablety tak, že každá tableta obsahuje 10 mg účinnej látky.

Príklady F.

I ' ‘ ¹ * ¹

Potiahnuté tablety

Podobne ako podľa príkladu E sa vylisujú tablety, ktoré sa potom zvyčajným spôsobom potiahnu povlakom zo sacharózy, zemiakového škrobu, mastenca, tragantu a farbiva.

Príklad G.

Kapsule , O sebe známym spôsobom sa plní do ¹ kapsulí z tvrdej želatíny 2 kg cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) tak, že každá kapsula obsahuje 20 mg účinnej látky.

Príklad H.

Ampula

Roztok 1 kg cyklo(Arg-Thr-Asp-leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-AbuAbu) v 60 1 dvakrát destilovanej vody sa sterilné sfiltruje a plní sa do ampulí, lyofilizuje sa za sterilných podmienok a sterilné sa ampule uzavrú. Každá ampula obsahuje 10 mg účinnej látky.

Príklad I.

Inhalačný sprej

Rozpustí sa 14 g cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-ArgAbu-Abu) v 10 1. izotonického roztoku chloridu sodného'a plní sa do bežných obchodných nádob na striekanie s pumpovým mechanizmom. Roztok sa môže striekať do úst alebo do nosu. Každý streknutie (približne 0,1 ml) zodpovedá dávke približne 0,14 mg.

Priemyselná využiteľnosť >

Peptidické zlúčeniny, ktoré ako ligand integrinu «ŕ sú vhodné na výrobu farmaceutických prostriedkov k ošetrovaniu chorôb založených na expresii a na patologickej funkcii integrinových receptorov.

- 34 TF ^>-2jdo2_

Claims

I * '

1. Deriváty cyklického peptídu obecného vzorca I cyklo(Arg-X¹-Asp-X²-X³-X^zl-X⁵-X^e-R^:1-) (I) kde znamená

X¹ Ser, Gly alebo Thr,

X² Leu, íle, Nie, Val alebo Phe,

X³ Asp, Glu, Lys alebo Phe,

X⁴ Gly, Ala alebo Ser,

X⁵ Leu, íle, Nie, Val alebo Phe,

X^e Arg, Har alebo Lys,

R¹ chýba alebo znamená jeden alebo niekoľko zvyškov óDaminókarboxylovej kyseliny, pričom zvyšok aminokarboxylovej kyseliny má dĺžku 500 až 2500 pm, pričom uvedené aminokyseliny môžu byť tiež derivatizované, vrátane D a L foriem a optický aktívnych aminokyselinových zvyškov a ich fyziologicky prijateľných solí a solvátov.
2. Deriváty cyklického peptídu obecného vzorca I cyklo( Arg-X^:L-Asp-X²-X³-X'¹-X⁵-X⁶-R^:L) (I) kde znamená

X¹ Ser, Gly alebo Thr, x² Leu, íle, Nie, Val alebo Phe, x³ Asp, Glu, Lys alebo Phe, x* Gly, Ala alebo Ser, x⁵ Leu, íle, Nie, Val alebo Phe, X® Arg, Har alebo Lys, R¹ chýba alebo znamená 1 až 10 aminokyselín volených zo súboru

zahrnujúceho Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Hcy, His, Hse, íle, Leu, Lys, Met, Pen, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val a H N-(CH CH 0) -(CH ) -COOH, kde znamená m, n vždy na sebe nezávisle O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, alebo 12, za podmienky, že m+n je väčšie ako 0.

pričom uvedené aminokyseliny môžu byť tiež derivatizované, vrátane D a L foriem a opticky aktívnych aminokyselinových zvyškov a ich fyziologicky prijateľných solí a solvátov.
3. Deriváty cyklického peptídu podľa nároku 1 alebo 2 zo súboru zahrnujúceho cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly) , cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Ala-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala~Leu-Arg-Abu-Abu), cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha-Aha), cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha), cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aee), cyklo (Arg-^Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), cyklo(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-.-Ala), cyklo(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-.-Ala), a ich fyziologicky prijetaľné soli.
4. Deriváty cyklického peptídu obecného vzorca I podľa nároku la 2a zlúčeniny podľa nároku 3 a ich fyziologicky prijateľné soli a solváty ako liečiva.
5. Liečiva podľa nároku 4 ako inhibítory na ošetrovanie chorôb, ktoré sú založené na expresii a na patologickej funkcii
6. Liečiva podľa nároku 5 na ošetrovanie trombóz, srdcového infarktu, koronárnych chorôb srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, fibróz, zápalov, infekcií, psoriázy a tiež k ovplyvneniu hojenia rán.
7. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň jedno liečivo podľa nároku 5 a 6 a poprípade nosič alebo pomocnú látku a poprípade iné účinné látky.

•
8. Použitie derivátov cyklického peptídu podľa nároku 1 až 3 alebo ich fyziologicky prijateľných solí na výrobu liečiva k ošetrovaniu chorôb, ktoré sú založené na expresii a patologickej funkcii &ζ /3 integr í nových receptorov.

V é
9. Použitie derivátov cyklického peptídu podľa nároku 8 na výrobu liečiva na ošetrovanie koronárnych chorôb srdca, osteoporózy, fibróz, zápalov, k ovplyvneniu hojenia rán.

trombóz, srdcového infarktu, artériosklerózy, nádorov, infekcií, psoriázy a tiež