DE69920031T2

DE69920031T2 - Verwendung von vegf-c und vegf-d genen oder proteinen zur vorbeugung der restenose

Info

Publication number: DE69920031T2
Application number: DE69920031T
Authority: DE
Inventors: Seppo Yla-Herttuala; Kari Alitalo; O. Mikko HILTUNEN; Markku M Jeltsch; G. Marc ACHEN
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Vegenics Pty Ltd
Priority date: 1998-10-26
Filing date: 1999-10-26
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2019-10-27
Also published as: JP5231587B2; CA2340593C; NZ510121A; AU1314700A; ES2229788T3; WO2000024412A3; AU768330B2; PT1126870E; EP1126870A2; EP1126870B1; JP4769929B2; JP2002528420A; DE69920031D1; JP2011173874A; CA2340593A1; NO20012017D0; NO20012017L; WO2000024412A2; ATE275417T1; CN1338943A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verhinderung von Stenose und Restenose von Blutgefäßen und betrifft allgemein das Gebiet der Herz-Kreislauf-Medizin.
Hintergrund der Erfindung
Koronararterienerkrankungen bilden eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität in der ganzen Welt, insbesondere in den Vereinigten Staaten und Europa. Die perkutane transluminale Koronarangioplastie (z. B. Ballon-Angioplastie, mit oder ohne intrakoronares Stenting) ist eine nunmehr gebräuchliche und erfolgreiche Therapie für solche Erkrankungen, die hunderte bis tausende Male pro Jahr allein in den Vereinigten Staaten durchgeführt wird. Bei einem Drittel bis zur Hälfte solcher Revaskularisierungsverfahren tritt jedoch Restenose auf, üblicherweise innerhalb von sechs Monaten nach der Angioplastie-Maßnahme. Die ökonomischen Kosten der Restenose sind auf 2 Millionen Dollar jährlich allein in den Vereinigten Staaten beziffert worden. [Cerek et al., Am. J. Cardiol., 68: 24C-33C (1991).]
Restenose bleibt ein klinisches Problem bei der Angioplastie, die an peripheren Blutgefäßen angewendet wird. Gleichermaßen bildet Restenose ein klinisches Problem zum Beispiel nach der Transplantation von Blutgefäßen (z. B. verpflanzte Venen und verpflanzte künstliche Gefäße) für die Herz-Bypass-Therapie oder für die Behandlung peripherer Ischämie oder Claudicatio intermittens (z. B. femoro-popliteale arterielle Bypass-Transplantate oberhalb des Knies).
Mazur et al., Texas Heart Institute Journal, 21, 104-111 (1994) geben an, daß Restenose primär eine Antwort der Arterie auf die durch die perkutane Koronarangioplastie verursachte Verletzung ist, die die intimale Schicht von Endothelzellen und die darunterliegenden glatten Muskelzellen der Media zerstört. Die Autoren geben an, daß mehrere Wachstumsfaktoren, die durch Blutplättchen, Endothelzellen, Makrophagen und glatte Muskelzellen ausgeschieden werden, an dem Restenoseprozeß mechanistisch beteiligt sind, und daß die Proliferation von glatten Muskelzellen ein kritisches pathogenetisches Merkmal darstellt. Den Autoren zufolge hat sich die Proliferation dieser glatten Muskelzellen als refraktär gegenüber der mechanischen und pharmakologischen Therapie erwiesen. Kürzlich haben andere in Frage gestellt, ob die Proliferation glatter Muskelzellen von vorletzter Bedeutung bei der Restenose ist. Siehe Libby, Circ. Res., 82: 404-406 (1998).
Narins et al., Circulation 97: 1298-1305 (1998) geben eine Übersicht zur Verwendung von intrakoronaren Stents und deren Nutzen und Beschränkungen bei der Verhinderung von Restenose. Debbas et al., American Heart Journal 133: 460-468 (Mason 97) diskutieren das Stenting innerhalb eines Stents, um eine In-Stent-Restenose zu behandeln.
Chang & Leiden, Semin. Intervent. Cardiol. 1: 185-193 (und 1996), hier und durch Inbezugnahme aufgenommen, geben eine Übersicht über Ansätze zur somatischen Gentherapie zur Behandlung von Restenose. Chang und Leiden lehren, daß replikationsdefiziente Adenoviren ein vielversprechendes und siche res Vektorsystem für die Gentherapie umfassen, die auf die Verhinderung von Restenose gerichtet ist, weil solche Viren viele verschiedene Zellarten effizient infizieren können, einschließlich glatter Gefäßmuskelzellen; solche Viren können in hohen Titern hergestellt werden (zum Beispiel 10¹⁰-10¹² plaquebildende Einheiten pro Milliliter); solche Viren können ein Transgen-Insert von z. B. 7-9 Kilobasen (kb) Größe aufnehmen; solche Viren können perkutan durch Standardkatheter zugeführt werden; und solche Viren integrieren nicht in das Wirtsgenom. Sowohl Chang & Leiden als auch Feldman et al., oben, geben auch eine Übersicht über zytotoxische und zytostatische Gentherapieansätze, die dazu ausgelegt sind, proliferierende Gefäßmuskelzellen, die für Restenose kennzeichnende neointimale Bildungen verantwortlich gemacht werden, zu töten oder zu arretieren.
Riessen & Isner, J. Am. Coll. Cardiol., 23: 1234-1244 (1994), hier durch Inbezugnahme aufgenommen, geben eine Übersicht über Vorrichtungen zur intravaskulären Arzneimittelzufuhr und Vektoren für die intravaskuläre Gentherapie.
Cerek et al., Am. J. Cardiol. 68: 24C-33C (1991) schlagen die Verhinderung von Restenose durch Hemmung der wachstumsfaktorvermittelten Heilung von Arterienverletzungen vor. Mögliche Rollen von Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), Thrombospondin, insulinähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-1), Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs), transformierendem Wachstumsfaktor alpha (TGF-α) und beta (TGF-β), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) werden diskutiert.
Isner & Asahara, Veröffentlichung der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/19712, hier durch Inbezugnahme aufgenom men, schlagen die Behandlung von verletzten Blutgefäßen und die Beschleunigung der Reendothelialisierung im Anschluß an die Angioplastie durch Isolieren endothelialer Vorläuferzellen von dem Patienten und die Rückführung solcher Zellen an den Patienten vor. Die Autoren weisen darauf hin, daß die Wirksamkeit der Verwendung eines die Angiogenese fördernden Wachstumsfaktors, wie beispielsweise des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) oder das basischen Fibroblastenwachstumsfaktors (bFGF) durch das Fehlen von Endothelzellen, bei denen der VEGF oder bFGF ihre Wirkungen entfalten werden, beschränkt sein kann.
Martin et al., Veröffentlichung der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/20027 schlagen die Verwendung von VEGF-Gen oder -Protein zur Behandlung oder Verhinderung von Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes vor. Die Autoren geben an, daß jede vorteilhafte Wirkung von VEGF von einem anderen Wirkungsmechanismus als dem Mechanismus herrührt, dem eine Aktivität von VEGF hinsichtlich der Stimulierung der Reendothelialisierung in Fällen, wo das Endothel beschädigt wurde, zugrunde liegt.
Callow et al., Growth Factors, 10: 223-228 (1994) geben an, daß die intravenöse Injektion von vaskulärem Permeabilitätsfaktor (auch bekannt als VEGF) in Kaninchen, die einer durch Ballon-Angioplastie induzierten Endotheldenudation unterzogen worden waren, zu einer im Vergleich zu einer Kontrolle verstärkten Regeneration von Endothel führte. Die Autoren gaben auch an, daß der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) bei der Förderung der Reendothelialisierung wirksam ist, daß diese Reendothelialisierung jedoch von Zunahmen in der Größe neointimaler Läsionen begleitet wird.
Asahara et al., Circulation, 94: 3291-3302 (15. Dezember 1996) geben an, das die lokale perkutane Katheterzufuhr eines CMV-Human-VEGF₁₆₅-Transgens eine beschleunigte Reendothelialisierung bei Ballon-verletzten Kaninchen zeigte, und zu einer verminderten intimalen Verdickung führte. In einem Bericht durch eine verbundene Gruppe von Autoren, Van Belle et al., J. Am. Coll. Cardiol., 29: 1371-1379 (Mai 1997), ist angegeben worden, daß die Stent-Endothelialisierung durch Zufuhr eines CMV-Human-VEGF₁₆₅-Transgens beschleunigt wurde und von einer Abschwächung der intimalen Verdickung begleitet war.
Morishita et al., J. Atherosclerosis and Thrombosis, 4(3): 128-134 (1998) geben an, daß der Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) eine mitogene Aktivität auf menschliche Endothelzellen aufweist, die stärker ist als die von VEGF und stellen die Hypothese auf, daß eine HGF-Gentherapie einen potentiellen therapeutischen Wert für die Behandlung von Herzkreislauferkrankungen, wie beispielsweise Restenose nach Angioplastie, haben kann. Morishita et al. geben auch an, daß nur wenige Erkenntnisse über Wachstumsfaktoren vorliegen, die nur Endothelzellen, jedoch keine Gefäßmuskelzellen stimulieren.
DeYoung & Dichek, Circ. Res. 82: 306-313 (1998) geben an, daß die VEGF-Gen-Zufuhr gegenwärtig nicht zur Anwendung bei menschlicher Restenose geeignet sei, und daß zwei unabhängige Studien nahelegen, daß die VEGF-Zufuhr gegenwärtig die arterielle intimale Hyperplasie verschlechtern kann.
Brown et al., U.S.-Patent Nr. 5,795,898, schlagen die Verwendung eines Inhibitors des PDFG-, FGF-, EGF- oder VEGF-Signaling vor, um eine beschleunigte Atherogenese, die an der Restenose von Koronargefäßen oder anderen arteriellen Gefäßen nach einer Angioplastie beteiligt ist, zu unterdrücken.
Die vorstehende Diskussion zeigt, daß weiterhin ein seit langer Zeit bestehendes Bedürfnis für Verbesserungen an Angioplastiematerialien und/oder Verfahren und/oder begleitenden Therapien existiert, um Restenoseereignisse zu vermindern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung geht auf seit langer Zeit bestehende Bedürfnisse auf dem Gebiet der Medizin hinsichtlich der Verhinderung von Stenose oder Restenose bei Säugetierblutgefäßen ein.
Der Gegenstand der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Beispielsweise stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetierpatienten zur Verhinderung von Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes bereit, wobei die Behandlung die Schritte des Verabreichens einer ein Polynukleotid umfassenden Zusammensetzung an einen Säugetierpatienten, der einer Behandlung zur Verhinderung von Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes bedarf, umfaßt, und wobei das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors C (VEGF-C) umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Patient ein menschlicher Patient.
Obwohl es vorgesehen ist, daß das VEGF-C-Polynukleotid rein zur prophylaktischen Behandlung für die Verhinderung von Ste nose verabreicht werden könnte, ist vorgesehen, daß das Polynukleotid kurz vor und/oder gleichzeitig mit und/oder kurz nach einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie-Maßnahme verabreicht wird, um eine Restenose des Patientengefäßes zu verhindern. Das Polynukleotid kann vor, während und/oder kurz nach einer Bypass-Maßnahme (z. B. einer koronaren Bypass-Maßnahme) verabreicht werden, um Stenose oder Restenose in oder nahe dem transplantierten (verpflanzten) Gefäß zu verhindern, insbesondere Stenose am Ort der Verpflanzung selbst. Das Polynukleotid kann vor, während oder nach einer Gefäßtransplantation, die zur Behandlung peripherer Ischämie oder Claudicatio intermittens durchgeführt wurde, in der Gefäßperipherie verabreicht werden. Mit Verhinderung von Stenose oder Restenose ist eine prophylaktische Behandlung gemeint, um die Menge/Schwere von Stenose oder Restenose, die häufig bei solchen chirurgischen Maßnahmen auftritt, zu vermindern und/oder im wesentlichen zu eliminieren. Das Polynukleotid ist in einer Menge und einer Form in der Zusammensetzung enthalten, die wirksam ist, die Expression eines VEGF-C-Polypeptids in einem Blutgefäß des Säugetierpatienten zu fördern, wodurch die Stenose oder Restenose des Blutgefäßes verhindert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Säugetierpatient ein menschlicher Patient. Zum Beispiel ist der Patient eine an einer koronaren Arterienerkrankung leidende Person, die durch einen Kardiologen als ein Kandidat identifiziert wurde, der von einer therapeutischen Ballon-Angioplastie-Maßnahme (mit oder ohne Einführung eines intravaskulären Stents) oder von einer koronaren Bypass-Maßnahme profitieren könnte. Die Erfindung kann für andere Säugetierpatienten verwendet werden, insbesondere Säugetiere, die üblicherweise als Modelle zur Demonstration der therapeutischen Wirksamkeit beim Menschen verwendet werden (z. B. Primaten, Schweine, Hunde oder Kaninchen).
Für die Ausübung der Erfindung soll der Begriff "VEGF-C-Polypeptid" jedes Polypeptid beinhalten, das eine VEGF-C-Aminosäuresequenz oder eine zu VEGF-C analoge Aminosäuresequenz (wie andernorts in größerer Ausführlichkeit beschrieben) aufweist und das in vivo restenosevermindernde Wirkungen von menschlichem VEGF-C besitzt, wobei diese Wirkungen hier durch Beispiele in einem Kaninchen-Modell demonstriert werden. Der Begriff "VEGF-C-Polynukleotid" soll jedes Polynukleotid (z. B. DNA oder RNA, einzel- oder doppelsträngig) beinhalten, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein VEGF-C-Polypeptid kodiert. Aufgrund der gut bekannten Degeneration des genetischen Codes existieren mehrere VEGF-Polynukleotidsequenzen, die jedes ausgewählte VEGF-C-Polypeptid kodieren.
Zur Behandlung von Menschen sind VEGF-C-Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz eines menschlichen VEGF-C stark bevorzugt, und Polynukleotide, die eine Nukleotidsequenz einer menschlichen VEGF-C-cDNA umfassen, sind stark bevorzugt. Mit "menschlichem VEGF-C" ist ein Polypeptid gemeint, das einem natürlich vorkommenden Protein (Prä-Pro-Protein, teilweise prozessiertem Protein oder vollständig prozessiertem reifem Protein) entspricht, das durch irgendein Allel des menschlichen VEGF-C-Gens kodiert wird, oder ein Polypeptid, das ein biologisch aktives Fragment eines natürlich vorkommenden reifen Proteins umfaßt. Beispielsweise umfaßt ein menschlicher VEGF-C einen zusammenhängenden Bereich der in der SEQ ID NO: 2 wiedergegebenen Aminosäuresequenz, der ausreicht, damit das Polypeptid bindet und die VEGFR-2- und/oder VEGFR-3-Phos phorylierung in Zellen, die solche Rezeptoren exprimieren, stimuliert. Insbesondere ist ein Polypeptid vorgesehen, das 131-211 Aminosäuren der SEQ ID NO: 2 umfaßt. Beispielsweise sind Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz vorgesehen, die einen zusammenhängenden Bereich der SEQ ID NO: 2 umfassen, wobei der zusammenhängende Bereich an seinem Aminoterminus eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 30-131 der SEQ ID NO: 2 und an seinem Carboxyterminus eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 211 bis 419 der SEQ ID NO: 2. Wie hier an anderer Stelle in größerer Ausführlichkeit beschrieben, erhöhen sich die biologischen Aktivitäten von VEGF-C, insbesondere diejenigen, die durch VEGFR-2 vermittelt werden, bei der Prozessierung sowohl eines aminoterminalen als auch eines carboxyterminalen Propeptids. Daher ist ein Aminoterminus bevorzugt, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 102-131 der SEQ ID NO: 2, und ein Aminoterminus, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 103-113 der SEQ ID NO: 2, ist besonders bevorzugt. Gleichermaßen ist ein Carboxyterminus, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 211-227 der SEQ ID NO: 2, bevorzugt. Wie oben angegeben, soll der Begriff "menschlicher VEGF-C" auch Polypeptide umfassen, die durch allelische Varianten des menschlichen VEGF-C kodiert werden, die durch die in den SEQ ID NO: 1 & 2 wiedergegebenen Sequenzen gekennzeichnet sind.
Da der therapeutische VEGF-C als rekombinanter VEGF-C oder indirekt über somatische Gentherapie zu verabreichen ist, liegt es darüber hinaus innerhalb des Fachkönnens, Analoga von menschlichem VEGF-C (sowie Polynukleotide, die solche Analoga kodieren) herzustellen und zu verwenden, wobei eine oder mehrere Aminosäuren zugefügt, entfernt oder durch anderen Aminosäuren ersetzt worden sind, insbesondere mit konservativen Ersetzungen, und wobei die biologische Anti-Restenose-Aktivität erhalten geblieben ist. Analoga, die die biologische Anti-Restenoseaktivität von VEGF-C bewahren, sind als VEGF-C-Polypeptide zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung vorgesehen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Analoga, die 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 solche Modifikationen aufweisen und die biologische Anti-Restenose-Aktivität von VEGF-C bewahren, als VEGF-C-Polypeptide zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung vorgesehen. Polynukleotide, die solche Analoga kodieren, werden erzeugt unter Verwendung konventioneller PCR, ortsgerichteter Mutagenese und chemischer Synthesetechniken.
Ebenfalls als VEGF-C-Polypeptide vorgesehen sind nicht-menschliche Säugetier- oder Vogel-VEGF-C-Polypeptide und -Polynukleotide. Mit "Säugetier-VEGF-C" ist ein Polypeptid gemeint, das einem natürlich vorkommenden Protein (Prä-Pro-Protein, teilweise prozessierten Protein oder vollständig prozessierten reifen Protein) entspricht, das durch irgendein Allel eines VEGF-C-Gens irgendeines Säugetieres kodiert wird, oder ein Polypeptid, das ein biologisch aktives Fragment eines reifen Proteins umfaßt. Der Begriff "Säugetier-VEGF-C-Polypeptide" soll Analoga von menschlichen VEGF-Cs beinhalten, die in vivo die restenosevermindernde Wirkung von Säugetier-VEGF-C aufweisen. Die Tatsache, daß Gentherapie bei Verwendung eines einen menschlichen VEGF-C kodierenden Transgens bei der Verhinderung von Restenose in einem Kaninchenmodell wirksam ist, ist ein Hinweis auf die artübergreifende therapeutische Wirksamkeit von VEGF-C-Proteinen.
Unabhängig davon, welches VEGF-C-Polypeptid ausgewählt wird, umfaßt das VEGF-C-Polypeptid vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die ein sekretorische Signalpeptid kodiert, das "in-frame" mit der VEGF-C-Polypeptidsequenz verbunden ist. Das sekretorische Signalpeptid steuert die Sekretion des VEGF-C-Polypeptids durch die Zellen, die das Polynukleotid exprimieren, und wird durch die Zelle von dem ausgeschiedenen VEGF-C-Polypeptid abgespalten. Zum Beispiel könnte das VEGF-C-Polypeptid die vollständige in SEQ ID NO: 2 wiedergegebene Prä-Pro-VEGF-C-Sequenz kodieren; oder könnte das in-frame mit einer einen vollständig prozessierten VEGF-C (zum Beispiel die Aminosäuren 103-227 der SEQ ID NO: 2) oder ein VEGF-C-Analogon kodierenden Sequenz verbundene VEGF-C-Signalpeptid kodieren. Darüber hinaus ist es nicht erforderlich, daß das Signalpeptid von VEGF-C abgeleitet ist. Die Signalpeptid-Sequenz kann die eines anderen ausgeschiedenen Proteins sein, oder kann eine vollständig synthetische Signalsequenz sein, die wirksam ist, die Sekretion in Zellen des Säugetierpatienten zu steuern.
In einer Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße VEGF-C-Polypeptid eine Nukleotidsequenz, die mit einem Polynukleotid, das zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen menschlichen VEGF-cDNA-Sequenz komplementär ist, unter den folgenden beispielhaften stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: Hybridisierung bei 42 °C in 50% Formamid, 5 × SSC, 20 mM Na·PO₄, pH 6,8; und Waschen in 1 × SSC bei 55 °C für 30 Minuten; und wobei die Polynukleotidsequenz ein Polypeptid kodiert, das menschlichen VEGFR-2 und/oder VEGFR-3 bindet und stimuliert. Es ist ersichtlich, daß Variationen dieser exemplarischen Bedingungen auf Grundlage der Länge und des GC- Nukleotidgehalts der zu hybridisierenden Sequenzen auftreten. Formulierungen, die Standard im Stand der Technik sind, sind zur Feststellung der geeigneten Hybridisierungsbedingungen geeignet. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Zweite Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) §§ 9.47-9.51.
In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das VEGF-C-Polynukleotid ferner zusätzliche Sequenzen, um die VEGF-C-Gentherapie zu erleichtern. In einer Ausführungsform wird ein "nacktes" VEGF-C-Transgen (d. h. ein Transgen ohne einen viralen, liposomalen oder anderen Vektor zur Erleichterung der Transfektion) für die Gentherapie eingesetzt. In dieser Ausführungsform umfaßt das VEGF-C-Polynukleotid bevorzugt eine geeignete Promotor- und/oder Enhancer-Sequenz (z. B. Cytomegalovirus-Promotor/Enhancer [Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29: 2494-2502 (1991); Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)]; Rous-Sarkom-Virus-Promotor [Davis et al., Hum. Gene Ther. 4: 151 (1993)]; Tie-Promotor [Korhonen et al., Blood 68(5): 1828-1835 (1995)]; oder Affenvirus-40-Promotor zur Expression in der Säugetier-Zielzelle, wobei der Promotor zu der kodierenden Sequenz für VEGF-C stromaufwärts (d. h. 5') funktionell verbunden ist. Das VEGF-C-Polynukleotid beinhaltet vorzugsweise darüber hinaus eine geeignete Poly-A-Sequenz (z. B. die Poly-A-Sequenz des SV40 oder des Gens des menschlichen Wachstumshormons), die stromabwärts (d. h. 3') zu der kodierenden Sequenz von VEGF-C funktionell verknüpft ist. Das Polynukleotid kann ferner wahlweise Sequenzen umfassen, deren einzige gewünschte Funktion darin besteht, die Produktion des Vektors, z.B. in Bakterien, in großem Maßstab zu erleichtern, wie beispielsweise einen bakteriellen Replikationsursprung und eine Sequenz, die für einen selektierbaren Marker ko diert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Sonder-Sequenzen jedoch zumindest teilweise vor der Verabreichung an Menschen gemäß den Verfahren der Erfindung abgespalten. Man kann solche Polynukleotide herstellen und verabreichen, um eine erfolgreiche Gentherapie unter Verwendung von Verfahren zu erreichen, die in der Literatur für andere Transgene beschrieben wurden. Siehe z. B. Isner et al., Circulation, 91:2687-2692 (1995); und Isner et al., Human Gene Therapy 7:989-1011 (1996); hier durch Inbezugnahme vollständig aufgenommen.
Jeder geeignete Vektor kann verwendet werden, um das VEGF-Transgen in den Wirt einzuführen. Beispielhafte Vektoren, die in der Literatur beschrieben wurden, schließen replikationsdefiziente retrovirale Vektoren ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Lentivirus-Vektoren [Kim et al., J. Virol. 72(1): 811-816 (1998); Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, October 1998, S. 43-46.]; adeno-assoziierte virale Vektoren [Gnatenko et al., J. Investig. Med. 45: 87-98 (1997)]: adenovirale Vektoren (sie z.B. US-Patent Nr. 5,792,453; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet et al, J. Clin. Invest., 90: 620-630 (1992); und Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992)]; Lipofectin-vermittelter Gentransfer (BRL); liposomale Vektoren [siehe z. B. US-Patent Nr. 5,631,237 (Liposomen, die Sendai-Virusprotein umfassen)]; und Kombinationen davon. Alle vorstehenden Dokumente werden hier durch Inbezugnahme vollständig aufgenommen. Replikationsdefiziente adenovirale Vektoren stellen eine bevorzugte Ausführungsform dar.
In Ausführungsformen, die einen viralen Vektor einsetzen, beinhalten bevorzugte Polynukleotide weiterhin einen geeigne ten Promotor und eine geeignete Poly-A-Sequenz, wie oben beschrieben. Darüber hinaus ist leicht ersichtlich, daß bei diesen Ausführungsformen das Polynukleotid ferner Vektor-Polynukleotidsequenzen (z. B. adenovirale Polynukleotidsequenzen) beinhaltet, die mit den ein VEGF-C-Polypeptid kodierenden Sequenzen funktionell verbunden sind.
In einer Ausführungsform umfaßt die zu verabreichende Zusammensetzung daher einen Vektor, wobei der Vektor das VEGF-C-Polynukleotid umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor ein Adenovirus-Vektor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Adenovirus-Vektor replikationsdefizient, d.h., er kann aufgrund der Entfernung essentieller Virenreplikationssequenzen aus dem adenoviralen Genom in einem Säugetierpatienten nicht repliziert werden. Zum Beispiel sehen die Erfinder ein Verfahren vor, bei dem der Vektor einen replikationsdefizienten Adenovirus umfaßt, wobei der Adenovirus das VEGF-C-Polynukleotid funktionell mit einem Promotor verbunden und an beiden Enden von adenoviralen Polynukleotidsequenzen flankiert umfaßt.
Die gemäß der Erfindung zu verabreichende Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise (zusätzlich zu dem Polynukleotid oder Vektor) eine pharmazeutisch annehmbare Trägerlösung wie beispielsweise Wasser, Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung, Glucose oder andere Träger, die üblicherweise verwendet werden, um Therapeutika intravaskulär zuzuführen. Eine Multi-Gentherapie ist ebenfalls vorgesehen, wobei in diesem Fall die Zusammensetzung optional sowohl das/den VEGF-C-Polynukleotid/Vektor als auch ein/einen anderes/anderen Polynukleotid/Vektor umfaßt, die ausgewählt sind, um Restenose zu verhindern. Beispielhafte Kandidaten-Gene/Vektoren für die Co-Transfektion mit VEGF-C-Transgenen sind in der oben zitierten Literatur beschrieben, einschließlich Genen, die zytotoxische Faktoren, zytostatische Faktoren, endotheliale Wachstumsfaktoren und Wachstums/Migrationsinhibitoren der glatten Muskulatur kodieren. Wie in größerer Ausführlichkeit unten beschrieben, ist ein VEGF-D-Transgen ein bevorzugter Kandidat für die gemeinsame Verabreichung mit dem VEGF-C-Transgen. Insbesondere ist die gemeinsame Verabreichung eines VEGF-Transgens ebenfalls vorgesehen.
Die durchgeführte "Verabreichung" kann durchgeführt werden unter Verwendung jedes medizinisch annehmbaren Mittels zur Einführung eines Therapeutikums direkt oder indirekt in das Gefäßsystem eines Säugetierpatienten, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Injektionen; orale Aufnahme; intranasale oder topische Verabreichung und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verabreichung der das VEGF-C-Polynukleotid umfassenden Zusammensetzung intravaskulär durchgeführt, beispielsweise durch intravenöse, intraarterielle oder intrakoronararterielle Injektion.
Besonders bevorzugt kann die Zusammensetzung lokal verabreicht werden, z. B. an den Ort der Angioplastie oder des Bypass. Zum Beispiel umfaßt die Verabreichung einen kathetervermittelten Transfer der transgenhaltigen Zusammensetzung in ein Blutgefäß des Säugetierpatienten, insbesondere in eine Koronararterie des Säugetierpatienten. Beispielhafte Materialien und Verfahren zur lokalen Zufuhr sind beschrieben in Lincoff et al., Circulation 90: 2070-2084 (1994): und Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med. 3: 163-170 (1093), die beide hier durch Inbezugnahme aufgenommen sind. Beispielsweise wird die Zusammensetzung eines Infusions-Perfusions- Ballonkatheters (vorzugsweise eines mikroporösen Ballonkatheters) verabreicht, wie beispielsweise jenen, die in der Literatur für intrakoronare Arzneimittelinfusionen beschrieben sind. Siehe z. B. das US-Patent Nr. 5,713,860 (intravaskulärer Katheter mit Infusionsanordnung); US-Patent Nr. 5,087,244; US-Patent Nr. 5,653,689; und Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475-481 (1900) (Wolinsky-Infusionskatheter); und Lambert et al., Coron. Artery Dis. 4: 469-475 (1093). Die Verwendung solcher Katheter für die ortsgerichtete somatische Zellgentherapie ist zum Beispiel beschrieben in Mazur et al., Texas Heart Institute Journal 21: 104-111 (1094), hier durch Inbezugnahme aufgenommen. In einer Ausführungsform, bei der das VEGF-C-Transgen in einem Adenovirus-Vektor zu verabreichen ist, wird der Vektor bevorzugt in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger bei einem Titer von 10⁷-10¹³ Virenpartikeln, und besonders bevorzugt bei einem Titer von 10⁹-10¹¹ Virenpartikeln verabreicht. Die adenovirale Vektor-Zusammensetzung wird vorzugsweise über einen Zeitraum von 15 Sekunden bis 30 Minuten, besonders bevorzugt 1 bis 10 Minuten, infundiert.
Zum Beispiel beinhaltet ein beispielhaftes Protokoll bei Patienten mit Angina pectoris aufgrund einer einzelnen oder mehrerer Läsionen in Koronararterien, für die auf Basis erster Befunde anhand eines Koronar-Angiogramms PTCA verschrieben wurde, die Durchführung von PTCA mittels eines 7F-Führungskatheters gemäß klinischer Praxisstandards unter Verwendung des femoralen Zugangs. Wenn ein optimales Ergebnis mit PTCA allein nicht erreicht wird, wird ein endovaskulärer Stent ebenfalls implantiert. (Ein nicht optimales Ergebnis ist definiert als verbleibende Stenose von >30% des luminalen Durchmessers nach optischer Abschätzung, und Dissektion vom B- oder C-Typ). Arterieller Gentransfer am Ort der Ballondilatation wird mit einem replikationsdefizienten adenoviralen VEGF-C-Vektor sofort nach der Angioplastie, jedoch vor der Stent-Implantation unter Verwendung eines Infusions-Perfusions-Ballonkatheters durchgeführt. Die Größe des Katheters wird in Anpassung an den mittels Angiogramm gemessenen Durchmesser der Arterie ausgewählt und variiert z.B. von 3,0 bis 3,5F im Durchmesser. Der Ballon wird auf den optimalen Druck aufgeblasen und der Gentransfer wird während einer 10minütigen Infusion bei einer Rate von 0,5 ml/min mit einem Virustiter von 1,15 × 10¹⁰ durchgeführt.
Die intravaskuläre Verabreichung mit einem gelbeschichteten Katheter, wie er in der Literatur zur Einführung anderer Gene beschrieben worden ist, ist ebenfalls vorgesehen. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,674,192 (Katheter, beschichtet mit hartnäckig anhaftendem schwellbaren Hydrogelpolymer); Riessen et al., Human Gene Therapy 4: 749-758 (1993); und Steg et al., Circulation 96: 408-411 (1997) und 90: 1648-1656 (1994). Kurz gesagt, wird DNA in Lösung (z. B. das VEGF-C-Polynukleotid) ein oder mehrere Male ex vivo auf die Oberfläche eines aufgeblasen Angioplastiekatheter-Ballon, der mit einem Hydrogelpolymer (z. B. Schieber mit Hydroplus, Mansfield Boston Scientific Corp., Watertown, MA) beschichtet ist, aufgebracht. Die Hydroplus-Beschichtung ist ein hydrophiles Polyacrylsäure-Polymer, das mit dem Ballon quervernetzt ist, um ein Hydrogel mit hohem Molekulargewicht zu bilden, das fest an den Ballon angeheftet ist. Das DNA-beschichtete Hydrogel wird vor der Deflation des Ballons trocknen gelassen. Die erneute intravaskuläre Inflation des Ballons während einer Angioplastie-Maßnahme verursacht den Transfer der DNA auf die Gefäßwand.
In einer weiteren Ausführungsform ist eine dehnbare elastische Membran oder ähnliche Struktur, die auf einen Ballon-Angioplastiekatheter oder Stent montiert oder darin integriert ist zur Zuführung des VEGF-C-Transgens einzusetzen. Siehe z. B. die US-Patente Nr. 5,707,385, 5,697,967, 5,700,286, 5,800,507 und 5,776,184.
In einer anderen Variante ist die das VEGF-C-Transgen enthaltende Zusammensetzung extravaskulär zu verwenden, z. B. unter Verwendung einer Vorrichtung, um einen Bereich des Gefäßes zu ummanteln oder einzukapseln. Siehe z. B. die Veröffentlichung der internationalen Patentanmeldung WO 98/20027, die eine Manschette beschreibt, die (z. B. während einer Bypass-Maßnahme) um die Außenseite einer Arterie herum angeordnet wird, um ein Transgen mittels eines Plasmids oder Liposomen-Vektors an die Arterienwand zuzuführen.
Endothelzellen oder Endothel-Vorläuferzellen können auch ex vivo mit dem VEGF-C-Transgen transfiziert werden, und die transfizierten Zellen werden an den Säugetierpatienten verabreicht. Beispielhafte Verfahren zur Beimpfung eines Gefäßtransplantats mit genetisch modifizierten Endothelzellen sind im US-Patent, 5,785,965 beschrieben.
Wenn der Säugetierpatient ein Gefäßtransplantat empfängt, kann die das VEGF-C-Transgen enthaltende Zusammensetzung direkt an dem isolierten Gefäßsegment angewendet werden, bevor es in vivo verpflanzt wird.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetierpatienten bereit, um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, wobei die Behandlung den Schritt des Verabreichens einer ein VEGF-C-Polypeptid enthaltenden Zusammensetzung an einen Säugetierpatienten, der behandlungsbedürftig ist, um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, in einer Menge umfaßt, die bei der Verhinderung von Stenose oder Restenose des Blutgefäßes wirksam ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Verabreichung das Implantieren eines intravaskulären Stents in den Säugetierpatienten, wobei der Stent mit der Zusammensetzung beschichtet oder imprägniert ist. Beispielhafte Materialien zur Konstruktion des arzneimittelbeschichteten oder arzneimittelimprägnierten Stents sind in der oben zitierten Literatur beschriebenen und in Lincoff et al., Circulation, 90: 2070-2084 (1994) in einer Übersicht dargestellt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung Mikropartikel, die aus biologisch abbaubaren Polymeren wie PGLA, nicht-abbaubaren Polymeren oder biologischen Polymeren (z. B. Stärke) zusammengesetzt sind, wobei die Partikel das VEGF-C-Polypeptid einschließen oder damit imprägniert sind. Solche Partikel werden der intravaskulären Wand unter Verwendung z.B. eines Infusions-Angioplastie-Katheters zugeführt. Andere Techniken zur Erreichung einer lokal anhaltenden Arzneimittelzufuhr sind in Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med. 3: 163-170 (1993), hier durch Inbezugnahme aufgenommen, in einer Übersicht dargestellt.
Die Verabreichung über eine oder mehr intravenöse Injektionen im Anschluß an die Angioplastie- oder Bypass-Maßnahme ist ebenfalls vorgesehen. Die Lokalisierung des VEGF-C-Polypeptids an den Ort der Maßnahme erfolgt durch Expression von VEGF-C-Rezeptoren auf proliferierenden Endothelzellen. Die Lokalisierung wird weiter erleichtert durch rekombinante Ex pression des VEGF-C als Fusions-Polypeptid (z. B. fusioniert an ein Apolipoprotein B-100-Oligopeptid, wie in Shih et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1436-1440 (1990) beschrieben. Die gemeinsame Verabreichung von VEGF-C-Polynukleotiden und VEGF-C-Polypeptiden ist ebenfalls vorgesehen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines VEGF-C-Polynukleotids oder VEGF-C-Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhinderung von Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes bereit.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetierpatienten bereit, um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, wobei die Behandlung den Schritt des Verabreichens einer ein Polynukleotid enthaltenden Zusammensetzung an einen Säugetierpatienten, der behandlungsbedürftig ist, um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, umfaßt, wobei das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid eines vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor D (VEGF-D) umfaßt. Solche Verfahren werden im wesentlichen wie hier in Bezug auf VEGF-C-kodierende Polynukleotide beschrieben ausgeübt, mit der Ausnahme, daß Polynukleotide eingesetzt werden, die VEGF-D kodieren. Eine ausführliche Beschreibung des menschlichen VEGF-D-Gens und -Proteins wird in Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 95(2): 548.553 (1998); der Veröffentlichung der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/07832, veröffentlicht am 26. Februar 1998; und in der Genbank-Zugriffsnummer AJ000185 bereitgestellt. Eine cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenzen für Prä-Pro-VEGF-D ist hier in den SEQ ID NO: 3 und 4 wiedergegeben. Aufgrund der wohlbekannten Degeneration des genetischen Codes existieren natürlich viele VEGF-D-kodierende Polynukleotidsequenzen, die alle nach den hier gelehrten Verfahren eingesetzt werden können.
Wie hier ausführlich in Bezug auf VEGF-C beschrieben, ist die Verwendung von Polynukleotiden, die VEGF-D-Fragmente, VEGF-D-Analoga, VEGF-D-Allel- und -Interspezies-Varianten und dergleichen kodieren, die in vivo Anti-Restenose-Wirkungen von menschlichem VEGF-D besitzen, alle als von der vorliegenden Erfindung umfaßt vorgesehen.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetierpatienten bereit, um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, wobei die Behandlung den Schritt des Verabreichens einer ein VEGF-D-Polypeptid enthaltenden Zusammensetzung an einen Säugetierpatienten, der behandlungsbedürftig ist, um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, in einer Menge umfaßt, die bei der Verhinderung von Stenose oder Restenose des Blutgefäßes wirksam ist. Solche Verfahren werden im wesentlichen wie hier in Bezug auf VEGF-C-Polypeptide beschrieben ausgeübt.
In einem verwandten Aspekt stellt die Erfindung Materialien und Vorrichtungen zur Ausübung der oben beschriebenen Verfahren bereit.
Gleichermaßen stellt die Erfindung chirurgische Vorrichtungen bereit, die zur Behandlung von Kreislaufstörungen verwendet werden, wie beispielsweise intravaskuläre (endovaskuläre) Stents, Ballonkatheter, Infusions-Perfusions-Katheter, extravaskuläre Manschetten, elastomere Membranen und dergleichen, die durch Beschichten mit, Imprägnieren mit, Anheften an oder Einkapseln in der Vorrichtung einer Zusammensetzung umfassend ein VEGF-C-Polynukleotid, ein VEGF-C-Polypeptid, ein VEGF-D-Polynukleotid und/oder VEGF-D-Polypeptid verbessert worden sind.
Beispielsweise stellt die Erfindung in einer Ausführungsform einen endovaskulären Stent bereit, der gekennzeichnet ist durch eine Verbesserung, wobei der Stent mit einer Zusammensetzung beschichtet oder imprägniert ist, wobei die Zusammensetzung mindestens ein Anti-Restenose-Mittel umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus VEGF-C-Polynukleotiden, VEGF-C-Polypeptiden, VEGF-D-Polynukleotiden und VEGF-D-Polypeptiden. Beispielhafte Stents, die in dieser Weise verbessert werden können, sind beschrieben und dargestellt in den US-Patenten Nr. 5,800,507 und 5,697,967 (Medtronic, Inc., einen intraluminalen Stent beschreibend, der Fibrin und ein eluierbares Arzneimittel umfaßt, das eine Behandlung von Restenose bereitstellen kann); dem US-Patent Nr. 5,776,184 (Medtronic, Inc., einen Stent mit einer porösen Beschichtung beschreibend, die ein Polymer und eine therapeutische Substanz in einem Feststoff oder einem Feststoff/einer Lösung mit dem Polymer umfaßt); dem US-Patent Nr. 5,799,384 (Medtronic Inc., einen flexiblen zylindrischen Metall-Stent beschreibend, der eine biokompatible polymere Oberfläche zur Kontaktierung eines Körperlumens aufweist); den US-Patenten Nr. 5,824,048 und 5,679,400; und dem US Patent Nr. 5,779,729. Die Implantation solcher Stents bei konventionellen Angioplastie-Techniken führt zu weniger Restenose als die Implantati on von konventionellen Stents. In diesem Sinne ist die Biokompatibilität des Stents verbessert.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine durch eine Verbesserung gekennzeichnete extravaskuläre Manschette zur Zuführung eines therapeutischen Mittels an ein Blutgefäß bereit, wobei die Manschette beschichtet oder imprägniert ist mit einer Zusammensetzung oder diese einschließt, wobei die Zusammensetzung mindestens ein Anti-Restenose-Mittel umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus VEGF-C-Polynukleotiden, VEGF-C-Polypeptiden, VEGF-D-Polynukleotiden und VEGF-D-Polypeptiden. Eine beispielhafte Manschette, die in dieser Weise verbessert werden kann, ist beschrieben und dargestellt in der Offenlegungsschrift der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/20027 (Eurogene, Ltd., Manschette, umfassend einen Körper, der angepaßt ist, um eine Dichtung um ein Gefäß bereitzustellen und ein Reservoir zu bilden, um eine pharmazeutische Anti-Restenose-Formulierung zu halten).
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen durch eine Verbesserung gekennzeichneten Polymerfilm zum Einwickeln eines Stents bereit, wobei der Film beschichtet ist mit oder imprägniert ist mit einer Zusammensetzung, und wobei die Zusammensetzung mindestens ein Anti-Restenose-Mittel umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus VEGF-C-Polynukleotiden, VEGF-C-Polypeptiden, VEGF-D-Polynukleotiden und VEGF-D-Polypeptiden. Ein beispielhafter Film, der in dieser Weise verbessert werden kann, ist beschrieben und dargestellt in den US-Patenten Nr. 5,700,286 und 5,797,385 (Advanced Cardiovascular Systems, Inc., Hüllen aus bioabsorbierbarem polymeren Material, das mit einem Re stenose-verhindernden therapeutischen Mittel beschichtet oder imprägniert ist und an einen endovaskulärer Stent anbringbar ist).
Gleichermaßen beinhaltet die Erfindung Kits, die erfindungsgemäße Verbindungen oder Zusammensetzungen umfassen, die in einer Weise verpackt sind, die deren Verwendung zur Ausübung der erfindungsgemäßen Verfahren erleichtert. In einer einfachsten Ausführungsform beinhaltet solch ein Kit eine hier als geeignet zur Ausübung der Erfindung beschriebene Verbindung oder Zusammensetzung (z.B. VEGF-C- oder VEGF-D-Polynukleotide oder -Polypeptide), verpackt in einem Behälter wie beispielsweise einer verschlossenen Flasche oder einem verschlossenen Gefäß, mit einem an dem Behälter befestigten oder in dem Paket enthaltenen Etikett, das die Verwendung der Verbindung oder Zusammensetzung zur Ausübung der erfindungsgemäßen Verfahren beschreibt. Bevorzugt ist die Verbindung oder Zusammensetzung in einer Einheitsdosierform verpackt. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein erfindungsgemäßer Kit sowohl eine VEGF-C- als auch eine VEGF-D-Polynukleotid- oder -Polypeptid-Zusammensetzung, die zusammen mit einer technischen Vorrichtung verpackt ist, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, wie beispielsweise einem Stent, einem Katheter, einer extravaskulären Manschette, einem Polymerfilm oder dergleichen. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein erfindungsgemäßer Kit sowohl eine VEGF-C- als auch eine VEGF-D-Polynukleotid- oder -Polypeptid-Zusammensetzung, die zusammen mit einem Hydrogelpolymer oder Mikropartikelpolymer oder anderen hier als für die Zuführung des VEGF-C/VEGF-D an den Patienten geeignet beschriebenen Trägers verpackt ist.
Zusätzliche Eigenschaften und Variationen der Erfindung werden für den Fachmann aus der gesamten Beschreibung ersichtlich sein, und alle diese Eigenschaften sind als Aspekte der Erfindung vorgesehen.
Gleichermaßen können hier beschriebene Eigenschaften der Erfindung zu weiteren Ausführungsformen neu kombiniert werden, die als Aspekte der Erfindung gedacht sind, unabhängig davon, ob die Kombination von Merkmalen oben spezifisch als ein Aspekt oder eine Ausführungsform der Erfindung aufgeführt ist. Auch sollten nur solche Beschränkungen, die hier als kritisch für die Erfindung beschrieben sind, als solche angesehen werden; Variationen der Erfindung ohne Beschränkungen, die hier nicht als kritisch beschrieben sind, sind als Aspekte der Erfindung vorgesehen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt einen Querschnitt eines Blutgefäßes dar, in das ein Arzneimittelzufuhr-Ballonkatheter einschließlich einer schützenden Hülle eingeführt wurde, wobei die schützende Hülle dazu dient, den Ballon bei der Einführung und Positionierung abzudecken.
2A stellt eine perspektivische Sicht auf eine dehnbare Membran dar, die zwei Schichten aufweist, die vor der Verbindung von Rändern der Schichten miteinander räumlich voneinander getrennt sind.
2B stellt eine perspektivische Sicht auf die Membran aus 2A dar, die zu einer Röhre eingerollt wurde und zusammengefügte gegenüberliegende Ränder aufwies.
Die 3A und 3B stellen, perspektivisch (3A) und als Längsquerschnitt (3B), schematische Ansichten von einer extravaskulären Manschette dar, die einen Bereich eines Blutgefäßes umgibt.
4A stellt einen Querschnitt eines Drahtes dar, der mit einem Polymer oder Gel beschichtet ist, das eine therapeutische Zusammensetzung beinhalten (z. B. damit imprägniert sein) kann.
4B stellt eine perspektivische Ansicht eines intravaskulären Stents dar, der aus dem Draht aus 4A gebildet wurde.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß, wenn ein Gen, das menschlichen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor C (VEGF-C) kodiert, an ein Säugetier verabreicht wird, das an einem Gefäßtrauma wie dem Trauma, das bei einer konventionellen Ballon-Angioplastie-Maßnahme auftreten kann, leidet, eine Restenose des verletzten Gefäßes vermindert oder eliminiert ist. Ein in vivo kontrolliertes Experiment, das die Wirksamkeit eines VEGF-C-Transgens für die Verhinderung von Restenose zeigt, ist ausführlich in Beispiel 1 beschrieben. Beispiel 2 stellt eine "Side-by-side"-Vergleichsstudie bereit, die zeigt, daß die Anti-Restenose-Wirkungen von VEGF-C den Antirestenose-Wirkungen von in vergleichbarer Weise verabreichtem VEGF überlegen sind.
Der als vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor C (VEGF-C) bezeichnete Wachstumsfaktor sowie native menschliche, nicht-menschliche Säugetier- und Affen-Polynukleotidsequenzen, die VEGF-C und VEGF-C-Varianten und -Analoga kodieren, sind ausführlich in der internationalen Patentanmeldung Nummer PCT/US98/01973, eingereicht am 2 Februar 1998 und veröffentlicht als internationale Veröffentlichung Nr. WO 98/33917; und in Joukov et al., EMBO J., 16(13): 3898-3911 (1997), beschrieben worden. Wie dort im Detail erklärt, wird menschlicher VEGF-C in menschlichen Zellen zunächst als Prä-Pro-VEGF-C-Polypeptid aus 419 Aminosäuren hergestellt. Eine cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz für menschlichen Prä-Pro-VEGF-C sind in den SEQ ID NO: 1 bzw. 2 wiedergegeben, und eine menschlichen VEGF-C kodierende cDNA ist bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VR 20110-2209 (USA) gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt worden (Hinterlegungstag vom 24. Juli 1995 und ATCC-Zugriffsnummer 97231). VEGF-C-Sequenzen von anderen Arten sind ebenfalls beschrieben worden. Siehe beispielsweise die Genbank-Zugriffsnummern MMU73620 (Mus musculus) und CCY15837 (Coturnix coturnix).
Das Prä-Pro-VEGF-C-Polypeptid wird in mehreren Stufen prozessiert, um ein reifes und am meisten aktives VEGF-C-Polypeptid von etwa 21-23 kD (wie durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bindungen festgestellt) herzustellen. Dieses Processing beinhaltet die Abspaltung eines Signalpeptids (SEQ ID NO: 2, Reste 1-31); die Abspaltung eines carboxyterminalen Peptids (ungefähr den Aminosäuren 228-419 der SEQ ID NO: 2 entsprechend und ein Muster von beabstandeten Cysteinresten aufweisend, das an eine Balbiani-Ring-3-Protein(BR3P)-Sequenz [Dignam et al., Gene 88: 133-40 (1990); Paulsson et al., J. Mol. Biol., 211: 331-49 (1990)]) erinnert, um eine teilweise prozessierte Form von etwa 29 kD herzustellen; und die Abspaltung (offenbar extrazellulär) eines aminoterminalen Peptids (ungefähr den Aminosäuren 32-103 der SEQ ID NO: 2 entsprechend), um eine vollständig prozessierte reife Form von etwa 21-23 kD herzustellen. Versuchsergebnisse zeigen, daß teilweise prozessierte Formen von VEGF-C (z. B. die 29-kD-Form) in der Lage sind, den Flt4-(VEGFR-3)-Rezeptor zu binden, wohingegen eine hochaffine Bindung an VEGFR-2 nur bei vollständig prozessierten Formen von VEGF-C auftritt. Es scheint, daß VEGF-C-Polypeptide natürlicherweise als nicht-disulfidverknüfte Dimere assoziieren.
Darüber hinaus ist gezeigt worden, daß die Aminosäuren 103-227 der SEQ ID NO: 2 nicht alle kritisch für die Aufrechterhaltung der VEGF-C-Funktionen sind. Ein Polypeptid, das aus den Aminosäuren 113-213 der SEQ ID NO: 2 besteht (und dem die Reste 103-112 und 214-227 fehlen), bewahrt die Fähigkeit, VEGF-C-Rezeptoren zu binden und zu stimulieren, und es wird erwartet, daß ein Polypeptid, das von ungefähr Rest 131 bis ungefähr Rest 211 erreicht, die biologische VEGF-C-Aktivität bewahrt. Der Cystein-Rest an Position 156 hat sich als wichtig für die VEGFR-2-Bindungsfähigkeit erwiesen. VEGF-C-ΔC₁₅₆-Polypeptide (d. h. Analoga, denen dieses Cystein aufgrund von Deletion oder Substitution fehlt) bleiben jedoch potente Aktivatoren von VEGFR-3. Wenn die Anti-Restenose-Wirkungen von VEGF-C durch VEGRF-3 vermittelt werden, ist zu erwarten, daß die Verwendung von VEGF-C-ΔC₁₅₆-Polypeptiden (und diese kodierenden Polynukleotiden) eine Anti-Restenose-Wirksamkeit bereitstellt, während die VEGFR-2-vermittelten Nebenwirkungen minimiert werden. Das Cystein an Position 165 der SEQ ID NO: 2 ist wesentlich für die Bindung von einem der Rezeptoren, wohingegen Analoga, denen die Cysteine an den Positionen 83 oder 137 fehlen, mit nativem VEGF-C um die Bindung mit beiden Rezeptoren konkurrieren und beide Rezeptoren stimulieren.
Ein Alignment von menschlichem VEGF-C mit VEGF-C von anderen Arten (durchgeführt unter Verwendung irgendeines allgemein akzeptierten Alignment-Algorithmus) legt zusätzliche Reste nahe, bei denen Modifikationen eingeführt werden können (z. B. Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen), ohne die biologische Aktivität von VEGF-C zu zerstören. Jede Position, an der ausgerichtete VEGF-C-Polypeptide von zwei oder mehr Arten verschiedene Aminosäuren aufweisen, insbesondere verschiedene Aminosäuren mit Seitenketten unterschiedlicher chemischer Beschaffenheit, ist eine wahrscheinliche Position, die für Modifikationen ohne gleichzeitige Elimination der Funktion empfänglich ist. Ein beispielhaftes Alignment von menschlichem, murinem und Wachtel-VEGF-C ist in 5 der PCT/US98/01973 wiedergegeben.
Abgesehen von den vorstehenden Überlegungen wird es ersichtlich sein, das zahllose konservative Aminosäureaustausche an einer Wildtyp-VEGF-C-Sequenz vorgenommen werden können, die wahrscheinlich zu einem Polypeptid führen, das die biologischen Aktivitäten von VEGF-C bewahrt, insbesondere, wenn die Zahl solcher Austausche klein ist. Mit "konservativen Aminosäureaustauschen" ist die Substitution einer Aminosäure durch eine Aminosäure mit einer Seitenkette von ähnlicher chemischer Beschaffenheit gemeint. Ähnliche Aminosäuren zur Herstellung konservativer Austausche schließen jene ein, die eine saure Seitenkette (Glutaminsäure, Asparaginsäure); eine basische Seitenkette (Arginin, Lysin, Histidin); eine polare Amid-Seitenkette (Glutamin, Asparagin); eine hydrophobe aliphatische Seitenkette (Leucin, Isoleucin, Valin, Alanin, Glycin); eine aromatische Seitenkette (Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin); eine kleine Seitenkette (Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin); oder eine aliphatische Hydroxyl-Seitenkette (Serin, Threonin) aufweisen. Die Addition oder Deletion von einer oder mehr inneren Aminosäuren ohne Zerstörung der biologischen Aktivitäten von VEGF-C ist ebenfalls vorgesehen.
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß der Mechanismus hinter der Wirksamkeit von VEGF-C hinsichtlich der Verhinderung von Restenose mit der Fähigkeit von VEGF-C in Zusammenhang steht, die Endothelialisierung des verletzten Gefäßes (und/oder des intravaskulären Stents) ohne signifikante gleichzeitige Stimulation der Proliferation der glatten Muskulatur bei dem Gefäß zu stimulieren. VEGF-C kann auch die Proliferation glatter Muskelzellen hemmen. Entsprechend können in Frage kommende VEGF-C-analoge Polypeptide rasch zunächst auf ihre Fähigkeit zur Bindung und Stimulation der Autophosphorylierung von bekannten VEGF-C-Rezeptoren (VEGFR-2 und VEGFR-2) untersucht werden. Polypeptide, die einen oder beide bekannte Rezeptoren stimulieren, sind in vitro rasch auf ihre mitogene und/oder chemotaktische Aktivität gegenüber kultivierten kapillaren oder arteriellen Endothelzellen untersucht (wie z. B. in der WO 98/33917 beschrieben). Polypeptide mit mitogener und/oder chemotaktischer Aktivität werden dann in vivo wie hier beschrieben auf die Fähigkeit zur Verhinderung von Restenose untersucht. Auf diese Weise werden Varianten (Analoga) von natürlich vorkommenden VEGF-C-Proteinen rasch gescreent, um festzustellen, ob die Varianten die erforderliche biologische Aktivität aufwei sen, um "VEGF-C-Polypeptide" zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung darzustellen oder nicht.
Der als vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor D (VEGF-D) bezeichnete Wachstumsfaktor sowie menschliche Sequenzen, die VEGF-D und VEGF-D-Varianten und -Analoga kodieren, sind ausführlich in der internationalen Patentanmeldung Nummer PCT/US97/14696, eingereicht am 21. August 1997 und publiziert am 26 Februar 1998 als internationale Veröffentlichung Nummer WO 98/07832; und in Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(2): 548-553 (1998), die beide durch Inbezugnahme hier vollständig aufgenommen werden, beschrieben worden. Wie dort im Detail erklärt, wird menschlicher VEGF-D in menschlichen Zellen zunächst als Prä-Pro-VEGF-D-Polypeptid aus 354 Aminosäuren hergestellt. Eine cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz für menschlichen Prä-Pro-VEGF-D sind in den SEQ ID NO: 3 bzw. 4 wiedergegeben. VEGF-D-Sequenzen von anderen Arten sind ebenfalls beschrieben worden. Siehe beispielsweise die Genbank-Zugriffsnummern D89628 (Mus musculus) und AF014827 (Rattus norvegicus), hier durch Inbezugnahme aufgenommen.
Das Prä-Pro-VEGF-D-Polypeptid besitzt ein mutmaßliches Signalpeptid aus 21 Aminosäuren und wird offenbar proteolytisch in einer Weise prozessiert, die dem Processing des Prä-Pro-VEGF-C analog ist. Ein "rekombinant gereiftes" VEGF-D, dem die Reste 1-92 und 202-354 der SEQ ID NO: 4 fehlen, bewahrt die Fähigkeit, die Rezeptoren VEGFR-2 und VEGFR-3 zu aktivieren und scheint als nicht-kovalent gebundene Dimere zu assoziieren. Bevorzugte VEGF-D-Polynukleotide beinhalten daher die Polynukleotide, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die Aminosäuren 93-201 der SEQ ID NO: 4 kodieren. Die Anlei tung, die oben für die Einführung funktionsbewahrender Modifikationen in VEGF-C-Polynukleotide bereitgestellt wurde, ist ebenfalls geeignet zur Einführung funktionsbewahrender Modifikationen in VEGF-D-Polypeptide.
Eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung von Restenose beinhaltet die Verabreichung einer Zusammensetzung umfassend ein VEGF-C- oder VEGF-D-Polynukleotid oder -Polypeptid oder Kombinationen davon (hier manchmal allgemein als ein "therapeutisches VEGF-C- oder VEGF-D-Mittel" bezeichnet) an einen Säugetierpatienten wie beispielsweise einen Menschen.
Die "Verabreichung" kann durchgeführt führt werden unter Anwendung jedes medizinisch annehmbaren Mittels zur Einführung eines Therapeutikums direkt oder indirekt in das Gefäßsystem eines Säugetierpatienten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Injektionen, orale Aufnahme, intranasale oder topische Verabreichung und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verabreichung der Zusammensetzung, umfassend die VEGF-C- oder VEGF-D-Polynukleotid- oder Polypeptid-Zusammensetzung, intravaskulär, beispielsweise durch intravenöse, intraarterielle oder intrakoronararterielle Injektion durchgeführt.
Besonders bevorzugt kann die Zusammensetzung lokal verabreicht werden, zum Beispiel an den Ort der Angioplastie oder des Bypass. Zum Beispiel umfaßt die Verabreichung einen kathetervermittelten Transfer einer therapeutischen Zusammensetzung in ein Blutgefäß des Säugetierpatienten, insbesondere in eine Koronararterie des Säugetierpatienten. Beispielhafte Materialien und Verfahren zur lokalen Zuführung sind in einer Übersicht in Lincoff et al., Circulation 90: 2070-2084 (1994); und Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med. 3:163-170 (1993) dargestellt. Beispielsweise wird die Zusammensetzung unter Anwendung von Infusions-Perfusions-Ballonkathetern (vorzugsweise mikroporösen Ballonkathetern), wie sie beispielsweise in der Literatur für die intrakoronare Arzneimittelinfusion beschrieben sind, verabreicht. Siehe zum Beispiel das US-Patent Nr. 5,713,860 (intravaskulärer Katheter mit Infusionsanordnung); das US-Patent Nr. 5,087,244; das US-Patent Nr. 5,653,689; und Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475-481 (1990) (Wolinsky-Infusionskatheter); und Lambert et al., Coron. Artery Dis. 4: 469-475 (1993). Die Verwendung solcher Katheter zur ortsgerichteten somatischen Zellgentherapie ist z. B. in Mazur et al., Texas Heart Institute Journal 21: 104-111 (1994) beschrieben.
Zum Beispiel beinhaltet ein beispielhaftes Protokoll bei Patienten mit Angina pectoris aufgrund einer einzelnen oder mehrerer Läsionen in Koronararterien, für die auf Basis erster Befunde anhand eines Koronar-Angiogramms PTCA verschrieben wurde, die Durchführung von PTCA durch einen 7F-Führungskatheter gemäß klinischer Praxisstandards unter Verwendung des femoralen Zugangs. Wenn ein optimales Ergebnis mit PTCA allein nicht erreicht wird, wird ein endovaskulärer Stent ebenfalls implantiert. (Ein nicht optimales Ergebnis ist definiert als verbleibende Stenose von > 30% des luminalen Durchmessers nach optischer Abschätzung, und Dissektion vom B- oder C-Typ). Arterieller Gentransfer am Ort der Ballondilatation wird sofort nach der Angioplastie, jedoch vor der Stent-Implantation unter Verwendung eines Infusions-Perfusions-Ballonkatheters durchgeführt. Die Größe des Katheters wird in Anpassung an den mittels Angiogramm gemessenen Durch messer der Arterie ausgewählt und variiert z.B. von 3,0 bis 3,5F im Durchmesser. Der Ballon wird auf den optimalen Druck aufgeblasen und der Gentransfer wird während einer 10minütigen Infusion bei einer Rate von 0,5 ml/min mit einem Virustiter von 1,15 × 10¹⁰ durchgeführt.
Die intravaskuläre Verabreichung mit einem gelbeschichteten Katheter, wie er in der Literatur zur Einführung anderer Gene beschrieben worden ist, ist ebenfalls vorgesehen. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,674,192 (Katheter, beschichtet mit hartnäckig anhaftendem schwellbaren Hydrogelpolymer); Riessen et al., Human Gene Therapy 4: 749-758 (1993); und Steg et al., Circulation 96: 408-411 (1997) und 90: 1648-1656 (1994), die alle durch Inbezugnahme hier aufgenommen sind. Wie in 1 dargestellt, wird ein Katheter 10 bereitgestellt, an dem an einem distalen Ende ein aufblasbarer Ballon 12 angebracht ist. Der Ballon beinhaltet eine schwellbare Hydrogelpolymer-Beschichtung 14, die in der Lage ist, eine Lösung, umfassend ein therapeutisches VEGF-C- oder VEGF-D-Mittel, zu absorbieren. Kurz gesagt, wird DNA in Lösung (z. B. das VEGF-C- oder VEGF-D-Polynukleotid) ein oder mehrere Male ex vivo auf die Oberfläche eines aufgeblasen Angioplastiekatheter-Ballons, der mit einem Hydrogelpolymer (z. B. Schieber mit Hydroplus, Mansfield Boston Scientific Corp., Watertown, MA) beschichtet ist, aufgebracht. Die Hydroplus-Beschichtung ist ein hydrophiles Polyacrylsäure-Polymer, das mit dem Ballon quervernetzt ist, um ein Hydrogel mit hohem Molekulargewicht zu bilden, das fest an den Ballon angeheftet ist. Das DNA-beschichtete Hydrogel wird vor der Deflation des Ballons trocknen gelassen. Die erneute intravaskuläre Inflation des Ballons während einer Angioplastie-Maßnahme verursacht den Transfer der DNA auf die Gefäßwand. Somit wird, unter erneutem Hinweis auf 1, der Katheter mit angeheftetem, beschichteten Ballon in das Lumen 16 des Blutgefäßes 18 eingeführt, während er durch eine schützende Hülle 20 abgedeckt ist, um die Exposition des beschichteten Ballons gegenüber dem Blut vor der Planierung am Ort einer Okklusion 22 zu minimieren. Wenn das Instrument an der Behandlungsregion planiert worden ist, wird die schützende Hülle zurückgezogen oder der Katheter wird nach vorne bewegt, um den Ballon zu exponieren, der aufgeblasen wird, um den Ballon (und somit die Beschichtung) in die Gefäßwand zu pressen, wodurch der Transfer des therapeutischen VEGF-C- oder VEGF-D-Mittels in das Gewebe hervorgerufen wird, in einer Weise, die analog ist dem Auspressen von Flüssigkeit aus einem zusammengepreßten Schwamm oder der Übertragung feuchter Farbe auf eine Oberfläche durch Kontakt.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist eine dehnbare elastische Membran, ein Film oder eine ähnliche Struktur, montiert an oder integriert in einen Ballon-Angioplastiekatheter oder Stent zur Zuführung des therapeutischen VEGF-C- oder VEGF-D-Mittels einzusetzen. Siehe z. B. die US-Patente Nr. 5,707,385, 5,697,967, 5,700,286, 5,800,507 und 5,776,184. Wie in den 2A-2B dargestellt, wird ein einschichtiges 30 oder mehrschichtiges 30, 32 Blatt oder elastisches Membranmaterial (2A) zu einer röhrenförmigen Struktur 34 (2B) geformt, z.B. durch Zusammenbringen und Aneinanderheften gegenüberliegender Ränder des/der Blattes/Blätter, z. B. in einer überlappenden oder einer angrenzenden Beziehung. Auf diese Weise kann das elastomere Material um einen Katheterballon oder Stent herumgewickelt werden. Eine therapeutische VEGF-C- oder VEGF-D-Zusammensetzung wird mit der Membran unter Verwendung jedes geeigneten Mittels, einschließlich Spritzguß-, Beschichtungs-, Diffusions- und Absorptionstech niken kombiniert. In der in der Figur dargestellten mehrschichtigen Ausführungsform können die Ränder der zwei Schichten aneinandergefügt werden, um eine flüssigkeitsdichte Dichtung zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Schicht des Materials zunächst durch Strecken des Materials und Einführen mehrerer mikroskopischer Löcher oder Schlitze 36 verarbeitet. Nachdem die Schichten aneinandergefügt wurden, kann das Blatt gestreckt und die therapeutische VEGF-C/D-Zusammensetzung durch eines der Löcher injiziert werden, um den Hohlraum, der zwischen den Schichten besteht, zu füllen. Das Blatt wird dann entspannt, was dazu führt, daß die Löcher sich schließen und die therapeutische Zusammensetzung zwischen den Schichten eingeschlossen ist, bis das Blatt erneut gedehnt wird. Dies tritt zum Beispiel dann auf, wenn ein endovaskulärer Stent oder Ballon, der von dem Blatt bedeckt ist, innerhalb des Lumens eines stenosierten Blutgefäßes expandiert wird. Der expandierte Stent oder Ballon preßt radial nach außen gegen die innere Oberfläche 38 der röhrenförmigen Blattabdeckung, wodurch sich das Blatt dehnt, sich die Löcher öffnen und das therapeutische Mittel den Wänden des Gefäßes zugeführt wird.
In einer anderen Variante ist die Zusammensetzung, enthaltend das VEGF-C- oder VEGF-D-Therapeutikum extravaskulär zu verabreichen, z. B. unter Verwendung einer Vorrichtung, um einen Bereich des Blutgefäßes zu umgeben oder einzukapseln. Siehe z. B. die Veröffentlichung der internationalen Patentanmeldung WO 98/20027, hier durch Inbezugnahme aufgenommen, die eine Manschette beschreibt, die (z. B. bei einer Bypass-Maßnahme) um die Außenseite einer Arterie angeordnet ist, um mittels eines Plasmids oder eines Liposomen-Vektors ein Transgen an die Arterienwand zuzuführen. Wie in den 3A und Ziffer 3B dargestellt, eine extravaskuläre Manschette 40, beinhaltend eine durch eine z. B. aus einem biologisch abbaubaren oder biokompatiblen Material gebildete Wand 44 definierten ausgesparten Raum 42. Die Manschette berührt die äußere Wand 46 eines Blutgefäßes 48 an den äußeren Fortsetzen 50 der Manschette. Blut 52 fließt durch das Lumen des Blutgefäßes. Eine längslaufender Schlitz 54 in der flexiblen Manschette erlaubt es, die Manschette zu deformieren und um das Gefäß herum anzuordnen und anschließend unter Verwendung eines üblichen Gewebeklebers, wie z. B. Thrombin-Kleber, abzudichten.
In einer weiteren Variante können Endothelzellen oder Endothel-Vorläuferzellen ex vivo mit dem VEGF-C- u VEFG-D-Transgen transfiziert werden, und die transfizierten Zellen wie an den Säugetierpatienten verabreicht. Beispielhafte Verfahren zur Beimpfung eines Gewebetransplantats mit genetisch modifizierten Endothelzellen ist im US-Patent Nr. 5,785,965 beschrieben.
Wenn der Säugetierpatient ein Gewebetransplantat erhält, kann die therapeutische VEGF-C- oder VEGF-D-Zusammensetzung direkt an dem isolierten Gewebesegment angewendet werden, bevor es in vivo verpflanzt wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist ein intravaskulärer Stent in dem Säugetierpatienten zu implantieren, wobei der Stent mit der therapeutischen VEGF-C/D-Gen/Protein-Zusammensetzung beschichtet oder imprägniert ist. Beispielhafte Materialien zur Konstruktion eines arzneimittelbeschichteten oder arzneimittelimprägnierten Stents sind in der oben zitierten Literatur beschrieben und in Lincoff et al., Circulation 90: 2070-2084 (1994) in einer Übersicht dargestellt worden. Wie in den 4A und 4B dargestellt, wird ein metallener oder polymerer Draht 70 zur Bildung eines Stents mit einer Zusammensetzung 72 wie beispielsweise einem porösen biokompatiblen Polymer oder Gel beschichtet, das mit einer therapeutischen VEGF-C- oder VEGF-D-Zusammensetzung imprägniert ist (oder in diese hineingetaucht werden kann oder auf andere Weise unmittelbar vor der Verwendung leicht damit beschichtet werden kann). Das Kabel ist gewendelt, gewebt oder auf andere Weise zu einem Stent 74 geformt, der zur Implantation in das Lumen eines Gefäßes unter Verwendung konventioneller Materialien und Techniken, wie beispielsweise der intravaskulären Angioplastie-Katheterisierung, geeignet ist. Beispielhafte Stents, die auf diese Weise verbessert werden können, sind beschrieben und dargestellt in den US-Patenten Nr. 5,800,507 und 5,697,967 ((Medtronic, Inc., einen intraluminalen Stent beschreibend, der Fibrin und ein eluierbares Arzneimittel umfaßt, das eine Behandlung von Restenose bereitstellen kann); dem US-Patent Nr. 5,776,184 (Medtronic, Inc., einen Stent mit einer porösen Beschichtung beschreibend, die ein Polymer und eine therapeutische Substanz in einem Feststoff oder in Feststoff/Lösung mit dem Polymer umfaßt); dem US-Patent Nr. 5,799,384 (Medtronic Inc., einen flexiblen zylindrischen Metall-Stent beschreibend, der eine biokompatible polymere Oberfläche zur Kontaktierung eines Körperlumens aufweist); den US-Patenten Nr. 5,824,048 und 5,679,400; und dem US Patent Nr. 5,779,729. Die Implantation solcher Stents bei konventionellen Angioplastie-Techniken führt zu weniger Restenose als die Implantation von konventionellen Stents. In diesem Sinne ist die Biokompatibilität des Stents verbessert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung Mikropartikel, die aus biologisch abbaubaren Polymeren wie PGLA, nicht-abbaubaren Polymeren oder biologischen Polymeren (z. B. Stärke) zusammengesetzt sind, wobei die Partikel das VEGF-C- oder VEGF-D-Polypeptid/Polynukleotid einschließen oder damit imprägniert sind. Solche Partikel werden der intravaskulären Wand unter Verwendung z.B. eines Infusions-Angioplastie-Katheters zugeführt. Andere Techniken zur Erreichung einer lokal anhaltenden Arzneimittelzufuhr sind in Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med. 3: 163-170 (1993) in einer Übersicht dargestellt.
Die Verabreichung über eine oder mehr intravenöse Injektionen im Anschluß an die Angioplastie- oder Bypass-Maßnahme ist ebenfalls vorgesehen. Die Lokalisierung des VEGF-C- oder VEGF-D-Polypeptids an den Ort der Maßnahme erfolgt durch Expression von VEGF-C/D-Rezeptoren auf proliferierenden Endothelzellen. Die Lokalisierung wird weiter erleichtert durch rekombinante Expression des VEGF-C oder VEGF-D als Fusions-Polypeptid (z. B. fusioniert an ein Apolipoprotein B-100-Oligopeptid, wie in Shih et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1436-1440 (1990) beschrieben.
Die pharmazeutische Wirksamkeit von VEGF-C-Polynukleotiden, VEGF-C-Polypeptiden, VEGF-D-Polynukleotiden und VEGF-D-Polypeptiden zur Verhinderung von Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes wird in vivo z. B. unter Verwendung von Verfahren gezeigt, wie sie in den folgenden Beispielen beschrieben sind, von denen einige prophetisch sind. Die Beispiele tragen dazu bei, die Erfindung weiter zu beschreiben, sind aber in keiner Weise dazu vorgesehen, den Schutzbereich der Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1
Verwendung von adenovirusvermitteltem VEGF-C-Gentransfer zur Verhinderung von Restenose
Die folgenden Experimente, durchgeführt in vivo in einem Kaninchen-Restenose-Modell, zeigen die Wirksamkeit von adenovirusvermitteltem intravaskulären VEGF-C-Gentransfer zur Verhinderung von Post-Angioplastie-Restenose.
A. Material und Methoden
1. Adenovirale Konstrukte
Ein Adenovirus-Plasmid, enthaltend eine den vollständigen offenen Leserrahmen menschlicher Prä-Pro-VEGF-C kodierende cDNA, funktionell verknüpft mit einem Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor und einer menschlichen Wachstumshormon-Poly-A-Signalsequenz, wurde wie folgt konstruiert. Ein DNA-Fragment, umfassend eine CMV-Promotorsequenz, wurde durch Verdauung des pcDNA3.1+-Vektors (Invitrogen) mit SalI und Auffüllen der 5'-Überhänge mit dem Klenow-Enzym hergestellt. Der CMV-Promotor (die Nukleotide 5431-911) wurde mit Hind III aus dem Vektor ausgeschnitten und isoliert. Eine menschliche Vollängen-VEGF-C-cDNA, enthaltend die in SEQ ID NC): 1 spezifizierte 1997-bp-Sequenz (sowie weniger als 50 Basen zusätzlicher nicht kodierender und Polylinkersequenzen) wurde mit Hind III und Xho I aus einem VEGF-C-pREP7-Expressionsvektor [beschrieben in WO 98/33917] ausgeschnitten und isoliert. Ein menschliches Wachstumshormon-Poly-A-Signal (860 Basenpaare) wurde mit SalI und BamHI aus einem αMHC-Vektor ausgeschnitten. Der CMV-Promotor, die VEGF-C-cDNA und die hGH-Poly-A-Signalfragmente wurden gleichzeitig in einen mit BamHI und EcoRV verdauten pCRII-Vektor ligiert. Der ligierte CMV-Promotor und die VEGF-C-cDNA sind in SEQ ID NO: 17 wiedergegeben. Das erhaltene Konstrukt wurde mit BglII geöffnet und teilweise mit BamHI verdaut. Die vollständige Transkriptionseinheit wurde in den mit BglII geöffneten pAdBglII-Vektor ligiert. Dieses Konstrukt [bezeichnet als pAdBglII-VEGF-C] wurde dann verwendet, um unter Verwendung von homologen Standard-Rekombinationstechniken rekombinante Adenoviren herzustellen, die die CMV-VEGF-C-hGH-Transkriptions Einheit enthielten. [Barr et al., Gene Ther. 1: 51-58 (1994)]. Replikationsdefiziente E1-E3-deletierte Adenoviren wurden in 293 Zellen hergestellt und durch Ultrazentrifugation unter Verwendung von aus der Literatur bekannten Techniken konzentriert. [Siehe z. B. Barr et al. (1994)]. Ein Kontroll-Plasmid, umfassend das funktionell mit demselben Promotor verknüpfte lacZ-Gen, wurde ebenfalls verwendet. [Laitinen M. et al., Hum. Gene Ther. 9: 1481-1486 (1998)]. Der lacZ-Adenovirus besaß ein Kernansteuerungssignal, um die β-Galaktosidase-Expression auf den Kern zu richten. Replikationsdefiziente E1-E3-deletierte Adenoviren wurden in 293 Zellen hergestellt und durch Ultrazentrifugation konzentriert (Barr et al., 1994). Die Adenoviren-Zubereitungen wurden auf Abwesenheit von Helferviren und bakterielle Kontaminanten analysiert.
2. Tiermodell
Weiße Neuseeland-Kaninchen wurden für die Gentransferstudien eingesetzt. Eine erste Gruppe von Kaninchen wurde über zwei Wochen mit einer 0,25%-Cholesterin-Diät gefüttert, dann einer Ballon-Denudation der Aorta ausgesetzt, dann drei Tage später dem adenovirusvermittelten Gentransfer unterzogen. Eine zweite Gruppe von Kaninchen wurde lediglich dem Gentransfer unterzogen. Die Tiere wurden 2 oder 4 Wochen nach dem Gentransfer getötet. Die Zahl von Experiment-(VEGF-C-) und Kontroll(lacZ-)Tieren in beiden Studiengruppen betrug 6.
In der ersten Gruppe von Kaninchen wurde die gesamte Aorta, ausgehend von der Spitze des Bogens, unter Verwendung eines 4,0-F-Arterien-Embolektomiekatheters (Sorin Biomedical, Irvine, CA) denudiert. Der Katheter wurde über die rechte Beckenarterie bis zum Aortenbogen eingeführt und aufgeblasen, und die Aorta wurde zweimal denudiert.
3. Gentransfer
Der Gentransfer wurde durchgeführt unter Verwendung eines 3.9-F-Kanal-Ballonkatheters zur lokalen Arzneimittelzufuhr (Boston Scientific Corp., Maple Grove, MA). Unter Verwendung einer fluoroskopischen Kontrolle wurde der Ballonkatheter kaudal zur linken Nierenarterie in einem von Nebenästen freien Abschnitt über eine perkutane 5-F-Einführhülle (Arrow International, Reading, PA) in der rechten Carotiden-Arterie positioniert und mit einer Mischung aus Kontrastmittel und Salzlösung auf 6 ATM inflatiert. Der anatomische Ort des Ballonkatheters wurde durch Messung seines Abstandes von der Aortenöffnung der linken Nierenarterie festgestellt. Virentiter von 1,15 × 10¹⁰ plaquebildenden Einheiten (FU) wurden jedem Tier in einem Endvolumen von 2 ml (0,9% NaCl) verabreicht, und der Gentransfer wurde für 10 Minuten (0,2 ml/min) bei 6 ATM Druck durchgeführt. In einer zweiten Studiengruppe hatten die Tiere lediglich einen Gentransfer und sie wurden 2 Wochen nach dem Gentransfer getötet. Die Zahl von Tieren in jeder Studiengruppe (nur 0,9% NaCl; lacZ-Gentransfer; und VEGF-C-Gentransfer) betrug 3. Alle Studien wurden vom Ausschuß für Tierversuche der Universität Kuopio in Finnland genehmigt.
4. Histologie
Drei Stunden vor der Tötung wurde den Tieren 50 mg BrdU, gelöst in 40% Ethanol, intravenös injiziert. Nach der Tötung wurde der Aortenabschnitt, in dem Gentransfer durchgeführt worden war, entfernt, behutsam mit Salzlösung gespült und in fünf gleiche Abschnitte aufgeteilt. Das proximale Segment wurde in Flüssigstickstoff schockgefroren und bei –70°C aufbewahrt. Der nächste Abschnitt wurde in 4% Paraformaldehyd/15% Saccharose (pH 7,4) für 4 Stunden immersionsfixiert, in 15% Saccharose (pH 7,4) über Nacht gespült und in Paraffin eingebettet. Das mediale Segment wurde in 4% Paraformaldehyd/phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,4) für 10 Minuten immersionsfixiert, 2 Stunden in PBS gespült, in OCT-Verbindung (Miles) eingebettet und bei –70°C aufbewahrt. Das vierte Segment wurde in 70% Ethanol über Nacht immersionsfixiert und in Paraffin eingebettet. Das distale Segment wurde direkt auf β-Galaktosidase-Aktivität in X-GAL-Färbungslösung bei +37 °C für 16 Stunden gefärbt, in 4% Paraformaldehyd/15% Saccharose (pH 7,4) für 4 Stunden immersionsfixiert, in 15% Saccharose über Nacht gespült und in Paraffin eingebettet. Paraffinschnitte wurden für den immunzytochemischen Nachweis von glatten Muskelzellen (SMC), Makrophagen und Endothel verwendet. Die Gentransfer-Effizienz wurde ermittelt unter Verwendung der X-GAL-Färbung von OCT-eingebetteten Geweben. BrdU-positive Zellen wurden nach Herstelleranweisungen detektiert. Morphometrie wurde unter Verwendung von Hämatoxylin- Eosin-gefärbten Paraffinschnitte unter Verwendung einer Bildanalysesoftware durchgeführt. Die Messung wurde unabhängig voneinander von zwei Beobachtern von mehreren Abschnitten gemacht, ohne Kenntnis des Ursprungs der Abschnitte. Intima/Media(I/M)-Verhältnisse wurden als Parameter für die intimale Verdickung gewählt.
B. Ergebnisse
Die histologische Analyse der Ballon-denudierten Mäuse ergab, daß die lacZ-transfizierte Kontrollgruppe zwei Wochen nach dem Gentransfer ein I/M-Verhältnis von 0,61 aufwies, was eine statistisch signifikante Differenz (p<0,05) gegenüber den VEGF-C-transfizierten Gruppen (I/M-Verhältnis von 0,40) darstellt. Die Tendenz, daß die VEGF-C-Gruppe kleinere I/M-Verhältnisse aufwies, hielt zu einem Zeitpunkt 4 Wochen nach dem Gentransfer an.
In der zweiten Gruppe von Kaninchen, die lediglich dem Gentransfer zur Gefäßwand (ohne endotheliale Denudation) ausgesetzt worden waren, betrug das I/M-Verhältnis in der lacZ-Gruppe nur 0,3, im Vergleich zu 0,15 für die VEGF-C-Gruppe. Diese Differenz stellt ebenfalls eine statistisch signifikante (p<0,05) Hemmung der Neointima-Bildung bei der VEGF-C-Gruppe dar.
Die BrdU-Markierung erlaubt die Analyse der Proliferation von glatten Muskelzellen bei VEGF-C-transfizierten gegenüber Kontroll(lacZ)-Tieren. Es wird erwartet, daß die SMC-Proliferation in der VEGF-transfizierten Population vermindert ist.
Die vorangegangenen Daten zeigen, daß der VEGF-C-Gentransfer die intimale Verdickung zu einem Zeitpunkt zwei Wochen nach einer Aorta-Denudation und nach Gefäßwandschädigung, die durch den Gentransferkatheter ohne Ballondenudation verursacht wurde, signifikant verminderte. Diese Daten zeigen eine therapeutische Eignung des VEGF-C-Gentransfers zur Verhinderung von Post-Angioplastie-Restenose.
Beispiel 2
Vergleichsbeispiel, das zeigt, daß die Anti-Restenose-Wirkungen von VEGF-C denen von VEGF überlegen scheinen
Die folgenden Experimente zeigen die Wirksamkeit von adenovirusvermitteltem intravaskulären VEGF- und VEGF-C-Gentransfer zur Verhinderung von Post-Angioplastie-Restenose, und zeigen, daß VEGF-C eine im Vergleich zu VEGF überlegene therapeutische Wirksamkeit zu bieten schien.
A. Material und Methoden
1. Adenovirale Konstrukte
VEGF-Adenovirus (muriner VEGF-A₁₆₄; SEQ ID NO: 18) wurde konstruiert unter Verwendung desselben Promotors wie bei dem VEGF-C-Konstrukt und unter Anwendung ähnlicher Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben. Das adenovirale VEGF-A₁₆₉-Konstrukt wurde in 293T Zellen hergestellt und im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben konzentriert, und auf Freiheit von Helferviren, Lipopolysacchariden und bakteriellen Kontaminanten analysiert.
2. Tiermodell
Dreiundsechzig weiße Neuseeland-Kaninchen wurden in zwei Hauptgruppen aufgeteilt, wobei die erste über zwei Wochen eine 0,25-Cholesterin-Diät und vor dem Gentransfer eine Ballon-Denudation der Aorta erhielt, und die zweite Gruppe lediglich den Gentransfer erhielt. Der Gentransfer wurde bei der ersten Gruppe von Kaninchen drei Tage nach der Denudation durchgeführt, und die Tiere wurden 2 oder 4 Wochen nach dem Gentransfer getötet. Die Zahl der Kaninchen in jeder Studiengruppe (lacZ, VEGF und VEGF-C) betrug zu beiden Zeitpunkten 6. In der zweiten Studiengruppe erhielten die Kaninchen lediglich den Gentransfer, ohne Cholesterin-Diät oder Ballon-Denudation und wurden 2 oder 4 Wochen nach dem Gentransfer getötet. Die Zahl von Kaninchen in jeder Studiengruppe (0,9% Salzlösung, lacZ, VEGF und VEGF-C) betrug 3.
3. Gentransfer
Der Gentransfer wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
4. Histologie
Die Histologie wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschreiben durchgeführt, mit folgenden Modifikationen: SMC wurde unter Verwendung von HHF35 (DAKO, 1:50-Verdünnung) detektiert, Makrophagen wurden unter Verwendung von RAM-11 (DAKO, 1:50-Verdünnung) detektiert, Endothel wurde unter Verwendung von CD31 (DAKO, 1:50-Verdünnung) detektiert und T-Zellen wurden unter Verwendung von MCA 805 (DAKO, 1:100-Verdünnung) detektiert. Kontrollen für die Immunfärbung bein halteten Inkubationen mit klassen- und speziesangepaßten Immunglobulinen, und Inkubationen, bei denen primäre Antikörper, wurden weggelassen. Morphometrie und Bildanalyse wurden durchgeführt unter Verwendung der Software Image-Pro Plus^TM und einem Olympus-AX70-Mikroskop (Olympus Optical, Japan). Statistische Analysen wurden unter Verwendung des ANOVA- und modifizierten t-Tests durchgeführt. P <0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
B. Ergebnisse
Die histologische Analyse der Ballon-denudierten Kaninchenaorta zeigt eine intimale Verdickung und SMC-Proliferation. Zwei Wochen nach dem Gentransfer wies die lacZ-Kontrollgruppe das höchste I/M-Verhältnis (0,57 ± 0,04) auf, wogegen die VEGF-C- (0,38 ± 0,02) und VEGF-Gruppen (0,49 ± 0,17) eine Abnahme der intimalen Verdickung zeigten. Die Differenz in den I/M-Verhältnissen zwischen den lacZ und den VEGV-C-Gruppen war an dem Zwei-Wochen-Zeitpunkt signifikant (P <0,05), wogegen jene zwischen lacZ- und VEGF-Gruppen nicht statistisch signifikant waren. Die Tendenz, daß sowohl die VEGF- als auch die VEGF-C-Gruppen kleinere I/M-Verhältnisse aufwiesen, hielt über den Vier-Wochen-Zeitpunkt an, als das I/M-Verhältnis 0,73 ± 0,16, 0,44 ± 0,14 bzw. 0,63 ± 0,21 für die lacZ-, VEGF-C- und VEGF-Gruppen betrug. Hämatoxylin-Eosin- und Immunfärbung der transfizierten Arterien zeigen, daß die intimale Verdickung in allen Arterien vornehmlich aus SMC zusammengesetzt war.
Die Verwendung von adenoviralen Vektoren kann zu immunologischen und entzündlichen Reaktionen führen, teilweise, weil Adenoviren in hohen Titern die Expression von NFκB induziert und eine CTL-Antwort aktiviert. Es wurden weder Anzeichen von Entzündung noch von Schaumzellenakkumulation festgestellt, zurückhalten anhand von Makrophagen- und T-Zell-Immunfärbung. Darüber hinaus wurden Viren in der Qualität für die klinische Gentherapie am Menschen zusammen mit kurzen Expositionszeiten bei den transfizierten Arterien verwendet, was ebenfalls die Abwesenheit von schweren Entzündungsreaktionen in dieser Studie erklären kann.
Der Prozentanteil proliferierender Zellen wurde unter Verwendung von BrdU-Markierung analysiert. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, obwohl die VEGF-C-Gruppe dazu neigte, niedrigere Proliferationsraten aufzuweisen, was mit der Beobachtung übereinstimmt, daß VEGF-C-transduzierte Arterien an beiden Zeitpunkten kleinere I/M-Verhältnisse aufwiesen. Zwei Wochen nach der Ballondenudation betrug der Prozentanteil proliferierender Zellen 1,8 ± 0,4, 2,2 ± 0,7 und 1,2 ± 0,0 für die lacZ-, VEGF-C- bzw. VEGF-Gruppen, und nach vier Wochen betrug der Prozentanteil proliferierender Zellen 0,3 ± 0,1, 1,2 ± 0,5 bzw. 0,3 ± 0,1 für die lacZ-, VEGF-C- bzw. VEGF-Gruppen. Erneutes endotheliales Wachstum wurde analysiert durch Messung der Länge von intaktem Endothel in histologischen Schnitten. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Studiengruppen gefunden.
Das Potential von Adenoviren, eine Schädigung an der Gefäßwand und eine Neointima-Bildung hervorzurufen, wurde getestet mittels Durchführung eines Hoch-Titer-Adenovirus-Gentransfers zur intakten abdominalen Aorta von Kaninchen ohne Ballondenudation. Kontroll-Kaninchen wurden in derselben Weise mit 0,9% Salzlösung behandelt. Die Positionierung des Gentransferkatheters verursachte eine Schädigung der inneren elastischen Lamina und eine moderate Induktion von Neointima-Bildung nach der Maßnahme. An dem Zwei-Wochen-Zeitpunkt betrug das I/M-Verhältnis in der lacZ-Gruppe 0,24 ± 0,06, in der Kontrollgruppe 0,28 ± 0,05, in der VEGF-C-Gruppe 0,18 ± 0,07 und in der VEGF-Gruppe 0,15 ± 0,03. An dem Vier-Wochen-Zeitpunkt wies die lacZ-Gruppe ein I/M-Verhältnis von 0,22 ± 0,13, die VEGF-C-Gruppe von 0,13 ± 0,03 und die VEGF-Gruppe von 0,23 ± 0,11 auf.
Diese Studie zeigt eine vorteilhafte therapeutische Wirkung von intravaskulärem adenovirusvermittelten VEGF-C-Gentransfer auf die Gefäßwand nach einer Ballon-Verletzung, und vergleicht auch den adenovirusvermittelten VEGF-C- und VEGF-Gentransfer zur Verhinderung von Neointima-Bildung. Obwohl verschiedene Rezeptorbindungsprofile von VEGF-C und VEGF zu verschiedenen biologischen Wirkungen in der Gefäßwand geführt haben mögen, verminderten beide VEGFs die intimate Verdickung zwei Wochen nach dem Gentransfer. Beide VEGFs sind daher potentielle Kandidaten für die vaskuläre Gentherapie von Ischemischen atherosklerotischen Krankheiten. Nach diesem Versuch scheint VEGF-C Restenose in diesem Modellsystem jedoch effizienter zu verhindern als VEGF. Die im Vergleich zu VEGF überlegene Fähigkeit von VEGF-C, Restenose zu verhindern, könnte auf die Expression oder Aktivität von VEGFR-3 zurückzuführen sein, der ein Rezeptor für VEGF-C und VEGF-D, nicht jedoch für VEGF ist. Alternativ könnte die offensichtliche Überlegenheit einer durch VEGFR-1 vermittelten restenosefördernden Wirkung von VEGF zuzurechnen sein oder auf differentielle Ligandeneffekte, vermittelt durch den gemeinsamen Rezeptor VEGFR-2 (VEGF-C gegen VEGF) zurückzuführen sein, von dem berichtet wird, daß er in glatten Muskelzellen von Gefä ßen exprimiert wird. [Siehe Grosskreutz et al., Microvasc. Res. 58(2): 128-136 (September 1990).
Beispiel 3
Expression von transfizierten VEGFs in der Aortawand
Unter Verwendung der Aorta-Abschnitte von denselben Versuchstieren, die in Beispiel 2 beschrieben wurden, wurde die mRNA-Expression von lacZ, VEGF-C und VEGF (murines VEGF-A₁₆₄) in Aortagewebe nach Gentransfer analysiert. Gesamt-RNA wurde aus transfizierten Aorta-Abschnitten unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Gibco-BRL) extrahiert, und 2 μg RNA wurden zur cDNA-Synthese verwendet. Es wurden Primer für lacZ, VEGF-C und VEGF hergestellt, um zwischen endogenen und transduzierten Genen zu unterscheiden, indem die 5'-Primer von dem CMV-Promotor und die 3'-Primer aus den kodierenden Regionen ausgewählt wurden.
Für die lacZ-Amplifikation waren die Primer: 5'-Primer 5'-TTGGAGGCCTAGGCTTTTGC-3' (SEQ ID NO: 5) und 3'-Primer 5'-ATRCTGTCGTCGTCCCCTCA-3' (SEQ ID NO: 6). Der erste PCR-Zyklus war eine anfängliche Inkubation bei 96 °C für 4 Minuten, gefolgt von 80 °C für 3 Minuten, währenddessen die DNA-Polymerase zugegeben wurde. Dem folgten 30 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 45 Sekunden, 58 °C für 45 Sekunden und 72 °C für 50 Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension von 72 °C für 5 Minuten. 5 μl des ersten PCR-Produkts wurden verwendet für die zweite PCR mit dem 5'-Primer 5'-GGTAGAAGACCCCAAGGACTTT-3' (SEQ ID NO: 7) und dem 3'-Primer 5'-CGCCATTCGCCATTCAG-3' (SEQ ID NO: 8). Der erste PCR-Zyklus war eine anfängliche Inkubation bei 96 °C für 3 Minuten, gefolgt von 80 °C für 3 Minuten, gefolgt von 32 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 60 Sekunden, 58 °C für 15 Sekunden und 72 °C für 90 Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72 °C für 5 Minuten.
Für die VEGF-C-Amplifikation waren die Primer: 5'-Primer 5'-CTGCTTACTGGCTTATCG-3' (SEQ ID NO: 9) und 3'-Primer 5'-CCTGTTCTCTGTTATGTTGC-3' (SEQ ID NO: 10). Der erste PCR-Zyklus war eine anfängliche Inkubation bei 96 °C für 4 Minuten, gefolgt von 80 °C für 3 Minuten, währenddessen die DNA-Polymerase zugegeben wurde. Dem folgten 39 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 30 Sekunden, 56 °C für 40 Sekunden und 72 °C für 90 Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension von 72 °C für 5 Minuten. 5 μl des ersten PCR-Produkts wurden verwendet für die zweite PCR mit dem 5'-Primer 5'-TCTCCAAAAAGCTACACCG-3' (SEQ ID NO: 11) und dem 3'-Primer 5'-CAAGTGCATGGTGGAAGG-3' (SEQ ID NO: 12). Der erste PCR-Zyklus war eine anfängliche Inkubation bei 96 °C für 3 Minuten, gefolgt von 80 °C für 3 Minuten, gefolgt von 39 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 60 Sekunden, 57 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 90 Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72 °C für 5 Minuten.
Für die VEGF-Amplifikation waren die Primer: 5'-Primer 5'-TCGATCCATGAACTTTCTGC-3' (SEQ ID NO: 13) und 3'-Primer 5'-TTCGTTTAACTCARGCTGCC-3' (SEQ ID NO: 14). Der erste PCR-Zyklus war eine anfängliche Inkubation bei 96 °C für 4 Minuten, gefolgt von 80 °C für 3 Minuten, gefolgt von 39 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 30 Sekunden, 53 °C für 40 Sekunden und 72 °C für 90 Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension von 72 °C für 5 Minuten. 5 μl des ersten PCR-Produkts wurden verwendet für die zweite PCR mit dem 5'- Primer 5'-GACCCTGGCTTTACTGCTG-3' (SEQ ID NO: 15) und dem 3'-Primer 5'-GGAACATTTACACGTCTGCG-3' (SEQ ID NO: 16). Der erste PCR-Zyklus war eine anfängliche Inkubation bei 96 °C für 3 Minuten, gefolgt von 80 °C für 3 Minuten, gefolgt von 39 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 60 Sekunden, 54 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 90 Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72 °C für 5 Minuten.
Die mRNA von lacZ, VEGF-C und VEGF wurde bis zu vier Wochen nach dem Gentransfer in Aortawandgewebe nachgewiesen.
Die Gentransfereffizienz wurde durch Feststellung der lacZ-Expression, analysiert mittels X-Gal-Färbung auf β-Galaktosidase Aktivität, in OCT-eingebetteten Gewebeschnitten ermittelt. Die Transfektionseffizienz betrug 1,1 %± 0,5 und 0,3% ± 0,1, zwei bzw. vier Wochen nach dem intravaskulären kathetervermittelten Gentransfer.
Beispiel 4
Expression von VEGF-Rezeptoren in der Aortawand
Unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Versuchstieren wurde die VEGFR-1-, VEGFR-2- und VEGFR-3-Expression in Aortagewebe durch Immunfärbung und In-situ-Hybridisierung analysiert. Eine Immunhistochemie wurde durchgeführt unter Verwendung des Klons sc-316 (Santa Cruz Biotechnology, 1:50-Verdünnung), um VEGFR-1 zu detektieren, des Klons sc-6251 (Santa Cruz Biotechnology, 1:500-Verdünnung), um VEGFR-2 zu detektieren und des Klons sc-637 Santa Cruz Biotechnology, 1:300-Verdünnung), um VEGFR-3 zu detektieren. Kontrollen für Immunfärbungen beinhalteten Inkubationen mit klassen- und speziesangepaßten Immunglobulinen und Inkubationen, bei denen primäre Antikörper weggelassen wurden. Die In-situ-Hybridisierung von VEGF-Rezeptor-mRNAs wurde ausgeführt unter Verwendung von ³³P-UTP-markierten Ribosonden. Die Expression aller Rezeptoren wurde in Endothel lokalisiert. VEGFR-2 wurde auch in neointimalen SMCs exprimiert.
Beispiel 5
Verwendung nackter VEGF-C-Transgen-Therapie zur Verhinderung von Restenose
Die in Beispiel 1 oder 2 beschriebenen Verfahren werden wiederholt, mit den folgenden Modifikationen. Anstatt der Verwendung eines Adenovirus-Vektors für die Zufuhr des VEGF-C-Transgens wird ein Säugetier-Expressionsvektor für den direkten Gentransfer (von nackter Plasmid-DNA) konstruiert. Die für VEGF-C kodierende Sequenz ist funktionell mit einem geeigneten Promotor wie dem CMV-Promotor verbunden, und vorzugsweise mit einer geeigneten Poly-A-Sequenz wie der Poly-A-Sequenz von menschlichem Wachstumshormon verbunden. Beispielhafte VEGF-C-Vektoren können aus Vektoren modelliert werden, die in der Literatur zur Durchführung eines vektorfreien Gentransfers für andere Wachstumsfaktoren beschrieben wurden, indem eine für VEGF-C kodierende Sequenz an die Stelle einer für VEGF kodierenden Sequenz gesetzt wird. Siehe zum Beispiels Isner et al., Circulation 91:2687-2692 (1995); und Isner et al., Human Gene Therapy 7:989-1011 (1996), durch Inbezugnahme hier aufgenommen] Vektor. Ein ähnliches Konstrukt, das ein lacZ-Gen umfaßt, wird als Kontrolle verwendet.
Ein hydrogelbeschichteter Ballonkatheter (Boston Scientific) wird verwendet, um das VEGF-C-Transgen im wesentlichen wie in Asahara at al., Circulation 94: 3291-3302 (15. Dezember 1996), durch Inbezugnahme hier aufgenommen, beschrieben, durchgeführt. Kurz gesagt, wird ein Angioplastie-Ballon ex vivo durch vollständiges Vorschieben des entleerten Ballons durch eine schützende Teflonhülle (Boston Scientific) präpariert. Der Ballon wird inflatiert und eine konventionelle Pipette wird verwendet, um das Transgen-Konstrukt (z. B. 50-5000 μg Transgen-DNA in einer Salzlösung) auf dem Hydrogelpolymer, das die äußere Oberfläche des aufgeblasenen Ballons beschichtet, aufzutragen. Nachdem die Transgen-Lösung getrocknet ist, wird der Ballon entleert, in die Schutzhülle zurückgezogen und erneut aufgeblasen, um den Blutfluß um die Ballonoberfläche zu minimieren, bis der Ballon in der Zielarterie richtig positioniert ist.
Das Intima/Media (I/M)-Verhältnis wird erneut als Parameter für die intimale Verdickung verwendet. Ein vermindertes I/M-Verhältnis wird bei Tieren, die mit dem VEGF-C-Transgenbeschichteten Ballonkatheter behandelt wurden, als Hinweis auf die therapeutische Wirksamkeit angesehen. Wie in Beispiel 2 beschrieben, kann der Vergleich der therapeutischen Wirksamkeit des VEGF-C-Gentransfers mit anderen Therapien wie dem VEGF-Gentransfer parallel durchgeführt werden.
Beispiel 6
Verwendung der VEGF-C-Gentherapie zur Verhinderung von Restenose im Anschluß an eine Angioplastie mit Stent
Die in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Verfahren werden wiederholt mit der Modifikation, daß die anfängliche Ballon-Angioplastie begleitet wird von der Implantation eines koronaren Stents unter Verwendung konventioneller Verfahren. Das VEGF-C-Transgen wird gleichzeitig oder unmittelbar vor oder nach der Stent-Implantation im wesentlichen wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben zugeführt. Erhöhte Mengen (z. B. zweifache bis zehnfach) des Transgens (im Vergleich zu Angioplastie ohne Stent) und eine erhöhte Transfektionszeit können erwünscht sein, wie in Van Belle et al., J. Am. Coll. Cardiol. 29:1371-1379 (Mai 1997), durch Inbezugnahme hier aufgenommen, beschrieben. Eine verminderte neointimale Verdickung und/oder verminderte thrombotische Okklusion in den VEGF-C-Gen-behandelten Tieren gegenüber Kontrolltieren, die mit einem Markergen behandelt wurden, wird als Beweis für die Wirksamkeit der VEGF-C-Gentherapie angesehen.
Beispiel 7
Verwendung einer extravaskulären Manschette zur Verminderung von Gefäßstenose
Eine inerte Silikon-Manschette, wie beispielsweise in der Veröffentlichung der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/20027 beschrieben, wird operativ um die Carotisarterien von weißen Neuseeland-Kaninchen implantiert. Die Manschette agiert als Reizmittel, das eine intimale Verdickung induzieren wird, und enthält ein Reservoir, das zur lokalen Zufuhr einer pharmazeutischen VEGF-C-Transgen- oder -Protein-Formulierung geeignet ist. Ein Gentransfer wird fünf Tage später unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen VEGF-C-Adenoviruskonstrukts oder Kontrollkonstrukts durch Injektion von 10⁸-10¹¹ pfu in die Manschette initiiert. Die Tiere werden 14 oder 28 Tage später getötet und histologische Untersuchungen werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Intima/Media-Dickeverhältnisse [Yla-Herttuala et al., Arteriosclerosis 6:230-236 (Nutzen 186)] werden als Hinweis auf Stenose verwendet. Verminderte I/M-Verhältnisse in den VEGF-C-transfizierten Kaninchen im Vergleich zu lacZ-Kontroll-Kaninchen zeigt die therapeutische Wirksamkeit des VEGF-C-Gentransfers zur Verhinderung von arterieller Stenose.
Beispiel 8
Verwendung von VEGF-C-Polypeptiden zur Verminderung oder Verhinderung von Restenose
Die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren werden wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstatt der Behandlung der Versuchstiere mit einem Adenovirus enthaltend ein VEGF-C-Transgen oder lacZ-Kontrolle, die Tiere mit einer Zusammensetzung, die ein VEGF-C-Polypeptid in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger (z. B. isotonische Salzlösung mit Serumalbumin) umfaßt oder mit Trägerlösung allein als Kontrolle behandelt werden. Die Versuchstiere erhielten entweder 10, 100, 250, 500, 1000 oder 5000 μg eines VEGF-C-Polypeptids mittels intraarterieller Infusion, wie beispielsweise in Beispiel 1 beschrieben. Eine zweite Gruppe von Tieren erhielt zusätzlich eine Injektion des VEGF-C-Polypeptids 7 Tage später. Die Tiere wurden getötet und eine histologische Untersuchung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Verminderte I/M-Verhältnisse in den VEGF-C-behandelten Tieren gegenüber Kontrolltieren bilden einen Hinweis auf die therapeutische Wirksamkeit der VEGF-C-Polypeptid-Behandlung. Von der Wiederholung des Experiments unter Verwendung verschiedener VEGF-C-Formulierungen mit anhaltender Abgabe und von Materialien, wie sie oben beschrieben sind, wird erwartet, daß sie die therapeutische Wirksamkeit des VEGF-C-Polypeptids weiter verbessert. Darüber hinaus ist als Variante der Erfindung insbesondere ein Behandlungsschema vorgesehen, das die gleichzeitige Verabreichung von VEGF-C-Protein (zur Bereitstellung einer sofortigen Therapie für das Zielgefäß) mit einem VEGF-C-Transgen (um eine anhaltende Therapie über mehrere Tage oder Wochen bereitzustellen) umfaßt.
Beispiel 9
Anti-Stenose/Anti-Restenose-Aktivität von VEGF-D
Die in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Verfahren werden unter Verwendung einer Zusammensetzung wiederholt, die ein VEGF-D-Polynukleotid oder VEGF-D-Polypeptid anstelle des VEGF-C-Polynukleotids/-Polypeptids umfaßt, um die Fähigkeit von VEGF-D zu demonstrieren, Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern.
Obwohl die vorliegende Erfindung anhand spezifischer Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist ersichtlich, daß dem Fachmann Variationen und Modifikationen begegnen werden, die alle als Aspekte der vorliegenden Erfindung gedacht sind. Entsprechend sollten der Erfindung lediglich die aus den Ansprüchen ersichtlichen Beschränkungen auferlegt werden.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhinderung von Restenose eines Blutgefäßes bei einem Säugetierpatienten, vorzugsweise einem Menschen, wobei die Zusammensetzung mindestens ein Mittel umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Polynukleotiden, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die für das Polypeptid eines vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors C (VEGF-C) kodiert; Polynukleotiden, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die für das Polypeptid eines vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors D (VEGF-D) kodiert; VEGF-C-Polypeptid; und VEGF-D-Polypeptid.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Mittel ein Polynukleotid umfaßt, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Säugetier-VEGF-C-Polypeptid, bevorzugt ein menschliches VEGF-C-Polypeptid, kodiert, oder eine Nukleotidsequenz, die ein Säugetier-VEGF-D-Polypeptid, bevorzugt ein menschliches VEGF-D-Polypeptid, kodiert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei, wenn die Nukleotidsequenz für ein menschliches VEGF-C-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die einen zusammenhängenden Bereich der SEQ ID NO: 2 enthält, der zusammenhängende Bereich an seinem Aminoterminus eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 30-131 der SEQ ID NO: 2 und an seinem Carboxyterminus eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 211 bis 419 der SEQ ID NO: 2.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei dem Polynukleotid eine Nukleotidsequenz fehlt, die für die Aminosäuren 228-419 und/oder die Aminosäuren 32-102 der SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei das Polynukleotid ferner eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für ein sekretorisches Signalpeptid kodiert, wobei die Sequenz, die für das sekretorische Signalpeptid kodiert, mit der Sequenz, die für das VEGF-C-Polypeptid kodiert, "in-frame" verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Polynukleotid ferner eine Promotorsequenz umfaßt, die mit der Sequenz, die für die sekretorische Signalsequenz und das VEGF-C-Polypeptid kodiert, funktionell verbunden ist, wobei die Promotorsequenz die Transkription der Sequenz, die für die sekretorische Signalsequenz und das VEGF-C-Polypeptid kodiert, in Säugetierzellen fördert.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Polynukleotid ferner eine Poly-A-Sequenz umfaßt, die mit der Sequenz, die für das VEGF-C-Polypeptid kodiert, funktionell verbunden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1-7, wobei die Zusammensetzung einen Gentherapie-Vektor umfaßt, wobei der Gentherapie-Vektor das Polynukleotid enthält, und wobei der Vektor optional einen replikationsdefizienten Adenovirus umfaßt, wobei der Adenovirus das Polynukleotid funktionell mit einem Promotor verbunden und durch eine adenovirale Polynukleotidsequenz flankiert umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die Zusammensetzung ferner einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1-9, wobei das Arzneimittel formuliert ist zur Verabreichung: (a) in mindestens einer intravaskulären Injektion; oder (b) in einem kathetervermittelten Transfer der Zusammensetzung in ein Blutgefäß eines Säugetierpatienten, bevorzugt durch Einführen eines Katheters in eine Koronararterie des Säugetierpatienten und Freisetzen der Zusammensetzung in die Koronararterie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1-10, wobei das Arzneimittel formuliert ist für die gleichzeitige Verabreichung mit einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie.
Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, wobei ein intravaskulärer Stent mit dem Arzneimittel beschichtet oder imprägniert wird.
Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung von Restenose eines Blutgefäßes bei einem Menschen, wobei die Zusammensetzung einen replikationsdefizienten Adenovirus-Vektor umfaßt, der ein Polynukleotid enthält, das mindestens ein Polypeptid kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus VEGF-C-Polypeptiden und VEGF-D-Polypeptiden, und ferner eine Promotorsequenz zur Förderung der Expression von dem mindestens einen Polypeptid in Zellen des Blutgefäßes umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Polynukleotid ein VEGF-C-Polypeptid kodiert.
Endovaskulärer Stent, angepaßt zur Kontaktierung einer Oberfläche eines Blutgefäßes im Verlauf einer Operation zur Behandlung der Stenose eines Blutgefäßes, wobei der Stent eine äußere Oberfläche zur Kontaktierung einer Oberfläche eines Blutgefäßes und eine Zusammensetzung auf der Oberfläche umfaßt, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-15.
Extravaskuläre Manschette, angepaßt zur Kontaktierung einer Oberfläche eines Blutgefäßes im Verlauf einer Operation zur Behandlung der Stenose eines Blutgefäßes, wobei die Manschette eine äußere Wand umfaßt, die so gestaltet ist, daß sie die äußere Oberfläche eines Blutgefäßes umgibt, wobei die Wand einen Raum einschließt, der eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-15 enthält.
Kit zur Behandlung von Restenose, umfassend einen Behälter, der eine wie in Anspruch 1 oder Anspruch 14 definierte Zusammensetzung enthält, ein an dem Behälter angebrachtes oder damit verpacktes Etikett, wobei das Etikett die Verwendung der Zusammensetzung zur Verhinderung von Restenose eines Blutgefäßes beschreibt, und: (a) eine medizinische Vorrichtung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: intravaskulären Stents, intravaskulären Kathetern, extravaskulären Manschetten und Membranen, die angepaßt sind, eine Oberfläche eines intravaskulären Stents oder Katheters zu bedecken; und/oder (b) eine Trägersubstanz zur Zuführung des Mittels an die Lumenwand eines Gefäßes, wobei der Träger bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hydrogelpolymeren und Mikropartikelpolymeren.