CN101474456B - 一种携载基因的医疗器械的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种携载基因的支架及其制备方法。该支架采用静电吸附和/或微孔物理吸附的原理，在其本体表面直接涂覆和/或固定治疗基因制备而成。在本发明所述医疗装置的制备过程中，不需在本体表面涂覆基质，从而避免了基质带来的炎症等副作用，另外，医疗装置本体表面的治疗基因能够耐受血流以及其他体液的冲刷、使治疗有效量的治疗基因达到血管病变位置，从而达到靶向输送或局部定位基因的目的。该种方法制备的基因支架生产工艺简单，适合大规模的放大生产。

Description

一种携载基因的医疗器械的制备方法

技术领域

本发明涉及一种医疗器械，具体的说，涉及一种携载基因的医疗器械及其制备方法。 

背景技术

1987年，希格沃特(Sigwart)等首次将血管内金属支架用于冠状动脉以来，为治疗血管堵塞性疾病提供了良好的途径。然而血管支架内再狭窄一直是影响经皮冠状动脉介入治疗(PCI)疗效的主要原因。随着2004年强生Cypher雷帕霉素药物支架和2005年波士顿科学公司的Taxus紫杉醇药物支架的上市，药物洗脱支架将支架内再狭窄率从金属裸支架时代的30％降低到10％以下。 

然而随着药物支架研究的深入和应用范围的不断扩大以及积累病例的逐步增加，人们对其使用应更趋理性，对其目前存在的问题也有了清醒的认识。在药物洗脱支架的动物实验中，药物洗脱支架植入后3个月药物完全释放后，出现局部纤维蛋白和炎性细胞聚集和内皮修复不完全，此时内膜增殖的程度和金属裸支架相似，即所谓晚期再狭窄。此外，第一代药物洗脱支架所携带的药物，雷帕霉素、紫杉醇以及它们的类似物在抑制血管平滑肌细胞增殖降低支架内再狭窄的同时，也抑制了血管内皮细胞的增殖，因此延迟了支架表面的内皮化，从而增加了支架血栓的发生。同时第一代药物洗脱支架携载药物的聚合物基质的长期存在可能导致过敏和炎症反应。 

伴随着分子生物学的发展，许多疾病的发病机理在基因水平上得以阐明，这使得从基因水平诊断和根治疾病成为可能。在医治心脏病、肿瘤、糖尿病等方面利用基因转移和调位的治疗正在深入研究。例如将抗血栓形成基因导入心血管内，使之在血管内表达，从而达到抑制 血栓形成，防止血管堵塞的目的。然而如何将基因向生物体内靶向输送或局部定位，这一关键性的技术问题尚未得到解决。美国MichealSimons等人曾用一种聚醚载体，将基因加入这种载体的凝胶中，然后将其送入动物的颈动脉中(Nature，359(3)，67-70)。这种方法的缺点在于：该凝胶遇到血流冲击后会很快溶解于血液中，无法定位于血管的某一部位，无法达到靶向输送基因的目的。 

动物研究证明支架携带基因能够作为基因传递系统提供治疗基因，阻止支架内再狭窄和潜在的血管疾病。使用支架作为基因载体具有显著的治疗优势，并得到广泛的关注。2006年美国费城大学Levy研究小组用聚乙烯亚胺双磷酸酯在金属支架表面形成亚胺双磷酸酯单分子层，结合反义腺病毒抗体再耦联病毒基因，植入试验兔体内，显示有效地抑制了血管增殖。近年来，国内学者也在支架上携带各种基因进行动物学研究都表明支架上携带基因进行治疗的可行性了有效性。 

专利CN 1408446A采用在金属支架表面制备一层蛋白涂层，利用该蛋白涂层吸附抑制平滑肌细胞增生和迁移的基因和抑制血栓形成的基因，使基因在支架置入血管局部高效表达，以达到能够安全有效抑制支架置入后的再狭窄。但是由于该蛋白涂层在支架置入过程中易被血流冲走，无法理想实现靶向输送或局部定位基因的目的。 

专利CN 1961978A利用多层组装方法，在支架上稳定连接网状大分子骨架，通过网状分子共价连接糖类、肽类及抗体分子，然后利用这些抗体分子在支架表面固定治疗基因，这种方法固定的治疗基因在血流冲击下能够较多的保留，但是由于引进了多层网状分子和抗体分子，可能会引起炎症和较强的免疫反应，临床应用前景受到极大限制。 

显然，将治疗基因应用于支架能降低再狭窄率和抗血栓形成，已经在临床前研究阶段和部分临床研究中得到证实；而且治疗基因应用于心血管疾病的安全性和有效性也已经得到证实。临床前研究表明能 够促进血管形成的基因和蛋白包括：一氧化氮合酶(NOS)基因(iNOS，eNOS)、角蛋白8(Keratin 8)基因、血管内皮生长因子(VEGF)基因、表皮生长因子(EGF)基因、PTEN基因(一种同肿瘤抑制基因)、尿激酶前体(Pro-UK)基因或反义寡核核苷酸，胎盘生长因子(PLGF)基因，成纤维细胞生长因子(FGF)基因，血管生成素基因，肝细胞生长因子(HGF)基因，血小板衍化生长因子(PDGF-BB)基因，血小板生长因子(PGF)基因，血栓调节蛋白(TM)基因，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，胰岛素样生长因子(IGF)基因，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因，巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)基因，缺氧诱导因子(HIF)基因，早期生长反应(Egr)基因，Prox-1基因，Del-1基因，Cyr61基因，PR39基因，kallikrein基因，分泌性Frizzled相关蛋白(sFrp)基因(Jiro Aoki，Rev Esp Cardiol.2005；58(8)：962-73；MM Gaffney，British Journal of Pharmacology.2007；152：175-188)。 

各国学者进行了将各种治疗基因负载在支架上的尝试，但是所有的这些尝试都存在一个问题，由于支架置入过程中会遇到高速血流的冲击，因此如何将治疗基因牢固吸附在支架表面输送到病变部位成为这种方法应用于临床的关键障碍。现有研究、专利等基本都采用了在金属裸支架表面涂覆一层高分子载体或者蛋白涂层，然后利用这层高分子载体或者蛋白涂层携带基因。这样就存在几个方面的问题：1)高分子载体涂层或者蛋白涂层本身与金属基体的结合力在高速血流冲击下容易与金属基体分离，尤其是那些极易溶于水的胶原、多聚赖氨酸等涂层，这样负载在涂层上的治疗基因会随着血流冲击而大量流失，到达靶病变部位的基因量有限；2)引入的高分子载体或蛋白涂层作为体内异物，会引起机体的应激和免疫反应，尤其是蛋白涂层会引起的免疫排斥作用会大大削弱基因的治疗效果。 

综上所述，如何将有效量的治疗基因牢固负载在支架表面安全输 送到血管病变部位成为制约这一技术应用于临床的瓶颈。在治疗基因与金属支架本体之间设置各种涂层(蛋白涂层、高分子载体涂层、等离子沉积技术、光固化技术)都没有很好解决这一关键问题。如果能够在支架表面牢固吸附治疗基因，在高速血流冲击上仍能够安全输送到病变部位，并且不引入其它可能引起体内应激和免疫反应的因素，将极大推动治疗基因在介入治疗领域的应用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种携载基因的医疗器械及其制备方法。 

本发明所述的携载基因的医疗器械，包括医疗器械本体、涂敷和/或固定在支架本体表面的基因或其片段，其特征在于，基因或其片段利用静电吸附和/或微孔吸附直接涂覆和/或固定在医疗器械本体的表面。 

所述的医疗器械是指血管支架、合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、PFO隔膜封闭器械、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物器械、静脉瓣、血管接合夹、留置式动脉导管、血管护鞘等医疗器械中的一种或上述多种医疗器械的组合。所述医疗器械优选表面具有载药孔洞的医疗器械。更优选表面具有纳米孔洞的医疗器械，纳米孔洞的尺寸优选10-800nm。 

所述医疗器械优选支架，更优选表面具有载药孔洞的支架。更优选表面具有纳米孔洞的支架，纳米孔洞的尺寸优选10-800nm。 

血管介入术后再狭窄和抗血栓的治疗基因主要从以下几方面考虑：(1)抗凝血，抗血小板粘附基因；(2)抑制趋化因子，如MCP-1的相关基因；(3)提供血清HDL水平相关基因，如ApoA-1；(4)血管舒张因子，抑制平滑肌细胞增殖和迁移相关基因；(5)促进内皮细胞功能恢复和内皮层的修复能力。目前对于载基因支架研究较多。使用的治疗基因通常以加速内皮细胞的修复或者抑制平滑肌细胞的增 殖为主，常见的有血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、一氧化氮合酶(NOS)、白介素-1β转化酶(ICE)等具有抑制内皮细胞增殖作用的基因，其中一氧化氮合酶高水平表达能较强地抑制血管平滑肌细胞增殖但不抑制内皮细胞增殖和活性，并减少血管紧张素内毒素诱导的内皮细胞凋亡。 

因此本发明所涉及的医疗器械本体表面直接涂覆和/或固定的基因或其片段包括下述一种或多种：一氧化氮合酶(NOS)基因(iNOS，eNOS)、角蛋白8(Keratin 8)基因、血管内皮生长因子(VEGF)基因、表皮生长因子(EGF)基因、PTEN基因(一种同肿瘤抑制基因)、尿激酶前体(Pro-UK)基因或反义寡核核苷酸，胎盘生长因子(PLGF)基因，成纤维细胞生长因子(FGF)基因，血管生成素基因，肝细胞生长因子(HGF)基因，血小板衍化生长因子(PDGF-BB)基因，血小板生长因子(PGF)基因，血栓调节蛋白(TM)基因，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，胰岛素样生长因子(IGF)基因，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因，巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)基因，缺氧诱导因子(HIF)基因，早期生长反应(Egr)基因，Prox-1基因，Del-1基因，Cyr61基因，PR39基因，kallikrein基因，分泌性Frizzled相关蛋白(sFrp)基因。 

优选一氧化氮合酶(NOS)基因、血管内皮生长因子(VEGF)基因和表皮生长因子(EGF)基因中的一种或多种。 

治疗基因或其片段的真核表达载体为腺病毒、质粒、细胞、高分子中的一种。所述质粒是pQE30、pCNDA3、pCDNA3.1、pTYB1、KS质粒中的一种。 

所述涂覆和/或固定基因可采用蘸涂、浸涂、雾化喷涂和静电喷涂中的一种或多种来进行。 

本发明所述的携载基因的医疗器械的制备方法，包括： 

1)采用电化学抛光、腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化、 阳极极化中的一种或多种，使医疗器械本体表面带正电； 

2)采用蘸涂、浸涂、雾化喷涂和静电喷涂中的一种或多种涂敷基因溶液来涂覆和/或固定基因。 

步骤2)所述静电喷涂可采用该领域公知技术，在支架和喷嘴之间设置静电发生器，使从喷嘴中喷出的基因带更多负电，从而利用静电吸附的原理在支架表面涂覆和/或固定更多的基因。 

所述基因溶液的基因浓度为0.001～100mg/ml，溶剂是琼脂糖DNA电泳缓冲液(TAE缓冲液)、水、磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)中的一种。 

本发明所述的携载基因的医疗器械的制备方法，在步骤1)之前，还包括：i)采用腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化中的一种或多种的结合，在医疗器械本体表面制备孔洞，孔洞的制备可参照专利CN 101161299A中提出的工艺步骤，如在316L不锈钢金属裸支架表面制备多孔表面，孔洞大小不均一，呈多晶相结构，孔洞的大小为1nm～500μm。 

具体的说，如采用酸溶液腐蚀的方法制孔，可将本体浸泡在0～100℃温度的腐蚀液中，所述腐蚀液优选浓度为1～38％的盐酸，或含有1～38％的盐酸混合1～98％的硫酸成分的盐酸混酸溶液，或浓度为1～30％的氢氟酸，或上述三种酸溶液的任意浓度比例混合后的混酸溶液，腐蚀时间控制在1min～480h后形成单尺寸孔洞。 

如采用阳极氧化的方法制孔，可将支架本体作为阳极与脉冲电源的正极连接，钛、镁、铝、铁、锌、铜、金、银、铂金属及其合金制成的金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接，将支架本体与阴极金属片同时置于盐酸溶液中，电解液优选浓度为1～38％的盐酸，或1～98％的硫酸溶液，电流设定为0.01～30A，频率为25～3000赫兹，时间为1～20min，在支架本体表面制备单尺寸或复合结构的孔洞。 

上述制孔方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化，都可参照专利CN 101161299A中提出的工艺参数，也可以用于使医疗器械本体带正电，另外电化学抛光和阳极极化也可以用于使器械本体带正电，其工艺参数可参照专利CN 101161299A中的阳极氧化制孔工艺。 

在支架本体上直接制备单尺寸的纳米级孔洞，可先采用酸溶液腐蚀制孔方法在支架本体上直接制备单尺寸的纳米级孔洞，再采用阳极氧化或微弧氧化、微弧氮化相结合的方法制备多尺寸的纳米级复合孔洞。 

本发明所述的携载基因的医疗器械的制备方法，在步骤i)之前，还包括医疗器械本体的预处理：超声波清洗医疗器械本体，清除其表面的杂质，并干燥。 

具体的说，可使用浓度为99.5％的丙酮分析纯溶液，或浓度为75％的医用乙醇溶剂，利用频率为28～100khz超声波清洗支架本体材料，清洗5-15min，去除本体材料表面的杂质，将清洗后的本体材料干燥备用。 

本发明所述的携载基因的医疗器械的制备方法，在步骤i)之后，还包括医疗器械本体的后处理：将制备好孔洞的本体用四氢呋喃、丙酮、乙醇或甲醇超声清洗或酸液浸洗，然后再用去离子水进行清洗，并干燥备用。 

具体的说，所述后处理可以是先使用四氢呋喃、乙醇溶液、甲醇溶液或浓度为99.5％的丙酮，再使用蒸馏水，利用频率为28～100khz超声波清洗本体材料5-15min；最后将清洗后的本体材料干燥；或使用浓度为1～38％的盐酸溶液在15-25℃浸泡本体30min～48h后，再使用蒸馏水，利用频率为28～100khz超声波清洗本体材料5-15min取出后干燥； 

所述干燥是将医疗器械本体放置在干燥机中，温度设定在30～40℃，干燥30～60min。 

所述的医疗器械是指血管支架、合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、PFO隔膜封闭器械、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物器械、静脉瓣、血管接合夹、留置式动脉导管、血管护鞘等医疗器械中的一种或上述多种医疗器械的组合。所述医疗器械优选表面具有载药孔洞的医疗器械。更优选表面具有纳米孔洞的医疗器械，纳米孔洞的尺寸优选10-800nm。 

所述医疗器械优选支架，更优选表面具有孔洞的支架。更优选表面具有纳米孔洞的支架，纳米孔洞的尺寸优选10-800nm。 

本发明所涉及的医疗器械本体表面直接涂覆和/或固定的基因包括下述一种或多种：一氧化氮合酶(NOS)基因(iNOS，eNOS)、角蛋白8(Keratin 8)基因、血管内皮生长因子(VEGF)基因、表皮生长因子(EGF)基因、PTEN基因(一种同肿瘤抑制基因)、尿激酶前体(Pro-UK)基因或反义寡核核苷酸，胎盘生长因子(PLGF)基因，成纤维细胞生长因子(FGF)基因，血管生成素基因，肝细胞生长因子(HGF)基因，血小板衍化生长因子(PDGF-BB)基因，血小板生长因子(PGF)基因，血栓调节蛋白(TM)基因，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，胰岛素样生长因子(IGF)基因，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因，巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)基因，缺氧诱导因子(HIF)基因，早期生长反应(Egr)基因，Prox-1基因，Del-1基因，Cyr61基因，PR39基因，kallikrein基因，分泌性Frizzled相关蛋白(sFrp)基因。 

优选一氧化氮合酶(NOS)基因、血管内皮生长因子(VEGF)基因和表皮生长因子(EGF)基因中的一种或多种。载体治疗基因的真核表达载体为腺病毒、质粒、细胞、高分子中的一种。 

不同的基因(包括载体治疗基因)在支架表面涂覆和/或固定的量要求不同，如果单纯采用孔洞物理吸附、静电吸附和静电喷涂技术 中的一种即可满足，则基因支架制备只需要采用其中的一种方式，反之，则可同时联合这三种方法，以增加基因在支架表面的涂覆和/或固定量，保证基因支架的有效性。 

所述基因可市购，也可参照本领域常用的方法自制，以一氧化氮合酶(NOS)为例，可先采用提取基因组再PCR扩增出目的基因片段，或提取目的基因的RNA再通过RT-PCR法扩增，获取目的基因NOS：再将构建与扩增目的基因的真核细胞表达载体，所述的目的基因的真核表达载体为腺病毒、质粒、细胞、高分子中的一种；所述的质粒可采用pQE30、pCNDA3、pCDNA3.1、pTYB1、KS质粒中的一种。 

因此，本发明所述的携载基因的医疗器械的制备制备方法，包括： 

1)医疗器械本体表面的预处理：超声波清洗医疗器械本体，清除其表面的杂质，并干燥； 

2)采用腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化中的一种或多种的结合在医疗器械表面制备孔洞； 

3)医疗器械本体表面的后处理：用四氢呋喃、丙酮、乙醇或甲醇超声清洗或酸液浸洗，然后再用去离子水进行清洗，并干燥备用； 

4)采用电化学抛光、腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化、阳极极化中的一种或多种的结合，使支架表面带上较多的正电，利用基因在溶液中带负电的特性，通过静电吸附效应在支架表面涂覆或者固定基因； 

5)采用静电喷涂技术，在支架表面喷涂和固定基因时，通过外加电场使支架表面带上更多的正电、基因带上更多的负电，通过静电喷涂工艺增加基因在支架表面涂覆和固定的量； 

6)利用上述(2)、(4)、(5)三种方法的两两组合或者同时利用这三种方法在支架表面涂覆和/或固定基因。 

在工业生产中，还可以包括利用本领域内公知的技术进行支架表面基因活性和牢固度的检测，如采用荧光定量方法检测支架表面基因 的含量；将涂覆有基因的支架放置在人工血管模拟器械中冲刷，以评价基因在支架表面的牢固度。 

本发明采用静电吸附和微孔物理吸附效应在器械本体表面直接涂覆和/或固定具有治疗有效量的基因，提供了一种将治疗基因和医疗器械本体直接结合起来，无需基质的医疗器械。其具有以下优点：1)治疗基因直接负载在支架表面，无需任何中间基质，避免了在基因和支架本体支架设置中间层基质可能带来的炎症及其副作用；2)采用微孔或者静电吸附方式固定的治疗基因相对牢固，能够耐受支架植入过程中高速冠脉血流的冲击，从而能够使治疗有效量的治疗基因达到血管病变位置，从而达到靶向输送或局部定位基因的目的。 

本发明所述的携载治疗基因的医疗器械的制备方法简单，将表面带正电并有孔洞的金属医疗器械浸没在含有基因的溶液中，利用基因在缓冲溶液中呈负电性的特性，通过正负电荷相吸的静电吸附效应和器械本体表面孔洞的物理吸附双重作用来固定基因，基因固定效果好，且不引入基质，降低了炎症和再狭窄风险。 

附图说明

图1带有载药孔洞的金属支架本体扫描电镜照片。 

图2表面附着大量基因质粒的携载基因支架的扫描电镜照片。 

图3携载基因支架和金属裸支架的荧光显微镜照片对比，a图为金属裸支架，其表面几乎没有绿色荧光；b图为基因支架，其表面有大量绿色荧光。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如物特别指明，实施例中使用的基因来源于美国Invitrogen公司。 

实施例1 

1.带有孔洞的裸支架的制备 

将316L不锈钢裸支架经切割、去渣、抛光，放置在浓度为75％的 医用酒精中，在频率50khz的超声波清洗10分钟，然后置于干燥箱中，温度设定在35℃，干燥60分钟后取出。 

然后将支架放置在～38％的盐酸腐蚀15小时，将支架本体作为阳极与脉冲电源的正极连接，钛金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接，将支架本体与阴极金属片同时置于为20％的盐酸，电流设定为20A，频率为250赫兹，时间为20分钟，在316L金属裸支架本体表面制备孔洞，并使支架表面带上正电。如图1所示，扫描电镜下，可见金属支架本体表面有明显的微孔。 

2.iNOS基因支架的制备 

将iNOS基因制备成10mg/ml的TAE缓冲液溶液，然后将上述步骤制备的带有载药孔洞的316L金属裸支架放入配制好的缓冲液中，温育60分钟取出，4℃长期保存。扫描电镜下可见316L金属支架表面吸附了大量iNOS基因质粒，如图2所示。 

3.iNOS基因支架表面基因检测 

1)iNOS基因支架表面基因质粒的电镜观察研究 

将iNOS基因支架和裸支架(对照组)放置在SYBR Green染料溶液中室温孵育温育15分钟后，取出用去离子水冲洗5分钟后，于荧光显微镜下观察基因支架和裸支架表面的绿色荧光，基因支架表面有大量绿色荧光；而金属裸支架表面几乎没有绿色荧光。 

2)iNOS基因支架表面基因质粒牢固度的检验 

将基因支架放置在冠脉血流模拟冲刷器械中，冲刷1h后取出，然后将基因支架放置SYBR Green染料溶液中室温孵育温育15分钟后，取出用去离子水冲洗5分钟后，于荧光显微镜下观察仍然可见大量绿色荧光。 

以上研究表明，基因支架表面的基因质粒能够耐受动脉血流的冲刷，具有较高的牢固度，表明采用该专利方法制备的基因支架能够安全有效的将治疗有效量的基因靶向输送定位在损伤血管处。通过在病 变处释放治疗基因从而达到采用靶向基因治疗的目的。 

实施例2 

1.带有孔洞的裸支架的制备 

同实施例1中的(1)步骤。 

2.VEGF基因支架的制备 

将VEGF基因质粒制备成100mg/ml的去离子水溶液，然后将步骤1制备的316L金属裸支架放入配制好的缓冲液中，温育1天后取出，4℃长期保存。扫描电镜下可见316L金属支架表面吸附了大量VEGF基因质粒。 

实施例3 

1.带有孔洞的裸支架的制备 

将市售镍钛合金支架裸支架放置在浓度为99.5％的丙酮中，在频率100khz的超声波清洗5分钟，然后置于干燥箱中，温度设定在30℃，干燥30分钟取出。 

然后将支架放置在～38％的盐酸腐蚀12小时后，将支架本体作为阳极与脉冲电源的正极连接，钛金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接，将支架本体与阴极金属片同时置于为～38％的盐酸中，电流设定为10A，频率为1000赫兹，电解20分钟，在支架本体表面制备孔洞，并使支架表面带上正电。 

然后进行后处理：先使用浓度为99.5％的丙酮，再使用蒸馏水，利用频率为60khz超声波清洗本体材料各10min，然后置于干燥箱中，温度设定在50℃，干燥25分钟取出。 

2.VEGF和iNOS基因支架的制备 

将VEGF和iNOS基因制备成浓度分别为0.01mg/ml的TAE缓冲液混合溶液，装入喷涂机中，在支架和喷嘴之间设置静电发生器，电压设置为10KV，电流设定为0.1mA，使从喷嘴中喷出的基因带更多负电，利用静电吸附的原理在支架表面涂覆和/或固定更多的基因。反 复喷涂5遍，4℃长期保存。 

实施例4 

1.带有孔洞的裸支架的制备 

将市售镁合金支架裸支架放置在浓度为95％的乙醇中，在频率100khz的超声波清洗5分钟，然后置于干燥箱中，温度设定在40℃，干燥20分钟取出。 

然后将支架放置在～18％的盐酸腐蚀24小时后，将支架本体作为阳极与脉冲电源的正极连接，钛金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接，将支架本体与阴极金属片同时置于为～18％的盐酸中，电流设定为30A，频率为3000赫兹，电解5分钟，在支架本体表面制备孔洞，并使支架表面带上正电。 

然后进行后处理：先使用浓度为95％的乙醇中，再使用蒸馏水，利用频率为60khz超声波清洗本体材料各10min，然后置于干燥箱中，温度设定在50℃，干燥25分钟取出。 

2.EGF基因支架的制备 

将EGF基因制备成浓度为80mg/ml的TAE缓冲液混合溶液，装入喷涂机中，在支架和喷嘴之间设置静电发生器，电压设置为20KV，电流设定为0.2mA，使从喷嘴中喷出的基因带更多负电，利用静电吸附的原理在支架表面涂覆和/或固定更多的基因。反复喷涂3遍，4℃长期保存。 

Claims (1)

1.一种携载基因的医疗器械的制备方法，该医疗器械包括医疗器械本体、涂敷和/或固定在支架本体表面的基因或其片段，其特征在于，其是将316L不锈钢裸支架本体经切割、去渣、抛光，放置在浓度为75％的医用酒精中，在频率50khz的超声波清洗10分钟，然后置于干燥箱中，温度设定在35℃，干燥60分钟后取出；

然后将支架放置在38％的盐酸腐蚀15小时，将支架本体作为阳极与脉冲电源的正极连接，钛金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接，将支架本体与阴极金属片同时置于为20％的盐酸，电流设定为20A，频率为250赫兹，时间为20分钟，在316L不锈钢裸支架本体表面制备孔洞，并使支架表面带上正电；

将iNOS基因制备成10mg/ml的TAE缓冲液溶液，然后将上述步骤制备的带有载药孔洞的316L不锈钢裸支架本体放入配制好的缓冲液中，温育60分钟取出，4℃长期保存。

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