MXPA99004088A - Uso terapeutico de factor de crecimiento, y dispositivo de suministro, especialmente para el tratamiento de hiperplasia intima - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) tiene utilidad en el tratamiento de la hiperplasia intimal, hipertensión y aterosclerosis, y de condiciones susceptibles para el tratamiento con agentes que producenóxido nítrico o prostaciclina. En lugar de VEGA un agente equivalente tal como un agonista de receptores de VEGA puede ser dado, asícomo lo puede ser un,ácido nucleico que codifica dicho agonista .El agente exitosamente puede ser administrado a través de la superficie adventicial de un vaso sanguíneo, por ejemplo utilizando un dispositivo que define un depósito entre la pared de cuerpo y la superficie adventicial del vaso, el deposito se encuentra lleno en parte por una formulación farmacéutica que contiene el agente que va hacer suministrado.

Description

USO TERAPÉUTICO DE FACTOR DE CRECIMIENTO, Y DISPOSITIVO DE SUMINISTRO, ESPECIALMENTE PARA EL TRATAMIENTO DE HIPERPLASIA INTIMA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso terapéutico del factor de crecimiento, y particularmente al tratamiento y prevención de hiperplasia íntima de vasos sanguíneos y otras condiciones, especialmente hipertensión. La invención se refiere también a un dispositivo que puede ser utilizado para suministrar el agente activo. La hiperplasia íntima es el incremento en el número de células entre el endotelio y la lámina elástica interna de un vaso sanguíneo, particularmente en la placa íntima encontrada" ahí, o en una arteria. La hiperplasia íntima por lo general es causada por proliferación de célula de músculo liso (SMC) en la pared del vaso sanguíneo. Cuando ocurre la hiperplasia íntima, el espesamiento de novo de la placa íntima o la pared del vaso, es decir, estenosis, puede presentarse. De esta manera, el vaso sanguíneo puede quedar ocluido. También, cuando ha sido aclarada una obstrucción en un vaso sanguíneo, la hiperplasia íntima que ocurre después de la cirugía puede conducir a que la arteria quede ocluida de nuevo, esto se conoce como restenosis.

La proliferación de células de músculo liso arteriales comúnmente ocurre cuando un vaso sanguíneo, por ejemplo, una arteria, se deforma o trastorna durante la cirugía. Por ejemplo, la hiperplasia íntima puede conducir a estenosis de novo después de injertos de derivación, en donde una vena es anastoinizada a una arteria, y después de anastomosis quirúrgica en general. Dos ejemplos de procedimientos quirúrgicos que pueden dar surgimiento a la estenosis, son injertos de derivación coronaria e injertos de derivación de arteria femoropopliteal por arriba de la rodilla. Similarmente, la restonosis puede ocurrir después de procedimientos de angioplastía de globo utilizados para aclarar obstrucciones en vasos sanguíneos, por ejemplo, procedimientos de angioplastía de globo. La hiperplasia íntima, ya sea conducida a estenosis o restenósis, permanece como un problema mayor después de varios procedimientos quirúrgicos. La enfermedad cardiovascular arterioesclerótica es la causa principal de muerte en Europa y Norteamérica y acelera una morbidez altamente significativa consecuente después de la utilización del lumen arterial, ya sea evitando o reduciendo el flujo sanguíneo, trombosis super-impuesta después de una placa, con embolización distante posible, debilitamiento de la pared arterial, conduciendo a dilatación aneurismal y ruptura final. Dependiendo del sitio y distribución de la enfermedad, pueden existir varias opciones para el tratamiento, con el injerto de derivación arterial siendo la intervención quirúrgica más común. Para la enfermedad de arteria coronaria, esto ahora se ha vuelto el procedimiento quirúrgico más común en todos los Estados Unidos con .200,000 operaciones realizadas cada año desde 1990 y con >20,000 operaciones realizadas cada año en el Reino Unido. En la aorta, vasos renales, mesentéricos y periféricos, la parte principal de procedimientos de derivación quirúrgicos continua en incremento, con regímenes de operación en los Estados Unidos y Europa de 35-70 por 100, 000 de población. En combinación, el número de procedimientos de derivación quirúrgico realizados cada año se aproxima a un millón. En los primeros 24 meses después de la cirugía, un número muy importante de injertos de derivación arterial cae (ocluidos) . Los valores citados varían de 20% a 30%. Esto significa que para todos los procedimientos de derivación arterial cardiacos y periféricos realizados cada año en el Reino Unidos (aproximadamente 25,000-30,000), de entre 6,000 y 7,000 puede esperarse que fallen, en dos años. Los regímenes de falla para procedimientos de "volver a ser" aún son más altos. Tal es el costo financiero de falla que, en los Estados Unidos, ha sido calculado que aún una reducción modesta en regímenes de falla después del procedimientos coronarios, de 33% a 25%, puede ahorrar hasta $750 millones del presupuesto del cuidado de la salud. Existen tres causas principales para falla de injerto dentro de los cinco años a partir de la cirugía. El primero ocurre en forma rápida, dentro de los 30 días de la operación (<5%), y representa un error técnico, (por ejemplo una deficiente técnica anastomótica) . La última falla, después de 24 meses, generalmente es el resultado de progresión del proceso arterioescleróticos original. Sin embargo, es en aquellos injertos que se ocluyen entre uno y 24 meses que forman la mayor parte de las fallas (<70 ) . En estos casos, es hiperplasia íntima SMC la que es responsable del estrechamiento progresivo, es decir, estenosis, del lumen arterial, dando como resultado finalmente una completa oclusión. Típicamente, la hiperplasia íntima SMC es situada alrededor de la anastomosis arterial distante y la pared del vaso masivo opuesto a la anastomosis. De esta manera, una patología primaria en este sitio y no restonosis en un sitio de hiperplasia íntima previa como pudiera ocurrir después de la angioplastía. La hiperplasia íntima SMC puede ocurrir en la anastomosis arterial más próxima y alargar el mismo injerto . La restenosis después de la angioplastía puede conducir a regímenes de falla aún más altos, de 20 a 50% en los primeros seis meses después de la angioplastía. La estenosis y restenosis ambos siguen siendo problemas principales después de la cirugía. En la actualidad, numerosos métodos para tratar o prevenir hiperplasia íntima han sido probados, pero ninguno ha sido clínicamente satisfactorio. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una proteína de existencia natural. En seres humanos, por lo menos existen cuatro formas, de 121, 165, 189 y 206 aminoácidos. El ADNc y las secuencias de aminoácido de las cuatro formas de VEGF humano se presentan en Houck et al . Molecular Endocrinology (1991) vol 5. No. 12, páginas 1806-1814) . También se da una secuencia genómica parcial. La secuencia de ADNc de VEGF humano también se da por Leung et al . Science (1989) 246:1306-1309), junto con la secuencia de ADNc de VEGF de bovino. Estas cuatro formas son denominadas en la presente como VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 y VEGF-206. Se debe entender que esta numeración se refiere al número de aminoácidos en la proteína madura en cada caso. La proteína traducida también incluye una pre-secuencia de 26 aminoácidos, la cual, por naturaleza, es dividida durante el procesamiento intracelular. VEGF se sabe que juega un papel muy importante en la angiogénesis, en donde estimula la división de células endoteliales vasculares (EC) , incrementa la permeabilidad endotelial y actúa como "un factor de sobrevivencia" endotelial en vasos retínales. Por ejemplo, VEGF, en la forma de proteína recombinante o cuando se expresa a partir de un plásmido, puede inducir el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos cuando se inyecta intra-arterialmente a extremidades isquémicas. Esta propiedad ha conducido a su uso en la reparación de arterias, cuyos endotelios han sido dañados durante cirugía. De esta manera, Asahara et al , Circulation (1995) 91:2793, suministro VEDF, a través de una cánula, al interior de arterias carótidas de rata después de angioplastía que despojó al endotelio de la arteria; se encontró que VEGF estimuló la re-endotelización de la arteria que, a su vez, pareció contribuir a la supresión de hiperplasia íntima. La proteína de VEGF y el gen se describen en WO-A-9013649, y su uso para tratar trauma del epitelio vascular, úlceras diabéticas y heridas de vaso sanguíneo, se propone. Los fragmentos de VEGF se describen en la WO-A-9102058, y su uso en angiogénesis y re-endotelización de superficies vasculares internas, por ejemplo, en el tratamiento de úlceras . La GB-A-2298577 describe un stent externo, poroso, de no restricción para procesos de injertos de derivación arteriovenosos . Este stent tiene efectos -benéficos en el tamaño luminal y en el espesamiento medio e íntimo. La O-A-9423668 describe un dispositivo para el suministro local de un agente hacia un vaso sanguíneo, incluyendo un depósito formado entre -us dos elementos. Su uso requiere implantación, es decir, corte a través del vaso y después asegurar el dispositivo a las paredes del vaso. El dispositivo es parcialmente poroso. El dispositivo está en contacto directo con el flujo sanguíneo luminal Esto implica el riesgo de infección. La US-A-3797485 describe un dispositivo para administrar un fármaco a la superficie adventicia de un vaso sanguíneo. Se proporciona con paredes permanentes y tubos transcutáneos para el suministro del fármaco en forma líquida. La intención es que el fármaco deba pasar a otro sitio. La presente invención busca tratar y/o evitar todas las condiciones descritas anteriormente, conforme vayan surgiendo a partir de la hiperplasia íntima. Sorprendentemente se han identificado propiedades de VEGF, indicando que puede ser utilizado contra hiperplasia íntima en diferentes formas. Se colocó un collarín alrededor de la parte externa de la arteria de un conejo. Este procedimiento normalmente causa hiperplasia íntima en la arteria del conejo, conduciendo a espesamiento de la pared arterial, que es similar a la estenosis que puede ocurr±r en arterias de seres humanos después de operaciones de derivación. Cuando el collarín se utilizó para suministrar ADN que codifica VEGF a la pared arterial utilizando un plásmido/vector de liposoma, el gen VEGF fue sobre-expresado en la pared arterial, incluyendo la capa endotelial. La hiperplasia íntima se midió. Se encontró que el collarín adventicio es adecuado para la transferencia de gen arterial con todos los sistemas de suministro de gen probados. Esto demuestra que VEGF, además de estimular la re-endotelización en casos en donde el endotelio está dañado, es capaz de suprimir la hiperplasia íntima en situaciones en donde la hiperplasia íntima surge cuando el endotelio está total o enormemente intacto-. Por lo tanto, es potencialmente útil no solo suprimir la estenosis después de angioplastía sino que también evitar o tratar la estenosis de novo en otras situaciones quirúrgicas. De esta manera, existe un contraste entre los nuevos hallazgos y los hallazgos previos, en donde se encontró que VEGF estimula el crecimiento adicional, o cura el endotelio. Probablemente es que los nuevos hallazgos surjan de un mecanismo diferente de acción de VEGF. Además, los nuevos hallazgos demuestran que agentes efectivos pueden ser suministrados al exterior del vaso sanguíneo, para tratar hiperplasia íntima. Esto presenta varias ventajas. En particular, el agente terapéutico no es eliminado del sitio de la hiperplasia a través del flujo sanguíneo como con el flujo intralumenal « Un depósito de suministro puede ser mantenido alrededor del vaso sanguíneo, y no hay necesidad de ninguna manipulación intralumenal que dañe el endotelio del vaso sanguíneo (y por sí mismos puede activar la hiperplasia íntima) . Más particularmente, la presente invención habilita a agentes para combatir hiperplasia íntima CMS que seré aplicada directamente a la superficie adventicia de la pared arterial (es decir, muy cerca de aquellas células en el medio externo) . Cualquier agente utilizado puede ser aplicado específicamente a los sitios que con más probabilidad desarrollen una lesión hiperplásica íntima, ya que estos sitios están fácilmente expuestos en el momento de la operación. VEGF media sus efectos conocidos a través de receptores de quinasa de tirosina de alta afinidad específicos flk-1/KDR y flt-1, los cuales no solamente son expresados en EC y monocito. Sin desear que esté ligado por teoría, se considera que los efectos de VEGF en la inhibición de hiperplasia también son mediados a través de la inhibición de los mismos receptores. Por consiguiente, la invención también se extiende al uso de los agonistas de los receptores a los cuales se une VEGF, u otros materiales que tienen el mismo mecanismo de acción para tratar o prevenir hiperplasia íntima. La ubicación específica de receptores VEGF también confiere una ventaja de VEGF según comparado con muchos otros factores de crecimiento y citocinas sugeridas para el tratamiento de espesamiento de la íntima; los efectos de VEGF son más específicos a EC, ya que, en ausencia de monocitos, los receptores de VEGF de alta afinidad en la pared arterial son solamente expresados en EC. Por ejemplo, se ha encontrado que el mecanismo de inhibición de VEGF de hiperplasia íntima en situaciones en donde el endotelio está total o enormemente no dañado es por lo menos parcialmente a través de la trayectoria de óxido nítrico (NO) , para que la administración del inhibidor de síntesis NO, L-NAME, contrarresta los efectos de VEGF en la hiperplasia íntima en el modelo de collarín descrito anteriormente. De esta manera, VEGF estimula la producción de NO. También es posible que VEGF tenga otros efectos biológicos que contribuyan a su inhibición de hiperplasia íntima. En particular, se ha encontrado que la sobre-expresión de VEGF estimula la producción de prostaciclina, activación de fosfolipasa A2 citosólica y la secreción del factor de von illebrand a través de EC. Puede ser el caso que la estimulación de VEGF de la producción de NO y su estimulación de prostaciclina actúen en grupo para suprimir la hiperplasia íntima. El hallazgo de que VEGF actúa para estimular NO y la producción de prostaciclina también sugiere que VEGF y agonistas de los receptores a los cuales se une VEGF serán útiles para el tratamiento de otras condiciones enlazadas a NO y/o enlazadas a prostaciclina. En particular, Forte et al , Lancet (1997) 349:837-42, ha mostrado que los niveles de NO son bajos en individuos que padecen de hipertensión. Por lo tanto, VEGF puede ser útil en el tratamiento o prevención de varias formas de hipertensión. Similarmente, VEGF puede ser utilizado en el tratamiento de ateroesclerosis. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un agente que tiene cualquiera de las características dadas encontra-das para VEGF es utilizado para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de hiperplasia íntima, por ejemplo de estenosis. El agente puede ser proporcionado en la forma de un implante. Más particularmente, el agente estimula la producción de NO o prostaciclina; puede ser un agonista de un receptor al cual se une VEGF, por ejemplo el mismo VEGF o un fragmento del mismo, o un ácido nucleico que codifica dicho agonista. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, un dispositivo para utilizarse en el suministro de un agente terapéutico a un vaso sanguíneo en un paciente, comprende un cuerpo adaptado para proporcionar un sello alrededor del vaso, el agente siendo mantenido dentro de o asociado con el dispositivo, de manera, durante uso, el agente se pone en contacto con la superficie adventicia del vaso. Dichos dispositivos puede ser biodegradables, y no requerir de tubos de suministro transcutáneos permanentes. Como se sugirió anteriormente y se demuestra en los Ejemplos, varios agentes, incluyendo sintasa de óxido nítrico y un ácido nucleico que la codifica, son adecuados para utilizarse en la invención. El agente por lo general será descrito en la presente como la proteína de VEGF o ácido nucleico, y aquellas referencias, y referencias al mismo VEGF, se dan solamente a manera de ejemplo, cualquiera de las formas de VEGF descritas anteriormente pueden ser utilizadas para los propósitos de esta invención. En la presente, las referencias a estas secuencias de proteína VEGF se debe entender que se refieren tanto a secuencias que comprenden la pre-secuencia y secuencia que carecen de la pre-secuencia. Las proteínas VEGF con y sin la pre-secuencia son adecuadas para la práctica de la invención. Similarmente, las referencias a ácido nucleico de VEGF (ADN y ARN) se refieren a ambas secuencias que codifican la pre-secuencia y secuencias que no codifican la pre-secuencia. Se debe observar que, Houck et al , supra, da la secuencia de VEGF-165 como incluyendo el aminoácido asparagina (N o Asn) en la posición 141 (115 en la nota de Houck et al, que corresponde a la proteína madura) . Houck et al da este aminoácido como lisina (K o Lys) en VEGF-121, VEGF-1B9 y VEGF-206, la secuencia de ADNc (de VEGF-206) citada por Houck et al soporta esto. Por lo tanto, en la invención, el aminoácido en la posición 141 puede ser asparagina (N o Asn) o lisina (Lys o K) . Cada aminoácido es codificado por el codón de triplete apropiado en secuencias de ácido nucleico de la invención (para ADN, estos codones pueden ser AAA o AAG para lisina y AAT o AAC para asparagina. Esto se aplica especialmente a VEGF-165. Las cuatro formas son codificadas por el mismo gen pero generadas por división alternativa al nivel de RNA. De esta manera, existe una forma de longitud completa de VEGF humano y tres formas truncadas conocidas. VEGF-121 y VEGF-165 son formas solubles y son formas secretadas. Similarmente, la secuencia de 26 aminoácidos es hidrofóbica y se cree que reduce la solubilidad de la proteína. De esta manera, las formas de VEGF sin la pre-secuencia son preferidas, ya que se espera que tengan una solubilidad más alta. Todas las formas de VEGF son adecuadas para la práctica de la invención, aunque se prefieren las formas secretadas. Las proteínas de VEGF adecuadas para la práctica de la invención también pueden originarse de otras especies, aunque se prefiere VEGF humano. Por ejemplo, el VEGF de ratón, de conejo y de vaca ha sido clonado y sus secuencias están disponibles. Para referencias, se debe observar que VEGF-121, 165, 189 y 206 también son denominados en la técnica como VEGF-120, 164, 188 y 205. Las proteínas de VEGF y ácidos nucleicos (ADN y ARN) son agentes adecuados para la práctica de la invención. Cuando se utiliza la proteína de VEGF, la proteína de VEGF teniendo la secuencia de aminoácido la SEC. DE IDENT. NO. 2 (VEGF-121), 4(VEGF-165), 6 (VEGF-189) o 8 (VEGF-206) es preferida. Las formas secretadas de VEGF son preferidas, y de esta manera son particularmente preferidos VEGF-121 y VEGF-165. En la práctica de la invención, se prefiere utilizar ADN de VEGF que codifica VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 o VEGF-206, por ejemplo, que tiene la secuencia de la SEC. DE IDENT. NO. 1, 3, 5 o 7. Las secuencias de ADN que codifican formas secretadas de VEGF humano son preferidas. De esta manera, las secuencias de ADN de la SEC. DE IDENT . NO. 1 y 3 son particularmente preferidas. Sin embargo, el ADN de VEGF y las proteínas adecuadas para la práctica de la invención no están limitadas a aquellas secuencias específicas. Más bien, la invención también proporciona el uso de otra secuencia de ADN y proteína estrechamente relacionadas.

Las secuencias de ADN de la invención están relacionadas con aquellas de la SEC. DE IDEN . NO. 1, 3, 5 ó 7 en un número de formas. Por ejemplo, las secuencias de ADN adecuadas - para la práctica de la invención pueden ser secuencias degeneradas que codifican la misma proteína, la proteína de la SEC. DE IDENT. NO. 2, 4, 6 u 8. Alternativamente, la secuencia de ADN de la invención pueden ser sustancialmente homologas a aquella de la SEC. DE IDENT. NO. 1, 3, 5 ó 7, y codifican una proteína que difiere en secuencia de aminoácido de aquella de la SEC. DE IDENT. NO. 2, 4, 6, u 8 pero codifica una proteína que tiene una actividad VEGF. Típicamente, las secuencias de ADN para utilizarse en la invención tienen por lo menos 70%, al menos 80%, por lo menos 90%, al menos 95%, o por lo menos 99% de homología de secuencia con la secuencia de la SEC. DE IDENT. NO. 1, 3, 5 ó 7. Similarmente, las secuencias de ADN se VEGF para utilizarse en la invención pueden codificar fragmentos de VEGF que retiene la actividad de VEGF. Los fragmentos de interés son, es decir, por lo menos 15 aminoácidos largos, de hasta 40 o más aminoácidos. Ejemplos de fragmentos adecuados son una longitud de 20 aminoácidos, por ejemplos, las secuencias 1-20, 11-30, 21-40, 31-50, 41-60, 51-70, 61-80, 71-90, 81-100, 91-110, 101-120, 111-130, 121-140, 131-150, 141-160, 151-170, 161-180, 171-190, 181-200, 191-210 y 196-215 de la proteína de VEGF activo mostrada como la SEC. DE IDENT. NO. 6. Las secuencias de ADN para utilizarse en la invención pueden ser, por ejemplo, los ADN genómicos o los ADNc, o híbridos entre ADN genómico y ADNc, o pueden ser sintéticas o semi-sintéticas . Se pueden originar de cualquier especie, aunque se prefieren los ADN que codifican VEGF humanos. Pueden ser de estructura de cadena individual o de estructura de cadena doble. Particularmente se prefieren los ADN genómicos que codifican proteínas de la SEC. DE IDENT. NO . 2 , 4 , 6 y 8. Las secuencias de ADN para utilizarse en la invención pueden diferir de la secuencia mostrada en la SEC. DE IDENT. NO. 1, 3, 5 ó 7 a través de eliminación, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, siempre que codifiquen una proteína que tenga actividad de VEGF. Similarmente, pueden ser truncados con respecto a la SEC. DE IDENT. NO. 1, 3, 5 ó 7 o extendidos por uno o más nucleótidos siempre que codifiquen una proteína que tengan actividad VEGF. La secuencia de ARN también son adecuadas para la práctica de la invención. En particular, la invención proporciona el uso de las secuencias de ARN que corresponden a aquellas de la SEC. DE IDENT. NO. 3, 5 ó 7; estas son secuencia de ARN preferidas. La invención también proporciona el uso de secuencias de ARN que están relacionadas con aquellas secuencias en cualquiera de las formas descritas anteriormente para las secuencias de ADN. Las secuencias de ARN para la invención pueden ser de estructura de cadena individual o estructura de cadena doble. Los los ARN de la invención pueden ser de cualquier origen, por ejemplo, se pueden originar de cualquier especie, aunque se prefieren los ARN que codifican VEGF humano, especialmente VEGF de humano que tiene la secuencia mostrada en la SEC. DE IDENT. NO. 2, 4, 6 u 8. También se pueden utilizar los ADN sintéticos, así como los ARN semi-sintéticos. Además, se puede utilizar ADN transcrito que forma plásmidos bacterianos ín vivo o in vi tro. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica, en- las secuencias de ARN adecuadas para la práctica de la invención, los residuos T serán reemplazados por U. Las proteínas de VEGF para utilizarse en la invención son codificadas con secuencias de ADN o ARN de la invención como se definió anteriormente. Las proteínas preferidas de la invención son las proteínas de la SEC. DE IDENT. NO. 2, 4, 6 y 8, aunque la invención también proporciona el uso de otras proteínas que tienen secuencias estrechamente relacionadas que difieren de aquellas de la SEC. DE IDENT. NO. 2, 4, 6 u 8 pero que tiene actividad VEGF.

De acuerdo con la invención, ya que se refiere al tratamiento o prevención de hiperplasia íntima, la actividad de VEGF es la habilidad de inhibir completa o parcialmente o evitar la hiperplasia íntima en un vaso sanguíneo, particularmente una arteria. Las proteínas que difieren ligeramente en secuencia de VEGF de existencia natural, como se describió anteriormente, retienen esta propiedad, aunque no necesariamente a un grado tan grande como VEGF. Similarmente, dichas proteínas pueden exhibir una actividad VEGF más fuerte que el VEGF de existencia natural. Lo mismo se aplica a agonistas de VEGF, por ejemplo péptido, peptoides u otras moléculas pequeñas. Ya que la invención se refiere a otras propiedades de VEGF, la actividad de VEGF es la habilidad de las moléculas distintas a VEGF para reproducir aquellas propiedades. Por ejemplo, ya que la invención se refiere a la actividad de VEGF contra condiciones enlazadas a NO para estimular la producción de NO, la actividad v incluye la habilidad de estimular la producción de NO. Ya que la invención se refiere a la actividad de VEGF contra condiciones enlazadas a prostaciclina, la actividad de VEGF incluye la habilidad de estimular la producción de prostaciclina. Las proteínas de VEGF adecuadas para la práctica de la invención típicamente también exhiben una o más de las propiedades biológicas del VEGF que ya son conocidas en la técnica, tales como la habilidad de promover la proliferación de EC arterial in vi tro y/o in vi vo o la habilidad de unirse a los receptores a los cuales VEGF se une y activarlos en la forma de VEGF. Las proteínas de VEGF adecuadas para la práctica de la invención pueden ser sustancialmente homologas al VEGF de la SEC. DE IDENT. NO. 2, 4, 6 u 8, típicamente por lo menos un 70%, al menos un 80%, por lo menor un 90%, al menos un 95%, o por lo menos un 99% homólogo. Las proteínas de VEGF adecuadas para la práctica de la invención pueden diferir de la secuencia mostrada en la SEC. DE IDENT. NO. 2, 4, 6 u 8 a través de la eliminación, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos, siempre que tengan actividad de VEGF. Similarmente, pueden ser truncados por uno o más aminoácidos con respecto a la SEC. DE IDENT. NO. 2, 4, 6 u 8 o extenderse con respecto a la SEC. DE IDENT. NO. 2, 4, 6 u 8 por uno o más aminoácidos, siempre que tengan actividad de VEGF. Con respecto a sustituciones, se prefieren las sustituciones conservadoras. Típicamente, las sustituciones conservadoras son sustituciones donde el aminoácido sustituido es de una naturaleza similar a aquella presente en el VEGF de existencia natural, por ejemplo, en términos de carga y/o tamaño y/o polaridad y/o hidrofobicidad. Similarmente, las sustituciones conservadoras típicamente tienen poco o ningún efecto sobre la actividad de VEGF de la proteína. Las proteínas de VEGF para utilizarse en la invención, que difieren en secuencia del VEGF de existencia natural pueden ser diseñadas por ingeniería para diferir en la actividad a partir del VEGF de existencia natural. Por ejemplo, pueden ser diseñadas por ingeniería para tener una actividad de VEGF más fuerte. Dichas manipulaciones típicamente podrán ser realizadas a nivel de ácido nucleico utilizando técnicas recombinantes conocidas en la técnica. Como una alternativa para utilizar una proteína de VEGF como se describió anteriormente, es posible utilizar un agonista de VEGF. Esto se aplica a todas las aplicaciones médicas descritas aquí, especialmente el tratamiento de ateroesclerosis . En general, un agonista de VEGF es una molécula que enlaza a un receptor al cual VEGF se une y tiene sustancialmente los mismo efectos, conduciendo a la actividad de VEGF como se describió en la presente. En particular, un agonista puede unirse a los receptores flk-1/KDR o flt-1. Los agonistas de la invención de esta manera son denominados tanto como agonistas de VEGF como de receptores a los cuales VEGF se une. Un agonista de VEGF puede tener cualquier estructura química. Por ejemplo, un agonista de VEGF puede ser un péptido o un polipéptido de, por ejemplo, hasta 10, hasta 20, hasta 50 o hasta 100 aminoácidos. Un agonista similarmente puede ser un péptido modificado o un peptoide. Se puede hacer cualquier modificación- adecuada, incluyendo glicosilación, sulfatación, amidación con -COOH y acetilación, por ejemplo, acetilación N-terminal. Además, o alternativamente, pueden estar presentes- aminoácidos modificados y/o L-aminoácidos. Algunos agonistas preferidos son fragmentos, opcionalmente modificados como se describió anteriormente, de VEGF, que tienen actividad de VEGF. Un fragmento de agonista particularmente preferido de VEGF consiste de los aminoácidos 1 a 20 (M...H) de la SEC. DE IDENT. NO. 4; este péptido se reporta que es un agonista del receptor de Flt-1 en células de trofoblasto humanos, por Ah ed et al , Lab. Invest. (1997) 76:779. Los agonistas relacionados adicionales también pueden ser derivados de la región terminal de VEGF. Por ejemplo, con referencia a la SEC. DE IDENT. NO. 4, los agonistas de péptido del VEGF pueden comprender el término N de VEGF (aminoácido No. 1) y tener la secuencia de aminoácido de VEGF hasta un aminoácido en la escala de 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 100. Similarmente, los agonistas preferidos pueden derivarse de la región N-terminal de VEGF pero comprenden una versión truncada del término N. Por ejemplo, en lugar de iniciar en el aminoácido No. 1 en la SEC. DE IDENT. NO. 4, puede empezar en el aminoácido No. 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 ó 10 de la SEC. DE IDENT. NO. 4, y tener la secuencia de aminoácido de VEGF hasta un aminoácido en la escala de 25 a 30, 30 a 40, 40 a 50 o 50 a 100. Los agonistas de péptido de la invención también puede derivarse de la secuencia de VEGF. Por ejemplo, un agonista de péptido preferido adicional es un péptido que consiste de los aminoácidos 145 a 169 (R...P) de la secuencia de VEGF-189 de la SEC. DE IDENT. NO.6. Los agonistas relacionados adicionales también pueden derivarse de esta región de VEGF. Por ejemplo, con referencia a la SEC. DE IDENT . NO. 6, los agonistas de péptido de VEGF pueden tener la secuencia de aminoácido de VEGF a partir de un aminoácido en la región de 135 a 155 a un aminoácido en la región de 160 a 180. Por ejemplo, los agonistas de péptido derivados de la región pueden tener la secuencia de VEGF a partir de un aminoácido en la región de 135 a 140, 140 a 145 ó 145 a 150 hacia un aminoácido en la región de 160 a 165, 165 a 170 ó 170 a 175. Los fragmentos de péptido de VEGF como se definió anteriormente preferiblemente tienen una longitud total de 10 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 40 ó 40 a 50 aminoácidos. Otros agonistas preferidos son fragmentos de la proteína HIV Tat. La proteína HIV Tat se asemeja a las acciones agonistas de VEGF y puede estimular la angiogénesis en células endoteliales actuando a través del receptor Flk- 1/KDR; ver Albini et al, Oncogene (1996) 12:289-297, y Nature Medicine (1996) 2(12): 1321-1375. De esta manera, los péptidos derivados de la secuencia HIV-1 Tat tales como la secuencia de 46-60 aminoácidos de la proteína HIV Tat han mostrado que estimulan el desarrollo y migración de células endoteliales; ver Albini et al, Oncogene (1996) 12:289-297. El péptido que consiste de los aminoácidos 41-65 de la proteína HIV-1 Tat es un agonista de péptido preferido adicional de la invención. Los agonistas de la invención también pueden tener secuencias de aminoácido que difieran de aquella de VEGF de existencia natural en cualquiera de las formas descritas anteriormente para proteínas VEGF, siempre que sean retenidas sus propiedades agonistas. Cuando los agonistas de la invención son péptidos, estos puede ser generados in vivo a partir de secuencias de ácido nucleico que los codifican, con el fin de efectuar el tratamiento de acuerdo con la invención. De esta manera, el agonista que codifica ácidos nucleicos puede ser suministrado a través de terapia de gen, como se describió anteriormente. Alternativamente, se pueden utilizar agonistas de v de no péptido. Por ejemplo, se pueden utilizar pequeñas moléculas que se asemejan a la forma de las partes de VEGF que interactúan con sus receptores. En la práctica de la invención, el VEGF, un ácido nucleico que codifica VEGF o un agonista de VEGF o ácido nucleico que codifica a un agonista de VEGF pueden ser suministrados a un vaso sanguíneo, preferiblemente una arteria en cualquier forma adecuada. Los ácidos nucleicos pueden ser suministrados en una forma "natural" no asociada con un vector, o a través de un vector de terapia de gen. Se prefiere suministrarlos a través de cualquier vector de terapia de gen adecuado. En particular, se pueden utilizan vectores virales o no virales. Los vectores virales adecuados incluyen, adenovirus, retrovirus, retrovirus pseudotificados, hipervirus, virus de vacuna y baculovirus. Los vectores no virales adecuados incluyen oligonucleótidos, plásmidos, liposomas, liposomas catiónicos, liposomas sensibles al pH, complejos de liposoma-proteína, i unoliposomas, derivados de liposoma-proteína-polilisina, emulsiones de agua-aceite, polietileniminas y dendrímeros. Los vectores preferidos incluyen los retrovirus derivados de virus de leucemia de murino Moloney (MMLV) , retrovirus que contienen proteína-G de virus de estomatitis vesicular pseudotificada (VSV-G) , adenovirus, plásmidos y complejos de plásmido/liposo a .

Cuando sea apropiado, se puede utilizar conjuntamente dos o más tipos de vector. Por ejemplo, un vector de plásmido puede ser utilizado junto con liposomas. Los liposomas adecuados incluyen, por ejemplo, aquellos que comprenden dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), 3ß- [N- (N' ,N' -dimetilaminoetan) carbomil] colesterol (DC-Choil) , o el lípido positivamente cargado (N- [1- (2, 3-dioleiloxi) propil] -N,N,N-trietilamonio (DOTMA) . Los vectores virales de la invención son preferiblemente deshabilitados, por ejemplo, deficientes de replicación. Es decir, carecen de uno o más genes funcionales requeridos para su replicación, lo cual evita su proliferación no controlada in vivo y evitan los efectos laterales indeseables de la infección viral. Preferiblemente, todo el genoma viral es removido excepto para los elementos genómicos mínimos requeridos para empacar el genoma viral incorporando el ácido nucleico VEGF en el revestimiento viral o cápsido. Por ejemplo, es deseable eliminar todo el genoma viral excepto las Repeticiones de Terminal Larga (las LTR) y una señal de empaque. En el caso de adenovirus, las eliminaciones se hacen típicamente en la región El y opcionalmente en una o más de las regiones E2, E3 y/o E4. Los virus de la invención pueden ser deshabilitados a través de cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, las eliminaciones genómicas pueden implicar la remoción completa de genes requeridos para replicación, o solamente la remoción parcial. Se prefiere la remoción completa. En general, las eliminaciones preferidas son de genes requeridos para la transcripción temprana de genes virales. También se pueden utilizar vectores virales de auto-limitación o auto-destrucción de replicación competente. En general, el ácido nucleico de VEGF para utilizarse en la invención estará comprendido dentro de una construcción de expresión que asegura su expresión in vivo después de que han sido suministrados hacia la arteria, preferible a través de un vector como se definió anteriormente. Dichas construcciones típicamente comprende un promotor capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico de VEGF (y opcionalmente un regulador del promotor) , un codón de inicio translacional y, operablemente enlazado al promotor, el ácido nucleico VEGF. Preferiblemente, estos componentes están dispuestos en una orientación 5' -3'. La construcción también puede comprender cualquier otro componente adecuado. Por ejemplo, la construcción puede comprender un ácido nucleico que codifica una secuencia de señal, así colocada en dicha posición con relación al ácido nucleico VEGF que, cuando es traducido, es capaz de dirigir la proteína de VEGF expresada hacia un tipo de célula dado o compartimento de células. Cualquier secuencia de señal típicamente será colocada inmediatamente 3' o inmediatamente 5' al ácido nucleico de VEGF, de manera que la secuencia de señal y la proteína de VEGF son traducidas como una proteína de fusión individual, con una secuencia de señal en el término C o N. La construcción también puede comprender un mejorador, el cual mejora el grado de expresión provisto por el promotor. Cualquier mejorador que mejore la expresión provista por el promotor seleccionado puede ser utilizado.

Por ejemplo, en el caso del promotor de gen temprano CMV, se puede utilizar un mejorador de gen temprano CMV. Opcionalmente, la construcción puede comprender un terminador transcripcional 3' para el ácido nucleico VEGF. Se puede utilizar cualquier terminador adecuado. Opcionalmente, la construcción puede comprender una señal de poliadenilación operablemente enlazada a 3' al ácido nucleico VEGF. Opcionalmente, la construcción puede comprender uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo, de resistencia antibiótica, para permitir la selección de células transformadas en el cultivo. Por ejemplo, las células pueden ser seleccionadas para resistencia antibiótica en orden. Opcionalmente, la construcción puede comprende uno o más intrones, u otra secuencia de no codificación, por ejemplo 3' o 5' al ácido nucleico VEGF.

Cualquier promotor adecuado puede ser utilizado para controlar la expresión del ácido nucleico de la invención. En general, se prefiere utilizar un promotor viral o un promotor adaptado para funcionar en la especie del sujeto que ha sido tratado. De esta manera, en el caso de un ser humano, se prefiere utilizar promotores virales, especialmente promotores derivados de virus que infectan seres humanos, o promotores derivados de genes humanos. Opcionalmente, se puede utilizar un promotor en combinación con cualquier mejorador adecuado. En forma Deseable, se utiliza un promotor "fuerte", es decir, uno que asegure altos niveles de expresión de la proteína VEGF de la invención. Los promotores que logran la sobre-expresión de la proteína VEGF son deseables. Los promotores preferidos incluyen el promotor citomegalovirus (CMV) , opcionalmente en combinación con el mejorador CMV; el promotor ß-actina humano; el promotor de gen temprano de virus de simio 40 (SV 40) ; el promotor de virus de sarcoma de Rous (RSV) ; y el promotor de repetición de terminación larga retroviral (LTR) . Los promotores, y otros componentes de construcción están operablemente enlazados al ácido nucleico VEGF. De esta manera, se colocan en orden que pueden ejercer su efecto sobre la expresión del ácido nucleico VEGF. Por ejemplo, en el caso de un promotor, el promotor es colocado con relación al ácido nucleico VEGF de manera que es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico VEGF. En forma deseable, los componentes de construcción son colocados para permitir que éstos ejerzan su máximo efecto sobre la expresión. Los ácidos nucleicos o construcciones utilizados en la invención, pueden ser incorporados en genomas virales de cualesquier medios adecuados conocidos en la técnica. Entonces los genomas virales pueden ser empacados en revestimientos virales o cápsidos a través de cualquier procedimiento adecuado. En particular, cualquier línea de célula de empaque puede ser utilizada para generar vectores virales de la invención. Estas líneas de empaque complementan los genomas virales deficientes de replicación de la invención, ya que incluyen, típicamente incorporados en sus genomas, los genes que han sido eliminados del genoma deficiente de replicación. De esta manera, el uso de líneas de empaque permiten que los vectores virales de la invención sean generado en cultivo. Las líneas de empaque adecuadas incluyen derivados de células PA317, células ?-2, células CRE, células CRIP, células E-86-GP, células Fly, células de línea 293 y células 293 GP. En el caso de vectores no virales, el ácido nucleico puede ser incorporado en los vectores no virales a través de cualesquiera medios adecuados conocidos en la técnica.

Según se desee, los vectores, los vectores virales, pueden ser seleccionados para lograr la integración del ácido nucleico o construcción en el genoma de las células del sujeto que se está tratando, o dejar el ácido nucleico o construcción libre en el citoplasma. Se prefiere los vectores de integración. Las proteínas VEGF o ácidos nucleicos VEGF para utilizarse en la invención preferiblemente asociados con un vector viral o no viral, como se describió anteriormente, pueden ser administrados a arterias en cualquier forma adecuada con el fin de efectuar el tratamiento de hiperplasia. Por ejemplo, el VEGF o un ácido nucleico que codifica VEGF puede ser administrado a la pared exterior del vaso sanguíneo, por ejemplo, una arteria, o al endotelio del vaso sanguíneo, por ejemplo, el endotelio arterial, por ejemplo, a través del lumen. La transferencia de gen local probablemente es ventajosa con respecto a la administración de la proteína VEGF recombinante, ya que los compuestos infundidos son rápidamente llevados por el flujo sanguíneo y reducen la vida media en la sangre. Una vez suministrados, los ácidos nucleicos VEGF de la invención son expresados para producir proteínas VEGF, las cuales a su vez efectúan el tratamiento o prevención de hiperplasia íntima. La expresión puede presentarse en cualquier tipo o tipos de célula en el vaso sanguíneo, por ejemplo, la pared arterial. Preferiblemente, la expresión ocurre en tal sitio que el VEGF expresado es capaz de llegar al endotelio del vaso sanguíneo, por ejemplo arteria. Por ejemplo, la expresión puede ocurrir en las células de músculo liso y/o en el endotelio. Más preferiblemente, la expresión se presenta por lo menos en el endotelio del vaso sanguíneo, por ejemplo, una arteria. Por ejemplo, la proteína o ácido nucleico VEGF puede ser suministrado a la parte externa del vaso sanguíneo, por ejemplo, una arteria, a través de la inyección directa alrededor del sitio de la hiperplasia que será tratada o evitada, o a través de la inyección en el lumen del vaso sanguíneo, por ejemplo, una arteria. Más preferiblemente, la proteína o ácido nucleico VEGF se suministra a través de un implante colocado de manera externa al vaso sanguíneo, por ejemplo, una arteria, cerca del sitio de la hiperplasia que será tratada. Dicho implante contiene proteina o ácido nucleico V?GF o el vector y proporciona un depósito del agente. La proteína o ácido nucleico VEGF (preferiblemente en asociación con un vector) puede ser introducido al implante antes o después de que el implante sea introducido al sujeto que se va a tratar. Por ejemplo, el implante puede ser sometido cerca del vaso sanguíneo, con la proteína o ácido nucleico VEGF siendo introducido en el implante, por ejemplo, a través de inyección, subsecuentemente. De preferencia, el implante es implementado en contacto directo con el vaso sanguíneo, por ejemplo, una arteria. Esto es especialmente preferido cuando se utilizan vectores retrovirales para suministrar ácidos nucleicos VEGF, ya que la deformación física del vaso sanguíneo puede inducir a la proliferación de células de músculo liso, lo cual incrementa la deficiencia de transferencia de gen a través de vectores retrovirales. Esta proliferación, así como la proliferación inducida por la misma hiperplasia, se supera, o al menos se alivia a través del suministro de la proteína o ácido nucleico VEGF. En forma similar, se prefiere que el implante esté en contacto con la arteria cuando se emplean otros vectores que exhiben eficiencia incrementada de transferencia de gen cuando sus células objetivo se dividen. Por ejemplo, la proliferación de célula también puede mejorar la eficiencia de transferencia de gen con complejo de plásmido/liposoma. Dichos implantes pueden estar en cualquier forma adecuada. De preferencia, el implante esta en la forma de un collarín que rodea, parcial o completamente, de preferencia completamente, la arteria, en o cerca del tipo de la hiperplasia que será tratada o evitada.

El suministro de gen extra-vascular evita procedimientos tales como cateterización de globo o fluido de alta presión, los cuales pueden producir a daño endotelial o separación. Los genes transfectados preferiblemente son aplicados a través de un implante silástico o biodegradable, preferiblemente un collarín colocado cerca de, de preferencia alrededor de la parte externa del vaso sanguíneo. El endotelio sufre poco o ningún daño. Esto es una ventaja principal de esta forma de suministro. Cuando, de acuerdo con la invención, se aplican vectores directamente sobre la superficie adventicia de un vaso sanguíneo dentro de un collarín, se mantiene un contacto estrecho con la adventicia. En arterias de conejo, un collarín solo típicamente conduce a la formación de una neoíntima en 7-14 días después de la operación. El collarín también mantiene una alta concentración de vector en la superficie de la adventicia. Los implantes, preferiblemente collarines, se pueden hacer de cualquier material adecuado. Los implantes silásticos, es decir, implantes que comprenden cauchos de silicón, son una alternativa preferida. Más preferidos son los implantes biodegradables. Se puede utilizar cualquier material adecuado biodegradable. Dentro del implante, por ejemplo, el collarín, la proteína o el ácido nucleico VEGF, pueden estar contenidos en cualquier forma. De preferencia, la estructura del implante, por ejemplo, collarín es tal que la proteína o ácido nucleico V?GF se mantiene en contacto directo con la pared del vaso sanguíneo. De esta manera, en una modalidad, la estructura del implante deja un espacio entre la pared del vaso sanguíneo y la pared del implante. En el caso de un collarín, el implante forma de esta manera un recipiente hueco alrededor del vaso sanguíneo. En este espacio, los ácidos nucleicos o proteínas VEGF pueden ser introducidos, de manera que están en contacto con la pared del vaso sanguíneo. De preferencia, las extremidades del implante están en contacto con la pared del vaso sanguíneo, evitando así el escape del ácido nucleico o proteína VEGF. De preferencia, la pared externa -del collarín es impermeable, o sustancialmente impermeable, al ácido nucleico o proteína de VEGF, evitando así o por lo menos limitando, su escape hacia el tejido circundante y asegurando su suministro hacia el vaso sanguíneo. Opcionalmente, el espacio que contiene el ácido nucleico o proteína VEGF puede estar separado de la pared del vaso sanguíneo a través de una o más capaz de material permeable o semipermeable al VEGF o ácido nucleico. Esto puede ser deseable si se pretende un suministro gradual y si se desea limitar la velocidad a la cual la proteína o ácido nucleico VEGF se suministra hacia la pared del vaso sanguíneo . Opcionalmente, el implante, por ejemplo collarín, puede ser diseñado para actuar como una bomba osmótica. Opcionalmente, el VEGF puede estar contenido dentro de un medio dentro del collarín, por ejemplo, un medio sólido o de gel. Esto puede ayudar a que la proteína o ácido nucleico VEGF escape hacia el tejido. En este caso, la pared externa del collarín puede no necesitar estar en contacto con el vaso sanguíneo de la extremidad del implante. Alternativamente, el ácido nucleico o proteína VEGF puede ser colocado como revestimiento sobre la superficie de implante, que esta en contacto con el vaso sanguíneo en uso.

Alternativamente, el ácido nucleico o proteína VEGF puede ser dispersado a través de la estructura del implante. Algunas ventajas del uso de implantes de esta manera, especialmente collarines, son: (i) proporcionan un depósito de suministro, permitiendo el suministro sostenido; (ii) no se requiere de manipulaciones intralumenales y el endotelio arterial permanece intacto; y (iii) la deformación (por ejemplo, constricción en el caso de un collarín) creada por el implante puede mejorar la eficiencia de suministro de gen, como se explicó anteriormente. Un dispositivo de la invención generalmente comprende un cuerpo que incluye al menos una primera porción de cuerpo sustancialmente impermeable, la cual está configurada para que, durante uso, se extienda longitudinalmente a lo largo de y por lo menos parcialmente alrededor de un primer vaso que lleva sangre, la primera porción de cuerpo incluyendo porciones de sello longitudinalmente separadas adaptadas para sellar, durante uso, contra la superficie de la adventicia del primer vaso que lleva sangre, una porción intermedia entre las porciones de sello, la cual está adaptada para, durante uso contener y suministrar por lo menos un agente hacia la superficie adventicia del primer vaso que lleva sangre. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las modalidades preferidas de los dispositivos de acuerdo con la presente invención ahora serán descritas, a manera de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos anexos en los cuales: la Figura 1 es una vista en sección longitudinal, esquemática de un dispositivo de la invención en su lugar alrededor de un vaso sanguíneo; La Figura 2 es una vista en sección coronal, esquemática de la misma modalidad, a lo largo de la línea A-A a lo largo de la Figura 1; la Figura 3 muestra una vista en perspectiva, esquemática de una modalidad de un dispositivo colocado alrededor de una anastomosis de extremo a extremo; la Figura 4 es una vista en sección transversal longitudinal en el plano vertical de la modalidad de la Figura 3; la Figura 5 es una vista similar a aquella de la Figura 4, pero mostrando una forma modificada de esa modalidad; con una construcción alternativa para sus porciones de sello; la Figura 6 muestra una vista en perspectiva, esquemática de una tercera modalidad de un dispositivo colocado alrededor de una anastomosis de extremo alado; la Figura 7 es una vista en sección transversal longitudinal en el plano vertical de la modalidad de la Figura 6, la Figura 8 muestra una vista en perspectiva esquemática de una - cuarta modalidad de un dispositivo colocado alrededor de una anastomosis de lado a lado; la Figura 9 es una vista en sección transversal longitudinal en el plano vertical de la modalidad de la Figura 8; la Figura 10 muestra una vista en perspectiva, esquemática de una quinta modalidad de un dispositivo colocado alrededor de una anastomosis de lado a lado, mostrando una parte del vaso sanguíneo embebido; y la Figura 11 es una vista en sección transversal longitudinal en el plano vertical de la modalidad de la- Figura 10. A manera de antecedentes, los injertos de derivación arterial son "comúnmente utilizados para restaurar o mejorar el flujo sanguíneo hacia los tejidos cuando los vasos nativos son ocluidos o significativamente estenosis, usualmente a través de ateroma. Cuando se utiliza una vena o arteria autóloga, o un material sintético tal como Dacron o PTFE, los injertos son comúnmente anastomizados a los vasos nativos en una de tres formas: "de extremo a extremo" (Figura 4; "de extremo a lado" (Figura 7); o "de lado a lado" (Figura 9) . De estas técnicas, la de extremo a lado y lado a lado son mucho más comunes que la de extremo a extremo. La dirección del flujo sanguíneo está representada por las flechas. Las Figuras 1 y 2 muestran la sangre 1 dentro de una pared de vaso 2, y un collarín adventicio incluyendo un espacio hueco 3 detenido por una pared 4, por ejemplo, un material biodegradable. Un collarín 5 toca la pared de un vaso en-- las extremidades del collarín. Esta modalidad puede ser utilizada de la misma manera como se describe más adelante, para otras modalidades. La modalidad ilustrada en las .Figuras 3 y 4 se muestra aplicada a una anastomosis de extremo a extremo. El dispositivo comprende un cuerpo generalmente tubular 12, el cual, durante uso, se extiende longitudinalmente a lo largo de y rodea al vaso que lleva sangre hecho a través de anastomosis de extremo a extremo de un injerto 13 a un vaso sanguíneo nativo 14. Como es más claramente visible en la Figura 4, el cuerpo 12 del dispositivo tiene porciones de sello longitudinalmente separadas 15 provistas en sus extremos opuestos. Durante uso, cuando el dispositivo es colocado sobre el sitio 16 de la anastomosis de extremo a extremo, estas porciones de sello 15 sellan contra la superficie adventicia del injerto 13 y el vaso sanguíneo nativo 14. El espesor radial del material del cuerpo 12 es mayor en las porciones de sello 15 que en su porción intermedia 17. Consecuentemente, cuando las porciones de sello 15 sellan contra las superficies adventicias del injerto 13 y vaso 14, se forma un espacio entre el interior del cuerpo 12 del dispositivo y las superficies adventicias de extremos encerrados del injerto 13 y el vaso 14. Este espacio constituye un depósito cerrado 18 y se muestra longitudinalmente alineado con la anastomosis 16. Este depósito permite que una formulación farmacéutica conteniendo uno o más agentes sea colocada con la superficie adventicia del injerto y vasos 13, 14, en el sitio de la anastomosis 16. Cuando la formulación está en la forma de un fluido o gel, esta puede ser, por ejemplo, inyectada utilizando una aguja hipodérmica y jeringa, a través de la pared del cuerpo 12 hacia el depósito sellado 18. Los agentes contenidos en la formulación ventajosamente tiene un efecto anti-proliferativo, para encontrar hiperplasia íntima de célula de músculo liso en el sitio de la anastomosis 16 y áreas contiguas a la misma. La formulación farmacéutica no necesita ser un fluido o forma de gel, por ejemplo, puede ser una pasta deslizante que tiene una consistencia similar a aquella de la pasta de dientes. Después, permanece en contacto con la superficie adventicia en pulso a la cual se expone, restringiendo el vaso. Para colocar el dispositivo sobre el sitio de la anastomosis 16, el cuerpo cilindrico 12 puede ser deslizado axialmente sobre uno del injerto 12 y vaso sanguíneo 14 antes de ser anastomizado. El cirujano entonces puede unir el injerto 13 y el vaso 14 conjuntamente en el sitio de anastomosis 16 y el cuerpo 12 entonces puede ser deslizado sobre el sitio de anastomosis 16 para ocupar la posición mostrada en la Figura 4, para permitir el sello de- las porciones de sello 15 a las superficies adventicias respectivas . Alternativamente, el cuerpo 12 del dispositivo puede estar, como se muestra, provisto con una ranura longitudinal 19 a lo largo de toda su longitud. De esta manera, el cirujano puede anastomizar el injerto 13 y vaso 14 sin introducir el dispositivo 12 al cuerpo del paciente. Una vez que la anastomosis ha sido completada exitosamente, el cirujano puede seleccionar un cuerpo 12 apropiadamente dimensionado y aplicarlo alrededor del injerto y vaso anastomizados abriendo el cuerpo flexible 12 a lo largo de la ranura 19, deslizándolo sobre el injerto y vaso anastomizado 13, 14 y después sellando los bordes longitudinales opuestos del cuerpo en la ranura 19, conjuntamente, por ejemplo, utilizando un "pegamento de tejido" convencional, tal como pegamento de trombina vendido bajo el nombre comercial de Tisseal, o un pegamento a base de cianometacrilato . Para concentrar el efecto de la formulación farmacéutica contenida dentro del depósito 18, y para evitar la fuga de sus agentes hacia el tejido circundante, el cuerpo 12 es sustancialmente impermeable a la formulación. El material también es, ventajosamente, biodegradable durante un tiempo fijado, por ejemplo, un período de 1 a 5 días, a través de este tiempo, los agentes activos en la formulación probablemente escapen. El material también se elige de manera que no promueva una reacción demasiado severa desde el tejido circundante . Ejemplos de materiales adecuados para el cuerpo incluyen gelatina, alginato o colágeno. Estos materiales también permiten la flexibilidad del cuerpo y permiten que el dispositivo sea fabricado a través de moldeo o extrusión. El material de pared del cuerpo 12 también ventajosamente puede ser auto-sellante, con el fin de conservar la integridad del depósito sellado 18 si se requiere que este sea perforado a través de una aguja hipodérmica. Alternativa o adicionalmente, cualquier fuga en la pared que es revelada después de la remoción de la aguja puede ser sellada con "pegamento de tejido" o similar. Una escala de cuerpos 12 de diferente tamaño puede ser provista para ajustarse a los vasos de diferente tamaño. Los vasos de las extremidades inferiores comúnmente tiene un diámetro externo de aproximadamente 6-8mm. Los vasos coronarios comúnmente tienen un diámetro externo de aproximadamente 3-5mm. Por consiguiente, una escala de tamaños de cuerpo con un diámetro de entre aproximadamente 3-10mm puede estar disponible en paquetes esterilizados para el cirujano. Además, el tamaño del cuerpo puede variar para influenciar el volumen del depósito 18. Cualquier tamaño adecuado para el depósito 18 es de hasta lO l. preferiblemente 2-5 ml. Para adaptarse a la expansión del vaso que lleva sangre 13, 14 ocasionado por el flujo sanguíneo pulsátil a lo largo del mismo, por lo menos las porciones de sello 15 del cuerpo ventajosamente son capaces de ser estiradas con el fin de adaptarse a la expansión de las paredes del vaso. Es altamente deseable evitar la construcción de las paredes del vaso a través del dispositivo, aunque al mismo tiempo se mantenga los sellos intactos. La Figura 5 ilustra diferentes porciones de sello.

El espesor radial del material del cuerpo 12 es constante a lo largo de la longitud del cuerpo, y la porción intermedia 17 tiene forma de globo hacia adentro con relación al diámetro interno del cuerpo 12 en las porciones del sello 15. Ambas porciones de sello 15 se forman con colas, las cuales se extienden en la dirección longitudinal, por ejemplo, cada una para hacer contacto con las superficies adventicias respectivas del injerto 13 y vaso 14 sobre la longitud "X" en la dirección axial, de aproximadamente 8-15mm. Estas colas largas para las porciones de sello 15 pueden hacerse que actúen en una forma de "válvulas de aleta" para ayudar a sellar el depósito 18, aunque claramente no se desea ningún flujo a través de la "válvula de aleta". Alternativamente, las colas pueden ser dobladas hacia adentro (no mostrado) para doblar el espesor del cuerpo en sus extremos para formar porciones de sello de espesor de cuerpo radial mayor que el espesor del cuerpo en la porción intermedia, en una forma similar a aquella mostrada en la Figura 4. Para formar o ayudar a formar los sellos herméticos al fluido, el cirujano pueden adherir las porciones de sello 15 a las superficies adventicias, por ejemplo, utilizando un pegamento del tipo antes mencionado, por ejemplo, un "pegamento de tejido". Sin embargo, esto no es esencial. Por ejemplo, si el tamaño del cuerpo 12 en las porciones de sello 15 se selecciona para que coincida con la circunferencia de los vasos 13, 14 puede no ser necesario utilizar ningún pegamento, más bien, el cirujano puede basarse en la interferencia radial entre el diámetro interno del cuerpo 12 en las porciones de sello 15 y el diámetro de las superficies adventicias. Esto es particularmente con la porción de sello de cola larga de la modalidad de la Figura 5. Las porciones de sello no deben ser, sin embargo, herméticas en el vaso de manera que quede restringido. Las Figuras 6 y 7 ilustran una modalidad del dispositivo que es utilizado junto con una anastomosis de extremo alado. Estos dibujos muestran un cuerpo 20 que tiene una primera porción de cuerpo 21 y una segunda porción de cuerpo 22 ramificada hacia la misma a un ángulo menor que 90° para formar un cuerpo generalmente con forma de Y. Se apreciará que la primera y segunda porciones de cuerpo 21, 22 pueden ser ramificadas una hacia la otra en otros ángulos de ramificación hasta de e incluyendo 90°, en este último caso, el cuerpo puede tener una forma generalmente de T. El cirujano ventajosamente puede tener a su disposición una serie de cuerpos de diferente tamaño y diferente forma, a partir de los cuales puede seleccionar el dispositivo más apropiado para la situación y el tamaño de vasos anastomizados. La primera porción de cuerpo 21 puede ser, por ejemplo, aproximadamente l-10cm en longitud; la segunda porción de cuerpo 22 puede tener una longitud de 1-5 cm. La primera porción de cuerpo 21 generalmente es tubular y se muestra como rodeando un vaso sanguíneo nativo 23. La segunda porción de cuerpo 22 generalmente también es tubular y se muestra rodeando un injerto 24 anastomizado al vaso sanguíneo nativo 23 en una forma de extremo alado en el sitio de anastomosis 29. Como se puede ver a partir de la Figura 7, los extremos opuestos de la primera porción de cuerpo 21 están provistos con porciones de sello 25 y el extremo final de la segunda porción de cuerpo 22 está provisto con una porción de sello 26. Como en la modalidad anterior, estas porciones de sello 25, 26 venta osamente pueden ser selladas a las superficies adventicias del vaso sanguíneo 23 e injerto 24 respectivamente, utilizando un "pegamento de tejido". - La Figura 7 muestra un depósito sellado 27 formado entre el interior de la primera porción de cuerpo 21 y la superficie adventicia del vaso sanguíneo 23. El depósito 27 se extiende hacia el interior de la segunda porción de cuerpo 22. Este depósito sellado 27 está de esta manera alineado con el sitio 29 de anastomosis. El depósito 27 ventajosamente puede ser inyectado con un formulación farmacéutica líquida teniendo agentes activos, utilización una aguja hipodérmica y j eringa. Para facilitar el ajuste del dispositivo al vaso 23 e injerto 24, el cuerpo 20 del dispositivo puede ser provisto al cirujano en un paquete esterilizado conteniendo dos mitades simétricas. Divididas en y simétricas alrededor del plano de la sección ilustrada en la Figura 7. En tal caso, el cirujano podría requerir de ensamblar las dos mitades de cuerpo idénticas juntas después de haberse anastomizado el injerto 24 al vaso 23, y para sellar los bordes de cara de las mitades idénticas conjuntamente, por ejemplo, utilizando pegamento como se describió previamente. Alternativamente, solo la primera porción del cuerpo 21 puede ser provista con una ranura longitudinal 28, como se muestra en la Figura 6. De esta manera, el cirujano puede deslizar la segunda porción de cuerpo 22 sobre el extremo del injerto 24. El cirujano entonces podrá ser capaz de anatomizar el extremo libre del extremo 24 al vaso sanguíneo 23 y después deslizar la segunda porción de cuerpo 22 de regreso al injerto 24 para cubrir el sitio de anastomosis 29, utilizando la ranura 28 para alimentar el vaso sanguíneo 23 hacia el centro de la primera porción de cuerpo 21 que será rodeada por el mismo. El cirujano después puede sellar entre sí los bordes longitudinales de cara de la primera porción de cuerpo 21 a la ranura 28 para formar el depósito sellado 27 en los mismos. Se apreciará que se pueden utilizar otras configuraciones para las porciones de cuerpo 21 y 22. Por ejemplo, las primera y segundas porciones de cuerpo 21 y 22 pueden ser provistas en forma separada una de la otra y asegurarse entre sí para formar el depósito sellado 27 solamente cuando está in si tu en el paciente. Las Figuras 8 y 9 ilustran una modalidad del dispositivo adecuado para utilizarse en la situación de anastomosis de lado a lado. El cuerpo 30 del dispositivo se muestra comprendiendo una primera porción de cuerpo 31, a partir de la cual están ramificadas segundas y terceras porciones de cuerpo 32, 33. La ramificación forma un cuerpo generalmente con forma de X co o se muestra en la Figura 8. Las tres porciones de cuerpo 31, 32, 33 generalmente tiene una forma tubular. El dispositivo en general es similar a aquel ilustrado en las Figuras 6 y 7, salvo por la tercera porción de cuerpo 33. La primera porción de cuerpo 31 rodea al vaso sanguíneo ocluido 34 y está sellada a su superficie adventicial por las porciones de sello 35. Las segunda y tercera porciones de cuerpo 32, 33 rodean al injerto 36 y están selladas a la superficie adventicial del injerto en las ' porciones de sello respectivas 37, 38. Como se muestra más claramente en la Figura 9, el efecto de las porciones de sello 35, 37, 38 es para formar un depósito sellado 39 entre el interior del cuerpo 30 y las superficies adventicias de los vasos cerrados, el depósito 39, puede ser por lo menos parcialmente llenado con una formulación farmacéutica en la forma descrita anteriormente Para facilitar la fijación del dispositivo ilustrado en las Figuras 8 y 9, el dispositivo ventajosamente se provee al cirujano por lo menos en dos partes. Por ejemplo, la primera porción de cuerpo 31 puede ser provista en forma separada de un segundo componente que comprende segunda y tercera porciones de cuerpo 32, 33. Proporcionando las porciones de cuerpo con ranuras longitudinales (no mostradas), las porciones de cuerpo pueden ser fijadas alrededor de vaso 34 e injerto 33 y después selladas a lo largo de aquellas ranuras longitudinales y selladas entre sí a lo largo de una línea de contacto, para proporcionar el depósito sellado 39 alrededor del punto de anastomosis 40. Las Figuras 10 y 11 muestra una variante del dispositivo mostrado en las Figuras 8 y 9 (y se usan los mismos números de referencia para partes comunes) . Un uso particularmente adecuado para el dispositivo de la presente invención es en cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria. En dicha situación, el primer vaso sanguíneo 34 puede ser, como se muestra, una arteria coronaria que en parte está embebida en la pared del corazón 50. Un dispositivo de la forma mostrada en las Figuras 8 y 9 no puede ser fijado a una arteria coronaria 34 de parte embebida, ya que la primera porción de cuerpo es incapaz de extenderse completamente alrededor de la arteria 34. Por consiguiente, en las modalidades de las Figuras 10 y 11, la primera porción de cuerpo 51 de cuerpo 31 no describe un círculo completo cuando se ve en sección transversal a través de su extensión longitudinal; más bien, es generalmente arqueado. En la modalidad ilustrada, describe un arco de aproximadamente 180°. Esto permite que la primera porción de cuerpo 51 sea fijada solamente sobre la porción expuesta de la arteria coronaria 34 de parte embebida, para rodearla solo parcialmente. En esta disposición, los bordes longitudinalmente extendidos 41 de la primera porción de cuerpo 51 son sellados por el cirujano ya sea a la pared adventicia de la arteria coronaria 34 o, como se muestra, a la superficie de la pared de corazón 50, por ejemplo, utilizando pegamento de tejido. El dispositivo de las Figuras 10 y 11 también se puede aplicar a otros procedimientos quirúrgicos en donde el primer vaso que lleva sangre es una arteria embebida en parte en una pared del órgano suministrado por aquella arteria. Dichos órganos incluyen el cerebro, vejiga y útero.

Aunque las modalidades ilustradas se han concentrado en el uso de dispositivo para suministrar agentes a vasos que llevan sangre en sitios de anastomosis así como en sitios contiguos con los mismos, la invención no está limitada a dichos usos. El dispositivo, por ejemplo, puede ser utilizado más generalmente para suministrar agentes a la superficie adventicia de vasos que llevan sangre no anastomizados. Por ejemplo, después de una angioplastía de globo, un dispositivo de la forma mostrada en las Figuras 3 a 5 puede ser colocado alrededor del exterior de una arteria en la región del sitio de angioplastía de globo, con el fin de suministrar uno o más agentes a la misma a través de la superficie adventicia de la arteria. En las modalidades anteriormente descritas, los depósitos detallados se muestran tomando la forma de un espacio o claro radial entre la superficie adventicia del vaso que lleva sangre y el interior de por lo menos la primera porción de cuerpo, dicho espacio por lo menos esta parcialmente lleno durante uso por una formulación farmacéutica. Sin embargo, dicho espacio no es esencial. Por ejemplo en una modalidad alternativa, el cuerpo puede tener una capa externa extensible generalmente impermeable y una capa interna flexible, la cual está impregnada con la formulación y la cual esta dispuesta para estar en contacto con la superficie adventicia en uso.

La capa externa puede hacerse, por ejemplo, colágeno sólido y la capa interna se puede hacer de colágeno de tipo esponja entrelazado entre la misma, la capa de tipo esponja siendo capaz de ser impregnada con la formulación farmacéutica conteniendo el agente que será suministrado. En dicha situación el dispositivo puede ser provisto al cirujano para fijación con la formulación ya impregnada en el mismo, o puede ser humedecido con la formulación después de la fijación, por ejemplo, siendo inyectado como se describió anteriormente. ' Alternativamente, el agente puede ser colocado como revestimiento sobre una superficie interna del cuerpo, dicha superficie - esta justo en contacto con el vaso sanguíneo durante uso. Alternativamente, el agente puede ser dispersado a través de la estructura del cuerpo. Se desea que el cuerpo del dispositivo deba tener suficiente resistencia para resistir las fuerzas de torsión. Para este propósito, el cuerpo puede ser formado con, por ejemplo, una capa interna por ejemplo una película de colágeno, o costillas longitudinales transversales o helicoidales. Las costillas pueden ser provistas que subdividen el . depósito en compartimentos, y proporcionan estabilidad adicional. Las proteínas o ácidos nucleicos .pueden ser utilizados para el tratamiento o prevención de hiperplasia íntima que surge de cualquier circunstancia clínica. Por ejemplo, es posible tratar hiperplasia que surge de cualquier tipo de procedimiento quirúrgico, incluyendo angioplastia, por ejemplo, anguioplastia de globo; cirugía de derivación, tal como cirugías de derivación coronaria en donde una vena es anastomizada a una arteria; otros procedimientos de anastomosis, por ejemplo anastomosis en las piernas; y en periocto ias, por ejemplo, endasterioctomia, por ejemplo, endarteriocto ia de arteria carótida. También es posible tratar hiperplasia íntima asociada con daño arterial o hipertensión, por ejemplo hipertensión arterial pulmonar. La invención proporciona el tratamiento de hiperplasia íntima en cualquier tipo de vasos sanguíneos, por ejemplo en una arteria o vena, de preferencia una arteria. - - De acuerdo con la invención, es posible tratar o mitigar la hiperplasia íntima establecida o evitar que surja la hiperplasia íntima. Similarmente, es posible disminuir la probabilidad de que surja la hiperplasia íntima, o disminuir la severidad de hiperplasia íntima establecida o hiperplasia que o la hiperplasia que probablemente pueda surgir. El tratamiento de acuerdo con la invención puede presentarse antes, durante o después de un tratamiento quirúrgico, por ejemplo, con el fin de reducir la-oportunidad de que la hiperplasia surja después del procedimiento.

Preferiblemente, el ácido nucleico o proteína de VEGF se administra con el propósito de prevenir o tratar estenosis de novo . Sin embargo, también se puede utilizar para tratar o evitar restenosis. Las proteínas o ácidos nucleicos de la invención preferiblemente son suministrados en la forma de una formulación farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se puede utilizar cualquier formulación farmacéutica adecuada. Por ejemplo, las formulaciones adecuadas pueden incluir soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener antioxidante, reguladores de pH, bacteriostatos, antibióticos bactericidas, y solutos, los cuales hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden ser presentadas en contenedores de una sola dosis o dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas y frascos sellados, y pueden ser almacenados en una condición congelada o secada por congelación (leofilizadas) requiriendo solamente de la visión del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de uso. Se debe entender que, además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica que tengan relación con el tipo de formulación en cuestión. De las formulaciones posibles, se prefieren soluciones acuosas y no acuosas libres de pirógeno, estériles. Las proteínas, ácidos nucleicos y vectores pueden ser suministrados a cualquier dosis adecuada, y utilizando cualquier régimen de dosis adecuado. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la cantidad de dosis y régimen pueden ser adaptados para asegurar un tratamiento óptimo de la condición particular que va a ser tratada, dependiendo de numerosos factores. Algunos de estos factores pueden ser la edad, sexo y condición clínica del sujeto que va a ser tratado. Para el suministro de ácidos nucleicos naturales que codifican VEGF o construcciones que comprenden dichos ácidos nucleicos, las dosis típicas son de 0.1-5000 µg, por ejemplo 50-2000 µg, tales como 50-100 µg, 100-500 µg o 500-2000 µg por dosis. Para el suministro de la proteína de VEGF, las dosis adecuadas incluyen dosis de 1 a lOOOµg, por ejemplo de 1 a 10 µg, de 10 a 100 µg, de 100 a 500 µg o de 500 a lOOOµg. La dosis utilizada para el suministro de ácidos nucleicos de VEGF a través de vectores virales y no virales dependerá de muchos factores, incluyendo la eficiencia con la cual los vectores suministran los ácidos nucleicos de VEGF a las células, y la eficiencia con la cual los ácidos nucleicos de VEGF son expresados en las células. Por ejemplo, los vectores virales pueden ser suministrados en dosis de 104 a 1014 cfu o pfu/ml, por ejemplo de 10" a 10 10b a 10b, 10° a 101U, 10?? a 10" o 10 .12 1014 cfu o pfu/ml. Las dosis en la región de 105 a 109 cfu o pfu/ml son preferidas. El término pfu (unidad de formación de placas) se aplica a ciertos virus, incluyendo adenovirus, y corresponde a la capacidad de infección de una solución de virus, y se determina por infección de un cultivo de célula apropiado, y mediación, generalmente después de 48 horas del número de placas de células infectadas. El término cfu (unidad de formación de colonias) se aplica a otros virus, incluyendo retrovirus, y se determina a través de medios conocidos en la técnica generalmente después de 14 días de incubación con un marcador seleccionable. La técnica para determinar la titulación de cfu o pfu de una solución viral son bien conocidas en el arte. Para retrovirus, la dosis en la región de 105 a 10e cfu/ml son particularmente preferidas. Para retrovirus seudotipificados, las dosis en la región de 107 cfu/ml son particularmente preferidas. Para adenovirus, las dosis en la región de 10q pfu/ml son particularmente preferidas.

Similarmente, dichas dosis pueden ser incluidas dentro de implantes de la- invención para suministro gradual. Los ácidos nucleicos de VEGF asociados con vectores no virales también pueden ser suministrados en cualquier dosis adecuada, a través de cualquier medio de administración, como se describe anteriormente, o gradualmente a partir de un implante. Las dosis adecuadas son típicamente de 0.1 a 1000 µg de ácido nucleico, por ejemplo de 1 a 100 µg, 100 a 500 µg o 500 a 1000 µg, 1000 a 2000 µg, 2000 a 3000 µg o 3000 a 5000 µg. Las dosis preferidas están en la región de 5 a 50 µg, por ejemplo, 10 a 20 µg. Los horarios de dosis también variaran de acuerdo con, por ejemplo, la ruta de administración, la especie del receptor" y la condición del receptor. Sin embargo, se contemplan dosis individuales y dosis múltiples extendidas durante periodos de días, semanas o meses. También como se explicó anteriormente el suministro de proteínas y ácidos nucleicos de V?GF puede ser efectuado a través de un implante adecuado para ajustarse alrededor de un vaso sanguíneo, preferiblemente una arteria; de preferencia, el implante está en la forma de un collarín. Dicho implante efectuará el suministro gradual. Por ejemplo, el suministro puede presentarse durante un período de horas, semanas, días o meses .

Las proteínas y ácidos nucleicos de la invención pueden ser administrados a través de cualquier forma de administración, por ejemplo, administración tópica, cutánea, parenteral, intramuscular, subcutánea o transdérmica, o a través de inyección directa en la corriente sanguínea, inyección directa en o alrededor de- la pared arterial o a través de aplicación directa a los tejidos de la mucosa. Preferiblemente, la administración es a través de un implante, como se describe anteriormente. Las proteínas, ácidos nucleicos y vectores de la invención pueden ser utilizados para tratar hiperplasia íntima en cualquier mamífero. Se prefiere en tratamiento de pacientes humanos. La invención también proporciona equipos para el tratamiento o prevención de hiperplasia íntima. Estos equipos comprenden, (i) como un agente, proteína o ácido nucleico de V?GF de preferencia en asociación con otro vector, como se definió anteriormente; y (ii) un implante de la invención en la forma de un collarín en el cual la proteína o ácido nucleico de VEGF puede ser introducido. Preferiblemente,' el ácido nucleico o proteína de VEGF se provee en la fórmula de una formulación farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable como se definió anteriormente. Los componentes (i) y (ii) pueden ser empacados en cualquier forma adecuada. También se pueden incluir otros componentes conocidos en la técnica, por ejemplo, reactivos estándares y/o soluciones y/o equipo. La invención también proporciona métodos para tratar o evitar hiperplasia íntima que comprende administrar a un paciente con la necesidad una cantidad no tóxica efectiva de una proteína, ácido nucleico o agonista de VEGF de la invención. Dicho tratamiento se efectúa en la forma descrita aquí. Los implantes de la invención, especialmente implantes en la forma de collarines, como se definió anteriormente, también pueden ser utilizados para el suministro de agentes distintos a VEGF a los vasos sanguíneos, por ejemplo, arterias; cualquier agente adecuado puede ser suministrado de esta manera, para lograr cualquier objetivo deseado terapéutico. Se ha observado que complejos de plásmido/liposoma, retrovirus MMLV, retrovirus de VSV-G y adenovirus conducen a la expresión en arterias con collarín. La eficiencia de transferencia de gen fue más alta con adenovirus y los retrovirus VSV-G seudotipificados también produjeron una eficiencia de transfección relativamente alta. La utilidad de retrovirus VSV-G deficientes en replicación en la transferencia de gen arterial no ha sido demostrada previamente. La expresión fue vista en algunas células Endoteliales de las arterias transfectadas con adenovirus. Ya que la penetración desde la adventicia hacia la íntima a ocurrido, estos resultados producen la posibilidad general de alterar la función Endotelial en enfermedades de seres humanos a través de transferencia de gen extralumenal utilizando genes distintos a VEGF. También esto puede ser útil para la expresión en la adventicia y otros medios de producto de gen de difusión o de secreción, los cuales después actúan en la pared arterial en cualquier parte. Preferiblemente, dicho suministro efectúa el tratamiento de hiperplasia íntima, como se definieron anteriormente, aunque también puede efectuar los objetivos terapéuticos adicionales o alternativos. Los agentes terapéuticos preferidos para el suministro de esta manera incluyen proteínas distintas a VEGF que estimulan la producción de óxido nítrico (NO) en la vena en la pared arterial. El suministro de cintasa de NO especialmente cintasa NO inducible (iNOS) , para efectuar el tratamiento o prevención de hiperplasia íntima es particularmente preferido. Otros agentes terapéuticos preferidos incluyen agonistas que activan el receptor de VEGF Endotelial (ver anteriormente) . Estos agonistas típicamente serán moléculas sintéticas pequeñas. Los péptidos que incluyen fragmentos de péptido de proteína VEGF también pueden ser utilizados. En este caso, el tratamiento puede ser efectuado a través del suministro de los mismos péptidos a ácidos nucleicos que los codifican, como se describió anteriormente para VEGF. Estos son particularmente suministrados a través de la misma ruta, es decir, a través de un implante como se definió aquí, aunque pueden ser suministrados sistemáticamente. De preferencia, los agentes terapéuticos estarán en la forma de ácido nucleico que codifica un polipéptido o proteína farmacéuticamente activos. Más preferiblemente, este ácido nucleico esta comprendido dentro de una construcción como se definió anteriormente. Aún de mayor preferencia el ácido nucleico o construcción será suministrado a la serie a través de un vector como se definió anteriormente, por ejemplo, un vector viral o no viral, como se definió. De esta manera, la transferencia de gen extra arterial puede ser utilizada para el suministro de material genético hacia la pared de los vasos sanguíneos, preferiblemente arterias. A partir de los ejemplos, se puede ver cambios en ese medio y aún en el endotelio pueden lograrse a partir del lado adventicio, permitiendo el desarrollo de nuevos métodos para el tratamiento del vaso sanguíneo, por ejemplo, arterial, enfermedad. Por consiguiente, la invención proporciona el uso, en la fabricación de un tratamiento o prevención de hiperplasia de un vaso sanguíneo, de NOS (opcionalmente iNOS) ; o un ácido nucleico que codifica NOS (opcionalmente iNOS) ; en donde la proteína NOS o ácido nucleico está provisto en un implante, preferiblemente un collarín como se definió anteriormente para VEGF. La invención también proporciona equipos que comprenden, (i) en proteína o ácido nucleico de NOS (opcionalmente iNOS) ; y (ii) un implante de la invención.

Estos equipos son como se describió anteriormente para V?GF.

Estos son adecuados para el tratamiento o prevención de hiperplasia íntima de un vaso sanguíneo. La invención también proporciona un método para tratar hiperplasia íntima de un vaso sanguíneo que comprende implantar un implante de la invención comprendiendo una proteína o ácido nucleico NOS cerca de la hiperplasia que será tratada o evitada, efectuando así el suministro de la proteína o ácido nucleico NOS. El ácido nucleico de NOS preferiblemente está asociado por un vector, como se describe anteriormente, para VEGF. El tratamiento se lleva a cabo como se describe anteriormente para V?GF, y las dosis y formulaciones farmacéuticas también son como se describió anteriormente para VEGF. La invención también proporciona implantes de la invención que comprenden una proteína o ácido nucleico de NOS (opcionalmente iNOS) .

El hallazgo de que VEGF estimula la producción de NO y prostaciclina en la pared arterial, también sugiere que V?GF y agonistas de receptores de VEGF serán útiles en el tratamiento de otras condiciones enlazadas a NO y/o enlazadas a prostaciclina. En particular, VEGF y agonistas de los receptores a los cuales se une VEGF pueden ser utilizados para tratar hipertensión, o alta presión sanguínea. Forte et al , Lacet (1997) 349:837-42 encontraron que los bajos niveles de NO son característicos de los individuos que sufren de hipertensión esencial (es decir, sistémica) el NO se sabe que relaja las paredes de los vasos sanguíneos; Forte et al sugieren que la producción dañada de NO reduce esta relajación, conduciendo a la constricción de los vasos sanguíneos y así a la presión sanguínea incrementada. Además, en los individuos que padecen de hipertensión esencial, los niveles de prostaciclina pueden ser reducidos. Ya que VEGF estimula la producción de NO y prostaciclina, puede ser útil para combatir la alta presión sanguínea. Más específicamente, un agente de la invención puede ser útil en la terapia de las tres enfermedades de interés particular. La primera es hipertensión esencial, es decir, a sistema de alta- presión sanguínea en cualquier ubicación, o alrededor del cuerpo. Para el tratamiento de hipertensión esencial, la cual es una condición sistémica, se prefiere que una proteína o agonista de VEGF de la invención sea suministrada en una forma sistémica, por ejemplo, a través de suministro sistémico de ácidos nucleicos de VEGF que codifican proteínas o agonistas de VEGF, a través de terapia de gen. La segunda enfermedad es corpulmonar, es decir falla cardiaca del ventrículo derecho ocasionada por alta presión sanguínea en arteria pulmonar. Esto se puede tratar administrando ácidos nucleicos, proteínas y agonistas de VEGF como se describió anteriormente, especialmente suministrando ADN de VEGF a la arteria a través de un collarín arterial (ver anteriormente) con la subsecuente expresión del ADN para producir la proteína en la pared arterial. La tercera enfermedad es hipertensión pulmonar primaria, es decir alta presión sanguínea en los pulmones. Esto usualmente conduce, finalmente a falla cardiaca y muerte, y actualmente solo se puede tratar a través de una infusión de prostaciclina continua o un transplante de pulmón. Aquí la técnica de tratamiento preferida podría ser transformar o trasnfectar el tejido de pulmón con ácido nucleico que codifica VEGF o una agonista del mismo, generando así VEGF in vivo y estimulando la producción de NO y/o prostaciclina, por consiguiente, la invención proporciona el uso de un agente seleccionado del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) , un ácido nucleico que codifica VEGF, un agonista de VEGF, y una molécula de ácido nucleico que codifica una agonista de un receptor al cual se une VEGF, en la fabricación de un medicamento para la estimulación de una producción, in vivo, de oxido nítrico (NO) o prostaciclina. Los equipos de la invención que comprenden proteínas, o ácidos nucleicos, de VEGF, o agonistas de un receptor al cual se une VEGF o ácido nucleicos que codifican dichos agonistas también son adecuados para el tratamiento de hipertensión . La invención también proporciona un método para tratar ? evitar hipertensión que comprende administrar a un paciente una cantidad no tóxica efectiva de una proteína, ácido nucleico o agonista de VEGF de la invención. Dicho tratamiento se efectúa como se describió en la presente. Para hipertensión pulmonar primaria, el método preferido es la transformación del tejido del pulmón con un ácido nucleico que codifica VEGF o ácido nucleico que codifica un agonista de un receptor al cual se une VEGF como se definió aquí. Una condición adicional que puede ser tratada con la invención es ateroesclerosis la cual puede ser una condición enlazada a NO y/o enlazada a prostaclclina . Cuando el tratamiento de ateroesclerosis es el punto, se prefiere utilizar un agonista de VEGF como se definió aquí.

De esta manera, la invención proporciona el uso de un agente seleccionado de Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) , un ácido nucleico que codifica VEGF, un agonista de VEGF y una molécula de ácido nucleico que codifica un agonista de un receptor al cual se une VEGF, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de ateroesclerosis a través de la estimulación de la producción in vivo de NO y/o prostaciclina. La invención también proporciona un método para tratar o evitar ateroesclerosis, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva no tóxica de una proteína, ácido nucleico o agonista de VEGF de la invención. Dicho tratamiento se efectúa como se describió en la presente. Para el tratamiento de ateroesclerosis, un modo preferido de suministro es el suministro oral, por ejemplo en la forma de tabletas, de una proteína de VEGF de la invención o, preferiblemente de un agonista de VEGF de la invención. Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Se utilizaron las siguientes abreviaturas: BSA albúmina de suero de bovino DMEM medio Eagle modificado con Dulbecco FCS suero de becerro fetal HUVEC células endoteliales de vena umbilical humana IgG inmunoglobulina G MAP cinasa cinasa de proteína activada con mitogen mAb anticuerpo monoclonal PBS solución salina regulada en su pH con fosfato PGI2 prostaciclina cPLA2 fosfolipasa citosólica A2 PIGF factor de crecimiento de placenta SDA PAGE electroforesis en gel de decilsulfato de sodio-poliacrilamida VEGF factor de crecimiento Endotelial vascular vWF factor de von Willebrand VSMC células de músculo liso vasculares EJEMPLO 1 El efecto de la transferencia de gen de VEGF específico en célula endotelial (EC) en el espesamiento de la íntima se estudio utilizando un collarín de silicón insertado alrededor de las arterial carótidas, el cual actúa tanto como el agente que ocasiona el crecimiento de células de músculo liso de la íntima y como un depósito para el gen y el vector. El modelo conservó la integridad de EC y permitió la transferencia de genes extravascular directa sin ninguna manipulación intravascular.

EJEMPLO 1.1 Transferencia de Gen: El espesamiento de la íntima se indujo en las arterias carótidas de treinta dos conejos blancos de Nueva Zelanda insertando un collarín de silicón inerte alrededor de las arterias bajo anestesia general (Booth et al , Atherosclerosis (1989) 76:257-268). La transferencia de gen se realizó cinco días después de la colocación del collarín abriendo moderadamente el collarín bajo anestesia e inyectando 500 µl de complejo de plasmido/liposoma al collarín (es decir, sobre la superficie adventicia de la arteria) no se involucraron manipulaciones intravasculares en ninguno de los pasos de los estudios. Complejos de plasmido/liposoma: veinticinco µg del plasmido CMV5-VEGF-164 (conteniendo ADNc de VEGF de ratón (Breier et al , Development (1992) 114:521-32; nucleótidos 1-583) se formaron en complejos con 25 µl de lipofectina (BRL) mientras se diluía con 500 µl Con una solución de Ringer. Los complejos se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos antes de la transferencia de gen. Se determinó previamente que a la concentración utilizada en los complejos de plasmido/lipofectina del estudio actuales fueron no tóxicos a la EC aórtica del conejo in vi tro . Se tranfectaron arterias de control con un complejo de plásmido/liposoma conteniendo plásmido de expresión de ADNc de E. Coli lacZ (Kalnins et ai, supra) (nucleotidos 1-3100) los plásmidos utilizados para los estudios fueron aislados de cultivos E. Coli (DH5a) utilizando columnas Qiagen Mega y se purificaron utilizando tres extracciones de fenol/cloroformo y una precipitación con etanol (Ausubel et al , eds. Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons (1991) 4.2.3-4.2.4) fueron ajustados a lµg/µl y analizados para ser libres de cualquier contaminación microbiológica o de endotoxina (ensayo de Limulus, límite de detección 0.2 ng) . Los animales fueron sacrificados 3 (n=8) , 7 (n=12) y 14 (n=12) días después de la operación de transferencia de gel; las arterias fueron removidas cuidadosamente y divididas en tres porciones iguales: la tercera cercana fue fijada por inmersión en 4% de paraformaldehído/PBS durante 15 minutos y fue embebida en el compuesto OCT (Miles Scientific) (Ylá-Herttuala et al: J. Clin. Invest. (1995)95:2692-2698). La tercera media se fijó como se hizo anteriormente durante 4 horas, se enjuagó en 15% de sacarosa durante 48 horas y se embebió en parafina. La tercera lejana se embebió directamente en el compuesto OCT y se congeló en nitrógeno líquido. En cuatro arterias, la tercera distante fue utilizada para aislamiento de ARNm y RT-PCR (ver más adelante) . Se utilizaron diez secciones aleatoriamente seleccionadas de la porción media para la determinación de relación de espesor de íntima/medios (Ylá-Herttuala et al: Arteriosclerosis (1986) 6; 230-236) a través de dos observadores independientes sin el conocimiento del origen de las muestras. Los valores medios de las dos mediciones independientes se utilizaron para calcular los resultados (media ± DS) . Las diferencias en las relaciones de espesor de íntima/medios entre los grupos fueron analizadas a través de ANOVA, seguido por la prueba t modificada (* p<0.05) . RT-PCR: Las porciones distantes de VEGF (n=2) y arterias transfectadas lacZ (n=2) recolectadas 7 días después de la transferencia de gen se utilizaron para aislamiento de ARNm (Micro-FastTrack, Invitrogen) y se transcribieron en forma inversa al primer AD?c de estructura de cadena utilizando transcriptasa inversa AMLV (5U por reacción, Boehringer) utilizando iniciadores de hexámero aleatorios (equipo de ciclo de AD?c, Invitrogen) como se describió (Hiltunen et al: Circulation (1995) 92:3297-3303). Se realizó una PCR de treinta y cinco ciclos con polimerasa Taq (Boehringer) y los iniciadores específicos para la construcción de pCMV5-VEGF-164 transfectada (5' -iniciador : SEC. DE IDE?T. ?O.: 9; 3' -iniciador : SEC. DE IDE?T . ?O. 10; parámetros de ciclo de PCR: 1 minuto 90°C, 1 minuto 60°C, 1 minuto 72 °C, excepto para el último ciclo, 5 minutos) . El fragmento amplificado con una longitud esperada (547nt) fue visto en las arterias transfectadas con VEGF. Los marcadores de tamaño de ADN (línea de lkb, BRL) se muestran sobre ambos lados del gel. Se tomaron microfotografías mostrando las características de las arterias carótidas de conejo 7 días después de la transferencia de gen de VEGF o lacZ . Las inmunotinciones de las arterias transfectadas demostraron: La arteria de control transfectada con el plásmido lacZ/liposomas (Mab HHF-35, específico en SMC, dilución 1:500, Enzo Diagonistics) mostró el espesamiento de la íntima típica; la arteria transfectada con plásmido/liposomas de VEGF (M b HHF-35 específico en SMC) mostró un espesamiento de la íntima solamente limitado; el endotelio estuvo presente en todos los segmentos vasculares estudiados (sección en serie A, específico en EC, dilución MAb, CD31, 1:50, DAKO) ; No se detectó ninguna evidencia de inflamación en arterias transfectadas con VEGF-y lacZ (Mab RAM-11 específico en macrófago, dilución 1:500, DKO) ; La neovascularización en la adventicia de la arteria transfectada con VEG fue vista 14 días después de la transferencia de gen (tinción con hematoxilina-eosina) . El sistema de peroxidasa de rábano de avidina-biotina (Vector Élite, Vector Labs) se utilizó para las inmunotinciones (Ylá-Herttuala et al, PNAS (1990) 87: 6959-6963) . Los controles para las inmunotinciones incluyeron incubaciones con inmunoglobulinas coincidentes en clase y especies irrelevantes, e incubaciones en donde se omitieron los anticuerpos primarios. Se realizaron hibridaciones in si tu utilizando una ribosonda de VEG antisentido (583 nt) , sintetizada a partir del plásmido pBluescript SK (Stratagene) como se describió (Ylá-Herttuala et al (1990), supra ) . En resumen, se pre-trataron secciones embebidas en parafina con proteína K, se acetilaron y se hibridizaron utilizando ribosondas marcadas con 35-S-UTP (DuPont, NEN) (6xl06 cpm/ml) a 52°C durante 16 horas. El lavado final después de la hibridación fue con O.lxSSC a 60°C durante 30 minutos. Se utilizó la autorradiografía para la detección de señal (Eastman-Kodak NAB-2) . Las hibridaciones de control con una ribosonda de sentido de no hibridación (Ylá-Herttuala et al (1990), supra) dieron resultados negativos. Las secciones fueron teñidas por conteo con hematoxilina. Ejemplo 1.2 Se realizó la transferencia de gen como se describió en el Ejemplo 1.1. A los conejos se les administró L-NAME (70 mg/kg/d) en el agua para beber, empezando un día antes del gen de transferencia de VEGF (n=5) o lacZ (n=5) . Los animales se sacrificaron 7 días después de la transferencia de gen y se analizaron para la relación de espesamiento de íntima/medios e histología como se describió anteriormente (Ylá-Herttuala et al , Arteriosclerosis (1986) 6: 230-236; Ylá-Herttuala et al (1990) supra) . La diferencia en el espesamiento íntimo fue abolida. Ejemplo 1.3 Los cultivos confluentes de HUVEC fueron lavados dos veces con un medio libre de suero y se incubaron con este medio ya sea en presencia de las concentraciones de VEGF humano recombinante indicadas durante 15 minutos, o con 10 ng/ml de VEGF durante los tiempos mostrados. En algunos experimentos, las células fueron pre-tratadas durante 1 hora con lOOµM L-NAME y subsecuentemente tratadas ya sea con o sin 10 ng/ml de VEGF durante 10 minutos. El medio se removió y las células se lisaron rápidamente a 4°C a través de la adición de lO M Tris/HCl (pH 7.6), 5mM EDTA, 50mM NaCl, 30 mM de pirofosfato de sodio, 50mM NaF, 0. lmM Na3V04/ lmM PMSF y 1% Tritón X-100 (regulador de pH de lisis) . Los lisatos fueron aclarados a través de centrifugación a 1500 xg durante 10 minutos, y las inmunoprecipitaciones se realizaron incubando los lisatos aclarados con PY20 anti-fosfotirosina mAb durante 2 horas a 40°C. Los inmunoprecipitados fueron recogidos incubando los lisatos durante 1 hora más con proteína A-agarosa. Los inmunoprecipitados se lavaron tres veces con regulador de pH de lisis y las proteínas después fueron extraídas con regulador de pH de muestra de 2xSDS-PAGE. Después de SDS-PAGE, las proteínas inmunoprecipitadas fueron transfectadas a membranas y después inmunoteñidas con PY20 mAb. Esto muestra que el VEGF induce la fosforilación de una proteína de 205 kD mayor correspondiendo al receptor vEGF (las proteínas fosforiladas de tirosina mayor en 100, 125, 145, 190 y 205) . L-NAME abolió la respuesta a VEGF. El VEGF recombinante se agregó a la concentración de 25 ng/ml para tiempos de hasta 2 horas (la producción de nitrito se incrementó a partir del nivel de íntima de 16 µM, y permaneció a 1.8-2 µM) , o a las concentraciones indicadas de 0, 2.5, 25 ng/ml durante 10 minutos. Se midió el efecto del pre-tratamiento de L-NAME (100 µM) (1 hora) en la respuesta VEGF después de la adición de 25 ng/ml de VEGF durante 10 minutos. Se midió la producción de nitrito utilizando el método de producción capilar (Leone et al , in Methods in Nitric Oxide Research, Feelisch and Stanler, eds. John Wiley & Sons, New York (1996) 499-508) . El nivel se incrementó a c. 19 y c. 2.1 µM en presencia de VEGF; se redujo al nivel de control (c. 17 µM) bajo la adición de L-NAME. Resultados: Se encontró que, comparado con las arterias transducidas con lacZ, la transferencia del gen VEGF significativamente redujo el espesamiento de la íntima una semana después de la operación (relación de íntima/medios 0.3 contra 1.1, <0.05, respectivamente). El efecto se redujo después de dos semanas, el cual probablemente se debió al hecho de que la transferencia de gen mediada por plásmído/liposoma típicamente sólo indujo la expresión temporal del gen transfectado con la expresión de proteína máxima entre 2-3 días después de la transferencia de gen (Nabel et al, Ann. Rev. Physiol. (1994) 56:741-761). Los análisis inmunohistoquímicos de las arterias mostraron que el espesamiento de la íntima fue casi exclusivamente compuesto de SMC. La capa endotelial estuvo presente en todos los segmentos estudiados. No se detectaron efectos adversos o inflamación en las arterias transfectadas. La expresión del VEGF transfectado se confirmó a través de RT-PCR utilizando iniciadores específicos para el transgen y a través de hibridación in si tu . La mayoría de la expresión de VEGF y lacZ ocurrió en la adventicia y medios externos en fibroblastos y SMC. La neovascularización de adventicia se vio en tres de las arterias transfectadas con VEGF 14 días después de la transferencia de gen. No se detectó ninguna neovascularización en las arterias transfectadas con lacZ. Se ha mostrado previamente que la transferencia de gen de lacZ-plasmido/liposoma utilizando el modelo de collarín conduce a una transferencia de gen local en 0.05% de las células arteriales. A pesar de la baja eficiencia de la transferencia de gen, la forma secretada de VEGF producida dentro del collarín condujo a efectos biológicos en el microambiente arterial local, como se indicó a través de la presencia de neovascularización en tres arterias transfectadas con VEGF, 14 días después de la transferencia de gen. Como en la hipoxia aguda, se cree que el VEGF secretado alcanza la EC a través de difusión y se une a receptores de VEGF en EC. Se hace una hipótesis de que los efectos inhibidores de VEGF en el espesamiento de la íntima se debieron ya sea a un factor derivado de EC inducido por VEGF directo o indirecto o actividad que, a su vez, puede inhibir la proliferación de SMC. En particular, se hizo una hipótesis de que los efectos de VEGF en el espesamiento de la íntima fueron mediados a través de la trayectoria NO. Esta hipótesis se probó en un subgrupo de conejos blancos de Nueva Zelanda (n=8) dando a los animales el inhibidor de sintasa NO L-NAME durante los experimentos de transferencia de gen. Se encontró que, L-NAME abolió la diferencia en el espesamiento de la íntima entre las arterias transfectadas con VEGF-y lacZ. Las células objetivo principales para VEGF en la pared arterial son EC. Los únicos otros tipos de célula que poseen receptores de VEGF son los monocitos, pero, según juzgado a partir de la inmunocitoquímica con anticuerpos específicos, los monocitos están ausentes de las arterias carótidas en el collarín bajo estas condiciones. Estos resultados (las habilidades de diferencia en el espesamiento de la íntima) fueron consistentes con la inhibición inducida por VEGF del espesamiento de la íntima a través de la estimulación de la producción de NO. Por lo tanto, se examinó si VEGF puede estimular directamente la producción de NO en cultivos de EC. VEGF indujo la fosforilación de tirosina de una proteína de 205 kDa mayor correspondiendo al receptor de VEGF dentro del rango de concentración de 1-25 ng/ml. La adición de VEGF a células endoteliales de vena umbilical humanas cultivadas (HUVEC) ocasionó un incremento dependiente del tiempo y de la concentración en la producción de NO, según verificado a través de la medición de los niveles de nitrito. El efecto de VEGF en la producción de NO se vio tan pronto como 30 segundos después de la adición de VEGF, alcanzando un máximo después de 5 minutos y se sostuvo hasta durante 2 horas. El efecto máximo medio de VEGF se obtuvo a 5 ng/ml. La fosforilación inducida por VEGF y producción de NO completamente fueron abolidas en presencia de 100 µM L-NAME. De esta manera, es probable que la transferencia del gen VEGF estimula la producción de NO en EC en las arterias transfectadas y limita la proliferación de SMC por lo menos parcialmente a través de un mecanismo mediado por NO. Los hallazgos son compatibles con las observaciones previas de que la transfección de arterias con ADNc de sintasa de NO endotelial reduce el espesamiento de la íntima (Von der Leyon et al , PNAS (1995) 92:1137-1141).

Callow et a-Z ( supra) y Asahara et al (supra) concluyeron que la administración de la proteína de VEGF estimuló la proliferación de EC en arterias desnudas, pero los mecanismos reales implicados en la inhibición del espesamiento de la íntima no fueron estudiados. La arteria carótida con collarín, el espesamiento de la íntima se estimuló en presencia de un endotelio anatómicamente intacto. Por lo tanto, es probable que el efecto inhibidor de la transferencia de gen de VEGF arterial en el espesamiento de la íntima aquí reportado se debió a la re-endotelización estimulada por VEGF. De acuerdo con estos resultados el VEGF puede inducir directamente la producción de NO en HUVEC, de manera que éste es un mecanismo a través del cual VEGF puede inhibir el espesamiento de la íntima. El VEGF también puede estimular' la producción de otros factores que pueden regular negativamente la proliferación de SMC incluyendo TGF-ß o prostaciclina. Ejemplo 2 Utilizando los complejos de plásmido/liposoma para el suministro de gen, se suministraron retrovirus derivados del virus de leucemia de murino Moloney (MMLV) , retrovirus conteniendo la proteína G del virus de estomatitis vesicular pseudotipificada (VSV-G) y adenovirus a la arteria carótida del conejo, utilizando un collarín silástico aplicado a la adventicia. El collarín se utilizó porque 1) proporciona un depósito de suministro de gen; 2) no se realizan manipulaciones intralumenales y el endotelio permanece anatómicamente intacto a través de esto; y 3) la instalación del collarín induce a la proliferación de células de músculo liso arteriales (SMC) y mejora la eficiencia de transferencia de gen retroviral, cuando se requiere la proliferación de células objetivo. Transferencia de Gen: Se utilizaron conejos blancos de Nueva Zelanda (1.8-2.5 kg) . El anestésico fue fentanil-fluanisona (0.3 ml/kg) /midazolam (1 mg/kg) /Yla-Herttuala et al . , J. Clin. Invest. (1995) 95:2692-2698). Una incisión en la línea media del cuello expuso la arteria carótida izquierda. Se colocó un collarín silástico de 2 cm biológicamente inerte (MediGene Oy, Kuopio, Finland) alrededor de la arteria carótida, de manera que tocaba la adventicia ligeramente en cualquiera de los extremos (Booth et al, supra) . Se realizó la transferencia de gen 4-5 días después de la operación para aplicar el collarín. Para la transferencia de gen, los animales fueron re-anestesiados. El collarín, el cual había sido re-expuesto quirúrgicamente, se abrió moderadamente y se llenó con 500 µl de la solución de transferencia de gen (ver más adelante) . La incisión se cerró y las arterias se analizaron después para la eficiencia de transferencia de gen.

Análisis Histológico: Se removieron cuidadosamente arterias con collarín y se dividieron en tres partes iguales: el tercero próximo fue fijado por inmersión en 4 % de paraformaldehído/PBS (pH 7.4) durante 15 minutos, seguido por embeber en el compuesto OCT (Miles Scientific, USA) . El tercer medio se fijo por inmersión en 4% de paraformaldehído/PBS (pH 7.4) durante 4 horas, se enjuagó en 15% de sacarosa (pH 7.4) durante 48 horas y se embebió en parafina. El tercero distante se embebió en el compuesto OCT y se procesó para secciones congeladas. Se tiñeron diez secciones aleatoriamente seleccionadas con X-gal para actividad de ß-galactosidasa a 12 horas y se utilizaron para la determinación de eficiencia de transferencia de gen (Nabel et al, Science (1990) 249: 1285-1288; Ylá-Herttuala et al, (1995) supra) . La eficiencia de transferencia de gen se calculó como un porcentaje de las células que contienen ß-galactosidasa como una proporción del número total de núcleos en 20 campos de 100X aleatoriamente seleccionados. Las secciones aleatoriamente seleccionadas a partir de cada tercera porción de las arterias con collarín fueron utilizadas para inmunocitoquímica y análisis de tipo de células y/o relaciones de espesor de íntima/medios (Booth et al , supra) . Los tipos de célula fueron identificados utilizando los siguientes anticuerpos: SMC: HHF-35 mAb (dilución 1:500, Enzo Diagnostics, USA), a-actina mAb (dilución 1:1000, Sigma Chemical Co . ) ; macrófagos: RAM-11 mAB (dilución 1:100, Dako, USA), anti-CD68 mAb (dilución 1:250; Dako), células endoteliales: anti-CD31 mAb (dilución 1:50, Dako); leucocitos polimorfonucleares: anti-CD45 mAb (dilución 1:100, Dako), y células T anti-conejo: MCA 805 mAb (dilución 1:1000; Dako). Se utilizó el sistema de peroxidasa de rábano de avidina-biotina para la detección de señal (Vector laboratories) (Ylá-Herttuala et al (1995) supra) . Después de la inmunotinción, las secciones de tejido fueron teñidas por conteo por hematoxilina. Determinación del índice de Proliferación: El índice de proliferación en las arterias con collarín se determinó utilizando la etiquetación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (Soma et al, Arterioscler. Thromb. (1993) 13:571-578). En resumen, se inyectaron conejos blancos de Nueva Zelanda (n=12) con BrdU (40 mg/kg del peso del cuerpo) 3 horas antes del sacrificio. Las arterias carótidas se fijaron en 70% de etanol durante la noche y se embebieron en parafina. Se tiñeron secciones en serie (20 secciones por animal) para detectar BrdU utilizando IgG de antiratón marcado con FITC (Dako) , después de la tinción con yoduro de propidio de los núcleos . El índice de marcación se calculó como el porcentaje de núcleos positivos a BrdU. Las arterias carótidas contra laterales fueron operadas por imitación y se utilizaron como controles. Plásmido/Liposom s : Se formó en un complejo el plásmido de expresión de pCMV-ß-galactosidasa (lacZ) (Promega) con el reactivo de lipofectina (BRL) como sigue: 25 µg del plásmido fueron lentamente mezclados con 25 µl del reactivo Lipofectina, mientras se diluía a 500 µl con la solución de Ringer. No se observaron precipitados en la solución de plásmido/Lipofectina. La mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos y se utilizó para transferencia de gen en dos horas. Las preparaciones de plásmido fueron verificadas para la ausencia de contaminación de lipopolisacárido (Limulus assay, Sigma Chemical Co . ) Retrovirus: Se utilizaron los retrovirus pLZRNL MMLV conteniendo LacZ (Ylá-Herttuala et al, (1995) supra; Miyanohara et al, PNAS (1994) 85:6538-6542) con los retrovirus LacZ VSV-G (Yee et al, PNAS (1994) 91:9564-9568) para los estudios. En ambos, la expresión lacZ es inducida por 5' LTR. Los retrovirus anfotrópicos LZRNL deficientes en replicación fueron empacados en células PA317 y utilizados en una titulación de 5xl06 cfu/ml como se describió (Yla-Herttuala et al, (1995) supra) . Los retrovirus VSV tipificados VSV-G deficientes de replicación fueron producidos en células 293 GP utilizando transfección pasajera (Yee et al , supra) . Los retrovirus seudotipificados fueron concentrados utilizando ultracentrifugación y se utilizaron a una titulación de 1x10 cfu/ml. Antes de uso, las preparaciones retrovirales fueron verificadas para la ausencia de cualquier contaminante bacteriológico o virus auxiliares (Yee et al , supra) . Vectores Adenovirales: Se utilizaron adenovirus eliminados en El deficientes en replicación para los estudios (Gosh-Choudhury et al, Gene (1986) 50: 161-171; Simari et al, J. Clin. Invest. (1996) 98: 225-235). El ADNc de ß-galactosidasa de objetivo nuclear bajo un promotor ß-actina y un mejorador CMV se clonó en la región eliminada El del genoma adenoviral utilizando recombinación homologa (Gosh-Choudhury et al, supra, Simari et al, supra) . Adenovirus deficientes en replicación fueron producidos en 293 células y concentrados a través de ultracentrifugación. Se utilizaron titulaciones de IxlO9 pfu/ml para los experimentos de transferencia de gen. Las precipitaciones adenovirales fueron analizadas para la ausencia de virus auxiliares o contaminantes bacteriológicos (Gosh-Choudhury et al , supra) . Resultados: El collarín de la adventicia condujo a hiperplasia íntima 7-14 días después de la operación. El endotelio permaneció anatómicamente intacto a través de los estudios. La etiquetación con BrdU indicó un índice de proliferación pico de 24% 3 días después de la operación. La neoíntima estuvo exclusivamente compuesta de SMC. Los complejos de plásmido/liposoma condujeron a una transferencia de gen detectable hacia la adventicia y medios externos, con una eficiencia menor que 0.01%. Las arterias con collarín no transfectadas o tratadas con liposoma no mostraron ninguna tinción para la actividad de ß-galactosidasa. La transferencia de gen retroviral de la adventicia fue menos eficiente sin el collarín, probablemente ya que la transferencia de gen retroviral sólo ocurre en células de proliferación. La eficiencia de transferencia de gen con retrovirus MMLV deficientes en replicación fue baja (menor que .01%). La eficiencia de transferencia de gen con retrovirus seudotipificados VSV-G fue de 0.1%. Utilizando los retrovirus MMLV y VSV-G, se observó una tinción de ß-galactosidasa en la adventicia y medios externos. Los adenovirus deficientes en replicación dieron una transferencia de gen eficiente, la tinción de ß-galactosidasa siendo detectada en la adventicia y medios externos. En forma interesante, la tinción también fue observada en algunas células endoteliales y en algunas células de la íntima. Ya que la construcción de adenovirus lacZ contuvo una señal de localización nuclear para ß-galactosidasa, la tinción de X-gal intensa fue ubicada en los núcleos de las células transfectadas. La eficiencia de transferencia de gen fue de aproximadamente 10%, según estimado a partir del número total de núcleos teñidos en las secciones analizadas. Algunas de las células inflamatorias fueron vistas en arterias transfectadas con retrovirus y adenovirus VSV-G. Ninguna célula inflamatoria fue vista en las arterias transfectadas con plásmido/liposoma. En este ejemplo, la transferencia del gen marcador de ß-galactosidasa (lacZ) a la adventicia y medios externos ocurrió con todos los sistemas de transferencia de gen. Los adenovirus también transfirieron el gen de ß-galactosidasa a algunas células endoteliales. Después de cinco días, los vectores adenovirales produjeron la eficiencia de transferencia de gen más alta, con hasta un 10% de células mostrando la actividad de ß-galactosidasa. Los retrovirus VSV-G seudotipificados también fueron efectivos para lograr la transferencia de gen en 0.1% de células en la adventicia y medios externos. Los complejos de plásmido/liposoma y retrovirus MMLV infectados <0.01% de células. No se observaron reacciones de tejido adversas con ninguno de los sistemas de transferencia de gen. De esta manera, los adenovirus deficientes en replicación, retrovirus seudotipificados VSV-G y los complejos de plásmido/liposoma pueden ser utilizados para la transferencia de gen a la pared arterial utilizando el método de collarín. Los efectos en SMC medio y aún el endotelio pueden obtenerse a partir del lado de la adventicia.

Ejemplo 3 En este Ejemplo, se examinó la estimulación de PGI2 por VEGF. Cultivo de Célula: Se obtuvieron HUVEC, ya sea de Clonetics y se cultivaron en el medio propio del fabricante suministrado con 2% de FBS, o se desarrollaron a partir de cordones umbilicales frescos a través de digestión de colagenasa y se cultivaron en placas revestidas con 1% de gelatina en un medio 199 suplementado con 20% de FCS y el suplemento de crecimiento de célula endotelial (Wheeler-Jones et al , Biochem. J. (1996) 315:407-416). Para los propósitos experimentales, se surtieron cultivos primarios de HUVEC a través del tratamiento con 0.05% de tripsina/0.02% de EDTA durante 5 minutos a 37°C y después se colocaron en placas ya sea en cajas de petri de plástico de 90 mm, 60 mm o 35 mm, o sobre placas de 24 cavidades. Los cultivos fueron mantenidos en una atmósfera húmeda conteniendo 5% de C02 y 90% de aire a 37°C y se utilizaron después de 6-8 días o cuando las células formaron una monocapa confluente . Ensayo de PGI : Se lavaron los cultivos confluentes de HUVEC en placas de 24 cavidades dos veces en M199 libre de suero (pH 7.4) y se expusieron a un medio conteniendo VEGF. El contenido de PGI2 de sobrenadantes de células fue cuantificado a través de radioinmunoensayo de 6-ceto-PGF?a, el producto de ruptura estable de PGI2 como se describió previamente (Wheeler-Jones et al , supra) . Liberación de Acido Araquidónico: Se determinó la liberación de ácido araquidónico esencialmente como se describió (Domin and Rozengurt, J. Biol. Chem. (1993) 268:8927-8934). Los cultivos de HUVEC confluentes fueron incubados durante 24 horas con ácido [5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15-, 3H] araquidónico (1 mCi/ml, 211 Ci/mmoles). Las células después fueron lavadas dos veces con el medio 199 y se incubaron en 1 ml de este medio suplementado con 0.3% de BASA (ácido graso libre esencial) y VEGF o trombina. Después del tratamiento, el medio fue removido, centrifugado en una microcentrífuga a 16,000xg durante 5 minutos y se determinó la radioactividad en el sobrenadante contando en un contador de cintilación. Procedimiento de Tinción Western: El tratamiento de cultivos quiescentes de células con factores, y lisis de células se realizaron como se describe anteriormente y en los Resultados y Leyendas de las Figuras. Después de SDS-PAGE, las proteínas fueron transfectadas a membranas de Immobilon (Millipore Inc.). Para ensayos de MAP cinasa, las membranas fueron bloqueadas utilizando 5% de leche seca sin grasa en PBS, pH 7.2, y se incubaron durante 3-5 horas en PBS/0.05% de Tween-20 conteniendo el anticuerpo primario (1 mg/ml) como se indicó. Para inmunotinciones con el anticuerpo a cPLA2, las membranas fueron bloqueadas durante 3 horas en TBST50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0.02% (v/v) Tween 20 pH 7.4 (TBST) que contiene 0.2% (p/v) del bloque I (Tropix) , después se incubaron con antisuero primario en TBST. Las membranas después fueron lavadas seis veces (10 minutos cada lavado) en TBST y se incubaron durante 1 hora en anticuerpo secundario conjugado con HRP conteniendo TBST. Las bandas inmunorreactivas fueron visualizadas a través de quimioluminiscencia utilizando el reactivo IgG y ECL™ de anti-ratón o anti-conejo conjugado con HRP de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ensayo de MAP Cinasa: Las células fueron tratadas con factores como se indicó, se lavaron rápidamente dos veces con PBS enfriado con hielo e inmediatamente se extrajeron a través de la visión de 100 ml de regulador de pH de muestra de SDS-PAGE en ebullición (2x) . Los extractos de célula fueron recogidos a través de raspado, se calentaron a 95°C durante 10 minutos y se operaron en 12.5% de geles de acrilamida de SDS-PAGE. Después de la transferencia de membrana de Immobilon las proteínas fueron inmunoteñidas con un anticuerpo que específicamente reconoce las MAP cinasas p42 y p44 (Erk-1 y Erk-2) activadas a través de fosforilación en Tyr204 (Payne et al , EMBO J. (1991) 10:885-892). Ensayo de Desplazamiento de Mobilidad de cPLA2: Se lavaron dos veces HUVEC quiesciente confluente en platos de 60 mm en un medio libre de suero 199 (pH 7.4) y subsecuentemente se expusieron, durante los tiempos indicados al medio que contiene los factores según detallado en las leyendas de las figuras. Se prepararon lisatos de célula como se describió previamente (Wheeler-Jones et al , supra) . Las proteínas fueron separadas a través de SDS-PAGE (10% de acrilamida) y después de la transferencia a las membranas se inmunotiñeron con antisuero policlonal a cPLA2 (BorschHaubold et al, J. Biol. Chem. (1995) 270: 25885-25892; y Kramer et al, J. Biol. Chem. (1996) 271:27723-27729). Ensayo de Secreción de vWF: La secreción de vWF se midió a través de ELISA (Wheeler-Jones et al , supra ) en muestras de medio obtenido a partir de los cultivos confluentes de HUVEC, los cuales fueron tratados con factores, como se indicó. Las placas fueron revestidas con el mAb CLBRAg35 anti-vWF, el límite de detección inferior del ensayo fue de aproximadamente 1.0 mU/ml . Materiales: El VEGF recombinante se obtuvo ya sea de UBI o de R&D Systems. El PIGF recombinante fue un regalo del profesor Werner Risau y también se obtuvo de R&D Systems.

El antisuero policlonal cPLA2 fue amistosamente proporcionado por el Dr. Ruth Kramer (Eli Lilly, Indianapolis) . El mAb CLBRAg35 anti-vWF fue un regalo del Dr. J.A. Van Mourik (Central Blood Laboratory, Amsterdam, Países Bajos) . El anticuerpo a la forma fosforilada activada de MAP cinasa p42/p44 se compró en New England Biolabs Inc. El ácido [5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15-3H] araquidónico, los reactivos ECLTM y el IgG de anti-ratón conjugado con HRP fueron de Amersham, UK. El IgG conjugado con HRP de anti-conejo de cabra se obtuvo de Pierce Inc. Todos los otros reactivos utilizados fueron del grado más puro disponible. Resultados: Los cultivos confluentes de HUVEC fueron tratados durante varios tiempos hasta de 2 horas con V?GF y el medio fue removido en esos tiempos y analizados para la presencia de 6-ceto PGFla, un producto de ruptura metabólico estable de PGI2. El VEGF ocasionó un incremento dependiente del tiempo en la producción de PGI2, el cual fue detectable después de 15 minutos de la adición del factor, continuó incrementándose durante hasta 60 minutos, y fue sostenido después durante 2 horas. Las células de control exhibieron solamente un pequeño incremento en la producción de PGI2 durante el curso del tiempo examinado. La estimulación de VEGF de la producción de PGI2 también fue dependiente de la concentración. Después de una incubación de 60 minutos, se detectó un incremento en la síntesis de PGI2 a 5 ng/ml, fue máxima media a 10 ng/ml y alcanzó un máximo a 15 ng/ml. Se observó consistentemente que la síntesis de PGI2 inducida por VEGF sufrió una pequeña reducción a 25 ng/ml. También se examinó si PIGF del factor relacionado con VEGF, un ligando específico para el receptor de VEGF Flt-1 pudo producir la síntesis de PGI. en HUVEC. En 5 experimentos independientes, el PIGF estimuló la síntesis de PGI. significativamente más débilmente que VEGF. Las respuestas tanto de VEGF como de PIGF también fueron comparadas con aquellas de trombina, un potente inductor de la síntesis prostanoide, en células endoteliales y plaquetas. En varios experimentos independientes en donde los efectos de VEGF, PIGF y trombina fueron di rectamente comparados en cultivos paralelos, el doblez medio se incrementó en 6-ceto PGFl , producido a través de incubaciones de 60 minutos con 25 ng/ml de VEGF, 60 ng/ml de PIGF y 1 U/ml de trombina, fueron, respectivamente, 2.0-, 1.3- y 4.4-veces por arriba del control medio del nivel no estimulado. Si la estimulación con VEGF de la síntesis de PGI fuese mediada a través de la activación de una isoforma de PLA, se pudiera predecir que VEGF puede ocasionar una rápida movilización de ácido araquidónico a partir de las células. Para probar esto, se preincubaron HUVEC con ácido araquidónico radiomarcado durante 24 horas y subsecuentemente se atacó con VEGF durante varios tiempos. VEGF ocasionó un incremento en la marcación liberada hacia el medio de células pre-etiquetadas, la cual fue evidente 10 minutos y llegó a un máximo de 30 minutos, después de la adición del factor . Según medido en cultivos paralelos, el uso de tiempo para la liberación de ácido araquidónico estimulado por VEGF fue muy similar a aquella para trombina. La dependencia de concentración para la liberación de ácido araquidónico estimulada por VEGF fue muy similar a aquella obtenida para la producción de PGI2, con un efecto máximo medio a 2.5-5 ng/ml y un máximo a 10-20 ng/ml. Similarmente a las habilidades relativas de trombina y VEGF para estimular la producción de PGI2/ la liberación de ácido araquidónico máxima inducida por VEGF fue consistentemente más baja que aquella obtenida para trombina. En cuatro experimentos independientes, VEGF y trombina ocasionaron incrementos medios en la liberación de ácido araquidónico marcado do 1.6-y 3.4- del nivel por arriba no estimulado basal respectivamente. PIGF no ocasionó un incremento significativo detectable en la liberación de ácido araquidónico a partir de HUVEC pre-marcados . Un posible mecanismo para la rápida liberación de ácido araquidónico estimulado por VEGF es la liberación enzimática directa de ácido araquidónico catalizado mediante la forma citosólica de PLA- . cPLA puede ser activada a través de fosforilación dependiente del MAP cinasa y, similar a la fosforilación y activación de otras enzimas incluyendo MAP cinasas, la conversión de CpLA a su forma activa puede ser verificada a través de un cambio en su mobilidad en geles SDS-PAGE a partir de una forma de migración rápida a una lenta. Por consiguiente, la activación de cPLA en respuesta de VEGF se determinó a través de análisis de tinción western de extractos HUVEC utilizando un anticuerpo específico a cPLA2 (Borsch/Haubold et al, supra y Kramer et al , supra ) . En extractos de HUVEC no estimulados de control, el anticuerpo para cPLA. reconoció dos distintas bandas de intensidad y rnj gración aproximadamente igual con un aproximado de Mr 97,000. Aunque cPLA2 tiene un peso molecular predicho de 85 kDa, esta proteína previamente ha sido reportada que migra en SDS-PAGE como una banda de 97 kDa (BorschHaubold et al, supra, y Kramer et al, supra) . VEGF a 25 ng/ml ocasionó un incremento marcado en la inmunorreactividad de la forma de migración lenta de cPLA.. y una reducción relativa concomitante en la forma de migración más rápida, la cual fue detectable después de 2 minutos, y alcanzó un máximo después de 15 minutos, y se sostuvo durante 60 minutos después de la adición de VEGF. En cinco experimentos independientes, VEGF consistentemente ocasionó un incremento marcado en la inmunorreactividad de la forma de migración más lenta de cPLA... La reducción inducida por VEGF en la mobilidad electroforética de cPLA también fue dependiente de la concentración, con un incremento notorio en la forma de migración lenta a 2.5 ng/ml y un incremento máximo a 5-10 ng/ml, la concentración más alta probada. Aunque VEGF provocó una reducción aparente en el nivel de la forma de migración más rápida de cPLA., esta especie fue evidente en todas las concentraciones de VEGF y tiempos de tratamiento examinados. La trombina también ocasionó un cambio fuerte en la mobilidad de cPLA.. a partir de una forma de migración más rápida a una más lenta, ambas de las cuales exactamente co-emigran con aquellas detectadas con extractos de HUVEC tratados con VEGF. La comparación directa de los efectos de VEGF y trombina en el mismo experimento mostró que, similar a los resultados obtenidos para la síntesis de PGI y la liberación de ácido araquidónico, la trombina ocasionó un incremento más marcado en el retraso de gel de cPLA con una desaparición virtualmente completa de la forma de migración más rápida de la enzima. PIGF no ocasionó ningún cambio detectiable en la mobilidad de cPLA inmunoreactivo a partir de las formas de migración más rápida a más lenta. Además examinó si VEGF Lambién indujo la secreción de vWF a través de HUVEC. vWF estimuló una producción de vWF dependiente del tiempo y concentración. El vWF fue detectable en el medio HUVEC 30 minutos después de la adición de 25 ng/ml de VEGF a células y continuó el incremento durante el curso del tiempo examinado alcanzando un nivel de 2.5 veces por arriba de las células de control después de 3 horas. La dependencia de concentración para el efecto de VEGF fue similar a aquella obtenida para la producción de PGI con una respuesta máxima media a aproximadamente 10 ng/ml y un efecto máximo a 25 ng/ml, la concentración más alta probada. Similarmente a los estudios obtenidos para la síntesis de PGI2, el efecto de VEGF fue comparable con, aunque consistentemente más débil que, aquel de trombina (Figura 12A) . En contraste a VEGF, PIGF no ocasionó ninguna estimulación detectable de la secreción de vWF en HUVEC. A comparación de los efectos de VEGF y PIGF en la migración de HUVEC en cámaras de quimiotaxis mostró que mientras VEGF estimuló un incremento dependiente de concentración en quimiotaxis, PIGF no ocasionó ningún incremento detectable en la escala de concentración de 5-60 ng/ml. VEGF activa p42/p44 MAP cinasas en HUVEC. Dado que las MAP cinasas han sido implicadas en la activación do cPLA por otros factores, esto eleva la posibilidad de que la cascada de MAP cinasa puede mediar la síntesis de PGI inducida por VEGF y la activación de cPLA, . La dependencia de concentración para la activación estimulada por VEGF de la actividad de p42/p44 MAP cinasas, en HUVEC confluente, fue examinada . La exposición de VEGF durante 15 minutos un incremento detectado en la actividad a una concentración tan baja como 0.5 ng/ml, un incremento máximo medio de entre 1 y 5 ng/ml, y un efecto máximo a 10 ng/ml, el cual fue sostenido hasta 50 ng/ml. En contraste al efecto potente de VEGF, PIGF en la escala de concentración de 1-60 ng/ml ocasionó poco incremento, si es que hubo alguno, detectabJ e en la actividad de MAP en HUVEC. La estimulación de VEGF de MAP cinasa p42/p44 fue completamente inhibido por un pretratamicnto de 30 minutos con PD98059, un inhibidor selectivo de MAP cinasa-cinasa (Dudley et al , PNAS USA (1995) 92:7686-7689), la treonina y cinasa de tirosina de carácter especifico doble que específicamente fosforila y activa Map cinasa p42/p44. El efecto del inhibidor fue dependiente de la concentración con más de 50V, de inhibición a 5 mM y una reducción de la actividad de MAP cinasa al nivel no estimulado de control a 10-20mM. El papel de la cascada de MAP cinasa en la trayectoria de movilización de ácido araquidónico inducida por VEGF fue inicialmente investigada examinando el efecto de PD98059 en la síntesis de PGL. El pretratamiento de HUVEC con 30 mM de PD98059 durante 30 minutos inhibió la producción de PG1-. inducida por una incubación subsecuente de 60 minutos ya sea con 25 ng/ml de VEGF o con 1 U/ml de trombina. El efecto de PD98059 sobre la síntesis de PGI,< inducida por VEGF fue dependiente de la concentración con un efecto máximo medio aproximadamente 5 mM y un efecto inhibidor máximo en la producción de PGIv estimulada a 10 mM. También se observó que PD98059 indujo la producción de PGI en células tratadas con VEGF por debajo de los valores medidos en las células de control, aunque este efecto fue solo aparente a concentraciones del inhibidor mayores que 10 mM.

Después se probó si PD98059 tuvo algún efecto en la reducción inducida por VEGF en la movilidad electroforética de cPLA2. El pretratamiento con PD98059 a 25 mM completamente bloqueó el incremento estimulado por VEGF en la forma de migración de cPLA2. Similarmente a los efectos de PD98059 en la síntesis de PGI2, el inhibidor no solo invirtió la reducción dependiente de VEGF en la movilidad del gel cPLA sino que también redujo la inmunorreactividad de la forma de migración más lenta más abajo, e incrementó aquella de la forma de migración más rápida por arriba de los niveles de control La selectividad del efecto de PD98059 para la activación de cPLA2 inducida por VEGF y la síntesis de PGI, fue investigada probando si la producción de vWF estimulada por VEGF fue también susceptible a la inhibición por PD98059. En contraste al efecto de PD98059 en la activación de cPLA. y la síntesis de PGI2 el pretratamiento de las HUVEC con El inhibidor de MAP cinasa-cinasa a 25 mM no evito ni significativamente redujo la secreción de vWF ocasionada por la adición subsecuente de VEGF. PD98059 tampoco tuvo ningún efecto ni en la estimulación vWF basal o estimulada por trombina . Sumario: VEGF estimulo un incremento dependiente de tiempo y concentración en la síntesis de PGI..,, que fue detectable en 15 minutos, máximo medio a 10 ng/ml y máximo a 15 ng/ml después de 60 minutos. En 10 experimentos independientes, la síntesis de PGI : estimulada por VEGF máxima media fue 2 veces-- por arriba de los niveles básales a 25 ng/ml después de 60 minutos. El factor relacionado con VEGF, factor de crecimiento de placenta (PIGF) , indujo un incremento de 1.3 veces mucho más débil, y la trombina (1 U/ml, 60min) indujo un incremento máximo de 4.4 veces por arriba de los niveles de control. El VEGF estimuló la liberación de ácido araquidónico a partir de HUVEC con una dependencia de concentración similar a aquella obtenida para la síntesis de PGI2 pero con una cinética más rápida: movilización de ácido araquidónico máxima media que ocurrió después de 10 minutos y fue máxima después de 30 minutos. La mediación de la activación de fosfolifasa A (cPLA') utilizando el cambio de movilidad en SDS-PAGE como un marcador de activación, mostró que la actividad de cPLA. estimulada por VEGF en una forma dependiente de tiempo y concentración: ocurrió un incremento en la migración lenta y la forma activada de cPLA¿ 2 minutos después y fue detectable a tan bajo como 2.5 ng/ml, y alcanzó un máximo después de 15 minutos a 5 ng/ml. Similar a otros agentes, los cuales inducen la síntesis de PGI2 VEGF también ocasionó un fuerte incremento dependiente de tiempo y concentración en la secreción de von Willebrand (vWF) en HUVEC, el cual fue detectable en 30 minutos, media máxima a 10 ng/ml y alcanzó 2.5 veces por arriba de los niveles de control después de un tratamiento de 3 horas con 25 ng/ml de VEGF. El VEGF indujo una activación rápida y pasajera de MAP cinasa p42/944, que fue detectable a tan bajo como 1 ng/-ml y alcanzó un máximo a 5-10 ng/ml. En contraste, PGI;. tuvo muy poco efecto en la actividad MAP cinasa. PD98059, un inhibidor selectivo de MAP cinasa-cinasa, ocasionó la completa inhibición de actividad de MAP cinasa estimulada por VEGF. La síntesis de PG1 y el retraso de gel cPLA2, pero no tuvo ningún efecto en la secreción de vWF inducida por vWF. Estos hallazgos proporcionan la primera evidencia de que VEGF puede estimular la síntesis de PGI2 a través de la liberación de ácido araquidónico mediado por cPLA . Estos hallazgos también indican que la estimulación de VEGF de esta trayectoria biosintética puede ocurrir, por lo menos en parte, a través de la activación de las MAP cinasas p42/p44. Los resultados aquí presentados muestran que VEGF estimula un fuerte incremento dependiente de tiempo y concentración en la producción de PGI.. en HUVEC. El efecto de VEGF fue más débil que aquel de trombina, aunque las respuestas de los dos factor variaron en promedio por un factor solo de 2.5. VEGF estimula la rápida movilización del ácido araquidónico a partir de células endoteliales humanas y, según juzgado a través de un análisis de retraso en gel, la rápida activación de cPLA.. El método utilizado para determinar el efecto de VEGF en la movilización de ácido araquidónico se basa en la liberación de la etiqueta H de las células premarcadas con 3H- ácido araquidónico. Ya que los estudios de liberación de ácido araquidónico fueron realizados con BSA presente en el medio, es muy probable que el producto principal liberado a partir de las HUVEC sea ácido 3H-araquidónico . Las dependencias de concentración para la producción de PGI2 inducida por VEGF, la liberación de ácido araquidónico y la activación de cPLA fueron similares entre sí (todas dentro de la escala de 5-10 ng/ml) . Estos resultados indican que la estimulación por VEFG de la liberación de ácido araquidónico y la síntesis de PGT son mediadas a través de receptores de alta afinidad para este factor en las HUVEC. La liberación de ácido araquidónico y el cambio de movilidad de cPLA; tanto ocurrieron más rápidamente que la síntesis de PGI,_, consistente con la noción de que la producción incrementada de PGI. es muy probable, por lo menos en parte, que sea una consecuencia directa de la actividad de PGI incrementada y un incremento subsecuente en la disponibilidad de ácido araquidónico intracelular, el sustrato para la enzima constitutiva COX-1. Ya que VEGF se sabe que estimula la fosforilación de tirodina C-g de fosfolipasa y el metabolismo de fosfoinositida, completamente es verosímil que otros mecanismos que incluyen la acción secuencial de C-g fosfolipasa (y/o fosfolipasa D) y lipasas de dialice y monaciglicerol, también puede contribuir a la movilización de ácido araquidónico inducida por VEGF de la síntesis de PGI... También se investigó si el factor relacionado con VEGF, PIGF, un ligando específico para Flt-1, puede simular la generación de PGI2, los resultados sugieren que PIGF puede inducir la síntesis de ~PGI2 pero más débilmente que VEGF. Ningún efecto significativo de PEGF fue detectado tanto en la liberación de ácido araquidónico como en el cambio de movilidad- cPLA, ya que PIGF se une con alta afinidad solamente al receptor VEGF Flt-1, estos resultados son más consistentes con la conclusión de que la estimulación de la producción de PGI, a través de VEGF en las HUVEC es mediada principalmente por receptores KDR/Flk-1 pero aquella de Flt-1 también puede contribuir a la estimulación de esta trayectoria. Sin embargo, cualquier síntesis de PGI, mediada por Flt-1 puede parecer que implica un mecanismo diferente a la fosforilación de cPLA2. Por lo menos dos explicaciones pueden representar la respuesta relativamente inferior a PIGF. Aunque Flt-1 induce a una respuesta más débil, y/o Flt-1 está presente a niveles más bajos que KDR/Flt-1 Los resultados aquí presentados demuestran que VEGF indujo la secreción de vWF en una forma dependiente de tiempo y concentración. La dependencia do concentración para el efecto de VEGF sobre la secreción de vWF estuvo de acuerdo estrechamente con aquella para la síntesis de PGI y la movilización de ácido araquidónico. En contraste al efecto relativamente débil de PIGF en la síntesis de PGI,, PIGF no estimuló un incremento detectable en la liberación de vWF a través de las HUVEC. El hallazgo de que VEGF ocasiona un rápido cambio en la movilidad electroforética de cPLA? es consistente con la fosforilación incrementada, y por lo tanto, la activación de MAP cinasas p42/p44. Esto es soportado por el hallazgo aquí presentado de que la trombina, la cual se sabe que estimula la fosforilación de cPLA2 y la activación en plaquetas, ocasiona un cambio similar en la movilidad de cPLA. en las HUVEC. Los resultados aquí presentados también muestran que VEGF activa las MAP cinasa p 2/p44 y e.quella inhibición de esta trayectoria con un inhibidor selectivo de MAP cinasa-cinasa, PD98059, bloquea la producción de PGI y el retraso de gel incrementado de cPLA- inducido por VEGF. El efecto de PD98059 fue por lo menos parcialmente selectivo, ya que no hubo ningún efecto en la secreción de vWF estimulada ya sea por VEGF o por trambina. En contraste al gran efecto de VEGF, PIGF falló para incrementar significativamente la actividad de MAP cinasa. La- inhabilidad aparente de PIGF para estimular la actividad MAP cinasa esta ampliamente de acuerdo con el efecto mucho más débil de este factor en la producción de PGI comparado con VEGF y con la inhabilidad aparente de este factor para promover el retraso en gel de cPLA_ . Los ensayos de la producción de PGI en HUVEC indicaron la presencia de un nivel basal significativo de síntesis. De manera interesante, el inhibidor de MAP cinasa-cinasa también abolió la producción PGI en células de control, no estimuladas. Consistente con la mediación de la generación de PGI2 a través de la activación de la cascada de MAP cinasa, PD98059 también redujo el nivel de la forma fosforilada de migración lenta de cPLA2 por abajo del nivel de control e incrementando aquel de 1 a forma menos forforilada de migración rápida por arriba del nivel de control. Los ensayos de la actividad de MAP cinasa sugirieron un nivel significativo de actividad basal, que también fue inevitable a través de PD98059, estos hallazgos sugieren que la activación de MAP cinasa pueden ser responsables no solamente de la activación de cPLA dependiente de VEGF y trombina, sino que la actividad MAP de cinasa basal también puede ser requerida para el mantenimiento de la actividad de cPLA. constitutiva y la producción de PGI.. Es verosímil que otros mecanismos de señalización pueden contribuir a la estimulación mediante VEGF de la síntesis de PGI2 y liberación de ácido araquidónico, incluyendo la elevación de [Ca~ ] intracelula . ío: VEGF hasta ahora principalmente ha sido considerado como un factor angiogénico que promueve el crecimiento de célula endotelial y la migración. Los hallazgos aquí presentados revelan actividades adicionales y, por lo tanto, pueden tener implicaciones importantes tanto para la regulación endotelial como para el entendimiento de la función de VEGF, así como para el tratamiento y prevención de los trastornos de vasos sanguíneos, tales como estenosis, restenosis, arteriosclerosis e hipertensión.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: EUROGENE LIMITED (B) CALLE: Marquis House, 67/68 Jermyn Street (C) CIUDAD: Londres (D) ESTADO: N/A (E) PAÍS: Reinó" Unido (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : SW1Y 6NY (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: USO TERAPÉUTICO DE FACTOR DE CRECIMIENTO, Y DISPOSITIVO DE SUMINISTRO, ESPECIALMENTE PARA EL TRATAMIENTO DE HIPERPLASIA INTIMA (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 10 (iv) FORMA DE LECTURA EN LA COMPUTADORA: - (A-) TIPO DE MEDIO: disco blando (B) COMPUTADORA: compatible con una PC IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Rel ase #1.0, Versión ..1.30 (EPO) (v) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: NUMERO DE SOLICITUD: WO (aún no conocido) (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 441 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI?ENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..441 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 1 ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTC GCC TTG CTG CTC 48 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA 96 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG 144 Gly Gly Gln Aso His His Glu Val Val Lys P e Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG 192 Arg Ser Tyr Cys His Pro He Glu Thr Leu Val Asp He Phe Gln Glu 50 55 60 TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCG CTG 240 Tyr Pro Asp Glu He Glu Tyr He Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC 288 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC 336 Thr Glu Glu Ser Asn He Thr Met Gln He Met Arg' He Lys Pro His 100 105 110 CAÁ GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT 384 Gln Gly Gln His Ha Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAÁ GAA AAA TGT GAC AAG 432 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys 130 135 140 CCG AGG CGG 441 Pro Arg Arg 145 2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDEN . NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 147 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 2 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 "30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro He Glu Thr Leu Val Asp He Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu He Glu Tyr He Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn He Thr Met Gln He Met Arg He Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His He Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys 130 135 140 Pro Arg Arg 14S (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 573 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) UBICACIÓN: 1..573 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDEN . NO: ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTC GCC TTG CTG CTC 48 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 150 155 160 TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA 96 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 165 170 175 GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG 144 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 180 185 190 195 CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG 192 Arg Ser Tyr Cys His Pro He Glu Thr Leu Val Asp He Phe Gln Glu 200 205 210 TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCG CTG 240 Tyr Pro Asp Glu He Glu Tyr He Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 215 220 225 ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC 288 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 230 235 240 ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC 336 Thr Glu Glu Ser Asn He Thr Met Gln He Met Arg He Lys Pro His 245 250 255 CAÁ GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT 384 Gln Gly Gln His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 260 265 270 275 GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAÁ GAA AAA CCC TGT GGG 432 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp ñrg Ala Arg Gln Glu Lys Pro Cys Gly 2S0 285 290 CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA CAÁ GAT CCG CAG ACG 480 Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys Hie Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr 295 300 05 TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG 528 Cys Lys Cys Ser Cye Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln 3X0 315 320 CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG 573 Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 325 330 335 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 4 Het A-r- Plie Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 " 5 10 ÍS Tyr Leu His Hie Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His slu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Argr Ser Tyr Cys His Pro He Glu Thr Leu Val Asp He Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu He Glu Tyr He Phe Lys Pro ser Cys Val Pro Leu 65 7? vs so Met Arg Cys Gly Gly Cys Cye Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn He Thr Met Gln lie Met Arg lie Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His He Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His ?sn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Pro Cys Gly 130 135 140 Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr 145 150 155 160 Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln -LS5 170 175 Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 180 185 190 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . ?0 : 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 645 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) AN ISENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..645 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO: 5; ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTC GCC TTG CTG CTC 48 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 195 200 2Q5 TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA 96 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 210 215 220 GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 225 23D 235 CGC AGC TAC TGC CAT CCA ?TC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG Arg Ser Tyr Cys His Pro He Glu Thr Leu Val Asp He Phe Gln Glu 240 245 25o 255 TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCG CTG Tyr Pro Asp Glu He Glu Tyr He Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 260 265 270 ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC 288 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 275 280 285 ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC 336 Thr Glu Glu Ser Asp ríe Thr Met Gln He Met Arg He I-ys Pro His 290 295 300 CAÁ GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT Glp Gly Gln Hia He Gly slu Met Ser Phe Leu Glp His Asn Lys Cys 305 310 315 GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAÁ GAA AAA AAA TCA GTT 432 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 320 325 330 335 CGA GGA AAG GGA AAG GGG CAÁ AAA CGA AAG CGC AAG AAA TCC CGG TAT Arg Gly Lye Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 340 345 3SO AAG TCC TCG ACC GTG CCC TGT GGG CCT TCC TC? GAG CGG ACA AAG CAT Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His 355 360 365 TTG TTT GTA CAÁ GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA 57S Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr 370 375 380 GAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC 624 Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu ?sn Glu Arg Thr Cys 385 390 395 AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG 645 Arg Cys Asp Lye Pro Arg Arg 400 405 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 215 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 6: et Asn Phe Leu Le s<-,r Tr£- al -fia Trp Ser- Leu Ala x,eu Leu -.ßu X 5 ÍO 15 Tyr Leu His His Ala Lys rp Ser Cln Ala Ala -ro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln ?sn Hls His Glu Val val Lys Phe Met Asp val Tyr Gln 35 4D <*5 Arg Ser Tyr Cys His Pro He slu Thr Leu Val Asp He Phe Gln Glu SO SS 60 Tyr Pro Asp Glu He Glu Tyr He Phe Lys Pro Ser Cyo Val Pro Leu 6S 70 75 OO Met Arg Cys Gly Cly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro SS 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn He Thr Met Gln He Met Arg He Lys Pro His loo ios no Gln Gly Gln His He sly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys US 120 12S Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140 Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys ser Arg Tyr 145 150 155 160 Lyß Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His 165 170 175 Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr 180 185 190 Asp Ser Arg Cye Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys 195 200 205 Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 210 215 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 696 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..696 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 7 ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTC GCC TTG CTG CTC 48 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 220 225 230 TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA 96 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala. Glu Gly 235 240 245 GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG 144 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 2SO 255 260 CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG 192 Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu Val Asp lie Phe Gln Glu 265 270 275 TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCG CTG 240 Tyr Paro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 280 285 290 295 ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC 288 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 300 305 310 ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC 336 Thr- Glu Glu Ser Asn He Thr Met Gln lie Met Arg lie Lys Pro His 315 320 32S CAÁ GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT 384 Gln Gly Gln His lie Gly slu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 33? 335 340 GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAÁ GAA AAA AAA TCA GTT 432 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 345 350 355 CGA GGA AAG GGA AAG GGG CAÁ AAA CGA AAG CGC AAG AAA TCC CGG TAT 480 Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 360 365 370 375 AAG TCC TGG AGC GTG TAC GTT GGT GCC CGC TGC TGT CTA ATG CCC TGG 528 Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp 380 38S 39? AGC CTC CCT GGC CCC CAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG 576 Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys ser Glu Arg Arg Lyß 395 40O 405 CAT TTG TTT GTA CAÁ GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC 624 His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn 410 415 420 ACA GAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT 672 Thr Agp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr 425 430 435 TGC AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG 696 Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 440 445 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 232 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val HÍ3 Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lya Trp Ser Oln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 2D 25 30 Gly Gly ßln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr ßln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu Val Asp lie Phß Gln Qlu SO 55 eo Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Aap Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 8S 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn He Thr Met Gln He Met Arg lie Lys Pro His loo 105 HO Gln Gly Gln His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140 Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp 165 170 175 Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys 180 185 190 His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn 195 200 205 Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr 210 215 220 Cys Arg Cys Asp Lys Pro ftrg ftrg 225 230 INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 9: TCGATCCATG AACTTTCTGC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 10: TCCGTTTAAC TCAAGCTGCC 20

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de un agente que es un agonista de un receptor al cual se une VEGF, o un ácido nucleico que codifica el agonista para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de hiperplasia de la íntima de un vaso sanguíneo, caracterizado porque el endotelio esta total o enormemente intacto.
2. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vaso sanguíneo es una arteria.
3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, para el tratamiento de prevención de estenosis inducida por un proceso quirúrgico o asociada con hipertensión pulmonar arterial.
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el procedimiento quirúrgico es angioplastía, cirugía de derivación coronaria anastomosis quirúrgica o endarterictomía.
5. 5. El uso de conformidad con las reivindicaciones precedentes, para el tratamiento o prevención de estenosis del vaso sanguíneo.
6. 6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para el tratamiento o prevención de restenosis del vaso sanguíneo.
7. 7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el agente es una proteína que tiene la función de VEGF humano, o un ácido nucleico que codifica la proteína.
8. 8. El uso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína tiene la secuencia de SEC DE IDENT. NO. 2, 4, 6 u 8, o un fragmento activo de la misma.
9. 9. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque el agente es un ácido nucleico en asociación con un vector viral o no viral.
10. 10. Un implante para uso terapéutico, adaptado para ser colocado cerca del sitio de hiperplasia que será tratada o evitada, y que contiene un agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes .
11. 11. El implante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es un implante silastico o un implante biodegradable.
12. 12. El implante de conformidad con la reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque está en la forma de un collarín para fijarse alrededor de un vaso sanguíneo cerca del sitio de la hiperplasia que será tratada o evitada.
13. 13. El implante de conformidad con las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque tiene una pared externa sustancialmente impermeable al agente comprendido en el mismo.
14. 14. El uso de un agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, para la fabricación de un medicamento para terapia de una condición que puede ser tratada o evitada a través de la estimulación de la producción de óxido nítrico (NO) y/o prostaciclina in vivo.
15. 15. El uso de un agente de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la condición es hipertensión, por ejemplo hipertensión esencial, hipertensión pulmonar primaria o corpulmonar.
16. 16. Un dispositivo para utilizarse en el suministro de un agente terapéutico a un vaso sanguíneo en un paciente, caracterizado porque comprende un cuerpo adaptado para proporcionar un sello alrededor del vaso, el agente siendo mantenido dentro de o asociado con el dispositivo, de manera que/ durante uso el agente se pone en contacto con la superficie adventicia del vaso.
17. 17. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque define un depósito entre la pared del cuerpo y la superficie adventicia del vaso, el depósito siendo por lo menos parcialmente llenado con una formulación farmacéutica que contiene el agente que será suministrado.
18. 18. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la formulación está en la forma de un fluido o gel que es inyectable al depósito o una pasta.
19. 19. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el material de la porción de cuerpo es autosellante .
20. 20. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque el depósito puede contener hasta 10 ml de fluido, de preferencia 2-5 ml .
21. 21. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizado porque el espesor del material del cuerpo generalmente es constante a lo largo de su longitud, el depósito siendo formado durante uso a través de una técnica de globo de la primera porción de cuerpo entre porciones separadas que sellan con tal vaso.
22. 22 . El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizado porque el espesor del material del cuerpo es más pequeño que una porción intermedia que en porciones de sellado separadas que sellan contra el vaso, el espesor reducido formando el depósito.
23. 23. El dispositivo de conformidad con las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque la superficie interna del cuerpo comprende un material de tipo esponja que es capaz de ser impregnado con una formulación farmacéutica que contiene el agente.
24. 24. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque la superficie interna del cuerpo está impregnada con una formulación farmacéutica que contiene el agente.
25. 25. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado porque el material del cuerpo es biodegradable.
26. 26. El Dispositivo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el material es gelatina, alginato o colágeno.
27. 27. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, caracterizado porque el cuerpo es moldeado o extruido.
28. 28. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27, caracterizado porque el cuerpo comprende porciones de sello flexible que pueden adaptarse a la expansión del vaso sanguíneo ocasionada por el flujo sanguíneo pulsátil.
29. 29 El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 28, caracterizado porque el cuerpo comprende porciones de sello alargadas, con un longitud de 8- 15 mm.
30. 30. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 29, caracterizado porque el cuerpo es generalmente tubular.
31. 31. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 29, caracterizado porque el cuerpo tiene dos porciones generalmente tubulares, las cuales están ramificadas para formar un cuerpo generalmente con forma de Y o T.
32. 32. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 29, caracterizado porque el cuerpo tiene tres porciones generalmente tubulares, las cuales, al menos durante uso, son ramificadas para formar un cuerpo generalmente con forma de X.
33. 33. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 31 ó reivindicación 32, caracterizado porque una porción de cuerpo generalmente esta arqueada en sección transversal a través de su extensión longitudinal con el fin de -que pueda rodear la porción expuesta de un primer vaso sanguíneo' cuando ese vaso está embebido en parte en el tejido, y bordes longitudinalmente extendidos de la primera porción de cuerpo están dispuestos para ser sellados, durante uso a la pared adventicia del primer vaso o adyacente al tejido.
34. 34. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 33, caracterizado porque el cuerpo tiene una ranura longitudinal para facilitar su fijación sobre el vaso sanguíneo.
35. 35. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 34, caracterizado porque el cuerpo incluye una capa interna o refuerzo helicoidal para incrementar la resistencia a la torsión.
36. 36. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, a un vaso sanguíneo, caracterizado porque comprende colocar un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 35 alrededor del vaso y, sino está presente introducir el agente en el dispositivo.