ES2229788T3 - Uso del gen o proteina vegf-c o vegf-d para prevenir la restenosis. - Google Patents

Abstract

El uso de una composición en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la restenosis de un vaso sanguíneo en un mamífero, preferiblemente un ser humano, donde la composición comprende al menos un agente seleccionado del grupo constituido por: polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del factor C de crecimiento endotelial vascular (VEGF-C); polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del factor D de crecimiento endotelial vascular (VEGF-D); polipéptido VEGF- C; y polipéptido VEGF-D.

Description

Uso del gen o proteína VEGF-C o VEGF-D para prevenir la restenosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la prevención de la estenosis y la restenosis de los vasos sanguíneos, y se refiere de forma general al campo de la medicina cardiovascular.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de la arteria coronaria constituye una causa principal de la morbilidad y mortalidad a lo ancho del mundo, especialmente en los Estados Unidos y Europa. La angioplastia coronaria transluminal percutánea (por ejemplo, angioplastia con balón, con o sin endoprótesis vascular (stent) intracoronaria) es actualmente una terapia común y satisfactoria para dicha enfermedad, realizada cientos de miles de veces por año solamente en los Estados Unidos. Sin embargo, la restenosis tiene lugar tantas veces como en un tercio o la mitad de tales procedimientos de revascularización, usualmente dentro de los seis primeros meses después del procedimiento de angioplastia. El coste económico de la restenosis ha sido estimado en 2 billones de dólares anualmente solamente en los Estados Unidos. [Feldman et al., Cardiovascular Research, 32: 194-207 (1996), incorporada aquí como referencia]. Los estudios de autopsia y aterectomía han identificado hiperplasia de la íntima como el componente histológico principal de las lesiones restenóticas. [Cerek et al., Am. J. Cardiol., 68: 24C-33C (1991)].

La restenosis también permanece como un problema clínico en la angioplastia que se realiza en los vasos sanguíneos periféricos. Asimismo, la estenosis es un problema clínico después de los transplantes de vasos sanguíneos (por ejemplo, venas injertadas y vasos artificiales injertados) para la terapia de bypass cardiaco o para el tratamiento de la isquemia periférica o la claudicación intermitente, por ejemplo (por ejemplo, injertos de bypass arterial femoro-popliteo por detrás de la rodilla).

Mazur et al, Texas Heart Institute Journal, 21; 104-111 (1994) indican que la restenosis es fundamentalmente una respuesta de la arteria al daño causado por la angioplastia coronaria percutánea, que rompe la capa de la íntima de las células endoteliales y las células subyacentes del músculo liso de la media. Los autores indican que los factores de crecimiento múltiples secretados por las plaquetas, células endoteliales, macrófagos, y células del músculo liso están mecanísticamente implicados en el proceso de la restenosis, y que la proliferación de las células del músculo liso constituye una característica patogénica crítica. Según los autores, esta proliferación de las células del músculo liso ha mostrado ser refractaria a la terapia mecánica y farmacológica. Más recientemente, otros investigadores han cuestionado si la proliferación de las células del músculo liso es de gran importancia en la restenosis. Véase Libby, Circ. Res., 82: 404-406 (1998).

Narins et al, Circulation, 97: 1298-1305 (1998) revisan el uso de endoprótesis intracoronarias y sus beneficios y limitaciones en la prevención de la restenosis. Debbas et al., American Heart Journal, 133: 460-468 (1997) discuten el estrechamiento dentro de una endoprótesis para tratar la restenosis por endoprótesis (in-stent).

Chang & Leiden, Semin. Intervent. Cardiol, I: 185-193 (1996), incorporada aquí como referencia, revisan la aproximación a la terapia génica somática para tratar la restenosis. Chang y Leiden indican que el adenovirus de replicación deficiente comprende un sistema vector prometedor y seguro para la terapia génica dirigida a la prevención de la restenosis, debido a que tales virus pueden infectar eficazmente una amplia variedad de tipos de células, incluyendo las células del músculo liso vascular; tales virus se pueden producir a altas concentraciones (por ejemplo, 10^{10}-10^{12} unidades formadoras de placa por milímetro); tales virus pueden acomodar un inserto transgénico, por ejemplo, de 7-9 kilobases (kb) en tamaño; tales virus se pueden liberar percutáneamente por medio de catéteres estándar; y tales virus no se integran dentro del genoma del hospedante. Tanto Chang & Leiden como Feldman et al., supra, revisan también las aproximaciones de la terapia génica citotóxica y citostática, diseñadas para matar o detener la proliferación de las células del músculo liso vascular que se piensa que es responsable de las formaciones de la neoíntima que caracterizan la restenosis.

Riessen & Isner, J. Am. Coll. Cardiol., 23: 1234-1244 (1994), incorporada aquí como referencia, revisan los dispositivos para la liberación intravascular del fármaco y los vectores para la terapia génica intravascular.

Cerek et al., Am. J. Cardiol., 68: 24C-33C (1991) sugieren la prevención de la restenosis mediante la inhibición de la curación del daño arterial mediada por el factor de crecimiento. Se discuten los papeles potenciales del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), trombospondina, factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF), factor alfa de crecimiento de transformación (TGF-\alpha) y beta (TGF-\beta), factor de crecimiento epidérmico (EGF).

Isner & Asahara, publicación de patente internacional Nº WO 98/19712, incorporada aquí como referencia, sugieren el tratamiento de los vasos sanguíneos dañados y la aceleración de la reendotelización después de la angioplastia mediante el aislamiento de células progenitoras endoteliales de un paciente y la readministración de dichas células al paciente. Los autores sugieren que la eficacia del uso de un factor de crecimiento que favorece la angiogénesis, tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o el factor de crecimiento del fibroblasto básico (bFGF), puede estar limitada por la ausencia de células endoteliales sobre las que VEGF o bFGF ejercerían su efecto.

Martin et al., publicación de patente internacional Nº WO 98/20027 sugieren el uso del gen o proteína VEGF para tratar o prevenir la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo. Los autores sugieren que cualquier efecto beneficioso de VEGF surge de un mecanismo de acción diferente del mecanismo que subyace en la actividad de VEGF relacionada con la estimulación de la reendotelización en los casos en los que el endotelio ha sido dañado.

Callow et al., Growth Factors, 10: 223-228 (1994) indican que la inyección intravenosa del factor de permeabilidad vascular (a.k.a. VEGF) en conejos que han sido sometidos a denudación endotelial inducida por la angioplastia con balón da como resultado un aumento de la regeneración del endotelio comparado con un testigo. Los autores también indican que el factor de crecimiento del fibroblasto básico (bFGF) es eficaz en favorecer la reendotelización, pero que dicha reendotelización se acompaña por aumentos en el tamaño de la lesión de la neoíntima.

Asahara et al., Circulation, 94: 3291-3302 (15 de diciembre, 1996) indican que la liberación local, por catéter percutáneo de un transgen CMV-humano-VEGF_{165} logró acelerar la reendotelización en los conejos dañados con balón, y dio como resultado una disminución en el espesamiento de la íntima. En un documento de un grupo relacionado de autores, Van Belle et al., J. Am. Coll. Cardiol, 29: 1371-1379 (mayo, 1997) indican que la endotelización de la endoprótesis se aceleró por la liberación de un transgen CMV-humano-VEGF_{165} y fue acompañada por la atenuación del espesamiento de la íntima.

Morishita et al., J. Atherosclerosis and Thrombosis, 4(3): 128-134 (1998) indican que el factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) tiene una actividad mitogénica en las células endoteliales humanas más potente que VEGF, y hacen una hipótesis de que la terapia génica HGF puede tener valor terapéutico potencial para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares tales como la restenosis después de la angioplastia. Morishita et al, indican también que se tiene muy poco conocimiento acerca de los factores de crecimiento que estimulan sólo las células endoteliales, pero no las células de músculo liso vascular.

DeYoung & Dichek, Circ. Res, 82: 306-313 (1998) indican que la liberación del gen VEGF no parece destinada comúnmente para la aplicación a la restenosis coronaria humana, y que dos estudios independientes sugieren que la liberación de VEGF puede en realidad empeorar la hiperplasia de la íntima arterial.

Brown et al., patente de Estados Unidos Nº 5.795.898 sugieren el uso de un inhibidor de las señales de PDGF, FGF, EGF, o VEGF para suprimir la aterogénesis acelerada implicada en la restenosis de los vasos coronarios o de otros vasos arteriales después de la angioplastia.

La discusión anterior demuestra que continua existiendo una vieja necesidad de mejoras en los materiales y/o en los métodos de la angioplastia, y/o en las terapias complementarias para reducir por ejemplo la restenosis.

Sumario de la invención

La presente invención se destina a las viejas necesidades en el campo de la medicina en relación a la prevención de la estenosis o restenosis en los vasos sanguíneos de los mamíferos. El objetivo de la invención se define en las reivindicaciones.

Por ejemplo, la invención proporciona el uso de una composición en la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero para prevenir la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo, comprendiendo dicho tratamiento la etapa de administrar a un mamífero que necesita el tratamiento para prevenir la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo, una composición que comprende un polinucleótido, comprendiendo el polinucleótido una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del factor C de crecimiento endotelial vascular (VEGF-C). En una realización preferida, el sujeto es un ser humano.

Aunque se contempla que el polinucleótido VEGF-C se puede administrar de forma pura como tratamiento profiláctico para prevenir la estenosis, se contempla que el polinucleótido se administre poco antes y/o a la vez, y/o poco después de un procedimiento de angioplastia coronaria transluminal percutánea, con el propósito de prevenir la restenosis del vaso del sujeto. El polinucleótido se puede administrar antes, durante y/o poco después de un procedimiento de bypass (por ejemplo, un procedimiento de bypass coronario), para prevenir la estenosis o restenosis en o cerca del vaso transplantado (injerto), especialmente la estenosis en la localización del propio injerto. El polinucleótido se puede administrar antes, durante o después de un transplante vascular en la periferia vascular que se ha desarrollado para tratar la isquemia periférica o la claudicación intermitente. Por prevención de la estenosis o restenosis se entiende un tratamiento profiláctico para reducir la cantidad/severidad, y/o eliminar sustancialmente, de la estenosis o restenosis que frecuentemente se da en dichos procedimientos quirúrgicos. El polinucleótido está incluido en la composición en una cantidad y en una forma eficaz para favorecer la expresión de un polipéptido VEGF-C en un vaso sanguíneo de un mamífero, previniendo así la estenosis o la restenosis del vaso sanguíneo.

En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. Por ejemplo, el sujeto es una persona que padece una enfermedad de la arteria coronaria que ha sido identificada por el cardiólogo como candidata que se podría beneficiar de un procedimiento terapéutico de angioplastia con balón (con o sin la inserción de una endoprótesis intravascular) o de un procedimiento de bypass coronario. También está contemplado que la invención se puede usar para otros mamíferos, especialmente mamíferos que se usan convencionalmente como modelos para demostrar la eficacia terapéutica en humanos (por ejemplo, primates, cerdos, perros, o conejos),

Para la práctica de la invención, el término "polipéptido VEGF-C" se pretende que incluya cualquier polipéptido que tenga un VEGF-C o una secuencia de aminoácidos análoga a VEGF-C (como se define en otra parte en mayor detalle) y que posea efectos de reducción de la restenosis in vivo del VEGF-C humano, cuyos efectos se demuestran aquí a modo de ejemplo en un modelo de conejo. El término "polinucleótido VEGF-C" se pretende que incluya cualquier polinucleótido (por ejemplo, DNA o RNA, sencillo o de doble hebra) que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido VEGF-C. Debido a la bien conocida degeneración del código genético, existen múltiples secuencias de polinucleótidos VEGF-C que codifican cualquier polipéptido VEGF-C seleccionado.

Para tratamientos humanos, son muy preferidos los polipéptidos VEGF-C con una secuencia de aminoácidos de un VEGF-C humano, y son muy preferidos los polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos de un cDNA VEGF-C humano. Por "VEGF-C humano" se entiende un polinucleótido que corresponde a una proteína de origen natural (prepro-proteína, proteína parcialmente procesada, o proteína madura totalmente procesada) codificada por cualquier alelo del gen VEGF-C humano, o un polipéptido que comprende un fragmento biológicamente activo de una proteína madura de origen natural. A modo de ejemplo, un VEGF-C humano comprende una porción continua de una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2 suficiente para permitir al polipéptido unir y estimular la fosforilación de VEGFR-2 y/o VEGFR-3 en células que expresan dichos receptores. Se contempla específicamente un polipéptido que comprende los aminoácidos 131-211 de la SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, se contemplan los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que comprenden una porción continua de SEQ ID NO: 2, teniendo la porción continua, como su extremo amino terminal, un aminoácido seleccionado del grupo constituido por las posiciones 30-131 de SEQ ID NO: 2, y teniendo, como su extremo carboxilo terminal, un aminoácido seleccionado del grupo constituido por las posiciones 211-419 de SEQ ID NO: 2. Como se explica en otra parte aquí en mayor detalle, las actividades biológicas de VEGF-C, especialmente aquellas mediadas por VEGFR-2, aumentan con el procesamiento de ambos pro-péptidos amino terminal y carboxilo terminal. Por tanto, se prefiere un extremo amino terminal seleccionado del grupo constituido por las posiciones 102-131 de SEQ ID NO: 2, y es muy preferido un extremo amino terminal seleccionado del grupo constituido por las posiciones 103-113 de SEQ ID NO: 2. Asimismo, se prefiere un extremo carboxilo terminal seleccionado del grupo constituido por las posiciones 211-227 de SEQ ID NO: 2. Como se ha indicado antes, el término "VEGF-C humano" también pretende englobar los polipéptidos codificados por variantes alélicas del VEGF-C humano caracterizados por las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1 & 2.

Además, aunque el VEGF-C terapéutico se va a administrar como VEGF-C recombinante o indirectamente por medio de terapia génica somática, está dentro de la experiencia de la técnica para preparar y usar análogos del VEGF-C humano (y polinucleótidos que codifican tales análogos) donde se han añadido, delecionado o reemplazado uno o más aminoácidos con otros aminoácidos, especialmente con reemplazos conservadores, y donde se ha conservado la actividad biológica anti-restenosis. Los análogos que conservan la actividad biológica anti-restenosis de VEGF-C se contemplan como polipéptidos VEGF-C para uso en la presente invención. En una realización preferida, los análogos que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 de tales modificaciones y que conservan la actividad biológica anti-restenosis de VEGF-C se contemplan como polipéptidos VEGF-C para uso en la presente invención. Los polinucleótidos que codifican tales análogos se generan usando PCR convencional, mutagénesis sitio-dirigida, y técnicas químicas de síntesis.

También se contemplan como polipéptidos VEGF-C los polipéptidos y polinucleótidos VEGF-C de mamíferos no humanos o de aves. Por "VEGF-C de mamífero" se entiende un polipéptido que corresponde a una proteína de origen natural (prepo-proteína, proteína parcialmente procesada, o proteína madura totalmente procesada) codificada por cualquier alelo de un gen VEGF-C de cualquier mamífero, o un polipéptido que comprende un fragmento biológicamente activo de una proteína madura. El término "polipéptido VEGF-C de mamífero" se pretende que incluya los análogos de los VEGF-C de mamíferos que posean efectos reductores de la restenosis in vivo del VEGF-C de mamífero. El hecho de que la terapia génica que usa un transgen que codifica el VEGF-C humano sea eficaz para prevenir la restenosis en un modelo de conejo es la evidencia de la eficacia terapéutica inter-especies de las proteínas VEGF-C.

Independientemente de cual polipéptido VEGF-C se elija, el polinucleótido VEGF-C comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal de secreción fusionado en el marco con la secuencia del polipéptido VEGF-C. El péptido señal de secreción dirige la secreción del polipéptido VEGF-C por las células que expresan el polinucleótido, y se escinde por la célula del polipéptido VEGF-C secretado. Por ejemplo, el polinucleótido VEGF-C podría codificar la secuencia de prepro-VEGF-C completa indicada en SEQ ID NO: 2; o podría codificar el péptido señal VEGF-C fusionado en el marco a una secuencia que codifica un VEGF-C totalmente procesado (por ejemplo, los aminoácidos 103-227 de SEQ ID NO: 2) o el análogo de VEGF-C. Además, no se requiere que el péptido señal se derive de VEGF-C. La secuencia del péptido señal puede ser esa u otra proteína secretada, o puede ser una secuencia señal completamente sintética eficaz para dirigir la secreción en las células de los mamíferos.

En otra realización, el polinucleótido VEGF-C de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que se hidridará a un polinucleótido que es complementario de la secuencia de VEGF cDNA humano especificada en SEQ ID NO: 1 como ejemplo en las siguientes condiciones rigurosas de hidridación: hidridación a 42ºC en formamida al 50%, 5X SSC, NaPO_{4} 20 mM, pH 6,8; y lavado en 1X SSC a 55ºC durante 30 minutos, y donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que une y estimula VEGFR-2 y/o VEGFR-3 humanos. Se entiende que la variación en estas condiciones de ejemplo sucede basándose en la longitud y el contenido del nucleótido GC de las secuencias a hibridar.

Las fórmulas estándar en la técnica son apropiadas para determinar las condiciones apropiadas de hidridación. Véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) \NAK\NAK 9,47-9,51.

En las realizaciones preferidas, el polinucleótido VEGF-C comprende además secuencias adicionales para facilitar la terapia génica con VEGF-C. En una realización, un transgen VEGF-C "desnudo" (es decir, un transgen sin un vector viral, liposomal u otro vector para facilitar la transfección) se emplea para la terapia génica. En esta realización, el polinucleótido VEGF-C comprende preferiblemente un promotor adecuado y/o una secuencia potenciadora (por ejemplo, el promotor/potenciador citomegalovirus [Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29: 2494-2502 (1991); Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)]; promotor del virus del sarcoma de Rous [Davis et al., Hum. Gene. Ther., 4: 151 (1993)]; promotor de Tie [Korhonen et al., Blood, 86(5): 1828-1835 (1995)]; o promotor del virus 40 de simio) para la expresión en células diana de mamíferos, estando unido el promotor de forma operativa hacia el extremo 5' de la secuencia que codifica VEGF-C. El polinucleótido VEGF-C incluye también además preferiblemente una secuencia de poliadenilación adecuada (por ejemplo, la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona del crecimiento del SV40 o humana) unida de forma operativa hacia el extremo 3' de la secuencia que codifica VEGF-C. El polinucleótido puede comprender además opcionalmente secuencias cuya única pretendida función es facilitar la producción a gran escala del vector, por ejemplo, en las bacterias, tales como un origen bacteriano de replicación y una secuencia que codifica un marcador seleccionable. Sin embargo, en una realización preferida, tales secuencias externas son al menos parcialmente escindidas antes de la administración a humanos de acuerdo con los métodos de la invención. Se pueden fabricar y administrar tales polinucleótidos para lograr con éxito la terapia génica usando procedimientos que se han descrito en la bibliografía para otros transgenes. Véase, por ejemplo, Isner et al., Circulation, 91: 2687-2692 (1995); e Isner et al., Human Gene Therapy, 7: 989-1011 (1996); incorporadas aquí como referencia en su
totalidad.

Cualquier vector adecuado se puede usar para introducir el transgén VEGF-C en el hospedante. Se han descrito ejemplos de vectores en la bibliografia que incluyen vectores retrovirales de replicación deficiente, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, los vectores lentivirus [Kim et al., J. Virol., 72(1): 811-816 (1998): Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, October, 1998, pp. 43-46]; vectores virales adeno-asociados [Gnatenko et al., J. Investig. Med, 45:87-98 (1997)]; vectores adenovirales [véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 5.792.453; Quantin et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630 (1992); y Rosenfeld et al., Cell, 68: 143-155 (1992)]; transferencia génica mediada por lipofectina (BRL); vectores liposomales [véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 5.631.237 (liposomas que comprenden proteínas del virus Sendai)]; y sus combinaciones. Todos los documentos anteriores se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Los vectores adenovirales de replicación deficiente constituyen una realización preferida.

En las realizaciones que emplean un vector viral, los polinucleótidos preferidos incluyen además un promotor adecuado y una secuencia de poliadenilación como se ha descrito antes. Además, se ve claramente, en estas realizaciones, que el polinucleótido incluye además secuencias de polinucleótido de vector (por ejemplo, secuencias de polinucleótido adenoviral) conectadas de forma operativa a la secuencia que codifica un polipéptido VEGF-C.

Por tanto, en una realización la composición a administrar comprende un vector, donde el vector comprende el polinucleótido VEGF-C. En una realización preferida, el vector es un vector adenovirus. En una realización muy preferida, el vector adenovirus es de replicación deficiente, es decir, no se puede replicar en el mamífero debido a la deleción de las secuencias de replicación virales esenciales del genoma adenoviral. Por ejemplo, en esta invención se contempla un método en el que el vector comprende un adenovirus de replicación deficiente, comprendiendo el adenovirus el polinucleótido VEGF-C conectado de forma operativa a un promotor y flanqueado en cada extremo por secuencias de polinucleótido adenoviral.

La composición a administrar según la invención comprende preferiblemente (además del polinucleótido o vector) una solución vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, glucosa, u otros vehículos convencionalmente usados para liberar los fármacos intravascularmente. También se contempla la terapia multi-génica, en cuyo caso la composición comprende opcionalmente tanto el polinucleótido/vector VEGF-C y otro polinucleótido/vector seleccionado para prevenir la restenosis. Ejemplos de candidatos de genes/vectores para la co-transfección con transgenes VEGF-C se describen en la bibliografía citada antes, incluyendo genes que codifican factores citotóxicos, factores citostáticos, factores de crecimiento endotelial, e inhibidores del crecimiento/migración de las células del músculo liso. Como se describe en mayor detalle después, un transgen VEGF-D es un candidato preferido para la co-administración con el transgen VEGF-C. También se contempla específicamente la co-administración de un transgen VEGF.

La "administración" que se realiza se puede hacer usando cualquier medio aceptado médicamente para introducir un compuesto terapéutico directamente o indirectamente en la vasculatura de un mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, inyecciones, ingestión oral, administración intranasal o tópica; y similares. En una realización preferida, la administración de la composición que comprende el polinucleótido VEGF-C se realiza intravascularmente, tal como por inyección intravenosa, intraarterial, o intracoronaria.

De forma muy preferible, la composición se puede administrar localmente, por ejemplo, en el sitio de la angioplastia o bypass. Por ejemplo, la administración comprende una transferencia mediada por catéter de la composición que contiene el transgen en un vaso sanguíneo del mamífero, especialmente en una arteria coronaria del mamífero. Ejemplos de materiales y métodos para la liberación local se revisan en Lincoff et al., Circulation, 90: 2070-2084 (1994); y Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med, 3: 163-170 (1993), incorporada aquí como referencia. Por ejemplo, la composición se administra usando catéteres con balón para infusión-perfusión (preferiblemente catéteres con balón microporosos) tales como los que se han descrito en la bibliografía para las infusiones intracoronarias de fármacos. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.713.860 (Intravascular Catheter with Infusion Array); patente de Estados Unidos Nº 5.087.244; patente de Estados Unidos Nº 5.653.689; y Wolinsky et al., J,. Am. Coll. Cardiol., 15: 475-481 (1990) (Wolinsky Infusion Catheter); y Lambert et al., Coron. Artery Dis, 4: 469-475 (1993). El uso de tales catéteres para la terapia génica celular somática dirigida al sitio se describe, por ejemplo, en Mazur et al., Texas Heart Institute Journal, 21; 104-111 (1994), incorporada aquí como referencia. En una realización donde el transgen VEGF-C se va a administrar en un vector adenovirus, el vector se administra preferiblemente en un vehículo farmacéuticamente aceptable en una concentración de 10^{7}-10^{13} partículas virales, y más preferiblemente en una concentración de 10^{9}-10^{11} partículas virales. Preferiblemente se realiza la infusión de la composición del vector adenoviral en un periodo de 15 segundos a 30 minutos, más preferiblemente 1 a 10 minutos.

Por ejemplo, en pacientes con angina de pecho debida a lesiones únicas o múltiples en las arterias coronarias o para los que se prescribe PTCA sobre la base de los hallazgos del angiograma coronario primario, un ejemplo de protocolo implica la realización de PTCA por medio de un catéter guía 7F de acuerdo con la práctica clínica estándar usando la aproximación femoral. Si no se logra un resultado óptimo con PTCA solamente, entonces también se implanta una endoprótesis vascular. (Un resultado no óptimo se define como una estenosis residual > 30% del diámetro luminal de acuerdo con una estimación visual, y disección tipo B o C). La transferencia génica arterial en el sitio de la dilatación con balón se realiza con un vector VEGF-C adenoviral de replicación deficiente inmediatamente después de la angioplastia, pero antes de la implantación de la endoprótesis, usando un catéter con balón de infusión-perfusión. El tamaño del catéter se seleccionará para igualar el diámetro de la arteria como se ha medido en el angiograma, variando, por ejemplo, de 3,0 a 3,5 F en diámetro. El balón se infla a la presión óptima y la transferencia génica se realiza durante 10 minutos a una velocidad de 0,5 ml/min con una concentración de virus de 1,15 X 10^{10}.

Se contempla también la administración intravascular con un catéter revestido con un gel, como se ha descrito en la bibliografía para introducir otros transgenes. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.674.192 (catéter revestido con un polímero en forma de hidrogel hinchable tenazmente adherido); Riessen et al., Human Gene Therapy, 4: 749-758 (1993); y Steg et al., Circulation, 96: 408-411 (1997) y 90: 1648-1656 (1994). Brevemente, el DNA en solución (por ejemplo, el polinucleótido VEGF-C) se aplica una o más veces ex vivo a la superficie de un balón de catéter de angioplastia inflado con un polímero en forma de hidrogel (por ejemplo, Slider with Hydroplus, Mansfield Boston Scientific Corp., Watertown, MA). El revestimiento Hydroplus es un polímero ácido poliacrílico hidrófilo que está reticulado al balón para formar un hidrogel de alto peso molecular adherido al balón. El hidrogel recubierto de DNA se deja secar antes de desinflar el balón. El re-inflado del balón intravascularmente, durante un procedimiento de angioplastia, provoca la transferencia del DNA a la pared del vaso.

En otra realización adicional, se va a emplear una membrana elástica expandible o una estructura similar montada o integrada con el catéter de angioplastia con balón o endoprótesis para liberar el transgen VEGF-C. Véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 5.707.385, 5.697.967, 5.700.286, 5.800.507 y 5.776.184.

En otra variante, la composición que contiene el transgen VEGF-C se administra extravascularmente, por ejemplo, usando un dispositivo para rodear o encapsular una porción del vaso. Véase, por ejemplo, publicación de patente internacional WO 98/20027, que describe un collar que se coloca alrededor del exterior de una arteria (por ejemplo, durante un procedimiento de bypass) para liberar un transgen a la pared arterial por medio de un plásmido o vector liposomal.

Las células endoteliales o las células endoteliales progenitoras se pueden transfectar ex vivo con el transgen VEGF-C, y las células transfectadas se administran al mamífero. Ejemplos de procedimientos para sembrar un injerto vascular con células endoteliales genéticamente modificadas se describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.785.965.

Si el mamífero recibe un injerto vascular, la composición que contiene el transgen VEGF-C se puede aplicar directamente al segmento del vaso aislado antes de que se injerte in vivo.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una composición en la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero para prevenir la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo, comprendiendo dicho tratamiento la etapa de administrar a un mamífero que necesite el tratamiento para prevenir la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo una composición que comprende un polipéptido VEGF-C, en una cantidad eficaz para prevenir la estenosis o restenosis del vaso sanguíneo. En una realización preferida, la administración comprende implantar una endoprótesis intravascular en el mamífero, donde la endoprótesis está revestida o impregnada con la composición. Ejemplos de materiales para construir una endoprótesis revestida de fármaco o impregnada de fármaco se describen en la bibliografía citada antes y se revisan en Lincoff et al., Circulation, 90: 2070-2084 (1994). En otra realización preferida, la composición comprende microparticulas compuestas de polímeros biodegradables tales como PGLA, polímeros no degradables, o polímeros biológicos (por ejemplo, almidón) cuyas partículas están encapsuladas o están impregnadas por el polipéptido VEGF-C. Tales partículas se liberan en la pared intravascular usando, por ejemplo, un catéter de infusión para angioplastia. Otras técnicas para lograr la liberación sostenida del fármaco localmente se revisan en Wilensky et al., Trends Caridovasc. Med., 3: 163-170 (1993), incorporada aquí como referencia.

También se contempla la administración por medio de una o más inyecciones intravenosas subsiguientes a los procedimientos de angioplastia o bypass. La localización de los polipéptidos VEGF-C en el sitio del procedimiento tiene lugar debido a la expresión de los receptores de VEGF-C sobre las células endoteliales que proliferan. La localización se facilita además expresando de forma recombinante VEGF-C como un polipéptido de fusión (por ejemplo, fusionado a un oligopéptido de apolipoproteína B-100 como se describe en Shih et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 87: 1436-1440 (1990). También se contempla la coadministración de los polinucleótidos VEGF-C y los polipéptidos VEGF-C.

En otra realización adicional, la invención proporciona el uso de un polinucleótido VEGF-C o de un polipéptido VEGF-C para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo.

En otra realización más, la invención proporciona el uso de una composición para la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero para prevenir la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo, comprendiendo dicho tratamiento la etapa de administrar a un mamífero que necesite el tratamiento para prevenir la estenosis o la restenosis de un vaso sanguíneo una composición que comprende un polinucleótido, comprendiendo el polinucleótido una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido (VEGF-D) del factor D de crecimiento endotelial vascular. Tales métodos se practican esencialmente como se describe aquí con respecto a los polinucleótidos que codifican VEGF-C, excepto que se emplean polinucleótidos que codifican VEGF-D. Se proporciona una descripción detallada del gen y la proteína VEGF-D humanos en Achen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 95(2): 548-553 (1998); publicación de patente internacional Nº WO 98/07832, publicada el 26 de febrero 1998; y en Genbank Accession Nº AJ000185. Un cDNA y la secuencia de aminoácidos deducida para prepro-VEGF-D se indica aquí en SEQ ID NO: 3 y 4. Por supuesto, debido a la bien conocida degeneración del código genético, existen múltiples secuencias de polinucleótidos que codifican VEGF-D, cualquiera de las cuales se puede emplear de acuerdo con los métodos mostrados aquí.

Como se describe aquí en detalle con respecto a VEGF-C, el uso de polinucleótidos que codifican fragmentos de VEGF-D, análogos de VEGF-D, alelos de VEGF-D y variantes interespecies, y similares que posean efectos anti-restenosis in vivo de VEGF-D humano todos se contemplan como englobados en la presente invención.

En otra realización adicional, la invención proporciona el uso de una composición en la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero para prevenir la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo, comprendiendo dicho tratamiento la etapa de administrar a un mamífero que necesita el tratamiento para prevenir la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo una composición que comprende un polipéptido VEGF-D, en una cantidad eficaz para prevenir la estenosis o restenosis del vaso sanguíneo. Tales métodos se practican esencialmente como se describe aquí con respecto a los polipéptidos VEGF-C.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona materiales y dispositivos para la práctica de los métodos descritos antes.

Asimismo, la invención proporciona también dispositivos quirúrgicos que se usan para tratar transtornos circulatorios, tal como endoprótesis intravasculares (endovascular), catéteres con balón, catéteres de infusión-perfusión, collares extravasculares, membranas elastoméricas, y similares, que han sido mejorados revistiéndolos, impregnándolos, adheriéndolos, o encapsulándolos dentro del dispositivo con una composición que comprende un polinucleótido VEGF-C, un polipéptido VEGF-C, un polinucleótido VEGF-D, y/o un polipéptido VEGF-D.

Por ejemplo, en una realización, la invención proporciona una endoprótesis vascular caracterizada por una mejora en la que la endoprótesis se reviste o se impregna con una composición, que comprende al menos un agente anti-restenosis seleccionado del grupo constituido por polinucleótidos VEGF-C, polipéptidos VEGF-C, polinucleótidos VEGF-D y polipéptidos VEGF-D. Ejemplos de endoprótesis que se pueden mejorar de esta manera se describen y representan en las patentes de Estados Unidos Nº 5.800.507 y 5.697.967 (Medtronic, Inc, que describen una endoprótesis intraluminal que comprende fibrina y un fármaco elutable capaz de proporcionar un tratamiento de la restenosis); patente de Estados Unidos Nº 5.776.184 (Medtronic, Inc, que describe una endoprótesis con un revestimiento poroso que comprende un polímero y una sustancia terapéutica en un sólido o sólido/solución con el polímero); patente de Estados Unidos Nº 5.799.384 (Medtronic, Inc, que describen una endoprótesis flexible, cilíndrica, de metal que tiene una superficie polimérica biocompatible para estar en contacto con el lumen); patentes de Estados Unidos Nº 5.824.048 y 5.679.400 y patente de Estados Unidos Nº 5.779.729. La implantación de tales endoprótesis durante las técnicas convencionales de angioplastia puede dar como resultado una menor restenosis que la implantación de las endoprótesis convencionales. En este sentido, se mejora la biocompatibilidad de la endoprótesis.

En otra realización, la invención proporciona un collar extravascular para liberar un agente terapéutico a un vaso sanguíneo, caracterizado por una mejora en la que el collar se reviste o se impregna o se encapsula con una composición, que comprende al menos un agente anti-restenosis seleccionado del grupo constituido por polinucleótidos VEGF-C, polipéptidos VEGF-C, polinucleótidos VEGF-D y polipéptidos VEGF-D. Un ejemplo de collar que mejora de esta manera se describe y representa en la publicación de patente internacional WO 98/20027 (Eurogene, Ltd, comprendiendo el collar un cuerpo adaptado para proporcionar un sellado alrededor de un vaso y para definir una reserva para contener una formulación farmacéutica anti-restenosis).

En una realización adicional, la invención proporciona una película de polímero para envolver una endoprótesis, caracterizada por una mejora en la que la película está revestida o impregnada con una composición, que comprende al menos un agente anti-restenosis seleccionado del grupo constituido por polinucleótidos VEGF-C, polipéptidos VEGF-C, polinucleótidos VEGF-D y polipéptidos VEGF-D. Un ejemplo de película que se mejora de esta manera se describe y se representa en las patentes de Estados Unidos Nº 5.700.286 y 5.707.385 (Advanced Cardiovascular Systems, Inc., cubiertas de material polimérico bioabsorbible revestido o impregnado con un agente terapéutico que previene la restenosis y que se puede unir a una endoprótesis vascular).

Similarmente, la invención incluye kits que comprenden compuestos o composiciones de la invención empaquetadas de manera que facilita su uso para practicar los métodos de la invención. En una realización simple, tal kit incluye un compuesto o composición descrito aquí como útil para la práctica de la invención (por ejemplo, polinucleótidos o polipéptidos VEGF-C o VEGF-D), empaquetados en un recipiente tal como un frasco o vaso sellado, con una etiqueta fijada al recipiente o incluida en el paquete que describe el uso del compuesto o composición para practicar el método de la invención. Preferiblemente, el compuesto o composición se empaqueta en una forma farmacéutica unitaria. En otra realización, un kit de la invención incluye las dos composiciones de polinucleótidos o polipéptidos VEGF-C o VEGF-D empaquetadas juntas con un dispositivo físico útil para implementar los métodos de la invención, tal como una endoprótesis, un catéter, un collar extravascular, una película polimérica, o similares. En otra realización, un kit de la invención incluye las dos composiciones de polinucleótidos o polipéptidos VEGF-C o VEGF-D empaquetadas juntas con un polímero en forma de hidrogel, o polímeros en forma de micropartículas, u otros vehículos descritos aquí como útiles para liberar VEGF-C/VEGF-D al paciente.

Características adicionales y variaciones de la invención se verán claramente por aquellos expertos en la técnica de la totalidad de esta especificación, y todas esas características se toman como aspectos de la invención.

Asimismo, las características de la invención descritas aquí se pueden recombinar en realizaciones adicionales que también se toman como aspectos de la invención, sin tener en cuenta si la combinación de características se menciona específicamente antes como un aspecto o realización de la invención. También, sólo dichas limitaciones que se describen aquí como críticas para la invención se deben ver como tales; las variaciones de la invención que carecen de limitaciones que no se han descrito como críticas se toman como aspectos de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa una sección de un vaso sanguíneo en el que se ha insertado un catéter con balón para liberar el fármaco que incluye una cubierta protectora, sirviendo la cubierta protectora para cubrir el balón durante la inserción y posicionamiento.

La Figura 2A representa una vista en perspectiva de una membrana expandible que tiene dos capas que están separadas, antes de unir los extremos de cada capa una con otra.

La Figura 2B representa una vista en perspectiva de la membrana de la Figura 2A que ha sido enrollada en un tubo y que tiene unidos los extremos opuestos.

Las Figura 3A y 3B representan, en perspectiva (3A) y sección longitudinal (3B), vistas esquemáticas de un collar extravascular que rodea una porción de un vaso sanguíneo.

La Figura 4A representa una sección de un alambre revestido con un polímero o gel que puede incluir (por ejemplo, por impregnación) una composición terapéutica.

La Figura 4B representa una vista en perspectiva de una intravascular formada con el alambre de la Figura 4A.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que cuando un gen que codifica el factor C de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF-C) se administra a un mamífero que ha sufrido un trauma vascular, tal como el trauma que puede tener lugar durante los procedimientos convencionales de angioplastia con balón, la restenosis del vaso dañado se reduce o elimina. Se describe en detalle en el ejemplo 1 un experimento controlado in vivo que demuestra la eficacia de un transgen VEGF-C para prevenir la restenosis. El ejemplo 2 proporciona un estudio comparativo frente a frente que demuestra que los efectos anti-restenosis de VEGF-C parecen superiores a los efectos anti-restenosis de VEGF administrado de una forma comparable.

El factor de crecimiento llamado factor C de crecimiento endotelial vascular (VEGF-C), así como secuencias de polinucleótidos nativas humanas, de mamífero no humano, y de las aves que codifican VEGF-C, y variantes y análogos de VEGF-C, se han descrito en detalle en la solicitud de patente internacional número PCT/US98/01973, presentada el 02 de febrero 1998 y publicada el 06 de agosto de 1998 como publicación internacional número WO 98/33917; en Joukov et al., J. Biol. Chem., 273(12): 6599-6602 (1998); y en Joukov et al., EMBO J. 16(13): 3898-3911 (1997). Como se explica aquí en detalle, el VEGF-C humano se produce inicialmente en las células humanas como un polipéptido prepo-VEGF-C de 419 aminoácidos. Un cDNA y la secuencia de aminoácidos deducida de la prepro-VEGF-C humana se indican en SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, y un cDNA que codifica VEGF-C humano se ha depositado en el American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209 (USA), que cumple las provisiones del tratado de Budapest (fecha del depósito de 24 de julio de 1995 y número de acceso de ATCC 97231). También se han publicado las secuencias de VEGF-C de otras especies. Véase Genbank Accession Nº MMU73620 (Mus musculus); y CCY15837 (Coturnix coturnix) por ejemplo.

El polipéptido prepro-VEGF-C se procesa en múltiples etapas para producir un polipéptido VEGF-C maduro y más activo de aproximadamente 21-23 kD (como se asegura por SDS-PAGE en condiciones reductoras). Tal proceso incluye la escisión de un péptido señal (SEQ ID NO: 2, residuos 1-31); la escisión de un péptido carboxilo terminal (que corresponde aproximadamente a los aminoácidos 228-419 de SEQ ID NO: 2 y que tiene un modelo de residuos de cisteína espaciados reminiscentes de una secuencia de proteína 3 con anillo Balbiani (BR3P) [Dignam et al., Gene, 88: 133-40 (1990); Paulsson et al., J. Mol. Biol., 211-331-49 (1990)] para producir una forma parcialmente procesada de aproximadamente 29 kD; y escisión (aparentemente de forma extracelular) de un péptido aminoterminal (que corresponde aproximadamente a los aminoácidos 32-103 de SEQ ID NO: 2) para producir una forma madura totalmente procesada de aproximadamente 21-23 kD. Las evidencias experimentales demuestran que las formas parcialmente procesadas de VEGF-C (por ejemplo, la forma de 29 kD) son capaces de unir el receptor Flt4 (VEGFR-3), mientras la unión de alta afinidad a VEGFR-2 tiene lugar solamente con las formas totalmente procesadas de VEGF-C. Parece que los polipéptidos VEGF-C se asocian de forma natural como dímeros no unidos por puentes disulfuro.

Además, se ha demostrado que los aminoácidos 103-227 de SEQ ID NO: 2 no son críticos para mantener las funciones de VEGF-C. Un polipéptido constituido por los aminoácidos 113-213 (y que carece de los residuos 103-112 y 214-227) de SEQ ID NO: 2 retiene la capacidad de unir y estimular los receptores de VEGF-C, y se espera que un polipéptido que se extiende desde el residuo 131 a aproximadamente el residuo 211 mantendrá la actividad biológica de VEGF-C. El residuo de cisteína en la posición 156 ha demostrado ser importante para la capacidad de unión de VEGFR-2. Sin embargo, los polipéptidos VEGF-C \DeltaC_{156} (es decir, los análogos que carecen de esta cisteína debido a deleción o sustitución) se mantienen como potentes activadores de VEGFR-3. Si los efectos anti-restenosis de VEGF-C están mediados por VEGFR-3, entonces el uso de polipéptidos VEGF-C \DeltaC_{156} (y los polinucleótidos que los codifican) se espera que proporcione la eficacia anti-restenosis mientras que se minimizan los efectos secundarios mediados por VEGFR-2. La cisteína en la posición 165 de SEQ ID NO: 2 es esencial para unir cada receptor, mientras que los análogos que carecen de cisteínas en las posiciones 83 o 137 compiten con VEGF-C nativo para unirse con ambos receptores y estimular a ambos receptores.

Una alineación del VEGF-C humano con VEGF-C de otras especies (realizada usando cualquier algoritmo de alineación generalmente aceptado) sugiere residuos adicionales en los que se pueden introducir modificaciones (por ejemplo, inserciones, sustituciones y/o deleciones) sin destruir la actividad biológica de VEGF-C. Cualquier posición en la que los polipéptidos VEGF-C alineados de dos o más especies tengan diferentes aminoácidos, especialmente aminoácidos diferentes con dos cadenas laterales de carácter químico diferente, es una posición probable susceptible de modificación sin la eliminación concomitante de la función. Un ejemplo de alineación de VEGF-C humano, murino, y de codorniz se indica en la Figura 5 de PCT/US98/01973.

Aparte de las consideraciones anteriores, se debe entender que se pueden realizar innumerables sustituciones conservadoras de aminoácidos en una secuencia de VEGF-C natural que probablemente darán como resultado un polipéptido que mantiene las actividades biológicas de VEGF-C, especialmente si el número de tales sustituciones es pequeño. Por "sustitución de aminoácidos conservadora" se entiende sustitución de un aminoácido con un aminoácido que tiene una cadena lateral de un carácter químico similar. Los aminoácidos similares para hacer sustituciones conservadoras incluyen los que tienen una cadena lateral ácida (ácido glutámico, ácido aspártico); una cadena lateral básica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral de amida polar (glutamina, asparagina); una cadena lateral alifática hidrófoba (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromática (fenilalanina, triptófano, tirosina); una cadena lateral pequeña (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral hidroxílica alifática (serina, treonina). También se contempla la adición o deleción de unos pocos aminoácidos internos sin destruir las actividades biológicas de VEGF-C.

Sin tratar de limitarse a una teoría particular, el mecanismo que subyace en la eficacia de VEGF-C para prevenir la restenosis se cree que se relaciona con la capacidad de VEGF-C para estimular la reendotelización del vaso dañado (y/o de la endoprótesis intravascular) sin estimulación concomitante significativa de la proliferación del músculo liso en el vaso. VEGF-C también puede inhibir la proliferación celular del músculo liso. Por consiguiente, los candidatos de polipéptidos análogos de VEGF-C se pueden cribar rápidamente primero en cuanto a su capacidad para unir y estimular la autofosforilación de los receptores de VEGF-C conocidos (VEGFR-2 y VEGFR-3). Los polipéptidos que estimulan uno o ambos receptores conocidos se vuelven a cribar rápidamente in vitro en cuanto a su actividad mitogénica y/o quimiotáctica frente a células cultivadas capilarmente o células endoteliales arteriales (por ejemplo, como se describe en WO 98/33917). Los polipéptidos con actividad mitogénica y/o quimiotáctica son después cribados in vivo como se describe aquí en cuanto a su capacidad para prevenir la restenosis. De este modo, las variantes (análogos) de las proteínas VEGF-C de origen natural se criban rápidamente para determinar si las variante tienen o no la actividad biológica requerida para constituir "polipéptidos VEGF-C" para uso en la presente invención.

El factor de crecimiento llamado factor D de crecimiento endotelial vascular (VEGF-D), así como las secuencias humanas que codifican VEGF-D, y las variantes y análogos de VEGF-D, se han descrito en detalle en la solicitud de patente internacional número PCT/US97/14696, presentada el 21 de agosto de 1997 y publicada el 26 de febrero de 1998 como publicación internacional número WO 98/07832; y en Achen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 95(2): 548-553 (1998), ambas incorporadas aquí como referencia en su totalidad. Como se explica aquí en detalle, el VEGF-D humano se produce inicialmente en células humanas como un polipéptido prepro-VEGF-D de 354 aminoácidos. Un cDNA y la secuencia de aminoácidos deducida para prepro-VEGF-D humana se indica aquí en SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente. También se han publicado las secuencias VEGF-D de otras especies. Véase Genbank Accession Nº D89628 (Mus musculus); y AF014827 (Rattus norvegicus), por ejemplo, incorporadas aquí como referencia.

El polipéptido prepro-VEGF-D tiene un péptido señal putativo de 21 aminoácidos y se procesa proteolíticamente de forma aparente de manera análoga al procesamiento de prepro-VEGF-C. Un VEGF-D "recombinantemente maduro" que carece de los residuos 1-92 y 202-354 de SEQ ID NO: 4 mantiene la capacidad para activar los receptores de VEGFR-2 y VEGFR-3, y parece que se asocia como dímeros unidos no covalentemente. Por tanto, los polinucleótidos VEGF-D preferidos incluyen aquellos polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 93-201 de SEQ ID NO: 4. La guía proporcionada antes para introducir modificaciones que conserven la función en los polipéptidos VEGF-C es también adecuada para introducir modificaciones que conserven la función en los polipéptidos VEGF-D.

Un tratamiento terapéutico o profiláctico de la restenosis implica administrar a un mamífero tal como un ser humano una composición que comprende un polinucleótido o polipéptido VEGF-C o VEGF-D o una de sus combinaciones (algunas veces denominada genéricamente aquí como "agente terapéutico VEGF-C o VEGF-D").

La "administración" se puede realizar usando cualquier medio aceptado médicamente para introducir un compuesto terapéutico directamente o indirectamente en la vasculatura de un mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, inyecciones; ingestión oral; administración intranasal o tópica; y similares. En una realización preferida, la administración de la composición que comprende una composición de polinucleótido o polipéptido VEGF-C o VEGF-D se realiza intravascularmente; tal como por inyección intravenosa, intraarterial, o intracoronaria arterial.

Muy preferiblemente, la composición se puede administrar localmente, por ejemplo, en el sitio de la angioplastia o bypass. Por ejemplo, la administración comprende una transferencia mediada por un catéter de la composición terapéutica en un vaso sanguíneo del mamífero, especialmente en una arteria coronaria del mamífero. Ejemplos de materiales y métodos para liberación local se revisan en Lincoff et al.,Circulation, 90: 2070-2084 (1994); y Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med, 3: 163-170 (1993). Por ejemplo, la composición se administra usando catéteres con balón de infusión-perfusión (preferiblemente catéteres con balón microporosos) tales como los que se han descrito en la bibliografía para infusiones intracoronarias de fármacos. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.713.860 (Intravascular Catheter with Infusion Array); patente de Estados Unidos Nº 5.087.244; patente de Estados Unidos Nº 5.653.689; y Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol, 15: 475-481 (1990) (Wolinsky Infusion Catheter); y Lambert et al., Coron. Artery Dis, 4: 469-475 (1993). El uso de tales catéteres para la terapia génica celular somática dirigida al sitio se describe, por ejemplo, en Mazur et al., Texas Heart Institute Journal, 21; 104-111
(1994).

Por ejemplo, en pacientes con angina de pecho debida a lesiones simples o múltiples en las arterias coronarias y para los que se prescribe PTCA sobre la base de hallazgos en el angiograma coronario primario, un ejemplo de protocolo implica el desarrollo de PTCA por medio de un catéter guía 7F de acuerdo con la práctica clínica estándar usando una aproximación femoral. Si no se logra un resultado óptimo con PTCA solamente, entonces se implanta también una endoprótesis vascular. (Un resultado no óptimo se define como una estenosis residual > 30% del diámetro luminal de acuerdo con una estimación visual, y una disección tipo B o C). La transferencia génica arterial en el sitio de la dilatación con balón se realiza inmediatamente después de la angioplastia, pero antes de la implantación de la endoprótesis, usando un catéter con balón de infusión-perfusión. El tamaño del catéter se seleccionará para ajustarse al diámetro de la arteria medido por el angiograma, variando, por ejemplo, de 3,0 a 3,5F en diámetro. El balón se infla a la presión óptima y la transferencia génica se realiza durante una infusión de 10 minutos a una velocidad de 0,5 ml/min con una concentración de virus de 1,15 X 10^{10}.

También se contempla la administración intravascular con un catéter revestido con gel, como se ha descrito en la bibliografía para introducir otros transgenes. Véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 5.674.192 (catéter revestido con un polímero en forma de hidrogel hinchable adherido tenazmente); Riessen et al., Human Gene Therapy; 4: 749-758 (1993); y Steg et al., Circulation, 96: 408-411 (1997) y 90: 1648-1656 (1994); todas incorporadas aquí como referencia. Como se muestra en la figura 1, se proporciona un catéter (10) al cual se ha unido un balón hinchable (12) en un extremo distal. El balón incluye un revestimiento con polímero en forma de hidrogel hinchable (14) capaz de absorber una solución que comprende un VEGF-C terapéutico o un agente terapéutico VEGF-D. Brevemente, DNA en solución (por ejemplo, polinucleótido VEGF-C o VEGF-D) se aplica una o más veces ex vivo a la superficie de un balón de catéter de angioplastia inflado revestido con un polímero en forma de hidrogel (por ejemplo, Slider with Hydroplus, Mansfield Boston Scientific Corp, Watertown, MA). El revestimiento de Hidroplus es un polímero ácido poliacrílico hidrófilo que está reticulado al balón para formar un hidrogel de alto peso molecular adherido fuertemente al balón. El hidrogel recubierto de DNA se deja secar antes de desinflar el balón. El volver a inflar el balón intravascularmente, durante el procedimiento de angioplastia, causa la transferencia del DNA a la pared del vaso. Por tanto, con referencia otra vez a la figura 1, el catéter que lleva unido un balón revestido se inserta en el lumen (16) del vaso sanguíneo (18) que esta revestido con una cubierta protectora (20) para minimizar la exposición del balón revestido a la sangre antes de la colocación en el sitio de una oclusión (22). Cuando se ha posicionado el instrumento en la región de tratamiento, la cubierta protectora se retira o se mueve el catéter para exponer el balón, que se infla para comprimir el balón (y por tanto el revestimiento) en la pared del vaso, causando la transferencia del agente terapéutico VEGF-C o VEGF-D al tejido, de una manera análoga al líquido extraído de una esponja comprimida o pintura húmeda que se transfiere a la superficie por contacto.

En otra realización adicional, se emplea una membrana elástica expandible, película, o estructura similar, montada o integrada a un catéter de angioplastia con balón o endoprótesis, para emplearla par liberar el agente terapéutico VEGF-C o VEGF-D. Véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos Nº 5.707.385, 5.697.967, 5.700.286, 5.800.507 y 5.776.184. Como se muestra en las Figuras 2A-2B, se forma una única capa (30) o multicapa (30), lámina (32) de material de membrana elástico (Fig. 2A) en una estructura tubular (34) (Fig. 2B), por ejemplo, juntando y adhiriendo los extremos opuestos de la lámina o láminas, por ejemplo, en un montaje o colindantes. De esta manera el material elastomérico se puede envolver alrededor de un balón de un catéter o endoprótesis. Una composición terapéutica de VEGF-C o VEGF-D se combina con la membrana usando cualquier medio adecuado, incluyendo técnicas de moldura por inyección, revestimiento, difusión, y absorción. En una realización en multicapas representada en las Figuras, los extremos de dos capas se pueden unir para formar un sellado fuerte fluido. En una realización preferida, una capa de material se procesa primero por extensión del material y se introduce una pluralidad de agujeros o hendiduras microscópicas (36). Una vez que se han unido las capas, la lámina se puede extender e inyectar con la composición terapéutica de VEGF-C o VEGF-D por uno de los agujeros o hendiduras para llenar la cavidad que existe entre las capas. Después se relaja la lámina, provocando que se cierren los agujeros y sellando la composición terapéutica entre las capas hasta dicho momento en que la lámina se extiende otra vez. Esto tiene lugar, por ejemplo, en el momento en que la endoprótesis vascular o el balón cubierto por la lámina se expande dentro del lumen de un vaso sanguíneo con estenosis. La endoprótesis o balón expandidos presionan radialmente contra el interior de la superficie (38) de la lámina tubular de cobertura, extendiendo, por tanto, la lámina, abriendo los agujeros, y liberando el agente terapéutico a las paredes del vaso.

En otra variación, la composición que contiene VEGF-C o VEGF-D terapéuticos se va a administrar extravascularmente, por ejemplo, usando un dispositivo para rodear o encapsular una porción del vaso. Véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional WO 98/20027, incorporada aquí como referencia, que describe un collar que se coloca alrededor de la parte exterior de una arteria (por ejemplo, durante un procedimiento de bypass) para administrar un transgen a la pared arterial por medio de un plásmido o un vector liposoma. Como muestran las Figuras 3A y 3B, un collar extravascular (40) que incluye un espacio vacío (42) definido por una pared (44) está formada, por ejemplo, de un material biodegradable o biocompatible. El collar toca la parte exterior de la pared (46) de un vaso sanguíneo (48) de los extremos exteriores del collar (50). La sangre (52) fluye a través del lumen del vaso sanguíneo. Una hendidura longitudinal (54) en el collar flexible permite que el collar se deforme y se coloque alrededor del vaso y después se selle usando una goma de tejido convencional, tal como una goma de trombina.

En otra variación adicional, las células endoteliales o las células progenitoras endoteliales se pueden transfectar ex vivo con el transgen VEGF-C o VEGF-D, y las células transfectadas se administran al mamífero. Ejemplos de procedimientos para sembrar un injerto vascular con células endoteliales genéticamente modificadas se describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.785.965.

Si el mamífero recibe un injerto vascular, la composición terapéutica de VEGF-C o VEGF-D se puede aplicar directamente al segmento del vaso aislado antes de que se injerte in vivo.

En otra realización preferida, se implanta una endoprótesis intravascular al mamífero, donde la endoprótesis está revestida o impregnada con la composición de gen/proteína VEGF-C/D terapéuticos. Ejemplos de materiales para la construcción de una endoprótesis revestida de fármaco o impregnada con fármaco se describen en la bibliografía citada antes y se revisan en Lincoff et al., Circulation, 90: 2070-2084 (1994). Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, un metal o alambre polimérico (70) para formar una endoprótesis se reviste con una composición (72) tal como un polímero o gel biocompatible poroso que se impregna (o puede ser introducido o sino fácilmente revestido inmediatamente antes de su uso) con una composición terapéutica VEGF-C o VEGF-D. El alambre se enrolla, se entreteje, o sino se forma dentro de una endoprótesis (74) adecuada para la implantación en el lumen de un vaso usando materiales y técnicas convencionales, tales como la cateterización de angioplastia intravascular. Ejemplos de endoprótesis que se pueden mejorar de esta manera se describen y representan en las patentes de Estados Unidos Nº 5.800.507 y 5.697.967 (Medtronic, Inc., que describe una endoprótesis intraluminal que comprende fibrina y un fármaco eluctable capaz de proporcionar un tratamiento contra la restenosis); patente de Estados Unidos Nº 5.776.184 (Medtronic, Inc., que describe una endoprótesis con un revestimiento poroso que comprende un polímero y una sustancia terapéutica en un sólido o sólido/solución con el polímero); patente de Estados Unidos Nº 5.799.384 (Medtronic, Inc., que describe una endoprótesis flexible, cilíndrica, de metal que tiene una superficie polimérica biocompatible para estar en contacto con el lumen); patentes de Estados Unidos Nº 5.824.048 y 5.679.400 y patente de Estados Unidos Nº 5.779.729. La implantación de dichas endoprótesis durante las técnicas de angioplastia convencionales puede dar como resultado una menor restenosis que la implantación de endoprótesis convencionales. En este sentido, se mejora la biocompatibilidad de la endoprótesis.

En otra realización preferida, la composición comprende micropartículas compuestas de polímeros biodegradables tales como PLGA, polímeros no degradables, o polímeros biológicos (por ejemplo, almidón) cuyas partículas están encapsuladas o impregnadas con el polipéptido/polinucleótido VEGF-C. Tales partículas se liberan en la pared intravascular usando, por ejemplo, un catéter de infusión de angioplastia. Otra técnicas para lograr la liberación sostenida del fármaco localmente se revisan en Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med, 3: 163-170 (1993).

También se contempla la administración por medio de una o más inyecciones intravenosas subsiguiente a los procedimientos de angioplastia o bypass. La localización de los polipéptidos de VEGF-C o VEGF-D en el sitio del procedimiento tiene lugar debido a la expresión de los receptores de VEGF-C/D sobre la proliferación de las células endoteliales. La localización se facilita además por la expresión recombinante de VEGF-C o VEGF-D como un polipéptido de fusión (por ejemplo, fusionado a un oligopéptido de apolipoproteína B-100 como se describe en Shih et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 87: 1436-1440 (1990).

La eficacia farmacéutica de los polinucleótidos VEGF-C, polipéptidos VEGF-C, polinucleótidos VEGF-D y polipéptidos VEGF-D para prevenir la estenosis o la restenosis de un vaso sanguíneo se demuestra in vivo, por ejemplo, usando procedimientos tales como los descritos en los siguientes ejemplos, algunos de los cuales son proféticos. Los ejemplos ayudan en la descripción adicional de la invención, pero no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Uso de transferencia génica de VEGF-C mediada por adenovirus para prevenir la restenosis

Los siguientes experimentos, realizados in vivo en un modelo de restenosis de conejo, demuestran la eficacia de la transferencia génica de VEGF-C mediada por adenovirus para la prevención de la restenosis post-angioplastia.

A. Materiales y métodos 1. Constructores adenovirales

Un plásmido de adenovirus que contiene cDNA que codifica el marco de lectura abierto de la prepro-VEGF-C humana completa unido de forma operativa a un promotor de citomegalovirus (CMV) y a una secuencia señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana se construyó como sigue. Un fragmento de DNA que comprende una secuencia promotora de CMV se preparó por digestión del vector pcDNA3,1+ (invitrogen) con Sal I y rellenando los salientes 5' con la enzima Klenow. El promotor CMV (nucleótidos 5431-911) se escindió del vector con Hind III y se aisló. Un cDNA de VEGF-C humano de longitud completa que contiene la secuencia 1997 bp especificada en SEQ ID NO: 1 (así como menos de 50 bases de secuencia que no codifica y poliligante adicional) se escindió del vector de expresión de VEGF-C pREP7 [descrito en WO 98/33917] con Hind III y Xho I y se aisló. Una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana (\sim 860 bp) se escindió del vector \alphaMHC con Sal I y BamHI. El promotor CMV, cDNA de VEGF-C, y los fragmentos señal de poliadenilación hGH se ligaron simultáneamente en un vector pCRII digerido con BamHI y EcoRV. El promotor CMV ligado y el cDNA de VEGF-C se muestran en SEQ ID NO: 17. El constructor resultante se abrió con BglII y se digirió parcialmente con BamII. La unidad transcripcional completa se ligó en el vector pAdBglII abierto con BglII. Este constructor [designado pAdBglII VEGF-C] se usó después para crear un adenovirus recombinante que contiene la unidad transcripcional CMV-VEGF-C-hHG, usando técnicas de recombinación homólogas estándar. [Barr et al., Gene Ther., 1: 51-58 (1994)]. Los adenovirus delecionados E1-E3 de replicación deficiente se produjeron en 293 células y se concentraron por ultracentrifugación usando técnicas conocidas en la bibliografía. [Véase, por ejemplo, Barr et al., (1994)]. Se usó también un plásmido de control que comprende el gen lacZ unido de forma operativa al mismo promotor. [Laitinen M. et al., Hum. Gene. Ther., 9: 1481-1486 (1998)]. El adenovirus lacZ tiene una señal objetivo nuclear, para dirigir la expresión de la \beta-galactosidasa al núcleo. Los adenovirus delecionados E1-E3 de replicación deficiente se produjeron en 293 células y se concentraron por ultracentrifugación (Barr et al., 1994). Las preparaciones adenovirales se analizaron en cuanto a la ausencia de virus auxiliares y contaminantes bacteriológicos.

2. Modelo animal

Se emplearon conejos blancos de Nueva Zelanda para el estudio de transferencia génica. Un primer grupo de conejos se alimentó con una dieta de 0,25% de colesterol durante dos semanas, después se sometió a denudación con balón de la aorta, luego se sometió tres días después a la transferencia génica mediada por adenovirus. Un segundo grupo de conejos se sometió solamente a la transferencia génica. Se sacrificaron los animales 2 ó 4 semanas después de la transferencia génica. El número de animales experimentales (VEGF-C) y testigo (lacZ) en ambos grupos de estudio fue de 6.

En el primer grupo de conejos, la aorta completa, empezando por la punta del arco, se denudó usando un catéter de embolectomía arterial 4,0F (Sorin Biomedical, Irvine, CA). Se introdujo el catéter por la arteria ilíaca derecha hasta el arco aórtico y se infló, y la aorta se denudó dos veces.

3. Transferencia génica

Se realizó la transferencia génica usando un catéter de liberación local del fármaco con balón de canal 3,0F (Boston Scientific Corp., Maple Grove, MA). Usando un testigo fluoroscópico, el catéter con balón se colocó en posición caudal respecto a la arteria renal izquierda, en un segmento libre de ramificaciones laterales, por medio de una cubierta introductora percutánea 5F(Arrow International, Reading, PA) en la arteria carótida derecha y se infló a 6 ATM con una mezcla de medios de contraste y solución salina. La localización anatómica del catéter con balón se determinó midiendo la distancia desde el orificio aórtico de la arteria renal izquierda. La concentración de virus de 1,15 X 10^{10} unidades formadoras de placa (pfu) se administró a cada animal en un volumen final de 2 ml (NaCl al 0,9%), y la transferencia génica se realizó a una presión de 6 ATM durante 10 minutos (0,2 ml/min). En el segundo grupo de estudio los animales tenían solamente transferencia génica y se sacrificaron 2 semanas después de la transferencia génica. El número de animales en cada grupo de estudio (sólo NaCl al 0,9%; transferencia génica de lacZ; y transferencia génica de VEGF-C) fue de 3. Todos los estudios se aprobaron por el Experimental Animal Committee de la Universidad de Kuopio en Finlandia.

4. Histología

Tres horas antes del sacrificio, se inyectaron intravenosamente a los animales 50 mg de BrdU disuelto en etanol al 40%. Después del sacrificio, el segmento aórtico donde se había realizado la transferencia génica se separó, enrojeciendo suavemente con la solución salina, y se dividió en cinco segmentos iguales. El segmento proximal se congeló bruscamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -70ºC . El siguiente segmento se fijo por inmersión en paraformaldehído al 4%/sacarosa al 15% (pH 7,4) durante 4 horas, se lavó con sacarosa al 15% (pH 7,4) durante la noche, y se embebió en parafina. El segmento medio se fijo por inmersión en paraformaldehído al 4%/solución salina tamponada de fosfato (PBS) (pH 7,4) durante 10 minutos, se lavó 2 horas con PBS, se embebió en el compuesto OCT (Miles), y se almacenó a -70ºC . Los cuatro segmentos fueron fijados por inmersión en etanol al 70% durante la noche y se embebieron en parafina. El segmento distal se tiñó directamente para la actividad de la \beta-galactosidasa en una solución de tinción X-GAL a +37ºC durante 16 horas, se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4%/sacarosa al 15% (pH 7,4) durante 4 horas, se lavó con sacarosa al 15% (pH 7,4) durante la noche y se embebió en parafina. Las secciones de parafina se usaron para la detección inmunocitoquímica de las células del músculo liso (SMC), macrófagos, y endotelio. La eficacia de la transferencia génica se evaluó usando tinción X-GAL de tejidos embebidos en OCT. Las células BrdU-positivas se detectaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó la morfometría usando secciones de parafina teñidas con hematoxilin-eosina usando software de análisis de imágenes. Las medidas se tomaron independientemente por dos observadores desde múltiples secciones, sin el conocimiento del origen de las secciones. La relación íntima/media (I/M) se usó como un parámetro para el espesamiento de la íntima.

B. Resultados

Los análisis histológicos de los ratones denudados con balón revelaron que el grupo testigo transfectado con lacZ tenía una relación I/M de 0,61 dos semanas después de la transferencia génica, lo que representa una diferencia significativa estadísticamente (p<0,05) de los grupos transfectados con VEGF-C (relación I/M de 0,40). La tendencia del grupo VEGF-C que tenía una relación I/M más pequeña persistió a las 4 semanas del momento de la transferencia génica.

En el segundo grupo de conejos que se sometió solamente a transferencia génica a la pared del vaso (sin denudación endotelial) la relación I/M en el grupo lacZ fue de 0,3, comparado con 0,15 del grupo VEGF-C. Esta diferencia, también, representó una inhibición estadísticamente significativa (p< 0,05) en la formación de la neoíntima en el grupo VEGF-C.

El marcaje BrdU permitirá el análisis de la proliferación de las células del músculo liso en los animales transfectados con VEGF-C frente a los testigo (lacZ). La proliferación SMC se espera que se reduzca en la población transfectada con VEGF-C.

Los datos anteriores demuestran que la transferencia génica de VEGF-C reduce significativamente el espesamiento de la íntima a las dos semanas del momento de la denudación aórtica y después del daño en la pared del vaso causado por el catéter de transferencia génica sin denudación con balón. Estos datos indican una utilidad terapéutica de la transferencia génica de VEGF-C para la prevención de la restenosis post-angioplastia.

Ejemplo 2 Ejemplo comparativo que demuestra que los efectos anti-restenosis de VEGF-C parecen superiores de los de VEGF

Los siguientes experimentos demuestran la eficacia de la transferencia génica de VEGF y VEGF-C intravascular mediada por adenovirus para la prevención de la restenosis post-angioplastia, y demuestran que VEGF-C parece proporcionar una eficacia terapéutica superior comparado con VEGF.

A. Materiales y métodos 1. Constructores adenovirales

El adenovirus VEGF (VEGF-A_{164} murino; SEQ ID NO: 18) se construyó usando el mismo promotor que para el constructor de VEGF-C, y siguiendo un procedimiento similar al que se describe en el ejemplo 1. El constructor adenoviral VEGF-A_{164} se produjo en células 293T y se concentró esencialmente como se describe en el ejemplo 1, y se analizó en cuanto a estar libre de auxiliares de virus, lipopolisacáridos, y contaminantes bacterianos.

2. Modelo animal

Se emplearon sesenta y tres conejos blancos de Nueva Zelanda que se dividieron en dos grupos principales, dando al primer grupo una dieta de 0,25% de colesterol durante dos semanas, y denudación con balón de la aorta antes de la transferencia génica y un segundo grupo que tiene sólo la transferencia génica. La transferencia génica se realizó en el primer grupo de conejos tres días después de la denudación y se sacrificaron los animales 2 ó 4 semanas después de la transferencia génica. El número de conejos de cada grupo de estudio (lacZ, VEGF y VEGF-C) en ambos momentos fue de 6. En el segundo grupo de estudio, los conejos tenían sólo la transferencia génica, sin dieta de colesterol o denudación con balón, y se sacrificaron los animales 2 ó 4 semanas después de la transferencia génica. El número de conejos de cada grupo de estudio (solución salina al 0,9%, lacZ, VEGF y VEGF-C) fue de 3.

3. Transferencia génica

Se realizó la transferencia génica de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 1.

4. Histología

La histología se realizó esencialmente como se describe en el ejemplo 1, con las siguientes modificaciones: se detectaron las SMC usando HHF35 (DAKO, dilución 1:50), los macrófagos se detectaron usando RAM-11 (DAKO, dilución 1:50), el endotelio se detectó usando CD31 (DAKO, dilución 1: 50), y las células T se detectaron usando MCA 805 (DAKO, dilución 1:100). Los testigos para la inmunotinción incluían incubaciones con categorías y especies con inmunoglobulinas iguales e incubaciones donde se omitieron los anticuerpos primarios. La morfometría y el análisis de imágenes se realizaron usando software Image-Pro Plus^{TM} y un microscopio Olympus AX70 (Olympus Optical, Japan). Los análisis estadísticos se realizaron usando ANOVA y t-test modificado. P< 0,05 se considero estadísticamente significativo.

B. Resultados

Los análisis histológicos de la aorta de conejos denudados con balón reveló demostró un espesamiento de la íntima y proliferación de las SMC. Dos semanas después de la transferencia génica, el grupo testigo lacZ tenía la relación I/M más alta (0,57 \pm 0,04) mientras que los grupos VEGF-C (0,38 \pm 0,02) y VEGF (0,49 \pm 0,17) mostraron una disminución del espesamiento de la íntima. La diferencia en las relaciones I/M entre los grupos lacZ y VEGF-C fue significativa (P< 0,05), mientras aquella entre los grupos lacZ y VEGF no fue estadísticamente significativa, a las dos semanas de tiempo. La tendencia de ambos grupos VEGF y VEGF-C tenía una relación I/M más pequeña persistió a las 4 semanas de tiempo cuando la relación de I/M era de 0,73 \pm 0,16, 0,44\pm 0,14, y 0,63 \pm 0,21 para los grupos lacZ, VEGF-C y VEGF, respectivamente. La hematoxilin-eosina y la inmunotinción de las arterias transfectadas indican que el espesamiento de la íntima en todas las arterias estaba compuesto predominantemente por SMC.

El uso de vectores adenovirales puede llevar a respuestas inmunológicas e inflamatorias, debido en parte a que la alta concentración de adenovirus induce la expresión de NF_{k}B y activa una respuesta de CTL. Sin embargo, no se detectaron signos de inflamación ni de acumulación celular de espuma si se juzga por la inmunotinción de macrófagos y células T. Adicionalmente, se usaron juntos los virus de grado de terapia génica clínica humana con cortos tiempos de exposición en las arterias transfectadas, lo que también puede ayudar a explicar la ausencia de reacciones inflamatorias severas en este estudio.

El porcentaje de células que proliferan se analizó usando un marcaje BrdU. No se observaron diferencias significativas, aunque el grupo VEGF-C tendía a tener una menor velocidad de proliferación, consecuente con la observación de que las arterias transducidas con VEGF-C tenían relaciones I/M más pequeñas en ambos momentos. Dos semanas después de la denudación con balón, el porcentaje de células proliferantes fue de 1,8 \pm 0,4, 2,2 \pm 0,7 y 1,2 \pm 0,0 para los grupos lacZ, VEGF y VEGF-C, respectivamente, y después de cuatro semanas, el porcentaje de células proliferantes fue de 0,3 \pm 0,1, 1,2 \pm 0,5 y 0,3 \pm 0,1 para los grupos lacZ, VEGF y VEGF-C, respectivamente. Se analizó el recrecimiento endotelial midiendo la longitud del endotelio intacto de las secciones histológicas. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos de estudio.

El potencial del adenovirus para causar daño a la pared del vaso y a la formación de la neoíntima se ensayó realizando la transferencia génica del adenovirus a alta concentración a la aorta abdominal intacta de los conejos sin denudación con balón. Los conejos testigo se trataron de la misma manera con solución salina al 0,9%. La colocación del catéter de la transferencia génica causó algún daño en la lámina elástica interna e inducción moderada de la formación de la neoíntima después del procedimiento. Después de dos semanas de tiempo, la relación I/M para el grupo lacZ fue de 0,24 \pm 0,06, en el grupo testigo 0,28 \pm 0,05, en el grupo VEGF-C 0,18 \pm 0,07, y en el grupo VEGF 0,15 \pm 0,03. En la cuarta semana el grupo lacZ tenía una relación I/M de 0,22 \pm 0,13, el grupo VEGF-C 0,13 \pm 0,03, y el grupo VEGF 0,23 \pm 0,11.

Este estudio muestra un efecto terapéutico beneficioso de la transferencia génica de VEGF-C mediada por el adenovirus intravascular sobre la pared del vaso después de la lesión con balón, y también compara la transferencia génica mediada por el adenovirus de VEGF-C y VEGF para la prevención de la formación de la neoíntima. Aunque diferentes receptores que unen los perfiles de VEGF-C y VEGF podrían llevar a diferentes efectos biológicos en la pared del vaso, ambos tipos de VEGF reducen el espesamiento de la íntima dos semanas después de la transferencia génica. Por tanto, ambos tipos de VEGF son candidatos potenciales para la terapia génica vascular de las enfermedades de arterioesclerosis isquémica. Sin embargo, de acuerdo con este experimento, VEGF-C parece prevenir la restenosis más eficazmente que VEGF en este sistema modelo. La capacidad superior de VEGF-C para prevenir la restenosis, comparado con VEGF, podría ser debida a la expresión o actividad de VEGFR-3, que es un receptor para VEGF-C y VEGF-D, pero no para VEGF. Alternativamente, la aparente superioridad puede ser atribuible a un efecto que favorece la restenosis de VEGF mediada por VEGFR-1 o debido a efectos ligantes diferenciales (VEGF-C frente a VEGF) mediados por el receptor común VEGFR-2, que se expresa, como se ha informado, en las células del músculo liso vascular. [Véase Grosskreutz et al., Microvasc. Res, 58(2): 128-136 (septiembre, 1999).

Ejemplo 3 Expresión de los VEGF transfectados en la pared aórtica

Usando los segmentos aórticos de los mismos animales experimentales descritos en el ejemplo 2, la expresión de mRNA de lacZ, VEGF-C y VEGF (VEGF-A_{164} murino) se analizó en el tejido aórtico después de la transferencia génica. El RNA total se extrajo de los segmentos aórticos transfectados usando el reactivo Trizol (Gibco-BRL) y 2 \mug de RNA se usó para la síntesis de cDNA. Los cebadores para lacZ, VEGF-C y VEGF se diseñaron para distinguir entre genes endógenos y transducidos seleccionando los cebadores 5' del promotor CMV y los cebadores 3' de las regiones de codificación.

Para la amplificación de lacZ, los cebadores fueron: 5' cebador 5'-TTGGAGGCCTAGGCTTTTGC-3' (SEQ ID NO: 5) y 3' cebador 5'-ATACTGTCGTCGTCCCCTCA-3' (SEQ ID NO: 6). El primer ciclo PCR fue una incubación inicial a 96ºC durante 4 minutos seguido por 80ºC durante 3 minutos durante los cuales se añadió la DNA polimerasa. Esto fue seguido por 30 ciclos, cada uno consistente en 94ºC durante 45 segundos, 58ºC durante 45 segundos, y 72ºC durante 50 segundos, seguido por una extensión final de 72ºC durante 5 minutos. Se usaron 5 \mul del primer producto PCR para el segundo PCR con 5' cebador 5'-GGTAGAAGACCCCAAGGACTTT-3' (SEQ ID NO: 7) y 3' cebador 5'-CGCCATTCGCCATTCAG-3' (SEQ ID NO: 8). El primer ciclo PCR fue una incubación inicial a 96ºC durante 3 minutos seguido por 80ºC durante 3 minutos, seguido por 32 ciclos, cada uno consistente en 94ºC durante 60 segundos, 58ºC durante 15 segundos, y 72ºC durante 90 segundos, seguido por una extensión final a 72ºC durante 5 minutos.

Para la amplificación de VEGF-C, los cebadores fueron: 5' cebador 5'-CTGCTTACTGGCTTATCG-3' (SEQ ID NO: 9) y 3' cebador 5'-CCTGTTCTCTGTTATGTTGC-3' (SEQ ID NO: 10). El primer ciclo PCR fue una incubación inicial a 96ºC durante 4 minutos seguido por 80ºC durante 3 minutos durante los que se añadió la DNA polimerasa. Esto fue seguido por 39 ciclos, cada uno consistente en 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 40 segundos, y 72ºC durante 90 segundos, seguido por una extensión final de 72ºC durante 5 minutos. Se usaron 5 \mul del primer producto PCR para el segundo PCR con 5' cebador 5'-TCTCCAAAAAGCTACACCG-3' (SEQ ID NO: 11) y 3' cebador 5'-CAAGTGCATGGTGGAAGG-3' (SEQ ID NO: 12). El primer ciclo PCR fue una incubación inicial a 96ºC durante 3 minutos seguido por 80ºC durante 3 minutos, seguido por 39 ciclos cada uno consistente en 94ºC durante 60 segundos, 57ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 90 segundos, seguido por una extensión final de 72ºC durante 5 minutos.

Para la amplificación de VEGF, los cebadores fueron: 5' cebador 5'-TCGATCCATGAACTTTCTGC-3' (SEQ ID NO: 13) y 3' cebador 5'-TTCGTTTAACTCAAGCTGCC-3' (SEQ ID NO: 14) El primer ciclo PCR fue una incubación inicial a 96ºC durante 4 minutos seguido por 80ºC durante 3 minutos seguido por 39 ciclos cada uno consistente en 94ºC durante 30 segundos, 53ºC durante 40 segundos, y 72ºC durante 90 segundos, seguido por una extensión final de 72ºC durante 5 minutos. Se usaron 5 \mul del primer producto PCR para el segundo PCR con 5' cebador 5'-GACCCTGGCTTTACTGCTG-3' (SEQ ID NO: 15) y 3' cebador 5'-GGAACATTTACACGTCTGCG-3' (SEQ ID NO: 16). El primer ciclo PCR fue una incubación inicial a 96ºC durante 3 minutos seguido por 80ºC durante 3 minutos, seguido por 39 ciclos cada uno consistente en 94ºC durante 60 segundos, 54ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 90 segundos, seguido por una extensión final de 72ºC durante 5 minutos.

El mRNA de lacZ, VEGF-C y VEGF se detectó en el tejido de la pared aórtica hasta cuatro semanas después de la transferencia génica.

La eficacia de la transferencia génica se evaluó ensayando la expresión de lacZ, analizada por tinción con X-GAL en cuanto a la actividad de la \beta-galactosidasa, en secciones de tejido embebidas en OCT. La eficacia de la transfección fue de 1,1% \pm 0,5 y 0,3% \pm 0,1, dos y cuatro semanas respectivamente, después de la transferencia génica mediada por un catéter intravascular.

Ejemplo 4 Expresión de los receptores de VEGF en la pared aórtica

Usando los animales experimentales descritos en el ejemplo 2, la expresión de VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3 en el tejido aórtico se analizó por inmunotinción e hidridación in situ. Se realizó la inmunohistoquímica usando el clon sc-316 (Santa Cruz Biotechnology, dilución 1:50) para detectar VEGFR-1, clon sc-6251 (Santa Cruz Biotechnology, dilución 1:500) para detectar VEGFR-2, y clon sc-637 (Santa Cruz Biotechnology, dilución 1:300) para detectar VEGFR-3. Los testigos para la inmunotinción incluían incubaciones con categorías y especies con iguales inmunoglobulinas e incubaciones donde se omitieron los anticuerpos primarios. La hidridación in situ de los mRNA de los receptores de VEGF se llevaron a cabo usando ribosondas con marcaje ^{33}P-UTP. La expresión de todos los receptores se localizó en el endotelio. VEGFR-2 también se expresó en las SMC de la neoíntima.

Ejemplo 5 Uso de terapia con el transgen VEGF-C desnudo para prevenir la restenosis

Los procedimientos descritos en los ejemplos 1 ó 2 se repiten, con las siguientes modificaciones. En vez de usar un vector adenovirus para la liberación del transgen VEGF-C, se construye un vector de expresión de mamífero para la transferencia génica directa (del plásmido de DNA desnudo). La secuencia de codificación de VEGF-C está unida de forma operativa a un promotor adecuado, tal como el promotor CMV, y preferiblemente está unida a una secuencia de poliadenilación adecuada, tal como la secuencia de poliadenilación de la hormona del crecimiento humana. Ejemplo de vectores VEGF-C se pueden modelar a partir de vectores que han sido descritos en la bibliografía para realizar la transferencia génica libre de vectores para otros factores de crecimiento, sustituyendo una secuencia de codificación de VEGF-C por una secuencia de codificación de VEGF. [Véase, por ejemplo, Isner et al., Circulation, 91: 2687-2692 (1995); e Isner et al., Human Gene Therapy, 7: 989-1011 (1996), incorporadas aquí como referencia] vector. Un constructor similar que comprende un gen lacZ se usa como testigo.

Se usa un catéter con balón revestido de hidrogel (Boston Scientific) para liberar el transgen VEGF-C esencialmente como se describe en Asahara et al., Circulation, 94: 3291-3302 (15 de diciembre, 1996), incorporada aquí como referencia. Brevemente, se prepara una angioplastia con balón ex vivo haciendo avanzar el balón desinflado completamente a través de una cubierta protectora de teflón (Boston Scientific). Se infla el balón y se usa una pipeta convencional para aplicar el constructor del transgen (por ejemplo, 50-5000 \mug de DNA del transgen en una solución salina) al polímero en forma de hidrogel que reviste la superficie externa del balón inflado. Una vez que se ha secado la solución del transgel, se desinfla el balón, se retira en la cubierta protectora, y se vuelve a inflar para minimizar el flujo de sangre a través de la superficie del balón hasta que el balón se coloca de forma apropiada en la arteria objetivo.

La relación íntima/media (I/M) se usa otra vez como un parámetro para el espesamiento de la íntima. La relación I/M reducida en animales tratados con el catéter con balón revestido con el transgen VEGF-C se considera indicativa de la eficacia terapéutica. Como se describe en el ejemplo 2, la comparación de la eficacia terapéutica de la transferencia génica de VEGF-C con otra terapias, tales como la transferencia génica de VEGF, se puede realizar en paralelo.

Ejemplo 6 Uso de terapia génica de VEGF-C desnudo para prevenir la restenosis después de la angioplastia con endoprótesis

Los procedimientos descritos en los ejemplos precedentes se repiten, con la modificación de que la angioplastia inicial con balón se acompaña con la implantación de una endoprótesis coronaria usando procedimientos convencionales. El transgen VEGF-C se libera a la vez o inmediatamente antes o después de la implantación de la endoprótesis esencialmente como se describe en los ejemplos precedentes. Pueden ser deseables cantidades que aumentan (por ejemplo, de dos veces a diez veces) del transgen (comparado con la angioplastia sin endoprótesis) y un tiempo de transfección que aumenta, como se describe en Van Belle et al., J. Am. Coll. Cardiol., 29: 1371-1379 (Mayo, 1997), incorporada aquí como referencia. La disminución del espesamiento de la neoíntima y/o el decrecimiento de la oclusión trombótica en los animales tratados con el gen VEGF-C frente a los animales testigo tratados con un gen marcador se considera evidencia de la eficacia de la terapia con el gen VEGF-C.

Ejemplo 7 Uso de un collar extravascular para reducir la estenosis vascular

Un collar de silicona inerte tal como se describe en la publicación de patente internacional Nº WO 98/20027 se implanta quirúrgicamente alrededor de las arterias carótidas de conejos blancos de Nueva Zelanda. El collar actúa como un agente de irritación e inducirá espesamiento de la íntima y contiene un recipiente adecuado para la liberación local de un transgen VEGF-C o formulación farmacéutica de proteína La transferencia génica, usando el constructor de adenovirus VEGF-C o el constructor testigo descrita en el ejemplo 1 se inicia cinco días después inyectando 10^{8}-10^{11} pfu en el collar. Los animales se sacrifican 14 ó 28 días después y los exámenes histológicos se describen en el ejemplo 1. La relación de espesor íntima/media [Yla-Herttuala et al., Arteriosclerosis, 6: 230-236 (1986)] se usa como un índice de la estenosis. La relación I/M reducida en los conejos transfectados con VEGF-C, comparado con los conejos testigo lacZ, indica la eficacia terapéutica de la transferencia génica VEGF-C para prevenir la estenosis arterial.

Ejemplo 8 Uso de polipéptidos VEGF-C para reducir o prevenir la restenosis

Los procedimientos descritos en el ejemplo 1 se repiten excepto que, en vez de tratar los animales de ensayo con un adenovirus que contiene un transgen VEGF-C o testigo lacZ, los animales se tratan con una composición que comprende un polipéptido VEGF-C en un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina isotónica con albúmina sérica), o con solución vehículo solamente como testigo. Los animales de ensayo recibieron cada uno 10, 100, 250, 500, 1000 ó 5000 \mug de polipéptido VEGF-C por medio de una infusión intra-arterial, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 1. Un segundo grupo de animales recibe adicionalmente una inyección del polipéptido VEGF-C 7 días después. Los animales se sacrifican y el examen histológico se realiza como se describe en el ejemplo 1. La relación I/M reducida en los animales tratados con VEGF-C frente a los animales testigo evidencia la eficacia terapéutica del tratamiento con el polipéptido VEGF-C. La repetición del experimento usando distintas formulaciones y materiales de VEGF-C de liberación sostenida como se ha descrito antes se espera que potencie adicionalmente la eficacia terapéutica del polipéptido VEGF-C. Además, un régimen de tratamiento que comprende la administración simultánea de proteína VEGF-C (para proporcionar terapia inmediata al vaso objetivo) con un transgen VEGF-C (para proporcionar terapia sostenida durante varios días o semanas) se contempla específicamente como una variación de la invención.

Ejemplo 9 Actividad anti-estenosis/anti-restenosis de VEGF-D

Los procedimientos descritos en los ejemplos precedentes se repiten usando una composición que comprende un polinucleótido VEGF-D o un polipéptido VEGF-D en lugar de polinucleótido/polpéptido VEGF-C, para demostrar la capacidad de VEGF-D para prevenir la estenosis o restenosis de un vaso sanguíneo.

Aunque la presente invención se ha descrito en términos de realizaciones específicas, se entiende que variaciones y modificaciones se les producirán a los expertos en la técnica, todas las cuales se toman como aspectos de la presente invención. Por consiguiente, sólo tales limitaciones que aparecen en las reivindicaciones deben limitar la invención.

Claims (17)

1. El uso de una composición en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la restenosis de un vaso sanguíneo en un mamífero, preferiblemente un ser humano, donde la composición comprende al menos un agente seleccionado del grupo constituido por: polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del factor C de crecimiento endotelial vascular (VEGF-C); polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del factor D de crecimiento endotelial vascular (VEGF-D); polipéptido VEGF-C; y polipéptido VEGF-D.

2. Un uso según la reivindicación 1, en el que dicho agente comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido VEGF-C de un mamífero, preferiblemente un polipéptido VEGF-C humano, o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido VEGF-D de mamífero, preferiblemente un polipéptido VEGF-D humano.

3. Un uso según la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido VEGF-C humano que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye una porción continua de SEQ ID NO: 2, teniendo dicha porción continua, como su extremo amino terminal, un aminoácido seleccionado del grupo constituido por las posiciones 30-131 de SEQ ID NO: 2, y teniendo, como su extremo carboxilo terminal, un aminoácido seleccionado del grupo constituido por las posiciones 211 a 419 de SEQ ID NO: 2.

4. Un uso según la reivindicación 3, en el que dicho polinucleótido carece de una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 228-419 y/o los aminoácidos 32-102 de SEQ ID NO: 2.

5. Un uso según las reivindicaciones 3 ó 4, en el que dicho polinucleótido comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal de secreción, donde la secuencia que codifica el péptido señal de secreción está conectada en el marco con la secuencia que codifica el polipéptido VEGF-C.

6. Un uso según la reivindicación 5, en el que el polinucleótido comprende además una secuencia promotora conectada de forma operativa a la secuencia que codifica la secuencia señal de secreción y el polipéptido VEGF-C, donde la secuencia promotora favorece la transcripción de la secuencia que codifica la secuencia señal de secreción y el polipéptido VEGF-C en las células de mamíferos.

7. Un uso según la reivindicación 6, en el que el polinucleótido comprende además una secuencia de poliadenilación conectada de forma operativa a la secuencia que codifica el polipéptido VEGF-C.

8. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la composición comprende un vector de terapia génica, incluyendo dicho vector de terapia génica dicho polinucleótido, comprendiendo opcionalmente dicho vector un adenovirus de replicación deficiente, comprendiendo dicho adenovirus el polinucleótido conectado de forma operativa a un promotor y flanqueado por las secuencias de polinucleótidos adenovirales.

9. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el medicamento está formulado para la administración:

(a) en al menos una inyección intravascular; o

(b) en una trasferencia mediada por catéter de dicha composición en un vaso sanguíneo de un mamífero, preferiblemente por la introducción de un catéter en una arteria coronaria del mamífero, y la liberación de la composición en la arteria coronaria.

11. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el medicamento está formulado para la administración concurrente, a dicho ser humano, con una angioplastia coronaria transluminal percutánea.

12. Un uso según las reivindicaciones 10 o la 11, en el que el medicamento está revestido o impregnado en una endoprótesis intravascular (stent).

13. El uso de una composición en la fabricación de un medicamento para prevenir la restenosis de un vaso sanguíneo en un ser humano, en el que la composición comprende un vector de adenovirus de replicación deficiente que incluye un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido seleccionado del grupo constituido por polipéptidos VEGF-C, y polipéptidos VEGF-D, y que comprende además una secuencia promotora para favorecer la expresión de al menos un polipéptido en las células del vaso sanguíneo.

14. Un uso según la reivindicación 15, en el que el polinucleótido codifica un polipéptido VEGF-C.

15. Una endoprótesis vascular diseñada para estar en contacto con la superficie de un vaso sanguíneo en el curso de la cirugía para tratar la estenosis del vaso sanguíneo, comprendiendo la endoprótesis una superficie exterior para estar en contacto con la superficie de un vaso sanguíneo, y una composición sobre dicha superficie que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

16. Un collar extravascular diseñado para estar en contacto con la superficie de un vaso sanguíneo en el curso de cirugía para tratar la estenosis del vaso sanguíneo, comprendiendo el collar una pared exterior conformada para rodear la superficie exterior de un vaso sanguíneo, donde la pared encierra un espacio que contiene una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

17. Un kit para tratar la restenosis, que comprende un recipiente que contiene una composición como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 14, una etiqueta unida o empaquetada con el recipiente, describiendo la etiqueta el uso de la composición para la prevención de la restenosis de un vaso sanguíneo, y:

(a) un dispositivo médico seleccionado del grupo constituido por: endoprótesis intravasculares, catéteres intravasculares, collares extravasculares, y membranas adaptadas para cubrir una superficie de una endoprótesis intravascular o catéter; y/o

(b) una sustancia vehículo para liberar el agente a la pared lumenal de un vaso, preferiblemente donde el vehículo se selecciona del grupo constituido por polímeros en forma de hidrogel y polímeros de en forma de micropartículas.