JP6472608B2 - Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物、薬剤輸送用キャリアー化合物、製剤、及び、薬剤輸送システム - Google Patents

Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物、薬剤輸送用キャリアー化合物、製剤、及び、薬剤輸送システム Download PDF

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Description

本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物、薬剤輸送用キャリアー化合物、製剤、及び、薬剤輸送システムに関し、詳しくは、ビメンチンやデスミン系のタンパク質が露出した細胞・部位に到達し易く、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質との結合性に優れるＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物、該化合物からなる薬剤輸送用キャリアー化合物、該キャリアー化合物を用いた製剤、及び、薬剤輸送システムに関するものである。
従来から動脈硬化や血栓形成により冠状動脈血管が狭窄している虚血性心疾患の患者に対し、血管へバルーンやステントを挿入して狭窄部位を押し広げるインターベーション治療がなされている。
その際にバルーンやステントが狭窄部分で擦れ血管内皮細胞を剥離させて、傷害を与えてしまう。その結果、血管で炎症を引き起こしたり、その傷害部位の内皮下にある平滑筋細胞や心筋細胞の異常な増殖による内膜肥厚や新たな血栓形成を引き起こして血管を再び狭窄させたりする。そのため、抗炎症や肥厚防止や血栓防止等のための薬物の徐放性製剤が塗布されたコイルを、この部位に挿入して、再狭窄等を防止するという、煩雑で患者の負担の大きな処置を施さなければならない。
また、過剰の線維症が病的障害および組織の機能不全を引き起こす線維性障害など各種線維性障害は、組織内に異常な形で線維性組織が蓄積することにより発生するものである。この線維性組織は、外科手術や外傷あるいは創傷以外の障害プロセスからも生じるものであり、例えば、肝硬変、肝臓線維症、糸球体腎炎、肺線維症、強皮症、心筋線維症、心筋梗塞後の線維症、発作後または神経退行性障害（アルツハイマー病など）後の中枢神経系線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、再狭窄（血管形成術後など）および関節炎など慢性的なものも挙げられる。
前述した症状等の治療（抑制、防止あるいは回復）の際に心臓や血管あるいは線維症の傷害部位へ特異的にこれらの薬物を輸送させることができる簡便なシステムが望まれている。薬物輸送システムとして、非特許文献１に、糖鎖導入ドラッグデリバリー材料であるネオ糖タンパク質とリポソームとの複合体が記載され、また非特許文献２に、肝細胞に特異的な遺伝子輸送剤であるポリエチレンイミンとアラビノガラクタンとの複合体が記載されている。しかし、これらは心臓や血管の傷害部位との特異的結合性がない。
創傷または線維性障害の部位に局所的に適用される、創傷治癒中の瘢痕形成を減少させるか、または線維性コンディションの治療における線維症を減少させるための医薬の製造におけるコンバターゼインヒビターの使用が提案されている（特許文献１参照）。さらに、薬物輸送剤等に関しては、虚血等により障害を受けた心筋細胞や血管平滑筋細胞、骨格筋芽細胞等の中に存在するビメンチンやデスミンなどの特定タンパク質との特異的相互作用を有する化合物、例えばＮ−アセチルグルコサミン類が露出され、またはコロイド粒子表面にコーティングされたアジピン類を介してＮ−アセチルグルコサミン類が結合されている薬物輸送剤（特許文献２及び３参照）が提案されている。また、内部に薬物を有する脂質膜に親和性を有する第１の領域と、前記第１の領域と結合し、そして自己磁性有機分子を含む第２領域と、を有する薬剤輸送用キャリアー化合物を用いた薬剤輸送システム等（特許文献４参照）が提案されている。
特開２００５−５３５６７４号公報（特許請求の範囲その他） 特開２００７−１９２３号公報（特許請求の範囲その他） 特開２００９−４６４１３号公報（特許請求の範囲その他） 特開２０１３−６３９２６号号公報（特許請求の範囲その他）
Noboru Yamazaki, Yoshifumi Jigami, Hans-Joachim Gabius, and ShujiKojima, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, Vol.13, No.71, pp.319-329(May 2001) M.Nogawa, T.Ishihara, T.Akaike, and A.Maruyama, S.T.P.Pharma Sciences,Vol.11, No.1, pp97-102 (2001)
前記特許文献１に記載の発明においては、コンバターゼインヒビターを所定の部位に搬送する方法がなく、部位へ直接適用するか、あるいは可能な限り直接届くような方法（例えば肺の創傷治癒の場合、吸入剤として使用）が用いられている。しかしながら、この方法では、コンバターゼインヒビターが局所に適用されるものではないため全身投与となるが、コンバターゼインヒビターの全身投与は有害であるので好ましくない。また前記特許文献２及び３では薬物輸送剤としてＮ−アセチルグルコサミン類を用いているが、ビメンチンやデスミン系のＮ−アセチルグルコサミン認識タンパク質が露出した細胞・部位に到達しにくく、また、薬剤が到達したとしてもＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質と結合しない、あるいは結合しにくい等、性能面で未だ満足するものではなかった。
そこで本発明の目的は、ビメンチンやデスミン系のタンパク質が露出した細胞・部位に到達し易く、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質との結合性に優れるＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物、該化合物からなる薬剤輸送用キャリアー化合物、該薬剤輸送用キャリアー化合物を用いた製剤、及び、薬剤輸送システムを提供することである。
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を有する化合物の重量平均分子量を特定の範囲に調整することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法は、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物が、重量平均分子量が１５，０００〜３０，０００の範囲であり、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を１分子当たり２７〜５０個有し、末端に３−メルカプトプロピオン酸が結合されたＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物であり、ビニルベンジルアミンに水溶性カルボジイミドを用いてキトビオン酸を縮合して作製したモノマーを、３−メルカルトプロピオン酸及びアゾビスイソブチロニトリルと混合して重合させることを特徴とするものである。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法は、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物がビオチン化合物であることが好ましい。
本発明の薬剤輸送用キャリアー化合物の製造方法は、前記薬剤輸送用キャリアー化合物が、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物からなる薬剤輸送用キャリアー化合物であり、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法で製造することを特徴とするものである。
本発明の製剤の製造方法は、前記製剤が、前記薬剤輸送用キャリアー化合物が、治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤を担持し、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基が表面に露出している製剤であり、前記薬剤輸送用キャリアー化合物を前記薬剤輸送用キャリアー化合物の製造方法で製造することを特徴とするものである。
本発明の薬剤輸送用キャリアー化合物の製造方法は、前記薬剤輸送用キャリアー化合物が、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基が表面に露出しているコロイド状粒子であることを特徴とするものである。
本発明の製剤の製造方法は、前記製剤が、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基が表面に露出しているコロイド状粒子である薬剤輸送用キャリアー化合物の前記コロイド状粒子中に、治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤を含有する製剤であり、前記薬剤輸送用キャリアー化合物を、前記薬剤輸送用キャリアー化合物の製造方法で製造することを特徴とするものである。
本発明の薬剤輸送システムは、治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤の表面に前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法で製造したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を結合させて、表面に露出したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基によって前記薬剤を目的の患部領域に誘導することを特徴とするものである。
本発明の薬剤輸送システムは、表面に前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法で製造したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を結合させたコロイド状粒子中に治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤を含有させ、表面に露出したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基によって前記コロイド状粒子中の前記薬剤を目的の患部領域に誘導することを特徴とするものである。
本発明によれば、ビメンチンやデスミン系のタンパク質が露出した細胞・部位に到達し易く、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質との結合性に優れるＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物、該化合物からなる薬剤輸送用キャリアー化合物、該薬剤輸送用キャリアー化合物を用いた製剤、及び、薬剤輸送システムを提供することができる。
比較例２のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物と、金表面に固定化したビメンチンとの結合を評価したセンサーグラムである。 比較例３のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物と、金表面に固定化したビメンチンとの結合を評価したセンサーグラムである。 実施例１のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物と、金表面に固定化したビメンチンとの結合を評価したセンサーグラムである。 比較例４のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物と、金表面に固定化したビメンチンとの結合を評価したセンサーグラムである。 ＦＩＴＣラベルした比較例１のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物によるＨｅＬａ細胞の染色度を示すグラフである。 ＦＩＴＣラベルした比較例２のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物によるＨｅＬａ細胞の染色度を示すグラフである。 ＦＩＴＣラベルした比較例３のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物によるＨｅＬａ細胞の染色度を示すグラフである。 ＦＩＴＣラベルした実施例１のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物によるＨｅＬａ細胞の染色度を示すグラフである。 ＦＩＴＣラベルした比較例４のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物によるＨｅＬａ細胞の染色度を示すグラフである。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物は、重量平均分子量が１５，０００〜１００，０００の範囲であり、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を有することを特徴とする化合物である。重量平均分子量が１５，０００未満であるとビメンチンやデスミン等のＮ−アセチルグルコサミン認識タンパク質には結合性が低い。また、１００，０００を超えると所望の細胞・部位への薬剤到達率が低下する。前記重量平均分子量は、合成性や収率及び薬剤到達率の面から、１６，０００〜５０，０００の範囲であることが好ましく、１６，５００〜４０，０００の範囲がより好ましく、１７，０００〜３０，０００の範囲であることがさらに好ましい。尚、従来のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物としては、キトビオースがＮ−アセチルグルコサミン末端で結合したビニル系樹脂が用いられており（例えば、特許文献２の実施例１）、その重量平均分子量は１２０，０００程度であった。また、キトビオースとビオチンとを結合して得られるＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物（分子量７００程度）を担体に結合して得られる薬物輸送剤のコロイドも用いられていた（例えば、特許文献３の実施例１３）。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物においてＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基としては、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン基や、Ｎ−アセチルグルコサミン基が２〜６個結合したキトポリオース基、即ち、キトビオース基、キトトリオース基、キトテトラオース基、キトペンタオース基、キトヘキサオース基が挙げられる。中でも、Ｎ−アセチルグルコサミン基及びキトビオース基が好ましく、キトビオース基がより好ましい。
Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基の具体例として、キトビオース基の化学式を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
Figure 0006472608
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物は、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を１分子当たり２７〜１７５個であることが好ましく、２９〜８８個であることがより好ましく、３０〜７０個であることがさらに好ましく、３０〜５０個であることが特に好ましい。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物は、ビメンチンやデスミン等のＮ−アセチルグルコサミン認識タンパク質と作用するためにＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基を有するものであり、目的に応じ適宜選択した化合物に対して、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を導入して得ることができる。本発明の化合物は、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を有するモノマーを重合して得られるポリマーや、ポリマー等の高分子化合物にＮ−アセチルグルコサミンを結合させた化合物であることがより好ましい。本発明の化合物は、ポリマーであることが好ましい。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物は、担体との吸着性の観点から、疎水性基を有していてもよい。
Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法は特に限定されない。例えば、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を有するモノマーを重合して得られるポリマーの製造方法としては、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖の還元末端に、スチレン化合物等の疎水性基を有する化合物が結合したモノマーを重合する方法等が挙げられる。より詳しい製造方法としては、疎水性基を有する化合物であるビニルベンジルアミンのアミノ基をキトビオースで還元的アミノ化することによって、Ｎ−アセチルグルコサミン基を導入したスチレン系モノマーを得た後、該モノマーを重合させて製造する方法等が挙げられる。また、前記高分子化合物にＮ−アセチルグルコサミンを結合させた化合物の製造方法としては、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖の還元末端でカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンやｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ等の疎水性基を有するポリマー化合物とを結合する方法等が挙げられる。
ここで、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖を化合物に結合させる方法は、特に限定されないが、例えば、アミノ基を有する化合物のアミノ基と、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖の還元末端とを、還元アミノ化法で結合することができる。また、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖のヒドロキシ基をカルボキシル基で置換し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）カップリング法等によって、アミノ基を有する化合物のアミノ基と結合させてもよい。
また、前記モノマーを重合する方法は特に限定されず、例えば、リビングラジカル重合法や連鎖移動剤による重合法等によって得ることができる。具体例としては、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖としてキトビオースと、疎水性基を有する化合物としてビニルベンジルフタルイミドとをモル比で１：１の割合で混合してモノマーを製造し、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ又は水などの溶液中でラジカル重合することによりpoly[N-p-vinylbenzyl-O-2-acetoamid-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetoamide-2-deoxy-β-D-gluconamide]（ＰＶＧｌｃＮＡｃ）を得ることができる。連鎖移動剤を用いた重合法では、重合時にモノマーに対するメルカプトプロピオン酸等の連鎖移動剤の混合比を変化させ重合することで、分子量が制御されたポリマーを製造することができる。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物は、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有ビオチン化合物であってもよい。Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有ビオチン化合物の製造は、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を弱い酸で処理してアルデヒド基を作製させ、ヒドラジン基を有するビオチンを反応させることで行うことができる。
〔薬剤輸送用キャリアー化合物〕
本発明の薬剤輸送用キャリアー化合物は、本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物からなるものである。本発明の薬剤輸送用キャリアー化合物は、前記Ｎ−アセチルグルコサミン基含有化合物のみから構成されてもよいが、薬剤輸送に用いられる担体等の他の材料、例えば、コロイド状粒子の表面に前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を結合させたものであってもよい。コロイド状粒子としては、例えば金、白金、銀、磁性体、セラミックなどの金属又は無機粒子、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリグリコール酸、変性ポリビニルアルコール、カゼイン、変性澱粉及びセルロース、プロテインなどの合成又は天然物由来樹脂粒子、リポソームなどが挙げられる。このコロイド状粒子の表面にＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を結合させる方法は特に限定されない。例えば、コロイド状粒子が金粒子の場合、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物にチオール基を導入し、金コロイド表面への共有結合を行うことにより結合させることができる。また、ポリ乳酸の場合、Ｎ−アセチルグルコサミン基含有化合物を溶解させた溶液をポリ乳酸と混合し、ポリ乳酸粒子の表面にＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物をコーティングすることにより結合させることができる。さらにリポソームの場合は、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物にアルキル基を導入したものをリポソーム表面にコーティングすることにより結合させることができる。
コロイド状粒子の粒径は、質量平均粒子径が５〜８００ｎｍの範囲であることが好ましい。この粒径が５ｎｍ未満であると、Ｎ−アセチルグルコサミン基含有化合物を結合させることが難しく、Ｎ−アセチルグルコサミン基が付加されなかった粒子は生体中で速やかに排泄されてしまうので好ましくない。また、粒径が８００ｎｍを超えると貪食細胞などによって生体中の異物として排除されてしまうので好ましくない。粒子表面へのＮ−アセチルグルコサミン基の負荷性および薬剤輸送性の面から好ましくは７〜５００ｎｍ、特に好ましくは１０〜３００ｎｍの範囲である。粒径をこの範囲内にコントロールすることで血管傷害部位の細胞間に生じた間隙や血管内で露出した平滑筋細胞等の細胞又は部位にのみ選択的に効率よく到達し、細胞・部位に取り込まれ易くなる。
〔製剤〕
本発明の製剤は、前記薬剤輸送用キャリアー化合物が、治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤を担持し、かつ、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基が表面に露出していることを特徴とするものである。また、本発明の他の製剤は、前記薬剤輸送用キャリアー化合物がＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基が表面に露出しているコロイド状粒子であって、前記コロイド状粒子中に、治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤が含有されていることを特徴とするものである。これらの本発明の製剤は投与されると、ビメンチンやデスミン等のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質を露出している細胞・部位に血液循環により到達する。すると薬剤輸送用キャリアー化合物のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基と、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質とが相互作用して引き寄せあい、この細胞に付着したり侵入したりする。その後、前記薬剤が製剤中から滲出して放出され、細胞に吸収され、蛍光させたり造影させたり薬効を発現するものである。
蛍光剤は、例えばフロオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、生細胞染色用色素Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（株式会社同人化学研究所製；商品名）が挙げられる。造影剤は、例えば核磁気共鳴画像診断用ガドリニウム化合物が挙げられる。治療剤は、例えば血管内皮細胞増殖促進剤、血管平滑筋細胞増殖抑制剤、抗炎症剤、抗癌剤、抗リウマチ剤が挙げられる。
〔薬剤輸送システム〕
本発明の薬剤輸送システムは、蛍光剤、造影剤および治療剤のうち少なくとも１種の薬剤の表面に、本発明の化合物を結合させて、表面に露出したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基によって、前記薬剤を患部領域に誘導することを特徴とするものである。また、本発明の他の薬剤輸送システムは、表面に本発明の化合物を結合させたコロイド状粒子中に治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤を含有させ、表面に露出したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基によって前記コロイド状粒子中の前記薬剤を目的の患部領域に誘導することを特徴とするものである。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物、薬剤輸送用キャリアー化合物、該薬剤輸送用キャリアー化合物を用いた薬剤、及び、薬剤輸送システムは、従来の薬剤輸送システムに比べ薬剤を効率的に所望の細胞・部位（ビメンチンやデスミン系のタンパク質が露出した細胞・部位）に到達させることができるため、これまでの薬剤輸送システムで使用される薬剤量よりも少ない量で効率よく、所望部位に薬剤を到達させることができ、その結果高い薬剤効果を得ることを可能にできるものである。そのため本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物、薬剤輸送用キャリアー化合物、製剤、及び、薬剤輸送システムは、医療分野、特に検査・診断・治療に有効なものである。
以下、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（モノマーの作製）
キトビオース（０．５ｇ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解して、１．４２５ｇのヨウ素を添加した。４％ＫＯＨをヨウ素の茶色が消えるまで滴下して加えた。その後、ジエチルエーテルで再結晶させた後、結晶物を水に溶解してイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０）でキトビオン酸を精製した。ビニルベンジルアミンにＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）を用いてキトビオン酸を縮合した。作製されたモノマーはクロロホルムで沈殿精製した。その後、沈殿物を水に溶解して凍結乾燥を行った。
［比較例１：Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物（ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃ；重量平均分子量９，３００）の作成］
上記で得たモノマー ０．１８５ｍｍｏｌに、０．００１８５ｍｍｏｌ ３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、及び、終濃度が０．５％になる量でアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を混合し、５００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。この溶液を６５℃のオイルバス中で１８時間インキュベーションを行い重合した。１８時間後、水に溶解させ一昼夜透析を行った。透析後、凍結乾燥を行った。
［比較例２：Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物（ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃ；重量平均分子量１１，０００）の作成］
上記で得たモノマー ０．１８５ｍｍｏｌに、０．０００９ｍｍｏｌ ＭＰＡ、及び、終濃度が０．５％になる量でＡＩＢＮを混合し、５００μＬのＤＭＳＯに溶解させた。この溶液を６５℃のオイルバス中で１８時間インキュベーションを行い重合した。１８時間後、水に溶解させ一昼夜透析を行った。透析後、凍結乾燥を行った。
［比較例３：Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物（ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃ；重量平均分子量１４，０００）の作成］
上記で得たモノマー ０．１８５ｍｍｏｌに、０．０００３７ｍｍｏｌ ＭＰＡ、及び、終濃度が０．５％になる量でＡＩＢＮを混合し、５００μＬのＤＭＳＯに溶解させた。この溶液を６５℃のオイルバス中で１８時間インキュベーションを行い重合した。１８時間後、水に溶解させ一昼夜透析を行った。透析後、凍結乾燥を行った。
［実施例１：Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物（ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃ；重量平均分子量１７，０００）の作成］
上記で得たモノマー ０．１８５ｍｍｏｌに、０．０００１８５ｍｍｏｌ ＭＰＡ、及び、終濃度が０．５％になる量でＡＩＢＮを混合し、５００μＬのＤＭＳＯに溶解させた。この溶液を６５℃のオイルバス中で１８時間インキュベーションを行い重合した。１８時間後、水に溶解させ一昼夜透析を行った。透析後、凍結乾燥を行った。
［比較例４：Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物（ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃ；重量平均分子量１２０，０００）の作成］
上記で得たモノマー ０．１８５ｍｍｏｌに、終濃度が０．５％になる量でＡＩＢＮを混合し、５００μＬのＤＭＳＯに溶解させた。この溶液を６５℃のオイルバス中で１８時間インキュベーションを行い重合した。１８時間後、水に溶解させ一昼夜透析を行った。透析後、凍結乾燥を行った
各種物性値の測定方法、及び諸特性の評価方法を以下に示す。得られた結果を表１に示す。
（１）Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質（ビメンチン）との相互作用
ビメンチンのＮ−アセチルグルコサミン結合ドメインの組み替えタンパク質をセンサーチップに固定化して、ＧＥヘルスケア社製ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｊを用いて、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物のビメンチンへの相互作用を表面プラズモン共鳴解析によって検討した。得られたセンサーグラムから相互作用の程度を、センサーグラムを観察し、目視により、センサーグラムの最大の値を比較して相対的に判断した。
（２）解離定数（ＫＤ（Ｍ））
Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の５種類の濃度系列（０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの５種類）を用意して、金表面に固定化したビメンチンと用意したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物との結合（分子間相互作用）をＧＥヘルスケア社製ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｊで検討した。各濃度のセンサーグラムの結果から、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の解離定数を算出した。比較例２、比較例３、実施例１および比較例４のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖含有化合物のセンサーグラムの結果をそれぞれ、図１〜４に示す（比較例３については、０．５μｇ／ｍｌは未測定）。縦軸はレゾナンスユニットを、横軸は時間（秒）を表す。これらの図は、各濃度の化合物のビメンチンに対する反応性を示したものである。高濃度になるにつれて反応性が上昇している。Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物をビメンチンに反応させてから１２０秒（比較例は６０秒）まではビメンチンとの結合を示し１２０秒（比較例は６０秒）以降は、ビメンチンからのＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の解離を示している。これらの反応経過から解離定数を算出した。尚、比較例２については、０．５μｇ／ｍｌはほとんど変化せず、解離定数の計算から外した。
（３）ＦＩＴＣ−ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃとの相互作用
５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨｅＬａ細胞懸濁液５００μＬにＦＩＴＣラベルしたＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物（ＦＩＴＣ−ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃ）を４μｇ／ｍＬで反応させた。反応は、４℃で３０分行った。その後、遠心を行いＰＢＳに再懸濁して、その細胞染色をフローサイトメーター（ＧＵＡＶＡ ｅａｓｙＣｙｔｅ、ミリポア社製）でフローサイトメトリーを行い、ＦＩＴＣ−ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃによるＨｅＬａ細胞の染色を検討した。比較例１、比較例２、比較例３、実施例１および比較例４のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖含有化合物のフローサイトメトリーの結果をそれぞれ、図５〜９に示す。縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を表す。中塗りつぶしのヒストグラムは、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ−ＰＶ−ＭＡを作用させたものであり、中抜けのヒストグラムはＦＩＴＣ−ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃに反応したＨｅＬａ細胞集団を示している。
（４）重量平均分子量
高速ＧＰＣ装置（東ソー社製、ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ）を用いて、次の条件で各材料の重量平均分子量を測定した。カラムは、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷｘＬ−ＣＰ＋Ｇ５０００ＰＷｘＬ−ＣＰ＋３０００ＰＷｘＬ−ＣＰを用いて溶離液は、２００ｍＭ 硝酸ナトリウム／アセトニトリル＝８０／２０で行った。流量は１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器はＲＩ検出器、カラム温度は４０℃で行った。分子量の標準曲線はプルランで実施した。
Figure 0006472608
 表中の「−」は測定不能を示す。
これらの結果から、実施例のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物はＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質との相互作用に優れ、また、ＨｅＬａ細胞におけるＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質に到達し易いことがわかる。これらのことから、本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を用いた薬剤輸送剤キャリアーによれば、所望の細胞及び部位に対して選択的に薬剤を到達させることが可能となることがわかる。また、本発明の化合物を用いた薬剤輸送システムによれば、所望の細胞・部位以外の細胞・部位に、効率的に薬剤を到達させることが可能となることがわかる。

Claims (8)

  1. Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法であって、
    前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物が、重量平均分子量が１５，０００〜３０，０００の範囲であり、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を１分子当たり２７〜５０個有し、末端に３−メルカプトプロピオン酸が結合されたＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物であり、
    ビニルベンジルアミンに水溶性カルボジイミドを用いてキトビオン酸を縮合して作製したモノマーを、３−メルカルトプロピオン酸及びアゾビスイソブチロニトリルと混合して重合させることを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法。
  2. 前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物がビオチン化合物であることを特徴とする請求項１記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法。
  3. 薬剤輸送用キャリアー化合物の製造方法であって、
    前記薬剤輸送用キャリアー化合物が、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物からなる薬剤輸送用キャリアー化合物であり、
    前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を、請求項１または２記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法で製造することを特徴とする薬剤輸送用キャリアー化合物の製造方法。
  4. 前記薬剤輸送用キャリアー化合物が、前記Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基が表面に露出しているコロイド状粒子であることを特徴とする請求項３記載の薬剤輸送用キャリアー化合物の製造方法。
  5. 製剤の製造方法であって、
    前記製剤が、薬剤輸送用キャリアー化合物が、治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤を担持し、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基が表面に露出している製剤であり、
    前記薬剤輸送用キャリアー化合物を請求項３記載の薬剤輸送用キャリアー化合物の製造方法で製造することを特徴とする製剤の製造方法。
  6. 製剤の製造方法であって、
    前記製剤が、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基が表面に露出しているコロイド状粒子である薬剤輸送用キャリアー化合物の前記コロイド状粒子中に、治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤を含有する製剤であり、
    前記薬剤輸送用キャリアー化合物を、請求項３記載の薬剤輸送用キャリアー化合物の製造方法で製造することを特徴とする製剤の製造方法。
  7. 治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤の表面に請求項１または２記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法で製造したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を結合させて、表面に露出したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基によって前記薬剤を目的の患部領域に誘導することを特徴とする薬剤輸送システム。
  8. 表面に請求項１または２記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物の製造方法で製造したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物を結合させたコロイド状粒子中に治療剤、蛍光剤および造影剤のうち少なくとも１種の薬剤を含有させ、表面に露出したＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基によって前記コロイド状粒子中の前記薬剤を目的の患部領域に誘導することを特徴とする薬剤輸送システム。
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