CN1239133C - 医疗装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有改良生物学特性的医疗装置，该装置在进入一个哺乳动物体内时至少部分与血液、体液和/或组织接触，该装置包括一个核心和一个存在于生物相容介质中的核酸。所述的核酸编码一个翻译或转录产物，该产物可以在体内促进在所述核心的一个至少部分人造表面内皮化。本发明还涉及根据本发明制造一种医疗装置的方法。进一步，本发明还涉及一种改善哺乳动物，优选人，的机体与一个人造表面的生物相容性的方法，该方法包括将根据本发明的一种装置引入机体内，至少部分与血液、体液和/或组织接触，以及将存在于生物相容性介质中的核酸释放到其周围。所述的核酸编码一个能够在体内所述至少部分人造表面上促进内皮化的一个翻译或转录产物。在可以选择的实施方案中核酸的应用可在将该装置引入机体之前、同时或之后进行。另外，本发明也包括这些实施方案的组合形式。

Description

医疗装置

技术领域

本发明涉及一种适合植入人体或动物体内的医疗装置，如可植入的修复装置，一种改善人或动物体对包括至少一个合成表面的医疗装置接受性的方法，以及制造根据本发明装置的方法。

背景技术

机体患病和损伤的部分最好采用一个生物体自己的组织来修复或替换。内科医生和外科医生经常通过细致和复杂的医疗操作过程来替换组织，器官或骨。适合的供体组织一般随处可得；或是来自受体自身(自体移植)；或是来自其他供体(异体移植)；或，在某些情况下，来自其他物种的供体(异种移植)。组织移植是昂贵的，要经受极高的失败率、增加疾病传播的危险性和供体组织的供应不足等因素困扰。因此，为了解决目前移植中的问题，采用通过组织工程技术制造的人工或合成的医用植入装置，已经成为广泛关注的主题。

虽然在某些情况下植入装置可作为基于供体的移植物的替换，但它们经常由于植入物与机体的不相容性产生不太满意的结果，并不能正常发挥作用。缺乏正常细胞连接的血管移植物的合成表面会面临一些问题，可以增加血栓，增生和其他医疗/外科操作并发症的危险性。血管移植物需要不引起血栓形成的表面。血管植入物材料必须具有生物相容性的表面，仅允许血小板与血管的内表面发生最小的反应；同时，在血管壁-血流界面上具有正确的流体动力学以消除或减少不需要的紊乱和涡流形成。在其他类型的植入物中可发生不需要的纤维形成，包裹移植物。然后植入物功能丧失、其他医学并发症的危险性增加。

心血管领域是经常使用植入物或移植物的一个特殊领域。心血管疾病影响了很大部分的人群，并是社会中高发病率，高费用和高死亡率的一个原因。在美国大约6000万成人患有心血管疾病，是美国死亡的主要原因。每年有100万人发生心肌梗塞或心脏病发作，其中每年有200000人死亡。间歇性跛行有很高的发病率，对于缺血性疾病每年有150000人需要进行下肢截肢术，其围手术期的死亡率很高。中枢性血管疾病，中风和出血也有很高的发病率、治疗费用和死亡率。每年有100万透析患者，为了给透析手术创建通路需要做200000个动静脉瘘手术。

冠脉和外周血管疾病的特征是为器官提供血流和营养的血管发生了阻塞。其他显著的疾病组是动脉瘤，即血管的局部扩张，假性动脉瘤，和血管壁的破裂。有药物，手术和经皮治疗的方法来治疗这些疾病。在缺血性心脏疾病的药物治疗中，其目标是使血液不容易凝结，并通过血管扩张增加血流或减少氧耗。

心血管疾病的外科治疗是采用血管移植物或贴片来制造旁路，替换或重建病变血管。可选择的是，血管可以采用腔内植入物经皮或手术处理，这些植入物如可调节的支架结构支撑物，管状移植物或其组合物。经皮方法的内容是在一个阻塞的血管被重新开放后采用气囊血管成形术，激光血管成形术，动脉粥样硬化切除术，旋转切除术，介入性手术，血栓溶解术，或将这些治疗方法组合来维持血管的开放。支架和管状移植物也可用来去除局部的血管扩张或破裂。

在冠状动脉手术中，阻塞的血管采用一条自体的血管移植物来建立旁路。这种手术称为CABG，意思是冠状动脉旁路移植术。心内贴片用来修复心间隔或壁的孔洞。在外周动脉手术中，经常植入移植物来对阻塞建立旁路，例如从腹股沟至大腿。在一些情况下，动脉片段可选择性的采用一个血管移植物来替换。人造血管贴片可用于一些血管外科的手术中，这些手术需要切开血管壁，如血栓切除术，动脉内膜切除术，动脉瘤修复和血管重建。在经皮血管再建中，具有气囊，支架或支架性移植物的导管可用来在不同解剖部位减少狭窄或去除扩张或破裂，这些解剖部位如中枢，冠状，肾，其他外周动脉和静脉和主动脉。气囊扩张，支架和支架移植物也在其他部位应用，如胆管分支，食管，肠，气管支气管分支和尿道。在透析的通路手术中，需要建立一个通路来与透析机一起清除血液。通常在上肢动静脉之间建立一个称为瘘的连接，以建立透析所需的高血流。

每年植入的血管移植物超过350000个，已经开发出大量的人工生物材料作为血管替代物。与自体材料比较，作为外源性材料的移植物易引起血栓，更易形成凝块。为了克服血栓形成，大多数方法集中在建立一个抗血栓的表面，这些方法大多数方向是改良的聚合体表面。研究证明所选择的材料，如Dacron和ePTFE(多孔聚四氟乙烯)，可成功的插入到动物模型的大和小口径动脉中(zdrahala，J Biomater Appl1996；10：309-29)。在人类，Dacron和ePTFE人造血管在大和中等大小的动脉重建中已经获得了一些临床上的成功，却并不理想。然而，这些成功仅限于直径小于6毫米的血管替代物，原因是血栓形成(即，易形成凝块)和吻合口增生(Nojiri，Artif Organs 1995 1月；19(1)：32-8)。

在动物，血管移植物的完全内皮化根据种属不同显示在2-4周内出现。无内皮表面的时期可能导致如表面血栓形成所引起的不期望的效应和问题。在人类，除了某些个例报道(Wu，血管外科杂志(J Vasc surg)1995 5月；21(5)：862-7，Guidon，生物材料(Biomaterials)1993 7月；14(9)：678-93)外，血流表面仍然是未复原的，但特别是在小血管，与自体移植物(Nojiri，Artif Organs 1995 1月；19(1)：32-8.Berger，Ann ofSurg 1972；175(1)：118-27，Sauvage)相比，这样会引起更差的效果。在另一方面，自体移植物包括一个获取的步骤，导致手术时间更长，以及在获取区内可能发生并发症。将血管结构未损伤的网膜转位至多孔颈总动脉PTFE移植物周围已经被证明可以增加狗移植物腔内内皮细胞的覆盖程度(Hazama，外科研究杂志(J of Surg Res)1999；81：174-180)，然而，却要承担如上所述的麻烦和复杂的步骤带来的问题。

一些策略被建议用来改善人工血管植入物的开放性。主要的策略是修饰植入物的材料或在移植物中加入化学成分(如，5,744,515)。大多数采用的物质是肝素，它可以与移植物结合，或用一个局部给药装置给予。

进一步，移植物可接种内皮细胞，用内皮细胞或骨髓覆盖(Noishiki，人造器官(Artif Organs)19981月；22(1)：50-62，Williams & Jarrel，NatMedicine 1996；2：32-34)。在细胞接种过程中，内皮细胞在获取后与血液或血浆混合，然后在血液凝固前的时间内加入到移植物表面。在这些方法中使用的内皮细胞可能从微血管(脂肪)，大血管(例如来自获得的静脉)获得，或来源于间皮，以后移植物被植入。更特殊的是，这些方法由许多步骤组成，包括从组织中收获内皮细胞，分离内皮细胞，某些情况下是内皮细胞的培养物，在移植物材料上接种内皮细胞，最后植入移植物。相应地，这些方法的一个很重要的不利因素是耗时，操作繁琐，需要特殊的专业技术和适当的装置。而且，这样接种的内皮细胞进行基因工程改造可产生许多后果：在细胞中转导组织纤溶酶原激活物(tPA)可降低内皮细胞与移植物表面的粘附，转染逆转录病毒可减少内皮化。为了提高细胞的接种，可以使用转染血管内皮细胞生长因子(VEGF)的内皮细胞或脂肪细胞。除了上面所述的不利因素，这种方法更加繁琐，因此在实际应用中花费更多。转化内皮祖细胞并再应用的方法已有所描述。但如上所述的问题仍然存在。为了改进内皮细胞在一个表面生长的技术，建议对移植物表面进行配体处理。在细胞覆盖过程中，内皮细胞在收获后直接应用于聚合的移植物表面，由此移植物被植入，但这样的技术也包括如上所述的几个步骤，同样使过程变得繁琐。同样，组织工程，也是一个复杂和因此昂贵的过程，也已应用用来构建植入的血管组织。动脉同种移植物也有所描述，但它们在动脉的保存和抗原性方面产生了问题。

因此，现在对于在临床实践中改善内皮化和移植物的复原有巨大的需求和兴趣。但至今实践中这样工作的方法仍未发明。

进一步，在美国每年要进行500000个放置支架的操作，平均每个患者1.7个支架。支架，即相对简单的精细网状结构装置，在本领域领域内是为人熟知的。对于血管阻塞放置支架通常是与采用扩张术，剥离术，动脉粥样硬化切除术或激光治疗扩张动脉相结合。通常，支架由一些物质，通常为不锈钢的网状结构组成，一般由一个导管引导经皮进入到病变区域。不同设计的支架实例有，如，可自行展开的/压力扩张的，管状/圆锥形/分叉的，永久的/临时的，不降解的/可生物降解的，金属/聚合材料，具有或不具有抗血栓作用的。它们植入到不同解剖部位的血管中，如中枢，冠状，肾脏，其他外周动脉和静脉，和主动脉。支架也可用在其他部位，如胆道分支，食管，肠，气管支气管分支和泌尿生殖道。支架可用于如处理狭窄，阻塞或动脉瘤。支架的特征是具有一个开放的网格结构，或是具有多个开口以便放射状的扩大和缩小，允许组织生长入装置结构的内部。在血管扩张后，支架就与导致阻塞的亚急性血栓形成和新生内膜增生有关。在支架期之前，仅使用气囊扩张就可以缓解血管狭窄。用于输送裸露DNA的具有水凝胶气囊(Riessen，人类基因治疗(Human Gene Therapy)1993，4：749-758)和具有水凝胶的气囊和用作药物输送的基因均有所描述(5,674,192，Sahatjian等人)。已经使用导管来输送血管生成肽，脂质体和编码基因的病毒至血管壁(WO 95/25807，如上面的5,833,651)。导管也用来输送VEGF以便提供更迅速的支架内皮化(Van Belle，循环(Circ.)1997：95438-448)。进一步，用作基因输送的水凝胶衬内的支架(5,843,089)和用作病毒基因输送的支架(Rajasubramanian，ASAIO J 1994；40：M584-89，5,833,651)也有所描述。在支架上接种内皮细胞被用作一种输送重组蛋白至血管壁的方法，以便克服血栓形成，但如上所述，这种技术很繁琐，并因此费用较高。另外，以前关于支架的文章主要集中于防止再狭窄。

支架移植物，也指有覆盖物的支架，在本领域领域中是为人熟知的。这样的支架是两部分的组合物，称为支架部分和移植物部分。在一个支架移植物中，顺应性的移植物结合于一个放射状可扩张的支架。支架移植物被认为是有用的，在支架和通过血管的血流之间形成一个完全的屏障。移植物可作为一个生物相容性的内部覆盖物，防止在支架构成的导线元件或其他结构性物质上产生强烈的血流，防止血栓或对支架构成的金属或其他物质的免疫反应，形成一个屏障将病变或损害的血管片段与流经的血流分离开。在人体中，支架移植物的主要问题是不能形成完全的内皮化，新生内膜增生引起阻塞，如上所述与移植物有关。实验性研究显示放置支架时造成的血管损伤，可诱导有丝分裂原和趋化因子在局部表达和释放，从而介导新生内膜病变形成。支架移植物可用于主动脉，中枢，冠状，肾脏，其他外周动脉和静脉，和主动脉。支架移植物也可用于其他部位如胆道分支，食管，肠，气管支气管分支和泌尿生殖道。

每年，要进行大约100000个心脏瓣膜置换手术。人工心脏瓣膜在本领域领域中是为人熟知的。有四种移植物：人工移植物，异种移植物，异体移植物和自体移植物。异种移植物通常保存心包和猪瓣膜如Carpentier-Edwards，Ionescu-Shiley，Hancock，Pericarbon或无支架瓣膜。在人造生物瓣膜中生物降解是一个主要的问题。降解的特征是内皮细胞屏障的破坏和缺乏内皮化，通透性增加导致宿主的循环血浆蛋白易化扩散至瓣膜组织，浸润过程如钙化和脂质积累的活动增加，以及胶原网络的生物降解。已有报道一年后有炎性细胞轻至中度的浸润，研究显示在人造生物瓣膜表面没有(Isomura，心血管外科杂志(J Cardiovasc Surg)1986，27：307-15)或少有(Ishihara，Am.J.Card.1981：48，443-454)内皮细胞的生长。其他几个问题也与人造瓣膜有关，如血栓栓塞，钙化，感染，溶血，瓣周漏和抗凝有关的出血。人造生物瓣膜内皮化在理论上可防止血栓形成，提供对感染的保护，增强尖部基底区域的机械强度，为血浆蛋白和其他成分的穿透提供一个屏障以便降低钙沉积。现在市场上没有可以迅速内皮化的组织瓣膜。改变保存的方法、中和戊二醛、人造生物瓣膜的保存和预先内皮化被认为可以改善瓣膜的性能。关于这些方面在内皮细胞接种已经进行了一些研究，但如上所述，由于需要许多步骤，在临床上造成许多麻烦。

有几种机械式瓣膜，它们通常使用球，盘，瓣膜小叶或其他机械装置来通过人工装置调节血流的方向。从其特性上说，在接触血流时，人造机械心脏瓣膜具有金属或塑料的表面。由于在设计，物理结构，运转特性和结构物质上的缺陷，其表面在一定程度上是可引起血栓的。小叶和盘通常由热解碳制成，室口环可能也由热解碳覆盖或制成。

如上所述，可植入的装置也可用于心血管以外的其他领域。已经报道了许多可植入的装置，如为了进行药物输送，基因治疗，和细胞包裹。为在体内植入，已经开发了不同的装置，可保护组织或细胞产生来自免疫系统的选择性产物，如血管外扩散室，血管内扩散室，血管内超滤室和微包裹的细胞。但是，当植入外源生物物质时，炎性的外源机体反应启动，最后包裹装置，抑制营养物质在半透膜内向细胞的扩散。这个区域是无血管的。缺少血管是物质扩散的障碍。它可降低包裹的内分泌组织的长期活性，也可使血管植入物更易感染。没有血管的纤维帽也限制了药物和基因治疗装置的性能。在5,882,354中，一个装有活细胞的小室包括两个区带，可防止结缔组织的侵入，并增加植入物内部的血管生成，其机制不清。

在植入装置的步骤中所使用的其他一些物质也遇到了如上所述的相似问题。例如，要提到缝合材料，这些材料用来修补，固定和/或在手术过程中将机体组织拉近。为人造装置或植入物的附着进行的缝合需要的一些严格要求与强度，生物相容性和生物降解性有关。

总之，在这个领域中的主要问题是哺乳动物，特别是人体与植入的医疗装置的生物相容性采用以前本领域的方法不能达到满意的程度。在血管植入物中，当使用合成材料时，在进行植入的部位由于开放了易形成血栓的表面，产生了问题，反过来产生了血凝块，并引起性能下降。在人造组织植入物中，结果是形成非血管化的无营养区，导致植入物的功能丧失。

发明概述

本发明的目的是为前面提到的问题提供一个解决方案。更特殊的是，本发明的一个目的是提供一种医疗装置，它可以解决引起血栓，增生和其他问题的医疗植入物表面出现的问题。本发明的另一个目的是提供一种医疗装置，与以前本领域的方法相比，在应用时不太繁琐，可以改善外源材料和受体或宿主本身之间的生物相容性。本发明的另一个目的是提供一种在血管外科中有用的医疗装置，使其较至今已知的装置具有较低的阻塞和再阻塞危险性。本发明的一个进一步目的是作为同种移植物的另一选择，提供一种有用的医疗装置，但却可避免抗原性的危险。本发明还有另一个目的是在检测和控制代谢功能方面提供一种有用的装置，可较以前本领域中的装置更易在人体或动物体内接受和维持。

上述给定的目的和其他目的是根据本发明，通过提供一种具有改良的生物学特性的医疗装置来实现的，因为当该装置被引导进入一个哺乳动物体内时至少有部分与血液，体液和/或组织接触。所述的装置包括一个核心和存在于一种生物相容的介质中的一个核酸，其特性是所述核酸编码一种能够在体内促进在所述核心的一个合成表面上至少部分内皮化的翻译或转录产物。

核酸是以裸露的形式，在一个病毒载体中，如逆转录病毒，仙台病毒，腺伴随病毒和腺病毒，或在一个脂质体中存在于生物相容的介质中。

在一个实施方案中，核酸编码一个蛋白或多肽，它们选自成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子(TGF)和上皮细胞生长因子(EGF)家族，胎盘衍生生长因子(PIGF)，肝细胞生长因子(HGF)和血管生成素。优选地，所述的核酸编码血管内皮细胞生长因子(VEGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)。

在另一个实施方案中，生物相容的介质是一个生物学稳定的聚合体，一个可吸收的聚合体，一个生物分子，一个水凝胶聚合体或纤维蛋白。

在一个有益的实施方案中，核酸存在于一个与所述核心分开的容器中，使其在一个哺乳动物体内可连续的给予。在一个可选择的实施方案中，核酸通过离子或共价键附着在核心上。

合成表面是无孔的或有孔的，后者可允许毛细血管和内皮细胞生长进入孔中。优选地，孔经在大约0μm至大约2000μm。

本装置的应用可具有广泛的内容，例如可是一个心血管植入物，如一个血管的人造部分，或是一个血管内植入物。一般来说，本装置可用作一个植入物用来替代一个哺乳动物机体中的一部分，其中所述的植入物适合至少部分与血液，体液和/或组织接触。进一步，本装置可用作一个组织植入物或一个生物传感器。优选地，该装置可选作血管移植物，血管内移植物，移植物连接物和生物传感器。

本发明还涉及一种根据本发明制造一种医疗装置的方法。

进一步，本发明涉及一种改善一种哺乳动物机体与一种合成表面的生物相容性的方法，该方法包括将一个具有一种合成表面的装置引入体内，该装置至少部分与血液，体液和/或组织接触，并将存在于一个生物相容性介质中的核酸给予在其周围。该方法的特点是核酸编码一个能够在体内在所述合成表面上至少部分内皮化的一个翻译或转录产物，所述的核酸的应用可在将该装置引入一个机体之前，同时或之后进行。

关于处理方法的进一步详细细节将在下面和附加的权利要求书中公开。该方法包括根据所使用的情况，可应用核酸至少一次。

附图说明

图1显示了HEK293细胞的短暂转染，表达质粒中含有VEGF165，FGF-2和FGF-5的人cDNA，可引起所需要蛋白的分泌。

图2显示了通过表达质粒中产生的VEGF165，FGF-2和FGF-5的人类形式，它可刺激鸡尿囊绒膜试验中的血管发生。

图3显示了在将人VEGF165的表达质粒应用至大鼠腹主动脉后转录人VEGF mRNA。

定义

下面，就在本说明中使用的一些术语的含义提供解释。在此处未专门说明的术语可按照在相关技术领域中的一般理解来解释。

在此一个“医疗植入物”是指一种植入物，一种装置，支架或假体，可理解为是一个为了至少在一个哺乳动物体内植入而制造的物体。它提供了至少一个朝向机体组织或液体的接触面，以便与机体组织和液体接触。在此一个心血管植入物是指在一个循环系统中的一种植入物，或如果没有特别的其他方式时，是与血流相连的一种植入物。在此一个组织植入物是指如果没有特别的其他方式时，是在其他机体组织或液体中植入的一种植入物。例如，一种植入物可能是一个可植入的人造装置，更特殊的是一种心血管植入物或一种组织植入物，以及一种与血液接触的医疗植入物，一种与组织接触的医疗植入物，一种与体液接触的医疗植入物，一种可种植的医疗装置，一种体外医疗装置，一种人造心脏，一种心脏辅助装置，一种内窥镜医疗装置，一种血管移植物，一种支架移植物，一种心脏瓣膜，一种心血管贴片，一种暂时的血管内植入物，一种瓣环，一种导管，一种起搏器导线，一种生物传感器，一种装载活细胞的小室，一种器官植入物，或一种人造生物器官。

在此一个“可附着的可传递的核酸片段”是指，代表大量的基因物质，可以传递至医疗植入物的周围组织中。例如，一个核酸片段可能是一个双链或单链DNA，或是RNA，如mRNA，tRNA或rRNA，编码一个蛋白或多肽。可以选择的是核酸可能是一个反义核酸分子，如反义RNA或DNA，可通过阻断基因表达来发挥作用。适当的核酸片段可以任何形式，如裸露DNA或RNA，包括线性核酸分子和质粒，或在不同的重组病毒，如DNA病毒或逆转录病毒，的基因组中作为功能性的插入物。核酸片段也可插入至其他载体中，如脂质体或其他病毒结构中。附着的可传递的核酸片段附着于医疗植入物上，其方式可使其被输送至周围组织，并摄取。

术语“附着”是指吸收，如物理吸附，化学吸附，配体/受体相互作用，共价键结合，氢键结合，或化学物质或生物分子的离子键结合，如一个聚合体，纤维蛋白或核酸与植入物的结合。

在此一个“周围组织”是指任何或所有细胞，它具有形成或促进植入物表面新生内皮细胞连接或毛细血管化形成的能力。这些组织包括多种组织，如脂肪，网膜，胸膜，心包，肌肉，血管壁和纤维组织，但只要细胞被激活的方式最后可引起植入物的内皮化或毛细血管化，周围组织的特殊类型则不重要。“周围组织”也用来指那些定位在组织内(除了组织小室内的细胞)的细胞，与植入物接触，或向植入物移行的细胞。同时，在刺激作用下进一步吸引内皮细胞的细胞，以及可到达心血管植入物内皮化或组织植入物血管化的活性部位的细胞或组织均可被认为是周围组织。

“内皮细胞”是一个单层或扁平的内皮细胞，边-边相连形成一层覆盖在血管壁，心脏和淋巴管内表面的膜。

在此“内皮化”是指内皮细胞在所有哺乳动物组织中或一个生物材料的液体接触表面上的生长，可用来形成一个多孔的或无孔的植入物。表面的内皮化可通过纵向生长，毛细血管向内生长和/或毛细血管内皮细胞通过孔隙进入植入物内，或通过接种循环内皮细胞前体细胞而发生。在这份公开书中，如果未特别说明，可与“毛细血管内皮化”一词交叉使用，指内皮细胞在一个生物材料的所有主要组织接触表面上的生长，用来形成一个多孔的或无孔的植入物。

术语“毛细血管化”和“血管化”在此可理解为毛细血管的形成和在植入物表面的微循环的形成，如果没有特殊说明，它们可与内皮化互换使用。

“血管形成”及其对应词，如“血管生成”，在此是指在所存在的哺乳动物组织中，如在周围组织中，内皮细胞的生长和形成。

具有促进医疗植入物“内皮化的潜能”的一个翻译或一个转录产物，在此可理解为一个化学物质或生物分子，优选一种激素，一种受体或一种蛋白，更优选一种生长因子，其发挥活性的结果，可诱导医疗植入物的内皮化或毛细血管化。

“多孔性”及其对应词，如“孔”和“多孔的”，在此如果没有特别说明，是指具有小通道或通路的一种生物材料，开始于前表面，一直延伸至生物材料的后表面。

“表面”是指在生物材料及其环境之间的界面。希望该词的应用可以包括其宏观含义(如，一片生物材料的两个主要的面)和微观含义(如，贯穿材料的孔洞的内层)。

术语区室是指任何适合的区室，例如一个小瓶或一个包裹。

具有7个数字的参考文献(如4,654,321)，如果没有特别说明，通过这种专门的方式使用，是指美国专利申请号。

发明的详述

第一方面，本发明涉及一种具有改良生物学特性的医疗装置，该装置在进入一个哺乳动物体内时至少部分与血液、体液和/或组织接触，其中该装置由一个核心和一个存在于一个生物相容介质中的核酸组成，其特性是所述的核酸编码一个翻译或转录产物，该产物可以在体内促进在所述核心的合成表面上至少部分内皮化。可允许以下面的方式提供核酸，即将其传递至植入物周围的组织细胞中。在本说明中，可以理解的是，术语“引入一个哺乳动物体内”的使用是以广义的包括全部包含在一个机体内的装置和仅部分引入体内的装置，但其中由一种合成材料制成的一个表面与所述机体的血液，体液和/或组织接触。

根据本发明在人工表面上形成的内皮细胞可提供天然表面具有的许多优点。内皮细胞是一个单层或扁平的细胞，边-边相连形成一层覆盖在血管壁，心脏和淋巴管内表面的膜。理论上，移植物内皮化的发生可通过从吻合区域纵向的生长(跨吻合区)，毛细血管和/或毛细血管内皮细胞通过合成表面，如移植物壁向内生长，并进入孔内(跨间质)，或接种循环内皮细胞前体细胞。在通过孔洞的跨间质移行过程中，内皮细胞通过附着从毛细血管中发生，延伸，向内移行并增殖。

因此，即使本领域已有技术已经付出很多努力来避免在血管移植物的聚合表面上发生血栓和随后的血凝块，但这些努力并未证明对于小血管有满意的效果，其中血栓和增生已经造成了重要的问题。本发明第一次提供了一种装置，它包括至少一个合成表面，由于在其上面能形成一个内皮细胞层，因此能被机体接受。本发明为广大范围的植入物提供了非常有用的技术，令人惊讶的也可有效的用于小口径的人造血管片段，这在以前被认为是要发生凝血的。根据本发明形成的内皮细胞层，根据以前的专业知识未曾在人类中被观察到，但由于生长非常缓慢，在程度上不足以避免其相关的问题，这在下面的实例中显示。

根据本发明在一个本装置的实施方案中，核酸在生物相容性介质中以裸露的形式存在。Riessen(JACC 1994：5，1234-1244)将裸露的DNA用一个水凝胶的气囊输送至以往本领域所使用的支架上，用来输送裸露的DNA。但是，在那样的实例中，所述DNA的目的是防止在支架网络中发生再狭窄，与根据本发明所使用的输送目的是相反的，在此新的内皮细胞层建立在一个表面上。在一个可以选择的实施方案中，核酸被引入一个病毒载体中，该载体选自逆转录病毒，仙台病毒，腺伴随病毒和腺病毒。在其他的实施方案中，核酸也可存在于一个脂质体中。

在一些出版的文章中已经要求使用基因转染用于疾病的治疗和预防中。基因治疗是应用基因物质作为药物。在开始认识到可以作为治疗遗传性疾病的一个手段的同时，基因治疗现在被理解为输送治疗性mRNA或蛋白作为局部和/或全身应用的一个有力工具。在基因治疗中有两种方法：离体和体内。在离体方法中，从宿主中去除的细胞在返回至宿主体内前在体外用基因工程修饰，在体内方法中基因本身的形成是直接传递至宿主内，而不需任何细胞作为传递的载体。基因可以根据其需求而被靶向，可以在干细胞中或原位进行。基因治疗的原理是细胞功能可以通过改变基因转录和产生一个基因转录产物，如一个多聚核苷酸或一个多肽来调节。多聚核苷酸或多肽然后与其他细胞相互作用来调节该细胞的功能。这种转录的改变是通过基因转染来完成的。Losordo等人(循环(Circulation)1994，89：785-792)显示被分泌的基因产物具有复杂的生物学效应，即使当转导细胞的数目与不编码分泌信号的基因相比还很少时。对于表达一个细胞内基因产物的基因，对于这个细胞内基因产物可能需要更大量的细胞群来表达其生物学效应，随后可能需要更有效的转染(Isner等人，循环(Circulation)，1995，91：2687-2692)。为了更详尽的阐明基因治疗的应用，例如，基因已经被转染至脂肪细胞中，该细胞具有关于疾病或状态的特殊的用途，因此可以通过在体内将基因转染至脂肪细胞治疗这种疾病或状态。也有报道在原位将核酸传递至骨组织中，并在原位使用感染的间皮细胞或在分离后将其作为治疗的来源。

采用本发明的方法和组合物，广泛而大量的基因物质可被传递至周围的组织中。例如，核酸可能是DNA(双链或单链)或RNA(如mRNA，tRNA，rRNA)。也可能是一个编码的核酸，即一个编码蛋白或多肽的核酸，或可能是一个反义核酸分子，如反义RNA或DNA，功能是阻断基因表达。可选择的是，可以是一个人造染色体。因此核酸可以是基因组序列，包括单独的外显子或内含子，或外显子和内含子，或编码DNA区，或任何需要用来将人造装置传递至组织周围以促进内皮化的构建物。适合的核酸也可以是病毒包装的任何形式，如裸露的DNA或RNA，包括线性核酸分子和质粒，或在不同重组病毒内的功能性插入物，包括具有DNA基因组的病毒和逆转录病毒。核酸也可以插入至其他载体，如脂质体和其他病毒结构中。

可使用化学，物理和病毒介导的机制来进行基因转染。几种不同的载体可用来进行基因转染。有多种病毒，或灭活的，包括重组病毒，可用来将核酸输送至组织，如逆转录病毒，慢病毒，腺病毒(如，5,882,887，5,880,102)和日本血细胞凝集病毒(HVJ或仙台病毒)(5,833,651)。在体内逆转录病毒由于一些问题限制了它的应用。它们可以提供稳定的基因转染，但目前逆转录病毒不能转导不复制的细胞。如果短期的基因转染足够，转基因插入至宿主DNA中的潜在危险是可以不考虑的。复制缺陷的腺病毒是高度有效的，可用于多种应用中。腺病毒可通过受体的相互作用很容易的进入细胞内，可用作将大分子转运至细胞内的一种手段。非病毒的核酸可以被包装在腺病毒内，或是替换，或是另外插入至腺病毒正常成分中。非病毒的核酸也可与腺病毒的表面相连接，或以被动的形式共同被内化，并在受体-内涵体复合体中一起作为处理物存在。腺病毒为基础的基因转染并不会造成转基因整合进宿主的基因组中，因此是不稳定的。也可以转染不复制的细胞。血管生成蛋白表达的有限周期足以进行血管发生，内皮化的暂时基因转染，以及在冠脉和外周部位人造血管的复原。使用病毒载体的其他实例是腺伴随病毒(AAV)，疱疹病毒，牛痘病毒，慢病毒，脊髓灰质炎病毒，其他RNA病毒和感冒病毒(Mulligan，科学1993；260：926-32；Rowland，Ann Thorac Surgery 1995，60：721-728)。DNA也可与其他类型的配体偶联，促进它的摄取和抑制它的降解(如，5,972,900，5,166,320，5,354,844，5,844,107，5,972,707)。也可与所谓的cre-lox系统相偶联(Saner & Henderson，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci)；1988，85：5166)。也可给予裸露的DNA，经验表明，双链DNA具有最小程度的免疫原性，不可能引起免疫反应。编码VEGF的裸露DNA，当在一个缺血后肢模型(Pu等人，外科研究杂志(JInvest Surg)，1994；7：49-60)中应用时，显示可以增加血管的生成。其他的生长因子在同一个模型上也有效(Ferrara & alitalo，1999；12：1359-64)。编码VEGF的裸露DNA也已经在缺血性外周血管疾病中进行临床应用(Isner等人，柳叶刀(Lancet)，1996；348：370-4，Baumgartner等人，循环(Circulation)，1998；97：1114-23)，目前至少有两个使用裸露DNA和载有编码VEGF基因的腺病毒治疗缺血性心脏疾病的临床试验正在进行。结果将在2000年春天期间发表(Hughes SCRIP 1999 11月2493：24)。载有编码FGF-5基因的腺病毒也已经用于心肌内感染(5,792,453)。

脂质体-DNA较腺病毒转染的效率低。当细胞增殖时转染效率增加。传统的化学基因转染方法是磷酸钙共沉淀，DEAE-葡聚糖，聚合体(5,972,707)和脂质体介导的转染(例如，5,855,910，5,830,430，5,770,220)，传统的物理方法是微注射，电穿孔(5,304,120)，离子电渗，离子电渗和电穿孔的组合方法(5,968,006)，以及压力(5,922,687)(Rowland)。转染效率也可通过药物检测的方法来提高，即加入PEI。

本发明可用来增强所需基因在植入物周围组织的表达，传递一种特定的表现型，因此可以促进人工假体的内皮化或血管化。这种表达可以是一个正常表达基因的增强(即过表达)，或是与在天然环境中假体周围组织正常无关的一种基因的表达。可以选择的是，本发明可用来抑制一种天然在该组织中表达的基因，并再次更换或改变其表现型。基因抑制的方式可以采用表达一种编码发挥下调功能的蛋白的基因。也可以使用反义技术。

因此，根据本发明与装置使用的核酸编码转录或翻译产物，可以在体内促进或刺激内皮化，即它们是血管生成因子。因此，在一个实施方案中，编码一种蛋白或多肽的核酸选自成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子(TGF)和表皮生长因子(EGF)家族，胎盘衍生生长因子(PIGF)，肝细胞生长因子(HGF)和血管生成素。在一个特殊的实施方案中，核酸编码血管内皮细胞生长因子(VEGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)。

WO 98/20027描述了在治疗内膜增生，高血压和动脉粥样硬化时，治疗性的使用一种刺激NO或前列环素产生的药剂。更特殊的是，这样一种药剂，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)，可以采用输送储存系统以囊状物的形式置于血管周围，被输送至血管外。然后囊状物可指引所述的药剂进入血管，同时避免其扩散进入周围组织。即使WO 98/20027输送装置就所使用的成分而言与本发明相似，但其特性是明显不同的。本发明为围绕人造装置的组织提供了编码一种血管生成因子，如VEGF基因的核酸，该人造装置被引入机体内，例如，是为了替换或支持一个天然的器官。所述的核酸进入所述组织的细胞中，提供一种或多种可刺激合成表面内皮细胞生长的物质的表达。WO 98/20027的目的是相反的，因为其目的是要输送一种基因，如VEGF，到机体的一个特殊部位，所述的基因将在此表达，提供的效应实际上是抑制该部位任何细胞的生长，即防止增生。达到这些总体上相反的效应，是因为输送的方式是不同的；本发明提供了一种广泛的输送方式，可将核酸输送至周围组织以便获得尽可能高的表达，而WO 98/20027的输送是设计用来提供一种对一个特定部位的定向给药。所述的定向给药是根据WO 98/20027，通过采用一种人造装置以一个囊状的形式获得的，可在输送的部位限制基因的扩散，而在本发明中没有任何的限制。因此即使WO 98/20027也使用一种人造装置，与本发明相反，其中并没有形成任何内皮细胞层。实际上，假设一个新的内皮细胞层在人造的WO 98/20027囊上建立，在本质上也不代表所要表达的目的，这很清晰地阐明了本发明和WO 98/20027之间的区别。

已有一些科学性报道描述血管生成蛋白或肽类的直接给药可以获得新生血管。成纤维细胞生长因子家族的几个成员：a-FGF，b-FGF，FGF-4，FGF-5，TGF家族，EGF家族，PDGF家族，如任何VEGF的异构体，血管生成素(Ang)家族，如Ang1/Ang2，和其他类似PIGF，已经考虑用来调节血管发生(例如，Ferrara等人，细胞生物化学杂志(J CellularBiochem)，1991，47：211-218，Folkman等人，细胞生物化学杂志(J BiolChem)1992；267：10931-34，Klasbrum等人，内科进展年报(Ann RevPhysiol)，1991；53：217-39，Harada等人，临床研究杂志(J Clin Invest)1994；94：623-30，Yanagisawa-Miwa等人，科学1992；257：1401-03，Baffour等人，血管外科杂志(J Vasc Surg)1992；16：181-191，Takeshita等人，临床研究杂志(J Clin Invest)1994；93：662-670，Shing等人，科学，1984；223：1296-99，Korpelainen & Alitalo，Curr Opin Cell Biol，1998；10：159-64，Ferara&Alitalo，国立医学(Nat Med)，1999；12：1359-63，5,928,939，5,932,540，5,607,918)。但使用这些蛋白达到这样一种血管生成效应的首要条件是需要重复或长期使用这些蛋白，这就限制了使用这些蛋白在临床环境中刺激内皮细胞生长的应用。一些VEGF异构体是肝素结合性的血管生成生长因子，可从完整的细胞中分泌，因为具有信号序列。FGF-5也可以合成，并从转染的细胞中分泌至间质中，在此诱导血管生成(5,792,453)。VEGF在其对内皮细胞的有丝分裂效应方面是特异的，因为其高活性受体存在于内皮细胞上。在其他生长因子中，FGF-1和纤维蛋白胶和肝素的混合物一起显示可增加通过60微米间隔距离的ePTFE移植物的透壁内皮化(Gray等人，外科研究杂志(J Surg Res)199411月，57(5)：596-612)。据报道VEGF蛋白和肝素、生物胶一起组合在离体时可特异地刺激内皮细胞增殖(Weatherford等人，外科(Surgery)，1996，120：439)。当与bFGF，明胶和肝素联合使用时，VEGF蛋白也可促进移植物内皮细胞的生长(Masuda，ASAIO J 1997，43：M530-534)。FGF蛋白被认为当与肝素一起使用时具有与VEGF相似的效应(Doi等人，J BiomedMat Res 1997，34：361-370)。临床上，FGF和VEGF蛋白在心肌内注射已经用来诱导冠状动脉疾病患者的血管生成。bFGF和aFGF蛋白也已经显示可以在体外和皮下组织增加瓣膜的内皮化(Fischlein等人，Int J ArtifOrgans 19946月；17(6)：345-352，Fischlein等，J Heart valve Dis 1996 1月；5(1)：58-65)。VEGF研究已经中断，FGF研究的最后结果将在2000年春天期间发表(Hughes，SCRIP 1999 11月；2493：24)。进一步，WO91/02058描述了研究结束时一种杂交蛋白的应用。总之，使用蛋白或肽类的所有这些报道需要繁琐和昂贵的步骤，因为给予的蛋白将仅能发挥其功能一次，然后通过转运、降解等方式消失。与此相反，较可能实现的通过直接的蛋白给药方式，本发明更加延长了输送，其优势是可以通过改造载体来进行控制。

在另一个实施方案中，生物相容性介质是一种生物稳定的聚合体，一种可吸收的聚合体，一种生物分子，一种水凝胶聚合体或纤维蛋白。在一个特殊的实施方案中，介质是一种粘蛋白成分。

根据本发明的装置的合成表面可能是无孔的或多孔的。因此，根据植入物的实施方案，多孔的和无孔的植入物材料可以用来制造该装置。例如，移植物的多孔性已经显示在动物的血管移植物内皮化中具有重要性(Wesolowski，Thorac Cardiovasc Surgeon 1982；30：196-208，Hara，美国外科杂志(Am J Surg)1967；113：766-69)。进一步，在机械心脏瓣膜的环境中，多孔的表面显示可以增加组织的生长和瓣膜环的内皮化(Bjork，Scand J Thorac Cardiovasc Surg 1990；24(2)：97-100)。在缝合口的环境中，有孔的缝合被认为可以促进组织长入至缝合口内或促进缝合口的内皮化(4,905,367，4,355,426)。在有孔的移植物中，如血管移植物，毛细血管和内皮细胞可允许通过孔洞，其中孔径可在0μm至2000μm之间。

在一个实施方案中，核酸通过离子或共价键与核心附着。

在一个有益的实施方案中，核酸存在于一个与所述核心分开的容器中，使其在一个哺乳动物体内可连续的给予。围绕植入装置的组织可以是，例如胸膜，心包，腹膜，筋膜、肌腱，脂肪，网膜，纤维，肌肉，皮肤或其他任何需要血管生成的组织。

表达血管生成因子的基因然后可以附着在植入物上，或给予于包绕装置的组织中。在周围组织的细胞被感染，刺激血管生成，引起植入物的内皮化和/或毛细血管化，该过程可以产生内皮化或血管化的表面，具有以前描述的这样一种表面所具有的优势。

本装置的表面可以采用多种方法处理，所有或部分方法，如，通过包被，添加纤维蛋白胶或粘附分子，如在下面材料和方法的普通公开书的试验部分所详细描述的。PTFE移植物的最佳的组合件间距离为大约60μm。

本装置可用于多种环境中，依赖于所需要使用的目的，可以由选自下列中的一种生物材料制成，这些材料是不溶的人造聚合体，金属和陶瓷，具有或不具有修饰的合成表面。

因此，在一个实施方案中，该装置是由选自下列材料中的一种生物材料制成的植入物，这些材料包括金属，钛，钛合金，锡-镍合金，形状记忆合金，氧化铝，铂，铂合金，不锈钢，MP35N，埃尔吉洛伊非磁性合金，钴铬合金，热解碳，碳酸银，玻璃碳，聚合体，聚酰胺，聚碳酸酯，聚醚，聚烯烃，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚亚胺酯，聚氯乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，硅橡胶，氟聚合物，聚丙烯酸酯，聚异戊二烯，聚四氟乙烯，橡胶，陶瓷，羟磷灰石，人类蛋白，人类组织，动物蛋白，骨骼，皮肤，层粘连蛋白，弹性蛋白，纤维蛋白，木材，纤维素，压缩碳和玻璃。

因此，该装置可以是选自下列的一种医疗植入物，包括一种接触血液的医疗植入物，一种接触组织的医疗植入物，一种接触体液的医疗植入物，一种可种植的医疗装置，一种体外医疗装置，一种内窥镜医疗装置，一种血管移植物，一种血管内植入物，一种起搏器导线，一种心脏瓣膜，暂时，血管内植入物，一种导管，起搏器导线，生物传感器或人造器官。在一个特殊的实施方案中，该装置是一种心血管植入物，如一种血管的人造部分，或一种血管内植入物。总之，本装置可用作一种植入物，可以用于替代一个哺乳动物机体的一部分，其中所述的植入物适合至少部分与血液，体液和/或组织接触。进一步，本装置可用作一个组织植入物或一个生物传感器。在可选择的实施方案中，本装置可以是任何其他的人造生物植入物，可为一个宿主提供一种代谢功能，如一种可输送胰岛素等的泵。

实际上，本装置实际上是任何一种装置之一，该装置是在一个机体内为植入物而开发的，可保护产生一种选择产物的组织或细胞不受免疫系统的影响，如血管外扩散室，血管内扩散室，血管内超滤室，和微包被的细胞。细胞可来源于其他物种(异种移植)，有时它们是以前从同一个体中分离但进行修饰的(自体移植)。人造生物植入物是设计用来为一个宿主提供所需要的代谢功能，或去除有害的物质。膜可以是疏水的，如PTFE和聚丙烯，或亲水的，如PAN/PVC和铜纺。

更特殊的是，由本发明所包含的植入物包括，但不限于，心血管装置，如人造血管，心血管贴片，支架移植物，人造瓣膜，人造心脏，心脏辅助装置，吻合装置，移植物连接器，瓣环，留置血管导管，起搏器导线，抗栓塞滤器，用于其他适应症的支架和支架移植物，如为种植装载活细胞的小室，生物传感器，外科缝合材料，外科网袋，纱布和贴片，气管套管，人造生物器官，外科植入物，整形外科植入物和矫形种植物。可以预测的是在此描述的步骤可以开发其他人造器官或装置。

在第二个方面，本发明提供了一种产生一种可种植的医疗装置的方法。该装置可以通过用基因预处理一种生物材料，并从处理的生物材料中制造而形成，或通过首先制造装置，然后处理装置暴露的表面。

在第三个方面，总之，本发明涉及通过将一种核酸传递至周围组织形成医疗植入物内皮化或血管化的方法。本发明的方法一般包括在血管或组织移植物周围，与包括一种核酸的成分一起与组织接触，其方式可有效的将所述的核酸传递至组织，并促进血管移植物，心血管贴片，支架移植物，心脏瓣膜，留置血管导管，心脏辅助装置和人造心脏的内皮化，或促进组织植入物表面的血管化。在植入至机体前，组织可以环绕在血管-或组织植入物-核酸成分周围。可选择的是，核酸序列-假体成分可种植在组织中，或核酸可在假体种植之前或之后应用在种植部位，以便影响，或促进核酸在体内传递至周围组织。在核酸传递至周围组织过程中，优选的方法涉及首先添加基因物质至组织相容的介质中，将核酸-介质组合物注入至假体中，然后使用已注入的假体与适当的组织部位接触。可选择的是，组织相容的介质可首先应用于植入物，然后再加入核酸，此后核酸-假体组合物应用于种植部位。可选择的是核酸应用于植入物周围的组织，其后种植植入物，或首先种植植入物，其后再将核酸应用于植入物上。也可以将已注入的植入物与在植入物周围组织中应用核酸在种植之前或之后同时使用。当周围组织很少，内皮细胞量较少时，注入的假体可在种植前采用手术埋在具有更高含量内皮细胞的组织中。一些心血管植入物，如人造血管，心血管贴片和支架移植物，具有多孔性，其数量足够内皮细胞通过孔洞的生长，其他一些心血管植入物，如心瓣膜是无孔的。

更特殊的是，根据本发明通过传递一种核酸至周围组织的医疗植入物内皮化的方法，作为一种改善哺乳动物，如人类，的机体对一种合成表面的接受性的方法而公开，其中该方法包括，引入体内一个含有一个合成表面的装置，该装置至少部分与血液，体液和/或组织接触，将一种存在于一个生物相容介质中的核酸应用于其周围。该方法的特征是核酸编码一个翻译或转录产物，该产物能在体内在所述的合成表面上至少部分促进内皮化，所述的核酸的给药可在将装置引入体内之前，同时或之后进行。如上所述，根据本发明关于本装置，核酸可以裸露的形式，在一个病毒载体，如一种逆转录病毒，一种仙台病毒，一种腺伴随病毒或一种腺病毒，或在一个脂质体中的形式给药。

根据装置的特性，即接受植入物的患者的条件，核酸可编码一种蛋白或一种多肽，选自成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板生长因子(PDGF)，转化生长因子(TGF)和表皮生长因子(EGF)家族，胎盘衍生生长因子(PIGF)，肝细胞生长因子(HGF)和血管生成素，特别是血管内皮细胞生长因子(VEGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)。

在一个实施方案中，核酸在装置进入一个哺乳动物体内之前应用于装置的周围，即组织中。可以选择的是，核酸在装置进入之后应用于周围组织中。如本领域专业技术人员所能理解的，可以组合使用这样的给药方式，如首先在引入装置周围给予特定的剂量，其他一次或多次追加给药，可以根据预先确定的方案，或根据机体的接受性和在合成表面上新生的内皮细胞生长速度来确定。

在另一个实施方案中，核酸在将装置引入一个哺乳动物体内前给予或与装置贴附。在一个特殊的实施方案中，可以通过将核酸与核心离子或共价键结合来完成。如果适合，这个实施方案可与上面提到的最后一个方案结合起来，以便可以在将装置用核酸预处理时，提供一种方法，而后来围绕装置的组织被进一步追加存在于一个适合载体中的核酸。在一个实施方案中，由于其简易性而具有优势，所述的载体是无菌水或无菌的水溶液。

在本方法的可选择的实施方案中，生物相容的介质是一种生物稳定的聚合体，一种可吸收的生物聚合体，一种生物分子，一种水凝胶聚合体或纤维蛋白。

本方法可用在任何哺乳动物的环境中，如用于人体以增加一种外源物，至少部分是人造的装置，如一种医疗植入物，的生物相容性。进一步，本方法可用于监测，其中引入了一个生物传感器或其他类似的装置。

因此，如上所述以及如下面进一步所详述的，用于本方法的装置可以是一种用于心血管外科的植入物，一种替代机体一部分的装置，如一根血管，一种进入人体的装置，如一种血管内植入物，一种组织植入物，或一种生物传感器。

总之，根据本发明，关于治疗性基因的传递和表达，普通的技术人员知道，不同的基因信号和处理事件可控制一个细胞中核酸和蛋白/肽的水平，如转录，mRNA翻译，和翻译后的处理。这些步骤可被细胞内存在的许多其他成分所影响，如其他蛋白，核糖核苷酸浓度以及类似物。

相应地，一般来说，本发明涉及了血管生成装置，该装置一般被认为是模塑的或设计的血管植入物-基因组合物。本发明的装置是天然存在的一种组织相容性植入物，其中一种或多种血管生成性基因与植入物有关。基因和植入物成分的组合可以由本领域的专业技术人员来决定，以便使装置能在植入时刺激血管生成，因此它们的形状适合体内的植入部位。

附图说明

图1显示了分泌的人VEGF165，FGF-2和FGF-5的Western斑点杂交分析。表达质粒pNGVL1-β-胶(阴性对照)，pNGVL-3VEGF165，pNGVL7-FGF-2和pNGVL3-FGF-5分别采用磷酸钙技术暂时转染进入HEK293细胞。细胞在转染后24小时用PBS冲洗，并添加无血清培养基。继续孵育24小时后收集培养基，采用特异抗体通过Western斑点杂交分析VEGF165，FGF-2和FGF-5蛋白。VEGF165在非还原条件下如期望的进行二聚化。

图2显示来自短暂转染的HEK293细胞的含有VEGF165，FGF-2或FGF-5的条件培养基，可在鸡尿囊膜测定试验中刺激血管发生。来自对照质粒pNGVL-1-β-胶短暂转染的HEK293细胞的条件培养基，没有刺激作用。在一张滤膜上添加条件培养基(10μl)，然后置于尿囊膜的无血管区。切下滤膜并在3天后拍照。

图3显示表达质粒pNGVL3-VEGF165当在体内用于大鼠腹主动脉时可产生mRNA。600μg pNGVL3-VEGF165添加至大鼠腹主动脉周围。腹主动脉和周围组织在7天后切除，立即在液氮中冷冻。提取总RNA，采用寡dT引物进行逆转录。立即采用基于人VEGF165 cDNA插入物的上游载体序列的一个反义引物进行PCR，基于人VEGF165序列的反义引物可产生所期望片段的扩增。如果不进行逆转录(RT)，则检测不到扩增产物。来自用对照质粒pNGVL1-β-胶转染组织的cDNA进行PCR也不能得到任何扩增产物。也可使用一部分GAPDH的引物，显示所制备的cDNAs具有很好的质量。

实验

下面的章节是用来描述本发明的，并不能解释为在以各种方式限制本发明。下面所给和本申请书中其他的文献在此加入作为参考。

本实验章节将首先描述可选择的材料和方法，可在上下文中应用以在所附加的权利要求中提供尽可能多的可能性。此后，在有大标题的实例中，也将提供用来描述本发明的效应及其优势的实验的特殊公开书。

材料和方法

1. 核酸植入物内皮化促进基因：

如在此所述，术语“植入物内皮化促进基因”用来指一种基因或一个DNA编码区，它们可编码一种多肽或一个肽，能够促进或辅助促进植入物内皮化或血管化的一种蛋白，或增加植入物内皮化或血管化的速率。术语促进，诱导和刺激在本文中可交叉使用，是指直接或间接的过程，最后可形成植入物内皮细胞和/或毛细血管，或增加植入物内皮化和/或毛细血管化的速率。因此，一种植入物内皮化促进基因是一种基因，当它表达时，可引起细胞显性改变，这样或者细胞分化，刺激其他细胞分化，吸引植入物内皮化促进细胞，或以某种方式发挥作用，最后引起新生的植入物内皮细胞形成。

一般来说，一种血管植入物内皮化促进基因的特征也可以是一种能够在人造血管周围组织中刺激内皮细胞生长的基因，因此可以促进植入物内皮化或血管化。因此在某些实施方案中，本发明的方法和成分可能会刺激人造血管本身和围绕它的组织中的内皮细胞的生长。

已知有许多种血管生成激素，均可适合与本发明一起使用。血管生成基因和它们编码的蛋白包括，例如，激素，许多不同的生长因子和细胞因子，生长因子受体基因，酶和多肽。适当的血管生成因子的实例包括PDGF超家族的成员，如所有突变体VEGF，成纤维细胞生长因子，如酸性FGF，碱性FGF和FGF-5，TGF基因家族，包括TGFs1-4，和TGF-β，血管生成素家族，如Ang1和Ang2，和肿瘤坏死因子aTNF，b-TNF，和PIGF和HGF/SF。

某些优选的血管生成基因和DNA是VEGF和那些FGF家族的成员。关于基因和多肽目前文献中所使用的术语中有很大的变化。对于那些本领域技术人员来说可以理解的是，所有一种活性血管生成蛋白的基因可考虑在本发明中使用，不管是否使用不同的术语。例如，VEGF可能指血管通透因子或vasculotropin，bFGF可能是指FGF-2。

几种血管生成基因的DNA序列在科研文章和美国专利中均有所描述，专利如5,928,939，5,932,540，5,607,918，5,168,051，4,886,747和4,742,003。

如在上述专利中所公开的以及可为那些本领域技术人员所了解的那样，一种重组基因或一种DNA的最初来源可用于一种治疗方案中，不需要与所治疗的动物是同一物种。关于这一点，可以考虑使用任何重组的血管生成基因来促进一个人类受试者或一种动物，如马，体内人造血管的内皮化。特别优选的基因是来自人的基因，如这些可最优选用于人类治疗方案中的基因。通过分离的DNA和基因编码的重组蛋白和多肽经常指，有前缀r的是重组的，rh是重组人的。

为了制备一种血管生成基因，基因片段或cDNA，可参考在此公开的内容和任何专利的内容或在文献列表中提到的科学文献或是科研文献。例如，可以通过采用分子生物学技术，如聚合酶链式反应(PCR)，或筛选一个cDNA或基因组文库，采用基于上述核苷酸序列的序列的探针来获得VEGF或FGF-2和FGF-5片段。这样一种技术的实践对于那些本领域的技术人员来说是一个常规的事情，如在许多科学文章中所教授的，如Sambrook等，在此加入作为参考。在本成分和方法中特别优选使用的血管生成基因和DNA片段是VEGF，FGF-2和FGF-5。也可以考虑进一步克隆编码一种血管生成蛋白或多肽的基因或cDNA。克隆DNA的技术，即从一个不同于DNA其他部分的DNA文库中获得一个特异的编码序列，在本领域是已知的。例如，这可以通过筛选一个适当的DNA文库来实现。筛选的步骤可以基于寡核苷酸探针的杂交，该探针是根据编码相关血管生成蛋白的已知DNA序列的氨基酸序列许多部分来设计的。这样筛选步骤的操作对于那些本领域技术人员是已知的，在科研文献中详细的描述，如Sambrook等人(Sambrook等，分子克隆：实验室指南，1989，Cold Spring Lab Press；Inniste等人，PCR策略，1995，Academic Press，New York)。

血管生成基因，具有与文献中所描述不同的序列，也包括在本发明中，只要改变或修饰的基因仍然可编码一种蛋白，其功能是以任何直接或间接的方式，刺激心血管或组织植入物的周围组织。这些序列包括那些由点突变引起的序列，由于基因代码简并或天然发生的等位基因突变引起的序列，和进一步通过基因工程引入的修饰，即通过人工的修饰，如一条杂交基因。

引入改变的核苷酸序列的技术，是设计用来改变在本领域已知的编码蛋白或多肽的功能特性。

这些修饰包括碱基的缺失，插入或替代，因此改变氨基酸序列。这些改变可用来增加一种蛋白的血管生成活性，增加其生物学稳定性或半衰期，减少其降解，增加其分泌，改变其糖基化的形式，以及类似情况。所有这些核苷酸序列的修饰均包括在本发明中。

也可以理解的是，一种或超过一种的血管生成基因可用于本发明的方法和成分中。因此核酸的输送可给予一种，两种或多种血管生成基因。可应用的基因的最大数目仅受实际情况的限制，如同时进行制备大量的基因构建物或具有引起毒性副作用的可能性。基因的特殊组合可以是两个或多种血管生成基因，或可以是与一种激素基因结合的生长因子基因。一种基因或生长因子可与一种基因结合，该基因编码能与前一基因的一种多肽产物相互作用的一种细胞表面受体。一种血管生成基因也可与编码反义产物的基因相结合。在使用多种基因时，基因可与在一个或多个启动子控制下的单一基因产物相结合，或可作为同一或不同类型分别的构建物进行制备。因此可以使用不同基因和基因构建物的无数组合。特定的基因组合物可设计用来，或其应用的结果是，在血管发生和内皮化中产生协同的效应。任何所有这些组合物应该属于本发明的范围。实际上，许多协同效应已经在科学文献中有所描述，其中本领域的一个技术人员可以很容易的鉴定可能的协同性的基因组合物或其基因蛋白组合物。也可以选择另一个具有降低血栓形成，纤维化，或新生内膜增生的基因。另一个基因可编码一种蛋白，该蛋白抑制新生内膜细胞的增生，例如诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)或内皮细胞一氧化氮合成酶(ecNOS)。可抑制血栓形成，如前列环素，组织酶原激活物(tPA)，尿激酶和链激酶的蛋白或酶蛋白产物，也是共转染的目标。血管生成基因也可以与其他基因结合，后者可在转录或翻译水平抑制血管生成因子的过度表达。给药可在血管生成性核酸的给药之前，同时或之后进行。

将可以理解的是核酸或基因，如果需要，可以进一步与药剂，如蛋白，多肽，相似的寡核苷酸，转录因子，耦合核苷酸或多种药物活性剂，刺激血管发生的生长因子，类似纤维连接蛋白的粘附分子，可促进内皮化的如肝素的物质联合应用。也可以使用免疫抑制剂和抗炎物质和抗再狭窄物质。只要基因物质形成了组分的一部分，假定添加剂不会在与靶细胞或组织接触时引起明显的副作用，实际上对包含其他成分没有限制。因此核酸可与许多其他的药剂一起输送。核酸也可以与一种植入物一起辐射状的给予周围组织，与血管生成一起发挥特殊的效应。

也可以理解的是核酸或基因应用时可同时进行细胞接种或覆盖的操作，也可同时进行基因工程修饰细胞的接种或覆盖。

基因构建物和核酸：

如在此所述，术语基因和核酸均可用来指一种已经分离的DNA分子，不含一种特殊物种的总基因组DNA。因此，一种基因或一种编码一个血管生成基因的DNA是指一个含有编码一种血管生成蛋白序列的DNA，但它是从获得DNA的物种的总基因组DNA中分离或纯化的。术语DNA也包含DNA片段和这样片段的更小片段，以及重组载体，包括，例如质粒，粘粒，人造染色体，噬菌体，慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，以及类似物。

术语基因单纯用来指一种功能性蛋白或肽的编码单位。如本领域技术人员可以理解的，这种功能性的术语包括基因组序列和cDNA序列。当然，它也指最初分离的DNA片段，并不排除基因或编码区，如编码引导肽或靶序列的序列，后者被人工地加入到片段中。

本发明提供了应用多种已知血管生成性DNA片段和重组载体的新方法。许多这样的载体很容易获得。但是，不需要使用高度纯化的载体，只要应用的编码片段编码一种血管生成基因，不包括任何在围绕心血管或组织植入物的组织中具有副作用的编码或调控序列。因此，也将可以理解的是有用的核酸序列可以包括附加的残基，如附加的位于编码区的5’或3’端的非编码侧向序列，或包括多种内部序列，即已知在基因内的内含子。

在鉴定一种适当的血管生成性基因或DNA分子之后，可以将其插入到许多本领域目前已知的许多载体中的任何一个中。以这种方式，可在掺入至围绕植入物的组织中时，引导血管生成性蛋白的表达和产生。在一个重组表达载体中，DNA片段的编码部分可在一个启动子的控制下定位。启动子可以是与一种血管生成基因天然相连的形式。编码的DNA片段也可在一种重组的，或异种的启动子的控制下定位。如在此所使用的，一种重组的或异种的启动子是用来指一种在其天然环境中不能与一种血管生成性基因正常相连的启动子。这样的启动子可包括那些正常与其他血管生成性基因相连的启动子，和/或从任何其他的细菌，病毒，真核细胞或哺乳动物细胞中分离的启动子。很自然，使用一种可在人造血管周围组织中有效引导DNA片段表达的启动子是很重要的。使用重组启动子来获得蛋白表达是分子生物学专业的技术人员所熟知的(Sambrook等)。使用的启动子可以是构成性的或诱导性的，可以在适当的条件下用来引导所引入的DNA片段的高水平或可调控的表达。目前优选的构成性启动子可以是，例如CMV，RSV LTR，免疫球蛋白启动子，单独的SV40启动子，以及与SV40增强子结合的SV40启动子，调控性启动子，如四环素调控的启动子系统，或金属硫堇启动子。启动子可以或不与增强子相连，其中增强子天然是与特殊的启动子或不同的启动子相连的。终止区可为生长因子编码区提供3’端，其中终止区天然与胞浆区相连，或具有不同的来源。可使用多种终止区，而不会反过来影响表达。在多次操作后，可以克隆得到的构建物，分离的载体，基因筛选或测序可保证构建物的正确性。可以使用限制性分析，测序或类似的方法进行筛选。

血管生成性基因和DNA片段也可是一种DNA插入物的形式，它可以定位在一种重组病毒的基因组中，例如，重组腺病毒，腺伴随病毒(AAV)或逆转录病毒。为了将基因与植入物周围组织接触，在这种实施方案中，可以制备重组的病毒颗粒，包含血管生成性基因插入物的基因组，仅用病毒与植入物周围组织接触，其中病毒感染细胞，并传递基因物质。在本发明的一些实施方案中，可以将病毒以一种成分的形式贴附于一个植入物上，如一个人造血管，心血管贴片，支架移植物或移植物连接物，然后就地将植入物与植入物周围组织接触。病毒可从成分中给予，其中细胞可长入植入物中，在此与病毒接触，被病毒感染，结果细胞摄取所需要的基因或cDNA，表达所编码的蛋白，反过来引起血管发生和植入物的内皮化。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法涉及制备一种成分，其中血管生成性基因，多种基因，或DNA与一种人造血管，一种心血管贴片，一种支架移植物，一种心脏瓣膜，一种移植物连接物，或一种组织植入物贴附或注入其中，形成一种人造血管的，心血管贴片的，血管内移植物的，移植物连接物的，心脏瓣膜的，组织植入物的基因成分，然后人造血管的，心血管贴片的，支架移植物的，移植物连接物的，心脏瓣膜的，组织植入物的基因成分置于所述心血管或组织植入物周围组织中与其接触。人造血管的，心血管贴片的，支架移植物的，心脏瓣膜的，移植物连接物的，组织植入的基因成分是所有那些其中的基因可以被所述植入物吸收，或因此保持与其接触的物质。

2. 核酸向植入物装置周围组织细胞中的传递

一旦制备或获得合适的血管植入物基因成分，所有需要将血管生成性基因输送至周围组织的成分可以采用手术将心血管植入物基因或组织植入物基因成分，或借助导管，与机体所需要的部位接触，可以或不首先包裹在周围组织中。对于本领域的技术人员该方法是已知的。血管生成基因也可以在将心血管或组织植入物种植到部位之前，之间或之后应用。它可以是一个动静脉瘘，动脉旁路移植物，支架，心脏瓣膜，心脏辅助装置，吻合装置，瓣环成形术，血管导管，人造器官，器官植入物，矫形植入物，缝合材料，外科贴片，钳子或纱布，或任何医疗设备，所有这些至少包括一个合成表面。

在本发明中，一种或多种载体可传递至任何周围组织中，优选是一个哺乳动物的组织。几篇文章均探讨了使用基因转染来治疗或防止疾病(Levine和Friedman，Curr Opin in Biotech 1991；2：840-44，Mulligan，Science 1993；260：926-32，Crystal，Science 1995；270：404-410，Rowland，Ann Thorac Surgery 1995；60：721-728；Nabel等人，科学1990；249：1285-88)。真核宿主细胞最佳是存在于体内。根据本发明，细胞与本发明的载体的接触可以通过任何方式，通过这些方式载体可被引入至细胞中。这样的引入可通过任何适当的方法。优选，载体可通过转染的方式被引入，即采用裸露DNA自然进入细胞内的能力(如，载体经受受体介导的内吞的能力)。但，载体也可通过任何其他适合的方式被引入，如通过转导，磷酸钙介导的转化，微注射，电穿孔，渗透性休克，以及类似方法。

对于多种细胞可以使用的方法，可在载体受体的数量上，载体的细胞表面受体的亲和活性上有所变化。根据本发明，在体内可考虑进行基因输送的细胞类型包括所有的哺乳动物细胞，更优选的是人类的细胞。载体可制入适合与适当的赋形剂(如药学可接受的)一起接触细胞的成分中，这些赋形剂如运载体，佐剂，赋形剂或稀释剂。制造这样一种成分的方法和应用的方法，在本领域中已有描述。当合适时，载体可以制成固体制剂，半固体，液体或，气雾剂形式，如气雾剂，喷雾，糊剂，软膏，凝胶，胶，粉末，颗粒，溶液，注射液，乳酪和乳滴，可以采用其分别的传统的给药方式给予，不排除其他任何方法。也可以使用一种不影响本发明成分效果的药学可接受的形式。在药物用药的形式中，可单独使用成分，或以合适的组合形式，以及与其他药物活性成分联合使用。例如，编码VEGF的核酸可与编码抑制血小板沉积或平滑肌细胞增殖的核酸一起使用。相应地，本发明的药学成分可经多种方式输送至哺乳动物体内的多个部位以发挥特殊的效应。本领域的技术人员可以认识到虽然不只一种方法可用来给药，但可提供一种较其他方法更迅速和有效的方法。对在体内植入物周围组织局部输送可以通过使用在植入物局部应用或滴注药剂，或直接给药的方式，或其他任何的局部给药方法来完成。用这种方法的给药可使药物具有部位特异性，给予高浓度和/或高度潜能药物的方式仅限于对靶组织的直接给药。优选的方法是将核酸以水溶液的形式输送，溶液中加入纤维蛋白，水凝胶，粘多糖，多糖，或任何其他的生物相容性聚合载体基质，如藻酸盐，胶原，透明质酸，聚亚胺酯，纤维素，它们至少可覆盖植入物的一部分(5,833,651)。将核酸加入至聚合体包被的植入物，可在植入物制造时，或由医生在植入之前，之间或之后进行。纤维蛋白具有许多特性使其特别适合维持基因的输送。纤维蛋白具有孔洞，间隙和空间可以支持和为核酸提供空间。在植入后，核酸从纤维蛋白网中移出至植入物周围组织。纤维蛋白能脱水和再水化，可使纤维蛋白覆盖的植入物适合以液体悬浮液的形式接受核酸。纤维蛋白也是生物可降解的，在一个纤维蛋白/核酸植入物上的纤维蛋白生物降解可促进核酸与周围组织的接触。包含纤维蛋白和载体的聚合体成分可为基因输送提供稳定的成分。聚合体也可以是一个生物稳定的或一个可生物可吸收的聚合体，根据所需要的聚合体给予的速率或稳定性的程度来确定。可以是天然的或人造的化合物，也可以包括化合物的衍生物和盐类。更需要一个可生物吸收的聚合体，因为不引起慢性的局部反应。可使用的可生物吸收的聚合体包括，但不限于，聚L-乳酸，聚己酸内酯，聚(丙交酯-联乙交酯)，聚羟基丁酸，聚羟基丁酸联戊酸盐，聚二噁烷，多元酸酯，聚酸酐，聚羟基乙酸，聚D，L-乳酸，聚乳酸-聚羟基乙酸，polyglactin，聚二乙双酮，聚葡糖酸盐，聚羟基乙酸-联环丙烷羧酸酯，聚磷酸酯，聚磷酸酯氨基甲酸乙酯，聚合氨基酸，氰基丙烯酸酯，聚环丙烷羧酸酯，聚氨基羧酸酯，联聚醚酯(如，PEO/PLA)，聚亚烃基草酸盐，聚磷晴和生物分子，如纤维蛋白，纤维蛋白原，纤维素，淀粉，胶原，粘蛋白，纤维连接蛋白和透明质酸。也可使用具有相对低的慢性组织反应的生物稳定的聚合体，如聚亚胺酯，硅酮，如果可以在植入物中溶解，治愈或聚合，可使用聚酯，如polyelolefins，聚异丁烯和乙烯-α-烯烃共聚物；丙烯酸聚合体和共聚物，卤化乙烯基聚合体和共聚物，如聚氯乙烯；聚乙烯醚，如聚乙烯甲酯；聚卤化偏乙烯，如聚氟偏乙烯和聚氯偏乙烯；聚丙烯腈，聚乙烯酮；聚乙烯芳香族，如聚苯乙烯，聚乙烯酯，如聚乙烯乙酯；乙烯基单聚体相互共聚及与烯烃的共聚物，如乙烯-乙烯乙酸酯共聚物：聚酰胺，如尼龙66和聚己内酰胺；醇酸树脂；聚碳酸酯；聚氧化甲烯；聚酰亚胺；聚醚；环氧树脂；聚亚胺酯；人造纤维；三醋酸盐人造纤维；纤维素，醋酸纤维素，丁酸纤维素；乙酸丁酸纤维素；玻璃纸；硝酸纤维素；丙酸纤维素；纤维素醚；和羧甲纤维素(5,776,184)。也可将纤维蛋白与其他生物相容性聚合体一起使用，或是天然的，或是人造的及其衍生物和盐。聚合体多糖是有优势的。在一个方面，具有聚合体和药物的固体/固体溶液。这就意味着药物和聚合体均可溶解在同一种溶剂中，并已在溶剂的存在下充分混合。药物和聚合体可以多种方式应用，如通过简单的将植入物浸入溶液中，或将溶液喷射至植入物上(5,776,184)。可使用多种水凝胶聚合体，如选自多羧酸，纤维素聚合体，明胶，藻酸盐，聚2-羟乙基甲基烯酸酯(HEMA)聚乙烯吡咯烷，马来酐聚合体，聚酰胺，聚乙烯醇，聚环氧乙烷，聚乙二醇，聚丙烯酰胺，多酸类，如聚丙烯酸，多糖，如粘多糖如透明质酸(5,674,192)(5,843,089)。在植入物上聚合体可以是多孔的或无孔的。可以使用几层聚合体，在同一植入物中也可组合几种不同的聚合体。不同的层面和不同的聚合体可负载不同的药学物质(5,833,651)。植入物的一个或多个表面也可以用一种或多种聚合体的附加包衣来包被，该聚合体是同一种或与不同于第二种聚合体。包衣的粘附和药物输送的速率可以通过选择一种适当的可生物吸收或生物稳定的聚合体，以及通过溶液中药物与聚合体的比例来控制(5,776,184)。应用于组织的药物剂量也可以通过调节药物预先浸入水凝胶包衣的时间来控制，通过水凝胶包衣来确定药物溶液吸收的量。其他影响药物剂量的因素是在包衣中使用的溶液中的药物浓度，以及水凝胶包衣的药物给予能力，它的确定可以根据，例如水凝胶包衣的稠密度，其弹性，多孔性和水凝胶包衣保持药物的能力，如通过改变PH来改变。对于一种特殊的药物，其优势是选择了一种水凝胶包衣，这样在应用于部位之前大体上不给至体液中。聚合体和药物的固体/固体溶液的给予可进一步通过改变在多个层面上药物与聚合体的比例来控制。包衣不需要聚合体和药物的固体/固体溶液，但要从应用于植入物的药物和聚合体的任何组合中提供。溶液中治疗性物质与聚合体的比例要依赖于聚合体保护治疗性物质到达植入物之上和包衣给予治疗性物质至组织的速率的效率。如果在将治疗性物质保持在植入物上的效率相对低，就需要更多的聚合体，需要更多的聚合体来提供洗脱基质，该基质能限制极高溶解性的治疗性物质的洗脱。因此，适合的治疗性物质与聚合体的比例很宽，可从大约10∶1至1∶100(5,776,184)。药物的结合也可以通过将药物静电吸引至包衣上，或一个包衣添加物或一种机械式的结合，例如通过应用一种包衣，其孔径大小可抑制体液的内流或药物本身的外流，这样可能造成药物的给予。

水凝胶是特别有优势的，因为药物可固定在由凝胶形成的水凝胶结合基质中(5,674,192)。水凝胶的实例是，如HYDRO-PLUS.RTM(5,674,192)，CARBOPOL.RTM(5,843,089)，AQUAVENE.RTM(4,883,699)，HYPAN.RTM(4,480,642)。在某些情况下，水凝胶可在与植入物连接之前进行交联，例如包被在一种血管或血管内移植物上的水凝胶可在水凝胶沉淀在植入物上之前与一种引物浸液相接触。如果已经交联，它可在植入物表面形成一个相对永久的连接，如果仍未交联，则在植入物表面上形成一个相对可降解的连接。例如，在支架连接中的一种给定水凝胶交联形式的寿命，至少是未交联形式的两倍(5,843,089)。可以选择的是，水凝胶连接在原位，与一种交联剂相接触(5,843,089)。一般来说，当干燥时，水凝胶包衣优选大约1至10微米厚，典型为2至5微米。也可以是非常薄的水凝胶包衣，如大约0.2-0.3微米(干燥时)，以及更厚的水凝胶包衣，如超过10微米(干燥时)。典型地，当水凝胶水合时，水凝胶包衣的厚度可膨胀至大约6至10或更高的系数(5,674,192)。通常，聚合的载体将是可生物降解的或可生物排泄的(例如在5,954,706，5,914,182，5,916,585，5,928,916中所教授的)。载体也可以构建成为一种充满孔洞的可生物降解的物质，并通过基质的进行性溶解而给予一种或多种物质进入周围组织中。随后，孔洞将开放。被输送的载体可以是编码治疗性蛋白的核酸，如一种裸露核酸或插入至一种病毒载体中或脂质体中的一种核酸。一种裸露的核酸是指一种不插入至一种病毒或脂质体中的单链或双链DNA或RNA分子。可特异与互补mRNA分子结合的反义寡核苷酸因此可以降低或抑制蛋白的表达，也可以经水凝胶的包衣被输送至植入物部位(5,843,089)。一般来说，核酸与植入物的贴附也可通过几种方式进行，如通过采用共价或离子结合技术。典型地，共价结合技术需要使用偶联剂，如戊二醛，溴化氰，p-苯醌，琥珀酐，碳化二亚胺，二异氰酸盐，氯甲酸乙酯，二硫联吡啶，氯环氧丙烷，叠氮化物，其中，不排除其他试剂，但使用本发明所描述方法的任何方法均可以使用，并将为本领域技术人员所认可。一种生物分子与一种表面的共价偶联可能在生物分子之间产生不需要的交联，因此会破坏生物分子的生物学特性。它们也可在表面功能部位中建立一些连接点，因此抑制了贴附。一种生物分子与表面的共价偶联也会破坏生物分子的三维结构，因此降低或破坏了生物学特性(5,928,916)。离子偶联技术具有不改变结合的生物分子的化学成分的优点，生物分子的离子偶联也具有可在适当条件下给予生物分子的优势。一个实例是(4,442,133)。目前通过离子键固定生物分子的技术已经可以通过在生物材料表面使用季铵盐引入阳性电荷的方式来达到，含有叔胺和季胺基团的聚合体，如TDMAC，benzalconium chloride，西吡氯铵，氯苯二甲硬脂铵，氯苯十六烷基二甲铵，胍或双胍部分(5,928,916)。当经皮输送血管植入物时，可加入一个壳部件，来抑制在导管的放置过程中药物向体液中的给予。例如，可以是聚乙二醇，明胶，聚乙烯醇，聚环氧乙烷，聚乙二醇，或一种生物可降解的或可热降解的聚合体，如白蛋白或聚醚胶F-127(5,674,192)。当实施和使用本发明的方法和成分时，贴附结合方法的特殊类型是不重要的，只要从植入物中给予的核酸可刺激周围组织，其方式是它们被激活，在体内实施方案的情况下，最后可引起心血管或组织植入物的内皮化，而不引起副反应。在此描述的方法决不是包括一切的，进一步适合特殊应用的方法对于本领域的专业技术人员是显而易见的。

本发明的成分可以单位药物剂量的形式提供，其中每个药物剂量单位，如溶液，凝胶，胶，微滴和气溶胶，含有预定量的成分，单独或与其他活性剂适当联合。术语单位药物剂量形式，如在此所使用的，是指适合人或动物受试者单次给药的物理上的不连续单位。其中每个单位含有预定量的本发明成分，单独或与其他活性剂相结合，计算的量足以产生所需的效应，当合适时可一起使用一种药学可接受的稀释剂，载体，或赋形剂。对于本发明的单位药物剂量形式的详细说明要根据要达到的特殊效应，和在特别的宿主中与药物成分相关的特殊药效学。

相应地，本发明也提供了一种将一种治疗性基因转染给一个宿主的方法，该方法包括应用本发明的载体，优选在植入物中的一部分成分，采用前述的给药方法，或对于本领域技术人员已知的可选择的方法。有效量的成分可以在一个宿主中产生所需的效应，可以采用本领域技术人员已知的几种结果判定法来监测。根据本发明，一种载体有效地将基因转染给一个宿主细胞，可以以治疗的效应来监测(如，表面毛细血管和内皮化的形成)，或进一步通过在宿主内传递基因的证据或基因表达的情况来监测(如，采用聚合酶链式反应结合测序，Northern或Southern杂交，或转录分析来检测宿主细胞中的核酸，或采用免疫斑点分析，抗体介导的测定，mRNA或蛋白半衰期研究，或检测由转染核酸编码的蛋白或多肽的特殊测定法，或由于这样的传递对水平和功能的影响)。在实施例中所描述的一种这样特殊测定法包括检测VEGF基因编码蛋白的Western免疫测定。这些方法决不是包括一切的，进一步适合特殊应用的方法对于本领域的专业技术人员是显而易见的。而且，有效量的成分可进一步接近已知可发挥所需效应的化合物(如，传统用来刺激血管发生的化合物可指导VEGF和FGF-5核酸用于宿主时的剂量)。

而且，根据本发明包含在成分中的每个活性剂的优选剂量，包含的VEGF优选在大约0.1微克至10000微克(虽然可使用任何适合的量，或在其之上，即超过大约10000微克，或在此之下，即小于大约0.1微克)，可对医生所使用的每种成分的范围提供指导，以在体内使用时优化本发明的方法。类似地，包含的FGF-5和FGF-2质粒范围在0.1至10000微克之间(虽然可使用任何适合的剂量，或在其之上，即超过大约10000微克，或在其之下，即小于大约0.1微克)。FGF-5在体优选在10⁷至10¹³个病毒颗粒的范围内，尽管可使用任何适合的剂量，或超过10¹³或少于10⁷。而且，这样的范围决不排除使用更高或更低剂量的成分，这在一些特殊的应用中可能会被考虑。例如，实际的给药和方案可根据是否该成分与其他药学成分联合应用，或根据在药物动力学，药物分布，代谢的个体间差异而变化。而且，在每个细胞中加入的载体的量将可能根据插入至载体中的基因的长度和稳定性，以及序列的特性来变化，是一个特殊的需要经验来确定的参数，可根据与本发明方法无关的因素来变化(例如，合成相关的成本)。本领域的技术人员可很容易的根据特殊情况的紧急条件而作出任何必要的调整。应用于周围组织的基因构建物的量或应用于植入物或组织中的基因成分的量，将最终由主治医生或兽医在考虑多种生物学和医疗因素后来确定。例如，希望考虑特殊的血管生成基因和血管植入物材料，患者或动物的大小，年龄，性别，饮食，应用的时间，以及任何可能影响内皮化的临床因素，如多种因子和激素的血清水平。适当的用药方案因此将很容易的由本领域的技术人员在将来公开书的指导下，考虑个体情况后来确定。

同时，对于这些实施方案，当一种或多种不同的载体(即，每一个编码一个或多个不同治疗性基因的载体)在这里描述的方法中使用时，细胞与多种本发明成分之间的接触可以任何顺序进行，或同时进行。优选同时进行。

3. 促进内皮化的组织

本发明提供了采用基因来刺激多孔材料植入物从周围组织内皮化的便利方法。在此所使用的周围组织是指任何或所有具有最终可在植入物表面形成，或有助于形成新生内皮细胞的那些细胞。这包括了以多种形式的多种组织，如胸膜，心包，腹膜，网膜，脂肪和肌肉。

只要被刺激的细胞激活的方式，在体内实施方案的情况下，最后可引起植入物的内皮化或毛细血管化，被本发明的方法和成分刺激的周围组织的类型或特殊类型则不重要。

周围组织也用来特别指那些定位在植入物内，与其接触，向植入物移行的细胞，其中细胞可直接或间接刺激内皮细胞和/或毛细血管的形成。正是如此，微血管内皮细胞可以是形成内皮细胞的细胞。在刺激时，可进一步吸引内皮细胞的细胞，在本公开书的上下文中，也可以认为是周围组织，因为它们的刺激作用间接地引起内皮化。影响内皮化的细胞间接地通过多种生长因子和细胞因子的作用，或通过它们与其他细胞类型的物理相互作用起作用。周围组织细胞也可以是被吸引的或再返回至该区域的细胞。虽然引起科学家的兴趣，周围组织细胞刺激内皮化的直接或间接的机制并不是本发明实践所考虑的。

周围组织细胞可以是在其天然环境中到达活化的人造血管，人造血管内内皮化，或组织植入物血管化区域的细胞或组织。就周围组织而言，这些细胞也可以是被吸引或重新再返回该区域的细胞。

根据本发明，周围的细胞和组织将是那些到达希望内皮化的心血管植入物表面的细胞和组织，或是那些到达希望血管化的组织植入物表面的细胞或组织。

相应地，在治疗的实施方案中，鉴定对现在的治疗性成分适合的周围组织和应该应用的心血管和组织植入物是没有困难的。在这个实例中所有需要的是要获得一个适当的刺激性成分，如在此公开的，并将心血管或组织植入物与刺激性成分和周围组织接触。这种生物学环境的特性是合适的细胞将在缺乏任何进一步的医生需要鉴定的靶目标或细胞时被激活。

本发明的一个方面一般涉及将周围组织与一种由一种或两种基因(具有或不具有附加的基因，蛋白，生长因子，药物或其他生物分子)组成的成分接触，以及一种在所述的细胞中促进所述基因表达的一种心血管或组织植入物。如所概要的，细胞可以在体内进行接触。这可以大多数直接的方式，仅通过获得一种功能上可促进内皮化的基因构建物，并将此构建物应用于细胞而达到。将细胞与DNA，如一种线性DNA分子，或质粒形式的DNA，或一些含有在一个启动子控制下的目的基因，以及适当的终止信号的其他重组载体接触，就足以摄取和表达DNA，不需要进一步其他的步骤。

在优选的实施方案中，将周围组织与促进内皮化的成分接触可在体内进行。此外，这种过程的一种直接结果是细胞摄取和表达基因，翻译或转录产物可刺激血管发生，引起植入物的内皮化和/或毛细血管化，不需要医生进行其他的步骤。

4. 根据本发明在装置中使用的材料

如在此所使用的，下面的术语和单词应该具有下面所描述的意思。可植入的医疗装置，简单说是指植入物，装置或假体是指制造的一种物体，至少部分来源于一种生物材料，是用来与机体组织，包括体液接触。生物材料应该是指用来制备一种装置的材料的成分，可提供一个或多个与组织接触的表面。如果没有特殊说明，其多孔性和变形性(如小孔和多孔)是指一种具有小的通道或通路的生物材料，这些通道或通路在生物材料的外表面(如第一个主要的表面)起始通过生物材料一直延伸至内表面(如，第二个)。其坚固和变形性，在一个不可吸收的材料的情况下，当以一种可植入的医疗装置的形式制造时，是指在使用过程中能够对抗所遇到的压力的能力，如在体内保持开放性和孔洞的结构。术语要包括将词语在广义(如，一片生物材料的两个主要的面上)和狭义(如，跨越材料的孔洞的连接)的情况下都能使用。术语“贴附”及其衍生词汇是指一种聚合物质或核酸与植入物之间的吸收，如物理吸附或化学吸附，配体/受体相互作用，共价键，氢键，或离子键。如果没有特殊说明，内皮化可与毛细血管内皮化一词交叉使用，是指在一种用来形成一个多孔的坚固的或无孔的坚固的植入物的生物材料的所有接触组织的主要表面上内皮细胞的生长。

可用于本发明的成分，装置和方法中的心血管和组织植入物的类型，只要它们是组织相容性的，实际上是不受限制的。因此，本发明的装置包括要延长与血液，体液或组织接触的医疗装置，特别是，当在体内应用时那些可因毛细血管内皮化而受益的装置。优选的装置是可在体内植入的，包括心血管植入物，组织植入物，人造器官，如胰腺，肝脏和肾脏，以及器官植入物，如乳房，阴茎，皮肤，鼻子，耳朵和矫形植入物。每个特殊的装置中毛细血管内皮化的重要性是不同的，根据装置的类型和目的而有所变化。长入的毛细血管可为血管植入物提供连接的内皮细胞，保护组织植入物免受感染，携带营养至装置中的细胞，使传感器能感受循环中的物质水平。这意味着植入物具有与生物相容性相关的所有特性，因为当用于一种哺乳动物时它们的形式不能产生副作用，变态反应，或任何其他不合适的反应。它们也适合被放置于与围绕植入物的组织相接触。后者需要考虑一些因素，如所述植入物为形成血管内皮细胞提供一种结构的能力。

优选的生物材料可在体内对所需的用途提供足够的刚度。为在形成一种血管移植物和心血管贴片中使用，例如，生物材料要具有足够的刚度才能保证移植物在其需要的应用中维持移植物的开放。植入物材料的选择将根据血管或组织植入物植入的特殊环境和部位而变化。人造血管可由选自以下的生物材料制成，如聚四氟乙烯，芳香/脂肪族聚酯树脂，聚亚胺酯，和硅橡胶。但可以使用任何类型的生物相容性微孔网格。所述的生物材料可互相或与其他的物质相结合，如聚乙醇酸，聚乳酸，聚二乙双酮和聚葡萄糖酸盐。优选膨胀的聚四氟乙烯和涤纶。涤纶具有或不具有丝绒，或以其他方式修饰。涤纶通常是机织的、编织的或针织的，适合的纱线在10至400支之间。ePTFE的结节区由无孔的PTFE组成，后者可提供对撕扯的抵抗力(如，为了缝合和对抗动脉瘤扩张)。结节间区是由PTFE的纤维组成，可用来将结节与纤维间的空隙相连接，这些纤维可提供在此所描述的孔洞。结节的大小用由结节PTFE组成的接触组织的表面的百分比来表示。结节间的距离可用平均原纤维的长度来表示。反过来，孔洞一般是用结节间距离来表示(即，从一个结节的中间至另一个邻近结节中间的平均距离)。优选的ePTFE材料具有足够大小和频数的结节，以提供足够的强度(如，考虑动脉瘤扩张)，足够频次和纤维长度的结节间区提供足够的孔洞(允许毛细血管内皮化)。根据本说明，本领域的技术人员将能够鉴定和制造采用生物材料的装置，该材料具有适当的孔洞和刚度。生物材料优选有孔的，可以允许细胞贴附和移行，然后紧接着在表面上可以形成和生长毛细血管。适合的孔可以小通道或通路的形式存在，从一个外表面开始，部分或完全延伸通过生物材料。在这些情况下，孔洞毛细管直径横切面尺寸大于5微米，典型地小于1毫米。只要生物材料保持足够的刚度，上面孔径大小的值不重要，但不太可能的是，可使用的装置的孔径超过大约1毫米。这样的孔洞尺寸在显微镜下可以定量。如本领域技术人员可以理解的是，可以对移植物材料和表面进行几种修饰作用，如预包被以，例如，蛋白(见，如5,037,377，4,319,363)，非肝素化的全血和富血小板血浆，对表面进行热放电修饰，聚醚凝胶，纤维蛋白胶，纤维连接蛋白，粘附分子，共价键，与碳(5,827,327，4,164,045)一起，以影响表面电荷，并用一种表面活性物质或清洁剂来处理，也不排除任何其他的方法。而且，植入物可构建为一个内和外表面具有不同结节间距离的杂合体，对于结节间距离(HYBRID PTFE)，外部的值大小为60微米，内部为20微米。也可使用具有不同结节间距离的多个层面。当不抑制内皮化时，它们均是在本发明的范围之内的。潜在的可生物降解的血管植入物可与成分，装置和本发明的方法结合使用。例如，可生物降解的和化学修饰的聚乳酸，聚乙醇酸，纯化蛋白基质，半纯化细胞外基质成分，和胶原也可使用。天然产生的自体的，异体的和异种的材料，如脐静脉，大隐静脉，新生牛动脉或肠粘膜下组织可用作血管植入物材料。临床应用移植物的实例在4,187,390，5,474,824和5,827,327中公开。可生物降解或生物吸收的材料，如同聚物，如聚对二噁烷，聚赖氨酸或聚乙醇酸和共聚物；如，聚乳酸和聚乙醇酸或其他生物材料，可单独使用或与其他材料联合使用作为血管移植物材料，只要它们可提供所需的刚度。其他生物学材料，如肠粘膜下组织，纯化蛋白基质和半纯化细胞外基质成分也可使用。适当的血管移植物可输送基因成分，也可为新生的内皮细胞生长提供一个表面，即可在原位搭建成支架，内皮细胞可通过它进行移行。本领域技术人员可以理解的是任何具有生物相容性，刚度和孔洞，允许穿过移植物生长的材料均是可以接受的。

心血管贴片的背景技术在例如5,104,400，4,164,045，5,037,377中有很好的描述。在血管贴片的情况下，贴片的一侧与血液接触，而另一侧与周围组织接触以促进内皮细胞跨移植物生长。在心内贴片的情况下，血液与贴片的两侧都接触。优选的生物材料是那些在体内具有足够刚度者。血管贴片的生物材料将有足够的刚度以使贴片在其预期使用的过程中保持其形状和孔状结构。贴片材料的选择依血管贴片植入的特定环境和部位而异。血管贴片由合成生物材料制成，该种材料包括但不限于，聚四氟乙烯、芳香族的/脂肪族的聚酯树脂、聚亚氨酯和硅橡胶，但是任何类型的生物相容性多微孔网状织物都可使用。所述生物材料可以相互结合或与其它物质结合，如聚乙醇酸。优选多孔的聚四氟乙烯和涤纶。涤纶通常是机织织物，编成辫子形的或编织的，含或不含丝绒，适合的棉纱支数在10至400支之间。ePTFE的结点区域由无孔的PTFE组成，用于提供剪切承受力(如用于缝合和对抗主动脉瘤的膨胀)。结间的区域由PTFE纤维组成以连接结点，纤维间的空间构成了这里提到的多孔性。结点的大小可以表述为由结点PTFE组成的组织接触表面的百分比。结点间的距离可以表述为原纤维的平均长度。反过来，多孔性通常表述为结间的距离(即从一个结点的中点到邻近结点中点的平均距离)。优选的材料具有足够大小和频次的结点以提供适当的强度(如对于主动脉瘤的膨胀)，结点间区域具有足够的频次和纤维长度以提供适当的多孔性(以使毛细血管内皮化)。这种材料将提供较少但较粗的结点，它反过来在体内具有显著增强的强度。指定本规格，本领域内的技术人员将能够用具有多孔性和刚度适当结合的生物材料确定和制造装置。生物材料优选多孔的，使细胞得以附着和移行，这使毛细血管可以形成和生长进内腔表面。适合的孔可以以小通路或通道的形式存在，它起于外表面并贯穿生物材料。在这种情况下，孔的横截尺寸大于5微米毛细血管的直径，典型地小于1毫米。只要生物材料保持足够的刚度，孔大小的上界值是不严格的。但是，孔大小超过大约1毫米的有用装置是不大可能的。这种孔的直径可在显微镜中定量。如本领域技术人员会理解的，可以进行移植物材料和表面的数种修饰，如用例如蛋白(例如，5,037,377，4,319,363)、非肝素化全血和富血小板血浆预涂层，表面的辉光-放电修饰，添加聚醚凝胶、纤维蛋白胶、粘附分子、共价键，用例如碳(5,827,327，4,164,045)影响表面电荷，用表面活性剂或清洁剂处理，不排除其它方法。此外，植入物可被构建成内、外表面结点间距离不同的杂合体，如结点间距离在外面60微米而内面20微米(HYBRIDPTFE)。更可使用更多层的不同结点间距离。当不抑制内皮化时，它们均归于本发明的范畴。与本发明的成分、装置和方法有关，可以使用潜在的生物可降解材料，例如，同聚物如聚对二乙双酮、聚赖氨酸或聚乙醇酸，和共聚物如聚乳酸和聚乙醇酸，或其它生物材料，如纯化的蛋白基质或半纯化的细胞外间质，可以单独或与其它材料联合使用作为心血管贴片的材料，只要它们提供所需的刚度。天然存在的自体的、异体的和异种的材料如脐静脉、隐静脉、天然牛动脉、心包膜或小肠粘膜下组织也可用作心血管贴片材料。临床使用的血管贴片的实例公开于5,037,377，5,456,711，5,104,400，4,164,045中。合适的血管贴片不仅传递基因组成，而且提供了新内皮生长的表面，即，将作为内皮细胞在其上或其中移行的原位骨架。优选地，核酸附着在与血管周围组织接触的一侧。合适的心内贴片不仅传递基因成分，而且提供新内皮生长的表面，即，将作为内皮细胞在其上或其中移行的原位支架。优选地，核酸附着在心内贴片的两侧表面。可选择地，核酸附着于心内贴片的表面之一。本领域技术人员会理解，具有生物相容性、刚度和多孔性，可以内皮化的任何材料是可接受的。

支架在这里是指一个中空圆柱形的医学植入物，当它植入要治疗的管腔与管壁接触时，它将提供体腔的支撑。可以有几种不同的设计，如管状的、圆锥形的或分叉的。其结构可以诸如盘成弹簧形的、编成辫子的细丝形、穿孔的管、切开的管和拉链形，或任何其他的变化。优选地，在血管中采用的是支架，有一个与管腔接触的外表面和与血液接触的内表面。本领域的许多支架被做成独立的膜，如金属丝、塑料、金属带或网状织物，它们是弯曲的、编织的、交织的或另外制成通常的圆柱形结构。支架也可以有聚合体的或金属结构成分的基础，在这些成分之上应用一个薄膜(5,951,586)。支架分成自体伸展的或压力下展开的。术语伸展、扩展和可展开的在这里是指在直径上可调节的腔内支架。当自伸展支架用传送导管被置于治疗部位时，推测它们在从一个约束力中释放后放射状地伸展，该约束力限制支架于较小的直径，并在没有对支架施加外向放射性力的情况下使之与血管壁或其他组织形成表面接触。此型支架包括编织成辫子形的或成形金属丝的支架。压力可展开的支架由可塑的或弹性的可变形材料制成，典型地由金属丝或金属带组成。折叠的支架用传送导管带到治疗部位，然后用气球或其它支架扩张装置迅速膨胀至其计划的工作直径。对于应用需要的柔韧性和有效抵抗植入后的放射压缩，细丝成分或带形金属通常是有利的。强度和柔韧性的优势结合主要是由于条带时效硬化后的特性，或另外在聚合体条带情况下热处理。螺旋条带的编制角度和邻近条带间的轴向距离也对强度和柔韧性起作用。

支架丝线可以是金属的、无机纤维的或有机聚合体的。它们应当是弹性的、有强度的、生物相容的和耐疲劳和腐蚀的。例如，通常选择由金属组成的核心，如不锈钢或金或其它比较柔韧的无毒金属和合金，它们在植入时间内不退化或在电流影响下不发生严重的退化(腐蚀)。这些金属包括但不限于，铂、铂-铱合金、铜和锡或钛的合金、镍-铬-钴合金、以钴为基础的合金、钼合金、镍-钛合金。条带不一定是金属，例如可以是聚合体材料如PET、聚丙烯、PEEK、HDPE、聚砜、乙酰、PTFE、FEP和聚亚氨酯不排除任何其它物质(其它变化：聚四氟乙烯、氟化乙烯丙烯、聚四氟乙烯-全氟烃基乙烯醚共聚物、聚氯乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、主要的氟化物和其它生物相容性塑料)。此外，生物可降解的或生物可吸收的材料，例如，同聚物如聚对二乙双酮、聚赖氨酸或聚乙醇酸，和共聚物如聚乳酸和聚乙醇酸、聚亚氨酯，或其它生物材料可以单独或与其它材料联合使用作为支架的材料。这种单丝条带的直径范围从0.002到0.015英尺，当然，直径随管腔大小和需要的支撑程度而异。在支架上也可以附着有抗血栓形成、抗血小板、血管扩张剂、抗增殖、抗迁移、抗纤维化、抗炎药物，更特殊地，肝素、水蛭素、hirulog、依曲昔酯、freskolin等。临床应用的支架例子公布于4,733,665，4,886,062中，在此合并为参考。

用于跨管腔移植的支架移植物，也称为覆盖支架，包括一个金属或聚合体单丝的弹性的管状编织网格物、一个形成复杂交织纺织带的管状编织袖套、和一个将网格物和袖套固定在一起的附属部分，相互以选定的轴向排列，相互连接，选定的一个网格物和袖套包绕其余部分，其中网格物结构性地支撑着袖套。保证网格物和袖套按照基本相同的关系运转，控制伴随给定轴向延长时的半径缩小的数量。袖套可以在网格物的外面或内面，或网格物可整合进袖套中，它可以是连续的或不连续的。几个假体结构已被建议为结合不同类型条带的复合编织结构，如多丝纱、单丝、可熔的材料和胶原蛋白。实例见WO91/10766。尽管可以是单丝的，但织物条带优选地是多丝纱。在任一情况下，织物条带在大约10到40但尼尔范围内较结构条带精细。多丝纱的每个纤维可以从大约0.25到10但尼尔。多丝纱可由各种材料组成，如PET、聚丙烯、聚乙烯、聚氨酯、HDPE、硅酮、PTFE、聚烯烃和ePTFE。通过修饰纱线可能改变袖套特性，例如，无捻的平直丝线提供较薄的壁、较小的纱线间空隙，因此获得较低的通透性和较大的纱线横截多孔性，以利毛细血管跨移植物生长。多孔膨胀的PTFE膜具有由小纤维互相连接的结点微结构，可以按如美国专利号3,953,566，4,187,390和4,482,516所教授的方法制造。适合的孔可以以小通路或通道的形式存在，起于外表面并贯穿生物材料。在这种情况下，孔的横截尺寸大予5微米毛细血管的直径，典型地小于1毫米。只要生物材料保持足够的刚度，孔大小的上界值是不严格的，但是，孔大小超过大约1毫米的有用装置是不大可能的。这种孔的直径可在显微镜中定量。如那些本领域中人员会理解的，可以进行移植物材料和表面的数种修饰，如用蛋白、非肝素化全血和富血小板血浆预涂层，表面的辉光-放电修饰，添加聚醚凝胶、纤维连接蛋白、纤维蛋白胶、黏附分子、共价键，用例如碳(5,827,327，4,164,045)影响表面电荷，用表面活性剂或清洁剂处理，机械性改变特性如添加凹槽和改变终末角，不排除其它方法。此外，植入物可被构建成内、外表面结点间距离不同的杂合体，如结点间距离在外面60微米而内面20微米(HYBRID PTFE)。更可使用具有不同结点间距离的多层。当不抑制内皮化时，它们均归于本发明的范畴。原纤维可以是单轴向定向的，即主要在一个方向定向，或是多轴向定向的，即在多于一个方向定向。这里用的术语膨胀的是指多孔膨胀的PTFE。本领域技术人员会理解，具有生物相容性和多孔性，可以使内皮跨移植物生长的任何材料是可接受的。临床应用的支架移植物的实例公开于5,957,974，5,928,279，5,925,075，5,916,264中。

此外，天然存在的自体的、异体的或异种的材料，如动脉、静脉和肠粘膜下组织可被用在支架移植物中，例如脐静脉、隐静脉、或天然牛动脉。与本发明的成分、装置和方法有关，潜在的生物可降解血管植入物可被用作支架移植物，例如生物可降解和化学限定的聚乳酸、聚乙醇酸、纯化蛋白的基质、半纯化的细胞外间质成分。合适的血管移植物和支架移植物将不仅传递基因成分，而且提供了新内皮生长的表面，即，将作为内皮细胞在其中移行的原位支架。用本发明方法和成分植入的植入物的特殊设计并不重要，只要在体内实施例环境下，它们作为内皮细胞可以在其中移行的支架并最终使植入物内皮化。

各种导管系统被用于传送介入支架和支架移植物到所需的部位。只要使用本发明的方法，选择的类型并不重要。

心瓣膜为本领域熟知，并由于心脏的泵功能起血液动力学作用。通常，有一个具有内表面的环状体称为血流通道，其上有一个或多个遮板支撑以交替封闭，然后使得血液以预先确定的方向流动。心瓣膜假体有各种不同的设计，用自体的、异体的、异种的或人造的材料。机械瓣膜环状框架，也叫环状体，和瓣膜部件可以用任何生物相容的和非血栓形成的材料制成，而且要承受它们将会受到的磨损。有各种不同的设计，如环状瓣膜框架和瓣膜部件，如球面部件或球、轴移圆盘、提升圆盘和叶片部件，如单或多叶片结构，例如两个平叶片、具有圆锥、半圆锥和圆柱形表面的叶片。出口环可以用各种材料制成，如热解碳包被的表面、银包被的表面或固体热解碳(4443894)，叶片可由一种基质制成，如多晶石墨、塑料、金属或任何其它刚性材料，然后用其它包被，如热解碳(如3546711，3579645)。环状瓣膜框架可以是多孔的(这里指具有多孔的表面和在液流与孔交流的表面下连通的间质孔的网络，见4,936,317)，或无孔的，和其它方法，如周围凹槽或一对平片可供固定一个缝合环到环状体上以方便缝补或缝合心瓣膜到心脏组织上。缝合部件可有一个刚性环状部件或袖套环绕着基质。袖套可以是刚性材料，如金属或塑料或类似物。袖套可有编织物的套环，如特氟隆或涤纶(RE31,400)。瓣膜可有进一步的部件，如缓冲部件和减震部件。机械心瓣膜的实例描述于3,546,711，4,011,601，4,425,670，3,824,629，4,725,275，4,078,268，4,159,543，4,535,484，4,692,165，5,035,709，5,037,434中。

异种移植物、异体移植物或自体移植物是组织瓣膜。当使用自体移植物时，通常肺瓣膜被手术到主动脉位置-Ross手术。异体移植物也称同种移植物，是尸体来源的。异种移植物生物人造瓣膜通常是猪来源的。它们可以是具有支架或没有支架的。传统的支架瓣膜可被设计为具有瓣膜部件、支架组合和缝合环。支架可被织物覆盖。所有已知的支架材料可被用作支架，包括但不限于钛、聚甲醛树酯、聚乙缩醛、聚丙烯和耐蚀游丝合金。如本领域技术人员已知的，有几种方式使用组织瓣膜。例如，生物合成材料可以无细胞制成(Wilson，Ann Thorac Surg，1995；60(2suppl)：S353-8)，或用各种方式保存，如用戊二醛、甘油(Hoffman)、染料介导的光氧化作用(Schoen，J Heart Vaive Dis，1998；7(2)：174-9)，如果用戊二醛保存，戊二醛可以被氨试剂(如4405327)中和。同种移植物可以被去上皮化。组织心瓣膜的实例描述于3,755,823，4,441,216，4,172,295，4,192,020，4,106,129，4,501,030，4,648,881中。此外，在此课题中有大量的科学文献。本领域技术人员会理解，任何具有生物相容性，可以使内皮生长的材料或组织都是可接受的。基因可以通过各种方法附着在心瓣膜假体上，但方法并不重要，只要基因被周围组织吸收并产生血管生成因子，刺激血管生成，这导致了出口环和/或瓣膜部件表面的内皮化。核酸或含核酸的成分可附着在全部或部分心瓣膜上。优选地，在组织瓣膜上核酸将附着在全表面和支架组合上，在机械瓣膜上附着在环状体和缝合环上。

组织植入物可以由各种材料组成，如聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚碳酸酯、聚酯、尼龙、聚砜、纤维素混合酯、二氟聚乙二烯、硅酮、胶原蛋白和聚丙烯腈。组织工程优选的支持材料是人造的聚合体，包括由加聚反应和缩聚反应而来的低聚物、同聚物和共聚物。组织植入物的实例被描述于例如5,314,471，5,882,354，5,874,099，5,776,747，5,855,613中。本领域技术人员会理解，任何具有生物相容性，可以使内皮生长和/或毛细血管化的材料都是可接受的。基因可以通过各种方法附着在植入物上，但方法并不重要，只要基因被周围组织吸收并产生血管生成因子及刺激血管生成，导致植入物内皮化和/或毛细血管化。

吻合装置也叫移植物连接器，其背景在5,904,697和5,868,763中得到很好描述。通常，吻合装置被用于端一端吻合或端一侧吻合。本发明包括端一侧吻合装置，优选那些具有被腔内植入到靶血管并暴露于血液的固定部件者，如SOLEM移植物连接器^TM。术语“固定部件”在此是指与靶血管形成接触的部件。术语“连接部件”或“连接部件”在此是指与旁路移植物管道形成接触的部件。固定部件和连接部件可形成单一单位或在操作过程中被分别连接。还可包含附加的部件如柄和针。腔内固定部件可以有各种设计，首选管状结构的。腔内固定部件可以由任何生物相容的材料制成，如金属、陶瓷、塑料、聚合体、PTFE、DACRON、PET、聚丙烯、聚乙烯、聚亚氨酯、HDPE、硅酮、聚烯烃和ePTFE或几种结构的组合。此外，生物可降解或生物可吸收的材料，例如，同聚物如聚对二乙双酮、聚赖氨酸或聚乙醇酸，和共聚物如聚乳酸和聚乙醇酸或其它生物材料，可以单独或与其它材料联合使用。吻合装置可以是多孔的、部分多孔的或无孔的。优选地，连接部件是无孔的，固定部件是多孔的。如果是多孔的，孔毛细直径的横截尺寸大于5微米，典型地小于1毫米。只要生物材料保持足够的刚度，孔大小的上界值是不严格的，但是，孔大小超过大约1毫米的有用装置是不大可能的。这种孔的直径可在显微镜中定量。适合的孔可以小通路或通道的形式存在，起于外表面并贯穿生物材料。如本领域人员会理解的，可以对移植物连接器设计材料和表面进行数种修饰，如用蛋白、非肝素化全血和富血小板血浆预涂层，表面的热-放电修饰，添加聚醚凝胶、纤维蛋白胶、粘附分子、共价键，用例如碳(5,827,327，4,164,045)影响表面电荷，用表面活性剂或清洁剂处理，机械性改变表面特性如添加凹槽和改变终末角，不排除其它方法。此外，植入物可被构建成内、外表面结点间距离不同的杂合体，如结点间距离在外面60微米而内面20微米(如HYBRIDPTFE)。更可使用多层不同结点间距离。当不抑制内皮化时，它们均归于本发明的范畴。基因可以通过各种方法附着在植入物上，但方法并不重要，只要基因被周围组织吸收并产生血管生成因子及刺激血管生成，导致植入物内皮化和/或毛细血管化。合适的移植物连接器不仅传递基因组分，而且提供新内皮生长的表面，即，将作为内皮细胞在其中移行的原位支架。本领域技术人员会理解，任何具有生物相容性、刚度和多孔性，可以允许跨移植物生长的材料是可接受的。

起搏器导线是本领域熟知的，它们可以是多孔的(4,936,317)或无孔的。起搏器导线通常由金属或合金制成，如钴合金或钛。本领域技术人员会理解，具有生物相容性并使内皮生长的任何材料是可接受的。基因可以用任何方法附着在起搏器导线上。在基因被周围组织吸收后，产生了血管生成因子并刺激血管生成，导致植入物内皮化。

血管导管为本领域熟知。本领域技术人员会理解，具有生物相容性并使内皮生长的任何材料是可接受的。基因可以用任何包括在此公开文件中的方法附着在血管导管上。在基因被周围组织吸收后，产生了血管生成因子并刺激血管生成，导致植入物内皮化。

缝合材料为领域内熟知。“丝线”在此指非吸收或可吸收材料的单、长、细的易弯曲结构。可以是连续的或成段的。“可吸收的”丝线这里是指在哺乳动物组织内被吸收者，即被消化或溶解。缝合线可以是单线即单股丝线，或多线即以辫子形、螺旋形或其它多线结构形式的几股线，并由广泛材料制成，包括天然的如金属、蚕丝、亚麻、棉花和肠线，人造的如尼龙、聚丙烯、聚酯、聚乙烯、聚亚氨酯、聚丙交酯、聚乙交酯、丙交酯和乙交酯的共聚物。缝合线可以是多孔的(4,905,367，4,281,669)或无孔的，它们可以用例如4,185,637，4,649,920，4,201,216，4,983,180，4,711,241中描述的各种材料包被或不包被。核酸可附着于任何缝合线材料上以促进缝合线的内皮化。核酸的附着对于人造的非吸收的血管缝合线特别有用。如果要包被多线缝合线，不必缝合线中的每条丝线都单独地或完全地包被。缝合线材料的大小通常在0.001mm的12-0U.S.P号到外径0.599mm的2号U.S.P.之间。缝合线材料可以在一或两端有或没有针，针可以通过领域内已知的任何方法连接到缝合线材料上，如规定一个盲孔即一个圆柱形凹口，沿缝合针轴从近端端面延伸。缝合线安装部分的长度通常等于或略大于孔的长度。缝合线被插入孔，然后缝合线安装部分被卷曲，即变形或压缩，以把持缝合线。可选择地，缝合线可通过在这个盲孔上添加胶接剂而被保护(例如1,558,037)。此外，可以使用附着剂和粘合剂，如2,928,395，3,394,704。还可以使用其它修饰如4,910,377，4,901,722，4,890,614，4,805,292，5,102,418。外科针本身可以用各种材料制成，如所需直径的医学可接受的不锈钢。缝合线与针的连接可能是标准的，即缝合线安全地连接并不倾向从其上分开，除非切割或切断缝合线，或可能是可脱离或可移除的，即在外科医生施予的力量下被分离(3,890,975，3,980,177，5,102,418)。外科针可能是各种形状，如1/4圆、3/8圆、1/2曲线、1/2圆、5/8圆或直的，针末端可能是锥点、截锥、变向切削、精细点、刮刀形，等。附着在缝合材料或缝合线涂层成分上的核酸数量变化有赖于纤维的结构，如纤维数量、编织或捻转紧密度，和组成成分、应用的固体或溶液的共同配置。本领域技术人员会理解，任何具有生物相容性以使血管生成的材料是可接受的。基因可以用此公开材料中描述的任何方法及任何在那种情况下首选的其它方法附着到缝合线上。在基因被周围组织吸收后，产生了血管生成因子并刺激血管生成，导致缝合材料表面的内皮化。

外科纱布为本领域熟知。本领域技术人员会理解，任何具有生物相容性以使内皮生长的材料是可接受的。基因可以用任何包括在此公开材料中的方法或其它任何方法附着到外科纱布上。在基因被周围组织吸收后，产生了血管生成因子并刺激血管生成，导致植入物内皮化。

如那些本领域技术人员熟知的，在选择所述血管或组织移植物中可能会考虑物理和化学特性，如生物相容性、生物可降解性、强度、刚度、多孔性、界面特性、持久性、甚至美观表现。而且，本发明的一个重要方面是与其它植入物联合使用，后者具有组织界面血管化的优势，包括植入物本身和植入物的功能部分，如长期使用的组织腔室、起搏器导线、内在的血管导管，等。表面可被充满核酸亲和性材料的微孔包被，然后被包被的表面可再用希望转移的基因或核酸包被。如那些本领域技术人员已知的，市售的吸附作用化学基团可容易地使用以控制其核酸亲和力。

      方法-构建VEGF165、FGF-2和FGF-5表达质粒

               及表达蛋白的功能性测试

表达质粒

VEGF165表达质粒

人VEGF₁₆₅ cDNA(Medline注册号#M32977)用从HEK293细胞中分离的总RNA制备的cDNA模板PCR扩增。为增加VEGF₁₆₅mRNA转录产物，用130μM去铁胺处理HEK293细胞24小时以模拟低氧环境。总RNA用Trizol^试剂(Gibco BRL)按照生产者说明书制备。纯化RNA的完整性用1％琼脂糖凝胶电泳分析。采用Advantage^RT-for-PCR试剂盒(Clontech)，用寡dT引物通过反转录合成互补DNA。

VEGF₁₆₅ cDNA被PCR扩增，采用含Eco R1位点的正向引物GATCGAATTCGTTAACCA-TGAACTTTCTGCTGTCTTGG和具有设计的Bam H1位点的反向引物GATCGGATCCGTTAACTCACCGCCTCGGCTTGTCACATC。扩增用Platinum^Taq DNA聚合酶(Gibco BRL)按照生产者说明书进行，其循环参数如下：94℃1分钟，然后94℃30秒、72℃1分钟循环35次。PCR反应混合物在2％低胶凝温度琼脂糖凝胶上电泳，扩增的cDNA用溴化乙锭染色显影。具有期望的606核苷酸大小的产物从凝胶上切下并纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen)。纯化产物和表达载体pNGVL3用EcoR1和Bam H1联合消化。然后VEGF₁₆₅ cDNA定向地连接进pNGVL3(Ligation Express试剂盒，Clontech)，其后转化化学感受态的DH5α大肠杆菌，在含30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上选择细菌集落。分离单独的细菌集落，在3ml液体培养基中生长并纯化质粒DNA(QIAprep旋转小量制备试剂盒，Qiagen)。最终pNGVL3-VEGF₁₆₅构建物的同一性和正确性用ABI自动序列分析仪通过DNA测序证实。

FGF-2表达质粒

人FGF-2 cDNA(基因库注册号#NJ04513)用来自HEK293细胞的模板cDNA进行PCR扩增，HEK293细胞按上面描述的VEGF₁₆₅表达载体方法制备。PCR扩增用含Xba1限制性位点的正向引物ATACTCTAGAATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTG联合含BglII限制性位点的反向引物GATCAGATCTTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAAA进行。扩增参数如上所述。得到的具有期望的488核苷酸大小的产物从凝胶上切下并纯化(如上所述)，然后用Xba1和BglII消化。限制性酶消化的产物被定向地连接进表达载体pNGVL7中(已被Xbal和BglII消化过的)，分离细菌集落，得到的pNGVL7-FGF-2构建物的同一性和正确性用自动DNA测序证实。

FGF-5表达质粒

人FGF-5 cDNA(基因库注册号#M37825)用含EcoR1位点的正向引物GATCGAATTCGTTAACGCCACCGAGCTTGTCCTTCCTCCTCCTC联合含Xba1位点的反向引物GATCTCTAGAGTTAACTTATCCAAAGCGAAACTTG-AGTCT进行PCR扩增。GeneStorm表达简易克隆H-NM_004464(Invitrogen)被用作模板。PCR循环参数为：94℃1分钟，然后94℃30秒、65℃30秒、72℃1分钟循环30次。得到的具有期望的842核苷酸的产物被凝胶纯化、用EcoR1和Xba1消化、并连接进表达载体pNGVL-3中相应的限制性位点。在化学感受态DH5α大肠杆菌转化后，分离单独的细菌集落并纯化DNA。对得到的pNGVL3-FGF-5质粒进行自动DNA测序以确定序列同一性和正确定位。

β-半乳糖苷酶对照质粒

pNGVL1-nt-β-ga1表达质粒编码核靶向的β-半乳糖苷酶并被用作对照质粒。

细胞培养、短暂转染和VEGF₁₆₅、FGF-2和FGF-5的产生。

HEK293T细胞用添加有10％FBS(Gibco BRL)的Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM；Gibco BRL)在明胶包被的组织培养塑料板上培养。细胞在转染前24小时被接种在10cm培养皿上(6×10⁶细胞/皿)。质粒DNA(4μg)用0.5ml 2.5M的Ca₂PO₄混合，逐滴加到0.5ml 2XHepes缓冲盐(HeBSS：280mM NaCl，50mM Hepes，1.5mM Na₂HPO₄)中，简单旋涡振荡并在室温下孵育20分钟。DNA溶液逐滴加到细胞中，并用DNA孵育细胞4h，随后用10％甘油的DMEM处理细胞2分钟，用PBS冲洗并供给完全培养基。转染培养基移除后24h，细胞用5ml PBS冲洗2次，然后添加5ml无血清DMEM(无添加成分)。另外孵育24h后，此培养基被作为“条件培养基”回收并等分冰冻以进行后面的分析。

Western印迹。

一份(50μl)条件培养基与Laemmli样品缓冲液混合并在12％SDS/PAGE凝胶上电泳以分离蛋白。在研究VEGF二聚作用时，在Laemmli样品缓冲液中不含还原剂。然后蛋白通过半干印迹被转移到Hybond^TM-C特级膜上(Amersham Life Science)。在含0.1％Tween 20和5％BSA的Tris缓冲盐(TBS：20mM Tris碱pH 7.6，137mM NaCl)(TBS/Tween/BSA)中室温孵育膜1h以阻断非特异结合，然后，滤膜用特异性初级抗体(用TBS/Tween/BSA 1∶500稀释)孵育1h。VEGF₁₆₅用兔多克隆抗体(Santa Cruz，目录号SC-152)显影，FGF-2用山羊多克隆抗体(Santa Cruz，目录号sc-79-G)显影，FGF-5用多克隆山羊抗体(Santa Cruz，目录号sc-1363)显影。最终，膜用辣根过氧化酶(HRP)结合的二抗(抗山羊HRP来自Sigma，目录号A4174；抗兔HRP来自Amersham Life Science，目录号NA934，用TBS/Tween/BSA 1∶5000稀释)孵育1h，蛋白在添加了ECL western印迹检测试剂(Amersham Pharmacia Biotech)后通过暴露于医用X-线胶片(Fuji)而显影。

绒膜尿囊膜血管生成试验

受精的鸡卵从当地购买并在38℃70％湿度下预孵10天。在壳上1cm²窗内暴露绒膜尿囊膜(CAM)，确定一个无血管带以应用样品。Whatman过滤盘(5mm直径)用3mg/ml醋酸可的松(Sigma)浸透并浸泡于来自短暂转染的HEK293T细胞的条件培养基中(含VEGF₁₆₅、FGF-2或FGF-5)。窗口用胶带密封并再孵育3天。然后沿滤膜周围切下CAM并用Nikon Eclipse TE 300光学显微镜(放大倍数2.5或4)检查。以双盲法，通过估算过滤盘上膜内血管分支点的数目对每个胚胎的血管生成进行评分。评分范围从1(低，背景)到4(高)。每个物质用5-7个胚胎平行分析。样本变异小于15％。P值用ANOVA计算(方差分析)。

制备无内毒素质粒DNA以体内应用。

在体内应用前使用的质粒DNA用EndoFree^TM Plasmid MegaKit(Qiagen)按照生产者提供的说明书纯化，最终重悬在无内毒素TE(10mM Tris pH8.0，1mM EDTA)中。得到的质粒制剂的质量通过分光光度分析检测，其中A₂₆₀/A₂₈₀的比值为1.80和1.82之间。此外，制剂用合适的限制性酶通过限制性酶消化，及通过HEK293细胞的短暂转染在条件培养基进行Western印迹后被分析。

RT-PCR

总RNA用Trizol^试剂(Gibco BRL)按照生产者说明书从速冻组织中纯化。纯化RNA的完整性用1％琼脂糖凝胶电泳分析。采用Advantage^RT-for-PCR试剂盒(Clontech)，用寡dT引物通过反转录合成互补DNA。进行PCR采用载体来源的正向引物CGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTG，以多克隆位点上游的111bp载体序列为基础，以及人特异的VEGF₁₆₅反向引物GCAAGTACGTTCGTTTAACTCAAGCTG，从人VEGF序列羧基末端的21bp。扩增参数为：94℃1分钟，然后94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟循环35次。扩增的产物在2％低熔点琼脂糖凝胶上分离并用溴化乙锭染色后，通过紫外光显影。适于GAPDH扩增的引物被用作阳性对照。没有辅助RT的cDNA合成被作为阴性对照。

结果

VEGF₁₆₅、FGF-2和FGF-5的质粒构建和表达

我们使用pNGVL表达质粒家族来表达不同的生长因子。这些载体已经在国家基因载体库、Michigan大学医学中心、基因治疗中心被开发用于基因治疗。VEGF₁₆₅和FGF-5含有引导其分泌的信号序列。因此，这些基因的完整编码序列被PCR克隆并直接克隆进pNGVL3表达质粒中。FGF-2缺少信号序列，因此人FGF-2编码序列与组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA，由pNGVL7质粒提供)的信号序列一起在结构上克隆进pNGVL7表达式以使FGF-2分泌。插入物和靠近插入物的载体序列可进行DNA测序以确证目的cDNA无错误地扩增并按正确的方位连接进表达载体。

HEK293细胞的短暂转染被用于显示质粒能够表达目的蛋白。转染后，收集转染后24-48h间的无血清条件培养基。用特异性抗体通过Western印迹分析条件培养基等分(图1)。来自用空白载体转染细胞的条件培养基作为阴性对照。VEGF₁₆₅在大约21kDa的期望大小处显示。此外，检测到一个较大的蛋白(23kDa)，可能反映了糖化VEGF₁₆₅。而且，当使用非还原条件时，观察到期望的VEGF₁₆₅二聚体形式。FGF-2和FGF-5分别在期望大小的17和27kDa处显示为截然不同的条带。

VEGF165、FGF-2和FGF-5的功能检测。

前面提到的生长因子已知是促进内皮细胞有丝分裂的、化学趋化的和诱导分化的。所有这些过程对于形成新血管，即血管生成是必要的，前面已经显示，它们均诱导血管生成。因此，为进一步确定这些分泌的重组生长因子的特性，我们采用一个体内血管生成试验，即所谓的鸡绒膜尿囊膜(CAM)试验。同用空白载体转染细胞的条件培养基相比(图2)，含VEGF165、FGF-2或FGF-5的条件培养基在CAM试验中均引起增加的血管生成反应。这些试验显示，由上述表达质粒产生的因子是有生物活性的，因为它们能够刺激血管生成的复杂过程。

RT-PCR以证明体内基因转染。

RT-PCT用于进一步证明编码VEGF165、FGF-2和FGF-5的质粒DNA在体内应用于组织后被转录。质粒DNA被用于腹主动脉周围，7天后切除组织并在液氮中快速冷冻。总RNA从切除的组织中制备，然后用寡dT引物反转录。对于阴性对照，RT从反应混合物中被忽略。当使用pNGVL-165时，PCR扩增了一个具有正确期望大小的666bp片段，然而用pNGVL-β-gal质粒处理的组织的RT-PCR不产生任何PCR产物(图3)。在阴性对照样本中没有观察到扩增产物(图3)。用GAPDH引物扩增得到期望大小的产物。

实施例1.

在大鼠中的ePTFE移植物

本实例显示，可以在ePTFE移植物上给予VEGF质粒的灭菌水溶液得到内皮表面。

方法

遗传学方法：

按照前面的方法进行编码VEGF 165的质粒的构建和评价。VEGF质粒以2μg/μL浓度的灭菌水溶液提供。

外科学方法：

4只雄性Sprague Dawley大鼠被分为4组以研究人造的ePTFE移植物的内皮化。3只大鼠进行肾下主动脉置换并用编码h-VEGF 165的表达质粒转染。所用的表达质粒的数量分别为200μg(n＝1)、400μg(n＝1)和800μg(n＝1)。1只大鼠接受没有基因转染的移植物。转染后2周，VEGF转染的效果用组织化学和电子显微镜扫描(SEM)被分析。

通过腹腔内注射含1.25mg/ml咪达唑仑、2.5mg/ml氟阿尼酮和0.079mg/ml枸橼酸芬太尼的混合物1ml诱导麻醉。此外，给予双氢链霉素25ml/kg和bensylpenicillinprokain 20mg/kg肌注。大鼠在背部编码、灭菌铺巾、Klorhexidin清洁并用机器剃毛。动物置于一个加热垫上，腹部喷以75％乙醇。做切口，剖开主动脉而不切开腔静脉。暴露肾动脉至分支。包括腰支出口的主动脉部分被在近端和远端结扎。在近端和远端夹住主动脉，并在夹子和结扎点间进行动脉切开术以容纳2cm移植物。主动脉残端用盐水冲洗，用镊子轻度扩张，用9-0非吸收单丝缝合线端一端缝合主动脉移植物(20mm×2mm)。所用的移植物是结点间距离为60微米的多孔ePTFE移植物(Impra，Tucson，USA)，按照ILN150 44-46页生产。用移液管将基因溶液用于移植物上。等待3分钟后，逐层关闭腹腔，第一层筋膜用3-0进行，然后皮肤用3-0进行。外科手术中使用无淀粉手套。动物被移到具有暖垫的恢复区。

处死：

动物在第14天处死(n＝4)，获取主动脉移植物及其附着的主动脉。在用芬太尼/氟阿尼酮和咪达唑仑如上麻醉后，在阴茎静脉内使用500单位肝素，暴露腹腔主动脉并进行胸骨劈开术。通过大口径针给予左心室120mmHg的PBS灌注，同时通过右心房切开，动物被同步地放血。一旦血液流干，用2％多聚甲醛和0.2％戊二醛的PBS溶液以120mmHg灌注原位固定10分钟。移植物被随意剖开并切断，带有1-2cm天然血管和周围脂肪组织。它被沿长轴方向切断并分为5部分。A部分用2％多聚甲醛/0.2％戊二醛保存以进行组织学研究，B部分保存于4％甲醛以进行光学显微镜和免疫组化研究，C部分保存于2％多聚甲醛/2％戊二醛的PBS溶液中以用于SEM，D部分保存于2％多聚甲醛/0.2％戊二醛中以进行组织学研究，E部分保存于4％甲醛中以作光学显微镜和免疫组化。

移植物分析：

移植物C部分用SEM分析以识别表面的细胞结构并确定该细胞结构来源于跨移植物生长。在免疫组化染色后进行B部分的光镜观察以测定内皮细胞的移植物内表面覆盖范围并评价新毛细血管的形成。

结果

内皮化和血管化

用VIII因子抗体免疫染色后进行的光镜观察显示，同对照移植物相比，在VEGF处理的移植物周围组织内，FVIII染色增加。此外，在VEGF处理的移植物中观察到移植物内腔几乎完全的内皮化，而对照移植物没有观察到内皮化。周围组织FVIII染色存在剂量依赖的增加。在对照移植物中，移植物内腔内缺少内皮。在所有VEGF处理的移植物中，至少显示出部分内皮化。SEM显示，在C部分组，67％的VEGF处理的动脉有内皮细胞覆盖，而在对照移植物中未能显示有内皮细胞覆盖。

基因表达

基因表达用原位杂交检测，显示人VEGF在对照移植物中没有表达，而在3个VEGF处理的移植物中有2个可见到内腔内皮细胞中有强表达，一个处理的移植物中观察到弱表达。

实施例2

在大鼠中的ePTFE移植物

此实例显示给予VEGF质粒的灭菌水溶液使得ePTFE移植物更快、更完全的内皮化。

方法

遗传学方法

遗传学方法与前面实例中描述的相似。质粒在灭菌水中提供。剂量为：LacZ 100μg(2.5μg/ml或2.7μg/μL)，VEGF 100μg(2μg/μL或2.7μg/μL)，VEGF 400μg(2μg/μL或2.4μg/μL)和VEGF 800μg(2.3μg/μL)。

外科学方法：

37只大鼠分为4组以研究人造的血管移植物的内皮化。23只大鼠接受肾下主动脉置换及用编码h-VEGF 165的表达质粒转染。应用的质粒剂量为：100μg(n＝7)，400μg(n＝12)和800μg h-VEGF 165(n＝4)。14只大鼠被用作对照并接受有100μg β-gal(LacZ)(n＝9)的或没有基因转染(n＝5)的移植物。在1周(7-8天)(n＝7)、2周(14-15天)(n＝17)和4周(28-31天)(n＝13)时用组织学和SEM进行移植物和周围组织分析。动物如实例1中所描述的准备外科和手术。

处死：

处死步骤如实例1所描述的进行。移植物沿长轴被切割、照相并分成2组。然后远段一半被进一步分成两部分。A部分保存在2％多聚甲醛/2％戊二醛中以进行SEM，B部分保存在4％甲醛中以进行光镜检查和免疫组化，C部分保存在2％多聚甲醛/0.2％戊二醛PBS溶液中以进行光镜检查。

移植物分析：

平面分析、SEM和免疫组化被用来测定移植物内腔表面的内皮化。电镜能够区分来自吻合的纵向细胞移行和透壁移行。

结果

内皮化

用伊文思蓝进行的平面分析显示，在4周时，VEGF处理的移植物中有89％内皮覆盖，而在对照移植物中，仅有平均44％的内腔表面内皮化。

SEM显露了相似的发现。在1周时，没有移植物具有移植物中部区域的内皮覆盖。在2周时，55％的VEGF处理的移植物在移植物中部区域被内皮表面覆盖，而仅有17％的对照移植物在移植物中部区域被内皮覆盖。相似地，在4周时，88％的VEGF处理的移植物内皮化，17％的对照在移植物中部区域显示内皮表面。此外，在VEGF组，移植物中部区域中可见到跨移植物生长。

B部分免疫染色后的光镜显示，4周时，50％的VEGF处理移植物(400μg)完全内皮化，而在所有对照移植物中内皮化仍然不完全。而且，所有VEGF处理的移植物的内皮表面超过腔内表面的一半。总的说来，25％的VEGF处理移植物在4周时显示完全内皮化，而在此时没有对照移植物显示完全的内皮化。内皮化是VEGF剂量依赖性的。在4周时，没有对照移植物显示完全内皮化，且仅有40％的对照移植物显示内皮覆盖超过表面的一半。

实施例3

在大鼠中的ePTFE移植物

此实例表明，同时给予裸露的FGF-2和FGF-5质粒，使ePTFE移植物更快地内皮化。

方法

遗传学方法

如前描述的方法被用于FGF-2和FGF-5。500μg的FGF-2表达质粒和500μg的FGF-5表达质粒以2μg/μL的浓度在灭菌水中提供。用移液管先给FGF-2，然后给FGF-5。

外科学方法：

6只雄性Sprague Dawley大鼠被分成3个时间点，使用与实例2同样的对照比较，研究同一个ePTFE移植物的内皮化。对照数量为1周n＝3，2周n＝6，4周n＝5。6只大鼠接受肾下主动脉置换并分别用500μg&500μg的FGF-2&FGF-5共转染。在1周(n＝2)、2周(N＝3)和4周(n＝1)时研究FGF-2&FGF-5转染的组织学结果。外科学、处死、移植物保存和分析按前面实例中的描述进行。

结果

内皮化

用伊文思蓝进行的平面分析显示，在4周时，FGF处理的移植物中有92％的内皮覆盖，而在对照移植物中，仅有平均44％的表面积内皮化。

A部分的SEM显示，1周时，FGF处理移植物的移植物中部区域完全内皮化，而在同一时间点，没有对照移植物在移植物中部区域有完全的内皮表面。2周时，在FGF处理的移植物中，移植物中部区域的内皮化为100％，而17％的对照移植物显示移植物中部区域的内皮化。相似地，4周时，100％的FGF处理移植物内皮化，20％的对照在移植物中部区域显示内皮表面。1、2和4周时，在FGF处理的移植物中可见到跨移植物生长。

B部分免疫染色后的光镜显示，1周时，在FGF处理的移植物中有一个超过50％的内皮化，另一个完全内皮化，2周时，67％的FGF移植物有超过50％的表面被覆盖而没有一个对照移植物在14天时有超过50％的移植物内表面覆盖。而且，所有的对照移植物在4周时仍然不完全内皮化，而FGF处理的移植物在4周时完全地内皮化。

实施例4

在大鼠中具有纤维蛋白胶的ePTFE移植物

此实例表明，在纤维蛋白胶中给予VEGF质粒可以在ePTFE移植物上产生内皮表面。

方法

遗传学方法

遗传学方法与上面的描述相似。

外科学方法：

4只大鼠分成2组以研究人造的ePTFE移植物内皮化。大鼠按前面的实例接受肾下主动脉置换并用来自纤维蛋白胶的h-VEGF 165转染。2只大鼠接受没有质粒的灭菌水移植物和胶。在2周时研究VEGF转染的组织学结果。外科学步骤按前面实例的描述进行。在移植物吻合后，用一个双管注射器(Duo Mix)在移植物上给予胶。0.6mL灭菌水中的VEGF质粒(2μg/μL)被注入含市售0.4mL人凝血酶(凝血酶，Immuno，Austria)的注射器中。然后，凝血酶和质粒结合物在两个注射器间通过一个三通活塞来回拉动以形成两成分的均匀混合物。在进行外科吻合术后，0.1mL纤维蛋白原(Tisseel，Immuno，Austria)和0.15mL凝血酶-质粒混合物通过一个Tisseel Duo Mix applicator被同时用在移植物上。在对照移植物中，给予等量的无质粒灭菌水。处死和移植物分析按前面的描述进行。

结果

内皮化

A部分的SEM显示，1周时，50％VEGF处理的移植物在移植物中部区域被内皮细胞覆盖，而没有一个对照移植物显示有内皮细胞内衬。

B部分免疫染色后的光镜显示，1周时，50％的VEGF移植物接近完全内皮化，而没有对照组移植物有超过50％的内皮表面覆盖。

实施例5

在大鼠中具有透明质酸-纤维蛋白胶的ePTFE移植物

此实例表明，在与透明质酸混合的纤维蛋白胶中共同给予VEGF和FGF-2质粒减少了ePTFE移植物的血栓形成。

方法

遗传学方法和胶的制备

FGF-2和VEGF按前面实例描述的方法制备。质粒以胶成分的方式提供并按下面的说明给予。市售人纤维蛋白原(Tisseel，Immuno，Austria)在水中被加热到37℃。0.7mL纤维蛋白原和0.7mL市售透明质酸(Healon GV 14mg/mL，Kabi Pharmacia)被抽进2个注射器中。一个三通活塞被连接到注射器上，纤维蛋白原和透明质酸在注射器间被来回拉动以得到均匀的混合物。然后，0.3mL灭菌水中的VEGF质粒(2μg/μL)、0.1mL灭菌水中的FGF-2质粒(5μg/μL)和0.05mL肝素(1000U/μL)被分别抽进一个注射器，市售凝血酶(Immuno，Austria)在另一个注射器中。它们被连接到另一个活塞的出口。凝血酶和质粒结合物在注射器间通过一个三通活塞来回拉动以获得两成分的均匀混合物。在进行外科吻合术后，0.25mL透明质酸/纤维蛋白原和0.25mL凝血酶/质粒/肝素成分通过一个Tisseel Duo Mixapplicator被用在移植物上。在胶聚合后，聚合和外科步骤完成。

外科学方法：

2只雄性Sprague Dawley大鼠分成2组以研究和前面实例中一样的ePTFE移植物的内皮化，接受肾下主动脉置换并用h-VEGF 165和以透明质酸-肝素-纤维蛋白胶成分提供的人FGF-2共转染。1只大鼠接受移植物和没有质粒的灭菌水胶。VEGF和FGF-2共转染的组织学结果在7天时研究。外科学步骤和移植物分析按前面实例的描述进行。

结果

内皮化

平面显示，胶-FGF-VEGF处理的移植物在1周时被内皮细胞覆盖至46％，而对照移植物被内皮覆盖3％。在对照移植物中有血栓。

A部分的SEM显示，1周时，VEGF-FGF移植物是开放的并有细胞移植物表面，而在对照移植物中有较大的血栓形成。

实施例6

在大鼠中具有结合粘蛋白的ePTFE移植物

在此实例中，VEGF质粒与粘蛋白一起结合到ePTFE移植物上并产生内皮表面。

方法

商业BSM(Sigma M3895)的纯化

BSM(Sigma M3895)通过连续使用阴离子交换剂(Q Sepharose byAmersham Pharmacia Biotech)和凝胶过滤(Sepharose 6B-CL byAmersham Pharmacia Biotech)被纯化。

胺化PTFE的制备

膨胀的PTFE(ePTFE)按如下被血浆处理：用O₂进行预处理，8cc/min，14MHz，100W，30秒。然后用二胺环己胺(DACH)进行胺化，18mTorr，170kHz，10W 2分钟，然后移植物在干燥器内被冷冻直至使用。

此实例需要的其它材料为，7.5mL和20mL玻璃试管。此外，使用pH7.4的MilliQ和TBS，以及吸头和切成1×1cm的Wettex片。使用20％葡萄糖和灭菌过滤的PEI母液(90μM)。70％的EtOH被用作抑菌剂。靶质粒(VEGF)和对照质粒(β-gal)为2mg/ml的TE缓冲液，pH 8.0。

移植物在高压锅内125℃25分钟灭菌，然后以2mg/ml的TBS在BSM(牛粘蛋白盐水)馏分QS1A(高MV，高相关电荷)中孵育，pH 7.4。孵育用200rpm振荡器进行，37℃过夜。(17:55-9:30，即15.5小时)

然后冲洗移植物。在50ml Falcon管中用10ml TBS连续冲洗移植物，且冲洗线分成“靶”和“对照”冲洗线。试管首先被剧烈振荡，然后休息1分钟。重复2次(2个冲洗步骤)。按照前面描述的步骤制备DNA后，进行DNA孵育，并制作增强转染的系统：2ml 20％葡萄糖+1mlPEI母液+1ml质粒溶液+4ml MilliQ。移植物在每个质粒孵育溶液中以200rpm室温振荡孵育2小时。然后在50ml Falcon管中用10ml MilliQ进行连续冲洗。“靶”和“对照”冲洗线是分离的。剧烈振荡并休息1分钟。重复2次。其后，移植物在50ml Falcon管中与1×1cm Wettex片孵育，每个试管中加入0.1Ml MilliQ湿润。移植物置于试管上区(帽区)并水平贮存在4-8℃直至使用。

4只大鼠分为2组以研究多孔的ePTFE移植物的内皮化。3只大鼠接受肾下主动脉置换并用从包被粘蛋白的移植物中释放的h-VEGF165转染。1只大鼠接受包被粘蛋白的移植物但没有质粒。2周时研究VEGF转染的组织学和扫描电镜结果。

结果

内皮化

A部分的SEM显示，2周时，67％的VEGF处理的移植物在移植物中部区域被内皮细胞覆盖，而对照移植物在移植物中部区域没有内皮表面。

B部分免疫染色后的光镜显示，14天时，在67％的VEGF处理移植物中超过50％的表面积内皮化，而在对照移植物中没有见到内皮化。

实施例7

兔ePTFE移植物

此实例表明，在ePTFE移植物上给予裸露的VEGF质粒灭菌水引起较快的内皮化和较高的开放率。

方法

新西兰兔(2.5-4kg)被用在此及后面的试验中。9只动物分为2组以研究60微米结点间距的ePTFE移植物的内皮化。5只兔子接受主动脉置换及用600μg h-VEGF 165转染，4只兔子被用作对照，接受同样的移植物置换及100μg B-gal(LacZ)转染。在2周(n＝5)、和12周(n＝4)时研究β-gal/LacZ转染和VEGF转染的组织学和电镜结果。编码VEGF 165的质粒的表达构建和评价按前面的描述进行。质粒以LacZ(2.5μg/μL；剂量100μg)和VEGF(2.5μg/μL；剂量600μg)的灭菌水溶液方式供给。

外科动脉重建和基因转染

320mg乙酰水杨酸被加入饮用水中以提供估计的每日ASA剂量，10mg/天。兔子用芬太尼0.315mg/mL/fluanosine 10mg/mL混合物s.c.和嘧达唑仑i.m.联合麻醉。二氢链霉素25mg/Bensylpenicillinprokain20mg/kg i.m.给药，而且布比卡因2.5mg/mL在伤口区域皮内给药。行腹部中线切口。主动脉被切开游离于腔静脉。识别主动脉最后的腰部分支并结扎。暴露近端主动脉至分叉，静脉给予右旋糖酐(Mw 70000，含60g/L右旋糖酐的生理盐水)15分钟，然后在手术过程中给予缓冲的葡萄糖，2.5％，100mL/小时)。通过一个venflo在耳静脉中注射500U肝素。在肝素循环4分钟后，夹住主动脉并近端切开至分叉以容纳2cm长、3mm内径的ePTFE移植物，其结点间距离60μm(Impra，Tempe，AZ，USA)，按照ILN 150，pp.44-46生产。移植物用连续7-0缝合线被端一端吻合。腹膜后腔和筋膜用4-0闭合，皮肤用3-0缝合。术后使用热绝缘加热板并记录直肠温度直至达到37℃。在本实例中使用的外科学方法也在下面的实例中使用。

体外动物检查

如上进行麻醉，处死前半小时在耳静脉内给予6mL伊文思蓝和0.2mL肝素(5000U/mL)。一些动物进行MRI检查，在麻醉步骤中使用氯胺酮。进行腹部切开和劈开胸骨术。暴露主动脉和心脏。通过大口径针对左心室给予120mmHg的PBS灌注，同时通过右心房切开，动物被同步地放血。一旦血液流干，用2％多聚甲醛和0.2％戊二醛的PBS溶液以120mmHg灌注原位固定10分钟。移植物被随意剖开并切断，带有1-2cm天然血管。检查获得的动脉片段并沿长轴打开。照相进行无血栓表面积的平面研究。移植物被切成3部分以检测。

移植物分析

获得的移植物拍照后，在解剖显微镜中进行平面分析。在应用伊文思蓝后，仍然缺乏内皮的内膜表面区域被染成蓝色。通过光镜分析的免疫染色证实肉眼分析。内皮化程度计算为包含在移植物内的总内膜面积的百分比。在移植物的近端一半按照标准的方法进行扫描电镜观察。在样本近段、中段和远段部分的近侧一半获取SEM图像。从接近移植物中间的移植物中部区域评价SEM图像。获取SEM图像以确定跨移植物生长。进行免疫组织化学以在光镜中识别细胞类型。

结果

内皮化

用伊文思蓝进行的平面分析显示，在2周时，在VEGF处理的移植物中有77％内皮化，而在LacZ移植物中，14天时内皮化为27％表面积。

SEM显露了相似的发现。在2周时，67％的VEGF处理的移植物在移植物中部区域表面上有内皮细胞，而LacZ移植物没有被内皮细胞覆盖。此外，在VEGF处理组可见到跨移植物生长。

光镜显示了相似的发现。在2周时，100％VEGF处理的移植物被证实在表面上有内皮细胞，而LacZ移植物没有被内皮细胞覆盖。

另外，在3月时开放性上存在不同；开放性用肉眼观察并组织学证实，VEGF处理组为100％，对照组为50％。

实施例8

兔ePTFE移植物

此实例表明，在ePTFE移植物上共同给予FGF-2和FGF-5质粒的灭菌水引起较快的内皮化。

方法

2只兔子用FGF-2和FGF-5转染以研究60微米结点间距的ePTFE移植物的内皮化，接受主动脉置换并用500μg FGF-2和500μg FGF-5共转染。2只LacZ转染的兔子被用作对照。接受同样的移植物置换及100μg B-gal(LacZ)转染。在2周(n＝4)时研究B-LacZ转染和FGF共转染的组织学和电镜结果。编码FGF-2和FGF-5的质粒的表达构建和评价按前节的描述进行。LacZ(剂量100μg：2.5μg/μL)、FGF-2(剂量500μg：2μg/μL)和FGF-5(剂量600μg：2.5μg/μL)以灭菌水溶液方式提供。

外科动脉重建和基因转染按前面描述的方法进行。首先在移植物上给予FGF-2制剂，然后给予FGF-5。

结果

内皮化

平面分析显示，2周时，在对照移植物中，表面的内皮覆盖平均为27％，而FGF处理的移植物中为91％。

SEM显示了相似的发现。在2周时，所有FGF处理的移植物有移植物中部区域的一些内皮覆盖，而LacZ移植物在同一部位没有被内皮覆盖。此外，在FGF组可见到跨移植物生长。

光镜显示了相似的发现。在2周时，两种FGF处理的移植物均有接近完全的内皮细胞覆盖，而对照移植物没有显示有内皮内衬。

实施例9

兔涤纶移植物

此实例表明在移植物上给予裸露的VEGF质粒灭菌水引起编织的、预凝结的涤纶移植物较快的内皮化。

方法

5只兔子被分为2组以研究编织的涤纶移植物(Sulzer Vaskutec)的内皮化。2只兔子接受主动脉置换及用600μg h-VEGF 165(n＝2)转染，1只对照兔子没有转染而2只其它兔子用600μg B-gal(LacZ)转染。在1周(n＝2)和2周(n＝3)时研究B-LacZ转染和VEGF转染的组织学结果。

遗传学方法

编码VEGF 165的质粒的表达构建和评价按前面描述的方法进行。质粒以LacZ(600μg；2.5μg/μL)和VEGF(600μg；2.5μg/μL)的灭菌水溶液方式供给。

外科动脉重建和体外检查

除使用3cm长、3mm内径的编织涤纶移植物以及在来自耳静脉的非肝素化血中预凝结30分钟以外，对兔子的操作步骤与实施例7中的描述是一样的。预凝结的移植物手工压迫并清理内腔。移植物被切成2cm长并吻合到主动脉上。处死后，移植物用SEM和光镜分析。

结果

内皮化

SEM分析显示，1周时，VEGF移植物中有较平滑的表面和内皮细胞，而在对照移植物中7天时没有观察到内皮化。VEGF处理的移植物在2周时形成了完整的鹅卵石表面，而50％LacZ处理的移植物在2周时的SEM中显示完整的表面。

光镜显示，7天时两组对照移植物均未完全内皮化，在2周时均完全内皮化。

实施例10

兔涤纶移植物

此实例用FGF-2和FGF-5共转染预凝结的涤纶显示较快的内皮化。

方法

6只兔子分为2组以研究编织的涤纶移植物的内皮化。使用与实施例9同样的对照。3只兔子接受主动脉置换及用500μg FGF-2和500μg FGF-5共转染。一只非转染的和2只LacZ转染(600μg)的兔子被用作对照。在1周(n＝2)和2周(n＝4)时研究FGF共转染的组织学结果。

遗传学方法

编码FGF-2和FGF-5的质粒的表达构建按前面的描述进行。质粒以LacZ(600μg；2.5μg/μL)、FGF-2(500μg；2μg/Ml)和FGF-5(500μg；2.5μg/μL)的灭菌水溶液方式供给。除质粒按顺序给予外，外科重建、基因转染和体外动物检查按实施例9中的描述进行；首先，FGF-2首轮给予移植物，然后加入FGF-5。移植物如前用SEM和光镜分析。

结果

内皮化

扫描电镜显示，1周时，FGF移植物上有部分内皮化，而对照移植物上没有观察到内皮化。在2周时，1个FGF处理的移植物具有鹅卵石形态的完美内皮表面，另一个有一些不连续的内皮细胞，而两个对照移植物中的1个已形成了内皮表面。免疫染色的光镜表明，覆盖表面的细胞是内皮细胞。

实施例11

兔具有纤维蛋白胶的ePTFE

此实例显示用纤维蛋白胶中VEGF质粒处理的ePTFE移植物有较高程度的内皮化。

方法

3只兔子分为2组以研究60微米结点间距的ePTFE移植物的内皮化。1只兔子接受主动脉置换及用纤维蛋白胶中的h-VEGF 165转染。另2只兔子被用作对照，接受用纤维蛋白胶中B-gal(LacZ)转染的移植物置换。在2周(n＝3)时研究B-LacZ转染和VEGF转染的组织学和电镜结果。

编码VEGF 165的质粒的表达构建和评价按前面的描述进行，胶按下面的描述建成。在2周时研究VEGF和B-gal转染的组织学结果。在移植物吻合后，通过Tisseel Duo Mix应用器在移植物上给予胶。0.6mL灭菌水中的VEGF质粒(1200μg；2μg/μL)被注入含市售0.4mL人凝血酶(Thrombin，Immuno，Austria)的注射器中。然后，凝血酶和质粒结合物在两个注射器间通过一个三通活塞来回拉动以形成两成分的均匀混合物。在进行外科吻合术后，0.2mL纤维蛋白原(Tisseel，Immuno，Austria)和0.3mL凝血酶-质粒混合物通过一个Tisseel Duo Mix applicator被同时用在移植物上。在对照移植物中，应用B-gal质粒在灭菌水中与凝血酶混合。

结果

内皮化

光镜显示在对照移植物中没有内皮细胞覆盖，而在VEGF处理的移植物中，大约一半表面被内皮细胞覆盖。在SEM中，没有一组有形成的内皮。

实施例12

有纤维蛋白胶的EPTFE杂合移植物

此实例显示当在纤维蛋白胶中给予VEGF质粒时，杂合移植物有较高程度的内皮化。

方法

2只兔子动物被分成2组以研究市售60微米/20微米结点间距离杂合移植物ePTFE(Atrium，New Jersey，USA)的内皮化。1只兔子接受主动脉置换及用600μg h-VEGF 165转染。另一只兔子被用作对照，接受同样的移植物置换及B-gal(LacZ)转染。在2周(n＝2)时研究B-LacZ转染和VEGF转染的组织学和SEM结果。

编码VEGF 165的质粒的表达构建和评价按前面描述的步骤进行。在0.4mL凝血酶从市售1mL凝血酶注射器(Thrombin，Immuno，Austria)中推出后，0.6mL 2μg/μL的质粒溶液注入到含0.6mL人凝血酶的注射器(Thrombin，Immuno，Austria)中。然后凝血酶和质粒结合物通过一个18G针(Terumo Europe N.V.，3001 Leuven，Belgium)在1mL注射器(Codan Medical，Denmark)间被来回抽动以形成两种成分的均匀混合物。在植入60/20微米结点间距离的市售多孔杂合移植物(Atrium，NewJersey，USA)后，在移植物周围给予0.2mL纤维蛋白原(Thrombin，Immuno，Austria)溶液。0.2mL纤维蛋白原(Thrombin，Immuno，Austria)溶液被用在移植物周围。通过给予0.4mL人凝血酶/质粒结合物得到移植物周围局部的纤维蛋白原聚合以在移植物周围产生含质粒的纤维蛋白胶。

结果

内皮化

用伊文思蓝进行的平面分析显示，14天时，在VEGF组中有0.96％的表面被内皮覆盖，而在LacZ移植物中为0.76％。

在SEM中，观察到在VEGF组有较高程度的内皮细胞覆盖和可见到更多的跨移植物生长。

实施例13

有或没有纤维连接蛋白的感光氧化心瓣膜

此实例显示当给予VEGF质粒时，有或没有纤维连接蛋白预涂层的心瓣膜表面较快的内皮化。还观察到植入物毛细血管化增加。

方法

VEGF质粒按照前面描述的步骤制备。

通常被用作心内贴片和生物学心瓣膜的市售感光氧化心包(SulzerCarbomedics，Austin，Texas)从储存液中被取出并在灭菌盐溶液(0.9％)中漂洗2次，进行1小时。然后该材料离开盐溶液3小时。其后，心包在灭菌条件下平置并分成两半。

第一半被分成2块。第一块被分成1cm²，在给予0.6mL灭菌水并风干1小时后失去作用。另一块接触质粒溶液(2μg/μL浓度，300²μg/cm²剂量)并风干1小时。第二半用0.252μg/μL(SigmaChemical Co.St Louis，Mo)大鼠纤维连接蛋白以10μg/cm²浓度预涂布并风干1小时。其后，通过引入2U/cm²浓度的肝素(L wens，Ballerup，Denmark)，在心包表面上应用二聚血浆纤维连接蛋白的肝素亲和性1小时。然后，纤维连接蛋白处理的心包片被分成2半，一半给予VEGF-质粒(2μg/μL；300μg/cm²)，另一半给予灭菌水。各块被风干1小时。碎片被分成1cm×1cm大小的小块，在大鼠中这些小块是不起作用的。对照大鼠在右侧腹壁接受普通对照瓣膜，左侧腹壁接受纤维连接蛋白和肝素的侧面对照瓣膜。处理动物在右侧腹壁接受有质粒的瓣膜，左侧为有纤维连接蛋白/肝素和质粒的瓣膜。跟踪动物2周(n＝2)和5周(n＝2)。

对照2周：左侧4个瓣膜，右侧4个瓣膜

处理2周：左侧6个瓣膜，右侧6个瓣膜

对照5周：左侧5个瓣膜，右侧6个瓣膜

处理5周：左侧6个瓣膜，右侧6个瓣膜

外科学步骤和处死：

动物用与大鼠主动脉移植物手术所用的一样的麻醉方法麻醉。腹部被剃毛并打开。在伤口区域给予2mL布比卡因。瓣膜用连续的5-0尼龙被缝在中线两侧的腹膜上。每一片用连续的5-0单丝缝合线分别连接在腹壁上。腹部用3-0线逐层关闭。在用心瓣膜片外植腹壁后，动物在麻醉中处死。

分析：

每一片在中部分开。一半瓣膜在2％多聚甲醛/2％戊二醛保存后送电镜检查。第二半在4％福尔马林保存后在光镜下检查，并对Ⅷ因子免疫染色。从每组中随机选择的2个瓣膜送SEM检查，并在每个瓣膜中观察免疫化学的组织学。

结果

SEM显示，2周时，在没有纤维连接蛋白的对照中没有内皮细胞内衬，而用质粒处理者，50％有形成的内皮表面。在仅用纤维连接蛋白处理的瓣膜中，50％已形成了内皮内衬，添加了质粒者100％形成了内皮内衬。4周时，25％的对照瓣膜已形成了内皮内衬，而所有质粒处理的移植物均被具有很好鹅卵石形态的内皮覆盖。

光镜显示，5周时，与对照组相比，质粒处理组中瓣膜毛细血管化增加。

实施例14

在兔子中的ePTFE支架移植物

此实例表明在VEGF或联合应用VEGF和FGF-2基因转染后，内皮表面增加且血栓形成减少。

方法

6只新西兰白兔(2.5-3.2kg)被用在本试验中并在颈动脉接受双侧支架移植物放置。

遗传学方法：

使用与前面描述一样的遗传学方法。

支架移植物的构建

支架移植物基本上按别人以前描述的方法(Swedish专利申请号9903674-1)构建。我们使用了高孔率ePTFE管。60μm结点间距离的10cm长聚四氟乙烯(PTFE)管(1.0mm内径，壁厚0.06mm)的开始2mm被安装在200μm移液头(Labora，Sweden)上。一个25cm长的鱼线环(Expert，#340，0.20mm厚，Fladen Fishing)在最近端的支架支柱(JOSTENTFLEX，16mm长，3-5mm扩张后直径，JomedInternational AB，Helsingborg，Sweden)间被拉动，直到支架位于线的中央。其后，两个游离的线端从移液头的宽末端穿过PTFE管。在环尖有支架的线环被拉过移液头和PTFE管直至支架近端从PTFE管的游离端露出。PTFE管在支架远端被切掉。此步骤得到了一个除远端0.2-0.5mm外完全被PTFE管覆盖的支架。然后，支架移植物在植入前被即时安装和卷曲在冠状血管成形术导管(FREEWAYPTCA导管，2.0cm长，2.5mm直径，Jomed International AB，Helsingborg，Sweden)上。

插入支架移植物的颈动脉血管成形术

320mg乙酰水杨酸(ASA)被加入饮用水中以提供估计的日ASA剂量，10mg/天。动物用0.33mL/kg皮下Hypnorm(0.315mg/mL芬太尼 & 10mg/mL氟阿尼酮，Janssen Pharmaceutica)和0.33mL/kg肌内Dormicum(5mg/mL嘧达唑仑，Roche)麻醉，且用间断静脉内弹丸注射维持麻醉。二氢链霉素25mg和bensylpenicillinprokain 20mg/kg联合肌注给药，且麻卡因(2.5mg/mL)在伤口区域皮内给药。颈部剃毛和灭菌准备。通过中线颈部切口，在解剖显微镜下暴露双侧普通颈动脉。所有分叉下的分枝用4-0 Neurolon(Ethicon)结扎。在耳缘静脉静脉内给予500IU肝素。随机选择颈动脉之一进行本研究。用血管环在近端和远端阻断血管，在远端普通颈动脉内给予肝素后4分钟，紧邻颈动脉分叉近端进行动脉切开术。带有支架移植物的血管成形术导管被引导经过动脉切口并置于近端普通颈动脉。50μl灭菌水的质粒溶液(600μg VEGF，或600μg VEGF和300μg FGF-2)或安慰剂(50μl灭菌水)被抽到接有管针头(0.30mm直径)的注射器中，并在支架移植物中部位置通过支架移植物和血管壁之间的管壁注射。注射后即刻，带有支架移植物的血管成形术导管被扩张到9 ATM 60秒。其后，导管撤出，在适当的位置留下支架移植物。动脉切口用10-0 Ethicon缝合线(Ethicon)手术关闭，血管环移走从而重建了颈动脉的血流。随后，在留下的对侧颈动脉上重复此步骤，伤口用3-0 Monocryl(Ethicon)逐层关闭。在这些试验中，每只动物的左右两侧颈动脉均接受同样的处理。

体外动物检查

植入后1周(7天)或2周(14-15天)，动物如上麻醉。处死前半小时在耳静脉中给予6mL 0.5％的伊文思蓝。在局部注射布比卡因后，进行颈部切开和劈开胸骨术。静脉内给予1000IU肝素。暴露主动脉和心脏。通过大口径针给予左心室120mmHg的磷酸缓冲盐灌注，同时通过右心房切开，动物被同步地放血。一旦血液流干，停止灌注并切离颈动脉。扩张颈动脉并将伸展的血管片段横向分成2个等长的部分。远端一半沿长轴切开，如前所述，照相用于求积法，进一步处理用于扫描电镜。随机选择的近半段之一被异丁烯酸甲脂(MMA)包埋处理并进一步组织学检查。另一半沿长轴切开，照相用于求积法，进一步处理用于表面免疫组化检查。

通过双盲法让两个人进行求积法。内皮覆盖的面积由两个研究者一起确定以意见一致。

SEM

SEM按照前面描述的方法进行。SEM图像上的求积法通过双盲法让两个人进行。内皮覆盖的面积由两个研究者一起确定以意见一致。

组织学检查

组织学分析方法

含支架移植物的完整血管片段和5mm相邻的未处理动脉整体移出并在4％中性缓冲的福尔马林中浸泡固定12小时。固定的标本在乙醇梯度中脱水，并用MMA和二甲苯的1∶1溶液及最后用MMA渗透(4℃，每次12小时)。浸透的样本放进包埋模子中并在-15℃过夜进行聚合作用。聚合的小块被初步处理以让组织成分较接近切片表面。

同一MMA块的两个连续切片，5μm厚，4mm相隔，在Leica 2500SM滑动切片机上用硬组织刀片(Leica，Bensheim，Germany)切片。在一滴80％乙醇浸没后，切片在Superffost玻璃载片(Menzel-G1 ser，Germany)上伸展为无折叠状态，用聚乙烯片和数层滤纸覆盖，在玻璃载片上轻压，然后在42℃负压下过夜干燥。在2-甲氧-乙基-醋酸盐中45-90min进行透明。在梯度乙醇溶液和1mM PBS中进行再脱水。按照标准的组织病理学方法进行苏木精和伊红、Masson’s三色和Elastica van Gieson’s染色。

免疫细胞化学

切片在0.1M柠檬酸缓冲液中90℃负压加热3min，以使抗原修复。用ABC/AEC方法进行免疫组织化学染色。内源性过氧化物酶通过用0.3％H₂O₂甲醇溶液孵育20min，然后用Zymed CAS阻断溶液(ZymedLaboratories，San Francisco，CA)孵育30min而阻断。然后，切片与一抗孵育1h，漂洗，加入二抗30min。卵白素-生物素复合物加入30min后，用3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC，Zymed Laboratories)检测信号。内皮细胞用PECAM-1多克隆Ab(M-20，Santa CruzBiotechnology，1∶20)检测。生物素化二抗购自Dako，以1∶50稀释使用。免疫染色的对照包括用不相关的抗体种类孵育和省略一抗的孵育。

组织学分析由一个独立的对处理毫无所知的人进行。

表面免疫组织化学

在4％磷酸缓冲的多聚甲醛过夜固定后，血管片段用PBS冲洗，用梯度乙醇脱水直到终浓度为50％以在+4℃贮存。在进一步处理前，血管再水化到PBS。标本用一级多抗PECAM-1(M-20，Santa CruzBiotechnology，1∶250)+4℃过夜孵育，用PBS冲洗，用二抗(山羊抗兔IgG，Dako，1∶100)+4℃孵育2h，然后PBS冲洗，用色原(3，3’-二氨基联苯胺四氯化氢用作过氧化物酶反应的底物)室温孵育30min。然后标本用水冲洗，在莱卡M12立体显微镜中观察标本。图像用莱卡DC100数码相机获取。

结果

内皮化

求积法显示，2周时，VEGF质粒处理的支架移植物被内皮细胞覆盖至55.8-62.0％，而对照支架移植物被血栓阻塞，即内皮覆盖0％。1周时，覆盖率为VEGF+FGF-2组57.6％，VEGF组57.9％，对照32.9％。

A部分SEM显示，2周时，55.8-62.0％的VEGF质粒处理的支架移植物被内皮细胞覆盖，而对照支架移植物的表面是形成血栓的，即内皮覆盖0％。1周时，VEGF处理的支架移植物显示32.7％的内皮覆盖，VEGF+FGF-2处理的支架移植物38.9％覆盖。在对照支架移植物中内皮覆盖为21.6％。

表面免疫染色后的光镜证实，在给予伊文思蓝后仍然白色的区域有典型的网状形式，类似于没有支架移植物的正常血管片段。网状染色通常见于大多数区域，除伊文思蓝强染色或有红细胞聚集或血栓的相应区域。

进行转换血管切片的组织病理学检查以证实求积法和SEM关于存在内皮的发现。

结果总结于下表。

动物号，处理，观察终止时间	求积法(来自A和B片段)	SEM(A片段)	组织学(B片段)
				OD153，600μgVEGF，1周	57.9％	32.7％	内皮细胞盖在中膜上，中等量内腔内皮细胞
OD155，600μgVEGF+300μgFGF-2，1周	57.6％	38.9％	内皮细胞在移植物膜壁层表面上，中等量内腔内皮细胞
				OD156，安慰剂，1周	32.9％	21.6％	腔内血栓。观察到腔

			内移植物衣面单一内皮细胞
				OD178，600μgVEGF，2周	55.8％	73.4％	几乎全部有内皮内衬
OD179，安慰剂，2周	0％，血栓形成	0％，血栓形成	血栓性阻塞
				OD184，600μgVEGF，2周	62.0％	66.5％	内腔侧大部分内皮化

实施例15

在兔子中的ePTFE支架移植物

此实例表明，结合VEGF质粒到ePTFE支架移植物上增加了腔内表面的内皮化。

方法

2只新西兰白兔(2.5-3.2kg)被用在本试验中并在颈动脉接受双侧支架移植物放置以研究内皮化。

遗传学方法：

使用与前面描述一样的遗传学方法。

支架移植物膜表面的修饰

通过在面向血管壁的PTFE膜上引入阳离子表面涂层在CorlineSystems AB，Sweden上修饰表面。用5μl增量的移液器将质粒溶液(大约600μg VEGF，50μl灭菌水)或安慰剂(50μl灭菌水)应用在支架移植物表面上，并风干直至可见水蒸发。然后即刻如下描述使用支架移植物。在这些试验中，每只动物的左右两侧颈动脉均接受同样的处理。

支架移植物构建

支架移植物按前面的描述构建，除使用其它生产厂家的支架(PURA-A支架，7mm长，3-5mm扩张后直径，Daevon Medical，Hamburg，Germany)外。

用支架插入的颈动脉血管成形术。

除质粒溶液如上应用在移植物上以外，支架按前面实例的描述植入。

体外动物检查

动物处死过程如前面实例所述。来自1周终点的动物颈动脉被扩张，将装有支架的血管片段进行异丁烯酸甲脂(MMA)包埋并用于进一步组织学检查。

组织学检查

组织学检查按前面实例的描述进行。

结果

内皮化

对已转染基因的血管切片进行组织病理学检查以检测内皮的存在。

结果总结于下表。

动物号，处理，观察终止时间	组织学(完全支架移植物)，dx	组织学(完全支架移植物)，sin
			OD182，600μgVEGF，1周	极少内腔内皮细胞	内腔内皮细胞
OD191，对照，1周	新鲜阻塞的血栓	腔内血栓形成，单一内皮细胞？

Claims (12)

1.一种具有改良生物学特性的医疗装置，以便当其进入哺乳动物体内时至少部分与血液、体液和/或组织接触，该装置包括一个多孔的合成核心和存在于生物相容介质中的核酸，所述的医疗装置选自：心血管植入物、置换哺乳动物身体一部分的植入物、多孔的支架植入物、多孔的血管支架植入物、多孔的移植连接器、组织植入物和生物感受器，其特征在于，所述的核酸编码选自激素、受体、蛋白和生长因子的化学物质和生物分子的翻译或转录产物，其中，所谓作为其活性的结果是可以在所述的核心的至少一个合成表面上至少部分诱导医疗植入物内皮化或血管化。

2.根据权利要求1所述的医疗装置，其中所述的核酸编码选自成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子和表皮生长因子家族、胎盘衍生生长因子、肝细胞生长因子、血管生成素、血管内皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或成纤维细胞生长因子-5的蛋白或多肽的翻译或转录产物。

3.根据权利要求1所述的装置，其中所述的核酸至少暂时附着到所述的装置上，并且在所述的装置导入所述的哺乳动物体内时从所述的装置释放。

4.根据权利要求1或3所述的装置，其中所述的核酸以裸露的形式存在于生物相容的介质中。

5.根据权利要求1所述的装置，其中所述的核酸被引入病毒载体中，所述的病毒载体选自逆转录病毒、仙台病毒、腺伴随病毒和腺病毒。

6.根据权利要求1所述的装置，其中所述的核酸存在于脂质体中。

7.根据权利要求1所述的装置，其中所述的生物相容的介质是生物学稳定的聚合体、生物可吸收的聚合体、生物分子、水凝胶聚合体或纤维蛋白。

8.根据权利要求1所述的装置，它包括在与所述核心分离的容器中贮存的核酸，使其能够成功地被传递到哺乳动物体内。

9.根据权利要求1所述的装置，其中所述的核酸已经通过离子或共价键连接到核心上。

10.根据权利要求1所述的装置，其中所述的合成表面是无孔的。

11.根据权利要求1所述的装置，其中所述的合成表面是多孔的，可以使毛细血管和内皮细胞在孔中生长。

12、编码血管生成因子的核酸在改善医疗装置合成表面的生物学特性中的用途，当该医疗装置植入哺乳动物体内时至少部分与血液、体液和/或组织接触，该装置包括一个多孔的合成核心和存在于生物相容介质中的核酸，所述的医疗装置选自：心血管植入物、置换哺乳动物身体一部分的植入物、多孔的支架植入物、多孔的血管支架植入物、多孔的移植连接器、组织植入物和生物感受器，其特征在于，所述的核酸编码选自激素、受体、蛋白和生长因子的化学物质和生物分子的翻译或转录产物，其中，所谓作为其活性的结果是可以在所述的核心的至少一个合成表面上至少部分诱导医疗植入物内皮化或血管化，其中所述的核酸，编码一种能够至少部分地在至少一个所述核心的合成表面上诱导体内毛细血管内皮化的翻译或转录产物，以溶液或凝胶的形式与所述的表面接触。

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