ES2206342T3

ES2206342T3 - Dispositivo medico que comprende una superficie sintetica que tiene acido nucleico para la induccion in vivo de su endotelializacion.

Info

Publication number: ES2206342T3
Application number: ES00986137T
Authority: ES
Inventors: Mika Lahtinen
Original assignee: Finnish Immunotechnology Ltd
Current assignee: Finnish Immunotechnology Ltd
Priority date: 1999-12-07
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2020-12-07
Also published as: ATE243479T1; AU2242901A; CA2392284A1; EP1235536B1; DE60003580D1; JP2003516180A; US20030059463A1; EP1235536A1; SE0000285D0; DE60003580T2; WO2001041674A1; CA2392284C; CN1407873A; AU782237B2; HK1054858A1; CN1239133C; DK1235536T3

Abstract

Un dispositivo médico con propiedades biológicas mejoradas para estar al menos en contacto parcial con la sangre, los fluidos corporales y/o los tejidos cuando se implanta en el cuerpo de un mamífero, cuyo dispositivo comprende 5 un núcleo sintético poroso y un ácido nucleico presente en un medio biológicamente compatible, que se caracteriza porque dicho ácido nucleico codifica un producto de conversión o de transcripción capaz de inducir in vivo la endotelialización capilar, al menos parcialmente, de al menos una superficie sintética de dicho núcleo.

Description

Dispositivo médico que comprende una superficie sintética que tiene ácido nucleico para la inducción en vivo de su endotelialización.

Campo técnico

La invención se refiere a un dispositivo médico adecuado para su implantación en un ser humano o en un animal, tal como un dispositivo protésico implantable, así como a un método de producción de un dispositivo de acuerdo con la invención.

Antecedentes

Las partes enfermas y dañadas del cuerpo, son mejor reparadas o sustituidas con tejido del propio organismo. Los médicos y cirujanos sustituyen rutinariamente el tejido, los órganos o un hueso mediante procedimientos médicos delicados y complicados. Los tejidos donantes apropiados se obtienen generalmente de cualquier parte: ya sea del propio cuerpo del receptor (auto-injerto); de un segundo donante (alo-injerto); o, en algunos casos, de un donante de otra especie (xeno-injerto). El trasplante de tejido es costoso, y adolece de proporciones de fallo significativas, de un riesgo creciente de transmisión de enfermedades, y del suministro de tejidos de donantes inadecuados. Por lo tanto, como respuesta a estos casos de trasplante actual, el uso de dispositivos de implante médico artificiales o sintéticos, fabricados mediante tecnología de ingeniería tisular, ha sido objeto de atención considerable.

Aunque los dispositivos de implante pueden ser utilizados en algunos casos como alternativa a los trasplantes en base a un donante, los mismos producen con demasiada frecuencia resultados no satisfactorios, debido a la incompatibilidad del implante con el cuerpo, y a su incapacidad para funcionar adecuadamente. La falta de revestimiento celular normal de la superficie sintética del injerto vascular, establece condiciones que incrementan el riesgo de trombosis, hiperplasia y otras complicaciones de procedimiento médico/quirúrgico. Los injertos vasculares requieren superficies no trombogénicas. Los materiales de implante vascular deben tener una superficie biocompatible, permitiendo solamente una mínima respuesta de las plaquetas respecto a la superficie interior del vaso; y, al mismo tiempo, tener la correcta dinámica de fluidos en la interfaz de pared del vaso-sangre, con el fin de eliminar o reducir la formación indeseada de vórtice y turbulencia. En otros tipos de implantes, puede ocurrir una fibrogénesis indeseada, recubriendo el implante. El implante tendrá entonces un riesgo incrementado de disfunción, así como otras complicaciones médicas.

Un área específica en la que se utilizan frecuentemente los implantes o injertos, es el campo cardiovascular. Las enfermedades cardiovasculares afectan a un amplio sector de la población humana, y constituyen una causa de morbidez significativa, costes y mortalidad en la sociedad. Alrededor de 60 millones de personas adultas en los Estados Unidos, tienen alguna enfermedad cardiovascular, lo cual constituye la mayor causa de muerte en los Estados Unidos. Existe un millón de infartos de miocardio agudos o de ataques al corazón por año, con 200.000 muertes por año. El claudicatio intermittens provoca una morbidez significativa, y anualmente se requieren 150.000 amputaciones de miembros inferiores por enfermedad isquémica, con una mortalidad perioperativa significativa. La enfermedad vascular cerebral, los golpes y las hemorragias, causan también morbidez significativa, gastos y mortalidad. Existe un millón de pacientes de diálisis, y anualmente se requieren 200.000 operaciones de fístula arteriovenosa para crear quirúrgicamente el acceso para la diálisis.

Las enfermedades coronarias y vasculares periféricas, están caracterizadas por el bloqueos de los vasos sanguíneos que proporcionan el flujo sanguíneo y la nutrición a los órganos. Otros grupos de enfermedad importantes son las aneurismas, es decir, la dilatación local de los vasos, la seudoanuerisma, y la disección de la pared del vaso. Existen estrategias farmacológicas, quirúrgicas y percutáneas para el tratamiento de esas enfermedades. En el tratamiento farmacológico de la enfermedad isquémica del corazón, el objetivo consiste en hacer que la sangre sea menos coagulable, y en incrementar el flujo sanguíneo por dilatación del vaso, o en reducir el consumo de oxígeno.

El tratamiento quirúrgico para la enfermedad cardiovascular consiste en desviar, sustituir o reconstruir un vaso enfermo con un injerto o paso vascular. Alternativamente, el vaso puede ser tratado percutánea o quirúrgicamente con implantes intraluminales, tales como soportes estructurales dilatadores ajustables, injertos tubulares, o una combinación de los mismos. El objetivo de los métodos percutáneos consiste en mantener patencia después de que un vaso obstruido ha sido re-abierto, utilizando angioplastia de globo, angioplastia de láser, arterioectomía, roto-ablación, cirugía invasiva, o una combinación de estos tratamientos. Los dilatadores estenóticos y los injertos tubulares, pueden ser utilizados también para excluir una dilatación o disección vascular local.

En la cirugía de arteria coronaria, el vaso obstruido es desviado con un injerto vascular autólogo. La operación se denomina CABG, que significa "injerto de desvío de arteria coronaria". Los parches intracardíacos se utilizan para reparar orificios de la septa o pared cardíaca. En la cirugía de arteria periférica, se utiliza normalmente un injerto para desviar una obstrucción, por ejemplo desde la ingle hasta el muslo. En algunos casos, el segmento arterial puede ser sustituido alternativamente por un injerto vascular. Los parches protésicos vasculares se utilizan en cirugía vascular para diversas operaciones, lo que requiere una incisión en la pared del vaso sanguíneo, tal como en tromboectomías, endarteroectomías, reparaciones aneurísmicas y reconstrucciones de vasos. En los catéteres de re-vascularización con globos, se utilizan dilatadores estenóticos o injertos dilatadores para reducir el estrechamiento o para excluir la dilatación o disección de diferentes posiciones anatómicas tal como en las arterias cerebrales, coronarias, renales y en otras arterias y venas, y en la aorta. Las dilataciones con globo, los dilatadores estenóticos y los injertos de dilatación, pueden ser empleados también en otros lugares, tal como en el sistema biliar, el esófago, los intestinos, el árbol traqueobronquial y el tracto urinario. En la cirugía de acceso para diálisis, existe la necesidad de crear un acceso para limpiar la sangre con la máquina de diálisis. Habitualmente, se construye una conexión llamada fístula entre la arteria del extremo superior y la vena, para crear un alto flujo sanguíneo necesario para la diálisis.

Cada año se implantan mas de 350.000 injertos vasculares, y se han desarrollado numerosos biomateriales sintéticos como sustitutos vasculares. Como material extraño, los injertos son trombogénicos y proclives a un coágulo en un grado más alto que el material autólogo. Para superar la trombogenicidad, la mayor parte de los intentos de han concentrado en la creación de una superficie que sea trombo-resistente, habiendo sido dirigidos la mayor parte de estos esfuerzos hacia una superficie polímera mejorada. Los estudios han demostrado que los materiales seleccionados, por ejemplo Dacrón y ePTFE (politetrafluoretileno expandido), pueden ser incorporados con éxito en ambas arterias de calibre grande y pequeño en modelos animales (Zdrahala, J. Biomater Appl. 1996; 10:309-29). En los humanos, las prótesis vasculares de Dacrón y ePTFE han encontrado un cierto éxito clínico en reconstrucciones arteriales de tamaño grande y mediano, pero todavía no son las ideales. Sin embargo, el éxito está limitado a sustitutos para vasos más pequeños de 6 mm de diámetro, debido a la trombosis (es decir, la propensión al desarrollo de coágulos) y a la hiperplasia anastomótica (Nojiri, Artif Organs 1995 Enero; 19(1): 32-8).

En animales, se ha demostrado que la endotelialización completa del injerto vascular ocurre en 2-4 semanas, dependiendo de la especie. Este período sin superficie endotelial puede dar como resultado efectos y problemas indeseados, debido por ejemplo a la trombogenicidad de la superficie. En humanos, la superficie de flujo permanece insalubre salvo para algunos informes casuales (Wu, J Vasc surg 1995 Mayo; 21(5); 862-7, Guidon, Biomaterials 1993 Julio; 14(9): 678:93), lo que sin embargo, en particular en los vasos pequeños, ha conducido a un rendimiento inferior en comparación con los injertos autólogos (Nojiri, Artif Organs 1995 Enero; 19(1): 32-8). Berger, Ann of Surg 1972; 175 (1): 118-27, Sauvage). Los injertos autólogos, por otra parte, comprenden una fase para crecimiento de los mismos, lo que conduce a tiempos de operación más largos y también a posibles complicaciones en el área de crecimiento. La transposición de omento con vasculatura no comprometida alrededor de un injerto de PTFE de arteria carótida porosa, se ha demostrado que incrementa la cobertura celular endotelial en el lumen de injerto en perros (Hazama, J of Surg Res 1999; 81; 174-180), sin embargo, causando problemas con un procedimiento dificultoso y complejo, según se ha discutido en lo que antecede.

Se han sugerido diversas estrategias para mejorar la patencia de los implantes vasculares sintéticos. Las principales estrategias se han destinado a modificar materiales de implante, o para añadir compuestos químicos a los injertos (por ejemplo, el documento US-A-5.744.515). La sustancia mayormente utilizada ha sido la heparina, la cual, o bien se une al injerto, o bien se proporciona con un dispositivo de suministro de medicamento local.

Además, se han cultivado injertos con células endoteliales, y se han impregnado con célula endoteliales o con médula ósea (Noishiki, Artif Organs 1998, Enero; 22(1): 50-62, Williams & Jarrel, Nat Medicine 1996; 2:32-34). En el cultivo celular, las células endoteliales se mezclan con sangre o plasma tras su cultivo, y después son añadidas a la superficie del injerto durante el período de precoagulación. Las células endoteliales utilizadas en estos métodos, puede derivar de una fuente microvascular (grasa), macrovascular (por ejemplo, de venas cultivadas), o mesotelial, con lo que el injerto es implantado posteriormente. Más específicamente, estos métodos comprenden varias etapas, incluyendo el cultivo del tejido con células endoteliales, la separación de células endoteliales, en algunos casos un cultivo de células endoteliales, el cultivo de células endoteliales sobre los materiales del injerto, y finalmente la implantación del injerto. En consecuencia, un inconveniente sustancial asociado a estos métodos consiste en que los mismos consumen tiempo y resultan dificultosos en la práctica, y también requieren un experto específico en la materia, así como también un equipamiento adecuado. Además, dichas células endoteliales cultivadas han sido manipuladas genéticamente, con diversos resultados: la transducción de las células con activador plasminógeno de tejido (tPA) reduce la adhesión celular endotelial a la superficie del injerto, y la transfección con retrovirus reduce la endotelialización. Con el fin de mejorar el cultivo celular, se han utilizado células endoteliales transfectadas con factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o células grasas. Adicionalmente a los inconvenientes discutidos en lo que antecede, este método es incluso más dificultoso y por lo tanto más costoso de utilización en la práctica. Se ha descrito un método para transducir células progenitoras endoteliales y después re-administrarlas. Sin embargo, los problemas siguen siendo como los que se han mencionado en lo que antecede. Con el fin de mejorar la tecnología de crecimiento celular endotelial sobre una superficie, se ha sugerido el tratamiento con ligante de las superficies del injerto. En la impregnación celular, se administran células endoteliales directamente sobre la superficie polimérica del injerto tras su cultivo, con lo que el injerto puede ser implantado, pero esta técnica incluye también varias etapas según se ha mencionado en lo que antecede, lo que hace que sea también dificultoso. También, la ingeniería tisular, que es también un procedimiento complejo y por tanto costoso, ha sido utilizado con el fin de construir tejidos vasculares para su implantación. Se han descrito homo-injertos arteriales, pero dan lugar a problemas con relación a la conservación arterial y la antigenicidad.

Así, de momento, existe una gran necesidad e interés por mejorar la endotelialización y la curación de injerto en la práctica clínica. Sin embargo, hasta ahora, ninguno de tales métodos de trabajo ha sido aún desarrollado en la práctica.

Además, en los Estados Unidos, se han llevado a cabo 500000 procedimientos de provisión de dilatadores cada año, con una media de 1,7 dilatadores por paciente. Los dilatadores estenóticos, es decir, dispositivos relativamente simples con finas estructuras de red, son bien conocidos en la técnica. Los dilatadores estenóticos para la obstrucción de vasos, se combinan normalmente con la apertura de la arteria por dilatación, ablación, arterioectomía, o tratamiento con láser. Normalmente, los dilatadores estenóticos de red de algún tipo de material, normalmente acero inoxidable, se introducen en el área enferma, normalmente de forma percutánea con un catéter. Los dilatadores estenóticos son de diferentes diseños, por ejemplo, auto-desplegables / expansionables con presión, tubulares / cónicos / bifurcados, permanentes / temporales, no degradables / biodegradables, metálicos / de material polimérico, con o sin medicación anti-trombótica. Los mismos se implantan en un vaso sanguíneo en diferentes posiciones anatómicas, tal como cerebrales, coronarias, renales, en otras arterias y venas periféricas, y en la aorta. Los dilatadores estenóticos pueden ser utilizados también en otras posiciones, tales como el sistema biliar, el esófago, los intestinos, el sistema traqueobronquial y el tracto genitourinario. Se pueden utilizar dilatadores estenóticos, por ejemplo, para tratar estenosis, constricciones o aneurismas. Los dilatadores estenóticos tienen, de forma característica, una construcción de malla abierta, o se forman de cualquier otro modo con múltiples aberturas con el fin de facilitar los ensanchamientos y las reducciones radiales, y para permitir el crecimiento interno de tejido en la estructura del dispositivo. Tras la dilatación del vaso, los dilatadores estenóticos han sido asociados a la trombosis sub-aguda y con el espesamiento neoíntimo que conduce a la obstrucción. Con anterioridad a la era del dilatador estenótico, sólo se utilizaban las dilataciones con globo para recuperar el estrechamiento del vaso. Se ha descrito un globo con hidrogel para el suministro de ADN desprotegido (Riessen, Human Gene Therapy 1993, 4:749-758), y también un globo con hidrogel y genes para el suministro de medicamento (documento US-A-5.674.192, Sahatjlan et al.). Se han utilizado catéteres para suministrar péptidos angiogénicos, liposomas y virus con gen de codificación a la pared vascular (WO 95/25807), USA-A-5.833.651 como en lo que antecede). Se han utilizado también catéteres para suministrar proteína VEGF con el fin de proporcionar una endotelialización más rápida de los dilatadores estenóticos (van Belle, Circ. 1997:95 438-448). Además, se ha descrito un dilatador estenótico revestido de hidrogel para el suministro génico (documento US-A-5.843.089) y un dilatador estenótico para el suministro génico (Rajasubramanian, ASAIO J 1994; 40: M584-89, US-A-5.833.651). Se ha utilizado el cultivo celular endotelial como método para suministrar proteína recombinante a la pared vascular, con el fin de superar la trombosis, pero según se ha mencionado en lo que antecede, esta tecnología es compleja y por lo tanto costosa. Además, la técnica anterior relativa a los dilatadores estenóticos está enfocada principalmente a la prevención de restenosis.

Los injertos dilatadores, también conocidos como dilatadores estenóticos recubiertos, son bien conocidos en la técnica. Tales dilatadores estenóticos consisten en una combinación de dos partes, a saber una porción dilatadora y una porción de injerto. En un injerto dilatador, un injerto elástico se acopla a un dilatador radialmente expansionable. Los injertos dilatadores son considerados como utilizables, debido a la formación de una barrera completa entre el dilatador estenótico y el flujo sanguíneo a través del vaso. El injerto puede servir como cobertura interna biológicamente compatible, evitando el flujo sanguíneo turbulento sobre los miembros de alambre u otros materiales estructurales con los que se haya formado el dilatador estenótico, evitando las reacciones trombóticos o inmunológicas al metal o a otros materiales con los que se haya fabricado el dilatador estenótico, y mediante la formación de una barrera para separar un segmento enfermo o dañado del vaso sanguíneo respecto al flujo sanguíneo que pasa por aquel. En los humanos, el problema principal asociado a los injertos dilatadores consiste en la falta de endotelialización completa y a la formación de espesamiento neoíntimo que conduce a la oclusión, según se ha discutido en lo que antecede con relación a los injertos. Los estudios experimentales han demostrado que los daños vasculares, que se producen cuando se proporciona el dilatador estenótico, induce expresión local y liberación de mitógenos y factores quemotácticos, con formación de lesión neoíntima mediata. Los injertos dilatadores pueden ser utilizados también en otras posiciones tales como el sistema biliar, el esófago, los intestinos, el sistema traqueobronquial y el tracto genitourinario.

Cada año, se realizan alrededor de 100000 operaciones de sustitución de válvula cardíaca. Las prótesis de válvula cardíaca son bien conocidas en la técnica. Existen cuatro tipos de injertos: injertos sintéticos, xeno-injertos, alo-injertos, y auto-injertos. Los xeno-injertos están reservados normalmente a la válvulas pericárdicas y porcinas, por ejemplo, Carpentier-Edwards, Ionescu-Shiley, Hancock, Pericarbono, o válvulas sin dilatador estenótico. La degeneración biológica es una circunstancia importante en las válvulas bioprotésicas. La degeneración se caracteriza por la disrupción de la barrera celular endotelial y por la carencia de endotelialización, la permeabilidad incrementada que conduce a una difusión facilitada de circulación de proteínas de plasma anfitrión hacia el tejido valvular, y a la actividad incrementada de procesos de infiltración, por ejemplo calcificación y acumulación de lípidos, y biodegradación de la estructura colágena. También se ha descrito un método para moderar la infiltración de células inflamatorias, y los estudios han demostrado o bien ninguno o bien muy poco crecimiento de endotelio sobre la superficie de la válvula bioprotésica (Ishihara, Am. J. Card. 1981: 48, 443-454) después de un año. Otros diversos problemas están asociados también a las prótesis valvulares, tales como tromboembolismo, calcificación, infecciones, hemólisis, fugas perivalvulares y anticoagulante en relación con la hemorragia. La endotelialización de válvula bioprotésica pudo dar como resultado, en teoría, la formación de trombos, proporcionar protección contra infecciones, reforzar la resistencia mecánica de las regiones basales de las cúspides, y presentar una barrera a la penetración de proteínas de plasma y de otros componentes, reduciendo así los depósitos de calcificadores. En este momento, no existe ninguna válvula tisular en el mercado, que pueda realizar endotelialización rápidamente. Cambiando el método de conservación, se ha sugerido la neutralización del conservante de glutaraldehído y la pre-endotelialización de válvulas bioprotésicas para mejorar el comportamiento de la válvula. Se han hecho algunos estudios sobre crecimiento endotelial en este contexto, pero resulta clínicamente complejo debido a las muchas etapas requeridas, como se ha descrito en lo que antecede.

Existen varias válvulas cardíacas mecánicas, y las mismas utilizan normalmente una bola, un disco, hojas de válvula, u otros dispositivos mecánicos para regular la dirección del flujo sanguíneo a través de la prótesis. Por su naturaleza, las prótesis mecánicas de válvula cardíaca tienen superficies de metal o plástico cuando están expuestas al flujo sanguíneo. Las superficies con trombogénicas en alguna medida, debido a las deficiencias de diseño, la estructura física, a las características operativas y al material de la estructura. Las hojas y los discos, se realizan habitualmente con carbón pirolítico, y el anillo del orificio puede estar cubierto por, o hecho de, carbón pirolítico.

Según se ha mencionado en lo que antecede, se utilizan también dispositivos implantables en campos distintos al cardiovascular. Se han descrito diversos dispositivos implantables, tal como a efectos de suministro de medicamento, terapia génica, y encapsulación celular. Una diversidad de dispositivos, que protegen los tejidos o las células que producen un producto elegido a partir del sistema inmune, han sido explorados para su implantación en el cuerpo, tales como las cámaras de difusión extravascular, las cámaras de difusión intravascular, las cámaras de ultrafiltración intravascular, y las células microencapsuladas. Sin embargo, se implantan biomateriales extraños, se inicia una reacción inflamatoria contra el cuerpo extraño, que finalmente acaba encapsulando al dispositivo, e impide la difusión de sustancias nutritivas a las células del interior de la membrana semi-permeable. La zona no es vascular. La falta de vascularidad es un obstáculo para la difusión de sustancias. Ello reduce a largo plazo la viabilidad del tejido endocrino encapsulado, y hace también que los implantes vasculares sean más susceptibles a las infecciones. La cápsula fibrótica sin vascularidad puede limitar también el rendimiento del medicamento y del dispositivo de terapia génica. En el documento US-A- 5.882.354, una cámara de conservación de células vivas comprende dos zonas que, mediante un mecanismo desconocido, evitan la invasión del tejido conectivo, e incrementan la vascularización cerca del implante.

Algunos otros materiales utilizados en el procedimiento de los dispositivos implantados, encuentran también problemas similares a los que se han discutido en lo que antecede. Como ejemplo, se pueden mencionar los materiales de sutura, cuyos materiales se utilizan para la reparación, fijación y/o aproximación de tejidos corporales durante los procedimientos quirúrgicos. Existen requisitos estrictos para las suturas de sujeción de los dispositivos protésicos o los implantes con relación a la resistencia, la biocompatibilidad y la biodegradabilidad.

Para resumir, el mayor inconveniente en esta materia consiste en que la biocompatibilidad del cuerpo del mamífero, especialmente el cuerpo humano, con dispositivos médicos implantados, no puede ser alcanzada en ningún grado satisfactorio con la utilización de los métodos de la técnica anterior. En los implantes vasculares, cuando se utilizan materiales sintéticos, se ponen de manifiesto algunos problemas debido a las superficies trombóticas abiertas cuando se realiza el implante, lo que a su vez genera coagulación sanguínea y un rendimiento inferior. En implantes tisulares sintéticos, la consecuencia es una zona no vascularizada, no nutritiva, que conduce a la disergia del implante.

Sumario de la invención

El objeto de la presente invención consiste en proporcionar una solución a los problemas mencionados en lo que antecede. Más específicamente, un objeto de la invención consiste en proporcionar un dispositivo médico que resuelva los problemas de las superficies de implantes médicos que dan como resultado la trombosis, la hiperplasia y otros problemas. Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un dispositivo médico que sea mucho menos dificultoso de utilizar en la práctica que los métodos de la técnica anterior para mejorar la biocompatibilidad entre los materiales extraños y el receptor o anfitrión de los mismos. Otro objeto de la invención consiste en proporcionar un dispositivo médico que sea útil en cirugía vascular, que ocasione menos riesgos de resulta oclouido y re-ocluido que los dispositivos conocidos hasta ahora. Un objeto adicional de la invención consiste en proporcionar un dispositivo médico útil como alternativa a los homo-injertos, pero que evite los riesgos de antigenicidad. Todavía otro objeto de la invención consiste en proporcionar un dispositivo que sea útil para la medición y control de funciones metabólicas, que sea mejor aceptado y mantenido en el cuerpo humano que los dispositivos de la técnica anterior.

Los objetos proporcionados en lo que antecede y otros objetos, están de acuerdo con la presente invención y se consiguen proporcionando un dispositivo médico de propiedades biológicas mejoradas para un contacto al menos parcial con la sangre, con los fluidos corporales y/o con los tejidos cuando se introduce en el cuerpo de un mamífero. Dicho dispositivo comprende un núcleo y un ácido nucleico presente en un medio biológicamente compatible, y se caracteriza porque dicho ácido nucleico codifica un producto de conversión o transcripción capacitado para promover la endotelialización in vivo, al menos parcialmente, sobre una superficie sintética de dicho núcleo.

El ácido nucleico está presente en el medio biológicamente compatible en forma desprotegida, en un vector viral, tal como un retrovirus, virus de Sendal, virus adeno asociados, y adenovirus, o en una liposoma.

En otra realización, el ácido nucleico codifica una proteína o polipéptido elegido en el grupo consistente en familias de factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factor de crecimiento de transformación (TGF), y factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de placenta (PIGF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), y una angiopoyetina. Con preferencia, el ácido nucleico codifica factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), o factor-5 de crecimiento de fibroblasto (FGF-5).

En otra realización, el medio biológicamente compatible consiste en un polímero bioestable, un polímero bioabsorbible, una biomolécula, un polímero hidrogel o una fibrina.

En una realización ventajosa, el ácido nucleico está presente en un depósito separado de dicho núcleo, permitiendo una entrega sucesiva al cuerpo de un mamífero.

En una realización alternativa, el ácido nucleico ha sido fijado al núcleo por medio de enlace iónico o covalente.

La superficie sintética es, o bien no porosa o bien porosa, en cuyo caso permite el crecimiento celular capilar y endotelial a través de los poros. Con preferencia, la porosidad va desde alrededor de 0 \mum hasta alrededor de 2000 \mum.

El presente dispositivo resulta útil en una amplia variedad de contextos, y puede ser, por ejemplo, un implante cardiovascular, tal como una parte artificial de un vaso sanguíneo, o un implante endovascular. En términos generales, el presente dispositivo puede ser utilizado como implante usado para la sustitución de una parte del cuerpo de un mamífero, en el que dicho implante está adaptado para un contacto al menos parcial con la sangre, los fluidos corporales, y/o los tejidos. Además, el presente dispositivo resulta útil como implante tisular o como biosensor. Con preferencia, el dispositivo se elige en el grupo consistente en injertos vasculares, implantes endovasculares, conectores de injerto y biosensores.

La presente invención se refiere también a un método de fabricación de un dispositivo médico de acuerdo con la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra que la transfección temporal de células HEK293 con plásmidos de expresión que contienen cADNs humanos para VEGF 165, FGF-2 y FGF-5, da como resultado la secreción de las proteínas buscadas.

La Figura 2 muestra que las formas humanas de VEGF 165, FGF-2 y FGF-5, producidas por los plásmidos de expresión, estimulan la angiogénesis en el ensayo de membrana corioalantoica de pollo.

La Figura 3 muestra que el VEGF mARN humano se transcribe tras la aplicación del plásmido de expresión para VEGF 165 humano en la aorta abdominal de la rata.

Definiciones

En lo que sigue, se proporcionan explicaciones en cuanto al significado de algunos de los términos utilizados en la presente descripción. Los términos que no se definen aquí específicamente, deben ser interpretados según la comprensión general de los mismos dentro del campo técnico relevante.

Un "implante médico" se menciona aquí como referido a un implante, un dispositivo, andamiaje o prótesis, y se entiende como un objeto que se fabrica para ser implantado, al menos parcialmente, en un mamífero. Se prevé que esté en contacto con tejidos y fluidos corporales, proporcionando al menos una superficie de contacto hacia los tejidos o fluidos corporales. Un implante cardiovascular se refiere aquí a un implante de un sistema circulatorio, o un implante que está conectado al flujo sanguíneo, si no se especifica otra cosa. Un implante tisular se refiere aquí a un implante que se está implantado en otros tejidos o fluidos corporales, si no se especifica otra cosa. Por ejemplo, un implante médico puede ser un dispositivo protésico implantable, y más en particular un implante cardiovascular o un implante tisular, así como también un implante médico de contacto con la sangre, un implante médico de contacto con el tejido, un implante médico de contacto con el fluido corporal, un dispositivo médico implantable, un dispositivo médico extracorpóreo, un corazón artificial, un dispositivo de ayuda cardíaca, un dispositivo médico endoprotésico, un injerto vascular, un injerto dilatador, una válvula cardíaca, un paso cardiovascular, un implante intravascular temporal, un anillo de anuloplastia, un catéter, un marcapasos, un biosensor, una cámara para mantener células vivas, un implante de órgano, o un órgano bioartificial.

Un "segmento de ácido nucleico transferible unido" al que aquí se alude, representa la amplia variedad de material genético que puede ser transferido a los tejidos que circundan al implante médico. Por ejemplo, un segmento de ácido nucleico puede ser un ADN trenzado simple o doble, o puede ser también ARN, tal como mARN, tARN o rARN, que codifique una proteína o un polipéptido. Opcionalmente el ácido nucleico puede ser una molécula de ácido nucleico anti-sentido, tal como ARN o ADN anti-sentido, que pueda funcionar por disrupción de la expresión de gen. Los segmentos de ácido nucleico adecuados pueden ser de cualquier forma, tal como ADN o ARN desprotegido, incluyendo moléculas de ácido nucleico lineal y plásmidos, o como inserto funcional dentro de los genomas de varios virus recombinantes, tales como virus o retrovirus de ADN. El segmento de ácido nucleico puede estar también incorporado en otros portadores, tales como liposomas u otras estructuras virales. El segmento unido de ácido nucleico transferible se fija al implante médico de tal modo que puede ser entregado a, y tomado por, los tejidos circundantes.

El término "unido" se refiere a adsorción, tal como fisisorción, quimisorción, interacción ligando/receptor, enlace covalente, enlace de hidrógeno, o enlace iónico de la sustancia química o biomolécula, tal como una sustancia polimérica, una fibrina o ácido nucleico, con el implante.

Un "tejido circundante" se refiere aquí a cualesquiera o a todas las células que tengan capacidad de formar, o de contribuir a la formación de, nuevo revestimiento endotelial o capilarización de la superficie de implante. Esto incluye varios tejidos, tales como los grasos, el omento, la pleura, el pericardio, el músculo peritoneo, la pared del vaso, y el tejido fibroso, pero el tipo particular de tejido circundante no es importante en tanto que las células son activadas de modo que dan lugar finalmente a la endotelialización o capilarización del implante. "Tejido circundante" se utiliza también para referirse a aquellas células que se sitúan dentro de (excluyendo las células de las cámaras tisulares), están en contacto con, o migran hacia, el implante. También, las células que con estimulación atraen además células endoteliales, se consideran que son tejido circundante, así como también las células o tejidos que llegan al lugar activo de endotelialización de implante cardiovascular o de vascularización de implante tisular.

Un "endotelio" es una capa simple de células endoteliales aplanadas, que se unen borde-a-borde formando una membrana que cubre la superficie interna de los vasos sanguíneos, del corazón, y del sistema linfático.

"Endotelialización" se refiere aquí al crecimiento de células endoteliales en todos los tejidos de un mamífero o en las superficies de un biomaterial en contacto con el fluido, que se utiliza para formar un implante poroso o no poroso. La endotelialización de superficies puede ocurrir mediante crecimiento longitudinal, crecimiento hacia dentro de los capilares y/o de las células endoteliales capilares a través de los poros de los implantes, o cultivo de células precursoras endoteliales circulantes. En esta descripción, se utilizará intercambiablemente con la frase "endotelialización capilar", para referirse al crecimiento de células endoteliares sobre sustancialmente todas las superficies de un biomaterial en contacto con el tejido, que se utiliza para formar un implante poroso o no poroso, a menos que se especifique lo contrario.

Los términos "capilarización" y "vascularización" se entienden aquí como la formación de capilares y la microcirculación sobre la superficie del implante, y serán utilizados de forma intercambiable con endotelialización, a menos que se especifique otra cosa.

"Angiogénesis" y las reflexiones de la misma, tal como la "angiogénica", se refieren aquí a la formación y el crecimiento de células endoteliales en el tejido de mamífero existente, tal como en el tejido circundante.

Un producto conversional o transcripcional, que tenga "el potencial de promover la endotelialización" del implante médico, se entiende aquí como una biomolécula o sustancia química, con preferencia una hormona, un receptor o una proteína, más preferiblemente un factor de crecimiento, que, como resultado de su actividad, puede inducir endotelialización o capilarización del implante médico.

"Porosidad" y reflexiones de la misma, tales como "poros" o "poroso", se requieren aquí, si no se especifica otra cosa, a un biomaterial que tiene pequeños canales o pasos, que comienzan en una primera superficie, y que se extienden sustancialmente a través de una segunda superficie del biomaterial.

"Superficie" se refiere a la interfaz entre el biomaterial y su entorno. Se pretende incluir el uso de la palabra tanto en su sentido macroscópico (por ejemplo, dos caras mayores de una lámina de biomaterial), como también en su sentido microscópico (por ejemplo, recubrimiento de poros que atraviesan el material).

El término compartimento se refiere a cualquier compartimento adecuado, tal como, por ejemplo, un vial o un envase.

Las referencias que tienen siete dígitos (por ejemplo, 4.654.321), que se utilizan a lo largo de esta descripción, se refieren a números de solicitudes de Patentes estadounidenses, si no se especifica nada en contra.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un dispositivo médico con propiedades biológicas mejoradas para estar al menos en contacto parcial con la sangre, los fluidos corporales y/o los tejidos cuando se introduce en el cuerpo de un mamífero, cuyo dispositivo comprende un núcleo y un ácido nucleico presente en un medio biológicamente compatible, que se caracteriza porque dicho ácido nucleico codifica un producto de conversión o transcripción capaz de promover la endotelialización in vivo, al menos parcialmente, sobre una superficie sintética de dicho núcleo. El ácido nucleico se proporciona de una forma tal que se permite su transferencia a las células del tejido que rodea al implante. En la presente descripción, debe entenderse que el término "introducido en el cuerpo de un mamífero" se utiliza en sentido amplio para abarcar tanto los dispositivos que son incluidos totalmente en el cuerpo y los dispositivos que son introducidos sólo parcialmente, pero en los que al menor una superficie hecha de material sintético está en contacto con la sangre, los fluidos corporales y/o los tejidos de dicho cuerpo.

El endotelio formado de acuerdo con la invención sobre la superficie sintética, ofrece muchas de las ventajas de la superficie natural. El endotelio es una capa simple de células aplanadas, que se unen borde con borde para formar una membrana de células que cubre la superficie interna de los vasos sanguíneos, el corazón y el sistema linfático. En teoría, la endotelialización del injerto puede ocurrir, ya sea mediante crecimiento longitudinal a partir del área de anastomosis (transanastomótica), crecimiento interior de las células capilares y/o endoteliales capilares a través de la superficie sintética, tal como una pared de injerto, y en porosidades (transintersticial), o cultivo de células precursoras endoteliales circulantes. En la migración transintersticial a través de los poros, las células endoteliales se originan a partir de los capilares mediante fijación, esparcimiento, migración hacia el interior y proliferación.

De este modo, incluso aunque se han hecho esfuerzos en la técnica anterior para evitar la trombogenicidad y la oclusión resultante sobre las superficies poliméricas de injertos vasculares, tales esfuerzos no han resultado satisfactorios con los vasos más pequeños, en los que la trombosis y la hiperplasia han ocasionado problemas sustanciales. La presente invención proporciona, por primera vez, un dispositivo que comprende al menos una superficie sintética, que está capacitada para ser aceptada por el cuerpo debido a la formación de una capa endotelial sobre el mismo. La presente invención proporciona una tecnología versátil que es útil con una amplia gama de implantes, y sorprendentemente también eficaz con secciones de vaso sintéticas de pequeño tamaño que se sabe que anteriormente se coagulaban. Las capas endoteliales formadas de acuerdo con la invención, no se ha observado que se formen en los humanos según la técnica anterior, y la formación de las mismas en animales ha sido observada, pero debido a un crecimiento muy lento, no en la cantidad suficiente como para evitar los problemas asociados a las mismas, como se muestra en los ejemplos que siguen.

En una realización del dispositivo conforme a la invención, el ácido nucleico está presente en el medio biológicamente compatible en forma desprotegida. Riesen (JACC 1994:5, 1234-1244) ha suministrado ADN desprotegido a un dilatador de la técnica anterior en forma de globo con hidrogel para el suministro de ADN desprotegido. Sin embargo, en ese caso, el propósito de dicho ADN fue el de evitar la re-estenosis en la red del dilatador, contrariamente a lo proporcionado según la presente invención, en la que se crea una nueva capa endotelial sobre una superficie. En una realización alternativa, el ácido nucleico ha sido introducido en un vector viral seleccionado en el grupo consistente en retrovirus, virus Sendal, virus adeno asociados, y adenovirus. Aún en otra realización, el ácido nucleico está presente en un liposoma.

Se ha postulado el uso de transferencia de gen para el tratamiento o la prevención de enfermedades en varias publicaciones. La terapia genética ocasiona el uso de material genético como agente farmacológico. Mientras que originalmente se ha reconocido como un medio para el tratamiento de enfermedades hereditarias, la terapia de gen ha sido entendida ahora como una potente herramienta para el suministro de mARN terapéutico o proteínas para uso local y/o sistémico. Existen dos alternativas en la terapia genética: ex vivo e in vivo. En la alternativa ex vivo, las células extraídas del anfitrión se modifican genéticamente in vitro con anterioridad a ser devueltas al anfitrión, y en la alternativa in vivo la propia información genética se transfiere directamente al anfitrión sin emplear células como vehículo de transferencia. Los genes pueden ser objetivados dependiendo de dónde se necesiten, ya sea en células germinales o in situ. El principio de la terapia genética consiste en que las funciones celulares se regulan mediante la alteración de la transcripción de genes y la producción de un gen, un producto de transcripción, tal como un polinucleótido o un polipéptido. El polinucleótido o el polipéptido interactúa después con otras células para regular la función de esa célula. Este cambio de transcripción se realiza con transferencia de gen. Losordo et al (Circulation 1994, 89:785-792) han mostrado que los productos genéticos que son secretados pueden tener efectos biológicos profundos incluso cuando el número de células transducidas se mantiene bajo en contraste con los genes que no codifican una señal secretora. Para los genes que expresan un producto genético intracelular, se podría requerir una población celular mucho más grande para que ese producto génico exprese sus efectos biológicos y posteriormente puede requerirse una transfección más eficaz (Isner et al., Circulation, 1995, 91:2687-2692). Para ilustrar el uso de la terapia génica, estos genes son transferidos, por ejemplo, a adipocitos que tienen una utilidad particular con respecto a las enfermedades o condiciones que pueden ser tratadas directamente mediante una transferencia génica in vivo a los adipocitos. La transferencia de ácidos nucleicos al tejido óseo, ha sido mostrado in situ, y el uso de mesotelio infectado, ya sea in situ o ya sea tras su aislamiento como recurso terapéutico, ha sido también descrito.

Una variedad extremadamente amplia de materiales genéticos, pueden ser transferidos a los tejidos circundantes con el uso de las composiciones y métodos de la invención. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser ADN (con trenzado doble o simple), o ARN (por ejemplo, mARN, tARN, rARN) Puede ser también un ácido nucleico codificador, es decir, uno que codifique una proteína o un polipéptido, o puede ser una molécula de ácido nucleico anti-sentido, como ARN o ADN anti-sentido, que puede funcionar de modo que interrumpe la expresión génica. Alternativamente, puede ser un cromosoma artificial. Así, los ácidos nucleicos pueden ser secuencias genómicas, incluyendo los exones o los intrones solos, o los exones y los intrones, o regiones de ADN codificador, o cualquier construcción que se desee transferir al tejido que circunda a la prótesis con el fin de promover la endotelialización. Los ácidos nucleicos adecuados pueden tener virtualmente cualquier forma, tal como ADN o ARN desprotegido, incluyendo las moléculas de ácido nucleico lineales y los plásmidos, o un inserto funcional dentro de los genomas de varios virus recombinantes, incluyendo los virus con genomas de ADN, y los retrovirus. El ácido nucleico puede ser también incorporado en otros portadores, tales como los liposomas y otras estructuras virales.

Se utilizan mecanismos químicos, físicos y virales intermedios para la transferencia génica. Se emplean varios vehículos diferentes en la transferencia génica. Existe un numero de virus, vivos o inactivos, incluyendo los virus recombinantes, que pueden ser utilizados para suministrar ácido nucleico a los tejidos, tales como retrovirus, lentivirus, adenovirus (por ejemplo, documentos 5.882.887, 5.880.102) y los virus hemoaglutinantes de Japón (virus HVJ o de Sendal) (5.883.651). Los retrovirus tienen varios inconvenientes in vivo, que limitan su utilidad. Los mismos proporcionan una transferencia génica estable, pero los retrovirus normales no están capacitados para transducir células no replicantes. Los riesgos potenciales de la incorporación transgénica en el ADN del anfitrión, no están garantizados si la transferencia génica a corto plazo resulta suficiente. Los adenovirus de déficit de replicación son altamente eficaces y se utilizan en una amplia variedad de aplicaciones. El adenovirus entra en la célula fácilmente a través de interacciones receptoras, habiendo sido utilizado como medio para el transporte de macromoléculas hasta la célula. Los ácidos nucleicos no virales pueden ser empaquetados dentro del adenovirus, ya sea como sustituto de, o ya sea como adición a, los componentes adenovirales normales. Los ácidos nucleicos no virales pueden ser también, ya sea enlazados a la superficie del adenovirus, o ya sea, con un proceso, co-incorporados y llevados consigo como carga en el complejo receptor-endosoma. La transferencia génica a base de adenovirus, no da como resultado la integración del transgén en el genoma anfitrión, y por lo tanto no es estable. También transfecta a las células no replicables. La duración limitada de la expresión de proteína angiogénica, es suficiente para la angiogénesis, la transferencia génica temporal para la endotelialización, y la curación de la prótesis vascular en localizaciones coronarias y periféricas. Otros ejemplos de vectores virales utilizados, son los virus adeno asociados (AAV), virus de herpes, virus vaccinia, lentivirus, poliovirus, otros virus de ARN y el virus de la gripe (Mulligan, Science 1993; 260: 926-32); Rowland, Ann Thorac Surgery 1995, 60: 721-728). El ADN puede ser acoplado también a otros tipos de ligandos que promuevan su captación e impidan su degradación (por ejemplo, documentos 5.972.900, 5.166.320, 5.354.844, 5.844.107, 5.972.707). También puede ser acoplado al llamado sistema cre-lox (Sauer & Henderson, Proc Natl Acad Sci; 1988, 85:5166). También se puede proporcionar ADN desprotegido, y la experiencia empírica es consistente con el hecho de que el ADN de doble trenzado es mínimamente inmunogénico y es improbable que produzca una reacción inmunogénica. La codificación de ADN desprotegido para VEGF, ha demostrado incrementar la angiogénesis cuando se proporciona en un modelo de agente isquémico posterior (Pu et al., J Invest Surg, 1994; 7:49-60). También han resultado efectivos otros modelos de crecimiento en el mismo modelo (Ferrara & Alitalo, 1999; 12:1359-64). La codificación de ADN desprotegido para VEGF, ha sido utilizado también clínicamente en la enfermedad vascular periférica isquémica (Isner et al, Lancet, 1996; 348:370- 4, Baumgartner et al, Circulation, 1998; 97:1114-23), y actualmente se están llevando a cabo al menos dos intentos respecto a la enfermedad isquémica del corazón con ADN desprotegido y una codificación de gen portado por adenovirus para VEGF. Los resultados serán publicados durante la primavera del 2000. (HUghes SCRIP 1999 Noviembre 2493:24). La codificación génica portada por adenovirus para FGF-5, ha sido utilizada también para inyecciones intramiocárdicas (documento 5.792.453).

El complejo liposoma-ADN tiene una eficacia más baja que la transfección adenoviral. La eficacia de la transfección se mejora cuando las células son proliferantes. Estos métodos químicos tradicionales de transferencia génica, consisten en la co-precipitación de fosfato de calcio, DEAE-dextrano, polímeros (documento 5.972.707), y transferencia mediata de liposoma (por ejemplo, documentos 5.855.910, 5.830.430, 5.770.220), y los métodos físicos tradicionales son la microinyección, electroporación (documento 5.304.120), lontoforesis, una combinación de lontoforesis y electroporación (documento 5.968.006), y presión (documento 5.922.687) (Rowland). La eficacia de la transfección puede ser mejorada también mediante medidas farmacológicas, es decir, la adición de PEI.

La invención puede ser empleada para promover la expresión de un gen deseado en los tejidos que circundan a un implante, y para impartir un cierto fenotipo, y promover con ello la endotelialización o vascularización de prótesis. Esta expresión podría ser la expresión incrementada de un gen que se expresa normalmente (es decir, la sobre- expresión), o podría ser la expresión de un gen que no se asocia normalmente a los tejidos que circundan la prótesis en su entorno natural. Alternativamente, la invención puede ser utilizada para suprimir la expresión de un gen que se expresa de forma natural en tales tejidos, y de nuevo, para cambiar o alterar el fenotipo. La supresión de gen puede ser una forma de expresión de un gen que codifica una proteína que ejerce una función reguladora descendente. También puede utilizar tecnología anti-sentido.

Así, los ácidos nucleicos utilizados con el dispositivo conforme a la presente invención, codifican la transcripción o conversión de productos capaces de promover o estimular la endotelialización in vivo, es decir, que son factores angiogénicos. Así, en una realización, el ácido nucleico codifica una proteína o un polipéptido seleccionados en el grupo de familias consistentes en factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factor de crecimiento de transformación (TGF), y factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de placenta (PIGF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), y angiopoyetina. En una realización específica, el ácido nucleico codifica el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFGF), el factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), o el factor-5 de crecimiento de fibroblasto (FGF-5).

El documento WO 98/20027 ha descrito el uso terapéutico de un agente que estimula NO o la producción de prostaciclina en el tratamiento de la hiperplasia íntima, la hipertensión y la ateroesclerosis. Más específicamente, tal agente, por ejemplo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), se suministra al exterior de un vaso sanguíneo utilizando un depósito de suministro en forma de collar situado alrededor del vaso. El collar dirige entonces dicho agente hasta el vaso mientras que se evita la difusión del mismo hacia el tejido circundante. Incluso aunque el dispositivo de suministro del documento WO 98/20027 es similar al de la presente invención en lo que se refiere a los componentes utilizados, la naturaleza del mismo es completamente diferente. La presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica un factor angiogénico, tal como un gen VEGF, respecto al tejido que circunda a un dispositivo sintético que se introduce en el cuerpo, por ejemplo para sustituir o soportar un órgano natural. Dicho ácido nucleico entra en las células de dicho tejido y proporciona la expresión de una o más sustancias que estimulan el crecimiento endotelial de la superficie sintética. El propósito del documento WO 98/20027 es completamente contrario, puesto que su objetivo consiste en proporcionar un gen, tal como el VEGF, a un lugar específico del cuerpo, en el que dicho gen será expresado, y proporciona un efecto que, de hecho, es capaz de soportar cualquier crecimiento celular en el lugar de suministro, es decir, evita la hiperplasia. Se consiguen estos efectos totalmente contrarios debido a que el modo de suministro es diferente; la presente invención proporciona un suministro ampliamente esparcido del ácido nucleico al tejido circundante con el fin de obtener una expresión tan alta como sea posible, mientras que la entrega del documento WO 98/20027 está diseñada para proporcionar una administración dirigida hasta un lugar específico. Dicha administración dirigida se obtiene, de acuerdo con el documento WO 98/20027, utilizando un dispositivo sintético en forma de collar, que limita la dispersión de genes en el lugar de entrega, mientras que no se utiliza esa limitación en la presente invención. Así, incluso aunque el documento WO 98/20027 utiliza también un dispositivo sintético, al contrario que en la presente invención, no se crea en el mismo ninguna capa endotelial. De hecho, se podría crear una nueva capa endotelial sobre el collar sintético del documento WO 98/20027, que en si mismo sería una señal de fallo del objetivo previsto, lo que ilustra claramente las diferencias entre el documento WO 98/20027 y la invención.

La administración directa de péptidos o de proteínas angiogénicas para obtener un nuevo desarrollo del vaso, ha sido descrita en informes científicos. Los diversos miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblasto (FGF): a-FGF, b-FGF, FGF- 4, FGF-5, familia-TGF, familia-EGF, familia PDGF, tal como cualquier isómero de la familia-VEGF, familia angiopoyetina (Ang), tal como Ang1 / Ang2 y otros como el PIGF, han estado implicados en la regulación de la angiogénesis (por ejemplo, Ferrara et al., J. Cellular Biochem, 1991, 47:211-218, Folkman et al., J Biol Chem 1992; 267:10931-34, Klasbrun et al., Ann Rev Physiol, 1991; 53:217-39, Harada et al., J Clin Invest 1994; 94:623-30, Yanagisawa et al., Science 1992; 257:1401-03, Baffour et al., J Vasc Surg 1992; 16:181-191, Takeshita et al., J Clin Invest 1994; 93:662-670, Shing et al., Science, 1984; 223:1296-99, Korpelainen & Alitalo, Curr Opin Cell Biol, 1998; 10:159-64, Ferrara & Alitalo, Nat Med, 1999; 12:1359-63, 5.928.939, 5.932.540, 5.607.918). Sin embargo, un requisito previo para obtener un efecto angiogénico con estas proteínas, ha sido una necesidad para el suministro repetido o a largo plazo de la proteína, lo que limita la utilidad de uso de estas proteínas para estimular el crecimiento endotelial en los entornos clínicos. Algunos de los isómeros de VEGF son factores de crecimiento angiogénicos de enlace de heparina, los cuales pueden ser secretados a partir de células intactas debido a una secuencia de señal. También, el FGF-5 se sintetiza y se secreta a partir de células transfectadas respecto al intersticio en el que induce la angiogénesis (documento 5.792.453). El VEGF es específico en cuanto a sus efectos mitogénicos para células endoteliales, puesto que sus receptores de alta afinidad están presentes en el endotelio. Entre los otros factores de crecimiento FGF-1, junto con la mezcla de pegamento de fibrina y de heparina, se ha demostrado un incremento de la endotelialización transmural mediante injertos de ePTFE de 60 micras de distancia internodal (Gray et al., J Surg Res 1994 Noviembre, 57(5):596-612). La proteína VEGF en combinación con heparina y con pegamento biológico, ha sido descrita específicamente para estimular ex vivo proliferación celular endotelial. (Weatherford et al., Surgery, 1996, 120:439). La proteína VEGF promueve también el crecimiento celular endotelial de transinjerto cuando se combina con bFGF, gelatina y heparina (Masuda, ASAIO J 1997, 43; M530-534). Se ha descrito que la proteína FGF tiene efectos similares a la VEGF cuando se utiliza junto con la heparina. (Doi et al., J Biomed Mat Res 1997, 34: 361-370). Clínicamente, ambas inyecciones de proteína FGF y VEGF en el miocardio, han sido utilizadas para inducir angiogénesis en pacientes con enfermedad de la arteria coronaria. Las proteínas bFGF y aFGF han demostrado también que incrementan la endotelialización valvular in vitro y en tejido subcutáneo (Fischlein et al., Int J Artif Organs 1994 Junio; 17(6): 345-352, Fischlein et al, J Heart valve Dis 1996 Enero; 5(1): 58-65). El estudio de VEGF ha sido interrumpido y los resultados finales del estudio de FGF será publicado durante la primavera del 2000 (Hughes, SCRIP 1999 Noviembre; 2493:24). Además, el documento WO 91/02058 ha descrito la administración de una proteína híbrida a este efecto. En resumen, todos estos informes de uso de proteína o de péptidos, ocasiona un procedimiento dificultoso y costoso, puesto que la proteína administrada únicamente será capaz de ejercer su función una vez y desaparecerá después por transporte, degradación, etc. Contrariamente a todo esto, la presente invención permite un suministro más prolongado, que ventajosamente puede estar controlado mediante el manejo del vector, de lo que era posible mediante administración directa de proteína.

En otra realización, el medio biológicamente compatible es un polímero bioestable, un polímero bioabsorbible, una biomolécula, un polímero hidrogel, o fibrina. En una realización específica, el medio es una composición de mucina.

La superficie sintética del dispositivo conforme a la invención, puede ser no porosa o en su caso porosa. Así, los materiales de implante porosos, así como también los no porosos, pueden ser utilizados para fabricar el dispositivo, dependiendo de la realización del implante. Por ejemplo, se ha demostrado que la porosidad del injerto es importante en la endotelialización del injerto vascular en animales (Wesolowski, Thorac Cardiovasc Surgeon 1982; 30:196-208, Hara, Am J Surg; 1967; 113:766-69). Además, en el contexto de las válvulas mecánicas para el corazón, las superficies porosas han demostrado incrementar el crecimiento tisular y la endotelialización de los anillos valvulares (Bjork, Scand J Thorac Cardiovasc Surg 12990; 24 (2):97-100). En el contexto de las suturas, se ha descrito que las suturas porosas promueven el crecimiento tisular hacia las suturas, o promueven la endotelialización de la sutura (documentos 4.905.367, 4.355.426). En los injertos porosos, tales como los injertos vasculares, se permite el crecimiento celular capilar y endotelial a través de los poros, y la porosidad de los mismos puede estar comprendida entre 0 \mum y
2000 \mum.

En una realización, el ácido nucleico ha sido fijado al núcleo por medio de enlace iónico o covalente.

En una realización ventajosa, el ácido nucleico está presente en un depósito separado de dicho núcleo, permitiendo un suministro sucesivo de éste al cuerpo de un mamífero. El tejido que circunda al dispositivo implantado puede ser, por ejemplo, la pleura, el pericardio, el peritoneo, la fascia, el tendón, tejido graso, el omento, tejido fibroso, el tejido muscular, la piel, o cualquier otro tejido en el que se requiera angiogénesis.

El factor angiogénico de expresión de genes se fija entonces al implante o se administra al tejido que circunda al dispositivo. Las células del tejido circundante resultan transfectadas y estimulan angiogénesis y dan como resultado la endotelialización y/o la capilarización del implante, un proceso que da como resultado una superficie endotelializada o vascularizada con las ventajas descritas anteriormente de una superficie de este tipo.

La superficie del presente dispositivo puede ser tratada de una diversidad de formas, en toda o en parte de la misma, por ejemplo mediante recubrimiento, añadiendo pegamento de fibrina o moléculas de adhesión, como se discute con mayor detalle en lo que sigue, en la sección experimental, en la descripción general de los materiales y métodos. La distancia internodal óptima para los injertos de PTFE ha sido de aproximadamente 60 \mum.

El presente dispositivo resulta útil en una diversidad de contextos y dependiendo del uso previsto, puede estar hecho de un biomaterial elegido en el grupo de los polímeros sintéticos no solubles, los metales y las cerámicas, con o sin modificación de las superficies de prótesis.

Así, en una realización, el dispositivo consiste en un implante realizado con un material biocompatible elegido en el grupo consistente en metal, titanio, aleaciones de titanio, aleaciones de estaño-níquel, aleaciones con memoria de forma, óxido de aluminio, platino, aleaciones de platino, acero inoxidable, MP35N, Elgiloy, estelita, carbón pirolítico, carburo de plata, carbón vítreo, polímero, poliamida, policarbonato, poliéter, poliéster, poliolefina, polietileno, poliestireno, poliuretano, cloruro de polivinilo, polivinilpirrolidona, elastómero de silicona, fluorpolímero, poliacrilato, poliisopreno, politetrafluoretileno, caucho, cerámica, hidroxiapatita, proteína humana, tejido humano, proteína animal, tejido animal, hueso, piel, laminina, elastina, fibrina, madera, celulosa, carbón comprimido y vidrio.

Así, el dispositivo puede consistir en un dispositivo médico elegido en el grupo consistente en un implante médico para entrar en contacto con la sangre, un implante médico para entrar en contacto con el tejido, un implante médico para contactar con los fluidos corporales, un dispositivo médico implantable, un dispositivo médico extra-corpóreo, un dispositivo médico endoprotésico, un injerto vascular, un implante endovascular, un cable para marcapasos, una válvula cardíaca, un implante intravascular temporal, un catéter, un cable para marcapasos, un órgano biosensor o artificial. En una realización específica, el dispositivo es un implante cardiovascular, tal como una parte artificial de un vaso sanguíneo, o un implante endovascular. En términos generales, el presente dispositivo puede ser un implante utilizado para sustitución de una parte del cuerpo de un mamífero, donde dicho implante se adapta para al menos un contacto parcial con la sangre, los fluidos corporales y/o los tejidos. Además, el presente dispositivo resulta útil como implante tisular o como biosensor. En realizaciones alternativas, el presente dispositivo puede ser cualquier otro implante bioartificial que proporcione una función metabólica a un anfitrión, tal como una bomba para el suministro de insulina, etc.

De hecho, el presente dispositivo puede ser virtualmente uno cualquiera de una diversidad de dispositivos, que protejan los tejidos o las células que produzcan un producto elegido a partir del sistema inmune, que haya sido explorado para su implantación en el cuerpo, tal como las cámaras de difusión extravascular, las cámaras de difusión intravascular, las cámaras de ultrafiltración intravascular, y las células microencapsuladas. Las células pueden ser derivadas de otras especies (xeno-injertos), pueden ser de las mismas especies pero de diferentes individuos (alo-injertos), y a veces son aisladas previamente a partir del mismo individuo, pero son modificadas (auto-injertos). Los implantes bioartificiales están diseñados para proporcionar una función metabólica necesaria para un anfitrión, ya sea entregando sustancias biológicamente activas tales como la insulina en la diabetes mellitus, o extrayendo las sustancias perjudiciales. Las membranas pueden ser hidrofóbicas, tales como el PTFE y el polipropileno, o hidrofílicas, tales como el PAN/PVC y el cuprofano.

Más específicamente, los implantes abarcados por la invención incluyen, aunque sin limitación alguna, los dispositivos cardiovasculares, tales como las prótesis vasculares artificiales, los parches cardiovasculares, los injertos dilatadores, las válvulas protésicas, los corazones artificiales, los dispositivos de asistencia cardíaca, los dispositivos anastomóticos, los conectores de injerto, los anillos de anuloplastia, los catéteres vasculares residentes, los cables para marcapasos, los filtros anti-embolismo, los dilatadores estenóticos y los injertos dilatadores para otras indicaciones, y los implantes de tejido, tales como las cámaras que mantienen células vivas para su implantación, los biosensores, los materiales de sutura quirúrgica, las mallas quirúrgicas, los tapones y parches, las cánulas traqueales, los órganos bioartificiales, los implantes quirúrgicos, los implantes quirúrgicos de plástico y los implantes ortopédicos. Se prevé que los procedimientos aquí descritos puedan llevar al desarrollo de otros dispositivos u órganos artificiales.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para la producción de un dispositivo médico implantable. El dispositivo puede ser formado, ya sea mediante pre-tratamiento de un biomaterial con genes, y fabricando después el dispositivo a partir del biomaterial tratado, o fabricando en primer lugar el dispositivo y tratando después las superficies al descubierto del dispositivo.

En un tercer aspecto, en términos generales, se describen métodos para la endotelialización o capilarización de implantes médicos por transferencia de un ácido nucleico a los tejidos circundantes. Los métodos comprenden en general contactar con el tejido, rodear el implante vascular o tisular con una composición que comprende un ácido nucleico de una manera efectiva como para transferir dicho ácido nucleico al tejido, y promover la endotelialización de los injertos vasculares, los parches cardiovasculares, los injertos dilatadores, las válvulas cardíacas, los catéteres vasculares residentes, los dispositivos de asistencia cardíaca y los corazones artificiales, o para promover la vascularización de las superficies de implante de tejido. El tejido puede ser arrollado alrededor de la composición de implante vascular - o tisular - ácido nucleico, con anterioridad a su implantación en el cuerpo. Alternativamente, la composición de secuencia de ácido nucleico - prótesis puede ser implantada en los tejidos, o el ácido nucleico puede ser aplicado a la implantación en el lugar antes o después de la implantación de la prótesis, con el fin de efectuar, o promover, la transferencia de ácido nucleico a los tejidos circundantes in vivo. En la transferencia de ácidos nucleicos hacia los tejidos circundantes, el método preferido incluye añadir en primer lugar el material genético al medio compatible con el tejido, para impregnar la prótesis con la composición de ácido nucleico - medio, y utilizar después la prótesis impregnada para contactar con el lugar adecuado del tejido. Alternativamente, el medio compatible con el tejido puede ser administrado, en primer lugar, al implante, añadiéndose después el ácido nucleico, después de lo cual se aplica la composición de ácido nucleico - prótesis al lugar de implantación. Alternativamente, el ácido nucleico se administra a los tejidos que rodean al implante, después de lo cual se realiza la implantación del implante, o el implante se implanta primero, después de lo cual se administra el ácido nucleico sobre el implante. También se puede utilizar un implante impregnado en combinación con la administración de ácido nucleico a los tejidos que rodean al implante, antes o después de la implantación. Cuando el tejido circundante es escaso y tiene una cantidad pequeña de células endoteliales, la prótesis impregnada puede ser arrollada quirúrgicamente en un tejido de mayor contenido celular endotelial con anterioridad a la implantación. Algunos de los implantes cardiovasculares, tales como las prótesis vasculares, los pasos cardiovasculares y los injertos dilatadores, tienen una porosidad que es suficientemente alta como para permitir el crecimiento de células endoteliales a través de los poros, y algunos otros implantes cardiovasculares, tales como las válvulas cardíacas, son no porosos.

Más específicamente, el método de endotelialización de implantes médicos por transferencia de ácido nucleico a los tejidos circundantes puede ser descrito como un método de mejora de la aceptación del cuerpo de un mamífero, por ejemplo un ser humano, de una superficie sintética, cuyo método comprende introducir un dispositivo que comprende una superficie sintética en el cuerpo con al menos un contacto parcial con la sangre, los fluidos corporales y/o los tejidos, y administrar un ácido nucleico presente en un medio biológicamente compatible a los alrededores de aquel. El método se caracteriza porque el ácido nucleico codifica una conversión o transcripción de producto capaz de promover la endotelialización in vivo, al menos parcialmente, sobre dicha superficie sintética, siendo efectuada dicha administración de ácido nucleico antes de, simultáneamente con, o después de, la introducción del dispositivo en el cuerpo. Según se ha discutido en lo que antecede en relación con el dispositivo de acuerdo con la invención, el ácido nucleico puede ser administrado, por ejemplo, en forma desprotegida, en un vector viral tal como un retrovirus, en un virus de Sendal, en un virus adeno asociado o un adenovirus, o en un liposoma.

Dependiendo de la naturaleza del dispositivo, es decir, la condición del paciente que ha de recibir el implante, el ácido nucleico puede codificar una proteína o un polipéptido seleccionado en el grupo consistente en familias de factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factor de crecimiento de transformación (TGF), y factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento derivado de placenta (PDGF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF) y angiopoyetina, y en especial factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) o factor-5 de crecimiento de fibroblasto (FGF-5).

En una realización, el ácido nucleico se administra a los alrededores del dispositivo, es decir, el tejido, con anterioridad a la introducción del mismo en el cuerpo de un mamífero. Alternativamente, el ácido nucleico se administra a tales alrededores después de la introducción del mismo. Según comprenderán los expertos en la materia, son posibles combinaciones de tales administraciones, tales como una primera administración de una cierta cantidad a los alrededores, la introducción del dispositivo, y a continuación una o más administraciones adicionales, ya sea de acuerdo con un esquema predeterminado o ya sea dependiendo de su aceptación por el cuerpo y la velocidad de crecimiento de la nueva capa endotelial sobre la superficie sintética.

En otra realización, el ácido nucleico se administra o se fija al dispositivo antes de la introducción del mismo en el cuerpo de un mamífero. En una realización específica, esto se consigue fijando el ácido nucleico al núcleo mediante enlace iónico o covalente. Este realización puede, en su caso, ser combinada con la última mencionada en lo que antecede, con el fin de proporcionar un método en el que el dispositivo haya sido pre- tratado con ácido nucleico, mientras que el tejido circundante del dispositivo se suplementa posteriormente con otras adiciones de ácido nucleico presente en un portador adecuado. En una realización que resulta ventajosa debido a su simplicidad, dicho portador es agua estéril o una solución acuosa estéril.

En realizaciones alternativas del presente método, el medio biológicamente compatible es un polímero bioestable, un polímero bioabsorbible, una biomolécula, un polímero hidrogel o fibrina.

El presente método puede ser utilizado en el contexto de cualquier mamífero, tal como en el tratamiento de humanos para incrementar la biocompatibilidad de un dispositivo extraño, al menos parcialmente sintético, tal como un implante médico. Además, el presente método puede ser utilizado a efectos de monitorización, cuando se introduce un biosensor u otro equipo similar.

Así, según se ha mencionado en lo que antecede, y los detalles adicionales que se proporcionan en lo que sigue, el dispositivo utilizado en el presente método puede ser un implante utilizado en cirugía cardiovascular, un dispositivo de sustitución de alguna parte del cuerpo, tal como un vaso, un dispositivo para la introducción en el cuerpo humano, tal como un implante endovascular, un implante tisular, o un biosensor.

En resumen, con respecto a la transferencia y expresión de genes terapéuticos de acuerdo con la presente invención, el experto habitual conoce esas diferentes señales genéticas y el procesamiento de niveles de control de eventos de ácidos nucleicos y de proteínas / péptidos en una célula, tales como transcripción, conversión de mARN, y procesamiento post-conversional. Estas etapas están afectadas por otros diversos componentes también presentes en las células, tales como otras proteínas, concentraciones de ribonucleótidos, y similares.

En consecuencia, en términos generales, la presente invención se refiere a dispositivos angiogénicos, cuyos dispositivos pueden ser considerados en general como composiciones de implante génico moldeadas o diseñadas. Los dispositivos de la invención son naturalmente un implante compatible con el tejido, en el que uno o más genes angiogénicos se encuentran asociados al implante. La combinación de gen(es) y de componentes de implante, lo deciden los expertos en la materia con el fin de hacer que el dispositivo sea capaz de simular angiogénesis cuando esté implantado. Los dispositivos de acuerdo con la invención pueden ser virtualmente de cualquier tamaño o configuración, de modo que sus dimensiones estén adaptadas para su acoplamiento en el lugar de implantación del cuerpo.

Descripción detallada de los dibujos

La Figura 1 muestra un análisis de mancha western de VEGF 165, FGF-2 y FGF-5 humanos secretados. Los plásmidos de expresión pNGVL1-\beta-gal (control negativo), pNGVL3-VEGF 165, pNGVL7-FGF-2 y pNGVL3-FGF-5 fueron transfectados temporalmente por separado en células HEK293 utilizando la técnica del fosfato de calcio. Las células fueron enjuagadas con PBS 24 h después de la transfección y se añadió un medio libre de suero a las células. El medio fue recogido después de 24 horas más de incubación y se analizó en cuanto a proteínas VEGF 165, FGF-2 y FGF-5 mediante manchado western con anticuerpos específicos. El VEGF 165 dimerizó bajo condiciones no reductoras según se esperaba.

La Figura 2 muestra los medios acondicionados que contenía VEGF 165, FGF-2 o FGF-5, a partir de células HEK293 transfectados temporalmente, estimulan angiogénesis en el ensayo de membrana corioalantoica de pollo. Los medios acondicionados a partir de células HEK 293 transfectados temporalmente con el plásmido de control pNGVL1- \beta-gal no tenían ningún efecto estimulatorio. El medio acondicionado (10 \mul) fue aplicado a un disco de filtro que fue colocado posteriormente sobre una zona avascular de la membrana corioalantoica. Los filtros fueron cortados y se fotografiaron 3 días después.

La Figura 3 muestra que la aplicación del plásmido de expresión pNGVL3-VEGF165 produce mARN cuando se aplica a la aorta abdominal de la rata in vivo. Se añadieron 600 \mug de pNGVL3 - VEGF 165 alrededor de la aorta abdominal de la rata. La aorta abdominal y el tejido circundante fue cortado 7 días después y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido. Se extrajo el ARN total y fue transcrito inversamente utilizando oligo imprimadores dT. El PCR con un imprimador de sentido basado en una secuencia de vector inmediatamente corriente arriba del inserto VEGF 165 cADN humano y un imprimador de anti-sentido basado en la secuencia VEGF-165 humana, dieron como resultado la amplificación del segmento esperado. No se pudo detectar ningún producto amplificado si se omitía la transcriptasa inversa (RT). El PCR del cADN de los tejidos transfectados con el plásmido de control pNGVLI-\beta-gal no dio como resultado ningún producto amplificado. Los imprimadores para una parte del GAPDH fueron utilizados para mostrar que los cADN preparados eran de buena calidad.

Experimental

La sección que sigue se proporciona con el fin de ilustrar la presente invención y no debe ser interpretada como limitativa de la invención en ningún sentido.

La presente sección experimental describirá en primer lugar materiales y métodos alternativos que pueden ser utilizados en este contexto con el fin de ofrecer tantas posibilidades como sea posible dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. A continuación, bajo los ejemplos del encabezamiento, se proporcionarán las descripciones específicas del experimento llevado a cabo con el fin de describir el efecto de la invención y las ventajas de la misma.

Materiales y métodos 1. Los ácidos nucleicos Genes de promoción de endotelialización de implante

Según se utiliza aquí, el término "gen de promoción de endotelialización de implante" se utiliza a efectos de referirse a un gen o a una región de codificación de ADN que codifica una proteína, un polipéptido o un péptido, que es capaz de promover, o ayudar a la promoción, de la endotelialización o la vascularización del implante, o que incrementa la velocidad de endotelialización o vascularización del implante. Los términos promoción, inducción y estimulación, se utilizan intercambiablemente a través de este texto para referirse a procesos directos o indirectos que finalmente den como resultado la formación de endotelio y/o capilares de implante, o una velocidad incrementada de endotelialización y/o vascularización de implante. De este modo, un gen de promoción de endotelialización de implante consiste en un gen que, cuando se expresa, provoca que el fenotipo de la célula cambie, de modo que la célula o bien se diferencia, estimula a otras células para diferenciarlas, atraiga células de promoción de endotelialización de implante, o bien funcione en su caso de una manera que dé lugar finalmente a nuevo endotelio de implante.

En términos generales un gen de endotelialización de implante vascular puede estar también caracterizado como gen capaz de estimular el crecimiento de endotelio en los tejidos que rodean la prótesis vascular, y promover con ello la endotelialización o la vascularización del implante. Así, en determinadas realizaciones, los métodos y las composiciones de la invención pueden estimular crecimiento de endotelio en la propia prótesis vascular, y también en los tejidos que la rodean.

Se conocen ahora una diversidad de hormonas angiogenéticas, de las que todas son adecuadas para su uso en relación con la presente invención. Las proteínas y genes angiogénicos que codifican pueden incluir, por ejemplo, hormonas, muchas citoquinas y factores de crecimiento diferentes, enzimas y polipéptidos. Ejemplos de factores angiogenéticos adecuados incluyen los de la super-familia del PDGF, tales como VEGF en todas sus variantes, factores de crecimiento de fibroblasto, tales como FGF acídico, FGF básico y FGF-5, familia de gen-TGF, incluyendo los TGFs 1-4, y el TGB-beta, familia angiopoyetina, tal como Ang1 y Ang2, y factores de necrosis de tumor a-TNF, b- TNF, y PIGF y HGF/SF.

Algunos genes y ADN angiogénicos preferidos, son VEGF y los de la familia FGF. Existe una variación considerable en la terminología actual empleada en la literatura con referencia a genes y polipéptidos. Los expertos en la materia deben entender que todos los genes que codifican una proteína angiogénica deben ser considerados para su uso en esta invención, con independencia de la diferente terminología que pueda ser empleada. Por ejemplo, VEGF puede estar referido a un factor de permeabilidad vascular o vasculotropina, y bFGF puede estar referido a FGF-2.

Las secuencias de ADN para diversos genes angiogénicos han sido descritas tanto en artículos científicos como en Patentes U.S. tales como las núms. 5.928.939, 5.932.540, 5.607.918, 5.168.051, 4.886.747 y 4.742.003.

Según se describe en las patentes que anteceden, y conocen los expertos en la materia, la fuente original de un gen de recombinación o un ADN que ha de ser utilizado en el régimen terapéutico, no necesita ser de la misma especie que el animal que ha de ser tratado. En este sentido, se contempla que cualquier gen angiogénico recombinante puede ser utilizado para promover la endotelialización de prótesis vascular en un humano o un animal, tal como por ejemplo un caballo. Los genes particularmente preferidos son aquellos procedentes del ser humano que como tales genes son los más preferidos para su uso en regímenes de tratamiento humano. Las proteínas y los polipéptidos recombinantes, codificados por medio de genes y de ADN aislados, se mencionan con frecuencia con el prefijo "r" para el recombinante, y "rh" para el humano recombinante.

Para preparar un gen angiogénico, un segmento génico o cADN, se pueden seguir las enseñanzas que aquí se describen y también las enseñanzas de cualquier patente o de documentos científicos referidos a la lista de referencia o a la literatura científica. Por ejemplo, se puede obtener VEGF o segmentos FGF-2 y FGF-5 con la utilización de técnicas biológicas moleculares, tales como la reacción de cadena de polimerasa (PCR), o mediante examen de un cADN o librería genómica, utilizando imprimadores o sondas con secuencias basadas en la secuencia nucleótida anterior. La puesta en práctica de una técnica de este tipo, es un tema rutinario para los expertos en la materia, según enseñan diversos artículos científicos, tales como Sambrook et al., incorporados aquí como referencia. Los genes angiogénicos y los segmentos de ADN que se prefieren en particular para su uso en las presentes composiciones y métodos, son VEGF, FGF-2 y FGF-5. También se contempla que se pueden clonar otros genes o cADN que codifiquen un polipéptido o una proteína angiogénicos. Las técnicas para clonar ADN, es decir, obtener una secuencia de codificación específica a partir de librería de ADN que sea distinta de otras porciones de ADN, son bien conocidas en la técnica. Esto puede conseguirse, por ejemplo, analizando una librería de ADN adecuada. El procedimiento de análisis puede estar basado en la hibridación de sondas oligonucleótidas, diseñadas a partir de la consideración de porciones de secuencia de aminoácido de secuencias de ADN conocidas que codifican las proteínas angiogénicas relativas. La operación de tales protocolos de análisis, la conocen bien los expertos en la materia, y se encuentra descrita con detalle en la literatura científica, por ejemplo Ambrook et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Lab Press; Inniste et al., estrategias PCR, 1995, Academic Press, New York).

Los genes angiogénicos, con secuencias que varían respecto a las descritas en la literatura, están comprendidas también en la invención, en tanto que el gen alterado o modificado codifica una proteína que funciona de modo que estimula los tejidos circundantes de implantes cardiovasculares o tisulares, de cualquier manera directa o indirecta. Estas secuencias incluyen las provocadas por mutaciones puntuales, las debidas a las degradaciones del código genético o las variantes alélicas que ocurren de forma natural, y otras modificaciones que han sido introducidas por ingeniería genética, tal como un gen híbrido, es decir, por la mano del hombre.

Las técnicas de introducción de cambios en secuencias nucleótidas que han sido diseñadas para alterar las propiedades funcionales de las proteínas o polipéptidos codificados, son bien conocidas en la técnica.

Tales modificaciones incluyen la supresión, inserción o sustitución de bases, y así, cambios en la secuencia del aminoácido. Los cambios pueden efectuarse con el fin de incrementar la actividad angiogénica de una proteína, para incrementar su estabilidad biológica de vida media, para reducir su degradación, incrementar su secreción, cambiar su patrón de glicolización, y similar. Todas esas modificaciones de las secuencias nucleótidas, están abarcadas por esta invención.

También de comprenderá que se puede utilizar uno, o más de uno, genes angiogénicos en los métodos y composiciones de la invención. El suministro de ácido nucleico puede dar así lugar a la administración de uno, dos, tres, o más genes angiogénicos. El número máximo de genes que pueden ser aplicados, está limitado solamente por consideraciones prácticas, tales como el esfuerzo necesario para preparar simultáneamente un gran número de construcciones génicas, o incluso por la posibilidad de generar un efecto citotóxico adverso. La combinación particular de genes puede ser de dos o más genes angiogénicos, o puede ser tal que se combine un gen de factor de crecimiento con un gen de hormona. Un gen de factor de crecimiento o de hormona, puede ser incluso combinado con un gen que de codificación de un receptor de superficie celular capaz de interactuar con un producto polipéptido del primer gen. También, un gen angiogénico puede ser combinado con genes que codifiquen productos antisentido. Con el uso de genes múltiples, los genes pueden ser combinados en un producto genético simple bajo el control de uno o más promotores, o pueden ser preparados como productos separados del mismo o de diferentes tipos. Así, se puede emplear una combinación casi sin fin de diferentes genes y productos genéticos. Ciertas combinaciones de genes pueden estar diseñadas para, o su uso puede dar como resultado, la consecución de efectos sinergísticos sobre angiogénesis y endotelialización. Cualesquiera de todas esas combinaciones están previstas para que caigan dentro del alcance de la presente invención. En efecto, se han descrito muchos efectos sinergísticos en la literatura científica, por lo que una persona experta en la materia estaría fácilmente capacitada para identificar combinaciones génicas sinergísticas probables, o incluso combinaciones de proteína de gen. También, se puede elegir otro gen con cualidades reductoras de la trombogenicidad, la fibrosis o el crecimiento neoíntimo. Otro gen puede codificar una proteína que inhiba el crecimiento de células neoíntimas, por ejemplo sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) o sintasa de óxido nítrico celular endotelial (ecNOS). Las proteínas o productos de proteínas de enzima que inhiben las trombosis, por ejemplo la prostaciclina, el activador plasminógeno tisular (tPA), la uroquinasa, y la estreptoquinasa, son también de interés para la co- transfección. También se pueden combinar los genes angiogénicos con otros genes que inhiban después la sobre-expresión de factores angiogénicos a cualquier nivel, tal como la transcripción o la conversión. La administración puede ocurrir antes, simultáneamente o después, de la administración del ácido nucleico angiogénico.

Se comprenderá que el ácido nucleico o el gen podría, si se desea, ser administrado en combinación con otros agentes, tales como, por ejemplo, proteínas, polipéptidos, oligonucleótidos aptámeros, oligonucleótidos de simulación de factor de transcripción o diversos agentes farmacológicamente activos, factores de crecimiento que simulan angiogénesis, moléculas de adhesión como la fibronectina, sustancias tales como la heparina para promover endotelialización, etc. También se pueden utilizar inmunosupresores y sustancias anti-inflamatorias y anti-restenosis. En tanto que el material genético forma parte de la composición, no existe virtualmente límite alguno para incluir otros componentes, dado que el agente adicional no provoca un efecto adverso significativo por el contacto con los tejidos o las células objetivo. Los ácidos nucleicos pueden ser así suministrados junto con otros diversos agentes. También, el ácido nucleico puede ser suministrado junto con un implante que proporcione radiación al tejido circundante con el fin de ejercer un efecto específico junto con la angiogénesis.

Se comprenderá que el gen o el ácido nucleico pueden ser administrados en combinación con un crecimiento celular simultáneo o procedimiento de impregnación, y puede ser combinado con crecimiento o impregnación simultáneos con células genéticamente modificadas.

Construcciones génicas y ácidos nucleicos

Según se utilizan aquí, los términos gen y ácido nucleico se utilizan ambos para referirse a una molécula de ADN que ha sido aislada, y están libres de ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un gen o un ADN que codifique un gen angiogénico, se refiere a un ADN que contiene secuencias que codifican una proteína angiogénica, pero que está aislada de, o purificada libre de, ADN genómico total de la especie de la que se obtiene el ADN. Incluidos dentro del término ADN están los segmentos de ADN y los fragmentos más pequeños de tales segmentos, y también los vectores recombinantes, incluyendo por ejemplo los plásmidos, los cósmidos, los cromosomas artificiales, los fagos, los lentivirus, retrovirus, adenovirus, y similares.

El término gen se utiliza aquí por motivos de simplificación para referirse a una unidad funcional de codificación de proteína o de péptido. Según comprenderán los expertos en la materia, este término funcional incluye tanto secuencias genómicas como secuencias de cADN. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN según se aísla originalmente, y no excluye los genes o regiones de codificación, tales como las secuencias que codifican péptidos maestros o secuencias de objetivación, añadidas posteriormente al segmento por el hombre.

Esta invención proporciona nuevas formas de utilizar diversos segmentos de ADN angiogénico conocidos y vectores recombinantes. Muchos de tales vectores están fácilmente disponibles. Sin embargo, no existe ninguna necesidad de utilización de un vector altamente purificado, en tanto que el segmento de codificación empleado codifica una proteína angiogénica, y no incluye ninguna secuencia de codificación o reguladora que pudiera tener un efecto adverso sobre el tejido que circunda al implante cardiovascular o tisular. Por lo tanto, se podrá entender también que las secuencias útiles de ácido nucleico pueden incluir residuos adicionales, tales como secuencias adicionales no codificadores que flanqueen cualquiera de las porciones 5' o 3' de la región de codificación, o pueden incluir varias secuencias internas, es decir, intrones, que se sabe que ocurren dentro de los genes.

Tras la identificación de un gen angiogénico apropiado o molécula de ADN, se puede insertar en uno cualquiera de los muchos vectores conocidos actualmente en la materia. De esta manera dirigirá la expresión y producción de la proteína angiogénica cuando se incorpora en un tejido que circunde al implante. En un vector de expresión recombinante, la porción de codificación del segmento de ADN se sitúa bajo el control de un promotor. El promotor puede estar en una forma que se asocie de forma natural con un gen angiogénico. Los segmentos de ADN codificante pueden estar situados bajo el control de un promotor recombinante, o heterólogo. Según se utiliza aquí, un promotor recombinante o heterólogo pretende referirse a un promotor que normalmente se asocia a otros genes angiogénicos, y/o promotores aislados de cualquier otra célula bacteriana, viral, eucariótica, o de mamífero. Naturalmente, será importante emplear un promotor que dirija de forma efectiva la expresión del segmento de ADN a los tejidos que circundan la prótesis vascular. El uso de promotores recombinantes para conseguir la expresión de proteína, es conocido en general por los expertos en la técnica de biología molecular (Sambrook et al.). Los promotores utilizados pueden ser constitutivos, o inducibles, y pueden ser utilizados bajos condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel o regulado del segmento de ADN introducido. Los promotores actualmente preferidos son, por ejemplo, CMV, RSV, LTR, promotor de inmunoglobulina, promotor SV40 sólo, y promotor de SV40 en combinación con el intensificador de SV40, y promotores regulables tales como el sistema promotor regulado-con-tetra-ciclina, o el promotor de metalotionina. Los promotores pueden estar asociados o no a intensificadores, donde los intensificadores pueden estar asociados de manera natural al promotor particular o asociados a un promotor diferente. Se proporciona una región de terminación 3' a la región de codificación de factor de crecimiento, donde la región de terminación puede estar asociada, de forma natural, al dominio citoplásmico o puede ser derivada de una fuente diferente. Se puede emplear una amplia variedad de regiones de terminación sin afectar negativamente la expresión. Tras diversas manipulaciones, la construcción resultante puede ser clonada, el vector aislado, y el gen examinado o secuenciado para asegurar de corrección de la construcción. El examen puede ser efectuado con análisis de restricción, secuenciamiento o similar.

Los genes angiogénicos y los segmentos de ADN pueden tener también forma de inserto de ADN, que se sitúa en el interior del genoma de un virus recombinante, tal como, por ejemplo, adenovirus recombinante, virus adenoasociado (AAV) o retrovirus. Para poner el gen en contacto con un tejido circundante de un implante, se podría, en tales realizaciones, preparar las partículas virales recombinantes, el genoma que incluye el inserto de gen angiogénico, y poner simplemente en contacto los tejidos que circundan el implante con el virus, con lo que el virus infecta las células y transfiere el material genético. En algunas realizaciones de la invención, se podría fijar el virus, en una composición, a un implante, tal como una prótesis vascular, un paso cardiovascular, un injerto dilatador, o un conector de injerto, y después poner en contacto el tejido que rodea al implante con el implante, en el lugar. El virus se libera de la composición, con lo que las células crecen en el implante, entrando así en contacto con el virus y permitiendo la infección viral, lo que da como resultado que las células tomen el cADN o el gen deseado, y expresen la proteína codificada, lo que a su vez da como resultado la angiogénesis y la endotelialización del implante.

En una realización preferida, los métodos de la invención incluyen preparar una composición en la que el gen angiogénico, los genes, o los segmentos de ADN se fijan a, o se impregnan sobre, una prótesis vascular, un paso cardiovascular, un injerto dilatador, una válvula cardíaca, un conector de injerto, o un implante tisular para formar una prótesis vascular, un paso cardiovascular, un injerto endovascular, un conector de injerto, una válvula cardíaca, o una composición de implante tisular-gen. A continuación, la prótesis vascular, el paso cardiovascular, injerto dilatador, conector de injerto, válvula cardíaca, composición de gen-implante tisular, puede ser puesto en contacto con el tejido que rodea a dicho implante tisular o cardiovascular. La prótesis vascular, el paso cardiovascular, el injerto dilatador, la válvula cardíaca, el conector de injerto, o las composiciones de gen-implante tisular, son todas aquellas en las que un gen es adsorbido, absorbido, o en su caso mantenido en contacto con el citado implante.

2. Transferencia de ácido nucleico a las células del tejido que rodea a un dispositivo implantado

Una vez que se ha preparado u obtenido una composición adecuada de gen-implante vascular, todo lo que se requiere para el suministro del en angiogénico al tejido circundante, consiste en colocar la composición de gen-implante cardiovascular o de gen-implante tisular quirúrgicamente, o con la ayuda de un catéter, en contacto con el lugar deseado, con o sin arrollarla primero con el tejido circundante. Los métodos son bien conocidos por los expertos en la materia. El gen agiogénico puede ser administrado también al tejido antes de, durante o después de la implantación del implante tisular o cardiovascular en el lugar. Éste podría ser una fístula arteriovenosa, un injerto de desviación (bypass) arterial o un injerto de interposición, un paso cardiovascular, un corazón artificial, un injerto dilatador, un dilatador estenótico, una válvula cardíaca, un dispositivo de ayuda cardíaca, un dispositivo anastomótico, una anuloplastia, un catéter vascular, un cable para marcapasos, una cánula traqueal, un sensor biomédico, una cámara para células vivas, un órgano artificial, un implante de órgano, un implante ortopédico, material de sutura, un paso quirúrgico, una pinza o un tapón, o cualquier dispositivo médico, todos los cuales comprenden al menos una superficie sintética.

En la presente invención, se transfieren uno o más vectores a cualquier tejido circundante, el cual es, con preferencia, un tejido de un mamífero. Diversas publicaciones han postulado el uso de transferencia génica para el tratamiento o la prevención de enfermedades (Levine y Friedman, Curr Opin in Biotech 1991; 2:840-44, Mulligan, Science 1993; 260:926-32, Crystal, Science 1995; 270:404-410, Rowland, Ann Thorac Surgery 1995; 60:721-728; Nabel et al., Science 1990; 249:1285-88). La célula anfitrión eucariótica está óptimamente presente in vivo. De acuerdo con la presente invención, el contacto de las células con los vectores de la presente invención puede hacerse mediante cualquier medio con el que los vectores puedan ser introducidos en la célula. Tal introducción puede hacerse mediante cualquier método adecuado. Con preferencia, los vectores serán introducidos por medio de transfección, es decir, utilizando la capacidad natural del ADN desprotegido para entrar en las células (por ejemplo, la capacidad del vector para someterse a endocitosis de receptor mediata). Sin embargo, los vectores pueden ser introducidos mediante cualquier otro medio adecuado, por ejemplo, mediante transducción, transformación mediata de fosfato de calcio, microinyección, electroporación, shock osmótico, y similares.

El método puede ser empleado con respecto a diversas células, difiriendo tanto el número de receptores de vector como también la afinidad de los receptores superficiales celulares para el vector. De acuerdo con la invención, los tipos de células respecto a los que se contempla el suministro génico in vivo, incluyen todas las células de mamíferos, con mayor preferencia las células humanas. Los vectores pueden ser realizados en las composiciones apropiadas para poner en contacto las células con excipientes apropiados (por ejemplo, farmacéuticamente aceptables), tales como portadores, adyuvantes, vehículos o diluyentes. Los medios para la realización de esa composición, y los medios para su administración, se encuentran descritos en el estado de la técnica. Donde sea apropiado, los vectores pueden ser formulados como preparaciones en forma sólida, líquida o de aerosol, tales como aerosol, pulverizador, pasta, pomada, gel, pegamento, polvos, gránulos, soluciones, inyecciones, crema y gotas, en las formas usuales para sus respectivas vías de administración, sin excluir cualquier otro método. Se deberá emplear una forma farmacéuticamente aceptable, que no sea ineficaz para las composiciones de la presente invención. En cuanto a las formas de dosificación farmacéutica, las composiciones pueden ser utilizadas solas o en alguna asociación apropiada, así como también en combinación con otros compuestos farmacéuticamente activos. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican el VEGF pueden ser administrados junto con ácidos nucleicos que codifican la inhibición de deposición de plaquetas o la proliferación muscular lisa. En consecuencia, la composición farmacéutica de la presente invención puede ser suministrada a través de diversas formas y en diversos lugares de un mamífero para conseguir un efecto particular. Un experto en la materia reconocerá que aunque se pueda utilizar más de una forma para la administración, una forma particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra forma. El suministro local puede llevarse a cabo mediante administración que comprenda la aplicación tópica o instilación de la formulación en el implante, o la administración de la formulación directamente, a los tejidos que rodean al implante in vivo, o cualquier otro método de aplicación tópica. La administración de esta forma de medicamento, permite que el medicamento sea específico del lugar, de una manera que la liberación de medicamentos de alta concentración y altamente potentes pueda ser limitada para dirigir la aplicación al tejido objetivo. Los métodos preferidos consisten en suministrar ácidos nucleicos en solución acuosa incorporados en fibrina, hidrogel, glicosaminoglicanos, o cualquier otra matriz polimérica biocompatible, tal como alginato, colágeno, ácido hialurónico, poliuretano, celulosa, ácido poliláctico, que cubra al menos una porción del implante (documento 5.833.651). Los ácidos nucleicos pueden ser añadidos al implante recubierto de polímero, ya sea en el momento de fabricación del implante o por el médico con anterioridad a, durante, o después de, la implantación. La fibrina tiene un número de características que la hacen particularmente adecuada para el suministro génico sostenido. La fibrina posee orificios, separaciones y espacios que soportan y proporcionan un alojamiento para el ácido nucleico. Tras la implantación, el ácido nucleico se desplaza desde la malla de fibrina hasta los tejidos que circundan al implante. La fibrina tiene capacidad de deshidratación y de rehidratación, lo que hace que un implante recubierto de fibrina sea adecuado para cargar ácido nucleico en una suspensión líquida. La fibrina es también biodegradable, y la biodegradación de fibrina sobre un implante de fibrina / ácido nucleico facilita además el contacto del ácido nucleico con el tejido circundante. La composición de polímero que comprende fibrina y vector, proporciona una composición de estabilización para el suministro génico. El polímero puede tener también, ya sea un polímero bioestable o ya sea un bioabsorbible, dependiendo de la velocidad de liberación deseada o del grado deseado de estabilidad del polímero. Puede ser un compuesto sintético o que se produzca de forma natural, estando también incluidos los derivados y las sales del compuesto. Resulta más deseable un polímero bioabsorbible, puesto que éste no provoca ninguna respuesta local crónica. Los polímeros bioabsorbibles que pueden ser utilizados incluyen, aunque sin limitarse a ellos, poli(L-ácido láctico), policaprolactona, poli(láctido-glicólido), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co-valerato), polidioxanona, poliortoéster, polianhídrido, poli(ácido glicólico), poli(D,L-ácido láctico), ácido poliláctico-poliglicólico, poliglactina, polidioxona, ploligluconato, poli(ácido glicólico-carbonato de cotrimetileno), polifosfoéster, polifosfoéster uretano, poli(aminoácidos), cianoacrilatos, poli(carbonato de trimetileno), poli(iminocarbonato), eopoli(éter-ésteres) (por ejemplo, PEO/PLA), oxalatos de polialqueno, polifosfazenos, y biomoléculas tales como fibrina, fibrinógeno, celulosa, almidón, colágeno, mucina, fibronectina, y ácido hialurónico. También, los polímeros bioestables con una respuesta tisular crónica relativamente baja, tales como los poliuretanos, siliconas y poliésteres, pueden ser utilizados siempre que los mismos puedan ser disueltos y curados o polimerizados sobre el implante, tal como las poliolefinas, poliisobutileno y copolímeros de etileno-alfaolefina;los polímeros y copolímeros acrílicos, los polímeros y copolímeros de haluro de vinilo, tales como el cloruro de polivinilo; los éteres de polivinilo, tales como el polivinil metil éter; los haluros de polivinilo, tales como el fluoruro de polivinilideno; el poliacrilonitrilo, las polivinil quetonas; los polivinilos aromáticos, tales como el poliestireno; los ésteres de polivinilo, tales como el acetato de polivinilo; los copolímeros de monómeros de vinilo cada uno con los otros, y las olefinas, tales como los copolímeros de etileno-metil metacrilato, los copolímeros de acrilonitrilo-estireno, las resinas de ABS, los copolímeros de etileno-acetato de vinilo; las poliamidas, tales como el Nylon 66 y la policaprolactama; las resinas alkyd; los policarbonatos, los polioximetilenos; las poliimidas; los poliéteres; las resinas epoxi; los poliuretanos; el rayón; el rayón-triacetato; la celulosa; el acetato de celulosa, butirato de celulosa; el acetato butirato de celulosa; el celofán; el nitrato de celulosa; el propionato de celulosa; los éteres de celulosa; y la carboximetilcelulosa (documento 5.776.184). También se puede utilizar la fibrina junto con otros polímeros biocompatibles, ya sea naturales o sintéticos, y con sus derivados y sales. De los polímeros, los glicopolisacáridos pueden ser ventajosos. Según un aspecto, existe una solución de sólido/sólido de polímero y medicamento. Esto significa que el medicamento y el polímero son ambos solubles en el mismo solvente, y han sido mezclados íntimamente en presencia de ese solvente. El medicamento y el solvente pueden ser aplicados de diversas formas, tal como sumergiendo simplemente el implante en la solución o mediante pulverización de la solución sobre el implante (documento 5.776.184). Se pueden utilizar diversos polímeros de hidrogel, tales como los seleccionados en el grupo consistente en ácidos policarboxílicos, polímeros celulósicos, gelatina, alginato, poli 2-hidroxietilmetilmetacrilato (HEMA) polivinilpirrolidina, polímeros de anhídrido maleico, poliamidas, alcoholes de polivinilo, óxidos de polietileno, polietileno glicol, poliacrilamida, poliácidos, por ejemplo ácidos poliacrílicos, polisacáridos, por ejemplo mucopolisacárido tal como el ácido hialurónico (documento 5.674.192) (documento 5.843.089). El polímero puede ser poroso o no poroso sobre el implante. Se pueden utilizar varias capas de polímeros y se pueden combinar varios polímeros diferentes sobre el mismo implante. Las diferentes capas y los diferentes polímeros pueden portar sustancias farmacológicas diferentes (documento 5.833.651). También, una o más superficies del implante pueden estar recubiertas con uno o más recubrimientos adicionales de un polímero que sea el mismo o diferente del segundo polímero. La adhesión del recubrimiento y la velocidad a la que se suministra el medicamento, pueden ser controlados con la selección de un polímero bioestable o bioabsorbible apropiado, y mediante la relación de medicamento respecto al polímero de la solución (documento 5.776.184). La dosis aplicada al tejido puede ser controlada mediante la regulación del tiempo de pre-empapado de medicamento en el recubrimiento hidrogel para determinar la cantidad de absorción de la solución de medicamento por parte del recubrimiento hidrogel. Otros factores que afectan a la dosificación, son la concentración del medicamento en la solución aplicada al recubrimiento, y la drogoaceptación del recubrimiento hidrogel, determinada, por ejemplo, por el espesor del recubrimiento hidrogel, su elasticidad, porosidad, y capacidad de recubrimiento hidrogel para retener el medicamento, por ejemplo enlace electrostático o tamaño de pro, o la resistencia iónica del recubrimiento, por ejemplo modificada mediante cambio del pH. Puede resultar ventajoso seleccionar un recubrimiento hidrogel para un medicamento particular, de tal modo que el medicamento no se libera sustancialmente hacia los fluidos corporales con anterioridad a su aplicación al lugar. La liberación de la solución de sólido/sólido de polímero y medicamento, puede ser además controlada con la variación de la relación del medicamento respecto al polímero en las múltiples capas. El recubrimiento no necesita ser una solución sólido/sólido de polímero y medicamento, sino que puede ser proporcionada, a su vez, a partir de cualquier combinación de medicamento y polímero aplicada al implante. La relación de sustancia terapéutica respecto al polímero presente en la solución, dependerá de la eficacia del polímero para asegurar que la sustancia terapéutica sobre el implante y de la velocidad a la que el recubrimiento debe liberar la sustancia terapéutica a los tejidos. Se puede necesitar mayor cantidad de polímero si éste tiene una eficacia relativamente pobre para la retención de sustancias terapéuticas sobre el implante, y se puede necesitar más polímero con el fin de proporcionar una matriz de solución que limite la levigación de una sustancia terapéutica muy soluble. Por lo tanto, podría resultar apropiada una relación amplia de sustancia terapéutica-respecto- a-polímero, y podría estar comprendida en la gama de 10:1 a 1:100 (documento 5.776.184). El enlace del medicamento puede ser realizado también por medio de la atracción electrostática del medicamento respecto al recubrimiento, o respecto a un aditivo de recubrimiento o un enlace mecánico, por ejemplo con el empleo de un recubrimiento que tenga un tamaño de poro que impida el flujo hacia adentro de fluidos corporales o el flujo hacia fuera del propio medicamento, lo que podría tender a liberar el medicamento.

Los hidrogeles son particularmente ventajosos debido a que el medicamento está contenido en el interior de la matriz de enlace de hidrogel, formada por el gel (documento 5.674.192). Ejemplos de hidrogeles son, por ejemplo HYDRO-PLUS.RTM (documento 5.674.192), CARBOPOL.RTM (documento 5.843.089), AQUAVENE.RTM (documento 4.883.699), HYPAN.RTM (4.480.642). En algunos casos, el hidrogel puede ser de enlace cruzado con anterioridad al revestimiento del implante, por ejemplo el recubrimiento de hidrogel sobre un injerto vascular o endovascular puede estar en contacto con un imprimador, por inmersión, con anterioridad a que el hidrogel sea depositado sobre el implante. Si es de enlace cruzado, forma un revestimiento relativamente permanente sobre la superficie del implante, y si se deja sin enlace cruzado, forma un revestimiento relativamente degradable sobre la superficie del implante. Por ejemplo, la longevidad de una forma de enlace cruzado de un hidrogel dado en el revestimiento de dilatador estenótico, ha sido al menos doble del correspondiente a su forma de no enlace cruzado (documento 5.843.089). Alternativamente, el revestimiento de hidrogel puede ser puesto en contacto con un agente de formación de enlace cruzado in situ (documento 5.843.089). En general, cuando se seca, el recubrimiento hidrogel es, con preferencia, del orden de alrededor de 1 a 10 micras de espesor, y típicamente de 2 a 5 micras. Los recubrimientos de hidrogel muy delgados, por ejemplo de alrededor de 0,2 - 0,3 micras (secos) y los recubrimientos de hidrogel mucho más gruesos, por ejemplo de más de 10 micras (secos), son también posibles. Típicamente, los espesores de los recubrimientos hidrogel pueden hincharse según un factor de alrededor de 6 a 10 o más, cuando el hidrogel se hidrata (documento 5.674.192). Normalmente, el portador polimérico deberá ser biodegradable o biolevigante (según enseñan, por ejemplo, los documentos 5.954.706, 5.914.182, 5.916.585, 5.928.916). El portador puede estar construido también de modo que sea una sustancia biodegradable que rellene los poros, y que libere una o más sustancias hacia el tejido circundante mediante disolución progresiva de la matriz. Posteriormente, los poros se abrirán. Los vectores suministrados pueden ser ácidos nucleicos que codifiquen la proteína terapéutica, por ejemplo un ácido nucleico desprotegido o un ácido nucleico incorporado en un vector viral o un liposoma: Mediante ácido nucleico desprotegido se indica una molécula de ADN o de ARN de trenzado simple o doble, no incorporada en un virus o un liposoma. Los oligonucleótidos anti-sentido que enlazan específicamente con las moléculas mARN complementarias, y reducen con ello o inhiben la expresión de proteína, pueden ser también suministrados al lugar de implante a través del recubrimiento hidrogel (documento 5.843.089). En general, la fijación del ácido nucleico al implante puede hacerse también de otras diversas formas, tal como utilizando técnicas de fijación iónica o covalente. Típicamente, las técnicas de fijación covalente requieren el uso de agentes de acoplamiento, tales como glutaraldehído, bromuro cianógeno, p-benzoquinona, anhídridos succínicos, carbodiimidas, diisocianatos, cloroformato de etilo, disulfuro de dipiridilo, epiclorohidrina, azidas, entre otros, sin excluir cualquier otro agente, pero cualquier método que haga uso de los métodos descritos en esta invención, pueden ser utilizados y serán reconocidos por un experto en la materia. El acoplamiento covalente de una molécula a una superficie puede crear enlaces cruzados indeseados entre las biomoléculas, y destruir con ello las propiedades biológicas de la biomolécula. También, pueden crear enlaces entre los lugares funcionales de la superficie e inhibir con ello la fijación. El acoplamiento covalente de una biomolécula a una superficie, puede destruir también la estructura tridimensional de las biomoléculas, y reducir con ello o destruir las propiedades biológicas (documento 5.928.916). Las técnicas de acoplamiento iónico tienen la ventaja de que no alteran la composición química de la biomolécula fijada, y el acoplamiento iónico de biomoléculas tiene también la ventaja de liberar la biomolécula bajo condiciones apropiadas. Un ejemplo consiste en el documento 4.442.133. Las técnicas actuales para inmovilización de biomoléculas por medio de un enlace iónico han sido logradas mediante la introducción de cargas positivas de la superficie de biomaterial utilizando sales de amonio cuaternario, polímeros que contienen grupos amina terciaria y cuaternaria, tal como TDMAC, cloruro de benzalconio, cloruro de cetilpirridinio, cloruro de benzildimetilestearilamonio, cloruro de benzilcetildimetilamonio, porciones de guanidina o biguanida (documento 5.928.916). Cuando se suministra el implante vascular percutáneamente, se puede incluir un miembro de cubierta para inhibir la liberación del medicamento en los fluidos corporales durante la colocación del catéter. Por ejemplo, puede ser carbo-cera, gelatina, alcohol de polivinilo, óxido de polietileno, polietileno glicol, o un polímero biodegradable o térmicamente degradable, por ejemplo albúmina o gel plurónico F-127 (documento 5.674.192). El tipo particular de método de fijación cuando se ponen en práctica los métodos y las composiciones de la invención, no es importante, siempre que los ácidos nucleicos liberados del implante estimulen el tejido circundante de la manera en que aquellos sean activados, y en el contexto de las realizaciones in vivo, y den lugar finalmente a la endotelialización del implante tisular o cardiovascular sin provocar reacciones adversas. Los métodos aquí descritos son considerados todos inclusive, y otros métodos adicionales que se adecuen a la aplicación específica resultarán evidentes para las personas expertas en la materia.

La composición útil de la presente invención puede ser suministrada en forma de dosificación unitaria, en la que cada unidad de dosificación, por ejemplo solución, gel, pegamento, gotas y aerosol, contiene una cantidad predeterminada de la composición, sola o en una combinación apropiada con otros agentes activos. El término "forma de dosificación unitaria", según se utiliza aquí, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para humanos y sujetos animales, en las que cada unidad contiene una cantidad predeterminada de las composiciones de la presente invención, sola o en combinación con otros agentes activos, calculada en cantidad suficiente como para producir el efecto deseado, en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, donde se considere apropiado. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria de la presente invención, dependen del efecto particular que haya de alcanzarse, y de la farmacodinámica particular asociada a la composición farmacéutica en el anfitrión particular.

En consecuencia, se describe un método de transferencia de un terapéutico a un anfitrión, que comprende administrar el vector descrito en la presente invención, con preferencia como parte de la composición con el implante, utilizando las formas de administración mencionadas anteriormente o formas alternativas conocidas por los expertos en la materia. La cantidad efectiva de la composición será tal como para producir el efecto deseado en el anfitrión, lo que puede ser monitorizado utilizando varios puntos finales conocidos por los expertos en la materia. La transferencia génica efectiva del vector hasta una célula anfitrión, puede ser monitorizada en términos de efecto terapéutico (por ejemplo, formación de capilares y endotelialización de superficies), o también mediante la evidencia del gen transferido o expresión del gen en el interior del anfitrión (por ejemplo, utilizando la reacción de cadena de polimerasa junto con secuenciamiento, hibridación Northern o Southern, o ensayos de transcripción para detectar el ácido nucleico en las células del anfitrión, o utilizando análisis de inmunomancha, detección mediata de anticuerpo, estudios de vida media de mARN o de proteína, o ensayos particularizados para detectar la proteína o el polipéptido codificado por el ácido nucleico transferido, o impactado en cuanto a nivel o función debido a esa transferencia). Un ensayo particularizado de este tipo, descrito en los ejemplo, incluye el inmunoensayo Western para la detección de proteína codificadas por el gen VEGF. Estos métodos se consideran todos inclusives, y otros métodos adicionales adecuados para la aplicación específica resultarán evidentes para los expertos en la materia. Además, la cantidad efectiva de las composiciones puede ser mejor aproximada por analogía con los compuestos conocidos para ejercer el efecto deseado (por ejemplo, compuestos empleados tradicionalmente para estimular la angiogénesis pueden proporcionar una guía en términos de la cantidad de ácido nucleico VEGF y FGF-5 que ha de ser administrada a un anfitrión).

Además, las cantidades preferidas de cada agente activo incluido en las composiciones conforme a la invención, el VEGF está incluido, con preferencia, desde alrededor de 0,1 microgramos hasta 10000 microgramos (aunque se puede utilizar cualquier otra cantidad superior que sea adecuada, es decir, mayor que alrededor de 10000 microgramos, o inferior, es decir, menor de alrededor de 0,1 microgramos), proporcionan una guía general de la gama de cada componente que ha de ser utilizado por el experto para la optimización de los métodos de la presente invención durante la puesta en práctica in vivo. De manera similar, los plásmidos de FGF-5 y FGF-2 están incluidos desde 0,1 hasta 10000 microgramos (aunque se puede utilizar cualquier cantidad que sea adecuada, ya sea superior a alrededor de 10000 microgramos, o ya sea inferior, es decir, menor de alrededor de 0,1 microgramos). El vector FGF-5 tiene con preferencia entre 10^{7} y 10^{3} partículas virales, aunque se puede utilizar cualquier cantidad adecuada, ya sea mayor de 10^{3} o ya sea menor de 10^{7}. Además, no significa que tales gamas excluyan el uso de una cantidad superior o inferior de un componente, como podría ser garantizado en una aplicación particular. Por ejemplo, la dosis y la clasificación reales pueden variar dependiendo de si las composiciones son administradas en combinación con otras composiciones farmacéuticas, o dependiendo de las diferencias individuales en la farmacocinética, la disposición de medicamento, y el metabolismo. Además, la cantidad de vector que ha de ser añadida por célula, variará probablemente con la longitud y la estabilidad del gen insertado en el vector, así como también con la naturaleza de la secuencia, y consiste particularmente en un parámetro que necesita ser determinado empíricamente, y puede ser alterado debido a factores no inherentes a los métodos de la presente invención (por ejemplo, el coste asociado a la síntesis). Un experto en la materia puede realizar fácilmente los ajustes necesarios de acuerdo con las exigencias de la situación particular. La cantidad de construcción génica que se aplica al tejido circundante o la cantidad de composición génica que se aplica sobre el implante o en el tejido, será determinada finalmente por el médico o veterinario que preste la atención, tomando en consideración los diversos factores médicos y biológicos. Por ejemplo, podría desearse el hecho de considerar el gen angiogénico particular y el material de implante vascular, el tamaño del paciente o del animal, la edad, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, así como también otros factores clínicos que pudieran afectar a la endotelialización, tales como los niveles de suero de los diferentes factores y de las hormonas. El régimen de dosificación adecuada podrá ser por tanto fácilmente determinable por un experto en la materia, a la vista de la descripción que sigue, tomando en consideración las circunstancias individuales.

También, para estas realizaciones, cuando se emplean uno o más vectores diferentes en los métodos aquí descritos (es decir, cada uno de ellos codificando uno o más genes terapéuticos diferentes), el contacto de las células con los diversos componentes de la presente invención puede producirse en cualquier orden o puede ocurrir simultáneamente. Preferentemente, se produce simultáneamente.

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3. Tejido de promoción de endotelialización

Esta invención proporciona métodos ventajosos de utilización de genes para estimular la endotelialización de implante médico poroso desde el tejido circundante. Según se utiliza aquí, el término tejido circundante se refiere a cualquiera, o a todas, las células que tengan capacidad de formar finalmente, o contribuir a la formación de nuevo endotelio en la superficie del implante. Esto incluye diversos tejidos de diversas formas, tal como por ejemplo pleura, pericardio, peritoneo, omento, tejido graso y tejido muscular.

El tipo o los tipos particular(es) de tejido circundante, que son estimulados con los métodos y composiciones de la invención, no son importantes, en tanto que las células son estimuladas de tal modo que las mismas son activadas, y, en el contexto de las realizaciones in vivo, dan lugar finalmente a la endotelialización o capilarización del implante.

El tejido circundante se utiliza también para referirse en particular a aquellas células que están situadas en el interior de, están en contacto con, o migran hacia, el implante, y cuyas células estimulan directa o indirectamente la formación de endotelio y/o capilares. Como tales, las células endoteliales microvasculares pueden ser células que forman endotelio. Las células, que con estimulación adicional atraen células endoteliales, son consideradas también como tejido circundante en el contexto de esta descripción, y su estimulación conduce indirectamente a la endotelialización. Las células que afectan a la endotelialización pueden hacerlo indirectamente mediante la elaboración de diversos factores de crecimiento y citoquinas, o mediante su interacción química con otros tipos de células. También, las células o tejidos que en su entorno natural llegan a un área de endotelialización o vascularización de implante activo, pueden ser tejido circundante. Las células de tejido circundante pueden ser células que son atraídas o abastecidas a esa área. Aunque de interés científico, los mecanismos directos o indirectos en virtud de los cuales las células de tejido circundante estimulan la endotelialización, no es un objetivo a tomar en consideración en la puesta en práctica de esta invención.

Las células de tejido circundante pueden ser células o tejidos que en su entorno natural llegan a un área de prótesis vascular activa, de endotelialización de prótesis endovascular, o de vascularización de implante tisular. En términos de tejido circundante, estas células pueden ser también células que son atraídas o abastecidas a esa área.

De acuerdo con la invención, las células y los tejidos circundantes serán aquellas células y tejidos que llegan a la superficie de los implantes cardiovasculares que se desee endotelializar, o las células o tejidos que llegan a la superficie de los implantes tisulares que se desea vascularizar.

En consecuencia, en las realizaciones de tratamiento no existe ninguna dificultad asociada a la identificación de tejidos circundantes adecuados a las que las presentes composiciones terapéuticas, y los implantes cardiovasculares y tisulares, deban ser aplicados. Todo esto se requiere en aquellos casos en los que se debe obtener una composición estimuladora apropiada, según se describe aquí, y para poner en contacto el implante tisular o cardiovascular con la composición estimuladora y con el tejido circundante. La naturaleza de este entorno biológico es tal que las células apropiadas resultarán activadas en ausencia de cualquier otra identificación celular u objetiva por parte del médico.

Un aspecto de la invención incluye poner en contacto los tejidos circundantes con una composición que comprenda uno o dos genes (con o sin genes adicionales, proteínas, factores de crecimiento, medicamentos u otras biomoléculas), y un implante tisular o cardiovascular para promover la expresión de dicho gen en las citadas células. Según se ha indicado, las células pueden ser contactadas in vivo. Esto se consigue, de la manera más directa, obteniendo simplemente una construcción génica de promoción funcional de endotelialización, y aplicando la construcción a las células. Poner en contacto las células con ADN, por ejemplo con una molécula lineal de ADN, o con ADN en forma de plásmido, o con algún otro vector recombinante que contenga el gen de interés bajo el control de un promotor, junto las señales de terminación apropiadas, resulta suficiente para conseguir una captación y una expresión de ADN, sin que sean necesarias etapas adicionales.

Con preferencia, el proceso de puesta en contacto del tejido circundante con la composición de promoción de endotelialización, se realiza in vivo. De nuevo, una consecuencia directa de este proceso consiste en que las células captan y expresan el gen, y el producto de conversión y transcripción estimula el proceso de angiogénesis que da como resultado la endotelialización y/o la capilarización del implante sin que el médico requiera etapas adicionales.

4. Materiales utilizados en los dispositivos de acuerdo con la invención

Según se utiliza aquí, las expresiones y las palabras tendrán los significados atribuidos que siguen. Dispositivo médico implantable, que por brevedad será citado como implante, dispositivo o prótesis, se referirá a un objeto que se fabrica, al menos en parte, a partir de un biometal, y que está previsto para ser utilizado en contacto con los tejidos corporales, incluyendo los fluidos corporales. Biomaterial se referirá a la composición de material utilizado para preparar un dispositivo, que proporciona una o más de sus superficies para estar en contacto con el tejido. La porosidad y las inflexiones de la misma (tales como poroso o poroso), si no se especifica otra cosa, se referirá a un biomaterial que tenga canales o pasos pequeños que comienzan en una superficie externa (por ejemplo, la primera más grande) del biomaterial, y que se extienden sustancialmente a través del biomaterial hasta una superficie interna (por ejemplo, la segunda). Rígido y sus inflexiones, se referirá, en caso de un biomaterial no absorbible, cuando se fabrica en forma de dispositivo médico implantable, a la capacidad de resistir las presiones encontradas en el transcurso de su utilización, por ejemplo para la patencia y la estructura de poro in vivo. La superficie se referirá a la interfaz entre el biomaterial y su entorno. El término está previsto que incluya el uso de la palabra tanto en sentido macroscópico (por ejemplo, las dos caras mayores de una lámina de biomaterial), como también en sentido microscópico (por ejemplo, el revestimiento de poros que atraviesan el material). El término "fijación" y sus derivados, se refieren a adsorción, tal como fisisorción o quimisorción, interacción de ligando/receptor, enlace covalente, enlace de hidrógeno, o enlace iónico de una sustancia polimérica o ácidos nucleicos con el implante. Endotelialización será utilizado, a menos que se especifique otra cosa, de manera intercambiable con la frase endotelialización capilar para referirse al crecimiento de células endoteliales sobre sustancialmente todas las superficies de contacto del tejido de un biomaterial utilizado para formar un implante rígido poroso o rígido no poroso.

El tipo de implantes cardiovasculares y tisulares que pueden ser utilizados en las composiciones, dispositivos y métodos de la invención, es virtualmente ilimitado, siempre que sean compatibles con el tejido. Así, los dispositivos de la presente invención incluyen los dispositivos médicos previstos para un contacto prolongado con la sangre, los fluidos corporales o los tejidos, y en particular aquellos que pueden beneficiarse de la endotelialización capilar cuando se utilizan en aplicaciones in vivo. Los dispositivos preferidos son implantables en el cuerpo, e incluyen los implantes cardiovasculares, los implantes tisulares, los órganos artificiales, tales como el páncreas, el hígado, y el riñón, y los implantes de órganos tales como los implantes para el pecho, el pene, la piel, el cuello, el oído y los ortopédicos. El significado de endotelialización capilar variará con cada dispositivo particular, dependiendo del tipo y el propósito del dispositivo. Los capilares de crecimiento interior pueden proporcionar células endoteliales para revestir las superficies de los implantes vasculares, proteger los implantes tisulares frente a infecciones, portar nutrientes hasta las células del dispositivo, y hacer que sea posible que los sensores detecten niveles de las sustancias en circulación. Esto significa que el implante tenga todas las características asociadas habitualmente a la biocompatibilidad, puesto que el mismo ha de estar de una forma que no produzca una reacción adversa, alérgica, o cualquier otra desfavorable cuando se administra a un mamífero. Los mismos han de ser adecuados para ser colocados en contacto con el tejido que circunda al implante. El último requisito tiene en cuenta factores tales como la capacidad de dichos implantes para proporcionar una estructura para el desarrollo de endotelio vascular.

Los biomateriales preferidos son aquellos que proporciona rigidez para sus objetivos previstos in vivo. Para su utilización en la formación de un injerto vascular y de un paso cardiovascular, por ejemplo, el biomaterial puede ser de rigidez suficiente como para permitir que el injerto conserve patencia de injerto durante el transcurso del uso previsto. La elección del material de implante será diferente de acuerdo con las circunstancias particulares y con el sitio en que deba ser implantado el implante vascular o tisular. Las prótesis vasculares se realizan con biomateriales, elegidos en el grupo consistente en, por ejemplo, polímeros de tetrafluoretileno, resinas de poliéster aromático/alifático, poliuretano, y cauchos de silicona. Sin embargo, se puede utilizar cualquier tipo de malla microporosa biocompatible. Los citados materiales pueden ser combinados cada uno con los otros, o con otras sustancias, tales como ácido poliglicólico, ácido poliláctico, polidioxona, y poligliconato. Se prefiere el politetrafluoretileno expandido y el Dacrón. El Dacrón puede ser considerado con o sin veludillo, o modificado de cualquier otro modo. El Dacrón está normalmente tejido, trenzado o tejido a punto, y los hilos adecuados están comprendidos entre 10 y 400 denier. Las regiones nodales de ePTFE están compuestas por PTFE no poroso que sirve para proporcionar resistencia al desgarro (por ejemplo, para suturas, y resistencia a la dilatación aneurísmica). Las regiones internodales están compuestas por fibras de PTFE, las cuales sirven para conectar los nodos con los espacios entre las fibras que proporcionan la porosidad a la que aquí se hace referencia. El tamaño nodal pueden ser expresado como el porcentaje de superficie en contacto con el tejido que está compuesta por PTFE nodal. La distancia entre nodos puede ser expresada como la longitud fibrilar media. A su vez, la porosidad se expresa normalmente como la distancia internodal (es decir, la distancia media desde la mitad de un nodo hasta la mitad del nodo adyacente). Los materiales de ePTFE preferidos tienen nodos de tamaño y frecuencia suficientes como para proporcionar una resistencia adecuada (por ejemplo, con respecto a la dilatación aneurísmica), y regiones internodales de frecuencia y longitud de fibra suficientes como para proporcionar una porosidad adecuada (para permitir endotelialización capilar). Dada la presente especificación, los expertos en la materia estarán capacitados para identificar y fabricar dispositivos que utilicen biomateriales que tengan una combinación adecuada de porosidad y de rigidez. Los biomateriales son preferentemente porosos para permitir la fijación y migración de células, que puede ir seguido de la formación y crecimiento de capilares en la superficie. Pueden existir poros adecuados en forma de pequeños canales o pasos, que comiencen en una superficie externa, y que se extiendan total o parcialmente a través del biomaterial. En esos casos, las dimensiones en sección transversal del diámetro capilar de poro, son mayores de t micras, y típicamente menores de 1 mm. El valor superior de tamaño de poro, no es crítico siempre que el biomaterial conserve rigidez suficiente, sin embargo es improbable que los dispositivos útiles puedan tener un tamaño de poro que sea superior a 1 mm. Tales dimensiones de poro pueden ser cuantificadas con un microscopio. Según comprenderán los expertos en la materia, se pueden realizar diversas modificaciones de los materiales y las superficies del injerto, tal como un recubrimiento previo con, por ejemplo, proteínas (véanse, por ejemplo, los documentos 5.037.377, 4.319.363), plasma sanguíneo sin estar completamente heparinizado, y rico en plaquetas, modificaciones de superficies de descarga de luminosidad, gel plurónico de adición, pegamento de fibrina, fibronectina, moléculas de adhesión, enlace covalente, cargas superficiales influenciadoras, con carbono por ejemplo (documentos 5.827.327, 4.164.045), y tratar con un agente surfactante o de limpieza, sin excluir ningún otro método. Además, el implante puede ser construido como híbrido de diferentes distancias internodales para las superficies interna y externa, tales como 60 micras como valor externo y 20 micras como valor interno, para las distancias internodales (HYBRID PTFE). También, se pueden utilizar más capas con diferentes distancias internodales. Todas ellas están previstas de modo que caen dentro del alcance de la presente invención cuando no inhiben la endotelialización. Se pueden utilizar potenciales implantes vasculares biodegradables en relación con las composiciones, dispositivos y métodos de esta invención. Por ejemplo, se puede emplear ácido poliláctico biodegradable y definido químicamente, ácido poliglicólico, matrices de proteínas purificadas, composiciones de matriz extracelular semi-purificadas, y también colágeno. También, se puede emplear como material de implante vascular, material autogénico, alogénico y xenogénico que se produce de forma natural, tal como una vena umbilical, y tejido sub-mucosal de arteria bovina natural o de intestino. Ejemplos de injertos utilizados clínicamente, se encuentran descritos en los documentos 4.187.390, 5.474.824 y 5.827.327. Los materiales biodegradables o bioabsorbibles, tales como los homopolímeros, por ejemplo la poliparadioxanona, polilisina o el ácido poliglicólico y los copolímeros; por ejemplo, el ácido poliláctico y los ácidos poliglicólidos, siempre que proporcionen la rigidez requerida. También, se pueden utilizar otros materiales biológicos, tales como la submucosa intestinal, las matrices de proteínas purificadas y las composiciones de matriz extracelular semi-purificadas. Los injertos vasculares apropiados suministrarán la composición génica y también proporcionarán una superficie de nuevo crecimiento endotelial, es decir, actuarán como un andamiaje in situ, a través del cual pueden migrar las células endoteliales. Los expertos en la materia comprenderán que será aceptable cualquier material con una biocompatibilidad, una rigidez y una porosidad que permitan el crecimiento de trans-injerto.

Los antecedentes relativos a los parches cardiovasculares, se encuentran bien descritos por ejemplo en los documentos 5.104.400, 4.164.045 y 5.037.377. En el caso de parches vasculares, un lado del parche está en contacto con la sangre, mientras que el otro lado está en contacto con los tejidos circundantes para promover el crecimiento de trans-injerto de las células endoteliales. En el caso de parches intracardíacos, la sangre conecta con ambos lados del parche. Los biomateriales preferidos son aquellos que proporcionan una rigidez suficiente in vivo. Un material para parche vascular será de rigidez suficiente como para permitir que el parche conserve su forma y su estructura de poro con el transcurso del uso previsto para el mismo. La elección del material del parche será diferente de acuerdo con las circunstancias particulares y el lugar en el que se implante el parche vascular. El parche vascular está hecho de biomaterial sintético, incluyendo esos materiales, aunque sin limitación, los polímeros de tetrafluoretileno, las resinas de poliéster aromáticas / alífáticas, los poliuretanos, y los cauchos de silicona, aunque no obstante se puede utilizar cualquier tipo de malla microporosa que sea compatible. Los citados biomateriales pueden ser combinados cada uno con los otros o con otras sustancias tales como el ácido poliglicólico. Se prefiere el politetrafluoretileno expandido y el Dacrón. El Dacrón está normalmente tejido, trenzado o tejido a punto, con o sin veludillo,y los hilos adecuados están comprendidos entre 10 y 400 denier. Las regiones nodales del ePTFE están compuestas por FIFE no poroso que sirve para proporcionar resistencia la desgarro (por ejemplo, para suturas, y resistencia a la dilatación aneurísmica). Las regiones internodales están compuestas por fibras de PTFE que sirven para conectar los nodos, proporcionando los espacios entre las fibras la porosidad a la que aquí se alude. La distancia nodal puede ser expresada como el porcentaje de la superficie en contacto con el tejido que está compuesta por PTFE nodal. La distancia entre nodos puede ser expresada como la longitud fibrilar media. A su vez, la porosidad se expresa habitualmente como la distancia internodal (es decir, la distancia media desde la mitad de un nodo hasta la mitad del nodo adyacente). Los materiales ePTFE preferidos tienen nodos de tamaño y frecuencia suficientes como para proporcionar una resistencia adecuada (por ejemplo, con respecto a la dilatación aneurísmica), y regiones internodales de frecuencia y longitud de fibra suficientes como para proporcionar una porosidad adecuada (que permita la endotelialización capilar). Tales materiales proporcionarán menos nodos aunque más gruesos, que a su vez conferirán una resistencia significativamente mayor in vivo. Dada la presente descripción, los expertos en la materia estarán capacitados para identificar y fabricar dispositivos que utilicen biomateriales que tengan una combinación adecuada de porosidad y rigidez. Los biomateriales son preferentemente porosos para permitir la fijación y la migración de las células, lo que puede ir seguido de la formación y el crecimiento de capilares en la superficie luminal. Pueden existir poros adecuados en forma de pequeños canales o pasos, que empiecen en una superficie externa y que se extiendan a través del biomaterial. En esos casos, las dimensiones en sección transversal de los poros son más grandes que el diámetro de un capilar de 5 micras, y son típicamente menores de 1 mm. El valor superior del tamaño de poro no es crítico, siempre que el biomaterial conserve suficiente rigidez. Sin embargo, es improbable que los dispositivos útiles tengan un tamaño de poro que sea mayor de alrededor de 1 mm. Tales dimensiones de poro pueden ser cuantificadas con un microscopio. Como comprenderán los expertos en la materia, se pueden realizar diversas modificaciones de los materiales de injerto y de las superficies, tal como un recubrimiento previo con, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, documentos 5.037.377, 4.319.363), plasma sanguíneo que no está totalmente heparinizado y que es rico en plaquetas, modificaciones de descarga de luminosidad de las superficies, gel plurónico de adición, pegamento de fibrina, moléculas de adhesión, enlace covalente, cargas superficiales influenciadoras con, por ejemplo, carbono (documentos 5.827.327, 4.164.045), tratamiento con un surfactante o un agente de limpieza, sin excluir ningún otro método. También puede construirse el implante como un híbrido de diferentes distancias internodales en la superficie interior y exterior, tal como 60 micras por el exterior y 20 micras por el interior de distancia internodal (HYBRID PTFE). Incluso se pueden utilizar más capas con diferentes distancias internodales. Todas ellas está previsto que caigan dentro del alcance de la presente invención, cuando no inhiben la endotelializacion. Se pueden utilizar materiales potenciales biodegradables en relación con las composiciones, los dispositivos y los métodos de la invención, como por ejemplo los homopolímeros, por ejemplo la poli-paradioxanona, la polilisina o el ácido poliglicólico, y copolímeros, por ejemplo el ácido poliláctico y los ácidos poliglicólicos y otros biomateriales, tales como las matrices de proteínas purificadas y las composiciones de matriz extracelular semi- purificadas pueden ser utilizadas ya sea solas o en combinación con otros materiales como material para parche cardiovascular, siempre que proporcionen la rigidez requerida. Se puede utilizar también como material de parche cardiovascular, el material xenogénico, alogénico y autogénico que se produce de forma natural, tal como una vena umbilical, una vena safena, arteria bovina natural, pericardio o tejido submucosal intestinal. Ejemplos de parches vasculares utilizados clínicamente, se encuentran descritos en los documentos 5.037.377, 5.456.711, 5.104.400, 4.164.045. Los parches vasculares apropiados suministrarán la composición génica y también proporcionarán una superficie para el crecimiento de nuevo endotelio, es decir, a modo de andamiaje in situ sobre el que, y a través del cual, las células endoteliales pueden migrar. Con preferencia, los ácidos nucleicos se fijan al lado que está en contacto con los tejidos que circundan al vaso. Los parches intracardíacos apropiados proporcionarán la composición génica a los tejidos circundantes, y proporcionarán una superficie para el crecimiento de nuevo endotelio, es decir, actuarán como andamiaje in situ sobre el que, y a través del cual, las células endoteliales pueden migrar. Con preferencia, los ácidos nucleicos se fijan a ambas superficies del parche intracardíaco. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden ser fijados a una de las superficies del parche intracardíaco. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier material con una biocompatibilidad, una rigidez, y una porosidad que permitan la endotelialización, será aceptable.

Dilatador estenótico significa aquí un implante médico en forma de cilindro hueco, que proporcionará soporte al lumen corporal cuando se implanta en contacto con un lugar de la pared de un lumen que ha de ser tratado. Puede adoptar diversos diseños diferentes, tales como tubular, cónico o bifurcado. La configuración puede ser tal como un resorte helicoidal, un filamento trenzado, un tubo perforado, un tubo partido, y en zig- zag, o según cualquier otra variante. Con preferencia, está adaptado para su utilización en los vasos sanguíneos de una manera que posee una superficie externa, de contacto con el lumen, y una superficie interna, de contacto con la sangre. Muchos dilatadores estenóticos de la técnica anterior están formados por uno o más miembros individuales, tal como alambre, plástico, tiras metálicas, o malla, que se doblan, tejen, entrelazan o se fabrican de cualquier otro modo para adoptar una configuración cilíndrica en general. El dilatador estenótico puede tener también elementos estructurales poliméricos o metálicos subyacentes, sobre cuyos elementos, se aplica una película (documento 5.951.586). Los dilatadores estenóticos han sido clasificados en auto-expansores y en expansionables con presión. Los términos expandirse, expansionarse y expandible, se utilizan aquí para referirse a dilatadores estenóticos intraluminales diametralmente ajustables. Cuando los dilatadores estenóticos auto expansionables se sitúan en el lugar de tratamiento con un catéter de suministro, se supone que los mismos han de expansionarse radialmente para alcanzar un diámetro mayor después de ser liberados de la fuerza constrictora, cuya fuerza los restringe a un diámetro más pequeño, y conformar una superficie de contacto con la pared del vaso sanguíneo u otro tejido sin ejercer ninguna fuerza radial dirigida hacia el exterior en el dilatador estenótico. Los dilatadores estenóticos de este tipo incluyen los dilatadores estenóticos de alambre conformados o trenzados. Los dilatadores estenóticos expansionables por presión, se fabrican con material maleable o plásticamente deformable, formados típicamente con alambre metálico o con hilos metálicos. El dilatador estenótico plegado se lleva hasta el lugar de tratamiento con un catéter de suministro, y se expansiona radialmente con un globo o con otro aparato de expansión de dilatador, hasta su diámetro operativo previsto. Los elementos roscados o los hilos formados con metal, son por lo general favorables para aplicaciones que requieran flexibilidad y resistencia efectiva a la compresión radial tras su implantación. La combinación favorable de resistencia y flexibilidad, se debe en gran medida a las propiedades de los hilos después de que los mismos se han endurecido con el paso del tiempo, o en su caso tratados térmicamente en el caso de los hilos poliméricos. El ángulo de trenzado de los hilos helicoidales y la separación axial entre hilos adyacentes, contribuyen también a la resistencia y a la flexibilidad.

Los alambres para dilatador estenótico pueden ser metálicos, de fibras inorgánicas, o de polímeros orgánicos. Los mismos pueden ser elásticos, fuertes, biocompatibles, y resistentes a la corrosión y la fatiga. Por ejemplo los alambres del núcleo puede ser metálicos, tal como de acero inoxidable o de oro, o de otros metales y aleaciones no tóxicas relativamente plegables que no se degraden durante el tiempo de implantación, o que no estén sujetos a una degradación (corrosión) severa bajo la influencia de una corriente eléctrica, son normalmente los elegidos. Tales metales incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el platino, las aleaciones de platino-iridio, con estaño o titanio, las aleaciones de níquel-cobalto-cromo, las aleaciones a base de cobalto, las aleaciones de molibdeno, las aleaciones de níquel-titanio. Los hilos no necesitan ser metálicos, y pueden ser, por ejemplo, de un material polimérico tal como PET, polipropileno, PEEK, HDPE, polisulfona, acetilo, PTFE, FEP, y poliuretano, sin excluir ninguna otra sustancia (otras variantes: politetrafluoretileno, etileno propileno fluorinado, copolímero de politetrafluoretileno-perfluoroalquil vinil éter, cloruro de polivinilo, polipropileno, tereftalato de polietileno, fluoruro en sentido amplio, y otros plásticos biocompatibles). También, un material biodegradable o bioabsorbible, tal como los homopolímeros, por ejemplo la poli-paradioxanona, la polilisina o el ácido poliglicólico, y los copolímeros, por ejemplo el ácido poliláctico y los ácidos poliglicólicos, el poliuretano u otros biomateriales, pueden ser utilizados, ya sea solos o en combinación con otros materiales, como material para el dilatador estenótico. Dichos hilos monofilamento están comprendidos en la gama de 0,051 a 0,381 mm (0,002 a 0,015 pulgadas) de diámetro, pero por supuesto, el diámetro puede variar dependiendo del tamaño del lumen y del grado de soporte que se necesite. A los dilatadores estenóticos se pueden fijar también agentes anti-trombóticos, anti-plaquetas, vasodilatadores, anti-proliferantes, anti-migratorios, anti-fibróticos, anti-inflamatorios, y de manera más específica, heparina, hirudina, hirulog, etritinato, frescolina y similares. Ejemplos de dilatadores estenóticos utilizados clínicamente, se encuentran descritos en los documentos 4.733.665, 4.800.882 y 4.886.062.

Los injertos dilatadores, también llamados dilatadores estenóticos recubiertos, para implantaciones trans-luminales, incluyen un armazón en celosía entrelazada tubular elástico, de monofilamentos metálicos o poliméricos, un manguito tramado tubular formado por una pluralidad de hilos textiles inter-tejidos, y un componente de fijación que fija el armazón de celosía y el manguito conjuntamente, en la alineación axial seleccionada de cada uno con el otro, enganchados cada uno con el otro, y con uno de entre el armazón en celosía y el manguito elegido para circundar al otro, con los que el armazón en celosía soporta estructuralmente al manguito. Esto asegura que la celosía y el manguito se comportan de acuerdo con sustancialmente la misma relación que gobierna la cantidad de reducción radial que acompaña a una elongación axial dada. El manguito puede ser exterior o interior a la celosía, o la celosía puede estar integrada en el manguito, y puede ser continua o discontinua. Se ha sugerido la construcción de diversas prótesis para estructuras trenzadas compuestas que combinan diferentes tipos de hilos, por ejemplo hilos multifilamento, monofilamentos, fusibles, materiales y colágenos. Se han encontrado ejemplos en el documento WO 91/10766. Los hilos textiles son, con preferencia, hilos multifilamento, incluso aunque podrían ser monofilamentos. En cualquier caso, las hilos textiles son mucho más finos que los hilos estructurales, estando comprendidos en la gama de 10 a 400 denier. Los filamentos individuales de los hilos multifilamento pueden estar comprendidos en la gama de alrededor de 0,25 a alrededor de 10 denier. Los hilos multifilamento pueden estar compuestos por diversos materiales, tales como PET, polipropileno, polietileno, poliuretano, HDPE, silicona, PTFE, poliolefinas y ePTFE. Modificando los hilos, resulta posible modificar las calidades del manguito, por ejemplo los filamentos planos sin retorcer proporcionan paredes más delgadas, intersticios más pequeños entre los hilos, consiguiendo así una permeabilidad menor, y una porosidad en sección transversal de hilo más elevada para el crecimiento de trans-injerto capilar. La película porosa de PTFE expandido posee una microestructura de nodos interconectados por medio de fibrillas, y puede realizarse según enseñan, por ejemplo, las Patentes U.S. núms. 3.953.566, 4.187.390 y 4.482.516. Pueden existir poros adecuados en forma de pequeños canales o pasos que comienzan en una superficie externa y que se extienden a través del biometal. En esos casos, las dimensiones en sección transversal de los poros son mayores que el diámetro de un capilar de 5 micras, y son típicamente menores de 1 mm. El valor superior del tamaño de poro no es crítico, siempre que el biometal conserve rigidez suficiente; sin embargo, es improbable que los dispositivos útiles tengan un tamaño de poro superior a alrededor de 1 mm. Tales dimensiones de poro pueden ser cuantificadas con el microscopio. Como comprenderán los expertos en la materia, se pueden realizar diversas modificaciones de las superficies y los materiales del injerto dilatador, tales como un recubrimiento previo con proteínas, plasma sanguíneo sin heparinizar por completo y rico en plaquetas, modificaciones de descarga de luminosidad de las superficies, gel plurónico de adición, fibronectina, pegamento de fibrina, moléculas de adhesión, enlace covalente, cargas superficiales influenciadoras con, por ejemplo, carbono (documentos 5.827.327, 4.164.045), tratamiento con un agente surfactante o de limpieza, cambiar mecánicamente las características, tal como adición de ranuras, y cambiar los ángulos extremos, sin excluir ningún otro método. También, el implante puede ser construido como un híbrido de diferentes distancias internodales en la superficie interior y exterior, tal como 60 micras en el exterior y 20 micras en el interior como distancia internodal (HYBRID PTFE). Incluso se pueden utilizar más capas con diferentes distancias internodales. Está previsto que las mismas caigan dentro del alcance de la presente invención cuando no presenten inhibición de endotelialización. Las fibrillas pueden estar orientadas uni-axialmente, es decir, orientadas principalmente en una dirección, u orientadas multi-axialmente, es decir, orientadas según más de una dirección. El término expandido se utiliza aquí para referirse a PTFE expandido poroso. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier material con biocompatibilidad y porosidad que permita el crecimiento trans-injerto, será aceptable. Ejemplos de injertos dilatadores utilizados clínicamente, se encuentran descritos en los documentos 5.957.974, 5.928.279, 5.925.075 y 5.916.264.

También, los materiales xenogénicos, alogénicos o autólogos que se producen de forma natural, tales como las arterias, venas y la submucosa intestinal, pueden ser utilizados en injertos dilatadores, tal como una vena umbilical, una vena safena, o arteria bovina natural. Los implantes potenciales vasculares biodegradables, pueden ser utilizados como injertos dilatadores en relación con las composiciones, los dispositivos y los métodos de esta invención, por ejemplo el ácido poliláctico biodegradable y químicamente definido, las matrices de proteínas purificadas, y las composiciones de matriz extracelular semi-purificadas. Los injertos dilatadores y los injertos vasculares apropiados, suministrarán la composición génica y también proporcionarán una superficie para el crecimiento de nuevo endotelio, es decir, actuarán como andamiaje in situ a través del cual pueden migrar las células endoteliales. El diseño particular de los implantes que utilizan los métodos y composiciones de la invención, no son importantes, siempre que actúen como andamiajes a través de los cuales pueda migrar el endotelio, en el contexto de las realizaciones in vivo, y den lugar finamente a la endotelialización del implante.

Una diversidad de sistemas de catéter resultan útiles para el suministro de dilatadores estenóticos intervencionales y de injertos dilatadores en el lugar deseado. El tipo elegido no es importante mientras se utilicen los métodos de la presente invención.

Las válvulas cardíacas son bien conocidas en el estado de la técnica, y operan hemodinámicamente como resultado de la acción de bombeo del corazón. En general, existe un cuerpo anular que tiene una superficie interior, la cual define un paso para el flujo sanguíneo, y la cual tiene uno o múltiples oclusores que soportan el mismo, para bloquear alternativamente, y permitir después, el flujo sanguíneo en una dirección predeterminada. Las prótesis de válvula cardíaca son de diversos diseños diferentes, y de material autólogo, alogénico, xenogénico o sintético. El alojamiento anular de válvula mecánica, llamado también cuerpo anular, y los miembros de válvula, pueden estar hechos de cualquier material biocompatible y no trombogénico, que absorba también el desgaste a que se encuentran sometidos aquellos. Existen varios diseños diferentes, tal como un alojamiento de válvula y un miembro de válvula circulares, tal como un miembro esférico o bola, un disco de pivotamiento, y miembros de hoja, tales como construcciones de hoja simple o múltiple, por ejemplo dos hojas planas, hojas con superficies cónicas, semi- cónicas y cilíndricas. El anillo del orificio puede estar hecho con diversos materiales, tal como con una superficie recubierta de policarbono, una superficie recubierta con plata o con carbón pirolítico sólido (documento 4.443.894), y las hojas pueden estar hechas con un substrato, tal como de grafito policristalino, plástico, metal o cualquier otro material rígido, y recubierto después con otro, tal como carbón pirolítico (por ejemplo, documentos 3.546.711 y 3.579.645). El alojamiento de válvula circular puede ser poroso (citado aquí como poseedor de una superficie porosa y una red de poros intersticiales interconectados por debajo de la superficie en comunicación de flujo de fluido con los poros, véase el documento 4.936.317), o no poroso,y medios adecuados, tales como una ranura periférica o un par de cortes planos, pueden ser proporcionados a efectos de sujetar un anillo de sutura al cuerpo anular para facilitar el cosido o la suturación de la válvula cardíaca al tejido del corazón. El miembro suturador puede tener un miembro anular rígido o un manguito que circunde la base. El manguito puede ser de un material rígido, tal como un metal, de plástico o similar. El manguito puede tener collares de tejido, tal como de Teflón o Dacrón (RE 31.400). La válvula puede tener miembros adicionales, tales como una miembro de amortiguación y un miembro de absorción de choque. Ejemplos de válvulas cardíacas mecánicas se encuentran descritos en los documentos 3.546.711, 4.011.601, 4.425.670, 3.824.629, 4.725.275, 4.078.268, 4.159.543, 4.535.484. 4692.165, 5.035.709 y 5.037.434.

Los xeno-injertos, alo-injertos y auto-injertos, son válvulas tisulares. Cuando se utiliza un injerto autólogo, se acciona normalmente la válvula pulmonar hasta la posición aórtica, una operación de Ross. Los alo-injertos, también llamados homo-injertos, son de origen cadavérico. Las válvulas cardíacas bioprotésicas de xeno-injerto, son de origen porcino. Pueden ser dilatadas o no dilatadas. Las válvulas dilatadas tradicionales pueden estar diseñadas de modo que tengan un elemento valvular, un conjunto dilatador y un anillo de sutura. El dilatador puede estar recubierto de tela. Todos los materiales dilatadores conocidos pueden ser utilizados en el dilatador estenótico, incluyendo aunque sin limitación alguna, el titanio, Delrin, poliacetal, polipropileno, y Elgiloy. Según conocen los expertos en la materia, existen varias formas de manipular válvulas tisulares. Por ejemplo, una bioprótesis puede hacerse de forma acelular (Wilson, Ann Thorac Surg, 1965; 60 (2 supl): S353-8), o conservada de diversas formas, tal como con glutaraldehído, glicerol (Hoffman), fotooxidación mediata con tinte (Schoen, J Heart Valve Dis, 1998; 7(2): 174-9), y si se conserva con glutaraldehído, el glutaraldehído puede ser neutralizado mediante amino-reactivos (por ejemplo, documento 4.405.327). Los homo-injertos pueden ser desendotelializados. Ejemplos de válvulas cardíacas tisulares se encuentran descritas en los documentos 3.755.823, 4.441.216, 4.172.295, 4.192.020, 4.106.129, 4.501.030 y 4.648.881. También existe una extensa literatura científica sobre la materia. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier material o tejido con biocompatibilidad que permita crecimiento endotelial, podrá ser aceptable. Los genes pueden ser fijados a las prótesis valvulares cardíacas por medio de diversos métodos, pero el método no es importante siempre que el gen sea captado por el tejido circundante, y se produzcan los factores angiogénicos y se estimule la angiogénesis, lo que da como resultado la endotelialización del anillo del orificio y/o la superficie de la membrana valvular. Los ácidos nucleicos o una composición que comprenda ácidos nucleicos, puede ser fijada a la totalidad o a parte de las válvulas cardíacas. Con preferencia, en las válvulas tisulares, los ácidos nucleicos se fijarán a la superficie completa y al conjunto dilatador, y en las válvulas mecánicas al cuerpo anular y al anillo de cosido.

Los implantes tisulares pueden hacerse con diversos materiales, tales como polietileno, polipropileno, politetrafluoretileno (PTFE), acetato de celulosa, nitrato de celulosa, policarbonato, poliéster, nylon, polisulfona, ésteres de celulosa mezclados, difluoruro de polivinilideno, silicona, colágeno y poliacrilonitrilo. Los materiales de soporte preferidos para la ingeniería tisular, son los polímeros sintéticos, incluyendo los oligómeros, homopolímeros, y copolímeros resultantes de polimerizaciones de adición o de condensación. Ejemplos de implantes tisulares se encuentran descritos, por ejemplo, en los documentos 5.314.471, 5.882.354, 5.874.099, 5.776.747 y 5.855.613. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier material con biocompatibilidad que permita el crecimiento endotelial y/o la capilarización, puede ser aceptable. Los genes pueden ser fijados al implante con varios métodos, pero el método no es importante siempre que el gen sea captado por el tejido circundante y se produzcan factores angiogénicos y se estimule la angiogénesis que dé como resultado la endotelialización y/o la capilarización del implante.

Los antecedentes de dispositivos anastomóticos, también llamados conectores de injerto, se encuentran bien descritos en los documentos 5.904.697 y 5.868.763. En general, los dispositivos anastomóticos se emplean, ya sea en anastomosis de extremo-con- extremo, o ya sea en anastomosis de extremo-con-lado. Esta invención comprende los dispositivos anastomóticos de extremo-con-lado, preferentemente aquellos dispositivos anastomóticos que tienen un miembro de anclaje que se implanta intraluminalmente en el vaso objetivo y se expone a la sangre, tal como el SOLEM Graft-Connector®. El término "miembro de anclaje" se refiere aquí al miembro que forma la fijación con el vaso objetivo. El término "miembro de acoplamiento" o "miembro de conexión" se refiere aquí al miembro que forma sujeción con el vaso de injerto del desvío (bypass). El miembro de anclaje y el miembro de acoplamiento, pueden formar una sola unidad o estar separados, siendo conectados durante el procedimiento. Los miembros adicionales tales como un mango y pernos, pueden estar también comprendidos. El miembro de anclaje intraluminal puede ser de diversos diseños, consistiendo con preferencia en una estructura tubular. El miembro de anclaje intraluminal puede estar hecho de cualquier material biocompatible, tal como metal, cerámica, plástico, polímero, PTFE, DACRÓN, PET, polipropileno, polietileno, poliuretano, HOPE, silicona, poliolefinas y ePTFE o combinación de diversas estructuras. También, un material biodegradable o bioabsorbible, tal como los homopolímeros, por ejemplo la poli- paradioxanona, la polilisina o el ácido poliglicólico, y los copolímeros, por ejemplo el ácido poliláctico y los ácidos poliglicólicos u otros biomateriales, pueden ser utilizados, ya sea solos o ya sea en combinación con otros materiales. El dispositivo anastomótico puede ser poroso, o no poroso. Con preferencia, el miembro de conexión es no poroso, y el miembro de anclaje es poroso. Alternativamente, tanto el miembro de conexión como el miembro de anclaje, son porosos. Si es poroso, las dimensiones en sección transversal del diámetro capilar del poro son mayores de 5 micras y típicamente menores de 1 mm. El valor superior de tamaño de poro no es crítico mientras el biomaterial conserve rigidez suficiente, aunque sin embargo es improbable que los dispositivos útiles tengan un tamaño de poro mayor de alrededor de 1 mm. Tales dimensiones de poro pueden ser cuantificadas con el microscopio. Pueden existir poros adecuados en forma de canales o pasos que comienzan en la superficie externa y que se extienden a través del biometal. Según comprenderán los expertos en la materia, se pueden realizar diversas modificaciones de las superficies y los materiales de diseño de conector de injerto, tal como un recubrimiento previo con proteínas, plasma sanguíneo no heparinizado completamente y rico en plaquetas, modificaciones de descarga de luminosidad de las superficies, gel plurónico de adición, pegamento de fibrina, moléculas de adhesión, enlace covalente, cargas superficiales influenciadoras con, por ejemplo, carbono (documentos 5.827.327 y 4.164.045), tratamiento con un agente surfactante o de limpieza, cambiar mecánicamente las características superficiales, tal como con la adición de ranuras, y cambiar los ángulos extremos, sin excluir otros métodos. También el implante puede ser reconstruido como híbrido de diferentes distancias internodales en la superficie interior y en la exterior, tal con 60 micras por el exterior y 20 micras por el interior como distancia internodal (tal como HYBRID PTFE). Incluso se pueden utilizar más capas con diferentes distancias internodales. Todos ellos está previsto que caigan dentro del alcance de la presente invención cuando no inhiben la endotelialización. Los genes pueden fijarse al implante mediante varios métodos, pero el método no es importante mientras el gen sea captado por el tejido circundante y se estimule la angiogénesis que dé como resultado la endotelialización y/o la capilarización del implante. Los conectores de injerto apropiados proporcionarán la composición geniosa y también proporcionarán una superficie para el crecimiento de nuevo endotelio, es decir, actuarán como un andamiaje in situ, a través del cual pueden migrar las células endoteliales. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier material con biocompatibilidad, rigidez y porosidad que permitan el crecimiento trans- injerto, puede ser aceptable.

Los cables para marcapasos son bien conocidos en la técnica, y pueden ser porosos (documento 4.936.317), o no porosos. Los cables para marcapasos están hechos normalmente de metal o de aleaciones metálicas, tal como aleaciones de cobalto o de titanio. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier material con biocompatibilidad que permita el crecimiento endotelial, puede ser aceptable. Los genes pueden ser fijados a los cables para marcapasos mediante cualquier método. Después de que el gen ha sido captado por el tejido circundante, se producen factores angiogénicos, y se estimula la angiogénesis que da como resultado la endotelialización del implante.

Los catéteres vasculares son bien conocidos en la técnica. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier material con biocompatibilidad que permita un crecimiento endotelial, podrá ser aceptable. Los genes pueden ser fijados al catéter vascular por medio de cualquier método incluido en esta descripción. Una vez que el gen ha sido captado por el tejido circundante, se producen factores angiogénicos, y se estimula la angiogénesis que da como resultado la endotelialización del implante.

Los materiales de sutura son bien conocidos en la técnica. Con "filamento" se designa aquí una estructura flexible simple, delgada, larga, de un material absorbible o no absorbible. Puede ser continuo o de fibra. Con filamento "absorbible" se hace referencia aquí a uno que se absorbe, es decir, se digiere o disuelve, en el tejido del mamífero. Las suturas pueden ser monofilamento, es decir, hilos de filamento único o multifilamento, es decir, varios hilos en una construcción trenzada, retorcida, u otra construcción multifilamento, y están hechos de una amplia variedad de materiales, ya sean naturales, tal como metal, seda, lino, algodón y catgut (tripa de gato), o ya sean sintéticos, tal como nylon, polipropileno, polietileno, poliuretano, poliláctido, poliglicólido, copolímeros de láctido y glicólido. Las suturas pueden ser porosas (documentos 4.905.367, 4.281.669), o no porosas, y pueden estar recubiertas con varios materiales que están descritos, por ejemplo, en los documentos 4.185.637, 4.649.920, 4.201.216, 4.983.180 y 4.711.241, o no recubiertas. Los ácidos nucleicos pueden ser fijados a cualquier material de sutura para promover la endotelialización de las suturas. La fijación de los ácidos nucleicos resulta particularmente útil con las suturas vasculares sintéticas no absorbibles. Si la sutura multifilamento ha de ser recubierta, no es necesario que cada filamento del interior de la sutura sea recubierto individualmente o completamente. Los tamaños de los materiales de sutura están normalmente comprendidos en la gama de 12-0 U.S.P., tamaño de 0,001 mm, hasta 2 U.S.P. con diámetro externo de 0,599 mm. Los materiales de sutura pueden ser con o sin aguja en uno o ambos extremos, y la aguja puede ser fijada al material de sutura por medio de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, tal como definiendo un orificio ciego, es decir, un rebaje cilíndrico, que se extienda desde una cara extrema proximal de la aguja de sutura a lo largo del eje de la misma. La longitud de la porción de montaje de sutura es, por lo general, igual a, o ligeramente mayor que, la longitud del orificio. Una sutura se inserta en el orificio y a continuación se corruga la porción de montaje de sutura, es decir, se deforma o se comprime, para mantener la sutura. Alternativamente, la sutura puede ser asegurada mediante la adición de material de cemento a dicho orificio ciego (por ejemplo, documento 1.558.037). También se pueden utilizar agentes adhesivos y de enlace, tal como en los documentos 2.928.395, 3.394.704. También pueden emplearse otras modificaciones, tal como en los documentos 4.910.377, 4.901.722, 4.890.614, 4.805.292 y 5.102.418. La propia aguja quirúrgica puede estar hecha con diversos materiales, tal como acero inoxidable médicamente aceptable con el diámetro requerido. La fijación de sutura a la aguja puede ser estándar, es decir, la sutura se sujeta de forma segura y se pretende que no se separe de la misma, salvo mediante corte o tratamiento severo de la sutura, o que sea separable o liberable, es decir, separable en respuesta a una fuerza ejercida por el cirujano (documentos 3.890.975, 3.980.177, 5.102.418). La agujas quirúrgicas pueden ser de diversas formas, tales como de 1/4 de círculo, 3/8 de círculo, 1/2 curva, 1/2 círculo, 5/8 de círculo, o recta, y el punto distal de la aguja puede ser una punta aguzada, un corte aguzado, un corte inverso, una punta de precisión, de tipo espátula, y similar. La cantidad de ácido nucleico fijado al material de sutura o a la composición que recubre la sutura, variará dependiendo de la construcción de la fibra, por ejemplo el número de filamentos y la hermeticidad o retorcimiento del trenzado y la co-posición de la composición el sólido o la solución que se aplique. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier material con biocompatibilidad que permita la angiogénesis, podrá ser aceptable. Los genes pueden fijarse a las suturas mediante cualquiera de los métodos que se describen en la presente descripción, o mediante cualquier otro método si así se prefiere. Una vez que el gen ha sido captado por el tejido circundante, se producen factores y se estimula la angiogénesis dando como resultado la endotelialización de la superficie de material de sutura.

Los tapones quirúrgicos son bien conocidos en la técnica. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier material con biocompatibilidad que permita el crecimiento endotelial, podrá ser aceptable. Se pueden fijar genes a los tapones quirúrgicos mediante cualquier método incluido en esta descripción, o mediante cualquier otro método. Una vez que el gen ha sido captado por el tejido circundante, se producen los factores angiogénicos y se estimula la angiogénesis que da como resultado la endotelialización del implante.

Las características físicas y químicas, tales como, por ejemplo, biocompatibilidad, biodegradabilidad, resistencia, rigidez, porosidad, propiedades de interfaz, durabilidad e incluso la apariencia cosmética, pueden ser considerados durante la elección de dicho implante vascular o tisular, como conocen bien los expertos en la materia. También, un aspecto importante de la presente invención consiste en su uso en relación con otros implantes que tengan la ventaja de las vascularización de la interfaz con los tejidos, incluyendo los propios implantes y las partes funcionales del implante, tal como las cámaras tisulares, los cables para marcapasos, los catéteres vasculares residentes para su uso durante un tiempo prolongado, y similares. La superficie puede estar recubierta de poros rellenos de un material que tenga afinidad por los ácidos nucleicos, y después la superficie recubierta puede ser revestida adicionalmente con el gen o ácido nucleico que se desee transferir. Los grupos químicos disponibles del adsorbente, puede ser fácilmente controlada para controlar su afinidad por los ácidos nucleicos, como conocen bien los expertos en la materia.

Métodos - Construcción de plásmidos de expresión para VEGF 165, FGF-2 Y FGF-5, y prueba funcional de proteínas expresadas Plásmidos de expresión Plásmido de expresión VEGF-165

El cADN de VEGF_{165} humano (accesión Medline #M32977) fue amplificado en PCR con cADN patrón preparado a partir de ARN asilado de células HEK293. Con el fin de incrementar las transcripciones mARN de VEGF_{165}, las células HEK293 fueron tratadas con 130 \muM de deferoxamina durante 24 h, para imitar un entorno hipóxico. El ARN total fue preparado con la utilización del reactivo Trizol® (Gibco BRL) de acuerdo con las instrucciones de fabricación. Se analizó la integridad del ARN purificado mediante eletroforesis de gel de agarosa al 1%. El ADN complementario fue sintetizado mediante transcripción inversa utilizando el kit Advantage® RT-para-PCR (Clontech) con oligo imprimadores dT.

El cADN de VEGF_{165} fue amplificado utilizando el imprimador de sentido GATCGAATTCGTTA-ACCA-TGAAC- TTTCTGCT-GTCTTGG que contiene un sitio Eco R1, y el imprimador anti-sentido GATCGGATCCGTTAACTCACCGCCTCGGCTTGCTCACATC con un sitio Bam H1 gestionado. La amplificación se realizó con polimerasa Taq ADN Platinum® (Gibco BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los siguientes parámetros de realización de ciclo: 94ºC durante 1 minuto y después 35 ciclos de 94ºC, 30 s; 60ºC, 30 s; 72ºC, 1 minuto. La mezcla de reacción de PCR fue electroforada en un 2% de gel de agarosa a una temperatura de gelificación baja, y el cADN amplificado fue visualizado mediante teñido bromuro de etidio. En el gel se cortó un producto con el tamaño esperado de 606 nucleótidos, y se purificó (kit de extracción de gel QIAquick®, Qiagen).

El producto purificado, y el vector de expresión pNGVL3, fue digerido con una combinación de Eco R1 y Bam H1. El cADN de VEGF_{165} fue a continuación ligado direccionalmente en pNGVL3 (Kit Ligation Express®, Clontech), seguido de transformación de DH5\alpha E. Colli químicamente competente, y de colonias bacterianas seleccionadas sobre placas ágar LB que contenían 30 \mug/ml de kanamicina. Se aislaron colonias bacterianas simples, crecidas en 3 ml de cultivos líquidos y de ADN plásmido purificado (kit QIAprep spin miniprep, Qiagen). La identidad y corrección del producto final pNGVL3-VEGF_{165}, se verificó mediante secuenciamiento de ADN utilizando un secuenciador automático ABI.

Plásmido de expresión FGF-2

El FGF-2 cADN humano (accesión Genbank #NJ04513) fue amplificado en PCR con cADN patrón a partir de células HEK293 preparadas como se ha descrito en lo que antecede para plásmido de expresión VEGF_{165}. La amplificación de PCR se realizó con el imprimador de sentido ATACTCTAGA-ATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTG, que contenía un sitio de restricción Xba1, en combinación con el imprimador anti-sentido GATCAGATCTTCAGCTCTTAGCAGA-CATTGGAAGAAA que contenía un sitio de restricción BgIII. Los parámetros de amplificación fueron según se han descrito en lo que antecede. El producto resultante, con el tamaño de expresión de 488 nucleótidos, se cortó a partir del gel y se purificó (según se ha descrito en lo que antecede), después de lo cual fue digerido con Xba1 y BgIII. El producto digerido por la enzima de restricción estaba ligado direccionalmente al vector de expresión pNGVL7 (que había sido digerido con Xba1 y BamH1), las colonias bacterianas aisladas y la identidad y la corrección de la construcción pNGVL7-FGF-2 resultante verificada por secuenciamiento automático de ADN.

Plásmido de expresión FGF-5

El FGF-5 ADN humano (accesión Genbanck # M 37825) era PCR amplificado con la utilización del imprimador de sentido GATCGAATTCGTTAACGCCGAGCTTGTCCTTCCTCCTCCTC, con un sitio Eco R1, en combinación con el imprimador anti-sentido GATCTCTAGAGTTA- ACTTATCCAAAGCGAAACTTG-AGTCT con un sitio Xba1. El clon H-NM-004464 preparado de expresión GeneStorm® (Invitrogen), fue utilizado como patrón. Los parámetros de ciclo de PCR fueron: 94ºC durante 1 minuto y después 30 ciclos de 94ºC, 30 s; 65ºC, 30 s; 72ºC, 1 minuto. El producto resultante de 842 nucleótidos esperado fue purificado en gel, digerido con Eco R1 y Xba1, y ligado en los sitios de restricción correspondientes en el vector de expresión pNGVL-3. Tras la transformación de DH5\alpha E. coli químicamente competente, se aisló una sola colonia bacteriana y se purificó el ADN. El secuenciamiento automático de ADN del plásmido pNGVL3-FGF-5 resultante, fue llevado a cabo con el fin de confirmar la identidad de la secuencia y la orientación correcta.

Plásmido de control \beta-galactosidasa

El plásmido de expresión pNGVL1-nt-\beta-gal codifica la \beta-galactosidasa objetivada nuclear, y se utiliza como plásmido de control.

Cultivo celular, transfecciones temporales y producción de VEGF_{165}, FGF-2 y FGF-5

Se cultivaron células HEK293T en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco BRL) suplementado con un 10% de FBS (Gibco BRL) sobre plásticos de cultivo de tejido recubiertos de gelatina. Las células fueron cultivadas sobre cubetas de cultivo de 10 cm (6 x 10^{6} células/cubeta) 24 horas antes de la transfección. El ADN del plásmido (4 \mug) fue mezclado con 0,5 ml 2,5 M de Ca_{2}PO_{4} y añadido gota a gota a 0,5 ml se solución salina amortiguada 2X Hepes (HeBSS; 280 mM de NaCl, 50 mM Hepes, 1,5 mM de Na_{2}HPO_{4}), brevemente removido e incubado a temperatura ambiente durante 20 minutos. La solución de ADN fue añadida gota a gota a las células, y las células se incubaron con el ADN durante 4 h después de lo cual las células fueron tratadas con un 10% de glicerol en DMEM durante 2 minutos, lavadas con PBS y alimentadas al medio total. 24 h después de la transfección, el medio fue retirado, las células lavadas dos veces con 5 ml de PBS, después de lo cual se añadieron 5 ml de DMEM libre de suero (sin suplementos). Tras una incubación adicional de 24 h, este medio fue recuperado como "medio acondicionado" y se congeló en lotes para su posterior análisis.

Mancha Western

Una cantidad (50 \mul) de medio acondicionado, fue mezclada con amortiguador de muestra Laemmli, y dispuesta sobre un gel de SDS/PAGE al 12% para separar las proteínas. Cuando se investigó la dimerización de VEGF, no se encontraba incluido ningún agente reductor en el amortiguador de muestra Laemmli. Las proteínas fueron transferidas a continuación a membranas Hybond®-C extra (Amersham Life Science) mediante una mancha semi-seca. El ligante no específico fue bloqueado por membranas de incubación en solución salina amortiguadora Tris (TBS; 20 mM Tris base con pH 7,6, 137 mM NaCl) con 0,1% Tween® 20 y 5% de BSA (TBS/Tween/BSA) a temperatura ambiente durante 1 h, después de los cual se incubaron filtros durante 1 h con anticuerpos primarios específicos (diluidos a 1:500 en TBS/Tween/BSA). El VEGF_{165} fue visualizado con anticuerpo policlonal de conejo (Santa Cruz, cat. núm. SC-152), FGF-2 con un anticuerpo policlonal de cabra (Santa Cruz, cat. núm. sc-79-G), y FGF-5 con un anticuerpo policlonal de cabra (Santa Cruz, cat. núm. sc-1363). Finalmente, se incubaron membranas con anticuerpos secundarios conjugados de peroxidasa de rábanos para caballerías (HRP) (HRP anti-cabra de Sigma cat. núm. A4174 y HRP anti-conejo cat. núm. NA934 de Amersham Life Science en una dilución de 1:5000 en TBS/Tween/BSA) durante 1 h, y las proteínas fueron visualizadas por exposición a películas médicas de rayos X (Fuji) tras la adición de un reactivo de detección de mancha western ECL (Amersham Pharmacia Biotech).

Ensayo de angiogénesis de membrana corioalantoica

Se adquirieron localmente huevos de gallina fertilizados, y se pre-incubaron durante diez días a 38ºC a un 70% de humedad. Una ventana de 1 cm^{2} de la cáscara dejó al descubierto la CAM, y se identificó una zona avascular para aplicación de la muestra. Discos de filtro Whatman (de 5 mm de diámetro), fueron saturados con 3 mg/ml de acetato de cortisona (Sigma) y empapados en medios acondicionados (que contenían VEGF_{165}, FGF-2 o FGF-5) a partir de células HEK293T transfectadas temporalmente. La ventana fue sellada con cinta e incubada durante tres días adicionales. La CAM fue cortada entonces alrededor del filtro y examinada con la utilización de un microscopio luminoso Nikon Eclipse TE 300 (aumento de 2,5 ó 4). La agiogénesis fue clasificada mediante un procedimiento doble en seco para cada embrión, mediante estimación del número de puntos de ramificación de la membrana del disco de filtro. Las clasificaciones estuvieron en una gama desde 1 (baja, fondo) hasta 4 (alta). Cada sustancia fue analizada paralelamente con 5 a 7 embriones. La variación de muestra fue menor del 15%. Se calcularon P valores con ANOVA (análisis de varianza).

Preparación de ADN de plásmido libre de endotoxinas para usos in vivo

El ADN de plásmido utilizado para su aplicación peroperativa in vivo, fue purificado con el Mega Kit EndoFree® Plasmid (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones específicas del fabricante, y finalmente re-suspendido en TE libre de endotoxinas (10 mM Tris pH 8,0, 1mM EDTA). La calidad de las preparaciones de plásmido resultantes, fue comprobada mediante análisis espectrofotométrico en el que la relación A_{260}/A_{280} estuvo entre 1,80 y 1,82. También, se comprobaron las preparaciones mediante digestiones de enzimas de restricción con enzimas de restricción apropiadas, y mediante transfecciones temporales de células HEK293 seguidas de una mancha Western del medio acondicionado.

RT-PCR

El ARN total fue purificado a partir de tejidos congelados con la utilización del reactivo Trizok® (Gibco BRL) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Se analizó la integridad del ARN purificado mediante electroforesis de gel de agarosa al 1%. Se sintetizó ADN complementario mediante transcripción inversa utilizando el kit Advantage® RT-para-PCR (Clontech) con oligo imprimadores dT. El PCR fue llevado a cabo con la utilización del vector derivado del imprimador de sentido CGCGCGCCACCAGACATAATAGCTG basado en la secuencia vectorial 111 bp corriente arriba del sitio de clonación múltiple y del imprimador GCAAGTACGTTCG- TTTAACTCAAGCTG 21 bp antisentido de VEGF_{165} específico humano procedente del extremo carboxiterminal de la secuencia VEGF humana. Los parámetros de amplificación fueron: 94ºC durante 1 minuto y después 35 ciclos de 94ºC, 30 s; 60ºC, 30 s; 72ºC, 1 minuto. Los productos amplificados fueron visualizados mediante luz UV tras su separación sobre un 2% gel de agarosa de baja temperatura de fusión, y su manchado con bromuro de etidio. Se utilizaron imprimadores adecuados para la amplificación de GAPDH, como control positivo. La síntesis de cADN sin adición de RT sirvió para los controles negativos.

Resultados Construcción de plásmido y expresión de VEGF_{165}, FGF-2 y FGF-5

Utilizamos la familia pNGVL de plásmidos de expresión para expresar los diferentes factores de crecimiento. Estos vectores han sido desarrollados a efectos de terapia génica por National Gene Vector Laboratories, The University of Michigan Medical Center, Center for Gene Therapy. VEGF_{165} y FGF-5 contienen secuencias de señal que los dirigen en cuanto a la secreción. Por lo tanto, las secuencias de codificación completas para estos genes, fueron clonadas en PCR y clonadas directamente en el plásmido de expresión pNGVL3. El FGF-2 carece de secuencia de señal y, por lo tanto, la secuencia de codificación para el FGF-2 humano fue clonado en la expresión pNGVL7 en bloque con la secuencia de señal para el activador plasminógeno de tipo de tejido (tPA; proporcionado en el plásmido pNGVL7), para permitir la secreción de FGF-2. Los injertos, y las secuencias vectoriales en proximidad cercana a los injertos, fueron sometidos a secuenciamiento de ADN para verificar que el cADN previsto había sido amplificado, sin errores, y ligado al vector de expresión con la orientación correcta.

La transfección temporal de células HEK293 fue utilizada para mostrar que los plásmidos eran capaces de expresar las proteínas previstas. Tras la transfección, el medio acondicionado libre de suero fue recogido entre 24-48 después de la transfección. Se analizaron cantidades del medio acondicionado mediante mancha western con la utilización de anticuerpos específicos (Figura 1). El medio acondicionado procedente de las células transfectadas con vectores vacíos, sirvió como control negativo. El VEGF_{165} apareció con el tamaño esperado de aproximadamente 21 kDa. Además, existía una proteína más grande detectada (23 kDa) que probablemente refleja VEGF_{165} glicosilado. También, cuando se utilizaron condiciones no reductoras, se observó el dímero esperado de VEGF_{165}. El FGF-2 y el FGF-5 aparecieron como hilos distintos y al tamaño esperado de 17 y 27 kDa, respectivamente.

Prueba funcional de VEGF_{165}, FGF-2 y FGF-5

Se sabe que los factores de crecimiento mencionados en lo que antecede son mitogénicos, quemotácticos, e inducen diferenciación de las células endoteliales. Todos estos procesos son necesarios para la formación de nuevos vasos sanguíneos, angiogénesis, y se ha demostrado previamente que todos ellos inducen angiogénesis. Por lo tanto, para caracterizar mejor estos factores de crecimiento recombinante secretados, empleamos un ensayo de angiogénesis in vivo, el llamado ensayo de membrana de pollo corioalantoico (CAM). La aplicación de medios acondicionados con VEGF_{165}, FGF-2 o FGF-5, inducen todos una respuesta angiogénica incrementada en el ensayo CAM en comparación con el medio acondicionado a partir de células transfectadas con ventor vacío (Figura 2). Estos experimentos mostraron que los factores producidos por los plásmidos de expresión descritos en lo que antecede fueron biológicamente activos ya que los mismos fueron capaces de estimular el proceso complejo de angiogénesis.

RT-PCR para comprobar transferencia génica in vivo

Se utilizó RT-PCR para probar mejor que la codificación VEGF_{165}, FGF-2 y FGF-5 del ADN de plásmido, fueron transcritos tras su aplicación a los tejidos in vivo. El ADN plásmido fue aplicado alrededor de las aortas abdominales y el tejido extirpado 7 días después y congelado rápidamente en nitrógeno líquido. La totalidad del ARN fue preparado a partir de tejidos extirpados y después transcrito a la inversa utilizando oligo imprimación dT. Para los controles negativos, se omitió el RT de la mezcla de reacción. El PCR amplificó un fragmento con tamaño correcto esperado de 666 pb cuando se utilizó pNGVL-165 mientras que el RT-PCR de los tejidos con el plásmido pNGVL-\beta- gal no proporcionó ningún producto (Figura 3). No se observó ninguna amplificación en las muestras de control negativo (Figura 3). La amplificación con la utilización de imprimadores GAPDH dio como resultado un producto del tamaño esperado.

Ejemplo 1 Injertos ePTFE en ratas

Este ejemplo demuestra que la administración de plásmido VEGF en solución acuosa estéril, da como resultado una superficie endotelial sobre un injerto ePTFE.

Métodos Métodos genéticos

La construcción y evaluación de expresión de plásmido que codifica el VEGF 165 se llevó a cabo conforme a métodos previos. Los plásmidos VEGF fueron proporcionados en agua estéril a una concentración de 2 \mug/\mul.

Métodos quirúrgicos

Cuatro ratas Sprague Dawley macho fueron divididas en cuatro grupos para estudiar la endotelialización de injertos de ePTFE sintético. Las cantidades de plásmido de expresión utilizado fueron de 200 \mug (n = 1), 400 \mug (n = 1) y 800 \mug (n = 1), respectivamente. Una rata recibió un injerto sin transferencia génica. El efecto de la transfección de VEGF fue analizado por histología y exploración con microscopio electrónico (SEM) 2 semanas después de la transfección.

Se indujo anestesia mediante una inyección intraperitoneal de 1 ml de una mezcla que contenía 1,25 mg/ml de midazolam, 2,5 mg/ml de fluasinona, y 0,079 mg/ml de citrato de fentanilo. Además, se proporcionaron 1.m. 25 mg/kg de dihidroestreptomicina y 20 mg/kg de bensilpenicilinprocaína. La rata se colocó de espaldas, se cubrió de forma estéril, se limpió con Klorhexidin, y se afeitó con una máquina. El animal se colocó sobre una almohadilla caliente y el abdomen fue pulverizado con Etanol al 70%. Se realizó la incisión y la aorta fue diseccionada para dejarla libre de la vena cava. Se dejó al descubierto a partir de las arterias renales hasta la bifurcación. Parte de la aorta, incluyendo la salida de las ramas lumbares, fue ligada proximal y distalmente. La aorta fue prensada proximal y distalmente, y se realizó una aortotomía entre las zonas prensadas y las ligaduras con el fin de acomodar un injerto de 2 cm. Los fragmentos de aorta fueron limpiados con solución salina, dilatados suavemente con pinzas, y el injerto aórtico (20 mm x 2 mm) fue suturado extremo-con-extremo con 9-0 suturas microfilamento no reabsorbibles. El injerto utilizado era un injerto poroso de ePTFE con una distancia internodal de 60 micras (Impra, Tucson, USA) y fabricado de acuerdo con ILN 150, pp 44-46. La solución génica fue administrada al injerto con una pipeta. Después de esperar 3 minutos, el abdomen fue cerrado con fascia de primeras capas con recorrido 3-0, y después la piel con recorrido 3-0. Se utilizaron guantes sin almidón durante la cirugía. El animal fue retirado al área de recuperación con una almohadilla de calentamiento.

Sacrificio

Se sacrificaron animales en el día 14 (n = 4), y se recogió el injerto aórtico con la aorta sujeta. Tras anestesia con fentanil/fluanisona y midazolam como en lo que antecede, y 500 unidades de heparina en la vena penil, se dejó al descubierto la aorta abdominal y se efectuó la esternotomía. Se proporcionó perfusión PBS a 120 mm de Hg al ventrículo izquierdo mediante una aguja de amplio orificio, mientras que el animal era desangrado simultáneamente mediante la incisión en el atrio derecho. Una vez que la sangre se aclaró, el animal se fijó por perfusión in situ durante 10 minutos a 120 mm Hg con un 2% de paraformaldehído y 0,2% de glutaraldehído en PBS. El injerto fue diseccionado y extirpado con 1-2 cm de vasos naturales y circundando al tejido graso. Se cortó longitudinalmente y se dividió en cinco partes. La parte A se conservó en 2% de paraformaldehído/0,2% de glutaraldehído para su histología, la parte B en 4% de formaldehído para el microscopio luminoso e inmunohistoquímica, la parte C en 2% de paraformaldehído/2% de glutaraldehído en PBS para SEM, la parte D en 2% de paraformaldehído/0,2% de glutaraldehído para histología, y la parte E en 4% de formaldehído para el microscopio luminoso e inmunohistoquímica.

Análisis de injerto

Las partes C de los injertos fueron analizadas con SEM, con el fin de identificar la celularidad de la superficie, y para asegurar que la celularidad se había originado a partir de crecimiento de trans-injerto. La microscopía luminosa se realizó en la parte B después del manchado inmunohistoquímico para medir la cobertura celular endotelial de la superficie interna del injerto y estimar el desarrollo de nuevos capilares.

Resultados Endotelialización y vascularización

La microscopía luminosa realizada después del inmuno-manchado con anticuerpo de factor VIII mostró un teñido incrementado para FVIII en el tejido circundante de los injertos tratados con VEGF en comparación con el injerto de control. También, se observó la endotelialización casi completa del lumen interno del injerto entre los injertos tratados con VEGF, mientras que no se observó ninguna endotelialización de los injertos de control. Existió un incremento dependiente de la dosis en el manchado FVIII del tejido circundante. En el injerto de control faltó el endotelio en el lumen interno del injerto. Se demostró al menos una endotelialización parcial en todos los injertos tratados con VEGF. El SEM describió que el 67% de las arterias tratadas de VEGF tenían cobertura celular endotelial en la parte C, mientras que en los injertos de control no se pudo mostrar ninguna cobertura endotelial.

Expresión génica

La expresión génica se evaluó mediante hibridación in situ, y no demostró ninguna expresión de VEGF humano en el injerto de control mientras que se vio una fuerte expresión en las células endoteliales luminales de los tres injertos tratados con VEGF, y se observó una débil expresión en un injerto tratado.

Ejemplo 2 Injerto de ePTFE en ratas

Este ejemplo demuestra que la administración de plásmido de VEGF en solución acuosa estéril, proporciona una endotelialización más rápida y más completa de un injerto de ePTFE.

Métodos Métodos genéticos

Los métodos genéticos fueron similares a la descripción del ejemplo anterior. Los plásmidos fueron proporcionados en agua estéril. Las cantidades fueron: LacZ 100 \mug (2,5 \mug/ml o 2,7 \mug/ml), VEGF 100 \mug (2 \mug/\mul o 2,7 \mug/ml), VEGF 400 \mug (2 \mug/\mul o 2,4 \mug/ml) y VEGF 800 \mug (2,3 \mug/ml).

Métodos quirúrgicos

37 ratas fueron divididas en cuatro grupos para el estudio de la endotelialización de injertos vasculares sintéticos. 23 ratas se sometieron a una sustitución de la aorta intra-renal y a transfección con un plásmido de expresión que codifica el h-VEGF 165. Las cantidades de plásmido utilizadas fueron: 100 \mug (n = 7) y 800 \mug de h-VEGF 165 (n = 4). Se utilizaron 14 ratas como controles y recibieron el injerto con 100 \mug de \beta-gal-(LacZ) (n = 9), o bien sin transferencia de gen (n = 5). El análisis de los injertos y del tejido circundante con histología y SEM se realizó en 1 semana (día 7-8), 2 semanas (días 14-15) (n = 17) y 4 semanas (días 28-31) (n = 13). Los animales fueron preparados para la cirugía y operados según se ha descrito en el ejemplo 1.

Sacrificio

El procedimiento de sacrificio se realizó según se ha descrito en el ejemplo 1. El injerto se cortó longitudinalmente, se fotografió, y se dividió en dos partes. A continuación, la mitad distal se dividió adicionalmente en dos partes. La parte A se conservó en 2% de paraformaldehído/2% de glutaraldehído para SEM, y la parte B en 4% de formaldehído para microscopía luminosa e inmunohistoquímica, y la parte C en 2% de formaldehído/0,2% de glutaraldehído en PBS para microscopía luminosa.

Análisis de injerto

El análisis planimétrico, el SEM y la inmunohistoquímica fueron utilizados para determinar la endotelialización de la superficie luminal del injerto. El microscopio electrónico pudo distinguir entre migración celular longitudinal desde la anastomosis, y migración transmural.

Resultados Endotelialización

El análisis planimétrico, realizado con azul de Evans, mostró un 89% de cobertura endotelial entre los injertos tratados con VEGF en cuatro semanas, mientras que solamente una media del 44% de la superficie luminal estaba endotelializada en los injertos de control a las cuatro semanas.

El SEM describió hallazgos similares. En una semana, ninguno de los injertos tenía cobertura endotelial del área media del injerto. A las 2 semanas, el 55% de los injertos tratados con VEGF fueron cubiertos por superficie endotelial en el área media de injerto, mientras que solamente el 17% de los injertos de control fueron cubiertos en el área media de injerto por endotelio. De manera similar, a las cuatro semanas el 88% de los injertos tratados de VEGF estaban endotelializados y el 17% de los controles mostraron superficie endotelial en el área media de injerto. También, el crecimiento de transinjerto fue visualizado en el área media de injerto del grupo VEGF.

La microscopía luminosa, tras el inmunomanchado de la parte B, mostró una endotelialización completa en el 50% de los injertos tratados con VEGF (400 \mug) a las cuatro semanas, mientras que la endotelialización se mantuvo incompleta en todos los injertos de control a las cuatro semanas. También, todos los injertos tratados de VEGF tenían una superficie endotelial mayor que la mitad de la superficie luminal. En total, el 25% de los injertos tratados con VEGF mostraron una endotelialización completa en cuatro semanas, mientras que ninguno de los injertos de control mostró endotelialización completa en ese momento. La endotelialización dependió de la dosis de VEGF. Ninguno de los injertos de control mostró endotelialización completa, y solamente el 40% de los injertos de control mostró una cobertura endotelial mayor que la mitad de la superficie a las cuatro semanas.

Ejemplo 3 Injerto de ePTFE en ratas

Este ejemplo demuestra que la administración simultánea de plásmidos FGF-2 y FGF-2 desprotegidos, proporciona una endotelialización más rápida de un injerto de ePTFE.

Métodos Métodos genéticos

Los métodos según se ha descrito anteriormente, fueron utilizados para el FGF-2 y el FGF-5. Se proporcionaron 5.500 \mug de plásmido de expresión FGF-2 y 500 \mug de plásmido de expresión FGF-5 en agua estéril, a una concentración de 2 \mug/\mul. El FGF-2 fue administrado con una pipeta en primer lugar, y a continuación el FGF- 5.

Métodos quirúrgicos

6 ratas Sprague Dawley macho fueron divididas en tres momentos temporales y comparadas con los mismos controles que los utilizados en el ejemplo 2 para estudiar la endotelialización de los mismos injertos PTFE. El número de controles fue de n = 3 en 1 semana, n = 6 en 2 semanas, y n = 5 en 4 semanas. Se sometieron 6 ratas a sustitución de aorta infra-renal y co-transfección con FGF-2 & FGF-5 con dosis de 500 \mug & 500 \mug, respectivamente. Las consecuencias histológicas de la transfección de FGF-2 & FGF-5 fueron estudiadas en 1 semana (n = 2), 2 semanas (n = 3) y 4 semanas (n = 1). La cirugía, el sacrificio, la conservación de injerto y el análisis se llevaron a cabo según se ha descrito en los ejemplos que anteceden.

Resultados Endotelialización

El análisis planimétrico realizado con azul de Evans mostró un 92% de cobertura endotelial en el injerto tratado con FGF a las cuatro semanas, mientras que la endotelialización de los injertos de control estuvo en un valor medio del 44% del área superficial a las cuatro semanas. El SEM de la parte A mostró una endotelialización completa en el área media de injerto entre los injertos tratados con FGF en una semana, mientras que ninguno de los injertos de control tenía ninguna superficie endotelial completa en el área media de injerto en el mismo tiempo. En los injertos tratados con FGF, la endotelialización del área media de injerto era del 100% a las dos semanas, mientras que el 17% de los injertos de control mostró endotelialización del área media de injerto en 2 semanas. De forma similar, a las cuatro semanas el 100% del injerto tratado con FGF estaba endotelializado, y el 20% de los controles mostraron superficie endotelial en el área media de injerto. El crecimiento transinjerto fue visualizado en los injertos tratados con FGF en una, dos y cuatro semanas.

La microscopía luminosa tras el inmunomanchado de la parte B fue en una semana de más del 50% en uno, y una endotelialización completa en el otro injerto tratado con FGF, y en dos semanas el 67% de injertos FGF tenían más del 50% de la superficie cubierta, mientras que ninguno de los injertos de control tenía más del 50% de la superficie interna de injerto cubierta a los 14 días. También, los injertos de control permanecieron endotelializados de forma incompleta a las cuatro semanas, mientras que el injerto tratado con FGF estaba completamente endotelializado en cuatro semanas.

Ejemplo 4 Injerto de ePTFE con pegamento de fibrina en ratas

Este ejemplo demuestra que la administración de plásmido VEGF en pegamento de fibrina proporciona superficie endotelial sobre un injerto de ePTFE.

Métodos Métodos genéticos

Los métodos genéticos fueron similares a los que se han descrito en lo que antecede.

Métodos quirúrgicos

Cuatro ratas fueron divididas en dos grupos para estudiar la endotelialización del injerto de ePTFE sintético. Las ratas se sometieron a sustitución de aorta infra-renal de acuerdo con los ejemplos anteriores, y a transfección con h-VEGF 165 proporcionada a partir de pegamento de fibrina. Dos ratas recibieron el injerto y pegamento con agua estéril sin el plásmido. Las consecuencias histológicas de la transfección de VEGF fueron estudiadas a las 2 semanas. El procedimiento quirúrgico fue realizado según se ha descrito en el ejemplo anterior. Tras la anastomización del injerto, se administró el pegamento con un inyector doble (Duo Mix) sobre el injerto. Se inyectaron 0,6 ml de plásmido de VEGF en agua estéril (2 \mug/\mul) con una jeringa que contenía 0,4 ml de trombina humana comercialmente disponible (Thrombin, Immuno, Austria). La combinación de trombina y de plásmido fue retirada y repartida entre dos jeringas por medio de un grifo de tres vías, para hacer una mezcla uniforme de los dos componentes. Tras la realización de la anastomosis quirúrgica, se administraron 0,1 ml de fibrinógeno (Tisseel, Immuno, Austria) y 0,15 ml de mezcla de trombina - plásmido simultáneamente a través de un aplicador Tisseel Duo Mix sobre el injerto. En el injerto de control, se proporcionó la misma cantidad de agua estéril sin plásmido. El sacrificio y el análisis de los injertos, se realizaron como se ha descrito anteriormente.

Resultados Endotelialización

El SEM de la parte A mostró que en 1 semana, el 50% de los injertos tratados con VEGF estaban cubiertos por células endoteliales en la zona media del injerto, mientras que ninguno de los injertos de control mostró revestimiento celular endotelial.

La microscopía luminosa tras el inmunoteñido de la parte B, mostró una endotelialización casi completa entre el 50% de los injertos VEGF, mientras que ninguno de los injertos del grupo de control tenía más del 50% de la superficie cubierta por endotelio en 1 semana.

Ejemplo 5 Injerto de ePTFE con ácido hialurónico - pegamento de fibrina en ratas

Este ejemplo demuestra que la co-administración de plásmidos de FGF-2 y de VGFE en pegamento de fibrina mezclado con ácido hialurónico, reduce la trombogenicidad de un injerto ePTFE.

Métodos Métodos genéticos y preparación del pegamento

El FGF-2 y el VEGF fueron preparados de acuerdo con los métodos de los ejemplos anteriores. Los plásmidos fueron proporcionados en una composición de pegamento y administrados de acuerdo con la descripción que sigue. Se calentó fibrinógeno humano comercialmente disponible (Tisseel, Immuno, Austria) a 37ºC en agua. Se retiraron 0,7 ml del fibrinógeno y 0,7 ml de ácido hialurónico comercialmente disponible (Healon GV 14 mg/ml, Kabi Pharmacia) en dos jeringas. Se conectó un grifo de tres vías a las jeringas y el fibrinógeno y el ácido hialurónico fueron retirados repartidos entre las jeringas con el fin de obtener una mezcla uniforme. A continuación se extrajeron por separado 0,3 ml de plásmido VEGF en agua estéril (2 \mug/\mul), 0,1 ml de plásmido FGF-2 en agua estéril, y 0,05 ml de heparina (1000 U/ml) con una jeringa, y trombina comercialmente disponible (Immuno, Austria) en otra jeringa. Éstas se conectaron a las salidas de otro grifo. La combinación de trombina y de plásmido fue extraída y repartida mediante un grifo de 3 vías entre las jeringas con el fin de conseguir una mezcla uniforme de los componentes. Una vez que se hubo realizado la anastomosis quirúrgica del injerto, las composiciones de 0,25 ml de ácido hialurónico/ fibrinógeno y 0,25 ml de trombina/plásmido/heparina, fueron administradas al injerto mediante un aplicador Tiessel Duo Mix. Tras la polimerización del pegamento, se completó la polimerización y el procedimiento quirúrgico.

Métodos quirúrgicos

Se dividieron 2 ratas Sprague Dawley macho en dos grupos con el fin de estudiar la endotelialización de los mismos injertos de ePTFE que en los ejemplos anteriores, y se sometieron a sustitución de aorta infra-renal y a co-transfección con h-VEGF 165 y FGF-2 humano proporcionado en una composición de ácido hialurónico - heparina - pegamento de fibrina. Una de las ratas recibió el injerto y pegamento con agua estéril sin plásmido. Las consecuencias histológicas de la co-transfección de VEGF y FGF-2 fueron estudiadas a los 7 días. El procedimiento quirúrgico y el análisis del injerto fueron realizados según se ha descrito en los ejemplos anteriores.

Resultados Endotelialización

La planimetría demostró que el injerto tratado con pegamento-FGF-VEGF estaba cubierto en una semana por células endoteliales hasta un 46%, mientras que el injerto de control estaba cubierto hasta un 3% por endotelio. En el injerto de control existían trombos.

El SEM de la parte A mostró que, en 1 semana, el injerto con VEGF-FGF estaba abierto y tenía superficie de injerto celular, mientras que en el injerto de control existía una importante formación de trombos.

Ejemplo 6 Injerto de ePTFE con mucina de enlace en ratas

En este ejemplo, los plásmidos VEGF fueron unidos al injerto de ePTFE con mucina y dieron como resultado superficie epitelial.

Métodos Purificación de BSM comercial (Sigma M3895)

Se purificó BSM (Sigma M3895) mediante uso secuencial de intercambiador aniónico (Sefarosa Q de Amersham Pharmacia Biotech) y mediante filtración de gel (Sefarosa 6B-CL de Amersham Pharmacia Biotech).

Preparación de PTFE aminado

El PTFE expandido (ePTFE) fue tratado con plasma de acuerdo con lo siguiente: se realizó un tratamiento previsto con O_{2}, 8 cc/min, 14 MHz, 100 W durante 30 s. A continuación se llevó a cabo la aminación con diaminociclohexano (DACH), 18 mTorr, 170 KHz, 10 W durante 2 minutos, y a continuación el injerto fue refrigerado en un desecador hasta su uso.

Unos materiales necesarios para este ejemplo, fueron viales de vidrio de 7,5 ml y 20 ml. También, se utilizaron MiLLQ y TBS de pH 7,4, así como también cabos y paños Wettex cortados en 1 x 1 cm. Como bacteriostato se utilizó un 20% de glucosa y solución madre de PEI filtrada estéril (90 \muM). Se utilizó EtOH al 70% como bacteriostato. El plásmido objetivo (VEGF) y el plásmido de control (\beta-gal) estuvieron a razón de 2 mg/ml en amortiguador TE, pH 8,0.

Los injertos fueron esterilizados en autoclave a 125ºC durante 25 minutos, y después incubados en BSM (mucina salina de bovino), fracción QS1A (alto PM, carga relativa alta) a 2 mg/ml en TBS y pH 7,4. La incubación se realizó con agitador a 200 rpm durante la noche, a 37ºC (17:55 - 9:30, es decir, 15,5 horas).

Los injertos fueron lavados. Se utilizaron tubos Falcon de 10 ml TBS en 50 ml para el lavado secuencial de los injertos, y las líneas de lavado se agruparon en líneas de lavado "Objetivo" y de "Control". Los tubos fueron primero agitados vigorosamente, y después se dejaron reposar durante un minuto. Esto se repitió dos veces (2 etapas de lavado). La incubación de ADN se realizó después de la preparación de ADN de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente y se realizó el sistema para incrementar la transfección: 2 ml de glucosa al 20% + 1 ml de solución madre de PEI + 1 ml de solución de plásmido + 4 ml de MillQ. Los injertos se incubaron en cada solución de incubación de plásmido durante 2 horas con agitador a 200 rpm, a temperatura ambiente. A continuación se realizó un lavado secuencial en 10 ml de MillQ en tubos Falcon de 50 ml. La línea de lavado era separada para las líneas "Objetivo" y de "Control". Agitación vigorosa y 1 minuto de relajación. Esto se repitió dos veces. Después de que los injertos fueron incubados en tubos Falcon de 50 ml con paño Wettex, se añadieron 0,1 ml de MillQ a cada tubo para humedecerlo. El injerto se situó en la zona superior (región de cabecera) del tubo, y se almacenó horizontalmente a 4-8ºC hasta su uso.

Cuatro ratas fueron divididas en dos grupos para el estudio de la endotelialización de un injerto de ePTFE poroso. 3 ratas fueron sometidas a una sustitución de aorta infra-renal y a transfección con h-VEGF 165 extraído del recubrimiento de mucina del injerto. 1 rata recibió el injerto con recubrimiento de mucina, pero sin plásmido. Se estudiaron las consecuencias histológicas y de exploración con microscopio electrónico de las transfección de VEGF a las 2 semanas.

Resultados Endotelialización

El SEM de la parte A mostró que a las 2 semanas el 67% de los injertos tratados con VEGF estaban cubiertos por células endoteliales en el área media de injerto, mientras que el injerto de control no tenía ninguna superficie endotelial en el área media del injerto.

La microscopía luminosa tras el inmunomanchado de la parte B mostró endotelialización en más del 50% del área superficial entre el 67% de los injertos tratados con VEGF a los 14 días, mientras que no se apreció ninguna endotelialización en el injerto de control a los 14 días.

Ejemplo 7 Injerto de ePTFE de conejo

Este ejemplo demuestra que la administración de plásmido VEGF desprotegido en agua estéril sobre un injerto ePTFE, da como resultado una endotelialización más rápida y una relación de patencia más elevada.

Métodos

Se utilizaron conejos de Nueva Zelanda (2,5 - 4 kg) en los experimentos. En éste y en los siguientes experimentos, se dividieron 9 animales en dos grupos con el fin de estudiar la endotelialización del injerto de ePTFE internodal de 60 micras. Se sometieron 5 conejos a sustitución de aorta y a transfección con 600 \mug de h-VEGF 165, y se utilizaron 4 conejos como controles y se sometieron a idéntica sustitución de injerto con transfección de 100 \mug de B-gal(LacZ). Las consecuencias histológicas y al microscopio electrónico de la transfección de \beta-gal/LacZ y de la transfección de VEGF, fueron estudiadas a las 2 semanas (n = 5) y a las 12 semanas (n = 4). La construcción y evaluación de expresión de codificación de plásmido para el VEGF 165, fueron realizadas según lo que se ha descrito en lo que antecede. Los plásmidos fueron suministrados en solución de agua estéril con LacZ (2,5 \mug/\mul; dosis de 100 \mug) y con VEGF (2,5 \mug/\mul; dosis de 600 \mug).

Reconstrucción arterial quirúrgica y transferencia génica

Se añadieron 320 mg de ácido acetilsalicílico a agua potable para proporcionar una dosis ASA diaria estimada de 10 mg/día. El conejo fue anestesiado con una combinación de una mezcla de 0,315 mg/ml de fentanilo/10 mg/ml de fluanosina y de 5 mg/ml de midazolam i.m. Se proporcionaron i.m. 25 mg de dihidroestreptomicina / 20 mg/kg de bensilpenicilinprocaína y se administraron 2,5 mg/ml de bupivacaína intracutáneamente al área herida. Se realizó una incisión en la línea media abdominal. La aorta fue diseccionada libremente respecto a la vena cava. Se identificó y se ligó la última ramificación lumbar de la aorta. La aorta quedó al descubierto en la zona proximal a la bifurcación y se proporcionó dextrano intravenoso (PM 70000 que contenía 60 g/l de dextrano en NaCl fisiológico), durante 15 minutos, seguido de glucosa amortiguada al 2,5% a razón de 100 ml/hora durante la operación. Se administraron 500 U de heparina i.v. en la vena del oído mediante un venflo. Tras 4 minutos de circulación de heparina, la aorta fue pinzada y resecada en las proximidades de la bifurcación para acomodar el injerto de ePTFE de 2 cm de largo y 3 mm de diámetro interno, con una distancia internodal de 60 \mum (Impra, Tempe, AZ, USA), fabricado de acuerdo con ILN 150, pp. 44-46. El injerto fue anastomotizado extremo-con-extremo con suturas de recorrido 7-0. El retroperitoneo y la fascia fueron cerrados con 4-0 y la piel suturada con 3-0. Se utilizaron almohadillas de calentamiento para barrera térmica post-operatoriamente, y se registró la temperatura rectal hasta que se alcanzaron 37ºC. El método quirúrgico utilizado en este ejemplo fue utilizado también en los ejemplos que siguen.

Examen animal ex vivo

Se realizó la anestesia como en lo que antecede, y se proporcionaron 6 ml de azul Evans al 0,5% y 0,2 ml de heparina (5000 U/ml) en la vena del oído media hora antes del sacrificio. Algunos animales fueron sometidos a examen de MRI con el uso de quetamina en el protocolo de anestesia. Se realizaron una incisión abdominal y una esternotomía. La aorta y el corazón se dejaron al descubierto. Se inyectó PBS a una presión de 120 mm de HG a través de una aguja con orificio amplio hasta el ventrículo izquierdo mientras el animal era desangrado simultáneamente a través de una incisión en el atrio derecho. Una vez que la sangre se aclaró, el animal se fijo por perfusión in situ durante 10 minutos a 120 mm de Hg con un 2% de paraformaldehído / 0,2% de glutaraldehído en PBS. El injerto fue diseccionado libremente y se extirpó con 1-2 cm de vasos naturales. El segmento arterial recogido fue inspeccionado y abierto longitudinalmente. Se fotografió a efectos de estudios planimétricos del área superficial libre de trombos. El injerto se cortó en tres partes para las mediciones.

Análisis del injerto

Se efectuó el análisis planimétrico tras el fotografiado del injerto recogido en la disección con microscopio. El área de superficie íntima que conservó endotelio deficiente, fue manchada de azul tras la aplicación de azul de Evans. Se confirmaron los análisis macroscópicos mediante inmunomanchado de análisis microscópico luminoso. La cantidad de endotelialización fue calculada como porcentaje del área íntima total abarcada dentro del injerto. La microscopía electrónica de exploración fue llevada a cabo según métodos estándar en la mitad proximal del injerto. Se tomaron imágenes de SEM en las proximidades de la mitad proximal, en el centro y en la parte distal de la muestra. Las imágenes de SEM fueron evaluadas a partir del área media de injerto próxima a la mitad del injerto. Las imágenes de SEM fueron tomadas para verificar el crecimiento de transinjerto. La inmunohistoquímica fue realizada para identificar tipos de células con microscopía electrónica.

Resultados Endotelialización

Los análisis planimétricos realizados con azul de Evans a las dos semanas, mostraron un 77% de endotelialización entre los injertos tratados con VEGF,mientras que la endotelialización en injertos LacZ era del 27% del área superficial a los 14 días.

El SEM mostró hallazgos similares. A las dos semanas, el 67% de los injertos tratados con VEGF tenían células endoteliales sobre la superficie, en el área media de injerto, mientras que ninguno de los injertos LacZ estaba cubierto por células endoteliales. También, el crecimiento transinjerto pudo ser visualizado en el grupo tratado con VEGF.

El microscopio luminoso mostró hallazgos similares. A las dos semanas, se verificó que el 100% de los injertos tratados con VEGF tenían células endoteliales sobre la superficie, mientras que ninguno de los injertos LacZ estaba cubierto por células endoteliales.

También, existía diferencia en la patencia a los tres meses; la patencia fue observada macroscópicamente y verificada histológicamente en el 100% del grupo tratado con VEGF y en el 50% del grupo de control.

Ejemplo 8 Injerto de ePTFE de conejo

Este ejemplo demuestra que la co-administración de plásmido de FGF-2 y de FGF-5 en agua estéril sobre un injerto ePTFE, da como resultado una endotelialización más rápida.

Métodos

Dos conejos fueron transfectados con FGF-2 y FGF-5 con el fin de estudiar la endotelialización del injerto de ePTFE internodal de 60 micras,y se sometieron a sustitución de aorta y co-transfección con 500 \mug de FGF-2 y 500 \mug de FGF-5. Se utilizaron dos conejos transfectados con LacZ como controles. Las consecuencias histológicas y al microscopio electrónico de la transfección de B-LacZ y la co-transfección de FGF, fueron estudiadas a las 2 semanas (n = 4). La construcción y la evaluación de expresión de codificación de plásmido para FGF-2 y FGF-5 fueron realizadas según se ha descrito en los apartados anteriores. El LacZ (dosis de 100 \mug: 2,5 \mug/\mul), FGF-2 (dosis de 500 \mug: 2 \mug/\muL) y FGF-5 (600 \mug: 2,5 \mug/\mul), fueron proporcionados como solución de agua estéril.

La reconstrucción arterial quirúrgica y la transferencia génica, fueron llevadas a cabo según los métodos descritos en lo que antecede. En primer lugar, se administró al injerto la dosis de GFG-2, y después la de FGF-5.

Resultados Endotelialización

El análisis planimétrico demostró que en los injertos de control, la cobertura endotelial de la superficie tuvo un valor medio del 27% a las dos semanas, mientras que fue del 91% en los injertos tratados con FGF.

El SEM mostró hallazgos similares. A las dos semanas, todos los injertos tratados con FGF tenían alguna cobertura celular endotelial del área media de injerto, mientras que ninguno de los injertos LacZ estaban recubiertos por endotelio en la misma posición. También, el crecimiento de transinjerto pudo ser visualizado en el grupo FGF.

El microscopio luminoso mostró hallazgos similares. A las dos semanas, ambos injertos tratados con FGF tenían una cobertura celular endotelial casi completa, mientras que ninguno de los injertos de control mostró revestimiento endotelial.

Ejemplo 9 Injerto de dacrón de conejo

El ejemplo demuestra que la endotelialización más rápida de un injerto de Dacrón precuajado desprotegido, se produce con la administración de plásmido VEGF desprotegido en agua estéril sobre el injerto.

Métodos

Cinco conejos fueron divididos en dos grupos para estudiar la endotelialización del injerto Dacrón desprotegido (Sulzer Vaskutec). 2 conejos se sometieron a sustitución de aorta y transfección con 600 \mug de h-VEGF 165 (n = 2). Un conejo de control no fue transfectado y los otros dos fueron transfectados con 600 \mug de B-gal (LacZ). Las consecuencias histológicas de la transfección de B-LacZ, y de la transfección de VEGF, fueron estudiadas en 1 semana (n = 2) y 2 semanas (n = 3).

Métodos genéticos

La construcción y evaluación de expresión de codificación de plásmido para VEGF 165, fue llevada a cabo de acuerdo con los métodos descritos en lo que antecede. Los plásmidos fueron proporcionados en solución LacZ de agua estéril (600 \mug; 2,5 \mug/\mul) y VEGF (600 \mug; 2,5 \mug/\mul).

Reconstrucción arterial quirúrgica y examen ex vivo

El procedimiento fue el mismo para los conejos que el que se ha descrito en el ejemplo 7, salvo en que se utilizó un injerto Dacrón desprotegido de 3 cm de largo y 3 mm de diámetro interno, y fue precoagulado durante 30 minutos en sangre no heparinizada procedente de la vena del oído. El injerto precoagulado fue presionado manualmente y despejado el lumen interno. El injerto fue cortado a una longitud de 12 cm y anastomotizado en la aorta. Tras el sacrificio, los injertos fueron analizados con SEM y microscopio luminoso.

Resultados Endotelialización

El análisis SEM mostró una superficie más lisa y células endoteliales en el injerto de VEGF en una semana, mientras que no se observó ninguna endotelialización a los 7 días en el injerto de control. El injerto tratado con VEGF había desarrollado una superficie de pavimentación a las 2 semanas, mientras que el 50% de los injertos tratados con LacZ mostraban una superficie completa en SEM a las 2 semanas.

El microscopio luminoso mostró endotelialización incompleta a los 7 días en ambos grupos de injerto de control, y endotelialización completa en ambos grupos a las dos semanas.

Ejemplo 10 Injerto de Dacrón de conejo

Este ejemplo demuestra una endotelialización más rápida con co-transfección de FGF-2 y FGF-5 de Dacrón precoagulado.

Métodos

Seis conejos fueron divididos en dos grupos para el estudio de la endotelialización del injerto de Dacrón desprotegido. Se utilizaron algunos controles como en el ejemplo 9. 3 conejos se sometieron a sustitución de aorta y co-transfección con 500 \mug de FGF-2 y 500 \mug de FGF-5. Un conejo no transfectado y dos transfectados con LacZ (600 \mug) fueron utilizados como controles. Las consecuencias histológicas de la co- transfección con FGF, fueron estudiadas en 1 semana (n = 2) y 2 semanas (n = 4).

Métodos genéticos

La construcción de expresión de codificación de plásmido para FGF-2 y FGF-5, se realizó como se ha descrito anteriormente. Los plásmidos fueron proporcionados en LacZ en solución acuosa estéril (600 \mug; 2,5 \mug/\mul), FGF-2 (500 \mug; 2 \mug/\mul) y FGF-5 (500 \mug; 2,5 \mug/\mul). La reconstrucción quirúrgica, la transferencia génica y el examen animal ex vivo, fueron realizados según se ha descrito en el ejemplo 9, salvo en que los plásmidos se proporcionaron según una secuencia; en primer lugar, se proporcionó el FGF-2, primero alrededor del injerto y después se añadió FGF-5. Los injertos fueron analizados con SEM y microscopio luminoso, como en lo que antecede.

Resultados Endotelialización

La exploración con microscopio electrónico mostró una endotelialización parcial sobre el injerto de FGF en una semana, mientras que no se observó ninguna endotelialización sobre el injerto de control. A las dos semanas, un injerto tratado con FGF mostraba una bella superficie endotelial completa con morfología de pavimento, y el otro algunas células endoteliales no conectadas, mientras que se había desarrollado superficie endotelial en uno de los dos injertos de control. El microscopio luminoso con inmunomanchado demostró que las células que cubrían la superficie, eran células endoteliales.

Ejemplo 11 ePTFE de conejo con pegamento de fibrina

El ejemplo demuestra un grado más alto de endotelialización de un injerto ePTFE tratado con plásmido VEGF en cuanto a pegamento de fibrina.

Métodos

3 conejos fueron divididos en dos grupos para estudiar la endotelialización del injerto de ePTFE internodal de 60 micras. 1 conejo fue sometido a sustitución de aorta y transfección con h-VEGF 165 en pegamento de fibrina. Otros 2 conejos fueron utilizados como controles, y sometidos a sustitución de injerto con transfección de B-gal (LacZ) en pegamento de fibrina. Las consecuencias histológicas y electrónicas de la transfección de B-LacZ, y de la transfección de VEGF, fueron estudiadas a las 2 semanas (n = 3).

La construcción y la evaluación de expresión de codificación de plásmido para VEGF 165, fueron realizadas según se ha descrito anteriormente, y el pegamento fue construido según se describe más abajo. Las consecuencias histológicas de la transcripción de VEGF y de B-gal, fueron estudiadas a las 2 semanas. Tras la anastomización del injerto, se administró el pegamento mediante un aplicador Tisseel Duo Mix sobre el injerto. Se inyectaron 0,6 ml de plásmido de VEGF en agua estéril (1200 \mug; 2 \mug/\mul) en una jeringa que contenía 0,4 ml de trombina humana comercialmente disponible (Thrombin, Immuno, Austria). A continuación, la combinación de trombina y plásmido fue retirada y repartida en dos jeringas mediante un grifo de tres vías, con el fin de realizar una mezcla uniforme de los dos componentes. Tras llevar a cabo la anastomosis quirúrgica, se administraron simultáneamente 0,2 ml de fibrinógeno (Tisseel, Immuno, austria) y 0,3 ml de mezcla de trombina-plásmido mediante un aplicador Tisseel Duo Mix sobre el injerto. En los injertos de control, el plásmido B-gal fue utilizado en agua estéril mezclado con trombina.

Resultados Endotelialización

El microscopio luminoso no mostró ninguna cobertura celular endotelial en los injertos de control, mientras que en el injerto tratado con VEGF, alrededor de la mitad de su superficie estaba cubierta con células endoteliales. En SEM, ninguno de los grupos había desarrollado endotelio.

Ejemplo 12 Injerto híbrido de ePTFE con pegamento de fibrina

Este ejemplo demuestra un grado de endotelialización más alto del injerto híbrido cuando el plásmido de VEGF fue administrado en pegamento de fibrina.

Métodos

2 conejos fueron divididos en dos grupos para el estudio de la endotelialización del injerto ePTFE de injerto híbrido de distancia internodal 60 micras / 20 micras, comercialmente disponible (Atrium, New Jersey, USA). 1 conejo fue sometido a una sustitución de aorta y a transfección con 600 \mug de h-VEGF 165. Otro conejo fue utilizado como control y sometido a idéntica sustitución de injerto con transfección de B-gal (LacZ). Las consecuencias histológicas y de SEM de la transfección de B-LacZ y de transfección de VEGF, fueron estudiadas en la semana 2 (n = 2).

La construcción y evaluación de expresión de codificación de plásmido para el VEGF 165, se realizaron de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Después de extraer 0,4 ml de trombina a partir de una jeringa de trombina de 1 ml comercialmente disponible (Thrombin, Immuno, Austria), se inyectaron 0,6 ml de solución de plásmido de 2 \mug/\mul en la jeringa que contenía los 0,6 ml de trombina humana (Thrombin, Immuno, Austria). La combinación de trombina y de plásmido fue extraída y repartida entre jeringas de 1 ml (Codan Medical, Dinamarca) mediante una aguja 18 G (Terumo Europe, N.V., 3001 Leuven, Bélgica) para la realización de una mezcla uniforme de los dos componentes. Se administraron 0,2 ml de solución de fibrinógeno (Tisseel, Immuno, Austria) alrededor del injerto tras la implantación del injerto híbrido poroso comercialmente disponible con distancia internodal de 60/20 micras (Atrium, New Jersey, USA). Se administraron 0,2 ml de fibrinógeno (Tisseel, Immuno, Austria) alrededor del injerto. La polimerización del fibrinógeno localmente alrededor del injerto, se alcanzó con la administración de 0,4 ml de combinación de trombina humana / plásmido,para producir plásmido que contenía pegamento de fibrina alrededor del injerto.

Resultados Endotelialización

El análisis planimétrico realizado con azul de Evans, mostró un 0,96% de cobertura superficial con endotelio en el grupo VEGF, mientras que la endotelialización en injertos LacZ fue del 0,76% a los 14 días.

Mediante SEM, un grado más alto de cobertura celular fue observado en el grupo VEGF, y se pudo visualizar mayor crecimiento transinjerto en el grupo VEGF.

Ejemplo 13 Válvula de corazón fotoxodizada con o sin fibronectina

Este ejemplo muestra una endotelialización más rápida de las superficies valvulares del corazón con o sin pre-recubrimiento de fibronectina cuando se administró el plásmido de VEGF. También fue apreciada una capilarización incrementada del implante.

Métodos

Se preparó plásmido de VEGF de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente.

Pericardio fotoxidizado comercialmente disponible (Sulzer Carbomedics, Austin, Texas), utilizado normalmente como parches intracardíacos, y en válvulas biológicas para el corazón, fue extraído de la solución almacenada, y enjuagado en solución salina estéril (0,9%) dos veces durante 1 hora. A continuación, el material se dejó en solución salina durante 3 horas. Posteriormente, el pericardio se colocó en forma plana y se dividió en dos piezas bajo condiciones estériles.

La primera mitad fue dividida en dos piezas. La primera fue dividida en 1 cm^{2} invalidada tras la administración de 0,6 ml de agua estéril y secada al aire durante 1 hora. La otra mitad fue expuesta a la solución de plásmido (concentración de 2\mug/\mul; dosis de 300 \mug/cm^{2}) y secada al aire durante una hora.

La segunda mitad estaba pre-recubierta con 0,25 \mug/\mul de fibronectina de rata (Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo), a una concentración de 10 \mug/cm^{2}, y se secó al aire durante 1 hora. A continuación, se hizo uso de la afinidad de heparina de la fibronectina de plasma dimérico, mediante la introducción de heparina (Löwens, Balle-rup, Dinamarca), a una concentración de 2 U/cm^{2}, sobre la superficie pericárdica durante 1 hora. A continuación, la lámina pericárdica tratada con fibronectina fue dividida en dos piezas, y se administró el VEGF-plásmido (2 \mug/\mul; 300 \mug/cm^{2}) sobre una mitad y el agua estéril sobre la otra. Se dejó que las piezas se secaran al aire durante una hora. Las láminas fueron divididas en piezas que medían 1 cm x 1 cm, y las piezas fueron dejadas sin efecto en las ratas. Las ratas de control recibieron, por el lado derecho de la pared abdominal, válvulas de control simples, y por el lado izquierdo válvulas de control lateral con fibronectina y heparina. Las animales de tratamiento tuvieron por el lado derecho de la pared abdominal, válvulas con el plásmido, y por el lado izquierdo una válvula con fibronectina / heparina y plásmido. Los animales fueron seguidos durante 2 semanas (n = 2) y 5 semanas (n = 5).

Control a las 2 semanas: 4 válvulas en el lado izquierdo y 4 válvulas en el lado derecho.

Tratamiento a las 2 semanas. 6 válvulas por el lado izquierdo y 6 válvulas por el lado derecho.

Control de 5 semanas, 5 válvulas por el lado izquierdo y 6 válvulas por el lado derecho.

Tratamiento a las 5 semanas: 6 válvulas por el lado izquierdo y 6 válvulas por el lado derecho.

Procedimiento quirúrgico y sacrificio

Los animales fueron anestesiados con la misma anestesia que la utilizada para las ratas operadas con injerto aórtico. El abdomen fue afeitado y abierto. Se administraron 2 ml de bupivacaína en el área herida. Se cosieron válvulas al peritoneo a ambos lados de la línea media con nylon continuo 5-0. Cada pieza fue fijada por separado a la pared con un recorrido de sutura monofilamento de 5-0. El abdomen fue cerrado por capas con 3-0. Los animales fueron sacrificados con la anestesia después de la explantación de la pared abdominal con las piezas valvulares de corazón.

Análisis

Cada pieza fue dividida por la mitad. La mitad de la válvula fue enviada para su observación con el microscopio electrónico tras su conservación en 2% de paraformaldehído / 2% de glutaraldehído. La segunda mitad fue examinada con microscopio luminoso tras su conservación en 4% de formalina e inmunoteñida para su manchado por el factor VIII. Dos válvulas elegidas aleatoriamente en cada grupo, fueron enviadas a SEM, y se investigó la histología con inmunoquímica en cada válvula.

Resultados

El SEM mostró que a las dos semanas no existía ningún revestimiento celular endotelial en los controles sin fibronectina, mientras que el 50% de tratamiento con plásmido había desarrollado una superficie endotelial. En las válvulas tratadas solamente con fibronectina, el 50% había desarrollado un recubrimiento endotelial, y con la adición de plásmido el 100% habían desarrollado un revestimiento endotelial. A las 4 semanas, el 25% de las válvulas de control había desarrollado un revestimiento endotelial, mientras que todos los injertos tratados con plásmido estaban recubiertos por endotelio agradable morfología de pavimentación.

El microscopio luminoso mostró a las 5 semanas una capilarización incrementada de las válvulas en el grupo tratado con plásmido en comparación con el grupo de control.

Ejemplo 14 Injertos dilatadores de ePTFE en conejos

Este ejemplo demuestra una superficie endotelial incrementada y una trombogenicidad reducida tras la aplicación de VEGF o la aplicación combinada de transferencia génica de VEGF y de FGF-2.

Métodos

Seis conejos blancos de Nueva Zelanda (2,5 - 3,2 kg), fueron utilizados en los experimentos, y se sometieron a la colocación de injerto dilatador bilateral en las arterias carótidas para el estudio de la endotelialización.

Métodos genéticos

Se utilizaron los mismos métodos genéticos que se han descrito anteriormente.

Construcción de injerto dilatador

El injerto dilatador fue construido según ha sido descrito previamente por otros (solicitud de Patente sueca núm. 9903674-1). Nosotros hemos utilizado tubo de ePTFE de alta porosidad. Un tubo inicial de 2 mm a partir de uno de politetrafluoretileno (PTFE) de 10 cm de largo, con 60 \mum de distancia internodal (1,0 mm de diámetro interno, 0,06 mm de espesor de pared, Zeus Inc., Orangeburg, SC, USA), fue montado en la punta de una pipeta de 200 \mum (Labora, Suecia). Un bucle de cuerda de pescado de 25 cm de largo (Expert, #340, 0,20 mm de espesor, Fladen Fishing), fue arrastrado entre los puntales de dilatador más proximales (JOSTENT® FLEX, 16 mm de largo, 3-5 mm de diámetro post-dilatación, Jomed International AB, Helsingbord, Suecia) hasta que el dilatador estenótico estuvo en la mitad de la cuerda. A continuación, ambos extremos de la cuerda fueron colocados a través del tubo de PTFE, empezando desde el extremo ancho de la punta de la pipeta. El bucle con el dilatador estenótico en la punta del bucle, fue arrastrado a través de la punta de la pipeta y del tubo de PTFE, hasta que el extremo proximal del dilatador estenótico emergió desde el extremo libre del tubo de PTFE. El tubo FIFE se cortó en el extremo distal del dilatador estenótico. El procedimiento dio como resultado un dilatador completamente recubierto por el tubo de PTFE, salvo por los extremos distales en 0,2 - 0,5 mm. El injerto dilatador se montó a continuación y se corrugó sobre un catéter de angioplastia coronaria (FREEWAY® PTCA Catheter, 2,0 cm de largo, 2,5 mm de diámetro, Jomed International AB, Helsingborg, Suecia) inmediatamente antes de su implantación.

Angioplastia de arteria carótida con inserción de injertos dilatadores

Se añadieron 320 mg de ácido acetilsalicílico (ASA) a agua potable para proporcionar una dosis ASA diaria estimada de 10 mg/día. Los animales fueron anestesiados con 0,33 ml/kg de Hypnorm® subcutáneo (0,315 mg/ml de fentanil & 10 mg/ml de fluonasina, Janssen Pharmaceutica) y 0,33 ml/kg de Dormicum® intramuscular (midazolam, 5 mg/kg de dihidroestreptomicina y 20 mg/kg de bensilpenicilinprocaína fueron suministrados i.m. y 3 ml de marcaína (2,5 mg/ml) fueron administrados intracutáneamente a la zona herida. El cuello fue afeitado y preparado de forma estéril. Bajo el microscopio de disección, ambas arterias carótidas comunes fueron puestas al descubierto mediante una incisión en la línea media del cuello. Todas las ramificaciones por debajo de la bifurcación fueron ligadas con 4-0 Neurolon (Ethicon). Se administraron 500 IU de heparina intravenosa en la vena marginal del oído. Una de las arterias carótidas fue elegida aleatoriamente para ser sometida a la intervención. El vaso fue ocluído proximal y distalmente con cuerdas para vaso, y se realizó una arteriotomía después de 4 minutos de la administración de la heparina a la arteria carótida común distal, inmediatamente proximal a la bifurcación carótida. El catéter de angioplastia con el injerto dilatador, fue guiado a través de la arteriotomía, y colocado en la arteria carótida común proximal. La solución de plásmido (600 \mug de VEGF, o 600 \mug de VEGF con 300 \mug de FGF-2) en 50 \mul de agua estéril, o placebo (50 \mul de agua estéril), fue extraída a una jeringa sujeta a una aguja de tuberculina) 0,30 mm de diámetro) y se inyectó a través de la pared del vaso, entre el injerto dilatador y la pared del vaso, en posición intermedia del injerto dilatador. Inmediatamente después de la inyección, el catéter de angioplastia con el injerto dilatador, fue inflado hasta 9 ATM durante 60 s. A continuación, el catéter fue retirado, dejando el injerto dilatador en su lugar. La arteriotomía fue cerrada quirúrgicamente con sutura Ethilo 10-0 (Ethicon), las cuerdas para vaso se retiraron reestableciendo con ello el flujo sanguíneo a través de la arteria. A continuación, el procedimiento fue repetido sobre la otra arteria carótida contralateral y la herida cerrada por capas con Monocryl 3-0 (Ethicon). En estos experimentos, tanto la arteria carótida izquierda como la derecha de cada individuo animal, recibieron idéntico tratamiento.

Examen animal ex vivo

Los animales fueron anestesiados como en lo que antecede, ya sea una semana (7 días) o dos semanas (14-15 días) después de la implantación. Se proporcionaron 6 ml de azul de Evans al 5% en la mitad de la vena del oído media hora antes del sacrificio. Tras la inyección de bupivacaína localmente, se realizó una incisión cervical y esternotomía. Se suministraron 1000 IU de heparina intravenosamente. La aorta y el corazón se dejaron al descubierto. Se inyectó solución salida amortiguada de fosfato a 120 mm de Hg a través de una aguja con un amplio orificio al ventrículo izquierdo, mientras que el animal era desangrado simultáneamente a través de una incisión en el atrio derecho. Una vez que la sangre se aclaró, se detuvo la perfusión y las arterias carótidas fueron diseccionadas. Las arterias carótidas fueron explanadas y los segmentos de vaso dilatados fueron divididos transversalmente en dos mitades de igual longitud. Las mitades distales fueron abiertas longitudinalmente mediante corte, fotografiadas para planimetría, y procesadas adicionalmente para microscopía de exploración electrónica, según se ha descrito anteriormente. Una de las mitades proximales elegida aleatoriamente, fue procesada para estratificación de metilmetacrilato (MMA) y posterior examen histológico. La otra mitad fue abierta por corte longitudinalmente, fotografiada para planimetría, y procesada para su posterior examen inmunohistoquímico superficial.

La planimetría se realizó mediante dos individuos blindados para el tratamiento. Las áreas de cobertura endotelial fueron determinadas conjuntamente por los dos investigadores para lograr el consenso.

SEM

Se realizó una SEM de acuerdo con los medios descritos anteriormente. La planimetría de las imágenes SEM fue llevada a cabo por medio de dos individuos blindados al tratamiento. Las áreas de cobertura endotelial fueron determinadas conjuntamente por los dos investigadores con el fin de logran el consenso.

Examen histológico Métodos de análisis histológico

Los segmentos de vaso intactos que contenían los injertos dilatadores y 5 mm de arterias adyacentes sin manipular, fueron extraídos en bloque un fijados por inmersión en formalina amortiguada neutra al 4% durante 12 h. Las muestras fijadas se deshidrataron en series escalonadas de etanol y se infiltraron con solución 1:1 de MMA y de xileno, y finalmente con MMA (4ºC, 12 h cada una). Los bloques polimerizados fueron molidos inicialmente con el fin de llevar los componentes del tejido más cerca de la superficie de corte.

Dos secciones serie, de 5 \mum de espesor, separadas 4 mm de los mismos bloques MMA, fueron cortadas en un microtomo deslizante Leica 2500 SM provisto de cuchillas duras para tejido (Leica, Benshelm, Alemania). Tras la inmersión en un poco de etanol al 80%, la secciones fueron apretadas hasta un estado libre de plegado sobre planos de vidrio Superfrost (Menzel-Gläser, Alemania), se cubrieron con una hoja de polietileno y con varias capas de papel filtro, y se presionaron apretadamente sobre los planos de vidrio seguido de un secado durante la noche a 42ºC bajo presión. La desplastinación se llevó a cabo en 2-metoxi-etil-acetato durante 45-90 minutos. La re-hidratación de las secciones se realizó en soluciones de etanol graduado y en 1 mM de PBS. Las manchas de hematoxilina y eosina, de tricromo de Masson y de Elastica van Gieson, se llevaron a cabo de acuerdo con métodos histopatológicos estándar.

Inmunocitoquímica

Las secciones fueron calentadas durante 3 minutos a 90ºC bajo presión, en amortiguador de citrato 1,0 M para la recuperación de antígeno. Las manchas inmunohistoquímicas fueron realizadas con el método ABC/AEC. La peroxidasa endogéna fue bloqueada por incubación durante 20 minutos con 0,3% de H_{2}O_{2} en metanol, seguido de incubación durante 30 minutos con solución bloqueadora Zymed CAS (Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Las secciones fueron incubadas a continuación durante 1 h con anticuerpo primarios, se enjuagaron y se añadieron anticuerpos secundarios durante 30 minutos. Se añadió complejo de avidin-biotina durante 30 minutos, y se detectó una señal utilizando 3-amino-9-etil-carbazol (AEC, Zymed Laboratories). Las células endoteliales fueron detectadas con Ab PECAM-1 policlonal (M-20, Santa Cruz Biotechnology, 1:20). Los anticuerpos secundarios biotinilados se adquirieron en Dako, y se utilizaron a una dilución de 1:50. Los controles para las inmunomanchas incluían las secciones incubadas con clases y especies equiparados con anticuerpos extraños, e incubaciones en las que se omitió el anticuerpo primario.

El análisis histológico se llevo a cabo mediante un individuo blindado al tratamiento.

Inmunohistoquímica superficial

Después de fijación durante la noche en paraformaldehido amortiguado de fosfato al 4%, el segmento de vaso se lavó en PBS, y se deshidrató en una serie escalonada de etanol hasta la concentración final del 50% para su almacenaje a +4ºC. Con anterioridad a su procesamiento adicional, los vasos fueron re-hidratados de nuevo respecto a PBS. Las muestras fueron incubadas con el Ab PECMA-1 policlonal primario (M- 20, Santa Cruz Biotechnology, 1:250) durante la noche a +4ºC, lavadas con PBS con anterioridad a la incubación con Ab secundario (IgG de cabra anti-conejo, Dako, 1:100) durante 2 h a +4ºC, seguido de lavado en PBS, e incubación con cromógeno (3,3'- diaminobenzidina tetrahidrocloruro utilizado como substrato en la reacción de peroxidasa) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El espécimen fue lavado a continuación con agua y las muestras fueron observadas en un microscopio estéreo Leica M12. Las imágenes fueron adquiridas con una cámara digital Leica DC100.

Resultados Endotelialización

La planimetría mostró que los injertos dilatadores tratados con plásmido de VEGF, estaban recubiertos por células endoteliales hasta en un 55,8 - 62,0%, mientras que los injertos dilatadores de control resultaron ocluídos por trombosis, es decir, por endotelio, en dos semanas. Los porcentajes de cobertura en una semana fueron del 57,6% en el grupo VEGF + FGF-2, 37,9% en el grupo VEGF, y 32,9% en el control.

El SEM de la parte A mostró que a las 2 semanas, el 55,8 - 62,0% de los injertos dilatadores tratados con plásmido de VEGF estaban recubiertos por células endoteliales, mientras que la superficie del injerto dilatador de control estaba afectado de trombosis, es decir, recubierto al 0% por el endotelio. En una semana, el injerto dilatador tratado con VEGF presentaba un 32,7% de cobertura con endotelio, y el injerto dilatador tratado con VEGF + FGF-2 una cobertura del 38,9%. En el injerto dilatador de control, la cobertura endotelial fue del 21,6%.

El microscopio luminoso, tras el inmunomanchado superficial, confirmó que las áreas que permanecieron blancas después de la administración de azul de Evans tienen típicamente un diseño reticulado, similar a los segmentos de vaso normales sin injerto dilatador. La mancha reticulada pudo verse en general sobre la mayor parte de las áreas, salvo en las áreas correspondientes a la mancha intensa de azul de Evans o las áreas con células sanguíneas rojas agregadas o con trombosis.

El examen histopatológico de secciones transversales de vaso, se llevó a cabo con el fin de confirmar los hallazgos en cuanto a planimetría y el SEM con relación a la presencia de endotelio.

Los resultados se han resumido en la tabla que sigue.

\newpage

ID del animal,	Planimetría (desde los	SEM (segmento A)	Histología (Segmento B)
tratamiento, punto final	segmentos A y B)
OD 153, 600 \mug VEGF,	57,9%	32,7%	medios de superposición
una semana			de células endoteliales,
			cantidad moderada de
			células endoteliales luminales
OD 155, 600 \mug VEGF +	57,6%	38,9%	células endoteliales
300 \mug FGF-2, una semana			sobre la superficie
			mural de la membrana
			del injerto, cantidad
			moderada de células
			endoteliales luminales
OD 156, placebo, una	32,9%	21,6%	Trombo luminal. Una
semana			sola célula endotelial
			sobre la superficie
			del injerto observada
OD 178, 600 \mug VEGF,	55,8%	73,4%	Revestimiento endotelial
dos semanas			casi completo
OD 179, placebo,	0%, con trombosis	0%, con trombosis	Oclusión trombótica
dos semanas
OD 184, 600 \mug VEGF,	62,0%	66,5%	La mayor parte del
dos semanas			lado luminal
			endotelializado

Ejemplo 15 Injertos dilatadores de ePTFE en conejos

Este ejemplo demuestra que la vinculación de plásmido de Vegf con un injerto dilatador de ePTFE incrementa la endotelialización de la superficie luminal.

Métodos

Dos conejos blancos de Nueva Zelanda (2,5 - 3,2 kg) fueron utilizados en los experimentos y se sometieron a la colocación de un injerto dilatador bilateral en las arterias carótidas con el fin de estudiar la endotelialización.

Métodos genéticos

Se utilizaron los mismos métodos genéticos que se han descrito anteriormente.

Modificación de la superficie de membrana de injerto dilatador

La superficie fue modificada en Caroline Systems, AB, Suecia, mediante la introducción de un recubrimiento superficial catiónico en la membrana de PTFE enfrentada a la pared del vaso. La solución de plásmido (600 \mug de VEGF en aproximadamente 50 \mul de agua estéril) o en placebo (50 \mul de agua estéril), se aplicó con una pipeta en incrementos de 5 \mul sobre la superficie del injerto dilatador, y se secó al aire hasta que se evaporó toda el agua visible. Inmediatamente después, el injerto dilatador se desplegó según se describe en lo que sigue. En estos experimentos, tanto la arteria carótida derecha como la izquierda de cada individuo animal recibieron idéntico tratamiento.

Construcción de injerto dilatador

Los injertos dilatadores fueron construidos según se ha descrito anteriormente, salvo en lo que se refiere a los dilatadores de otros fabricantes que fueron utilizados (dilatador estenótico PURA-A, 7 mm de largo, 3,5 mm de diámetro post-dilatación, Daevon Medical, Hamburgo, Alemania).

Angioplastia de arteria carótida con inserción de injertos dilatadores

Los injertos dilatadores fueron implantados según se ha descrito en el ejemplo anterior, salvo en que la solución de plásmido fue aplicada sobre la superficie del injerto según lo anterior.

Examen animal ex vivo

El procedimiento de sacrificio de los animales fue el mismo que el ejemplo anterior. Las arterias carótidas de los animales con un punto final de una semana, fueron explanadas, y los segmentos de vaso dilatados fueron procesados para estratificación de metilmetacrilato (MMA) y posterior examen histológico.

Examen histológico

El examen histológico fue realizado según lo que se ha descrito en el ejemplo anterior.

Resultados Endotelialización

El examen histolopatológico a partir de las secciones de vaso transversales, fue llevado a cabo con el fin de detectar la presencia de las células endoteliales.

Los resultados se han resumido en la tabla que sigue

ID del animal, tratamiento,	Histología (injerto dilatador	Histología (injerto dilatador
punto final	completo), dx	completo), sin
OD 182, 600 \mug VEGF,	Pocas células endoteliales	Células endoteliales
una semana	luminales	luminales
OD 191, control, una semana	Trombo oclusor reciente	Formación de trombo luminal,
		¿células endoteliales simples?

Claims

1. Un dispositivo médico con propiedades biológicas mejoradas para estar al menos en contacto parcial con la sangre, los fluidos corporales y/o los tejidos cuando se implanta en el cuerpo de un mamífero, cuyo dispositivo comprende un núcleo sintético poroso y un ácido nucleico presente en un medio biológicamente compatible, que se caracteriza porque dicho ácido nucleico codifica un producto de conversión o de transcripción capaz de inducir in vivo la endotelialización capilar, al menos parcialmente, de al menos una superficie sintética de dicho núcleo.

2. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico se fija al menos temporalmente a dicho dispositivo, y se libera de dicho dispositivo tras su introducción en el cuerpo de dicho mamífero.

3. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el ácido nucleico está presente en el medio biológicamente compatible en forma desprotegida.

4. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el ácido nucleico ha sido introducido en un vector viral seleccionado en el grupo consistente en retrovirus, virus de Sendal, virus adeno asociados, y adenovirus.

5. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que la ácido nucleico está presente en un liposoma.

6. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico está codificando una proteína o un polipéptido elegidos en el grupo consistente en familias de factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factor de crecimiento de transformación (TGF), y factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento derivado de placenta (PIGF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF) y angiopoyetina.

7. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico está codificando el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFGF), el factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), o el factor-5 de crecimiento de fibroblasto (FGF- 5).

8. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio biológicamente compatible es un polímero bioestable, un polímero bioabsorbible, una biomolécula, un polímero hidrogel, o fibrina.

9. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el ácido nucleico en un depósito separado de dicho núcleo, permitiendo un suministro sucesivo del mismo al cuerpo de un mamífero.

10. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, en el que el ácido nucleico se ha fijado al núcleo mediante enlace iónico o covalente.

11. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la superficie sintética es no porosa.

12. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, en el que la superficie sintética es porosa y permite crecimiento celular endotelial y capilar a través de los poros.

13. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual es un implante cardiovascular.

14. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual es un implante endovascular.

15. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual es un implante para la sustitución de una parte del cuerpo de un mamífero.

16. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 15, en cual es un injerto dilatador poroso.

17. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, el cual es un injerto vascular poroso.

18. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, el cual es un conector de injerto poroso.

19. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13, el cual es un implante tisular.

20. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13, el cual es un biosensor.

21. Un método para la fabricación de un dispositivo médico con propiedades biológicas mejoradas para estar al menos en contacto parcial con la sangre, los fluidos corporales y/o los tejidos cuando se implanta en el cuerpo de un mamífero, cuyo dispositivo comprende un núcleo poroso sintético y un ácido nucleico presente en un medio biológicamente compatible, que comprende la provisión de un núcleo que comprende al menos una superficie de un material sintético, y la provisión de un ácido nucleico en un medio biológicamente compatible, que se caracteriza porque dicho ácido nucleico codifica un producto de conversión o transcripción capaz de inducir in vivo una endotelialización capilar, al menos parcialmente, sobre al menos una superficie sintética de dicho núcleo.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el ácido nucleico se fija al núcleo por medio de enlaces iónicos o covalentes.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el ácido nucleico se proporciona en un depósito separado del núcleo con el fin de permitir la adición del mismo, al menos una vez, a los alrededores del núcleo tras su introducción en el cuerpo de un mamífero.

24. Uso de un ácido nucleico que codifica un factor angiogénico para mejorar las propiedades biológicas de una superficie sintética de un dispositivo médico para su contacto, al menos parcial, con la sangre, los fluidos corporales y/o los tejidos cuando se implanta en el cuerpo de un mamífero, cuyo dispositivo comprende un núcleo sintético poroso y un ácido nucleico presente en un medio biológicamente compatible, y en el que dicho ácido nucleico, que codifica un producto de conversión o de transcripción capaz de inducir in vivo endotelialización capilar, al menos parcialmente, sobre una superficie sintética de dicho núcleo, está en contacto con dicha superficie en forma de solución o de gel.