ES2355094T3 - Inhibidores de furina para uso en el tratamiento de fibrosis y cicatrización. - Google Patents

Abstract

El uso de un inhibidor furina en la fabricación de un medicamento para reducir la cicatrización durante la curación de heridas o reducir la fibrosis en el tratamiento de afecciones fibróticas en donde el medicamento se aplica tópicamente al sitio de una herida o trastorno fibrótico.

Description

La presente invención se relaciona con curación de heridas y también con la regulación de la fibrosis en el tratamiento de afecciones en las que la fibrosis es un mecanismo principal de reparación de tejido o en donde la fibrosis excesiva conduce a trastornos patológicos y malfuncionamiento del tejido.

La curación de heridas en los adultos es un proceso de reparación complicado. El término "herida" como se utiliza aquí se ejemplifica por, pero no se limita a, lesiones a la piel. Otros tipos de heridas pueden involucrar daño, lesión o trauma en un tejido interno u órgano tal como el pulmón, riñón, corazón, intestino, tendones o hígado.

El proceso de curación en las heridas de la piel empieza típicamente con una respuesta hemostática que se inicia por daño a los vasos sanguíneos en la piel. Durante este proceso las plaquetas y un número de factores presentes en la sangre contribuyen a la formación de un coágulo que evita la pérdida adicional de sangre. Los factores liberados durante este proceso, particularmente mediante la desgranulación de las plaquetas, origina luego la incorporación de una variedad de células especializadas en el sitio de la herida que a su vez se involucran en la matriz extracelular y deposición de membrana de fondo, angiogenia, actividad proteasa selectiva y re-epitelización. Un componente importante del proceso de curación en mamíferos adultos es la estimulación de fibroblastos para generar la matriz extracelular. Esta matriz extracelular constituye un componente principal del tejido conectivo que desarrolla la reparación del área de la herida.

El tejido conectivo que se forma durante el proceso de curación es frecuentemente fibroso en la naturaleza y comúnmente se forma en una cicatriz de tejido conectivo (un proceso conocido como fibrosis).

Una cicatriz es una estructura morfológica anormal que resulta de una lesión o herida previa (por ejemplo una incisión, corte o trauma). Las cicatrices se componen de un tejido conectivo que es predominantemente una matriz de colágeno tipos 1 y 3 y fibronectina. La cicatriz puede consistir de fibras de colágeno con una organización anormal (como se ve en las cicatrices de la piel) o este puede ser una acumulación anormal de tejido conectivo (como se ve en las cicatrices del sistema nervioso central). La mayoría de las cicatrices consisten de colágeno organizado anormalmente y también exceso de colágeno. En el hombre, en la piel, las cicatrices se pueden deprimir por debajo de la superficie o se elevan por encima de la superficie de la piel. Las cicatrices hipertróficas representan una forma severa de cicatrización normal. Ellas se elevan por encima de la superficie normal de la piel y contienen colágeno excesivo dispuesto en un patrón anormal. Los queloides son otra forma de cicatrización patológica en la que la cicatriz no solo se eleva por encima de la superficie de la piel sino también se extiende entre los límites de la lesión original. En un queloide existe tejido conectivo excesivo que se organiza en una forma normal predominantemente en remolinos de tejido colagenoso. Existen predisposiciones genéticas para la formación de las cicatrices hipertróficas y queloides. Estas formas aberrantes de cicatrización son particularmente comunes en las razas Afro-Caribeñas y Mongoloides.

Existen muchos casos en donde la regulación de la formación de cicatriz es de importancia primaria cuando se considera el resultado de la curación de heridas. Ejemplos de tales situaciones son las cicatrices de la piel en donde la cicatrización excesiva puede ser perjudicial para la función del tejido, particularmente en contextos en donde ocurre contractura de la cicatriz (por ejemplo quemaduras de la piel y heridas que lesionan la flexibilidad de una articulación). La reducción de la cicatrización de la piel cuando son importantes las consideraciones cosméticas también es altamente deseable. En la piel las cicatrices hipertróficas y queloides pueden originar deterioro funcional y cosmético y existe una necesidad de evitar su ocurrencia. La cicatrización que resulta de los injertos de la piel en los sitios del donante y de la aplicación de piel artificial también puede ser problemático y necesita evitarse o ser minimizado.

Así como también las cicatrices de la piel, la cicatrización interna o fibrosis puede ser altamente perjudicial y los ejemplos específicos incluyen:

(i)

Dentro del sistema nervioso central, la cicatrización glial puede evitar la reconexión neuronal (por ejemplo luego de neurocirugía o lesiones penetrantes del cerebro).

(ii)

La cicatrización en el ojo puede ser perjudicial. En la córnea, la cicatrización puede resultar en opacidad anormal y conduce a problemas con la visión o aún ceguera. En la retina, la cicatrización puede originar pandeo o separación retinal y ceguera posterior. La cicatrización luego de curación de heridas en operaciones alivia la presión en glaucoma (por ejemplo cirugía de filtración de glaucoma) resulta en la falla de la cirugía en donde el humor acuoso falla en drenar y allí regresa el glaucoma.

(iii) La cicatrización en el corazón (por ejemplo luego de cirugía o infarto del miocardio) puede surgir en función cardiaca anormal.

(iv) Las operaciones que involucran el abdomen o pelvis resultan frecuentemente en adhesión entre las vísceras. Por ejemplo, las adhesiones entre los elementos del intestino y la pared corporal se puede formar y origina deformación en el buble del intestino que conduce a isquemia, gangrena y la necesidad de tratamiento de emergencia (los no tratados aún pueden ser fatales). De forma similar, el trauma o las incisiones en los intestinos pueden conducir a la cicatrización y contracturas de cicatriz en las estructuras que originan la oclusión del lumen de los intestinos que de nuevo pueden ser potencialmente letales.

(v) La cicatrización en la pelvis en la región de las trompas de falopio puede conducir a infertilidad.

(vi) La cicatrización luego de lesión a los músculos puede resultar en contracción anormal y así pobre función muscular.

(vii) Cicatrización o fibrosis luego de lesión a tendones y ligamentos puede resultar en pérdida seria de la función.

Relacionado a lo anterior es el hecho que existen un número de afecciones médicas conocidas como trastornos fibróticos en los que la fibrosis excesiva conduce a trastorno patológico y malfuncionamiento del tejido. Los trastornos fibróticos se caracterizan por la acumulación del tejido fibroso (predominantemente colágenos) en una forma anormal dentro del tejido. La acumulación de tales tejidos fibrosos puede resultar de una variedad de procesos de enfermedad. Estas enfermedades no tienen necesariamente que ser originados mediante cirugía, lesión traumática o heridas. Los trastornos fibróticos son usualmente crónicos. Ejemplos de trastornos fibróticos incluyen cirrosis del hígado, fibrosis de hígado, glomerulonefritis, fibrosis pulmonar, escleroderma, fibrosis del miocardio, fibrosis luego de infarto del miocardio, fibrosis del sistema nervioso central luego de una apoplejía o trastornos neurodegenerativos (por ejemplo Enfermedad de Alzheimer), vitreoretinopatía proliferativa (PVR), reestenosis (por ejemplo luego de angioplastia) y artritis. Existe por lo tanto también una necesidad de medicamentos que se pueden utilizar para el tratamiento de tales afecciones mediante fibrosis/cicatrización regular (es decir evitar, inhibir o reversar) en estos trastornos fibróticos.

Aunque las consideraciones anteriores aplican principalmente a afecciones, trastornos o enfermedades del hombre se apreciará que la curación de heridas, cicatrización y trastornos fibróticos también puede ser problemático en otros animales, particularmente animales veterinarios o domésticos (por ejemplo caballos, ganado, perros, gatos etc.). Por ejemplo las heridas o adhesiones abdominales son una de las razones principales de tener que sacrificar caballos (particularmente caballos de raza), como lo son daño de tendón y ligamento que conduce a cicatrización o fibrosis.

Existen varios desarrollos recientes en los campos de la curación de heridas, cicatrización y trastornos fibróticos. Algunos de estos acontecimientos giran en torno al entendimiento reciente de que una disposición de citoquinas y los factores de crecimiento se involucran íntimamente en la reparación del tejido herido. En particular, los miembros de la superfamilia de Factor de Crecimiento Transformante Factor β (TGF-β) se ha encontrado que juegan un papel importante en la curación de heridas. Por lo menos se conocen 25 moléculas que son miembros de la superfamilia TGF-β. Estos incluyen un número de citoquinas tal como TGF-β 1 a 5, el grupo DVR (por ejemplo dpp y Vg1), Proteínas Morfogenéticas Óseas, Nodal, Activina e Inhibina.

Los TGF-β se secretan frecuentemente de las células en una forma inactiva conocida como TGF-β latente. El TGF-β latente consiste de un Péptido Asociado a Latencia de terminal N (LAP) y el TGF-β y también denominado como el Complejo Latente Pequeño. Adicionalmente el Complejo Latente Pequeño se puede unir a otro péptido (derivado de un gen diferente) de tamaño variable denominado Proteína de Unión Latente TGF-β (LTBP) en cuyo caso se conoce el complejo completo como el Complejo TGF-β Latente Grande.

El TGF-β latente se activa cuando el TGF-β se origina para ser disociado del LAP. Esta disociación se puede coordinar en un receptor de factor II de Crecimiento similar a manosa-6-fosfato/Insulina (M6P-R) e involucra proteasas tal como plasmina, los sustratos se asocian a la superficie celular mediante transglutaminasa de tejido. Los radicales libres y las especies reactivas a oxígeno también pueden activar TGF-β al originar disociación del LAP.

El TGF-β (particularmente TGF-β1 y TGF-β2) promueve la curación de heridas pero también se asocia con la formación de cicatriz y fibrosis incrementada. El interés clínico en la modulación de TGF-β se ha asociado con inhibir su actividad con el fin de reducir la formación de cicatriz (aunque este puede comprometer el índice curación de heridas). Por ejemplo, la WO 92/17206 describe agentes neutralizantes que inhiben la actividad de TGF-β1 y TGF-β2 y son particularmente benéficos para reducir la formación de cicatriz.

Otro desarrollo involucra el uso de manosa-6-fosfato para uso en tratar trastornos fibróticos asociados con la acumulación de la matriz extracelular y con niveles elevados de los Factores de Crecimiento Transformantes β1 o β2 (GB-A-2,265,310). Se considera que la manosa-6-fosfato interfiere con la conversión de formas latentes de estos Factores de Crecimiento Transformantes en su forma activa.

A pesar de tales avances permanece una necesidad de continuar desarrollando medicamentos que se pueden utilizar para modular la curación de heridas, cicatrización y fibrosis. En particular existe una necesidad de medicamentos que no comprometen el índice de curación de heridas o calidad de cicatriz a favor de uno u otro.

Como se discute más completamente adelante, la invención se relaciona en su aspecto más amplio con el uso de inhibidores convertasa para el tratamiento de heridas.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención existe el uso provisto de un inhibidor convertasa en la fabricación de un medicamento para reducir la cicatrización durante la curación de heridas o reducir fibrosis en el tratamiento de afecciones fibróticas en donde el medicamento se aplica tópicamente al sitio de una herida o trastorno fibrótico.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, existe una composición provista que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor convertasa y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el tratamiento de heridas o fibrosis.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, existe un método provisto para uso en la reducción o prevención de la cicatrización durante la curación de heridas; o reduce o evita la fibrosis en el tratamiento de afecciones fibróticas que comprende administrar tópicamente a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor convertasa.

Las convertasas son una familia de proteasas serina dependientes de Ca2+, conocido de otra forma como SPC (convertasas proproteína similares a subtilisina; ver Dubois et al., 1995, Journ. Biol. Chem., 270(18):1061810624;Sha,X., et al., 1989, Mol. Endocrinology, 3: 1090-1098; Chan, S.J., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6678-6682; y referencias allí). Los inventores han encontrado que la enzima convertasa furina se involucra particularmente en la activación de TGF-β latente maduro en el sitio de una herida o trastorno fibrótico. Aunque los inventores no esperan estar vinculados mediante cualquier hipótesis ellos consideran que la actividad convertasa es capaz de estimular indirectamente la activación de TGF-β al modificar la actividad de otras enzimas con propiedades activantes TGF-β. Los inventores consideran que la actividad convertasa contribuye a la activación TGF-β que ocurre inicialmente intracelularmente, dentro de la plaqueta, y luego continúa extracelularmente cuando los contenidos de plaqueta se liberan en desgranulación. De acuerdo con lo anterior, se considera que los inhibidores convertasa utilizados de acuerdo con la presente invención modifican la actividad de esta enzima de tal manera que se reduce la activación de TGF-β.

Para los propósitos de las referencias especificadas en la actividad intracelular también se debe tomar que abarca la actividad dentro de las membranas de los fragmentos celulares, tal como las plaquetas, excepto en donde el contexto requiera otra cosa.

Los inventores consideran que las convertasas que se involucran en la activación de TGF-β son convertasas proproteína similares a furina. Las furinas comprenden una familia de siete convertasas proproteína de transmembrana producidas como un precursor inactivo. Ellos se pueden activar intracelularmente, y se involucran en el procesamiento preproteína en la red trans-Golgi, en la superficie celular, extracelularmente y en endosomas. Las furinas tienen su efecto en sitios de división que contienen arginina, el sitio mínimo es Arg-X-X-Arg. Relevant reviews include Molloy et al 1999; Shapiro et al. 1997 (J. Histochem. Cytochem. 45:3-12) y Pearton et al. 2001 (Experimental Dermatology 10:193-203).

Las plaquetas son una fuente principal de TGF-β en la circulación y liberación de TGF-β latente cuando se activa la plaqueta (por ejemplo en respuesta a la lesión). Durante el proceso de curación, se pueden encontrar varias formas de TGF-β que están en el sitio de una herida o sitio de un trastorno fibrótico. Estas diferentes formas son TGF-β activo (que está en su forma libre), el Complejo Latente Pequeño (péptido asociado a latencia TGF-β), y el complejo latente grande (proteína de unión TGF-β latente de péptido asociado a latencia TGF-β). Los diferentes complejos experimentan diferentes destinos y desarrollan diferentes papeles durante el proceso de curación. En particular, se activan los complejos latentes grandes y pequeños al dividir con el fin de liberar el TGF-β activo mientras ocurre el proceso de curación.

La técnica anterior sugiere que la división de los complejos latentes grandes y pequeños en un sitio de herida se media mediante plasmina. Adicionalmente, se considera que las convertasas tal como furina son responsables para el procesamiento intracelular de pro-TGF-β dentro de megacariocitos (que surge a las plaquetas) en la médula ósea. Este procesamiento de pro-TGF-β involucra la división y pliegue de la proproteína para producir la forma madura. La forma madura no se produce, sin embargo, el TGF-β “activo”, y se puede asociar con los complejos latentes grande y pequeño. De acuerdo con lo anterior las convertasas no han jugado previamente un papel en parte a la activación del TGF-β latente (tal como TGF-β en el Complejo Latente Pequeño) de las plaquetas en la sangre en el sitio de una herida o trastorno fibrótico.

Sin embargo, los inventores han establecido (como se describe en más detalle en el Ejemplo) que, sorprendentemente, la actividad de las enzimas convertasa tal como furina efectúa la activación extracelular de TGFβ en el sitio de una herida. Por lo tanto al inhibir la actividad de las enzimas convertasa en el sitio de una herida o en el sitio de un trastorno fibrótico es posible reducir la cantidad de TGF-β activo en tal un sitio y por lo tanto reduce la cicatrización y/o fibrosis. Es interesante notar que esta actividad de convertasas parece ocurrir intracelularmente y extracelularmente. Adicionalmente la actividad no parece estar asociada con, o controlada por, regulación transcripcional (en contraste con la actividad convertasa conocida en células tal como megacariocitos) y así es capaz de tener lugar en la plaqueta anuclear, o aún extracelularmente.

La observación novedosa que involucran las enzimas convertasa en la activación de TGF-β está en contraste con el papel previamente reportado de estas enzimas en el procesamiento y maduración de TGF-β, y abre un rango de posibilidades terapéuticas que no se han previsto anteriormente.

Aunque la técnica anterior reconoce que las plaquetas contienen TGF-β latente este no proporciona indicación que es posible evitar la activación de TGF-β al inhibir la actividad convertasa.

En cambio, la técnica anterior sugiere que los inhibidores de convertasa son capaces de inhibir el procesamiento y maduración que produce TGF-β latente. Esta actividad de convertasas se regula transcripcionalmente. Así la persona experta reconocerá que una vez está presente el TGF-β latente en convertasas de inhibidor de plaqueta circulante no sería capaz de influenciar su estado.

Solo con la presente invención se puede ver que los inhibidores convertasa son capaces de evitar la activación, y los efectos indeseados, de este TGF-β latente óseo de plaqueta en el sitio de una herida.

La eficacia de inhibidores convertasa para reducir la cicatrización o fibrosis se mejora por el hecho que los TGF-β latentes liberados por las plaquetas se compone casi completamente de TGF-β1 (asociado con el Complejo Latente Pequeño). Es bien conocido que el TGF-β1 es un factor clave en la curación de heridas y su pro-fibrótico favorece la formación de cicatriz. La preponderancia de la isoforma pro-fibrótica TGF-β durante las fases tempranas de curación de heridas (que origina afecciones locales que favorecen la formación de cicatriz y fibrosis) está en gran medición debido a la liberación del factor de crecimiento mediado por plaqueta. Con el tiempo la relación de las isoformas TGF-β cambia cuando se reducen los niveles de TGF-β1 derivados de plaqueta y existe un incremento en los niveles de TGF-β3 antifibrótico derivado de fibroblastos. Evitar la activación del TGF-β1 latente de acuerdo con la presente invención puede por lo tanto reducir dramáticamente el grado de cicatrización asociado con curación de heridas.

El inhibidor convertasa es un inhibidor de furina.

Ele inhibidor convertasa puede ser un inhibidor de proteasa serina y es preferiblemente un inhibidor tiol. El inhibidor tiol puede ser una cloroalquilcetona peptidilo que tiene un grupo funcional de péptido que imita por lo menos un sitio de división de enzima convertasa. Se ha encontrado que los cloroalquilcetona peptidilos con grupos funcionales de péptido que imitan el sitio de división de enzima convertasa son inhibidores específicos de la actividad enzimática. Un inhibidor preferido es decanoil- RVKR-cmk y sus derivados.

Alternativamente y/o adicionalmente, el inhibidor convertasa puede secuestrar Ca2+. Adicionalmente un secuestrante Ca2+ (tal como EDTA o EGTA) se puede utilizar en conjunto con inhibidores tal como aquellos mencionados anteriormente.

Los inventores han establecido que las enzimas convertasa actúan, extracelularmente y intracelularmente, para originar la activación del TGF-β latente en el espacio extracelular en el sitio de una herida o una afección fibrótica. Esto los lleva a darse cuenta que posible a utilizar inhibidores convertasa aplicados tópicamente para evitar la activación de TGF-β latente asociado con curación de heridas o fibrosis. La técnica anterior sugiere que la actividad de convertasas tal como furina tiene lugar en los megacariocitos en la médula ósea que se eleva a las plaquetas, y se limita esta actividad en el procesamiento que produce TGF-β latente. De acuerdo con lo anterior la técnica anterior no contiene enseñanza que sugiera que la inhibición local de la actividad furina inhibirá la conversión de TGF-β latente para activar TGF-β. Adicionalmente la técnica anterior sugiere que la manipulación terapéutica de furina requeriría un agente que se puede suministrar a, y alcanzar su acción en, la médula ósea.

El hallazgo sorprendente que la actividad de convertasa extracelular contribuye a la activación de TGF-β lleva a los inventores a darse cuenta que se pueden utilizar inhibidores convertasa solubles en agua para reducir la activación de TGF-β, y así reduce la cicatrización. El uso de inhibidores solubles en agua, que no puede penetrar la membrana celular, es particularmente ventajoso ya que tales inhibidores exhiben generalmente bajos niveles de citotoxicidad. Los inhibidores convertasa solubles en agua también se pueden formular fácilmente en composiciones que inducen las reacciones inflamatorias mínimas, una consideración importante cuando se diseñan agentes anticicatrización. Un inhibidor convertasa soluble en agua preferido adecuado para uso de acuerdo con la invención es L-hexaarginina.

Los efectos de inhibición localizada de actividad convertasa son muy diferentes de aquellos que se elevarían como un resultado de la administración sistémica de inhibidores convertasa. Aún una persona experta sugiere que el uso sistémico de inhibidores convertasa reduciría indirectamente los niveles de TGF-β activo al inhibir el procesamiento de pro-TGF-β en la médula ósea ellos también entenderán que tal un método tendría un número de efectos perjudiciales. Un tal efecto sería que la administración sistémica de inhibidores convertasa también reduciría el nivel de TGF-β3 antifibrótico que es importante en las últimas etapas de curación de heridas. Un segundo problema es que el uso sistémico de inhibidores convertasa tendría efectos perjudiciales, y posiblemente tóxicos, debido a que se involucran convertasas en el procesamiento normal de proteínas diferentes a TGF-β.

Ninguna de estas desventajas es aplicable a la aplicación tópica de inhibidores convertasa de acuerdo con la invención. En este uso el efecto de inhibidores se dirige a la región de la herida, o el sitio de fibrosis, y la administración de los inhibidores puede ser programado para que solo se afectan las cantidades iniciales del TGF-β liberado de las plaquetas.

Como se estableció anteriormente, los inventores consideran que la actividad convertasa que contribuye a la activación de TGF-β se inicial dentro de las plaquetas, y que la actividad convertasa extracelular ocurre como un resultado de convertasas que se liberan en el espacio extracelular en desgranulación de las plaquetas. Como un resultado, los inhibidores de actividad convertasa para uso de acuerdo con la invención pueden ser inhibidores que son capaces se cruzar la membrana celular y actuar intracelularmente. Tales inhibidores son capaces de reducir la actividad convertasa antes de desgranulación. Ellos pueden ser capaces de reducir la activación TGF-β que ocurre intracelularmente y extracelularmente. Ya dicho, parece que la mayoría de actividad convertasa contribuye a la activación de TGF-β extracelularmente después de desgranulación de plaqueta. Así se pueden utilizar inhibidores solubles en agua para reducir efectivamente la activación de TGF-β y así reducir la cicatrización y/o fibrosis.

En una realización preferida de la invención el medicamento que contiene el inhibidor convertasa se puede aplicar profilácticamente. Así el medicamento se puede aplicar al sitio en donde se puede formar una herida o puede ocurrir fibrosis (por ejemplo cirugía electiva anterior).

Los inventores encuentran que los inhibidores de acuerdo con la presente invención son altamente adecuados para aplicación tópica a heridas dérmicas o afecciones fibróticas dérmicas.

Los inhibidores convertasa utilizados de acuerdo con la invención pueden ser proteínas o tienen componentes peptidilo. Tales proteínas se pueden modificar fácilmente (por ejemplo mediante la adición, sustitución

o eliminación de aminoácido) para formar derivados que retienen la capacidad de inhibir enzimas tal como furina. Por lo tanto los derivados que retienen las características funcionales de proteínas de ocurrencia natural también son los inhibidores preferidos de la invención. Ejemplos de tales derivados incluyen fragmentos funcionalmente activos de proteínas de ocurrencia natural y aún precursores de proteínas de ocurrencia natural (por ejemplo proproteínas) que se activan in situ.

Se pueden utilizar inhibidores convertasa de acuerdo con la invención en situaciones o afecciones en donde la cicatrización necesita ser requerida o reducida tal como:

(i) en donde las cicatrices de la piel pueden ser excesivas y/o perjudiciales para la función del tejido y particularmente cuando ocurre contractura de cicatriz o puede ocurrir (por ejemplo quemaduras y heridas de la piel que deterioran la flexibilidad de una articulación y particularmente cicatrización en niños);

(ii) cicatrización a la piel cuando son importantes las consideraciones cosméticas;

(iii) cuando pueden ocurrir cicatrices hipertróficas o queloides (particularmente en las razas Afro-Caribeñas y Mongoloides) que pueden originar deterioro cosmético y funcional;

(iv)

cicatrización que resulta de injertos de piel en los sitios donantes y de la aplicación de piel artificial;

(v)

cicatrización dentro del sistema nervioso central (por ejemplo luego de neurocirugía o lesiones penetrantes del cerebro), por ejemplo cicatrización glial puede evitar la reconexión de varias neuronas;

(vi)

cicatrización en el ojo y particularmente de la cornea (la cicatrización puede resultar en opacidad anormal y conducir a problemas con la visión o aún ceguera), en la retina (la cicatrización puede originar pandeo o separación retinal y ceguera posterior) y la cicatrización luego de curación de heridas en operaciones alivia la presión de glaucoma (por ejemplo cirugía de filtración de glaucoma) que puede resultar en la falla de la cirugía por lo que el humor acuoso falla en drenar y por lo tanto regresa el glaucoma;

(vii) cicatrización en el corazón (por ejemplo luego de cirugía o infarto del miocardio) que puede surgir de la función cardiaca anormal;

(viii) puede ocurrir la cicatrización del intestino tal como luego de operaciones que involucran el abdomen o pelvis que resulta en adhesión entre vísceras (adhesiones entre elementos del intestino y la pared corporal se puede formar y produce torsión en el asa intestinal que conduce a isquemia, gangrena y la necesidad de tratamiento de emergencia –no tratado aún puede ser fatal); de forma similar, trauma o incisiones a los intestinos pueden conducir a cicatrización y contractura o estenosis de cicatriz que origina oclusión del lumen de los intestinos que de nuevo puede ser letal;

(ix)

cicatrización en la pelvis en la región de las trompas de falopio que pueden conducir a infertilidad;

(x)

cicatrización luego de lesión en los músculos que puede resultar en contracción anormal y por lo tanto pobre función muscular;

(xi)

cicatrización o fibrosis luego de lesión a tendones y ligamentos que puede resultar en pérdida seria de la función.

También se pueden utilizar inhibidores para el tratamiento o prevención de fibrosis. Por ejemplo se pueden utilizar los compuestos para tratar trastornos fibróticos tal como cirrosis del hígado, hígado fibrosis, glomerulonefritis, fibrosis pulmonar, escleroderma, hibernación del miocardio, fibrosis luego de infarto del miocardio, fibrosis del sistema nervioso central luego de una apoplejía o trastornos neurodegenerativos (por ejemplo Enfermedad de Alzheimer), vitreoretinopatía proliferativa (PVR), reestenosis y artritis.

Los inhibidores convertasa son útiles para reducir o evitar fibrosis en enfermedades fibróticas y para reducir o evitar la formación de fibrosis que se manifiesta como cicatrización hipertrófica (particularmente de la piel) o queloides.

Las composiciones de curación de heridas utilizadas de acuerdo con la invención pueden tomar un número de formas diferente que dependen, en particular de la forma en la que ellos se utilizan. Así, por ejemplo, ellos pueden estar en la forma de un líquido, ungüento, crema, gel, hidrogel, polvo o aerosol. Todas tales composiciones son adecuadas para aplicación tópica a la piel, que es un medio preferido de administrar inhibidores convertasa a un sujeto (persona o animal) en necesidad de tratamiento.

Los inhibidores convertasa se pueden proporcionar en un apósito estéril o parche que se puede utilizar para cubrir o aún cubrir la herida a ser tratada.

Una composición preferida de la invención puede estar en la forma de una solución inyectable (por ejemplo para inyección intradérmica alrededor de los márgenes de una herida o un sitio herido).

Se apreciará que el vehículo de la composición de la invención debe ser uno que es bien tolerado por el paciente y permite la liberación del inhibidor convertasa activo a la herida. Tal un vehículo es preferiblemente biodegradable, bioreabsorbible y/o no inflamatorio.

La composición de la invención se puede utilizar en un número de formas. Así, por ejemplo, se puede aplicar una composición en, y/o alrededor de una herida de un paciente para regular la curación de heridas. Si la composición es para ser aplicada a una herida "existente", entonces el vehículo farmacéuticamente aceptable será uno que es relativamente "moderado" es decir un vehículo que es biocompatible, biodegradable, bioreabsorbible y no inflamatorio.

También es posible utilizar composiciones de acuerdo con la invención antes de cirugía (particularmente cirugía electiva) con el fin de proporcionar la regulación de curación de la herida quirúrgica formada posteriormente. En este caso el vehículo de la composición tópicamente aplicada puede necesitar ser uno capaz ir cruzado en la capa queratinosa de la piel. Ejemplos de vehículos adecuados para este propósito incluyen dimetil sulfóxido y ácido acético. Tal uso profiláctico es un uso preferido de inhibidores convertasa de acuerdo con la invención.

Las composiciones son adecuadas para ser utilizadas para reducir o controlar la cicatrización que resulta de operaciones quirúrgicas en el ojo (por ejemplo cirugía láser en la cornea). En este caso la composición o medicamento puede estar en la forma de gotas para ojos.

Los inhibidores convertasa se pueden utilizar en un rango de aplicaciones de curación de heridas internas. Así por ejemplo, la composición se puede formular para inhalación para uso en curación de heridas de los pulmones

o para la prevención o tratamiento de fibrosis y estenosis en el pulmón.

Se apreciará que la cantidad de un inhibidor convertasa a ser aplicado en el sitio de la herida depende de un número de factores tal como la actividad biológica y biodisponibilidad del compuesto, que a su vez depende del modo de administración y las propiedades fisicoquímicas del inhibidor. Otros factores puede incluir:

A) La vida útil del inhibidor en el sujeto a ser tratado.

B) La afección específica a ser tratada.

C) La edad del sujeto.

La frecuencia de administración también se influenciará por los factores mencionados anteriormente y particularmente la vida útil del inhibidor convertasa dentro del sujeto a ser tratado.

Generalmente cuando se utilizan composiciones para tratar heridas o trastornos fibróticos existente el inhibidor convertasa se debe administrar tan pronto como ocurre la herida o ha sido diagnosticado el trastorno. La terapia con la composición debe continuar hasta que la herida haya curado a satisfacción del médico o, en el caso de un trastorno fibrótico, se haya suprimido el riesgo u originen de la formación de tejido fibroso anormal.

Las composiciones que modulan la cicatrización y/o trastornos fibróticos también se debe aplicar a una herida tan pronto como sea posible después que se ha formado la herida. Sin embargo se pueden desarrollar cicatrices y fibrosis durante los días o aún semanas. Por lo tanto el sujeto a ser tratado se puede beneficiar bien mediante la administración de un inhibidor convertasa aún si este se administra días o aún semanas después de que ocurra la herida o el trastorno desarrollado (o se diagnostica).

Cuando se utiliza como profiláctico (por ejemplo antes de cirugía o cuando existe un riesgo de desarrollar un trastorno fibrótico) los inhibidores convertasa se deben administrar tan pronto cuando se ha reconocido el riesgo de fibrosis indeseable. Por ejemplo, una crema o ungüento que contiene un inhibidor convertasa se puede aplicar a un sitio en la piel de un sujeto en donde la cirugía electiva se desarrolla y se desea posteriormente la reducción de formación de cicatriz. En este caso, se puede aplicar la composición durante la preparación preoperativa del sujeto o aún puede ser deseable aplicar la composición en las horas o días que preceden la cirugía (dependiendo del estado de salud y edad del sujeto así como también el tamaño de la herida a ser formada).

La frecuencia de administración dependerá de la vida útil biológica del inhibidor utilizado. Típicamente una crema o ungüento que contiene un inhibidor convertasa se debe administrar a un tejido objetivo de tal manera que la concentración del inhibidor en el sitio de la herida o tejido afectado por una afección fibrótica se mantienen en un nivel adecuado por tener un efecto terapéutico. Esto puede requerir la administración diaria o aún varias veces al día.

Los procedimientos conocidos, tal como aquellos empleados convencionalmente por la industria farmacéutica (por ejemplo experimentación in vivo, ensayos clínicos etc.), se pueden utilizar para establecer las formulaciones específicas de composiciones y regímenes terapéuticos precisos (tal como dosis diarias del inhibidor convertasa y la frecuencia de administración).

Generalmente, las composiciones para uso de acuerdo con la invención se deben formular de tal manera que cuando se administra al sitio de una herida o sitio de un trastorno fibrótico que se logra en el sitio una concentración de inhibidor de entre 0.01 mM y 10mM.

Únicamente por vía de ejemplo una solución inyectable que contiene entre 0.1mM y 10mM de decanoilRVKR-cmk es adecuado para aplicación a una herida existente (es decir "abierto").

Una dosis diaria adecuada de un compuesto que inhibe la actividad convertasa depende de los factores discutidos anteriormente así como también del tamaño de la herida, o cantidad del tejido efectuado por la fibrosis, a ser tratado. Típicamente la cantidad de un inhibidor convertasa requiere el tratamiento de heridas o trastornos fibróticos que estarán dentro del rango de 0.01mg a 100mg del compuesto activo/ 24 horas dependiendo del tamaño de la herida o el grado de fibrosis contra varios otros factores.

También se apreciará que se pueden aislar inhibidores convertasa sintetizados químicamente o naturales.

Muchos métodos conocidos para administrar inhibidores convertasa a un tejido relevante tienen la desventaja que puede ser difícil alcanzar niveles sostenidos del inhibidor convertasa activo en el sitio de una herida

o sitio de fibrosis sobre el curso de aún unos pocos días debido a que los inhibidores convertasa pueden tener vidas útiles cortas in vivo. Las vidas útiles de los inhibidores convertasa pueden ser cortas por un número de razones que incluyen:

(i)

Degradación mediante proteasas y similares.

(ii)

Depuración mediante proteínas de unión (por ejemplo macroglobulina α2).

(iii) Unión e inhibición de la actividad de agente mediante las moléculas de matriz extracelular tal como decorina y fibronectina.

Adicionalmente, los compuestos para la curación de heridas y/o el tratamiento de la cicatrización / fibrosis necesitan ser administrados en un vehículo adecuado y se proporcionan frecuentemente como una composición que comprende el compuesto y el vehículo. Como se destacó anteriormente, tales vehículos son preferiblemente no inflamatorios, biocompatibles, bioreabsorbibles y no pueden degradar o inactivar el compuesto activo (en almacenamiento o en uso). Sin embargo, puede ser frecuentemente difícil proporcionar un vehículo satisfactorio para suministrar compuestos específicos a un tejido a ser tratado.

Una forma conveniente en la que se pueden obviar estos problemas o mitigar es para proporcionar en el sitio de una herida (o sitio de fibrosis) una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína o inhibidor convertasa de péptido mediante terapia de gen.

Los sistemas de suministro son altamente adecuados para alcanzar niveles sostenidos de un inhibidor convertasa en el sitio de una herida o sitio de fibrosis durante un periodo mayor de tiempo que es posible para la mayoría de sistemas de suministro convencionales. Se puede expresar continuamente la proteína de células en el sitio de herida o sitio de fibrosis que se ha transformado con la molécula de ADN de la invención. Por lo tanto, aún si la proteína tiene una vida útil muy corta como un agente in vivo, las cantidades terapéuticamente efectivas de la proteína se puede expresar continuamente desde el tejido tratado.

Adicionalmente, el sistema de suministro se puede utilizar para proporcionar la molécula de ADN (y por lo tanto la proteína que es un agente terapéutico activo) sin la necesidad de utilizar vehículos farmacéuticos convencionales tal como aquellos requeridos en ungüentos o cremas que se ponen en contacto con la herida.

El sistema de suministro es de tal manera que la molécula de ADN es capaz de ser expresada (cuando el sistema de suministro se administra a un paciente) para producir una proteína que tiene directamente o indirectamente actividad para curación de heridas y/o tratamiento de fibrosis o cicatrización al inhibir la actividad convertasa. Por "directamente" significa que el producto de expresión de gen per se tiene la actividad requerida para curación de heridas y/o regular fibrosis o cicatrización. Por "indirectamente" significamos que el producto de la expresión de gen experimenta o media (por ejemplo como una enzima) por lo menos una reacción adicional para proporcionar un agente efectivo para curación de heridas y/o regular fibrosis o cicatrización al inhibir la actividad convertasa.

La molécula de ADN se puede contener dentro de un vector adecuado para formar un vector recombinante. El vector por ejemplo puede ser un plásmido, cósmido o fago. Tales vectores recombinantes son altamente útiles en el suministro de los sistemas de la invención para transformar células con la molécula de ADN.

Los vectores recombinantes también pueden incluir otros elementos funcionales. Por ejemplo, se pueden diseñar vectores recombinantes de tal manera que el vector replicará automáticamente en el núcleo de la célula. En este caso, los elementos que inducen la replicación de ADN pueden requerir en el vector recombinante. Alternativamente el vector recombinante se puede diseñar de tal manera que el vector y la molécula de ADN recombinante se integra en el genoma de una célula. En este caso son deseables las secuencias de ADN que favorecen la integración objetivo (por ejemplo mediante recombinación homóloga). Los vectores recombinantes también pueden tener ADN que codifica los genes que se puede utilizar como marcadores en el proceso de clonación.

El vector recombinante también puede comprender adicionalmente un promotor o regulador para controlar la expresión del gen cuando se requiera.

La molécula de ADN puede (pero no necesariamente) ser una que se llega a incorporar en el ADN de las células del sujeto a ser tratado. Las células no diferenciadas se pueden transformar establemente que conducen a la producción de células hijas modificadas genéticamente. Cuando este es el caso, la regulación de la expresión en el sujeto puede requerir por ejemplo con factores de transcripción específicos, activadores de gen o más preferiblemente con promotores inducibles que transcriben el gen en respuesta a una señal encontrada específicamente en el sitio de una herida. Alternativamente, el sistema de suministro se puede diseñar para favorecer la transformación transitoria o inestable de células diferenciadas en el sujeto a ser tratado. En este caso, la regulación de expresión puede ser menor importante debido a la expresión de la molécula de ADN que se detendrá cuando mueren las células transformadas o se detiene en la expresión de la proteína (idealmente cuando la herida, fibrosis o cicatrización se ha tratado o evitado).

El sistema de suministro puede proporcionar la molécula de ADN al sujeto si estar incorporado en un vector. Por ejemplo, la molécula de ADN se puede incorporar dentro de una liposoma o partícula de virus. Alternativamente, la molécula de ADN "desnudo" se puede insertar en las células de los sujetos mediante un medio adecuado por ejemplo retoma endocitotóxica directa.

La molécula de ADN se puede transferir a las células de un sujeto a ser tratado mediante transfección, infección, microinyección, fusión celular, fusión de protoplasto o bombardeo balístico. Por ejemplo, la transferencia puede ser mediante transfección balística con partículas doradas recubiertas, liposomas que contienen la molécula de ADN, vectores víricos (por ejemplo adenovirus) y significa que proporciona la retoma de ADN directa (por ejemplo endocitosis) mediante la aplicación de ADN de plásmido directamente al área herida tópicamente o mediante inyección.

La proteína expresada de la molécula de ADN puede ser una que proporciona directamente o indirectamente la curación de heridas con cicatrización reducida o una que sirve para regular (inhibir, evitar o reversar) la fibrosis.

La presente invención se describirá adicionalmente luego del Ejemplo no limitante que se refiere a los dibujos que acompañan, en los que:

La figura 1 ilustra los resultados de análisis de la capacidad de diferentes inhibidores, y inhibidores putativos, de activación de TGF-β para evitar la activación TGF-β mediante las plaquetas;

La figura 2 ilustra el efecto de Dec-RVKR-cmk y hexaarginina en: A releasatos de plaqueta; y B releasatos libres de plaqueta cuando se refiere a la sección de resultados experimentales 2 del ejemplo. En imagen1

A indica la hexaarginina activa y

imagen1 indica la hexaarginina total mientras que

imagen1 indica dec-RVKR-cmk activo y o indica el dec-RVKR-cmk total. En el panel B

imagen1 indica hexaarginina mientras

imagen1 indica dec-RVKRcmk; y

La figura 3 ilustra el efecto de inhibidores furina en la actividad de furina en los lisatos celulares y imagen1 imagen1

releasatos para muestras de control ; dec-RVKR-cmk ; y hexaarginina

imagen1 en la sección 2 de resultados experimentales del ejemplo.

EJEMPLO.

La capacidad de inhibidores de actividad furina para inhibir la producción de plaquetas’ activa del TGF-β activo se demuestra por la capacidad de los inhibidores de abrogar la liberación de plaquetas y la activación de TGFβ en respuesta al estímulo con trombina. El protocolo experimental se establece adelante.

1. Protocolos.

Colección y preparación de plaquetas humanas:

Las muestras sanguíneas venosas periféricas de voluntarios adultos saludables (de edad 21 a 45) se toman en S-Monovettes calibre 20. Se utiliza EDTA para evitar la coagulación de las muestras. Las plaquetas humanas se aíslan mediante centrifugación diferencial de acuerdo con el siguiente protocolo:

las muestras de sangre se centrifugan a 300g durante 10 minutos para producir un sobrenadante del plasma rico en plaquetas. El plasma rico en plaquetas luego se centrifuga a 2,500g durante 15 minutos para producir un glóbulo de las plaquetas. Las plaquetas se cosechan del glóbulo y se resuspenden antes de uso.

Producción de lisatos hipotónicos de plaqueta:

Las plaquetas recolectadas como se describió anteriormente se resuspenden en agua destilada y se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se detiene la lisis mediante la adición de un volumen igual de 2X de medio DME libre de suero que contiene 0.2% de albúmina de suero bovino pobre en pirógeno. El lisato se depura mediante centrifugación a 12,000g durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de uso.

2. Resultados Experimentales 1.

2.1. Plaquetas activadas con liberación de trombina y TGF-β activo:

Las plaquetas humanas recolectadas como se destacó anteriormente se activan mediante la adición de trombina (0.1 u/ml durante 30 minutos a 37˚C). Esta activación origina la liberación de grandes cantidades de TGF-β de las plaquetas (TGF- β total del promedio 60.2 ng/ml), y también activa la generación de cantidades significativas de TGF-β activo (159 pg/ml en promedio si las plaquetas son estáticas durante activación, 896 pg/ml en promedio si las plaquetas se someten a agitación durante activación) en los releasatos de plaqueta cuando se evalúa utilizando el bioensayo PAI/L para TGF-β descrito por Abe et al. ("An assay for transforming growth factor-β using cells transfected with a plasminogen activator inhibitor- 1 promoter-luciferase construct" 1994, Anal. Biochem. 216: 276284). Se mide los anticuerpos anti-TGF-β nuetralizantes específicos Pan completamente abolidos de la señal obtenida en el ensayo PAI/L verificando el TGF-β activo. La activación del TGF-β latente está mediada por la plaqueta, ya que la trombina exógena agregada a releasatos de plaqueta es incapaz de activar el TGF-β latente directamente (datos no mostrados). Los experimentos de inhibición de anticuerpo confirman que las plaquetas expresan exclusivamente TGF-β1 (datos no mostrados).

2.2. Plaquetas que contiene TGF-β intracelular activo:

La presencia del TGF-β activo dentro de las plaquetas se confirma por estudios de inmunolocalización y bioensayo.

Los estudios de inmunofluorescencia de microscopio confocal de la localización del TGF-β activo dentro de las plaquetas se llevan a cabo utilizando el pollo derivado de IgY AF-101-NA específico de TGF- β1 activo (R&D Systems) y un anticuerpo específicamente reactivo con el marcador de membrana CD41 (BD Biosciences). La localización subcelular de estas proteínas se investiga en las secciones ópticas recolectadas en intervalos de 0.5mm a lo largo del eje z. Se demuestra que el TGF-β1 está presente, y tiene una localización intracelular (que se encuentran dentro de aquel marcador de membrana CD41).

El bioensayo PAI/L para TGF-β se utiliza para validar la presencia de TGF-β activo en las plaquetas a través del ensayo para la presencia de TGF-β activo en lisatos hipotónicos de plaquetas humanas (preparado como se describió anteriormente).

En los lisatos derivados de las plaquetas restantes 99% del TGF-β total presente (TGF-β total de 34.7 ng/ml) es la forma latente, aunque se detecta una proporción significativa de TGF-β activa (104 pg/ml). En los lisatos derivados de trombina activa las plaquetas de media total TGF-β es 19.5 ng/ml, de la cual es activa 151 pg/ml.

Los resultados del bioensayo por lo tanto confirman la inmunolicalización que encuentra que las plaquetas contienen TGF-β activo.

2.3. Inhibición de actividad furina que inhibe la activación de TGF-β mediante plaquetas activadas por trombina:

En un experimento comparativo la capacidad de los inhibidores de activadores conocidos de TGF-β (tal como TSP-1, plasmina, receptor M6P/IGF-II) y se evalúan los activadores putativos de TGF-β latente tal como otras proteinasas serina, proteinasas cisteína, calpaina I y II, caspasa-3, y furina) para bloquear la activación de TGF-β latente en plaquetas humanas.

Las plaquetas humanas se preincuban con los inhibidores (listados adelante) ante del estímulo con trombina (como anteriormente), y los niveles TGF-β activos y totales se determinan en los releasatos de plaqueta utilizando el ensayo PAI/L (como anteriormente). Los resultados se muestran en la figura 1, paneles A a C.

Los resultados muestran que la activación de TGF-β latente no se afecta significativamente por la presencia de inhibidores específicos para TSP-1 (LSKL péptido), plasmina (anticuerpo monoclonal neutralizante, PG19- un anticuerpo neutralizante proporcionado por Dr. Michael Kramer), o receptor M6P/IGF-II (M6P - manosa-6-fosfato) (panel A). Más aún, un número de inhibidores (aprotinina, pefabloc, α 1-antitripsina, E-64, pepstatina, leupeptina, inhibidor caspasa-3 e inhibidor calpaína) de otras proteinasas involucradas potencialmente en la activación de TGFβ latente mediada por plaqueta también prueba ser inefectiva (panel B).

En comparación la incubación de plaqueta con un inhibidor permeable de membrana de inhibidor de convertasas proproteína similares a furina, dec-RVKR-cmk (decanoil-Arg-Val-Lys-Arg-clorometil cetona - Bachem), que reduce drásticamente la generación del TGF-β activo en releasatos así como también intracelularmente en una forma dependiente de dosis (panel C). (mediciones intracelulares se toman de lisatos hipotónicos). Los inventores consideran que el TGF-β residual presente (aproximadamente 20-30%) se activa prematuramente durante la preparación de plaqueta antes de la adición del inhibidor.

2.4. Resumen.

Los anteriores resultados indican que la activación de TGF-β latente mediada por plaqueta ocurre sorprendentemente extracelularmente en el sitio de activación de plaqueta (es decir un sitio de herida o un sitio de una afección fibrótica) e involucra el procesamiento proteolítico mediante una enzima convertasa similar a furina. Ellos muestran adicionalmente que la activación de TGF-β latente mediante las plaquetas se pueden inhibir exitosamente mediante el tratamiento de las plaquetas con un inhibidor de actividad furina que se puede aplicar tópicamente.

El experto en la técnica apreciará estos resultados ya que los inhibidores convertasa se pueden utilizar para inhibir la activación TGF-β1 y por lo tanto será efectivo como anticicatrizador o agentes anti-fibróticos.

3. Resultados Experimentales 2.

3.1. Enzimas similares a Furina se involucran en la activación TGF latente mediada por plaqueta.

Las plaquetas se activan con trombina en la ausencia o presencia de los inhibidores furina. Las plaquetas se preincuban con hexaarginina, aunque se agrega dec-RVKR-cmk 5 min después de trombina debido a la interferencia con la activación de plaqueta en concentraciones mayores. El TGF-β activo y total en releasatos se determinan en el bioensayo PAI/L. Los resultados se muestran en el panel A de la figura 2. Los niveles TGF-β activos en los controles son 82 pg/ml (datos dec-RVKR-cmk) y 61 pg/ml (datos hexaarginina), los niveles TGF-β totales es 33.4 ng/ml (datos dec- RVKR-cmk) y 39.5 ng/ml (datos hexaarginina).

En un experimento adicional, los inhibidores furina se agregan a los releasatos libres de plaqueta de plaquetas activas, y la activación se le permite continuar en la ausencia de las plaquetas durante 30 min a 37˚C. Los resultados de este experimento se muestran en el panel B del figura 2. Los niveles TGF-β activos en los controles son 77 pg/ml (datos dec-RVKR-cmk) y 104 pg/ml (datos hexaarginina). Incubación en hielo reduce la activación en los controles a aproximadamente 56% (datos no mostrados). Los datos representan los valores medios de tres experimentos independientes evaluados en triplicado.

Los resultados ilustran que la incubación de las plaquetas estimuladas con trombina con el inhibidor proteasa permeable de membrana, dec-RVKR-cmk, considerablemente reduce la generación de TGF-β activo en releasatos (Fig. 2 panel A). El Dec-RVKR-cmk es un inhibidor específico y potente de convertasas proproteína similares a subtilisina/Kex2p, con su secuencia de péptido que se basa en la secuencia de reconocimiento de sustrato de estas enzimas.

El miembro más prominente y expresado por doquier de esta familia endoproteasa es la furina, que se divide típicamente en el motivo de secuencia consensus R-X-(K/R)-R. El inhibidor furina impermeable a la membrana, hexa-L-arginina, también reduce significativamente el TGF-β activo en releasatos (Fig. 2 panel A) que indica por lo menos qie parte de la activación ocurre extracelularmente luego de liberación de TGF-ß latente.

La activación TGF-β latente parece ser enzimática e independiente de la presencia continua de las plaquetas, ya que la incubación de releasatos libres de plaqueta en hielo (cuando se compara con 37˚C) reduce los niveles TGF-β activos en aproximadamente 56%. Como se observa para suspensiones de plaqueta, se inhibe la activación en releasatos, en una forma dependiente de dosis, mediante los inhibidores furina, dec-RVKRcmk y hexaL-arginina (Fig. 2B). Esto indica que la enzima similar a furina involucrada en la activación de TGF-β latente se libera de las plaquetas activadas.

3.2. Plaquetas que contienen y liberan actividad de enzima similar a furina.

Releasatos o los lisatos hipotónicos de plaquetas activadas se evalúan utilizando el sustrato furina, pyrRTKR-amc en la ausencia o presencia de los inhibidores furina, hexaarginina (200 mM) o dec-RVKR-cmk (150 mM). Se corrigen los valores para fluorescencia endógena independiente de sustrato (control sin sustrato) así como también para la hidrólisis espontánea del sustrato (amortiguador de control). Se muestran los valores medios 6S.E.M. de 2-3 experimentos separados se evalúan en duplicado.

La presencia de actividad de enzima similar a furina en los lisatos hipotónicos y releasatos de plaquetas humanas se analiza utilizando el sustrato furina fluorogénico, pyr- RTKR-amc. Los lisatos de plaqueta contienen una actividad de enzima similar a furia, parte de lo cual (aproximadamente 12%) se libera luego del estímulo de trombina. La actividad de la enzima en los lisatos celulares y releasatos se inhibe por dec-RVKRcmk y hexa-L-arginina (Fig. 3).

La generación extracelular del TGF-β activo mediante plaquetas humanas estimuladas por trombina se reduce significativamente en la presencia de inhibidores de convertasas proproteína similares a furina.

3.3 Resumen.

Las convertasas proproteína similares a furina catalizan la maduración del precursor pro-TGF-β al complejo de factor de crecimiento latente activable por calor. Nuestros datos indican, sin embargo, que los gránulos β de plaqueta contienen y liberan, TGF-β latente activable por calor, y que los niveles no se afectan por inhibidores furina. Así, el procesamiento pro-TGF-β en el linaje megacariocítico ocurre en los megacariocitos. Estos datos por lo tanto identifican una función novedosa de enzimas similares a furina, a saber involucramiento en la activación extracelular del complejo TGF-β latente 1 de plaqueta grande bajo condiciones fisiológicas.

En resumen, los inventores encuentran que las plaquetas no son solo sitios de almacenamiento principales para el TGF-β1 latente sino también activan parte de este luego de desgranulación. Aunque el mecanismo de activación no requiere ninguno de los activadores bien caracterizados, TSP-1, receptor M6P/IGF-II, o plasmina, el complejo TGF-β latente de plaqueta parece ser activado por medio de una secuencia de eventos mediante una convertasa similar a furina liberada mediante las plaquetas. Luego de liberación in vivo, esta enzima parece continuar operando, independientemente de la presencia de las plaquetas, en el tejido circundante (por ejemplo el área de la herida), que conduce a la activación de la matriz extracelular asociada con el complejo TGF-β. Por lo tanto, este mecanismo novedoso de activación representa un objetivo para modular la actividad TGF-β en condiciones patológicas que involucran desgranulación de plaqueta, tal como reparación de la herida, fibrosis, arteriosclerosis, y cáncer. Por lo tanto los inventores han encontrado que los inhibidores de acuerdo con la invención (tal como decanoil-RVKR-cmk y hexa-arginina se pueden utilizar de acuerdo con la invención).

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   El uso de un inhibidor furina en la fabricación de un medicamento para reducir la cicatrización durante la curación de heridas o reducir la fibrosis en el tratamiento de afecciones fibróticas en donde el medicamento se aplica tópicamente al sitio de una herida o trastorno fibrótico.

2. 2.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el inhibidor es un inhibidor de proteasa serina.

3. 3.

   El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en donde el inhibidor es lípido soluble.

4. 4.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 2 en donde el inhibidor es una cloroalquilcetona peptidilo que tiene un grupo funcional de péptido que imita por lo menos un sitio de división de enzima convertasa.

5. 5.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 2 en donde el inhibidor es decanoil-RVKR-cmk.

6. 6.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde el inhibidor es soluble en agua.

7. 7.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 6 en donde el inhibidor es hexa-arginina.

8. 8.

   El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para tratar heridas para inhibir o evitar la formación de cicatriz.

9. 9.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 8 para inhibir o evitar cicatrización del ojo, tejido nervioso o intestinos.

10. 10.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 8 para inhibir o evitar la cicatrización dérmica.

11. 11.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 8 para inhibir o evitar cicatrización luego de una quemadura.

12. 12.

    El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para reducir la fibrosis en el tratamiento de afecciones fibróticas.

13. 13.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 12 en donde la afección fibrótica es un trastorno fibrótico seleccionado de glomerulonefritis, cirrosis del hígado, enfermedad fibrocítica, adhesiones o restenosis.