KR20050000416A - 의료 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직 상처 또는 의료 장치의 이식 이후 과형성 연결 조직 성장을 감서시키기 위해 유전자 전이 생성물을 이용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유 동물의 생체에 도입될 때 혈액, 체액 및/또는 조직과 적어도 일부 접촉하는 것인 향상된 생물학적 성능을 갖는 의료 장치에 관한 것이며, 이 장치는 생물학적 양립 가능 매질 중에 존재하는 세포 밖 초과산화물 디스뮤타제의 생성을 초래할 수 있는 생성물을 암호화하는 핵산 및 코어를 포함한다. 상기 핵산은 상기 코어의 합성 표면 상에서 적어도 부분적으로 생체내에서 과형성 연결 조직 성장을 억제할 수 있고 그리고 내포세피화를 촉진시킬 수 있는 번역 또는 전사 생성물을 암호화한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 의료 장치를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

의료 장치 {MEDICAL DEVICE}

생체 중에 감소되고 손상된 부분은 몇가지 방법으로 회복되거나 또는 교환될 수 있다. 이들 과정은 개입(intervention)이 수행되거나 또는 장치가 내이식되는 조직 내에 반응성 변화를 유도한다. 조직 내에서 이들 반응성 변화는 제어하기 어려우며 그리고 합병증을 유도한다. 조직 반응성 변화는 조직의 모든 상처 조작, 생물학적 물질의 이식(transplantation) 또는 합성 물질의 내이식(implantation)에 관련되어 발생한다.

조직을 회복하는데 있어 혈관내, 내시경내 또는 외과적 방법이 수행된다. 이들 모든 방법은 이어지는 상처 조직 형성 또는 섬유성 반응과 더불어 개입에 의해유발된 상처에 대한 반응으로부터 고통받는다. 신체 부분은 회복시키는 것 뿐 아니라 또한 교환될 수도 있다. 그렇다면 공여자의 조직은 일반적으로 다른 곳, 수여자 자체의 신체로부터 (자가 이식편); 제2의 공여자로부터 (동종 이식편); 또는, 어떤 경우에, 다른 종의 공여자로부터 (이종 이식편)에서 조달된다. 본래의 구조로 신체 부분의 교환이 일반적으로 바람직한 방법이지만 연결 부위에 조직 반응으로 고통을 받는다. 조직 이식은 비용이 들고, 급성 염증 및 장기 섬유성 반응 때문에 명백한 실패율로 고통을 받는다. 인공 또는 합성 의료 내이식 장치의 사용은 주목할 만한 관심의 대상이 되었지만, 이 기술은 연결 조직 또는 섬유증의 증가로 이어지는 내이식에 대한 외부 생체 반응으로 또한 고통을 받는다.

공여자-계 이식에 대안적으로 어떤 경우에 비록 내이식 장치가 사용될 수 있지만, 그들 역시 상처에 대한 조직 반응, 신체와 내이식물의 양립불가성, 외부 신체 염증 반응의 유도 및 기하학적 변화에 의한 연결 조직 형성의 유도 때문에 만족스럽지 못한 결과를 종종 발생시킨다. 또한, 심혈관계 장치 합성 표면의 세포 라이닝(lining)의 결여가 조건들을 설정하고, 그것은 혈전증 및 기타 의학적/외과적 절차상의 합병증의 위험을 증가시킨다. 조직에 내이식될 때 그 장치가 혈관 내 또는 이식물을 포위하는 섬유성 캡슐 내로 내이식될 때 임상적 귀결은 혈류의 제한 또는 폐색이다. 최종 귀결은 기능장애 및 이어지는 다른 임상 의료적 합병증이다.

성장 인자, 유전자 및 이식물이 사용되는 하나의 특정 분야가 심혈관계 분야이다. 심혈관계 질환은 인간 집단의 큰 부분에 영향을 미치며, 그리고 그 사회에 대해 심각한 질병율, 비용 및 사망율을 초래한다. 미국에서 약 6천만 성인이 심혈관계 질환을 가지며, 이는 미국에서 사망의 주 원인이 되는 것이다. 급성 심근 경색 중 연간 천만 또는 심장 마비 중 연간 200,000이 사망한다. 심각한 사망율 및 연간 150,000의 말단 사지 절단을 초래하는 간헐성 파행증은 심각한 구굴에 관련된 사망율과 더불어 허혈성 질환에 필요하다. 뇌혈관 질환, 심장마비 및 출혈 또한 심각한 질병율, 비용 및 사망율을 초래한다. 여기에는 백만 투석 환자가 있고, 그리고 투석을 위한 접근을 수술적으로 생성하기 위해 연간 200,000 동정맥 누공 수술이 필요하다.

관상 및 말초 혈관 질환은 장기에 혈류 및 영양을 공급하는 혈관의 폐색으로 특정된다. 이식편으로 사용되는 자연 혈관은 증가된 연결 조직 및 가속화된 죽상경화증으로 고통받는다. 이는 계속하여 혈관 루멘(lumen)의 협착을 유발한다. 다른 심각한 질환 군은 동맥류, 즉 혈관의 국소 팽창, 유사동맥류, 및 혈관 벽의 개석(dissection)이다.

이들 질환을 치료하는 데 있어 약리학적, 외과적 및 경피적 전략이 있다. 허혈성 심장 질환의 약리학적 치료에 있어서 그 목적은 혈액을 덜 응고될 수 있게 하고, 혈관 벽에 콜레스테롤의 축적을 억제하고 그리고 혈관을 팽창시킴으로써 혈류를 증가시키거나 또는 산소 소비를 감소시키는 것이다.

대안적으로 혈관은 경피성 통관 혈관 성형술 (풍선 혈관 성형술), 레이저 혈관 성형술, 아테롬절단술(atherectomy), 회전-절단술(roto-ablation), 파괴적 수술, 트롬빈 분해 또는 이들 치료의 조합으로 치료될 수 있다. 경피적 방법의 의도는 폐색된 혈관을 다시 연 후에 개방성을 유지하는 것이다. 혈관 성형술은 두가지의 주된 문제점 - 급성 폐색 및 재발협착증으로 고통 받는다. 급성 폐색은 팽창 과정 동안 또는 그 이후 혈관이 즉시 폐색되는 것을 의미한다. 재발협착증이란 초기에 성공적인 혈관 성형술 이후 동맥이 다시 협착되는 것을 의미한다. 그것은 성공적인 개입 이후 몇 달 이내에 20-40 %의 환자에게 발생하며 풍선이 팽창하는 동안 혈관의 손상 때문인 것으로 생각된다. 이후 혈관이 치료될 때 내피세포가 혈관 루멘을 협착시키는 것보다 더 빠르게 평활근 세포가 증식한다 (Ip et al. J. Am. College of Cardiol. 1990; 15: 1667-1687, Faxonj et al.. Am. J. of Cardiology: 1987; 60: 5B-9B). 풍선 혈관 성형술 이후 조기 재발협착증을 일으키는 환자의 퍼센트는 도관(stent) 내이식에 의해 감소될 수 있으며, 그것은 가변 도관 구조적 지지물, 튜브형 이식편 또는 혈관 성형술 이후 그들의 조합과 같은 루멘 내 내이식이다. 그렇지만, 도관은 실질직으로 동맥내막 과형성증으로 인한 나중의 루멘 협착의 양을 증가시키고 그리고 도관 재발협착증의 전체 비율은 이해할 수 없을 만큼 높게 유지된다 (Kuntz et al., Circ. 2000; 101: 2130-2133). 이들 장치는 그들이 내피 세포로 덮일 때까지 혈전증 및 수술후 출혈 합병증으로 고통받는다. 혈전증의 위험 때문에, 내피 세포가 도관 표면을 덮을 때까지 항응고제 치료가 사용된다. 내피 표면은 인간에 있어서 튜브형 이식편 상에 미치지 않는다. 도관 및 튜브형 혈관 내 이식편은 또한 국소적 혈관 팽창 또는 개석을 배제하는데 사용될 수 있다.

심혈관계 질환의 외과적 치료는 질병이 있는 혈관을 자연 또는 합성 혈관 이식편 또는 패치로 우회, 치환 또는 재구성하는 것이다.

이들 모든 혈관 내 및 외과적 방법은 동일한 문제점 - 혈관 내피의 상처, 과도한 연결 조직의 형성 및 혈전증 또는 재발협착증에 의한 폐색으로 인한 문제점에 의해 이어지는 염증 반응에 의해 악화된다.

관상 동맥 수술에서 폐색된 혈관은 자가 조직의 혈관 이식편으로 우회된다. 이 수술을 관상 동맥 우회 이식 (coronary artery bypass grafting)을 의미하는 CABG라고 부른다. 말초 동맥 수술에서 자연 또는 합성 이식편은 일반적으로 폐색을 우회시키도록, 예컨대 서혜부로부터 가랑이까지 이식된다. 어떤 경우에 있어서 동맥 조각이 자연 또는 합성 혈관 이식편에 대해 대안적으로 대치될 수 있다. 투석을 위한 접근 시술에서 투석기로 혈액을 세척하기 위한 접근을 생성시키는데 필요하다. 일반적으로 누공(fistula)이라 불리는 연결부는 투석에 필요한 높은 혈류를 제공하기 위해 상지 동맥과 정맥 사이에 구성된다. 심장 내 패치는 심장 중격 또는 벽에 있는 홀을 회복시키는데 사용된다. 몇가지 수술 중, 혈관 벽 중에 절개를 요하는 혈관 수술, 에컨대 혈전 제거술, 말단 동맥 제거술, 동맥류 회복 및 혈관 재구성에 있어서 보조 혈관 패치가 사용된다. 경피성 혈관 재형성에서 풍선, 도관 또는 도관 이식편으로 된 카테터가 뇌, 관상, 신장, 기타 말초 동맥 및 정맥과 같은 상이한 해부학적 위치에서, 대동맥 및 혈관 이식편에서 협착을 감소시키거나 팽창 또는 개석을 배제시키는데 사용된다. 풍선 팽창, 도관 및 도관 이식편은 담관 가지, 식도, 장, 기관-기관지 가지 및 요도와 같은 다른 영역에도 또한 사용될 수 있다.

모든 혈관 내 및 외과적 장치는 동일한 문제점 - 합성 표면 상에 내피 표면의 부족, 과도한 연결 조직의 형성 및 염증 반응으로 악화된다.

혈관 개입 및 합성 혈관 이식의 내이식 이후 개방성을 향상시키는 데 있어 몇가지 전략이 제안되었다. 전세계적으로 연간 약 1,600,000 혈관 성형술이 수행되고 그리고 이들 과정의 대부분에서 도관이 삽입된다 (8차 방사선 및 분자 전략에 대한 국제 약물 전달 회의 및 심혈관계 과정, 제네바, 스위스, Feb 1, 2002). 혈관 성형술 또는 도관 삽입 이후 혈관 성형술에서의 문제점은 재발협착증의 과정이다. 혈관에 대한 상처 때문에 6개월 이후 과도한 연결 조직의 형성은 이 경우의 20-30 퍼센트가 혈관 루멘의 협착으로 발전된다 (Bittl JA: Advances in coronary angioplasty N. Engl. J. Med. 1996; 335: 1290-1302, Narins CR, Holmes DR, Topol EJ: A call for provisional stenting: the balloon is back! Circulation 1998; 97: 1298-1305). 재발협착증으로 인한 문제점은 본 기술 분야에서 기재되어 왔으며 그리고 과학 문헌 및 특허에서 몇가지 접근이 기재되어 왔다. 최근까지 삽입되는 장치 없이 간단한 혈관 성형술 이후 재발협착증을 감소시키기 위한 이 분야에서의 전략은 없었다. 혈관 성형술 과정 이후 도관 장치를 사용할 때 약학적으로 코팅된 도관이 장기 효과에 대해 평가되지 않았으며 도관 또는 도관 이식편에서 장기 재발협착증의 비율을 확실하게 감소시키는 인간에 대해 증명된 방법이 없었다. 주 전략은 도관과 더불어 라파마이신, 시롤리머스, 파클리탁셀, 타크롤리머스, 덱사메타손, 사이토칼라신 D 및 악티노마이신 C와 같은 조직에 대한 상처 이후 과형성증을 감소시키는 다양한 약학적 물질을 사용하는 것이었다. 현재 약학적으로 코팅된 장치의 한가지 단점은 장치 표면으로부터 물질이 방출된 이후 효과가 소멸될 가능성이다. 게다가, 혈관 벽 내부 및 하류 혈관 또는 조직으로 높은 국소 농도로화합물을 방출하는 성질이 관심의 대상이 된다. 다른 단점은 이들 물질이 체내에서 자발적으로 발생하지 않으며 따라서 외부 생체 표면의 자연 치유에 실패한다는 것이다. 예컨대 파클리탁셀 및 악티노마이신 D는 세포에 대해 세포독성이 있다.

자연 혈관 이식편에서 주된 문제점은 특정 신체 부위에서 이식편의 연결 영역 및 혈관에서의 동맥내막 과형성 및 이식편 혈관 강내에서의 동맥내막 과형성이었다. 자연 혈관과 합성 혈관 이식편을 연결할 때 문합(anastomosis) 과형성의 동일한 문제점이 존재한다. 매년 350,000 이상의 합성 혈관 이식편이 이식되고 그리고 혈관 대체물로서 수많은 합성 생체 물질이 개발되었다. 외부 물질로서, 이식편은 외부 신체 반응의 타겟이며 트롬보겐 형성 때문에 자가 조직 물질보다 더 높은 정도로 응고되는 경향이 있다. 트롬보겐 형성을 극복하기 위해, 대부분의 접근은 트롬빈에 저항을 갖는 표면을 생성하는 것에 집중되었으며, 이들 노력의 대부분은 향상된 중합체 표면으로 향하게 되었다. 연구에서는 선택된 물질, 예컨대 다크론(Dacron) 및 ePTFE (팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌)가, 동물 모델에서 크고 작은 직경의 동맥에 성공적으로 도입될 수 있다는 것을 보여 주었다 (Zdrahala, J. Biomater. Appl. 1996; 10: 309-29). 인간에서, 다크론 및 ePTFE 혈관 보조물이 중대형 크기의 동맥을 재구성하는데 임상적 성공을 거두었지만, 아직 이상적이지는 않다. 그렇지만, 그 성공은, 열린 혈전 생성 표면에서 문합 과형성 즉, 자연 혈관 또는 합성 인공 혈관 및 자가 이식 혈관에서 과도한 연결 조직의 형성을 유발시키는 경향이 혈전증 (즉 혈병을 생성시키는 경향)으로 연결되거나 또는 혈전증에 의해 6 mm 이하의 직경을 갖는 혈관 치환체에 대해서는 제한된다 (Nojiri, Artif.Organs 1995 Jan; 19 (1): 32-8). 자가 이식 정맥 이식편은 동맥 위치에 이식될 때 재발협착증의 발생으로 고통받는다. 종래 기술에서 특허 및 과학 문헌에 기재된 것으로서 재발협착증의 발생을 감소시키는데 있어 유전자 치료가 사용되어 왔다. 유전자를 주입시킨 슬리브(sleeve)가 기재되었으며 과형성을 억제하기 위한 혈관 문합 주변 장치로서 사용되었다 (WO 98/20027, WO 99/55315). 이들 시스템에서 주된 결점은 슬리브의 번거로운 사용이며 그리고 사용된 물질은 성장 인자 또는 성장 인자를 암호화하는 것이다. 게다가, 이식의 트롬빈 형성에 대한 연구는 이식 물질을 변형시킴으로써 또는 이식편에 화학 화합물을 첨가함으로써 감소되었다 (에컨대 미국 특허 5.744.515). 이식편에 결합되거나, 또는 국소 약물 전달 장치와 더불어 주어지는 물질은 대부분 헤파린이 사용되었다.

인간에서 외부 이식편의 흐름의 표면은 몇몇 경우를 제외하고는 내피 세포로 덮이지 않고 유지된다 (Wu, J. Vasc. Surg. 1995 May; 21 (5): 862-7, Guidon, Biomaterials 1993 Jul; 14 (9): 678-93). 동물에서, 혈관 이식편의 완전한 내피세포화는 종에 따라 좌우되어 2-4 주에 발생하는 것으로 보여 졌다. 내피 세포가 없는 이 기간은, 예컨대 표면의 트롬보겐 생성에 의해, 원하지 않았던 효과 및 문제점을 유발할 수 있다. 내피 표면의 결핍은 자기 이식편에 비해 합성 이식편의 악화된 성능을 유발한다 (Nojiri, Artif. Organs 1995 Jan; 19 (1): 32-8). Berger, Ann. of Surg. 1972 ; 175 (1): 118-27, Sauvage). 자가 이식편은, 달리 말하면, 그 자체를 채집하기 위한 단계를 포함하며, 이는 더 길어진 수술 시간을 유발시키며 그리고 채집 영역에서 합병증의 가능성이 또한 있다. 다공성 경동맥 PTFE 이식편 주변의 강경한 맥관 구조에 의한 대망(omentum)의 전위는 개에서 이식편 루멘 내의 내피 세포를 덮는 것이 증가하는 것으로 설명하고 있지만 (Hazama, J. of Surg. Res. 1999; 81; 174-180), 그렇지만, 전술한 바와 같이 번거롭고 복잡한 과정과 더불어 문제점이 수반된다. 게다가, 이식편은 내피 세포로 접종되고, 그리고 내피 세포 또는 골수로 재배된다 (Noishiki, Artif. Organs 1998 Jan; 22 (1): 50-62, Williams & Jarrel, Nat. Medicine 1996; 2: 32-34). 세포 접종에서, 내피 세포는 채집 이후 혈액 또는 혈장과 혼합되고 그리고 이후 응고 되기 이전 기간 동안 이식편 표면에 첨가된다. 이들 방법에 사용된 내피 세포는, 이식편이 나중에 이식될 수 있도록, 미세혈관계 (지방), 거대혈관계 (예컨대 채집된 정맥으로부터), 또는 중피성 공급원으로부터 유도될 수 있다. 더 구체적으로는, 이들 방법은, 내피 세포로 조직을 채집하는 단계, 내피 세포의 분리, 어떤 경우에는 내피 세포의 배양, 이식편 물질 상에 내피 세포를 접종시키는 단계 및 최종적으로 이식편을 이식시키는 단계를 포함하는 몇개의 단계를 포함한다. 따라서, 이들 방법의 실질적인 결점은 그것이 시간이 소비되며 그리고 실시가 번거롭고, 그리고 또한 적절한 장비와 같이 본 기술 분야에서 특정 전문 기술을 필요로 한다는 것이다. 게다가, 그렇게 접종된 내피 세포는 다양한 결과로 유전자적으로 조작되었다: 이식편 표면에 내피 세포 부착을 감소시키는 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA)로 세포에 형질 도입, 및 내피세포화를 감소시키는 레트로바이러스에 의한 형질 감염. 세포 접종을 향상시키기 위해, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)로 형질 감염된 내피 세포 또는 지방 세포가 사용되었다. 전술한 결점에 덧붙여, 이 방법은 심지어 더 번거로우며 따라서 유용하게 실시되기엔 비용이 든다. 내피 프로제니터 세포를 형질 도입시키기 위한 방법 및 이후 그들을 다시 가하는 방법이 기재되었었다. 그렇지만, 전술한 바와 같은 문제점은 여전히 있다. 표면 상에서 내피 세포 성장을 위한 기술을 향상시키기 위해, 이식편 표면의 리간드 처리가 제안되었었다. 세포 재배에서, 이식편이 이식되도록, 내피 세포는 중합체 이식편에 채집 이후 직접 투여되지만, 이 기술은 또한 전술한 바와 같은 몇가지 단계를 포함하며, 역시 번거롭다. 또한, 복잡하고 따라서 비용이 드는 과정인 조직 조작은, 이식에 대해 혈관 조직을 구성하기 위해 사용되어 왔다. 혈관 신생 요소로서 유전자 기술적 최종 목표가 내피 표면을 유도하기 위해 제안되어 왔다 (PCT/SE00/02460). 여기서 결점은 세포 상에 성장 인자의 성장 인자 자극 효과의 사용이 제어할 수 없는 연결 조직 성장을 유발 할 수 있다는 것이다. 동맥 동종 이식편이 기재되었지만, 그들은 동맥 보존 및 항원성에 관련된 문제점의 증가를 주고 있다.

또한, 전세계적으로 연간 1,600,000 도관화 과정이 환자 당 평균 1,7 도관으로 수행되고 있다. 도관은, 즉 미세한 네트워크 구조의 비교적 간단한 장치로서 본 기술 분야에 알려져 있다. 혈관 폐색에 대한 도관화는 일반적으로 동맥의 팽창, 절제, 동맥 절단술 또는 레이처 처리에 의한 공개와 조합된다. 이들 개입은 내피 세포주의 파괴와 더불어 혈관 벽에 상처 및 조직 손상을 유발한다. 일반적으로, 도관은 어떤 물질, 일반적으로 스테인레스 스틸의 네트워크로 구성되며, 그것이 카테터와 더불어 경피적으로 질병에 걸린 영역에 들어간다. 도관은, 예컨대, 자가-배치 가능한/압력 팽창형, 튜브형/원추형/두갈래로 분지된, 영구적/일시적, 분해 불가/생물 분해 가능, 금속/중합체계 물질, 약학적 화합물과 함께 또는 없이 상이한 디자인이다. 그들은 뇌, 관상, 신장, 다른 말초 동맥 및 정맥과 같은 상이한 해부학적 영역 및 대동맥에서 혈관에 이식된다. 도관은 또한 담관 가지, 식도, 장, 기관-기관지 가지 및 요도와 같은 다른 영역에 사용될 수 있다. 도관은 예컨대 재발협착증, 협착 또는 동맥류를 치료하는데 사용될 수 있다. 도관은 특징적으로 개구 체 구조를 가지며, 또는 달리 말하면 방사상 팽창 및 감소를 촉진하기 위해 그리고 장치 구조의 조직 내 성장을 허용하기 위해 다중 개구부로 형성된다. 혈관 팽창 이후 도관은 폐색을 유발시키는 아급성 혈전증 및 신생 동맥내막 비대(thickening)와 관련되었다. 도관 대(era) 이전에 풍선 팽창 단독으로 혈관 협착을 완화하는데 사용되어 왔다. VEGF를 코딩하는 네이키드(naked) DNA를 운반하기 위한 하이드로겔(hydrogel)로 된 풍선이 기재되었다 (Riessen, Human Gene Therapy 1993, 4: 749- 758). 미국 특허 5,830,879, 및 van Belle J. Am. Coll. of Cardiol. 1997 ; 29: 1371-9)에서는 또한 풍선에 연결되는 VEGF 플라스미드와 혈관 치유를 유도하기 위해 및 재발협착증을 감소시키기 위한 혈관내 도관의 동시 개발을 기재하고 있다. 또한, 하이드로겔로 된 풍선 및 약물 전달을 위한 유전자 (5,674,192, Sahatjian et al.)가 기재되었다. 혈관 신생 펩티드, 리포좀 및 혈관 벽에 대한 암호화 유전자를 갖는 바이러스를 운반하는 데 있어 카테터가 사용되어 왔다 (WO 95/25807, 미국 특허 5,833,651 전술하였음). 카테터는 또한 도관의 더 빠른 내피세포화를 제공하기 위해 VEGF 단백질을 운반하는데 사용되었다 (van Belle, Circ. 1997: 95 438-448). 또한, 유전자 운반을 위한 도관 (미국 특허 5,843,089, Klugherz BD et al.,Nat biotechnology 2000; 18: 1181-84) 및 바이러스 유전자 운반을 위한 도관 (Rajasubramanian, ASAIO J 1994; 40: M584-89, 미국 특허 5,833,651)이 기재되었다. 도관에 대한 내피 세포 접종이 혈전증을 극복하기 위해 혈관 벽에 대한 재조합 단백질을 운반하는 방법으로 사용되어 왔지만, 전술한 바와 같이 이 기술은 번거로우며 따라서 비용이 든다.

도관 이식편은, 또한 덮여진 도관으로 언급되는 것으로서, 본 기술 분야에 공지되어 있다. 그런 도관은 두 부분, 즉 도관 부분 및 이식편 부분의 조합이다. 도관 이식편에서, 순응성 이식편은 방사상 팽창되는 도관과 쌍을 이룬다. 도관 이식편은 도관과 혈류 사이에 혈관을 통해 완전한 장벽을 형성함으로써 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 도관을 형성하는 와이어 멤버 또는 다른 구조적 물질에 대한 난류 혈류를 억제함으로써, 도관을 이루는 금속 또는 다른 물질에 대한 트롬빈성 또는 면역학적 반응을 억제함으로써, 그리고 혈류가 통과하는 것으로부터 혈관의 질병 또는 손상된 부분을 분리시키는 장벽을 형성함으로써, 그 이식편은 내부 커버링(covering)과 생물학적 양립이 가능하도록 작용할 수 있다. 인간에서, 도관 이식편에 관련된 주된 문제점은 이식편에 관련하여 전술한 것으로서, 폐색을 유발하게 되는 동맥내막 비대의 형성 및 완전한 내피 세포화의 손상이다. 도관 이식편은 대동맥, 뇌, 관상, 신장, 다른 말초 동맥 및 정맥, 및 대동맥에 사용될 수 있다. 혈관내 장치가 운반될 때 발생하는 혈관 손상이 염증, 유사분열 물질 및 화학 주성 인자의 국소적 발현 및 방출을 유발하며, 그것이 동맥내막 병소 형성을 매개한다는 것을 실험적 연구에서 보여주고 있다. 도관 이식편은 담관 가지, 식도, 장, 기관-기관지 가지 및 요도와 같은 다른 영역에 또한 사용될 수 있다.

따라서, 현재, 조직의 상처 영역에서, 장치 이식의 영역에서, 혈관 연결 부위에서 또는 자연 이식편에서 동맥내막 과형성을 억제하는데 지대한 관심 및 요구가 있다. 또한, 현재, 임상적 실시에서 내피세포화 및 이식편 치유를 향상시키기 위한 지대한 관심 및 요구가 있다. 그렇지만, 지금까지, 그러한 연구는 사실상 개발된 방법이 없다.

연간, 약 100,000 심장 밸브 교환 수술이 수행되고 있다. 심장 밸브 보조물은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 여기에는 네 종류의 이식편이 있다: 합성 이식편, 이종 이식편, 동종 이식편 및 자가 이식편. 이종 이식편은 일반적으로 심장 주변 및 돼지의 밸브 예컨대 Carpentier-Edwards, Ionescu-Shiley, Hancock, 페리카본(Pericarbon) 또는 도관이 없는 밸브에서 보존된다. 생물 보조 밸브에 관련되는 주된 관심은 생물학적 변성이다. 변성은 내피 세포 장벽의 파괴 및 내피세포화의 손상, 밸브 조직 내에서 순환하는 숙주 혈장 단백질의 완화된 확산을 유도하는 증가된 투과성, 및 침투 과정 예컨대 석회화 및 지방 침착 및 콜라겐 프레임워크(framework)의 생물학적 분해의 증가된 활성으로 특정된다. 또한 염증 세포의 침입을 완화시키는 것이 기재되었으며 그리고 그 연구들은 1 년 이후 생물학적 보조 밸브 표면에 내피세포의 성장이 없거나 (Isomura J. Cardiovasc. Surg. 1986, 27: 307-15) 또는 부족한 것 (Ishihara, Am. J. Card. 1981: 48, 443-454)을 보여주고 있다. 글루타르알데히드 보존제의 보존, 중화 및 생물학적 보조물 밸브의 전-내피세포화 방법의 변형이 밸브의 성능을 향상시키기 위해 제안되었다. 문맥상 내피세포 접종에 대해 몇몇 연구가 이루어 졌지만, 이는 전술한 바와 같이 많은 단계가 요구되기 때문에 임상적으로 번거롭다.

전술한 바와 같이, 이식할 수 있는 장치는 또한 심혈관계가 아닌 다른 분야에도 사용될 수 있다. 구조적 지지체, 기능적 지지체, 약물 전달, 유전자 치료, 및 세포 캡슐화 목적과 같은 다양한 이식할 수 있는 장치가 기재되어 있다. 면역 시스템으로부터 선택된 생성물을 제조해내는 조직 또는 세포를 보호하는 다양한 장치, 예컨대 혈관외 확산 챔버, 혈관내 확산 챔버, 혈관내 초여과 챔버, 및 마이크로 캡슐화 세포가 신체에 이식되기 위해 연구되어 왔다. 그렇지만, 외래의 생체 물질이 이식될 때, 염증성 외부 신체 반응이 시작되고, 결국 그 장치를 캡슐화하게 되고, 그리고 반투과성 멤브레인 세포 내부로 영양 성분의 확산을 억제하게 된다. 혈관 분포의 손상은 물질의 확산에 대한 장애가 된다. 캡슐화된 내분비 조직의 장기 생존도가 감소되며, 그리고 또한 혈관 이식편을 감염에 대해 더 취약하게 만든다. 혈관 분포가 없는 섬유성 캡슐은 또한 장치의 성능을 제한할 수 있다. 미국 특허 5,882,354에 의하면, 알려지지 않은 메카니즘에 의한 두 존(zone)을 포함하는 생 세포를 지탱하는 챔버가 연결 조직의 침입을 억제하며 그리고 이식편의 혈관세포화를 증가시킨다.

이식된 장치의 과정 중에 사용된 몇몇 다른 물질도 전술한 것과 유사한 문제점에 또한 직면한다. 예컨대, 봉합 물질이 언급될 수 있으며, 그 물질은 수술 과정 동안 회복, 고정 및/또는 신체 조직의 접근에 사용된다. 강도, 생물학적 양립가능성 및 생물 분해 가능성에 관련되는 보조 장치 또는 이식편의 부착을 위해 봉합에대해 업격한 요구가 존재한다.

요약하면, 본 분야의 주된 결점은 혈관 내 및 수술적 과정 이후 과도한 연결 조직의 형성이다. 예컨대, 풍선 팽창 과정 이후 결과는 과도한 연결 조직 성장에 이어지는 합병증이다. 또한, 혈관 자가 이식편에서도 과도한 연결 조직 성장이 협착을 초래한다. 이식되는 장치가 있거나 또는 없는 혈관 수술 과정에서 문합 영역에서 과도한 연결 조직의 형성은 혈류를 제한하게 되는 혈관 연결의 협착을 초래하고 그리고 이어서 그 혈관에 의해 공급받는 장기의 기능장애로 이어진다. 혈관 이식에서, 합성 물질이 사용될 때, 이식이 수행된 곳에 트롬빈성 표면이 드러나는 것에 의한 문제점이 또한 발생하며, 그것은 혈액 응고 및 악화된 성능을 유발시킨다. 합성 조직 이식에서, 결과는 혈관화되지 않은 섬유성 비-영양 존이며, 이는 이식물의 기능장애를 유발한다. 종래 기술의 방법을 사용하여 어떤 만족스러운 정도에서도 이는 염증 반응과 함께 포유 동물 생체, 특히 인간의 신체에서 이식된 의학적 장치의 생물학적 양립성을 얻을 수 없다.

특허 EP1016726에서는 혈관 손상 이후 도관을 삽입할 때 내피 표면을 생성시키기 위해 혈관 신생 단백질 및 유전자, 예컨대 성장 인자 (예컨대 VEGF) 또는 다른 유전자 (예컨대 NOS)의 사용을 기재한다.

특허 EP1153129에서는 재발협착증을 억제하기 위해 올리고센스 뉴클레오티드를 기재한다.

세포밖 초과산화물 디스뮤타제(extracellular superoxide dismutase) (EC-SOD)가 항산화적 효소로 분비되며, 이는 생체 전체를 통해 널리 발현되며 그리고주된 SOD 동질 효소는 혈장에 있다. 혈관 벽, 폐, 신장, 갑상선 및 피하(epidymis)가 EC-SOD에 대한 주된 발현 영역으로 보여진다.

특허 ES2004687에서는 EC-SOD의 서열을 기재한다. Li et al.에 의한 논문에서는 심근을 보호하는 데 있어 EC-SOD의 사용을 기재한다 (Gene therapy with extracellular superoxide dismutase attenuates myocardial stunning in conscious rabbits. Circulation 1998; 98: 1438-1448, 및 Gene therapy with extracellular superoxide dismutase protects conscious rabbits against myocardial infarction. Circulation, 2001; 103: 1893-1898).

본 발명은, 이식될 수 있는 보조 장치와 같이, 재발협착증을 감소시키고, 내피화를 증가시키고 그리고 염증 반응을 감소시키고, 그리고 연결 조직 형성을 감소시키는 것을 보조하는 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 성분과 조합된 인간 또는 동물에 이식하기에 적당한 의료 장치에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로 연결 조직 및 염증 반응 형성을 감소시키는 방법 그리고 1 이상의 합성 표면을 포함하는 의료 장치에 대한 인간 또는 동물 생체의 허용을 목적으로 내피화를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명에 따른 의료 장치를 제조하는 방법에 관련된다.

본 발명의 목적은 전술한 문제점에 대한 해결책을 제공하는 것이다. 더 구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 연결 조직 과형성을 초래하는 상처화된 혈액 조직 반응의 문제점을 해결하는 의료 장치를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 폐색 및 다른 문제점을 초래하는 트롬보겐을 생성시키는 의료적 이식물 표면의 문제점을 해결하는 의료 장치를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 재발협착증을 감소시키거나 그렇지 않으면 외래 물질과 그것의 수혜자 또는 숙주 사이에 생물학적 양립가능성을 향상시키며 종래 기술에서의 방법보다 그것을 실시하는데 있어 덜 번거로운 의료 장치를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 지금까지 알려진 장치들보다 조직 과형성 또는 폐색 및 재폐색되는 것에 의해 협착되는 것이 적은 위험을 수반하며, 혈관 개입에 유용한 의료 장치를 제공하는 것이다. 본 발명의 더 다른 목적은 종래 기술의 장치보다 인간 또는 동물의 생체에 더 잘 수용되고 유지되는 것으로서 대사 기능의 측정 및 제어에 유용한 장치를 제공하는 것이다.

상기 목적은 포유 동물의 생체에 도입될 때 혈액, 체액 및/또는 조직과 적어도 일부 접촉하는 것으로서 향상된 생물학적 성능을 갖는 의료 장치를 제공함으로써 달성된다. 상기 장치는 코어(core) 및 생물학적 양립가능 매질 중에 존재하는 핵산을 포함하며 그리고 상기 핵산은, 상기 코어의 합성 표면 상의 적어도 일부에서 연결 조직 형성을 감소시킬 수 있으며 그리고 체내에서 내포세피화를 촉진시키는 것이 가능한 세포밖 초과산화물 디스뮤타제 (EC-SOD) 단백질의 생성을 초래하는 번역 또는 전사 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 한다.

가장 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 EC-SOD이다.

다른 구체예에서, 핵산은 EC-SOD 단백질 또는 폴리펩티드이다.

핵산은 레트로바이러스, 센다이(Sendai) 바이러스, 렌티 바이러스, 아데노 연관(adeno associated) 바이러스, 및 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터 또는 리포좀 중의 생물학적 양립 가능 매질 중에 네이키드 형태로 존재하거나 또는 인위적 염색체이다.

하나의 구체예에서 핵산은 혈관 벽에 국소적으로 투여된다.

다른 구체예에서 핵산은 장치를 포위하는 조직 중에 국소적으로 투여된다.

더 다른 구체예에서, 생물학적 양립 가능 매질은 생물학적 안정 중합체, 생물학적 흡수 가능 중합체, 생물분자, 하이드로겔 중합체 또는 피브린이다.

하나의 유리한 구체예에서, 핵산은 포유 동물 생체에 그것의 연속적인 전달이 가능하도록 상기 코어로부터 분리된 저장소(reservoir) 중에 존재한다.

대안적인 구체예에서, 핵산은 이온 결합 또는 공유 결합으로 코어에 부착되었다.

합성 표면은 무공성 또는 다공성이며, 이 경우 세공을 통해 모세관 세포 및 내피 세포 성장이 허용된다. 바람직하게는, 공극률은 약 0 mm 내지 약 2000 mm이다.

본 유전자 전이 생성물은 연결 조직 형성을 감소시키는데 있어 예컨대 자연 이식편을 이식하거나 또는 의료적 이식물을 이식하는 개입 과정에 연결되는, 몇가지 상이한 상황에 사용될 수 있다.

본 장치는 널리 다양한 상황에 유용하며, 그리고 예컨대 심혈관계 이식물, 예컨대 혈관의 인위적 부분, 또는 혈관내 이식물일 수 있다. 일반적인 용어에서, 본 장치는 포유동물의 생체의 일부를 교환하기 위해 사용되는 이식물로서 사용될 수 있으며, 여기서 상기 이식물은 혈액, 체액 및/또는 조직과 적어도 부분적으로 접촉하도록 적용된다. 나아가, 본 장치는 조직 이식물 또는 바이오센서(biosensor)로서 유용하다. 바람직하게는, 그 장치는 혈관 이식편, 도관, 커버링된 도관, 이식편 연결자 및 바이오센서로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 의료 장치를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 생물학적 양립 가능 매질 중의 핵산을 합성 이식편에 도입하는 방법에 관한 것이며, 상기 핵산의 투여는 생체 중에 장치의 도입 이전에, 동시에 또는 이후에 수행된다. 본 발명은 또한 생체 중에 혈액, 체액 및/또는 조직과적어도 부분적으로 접촉하는 자가, 동종 및 이종 합성 표면을 포함하는 장치를 도입하는 방법 및 생물학적 양립 가능 매질 중에 존재하는 핵산을 그것의 주변에 투여하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은, 핵산이 상기 합성 표면 상에 적어도 부분적으로 연결 조직 성장 및 염증 반응을 감소시킬 수 있으며 그리고 내피 세포화 및 생체내 생물학적 양립가능성을 촉진할 수 있는 EC-SOD의 번역 또는 전사 생성물의 발현을 암호화하거나 또는 증가시키는 것을 특징으로 하며, 상기 핵산의 투여는 생체에 장치의 도입 이전에, 동시에 또는 이후에 수행된다.

본 발명의 다른 양태에 따라, EC-SOD 유전자/cDNA 또는 EC-SOD 단백질의 사용은 재발협착증 또는 혈관 벽 비대와 같은 혈관 조작에 의한 손상에 의해 초래되는 조건을, 예컨대 염증을 억제함으로써 치료하기 위한 의약의 제조를 위해 제공된다.

치료 방법에 관한 더 상세한 설명은 이하 및 첨부된 청구범위에 개시되었다. 그 방법은, 문제되는 상황에 좌우되어 핵산을 1회 이상 투여하는 것을 포함할 수 있다.

도면의 설명

도 1.

정상 혈관 조각에서 (위쪽) 및 죽상경화증 병소가 이미 존재하는 조각에서 (아래쪽) EC-SOD 처리된 것 (왼쪽) 대 대조군 동물 (오른쪽)에서의 동맥내막 형성의 비교. H & E (위쪽) 및 Masson 트리크롬 (아래쪽), 위쪽은 본래 크기의 20× 및 아래쪽은 lO×. EC-SOD 처리된 동물에 이식된 장치는 향상된 생물학적 양립성을 보여준다. 이식물에 대한 원치않는 숙주 반응이 감소되었으며, 그리고 더 나은 치유를 의미하는 보호성 내피 세포 층의 회복이 가속화되었다.

내피 세포에 대해 PECAM으로 면역 스테이닝된 대동맥 영역은 EC-SOD 군에서 4 주에 내피 세포의 90.1 ± 11.5 % 회복을 보였으며, 반면에 LacZ 대조군은, 내피 세포 회복이 35.6 ± 9.4 %로 측정되었다 (P < 0.05).

도 2.

EC-SOD 삽입을 갖는 AdBgIII의 플라스미드 차트.

정의

본 명세서에 사용된 용어 중 몇몇 의미로서 이하의 설명이 제공된다. 본원에 구체적으로 정의되지 않은 것은 관련 기술 분야 내에서 그것의 일반적 의미로서 설명된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 것으로서, 문장에서 달리 명확히 언급하지 않는 한 단수형은 복수형 지시를 포함하는 것으로 여겨져야 한다.

"재발협착증"이란 튜브형 구조에서 연결 조직 성장을 초래하는 이식물이 있거나 또는 없는 팽창 과정을 수행한 이후 연결 조직의 성장에 이어 튜브형 구조의 협착으로 본원에서 언급된다. 연결 조직 성장은 튜브형 구조의 협착을 초래하는 생체 중 임의의 부위에서 발생할 수 있다. 연결 조직 성장은 어떤 유형의 세포에서 면적이 증가하거나 또는 세포 밖 메트릭스의 부피 또는 성분이 증가되는 것을 포함한다.

"섬유증"이란 연결 조직의 성장 및 동종, 자가 또는 이종 생물학적 이식물또는 합성 이식물 주변의 무세포 또는 무혈관 층의 형성으로서 본원에서 언급된다.

"과형성 연결 조직 반응"이란 종양의 형성을 포함하여 연결 조직 세포의 수가 증가하거나 및/또는 조직 중에 세포 밖 메트릭스의 부피가 증가를 초래하는 반응으로써 연결 조직의 벌크가 증가할 수 있는 것으로서 본원에서 정의된다.

"재발협착증" 및 "섬유증"은 다른 방식으로 특정화되지 않는다면 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

"의료 장치"란 이식물, 장치, 스카폴드(scaffold) 또는 보조물로서 본원에서 언급되며, 그리고 포유동물에서 적어도 부분적으로 이식되도록 조립된 대상물로서 이해된다. 그것은 생체 조직 또는 체액쪽으로 향하여 접촉하는 하나 이상의 표면을 제공하면서 생체 조직 또는 체액과 접촉하는 것으로 의도된다. 심혈관계 이식물은, 임의의 다른 방식으로 특정되지 않았다면, 순환 시스템 중에 이식물, 또는 혈류와 연결되는 이식물로서 본원에서 언급된다. 예컨대, 의료적 이식물은 이식될 수 있는 보조 장치, 및 더 구체적으로는 심혈관계 이식물 또는 조직 이식물 뿐 아니라 혈액-접촉 의료적 이식물, 조직-접촉 의료적 이식물, 체액-접촉 의료적 이식물, 이식될 수 있는 의료 장치, 체외의 의료 장치, 인공 심장, 심장 보조 장치, 내부 보조 의료 장치, 혈관 이식편, 도관 이식편, 심장 밸브, 심혈관계 패치, 일시적 혈관내 이식물, 윤성형술 링(annuloplasty ring), 카테터, 페이스메이커 리드(lead), 바이오센서, 생 세포를 지탱하는 챔버, 장기 이식물, 또는 생물학적 인공 장기일 수 있다.

본 문맥에서 의료적 이식물은, 예컨대 WO 96/29987에 기재된 바와 같이, 연질 조직 사이의 연결 조직 성장의 원하지 않는 형성을 막기 위한 단순한 장벽으로서 작용하도록 도입되는 장치를 의미하지는 않는다.

"이동할 수 있는 부착된 핵산 세그먼트"란 의료적 이식물을 포위하는 조직에 전달될 수 있는 광범위한 유전자 물질을 나타내는 것으로 본원에서 언급된다. 예컨대, 핵산 세그먼트는 이중 또는 단일 스트랜드 DNA일 수 있으며, 또는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA, tRNA 또는 rRNA와 같은 RNA일 수 있다. 선택적으로 핵산은 안티-센스(anti-sense)의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 세그먼트는 선형 핵산 분자 및 플라스미드를 포함하며, 또는 DNA 바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 다양한 재조합 바이러스의 게놈 내에 기능적 삽입물로서의 네이키드 DNA 또는 RNA과 같은 임의의 형태일 수 있다. 핵산 세그먼트는 또한 염, 중합체, 리포좀 또는 다른 바이러스 구조와 같은 다른 담체 중에 도입된다. 이동할 수 있는 부착된 핵산 세그먼트는 포위하는 조직에 의해 운반될 수 있고 그리고 취해질 수 있는 그런 방식으로 의료적 이식물에 부착된다.

용어 "부착된"이란 흡착, 예컨대 고분자 물질, 피브린 또는 핵산과 같은 화학 물질 또는 생불분자의 이식물에 대한 물리적 흡착, 화학적 흡착, 리간드/수용체 상호작용, 공유 결합, 수소 결합, 또는 이온 결합을 의미한다.

본원에서 "주변 조직"이란 과형성된 연결 조직의 형성 또는 이식물 표면의 섬유성 반응을 형성하거나 또는 기여하는 능력을 갖는 임의의 또는 모든 세포를 의미한다. 주변 조직은 또한 생물학적 또는 합성 표면 상에 내피세포화된 표면의 형성을 형성하거나 또는 기여하는 능력을 갖는 임의의 또는 모든 세포를 의미한다.이는 다양한 조직, 예컨대 지방, 대망, 늑막, 심막, 복막 근육, 혈관 벽, 및 섬유상 조직을 포함하지만, 주변 조직의 특정 유형은 이식물 중에 과형성된 연결 조직의 형성을 궁극적으로 상승시키게 되는 방식으로 세포가 활성화되는 것만큼 중요하지는 않다. "주변 조직"은 이식물 내부에 위치하거나 (조직 챔버 내의 세포를 제외하고), 이식물과 접촉하거나 또는 이식물 쪽으로 이동하는 그런 세포를 의미하는 것으로 또한 사용된다. 또한, 과형성된 연결 조직 세포 또는 내피 세포, 게다가 심혈관계 이식물 연결 조직 과형성, 조직 이식물 섬유증 또는 내피세포화의 활성 영역에 도달하는 세포 또는 조직을 더 유인하도록 자극하는 세포가 주변 조직인 것으로 고려된다. "주변 조직"이란 또한 이식 영역에 존재하거나 또는 이식물의 이식 이후 이식편 주변 영역에 도달하는 염증 세포를 의미하는 것으로 사용된다.

"내피세포"란, 혈관, 심장 및 림프의 내부 표면을 덮고 있는 멤브레인을 형성하면서 에지-대-에지(edge-to-edge)로 연결된 편평 내피 세포의 단일 층이다.

본원에서 "내피세포화"란 다공성 또는 무공성 이식물을 형성하는데 사용되는 모든 포유동물 조직 또는 생체 물질의 유체 접촉 표면 상에서 내피 세포의 성장을 의미한다.

표면의 내피세포화는 수직 방향 성장, 이식물 중의 세공을 통한 모세관 및/또는 모세관 내피 세포의 안쪽으로의 성장, 또는 순환하는 내피 세포 또는 내피 세포 전구체 세포의 접종을 경유하여 발생할 수 있다. 본 개시에서, 달리 구체화되지 않는 한, 다공성 또는 무공성 이식물을 형성하는데 사용되는 생체 물질의 표면에 접촉하는 실질적으로 모든 조직 상에서의 내피 세포의 성장을 의미하는 구 "모세관내피세포화"와 상호 교환적으로 사용될 것이다.

본원에서 용어 "모세관화" 및 "혈관화"는 이식물 표면 상에 모세관 및 미세 순환계의 형성으로 이해되며, 달리 구체화되지 않는 한, 그들은 내피세포화와 상호 교환적으로 사용될 것이다.

본원에서 "혈관신생의"와 같은 "혈관 신생" 및 그것의 활용형은 주변 조직과 같이 기존 포유 동물의 조직 중에 내피 세포의 형성 및 성장을 의미한다.

본원에서 의료적 이식물의 "재발협착증을 방지하거나 또는 내피세포화를 증가시키는 잠재력"을 갖는 번역 또는 전사 생성물은 그것의 활성의 결과로서, 과도한 연결 조직의 형성을 감소시킬 수 있으며 그리고 의료적 이식물의 내피세포화 또는 모세관화를 유도할 수 있는 화학적 성분 또는 생체 분자, 바람직하게는 호르몬, 수용체 또는 단백질로서 이해된다.

"세공" 및 "다공성"과 같은 "공극률" 및 그것의 활용형은, 달리 구체화되지 않는 한, 생체 물질의 첫번째 표면으로부터 출발하여 실질적으로 두번째 표면까지 연장되는 소형 채널 또는 통로를 갖는 생체 물질을 의미한다.

"표면"이란 생체 물질과 그것의 주변 사이의 경계면을 의미한다. 그 단어의 사용은 그것의 거시적 감각 (예컨대 생체 물질의 시트의 주된 두 면), 뿐 아니라 그것의 미시적 감각 (예컨대 그 물질을 관통하는 세공의 라이닝)을 다 포함하는 것으로 의도된다.

용어 구획이란, 예컨대 바이알 또는 패키지와 같은 임의의 적절한 구획을 의미한다.

발명의 상세한 설명

첫번째 양태에서, 본 발명은 생물학적 양립 가능 매질 중의 핵산을 합성 이식편에 투여하는 것에 관한 것이며, 상기 핵산은 생체내에서 과형성 연결 조직을 감소시킬 수 있는 세포 밖 초과산화물 디스뮤타제 (EC-SOD) 단백질의 생성을 유발하는 번역 또는 전사 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 양립 가능 매질 중의 핵산 및 이식물을 투여하는 것에 관한 것이며, 상기 핵산은 이식물을 포위하는 조직 중에서 생체내에서 과형성 연결 조직을 감소시킬 수 있는 세포 밖 초과산화물 디스뮤타제 (EC-SOD) 단백질의 생성을 초래하는 번역 또는 전사 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 한다.

세포 밖 초과산화물 디스뮤타제 (EC-SOD)는 항산화성 효소로 분비되며, 이는 생체 전체를 통해 널리 발현되며 그리고 혈장 중에 주된 SOD 동종효소이다. 혈관 벽, 폐, 신장, 갑상선 및 피하는 EC-SOD에 대한 예비적 발현 영역으로 보여진다. 인간 대동맥 중에 전체 SOD 함량의 약 50 %가 EC-SOD이다. 대부분의 조직 EC-SOD는 전체 SOD 활성의 단지 적은 부분을 나타내며, 이는 EC-SOD가 혈관 벽의 산화환원 균형에 중요한 생리학적 기능을 갖는다는 것을 제안한다. 아데노바이러스 매개 EC-SOD 유전자/cDNA 전이는 토끼 대동맥에서 풍선 박탈(denudation) 이후 동맥내막 형성의 명백한 억제를 초래한다 (예컨대 W002/087610 참조). 치료 효과는 전신 효과를 제안하는 것으로서 전체 복부 대동맥에 미친다. EC-SOD는 따라서 재발협착증을억제하기 위한 유효한 치료용 분자인 것으로 보여진다.

다른 양태에서, 본 발명은 포유 동물 생체에 도입될 때 혈액, 체액 및/또는 조직에 적어도 부분적으로 접촉하는 향상된 생물학적 성질을 갖는 의료 장치에 관한 것이며, 그 장치는 생물학적 양립 가능 매질 중에 존재하는 핵산 및 코어를 포함하며, 상기 핵산은 주변 조직 중에 염증을 억제할 수 있으며 및/또는 과형성 연결 조직 반응을 감소시킬 수 있으며 그리고 상기 코어의 합성 표면 상에 적어도 부분적으로 생체내 내피세포화를 촉진할 수 있는 번역 또는 전사 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 한다. 핵산이 그런 방식으로 제공됨으로써 이식물을 포위하는 조직의 세포 내로 그것의 전이가 허용된다. 본 명세서에서, 용어 "포유 동물 생체에 도입되는"이란 생체 중에 전체적으로 도입되고 그리고 단지 일부분으로 도입되는 두 장치를 포함하는 넓은 의미로 사용되지만, 여기서 합성 물질로 이루어진 1 이상의 표면은 상기 생체의 혈액, 체액 및/또는 조직에 접촉된다.

본 발명에 따라 얻어진 과형성 연결 조직 성장의 감소 및 내피세포화의 유도는 본래 구조에 대해 많은 장점을 제공한다. 연결 조직 과형성은 대응하는 조직 중에 세포의 증식 및 세포 밖 매트릭스 생성을 다 포함한다. 내피 세포는 편평화된 세포의 단일 층이며, 그것은 혈관, 심장 및 림프의 내부 표면을 덮고 있는 세포의 멤브레인을 형성하면서 에지 대 에지로 연결된다. 이론상, 이식편의 내피세포화는 문합 영역으로부터 수직 방향의 성장 (문합을 가로지르는, transanastomotic), 이식편 벽, 및 다공성 내부와 같은 합성 표면을 통한 모세관 및/또는 모세관 내피 세포의 안쪽에서의 성장 (틈새를 가로지르는, transinterstitial), 순환하는 내피 전구체 세포의 접종을 경유하여 발생할 수 있다. 세공을 통하여 틈새를 가로지르는 이동에서, 내피 세포는 부착, 스프레딩(spreading), 안쪽으로의 이동 및 증식을 통해 모세관으로부터 생겨난다.

따라서, 재발협착증 및 그것에 기인하는 생물학적 튜브형 구조의 협착 및 혈관 자체의 중합체 표면과 혈관 자체(body) 사이의 연결을 피하기 위해 종래 기술에서 노력이 행해졌지만, 그런 노력은 소형 맥관에 대해서는 만족스럽게 증명되지 않았으며, 여기서 과형성 및 혈전증이 실질적인 문제점으로 유발되었다. 또한, 트롬보겐 형성을 감소시키기 위해 종래 기술에서 몇몇 노력이 이루어졌지만 결과는 없었다. 놀랍게도, 본 발명은 혈관과 같은 생물학적 조직에서 개입 과정 이후 재발협착증을 감소시키는 유전자 전이 생성물을 제공하며, 그리고 본 발명은 또한 재발협착증으로부터 보호되는 신규한 장치를 제공한다. 본 발명은 이식물의 넓은 범위에 유용한 융통성있는 기술을 제공하며, 그리고 놀랍게도 연결 조직 과형성 및 폐색을 발전시키는 것으로 기존에 알려져 있던 작은 크기의 합성 맥관 섹션(section) 및 혈관 내 이식물에 또한 효율적이다. 본 발명에 따라 얻어진 재발협착증의 감소는 종래 기술에서 오랜 동안 인간에서 형성되는 것으로 관찰되지 않았었다. 본 발명은 또한 이식물 표면 상에 내피세포화를 증가시키는 유전자 전이 생성물을 제공한다.

본 발명에 따른 장치의 하나의 구체예에서, 핵산이 아데노바이러스와 관련하여 생물학적 양립 가능 매질 중에 존재한다. 대안적인 구체예에서, 핵산이 레트로바이러스, 렌티바이러스, 센다이 바이러스 및 아데노-연관 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 다른 바이러스 벡터 중에 도입된다. 다른 구체예에서 핵산이 네이키드 DNA로서 존재하며. 더 다른 구체예에서, 핵산이 리포좀 중에 존재한다.

유전자 전이의 사용은 몇몇 출판물 중에 질병의 치료 또는 예방을 위해 가정되어 왔다. 유전자 치료는 약리학적 시약으로서 유전자 물질의 사용을 수반한다. 본래 유전 질환을 치료하기 위한 수단으로서 인식되었던, 유전자 치료가 이제 국소적 및/또는 전신 사용을 위한 치료용 mRNA 또는 단백질을 운반하기 위한 강력한 수단으로 이해된다. 유전자 치료에는 생체외 및 생체내 두가지 접근이 있다. 생체외 접근에서, 숙주로부터 제거되는 세포는 그들이 숙주로 되돌아가기 이전에 생체내에서 유전자적으로 변형되며, 그리고 생체내 접근에서 유전자 정보 그 자체가 전이를 위한 비이클(vehicle)로서 임의의 세포를 사용하지 않고 숙주에 직접 전이된다. 유전자는 간세포(stem cell) 중에 또는 인시투(in situ)로, 그들이 필요로 하는 곳에 좌우되어 타겟이 될수 있다. 유전자 치료의 원칙은 세포 기능이 유전자 전사 및 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 같은 유전자 전사 생성물의 제조의 변형을 통해 조절된다는 것이다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 이후 다른 세포와 상호작용하여 그 세포의 기능을 조절하게 된다. 이런 전사 변화가 유전자 전이와 더불어 수행된다. Losordo et al. Circulation 1994, 89: 785-792에서는, 심지어 분비 시그날을 암호화하지 않는 유전자와는 대조적으로 형질도입된 세포의 수가 낮게 유지될 때에도 분비되는 유전자 생성물이 중요한 생물학적 효과를 가질 수 있다는 것을 보여 주었다. 세포내 유전자 생성물을 발현하는 유전자에 대해 세포내 유전자 생성물이 그것의 생물학적 효과를 발현하도록 그리고 이어서 더 유효한 형질 감염이 요구될 수 있도록 더 큰 세포 집단이 요구될 수 있다 (Isner et al., Circulation, 1995,91 : 2687-2692). 지금까지 유전자 치료의 용도를 설명하기 위해, 유전자는 예컨대 지방세포(adipocyte)로의 생체내 유전자 전이에 의해 직접 치료될 수 있는 질병 또는 조건에 대응하는 특정 용도를 갖는 지방세포에 전이되었다. 핵산의 골 조직 내로의 전이는 인시투로 보여졌으며 그리고 인시투로 또는 치료용 자원으로서 분리 이후에 감염된 중피의 사용 역시 기재되었다.

엄청나게 광범위한 다양한 유전자 물질이 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 주변 조직으로 전이될 수 있다. 예컨대, 핵산은 DNA (이중 또는 단일 스트랜드) 또는 RNA (예컨대 mRNA, tRNA, rRNA)일 수 있다. 그것은 또한 코딩 핵산, 즉 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 것일 수 있으며, 또는 그것은 유전자 발현을 방해하는 기능을 가질 수 있는 안티-센스 핵산 분자, 예컨대 안티-센스 RNA 또는 DNA일 수 있다. 대안적으로, 그것은 인위적 염색체일수 있다. 따라서, 핵산은 재발협착증, 섬유증 및 염증을 감소시키거나 또는 내피세포화를 향상시키는 보조물을 포위하는 조직에 전이되도록 목적하는 것인 엑손 또는 인트론 단독, 또는 엑손과 인트론, 또는 코딩 DNA 영역, 또는 임의의 구조물을 포함하는 게놈 서열일 수 있다. 적절한 핵산은 또한 선형 핵산 분자 및 플라스미드, 또는 DNA 게놈과 바이러스, 및 레트로바이러스를 포함하는 다양한 재조합 바이러스의 게놈 내의 기능성 삽입물을 포함하는 네이키드 DNA 또는 RNA와 같이 실질적으로 임의의 형태일 수 있다. 핵산은 또한 리포좀 및 다른 바이러스 구조와 같은 다른 담체 중에 도입될 수 있다. 핵산 백본(backbone)은 또한 안정성 또는 형질 감염 효율과 같은 성질을 변형시키기 위해 변형되거나 또는 치환될 수 있다.

유전자 전이를 위해 화학적, 물리적, 및 바이러스 매개 메카니즘이 사용된다. 유전자 전이에 몇가지 상이한 비이클이 사용된다. 핵산을 조직에 전달하는데 사용될 수 있는 것으로서, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 미국 특허 5,882,887, 미국 특허 5,880,102) 및 일본의 헤마클루틴화(hemagglutinating) 바이러스 (HVJ 또는 센다이 바이러스) (미국 특허 5,833,651)와 같은 재조합 바이러스를 포함하여, 살아있는 또는 불활성의 몇몇 바이러스가 있다. 레트로바이러스는 생체내에서 그들의 유용성을 제한하는 몇가지 결점을 갖는다. 그들은 안정한 유전자 전이를 제공하지만, 현재 레트로바이러스는 복제되지 않는 세포를 형질 도입시키는데 불안정하다. 만약 단기 유전자 전이가 충분하다면 숙주 DNA 내로의 전이 유전자 도입의 잠재 위험은 보장되지 않는다. 복제 결핍 아데노바이러스는 충분히 효율적이며 그리고 널리 다양한 응용으로 사용된다. 아데노바이러스는 세포내로 거대 분자를 전달하기 위한 수단으로써 사용되었던 수용체 상호작용을 통해 용이하게 세포로 들어간다. 비-바이러스성 핵산은 아데노바이러스 내에 치환체로서 또는 정상적인 아데노바이러스 성분에 대한 첨가로서 패키징될 수 있다. 비-바이러스성 핵산은 아데노바이러스의 표면에 연결되거나 또는 방관자 과정(bystander process)으로 공-일체화되며(co-internalised) 그리고 수용체-엔도좀(endosome) 착물 중에 화물로서 딸려갈 수 있다. 아데노바이러스-계 유전자 전이는 숙주 게놈 중에 전이 유전자의 통합(integration)을 초래하지 않으며, 따라서 안정하지 않다. 그것은 또한 아데노바이러스를 효율적인 벡터로 만드는 복제될 수 없는세포를 형질 감염시킨다. 사용된 바이러스 벡터의 다른 예로는 아데노-연관 바이러스 (AAV), 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 렌티바이러스, 폴리오바이러스, 다른 RNA 바이러스 및 인플루엔자 바이러스가 있다 (Mulligan, Science 1993; 260: 926-32; Rowland, Ann Thorac Surgery 1995, 60: 721-728). DNA는 또한 그것의 업테이크를 촉진하고 그것의 분해를 억제하며 (예컨대 5,972,900, 5,166,320, 5,354,844, 5,844,107, 5,972,707) 또는 핵 국소화로 그것을 이끄는 (Luo & Saltzman, Nat Biotech; 2000, 18: 33-37) 다른 유형의 리간드와 쌍을 이룰 수 있다. 그것은 또한 cre-lox 시스템이라고 불리우는 것과 쌍을 이룰 수 있다 (Sauer & Henderson, Proc Natl Acad Sci.; 1988, 85: 5166). 네이키드 DNA 또한 주어질 수 있으며 그리고 이중 스트랜드 DNA가 최소로 면역발성적이며 그리고 생각지 않았던 면역 반응을 유도해낸다는 것과 실험적 경험이 일치한다.

네이키드 DNA로서 언급되는 간단한 염 용액 또는 담체 또는 어쥬반트(adjuvant)와의 착물화된 것 중에 플라스미드 DNA가 투여될 수 있다. 후자의 경우 핵산은 다중 양이온, 단백질 또는 다른 중합체, 리포좀으로 둘러싸이거나 또는 리포좀과 연관된, 또는 콜로이드성 입자 상에 코팅된 덴드리머(dendrimer)와 착물화될 수 있다. 종래의 화학적 유전자 전이 방법은 인산 칼슘 공-침전, 탄수화물 (헤파란설페이트, 키토산), 폴옥사머, PEI, DEAE-덱스트란, 중합체 (미국 특허 5,972,707), 및 리포좀-매개 전이 (예컨대 미국 특허 5,855,910, 미국 특허 5,830,430, 미국 특허 5,770,220)이며, 그리고 종래의 물리적 방법은 미세주입(microinjection), 전기천공(electroporation) (미국 특허 5,304,120), 이온 삼투요법(iontophoresis), 이온 삼투요법과 전기천공의 조합 (미국 특허 5,968,006), 초음파 및 압력 (미국 특허 5,922,687)이다 (Luo & Saltzman, Nat Biotech; 2000, 18: 33-37, Rowland). 형질 감염 효율은 본 기술 분야에서 당업자에게 인식된 임의의 공지된 약학적 측정에 의해 향상될 수 있다.

본 발명은 이식물을 포위하는 조직 중에 EC-SOD의 발현을 촉진하기 위해, 및 특정 표현형을 덧붙이기 위해, 그럼으로써 과형성 연결 조직 성장 또는 섬유증으로부터 보조물을 보호하는 것을 촉진하기 위해 수행될 수 있다. 이 발현은 정상적으로 발현되는 유전자의 발현을 증가시킬 수 있거나 (즉 과발현), 또는 그것의 자연 환경 중에 보조물을 포위하는 조직과 정상적으로 관련되지 않은 유전자를 발현시킬 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 정상적으로 유전자 발현을 방해하는 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있으며, 즉 유전자 억제는 하향-조절성 기능을 발휘하는 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 방식일 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 장치에 사용되는 핵산은 연결 조직 과형성 및 조직 섬유증을 억제할 수 있으며 및/또는 생체내에서 내피세포화를 촉진하거나 자극할 수 있는 전사 및/또는 번역 생성물을 암호화하며, 즉 그것은 또한 항-재발협착증성 또는 혈관신생 인자이다. 따라서, 모든 구체예에서, 핵산은 EC-SOD 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다.

다른 구체예에서 EC-SOD 암호화 유전자를 사용하는 것 대신에 EC-SOD 단백질이 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 생물학적 양립 가능 매질은 생물학적 안정 중합체, 생물흡착될 수 있는 중합체, 생체 분자, 하이드로겔 중합체 또는 피브린이다. 특정 구체예에서, 매질은 뮤신(mucin) 조성물이다.

본 발명에 따른 다른 장치의 합성 표면은 무공성 또는 다공성일 수 있다. 따라서, 무공성 뿐 아니라 다공성의 이식물 물질이, 이식물 구체예에 좌우되어 장치를 제조하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 동물에서 혈관 이식편 내피세포화에서 이식편 다공성이 중요한 것으로 보여졌다 (Wesolowski, Thorac Cardiovasc Surgeon 1982; 30: 196-208, Hara, Am. J. Surg.; 1967; 113: 766-69). 봉합의 상황에서, 봉합 내부로 조직의 안쪽으로의 성장을 촉진하거나 또는 봉합의 내피세포화를 촉진하기 위한 다공성 봉합이 기재되었다 (미국특허 4,905,367, 미국특허 4,355,426). 혈관 이식편과 같은 다공성 이식편에서, 모세관 및 내피 세포 성장이 세공을 통해 허용되며, 그리고 그것의 공극률은 0 mm 내지 2000 mm이다.

하나의 구체예에서, 핵산은 이온 결합 또는 공유 결합으로 코어에 부착되었다.

하나의 유리한 구체예에서, 핵산은 포유 동물의 생체에 그것을 연속적으로 운반할 수 있는 상기 코어로부터 분리된 저장소 중에 존재한다. 이식된 장치를 포위하는 조직은 과형성 연결 조직 성장, 재발협착증 및 섬유증의 억제가 요구되는 예컨대 늑막, 심막, 복막, 근막, 건, 지방, 대망, 섬유상, 근육, 피부, 또는 임의의 다른 조직일 수 있다.

본 발명의 장점을 적어도 일부 상승시키는 것으로 주어지는 근본적인 메카니즘에 대한 그럴듯한 이론은, 항-재발협착증 EC-SOD를 발현하는 유전자가 이식물에접착되거나 또는 그 장치를 포위하는 조직 중에 투여된다는 것이다. 먼저 기재된 그런 조직의 장점으로 더 적은 과형성 또는 섬유성 조직 반응을 초래하는 과정으로서, 주변 조직 중의 세포는 형질 감염되고 그리고 재발협착증을 억제하며 결과적으로 조직 중에 연결 조직 성장을 감소시킨다.

본 장치의 표면은, 그것의 전체 또는 일부에, 예컨대 다른 약학적 성분을 코팅하거나 또는 첨가함으로써 다양한 방식으로 처리될 수 있으며, 물질 및 방법의 일반적 개시 중에 실험적 영역으로 이하에 더 상세히 논의된다. PTFE 이식편에 대한 최적 노드간(internodal) 거리는 대략 60 ㎛이었다.

본 장치는 널리 다양한 상황에서 그리고 의도하는 용도에 좌우되어 유용하며, 그것은 보조물 표면의 변형이 있거나 또는 없는 불용성 합성 중합체, 금속 및 세라믹의 군으로부터 선택되는 생체 물질로 이루어질 수 있다.

따라서, 하나의 구체예에서, 그 장치는 금속, 티타늄, 티타늄 합금, 주석-니켈 합금, 형상 기억 합금, 알루미늄 산화물, 백금, 백금 합금, 스테인레스 스틸, MP35N, 엘질로이(elgiloy), 스텔라이트(stellite), 열분해성 탄소, 은 탄소, 유리질 탄소, 중합체, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 염화 폴리비닐, 폴리비닐피롤리돈, 실리콘(silicone) 탄성체, 불소화 중합체, 폴리아크릴레이트, 폴리이소프렌, 폴리테트라플루오르에틸렌, 고무, 세라믹, 하이드록시아파타이트, 인간 단백질, 인간 조직, 동물 단백질, 동물 조직, 뼈, 피부, 라미닌(laminin), 엘라스틴(elastin), 피브린, 나무, 셀룰로스, 압축된 탄소 및 유리로 구성되는 군으로부터 선택되는 생물학적 양립 가능 물질로 이루어진 이식물이다.

따라서, 그 장치는 혈액-접촉 의료용 이식물, 조직-접촉 의료용 이식물, 체액-접촉 의료용 이식물, 이식될 수 있는 의료 장치, 체외 의료 장치, 보조물 내 의료 장치, 혈관 이식편, 혈관 내 이식물, 페이스메이커 리드, 심장 밸브, 일시적, 혈관내 이식물, 카테터, 페이스메이커 리드, 바이오센서 또는 인공 장기로 구성되는 군으로부터 선택되는 의료용 이식물일 수 있다. 하나의 특정 예에서, 그 장치는 혈관 또는 혈관 내 이식물의 인위적 부분과 같은 심혈관계 이식물이다. 일반적 용어로서, 본 장치는 포유 동물 생체의 일부를 대체하는데 사용되는 이식물로서 사용될 수 있으며, 여기서 상기 이식물은 혈액, 체액 및/또는 조직과 적어도 부분적으로 접촉하도록 적용된다. 게다가, 본 장치는 조직 이식물 또는 바이오센서로서 유용하다. 대안적 구체예에서, 본 장치는 인슐린 전달용 펌프 또는 글루코스 레벨 등을 인지하는 바이오센서와 같이 숙주에 대해 대사 기능을 제공하는 임의의 다른 생물 인위적(bioartificial) 이식물일 수 있다.

사실, 본 장치는, 혈관 외 확산 챔버, 혈관 내 확산 챔버, 혈관 내 초여과 챔버, 및 미세 캡슐화된 세포와 같이 생체 내에 이식물에 대해 탐구되었던 면역 시스템으로부터 선택된 생성물을 생성하는 조직 또는 세포를 보호하는 다양한 장치 중 실질적으로 임의의 하나일 수 있다. 세포는 다른 종으로부터 유도될 수 있으며 (이종 이식편), 그들은 동일한 종이지만 상이한 개체로부터일 수 있으며 (동종 이식편), 때때로 그들은 동일한 개체로부터 분리되지만 변형된 것 (자가 이식편) 또는 태아 오리진(origin)이다. 생물학적 인조 이식물은, 당뇨병에서 인슐린과 같이생물학적으로 활성 부를 운반함으로써, 또는 해로운 성분을 제거함으로써 숙주에 대해 필요한 대사 기능을 제공하도록 디자인된다. 멤브레인은 PTFE 및 폴리프로필렌과 같이 소수성일 수 있거나 또는 PAN/PVC 및 큐프로판(cuprophane)과 같이 친수성일 수 있다.

더 구체적으로, 본 발명에 의해 포함되는 이식물은, 심혈관계 장치, 예컨대 인공 혈관 보조물, 심혈관계 패치, 도관 이식편, 보조 밸브, 인공 심장, 심장 보조 장치, 문합 장치, 이식편 연결자, 윤성형술 링, 혈관 내재 카테터, 페이스메이커 와이어, 항-색전증 필터, 다른 지시용 도관 및 도관 이식편, 및 조직 이식물, 예컨대 이식용 생 세포를 지탱하는 챔버, 바이오센서, 수술용 봉합 물질, 수술용 망, 플레지(pledges) 및 패치, 기관 카뉼라, 생물학적 인공 장기, 수술용 이식물, 플라스틱 수술용 이식물 및 정형외과 이식물을 포함하지만 이것에 한정하지는 않는다. 본원에 기재된 방법이 다른 인공 장기 또는 장치의 개발을 유도할 수 있을 것으로 추측된다.

두번째 양태에서, 본 발명은 이식될 수 있는 의료 장치를 제조하는 방법을 제공한다. 그 장치는 유전자로 생체 물질을 전처리하고, 그리고 처리된 생체 물질로부터 그 장치를 조립함으로써, 또는 먼저 그 장치를 조립하고 그리고 이후 그 장치의 노출된 표면을 처리함으로써 제조될 수 있다.

본 발명에 기재된 방법은, 일반적으로 핵산을 함유하는 조성물로 혈관 또는 조직 이식물을 포위하는 조직에 상기 핵산을 조직 내부로 전달하는데 효과적인 방식으로 접촉시키고, 그리고 과형성 조직 성장을 억제하고 그리고 혈관 이식편, 심혈관계 패치, 도관 이식편, 심장 밸브, 혈관 내재 카테터, 심장 보조 장치 및 인공 심장의 내피세포화를 촉진시키거나, 또는 조직 이식물 표면의 내피세포화를 촉진시키는 것을 포함한다. 그 조직은 생체에 이식되기 이전 혈관- 또는 조직 이식물- 핵산 조성물 주변을 둘러쌀 수 있다. 대안적으로, 생체내에서 주변 조직 내로 핵산 전달을 수행하거나 또는 촉진하기 위해, 핵산 서열-보조물 조성물은 조직 중에 이식될 수 있으며, 또는 보조물 이식 이전 또는 이후에 핵산이 이식 부위에 적용될 수 있다. 주변 조직 내로 핵산을 전달할 때, 바람직한 방법은 먼저 조직에 양립할 수 있는 매질에 유전자 물질을 가하고, 핵산-매질 조성물을 보조물에 침투시키고, 그리고 이후 침투된 보조물을 사용하여 적절한 조직 부위에 접촉시키는 것을 포함한다. 대안적으로, 조직에 양립할 수 있는 매질은 먼저 이식물 상에 투여될 수 있으며, 그리고 이후 핵산이 첨가되고, 그 후에 핵산-보조물 조성물이 이식 부위에 적용된다. 대안적으로 핵산이 이식물을 포위하는 조직에 투여되고, 그 후에 이식물이 이식되거나, 또는 이식물이 먼저 이식되고, 그 후에 핵산이 이식물 상에 또는 이식물을 포위하는 조직에 투여된다. 또한, 이식 이전 또는 이후에 침투된 이식물이 이식물을 포위하는 조직 중에 핵산의 투여와 조합되어 사용될 수 있다. 주변 조직이 결핍되고 소량의 세포를 갖는 경우, 이식 이전에 수술로 침투된 보조물을 더 많은 세포 함량의 조직으로 둘러싼다. 혈관 보조물, 심혈관계 패치 및 도관 이식편과 같은 몇몇 심혈관계 이식물은, 세공을 통해 내피 세포의 성장을 허용하기에 충분히 높은 공극률을 가지며, 심장 밸브와 같이 몇몇 다른 심혈관계 이식물은 무공성이다.

더 구체적으로, 핵산을 주변 조직에 전달함으로써 의료용 이식물의 재발협착증을 억제하기 위한 본 발명에 따른 방법은 포유 동물, 예컨대 인간에서 합성 표면의 생체 수용능을 향상시키는 방법으로 개시될 수 있으며, 그 방법은 혈액, 체액 및/또는 조직과 적어도 일부 접촉하도록 생체 중에 합성 표면을 포함하는 장치를 도입하는 것 그리고 생물학적 양립 가능 매질 중에 존재하는 핵산을 그것의 주변에 투여하는 것을 포함한다. 그 방법은, 핵산이 생체내에서 새로운 협착증 또는 재발협착증을 억제할 수 있는 번역 또는 전사 생성물을 암호화하고, 상기 핵산의 투여는 생체 중에 장치의 도입 이전, 동시에 또는 이후에 수행되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 장치와 관련하여 전술한 바와 같이, 핵산은, 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터 중에, 또는 리포좀 중에 예컨대 네이키드 형으로 투여될 수 있다.

장치의 성질, 즉, 이식물을 수혜받는 환자의 조건에 좌우되어, 핵산은 EC-SOD 단백질 또는 EC-SOD 생성의 하향 조절을 억제하는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있다. 또한, EC-SOD 생성을 촉진하는 성분이 사용될 수 있다. 또한, EC-SOD 단백질이 핵산을 대신하여 투여될 수 있다.

하나의 구체예에서, 핵산 또는 단백질이 포유 동물의 생체에 장치가 도입되기 이전에 장치의 주변, 즉 조직으로 투여된다. 대안적으로, 핵산 또는 단백질이 장치의 도입 이후에 그 주변으로 투여된다. 본 분야에서 당업자라면 인지하고 있는 것으로서, 소정의 스킴에 따라 또는 생체의 장치에 대한 수용능 및 합성 표면 상에 새로운 내피세포 층의 성장 속도에 좌우되어, 그런 투여의 조합, 예컨대 주변에 특정 양의 1차 투여, 장치의 도입, 그 이후 1 또는 그 이상의 추가적 투여도 가능하다.

다른 구체예에서, 핵산 또는 단백질이 포유 동물의 생체 중에 장치의 도입 이전에 장치에 투여되거나 또는 부착된다. 특정 구체예에서, 이는 이온 결합 또는 공유 결합에 의해 핵산 또는 단백질을 코어에 부착함으로써 달성된다. 만약 적절하다면, 본 구체예는 방법을 제공하기 위해 전술한 것 중 임의의 하나와 적절히 조합될 수 있으며, 여기서 장치는 단백질 또는 핵산으로 전처리 되었으며, 장치를 포위하는 조직은 적절한 담체 중에 존재하는 핵산 또는 단백질의 추가 첨가로 나중에 보충된다. 또한, 단백질 및 핵산으로의 처리는 상이한 변형으로 조합될 수 있다. 하나의 구체예에서, 그것이 간단하기 때문에 유리하며, 상기 담체는 멸균수 또는 멸균 수용액이다. 본 발명의 단백질 및 핵산은 또한 추가적으로 약학적 허용 담체를 함유하는 임의의 적절한 약학적 제제 중에 전신으로 운반될 수 있다. 예로는 항산화제, 완충제, 항박테리아제, 박테리아계 항생제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 농후제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 그 제제는 멸균 액체 담체, 예컨대 주사용수에, 사용 직전에 첨가하는 것을 단지 요구하면서, 단일 투약 또는 다중-투약 컨테이너, 예컨대 봉인된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있으며, 냉동 또는 냉동 건조 (lyophilized) 조건으로 보관될 수 있다.

EC-SOD 단백질 또는 핵산은 새로운 협착증을 예방하거나 또는 치료하기 위해 또는 재발협착증을 예방하거나 또는 치료하기 위한 관점으로 투여된다. 그렇지만또한 내피세포화를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

본 방법의 대안적 구체예에서, 생물학적 양립 가능 매질은 생물학적 안정 중합체, 생물 흡착될 수 있는 중합체, 생체 분자, 하이드로겔 중합체 또는 피브린이다.

따라서, 전술한 바와 같이 그리고 이하에 상세히 설명하는 바와 같이, 본 방법에 사용되는 장치는 심혈관계 수술에 사용되는 이식물, 맥관과 같이 신체의 일부를 대체하는 장치, 혈관내 이식물, 조직 이식물, 바이오센서 또는 다른 유사한 장치와 같이 인간의 신체로 도입되기 위한 장치일 수 있다.

요약하면, 본 발명에 따른 치료용 단백질 또는 유전자의 전이 및 발현에 관련하여, 당업자는, 전사, mRNA 번역, 및 번역 후 프로세싱과 같이 상이한 유전자 시그날 및 프로세싱 이벤트가 세포 중에 핵산 및 단백질/펩티드의 수준을 제어한다는 것을 인지하고 있다. 이들 단계는 다른 단백질, 리보뉴클레오티드 농축물 등과 같이 세포 중에 또한 존재하는 다양한 다른 성분에 의해 영향을 받는다.

따라서, 일반 용어로서, 본 발명은 항-협착증성, 및 항-섬유증성 치료 및 장치에 관한 것이며, 그 장치는 일반적으로 몰딩되거나 또는 디자인된 혈관 이식물-유전자 조성물로서 고려될 수 있다. 본 발명의 장치는 1 또는 그 이상의 항-재발협착증성 또는 항-섬유증성 EC-SOD 유전자 또는 EC-SOD 단백질이 이식물과 연관되어 있는 본래 조직과 양립할 수 있는 이식물이다. EC-SOD 유전자 또는 단백질과 이식물 성분의 조합은, 협착증, 재발협착증 또는 섬유증을 억제할 수 있거나, 또는 이식될 때 혈관 신생을 자극할 수 있는 장치를 제공하기 위해 본 기술 분야에서 당업자에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 장치는, 그들의 디멘션이 생체 중에 이식 부위에 맞도록 적용되게 하기 위하여 실질적으로 임의의 크기 또는 형상일 수 있다.

이하의 구획은 본 발명을 설명하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 중에 이하 및 다른 곳에 주어진 참고문헌은 본원에 참고적으로 포함된다.

본 구획은 첨부된 청구범위의 범위에 속할 수 있는 수많은 가능성을 제공하기 위해 본 문맥에 사용될 수 있는 대안의 물질 및 방법을 기재한다. 따라서, 표제 실시예 이하, 본 발명의 효과 및 그것의 장점을 기재하기 위해 수행된 실험의 특정 개시가 제공될 것이다.

내피세포화를 증가시키거나 또는 재발협착증을 감소시키는 이식 유전자로서의 EC-SOD

본원에서 사용된 것으로서, 용어 "재발협착증 또는 섬유증 억제 유전자 및 내피세포화 촉진 유전자"는, EC-SOD 매개 재발협착증 및 섬유증의 억제 또는 EC-SOD 매개 내피세포화 또는 혈관화를 촉진하는데 있어 촉진하거나 또는 보조할 수 있는, 또는 EC-SOD 매개 재발협착증 및 섬유증의 억제 속도를 감소시키거나, 또는 EC-SOD 매개 내피세포화 또는 혈관화의 속도, 또는 EC-SOD 매개 마크로파지 침입의 억제를 증가시키는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 유전자 또는 DNA 코딩 영역을 의미하는 것으로 사용된다. 용어 억제하는 및 감소시키는 또는 촉진하는, 유도하는 및 자극하는이란 본 문장 전체를 통해, 궁극적으로 조직 상처 또는 장치의 이식 부위에 더 적은 연결 조직의 형성을 유발시키며 또는 이식물의 내피세포 및/또는 모세관의 형성을 증가시키거나, 또는 장치의 이식과 더불어 또는 장치의 이식 없이 내피세포화 및/또는 모세관화의 속도를 증가시키는 직접 또는 간접 방법을 의미하는 것으로 상호 교환될 수 있게끔 사용된다. 따라서, 이식물 재발협착증 또는 섬유증 억제 유전자 또는 내피세포화 촉진 유전자는, 그것이 발현될 때, 세포의 표현형의 변화를 초래하며, 따라서 그 세포가 분화되고, 다른 세포의 분화를 자극하고, 재발협착증 억제 유전자 또는 이식물 내피세포화 촉진 세포를 끌어들이고, 또는 그렇지 않다면 국소적으로 또는 전신으로 EC-SOD의 증가를 통해 새로운 이식물 내피세포의 상승을 궁극적으로 제공하는 방식으로 기능하는 유전자이다.

일반적 용어로서, 재발협착증 억제 유전자 또는 혈관 이식물 내피세포화 촉진 유전자는 또한 연결 조직의 형성을 감소시킬 수 있거나 또는 혈관 보조물을 포위하는 조직 중에 내피세포의 성장을 자극할 수 있으며 그럼으로써 EC-SOD의 증가를 통해 재발협착증 및 섬유증을 감소시키게 되거나 또는 상처화된 조직 또는 이식물의 내피세포화 또는 혈관화를 촉진시키게 되는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물의 특정 구체예는 혈관 보조물 자체 중에 또는 그것을 포위하는 조직 중에 내피 세포의 성장을 촉진할 수 있다.

현재 다양한 항-재발협착증성 팩터가 공지되어 있으며, 그들 모두는 본 발명과 관련하여 사용하기에 적합하다. 항-재발협착증성 유전자 및 그들이 암호화하는 단백질은, 예컨대, 호르몬, 많은 상이한 성장 인자 및 사이토킨, 성장 인자 수용체유전자, 효소 및 폴리펩티드를 포함한다. 적절한 항-재발협착증성 팩터의 예는 VEGF 및 FGF-패밀리, TGF-6 타입 II 수용체, NOS 및 HGF를 포함한다.

바람직한 항-재발협착증성 유전자 생성물은 EC-SOD이다. 유전자 및 폴리펩티드를 언급하는 문헌에 현재 사용되는 상당수의 다양한 용어가 있다. 활성 EC-SOD 단백질을 증가시키게 되는 모든 유전자가 사용될 수 있는 용어가 상이함에도 불구하고, 본 발명에 사용되도록 고려된다는 것이 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되어야 한다.

몇가지 EC-SOD 유전자에 대한 DNA 서열이 과학 문헌 (Genomics 22; 162-171, 1994, Hjalmarsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 6340- 6344, 1987. Laukkanen et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 19; 2171-2178, 1999. Laukkanen et al., Gene, 254,173-179, 2000), 미국 특허 5,788,961 및 WO 87/01384에 기재되었다.

상기 특허에 개시된 바와 같이, 그리고 본 기술 분야에서 당업자에게 공지된 바와 같이, 재조합 유전자 또는 DNA의 본래 공급원이 치료되는 동물과 동일한 종일 필요가 없는 치료 요법으로 사용된다. 이런 맥락에서, 임의의 재조합 항-재발협착증성 또는 항-섬유증성 유전자가 인간 대상 또는 예컨대, 말과 같은 동물에서 과도한 연결 조직 형성을 감소시키는데 또는 혈관 보조물 내피세포화를 촉진하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 특히 바람직한 유전자는 인간으로부터 유래한 것이며, 그런 유전자는 인간 치료 요법에 사용되기에 가장 바람직하다. 분리된 DNA 및 유전자에 의해 암호화되는 재조합 단백질 및 폴리펩티드는 종종 재조합에 대한 접두어 r 및 재조합 인간에 대한 rh를 덧붙여 언급된다.

항-재발협착증성 또는 항-섬유증성 유전자, 유전자 세그먼트 또는 cDNA를 제조하기 위해, 본원에 개시된 교시에 따를 수 있으며 그리고 또한 임의의 특허 또는 과학적 기록의 교시는 참고 문헌 목록 및 과학 문헌 중에 언급된다. 예컨대, 폴리머라제 체인 반응 (PCR)과 같은 분자 생물학적 기술을 이용하여, 프라이머 또는 프로브를 이용하여 상기 뉴클레오티드 서열을 기초로 하는 서열로 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 EC-SOD 세그먼트를 얻을 수 있다. 본원에 참고문헌으로 인용된 Sambrook et al.과 같은 다양한 과학 문헌에서 교시하는 바와 같이, 그런 기술의 실시는 본 기술 분야에서 당업자에게 평범한 일이다. 본 조성물 및 방법에 사용하기에 특히 바람직한 항-재발협착증성 또는 항-섬유증성 유전자 및 DNA 세그먼트는, EC-SOD 또는 그것의 코딩 또는 비-코딩 서열의 일부이다. 또한 EC-SOD 발현 및 단백질 제조를 증가시키는 또는 EC-SOD 하향 조절을 감소시키는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 추가의 유전자 또는 cDNA를 클로닝할 수 있는 것으로 고려된다. 클로닝 DNA에 대한 기술, 즉 DNA의 다른 부분으로부터 얻는 것과 구분되는 DNA 라이브러리로부터 특정 코딩 서열을 얻는 것은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 이는 예컨대, 적절한 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 스크리닝 과정은 연관된 항-재발협착증성 단백질을 암호화하는 공지된 DNA 서열의 아미노산 서열의 일부를 고려하는 것으로부터 디자인된 올리고뉴클레오티드 프로브의 하이브리드화에 기초할 수 있다. 그런 스크리닝 프로토콜의 작동은 본 기술 분야에서 당업자에게 공지되어 있으며 그리고 과학 문헌, 예컨대 Sambrook et al..(Sambrook et al., Molecular Cloning : a Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Lab Press; Inniste et al., PCR strategies, 1995, Academic Press, New York)에 상세히 기재되어 있다.

문헌 상에 기재된 것과 다른 서열을 갖는 EC-SOD 유전자 또한 본 발명에 포함되며, 게다가 임의의 직접 또는 간접 방식으로 바뀌거나 또는 변형된 유전자는 여전히 심혈관계의 주변 조직 또는 조직 이식물을 자극하는 기능을 갖는 단백질을 암호화 한다. 이들 서열은 점 돌연변이에 의한 것, 유전자 코드의 퇴화에 의한 것 또는 자연적으로 발생하는 상동성 변형, 및 하이브리드 유전자와 같이, 즉 인간의 손에 의한 유전자 조작에 의해 도입되었던 추가의 변형을 포함한다.

암호화된 단백질 또는 폴리펩티드의 기능적 성질을 바꾸기 위해 디자인되는 것으로서 뉴클레오티드 서열 중에 변화를 도입하는 기술은 본 기술 분야에서 당업자에게 공지되어 있다. 그런 변형은 염기의 결실, 삽입 또는 치환, 및 따라서, 아미노산 서열 중에 변화를 포함한다. 단백질의 EC-SOD 활성을 증가시키기 위해, 그것의 생물학적 안정성 또는 반감기를 증가시키기 위해, 그것의 변성을 감소시키기 위해, 그것의 분비를 증가시키기 위해, 그것의 글리코실화 패턴을 바꾸기 위해, 등등 변화가 일어날 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 모든 그런 변형은 본 발명에 속한다.

게다가, 물론 본 발명은 EC-SOD 유전자의 생성물의 사용으로 엄격히 제한하는 것은 아니지만, EC-SOD의 생물학적 효과를 효과적으로 모방하는 임의의 재조합 또는 합성 화합물을 포함한다. 본원에서 특별한 관심은, 타겟 세포를 포위하는 세포 밖 공간 중에 그들의 활성을 나타내는 임의의 다른 SOD 패밀리 멤버를 모방한 것과는 대조되는 것인 EC-SOD 모방에 놓여있다.

1 또는 1 이상의 항-재발협착증성 또는 항-섬유증성 유전자가 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 것으로 또한 이해되어야 한다. 핵산 전달은 따라서 1, 2, 3, 또는 그 이상의 항-재발협착증성 또는 항-섬유증성 유전자 또는 단백질의 투여를 수반할 수 있다. 적용될 수 있는 유전자 또는 단백질의 최대 수는, 다수의 유전자 구조물을 동시적으로 제조하는 것과 관련된 노력 또는 심지어 반 세포 독성 효과를 유도해 내는 가능성과 같은 실용적인 고려에 의해서만 단지 제한된다. 유전자의 특정 조합은 2 또는 그 이상의 항-재발협착증성 유전자일 수 있으며, 또는 성장 인자 억제 유전자가 호르몬 유전자와 조합된 그런 것일 수 있다. 호르몬 또는 성장 인자 유전자는 심지어 첫번째 유전자의 폴리펩티드 생성물과 상호작용하는 것이 가능한 세포 표면 수용체를 암호화하는 유전자와 조합될 수 있다. 또한, EC-SOD 유전자는 안티센스 생성물 세포내 아프타머(aptamer) 분자 또는 리보자임을 암호화하는 유전자와 조합될 수 있다. 다중 유전자를 사용할 경우, 그 유전자는 1 또는 그 이상의 프로모터의 제어 하에서 단일 유전자 구조물 상에 조합될 수 있으며, 또는 그들은 동일하거나 또는 상이한 유형의 분리 구조물로서 제조될 수 있다. 따라서, 상이한 유전자 및 유전자 구조물의 거의 한정없는 조합이 사용될 수 있다. 특정 유전자 조합, 또는 그렇지 않으면 그들의 사용이 과도한 연결 조직 형성 및 섬유증 또는 혈관 신생 및 내피세포화를 감소시키는데 있어 상승 효과를 얻도록 디자인될 수 있거나 또는 초래할 수 있다. 임의의 모든 그런 조합이 본 발명의 범위에속하는 것으로 해석된다. 본 기술 분야에서 당업자는 가능한 상승적 유전자 조합 또는 유전자 단백질 조합을 용이하게 확인할 수 있다. 다른 유전자는 신생 동맥내막 세포, 예컨대 유도성 일산화질소 합성효소 (iNOS) 또는 내피 세포 일산화질소 합성효소 (ecNOS)의 성장을 억제하는 단백질을 암호화할 수 있다. 혈전증을 억제하는 단백질 또는 효소 단백질의 생성물, 예컨대 프로스타사이클린, 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 유로키나제, 및 스트렙토키나제는 또한 공-형질 감염의 관심이 된다. 또한 EC-SOD는, EC-SOD의 과발현을 나중에 억제하거나 또는 전사 또는 번역과 같이 EC-SOD 발현을 임의의 수준으로 조절하는 다른 유전자와 조합될 수 있다. EC-SOD 핵산의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에 투여가 발생할 수 있다.

만약 목적한다면, 핵산 또는 유전자가, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 아프타머 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 전사 팩터 유인 올리고뉴클레오티드 또는 다양한 약리학적 활성 시약, 재발협착증 형성을 억제하는 성장 인자, 과도한 연결 조직 성장을 억제하는 헤파린과 같은 물질 등과 같은 추가의 시약과 조합되어 투여될 수 있는 것이 또한 이해되어야 한다. 또한, 면역 억제제, 항-염증성 및 기타 항-재발협착증 물질이 사용될 수 있다. 유전자 물질 또는 단백질이 조성물의 일부를 형성하는 한, 타겟 세포 또는 조직과 접촉하여 명백한 반대 효과를 유발하지 않는 추가의 시약으로 주어지는 것으로서, 실질적으로 다른 성분을 포함하는데 있어 제한은 없다. 핵산 또는 단백질은 다양한 다른 시약과 함께 운반될 수 있다. 또한, 핵산 또는 단백질은 항-섬유증과 함께 특정 효과를 드러내도록 주변 조직에 방사선, 초음파, 및 전류 또는 빛 에너지를 주면서 이식물과 함께 운반될 수 있다 .

핵산 또는 유전자가 이식 부위에서 동시적 세포 접종 또는 재배 과정, 또는 간세포의 동시 투여 또는 간세포 집단의 자극과 조합되어 투여될 수 있다는 것이 또한 이해되어야 한다. 유전자적으로 변형된 세포를 이용한 동시 접종 또는 재배와 또한 조합될 수 있다.

유전자 구조물 및 핵산

본원에서 사용된 것으로서, 용어 유전자 및 핵산은 둘 다 분리된 DNA 분자를 의미하는 것으로 사용되며, 그리고 특정 종의 전체 게놈 DNA로부터 벗어난다. 따라서, EC-SOD 암호화 유전자 또는 DNA란 EC-SOD 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 DNA를 의미하지만, 그 DNA가 얻어진 종의 전체 게놈 DNA로부터 분리되며, 또는 정제된다. 용어 DNA 내에 포함되는 것은 DNA 세그먼트 및 세그먼트 아프타머와 같은 더 소형 단편, 및 또한 예컨대 플라스미드, 코스미드, 인위적 염색체, 파지, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 등을 포함하는 재조합 벡터이다.

기능적 단백질- 또는 펩티드-암호화 단위를 의미하는데 있어 간단히 용어 유전자가 사용된다. 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되는 것으로서, 이 기능적 용어는 게놈 서열 및 cDNA 서열을 둘 다 포함한다. 물론, 이는 처음부터 분리된 DNA 세그먼트를 의미하며, 그리고 사람에 의해 세그먼트에 나중에 첨가된 것인 리더 펩티드 또는 타겟화 서열을 암호화하는 서열과 같은 유전자 또는 코딩 영역을 배제하지 않는다.

본 발명은 다양한 EC-SOD 단백질 및 공지의 EC-SOD DNA 세그먼트 및 재조합 벡터를 사용하는 신규한 방식을 제공한다. 많은 그런 벡터가 용이하게 응용될 수있다. 그렇지만, 코딩 세그먼트가 EC-SOD 단백질을 암호화하는데 사용되는 한 고도로 정제된 벡터가 사용될 필요는 없으며, 그리고 조직 상에 반대 효과를 갖는 임의의 코딩 또는 조절 서열을 포함하지 않는다. 따라서, 유용한 핵산 서열이 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분에 플랭킹(flanking) 된 추가적 비-코딩 서열과 같은 추가적 잔기를 포함할 수 있으며, 또는 유전자 내에서 발생하는 것으로 알려진 다양한 내부 서열, 즉 인트론을 포함할 수 있는 것으로 또한 이해되어야 한다.

적절한 EC-SOD 암호화 유전자 또는 DNA 분자를 동정한 후에, 본 기술 분야에서 공지된 많은 벡터 중 임의의 하나 내부로 삽입될 수 있다. 이식물을 포위하는 조직 내로 도입될 때 그 방식으로 직접 EC-SOD를 발현 및 생성하게 될 것이다. 재조합 발현 벡터에서, DNA 세그먼트의 코딩 부는 프로모터의 제어 하에 위치한다. 프로모터는 EC-SOD 유전자와 자연적으로 연관된 형태일 수 있다. 코딩 DNA 세그먼트는 또한 재조합, 또는 이종성, 프로모터의 제어 하에 위치할 수 있다. 본원에서 사용된 것으로서, 재조합 또는 이종성 프로모터는 그것의 자연 환경에서 EC-SOD 유전자와 정상적으로 연관되지 않은 프로모터를 의미하는 것으로 해석된다. 그런 프로모터는 임의의 다른 박테리아, 바이러스, 진핵성, 또는 포유 동물 세포로부터 분리된 다른 항-재발협착증성 유전자, 및/또는 프로모터와 정상적으로 연관된 것을 포함할 수 있다. 자연히, 조직 중에 DNA 세그먼트를 효과적으로 직접 발현시키는 프로모터를 사용하는 것이 중요할 것이다. 단백질 발현을 얻기 위해 재조합 프로모터를 사용하는 것은 일반적으로 분자생물학 기술 분야에서 당업자에게 알려져 있다 (Sambrook et al.). 사용되는 프로모터는 구성(constitutive), 또는 유도(inducible)일 수 있으며, 도입되는 DNA 세그먼트의 높은 수준 또는 조절된 발현을 이끄는 적절한 조건 하에서 사용될 수 있다. 현재 바람직한 구성 프로모터는 예컨대 CMV, RSV LTR, 면역 글로불린 프로모터, SV40 프로모터 단독, 및 SV40 인헨서(enhancer)와 조합된 SV40 프로모터, 및 테트라사이클린-조절 프로모터 시스템과 같이 조절할 수 있는 프로모터, 또는 메탈로티오닌 프로모터이다. 프로모터는 인헨서와 연관될 수 있거나 또는 연관되지 않을 수 있으며, 여기서 인헨서는 자연적으로 특정 프로모터와 연관될 수 있으며 또는 상이한 프로모터와 연관될 수 있다. 종료 영역은 EC-SOD 코딩 영역에 3'으로 제공되며, 여기서 종료 영역은 자연적으로 세포질 도메인과 연관될 수 있으며 또는 상이한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 다양한 종료 영역이 발현에 대한 반대 영향 없이 사용될 수 있다. 다양한 조작 이후, 제조된 구조물이 클로닝될 수 있으며, 벡터가 분리되고, 그리고 유전자가 스크리닝되거나 또는 구조물의 정확성을 보증하기 위해 시퀀싱된다. 스크리닝은 제한 분석, 시퀀싱 또는 비슷한 것으로 행해질 수 있다.

EC-SOD 유전자 및 DNA 세그먼트는 또한 예컨대, 재조합 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 (AAV) 또는 레트로바이러스와 같은 재조합 바이러스의 게놈 내에 위치하는 DNA 삽입물의 형태일 수 있다. 이식물을 포위하는 조직과 접촉하는 유전자를 EC-SOD 유전자 삽입물을 포함하는 게놈에 위치시키기 위한, 그런 구체예에서, 재조합 바이러스 입자를 제조하여야 하며, 이식물을 포위하는 조직이 바이러스와 간단히 접촉하고, 그럼으로써 바이러스가 세포를 감염시키고 그리고 유전자 물질을 전이시키게 된다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 조성물 중에 바이러스를 혈관보조물, 도관, 도관 이식편 또는 이식편 연결자와 같은 이식물에 부착시켜야 하며, 그리고 이후 이식물을 포위하는 조직과 부위 내의 이식물을 접촉시켜야 한다. 바이러스가 조성물로부터 방출되고, 그럼으로써 세포가 이식물 내에서 성장하고, 그럼으로써 바이러스와 접촉하게 되고 바이러스 감염이 허용되며, 이는 세포가 목적하는 유전자 또는 cDNA를 취하고 그리고 암호화된 단백질을 발현하는 결과를 초래하며, 이는 다시 말하면 연결 조직 형성의 억제를 초래하는 것이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은, 혈관 보조물-, 도관-, 심혈관계 이식편-, 이식편 연결자-, 심장 밸브- 또는 조직 이식물-유전자 조성물을 형성하기 위하여 혈관 보조물, 도관, 도관 이식편, 심장 밸브, 이식편 연결자, 또는 조직 이식물 상에 EC-SOD 유전자가 부착되거나 또는 침투되며 그리고 이후 혈관 보조물-, 도관-, 도관 이식편-, 이식편 연결자-, 심장 밸브-, 조직 이식물-유전자 조성물이 상기 심혈관계 또는 조직 이식물을 포위하는 조직과 접촉하여 위치되는 것인 조성물을 제조하는 방법에 관련된다. 혈관 보조물-, 심혈관계 패치-, 도관 이식편-, 심장 밸브-, 이식편 연결자-, 조직 이식물-유전자 조성물은 모두 그것의 유전자가 흡착되고, 흡수되거나, 또는 그렇지 않으면 상기 이식물에 접촉하여 유지된다.

이식된 장치를 포위하는 조직의 세포 내로의 핵산의 전이

일단 적절한 혈관 이식물-유전자 조성물이 제조되었거나 또는 얻어졌다면, EC-SOD 단백질 또는 EC-SOD 유전자를 주변 조직에 운반하는데 필요한 모든 것은, 심혈관계 이식물-유전자 또는 조직 이식물-유전자 조성물을 수술로 또는 카테터의 도움으로, 먼저 주변 조직을 둘러싸거나 또는 둘러싸지 않으면서, 생체 중의 목적하는 부위와 접촉하도록 위치시키는 것이다. 그 방법은 본 기술 분야에서 당업자에게 공지되어 있다. EC-SOD 유전자 또는 단백질은 또한 심혈관계 또는 조직 이식물을 그 부위에 이식 이전, 동안 또는 이후에 순환계 내부의 전신으로 또는 그 조직으로 투여될 수 있다. 이는 동정맥 누공, 동맥 우회 이식편 또는 삽입 이식편, 정맥 이식편, 심혈관계 패치, 인공 심장, 도관 이식편, 도관, 심장 밸브, 심장 보조 장치, 문합 장치, 윤성형술 링, 혈관 카테터, 페이스메이커 와이어, 기관 카뉼라, 생물의학적 센서, 생세포용 챔버, 인공 장기, 장기 이식물, 정형외과 이식물, 봉합 물질, 수술용 패치, 클립 또는 플레지, 또는 임의의 의료 장치일 수 있으며, 이들 모두는 1 이상의 합성 표면을 포함한다.

본 발명에서, 1 또는 그 이상의 벡터가 임의의 주변 조직, 바람직하게는 포유 동물의 조직에 전이된다. 몇가지 출판물이 질병의 치료 및 예방을 위한 유전자 전이의 사용을 가정한다 (Levine and Friedman, Curr. Opin. in Biotech. 1991; 2: 840-44, Mulligan, Science 1993; 260: 926-32, Crystal, Science 1995; 270: 404-410, Rowland, Ann. Thorac Surgery 1995; 60: 721-728; Nabel et al., Science 1990; 249: 1285-88). 진핵성 숙주 세포는 생체 내에 최적으로 존재한다. 본 발명에 따라, 세포와 본 발명의 벡터의 접촉은 세포 내로 벡터가 도입되는 것인 임의의 수단에 의할 수 있다. 그런 도입은 임의의 적절한 방법에 의할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 형질 감염의 수단으로, 즉 네이키드 DNA가 세포로 들어가는 자연 능력을 이용하여 도입되어야 한다 (예컨대, 벡터가 수용체로 작용하는 능력 - 매개 엔도사이토시스(endocytosis)). 그렇지만, 벡터는 또한 임의의 다른 적절한 수단,예컨대 형질 도입, 인산 칼슘-매개 형질 전이, 미세 주입, 전기 천공, 삼투성 쇼크, 등으로 도입될 수 있다.

본 방법은, 벡터 수용체의 수 뿐 아니라 벡터에 대한 세포 표면 수용체의 친화력이 상이한 다양한 세포에 관해서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라, 생체 내에서 유전자 전달이 기대되는 세포의 유형은 모든 포유 동물의 세포, 더 바람직하게는 인간 세포를 포함한다. 벡터는 적절한 (예컨대 약학적 허용) 부형제, 예컨대 담체, 어쥬반트, 비이클, 또는 희석제와 세포가 접촉하기에 적합한 조성물 내에서 이루어질 수 있다. 그런 조성물을 제조하는 수단, 및 투여하는 수단은, 본 기술 분야에 기재되어 있다. 적절한 경우, 벡터는 제제 내에서 고체, 반고체, 액체, 또는 에어로졸 형, 예컨대 에어로졸, 스프레이, 페이스트, 연고, 겔, 글루, 분말, 과립, 용액, 주사, 크림 및 액적으로, 임의의 다른 방법을 배제하지 않고 그들의 대응하는 투여 경로에 일반적인 방식으로 제제화될 수 있다. 본 발명의 조성물을 무효화시키지 않는 약학적 허용 형이 사용되어야 한다. 약학적 제형에서, 그 조성물은 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 적절히 관련되어, 뿐 아니라 조합되어 사용될 수 있다. 예컨대, EC-SOD를 암호화하는 핵산은 혈소판 침착 또는 평활근 세포 증식을 억제하기 위해 암호화하는 핵산과 함께 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 포유 동물에서 특정 효과를 얻기 위해 다양한 방식을 경유하여 및 다양한 부위에 운반될 수 있다. 본 기술 분야에서 당업자는 비록 투여에 1 이상의 방식이 사용될 수 있지만, 특정 방식이 다른 방식보다 더 당면되고 그리고 더 효과적인 반응임을 인식하여야 한다. 이식물 상에 제제의 국소적 적용 또는 점적주사(instillation)를 포함하는 투여, 또는 생체내에서 이식물을 포위하는 조직에 직접 제제를 투여함으로써, 또는 임의의 다른 국소적 적용에 의해 국소 전달이 수행될 수 있다. 이 방식의 약물의 투여는, 약물이 부위-특이적이 될 수 있게 하고, 고농도 및/또는 높은 잠재력의 약물을 방출하는 방식은 타겟화 조직에 직접 적용하는 것으로 제한될 수 있다. 핵산이 전신으로 또는 국소적으로 운반될 때 그들은 임의의 생물학적 양립 가능 염 용액 중에 네이키드 형으로 또는 생물학적 양립 가능 성분과 착물화되어 용액으로 운반될 수 있다. 핵산과 착물을 이루는 방식의 예는 폴리양이온 (예컨대 올리고덴드로머), 단백질 (예컨대 트랜스페린) 또는 다른 폴리머 (예컨대 DEAE-덱스트란, 폴리라이신)을 사용하는 것이다. 또한 그 예들의 유도체 및 염이 포함된다. 다른 예는 핵산을 캡슐화하거나 또는 리포좀 또는 콜로이드 입자 상에 코팅된 것과 연관시키는 것이다. 바람직한 방법은 핵산을, 이식물의 적어도 일부를 덮고 있는 피브린, 하이드로겔, 글리코스아미노글리칸, 글리코폴리사카리드, 또는 임의의 다른 생물학적 양립 가능 중합체 담체 매트릭스, 예컨대 알지네이트, 콜라겐, 뮤신, 하이알유론산, 폴리우레탄, 셀룰로스, 폴리락트산, 폴옥사머가 도입된 수용액 중에 운반하는 것이다 (미국 특허 5,833,651). 이식물의 제조 시점에서 또는 이식 이전, 동안 또는 이후에 의사에 의해, 핵산이 중합체 코팅된 이식물에 첨가될 수 있다. 중합체는 또한 목적하는 방출 속도 또는 목적하는 중합체 안정도에 좌우되어, 생물학적 안정 또는 생물흡착 가능한 중합체일 수 있다. 그것은 자연적으로 발생하거나 또는 합성 화합물일 수 있으며, 또한 그 화합물의 유도체 및 염이 포함된다. 생물 흡착될 수있는 중합체가 더 바람직하며, 그것은 만성의국소 반응을 유발하지 않는 것으로 제안된다. 사용될 수 있는 생물 흡착될 수 있는 중합체는, 폴리(L-락트산), 폴리카프로락톤, 폴리(락티드-코글리콜리드), 폴리(하이드록시부티르에이트), 폴리(하이드록시부티르에이트-코-발레레이트), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리(글리콜산), 폴리(D,L-락트산), 폴리락트-폴리글리콜산, 폴리글락틴, 폴리디옥손, 폴리글루코네이트, 폴리(글리콜산-코트리메틸렌 카르보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르 우레탄, 폴리(아미노산), 시아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카르보네이트), 폴리(이미노카르보네이트), 코폴리(에테르-에스테르) (예컨대 PEO/PLA), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠, 및 생물분자, 예컨대 피브린, 피브노겐, 셀룰로스, 전분, 콜라겐, 뮤신, 피브로넥틴, 및 하이알유론산을 포함하지만 이것만으로 제한되지는 않는다. 또한, 상대적으로 낮은 만성 조직 반응을 갖는 생물학적 안정 중합체, 예컨대 폴리우레탄, 실리콘, 및 폴리에스테르가 만약 그들이 이식물 상에서 용해될 수 있거나 또는 중합화될 수 있다면 사용될 수 있다, 예컨대 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌 및 에틸렌-알파올레핀 공중합체; 아크릴계 중합체 및 공중합체, 비닐 할리드 중합체 및 공중합체, 예컨대 염화 폴리비닐; 폴리비닐 에테르, 예컨대 폴리비닐 메틸 에테르; 폴리비닐리덴 할리드, 예컨대 폴리비닐리덴 플루오리드 및 폴리비닐리덴 클로리드; 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤; 폴리비닐 방향족, 예컨대 폴리스티렌, 폴리비닐 에스테르, 예컨대 폴리비닐 아세테이트; 각각의 비닐 단량체 및 다른 올레핀과의 공중합체, 예컨대 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스티렌 공중합체, ABS 수지, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체: 폴리아미드, 예컨대 나일론 66 및 폴리카프로락탐; 알키드 수지; 폴리카르보네이트; 폴리옥시메틸렌; 폴리이미드; 폴리에테르; 에폭시 수지; 폴리우레탄; 레이온; 레이온-트리아세테이트; 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 부티르에이트; 셀룰로스 아세테이트 부티르에이트; 셀로판; 셀룰로스 니트레이트; 셀룰로스 프로피오네이트; 셀룰로스 에테르; 및 카르복시메틸셀룰로스 (5,776,184). 또한 피브린도 천연 또는 합성 다른 생물학적 양립 가능 중합체, 및 그들의 유도체 및 염과 함께 사용될 수 있다. 그 중합체 중 글리코폴리사카리드가 유리할 수 있다. 하나의 양태에서 중합체와 약물의 고체/고체 용액이 있다. 이는 그 약물과 중합체가 동일한 용매에 가용인 것 및 그 용매의 존재하에 적절히 혼합된 것을 의미한다. 용액 내로 이식물을 간단히 담그거나 또는 이식물 상에 용액을 분무하는 것과 같은 다양한 방식으로 약물과 중합체가 적용될 수 있다 (미국 특허 5,776,184). 폴리카르복실산, 셀룰로스계 중합체, 젤라틴, 알지네이트, 폴리 2-하이드록시에틸메틸아크릴레이트 (HEMA) 폴리비닐피롤리딘, 말레산 무수물 중합체, 폴리아미드, 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아미드, 폴리산, 예컨대 폴리아크릴산, 폴리사카리드, 예컨대 뮤코폴리사카리드 예컨대 하이알유론산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것과 같은 다양한 하이드로겔 중합체가 사용될 수 있다 (미국 특허 5,674,192 및 미국 특허 5,843,089). 중합체는 이식물 상에서 다공성 또는 무공성일 수 있다. 중합체의 몇개의 층이 사용될 수 있으며 그리고 몇개의 상이한 중합체가 동일한 이식물 상에서 조합될 수 있다. 상이한 층 및 상이한 중합체는 상이한 약리학적 물질을 운반할 수 있다 (5,833,651). 또한, 이식물의 1 또는 그 이상의표면이 두번째 중합체와 동일하거나 또는 상이한 중합체의 1 또는 그 이상의 추가적 코팅물로 코팅될 수 있다. 코팅의 부착 및 치료 화합물이 운반되는 속도는 생물 흡착될 수 있거나 또는 적절한 생물학적 안정 중합체를 선택함으로써, 그리고 용액 중에 치료 화합물의 중합체에 대한 비율에 의해 제어될 수 있다 (미국 특허 5,776,184). 조직에 적용되는 투약은 하이드로겔 코팅에 의한 치료 화합물 용액의 흡수량을 결정하기 위해 하이드로겔 코팅 내부로 치료 화합물의 예비침수(presoaking) 시간을 조절함으로써 또한 제어될 수 있다. 투약에 영향을 미치는 다른 팩터는 코팅에 적용된 용액 중의 치료 화합물의 농도, 및 예컨대, 하이드로겔 코팅의 두께, 그것의 복원력(resiliency), 공극률 및 하이드로겔코팅이 치료 화합물을 보유하는 능력, 예컨대 정전기적 결합 또는 공극 크기, 또는, 예컨대 pH 변화에 의해 달라지는 코팅의 이온 강도에 의해 측정되는 하이드로겔 코팅의 약물 방출도(drugreleasability)이다. 특정 약물에 대해 치료 화합물이 부위에 적용되기에 앞서 실질적으로 체액으로 방출되지 않도록 하이드로겔 코팅을 선택하는 것이 유리할 수 있다. 중합체와 치료 화합물의 고체/고체 용액의 방출은 다중 층 중에 중합체에 대한 치료 화합물의 비를 다양하게 함으로써 더 제어될 수 있다. 코팅이 중합체와 치료 화합물의 고체/고체 용액일 필요는 없지만, 대신 이식물에 적용되는 약물과 중합체의 임의의 조합으로부터 제공될 수 있다. 용액 중에 중합체에 대한 치료 성분의 비는 이식물 상에서 치료 성분을 획득하는 중합체의 효율 및 코팅이 조직에 대해 치료 성분을 방출하는 속도에 좌우될 것이다. 이식물 상에 치료 성분을 보유하는데 있어 상대적으로 약한 효율을 갖는다면 더 많은 중합체가 필요할 수 있으며, 매우 가용성인 치료 성문의 용출을 제한하는 용출 매트릭스를 제공하기 위해 더 많은 중합체가 필요할 수 있다. 따라서, 광범위한 치료 성분-대-중합체 비가 적절할 수 있으며, 약 10:1 내지 1:100의 범위 일 수 있다 (미국 특허 5,776,184). 치료 화합물의 결합은 또한 약물의 코팅 또는 코팅 첨가제에 대한 정전기적 인력 또는 기계적 결합에 의해, 예컨대 치료 화합물을 방출시키게 될 수 있는 체액의 내부로의 흐름 또는 치료 화합물 자체의 외부로의 흐름을 억제하는 공극 크기를 갖는 코팅을 사용함으로써 수행될 수 있다.

치료 화합물이 겔에 의해 형성된 수소 결합 매트릭스 내에서 지탱될 때 하이드로겔이 특히 유리하다 (미국 특허 5,674,192). 하이드로겔의 예는 예컨대 HYDROPLUS.RTM (미국 특허 5,674,192), CARBOPOL.RTM (미국 특허 5,843,089), AQUAVENE.RTM (미국 특허 4,883,699), HYPAN.RTM (미국 특허 4,480, 642)이다. 어떤 경우에, 하이드로겔은 이식물의 라이닝에 앞서 교차연결될 수 있으며, 예컨대 혈관 또는 혈관내 이식편 상의 하이드로겔 코팅이 하이드로겔이 이식물 상에 침착되기 전에 프라이머 딥(primer dip)과 접촉될 수 있다. 만약 교차연결된다면 그것은 이식물 표면 상에 상대적으로 영구적인 라이닝을 형성하며, 그리고 만약 교차연결되지 않고 남는다면 이식물 표면 상에 상대적으로 분해될 수 있는 라이닝을 형성한다. 예컨대, 도관 라이닝 중에 주어진 하이드로겔의 교차연결된 형태의 수명은, 교차연결되지 않은 형태보다 두배 이상이었다 (미국 특허 5,843,089). 대안적으로, 하이드로겔 라이닝은 가교제(crosslinking agent)와 인시투로 접촉할 수 있다 (미국 특허 5,843,089). 일반적으로, 건조될 때, 하이드로겔 코팅은 바람직하게는 약1 내지 10 미크론 두께, 및 통상적으로 2 내지 5 미크론이다. 매우 얇은 하이드로겔 코팅, 예컨대, 약 0.2-0.3 미크론 (건조) 및 더 두꺼운 하이드로겔 코팅, 예컨대, 10 미크론 (건조) 이상이 또한 가능하다. 통상적으로, 하이드로겔이 수화될 때, 하이드로겔 코팅 두께가 팩터 약 6 내지 10 또는 그 이상으로 팽창될 수 있다 (미국 특허 5,674,192). 일반적으로, 중합체계 담체는 생물 분해 가능 또는 생물 용출될 것이다 (예컨대 미국 특허 5,954,706, 미국 특허 5,914,182, 미국 특허 5,916,585, 미국 특허 5,928,916의 교시). 담체는 또한 생물 분해 가능 성분으로 세공을 채워서 구성될 수 있으며, 그리고 매트릭스의 공격적인 용해에 의해 1 또는 그 이상의 성분을 주변 조직 내로 방출할 수 있다. 이어서 세공이 열리게 된다. 운반되는 벡터는 치료용 단백질을 암호화하는 핵산, 예컨대 네이키드 핵산 또는 바이러스 벡터 또는 리포좀 내로 도입된 핵산일 수 있다. 네이키드 핵산에 의한다는 것은 단일 또는 이중 스트랜드 DNA 또는 RNA 분자가 바이러스 또는 리포좀 내로 도입되지 않았음을 의미한다. 특이적으로 보체 mRNA 분자에 결합하고, 그럼으로써 단백질 발현을 감소시키거나 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또한 하이드로겔 코팅을 경유하여 이식 부위에 운반될 수 있다 (미국 특허 5,843,089). 일반적으로, 핵산의 이식물에 대한 부착은 몇가지 다른 방식, 예컨대 공유 또는 이온 부착 기술을 사용하여 수행될 수 있다 통상적으로, 공유 부착 기술은 커플링 시약, 예컨대 글루타르알데히드, 시아조겐 브로미드, p-벤조퀴논, 석신 무수물, 키르보디이미드, 디이소시아네이트, 에틸 클로로포르메이트, 디피리딜 디설피드, 에피클로로히드린, 아지드의 사용을 필요로 하며, 그 중에서도, 임의의 다른 시약을 배제하지 않지만,본 발명의 기재된 방법을 사용하는 임의의 방법이 사용될 수 있으며 본 기술 분야에서 당업자에게 인식되어 있을 것이다. 생체 분자의 표면에 대한 공유 커플링은 생체 분자들 사이에 바람직하지 않은 교차-연결을 생성시키며, 그럼으로써 생체 분자의 생물학적 성질을 파괴하게 된다. 또한, 그들은 표면 작용 부위들 사이에 결합을 생성시킬 수 있으며 그럼으로써 부착을 방해하게 된다. 생체 분자의 표면에 대한 공유 커플링은 또한 생체 분자의 3차원 구조를 파괴시킬 수 있으며, 그럼으로써 생물학적 성질을 감소시키거나 파괴시키게 된다 (미국 특허 5,928,916). 이온 커플링 기술은 부착된 생체 분자의 화학적 조성을 바꾸지 않는 장점을 가지며, 그리고 생체 분자의 이온 커플링은 또한 적절한 조건 하에서 생체 분자를 방출하는 장점을 가진다. 하나의 예는 (미국 특허 4,442,133)이다. 이온 결합에 의해 생체 분자를 부동화하기 위한 현재의 기술은 생체 물질의 표면 상에 4급 암모늄 염, 3급 및 4급 아민기를 포함하는 중합체, 예컨대 TDMAC, 벤잘코늄 클로리드, 세틸피리디늄 클로리드, 벤질디메틸스테아리암모늄 클로리드, 벤질세틸디메틸암모늄 클로리드, 구아니딘 또는 비구아니드 부를 이용하여 양전하를 도입함으로써 달성되었다 (미국 특허 5,928,916). 혈관 이식물을 경피적으로 운반할 때, 카테터를 위치시키는 동안 체액으로 약물의 방출을 억제하기 위해 시스 멤버(sheath member)가 관련될 수 있다. 예컨대, 그것은 카르보왁스, 젤라틴, 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 생물 분해 가능 또는 열 분해 가능 중합체, 예컨대 알부민 또는 플루로닉 젤 F-127 (미국 특허 5,674,192)일 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물이 실시될 때, 생체내 구체예의 문맥 상, 그들이 활성화되고, 역반응을 일으키지 않으면서 궁극적으로 심혈관계 또는 조직 이식물의 내피세포화를 상승시키게 되는 그런 방식으로 이식물로부터 방출된 핵산이 주변 조직을 자극하는 한, 부착 방법의 특정 유형은 중요하지 않다. 본원에 기재된 방법은 모든 것 및 본 기술 분야의 당업자에게 명백할 특정 응용에 맞는 추가의 방법을 결코 다 포함하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단위 제형으로 제공될 수 있으며, 여기서 각 투약 단위, 예컨대 용액, 젤, 글루, 액적 및 에어로졸은 소정량의 조성물을, 단독으로 또는 다른 활성 시약과 적절히 조합된 것을 포함한다. 용어 단위 제형은, 본원에서 사용된 것으로서, 인간 및 동물 대상에 대해 단일 투약에 적당한 물리적으로 개별적인 단위를 의미하며, 여기서 각 단위는 적절한 경우, 약학적 허용 희석제, 담체, 또는 비이클과 연관되어 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양으로 계산된 소정량의 본 발명의 조성물을, 단독으로 또는 다른 활성 시약과 적절히 조합된 것을 포함한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 사양은 얻어지는 특정 효과 및 특정 숙주에서 약학적 조성물과 관련된 특정 약물 동력학에 좌우된다.

따라서, 본 발명은 또한 숙주에 치료용 유전자를 전이시키는 방법을 제공하며, 그것은 본 기술 분야에서 당업자에게 공지된 전술한 투여 방식 또는 대안적 방식을 사용하여 바람직하게는 조성물의 일부로써, 본 발명의 벡터를 이식물과 투여하는 것을 포함한다. 조성물의 유효량은 숙주에 목적하는 효과를 나타내는 그런 것이며, 본 기술 분야에서 당업자에게 공지된 몇가지 종말점(end-point)을 사용하여 모니터링될 수 있다. 숙주에 대한 벡터의 효과적인 유전자 전이는, 본 발명에 따라, 치료 효과 (예컨대 표면의 모세관의 형성 및 내피세포화)의 관점으로, 또는 숙주 내부의 전이된 유전자 또는 유전자 발현의 증거에 의해 모니터링될 수 있다 (예컨대 숙주 세포에서 핵산을 검출하기 위해 시퀀싱과 관련된 폴리머라제 체인 반응, 노던 또는 서던 하이브리드화, 또는 전사 분석을 이용하여, 또는 전이된 핵산에 의해 암호화되거나, 또는 그런 전이에 의한 양 또는 기능에 대해 영향을 받은 단백질 또는 폴리펩티드를 검출하기 위한 면역블로팅 분석, 항체-매개 검출, mRNA 또는 단백질 반감기 연구, 또는 소립자화 분석을 이용하여). EC-SOD-유전자에 의해 암호화된 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 면역분석을 포함하여 그런 소립자화 분석은 실시예에 기재된다. 이들 방법은 모든 것 및 본 기술 분야의 당업자에게 명백할 특정 응용에 맞는 추가의 방법을 결코 다 포함하는 것은 아니다. 게다가, 조성물의 유효량은 목적하는 효과를 발휘하는 것으로 알려진 화합물에 유사한 것을 통해 더 추정될 수 있다 (예컨대, 재발협착증을 억제하는데 종래에 사용된 화합물이 숙주에 투여되는 EC-SOD 핵산의 양의 측면에서 안내를 제공할 수 있다).

게다가, EC-SOD는 바람직하게는 약 0.1 마이크로그램 내지 10000 마이크로그램 (그 이상, 즉 약 10000 마이크로 그램 이상, 또는 그 이하, 즉 약 0.1 마이크로 그램 이하의 임의의 적절한 양이 사용될 수도 있다)으로 포함된다는 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 각 활성 시약의 바람직한 양은 생체내에서 본 발명의 방법을 실시하는데 최적화된 것인 전문가에 의해 사용되는 각 성분의 범위의 일반적 안내를 제공한다. 유사하게, EC-SOD 플라스미드가 0.1 내지 10000 마이크로그램 포함된다 (그 이상, 즉 약 10000 마이크로 그램 이상, 또는 그 이하, 즉 약 0.1 마이크로그램 이하의 임의의 적절한 양이 사용될 수도 있다). EC-SOD 벡터는 바람직하게는 10⁷과 10¹³사이의 바이러스 입자를 갖지만, 10¹³이상 또는 10⁷이하의 임의의 적절한 양이 사용될 수도 있다. 게다가, 그런 범위는 특정 응용에 보증될 수 있는 것으로서, 더 많거나 또는 더 적은 양의 성분을 사용하는 것을 결코 배제하지 않는다. 예를 들면, 실제 투약 및 스케줄은 조성물이 다른 약학적 조성물과 조합되어 투여되는 지에 좌우되어, 또는 약물 동력학, 약물 성향, 및 대사에 있어서 개체간 차이에 좌우되어 다양할 수 있다. 나아가, 세포 당 첨가되는 벡터의 양은 벡터에 삽입되는 유전자의 길이 및 안정도, 게다가 또한 서열의 성질, 및 특히 실험적으로 결정될 필요가 있는 파라미터에 따라 다양할 것이며, 그리고 그것은 본 발명의 방법에 본질적이지 않은 팩터 (예를 들면, 합성에 관련된 비용)에 의하여 바뀔 수 있다. 본 기술 분야에서 당업자는 특정 상황의 긴박함에 따라 임의의 필요한 조절을 용이하게 만들어 낼 수 있다. 주변 조직에 적용되는 유전자 구조물의 양 또는 이식물 상에 또는 조직 중에 적용되는 유전자 조성물의 양은, 다양한 생물학적 및 의학적 팩터를 고려하면서 수행하는 의사 또는 수의사에 의해 최종적으로 결정될 것이다. 예컨대, 특정 EC-SOD 및 혈관 이식물 물질, 환자 또는 동물 크기, 연령, 성별, 식이, 투여 시간, 뿐 아니라 연결 조직 형성을 억제할 수 있는 임의의 추가적 임상 팩터, 예컨대 상이한 팩터 및 호르몬의 혈장 수준을 고려하여야 한다. 적절한 투약 요법은 본 기술 분야에서 당업자에 의해 참고로 개별 상황을 내포하고 있는 드러난 개시의 관점에서 따라 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 이들 구체예에 대해, 본원에 기재된 방법에서 1 또는 그 이상의 상이한 벡터 (즉 각각 1 또는 그 이상의 상이한 치료 유전자를 암호화하는 것)가 사용될 때, 세포와 본 발명의 다양한 성분과의 접촉은 임의의 순서로 또는 동시에 발생할 수 있다. 바람직하게는 그것은 동시에 발생한다.

연결 조직을 억제하는 조직

본 발명은 유전자를 사용하여 과도한 연결 조직 형성을 억제하고 그리고 내피세포화를 향상시키는 유리한 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 것으로서 주변 조직이란 조직 상처 이후 또는 장치 이식 이후 새로운 연결 조직을 궁극적으로 억제하거나 또는 억제에 기여하는 능력을 갖는 그런 임의의 또는 모든 세포를 의미한다. 이는 다양한 형태로 예컨대 맥관 벽, 늑막, 심막, 복막, 대방, 지방 및 근육과 같은 다양한 조직을 포함한다.

생체내 구체예의 문맥상 세포가 그들이 활성화되는 그런 방식으로 자극되는 한, 본 발명의 방법 및 조성물로 자극을 받는 주변 조직의 특정 유형 및 유형들은 중요하지 않으며, 그리고, 원하지 않는 연결 조직 성장, 신생 동맥내막 형성의 억제 또는 이식물의 내피세포화 및 모세관화의 촉진을 궁극적으로 상승시킨다.

주변 조직은 또한, 이식물 내에 위치하거나 이식물과 접촉하거나, 또는 이식물로 이동하는 그런 세포를 특히 의미하는 것으로 사용되며, 그 세포는 직접 또는 간접적으로 연결 조직 형성, 신생 동맥내막 형성을 억제하거나 또는 내피세포 및/또는 모세관 형성을 촉진한다. 때문에, 추가로 연결 조직 형성을 억제하거나 또는 내피 세포를 유인하는 것을 자극하는 것으로서, 그들의 자극이 간접적으로 연결 조직 형성의 억제 또는 내피세포화의 촉진을 유도하는 바와 같이, 모세관을 형성하는 세포일 수 있는 미세 혈관 내피 세포는, 본 개시의 문맥 내에서 또한 주변 조직으로 고려된다. 연결 조직 형성 또는 내피세포화에 간접적으로 영향을 미치는 세포는 다양한 성장 인자 및 사이토킨의 수고에 의해, 또는 다른 세포 유형과의 그들의 물리적 상호작용에 의해 그럴 수 있다. 또한, 그들의 자연 환경이 연결 조직 형성의 활발한 억제 또는 이식물 내피세포화 및 혈관화의 촉진의 영역에 도달하는 세포 또는 조직은 주변 조직일 수 있다. 주변 조직 세포는 또한 그런 영역에 유인되거나 또는 모집되는 세포일 수 있다. 과학적 관심에도 불구하고, 주변 조직 세포가 연결 조직 형성을 억제하거나 또는 내피세포화를 촉진한다는 직접 또는 간접 메카니즘은 본 발명을 실시하는데 있어 고려되지 않는다.

주변 조직 세포는 그들의 자연 환경이 활성 연결 조직 형성 또는 혈관 보조물, 내부혈관 보조물 내피세포화, 또는 조직 이식물 혈관화의 영역에 도달하는 세포 또는 조직일 수 있다. 주변 조직의 측면에서, 이들 세포는 또한 그런 영역에 유인되거나 또는 모집되는 세포일 수 있다.

본 발명에 따라, 주변 세포 및 조직은 연결 조직 형성이 억제되거나 또는 내피세포화를 바라는 경우 심혈관계 이식물의 조직 또는 표면에 도달하는 그런 세포 및 조직일 것이며, 또는 혈관화를 바라는 조직 이식물의 표면에 도달하는 세포 또는 조직일 것이다.

따라서, 치료 구체예에서 본 치료용 조성물, 및 심혈관계 및 조직 이식물 또는 다른 보조 장치가 적용될 때에 적절한 주변 조직의 확인과 관련된 어려움은 없다. 그런 경우에 필요한 모든 것은 적절한 억제성 및 촉진성 조성물을 얻는 것이며 그리고 심혈관계 또는 조직 이식물 또는 보조 장치를 촉진성 조성물 및 주변 조직과 접촉시키는 것이다. 이 생물학적 환경의 성질은 임의의 추가의 타겟화 또는 세포 동정이 없이도 숙련가에 의해 적절한 세포가 활성화될 것이라는 그런 것이다.

본 발명의 하나의 양태는 상기 세포 중에서 상기 유전자의 발현을 촉진하기 위하여 주변 조직이 EC-SOD 단백질 또는 유전자 (추가의 유전자, 단백질, 성장 인자, 약물 또는 다른 생체 분자와 함께 또는 없이), 및 심혈관계 또는 조직 이식물 또는 다른 보조 장치를 포함하는 조성물과 접촉하도록 조성물을 일반적으로 투여하는 것에 관련된다. 대략적으로, 세포는 생체 내에서 접촉될 수 있다. 이는 가장 직접적인 방식으로, 기능성 EC-SOD 유전자 구조물을 간단히 얻음으로써, 및 세포에 그 구조물을 적용함으로써 달성된다. 세포를 DNA, 예컨대 선형 DNA 분자, 또는 플라스미드의 형태 중의 DNA, 또는 어떤 다른 재조합 벡터 또는 프로모터의 제어 하에서 관심있는 유전자를 포함하는 인위적 염색체를 접촉시키는 것은, 적절한 종료 시그날과 더불어, 필요한 추가의 단계 없이, DNA의 획득 및 발현을 달성하기에 충분하다.

바람직한 구체예에서, 주변 조직과 EC-SOD 조성물을 접촉시키는 과정은 생체내에서 수행된다. 다시, 본 과정의 직접 결과는 세포가 획득되고 그리고 유전자를 발현하며, 그리고 숙련가에 의해 요구되는 추가적 단계 없이 번역 또는 전사 생성물이 감소된 연결 조직 형성의 과정 또는 이식물의 내피세포화 및/또는 모세관화의 촉진을 자극하는 것이다.

본 발명에 따른 장치에 사용된 물질

본원에 사용된 것으로서, 이하의 용어 및 단어는 이하의 귀속적 의미를 가져야 한다. 이식물, 장치 또는 보조물로서 간단히 언급되는 것인 이식 가능 의료 장치는 생체 물질로부터 적어도 일부 조립된 대상을 의미할 것이며, 그리고 체액을 포함하여 생체 조직과 접촉하는데 사용되기 위한 것으로 해석된다. 생체 물질은 장치를 제조하는데 사용되는 물질의 조성물을 의미하여야 하며, 이는 표면에 접촉하는 1 또는 그 이상의 그것의 조직을 제공한다. 공극률 및 그것의 활용형 (예컨대 세공 및 다공성)은, 달리 구체화되지 않았다면, 그 생체 물질의 외부 (예컨대 첫번째 주된) 표면으로부터 출발하여 그리고 실질적으로 생체 물질을 통해 내부 (예컨대, 두번째) 표면까지 연장되는 소형 채널 또는 통로를 갖는 생체 물질을 의미하여야 한다. 견고한 및 그것의 활용형은, 흡수 불가 생체 물질의 경우, 이식 가능 의료 장치의 형태로 조립될 때, 예컨대, 생체내에서 개방성 및 세공 구조를 유지하기 위해 그것을 사용하는 중에 마주치는 압력에 저항하는 능력을 의미한다. 그 표면은 생체 물질과 그것의 주변 사이의 계면을 의미하여야 한다. 그 용어는 그것의 거시적 감각으로 (예컨대 생체 물질의 시트의 주된 두 면), 뿐 아니라 그것의 미시적 감각으로 (예컨대 물질을 관통하는 세공의 라이닝) 그 단어를 사용하는 것을 포함하는 것으로 해석된다. 용어 "부착" 및 그것의 유도형은 흡착, 예컨대 중합체 성분 또는 핵산의 이식물에 대한 물리적 흡착, 또는 화학적 흡착, 리간드/수용체 상호 작용, 공유 결합, 수소 결합, 또는 이온 결합을 의미한다.

본 발명의 조성물, 장치 및 방법에 사용될 수 있는 심혈관계, 조직 이식물및 다른 보조 장치의 유형은 그들이 조직에 양립할 수 있는 한 실질적으로 제한이 없다. 따라서, 본 발명의 장치는 생체내 응용을 위해 사용될 때, 혈액, 체액 또는 조직, 및 특히, 원하지 않거나 또는 과도한 연결 조직 성장 및 섬유증의 억제 또는 모세관 내피세포화의 촉진으로부터 이익을 향유할 수 있는 것과 지속적으로 접촉하는 것으로 해석되는 의료 장치를 포함한다. 바람직한 장치는 생체에 이식될 수 있는 것이며, 그리고 심혈관계 이식물, 조직 이식물, 인공 장기, 예컨대 췌장, 간, 및 신장, 및 장기 이식물, 예컨대 유방, 페니스, 피부, 코, 귀 및 정형외과 이식물을 포함한다. 연결 조직 형성의 억제 또는 모세관 내피세포화의 취지는 장치의 유형 및 목적에 좌우되어 개별 특정 장치에 따라 다양할 것이다. 연결 조직 형성의 억제는 그 장치를 과도한 흉터 조직 형성, 협착(stricture) 및 섬유증으로부터 보호한다. 타고난 모세관은 혈관 이식물의 라인 표면에 내피 세포를 제공할 수 있고, 감염으로부터 조직 이식물을 보호하고, 장치 중의 세포에 영양분을 공급하고 그리고 센서로 하여금 순환 중의 성분을 인지하는 것을 가능하게 한다. 이는 이식물이 포유 동물에 투여될 때 그들이 반대 반응, 알러지 반응, 또는 임의의 다른 원하지 않는 반응을 나타내지 않는 형태라는 생물학적 양립가능성과 통상적으로 관련된 모든 특성을 갖는다는 것을 의미한다. 그들은 또한 이식물을 포위하는 조직과 접촉하도록 위치되기에 적절하다. 후자의 요구는 팩터, 내피세포 또는 원하지 않는 연결 조직 형성에 저항하는 것을 고려한다.

바람직한 생체 물질은 생체내에서 그들의 의도된 목적에 대한 충분한 견고성을 제공하는 그런 것이다. 심혈관계 이식편 및 심혈관계 패치를 형성하는데 사용되기 위해, 예를 들면, 생체 물질은 그것의 의도된 사용 동안 이식편이 이식편 개방성을 유지하는 것을 허용하기에 충분히 견고성일 것이다. 이식물 물질의 선택은 혈관 또는 조직 이식물이 이식되는 특정 상황 및 부위에 따라 상이할 것이다. 혈관 보조물은, 예컨대 테트라플루오로에틸렌 중합체, 방향족/지방족 폴리에스테르 수지, 폴리우레탄, 및 실리콘 고무로 구성되는 군으로부터 선택되는 생체 물질로 이루어진다. 그렇지만, 어떤 종류의 생물학적 양립 가능 미세 다공성 메시(mesh)라도 사용될 수 있다. 상기 생체 물질은 서로 또는 다른 물질, 예컨대 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리디옥손 및 폴리글리코네이트와 조합될 수 있다. 바람직한 것은 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌 및 다크론이다. 다크론은 벨루어(velour)와 함께 또는 없이, 또는 어떤 다른 방식으로 변형된다. 다크론은 일반적으로 직물(woven), 브레이드(braided) 또는 짠(knitted) 것이며 그리고 적절한 실(yarns)은 10과 400 데니어(denier) 사이이다. ePTFE의 노드 영역은 전단(tear) 저항 (예컨대 동맥류 팽창에 대한 봉합 및 내성)을 제공하도록 주어지는 무공성 PTFE로 구성된다. 노드 간 영역은 PTFE 섬유로 구성되며, 그것은 본원에 언급된 공극률을 제공하는 섬유들 사이의 공간과 노드가 연결되도록 제공된다. 노드 크기는 노드 PTFE로 구성되는 조직-접촉 표면의 퍼센트로서 표현될 수 있다. 노드 사이의 거리는 평균 피브릴 길이(fibril length)로 표현될 수 있다. 다시 말하면, 공극률은 노드간 거리 (즉 하나의 노드의 중심으로부터 다음 노드의 중심까지의 평균 거리)로서 통상 표현된다. 바람직한 ePTFE 물질은 적절한 강도 (예컨대, 동맥류 팽창에 관하여)를 제공하기에 충분한 크기 및 빈도의 노드 및 (모세관 내피세포화를 허용하기 위한) 적절한 공극률을 제공하기 위한 충분한 빈도의 노드간 영역 및 섬유 길이를 갖는다. 본 명세서에서 주어진 것으로서, 본 기술 분야에서 당업자는 공극률과 강성(rigidity)의 적절한 조합을 갖는 생체 물질을 사용하는 장치를 확인하고 조립하는 것이 가능하다. 생체 물질은 바람직하게는, 표면쪽으로 모세관의 형성 및 성장으로 이어질 수 있는 것인 세포의 부착 및 이동을 허용하기 위해 다공성이다. 외부 표면에서 출발하여 생체 물질을 통해 부분적으로 또는 완전히 연장되는 소형 채널 또는 통로의 형태로 적절한 세공이 존재할 수 있다. 그런 경우에, 세공 모세관 직경의 단면 디멘션은 5 미크론 이상 및 통상적으로 1 mm 이하이다. 더 큰 세공 크기는 생체 물질이 충분한 강성을 유지하는 한 중요하지 않지만, 약 1 mm 이상의 세공 크기를 갖는 유용한 장치는 있을 것 같지 않다. 그런 세공 디멘션은 현미경으로 정량화된다. 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되는 바와 같이, 임의의 다른 방법을 배제하지 않으면서, 예컨대, 단백질 (예컨대 5,037,377, 4,319,363 참조), 헤파린화되지 않은 전체 혈액 및 혈소판이 풍부한 혈장으로의 예비 코팅, 표면의 백열-방전 변형, 플루로닉 젤, 피브린 글루, 피브로넥틴, 접착 분자, 공유 결합의 추가, 예컨대 탄소를 이용한 표면 전하에 대한 영향 (5,827,327, 4,164,045), 및 계면 활성제 또는 세척제로의 처리와 같은 몇가지 이식편 물질 및 표면의 변형이 이루어질 수 있다. 게다가, 내부 및 외부 표면에 대해, 노드간 거리가 최대값으로 60 미크론 및 최소값으로 20 미크론과 같은 상이한 노드간 거리의 하이브리드 (하이브리드(HYBRID) PTFE)로서 이식물이 구조화될 수 있다. 또한, 상이한 노드간 거리를 갖는 더 많은 층이 사용될 수 있다. 내피세포화를 억제하지 않는 때에는 그들은 모두 본 발명의 범위 내에속하는 것으로 해석된다. 잠재적인 생물 분해 가능 혈관 이식물이 본 발명의 조성물, 장치 및 방법과 관련하여 사용될 수 있다. 예컨대, 생물 분해 가능하며 화학적으로 정의된 폴리락트산, 폴리글리콜산, 정제된 단백질의 매트릭스, 반-정제된 세포 밖 매트릭스 조성물 및 또한 콜라겐이 사용될 수 있다. 또한, 제대 정맥(umbilical vein), 복재 정맥(saphenous vein), 소의 천연 동맥 또는 장내 점막-하 조직과 같은 자연 발생의 자가, 동종 및 이종 물질이 혈관 또는 다른 이식물 물질로서 사용될 수 있다. 임상적으로 사용되는 이식편의 예는 미국 특허 4,187,390, 미국 특허 5,474,824 및 미국 특허 5,827,327에 개시되어 있다. 생물 분해 가능 또는 생물 흡수 가능 물질, 예컨대 동종 중합체(homopolymer), 예컨대 폴리-파라디옥사논, 폴리라이신 또는 폴리글리콜산 및 공중합체; 예컨대, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 또는 다른 생체 물질은 그들이 요구되는 강성을 제공하는 한, 단독으로 또는 혈관 이식편 또는 다른 이식물 물질로서 다른 물질과 조합되어 사용될 수 있다. 또한, 장내 점막 하 조직, 정제된 단백질의 매트릭스 및 반-정제된 세포 밖 매트릭스 조성물과 같은 다른 생물학적 물질이 사용될 수 있다. 적절한 혈관 이식편 또는 다른 보조 이식물이 유전자 조성물에 운반되며 그리고 새로운 내피세포 성장을 위한 표면을 제공할 것이며, 즉, 내피 세포가 이동할 수 있는 인시투 스카폴딩으로서 작용하게 될 것이다. 생물학적 양립 가능성, 강성을 가진 임의의 물질이 본 발명에 수용될 수 있다는 것이 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되어야 한다. 혈관과 문합 영역 사이에 연결이 있는 한, 과도한 연결 조직 형성의 억제가, 말단-대-말단, 말단-대-측면, 측면-대-측면 또는 다중 측면-대-측면 및 말단-대-측면-문합의 조합으로 자가 혈관의 자가 혈관에 대한, 이종 혈관의 자가 혈관에 대한, 자가 혈관의 합성 혈관에 대한 또는 임의의 유형의 혈관의 다른 혈관에 대한 연결 중에 발생할 수 있다는 것 역시 이해되어야 한다. 또한 이식편의 어느 부분으로도 과형성이 억제될 수 있다.

심혈관계 패치의 기본 배경은 예컨대 미국 특허 5,104,400, 미국 특허 4,164,045, 미국 특허 5,037,377에 잘 기재되어 있다. 혈관 패치의 경우, 패치의 한 면이 혈관을 끌어들이고 다른 면은 다른 주변 조직을 끌어 들여 내피 세포의 이식편 전이 성장을 촉진하게 된다. 심장내 패치의 경우, 혈액이 패치의 양 면을끌어들인다. 바람직한 생체 물질은 생체내에서 충분한 강성을 제공하는 것이다. 혈관 패치 생체 물질은 패치가 그것의 의도된 사용 동안 그것의 형태 및 세공-구조를 유지하는 것이 허용되는 충분한 강성이어야 한다. 패치 물질의 선택은 혈관 패치가 이식되는 특정 상황 및 장소에 따라 상이할 것이다. 혈관 패치는 합성 생체 물질ㄹ로 이루어지며, 그런 물질은 테트라플루오로에틸렌 중합체, 방향족/지방족 폴리에스테르 수지, 폴리우레탄, 및 실리콘 고무, 다만 사용될 수 있는 생물학적 양립 가능 미세 다공성의 메시의 임의의 종류를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 생체 물질은 서로 또는 폴리글리콜산과 같은 다른 성분과 조합될 수 있다. 바람직한 것은 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌 및 다크론이다. 다크론은 일반적으로 직물, 브레이드 또는 짠 것이며, 그리고 벨루어가 있거나 또는 없으며, 적절한 실은 10과 400 데니어 사이이다. ePTFE의 노드 영역은 전단 저항 (예컨대 동맥류 팽창에 대한 봉합 및 내성)을 제공하도록 주어지는 무공성 PTFE로 구성된다. 노드 간 영역은 PTFE 섬유로 구성되며, 그것은 본원에 언급된 공극률을 제공하는 섬유들 사이의 공간과 노드가 연결되도록 제공된다. 노드 크기는 노드 PTFE로 구성되는 조직-접촉 표면의 퍼센트로서 표현될 수 있다. 노드 사이의 거리는 평균 피브릴 길이로 표현될 수 있다. 다시 말하면, 공극률은 노드간 거리 (즉 하나의 노드의 중심으로부터 다음 노드의 중심까지의 평균 거리)로서 통상 표현된다. 바람직한 ePTFE 물질은 적절한 강도 (예컨대, 동맥류 팽창에 관하여)를 제공하기에 충분한 크기 및 빈도의 노드 및 (모세관 내피세포화를 허용하기 위한) 적절한 공극률을 제공하기 위한 충분한 빈도의 노드간 영역 및 섬유 길이를 갖는다. 그런 물질은 적지만 더 두꺼운 노드를 제공하며, 다시 말하면 생체내에서 명백히 더 강한 강도를 제공한다. 본 명세서에서 주어진 것으로서, 본 기술 분야에서 당업자는 공극률과 강성의 적절한 조합을 갖는 생체 물질을 사용하는 장치를 확인하고 조립하는 것이 가능하다. 생체 물질은 바람직하게는, 구경 표면(luminal surface)쪽으로 모세관의 형성 및 성장으로 이어질 수 있는 것인 세포의 부착 및 이동을 허용하기 위해 다공성이다. 외부 표면에서 출발하여 생체 물질을 통해 부분적으로 또는 완전히 연장되는 소형 채널 또는 통로의 형태로 적절한 세공이 존재할 수 있다. 그런 경우에, 세공 모세관 직경의 단면 디멘션은 5 미크론 이상 및 통상적으로 1 mm 이하이다. 더 큰 세공 크기는 생체 물질이 충분한 강성을 유지하는 한 중요하지 않다. 그렇지만, 약 1mm 이상의 세공 크기를 갖는 유용한 장치는 있을 것 같지 않다. 그런 세공 디멘션은 현미경으로 정량화된다. 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되는 바와 같이, 임의의 다른 방법을 배제하지 않으면서, 예컨대, 단백질 (예컨대 5,037,377, 4,319,363 참조), 헤파린화되지 않은 전체 혈액 및 혈소판이 풍부한 혈장으로의 예비 코팅, 표면의 백열-방전 변형, 플루로닉 젤, 피브린 글루, 피브로넥틴, 접착 분자, 공유 결합의 추가, 예컨대 탄소를 이용한 표면 전하에 대한 영향 (5,827,327, 4,164,045), 및 계면 활성제 또는 세척제로의 처리와 같은 몇가지 이식편 물질 및 표면의 변형이 이루어질 수 있다. 또한, 내부 및 외부 표면에 대해, 노드간 거리가 최대값으로 60 미크론 및 최소값으로 20 미크론과 같은 상이한 노드간 거리의 하이브리드 (하이브리드 PTFE)로서 이식물이 구조화될 수 있다. 상이한 노드간 거리를 갖는 더 더욱 많은 층이 사용될 수 있다. 내피세포화를 억제하지 않는 때에는 그들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 해석된다. 잠재적인 생물 분해 가능 혈관 이식물이 본 발명의 조성물, 장치 및 방법과 관련하여 사용될 수 있으며, 예컨대, 동종 중합체, 예컨대, 폴리-파라디옥사논, 폴리라이신 또는 폴리글리콜산 및 공중합체, 예컨대, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 또는 다른 생체 물질, 예컨대 정제된 단백질의 매트릭스, 반-정제된 세포 밖 매트릭스 조성물이, 그들이 요구되는 강성을 제공하는 한, 단독으로 또는 혈관 패치 물질로서 다른 물질과 조합되어 사용될 수 있다. 또한, 제대 정맥, 복재 정맥, 소의 천연 동맥, 심막 또는 장내 점막-하 조직과 같은 자연 발생의 자가, 동종 및 이종 물질이 혈관 패치 물질로서 사용될 수 있다. 임상적으로 사용되는 혈관 패치의 예는 미국 특허 5,037,377, 미국 특허 5,456,711, 미국 특허 5,104,400, 미국 특허 4,164,045에 개시되어 있다. 적절한 혈관 패치가 유전자 조성물에 운반되며 그리고 새로운 내피세포 성장을 위한 표면을 제공할 것이며, 즉, 내피 세포가 이동할 수 있는 인시투 스카폴딩으로서 작용하게 될 것이다. 바람직하게는, 맥관을 포위하는 조직에 참여하는 면에 핵산이 부착된다. 적절한 심장 내 패치가 유전자 조성물에 운반되며 그리고 새로운 내피세포 성장을 위한 표면을 제공할 것이며, 즉, 내피 세포가 이동할 수 있는 인시투 스카폴딩으로서 작용하게 될 것이다. 바람직하게는, 심장 내 패치의 양 표면에 핵산이 부착된다. 대안적으로, 핵산이 심장 내 패치 표면 중 하나에 부착될 수 있다. 생물학적 양립 가능성 및 강성을 갖는 임의의 물질이 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 본 기술 분야의 당업자는 이해할 것이다.

본원에서 도관은 속이 빈 실린더 형의 의료용 이식물을 의미하며, 이는 치료되는 루멘의 벽 중의 부위와 접촉하여 그것이 이식될 때 생체의 루멘에 대한 지지를 제공하게 된다. 그들은 몇가지 상이한 디자인, 예컨대 튜브형, 원추형 또는 두 갈래로 나뉘어진 형태일 수 있다. 구조는 코일화 된 스프링, 브레이드 필라멘트, 천공된 튜브, 슬릿 튜브, 및 지그재그, 또는 임의의 다른 변형체일 수 있다. 바람직하게는, 혈관 도관의 경우 도관이 외부의, 루멘-접촉 표면, 및 내부의 혈액-접촉 표면을 갖는 방식으로 혈관에 사용하기 위해 적용된다. 본 기술 분야에서 많은 도관이 개별 방식으로, 예컨대 와이어, 플라스틱, 금속 스트립, 또는 메시, 휘어진 것, 직물, 엇갈리게 꼬여진 것 또는 일반적으로 실린더 구조로 다르게 조립된 것으로 형성된다. 도관은 또한 기본적으로 중합체 또는 금속 구조 성분 및 그 위에 필름이 도포된 구조를 가질 수 있다 (미국 특허 5,951.586). 도관은 또한 스스로-팽창하거나 또는 압력에 의해 팽창할 수 있는 것으로 분류되었다. 용어 팽창한다, 팽창하는, 및 팽창할 수 있는이란 본원에서 직경 방향으로 조절할 수 있는 루멘 내부의 도관을 의미한다. 자가 팽창 도관이 카테터 운반과 더불어 치료 부위에 위치될 때, 그들은 속박력으로부터 해방된 이후 더 큰 직경으로 방사상으로 팽창되어야 하며, 그 힘은 도관에 대해 바깥쪽으로 향하는 방사력을 발휘하지 않고도, 더 작은 직경으로 그들을 제한하며 표면이 혈관 벽 또는 다른 조직과 접촉하도록 순응시키는 것이다. 이 종류의 도관은 브레이드 또는 성형 와이어의 도관을 포함한다. 스스로 팽창하는 도관은 또한 열 기억에 의해 정의되는 크기까지 팽창할 수 있다. 압력으로 팽창할 수 있는 도관은 가단(malleable) 또는 플라스틱과 같이 형상화 할 수 있는 물질, 통상적으로 성형 금속 와이어 또는 금속 스트립으로 조립된다. 붕괴된 도관이 카테터 운반과 더불어 치료에 이용되며, 이후 풍선 또는 다른 도관-팽창 기구를 사용하여 그것의 의도된 작동 직경까지 방사상으로 팽창된다. 이식 후 유연성 및 방사상 압력에 대한 효과적인 저항이 요구되는 적용례를 위해, 금속으로 성형된 실(thread) 성분 또는 스트랜드가 일반적으로 선호된다. 중합체 스트랜드의 경우 강도 및 유연성의 선호되는 조합은 그들이 굳어지거나, 또는 그렇지 않으면 열 처리된 후에 스트랜드의 성질에 크게 좌우된다. 나선 스트랜드의 브레이드 각 (braiding angle) 및 인접하는 스트랜드 사이의 축방향의 간격 또한 강도 및 유연성에 기여한다.

도관 와이어는 금속, 무기 섬유, 세라믹 또는 유기 중합체일 수 있다. 그들은 탄성이고, 강하고, 생물학적 양립 가능성을 가지며, 그리고 피로(fatigue) 및 부식에 내성이어야 한다. 예컨대, 이식하는 동안 일그러지지 않거나 또는 전류의 영향 하에서 심각한 변질 (부식)의 대상이 되지 않는 금속, 예컨대 스테인레스 스틸 또는 금 또는 다른 상대적으로 유연한 비독성 금속 및 합금으로 이루어진 코어 와이어가 일반적으로 선택된다. 그런 금속은 백금, 백금-이리듐 합금, 주석 또는 티타늄과 구리 합금, 니켈-크롬-코발트 합금, 코발트가 주성분인 합금, 몰리브데늄 합금, 니켈- 티타늄 합금을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 스트랜드가 금속일 필요는 없으며 임의의 다른 성분을 배제하지 않는, 예컨대 PET, 폴리프로필렌, PEEK, HDPE, 폴리설폰, 아세틸, PTFE, FEP, 및 폴리우레탄과 같은 중합체계 물질일 수 있다 (다른 변형례: 폴리테트라플루오로에틸렌, 불소화 에틸렌 프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌-퍼플루오로알킬 비닐 에테르 공중합체, 염화 폴리비닐, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 광범위 불화물 및 다른 생물학적 양립 가능 플라스틱). 또한, 생물 분해 가능 또는 생물 흡수 가능 물질, 예컨대 동종 중합체, 예컨대 폴리-파라디옥사논, 폴리라이신 또는 폴리글리콜산 및 공중합체, 예컨대 폴리락트산 및 폴리글리콜산, 폴리우레탄, 또는 다른 생체 물질이단독으로 또는 도관 물질로서 다른 물질과 조합되어 사용될 수 있다. 그런 단일 필라멘트 스트랜드는 0,002 내지 0,015 인치 범위의 직경이지만, 물론 그 직경은 루멘 크기 및 필요한 지지 정도에 좌우되어 다양할 수 있다. 또한 항혈전제, 항혈소판제, 혈관확장제, 항증식제, 항이동제, 항섬유증제, 항염증제 및 더 구체적으로, 헤파린, 히루딘, 히룰로그, 에트리티네이트, 프레스콜린, 라파마이신, 시롤리머스, 파클리탁셀, 타크롤리머스, 덱사메타손, 사이토칼라신 D 및 악티노마이신 C 등디 도관에 부착될 수 있다. 임상적으로 사용되는 도관의 예는 본원에 참고 문헌으로 도입된 미국 특허 4,733,665, 미국 특허 4,800,882, 미국 특허 4,886,062에 개시되어 있다.

도관 이식편은, 또한 커버링된 도관으로 불리며, 통관 이식에 대하여, 서로 및 격자 세공과 다른 것을 포위하는 슬리브 중 선택된 하나와 맞닿은, 서로 선택된 축방향 배열로, 탄성의 튜브형 금속 또는 중합체계 단일 필라멘트의 브레이드간 격자 세공(interbraided latticework), 복수의 직물간 섬유 스트랜드로 성형된 튜브형 브레이드간 슬리브, 및 격자 세공과 슬리브를 함께 고정시키는 접착 성분을 포함하며, 그럼으로써 격자 세공이 구조적으로 슬리브를 지지하게 된다. 주어진 축방향 확장을 수행하는 방사상 감소의 양을 지배하는 실질적으로 동일한 관계에 따라 격자 세공과 슬리브가 행동하는 것이 확실하다. 슬리브는 격자 세공에 대해 외부 또는 내부일 수 있으며, 또는 격자 세공이 슬리브 중에 집적될 수 있으며, 그리고 그것은 연속적 또는 불연속적이다. 몇개의 보조 구조물이 상이한 종류의 스트랜드, 예컨대 다중 필라멘트 실, 단일 필라멘트, 가용성(fusible), 물질 및 콜라주(collages)와 조합되는 복잡한 브레이드 구조도 제안되었다. 예는 W091/10766에서 발견되었다. 섬유 스트랜드는 바람직하게는 다중 필라멘트 실이지만, 단일 필라멘트일 수 있다. 두 경우에, 약 10 데니어 내지 400 데니어 범위로서 섬유 스트랜드가 구조적 스트랜드보다 더 미세하다. 다중 필라멘트 실의 개별 필라멘트는 약 0.25 내지 약 10 데니어 범위일 수 있다. 다중 필라멘트 실은 다양한 물질, 예컨대 PET, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리우레탄, HDPE, 실리콘, PTFE, 폴리올레핀 및 ePTFE로 구성될 수 있다. 예컨대 꼬이지 않은 편평한 필라멘트는 더 얇은 벽을 제공하며, 실 사이의 더 작은 땀 간격은 더 낮은 투과성을 얻게 하며, 그리고 모세관의 이식편을 통과하는 성장에 대한 높은 실 교차-섹션 공극률과 같이 실을 변형시킴으로써 슬리브 품질을 변형시는 것이 가능하다. 다공성의 팽창된 PTFE 필름은 피브릴에 의해 서로 연결된 노드의 미세구조를 가지며 그리고 예컨대 미국 특허 3,953,566, 4,187,390 및 4,482,516에서 교시하는 바와 같이 만들어 질 수 있다. 외부 표면으로부터 출발하여 생체 물질을 통해 연장되는 작은 채널 또는 통로의 형태로 적절한 세공이 존재할 수 있다. 그런 경우에 세공의 단면 디멘션은 모세관의 직경 5 미크론보다 더 크고, 통상적으로 1 mm보다 더 적다. 생체 물질이 충분한 강성을 유지하는 한 더 큰 세공 크기 값은 중요하지 않지만, 약 1 mm 이상의 세공 크기를 갖는 유용한 장치는 없을 것 같다. 그런 세공 디멘션은 현미경으로 정량화될 수 있다. 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되는 바와 같이 임의의 다른 방법을 배제하지 않으면서, 예컨대, 단백질, 헤파린화되지 않은 전체 혈액 및 혈소판이 풍부한 혈장으로의 예비 코팅, 표면의 백열-방전 변형, 플루로닉 젤, 피브린 글루, 피브로넥틴, 접착 분자, 공유 결합의 추가, 예컨대 탄소를 이용한 표면 전하에 대한 영향 (5,827,327, 4,164,045), 및 계면 활성제 또는 세척제로의 처리, 기계적 특성의 변화 예컨대 홀을 뚫는 것, 홈을 추가하는 것 및 말단 각을 변화시키는 것과 같은 도관 이식편 물질 및 표면의 몇가지 변형예가 이루어질 수 있다. 또한, 내부 및 외부 표면으로 노드간 거리가 바깥쪽으로 60 미크론 및 안쪽으로 20 미크론과 같은 상이한 노드간 거리의 하이브리드 (하이브리드 PTFE)로서 이식물이 구조화될 수 있다. 상이한 노드간 거리를 갖는 더 더욱 많은 층이 사용될 수 있다. 원하지 않는 연결 조직 성장을 촉진하거나 또는 내피세포화를 억제하지 않는 때에는 그들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 해석된다. 피브릴은, 기본적으로 한 방향을향하는 단일-축 방향이거나 또는 1 이상의 방향으로 향하는 다중 축 방향일 수 있다. 용어 팽창된다는 다공성의 팽창된 PTFE를 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 생물학적 양립가능성을 갖는 임의의 물질이 본 발명 내에서 사용되도록 받아들여질 것이라는 것은 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되어야 한다. 임상적으로 사용되는 도관 이식편의 예는 미국 특허 5,957,974, 미국 특허 5,928,279, 미국 특허 5,925,075, 및 미국 특허 5,916,264에 개시되어 있다.

또한, 동맥, 정맥 및 장내 점막하 조직과 같은 자연 발생의 자가, 동종 또는 이종의 물질, 예컨대 제대 정맥, 복재 정맥, 또는 소의 천연 동맥이 도관 이식편에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물, 장치 및 방법과 연관되어 잠재적 생물 분해 가능 혈관 이식물, 예컨대 생물 분해 가능 및 화학적으로 정의된 폴리락트산, 폴리글리콜산, 정제된 단백질의 매트릭스, 반-정제된 세포 밖 매트릭스 조성물이 도관 이식편으로 사용될 수 있다. 적절한 혈관 이식편 및 도관 이식편은 둘 다 유전자 조성물을 운반하고 그리고 또한 새로운 내피세포 성장을 위한 표면을 제공하며, 즉, 내피 세포가 이동할 수 있으며 그리고 바람직하게는 원하지 않는 조직 성장 또는 재발협착증을 억제하는 인시투 스카폴딩으로서 작용하게 될 것이다. 생체내 구체예의 문맥상 연결 조직 형성이 억제될 수 있고 그리고 내피세포가 이동할 수 있는 스카폴드로 그들이 작용하고, 그리고 궁극적으로 이식물의 내피세포화를 상승시키는 한, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 이식되는 이식물의 특정 디자인은 중요하지 않다.

중재 도관 및 도관 이식편을 목적하는 부위에 전달하는데 있어 다양한 카테터 시스템이 유용하다. 본 발명의 방법이 사용되는 한 선택되는 유형은 중요하지 않다.

심장 밸브는 본 기술 분야에서 잘 알려져 있으며 심장의 펌핑 작용의 결과로서 혈류 역학적으로 작동한다. 일반적으로, 거기에는 내부 표면을 갖는 윤성형체(annular body)가 있으며, 이는 혈류의 통로로 정의되며, 미리 지정된 방향으로 혈류를 교대로 블로킹 및 이후 통과시키기 위한 것으로서, 그 위에 지지된 1 또는 다중 폐색을 갖는다. 심장 밸브 보조물은 다양한 상이한 디자인이며, 그리고 자가, 동종, 이종 또는 합성 물질이다. 기계적 밸브 윤성형 하우징, 또한 윤성형체라고도 불리며, 및 밸브 멤버는, 그들의 대상이 되는 웨어를 또한 취하여야 하는 생물학적 양립 가능 그리고 혈전을 생성하지 않는 임의의 물질로 이루어질 수 있다. 원형 밸브 하우징 및 구형 멤버 또는 공, 피벗 디스크(pivoting disc), 포펫 디스크(poppet disc) 및 리플렛(leaflet) 멤버, 예컨대 단일 또는 다중 리플렛 구조물, 예컨대 두 평평한 리플렛, 원추형, 반원추형 및 원통형 표면 리플렛과 같은 다양한 상이한 디자인이 있다. 오리피스 링(orifice ring)이 다양한 물질, 예컨대 파이로카본 코팅된 표면, 은 코팅 표면 또는 고체 열분해성 탄소로부터 이루어질 수 있으며 (미국 특허 4,443,894 기재), 그리고 리플렛은 하나의 기질, 예컨대 다결정형 흑연, 플라스틱, 금속 또는 임의의 다른 견고한 물질로 이루어질 수 있고, 그리고 이후 다른 열분해성 탄소와 같은 것으로 코팅된다 (예컨대 미국 특허 3,546,711, 및 미국 특허 3,579,645). 원형 밸브 하우징은 다공성 (여기서는 세공을 통해 유체가 흐르는 다공성 표면 및 표면 아래에 서로 연결된 격자간 세공을 갖는 것으로 언급됨, 미국 특허 4,936, 317 참조), 또는 무공성일 수 있으며, 그리고 적절한 수단, 예컨대 주변 홈 또는 한 쌍의 평면이 심장 밸브 심장 조직에 대한 심장 밸브의 바느질 또는 봉합을 촉진하기 위해 윤형체에 봉합 링을 접착시키기 위해 제공될 수 있다. 봉합 멤버는 견고한 윤형 멤버 또는 베이스를 포위하는 슬리브를 가질 수 있다. 슬리브는 견고한 물질, 예컨대 금속, 플라스틱 또는 유사한 것일 수 있다. 슬리브는 직물의 칼라(collar), 예컨대 테플론 또는 다크론 (RE31,400)을 가질 수 있다. 밸브는 추가의 멤버, 예컨대 쿠션 멤버(cushioning member) 및 충격-흡수 멤버를 가질 수 있다. 기계적 심장 밸브의 예는 미국 특허 3,546,711, 미국 특허 4,011,601, 미국 특허 4,425,670, 미국 특허 3,824,629, 미국 특허 4,725,275, 미국 특허 4,078,268, 미국 특허 4,159,543, 미국 특허 4,535,484, 미국 특허 4,692,165, 미국 특허 5,035,709, 및 미국 특허 5,037,434에 기재되어 있다.

이종 이식편, 동종 이식편 또는 자가 이식편이 조직 밸브로서 사용될 수 있다. 자가 이식편이 사용될 때, 일반적으로 폐 밸브는 대정맥 위치로 작동된다 - 로스 (Ross) 작동. 동종 이식편(allografts, homografts)은 시신 공급원이다. 이종 이식편 생물 보조물 심장 밸브는 일반적으로 돼지 공급원이다. 그들은 도관이 있거나 또는 도관이 없다. 종래의 도관화된밸브는 밸브 성분, 도관 어셈블리 및 봉합 링을 갖도록 디자인될 수 있다. 도관은 천으로 덮여있을 수 있다. 티타늄, 델린(Delrin), 폴리아세탈, 폴리프로필렌, 및 엘질로이를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 것으로서, 모든 공지된 도관 물질이 도관에 사용될 수 있다. 본 기술 분야에서 당업자에게 알려진 바와 같이, 조직 밸브를 조작하는데 있어 몇가지 방식이 있다. 예컨대 생물 보조물은 무세포로 만들어질 수 있으며 (Wilson, Ann. Thorac Surg., 1995; 60 (2 suppl): S353-8) 또는 예컨대 글루타르알데히드, 글리세롤 (호프만), 염료-매개 광산화 (Schoen, J. Heart Valve Dis., 1998; 7 (2): 174-9)에 의한 다양한 방식으로 보존되며, 그리고 만약 글루타르알데히드로 보존된다면, 글루타르알데히드는 아미노시약(aminoreagent)으로 중화될 수 있다 (예컨대 미국 특허 4,405,327). 동종 이식편은 내피세포화될 수 있다. 조직 심장 밸브의 예는 미국 특허 3,755,823, 미국 특허 4,441,216, 미국 특허 4,172,295, 미국 특허 4,192,020, 미국 특허 4,106,129, 미국 특허 4,501,030, 및 미국 특허 4,648,881에 기재되어 있다. 또한, 주제로 다루고 있는 대규모의 과학 문헌이 존재한다. 원하지 않는 연결 조직 성장을 억제하거나 또는 내피세포 성장을 허용하는데 있어 생물학적 양립가능성을 갖는 임의의 물질 또는 조직이 허용될 수 있음을 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되어야 한다. 다양한 방식으로 유전자가 심장 밸브 보조물에 부착될 수 있지만, 주변 조직에 의해 유전자가 취해지고 그리고 EC-SOD가 발현되고 그리고 과도한 연결 조직 형성 및 섬유증이 억제되거나 또는 혈관 신생이 자극되어 오리피스 링 및/또는 밸브 멤버 표면의 내피세포화를 초래하는 한, 그 방법은 중요하지 않다. 핵산 또는 핵산을 포함하는 조성물은 심장 밸브의 전체 또는 일부에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 조직 밸브에서 핵산은 전체 표면 및 도관 어셈블리에, 기계적 밸브에서는 윤형체 및 바느질 링에 부착되어야 한다.

조직 이식물은 다양한 물질, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 나일론, 폴리설폰, 셀룰로스의 혼합된 에스테르, 폴리비닐리덴 디플루오리드, 실리콘, 콜라겐 및 폴리아크릴로니트릴로 이루어질 수 있다. 조직 조작에 대한 바람직한 지지 물질은, 첨가 또는 축합 중합화로부터 제조되는 올리고머, 동종 중합체, 및 공중합체를 포함하는 합성 중합체이다. 조직 이식물의 예는 예컨대 미국 특허 5,314,471, 미국 특허 5,882,354, 미국 특허 5,874,099, 미국 특허 5,776,747, 및 미국 특허 5,855,613에 기재되어 있다. 내피세포 성장 및/또는 모세관화를 허용하는데 있어 생물학적 양립가능성을 갖는 임의의 물질이 허용되어야 한다는 것은 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되어야 한다. EC-SOD 유전자는 다양한 방법으로 이식물에 부착될 수 있지만, 주변 조직에 의해 유전자가 위해지고 그리고 EC-SOD가 생성되고 그리고 섬유증이 억제되거나 또는 혈관 신생이 자극되어 이식물의 내피세포화 및/또는 모세관화가 촉진되는 한, 그 방법은 중요하지 않다.

이식편 연결자로도 불리는 문합 장치에 대한 기본 배경은 미국 특허 5,904,697 및 미국 특허 5,868,763에 잘 기재되어 있다. 일반적으로, 문합 장치는 말단-대-말단 문합 또는 말단-대-측면 문합으로 사용된다. 본 발명은 말단-대-측면 문합 장치를 포함하며, 바람직하게는 앵커링 멤버(anchoring member)를 갖는 그런 문합 장치, 예컨대 SOLEM GraftConnectorTM가 타겟 혈관에 대해 구경내로 이식되고 그리고 혈액에 노출된다. 용어 "앵커링 멤버"는 본원에서 타겟 혈관과 접촉을 형성하는 멤버를 의미한다. 용어 "커플링 멤버" 또는 "연결 멤버"는 본원에서 우회 이식편 혈관과 접촉을 형성하는 멤버를 의미한다. 앵커링 멤버 및 커플링 멤버는 하나의 단일 단위를 형성할 수 있으며 또는 그 과정 동안 연결되도록 분리된다. 핸들및 핀과 같은 추가의 멤버도 포함될 수 있다. 구경 내 앵커링 멤버는 다양한 디자인일 수 있으며, 바람직하게는 튜브형 구조이다. 구경 내 앵커링 멤버는 금속, 세라믹, 플라스틱, 중합체, PTFE, DACRON, PET, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리우레탄, HDPE, 실리콘, 폴리올레핀 및 ePTFE 또는 몇가지 구조의 조합과 같은 임의의 생물학적 양립 가능 물질로 이루어질 수 있다. 또한 생물 분해 가능 또는 생물학적 흡수 가능 물질, 예컨대 동종 중합체 예컨대 폴리-파라디옥사논, 폴리라이신 또는 폴리글리콜산 및 공중합체 예컨대 폴리락트산 및 폴리글리콜산 또는 다른 생체 물질이 단독으로 또는 다른 물질과 조합되어 사용될 수 있다. 문합 장치는 다공성, 부분 다공성, 또는 무공성일 수 있으며. 바람직하게는 연결 멤버는 무공성이며 앵커링 멤버는 다공성이다. 대안적으로 연결 멤 버 및 앵커링 멤버 모두 다공성이다. 다공성이라면, 세공 모세관 직경의 단면 디멘션은 5 미크론 이상이며 통상적으로 1 mm 이하이다. 생체 물질이 충분한 강성을 유지하는 한 더 큰 세공 크기 값은 중요하지 않지만, 약 1 mm 이상의 세공 크기를 갖는 유용한 장치는 없을 것 같다. 그런 세공 디멘션은 현미경으로 정량화될 수 있다. 외부 표면으로부터 출발하여 생체 물질을 통해 연장되는 채널 또는 통로의 형태로 적절한 세공이 존재할 수 있다. 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되는 바와 같이 임의의 다른 방법을 배제하지 않으면서, 예컨대, 단백질, 헤파린화되지 않은 전체 혈액 및 혈소판이 풍부한 혈장으로의 예비 코팅, 표면의 백열-방전 변형, 플루로닉 젤, 피브린 글루, 피브로넥틴, 접착 분자, 공유 결합의 추가, 예컨대 탄소를 이용한 표면 전하에 대한 영향 (5,827,327, 4,164,045), 및 계면 활성제 또는 세척제로의 처리, 기계적인 표면 특성의 변화 예컨대 홈을 추가하는 것 및 말단 각을 변화시키는 것과 같은 이식편 연결자 디자인 물질 및 표면의 몇가지 변형예가 이루어질 수 있다. 또한, 내부 및 외부 표면으로 노드간 거리가 바깥쪽으로 60 미크론 및 안쪽으로 20 미크론과 같은 상이한 노드간 거리의 하이브리드 (하이브리드 PTFE)로서 이식물이 구조화될 수 있다. 상이한 노드간 거리를 갖는 더 더욱 많은 층이 사용될 수 있다. 내피세포화를 억제하지 않는 때에는 그들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 해석된다. 유전자는 다양한 방법으로 이식물에 부착될 수 있지만, 주변 조직에 의해 유전자가 취해지고 그리고 EC-SOD가 생성되고, 연결 조직 형성이 억제되고 혈관 신생이 촉진되어 이식물의 내피세포화 및/또는 모세관화를 초래하는 한, 그 방법은 중요하지 않다. 적절한 이식편 연결자는 유전자 조성물을 운반할 것이며 그리고 또한 새로운 내피세포 성장을 위한 표면을 제공하며, 즉, 내피 세포가 이동할 수 있는 인시투 스카폴딩으로서 작용하게 될 것이다. 생물학적 양립 가능성, 강성및 다공성을 갖는 임의의 물질이 이식편을 통과하는 성장을 허용하도록 허용될 수 있다는 것을 본 기술 분야의 당업자는 이해할 것이다.

봉합 물질은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 본원에서 "필라멘트"는 흡수 불가 또는 흡수 가능 물질의 단일, 길고, 얇은 유연성 구조를 의미한다. 그것은 연속적이거나 또는 스테이플(staple)이다. "흡수 가능" 필라멘트란 본원에서 포유 동물 조직에서 소화되거나 또는 용해되어 흡수된 것을 의미한다. 봉합은 단일 필라멘트 즉 일겹 필라멘트 스트랜드 또는 다겹 필라멘트 즉 여러개의 스트랜드가 브레이드된, 꼬여있거나 또는 다른 다겹 필라멘트 구조일 수 있으며 그리고 금속, 실크,린넨, 면 및 캣거트(catgut)와 같은 천연 물질, 및 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리우레탄, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 락티드와 글리콜리드의 공중합체와 같은 다양한 합성 물질로 이루어진다. 봉합은 다공성 (미국 특허 4,905,367, 미국 특허 4,281,669) 또는 무공성일 수 있으며 그리고 그들은 예컨대 미국 특허 4,185,637, 미국 특허 4,649,920, 미국 특허 4,201,216, 미국 특허 4,983,180, 및 미국 특허 4,711,241에 기재된 다양한 물질로 코팅될 수 있거나 또는 코팅되지 않는다. 핵산은 원치않는 연결 조직 성장을 억제하거나 또는 봉합의 내피세포화를 촉진하는 임의의 봉합 물질에 부착될 수 있다. 핵산의 부착은 합성의 흡수되지 않는 혈관 봉합에 특히 유용하다. 만약 다중 필라멘트 봉합이 코팅된다면, 봉합 내의 모든 필라멘트가 개별적으로 또는 완전히 코팅될 필요는 없다. 봉합 물질의 크기는 일반적으로 외경 0.599 mm의 12-0 U.S.P. 크기 0.001 mm 내지 크기 2 U.S.P. 사이의 범위이다. 봉합 물질은 한쪽 또는 양 말단에 니들이 있거나 또는 없을 수 있으며 그리고 막혀있는 홀, 즉, 봉합 니들의 축을 따라 그것에 근위 말단 면으로부터 연장되는 원통형 함요부 (cylindrical recess)의 윤곽을 잡는 것과 같은 본 기술 분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서라도 니들이 봉합 물질에 부착될 수 있다. 봉합-장착 부분의 길이는 일반적으로 홀의 길이와 동일하거나 또는 약간 더 크다. 봉합이 홀 내로 삽입되고 이후 봅합-장착 부분이 권축되며(crimped), 즉 일그러지거나 또는 압축되어, 봉합을 유지하게 된다. 대안적으로, 봉합은 그런 막힌 홀에 시멘트 물질을 추가함으로써 확고하게 된다 (예컨대 미국 특허 1,558,037). 또한 미국 특허 2,928,395, 미국 특허 3,394,704에서와 같은 접착제및 결합제가 사용될 수 있다. 미국 특허 4,910,377, 미국 특허 4,901,722, 미국 특허 4,890,614, 미국 특허 4,805,292, 및 미국 특허 5,102,418과 같은 다른 변형이 또한 수행될 수 있다. 수술용 니들 그 자체는 의학적으로 허용되는 요구되는 직경을 갖는 스테인레스 스틸과 같은 다양한 물질로 이루어 질 수 있다. 봉합을 자르거나 또는 절단하는 것, 또는 분리할 수 있거나 또는 제거할 수 있는 즉 수술자에 의해 발휘되는 힘에 대응하여 분리될 수 있는 것을 제외하고는 니들에 대한 봉합의 부착은, 즉 봉합이 안전하게 부착되고 니들로부터 분리될 수 있는 것으로 여겨지지 않는 표준일 수 있다 (미국 특허 3,890,975, 미국 특허 3,980,177, 및 미국 특허 5,102,418). 수술용 니들은 1/4 서클(circle), 3/8 서클, 1/2 커브(curve), 1/2 서클, 5/8 서클, 또는 직선형과 같은 다양한 형태일 수 있으며 그리고 니들 원위 지점(distal point)은 테이퍼링 지점(taper point), 테이퍼링 절단(taper cut), 역 절단(reverse cutting), 정밀 지점(precision point), 스파츌라-형(spatula-type) 등일 수 있다. 봉합 물질 또는 봉합의 코팅 조성물에 부착된 핵산의 양은 섬유의 구조, 예컨대 필라멘트의 수 및, 고체 또는 용액이 적용된 브레이드 또는 트위스트(twist) 및 조성물의 밀집도에 좌우되어 다양할 것이다. 연결 조직 과형성의 억제를 허용하는 생물학적 양립 가능성을 갖는 임의의 물질이 허용된다는 것이 본 기술 분야의 당업자에게 이해되어야 한다. 본 개시에 기재된 임의의 방법 또는 만약 바람직하다면 임의의 다른 방법에 의해서 유전자가 봉합에 부착될 수 있다. 유전자가 주변 조직에 의해 취해진 이후, EC-SOD가 생성되고 그리고 과도한 연결 조직 성장이 억제되고 그리고 내피세포화가 촉진되어 봉합 물질 표면의 내피세포화를 초래하게 된다.

수술용 플레지는 본 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 내피세포 성장을 허용하는 생물학적 양립 가능성을 갖는 임의의 물질이 허용된다는 것이 본 기술 분야의 당업자에게 이해되어야 한다. 본 개시에 기재된 임의의 방법 또는 임의의 다른 방법에 의해서 유전자가 수술용 플레지에 부착될 수 있다. 유전자가 주변 조직에 의해 취해진 이후, EC-SOD가 생성되고 그리고 과도한 연결 조직 성장이 억제되고 그리고 혈관 신생이 촉진되어 이식물의 내피세포화를 초래하게 된다.

상기 혈관 또는 조직 이식물을 선택하는데 있어, 본 기술 분야에서 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 예컨대 생물학적 양립 가능성, 생물 분해 가능성, 강도, 강성, 다공성, 계면 특성, 내구성 및 심지어 외관과 같은 물리적 및 화학적 성질이 고려될 수 있다. 또한 본 발명의 중요한 양태는, 이식물 자체 및 조직 챔버, 페이스메이커 와이어, 오랫 동안 사용하기 위한 혈관 내재 카테터 등과 같은 이식물의 기능적 부분을 포함하는, 과도한 연결성 또는 섬유근 조직 성장의 회피 또는 계면과 조직의 혈관화의 장점을 갖는 다른 이식물과 연결하여 그것을 사용하는 것이다. 그 표면은 코팅될 수 있으며 또는 핵산 또는 핵산에 친화력을 갖는 물질로 세공이 채워질 수 있으며, 그리고 이후 코팅된 표면은 전이되고자 하는 유전자 또는 핵산으로 더 코팅될 수 있다. 흡수제의 유효한 화학물질 군은, 그것의 핵산에 대한 친화력을 제어하기 위해 용이하게 조작될 수 있으며, 본 기술 분야에서 당업자에게 공지되어 있다.

실험 영역

실시예 1

토끼 및 도관

방법

예

EC-SOD 발현 플라스미드

토끼 폐 cDNA 라이브러리 (Clontech # TL1O1Oa)가 부분 토끼 EC-SOD cDNA (genbank X78139; EC-SOD 암호화 염기 126-465)를 프로브로 사용하는 플라그 하이브리드화에 의해 스크리닝되었다 (Hiltunen et al., 1995, Hiltunen, T., Luoma, J., Nikkari, T. and Yla-Herttuala, S.: Induction of 15-lipoxygenase mRNA and protein in early atherosclerotic lesions. Circulation 92 (1995) 3297- 3303). 포지티브 클론이 표준 방법으로 정제되었고 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J. and Struhl, K. (eds.): Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc., USA, 1995) EC-SOD cDNA의 3' 영역을 포함하는 것이 발견되었다. 코딩 서열의 5' 말단을 토끼 게놈 DNA로부터 EC-SOD 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다 (genbank AJ007044); 5'-GAT GCT GGC GTT GGT GTG CTC-3' / 5'-GCA CGG CCA GCG GGT TGT AGT-3'. cDNA의 5' 및 3' 단편을 연속하여 결찰하여 EC-SOD 유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 생성시키고 그것이 이후 신장팩터 1α 프로모터 (pEC-SOD1α) 하에서 pHHT631 발현 벡터로 서브클로닝되었다 (Mizushima, S. and Nagata, S.: pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic. Acids. Res. 18 (1990) 5322). ALF 자동화 DNA 시퀀서(sequencer) (Pharmacia)를 사용하여 DNA 시퀀싱이 수행되었으며, 그리고 GCG 프로그랜 패키지로 서열 분석이 수행되었다 (Devereux, J., Haeberli, P. and Smithies, O.: A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic. Acids. Res. 12 (1984) 387-395). 전술한 바와 같은 아데노바이러스 구조에 대해 pEC-SOD 1α의 발현 카세트가 아데노바이러스 벡터 (AdBgIII) 내로 추가로 클로닝되었다 (Kozarsky, K. F. and Wilson, J. M.: Gene therapy: adenovirus vectors. Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (1993) 499-503).

아데노바이러스 제조

신장 팩터 1-α (Laukanen et al., 유전자 2000, Vol 254, pag 173-179) 프로모터를 포함하는 EC-SOD 발현 카세트가 아데노바이러스 벡터 (AdBgIII) 내에서 클로닝 되었다. 도 2 참조. 핵-타겟 LacZ 아데노바이러스가 대조군으로서 사용되었다 (Laitinen et al., Hum Gene Ther. 1998, Vol 9, pg 1481-1486). 임상-그레이드 아데노바이러스가 293 세포로 생성되었으며 미생물적인 오염, 마이코플라즈마, 내독소(endotoxin), 및 복제-저항 바이러스가 없는 것으로 분석되었다.

동물 실험

동형접합성 와타나베 유전성 고지방혈증 (WHHL) 성인 토끼 (Finnish National Experimental animal Center, Kuopio, Finland)를 표준 식이로 유지시켰다 (K2 special, 락타민 AB, Sweden). 일일 ASA 추정 투약량 10 mg/day가 되도록 아세틸살리실산을 음료수에 첨가하였다. EC-SOD (n=8) 또는 LacZ (n=8)로 유전자 전이 후 이어서 4 주 동안 동물을 유지시켰다. 0.25 ml/kg (펜타닐 0,315 mg/mL 플루아노신 10 mg/mL 혼합물, Hypnorm[등록 상표], Janssen) 피하 주사와 0.25 ml/kg 정맥 주사 (미다졸람 5 mg/ml, Dormicum[등록 상표], Roche)의 조합으로 동물을 마취시켰다. 대퇴 동맥 절개로부터 말단 동맥 절개(endarterectomy) 카테터 (3F Sorin Medical)의 반복되는 통과에 의해 전체 대동맥을 내피세포로부터 드러내었다. 3일 후 동물을 다시 마취시켰다. 정맥 주사 헤파린화 이후 2 cm 원(infra)-신동맥 세그먼트가 Infiltrator[등록 상표] 카테터 (Boston Scientific)로 형질 감염되고 (3×10⁹pfu/kg) 그리고 혈관 내 도관이 적용되었다 (1.1 도관 대 동맥 비, Guidant Corporation). 후처리 이후 동물이 마취제의 과투약으로 희생되었으며 도관이 있고 그리고 도관이 없는 근위 혈관 섹션을 수집하고 다음 분석을 위해 진행하였다.

조직학적 분석

손상되지 않은 혈관 세그먼트를 제거하고, 식염수로 부드럽게 세척하고, 그리고 24시간 동안 4% 중성 완충된 포르말린으로 일괄하여 담금-고정시켰다. 고정된 시료가 등급화된 일련의 에탄올에서 탈수되고 메틸 메타크릴레이트 (MMA)와 자일렌의 1:1 용액으로 그리고, 최종적으로, MMA (4℃, 각각 12 시간)로 침투되었다. 이후, 시료가 플라스틱 튜브에서 －4℃에서 중합화되었다. 이들 1급 메타크릴레이트블럭을 4 mm 두께 세그먼트로 절단하였다 (결과적으로 동물 당 4 내지 6 세그먼트). 세그먼트를 내장형 몰드(embedding molds) 내에 위치시키고, 그리고 블럭의 중합화가 －4℃에서 다시 수행되었다. 절단 표면에 더 가까운 조직 성분을 가져오도록 중합화된 블럭을 먼저 갈았다. Microm 회전 마이크로톰(microtome) 상에서 경질 조직 블레이드로 연속하는 섹션 (2-5 ㎛)의 MMA 블럭을 절단하였다. 80% 에탄올의 액적에 담근 후에, 섹션을 Superfrost 유리 슬라이드 (Menzel-Glaser) 상에 폴딩이 없는 상태로 펼치고, 폴리에틸렌 시트 및 몇 층의 필터 페이퍼로 덮고, 그리고 유리 슬라이드 상에 꽉 밀착시키고, 압력 하에서 42℃에서 밤새 유지시켰다. 2-메톡시에틸 아세테이트에서 5 회 15 분 동안 디플라스티네이션(deplastination)이 수행되었다. 등급화된 에탄올 용액 및 1 mmol/L PBS로 색션의 재 수화가 수행되었다. 톨루이딘 블루, 헤마톡실린 및 에오신, Masson's 트리크롬 및 Elastic van Gieson 스테이닝이 표준 조직병리학적 방법에 따라 수행되었다. (Cotran RS, Kumar V, Robbins SL. Robbins Pathologic Basis of Disease. Philadelphia, Pa: WB Saunders Co; 1994.)

Zeiss 현미경 (Axioplan), MRC 디지탈 카메라 및 KS 소프트웨어 (Rel. 4.0)를 사용하여 신생 동맥내막, 이미 존재하는 죽상 경화증 병소 및 매질의 두께가 디지탈화된 사진 상에서 측정되었다. 전체 동맥내막에 대한 신생 동맥내막의 비가 계산되었다. 내피 세포 (PECAM) 적용 범위 및 염증 세포 (마크로파지) 침투가 각각 구경 단면적 퍼센트 및 동맥내막 단면적 퍼센트로서 정량화되었다. 치료된 군과 대조군의 평균 값이 각 동물의 메디안 값으로부터 계산되었다. 다음의 항체가 사용되었다: PECAM (내피세포, 희석 1:50, Santa Cruz), RAM 11 (마크로파지, 희석 1:200, DAKO), HHF35 (평활근 세포 [SMCs], 희석 1:50, DAKO). 시그날 검출을 위해 아비딘-바이오틴-양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제 시스템이 DAB와 더불어 사용되었다 (Vector Elite Kit).

부검 분석

국립 수의학 및 식품 연구소 (National Veterinary and Food Research Institute, Kuopio Department, Finland)에서, P. Syrjala, DVM에 의해 부검 분석이 수행되었다.

통계적 분석

필요시, 비모수적(nonparametric) Mann-Whitney U-테스트 또는 스튜던트 T 테스트에 의해 군 간의 차이가 분석되었다. 변수 사이의 관계를 평가하는데 있어 Spearman (또는 필요시 Pearson) 상관 계수가 산출되었다. 모든 데이타는 평균 ± 표준 편차 (SD) 및/또는 표준 오차 (SE)로 나타내었다. 만약 p-값이 < 0.05 라면 차이가 현저한 것으로 고려된다. Kolmogorov-Smirnov 및 Chi-Square 테스트에 의해 분포 피팅(fitting)의 분석이 수행되었다.

결과

조직학적 분석

동맥내막 형성, 재-내피세포화 및 염증 세포 침입에 대한 국소적 EC-SOD 유전자 전이의 효과를 측정하기 위해 4-주 시간 지점에서 유전자 전이 부위가 조직학적으로 분석되었다. 죽상경화증 질환이 이미 존재하는 군과 그 안에 마크로파지 함량은 정도에 있어서 차이가 없었다. EC-SOD 동물에서 대조군 동물에 비해, 도관화 이전에 죽상경화 병소 형성에 의해 상대적으로 영향이 미치지 않는 혈관 세그먼트 뿐 아니라 이미 존재하는 죽상경화 병소를 갖는 세그먼트에서 모두 신생 동맥내막 형성이 명백하게 (P < 0.05) 감소되었다 (표 1, 도 1).

재발협착증 형성의 결과

	LacZ	ecSOD
재발협착증 (㎛, 매질 상에서의 스트럿(strut))	115.8 ± 34.4	8.9 ± 20.5
재발협착증 (㎛, qudth 상에서의 스트럿(strut))	228.9 ± 92.5	61.6 ± 10
재발협착증 / 병소 비율	5.4 ± 4.6	1.4 ± 0.8

실시예 2

돼지 및 플라스미드

방법

플라스미드 제조

인간 EC-SOD에 대한 서열이 pNGVL3 플라스미드 벡터 (National Gene Vectror Laboratories, USA) 내에서 클로닝되었다. 플라스미드 제조

인간 EC-SOD cDNA에 대한 코딩 서열이 pOTB7 플라스미드 벡터 (Acc.nr.BC0144418, 클론 MGC:20077 IMAGE:4644224)로부터 EcoRI 및 PstI 제한 효소를 사용하여 얻어졌으며 pNGVL3 플라스미드 벡터 (National Gene Vectror Laboratories, USA) 내에서 추가로 클로닝되었다.

핵-타겟화 LacZ 플라스미드 (pNGVL3)가 대조군으로서 사용되었다.

동물 실험

스웨덴 구텐베르그 대학 윤리 위원회(ethics committee of Gothenburg University, Sweden)에 의해 동물 작업이 승인되었다. 정상 식이 음식물을 먹인 가축용 돼지 4마리 (중량, 20 내지 30 kg)의 좌우 장골 동맥 외부에 8개의 도관이 이식되었다. 도관 장착 전날에 경구로 도입 투약량(loading dose)의 ASA 및 클로피도그렐으로 동물을 전-약물 처리하였으며 14일 후속 기간에 걸쳐 1일 투약량 치료가 계속되었다. 마취 유도에 케타민 (20 mg/kg IM) 및 실라진 (4 mg/kg IM)이 사용되었다. 흡입 마취제의 사용으로 전신 마취가 유지되었다. 9F 시스가 우측 경동맥에 역행으로 위치되었다. 헤파린의 볼러스(bolus) (150 U/kg)가 동맥 내로 투여되었다. 원위 대동맥 및 장골 혈관 조영법이 수행되었으며 근위 장골 동맥도 유도(guiding) 카테터로 개입되었다. 0.014-in 높은-토크(torque) 플로피 가이드 와이어 (Advanced Cardiovascular Systems)가 형광 현미경 하에서 대퇴부 동맥에 심어졌다. Infiltrator[등록 상표] 카테터 (Boston Scientific)로 5-cm 동맥 세그먼트를 (PBS 중의 2000 ㎍ 플라스미드 3회 주사로 나누어) 형질 감염시켰다. EC-SOD (n=2) 또는 대조군 처리 (n=2)로 동물이 도관화의 대상이 되었다. 도관화된 혈관 세그먼트에서 활발한 신생 동맥내막 형성을 얻기 위하여 긴 도관을 선택하였으며 혈관 세그먼트를 과팽창시키고 그리고 동맥 비 1.5에 대한 풍선 (도관)을 얻기 위한 시도로 도관 크기에 대한 유도 카테터가 참고로 사용되었다. 혈관 내 도관 (50 mm 길이)의 장착이 완료되었다. 맞은편 장골 동맥에서 이후 그 과정이 반복되었다.개방성을 확인하는데 있어 장착 이후 혈관 조영술이 완료되었다. 동물에게 회복이 허용되었으며 보호 시설로 돌려보냈다. 모든 동물을 정상적인 실험실 식이로 유지하였다. 이식 14일 후 혈관 조영술을 위해 카테터 연구 실험실로 동물을 돌려보냈다. 후속 혈관 조영술 완료 이후, 마취제의 과투약으로 동물이 안락사되었다. 혈관 세그먼트의 거시적 병소 검사에 의해 혈관 조영술 발견이 증명되었다.

결과

EC-SOD 처리된 동물 4 마리의 4 도관화된 혈관이 2 주 후속 기간 후에 드러낸 채 유지되었다. 대조적으로, 4 도관 중 2개 (각각 대조군 처리된 동물에서 하나씩)가 대조군 동물에서 폐색되었다.

실시예 3

정맥 이식편 실험

동물

뉴질랜드 흰토끼가 자유롭게 물과 더불어 정상 또는 혈관 신생 식이로 유지되었다. 0.25 ml/kg (펜타닐 0,315 mg/mL 플루아노신 10 mg/mL 혼합물, Hypnorm[등록상표], Janssen) 피하주사와 0.25 ml/kg 정맥 주사 (미다졸람 5 mg/ml, Dormicum[등록상표], Roche)의 조합으로 수술용 마취가 도입되었다. 모든 과정은 윤리 위원회 기구에 의해 승인되었다. 경정맥 세그먼트가 채집되었으며 혈관 세그먼트가 체외에서 EC-SOD 또는 대조군 벡터로 형질 감염되었으며 말단-대-말단 경향에 역행으로 동측 관상 동맥 내로 문합되었다. 이 과정 이후 다양한 시간 지점에서, 동물들이 마취제의 과투약으로 사망하였다.

혈관 채집 및 분석

수술 이후 미리 지정된 시간 지점에서 정맥 이식편을 채집하였다. 동물을 마취시키고, 혈관을 절개하였다. 존재하는 임의의 트롬빈이 제거되지 않도록 신선한 혈관 세그먼트를 조심스럽게 세정하였으며 초과산화물, 전이 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위해 계속 진행시켰다. 표준 조직 병리학적 방법에 따라 수행된 스테이닝 및 면역 스테이닝된 혈관 섹션 상에서 컴퓨터화된 형태계측학에 의해 정맥-이식편 비대, 내피 세포 보전 및 염증 침투가 정량화되었다. (Cotran RS, Kumar V, Robbins SL. Robbins Pathologic Basis of Disease. Philadelphia, Pa: WB Saunders Co; 1994.).

실시예 4

합성 이식편 실험

동물

뉴질랜드 흰토끼가 자유롭게 물과 더불어 정상 또는 혈관 신생 식이로 유지되었다. 0.25 ml/kg (펜타닐 0,315 mg/mL 플루아노신 10 mg/mL 혼합물, Hypnorm[등록상표], Janssen) 피하주사와 0.25 ml/kg 정맥 주사 (미다졸람 5 mg/ml, Dormicum[등록상표], Roche)의 조합으로 수술용 마취가 도입되었다. 모든 과정은 윤리 위원회 기구에 의해 승인되었다. 원-신장 대동맥 세그먼트가 노출되었으며 합성 혈관 이식편이 말단-대-말단 경향으로 이식되었다. 포위 조직이 EC-SOD 또는 대조군 벡터로 형질 감염되었다. 이 과정 이후 다양한 시간 지점에서, 동물들이 마취제의 과투약으로 사망하였다.

채집 및 분석

수술 이후 미리 지정된 시간 지점에서 이식편이 삽입된 혈관 세그먼트를 채집하였다. 동물을 마취시키고, 혈관을 절개하였다. 존재하는 임의의 트롬빈이 제거되지 않도록 신선한 혈관 세그먼트를 조심스럽게 세정하였으며 초과산화물, 전이 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위해 계속 진행시켰다. 표준 조직 병리학적 방법에 따라 수행된 스테이닝 및 면역 스테이닝된 혈관 섹션 상에서 컴퓨터화된 형태계측학에 의해 신생 동맥내막 형성, 내피 세포 보전 및 염증 침투가 정량화되었다. (Cotran RS, Kumar V, Robbins SL. Robbins Pathologic Basis of Disease. Philadelphia, Pa: WB Saunders Co; 1994.).

실시예 5

보조 이식물 실험

본 실시예는 VEGF 플라스미드가 투여되었을 때 피브로넥틴 예비코팅의 유무에 따른 심장 밸브 표면의 신속한 내피세포화를 보여준다. 또한 이식물의 증가된 모세관화를 알 수 있다.

방법

의료용 이식물에 사용되거나 또는 사용될 것으로 여겨지는 보조 물질을 멸균 식염 용액 (0.9 %)으로 세정하였다. 이후 멸균 조건에서 그 물질을 대략 1 cm²조각으로 분할하였다.

수술 과정 및 희생:

동물을 Hypnorm[등록 상표] (1 부), Dormicum[등록 상표] (1 부) 및 2 부의 멸균수 (0.33ml/lOOg 중량 래트)의 혼합물의 복강주사 투여로 마취시켰다. 배를 가르고 드러내었다. 2 mL의 부피바카인이 상처 영역에 투여되었다. 연속 5-0 나일론으로 중심선의 양 측면 상에서 복막에 대해 그 물질을 꿰맸다. 구동(running) 5-0 단일 필라멘트 봉합으로 각 조각이 분리되어 벽 상에 부착되었다. 첫번째 반을 포위하는 조직이 EC-SOD로 형질 감염되었으며, 두번째 반을 포위하는 조직이 대조군 (LacZ) 벡터로 형질 감염되었다. 3-0으로 층에서 배를 닫았다. 이식물 물질 조각으로 배 벽을 외식한 이후 동물이 희생되었다.

분석

매 조각을 중심에서 분할하였다. 그 물질의 반을 2% 파라포름알데히드 / 2% 글루타르알데히드로 보존 이후 전자 현미경으로 보냈다. 두번째 반을 4% 포르말린으로 보존 이후 광학 현미경으로 검사하였으며 내피세포, 평활근 세포, 연결 조직 특이적 및 염증 세포 마커로 면역 스테이닝하였다. 모세관 내피세포화 및 연결 조직 형성에 대한 컴퓨터 보조된 형태계측학에 의해 조직 반응이 정량화되었다.

Claims (39)

1. 포유 동물의 생체에 도입될 때 혈액, 체액 및/또는 조직과 적어도 일부 접촉하는 것인 향상된 생물학적 성능을 갖는 의료 장치로서, 이 장치는 코어(core) 및 생물학적 양립 가능 매질 중에 존재하는 핵산을 포함하며,

   상기 핵산이, 세포밖 초과산화물 디스뮤타제 (extracellular superoxide dismutase) (EC-SOD) 단백질의 생성을 초래할 수 있는 번역 또는 전사 생성물을 암호화하며, 이는 상기 코어의 1 이상의 합성 표면 상에서 적어도 부분적으로 생체내에서 과형성 연결 조직 또는 섬유근 형성을 억제할 수 있고, 염증을 억제할 수 있고 그리고/또는 내포세피화를 촉진시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 것인 장치.
2. 포유 동물 생체에 도입될 때 혈액, 체액 및/또는 조직과 적어도 부분적으로 접촉하는 향상된 생물학적 성능을 갖는 의료 장치로서, 그 장치는 코어 및 생물학적 양립 가능 매질 중에 존재하는 EC-SOD 단백질을 포함하며,

   EC-SOD 단백질이, 상기 코어의 1 이상의 합성 표면 상에서 적어도 부분적으로 생체내에서 과형성 연결 조직 형성을 억제할 수 있고, 염증을 억제할 수 있고 그리고/또는 내피세포화를 촉진할 수 있는 것을 특징으로 하는 것인 장치.
3. 제1항에 있어서, 핵산이 생물학적 양립 가능 매질 중에 네이키드 형(naked form)으로 존재하는 것인 장치.
4. 제1항에 있어서, 핵산이 레트로바이러스, 센다이(Sendai) 바이러스, 아데노 연관 바이러스 (adeno associated virus)및 아데노바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터 중에 도입되는 것인 장치.
5. 제1항에 있어서, 핵산이 리포좀 중에 존재하는 것인 장치.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 양립 가능 매질이 생물학적 안정 중합체, 생물학적 흡수 가능 중합체, 생체 분자, 하이드로겔(hydrogel) 중합체 또는 피브린인 장치.
7. 제1항에 있어서, 포유 동물의 생체에 핵산의 연속적인 전달이 가능하도록 상기 코어로부터 분리된 저장소(reservoir) 중에 핵산을 포함하는 장치.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산이 이온 결합 또는 공유 결합으로 코어에 부착된 것인 장치.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 합성 표면이 무공성(nonporous)인 장치.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 합성 표면이 다공성이고 그리고 세공을 통해 모세관 및 내피 세포 성장을 허용하는 것인 장치.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 심혈관계 이식물인 장치.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 혈관 이식편 (vascular graft)인 장치.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 혈관내 이식물 (endovascular implant)인 장치.
14. 제13항에 있어서, 도관(stent)인 장치.
15. 제13항에 있어서, 도관 이식편인 장치.
16. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이식편 연결자 (implant connector)인 장치.
17. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조직 이식물인 장치.
18. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바이오센서(biosensor)인 장치.
19. 포유 동물 생체의 합성 표면에 대한 생물학적 양립가능성을 향상시키는 방법으로서, 그 방법은 1 이상의 합성 표면을 포함하는 장치를 혈액, 체액 및/또는 조직과 적어도 부분적으로 접촉하도록 생체 중에 도입하는 것 그리고 생물학적 양립 가능 매질 중에 존재하는 핵산을 그것의 주변에 투여하는 것을 포함하며,

    여기서 핵산이 상기 합성 표면 상에서 적어도 부분적으로 생체내에서 EC-SOD 생성을 증가시킬 수 있고 그리고 과형성 연결 조직 성장을 억제할 수 있고, 염증을 억제할 수 있고 그리고/또는 내포세피화를 촉진시시킬 수 있는 번역 또는 전사 생성물을 암호화하며, 상기 핵산의 투여는 생체 중에 장치의 도입 이전에, 동시에 또는 이후에 수행되는 것인 방법.
20. 제17항에 있어서, 핵산이 네이키드 형으로 투여되는 것인 방법.
21. 제17항에 있어서, 핵산이 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노 연관 바이러스 및 아데노바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터 중에 투여되는 것인 방법.
22. 제17항에 있어서, 핵산이 리포좀 중에 투여되는 것인 방법.
23. 제17항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산이 포유 동물의 생체 중에 장치를 도입하기 이전, 도입하는 동안 또는 도입 이후에 포유 동물의 전신으로 투여되는 것인 방법.
24. 제17항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산이 포유 동물의 생체 중에 장치를 도입하기 이전, 도입하는 동안 또는 도입 이후에 장치의 주변으로 투여되는 것인 방법.
25. 제17항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산이 포유 동물의 생체 중에 장치를 도입하기 이전에 장치에 투여되는 것인 방법.
26. 제24항에 있어서, 핵산이 이온 결합 또는 공유 결합으로 코어에 부착되는 것인 방법.
27. 제17항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 양립 가능 매질이 생물학적 안정 중합체, 생물학적 흡수 가능 중합체, 생체 분자, 하이드로겔 중합체 또는 피브린인 방법.
28. 제17항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산을 투여하는 단계가 1회 이상 반복되는 것인 방법.
29. 제17항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 포유 동물 생체가 인간 생체인 방법.
30. 제17항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 그 장치가 심혈관계 수술에 사용되는 이식물인 방법.
31. 제17항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 그 장치가 생체의 일부를 대신하는 것인 방법.
32. 제17항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 그 장치가 혈관내 이식물인 방법.
33. 제17항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 그 장치가 조직 이식물인 방법.
34. 제17항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 그 장치가 바이오센서인 방법.
35. 포유 동물 생체에 도입될 때 혈액, 체액 및/또는 조직과 적어도 부분적으로 접촉하는 향상된 생물학적 성능을 갖는 의료 장치를 제조하는 방법으로서,

    합성 물질의 1 이상의 표면을 포함하는 코어를 제공하는 것; 그리고 생물학적 양립 가능 매질 중의 핵산을 제공하는 것을 포함하며,

    핵산이 핵산이 상기 코어의 1 이상의 표면 상에서 적어도 부분적으로 생체내에서 SOD 생성을 증가시킬 수 있고 그리고 과형성 연결 조직 성장을 억제할 수 있고, 염증을 억제할 수 있고 그리고/또는 내포세피화를 촉진시시킬 수 있는 번역 또는 전사 생성물을 암호화하는 것인 방법.
36. 제34항에 있어서, 핵산이 이온 결합 또는 공유 결합으로 코어에 부착되는 것인 방법.
37. 제34항에 있어서, 핵산이 포유 동물 생체 내로 도입 이후 코어의 주변에 1회 이상 핵산의 첨가가 가능한 코어로부터 분리된 저장소 중에 제공되는 것인 방법.
38. 의료 장치의 합성 표면의 생물학적 성능을 향상시키기 위한 EC-SOD을 암호화하는 핵산의 용도로서,

    여기서 상기 생물학적 양립 가능 매질 중의 핵산이 용액 또는 젤 형으로 상기 표면과 접촉되며, 그럼으로써 생체내에서 합성 표면 상에서 적어도 부분적으로 과형성 연결 조직 성장을 억제하고, 염증을 억제하고 그리고/또는 내피세포화를 촉진하는 것이 가능한 것인 용도.
39. 의료 장치의 합성 표면의 생물학적 성능을 향상시키기 위한 EC-SOD 단백질의 용도로서,

    여기서 상기 생물학적 양립 가능 매질 중의 단백질이 용액 또는 젤 형으로 상기 표면과 접촉되며, 그럼으로써 생체내에서 합성 표면 상에서 적어도 부분적으로 과형성 연결 조직 성장을 억제하고, 염증을 억제하고 그리고/또는 내피세포화를 촉진하는 것이 가능한 것인 용도.