KR20060015963A

KR20060015963A - 셀레콕십을 포함하는 동맥 재협착 예방 및 치료를 위한 약학 조성물

Info

Publication number: KR20060015963A
Application number: KR1020040064369A
Authority: KR
Inventors: 김효수; 구본권; 강현재; 양한모; 권병두
Original assignee: 주식회사 스텐텍; 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2004-08-16
Filing date: 2004-08-16
Publication date: 2006-02-21
Also published as: WO2006019203A1

Abstract

본 발명은 셀레콕십을 포함하는 동맥 재협착 예방 및 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 혈관 평활근 세포 증식 억제와 세포 고사 유도 효과와 항염증 효과를 통해 혈관 신생내막의 증식을 유의적으로 억제함으로써 동맥 재협착의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

셀레콕십, 동맥 재협착, 혈관 평활근 세포

Description

셀레콕십을 포함하는 동맥 재협착 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING ARTERY RESTENOSIS CONTAINING CELECOXIB}

도 1은 셀레콕십 처리한 혈관 평활근 세포의 광학 현미경 사진이다(200 배율).

도 2는 PDGF 자극 유무에 따라 셀레콕십이 Akt의 인산화에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다(t-Akt: total-Akt, p-Akt: phospho-Akt).

도 3은 각각 PDGF로 자극한 후 셀레콕십 처리한 혈관 평활근 세포의 생존성을 나타내는 그래프(A), 10 % FBS로 자극한 후 셀레콕십 처리한 혈관 평활근 세포의 생존성을 나타내는 그래프(B)이다.

*: 대조군(셀레콕십 0 uM)과 비교하여 p<0.01

**: (셀레콕십 25 uM + adeno-GFP)군과 비교하여 p<0.01

CXB: 셀레콕십

myr-Akt: 활성형 아데노바이러스

GFP: 녹색 형광 단백질 아데노바이러스

도 4는 각각 PDGF 자극 하에 셀레콕십이 DNA 합성에 미치는 영향을 보여주는 BrdU 분석 결과(A), PDGF 자극 하에 셀레콕십이 세포 주기에 미치는 영향을 보여주 는 FACS 분석 결과(B), PDGF 자극 하에 셀레콕십이 세포 고사에 미치는 영향을 보여주는 FACS 분석 결과(C)이다(*: 대조군(셀레콕십 0 uM) 또는 (셀레콕십 O uM + PDGF 자극)군과 비교하여 p<0.05).

도 5는 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 저배율과 고배율의 광학현미경 사진이다(I: 내막, M: 중막, A: 외피막).

도 6은 각각 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 내막/중막의 면적비(I/M 비)를 나타내는 그래프(A), 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 내막, 중막 및 혈관내강의 면적을 나타내는 그래프(B)이다(*: 대조군이나 아스피린군과 비교하여 p<0.01).

도 7은 각각 혈관 손상 후 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 PCNA에 대한 면역조직화학 염색의 결과(A)(400 배율, ▼: PCNA 양성 세포를 가리킨다), 혈관 손상 후 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 TUNEL 분석에 대한 면역조직화학 염색의 결과(B)(400 배율, ▼: TUNEL 양성 세포를 가리킨다, I: 내막, M: 중막, A: 외피막), 혈관 손상 후 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 activated caspase-3에 대한 면역조직화학 염색의 결과(C)를 나타낸다 (400 배율).

도 8은 각각 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군으로부터 측정한 PCNA 양성 세포(%)를 나타내는 그래프(A), 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군으로부터 측정한 TUNEL 양성 세포(%)를 나타내는 그래프(B)이다(*: 대조군과 비교하여 p<0.01).

도 9는 각각 혈관 손상 후 p-Akt와 p-GSK의 시간에 따른 변화를 보여주는 웨스턴 블롯 결과(A), 혈관 손상 후 셀레콕십이 p-Akt와 p-GSK에 미치는 영향을 보여 주는 웨스턴 블롯 결과(B)이다.

도 10은 각각 대조군, DN-Akt군, (대조군+CXB)군 및 (Myr-Akt+CXB)군의 내막/중막의 면적비(I/M 비)를 나타내는 그래프(A), 대조군, DN-Akt군, (대조군+CXB)군 및 (Myr-Akt+CXB)군의 내막, 중막 및 혈관내강의 면적을 나타내는 그래프(B)이다(CXB: 셀레콕십, Myr-Akt: 활성형-Akt, DN-Akt: 억제형-Akt, *: 대조군과 비교하여 p<0.01).

도 11은 혈관 손상 후 대조군, DN-Akt군, (대조군+CXB)군 및 (Myr-Akt+CXB)군의 PCNA 및 TUNEL 분석에 대한 면역조직화학염색 결과를 각각 나타낸다(400 배율, ▼: PCNA 양성 세포 또는 TUNEL 양성 세포를 가리킨다, I: 내막, M: 중막)

본 발명은 셀레콕십을 포함하는 동맥 재협착 예방 및 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

최근 증가하고 있는 허혈성 심혈관 질환은 그 유병율과 사망률에 있어서 수위를 차지하고 있다. 이러한 질환의 치료에 있어서 좁아진 혈관을 확장하는 방법으로 풍선 혈관 성형술과 스텐트 삽입술이 많이 쓰였으나, 그 재협착율이 20 ~ 30 % 정도에 이르고 있다. 따라서 이를 줄이고자 다양한 방법들이 연구 개발되고 있으며, 최근에는 약물 코팅-스텐트가 탁월한 효과를 보이고 있어 많이 사용되고 있는 실정이다. 이에 본 발명자들은 수많은 약물 중에서도 이미 약물의 안정성이 확보되 어 있으며 부작용이 적은 약물 중, 항암 효과와 항증식 효과가 있는 셀레콕십에 주목하게 되었다.

셀레콕십은 선택적 COX-2 저해제로써, 많은 관절염 환자에 있어서 안전하게 널리 쓰이고 있으며 기존의 비스테로이드성 항염증제(nonsteroidal anti inflammatory drug, NSAID) 등과 비교하여 위궤양 등 위장관 부작용이 훨씬 적음이 잘 알려져 있다(Bombardier C, Laine L, Reicin A, et al., N Engl J Med. 2000;343:1520-8, Silverstein FE, Faich G, Goldstein JL, et al., J Am Med Assoc. 2000;284:1247-55, FitzGerald GA, Patrono C., N Engl J Med. 2001;345:433-42). 이러한 셀레콕십은 항염증 작용 외에도 가족성 대장용종증(familial adenomatous polyposis) 환자에 있어서 대장용종의 숫자과 크기를 줄이는 효과가 있는 것이 잘 알려져 있고, 이러한 효과는 이미 FDA에서 공인받은 상태이다(Steinbach G, Lynch PM, Phillips RK, et al., N Engl J Med. 2000;342:1946-5). 선택적 COX-2 저해제가 대장암, 위암, 전립선암 등의 세포들에서 증식을 억제하고 세포괴사를 유도함은 잘 알려진 사실이다(Hara A, Yoshimi N, Niwa M, et al., Jpn J Cancer Res. 1997;88:600-4, Erickson BA, Longo WE, Panesar N, et al., J Surg Res. 1999;81:101-7, Liu XH, Yao S, Kirschenbaum A, et al., Cancer Res. 1998;58:4245-9, HsuAL, Ching TT, Wang DS, et al., J Biol Chem. 2000;275:11397-40). 또한 최근에는 셀레콕십이 폐암이나 대장암, 췌장암 환자들에서도 항암 효과가 있다는 임상연구들이 보고되고 있다(Rahme E, Barkun AN, Toubouti Y, et al.. Gastroenterology. 2003;125:404-12, Natale RB., Oncology (Huntingt). 2003;17:22-6, Crane CH, Mason K, Janjan NA, et al., Am J Clin Oncol. 2003;26:S81-4).

상기 셀레콕십의 항암 효과와 항증식 효과는 이미 알려져 있는 COX 의존성 경로 외에도 COX 비의존성 경로를 통하여 그 효과가 발휘되는 것임이 최근 밝혀지고 있다. 특히 셀레콕십이 암세포에서 Akt의 활성화를 억제하고(HsuAL, Ching TT, Wang DS, et al., J Biol Chem. 2000;275:11397-40) 3-PDK-1(3-phosphositide-dependent kinase-1)을 억제하여 세포 괴사(apoptosis)를 유도한다는 연구들이 발표되었다(Arico S, Pattingre S, Bauvy C, et al., J Biol Chem. 2002;277:27613-2). Akt는 세포 내에서 세포의 증식(proliferation), 이동(migration), 생존 및 세포 괴사 등에 관여하며, Akt의 신호 전달(signaling)은 VEGF(혈관 내피 성장 인자, vascular endothelial growth factor), PDGF(혈소판 유래 성장 인자, platelet-derived growth factor), IGF(인슐린 유사 성장 인자, insulin-like growth factor) 등의 성장 인자의 작용으로 세포가 증식하고 세포 괴사에 저항하는 과정을 매개하고 있다(Brazil DP, Hemmings BA., Trends Biochem Sci. 2001;26:657-6). Akt는 그 하위에 BAD, mTOR, Forkhead family member 등을 가지며 이들에 작용하게 된다(Brazil DP, Hemmings BA., Trends Biochem Sci. 2001;26:657-6). Akt는 또한 그 하위에 있는 GSK-3β를 인산화시키고 불활성화시키는 작용을 한다.

본 발명자들은 이미 풍선 혈관 성형술(ballon injury)이나 스텐트 삽입술(stent implantation) 이후에 혈관벽에서 Akt-GSK 축이 활성화됨을 발표한 바 있다(Park KW, Yang HM, Youn SW, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23:1364-9, Shigematsu K, Koyama H, Olson NE, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000;20:2373-8, Zhou RH, Lee TS, Tsou TC, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol . 2003;23:2015-2). 또한 본 발명자들은 GSK-3β의 활성화형을 이용하여 유전자 치료하는 경우 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하고 혈관 성형술 후의 신생내막 증식을 억제할 수 있음을 증명한 바 있다(Park KW, Yang HM, Youn SW, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23:1364-9). 그러나, 아직까지 셀레콕십이 신생내막의 생성을 유의적으로 억제하는 활성이 있음이 보고된 바는 없다.

이에 본 발명자들은 셀레콕십이 혈관 성형술이나 스텐트 삽입술 이후 활성화되는 Akt를 억제함으로써 신생내막 형성을 억제할 수 있는지에 대한 연구를 수행한 결과, 셀레콕십이 동맥 재협착 예방고 치료를 위한 약제로서 예기지 못했던 현저한 효과를 나타낸다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 셀레콕십이 풍선 혈관 성형술 후에 생기는 신생내막을 얼마나 억제하는지와 그 기전을 연구하기 위해 in vitro에서 셀레콕십이 PDGF에 의해 활성화되는 Akt를 억제함으로써 혈관 평활근 세포의 증식을 억제할 수 있는지 살펴보았다. 또한 in vivo에서도 풍선 손상 후 Akt가 활성화되는 것을 셀레콕십이 억제함으로써 신생내막 형성을 억제할 수 있는지를 살펴보았다. 또한 이러한 효과가 COX 의존성 경로로 발휘되는지 아니면 COX 비의존성 경로로 발휘되는지 살펴보기 위해 아스피린을 투여한 군에서도 효과가 있는지를 비교 연구하였다. 또한 이러한 셀레콕십이 그 효과를 보이는 데 있어서 Akt 경로 억제가 중요한 기전임 을 확인하기 위해 Akt 억제형 및 활성형의 유전자를 포함한 바이러스를 사용하여 혈관 성형술을 행하는 경우 각각의 유전자를 이식하여 그 효과를 확인함으로써 셀레콕십의 작용 기전을 알아보았다.

따라서, 본 발명의 목적은 셀레콕십을 포함하는 동맥 재협착 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 셀레콕십을 포함하는 동맥 재협착 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명에 따른 동맥 재협착 예방 및 치료를 위한 약학 조성물은 셀레콕십을 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약학 조성물에 포함되는 셀레콕십은 기존에 알려져 있는 항염증 작용 외에도 가족성 대장용종증(familial adenomatous polyposis) 환자에 있어서 대장용종의 숫자와 크기를 줄이는 효과가 있는 것은 잘 알려져 있으며, 이러한 항암효과는 대장암, 위암, 전립선암, 폐암, 췌장암 등에서 이미 동물 실험과 임상 연구를 통해서 효과가 있음이 계속 밝혀지고 있다.

본 발명의 일실시예에서는, in vitro에서 셀레콕십이 Akt/GSK-3β 신호 전달 축에 미치는 영향과 래트의 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell)의 생존성에 미치는 영향을 평가하였다. 도 1, 도 2 및 도 3에 도시한 바와 같이, 셀레 콕십이 배양 중인 혈관 평활근 세포의 Akt와 GSK-3β의 인산화(phosphorylation)를 억제하여 결국 생존하는 세포수를 줄이는 효과를 보였으며 이러한 효과는 활성형-Akt를 주입시에는 반전됨을 확인할 수 있었다. 도 4(A-C)에 도시한 바와 같이, 이러한 생존 세포수의 감소는 증식 억제 효과와 세포 고사(apoptosis) 유도를 통하여 이루어짐을 알 수 있었다.

본 발명의 또다른 일실시예에서는, 래트 경동맥 손상 모델의 in vivo에서 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군이 혈관 신생내막의 증식에 어떠한 영향을 주는지 살펴보았다. 도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, 혈관 손상 후 2 주째에는 셀레콕십을 투여한 군에서는 내막/중막 비(intima/media ratio)를 감소시키는 효과를 보였으나, 아스피린 투여군에서는 이러한 효과를 보이지 않았다. 도 7, 도 8 및 도 9에 도시된 바와 같이, 혈관 손상 후 3 일째에는 셀레콕십 투여군은 손상으로 인한 Akt와 GSK-3β의 인산화를 억제하여 결국 혈관 평활근 세포 증식을 감소시키고, caspase-3의 활성화를 억제시키는 것은 물론 세포 고사를 증가시키는 효과를 보였으나, 아스피린을 투여한 군에서는 그와 같은 효과를 보이지 않았다.

본 발명의 또다른 일실시예에서는, 셀레콕십의 신생내막 억제 작용이 Akt 신호경로 차단을 통하여 이루어진다는 것을 확실하게 증명하기 위해 in vivo에서 억제형-Akt와 활성형-Akt 유전자를 포함하는 아데노바이러스를 이용한 실험을 시행하였다. 도 10 및 11에 도시된 바와 같이, 아데노바이러스를 이용하여 억제형-Akt 유전자를 경동맥에 주입하였을 때는 셀레콕십 투여시 신생내막 형성이 억제되는 것과 동일한 효과를 보였다. 반대로 활성형-Akt 유전자를 경동맥에 주입하였을 때는 셀 레콕십에 의한 신생내막 증식 억제 효과가 반전되었고 이러한 결과들은 셀레콕십에 의해 Akt 신호전달 체계를 조절하는 것이 생리학적으로 적합한 기전이라는 것을 증명하는 것이라 할 수 있다.

상기 셀레콕십은 상업적으로 시판 중인 제품을 구입하여 사용할 수 있으며, 원재료만 정제하여 사용할 수 있다. 시판되는 약제로는 예를 들어, 쎄레브렉스(Celebrex™)가 대표적이다. 본 발명의 일실시예에서는 미국의 화이자 제약회사가 판매하고 있는 셀레콕십(상품명: 쎄레브렉스)을 사용하였다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 혈관 재협착 예방 및 치료 목적, 환자의 상태, 치료 기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며, 예컨대 셀레콕십을 5 uM 이상의 농도로 포함할 수 있다. 본 발명의 일례에서, 조성물 중 셀레콕십의 함량이 5 uM인 경우 신생내막 증식을 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 동맥 재협착의 예방 및 치료에 매우 효과적이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 동맥 재협착의 치료와 예방에 매우 효과적이다. 상기 동맥 재협착은 혈관 신생내막의 증식에 기인하는 것일 수 있다. 또한, 상기 동맥 재협착은 경피적 동맥 성형술, 풍선 혈관 성형술, 스텐트 삽입, 동맥 우회술, 동맥-정맥 문합술 등에 의하여 유발될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함함으로써 적합한 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 식염수, 완충식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 약학 조성물은 필요한 경우 추가의 성분, 예컨대 부형제, 안정화제, 붕해제, 감미제, 활 택제, 향미제 및 결합제 등을 함유할수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 통상적인 방법에 의해 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제, 유제, 유화제, 크림제 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 경구 또는 비경구로 사용될 수 있다.

특히, 본 발명의 약학 조성물은 스텐트에 코팅하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 침염 코팅(dip coating)이나 폴리머 기재 코팅(polymer-based coating) 등의 방법으로 스텐트에 코팅하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 동맥 재협착 방지제의 통상적인 투여량으로, 일예로 1 일 400 - 800 mg의 셀레콕십을 사용할 수 있다. 그러나 상기 투여량은 이에 한정되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 질환의 중증도, 병용되는 약물 등에 따라 달리 적용되는 것이 바람직하다.

이하, 하기 실시예를 들어 본 발명의 실시 형태를 구체적으로 설명하겠으나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

셀레콕십 시료의 제조

한국 화이자 제약(Pfizer Korea, 서울, 대한민국)으로부터 구입한 정제된 셀레콕십을 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹여 그 최종 농도가 0.1 %가 되도록 하여 사용하였다.

아데노바이러스 구조체

Akt의 활성도를 조절하기 위해, 헤마그글루티닌(hemagglutinin)이 붙어 있는 2 종류의 아데노바이러스 구조체를 사용하였다(Fujio Y, Walsh K., J Biol Chem. 1999;274:16349-54, Fujio Y, Guo K, Mano T, et al., Mol Cell Biol. 1999;19:5073-82):

- 억제형(dominant-negative, DN) Akt 구조체: 2 개의 인산화 부위, 즉 세린(serine) 473과 트레오닌(threonine) 308을 가지는데 이들이 알라닌(alanine)으로 치환되어 Akt가 인산화되지 못하게 된 것이며,

- 활성화형(Myr) Akt 구조체: N-말단이 마이리스토일(myristoyl)화되어 활성화 상태가 된 것이다.

또한, 대조군으로써 GFP(green fluorescent protein) 유전자를 붙인 아데노바이러스(adeno-GFP)를 사용하였다.

실험동물의 사육

13 주령의 수컷 스프라그-다우리계 래트(Sprague-Dawley rats)(체중 약 400 g)((주)대한바이오링크, 충북)에게 일반적인 먹이를 먹이면서 자유롭게 물을 먹도록 하였다. 실험 프로토콜은 서울대학교 병원, 임상의학 연구소, 동물실험실의 "동물 실험 지침"에 따랐다.

통계 분석

하기 실시예에서 모든 수치는 기본적으로 평균±표준오차(mean±SEM)으로 나타내었다. 다수 비교를 위해서 ANOVA를 실시하였고 Student's t test를 사용하였 다. P<0.05인 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 실험결과의 모든 통계 분석은 SPSS 11.0 프로그램을 사용하였다.

실시예 1: In vitro 에서 혈관 평활근 세포 생존성 감소 효과

1-1) 세포 분리와 배양

스프라그-다우리계 래트의 흉강 대동맥에서 대동맥 혈관 평활근 세포를 분리하였다(Sachinidis A, Flesch M, Ko Y, et al., Hypertension. 1995;26:771-8). 분리된 세포를 10 %의 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 100 IU/ml의 페니실린, 100 IU/ml의 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)(Gibco BRL)에서 배양시켰다.

1-2) 웨스턴 블롯을 통한 Akt의 인산화(phosphorylation)에 미치는 영향 분석

세포를 혈청이 없는 상태의 배지에서 24 시간 동안 배양시켰다. 어느 정도 배양되면 25 ng/ml의 PDGF-BB(혈소판 유래 증식 인자, platelet-derived growth factor)를 각각 0, 10, 25 uM 농도의 셀레콕십과 함께 첨가하여 자극시킨 후 2 시간 후에 채취하여 웨스턴 블롯을 시행하였다. 1 차 항체로 항-phospho-Akt(Ser 473)(1:500 희석, Cell Signaling Technology), 항-total-Akt(1:500 희석, Cell Signaling Technology), 항-phospho-GSK-3β(Ser9)(1:750 희석, Cell Signaling Technology), 항-α-tubulin(1:4000 희석, Oncogene)을 이용하였다.

셀레콕십 처리한 혈관 평활근 세포의 광학 현미경 사진을 보여주는 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 현미경으로 보았을 때 10 uM 또는 25 uM의 셀레콕십이 첨가 된 혈관 평활근세포는 점차 동그랗게 되고 배양 접시로부터 떨어지는 경향을 보였다.

세포의 생존성 상실은 인산화된 Akt(p-Akt)와 인산화된 GSK-3β(p-GSK-β)의 감소와 관계가 있다. 도 2는 PDGF 자극 유무에 따라 셀레콕십이 Akt의 인산화에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 결과로, 셀레콕십이 세포가 자극되지 않은 조건에서는 Akt와 GSK-3β의 인산화 정도를 감소시킴을 보여준다. 반면, PDGF를 사용하여 자극한 경우라도 자극하지 않은 경우에 비해서는 Akt와 GSK-3β의 인산화 정도가 증가하였으나 셀레콕십로 처리한 경우에는 농도 의존성으로 인산화 정도가 감소됨이 관찰된다.

1-3) WST-1을 이용한 혈관 평활근 세포의 생존에 미치는 영향 분석

셀레콕십이 어느 정도 세포수를 감소시키는지를 정량화하고 그러한 효과가 Akt 경로를 통해 일어나는지 알아보기 위하여, WST-1 분석을 이용하여 세포 생존성과 증식 정도를 분석하였다.

먼저, 96-웰 플레이트에 웰 당 2 X 10⁴ 개의 세포를 100 uL의 DMEM와 함께 분주한 후 48 시간 동안 혈청이 없는 상태로 배양하였다. 셀레콕십을 각각 0, 5, 10, 25 uM 농도로 첨가하면서 10 % FBS 또는 PDGF-BB로 자극하였다. 배양이 끝날 때 10 uL의 WST-1 용액을 첨가하였다. 다만, 이 때 유전자 전이(gene transfer)를 이용하는 경우에서는 셀레콕십을 첨가하기에 앞서 먼저 혈관 평활근 세포에 아데노바이러스 벡터를 넣고 하루밤(overnight) 정도 경과 후에 실험한다.

상기 분석 결과, PDGF나 10 % FBS로 자극을 준 상태에서 셀레콕십은 농도에 따라 혈관 평활근 세포수를 감소시킴을 도 3(A 및 B)에서 확인할 수 있다. 셀레콕십의 생존 세포수 감소 효과는 10 % FBS로 자극을 줄 때보다 PDGF로 자극했을 때 더 크게 나타났다. 구체적으로, PDGF로 자극한 경우의 세포수는 대조군을 100 %로 볼 때 10 uM 셀레콕십 투여시 41.2±6.7 %, 25 uM 셀레콕십 투여시 27.3±4.4 %이었으며, 10% FBS로 자극한 경우의 세포수는 대조군(100 %)에 비하여 10 uM 셀레콕십 투여시 76.8±7.0 %, 25 uM 셀레콕십 투여시 63.6±8.6 %이었다(두 경우 모두 p<0.01).

다른 한편, 아데노바이러스를 이용하여 활성형의 Akt gene을 전이시킨 경우에는 상기와 같은 셀레콕십의 생존 세포수 감소 효과를 반전시켰으며 결과적으로 생존 세포수의 증가시켰다(도 3). 구체적으로, PDGF로 자극한 경우의 세포수는 대조군을 100 %로 볼 때 25 uM 셀레콕십+adeno-GFP 전이시 27.3±4.4 %, 25 uM 셀레콕십+adeno-myr-Akt 전이시 91.3±13.2 %이었으며, 10 % FBS로 자극한 경우의 세포수는 대조군(100 %)에 비하여 25 uM 셀레콕십+adeno-GFP 전이시 63.6±8.6 %, 25 uM 셀레콕십+adeno-myr-Akt 전이시 84.8±8.5 %이었다(두 경우 모두 p<0.01).

1-4) BrdU 분석과 유세포 분석을 이용한 세포 주기와 세포 고사에 미치는 영향 분석

혈관 평활근 세포수의 감소에 대한 세포 고사와 세포 주기의 영향을 알아보기 위해서, BrdU 삽입(incorporation) 분석과 유세포 분석을 행하였다.

BrdU 분석:

BrdU 분석은 상기 WST-1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 다만 WST-1 용액 대신에 BrdU를 넣어서 분석하였다.

유세포 분석:

유세포 측정기(flow cytometry)를 사용하여 세포 주기와 세포 고사 정도를 평가하였다(Kim HS, Skurk C, Thomas SR, et., J Biol Chem. 2002;277:41888-9). 세포를 배양판에 착상시킨 후 0.4 % FBS를 첨가한 DMEM에서 48 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 셀레콕십을 첨가하고 25 ng/mL의 PDGF-BB 또는 10 % FBS가 함유된 DMEM로 교환하였다. 상기 세포들의 세포 주기를 평가하기 위해서 20 시간 뒤에 채취하고, 세포 고사 정도를 평가하기 위해서는 48 시간 뒤에 채취하여야 함에 유의한다. 유세포 측정기(Becton-Dickinson, USA)를 사용하여 DNA 양을 분석하였고, 각 세포 주기마다 어느 정도 분포되어 있는지는 Modfit LT 소프트웨어(Verity Software, Topsham, ME)를 사용하여 측정하였다.

결과:

셀레콕십은 용량에 비례하게 DNA 합성을 억제하였다(도 4-A). 또한 셀레콕십 처리한 경우에는 세포 주기 중 G1 주기 상태에서 정지시켰으며 결국 S 주기 상태는 감소시키는 결과를 가져왔다(도 4-B). 또한 유세포 분석 결과 셀레콕십은 세포 고사를 나타내는 DNA의 분절을 증가시키는 현상을 보였다(도 4-C).

BrdU 삽입, S 주기 분율, 세포 고사에 대한 셀레콕십의 효과는 10 % FBS보다 PDGF로 자극하였을 때 더 크게 나타났다(데이타 미첨부).

실시예 2: In vivo 에서 혈관 신생내막 증식의 억제 효과

본 실시예에서는 래트를 각 군당 10 마리씩 3 개의 군으로 나누어 실험하였다: 셀레콕십군(50 mg/kg/day 농도로 셀레콕십 투여), 아스피린군(50 mg/kg/day 농돌 아스피린 투여), 및 대조군(0.5 %의 메틸셀룰로스 및 0.025 %의 Tween 20 투여). 각 약제를 하기 풍선 카테터를 이용한 손상 3 일 전부터 해당 래트에게 경구 투여하였고, 손상 후에도 2 주간 계속 투여하였다.

2-1) 경동맥 손상 모델(rat carotid artery balloon injury model)의 제조

대상 래트를 염산케타민(ketamine hydrochloride) 50 mg/kg (유한양행)과 자일라진(xylazine) 7 mg/kg (유한양행)으로 마취한 후에 좌측 경동맥을 노출시켜 외경동맥(external carotid artery)에 절개를 가한 후 이 곳을 통하여 2F 풍선 카테터(Fogarty ballon catheter)(Baxter, USA)를 삽입하였다(Clowes AW, Reidy MA, Clowes MM., Lab Invest. 1983;49:327-33). 풍선 카테터를 총경동맥(common carotid artery)에 넣은 후 생리 식염수 0.2 mL를 주입하여 부풀린 후에 돌리면서 3 회 정도 전진과 후진을 반복하였다.

2-2) 형태학적 분석

혈관 성형술 후 하기와 같이 형태학적 분석을 실시하였다. 우선, 손상을 준 후 3 일째와 2 주째 되는 각 시점에, 래트에게 과량의 펜토바비탈(pentobarbital)로 안락사시키고 10 % 포름알데히드 용액을 관류시킨 후 경동맥을 채취하여 같은 포름알데히드 용액에 넣었다. 그런 다음, 조직을 파라핀에 포매(embeddng)한 후 여러 군데를 잘라서 4 um의 두께로 4 ~ 5 개의 절편을 제작하였다. 제작된 절편을 Hematoxylin & Eosin 또는 Elastic van Gieson으로 염색하였다. Image Pro Plus Analyzer Version 4.5 프로그램(Media Cybernetics Inc.)을 사용하여 각 절편에서 혈관내강(lumen) 면적, 신생내막(neointima) 면적(내탄성막 면적에서 혈관내강 면적을 뺀 면적) 및 중막(media) 면적을 구하였다. 그런 다음, 이들 구한 값으로부터 내막/중막 비(intima/media ratio)(I/M 비)를 계산하였다.

대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 저배율과 고배율의 광학현미경 사진을 나타내는 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 풍선을 이용한 혈관 손상 2 주 후에 대조군을 관찰한 결과 상당량의 신생내막이 형성되었음을 관찰할 수 있다. 또한 셀레콕십을 투여한 군에서는 대조군과 비교한 결과 신생내막 형성도 상당히 줄어들었음이 관찰되었다. 반면, 아스피린 투여군에서는 신생내막 형성의 감소는 관찰되지 않았다. 혈관 손상 후 3 일째에는 어떠한 군에서도 신생내막 형성을 관찰할 수 없었다(데이터 미첨부).

도 6은 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 내막/중막의 면적비(I/M 비)를 나타내는 그래프(A), 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 내막, 중막 및 혈관내강의 면적을 나타내는 그래프(B)이다. 도 6(A 및 B)으로부터 알 수 있는 바와 같이, 셀레콕십군의 I/M 비는 0.48±0.05 mm²로서, 대조군의 0.98±0.04 mm²에 비하여 상당히 감소되었으나(p<0.001), 아스피린군의 I/M 비(0.89±0.05 mm²)는 대조군의 경우(0.98±0.04 mm²)와 별다른 차이가 없었다(p=0.25).

2-3) 혈관 평활근 세포의 증식 및 세포 고사에 미치는 영향 분석

셀레콕십이 in vivo에서 혈관 평활근 세포의 증식과 세포 고사에 어떠한 영 향을 끼치는지를 확인하기 위하여 하기 면역조직화학 염색 및 TUNEL 분석을 실시하였다.

면역조직화학 염색:

면역조직화학 염색법은 기존에 쓰이던 방법을 이용하였다(Park KW, Yang HM, Youn SW, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23:1364-9). 1 차 항체로는 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)의 경우 항-PC-10(1:200, DAKO), 항-HA(1:200, Santa Cruz), 항-cleaved caspase-3(1:200, Cell Signaling Technology), 대식 세포의 경우 항-ED-1(1:200, Serotec)를 사용하였다.

TUNEL 분석:

TUNEL 분석은 이전의 사용 방법을 약간 수정하여 실시하였고, 14 Apoptag kit를 사용하였으며 DAB을 chromogen으로 사용하였다. Methyl green 또는 Mayer's hematoxylin을 대조 염색으로 사용하였다. 한 조직마다 세 곳의 다른 단면을 조사하여 전체 핵이 있는 세포수 중에서 PCNA, TUNEL, ED-1 양성인 세포수의 분율을 백분율(%)로 정량화하였다. 모든 샘플은 코드화하여 어떠한 군에 속하는지 알 수 없도록 하였다.

혈관 평활근 세포의 증식 억제 효과:

In vivo에서 셀레콕십이 혈관 평활근 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해, PCNA에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다.

도 7-A는 혈관 손상 후 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 PCNA에 대한 면역조직화학 염색의 결과를 나타내며, 도 8-A는 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군 으로부터 측정한 PCNA 양성 세포(%)를 나타내는 그래프이다. 도 7-A 및 도 8-A로부터 알 수 있는 바와 같이, 혈관 손상 후 3 일째에 대조군에서는 29.8±1.7 %의 PCNA 양성핵이 관찰되었으나 셀레콕십군에서는 단지 17.1±1.5 %만이 관찰되었다(p<0.001). 또한 혈관 손상 후 2 주 후 셀레콕십군의 PCNA 양성 세포수는 5.9±0.8 %로 대조군의 9.7±0.8 %에 비하여 감소되었다. 그러나 아스피린군에서는 혈관 평활근 세포의 증식에 대한 억제 효과는 나타나지 않았다(3 일째 25.6±1.9 %, 2 주째 8.5±0.7 %).

혈관 평활근 세포의 고사 유도 효과:

In vivo에서 셀레콕십이 혈관 평활근 세포의 고사에 미치는 영향을 알아보기 위해, TUNEL 분석과 activated caspase-3에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다.

도 7-B는 혈관 손상 후 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 TUNEL 분석에 대한 면역조직화학 염색의 결과를 나타내며, 도 7-C는 혈관 손상 후 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군의 activated caspase-3에 대한 면역조직화학 염색의 결과를 나타내며, 도 8-B는 대조군, 셀레콕십군 및 아스피린군으로부터 측정한 TUNEL 양성 세포(%)를 나타내는 그래프이다. 도 7(B 및 C), 및 도 8-B에서 알 수 있는 바와 같이, 혈관 손상 후 3 일째에 관찰한 결과 셀레콕십군(19.4±2.0 %)에서 대조군(12.3±1.3 %)이나 아스피린군(11.8±1.2 %)에 비하여 더 많은 세포 고사가 관찰되었다. 혈관 손상 후 2 주째의 TUNEL 양성 지수(%)도 셀레콕십군 8.1±0.9 %, 대조군 4.6±0.7 %, 아스피린군 5.3±0.8 %로, 그 차이가 상대적으로 좀 적을 뿐 3 일째의 경우와 동일한 경향을 보였다. 이들 결과와 동일한 경향이 Activated caspase-3에 대 한 면역조직화학 염색의 경우에도 나타남을 도 7-C를 통해 확인할 수 있다.

혈관 손상 후 2 주째의 조직을 살펴보았을 때 신생내막 내의 대식 세포는 혈관내강 주위에 있는 것이 아니라 내탄력막(internal elastic lamina) 주위에 위치하고 있었다(데이터 미첨부). 대조군에 비하여 아스피린군과 셀레콕십군에서 대식 세포의 침윤 정도가 조금 감소되어 있는 경향을 보였다(대조군, 아스피린군 및 셀레콕십군의 대식 세포 비율은 각각 7.1±0.9 %, 5.1±0.6 % 및 5.4±0.5 %이었음).

2-4) 웨스턴 블롯을 통한 Akt 신호경로에 미치는 영향 분석

풍선 손상 후 Akt의 활성화를 셀레콕십이 차단함으로써 신생내막 형성을 억제할 수 있는지 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯을 통하여 Akt 신호경로에 미치는 셀레콕십의 영향을 분석하였다.

3 개의 경동맥 표본을 얻어 섞은 후 상기 실시예 1의 1-2)에서와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 실시하였다.

구체적으로, in vivo 상태에서 혈관 손상 후 Akt의 활성화 정도의 변화를 알아보기 위해, 손상 전, 손상 3 일 후, 손상 2 주후의 혈관 조직을 얻어 phospho-Akt 및 phospho-GSK-3β에 대한 웨스턴 블롯을 시행하였다. 그 결과를 도 9-A에 나타내었다. 도 9-A에서 알 수 있는 바와 같이, 혈관 손상 후 3 일째 Akt는 상당히 활성화되고, 또한 GSK-3β의 인산화도 활성화된다. 또한 혈관 손상 후 2 주째에는 활성화된 Akt의 정도가 크게 감소하였다(도 9-A).

또한, 혈관 손상 후 셀레콕십이 p-Akt와 p-GSK에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보기 위해, 혈관 손상 후 3 일째에 각 군에서 조직을 얻어 Akt와 GSK-3β에 대한 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과는 도 9-B에 나타나 있다. 도 9-B에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군이나 아스피린군과 비교하여 셀레콕십군에서 Akt와 GSK-3β의 인산화 정도가 상당히 감소된다.

실시예 3: In vivo 에서 Akt 활성화 억제를 통한 신생내막 형성 억제 효과

본 실시예에서는 래트를 각 군당 10 마리씩 4 개의 군으로 나누어 실험하였다: adeno-GFP 유전자군(대조군), adeno-DN-Akt 유전자군, (셀레콕십+adeno-GFP 유전자)군, 및 (셀레콕십+myr-Akt 유전자)군. 실시예 2의 2-1)에서와 동일한 방법으로 풍선을 이용하여 손상을 준 후, 5 X 10⁸ pfu의 아데노바이러스를 손상된 혈관에 주입시킨 다음, 혈관 클램프(clamp)를 사용하여 20 분 동안 배양(incubation)하였다.

3-1) 억제형-Akt 유전자 전이를 통한 Akt 신호경로에 미치는 영향 분석

셀레콕십의 신생내막 형성 억제 효과가 Akt 활성화 억제를 통하여 이루어지는지 확인하기 위해, 풍선 혈관 손상 후에 억제형-Akt(DN-Akt) 유전자 전이를 행하였다. 유전자 전이 후 2 주째 조직에서 면역조직화학 염색을 실시한 결과, HA가 붙은 유전자의 발현을 확인할 수 있었으며, 웨스턴 블롯을 통해서도 이를 확인할 수 있었다(데이터 미첨부).

도 10-A에서 확인할 수 있는 바와 같이, 억제형-Akt 유전자를 전이시킨 군에서는 혈관 손상 후 2 주째 신생내막 형성이 현저히 줄어들어 있음을 관찰할 수 있다. 구체적으로, 대조군의 내막/중막 비(0.86±0.05 mm²)에 비하여 억제형-Akt(DK- Akt)의 내막/중막 비는 0.51±0.04 mm²로 크게 감소하였다(p<0.001).

혈관 손상 후 3 일째와 2 주째 조직의 내막과 중막에서 PCNA 양성인 혈관 평활근 세포수를 확인해본 결과, 억제형-Akt를 전이시킨 군의 경우 각각 3 일째 15.7±1.8 %, 2 주째 4.7±0.6 %로, 대조군(3 일째: 25.4±1.7 %, 2 주째: 7.6±0.9 %)에 비해 현저히 감소하였다(p<0.05). 또한, 혈관 손상 후 3 일째에 TUNEL 분석을 실시한 결과 억제형-Akt군(19.7±2.1 %)에서 대조군(1.38±1.6 %)에 비하여 더 많은 세포 고사를 보였다(p<0.05). 또한, 혈관 손상 후 2 주째 TUNEL 분석의 경우도 대조군 3.3±0.5 %, 억제형-Akt 5.3±0.7 %로, 그 절대값은 감소했으나 3 일째의 경우와 같은 경향을 보였다. 도 11은 혈관 손상 2 주 후 대조군과 억제형-Akt군의 PCNA 및 TUNEL 분석에 대한 면역조직화학염색 결과를 각각 나타낸 것이다.

3-2) 활성형-Akt 유전자 전이를 통한 Akt 신호경로에 미치는 영향 분석

셀레콕십에 의해 Akt 신호전달 체계를 조절하는 것이 생리학적으로 적합한 기전이라는 것을 확인하기 위해, 풍선 혈관 손상을 가한 동맥에 활성형-Akt 유전자를 전이시켰다.

도 10-A에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혈관 손상 후 2 주째 대조군(즉, adeno-GFP군)의 내막/중막비는 0.86±0.05 mm², (셀레콕십+adeno-GFP)군의 내막/중막비는 0.45±0.04 mm², (셀레콕십+활성형-Akt)군의 내막/중막비는 0.78±0.05 mm²로, 셀레콕십에 의해 신생내막이 감소되는 효과가 반전됨을 관찰할 수 있다.

또한, PCNA에 대한 면역조직화학 염색에서 활성형-Akt 유전자 전이는 셀레콕 십에 의해 억제되는 혈관 평활근 세포 억제 효과를 반전시키는 효과를 보였다. 구체적으로, (셀레콕십+adeno-GFP)군의 경우 3 일째 16.9±1.3 %, 2 주째 5.1±0.5 %인 반면, (셀레콕십+활성형-Akt)군의 경우는 각각 3 일째 20.7±1.3 %, 2 주째 6.9±0.7 %이었다(p<0.05). 또한, TUNEL 분석에서도 활성형-Akt 유전자 전이는 셀레콕십에 의해 유도되는 세포 고사 정도를 감소시키는 효과를 보였다. 구체적으로, (셀레콕십+adeno-GFP)군의 경우 3 일째 21.3±1.6 %, 2 주째 6.1±0.6 %인 반면, (셀레콕십+활성형-Akt)군의 경우는 각각 3 일째 15.4±1.4 %, 2 주째 4.1±0.5 %이었다(p<0.05). 도 11은 혈관 손상 2 주 후 (셀레콕십+adeno-GFP)군과 (셀레콕십+활성형-Akt)군의 PCNA 및 TUNEL 분석에 대한 면역조직화학염색 결과를 각각 나타낸 것이다.

본 발명에 따른 셀레콕십을 포함하는 동맥 재협착 예방 및 치료를 위한 약학 조성물은 혈관 평활근 세포 증식 억제와 세포 고사 유도 효과와 항염증 효과를 통해 혈관 신생내막의 증식을 유의적으로 억제함으로써 동맥 재협착의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

셀레콕십을 유효 성분으로 포함하는 동맥 재협착 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 동맥 재협착이 혈관 신생내막의 증식에 기인하는 것인 약학 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 동맥 재협착이 경피적 동맥 성형술, 풍선 혈관 성형술, 스텐트 삽입, 동맥 우회술, 동맥-정맥 문합술에 의해 유발되는 것인 약학 조성물.