CN103534276B - 具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法、用于该制造方法的唾液酸糖链加成氨基酸衍生物及该糖肽 - Google Patents
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Abstract
[问题]本发明提供了在通过Boc固相合成法合成糖肽时，位于糖链的非还原末端的唾液酸不会分解，且可在高产率下得到具有所需唾液酸糖链的糖肽的制造方法。[方案]该具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法的特征在于，在用于Boc固相合成法的Boc-唾液酸糖链加成氨基酸衍生物中，将位于糖链的非还原末端的唾液酸的羧基以苯甲酰甲基进行保护。
Description
技术领域
本发明涉及可用于例如医药品或分析机器的标准品、学术用试剂等应用的具有唾液酸糖链的糖肽的合成方法。
背景技术
近年来，作为排在核酸(DNA)、蛋白质之后的第三链状生物分子，糖链分子受到注目。人体是由约60万亿个细胞所组成的一大细胞社会，所有细胞表面由糖链分子所包覆。例如ABO式血型是由细胞表面之糖链相异来决定。
糖链具有涉及细胞间的辨识或相互作用的相关功能，作为构成细胞社会的必要物质而发挥作用。细胞社会的混乱与癌、慢性疾病、感染症、老化等相关，例如已知若细胞癌化时细胞表面上之糖链结构会起变化。
此外，已知霍乱弧菌（Vibriocholerae）或流行性感冒病毒等通过辨识某特定糖链的结合，可侵入细胞并感染。
如此糖链功能之阐明，有助于以新原理为基础的医药品或食品的开发等，期待疾病预防、对治疗之贡献等广泛应用。
糖链因具有单糖之序列、结合模式和部位、链长和分支模式、总体高级结构等等多样性，与核酸或蛋白质之结构相比，具有非常复杂的结构。因此，来自该结构之生物学信息与核酸或蛋白质相比，更多种多样。糖链的研究重要性虽已被认可，但该结构的复杂或多样性导致其处于比核酸或蛋白质的研究进展更为迟缓的状态。
于细胞膜表面或血清等存在的许多蛋白质与糖链结合。糖链与蛋白质以共价键结合的分子称为糖蛋白，由糖与蛋白质之结合模式的相异，可分为2组。其中一个为天冬酰胺(Asn)之侧链上的氨基与糖链结合的天冬酰胺结合型糖链(N-糖苷键型)。另一个为丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的醇与糖链结合的黏蛋白结合型糖链(O-糖苷键型)。所有天冬酰胺结合型糖链具有由5个糖残基所组成的基本骨架，依据所结合之糖链的非还原末端的糖残基种类可分类为高甘露糖型、复合型、混合型等子组。另一方面，黏蛋白结合型糖链由基本骨架(核心)之相异性可分类为4组。
具有糖链的蛋白质作为糖蛋白制剂已在世界范围内被利用，但该糖蛋白仅可由主要利用生化工程的方法获得，而且由此制作的糖蛋白纯度存在过低等问题。因此，期待一种纯度高且有效率地得到目标糖蛋白的化学合成方法。特别是，在合成具有非天然氨基酸的糖肽时，无法由生物学手法直接生产。
作为肽合成法而现在被广泛使用的为1963年时由R.B.Merrifield所开发的固相合成法。固相合成法是在被称为树脂（resin）的固相上连接氨基酸建筑块（BuildingBlocks）而延长肽链的方法。当肽链的延长完成后，从固相切除肽链而得到目标物。
作为该应用而延长肽链时，通过插入结合糖链之氨基酸，可进行糖肽链的合成。
固相合成法中，作为建筑块的氨基酸之氨基可由芴基甲氧基羰基(Fmoc)或叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲氧基羰基(Cbz或Z)等保护。
其中，对于使用Boc基的固相合成法，在肽之侧链保护基的脱保护与将肽本身从树脂切出时，使用氟化氢等超强酸，由于该氟化氢之处理，在目标物的一部分含有糖链时，含该糖链的部分，特别是糖链的非还原末端的唾液酸存在容易被分解等问题。因此，对于Boc固相合成法，难以直接制造具有唾液酸糖链的目标糖蛋白。
此外，对于使用Fmoc基的固相合成法，可在碱性条件下，从氨基酸的氨基脱离Fmoc基。对此，由于Boc基可在酸性条件下从氨基酸的氨基脱保护，故在使用对碱不稳定的非天然氨基酸通过固相合成法合成肽或糖肽时，必须使用到Boc固相合成法。
非天然氨基酸虽非蛋白质构成氨基酸，但亦有在天然下存在的，且亦可通过化学合成得到。非天然氨基酸的结构多样性或取代基选择之自由度极高，利用这样的非天然氨基酸合成肽时，可望获得活体内之稳定性改善或效能提高、吸收效率提高、组织内分布的改善，或肽的三级结构之变化等，因可用于设计新颖的肽医药或功能材料之候选物质而受到注目。
此外，作为固相合成法之一，已有文献记载从树脂切离肽时，将所制作之肽转化为硫酯体（硫酯形式）的方法(例如非专利文献1)。通过得到肽硫酯体，例如利用天然化学接合(NativeChemicalLigation、NCL法)或KCL法(KineticallyControlledLigation)，可与其他肽链结合，可制造出较大的目标蛋白质(专利文献1及非专利文献2)。
所谓NCL法是通过连接N末端氨基酸为Cys的肽片段、与在C末端具有硫酯的肽片段，得到更大肽链的方法。此时，若使用加成糖链的肽片段，可合成糖蛋白。各片段例如可由上述固相合成法合成，在合成途中，通过结合具有均匀糖链的糖链加成天冬酰胺而不是氨基酸，可得到氨基酸序列及糖链结构均匀的糖链加成片段(专利文献2)。此外，所谓KCL法为，所要连接的两肽片段为于C末端具有硫酯时，利用反应速度之相异性，可得到较多的目标糖蛋白的方法。
因此，使用糖链加成片段进行NCL法或KCL法时，可得到可利用的均匀糖蛋白作为医药品，而不会因大批制造等而造成偏差。
[在先技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]国际公开公报第96/34878号手册
[专利文献2]国际公开公报第2011/007747号手册
[非专利文献]
[非专利文献1]XianzhangBu.etal.:TetrahedronLetters(2002)43:2419-2422
[非专利文献2]HutloffA.etal.:Nature(1999)397:263-266
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，对于Boc固相合成方法，期望保持唾液酸在糖链上不被分解的合成方法。发明人们发现了，在固相合成法中，通过以特定化合物对糖链上的唾液酸的羧基进行保护而合成具有唾液酸糖链的糖肽的方法。然而，在Boc固相合成法中超强酸条件下，即使使用这些保护基，也无法充分保护糖链非还原末端的唾液酸，无法在期待产率下得到具有唾液酸糖链的糖肽。
因此，本发明提供了在使用Boc基的糖肽固相合成法中，在糖链的非还原末端之唾液酸不被分解下，可在高产率下合成具有唾液酸糖链的目标糖肽的方法。
另外，本发明提供了在使用Boc基的具有唾液酸糖链的糖肽的固相合成法中，制造硫酯形式糖肽的方法。
解决问题的手段
为解决上述问题，本发明人们经详细研究，结果发现，通过使用苯甲酰甲基作为糖链非还原末端之唾液酸的羧基的保护基，在Boc固相合成法中可大幅度改善具有唾液酸糖链的糖肽的收率。
即，本发明涉及具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法，含有以下步骤：
(1)将具有羟基的树脂(resin)与其氨基氮以Boc基进行保护的氨基酸结合的步骤；
其中，所述结合步骤为，将前述树脂的羟基与前述氨基酸的羧基通过酯化反应进行结合的步骤。
(2)通过将前述Boc基脱离而形成游离氨基的步骤；
(3)将以下的(i)及(ii)的步骤至少重复进行1次的步骤：
(i)通过进一步结合以Boc基保护氨基氮的其他氨基酸，使结合于树脂的氨基酸延长的步骤，
其中，该延长步骤为，将前述其他氨基酸的羧基与结合于前述树脂的氨基酸的前述游离氨基结合的步骤。
(ii)通过脱离(i)中的前述Boc基而形成游离氨基的步骤；
(4)以酸切断树脂的步骤，
其中步骤(1)中的前述氨基酸和/或步骤(3)的至少1次的(i)中的前述其他氨基酸为糖链加成氨基酸，该糖链加成氨基酸的糖链非还原末端中的至少1个具有唾液酸，且该唾液酸的羧基是由苯甲酰甲基保护。
进一步，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法的一实施方式中，其特征在于前述糖链加成氨基酸为天冬酰胺结合型糖链或黏蛋白结合型糖链。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述步骤(4)中，前述酸为三氟乙酸/三氟甲烷磺酸/二甲基硫化物/间甲酚的混合酸。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述步骤(1)中，前述氨基酸和/或前述步骤(3)的至少1次的(i)中的前述其他氨基酸为对碱不稳定（base-labile）的非天然氨基酸。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述糖链加成氨基酸中的至少1个为唾液酸糖链天冬酰胺，前述唾液酸糖链天冬酰胺具有6个以上的糖残基。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述糖链加成氨基酸中的至少1个为唾液酸糖链天冬酰胺，前述唾液酸糖链天冬酰胺具有9～11个糖残基。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述糖链加成氨基酸中的至少1个为唾液酸糖链天冬酰胺，前述糖链天冬酰胺具有6个以上的糖残基，并结合有2分支型糖链。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述糖链加成氨基酸由式(1)表示：
[式中，R3及R4中一方为下式(2)，另一方为选自由氢原子及式(2)～(6)所示基团组成的组中的基团]。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，在前述步骤(1)之前进一步包括将硫醇化合物与树脂结合的步骤。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，进一步包括(5)将具有唾液酸糖链的糖肽的硫酯体与肽片段或糖肽片段连接的步骤。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，在前述步骤(4)中以酸切断树脂之前，进一步包括使标识剂反应的步骤。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，标识剂为丹磺酰卤化物。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述步骤(1)～(3)中的至少1个步骤中，在前述氨基酸的缩合反应和/或Boc基的脱离反应时，进行微波照射。
此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，在前述步骤(4)之后，进一步包括将保护前述唾液酸的羧基的苯甲酰甲基脱保护的步骤。
此外，本发明的另一方式涉及通过上述制造方法所制造的具有唾液酸糖链的糖肽。
此外，本发明的另一方式涉及唾液酸糖链天冬酰胺之氨基由Boc基保护，且糖链非还原末端的唾液酸之羧基由苯甲酰甲基所保护的唾液酸糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，包括在天冬酰胺的氨基由脂溶性保护基所保护的唾液酸糖链天冬酰胺衍生物中导入苯甲酰甲基的步骤、将导入苯甲酰甲基的唾液酸糖链天冬酰胺的脂溶性保护基脱离的步骤与在脱离了脂溶性保护基的唾液酸糖链天冬酰胺中导入Boc基的步骤。
此外，本发明的唾液酸糖链天冬酰胺衍生物的制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述脂溶性保护基为Fmoc。
此外，在本发明的一实施方式中，由本发明的具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法所制造的糖肽具有与促红细胞生成素之氨基酸序列同等的氨基酸序列，且在任意位置上具有至少一个或多个的唾液酸糖链。此外，在本发明的一实施方式中，由本发明的具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法所制造的糖肽是具有与促红细胞生成素的氨基酸序列同等的氨基酸序列的糖肽的一部分，并且是在任意位置上具有至少一个或多个的唾液酸糖链的糖肽片段。
另外，所谓与促红细胞生成素的氨基酸序列同等的氨基酸序列是指，在蛋白质折叠(folding)后具有促红细胞生成素功能的氨基酸序列，并且在促红细胞生成素的氨基酸序列中，缺失、取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
发明效果
所谓本发明的具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法，可在Boc固相合成法中，直接提供在糖链非还原末端具有唾液酸的糖肽。此外，因使用Boc基作为氨基酸的氨基的保护基因，故可使用对碱不稳定的非天然氨基酸制作出糖肽。
通过如Boc固相合成等化学合成所制作的糖肽可大量合成糖链的结构为实质上均匀的糖肽。糖链结构均匀的该糖肽品质恒定，特别优选用于医药品的制造或检测等领域。
附图说明
[图1]图1表示本发明的一实施方式所述方法的流程示意图，该方法是将干扰素γ(INFγ)作为模型肽，通过Boc固相合成法制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺的氨基酸序列(TN(二苯甲酰甲基(diphenacyl)-二唾液酸糖链)YSVTDLNY)的方法。
[图2]图2表示本发明的一实施方式中的HPLC轮廓图，其中，将干扰素γ(INFγ)作为模型肽，通过Boc固相合成法制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺的氨基酸序列(TN(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)YSVTDLNY)。
[图3]图3表示本发明的一实施方式所述方法的流程示意图，该方法是将白细胞介素3(Interleukin3:IL-3)作为模型肽，通过Boc固相合成法制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺的氨基酸序列(SLQN(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)ASAIES)的方法。
[图4]图4表示本发明的一实施方式中的HPLC轮廓图，其中，将白细胞介素3(Interleukin3:IL-3)作为模型肽，通过Boc固相合成法制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺的氨基酸序列(SLQN(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)ASAIES)。
[图5]图5表示本发明的一实施方式中将促红细胞生成素作为模型肽，制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺的氨基酸序列的方法的步骤的一部分的示意图。具体而言，是连接具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第1-21的氨基酸序列的片段A、具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第22-49的氨基酸序列的片段B，以制作片段(A+B)之步骤的示意图。
[图6]图6表示本发明的一实施方式中将促红细胞生成素作为模型肽，制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺的氨基酸序列的方法的步骤的一部分的示意图。具体而言，是以下步骤的示意图：连接具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第98-127之氨基酸序列的片段E与具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第128-166之氨基酸序列的片段F，以制作片段(E+F)的步骤；以及将片段(E+F)的N末端的噻唑烷型半胱氨酸变换为半胱氨酸的步骤。
[图7]图7表示本发明的一实施方式中将促红细胞生成素作为模型肽，制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺的氨基酸序列的方法的步骤的一部分的示意图。具体而言，是以下步骤的示意图：连接具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第98-166之氨基酸序列的片段(E+F)、与具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第79-97之氨基酸序列的片段D，以制作片段(D+E+F)的步骤；将片段(D+E+F)的N末端之噻唑烷型半胱氨酸变换为半胱氨酸的步骤；及除去糖链唾液酸上的苯甲酰甲基及作为Trp的保护基的甲酰基(CHO)的步骤。
[图8]图8表示本发明的一实施方式中将促红细胞生成素作为模型肽，制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺之氨基酸序列的制造方法的步骤的一部分的示意图。具体而言，是以下步骤的示意图：连接具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第79-166之氨基酸序列的片段(D+E+F)、与具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第50-78之氨基酸序列的片段C，以制作片段(C+D+E+F)的步骤；将用于接合的半胱氨酸还原为丙氨酸的步骤；以及将片段(C+D+E+F)的N末端之噻唑烷型半胱氨酸变换为半胱氨酸的步骤。
[图9]图9表示本发明的一实施方式中将促红细胞生成素作为模型肽，制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺之氨基酸序列的制造方法的步骤的一部分的示意图。具体而言，是连接具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第50-166之氨基酸序列的片段(C+D+E+F)、与具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第1-49之氨基酸序列的片段(A+B)，以制作片段(A+B+C+D+E+F)之步骤的示意图。
[图10]图10表示本发明的一实施方式中将促红细胞生成素作为模型肽，制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺之氨基酸序列的制造方法的步骤的一部分的示意图。具体而言，是在具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第1-166之氨基酸序列的片段(A+B+C+D+E+F)中，将用于接合的半胱氨酸变为丙氨酸的步骤的示意图。
[图11]图11表示本发明的一实施方式中将促红细胞生成素作为模型肽，制作具有二分支型二唾液酸糖链天冬酰胺之氨基酸序列的制造方法的步骤的一部分的示意图。具体而言，是在具有促红细胞生成素氨基酸序列中的第1-166之氨基酸序列的片段(A+B+C+D+E+F)中，将半胱氨酸的保护基脱保护的步骤的示意图。
具体实施方式
本说明书中所谓「氨基酸」表示其最大范围的意思，不仅涵盖天然氨基酸，亦涵盖如氨基酸变体及衍生物等非天然氨基酸。本领域技术人员可考虑该广泛定义而理解：本说明书中之氨基酸的实例，例如可以是天然蛋白质原性L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变体及衍生物等经化学修饰之氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等天然非蛋白质原性氨基酸；及具有氨基酸之特征的为本领域公知的特性的经化学合成的化合物等。作为非天然氨基酸的例子，可举出α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、组氨酸类氨基酸(如2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸（homohistidine）、α-氟甲基-组氨酸及α-甲基-组氨酸等)、侧链具有额外亚甲基的氨基酸(「高(homo)」氨基酸)及侧链中的羧酸官能团由磺酸基所取代的氨基酸(半胱氨酸等)。在一优选方式中，本发明的化合物中含有的氨基酸包括非天然氨基酸。
本说明书中所谓「糖链」表示由一个或多个单元糖(单糖和/或其衍生物)连接所成的化合物。由2个以上的单元糖连接时，各单元糖彼此间会通过糖苷键的脱水缩合而结合。作为该糖链，除了例如活体中所含有的单糖类及多糖类(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰基氨基葡萄糖、N-乙酰基半乳糖胺、唾液酸以及其复合物及衍生物)以外，还可举出经分解之多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、糖脂质等复合生物分子所分解或衍生出的糖链等宽范围内的糖链，但并未限定于此。糖链可为直链型或分支链型。
此外，本说明书中，「糖链」亦涵盖糖链衍生物，作为糖链衍生物，例如可举出这样的糖链：构成糖链的糖为具有羧基之糖(例如，C-1位被氧化后成为羧酸的醛糖酸(例如，D-葡萄糖被氧化后所得的D-葡萄糖酸)、末端的C原子成为羧酸的糖醛酸(D-葡萄糖被氧化后所得的D-葡糖醛酸))、具有氨基或氨基衍生物(例如，被乙酰基化之氨基)的糖(例如N-乙酰基-D-氨基葡萄糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺等)、同时具有氨基及羧基的糖(例如N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)、N-乙酰基胞壁酸等)、经脱氧化之糖(例如2-脱氧-D-核糖)、含有硫酸基之硫酸化糖、含有磷酸基之磷酸化糖等糖链，但并未限定于此。
此外，本说明书中，糖链衍生物亦包括其他化合物经脱水缩合等结合至糖链的还原末端而形成的化合物。例如，可举出，对于天冬酰胺结合型糖链，在糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖上进一步结合化合物而形成的结构。亦包括，在其他糖链衍生物的情况下，同样地可在还原末端加成化合物。
作为糖链衍生物，亦包括在糖链的还原末端上加成氨基酸而形成的物质(糖链加成氨基酸)或加成肽、蛋白质、连接体(linker)、荧光基团、脂质、低分子量化合物、放射性化合物等而形成的物质。所述氨基酸不仅包括天然氨基酸，亦包括例如氨基酸变体及衍生物等非天然氨基酸。所述氨基酸、肽、蛋白质等亦可为所包含的如羟基、氨基、羧基等官能团的一部分或全部以保护基保护的氨基酸、肽、蛋白质。作为羟基的保护基，例如可举出甲基、苯甲基、苯甲酰基、乙酰基、三甲基硅(TMS)基、三乙基硅(TES)基、叔丁基二甲基硅(TBS或TBDMS)基等。作为氨基的保护基，例如作为脂溶性保护基可举出9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲基、烯丙氧基羰基、乙酰基等碳酸酯系或酰胺系保护基等。
本说明书中，优选的糖链，就制造要成为医药品的糖蛋白的观点来看，可以是在活体内作为糖复合物(glycoconjugate)(如糖肽(或糖蛋白)、蛋白聚糖、糖脂质等)存在的糖链，更优选为在活体内与肽(或蛋白质)结合而作为糖肽(或糖蛋白)的糖链，如N-结合型糖链、O-结合型糖链等。N-结合型糖链为，其中糖链与蛋白质结合时的连接形式是，糖链还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖中的异头（anomeric）羟基与天冬酰胺侧链的氨基(-NH2)之间经脱水缩合而结合的糖链的总称。O-结合型糖链为，其中糖链结合于蛋白质时的连接形式是，糖链还原末端的异头羟基与丝氨酸或苏氨酸侧链的羟基(-OH)之间经脱水缩合而结合的糖链的总称。
N-结合型糖链有时亦称为天冬酰胺结合型糖链、糖天冬酰胺、N-型糖链等。N-结合型糖链是将Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac作为基本骨架的母核的糖链群。此外，作为糖链的分支结构，已知有2分支型、3分支型、4分支型等多分支型结构，亦包括具有此类分支结构的糖链。这些糖链的结构，例如亦记载于生化学辞典(第3版，株式会社东京化学同人发行)等中。
另外，作为N-结合型复合型糖链，已知亦存在其中由上述糖链结合Fuc(岩藻糖)或Gn(N-乙酰基氨基葡萄糖)的化合物，此类化合物也包括在内。更具体而言，已知的是，对于还原末端之Gn，Fuc以α1,6结合，或在还原末端的Gn上所结合的Man的第4位上，Gn以β1,4结合，在分支部分中Fuc以α1,3或α1,4结合于Gn。此外，上述糖链的分支部分中的结合模式亦包括例如取代Gn(β1,6)Man的Gn(β1,4)Man或Gn(β1,2)Man的化合物、取代Gn(β1,4)Man的Gn(β1,2)Man的化合物；或唾液酸所结合部分上，Sia(α2,6)Gal的一部分为取代Sia(α2,6)Gal的Sia(α2,3)Gal的化合物或Sia(α2,3)Gal的一部分为取代Sia(α2,3)Gal的Sia(α2,6)Gal的化合物等糖苷键的结合模式相异的糖链。
另外，本说明书中，Gn或GlcNAc表示N-乙酰基氨基葡萄糖，Man表示甘露糖，Gal表示半乳糖。
本说明书中所谓「糖链加成氨基酸」表示结合有糖链的氨基酸，例如可举出如上述的N-结合型糖链、O-结合型糖链等。糖链与氨基酸可经由连接体而进行结合。糖链与氨基酸的结合部位并无特别限制，但优选糖链的还原末端结合氨基酸。
糖链所结合的氨基酸的种类并无特别限定，优选的实例包括Asn、Ser、Cys、Lys等，更优选为Asn。
糖链与氨基酸经由连接体进行结合时，连接体的种类并无特别限定，例如可举出-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-(式中，a为整数，只要不会阻碍作为目的的连接体功能即可，并无特别限定，优选为0～4的整数)、C1-10聚亚甲基、-CH2-R-(式中，R是选自由以下基团组成的组的基团脱离1个氢原子所产生的基团：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、碳环基、取代的碳环基、杂环基及取代的杂环基)等。
本说明书中所谓「唾液酸糖链」为上述糖链的非还原末端中的至少1个上具有唾液酸的糖链。因此，例如若为4分支的天冬酰胺结合型糖链，包括在非还原末端具有一个或多个唾液酸的四唾液酸体、三唾液酸体、二唾液酸体、单唾液酸体，若为3分支的天冬酰胺结合型糖链，包括在非还原末端具有一个或多个唾液酸的三唾液酸体、二唾液酸体、单唾液酸体，若为2分支的天冬酰胺结合型糖链，包括在非还原末端具有一个或多个之唾液酸的二唾液酸体、单唾液酸体。此外，唾液酸所存在的非还原末端的位置并无限定。
本说明书中所谓「唾液酸」为神经氨酸(neuraminicacid)的氨基或羟基被取代的物质的总称的家族名。且所谓「神经氨酸」为分子内具有氨基及羧基的特殊9碳糖，由下式表示。
作为唾液酸的结构，对于上述神经氨酸之氨基的取代，已知有氨基的乙酰基化、羟乙酰基化等以外，亦已知使氨基脱离的脱氨基化等，作为羟基的取代，已知有乙酰基化、甲基化、磷酸化、乳酸基化等，但并未限定于此。
本说明书中从天然存在的糖链的加成的观点来看，作为存在于糖链非还原末端的唾液酸，优选是天然存在最多的N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac)，以及排在其后存在的N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc)。特别从作为人糖蛋白而天然存在的糖链的加成的观点来看，以N-乙酰基神经氨酸为优选。
本说明书中所谓“唾液酸糖链加成氨基酸”为具有含唾液酸的唾液酸糖链的上述糖链加成氨基酸，其中，糖链的非还原末端中的至少1个与唾液酸结合。
本发明所使用的唾液酸糖链加成氨基酸可使用由天然物经纯化并加工而成的物质，或表达系统中合成的糖蛋白经纯化而成的物质，或以化学或酶合成的物质等，亦可使用这些物质经进一步糖链延长反应而获得的物质等。糖链延长反应可以根据所希望的糖链结构的糖苷键模式，选择可催化该糖苷键之形成的酶，并根据构成糖链之糖的结合顺序依序进行而实施。
作为由天然物分离唾液酸糖链加成氨基酸的方法，例如可举出特开第2003-128703号所公开的方法，该公开的所有内容已并入本说明书中。根据本发明人们所开发的该方法，各种经分离的糖链天冬酰胺衍生物与过去相比可非常容易且大量地得到。
该方法，例如是包括以下步骤的制造衍生自糖链天冬酰胺的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法：
(a)向含有1种或2种或多于2种的糖链天冬酰胺的混合物所含的糖链天冬酰胺中导入脂溶性保护基，以得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的步骤；以及
(b)以层析法从对该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物所含的糖链天冬酰胺衍生物水解所得的混合物中分离出各糖链天冬酰胺衍生物的步骤。
该糖链天冬酰胺衍生物的制造方法的一大特征为，例如向来自天然糖蛋白的糖链天冬酰胺，优选为由天冬酰胺结合型糖链所得的糖链天冬酰胺的混合物中所含的该糖链天冬酰胺中，导入脂溶性保护基(结合)，以得到糖链天冬酰胺衍生物的混合物，之后从该混合物分离出各糖链天冬酰胺衍生物。
此外，欲取得本发明所使用的唾液酸糖链加成氨基酸，对于从天然物分离或由化学/酶合成的糖链加成氨基酸，可通过本领域技术人员所熟知的方法在其糖链非还原末端上加成唾液酸。例如通过使用CMP-唾液酸与唾液酸转移酶，将唾液酸转移至糖链的非还原末端，制造出唾液酸糖链加成氨基酸。
本说明书中所谓“唾液酸转移酶”为糖转移酶的一种，其为可催化从作为糖供给体(亦称为供体底物)的CMP-唾液酸转移唾液酸残基于作为糖受体(亦称为受体底物)的糖链结构的反应(以下亦称为“唾液酸转移反应”)的酶。已知的是，唾液酸转移酶可转移唾液酸至糖链的非还原末端。唾液酸转移反应可由以下反应式表示。当替代糖链而使用糖链衍生物时，可将式中的糖链由糖链衍生物替换：
[式中，唾液酸-糖链表示在糖链的非还原末端上唾液酸以糖苷键结合的化合物]。
作为唾液酸转移酶，例如已知转移至存在于糖链的非还原末端的：半乳糖的第3位或第6位、N-乙酰基半乳糖胺的第6位，唾液酸的第8位。例如转移唾液酸至半乳糖的第3位的酶称为α-2,3唾液酸转移酶，转移唾液酸至半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺的第6位的酶称为α-2,6唾液酸转移酶，进一步转移唾液酸至唾液酸的第8位的酶称为α-2,8聚唾液酸转移酶。
唾液酸转移酶除来自细菌以外，亦已知来自虹鳟，来自哺乳类等，此外也已在植物中发现具有类唾液酸转移酶活性的蛋白质。特别从利用天然存在的糖链进行加成的观点来看，来自哺乳类者为优选，从制造作为人糖蛋白而天然存在的糖蛋白或其糖链的观点来看，以来自人体者为更优选。
对于来自人体的α-2,6唾液酸转移酶，例如已知有转移至半乳糖的第6位的酶ST6Gal-I(有时以ST6Gal1标识，以下相同)及ST6Gal-II，及转移至N-乙酰基半乳糖胺的第6位的酶ST6GalNAc-I、ST6GalNAc-II、ST6GalNAc-III及ST6GalNAc-IV。
对于来自人体的α-2,3唾液酸转移酶，例如已知有转移至半乳糖的第3位的酶ST3Gal-I～ST3Gal-VI。
本说明书中所谓“CMP-唾液酸”表示胞苷5’-单磷酸唾液酸，其为具有其中唾液酸的第2位的羟基与胞苷一磷酸(CMP)的磷酸基经脱水缩合而成的结构的物质。对于CMP-唾液酸，更具体至特定唾液酸时，可举出CMP-N-乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Ac)、CMP-N-羟乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Gc)等。本说明书中，从制造天然存在的糖蛋白或其糖链的观点来看，作为本发明所使用的CMP-唾液酸，以CMP-N-乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Ac)、CMP-N-羟乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Gc)为优选，特别由制造作为人糖蛋白而天然存在的糖蛋白或其糖链的观点来看，以CMP-N-乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Ac)为更优选。
此外，在本发明中，所谓唾液酸涵盖唾液酸衍生物，可使用以唾液酸衍生物结合于糖链非还原末端的物质。作为唾液酸衍生物，可举出在唾液酸的第7位、第8位或第9位的碳上所结合的羟基被氢原子或卤素原子所取代的衍生物。作为卤素原子，可举出氟、氯、溴等，优选为氟。
此外，唾液酸衍生物可通过制作“CMP-唾液酸衍生物”，使用上述转移酶转移至糖链的非还原末端。对于唾液酸衍生物向糖链非还原末端的转移，例如如国际公开公报第2004/058984号手册所记载，该手册所有公开内容皆并入本说明书中。
本发明的一实施方式中，具有唾液酸的糖链加成氨基酸为天冬酰胺结合型糖链时，可具有或不具有分支结构，只要非还原末端中的至少1个具有唾液酸即可。此外，分支结构并无特别限定，选自二分支、三分支、四分支。此外，天冬酰胺结合型糖链具有分支结构时，至少1个非还原末端上具有唾液酸即可，对应非还原末端的数目，可在1个、2个、3个或全部非还原末端上具有唾液酸。
本发明的一实施方式中，具有唾液酸的糖链加成氨基酸为天冬酰胺结合型糖链时，在一个糖链上，可优选具有4个或更多，例如5个或更多、7个或更多，特别为9个或更多的糖。
本发明的一优选方式中，具有唾液酸的糖链加成氨基酸为天冬酰胺结合型糖链时，在一个糖链上，可具有5～11个、9～11个或9个糖。
本发明的一优选方式中，具有唾液酸的糖链加成氨基酸为天冬酰胺结合型糖链时，其为下述式(7)所示的糖链。
[式中，R3及R4之一方为式(3)，另一方为氢原子或式(3)～(6)所示的基团]。
由上述方法所得的唾液酸糖链加成氨基酸在使用于本发明的固相合成法前，制备成氨基酸的氨基由Boc基所保护，且位于糖链上的非还原末端的唾液酸的羧基由苯甲酰甲基基团所保护。
本说明书中所谓「苯甲酰甲基物」如下式所示(但其中X为氢原子)。
此外，作为适用于本发明的苯甲酰甲基物的衍生物，可举出上述式中X=Cl或Br的物质。
本说明书中所谓「苯甲酰甲基」由下式表示。
向唾液酸糖链加成氨基酸的氨基导入Boc基，可通过以往熟知的方法进行导入。例如可通过在DMSO中将N-(叔丁氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Boc-OSu)或二叔丁基二碳酸酯[(Boc)2O]在碱(例如三乙基胺、二异丙基乙基胺等)存在下加入后导入。反应条件并无特别限定，例如可在室温下以约数小时(1～5小时)进行导入。
另外，通过将Boc导入天然物以分离Boc-唾液酸糖链加成氨基酸衍生物时，通过直接将苯甲酰甲基基团导入于Boc-唾液酸糖链加成氨基酸衍生物，可使用于本发明的固相合成法。
向唾液酸糖链加成氨基酸衍生物导入苯甲酰甲基基团时，例如可预先将糖链加成氨基酸衍生物溶解于5mM的碳酸铯后进行冷冻干燥，对于所得的冷冻干燥粉末添加DMF，再添加苯甲酰甲基溴化物，在室温下进行6小时或更长的搅拌，以实施导入。溶解于碳酸铯时的pH，以3～8之范围内为优选，以3～4.5的范围时为更优选，以3.6为最优选。
此外，例如向含有糖链的天然糖链混合物导入Fmoc，并将经分离的Fmoc-唾液酸糖链加成氨基酸衍生物作为原料时，通过包括以下步骤的方法可制造其氨基酸的氨基由Boc基所保护且唾液酸的羧基由苯甲酰甲基所保护的唾液酸糖链加成氨基酸衍生物：
(a)以苯甲酰甲基保护Fmoc-唾液酸糖链加成氨基酸衍生物的唾液酸的羧基的步骤；
(b)将前述Fmoc-唾液酸糖链加成氨基酸衍生物的Fmoc脱离的步骤；以及
(c)在前述步骤所得的唾液酸糖链加成氨基酸中导入Boc基的步骤。
另外，上述(a)～(c)的步骤可通过本说明书所记载的方法或过去熟知的方法进行。
将以上所得的其唾液酸以苯甲酰甲基保护的Boc-唾液酸糖链加成氨基酸衍生物使用于Boc固相合成，可直接提供在糖链非还原末端具有唾液酸的糖肽。
(固相合成法)
本发明的固相合成可通过公知方法或与之类似的方法进行。
例如未经糖链加成的片段可通过以下(1)～(4)的步骤合成而成为任意的氨基酸序列：
(1)使具有羟基的树脂(resin)的羟基与以Boc基保护氨基氮的氨基酸的羧基进行酯化反应。此时的氨基酸的氨基氮因由Boc基保护，故可防止氨基酸彼此间的自身缩合，从而可使树脂的羟基与氨基酸的羧基进行反应而引起酯化。
(2)使上述所得的酯的Boc基脱离以形成游离氨基。
(3)进行一次或多次的以下(i)及(ii)步骤。由此，连接任意数目的任意氨基酸，获得在C末端结合有树脂并在N末端具有游离氨基的肽。
(i)使该游离氨基与以脂溶性保护基保护氨基氮的任意氨基酸的羧基进行酰胺化反应。
(ii)使上述Boc基脱离以形成游离氨基。
(4)以酸切断树脂。
此外，加成糖链的片段时，例如可使用国际公开第2004/005330号手册(US2005222382(A1))所记载的方法，所有公开内容以引用方式并入本说明书。
具体而言，通过上述(1)～(3)的步骤，自C末端侧起合成至糖链加成氨基酸之前，然后使以Boc基保护氨基氮且唾液酸的羧基以苯甲酰甲基保护的唾液酸糖链加成氨基酸衍生物的羧基与(3)中的游离氨基进行酰胺化反应，接着使唾液酸糖链加成氨基酸衍生物的Boc基脱离以形成游离氨基。
其后，将上述(3)重复所需的次数，最后以酸切断树脂后，得到在任意位置上加成有糖链的具有任意氨基酸序列的唾液酸糖链加成肽。
另外，对于上述(1)，若使具有羟基的树脂(resin)的羟基与以Boc基保护氨基氮且唾液酸的羧基以苯甲酰甲基保护的唾液酸糖链加成氨基酸衍生物的羧基进行酯化反应，可得到在C末端氨基酸处加成糖链的唾液酸糖链加成肽。
此外，结合以Boc基保护氨基氮的唾液酸糖链加成氨基酸衍生物后，若合成立即结束，以酸切断树脂，可得到于在N末端氨基酸处加成糖链的唾液酸糖链加成肽。
另外，可包括连接唾液酸糖链加成氨基酸的步骤达至少1次以上的任意次数。此外，包括多次时，可连续或非连续地进行连接唾液酸糖链加成氨基酸的步骤，在目标糖肽的氨基酸序列中，可适宜地设定为可在该序列的任意处进行加成。
另外，本发明的一实施方式中，可将目标糖蛋白分为几个片段，分别合成各片段，通过接合法使其连接而制作目标糖蛋白。
作为本发明的一优选方式，所制造的唾液酸糖链的结构可实质地为均匀。本说明书中，所谓实质均匀的糖链结构是指，在具有唾液酸糖链的糖肽间做比较时，糖链加成部位、构成糖链之各糖的种类、结合顺序及糖间的结合模式均相同，至少90%以上，优选为95%以上，更优选为99%以上的糖链结构为均匀。糖链均匀的糖肽，品质恒定，特别优选用于医药品的制造或检测等领域中。均匀糖链的比率，例如可通过使用HPLC、毛细管电泳、NMR、质谱分析等方法进行测定。有关糖链结构为均匀的糖链的制造，如国际公开第03/008431号手册(US2004181054(A1))、国际公开第2004/058984号手册(US2006228784(A1))、国际公开第2004/058824号手册(US2006009421(A1))、国际公开第2004/070046号手册(US2006205039(A1))、国际公开第2007/011055号手册中所记载，该公开内容全体以参照的方式并入本说明书。
作为具有羟基的树脂(resin)，一般为具有使用于固相合成的羟基的树脂(resin)即可，例如可使用Amino-PEGA树脂(Merck公司制)、Wang树脂(Merck公司制)、HMPA-PEGA树脂(Merck公司制)、HMPB-PEGA树脂(Merck公司制)等。从在固相合成后进行硫酯化的观点来看，以HMPB-PEGA树脂为优选。
作为氨基酸，可使用所有氨基酸，例如可举出天然氨基酸之丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬酰氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯基丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)。此外，作为非天然氨基酸，例如可举出D-氨基酸；氨基酸变体及衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等。
本发明的固相合成法中，作为氨基酸的氨基的保护基，因为以Boc基进行保护，经固相合成后在酸性条件下可脱离Boc基，故可使用对碱不稳定（base-labile）的非天然氨基酸而合成糖肽。另外，本说明书中所谓「对碱不稳定的非天然氨基酸」是指，在碱性条件下(特别是在Fmoc固相合成法中，在Fmoc的脱离条件下)，例如化学键会切断等而使化学结构损坏的非天然氨基酸。另外，Boc固相合成法中因未使用如上所述的碱，故可直接由固相合成制作出对碱不稳定的肽硫酯。
Boc基的导入可在与向上述唾液酸糖链加成氨基酸导入的条件同样的条件下进行。
另外，使用Boc基作为脂溶性保护基的固相合成法称为Boc固相合成法。
作为以Boc基进行保护的氨基酸，可将上述氨基酸以上述方法而制得。此外，亦可使用市售产品。例如可举出Boc-Ser、Boc-Asn、Boc-Val、Boc-Leu、Boc-Ile、Boc-Ala、Boc-Tyr、Boc-Gly、Boc-Lys、Boc-Arg、Boc-His、Boc-Asp、Boc-Glu、Boc-Gln、Boc-Thr、Boc-Cys、Boc-Met、Boc-Phe、Boc-Trp、Boc-Pro。此外，作为以Boc基保护的非天然氨基酸，可由与氨基酸的保护同样的方法所制造。此外，亦可使用市售产品。
此外，以脂溶性保护基所保护的氨基酸中，作为在侧链导入保护基的氨基酸，例如可举出Boc-Arg(di-Z)、Boc-Asn(Xan)、Boc-Asp(Bn)、Boc-Cys(Acm)、Boc-Glu(Bn)、Boc-His(DNP)、Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-Ser(Bn)、Boc-Thr(Bn)、Boc-Trp(CHO)、Boc-Tyr(Br-Z)等。
此外，在本说明书中，Thz表示Cys的噻唑烷型(噻唑烷-4-羧酸)。此外，(di-Z)表示二苄氧羰基(N,N-双-(苯甲氧基羰基)-)，(Xan)表示呫吨基（xanthylgroup），(Bn)表示苯甲基，(Acm)表示乙酰氨甲基，(tBu)表示叔丁基，(Trt)表示三苯甲基，(DNP)表示2,4-二硝苯基，(Cl-Z)表示[(2-氯苯基)甲氧基]羰基，(CHO)表示甲酰基。
作为酯化催化剂，例如可使用1-均三甲苯磺酰-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)等公知脱水缩合剂。氨基酸与脱水缩合剂的使用比率，相对于前者1重量份而言，后者一般为1～10重量份，优选为2～5重量份。
酯化反应为优选通过例如将树脂放入固相柱，将该树脂以溶剂洗净，其后加入氨基酸溶液后来进行。作为洗净用溶剂，例如可举出二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷等。作为溶解氨基酸的溶剂，例如可举出二甲基亚砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反应在0～50℃，优选为在室温中，进行约10分钟～2小时左右，优选为进行5分钟～15分钟左右。
此时还优选使用乙酸酐等将固相上的未反应羟基予以乙酰基化以将其覆盖(capping)。
Boc基的脱离，例如可通过酸处理而进行。作为酸，例如可举出10%硫酸/二噁烷溶液、50%三氟乙酸/二氯甲烷、对甲苯磺酸/四氢呋喃-二氯甲烷等。
使游离氨基与以Boc基保护氨基氮的任意氨基酸的羧基进行酰胺化的反应，可优选在活化剂及溶剂的存在下进行。
作为活化剂，例如可举出二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(WSC/HCl)、叠氮磷酸二苯酯(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、二乙基氰膦酸酯(DEPC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸酯(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-偶氮苯并三唑(HOAt)、羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、3,4-二氢-3-氢二-4-氧杂-1,2,3-苯并三嗪(Dhbt)等。
活化剂的使用量对于以Boc基保护氨基氮的任意氨基酸而言，以0.8～10当量为优选，更优选为0.8～2当量，进一步优选为0.95当量。
作为溶剂，例如可举出DMSO、DMF、二氯甲烷等。反应在0～50℃，优选为室温下，进行约10分钟～约2小时，优选为5分钟～15分钟左右。
若要从树脂(resin)切断肽链，优选以酸进行处理。作为酸，例如可举出三氟乙酸/三氟甲烷磺酸(TfOH)、氟化氢(HF)、甲烷磺酸、三氟乙酸/三氟甲烷磺酸/二甲基硫化物/间甲酚(m-甲酚)的混合酸等超强酸。
本发明中所使用的糖链可以是该糖链上的羟基受到保护的糖链。作为保护基，例如可举出乙酰基、三乙基硅烷基等。优选为从合成的糖肽切断的同时可以用酸进行处理的保护基。例如可举出三乙基硅烷基。
此外，对于本发明，有时在固相合成法优选使用微波法。所谓微波法为，例如BacsaB.etal.,J.Org.Chem.(2008)73:7532-7542所记载的方法，该所有公开内容皆以参照方式并入本说明书中。
微波法为在氨基酸缩合步骤或脱保护步骤时，照射微波，以解决基于例如分子内的凝集或二级结构的形成、由保护基所造成的立体位阻等的问题的方法，适用于一般方法下不容易合成的肽特别是长链肽的合成。微波照射的条件可由本领域技术人员根据氨基酸序列，为防止在反应时热或能量的施加所造成的副反应的产生，而作适宜决定。
(C末端的硫酯化)
此外，本发明的一实施方式中，可制作出糖肽片段，以用于通过接合而连接，制造目标糖蛋白。即，为进行接合，可将所制造的具有唾液酸糖链的糖肽片段的C末端硫酯化，即在C末端可形成α-羧基硫酯部分。在C末端具有以-C(=O)-SR表示的α-羧基硫酯部分的肽片段(或糖肽片段)的制造方法可使用公知方法或类似的方法。该方法例如如国际公开第96/34878号手册(美国专利第6184344号说明书)所记载，该所有公开内容皆以参照方式并入本说明书中。
其中，R并无特别限定，只要不阻碍硫醇交换反应，可在对羰基碳的亲核取代反应中成为离去基团即可，优选为选自苯甲基硫醇等苯甲基型、硫代酚、4-(羧基甲基)-硫代酚等芳基型、2-巯基乙烷磺酸盐、3-巯基丙酰胺等烷基型等。
作为制造在C末端具有α-羧基硫酯部分的肽片段的方法，具体而言，例如可举出从固相切出肽时进行硫酯化的方法，或从固相切出肽后将肽的C末端羧基硫酯化的方法等。作为从固相切出肽时进行硫酯化的方法，例如已知的有在固相树脂上使用SafetyCatchLinker(硫酰胺连接体)以制造肽，使硫醇化合物对其起作用的方法(J.Am.Chem.Soc.,(1999)121:11369-11374、Angew.Chem.Int.Ed.,(2005)44:1650-1654)。
然而，上述方法需要将硫酰胺连接体烷基化，存在该烷基化效率较差，而且所使用的树脂昂贵等限制。
作为制造在C末端具有α-羧基硫酯部分的肽片段的其他方法，还有在固相合成的开始时，通过将硫酯体结合于树脂，从树脂切出肽时得到硫酯体的方法。该方法并不适用于在脂溶性保护基的脱离反应中需要碱的Fmoc固相合成法，但可适用于本发明的Boc固相合成法。例如，在将巯基丙酸与树脂进行硫酯结合后，通过连接氨基酸，从树脂切离所制作的肽时可制得肽硫酯。
另外，本发明的一实施方式中，可同时进行制备糖肽片段的步骤与将糖肽片段的C末端硫酯化的步骤。
作为同时进行制备糖肽片段的步骤与将糖肽片段的C末端硫酯化的步骤的方法，例如可以是，制备出具有在各糖肽片段的C末端侧加成内含肽（intein）的氨基酸序列的融合蛋白质，在通过内含肽反应切断内含肽的同时，将片段的C末端硫酯化。该方法，例如如MuralidharanV,etal.(NatureMethods(2006)Vol.3No.6429-438)所记载，该公开内容皆以参照方式并入本说明书中。
此外，糖肽片段亦可通过KCL法进行连接。使用KCL法时，所提供的第一糖肽片段的C末端的硫酯必须比第二糖肽片段的C末端的硫酯具有更高的脱离能力。借此，通过反应速度的差异，可在第一糖肽片段的C末端侧上结合第二糖肽片段，可抑制不正确连接的副产物等的生成。
一般而言，由于硫醇基的反应性顺序依次为芳基硫醇基>苯甲基型硫醇基>烷基型硫醇基，故依据该顺序，在一方肽片段的C末端上设置比另一方的肽片段的C末端具有更高反应性的硫醇基。
例如，优选的是，第一糖肽片段的C末端为硫苯基酯与第二糖肽片段的C末端为乙基硫酯之组合；第一糖肽片段的C末端为4-巯基苯基硫酯(MPAA)与第二糖肽片段的C末端为苯甲基硫酯之组合；第一糖肽片段的C末端为硫苯基酯与第二糖肽片段的C末端为巯基乙烷磺酰酯之组合等。
此外，糖肽片段的N末端Cys的-SH基可视需要以保护基进行保护。例如可将-SH基作为噻唑烷进行保护。该保护基可在进行接合反应前的所希望的时间点进行脱保护。例如二硫化物基团等在发生接合的条件下自然脱保护的保护基，可在不作脱保护的情况下直接使用于以下接合反应。二硫化物基团在其后的接合法反应条件下可容易地脱保护。
(通过接合法的连接步骤)
本发明的一实施方式中，可通过本领域技术人员已知的方法，将通过本发明的制造方法所制造的糖肽片段与其他肽片段或其他糖肽片段进行连接。另外，作为其他肽片段及其他糖肽片段，不限于Boc固相合成法所得，可使用通过Fmoc固相合成法、其他化学合成、生物合成等本领域技术人员所公知的方法所得的片段。
例如，将2个糖肽片段根据需要在4-巯基苯基乙酸、苯甲基硫醇、硫代酚等催化剂硫醇存在下，在100mM磷酸缓冲溶液等溶液中进行混合。优选为，相对于1当量的第一糖肽片段而言，在第二糖肽片段为0.5～2当量及催化剂硫醇为约5当量的比率下进行反应。反应为pH6.5～7.5左右，20～40℃左右的条件下，约进行1～30小时左右为优选。反应的进度可使用组合HPLC、MS等公知方法进行确认。
向此处加入如三（2-羧基乙基）膦盐酸盐(TCEP)等还原剂时可抑制副反应的发生，视需要可进行纯化，以连接第一肽片段与第二肽片段。
此外，KCL法为由Kent所报道的受到反应速度论的控制的NCL法(Kentetal.,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3985-3988)。NCL法是其中所连接的2个片段中，一方的C末端为羧基，另一方的C末端被硫酯化，在经硫酯化的片段的C末端侧上结合另一方片段的方法。与此相比，KCL法可使用于所要连接的片段双方均被硫酯化的情形，具有更高脱离能力的硫酯将发生连接反应。
如上所述，硫醇基的反应性大概顺序为芳基硫醇基>苯甲基型硫醇基>烷基型硫醇基。因此，对于C末端的硫酯-C(=O)-SR，R为芳基时具有更高的脱离能力，依次为R为苯甲基者，及R为烷基者。基于此，通过确定各片段的硫酯，可按所希望的顺序连接各片段。例如，若一方为硫苯基酯，另一方为乙基硫酯，硫苯基酯首先发生连接反应，得到在C末端具有乙基硫酯的肽。若一方为4-巯基苯基硫酯(MPAA)，另一方为苯甲基硫酯，MPAA首先进行反应，得到在C末端具有苯甲基硫酯的肽，若一方为硫苯基酯，另一方为巯基乙烷磺酰酯，硫苯基酯首先进行反应，得到在C末端具有巯基乙烷磺酰酯的肽。
如此通过KCL法所得的肽链因在C末端具有硫酯，故可将该肽链直接使用于与其他片段的接合。
(蛋白质折叠步骤)
此外，本发明的另一方式中，制得具有唾液酸糖链的糖肽后，连接片段，并进行蛋白质折叠步骤，亦可进行处理以使其呈现适宜的高级结构。
蛋白质折叠步骤可使用各种公知方法，例如可通过在蛋白质折叠缓冲液中通过透析来进行。蛋白质折叠缓冲液例如含有胍等具有胍基的化合物或其盐，pH可为6.0～9.0。透析可进行多次，其中各透析处理的缓冲液的组成或pH可相同或相异。
多肽进行蛋白质折叠时，可由解析多肽的立体结构的任意方法进行确认，例如可举出二硫化物制图法、特异于立体结构的表位的抗体的结合性的评估、X射线解析等，但并未限定于此。
另外，本说明书中所使用的术语用于说明特定实施方式，目的不在于限定本发明。
此外，本说明书中所使用的“包括/包含/含有”等用语，除文字上可作明显不同理解的情形之外，表示存在所记载的事项(构件、阶段、要素、数字等)，但不排除除此以外的事项(构件、阶段、要素、数字等)的存在。
除非有另外的定义，在此所使用的所有用语(含有技术用语及科学用语)具有与本发明所属技术领域的技术人员所广泛理解的相同的意思。在此所使用的用语，若未明示不同的定义，必须解释为具有与本说明书及相关技术领域中的意思一致的含义，不能被解释为经理想化或过度形式化的意思。
本发明的实施方式可参照示意图而得到说明，对于示意图，为了明确说明，有时会有夸张的呈现。
第一、第二等用语用于表现种种要素时，必须理解这些要素并未被这些用语所限定。这些用语仅使用于一要素需与其他要素区分时，例如将第一要素记载为第二要素时，同样地将第二要素记载为第一要素时，并未脱离本发明之范围。
以下将参照实施例对本发明作详细说明。然而，本发明可通过各式各样的方式来显现，不能解释为仅限定于所记载的实施例。
实施例
实施例1.Boc-二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺(Boc-diphenacyl--disialooligo-asparagine)的合成
(I)Fmoc-二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺(Fmoc-diphenacyl--disialooligo-asparagine)的合成
将Fmoc-二唾液酸糖链天冬酰胺(20mg)溶解于2ml冷水，使溶解Fmoc-二唾液酸糖链天冬酰胺的冷水通过Dowex-50×8(H+)树脂(10.5cm×5cm)，将溶出的溶液冷冻干燥。将经冷冻干燥的溶液溶解于10ml的水中，使用5mM的碳酸铯(Cs2CO3)水溶液将溶液pH调节成3.6。其后将溶液再度冷冻干燥。将冷冻干燥后的Fmoc-二唾液酸糖链天冬酰胺溶解于干燥DMF(4ml)，加入苯甲酰甲基溴化物(5.7mg)。经8小时后，对该混合溶液，加入乙醚(20ml)，析出目标物。将此以滤纸进行过滤。收集残余的沉淀物，于沉淀物中加入水：乙腈=7：3之溶液并溶解，以HPLC进行纯化。通过以上操作，可得到目标Fmoc-二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺(16mg，产率76%)。
Fmoc-diphenacyl-disialooligo-asparagine
ESI-MS:C119H166N8O68计算值:2796.6[M+H]+,1399.3[M+2H]2+;结果:2798.2[M+H]+,1399.6[M+2H]2+。
(II)Boc-二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺(Boc-diphenacyl--disialooligo-asparagine)的合成
向Fmoc-二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺(Fmoc-diphenacyl-disialooligo-asparagine)(20mg)中，加入溶解有1-甲基吡咯烷(75μL)、六亚甲基亚胺(2μL)、及HOBt(2mg)的干燥DMF(100μL)，在常温进行搅拌并使其溶解。经30分钟后，再加入乙醚，析出Fmoc已脱离后的二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺。回收沉淀物，蒸发乙醚后，将沉淀物溶解于蒸馏水。将溶解沉淀物之蒸馏水通过ShephadexG-15进行纯化后，将溶出的溶液冷冻干燥。将所得之二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺溶解于DMF(1mL)，加入Boc2O(4.8μL)并在常温下进行搅拌，导入Boc基。4小时后，加入乙醚，收集沉淀物。将沉淀物溶解于50mM乙酸铵：水=82：17，以HPLC进行纯化。通过以上操作，可得到目标之Boc-二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺(13mg，产率68%)。
Boc-diphenacyl-disialooligo-asparagine
ESI-MS:C109H164N8O68计算值:2674.5[M+H]+,1338.2[M+2H]2+;结果:2675.8[M+H]+,1338.4[M+2H]2+。
实施例2.糖肽硫酯体的合成(TN(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)YSVTDLNY-SR)
I)肽链的制备
固相合成使用聚苯乙烯柱(东京理科，No.183470)进行。于聚苯乙烯柱放入Amino-PEGA树脂(50μmol、1.67g)，于DMF溶剂充分调制。其后向Amino-PEGA树脂中，加入将S-三苯甲基-3-巯基丙酸(S-trityl-3-mercaptopropionicAcid)(200μmol)、HBTU(190μmol)、及DIPEA(800μmol)溶解于DMF的溶液，在常温下进行搅拌。经30分钟后，以DMF与DCM洗净树脂，加入95%TFA、5%TIPS。2分钟后过滤溶液，再度加入TFA与TIPS，经2分钟后，将树脂以DMF洗净。对于该树脂，将溶解Boc-Tyr(OBn)-OH(200mM)、HBTU(190mM)、DIPEA(400mM)之DMF的混合溶液加入于树脂中，使第一残基之氨基酸的酪氨酸进行缩合。20分钟后，将树脂依次以DMF、二噁烷进行洗净。对该树脂，加入10%硫酸/二噁烷溶液，5分钟后过滤，再加入相同溶液，并进行30分钟搅拌以进行Boc基的脱保护。随后的氨基酸(Boc-Asn(Xan)-OH、Boc-Leu-OH、Boc-Asp(OBn)-OH、Boc-Thr(OBn)-OH、Boc-Val-OH、Boc-Ser(OBn)-OH、Boc-Tyr(OBn)-OH)亦使用同样方法进行缩合。
II)唾液酸糖链加成氨基酸的缩合及其后的氨基酸缩合
将肽硫酯被延长的树脂(2μmol)的Boc基以上述方法进行脱保护后，以DMF洗净，加入5%DIPEA/DMF。经1分钟后，加入DMF并洗净，加入将Boc-二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺(4μmol)、DEPBT(6μmol)、及DIPEA(4μmol)溶解于DMF之溶液，在常温进行搅拌。经14小时后，将树脂以DMF充分洗净。之后的肽延长(Boc-Tyr(OBn)-OH)中，为防止糖链羟基的副反应，在氨基酸40mM之浓度下以上述同样方法进行缩合。
III)氨基酸侧链的脱保护与从树脂切出
将树脂以DCM洗净后，加入含有TFA(350μL)、DMS(210μL)、间甲酚(70μL)、及TfOH(70μL)，且冷却至0℃的混合物（“鸡尾酒”；Cocktail)，于0℃进行搅拌。经30分钟后过滤溶液，将树脂以TFA、乙醚、DMF、DCM、TFA之顺序洗净，再次加入相同量的上述混合物，在0℃进行搅拌。经2小时后过滤溶液，以TFA、乙醚、DMF的顺序充分洗净树脂。将MESNa(5mg)溶解于含有6M胍盐酸盐之200m磷酸盐缓冲液(95μL)，加入于该树脂中。经12小时后，将包含于溶出溶液的化合物通过HPLC分析并进行纯化。其结果得到具有二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺，且具有TN(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)YSVTDLNY-SR之氨基酸序列的糖肽(1)(SEQIDNO.1)。注：前述氨基酸序列中，N(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)表示糖链天冬酰胺，-SR表示磺酸乙基硫酯。
实施例3.具有唾液酸糖链的糖肽硫酯体的合成(SLQN(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)ASAIES-SR)
I)肽硫酯体的制备
固相合成使用聚苯乙烯柱(东京理科，No.183470)来进行。于聚苯乙烯柱放入Amino-PEGA树脂(50μmol，1.67g)，以DMF溶剂充分调制。其后向Amino-PEGA树脂中，加入将S-三苯甲基-3-巯基丙酸(S-trityl-3-mercaptopropionicAcid)(200μmol)、HBTU(190μmol)、及DIPEA(800μmol)溶解于DMF之溶液，在常温下进行搅拌。30分钟后，以DMF与DCM将树脂充分洗净，加入95%TFA、5%TIPS。2分钟后将溶液充分过滤，再度加入TFA与TIPS，经2分钟后，将树脂以DMF充分洗净。对该树脂，将Boc-Ser(OBn)-OH(200mM)、HBTU(190mM)、DIPEA(400mM)溶解于DMF之混合溶液加入于树脂中，可缩合第一残基之氨基酸的丝氨酸。20分钟后，将树脂以DMF、二噁烷之顺序洗净。对该树脂，加入10%硫酸/二噁烷溶液，5分钟后过滤，再加入相同溶液并进行30分钟搅拌后进行Boc基之脱保护。之后的氨基酸(Boc-Glu(OBn)-OH、Boc-Ile-OH、Boc-Ala-OH、Boc-Ser(OBn)-OH、Boc-Ala-OH)亦以同样方法进行缩合。
II)唾液酸糖链加成氨基酸的缩合及其后氨基酸缩合
将肽硫酯被延长的树脂(2μmol)的Boc基以上述方法进行脱保护后，以DMF洗净，加入5%DIPEA/DMF。经1分钟后，以DMF充分洗净，加入将Boc-二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺(4μmol)、DEPBT(6μmol)、及DIPEA(4μmol)溶解于DMF之溶液，在常温下进行搅拌。经14小时后，将树脂以DMF充分洗净。上述条件下再度进行糖链之缩合。之后的肽延长(Boc-Gln-OH、Boc-Leu-OH、Boc-Ser(OBn)-OH)中，为防止糖链羟基的副反应，在氨基酸40mM的浓度下以上述同样方法进行缩合。
III)氨基酸侧链的脱保护与从树脂切出
将树脂以DCM洗净后，加入含有TFA(350μL)、DMS(210μL)、间甲酚(70μL)、及TfOH(70μL)，切冷却至0℃的混合物(Cocktail)，在0℃进行搅拌。30分钟后，过滤溶液，将树脂以TFA、乙醚、DMF、DCM、TFA的顺序洗净，再度添加相同量的上述混合物(Cocktail)，在0℃进行搅拌。2小时后过滤溶液，以TFA、乙醚、DMF之顺序充分洗净树脂。将MESNa(5mg)溶解于含有6M胍盐酸盐的200m磷酸盐缓冲液(95μL)，加入于该树脂中。12小时后，将于溶出溶液中所含的化合物通过HPLC进行分析、纯化。其结果，可得到具有二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺并具有氨基酸序列SLQN(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)ASAIES-SR的糖肽(2)(SEQIDNO.2)。另外，前述氨基酸序列中，N(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)表示糖链天冬酰胺，-SR表示磺酸乙基硫酯。
糖肽-硫酯
ESI-MS:C143H222N18O83S2计算值:3585.5,[M+H]+,1793.8[M+2H]2+,1196.2[M+3H]3+；
结果:3586.9,[M+H]+,1794.0[M+2H]2+,1196.3[M+3H]3+
试剂简称：
DMF:N,N-二甲基甲酰胺；DCM:二氯甲烷；HOBt:1-羟基苯并三唑；TFA:三氟乙酸；DEPBT:3-(二乙氧基-磷酰氧基)-3H-苯并[d][1,2,3]三嗪-4-酮；HBTU:2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯；DIPEA:N,N-二异丙基乙胺
实施例4.促红细胞生成素的合成
(I)促红细胞生成素的合成流程
天然促红细胞生成素为具有166个氨基酸的序列，于第24位、38位、及83位上具有天冬酰胺(N)结合型糖链，于第126位上具有结合于丝氨酸的O结合型糖链。下述实施例中，合成糖肽，该糖肽是在天然促红细胞生成素的氨基酸序列中，将第24位及第38位糖链加成天冬酰胺变换为未加成糖链的天冬酰胺，将第21位谷氨酸变换为半胱氨酸，将第78位谷氨酰胺变换为半胱氨酸，将第126位糖链加成丝氨酸变换为未加成糖链的丝氨酸，并且在该氨基酸序列中的第83位上具有唾液酸糖链天冬酰胺。另外，取代第21位谷氨酸及第78位谷氨酰胺所插入的半胱氨酸用于接合的连接部位。本实施例举例说明了制造具有1～166个氨基酸的促红细胞生成素氨基酸序列的方法，其被分为六个片段：具有第1位～21位之氨基酸的肽片段A、具有第22位～49位之氨基酸的肽片段B、具有第50位～78位之氨基酸的肽片段C、具有第79位～97位之氨基酸的糖链加成肽片段D、具有第98位～127位之氨基酸的肽片段E、具有第128位～166位之氨基酸的肽片段F。
更具体而言，举例说明了包括下述步骤的制造方法：
(A)制作出由下式(8)所示的肽片段A、下式(9)所示的肽片段B、下式(10)所示的肽片段C、下式(11)所示的糖链加成肽片段D、下式(12)所示的肽片段E、及下式(13)所示的肽片段F的步骤。
另外，式中R1表示Acm基。片段A、片段B、及片段F在对应于天然促红细胞生成素的氨基酸序列中第7位、29位、33位、161位之位置上各具有含Acm基的半胱氨酸。此外，R2表示甲酰基(CHO)。片段D为，在对应天然促红细胞生成素的氨基酸序列中之第88位的位置上具有以甲酰基保护的色氨酸。此外，R3与邻接的S(硫)一起表示磺酸乙基硫酯，R4表示苯基，R5表示苯甲基。
在各片段中，用于通过接合来连接的C末端被硫酯化。此外，在各片段中，用于通过接合来连接的N末端具有半胱氨酸。此外，上式所示的肽片段C、糖链加成肽片段D、及肽片段E，为避免各C末端侧之接合步骤中的副反应，在N末端侧具有作为噻唑烷型的半胱氨酸。
上述片段B、片段C、糖链加成片段D、片段E、及片段F的N末端之氨基酸为天然促红细胞生成素氨基酸序列中之第22位、50位、79位、98位、及128位的丙氨酸。然而，本实施例中，在接合步骤中所要连接的片段的N末端必须具有半胱氨酸。因此，在各制造例中，将片段B、片段C、糖链加成片段D、片段E、及片段F的N末端的氨基酸，合成为半胱氨酸而不是丙氨酸。替代丙氨酸的半胱氨酸在各片段彼此接合后被还原为丙氨酸。
(B)将片段A与片段B通过接合使其连接而制作成片段(A+B)的步骤(参照图5)。
另外，在本说明书中，例如所谓片段(A+B)表示通过连接片段A的C末端与片段B的N末端所得的片段。
(C)将片段E与片段F通过接合而连接后制作成片段(E+F)的步骤及、将片段(E+F)的N末端的噻唑烷型半胱氨酸转化为半胱氨酸的步骤(参照图6)。
(D)将片段D与片段(E+F)通过接合而连接后制作成片段(D+E+F)的步骤、将片段(D+E+F)的N末端的噻唑烷型半胱氨酸转化为半胱氨酸的步骤、以及除去色氨酸上的甲酰基(CHO)基、及糖链唾液酸上的苯甲酰甲基的步骤(参照图7)。
(E)将片段C与片段(D+E+F)通过接合而连接后制作成片段(C+D+E+F)，将使用于接合的半胱氨酸还原为丙氨酸，将片段(C+D+E+F)的N末端的噻唑烷型半胱氨酸转化为半胱氨酸的步骤(参照图8)。
(F)将片段(A+B)与片段(C+D+E+F)通过接合而连接后制作成片段(A+B+C+D+E+F)的步骤(参照图9)。
(G)在片段(A+B+C+D+E+F)中，将使用于接合的半胱氨酸还原为丙氨酸的步骤(参照图10)。
(H)将半胱氨酸的保护基脱保护的步骤(参照图11)。
(II)各肽片段的合成
(II-1.肽片段A-SPh的合成)
本说明书中，肽片段A-SPh的“-SPh”表示硫苯基。即，所谓肽片段A-SPh表示于肽片段A的C末端具有硫苯基的片段。
在固相合成柱中放入HMPB-PEGA树脂(Merck公司制)(50μmol)，将Fmoc-Ala(0.25mmol)、MSNT(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.27mmol)溶解于DCM(1.25ml)后，放入固相合成柱，在25℃进行2小时搅拌。
搅拌后，将树脂使用DCM、DMF进行洗净。将Fmoc基使用20%哌啶/DMF溶液(2ml)，进行15分钟处理以脱保护。以DMF洗净后，之后的肽链延长使用以下所示方法，依次缩合氨基酸。
将以Fmoc基保护氨基的氨基酸溶解于二甲基甲酰胺(DMF)(1ml)，加入HOBt(0.25mmmol)、二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.25mmmol)，经5～10分钟活化后，加入于固相合成柱。使用微波，在37度下进行15分钟反应后，将树脂使用DCM及DMF进行洗净。重复进行该操作，使用以Fmoc基及Boc基保护之氨基酸(0.25mmol)，将氨基酸依次缩合。但是，仅Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-His(Trt)之氨基酸不使用微波，而是在室温进行15分钟反应。
作为将氨基酸之氨基氮以Fmoc基保护的氨基酸，依次使用Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Val、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Ile、Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Pro、Fmoc-Pro、Fmoc-Ala，连接于固相树脂。其结果，在固相树脂上得到Ala-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)--Leu-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Ile-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Pro-Ala-NH2之21残基肽(3)(SEQIDNO.3)。
将上述所得之肽(3)使用DCM及DMF进行洗净后，加入三氟乙醇与乙酸之混合溶液(1：1)至充分浸渍树脂的程度，进行12小时的室温下搅拌后，切离树脂与肽3。过滤并除去切离的树脂，将反应溶液在减压下浓缩。将所得之残渣经浓缩后得到氨基酸侧链经保护之肽(3)：Ala-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Ile-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Pro-Ala-NH2。
将具有21残基之氨基酸，且氨基酸侧链经保护的肽3，移至相当于25mL的茄型烧杯中，溶解于DMF(2.5mL)。其后在氮环境下，冷却至-15℃～-20℃。于此加入硫代酚(10.2μl，0.1mmol)后，加入PyBOP(52.0mg，0.10mmol)后继续加入DIPEA(18.0μl，0.1mmol)。于-20℃进行3小时搅拌后，加入乙醚，使肽沉淀。将所得之残渣加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)并在室温进行搅拌。2小时后，再度将此溶液加入于另外准备的乙醚并使其沉淀后，进行离心分离，除去溶液部分后得到含有目标肽硫酯体的残渣。将所得之残渣以HPLC[柱：Vydac(C18)；流速：4.0mL/min；洗脱液A液：0.1%TFA水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN梯度A：B=75：25→25：75(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到C末端为硫苯基酯之肽片段A-SPh(4)(SEQIDNO.4)：H2N-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile--Cys(Acm)-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-Ala-SPh。
ESI-MS:C116H190N32O30S2m/z计算值:[M+2H]2+1289.5,[M+3H]3+860.0,[M+4H]4+645.3；结果：[M+2H]2+1289.3,[M+3H]3+860.0,[M+4H]4+645.3。
(II-2.肽片段B-SBn的合成)
肽片段B-SBn为与上述II-1.肽片段A-SPh的合成方法同样的条件下，通过Fmoc固相合成法所合成。
作为以Fmoc基及Boc基保护的氨基酸，依次使用Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Val、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Pro、Fmoc-Val、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Leu、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Gly、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Cys(Trt)，连接于固相树脂。其结果，在固相树脂上得到Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Val-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)--Pro-Val-Thr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Cys(Acm)---His(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-Cys(Acm)-Gly-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-NH2之28残基肽(5)(SEQIDNO.5)。
将上述所得之肽(5)在与上述II-1.肽片段A-SPh的合成方法同样的条件下进行处理，从树脂上切离后，得到氨基酸之侧链受保护的肽(5)：Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Val-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Val-Thr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Cys(Acm)-His(Trt)-Glu(OtBu)---Ala-Cys(Acm)-Gly-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-NH2。
将具有28残基肽的氨基酸，且氨基酸之侧链受保护的肽(5)移至相当于25mL的茄型烧杯中，溶解于DMF(2.5mL)。其后，于氮环境下冷却至-15℃～-20℃。于其中加入苯甲基硫醇(11.7μl，0.1mmol)后，加入PyBOP(52.0mg，0.10mmol)，继续再加入DIPEA(18.0μl，0.1mmol)。于-20℃进行3小时搅拌后，加入乙醚，使肽沉淀。向所得之残渣中加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)并在室温进行搅拌。经2小时后，再度将该溶液加入于另外准备的乙醚并使其沉淀后，进行离心分离除去溶液部分后，得到含有目标肽硫酯体的残渣。将该所得之残渣以HPLC[柱：Vydac(C18)；流速：4.0mL/min；洗脱液A液：0.1%TFA水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN梯度A：B=70：30→20：80(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到C末端为硫苯甲基酯的肽片段B-SBn(6)(SEQIDNO.6)：H2N-Cys-Gln-Asn-Ile-Thr-Thr-Gly-Cys(Acm)-Ala-Glu-His-Cys(Acm)-Ser-Leu-Asn-Glu-Asn-Ile-Thr-Val-Pro-Asp-Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-SBn。
ESI-MS:C144H219N37O48S4m/z计算值:[M+2H]2+1863.4,[M+3H]3+1122.6,[M+4H]4+842.2,结果为[M+2H]2+1863.4,[M+3H]3+1122.6,[M+4H]4+842.2。
(II-3.肽片段C-SR的合成)
固相合成为使用聚苯乙烯柱(东京理科，No.183470)来进行。在聚苯乙烯柱中放入Amino-PEGA树脂(50μmol、1.67g)，以DMF溶剂充分调制。其后向Amino-PEGA树脂中，加入将S-三苯甲基-3-巯基丙酸(S-trityl-3-mercaptopropionicAcid)(200μmol)、HBTU(190μmol)、及DIPEA(800μmol)溶解于DMF之溶液，在常温下进行搅拌。30分钟后以DMF与DCM洗净树脂，加入95%TFA、5%TIPS。经2分钟后，过滤溶液，再度加入TFA与TIPS，经2分钟后，将树脂以DMF洗净。对于该树脂，将Boc-Ala(200mM)、HBTU(190mM)、DIPEA(400mM)溶解于DMF之混合溶液加入于树脂后，缩合第一残基的氨基酸之丙氨酸。经20分钟后，将树脂依次以DMF、二噁烷进行洗净。对该树脂，加入10%硫酸/二噁烷溶液，经5分钟后过滤后，再加入相同溶液并搅拌30分钟后，进行Boc基的脱保护。随后，使用以Boc基保护之氨基酸重复该操作，依次缩合氨基酸。
作为以Boc基保护的氨基酸，依次使用Boc-Gly、Boc-Arg(di-Z)、Boc-Leu、Boc-Val、Boc-Ala、Boc-Glu(Bn)、Boc-Ser(Bn)、Boc-Leu、Boc-Leu、Boc-Ala、Boc-Leu、Boc-Gly、Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Val、Boc-Glu(Bn)、Boc-Val、Boc-Ala、Boc-Gln、Boc-Gln、Boc-Gly、Boc-Val、Boc-Glu(Bn)、Boc-Met、Boc-Arg(di-Z)、Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-Trp(CHO)、Boc-Thz，连接于固相树脂。其结果是，在固相树脂上得到Ala-Gly-Arg(di-Z)-Leu-Val-Ala--Glu(Bn)-Ser(Bn)-Leu-Leu-Ala-Leu-Gly-Gln-Trp(CHO)-Val-Glu(Bn)-Val-Ala-Gln-Gln-Gly-Val-Glu(Bn)-Met-Arg(di-Z)-Lys(Cl-Z)-Trp(CHO)-Thz-NH之29残基肽(7)(SEQIDNO.7)。
将上述所得之树脂上的肽(7)以DCM洗净后，加入含有TFA(400μL)、TfOH(40μL)、EDT(20μL)、及硫代苯甲醚(40μL)，且冷却至0℃的混合物(Cocktail)，在0℃进行搅拌。经30分钟后，过滤溶液，将树脂以TFA、乙醚、DMF、DCM、TFA的顺序洗净，再度添加相同量之上述混合物(Cocktail)，在0℃进行搅拌。经30分钟后，过滤溶液，以TFA、乙醚、DMF之顺序充分洗净树脂。将MESNa(5mg)溶解于含有6M胍盐酸盐的200mM磷酸盐缓冲液(95μL)，加入于该树脂中。经12小时后，得到含有目标肽硫酯体的溶出溶液。将所得之溶液以HPLC进行纯化，得到C末端为硫酯的肽片段C-SR(8)(SEQIDNO.8)：HN-Thz-Trp-Lys-Arg-Met-Glu-Val-Gly--Gln-Gln-Ala-Val-Glu-Val-Trp-Gln-Gly-Leu-Ala-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Val-Leu-Arg-Gly-Ala-SR。另外，-SR表示磺酸乙基硫酯。
ESI-MS:C145H235N41O42S4m/z计算值:[M+2H]2+1677.5,[M+3H]3+1118.6,[M+4H]4+839.2,结果为[M+2H]2+1677.5,[M+3H]3+1118.6,[M+4H]4+839.2。
(II-4.具有唾液酸糖链的糖肽片段D-SR的合成)
与上述II-3.肽片段C-SR的合成方法同样地，使用通过Boc法之固相合成法，使用以Boc基保护至氨基酸丝氨酸残基的氨基酸，依次缩合氨基酸。
作为以Boc基保护的氨基酸，依次使用Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-Asp(Bn)、Boc-Val、Boc-His(DNP)、Boc-Leu、Boc-Gln、Boc-Leu、Boc-Pro、Boc-Glu(Bn)、Boc-Trp(CHO)、Boc-Pro、Boc-Gln、Boc-Ser(Bn)、Boc-Ser(Bn)，连接于固相树脂。其结果是，在固相树脂上得到Lys(Cl-Z)-Asp(Bn)-Val-His(DNP)--Leu-Gln-Leu-Pro-Glu(Bn)-Trp(CHO)-Pro-Gln-Ser(Bn)-Ser(Bn)之肽片段(9)(SEQIDNO.9)。
向上述所得之肽片段(9)中，加入10%硫酸/二噁烷溶液，经5分钟后过滤，再加入相同溶液，通过进行30分钟搅拌，进行Boc基之脱保护。其后以DMF洗净，加入5%DIPEA/DMF。经1分钟后以DMF充分洗净，加入将Boc-二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链天冬酰胺(4μmol)、DEPBT(6μmol)、及DIPEA(4μmol)溶解于DMF的溶液，在常温下进行搅拌。14小时后，将树脂以DMF充分洗净。在上述条件下再度进行糖链缩合。此时，为防止糖链羟基的副反应，在氨基酸40mM的浓度下以与上述同样的方法进行缩合。作为以Boc基保护的氨基酸，依次使用Boc-Val、Boc-Leu、Boc-Leu、Boc-Thz，连接于固相树脂。其结果是，在固相树脂上得到Lys(Cl-Z)-Asp(Bn)-Val-His(DNP)-Leu-Gln-Leu-Pro-Glu(Bn)-Trp(CHO)-Pro-Gln-Ser(Bn)-Ser(Bn)-Asn(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)-Val-Leu-Leu--Thz-NH之19残基糖肽(10)(SEQIDNO.10)。
将上述所得的树脂上的肽(10)以DCM洗净后，加入含有TFA(350μL)、DMS(210μL)、间甲酚(70μL)、及TfOH(70μL)，且冷却至0℃的混合物(Cocktail)，在0℃进行搅拌。30分钟后，过滤溶液，将树脂以TFA、乙醚、DMF、DCM、TFA的顺序洗净，再度添加相同量之上述混合物(Cocktail)，在0℃进行搅拌。经30分钟后，过滤溶液，将树脂以TFA、乙醚、DMF、DCM、TFA的顺序洗净，再度添加相同量之上述混合物(Cocktail)，在0℃进行搅拌。2小时后过滤溶液，以TFA、乙醚、DMF之顺序充分洗净树脂。将MESNa(5mg)溶解于含有6M胍盐酸盐的200mM磷酸盐缓冲液(95μL)，加入于该树脂中。经12小时后，得到含有目标肽硫酯体的溶出溶液。将此以HPLC进行纯化，得到C末端为硫酯的肽片段D-SR(11)(SEQIDNO.11)：HN-Thz-Leu-Leu-Val-Asn(二苯甲酰甲基-二唾液酸糖链)-Ser-Ser-Gln-Pro--Trp(CHO)-Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-His-Val-Asp-Lys-SR。且-SR表示磺酸乙基硫酯。
ESI-MS:C203H306N32O95S3m/z计算值:[M+3H]3+1604.7,[M+4H]4+1203.7,[M+5H]5+963.1,结果为[M+3H]3+1605.4,[M+4H]4+1204.3,[M+5H]5+963.2。
(II-5.肽片段E-SR的合成)
肽片段E-SR为与上述II-3.肽片段C-SR的合成方法同样的条件下，通过Boc固相合成法进行合成。首先使用以Boc基保护至就在糖链加成氨基酸的连接前的丝氨酸残基的氨基酸，由C末端侧依次缩合氨基酸。
作为以Boc基保护之氨基酸，依次使用Boc-Ala、Boc-Ser(Bn)、Boc-Ala、Boc-Ala、Boc-Asp(Bn)、Boc-Pro、Boc-Pro、Boc-Ser(Bn)、Boc-Ile、Boc-Ala、Boc-Glu(Bn)、Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-Glu(Bn)、Boc-Ala、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Ala、Boc-Arg(di-Z)、Boc-Leu、Boc-Leu、Boc-Thr(Bn)、Boc-Thr(Bn)、Boc-Leu、Boc-Ser(Bn)、Boc-Arg(di-Z)、Boc-Leu、Boc-Gly、Boc-Ser(Bn)、Boc-Val、Boc-Thz，连接于固相树脂。其结果，在固相树脂上得到Ala-Ser(Bn)-Ala-Ala-Asp(Bn)-Pro-Pro-Ser(Bn)-Ile-Ala-Glu(Bn)-Lys(Cl-Z)-Glu(Bn)-Ala-Gly-Leu-Ala-Arg(di-Z)-Leu-Leu-Thr(Bn)-Thr(Bn)-Leu-Ser(Bn)-Arg(di-Z)-Leu-Gly-Ser(Bn)-Val-Thz-NH之30残基肽(12)(SEQIDNO.12)。
将上述所得的树脂上的肽(12)在与上述II-3.肽片段C-SR的合成方法同样的条件下进行处理，以从树脂上切出。将此所得物以HPLC纯化，得到C末端为硫酯的肽片段E-SPh(13)(SEQIDNO.13)：HN-Thz-Val-Ser-Gly--Leu-Arg-Ser-Leu-Thr-Thr-Leu-Leu-Arg-Ala-Leu-Gly-Ala-Glu-Lys-Glu-Ala-Ile-Ser-Pro-Pro-Asp-Ala-Ala-Ser-Ala-SPh。且-SR表示磺酸乙基硫酯。
ESI-MS:C131H226N38O44S3m/z计算值:[M+2H]2+1567.8,[M+3H]3+1045.5,结果为[M+2H]2+1568.0,[M+3H]3+1045.6。
(II-6.肽片段F-OH的合成)
肽片段F-OH为在与上述II-1.肽片段A-SPh的合成方法同样的条件下，通过Fmoc固相合成法而合成。
作为以Fmoc基保护之氨基酸，依次使用Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Ala、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Leu、Fmoc-Phe、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Phe、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Leu、Fmoc-Pro、Fmoc-Cys(Trt)，连接于固相树脂。其结果是，在固相树脂上得到Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Val-Arg(Pbf)-Phe-Leu-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Phe-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Thr(tBu)-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Pro-Cys(Trt)-NH2之39残基肽(14)(SEQIDNO.14)。
将上述所得的树脂上的肽(14)以一般在Fmoc法所使用的手法，从树脂切出，并以HPLC进行纯化后，得到肽片段F(15)(SEQIDNO.15)：H2N-Cys-Pro-Leu-Arg-Thr-Ile-Thr-Ala-Asp-Thr-Phe-Arg-Lys-Leu-Phe-Arg-Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg-Gly-Lys-Leu-Lys-Leu-Tyr-Thr-Gly-Glu-Ala-Cys(Acm)-Arg-Thr-Gly-Asp-Arg。
ESI-MS:C206H334N62O56S2m/z计算值:[M+3H]3+1547.5,[M+4H]4+1160.8,[M+5H]5+928.9,[M+6H]6+774.2,[M+7H]7+663.8,实测为[M+3H]3+1547.2,[M+4H]4+1160.8,[M+5H]5+928.9,[M+6H]6+774.2,[M+7H]7+663.8。
(III)通过各片段之连接的二唾液酸糖链加成促红细胞生成素的合成
上述所制作的各片段的连接及二唾液酸糖链加成促红细胞生成素的合成通过以下所示总计10步骤来进行。
(III-1.第1步骤：肽片段E与肽片段F之连接)
将30残基的C末端为硫代苯基酯体的肽片段E(13)(3.7mg)与39残基的肽片段F(15)(2.5mg)这两种片段放入同一茄型烧杯中，溶解于pH6.8的缓冲液溶液(0.40ml)(以6M胍盐酸盐溶液、0.2M磷酸盐溶液、20mM三羧基乙基膦溶液(TCEP溶液)制备)后，加入MPAA(2.7mg)，在室温进行反应。3小时后，将反应以HPLC确认后，于反应溶液加入甲氧基胺溶液，调节至pH4.0，在室温下进行反应后，将N末端的噻唑烷型半胱氨酸转化为半胱氨酸。2小时后使用HPLC与ESI-MS，确认生成目标物。将反应溶液以HPLC[柱：Vydac(C18)；流速：4.0mL/min；洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN；A：B=75：25→25：75(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到目标肽片段(E+F)(16)(SEQIDNO.16)(图6)。ESI-MS:C334H554N100O97S3m/z计算值:[M+4H]4+1905.7,[M+5H]5+1524.8,[M+6H]6+1270.8,[M+7H]7+1089.4,[M+8H]8+953.4,[M+9H]9+847.5,[M+10H]10+762.9,实测为1906.0,1525.0,1271.0,1089.7,953.7,847.8,763.2。
(III-2.第2步骤：肽片段D与肽片段(E+F)之连接)
将19残基的C末端为硫酯体的二唾液酸糖链加成肽片段D(11)(3.8mg)与上述第1步骤所得之肽片段(E+F)(16)(6.0mg)这两种片段放入同一茄型烧杯中，溶解于pH6.8的缓冲液(0.40ml)(以6M胍盐酸溶液、0.2M磷酸盐溶液、40mMTCEP溶液所制备)。其后，加入MPAA(2.7mg)，在室温进行反应。使用HPLC与ESI-MS，确认反应终止后，加入2-巯基乙醇(3.0μL)(加入0.2M磷酸盐溶液、pH8.0，加至60μL后调节)，在室温下进行反应后，进行苯甲酰甲基及甲酰基的脱保护。经2小时后，使用盐酸使其中和后，于反应溶液中加入甲氧基胺溶液，调节为pH4.0，在室温进行反应后，将噻唑烷型半胱氨酸转化为半胱氨酸。经3小时后，使用HPLC与ESI-MS，确认生成目标物。将反应溶液以HPLC[柱：Vydac(C18)、流速：4.0mL/min、洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=75：25→25：75(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到目标糖链加成多肽片段(D+E+F)(17)(SEQIDNO.17)(图7)。
ESI-MS:C517H842N132O186S4m/z计算值：[M+7H]7+1716.9,[M+8H]8+1502.4,[M+9H]9+1335.6,[M+10H]10+1202.1,[M+11H]11+1092.9,[M+12H]12+1001.9,[M+13H]13+924.9,[M+14H]14+859.0,实测为1717.2,1502.8,1335.9,1202.4,1093.3,1002.2,925.1,858.7。
(III-3.第3步骤：肽片段C与糖链加成肽片段(D+E+F)之连接)
将29残基的C末端为硫酯体的肽片段C(8)(1.34mg)与上述第2步骤所得的糖链加成多肽片段(D+E+F)(17)(4.8mg)这两种片段放入同一茄型烧杯中，溶解于pH6.8的缓冲液(0.40ml)(由6M胍盐酸溶液、0.2M磷酸盐溶液、40mMTCEP溶液所制备)。其后加入MPAA(1.4mg)，在室温下进行反应。使用HPLC与ESI-MS，确认生成目标物后，将反应溶液以HPLC[柱：Vydac(C18)、流速：4.0mL/min、洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=70：30→20：80(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到目标糖链加成多肽片段(C+D+E+F)(18)(SEQIDNO.18)(图8)。
ESI-MS:C661H1071N173O235S6m/z计算值:[M+8H]8+1905.3,[M+9H]9+1693.7,[M+10H]10+1524.4,[M+11H]11+1385.9,[M+12H]12+1270.5,[M+13H]13+1172.9,[M+14H]14+1089.1,[M+15H]15+1016.6,[M+16H]16+953.1,[M+17H]17+897.1,实测为1905.1,1693.8,1524.5,1385.9,1270.7,1173.0,1089.2,1016.7,953.2,897.2。
(III-4.第4步骤：将Cys还原成Ala)
上述第3步骤所得的117残基的糖链加成肽片段(C+D+E+F)(18)是在相当于促红细胞生成素的氨基酸序列中第79、98、128位之位置的Cys上具有游离硫醇基，在相当于促红细胞生成素的氨基酸序列中第83位之位置的Asn上具有二唾液酸糖链，将该糖链加成肽片段(3.8mg)放入茄型烧杯中，溶解于pH7.0的缓冲液(1.0ml)(以6M胍盐酸盐溶液、0.2M磷酸盐溶液所调制)后，加入pH7.0的三乙基羧基膦(TCEP)(130mg)、MESNa(50mg)、VA-044(1.6mg)，于室温进行反应。经10小时后，使用HPLC与ESI-MS，确认生成目标物。将反应溶液以HPLC[柱：Vydac(C18)、流速：4.0mL/min、洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=70：30→20：80(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到目标糖链加成肽片段(C+D+E+F)(19)(SEQIDNO.19)(图8)。
ESI-MS:C661H1071N173O225S3m/z计算值:[M+9H]9+1683.9,[M+10H]10+1514.8,[M+11H]11+1377.2,[M+12H]12+1262.5,[M+13H]13+1165.5,[M+14H]14+1082.3,[M+15H]15+1010.2,[M+16H]16+947.1,[M+17H]17+891.5,[M+18H]18+842.0,实测为1683.1,1514.9,1377.2,1262.7,1165.6,1082.3,1010.3,947.2,891.6,842.1。
(III-5.第5步骤：脱Thz反应)
上述第4步骤所得的117残基的糖链加成多肽(C+D+E+F)(19)是在相当于促红细胞生成素的氨基酸序列中第83位之位置的Asn上具有二唾液酸糖链的糖链加成多肽，将该糖链加成多肽(2.0mg)溶解于pH6.8的缓冲液溶液(0.05ml)(以0.2M磷酸盐溶液调制)后，于反应溶液中加入0.2M甲氧基胺溶液，调节至pH4.0，于室温进行反应。经3小时后，将反应溶液以HPLC[柱：Vydac(C18)、流速：4.0mL/min、洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=75：25→30：70(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到目标糖链加成肽片段(C+D+E+F)(20)(SEQIDNO.20)(图8)。
ESI-MS:C660H1071N173O225S3m/z计算值:[M+9H]9+1681.6,[M+10H]10+1513.6,[M+11H]11+1376.0,[M+12H]12+1261.5,[M+13H]13+1164.5,[M+14H]14+1081.4,[M+15H]15+1009.4,[M+16H]16+946.4,[M+17H]17+890.8,[M+18H]18+841.3,实测为1681.6,1513.6,1376.0,1261.4,1164.4,1081.3,1009.4,946.3,890.7,841.3。
(III-6.第6步骤：肽片段A与肽片段B之连接)
将21残基的C末端为硫代苯基酯体的肽片段A(4)(2.0mg)与28残基的肽片段B(6)(2.7mg)这两种片段放入同一茄型烧杯中，溶解于pH6.5的缓冲液溶液(0.40ml)(以6M胍盐酸盐溶液、0.2M磷酸盐溶液、30mM三羧基乙基膦溶液(TCEP溶液)调制)，在室温进行反应。反应终了后，加入MESNa(5.2mg)，在室温进行反应。经2小时后，使用HPLC与ESI-MS，确认生成目的物。将反应溶液以HPLC[柱：Vydac(C18)、流速：4.0mL/min、洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=65：35→15：85(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到目标肽片段(A+B)(21)(SEQIDNO.21)(图5)。
ESI-MS:C249H401N69O81S6m/z计算值:[M+3H]3+1950.1,[M+4H]4+1463.4,[M+5H]5+1170.9,[M+6H]6+975.9,[M+7H]7+836.7,实测为1950.7,1463.6,1171.1,976.1,836.8。
(III-7.第7步骤：肽片段(A+B)与糖链加成肽片段(C+D+E+F)之连接)
将上述第6步骤所得之第49残基的C末端为硫酯体之肽片段(A+B)(21)(2.0mg)与上述第5步骤所得之糖链加成多肽片段(C+D+E+F)(20)(3.5mg)这两种片段放入同一茄型烧杯，溶解于pH7.0之缓冲液溶液(0.077ml)(以6M胍盐酸盐溶液、0.2M磷酸盐溶液、50mMTCEP溶液所调制)后，加入MPAA(ca.0.8mg)，在室温进行反应。使用HPLC与ESI-MS，确认生成目标物后，将反应溶液以HPLC[柱：Vydac(C18)、流速：1.0mL/min、洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=65：35→25：75(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到目标糖链加成肽片段(A+B+C+D+E+F)(22)(SEQIDNO.22)(图9)。
ESI-MS:C907H1468N242O303S7m/z计算值:[M+11H]11+1895.1,[M+12H]12+1737.3,[M+13H]13+1603.7,[M+14H]14+1489.2,[M+15H]15+1390.0,[M+16H]16+1303.2,[M+17H]17+1226.6,[M+18H]18+1158.5,[M+19H]19+1097.6,[M+20H]20+1042.8,[M+21H]21+993.2,[M+22H]22+948.1,[M+23H]23+906.9,[M+24H]24+869.1,[M+25H]25+834.4,实测为1895.0,1737.3,1603.8,1489.1,1389.9,1303.2,1226.6,1158.5,1097.7,1042.7,993.2,948.0,906.9,869.2,834.4。
(III-8.第8步骤：将Cys还原成Ala)
将上述第7步骤所得之第22、50位Cys上具有游离硫醇基，第83位Asn上具有二唾液酸糖链之166残基的糖链加成多肽(A+B+C+D+E+F)(22)(1.0mg)放入茄型烧杯中，溶解于pH7.0之缓冲液溶液(0.2ml)(以6M胍盐酸盐溶液、0.2M磷酸盐溶液调制)后，加入pH7.0的三乙基羧基膦(TCEP)(26mg)、MESNa(10mg)、VA-044(0.32mg)，在室温进行反应。经4小时后使用HPLC与ESI-MS，确认生成目标物。将反应溶液以HPLC[柱：Vydac(C8)、流速：4.0mL/min、洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=70：30→20：80(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到目标糖链加成多肽片段(A+B+C+D+E+F)(23)(SEQIDNO.23)(图10)。
ESI-MS:C907H1468N242O303S5m/z计算值:[M+13H]13+1598.8,[M+14H]14+1484.7,[M+15H]15+1385.7,[M+16H]16+1229.2,[M+17H]17+1222.8,[M+18H]18+1155.0,[M+19H]19+1094.2,[M+20H]20+1039.6,[M+21H]21+990.1,[M+22H]22+945.1,[M+23H]23+904.1,[M+24H]24+866.5,[M+25H]25+831.9,[M+26H]26+799.9,[M+27H]27+770.3,实测为1598.6,1484.4,1385.5,1299.0,1222.7,1154.9,1094.1,1039.4,990.0,945.2,904.0,866.4,831.6,799.9,770.3。
(III-9.第9步骤：Acm基之脱保护)
将上述第8步骤所得之第83位Asn上具有二唾液酸糖链的166残基的糖链加成多肽(23)(ca.0.7mg)放入Eppendorf管中，溶解于90%乙酸水溶液(0.176ml)后，加入乙酸银(ca.0.8mg)，在室温下避光反应。经3.5小时后，使用HPLC与ESI-MS，确认生成目标物。于反应溶液中加入二硫代苏糖醇(6.0mg)，在室温进行5分钟搅拌后，进行离心分离，除去沉淀物而回收澄清液。将该回收澄清液以膜滤器进行过滤，将含有目标物的滤液部分以HPLC[柱：proteonavi(C4)、流速：1.0mL/min、洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=65：35→25：75(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到第7位、29位、33位、161位的Acm基经脱保护，第83位Asn上具有二唾液酸二苯甲基糖链的166残基的糖链加成多肽(24)(SEQIDNO.24)(图11)。
ESI-MS:C895H1448N238O299S5m/z计算值:[M+13H]13+1576.9,[M+14H]14+1464.3,[M+15H]15+1366.8,[M+16H]16+1281.4,[M+17H]17+1206.1,[M+18H]18+1139.2,[M+19H]19+1079.3,[M+20H]20+1025.3,[M+21H]21+976.6,[M+22H]22+932.2,[M+23H]23+891.7,[M+24H]24+854.6,[M+25H]25+820.5,[M+26H]26+789.0,[M+27H]27+759.8,实测为1576.7,1464.3,1366.7,1281.4,1206.0,1139.1,1079.2,1025.2,976.5,932.2,891.6,854.6,820.4,788.9,759.8。
(III-10.第10步骤：蛋白质折叠步骤)
将通过上述第9步骤所得的第83位Asn上具有二唾液酸糖链之糖链加成多肽(24)放入离心沉淀管中，溶解于pH7.5的缓冲液溶液(13ml)(以6M胍盐酸盐溶液、0.1mMTris溶液调制)后，静置于室温。将该溶液移至透析膜(Spectra/Pro、MWCO；8000)。将该透析膜放入于透析外液A(以3M胍盐酸盐溶液、0.1mMTris溶液、4μM半胱氨酸、0.5μM胱氨酸所调制；pH8.5)，在4℃进行透析。经12小时后，将该透析膜放入透析外液B(以1M胍盐酸盐溶液、0.1mMTris溶液调制；pH8.0)，在4℃进行透析。经8小时后，将该透析膜放入透析外液C(10mMTris溶液；pH7.0)，在4℃进行透析。经24小时后，将该透析膜由透析外液取出，将透析膜内的溶液移至离心沉淀管。将透析膜内的溶液直接以HPLC[柱：proteonavi(C4)、流速：1.0mL/min、洗脱液A液：0.1%TFA-水；B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=60：40→25：75(30分钟)线性梯度]进行纯化，得到糖链加成多肽(25)(SEQIDNO.25)。另外，蛋白质折叠后的糖链加成多肽(25)为第7位之半胱氨酸与第161位之半胱氨酸之间具有双硫键，第29位的半胱氨酸与第33位之半胱氨酸之间具有双硫键。
ESI-MS:C895H1444N238O299S5m/z计算值：[M+11H]11+1863.1,[M+12H]12+1707.9,[M+13H]13+1576.6,[M+14H]14+1464.1,[M+15H]15+1366.5,[M+16H]16+1281.2,[M+17H]17+1205.9,[M+18H]18+1138.9,实测为1863.2,1708.0,1576.6,1464.0,1366.5,1281.2,1205.8,1138.9。
Claims (16)
1.具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法，其特征为，所述方法包含以下步骤，
(1)将具有羟基的树脂与氨基氮以Boc基保护的氨基酸进行结合的步骤；
其中，所述结合步骤为，将所述树脂的羟基与所述氨基酸的羧基通过酯化反应进行结合的步骤，
(2)通过使所述Boc基脱离而形成游离氨基的步骤；
(3)将以下的(i)及(ii)的步骤至少重复进行1次：
(i)通过进一步结合以Boc基保护氨基氮的其他氨基酸，使结合于树脂的氨基酸延长的步骤；
其中，所述延长步骤为，将所述其他氨基酸的羧基与结合于所述树脂的氨基酸的所述游离氨基结合的步骤，
(ii)通过使(i)中的所述Boc基脱离而形成游离氨基的步骤；以及
(4)以酸切断树脂的步骤；
其中，步骤(1)中的所述氨基酸和/或步骤(3)的至少1次的(i)中的所述其他氨基酸为糖链加成氨基酸，且该糖链加成氨基酸的糖链非还原末端中的至少1个具有唾液酸，且该唾液酸的羧基是由苯甲酰甲基保护。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸为天冬酰胺结合型糖链或黏蛋白结合型糖链。
3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述步骤(4)中，所述酸为三氟乙酸/三氟甲烷磺酸/二甲基硫化物/间甲酚的混合酸。
4.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述步骤(1)中的所述氨基酸和/或所述步骤(3)的至少1次的(i)中的所述其他氨基酸为对碱不稳定的非天然氨基酸。
5.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸中的至少1个为唾液酸糖链天冬酰胺，所述唾液酸糖链天冬酰胺具有6个以上的糖残基。
6.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸中的至少1个为唾液酸糖链天冬酰胺，所述唾液酸糖链天冬酰胺具有9～11个糖残基。
7.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸中的至少1个为唾液酸糖链天冬酰胺，所述糖链天冬酰胺具有6个以上的糖残基，并结合有2分支型糖链。
8.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸由下式(1)所示；
式中，R3及R4中的一方为下式(2)，另一方为选自由氢原子及下式(2)～(6)所示基团组成的组中的基团：
9.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，在所述步骤(1)之前，还包括将硫醇化合物与树脂结合的步骤。
10.如权利要求9所述的制造方法，其中，在所述步骤(4)之后，还包括(5)将具有唾液酸糖链的糖肽的硫酯体与肽片段或糖肽片段连接的步骤。
11.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，在所述前述步骤(4)的以所述酸切断所述树脂之前，还包括使标识剂反应的步骤。
12.如权利要求11所述的制造方法，其中，所述标识剂为丹磺酰卤化物。
13.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述步骤(1)～(3)中的至少1个步骤中，在进行所述氨基酸的缩合反应和/或Boc基的脱离反应时，照射微波。
14.如权利要求1或2所述的具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法，其特征为，在所述步骤(4)之后，还包括将保护所述唾液酸的羧基的苯甲酰甲基脱保护的步骤。
15.唾液酸糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，唾液酸糖链天冬酰胺的氨基以Boc基保护，且所述糖链的非还原末端的唾液酸的羧基以苯甲酰甲基保护，包括以下步骤：
在天冬酰胺的氨基由脂溶性保护基保护的唾液酸糖链天冬酰胺衍生物中导入苯甲酰甲基的步骤；
将导入苯甲酰甲基的唾液酸糖链天冬酰胺的脂溶性保护基脱离的步骤；以及
在脱离了脂溶性保护基的唾液酸糖链天冬酰胺中导入Boc基的步骤。
16.如权利要求15所述的制造方法，其中，所述脂溶性保护基为Fmoc。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1405858A1 (en) * | 2001-06-19 | 2004-04-07 | Otsuka Chemical Holdings Co., Ltd. | Process for producing sugar chain asparagine derivative |
| CN1829742A (zh) * | 2003-07-28 | 2006-09-06 | 大塚化学株式会社 | 氨基化复合型糖链衍生物及其制造方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU519815B2 (en) * | 1977-12-08 | 1981-12-24 | Ortho Pharmaceutical Corporation | New tetrapeptides |
| PT832096E (pt) | 1995-05-04 | 2002-01-30 | Scripps Research Inst | Sintese de proteinas atraves de ligacao quimica nativa |
| US6184344B1 (en) | 1995-05-04 | 2001-02-06 | The Scripps Research Institute | Synthesis of proteins by native chemical ligation |
| US5859284A (en) * | 1996-08-23 | 1999-01-12 | Gilead Sciences, Inc. | Preparation of carbocyclic compounds |
| WO2003054006A2 (en) | 2001-12-11 | 2003-07-03 | Aventis Pasteur | Mutated hiv tat |
| ATE316096T1 (de) * | 2002-06-10 | 2006-02-15 | Geneprot Inc | Verfahren zum carboxygruppenschutz der säuren c- terminalen aminosäuren bei chemischer verknüpfung von oligopeptiden |
| US7943763B2 (en) * | 2002-07-05 | 2011-05-17 | Otsuka Chemical Holdings Co., Ltd. | Process for preparing glycopeptides having asparagine-linked oligosaccharides, and the glycopeptides |
| TWI330641B (en) | 2002-12-24 | 2010-09-21 | Yasuhiro Kajihara | Sugar chain asparagine derivatives |
| WO2004058824A1 (ja) | 2002-12-26 | 2004-07-15 | Otsuka Chemical Co., Ltd. | ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法 |
| PT1591532T (pt) | 2003-02-04 | 2019-01-11 | Glytech Inc | Processo para produção de um derivado de asparagina de cadeia de açúcar |
| US20070011055A1 (en) | 2005-07-05 | 2007-01-11 | Netfire 1 Pty Ltd | E-commerce with direct access to real-time inventory |
| AU2008283317B2 (en) * | 2007-07-31 | 2012-08-02 | Glytech, Inc. | Method for producing peptide |
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