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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verhinderung von Stenose und
Restenose von Blutgefäßen und
betrifft allgemein das Gebiet der Herz-Kreislauf-Medizin.
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Hintergrund
der Erfindung
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Koronararterienerkrankungen
bilden eine Hauptursache für
Morbidität
und Mortalität
in der ganzen Welt, insbesondere in den Vereinigten Staaten und
Europa. Die perkutane transluminale Koronarangioplastie (z. B. Ballon-Angioplastie,
mit oder ohne intrakoronares Stenting) ist eine nunmehr gebräuchliche
und erfolgreiche Therapie für
solche Erkrankungen, die hunderte bis tausende Male pro Jahr allein in
den Vereinigten Staaten durchgeführt
wird. Bei einem Drittel bis zur Hälfte solcher Revaskularisierungsverfahren
tritt jedoch Restenose auf, üblicherweise
innerhalb von sechs Monaten nach der Angioplastie-Maßnahme.
Die ökonomischen
Kosten der Restenose sind auf 2 Millionen Dollar jährlich allein
in den Vereinigten Staaten beziffert worden. [Cerek et al., Am.
J. Cardiol., 68: 24C-33C (1991).]
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Restenose
bleibt ein klinisches Problem bei der Angioplastie, die an peripheren
Blutgefäßen angewendet
wird. Gleichermaßen
bildet Restenose ein klinisches Problem zum Beispiel nach der Transplantation
von Blutgefäßen (z.
B. verpflanzte Venen und verpflanzte künstliche Gefäße) für die Herz-Bypass-Therapie
oder für
die Behandlung peripherer Ischämie
oder Claudicatio intermittens (z. B. femoro-popliteale arterielle
Bypass-Transplantate
oberhalb des Knies).
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Mazur
et al., Texas Heart Institute Journal, 21, 104-111 (1994) geben
an, daß Restenose
primär eine
Antwort der Arterie auf die durch die perkutane Koronarangioplastie
verursachte Verletzung ist, die die intimale Schicht von Endothelzellen
und die darunterliegenden glatten Muskelzellen der Media zerstört. Die
Autoren geben an, daß mehrere
Wachstumsfaktoren, die durch Blutplättchen, Endothelzellen, Makrophagen
und glatte Muskelzellen ausgeschieden werden, an dem Restenoseprozeß mechanistisch
beteiligt sind, und daß die
Proliferation von glatten Muskelzellen ein kritisches pathogenetisches Merkmal
darstellt. Den Autoren zufolge hat sich die Proliferation dieser
glatten Muskelzellen als refraktär gegenüber der
mechanischen und pharmakologischen Therapie erwiesen. Kürzlich haben
andere in Frage gestellt, ob die Proliferation glatter Muskelzellen
von vorletzter Bedeutung bei der Restenose ist. Siehe Libby, Circ.
Res., 82: 404-406 (1998).
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Narins
et al., Circulation 97: 1298-1305 (1998) geben eine Übersicht
zur Verwendung von intrakoronaren Stents und deren Nutzen und Beschränkungen
bei der Verhinderung von Restenose. Debbas et al., American Heart
Journal 133: 460-468 (Mason 97) diskutieren das Stenting innerhalb
eines Stents, um eine In-Stent-Restenose
zu behandeln.
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Chang & Leiden, Semin.
Intervent. Cardiol. 1: 185-193 (und 1996), hier und durch Inbezugnahme aufgenommen,
geben eine Übersicht über Ansätze zur
somatischen Gentherapie zur Behandlung von Restenose. Chang und
Leiden lehren, daß replikationsdefiziente
Adenoviren ein vielversprechendes und siche res Vektorsystem für die Gentherapie
umfassen, die auf die Verhinderung von Restenose gerichtet ist,
weil solche Viren viele verschiedene Zellarten effizient infizieren
können,
einschließlich
glatter Gefäßmuskelzellen;
solche Viren können
in hohen Titern hergestellt werden (zum Beispiel 1010-1012 plaquebildende Einheiten pro Milliliter);
solche Viren können
ein Transgen-Insert von z. B. 7-9 Kilobasen (kb) Größe aufnehmen;
solche Viren können
perkutan durch Standardkatheter zugeführt werden; und solche Viren
integrieren nicht in das Wirtsgenom. Sowohl Chang & Leiden als auch
Feldman et al., oben, geben auch eine Übersicht über zytotoxische und zytostatische
Gentherapieansätze,
die dazu ausgelegt sind, proliferierende Gefäßmuskelzellen, die für Restenose
kennzeichnende neointimale Bildungen verantwortlich gemacht werden,
zu töten
oder zu arretieren.
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Riessen & Isner, J. Am.
Coll. Cardiol., 23: 1234-1244 (1994), hier durch Inbezugnahme aufgenommen,
geben eine Übersicht über Vorrichtungen zur
intravaskulären
Arzneimittelzufuhr und Vektoren für die intravaskuläre Gentherapie.
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Cerek
et al., Am. J. Cardiol. 68: 24C-33C (1991) schlagen die Verhinderung
von Restenose durch Hemmung der wachstumsfaktorvermittelten Heilung
von Arterienverletzungen vor. Mögliche
Rollen von Plättchen-Wachstumsfaktor
(PDGF), Thrombospondin, insulinähnlichem
Wachstumsfaktor 1 (IGF-1), Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs), transformierendem
Wachstumsfaktor alpha (TGF-α) und
beta (TGF-β),
epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) werden diskutiert.
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Isner & Asahara, Veröffentlichung
der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/19712, hier durch
Inbezugnahme aufgenom men, schlagen die Behandlung von verletzten
Blutgefäßen und
die Beschleunigung der Reendothelialisierung im Anschluß an die
Angioplastie durch Isolieren endothelialer Vorläuferzellen von dem Patienten
und die Rückführung solcher
Zellen an den Patienten vor. Die Autoren weisen darauf hin, daß die Wirksamkeit
der Verwendung eines die Angiogenese fördernden Wachstumsfaktors,
wie beispielsweise des vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) oder das basischen Fibroblastenwachstumsfaktors
(bFGF) durch das Fehlen von Endothelzellen, bei denen der VEGF oder bFGF
ihre Wirkungen entfalten werden, beschränkt sein kann.
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Martin
et al., Veröffentlichung
der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/20027 schlagen die
Verwendung von VEGF-Gen oder -Protein zur Behandlung oder Verhinderung
von Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes vor. Die Autoren geben an,
daß jede
vorteilhafte Wirkung von VEGF von einem anderen Wirkungsmechanismus
als dem Mechanismus herrührt,
dem eine Aktivität
von VEGF hinsichtlich der Stimulierung der Reendothelialisierung
in Fällen,
wo das Endothel beschädigt
wurde, zugrunde liegt.
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Callow
et al., Growth Factors, 10: 223-228 (1994) geben an, daß die intravenöse Injektion
von vaskulärem
Permeabilitätsfaktor
(auch bekannt als VEGF) in Kaninchen, die einer durch Ballon-Angioplastie
induzierten Endotheldenudation unterzogen worden waren, zu einer
im Vergleich zu einer Kontrolle verstärkten Regeneration von Endothel
führte.
Die Autoren gaben auch an, daß der
basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) bei der Förderung
der Reendothelialisierung wirksam ist, daß diese Reendothelialisierung
jedoch von Zunahmen in der Größe neointimaler
Läsionen
begleitet wird.
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Asahara
et al., Circulation, 94: 3291-3302 (15. Dezember 1996) geben an,
das die lokale perkutane Katheterzufuhr eines CMV-Human-VEGF165-Transgens eine beschleunigte Reendothelialisierung
bei Ballon-verletzten Kaninchen zeigte, und zu einer verminderten
intimalen Verdickung führte.
In einem Bericht durch eine verbundene Gruppe von Autoren, Van Belle
et al., J. Am. Coll. Cardiol., 29: 1371-1379 (Mai 1997), ist angegeben worden,
daß die
Stent-Endothelialisierung durch Zufuhr eines CMV-Human-VEGF165-Transgens beschleunigt wurde und von
einer Abschwächung
der intimalen Verdickung begleitet war.
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Morishita
et al., J. Atherosclerosis and Thrombosis, 4(3): 128-134 (1998)
geben an, daß der Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF) eine mitogene Aktivität
auf menschliche Endothelzellen aufweist, die stärker ist als die von VEGF und
stellen die Hypothese auf, daß eine
HGF-Gentherapie einen potentiellen therapeutischen Wert für die Behandlung
von Herzkreislauferkrankungen, wie beispielsweise Restenose nach
Angioplastie, haben kann. Morishita et al. geben auch an, daß nur wenige
Erkenntnisse über
Wachstumsfaktoren vorliegen, die nur Endothelzellen, jedoch keine
Gefäßmuskelzellen
stimulieren.
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DeYoung & Dichek, Circ.
Res. 82: 306-313 (1998) geben an, daß die VEGF-Gen-Zufuhr gegenwärtig nicht
zur Anwendung bei menschlicher Restenose geeignet sei, und daß zwei unabhängige Studien
nahelegen, daß die
VEGF-Zufuhr gegenwärtig
die arterielle intimale Hyperplasie verschlechtern kann.
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Brown
et al., U.S.-Patent Nr. 5,795,898, schlagen die Verwendung eines
Inhibitors des PDFG-, FGF-, EGF- oder VEGF-Signaling vor, um eine beschleunigte
Atherogenese, die an der Restenose von Koronargefäßen oder
anderen arteriellen Gefäßen nach
einer Angioplastie beteiligt ist, zu unterdrücken.
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Die
vorstehende Diskussion zeigt, daß weiterhin ein seit langer
Zeit bestehendes Bedürfnis
für Verbesserungen
an Angioplastiematerialien und/oder Verfahren und/oder begleitenden
Therapien existiert, um Restenoseereignisse zu vermindern.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung geht auf seit langer Zeit bestehende Bedürfnisse
auf dem Gebiet der Medizin hinsichtlich der Verhinderung von Stenose oder
Restenose bei Säugetierblutgefäßen ein.
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Der
Gegenstand der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
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Beispielsweise
stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines
Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetierpatienten zur Verhinderung
von Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes bereit, wobei die Behandlung die
Schritte des Verabreichens einer ein Polynukleotid umfassenden Zusammensetzung
an einen Säugetierpatienten,
der einer Behandlung zur Verhinderung von Stenose oder Restenose
eines Blutgefäßes bedarf,
umfaßt,
und wobei das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz umfaßt, die
ein Polypeptid des vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktors C (VEGF-C) umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Patient ein menschlicher Patient.
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Obwohl
es vorgesehen ist, daß das VEGF-C-Polynukleotid
rein zur prophylaktischen Behandlung für die Verhinderung von Ste nose
verabreicht werden könnte,
ist vorgesehen, daß das
Polynukleotid kurz vor und/oder gleichzeitig mit und/oder kurz nach
einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie-Maßnahme verabreicht
wird, um eine Restenose des Patientengefäßes zu verhindern. Das Polynukleotid
kann vor, während
und/oder kurz nach einer Bypass-Maßnahme (z. B. einer koronaren
Bypass-Maßnahme)
verabreicht werden, um Stenose oder Restenose in oder nahe dem transplantierten (verpflanzten)
Gefäß zu verhindern,
insbesondere Stenose am Ort der Verpflanzung selbst. Das Polynukleotid
kann vor, während
oder nach einer Gefäßtransplantation,
die zur Behandlung peripherer Ischämie oder Claudicatio intermittens
durchgeführt
wurde, in der Gefäßperipherie
verabreicht werden. Mit Verhinderung von Stenose oder Restenose
ist eine prophylaktische Behandlung gemeint, um die Menge/Schwere
von Stenose oder Restenose, die häufig bei solchen chirurgischen
Maßnahmen
auftritt, zu vermindern und/oder im wesentlichen zu eliminieren. Das
Polynukleotid ist in einer Menge und einer Form in der Zusammensetzung
enthalten, die wirksam ist, die Expression eines VEGF-C-Polypeptids
in einem Blutgefäß des Säugetierpatienten
zu fördern,
wodurch die Stenose oder Restenose des Blutgefäßes verhindert wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Säugetierpatient
ein menschlicher Patient. Zum Beispiel ist der Patient eine an einer
koronaren Arterienerkrankung leidende Person, die durch einen Kardiologen
als ein Kandidat identifiziert wurde, der von einer therapeutischen
Ballon-Angioplastie-Maßnahme
(mit oder ohne Einführung
eines intravaskulären
Stents) oder von einer koronaren Bypass-Maßnahme profitieren könnte. Die
Erfindung kann für
andere Säugetierpatienten
verwendet werden, insbesondere Säugetiere,
die üblicherweise
als Modelle zur Demonstration der therapeutischen Wirksamkeit beim
Menschen verwendet werden (z. B. Primaten, Schweine, Hunde oder
Kaninchen).
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Für die Ausübung der
Erfindung soll der Begriff "VEGF-C-Polypeptid" jedes Polypeptid
beinhalten, das eine VEGF-C-Aminosäuresequenz
oder eine zu VEGF-C analoge Aminosäuresequenz (wie andernorts
in größerer Ausführlichkeit
beschrieben) aufweist und das in vivo restenosevermindernde Wirkungen
von menschlichem VEGF-C besitzt, wobei diese Wirkungen hier durch
Beispiele in einem Kaninchen-Modell demonstriert werden. Der Begriff "VEGF-C-Polynukleotid" soll jedes Polynukleotid
(z. B. DNA oder RNA, einzel- oder doppelsträngig) beinhalten, das eine
Nukleotidsequenz umfaßt,
die ein VEGF-C-Polypeptid
kodiert. Aufgrund der gut bekannten Degeneration des genetischen
Codes existieren mehrere VEGF-Polynukleotidsequenzen, die jedes
ausgewählte
VEGF-C-Polypeptid kodieren.
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Zur
Behandlung von Menschen sind VEGF-C-Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz eines
menschlichen VEGF-C stark bevorzugt, und Polynukleotide, die eine
Nukleotidsequenz einer menschlichen VEGF-C-cDNA umfassen, sind stark bevorzugt.
Mit "menschlichem
VEGF-C" ist ein
Polypeptid gemeint, das einem natürlich vorkommenden Protein
(Prä-Pro-Protein,
teilweise prozessiertem Protein oder vollständig prozessiertem reifem Protein)
entspricht, das durch irgendein Allel des menschlichen VEGF-C-Gens
kodiert wird, oder ein Polypeptid, das ein biologisch aktives Fragment
eines natürlich
vorkommenden reifen Proteins umfaßt. Beispielsweise umfaßt ein menschlicher
VEGF-C einen zusammenhängenden
Bereich der in der SEQ ID NO: 2 wiedergegebenen Aminosäuresequenz,
der ausreicht, damit das Polypeptid bindet und die VEGFR-2- und/oder
VEGFR-3-Phos phorylierung in Zellen, die solche Rezeptoren exprimieren,
stimuliert. Insbesondere ist ein Polypeptid vorgesehen, das 131-211
Aminosäuren
der SEQ ID NO: 2 umfaßt.
Beispielsweise sind Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz vorgesehen, die
einen zusammenhängenden
Bereich der SEQ ID NO: 2 umfassen, wobei der zusammenhängende Bereich
an seinem Aminoterminus eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus
der Gruppe, bestehend aus den Positionen 30-131 der SEQ ID NO: 2
und an seinem Carboxyterminus eine Aminosäure aufweist, die ausgewählt ist aus
der Gruppe, bestehend aus den Positionen 211 bis 419 der SEQ ID
NO: 2. Wie hier an anderer Stelle in größerer Ausführlichkeit beschrieben, erhöhen sich
die biologischen Aktivitäten
von VEGF-C, insbesondere diejenigen, die durch VEGFR-2 vermittelt werden,
bei der Prozessierung sowohl eines aminoterminalen als auch eines
carboxyterminalen Propeptids. Daher ist ein Aminoterminus bevorzugt,
der ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 102-131 der SEQ ID NO:
2, und ein Aminoterminus, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend
aus den Positionen 103-113 der SEQ ID NO: 2, ist besonders bevorzugt.
Gleichermaßen
ist ein Carboxyterminus, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend
aus den Positionen 211-227 der SEQ ID NO: 2, bevorzugt. Wie oben
angegeben, soll der Begriff "menschlicher
VEGF-C" auch Polypeptide umfassen,
die durch allelische Varianten des menschlichen VEGF-C kodiert werden,
die durch die in den SEQ ID NO: 1 & 2 wiedergegebenen Sequenzen gekennzeichnet
sind.
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Da
der therapeutische VEGF-C als rekombinanter VEGF-C oder indirekt über somatische
Gentherapie zu verabreichen ist, liegt es darüber hinaus innerhalb des Fachkönnens, Analoga
von menschlichem VEGF-C (sowie Polynukleotide, die solche Analoga
kodieren) herzustellen und zu verwenden, wobei eine oder mehrere
Aminosäuren
zugefügt,
entfernt oder durch anderen Aminosäuren ersetzt worden sind, insbesondere
mit konservativen Ersetzungen, und wobei die biologische Anti-Restenose-Aktivität erhalten
geblieben ist. Analoga, die die biologische Anti-Restenoseaktivität von VEGF-C
bewahren, sind als VEGF-C-Polypeptide zur Verwendung bei der vorliegenden
Erfindung vorgesehen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Analoga, die
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24 oder 25 solche Modifikationen aufweisen und die biologische
Anti-Restenose-Aktivität von VEGF-C
bewahren, als VEGF-C-Polypeptide zur Verwendung bei der vorliegenden
Erfindung vorgesehen. Polynukleotide, die solche Analoga kodieren, werden
erzeugt unter Verwendung konventioneller PCR, ortsgerichteter Mutagenese
und chemischer Synthesetechniken.
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Ebenfalls
als VEGF-C-Polypeptide vorgesehen sind nicht-menschliche Säugetier- oder Vogel-VEGF-C-Polypeptide
und -Polynukleotide. Mit "Säugetier-VEGF-C" ist ein Polypeptid
gemeint, das einem natürlich
vorkommenden Protein (Prä-Pro-Protein, teilweise
prozessierten Protein oder vollständig prozessierten reifen Protein)
entspricht, das durch irgendein Allel eines VEGF-C-Gens irgendeines
Säugetieres
kodiert wird, oder ein Polypeptid, das ein biologisch aktives Fragment
eines reifen Proteins umfaßt.
Der Begriff "Säugetier-VEGF-C-Polypeptide" soll Analoga von menschlichen
VEGF-Cs beinhalten, die in vivo die restenosevermindernde Wirkung
von Säugetier-VEGF-C
aufweisen. Die Tatsache, daß Gentherapie
bei Verwendung eines einen menschlichen VEGF-C kodierenden Transgens
bei der Verhinderung von Restenose in einem Kaninchenmodell wirksam
ist, ist ein Hinweis auf die artübergreifende
therapeutische Wirksamkeit von VEGF-C-Proteinen.
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Unabhängig davon,
welches VEGF-C-Polypeptid ausgewählt
wird, umfaßt
das VEGF-C-Polypeptid vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die ein sekretorische
Signalpeptid kodiert, das "in-frame" mit der VEGF-C-Polypeptidsequenz
verbunden ist. Das sekretorische Signalpeptid steuert die Sekretion
des VEGF-C-Polypeptids
durch die Zellen, die das Polynukleotid exprimieren, und wird durch
die Zelle von dem ausgeschiedenen VEGF-C-Polypeptid abgespalten. Zum Beispiel
könnte
das VEGF-C-Polypeptid
die vollständige
in SEQ ID NO: 2 wiedergegebene Prä-Pro-VEGF-C-Sequenz kodieren;
oder könnte das
in-frame mit einer einen vollständig
prozessierten VEGF-C (zum Beispiel die Aminosäuren 103-227 der SEQ ID NO:
2) oder ein VEGF-C-Analogon
kodierenden Sequenz verbundene VEGF-C-Signalpeptid kodieren. Darüber hinaus
ist es nicht erforderlich, daß das
Signalpeptid von VEGF-C abgeleitet ist. Die Signalpeptid-Sequenz kann die
eines anderen ausgeschiedenen Proteins sein, oder kann eine vollständig synthetische
Signalsequenz sein, die wirksam ist, die Sekretion in Zellen des
Säugetierpatienten
zu steuern.
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In
einer Ausführungsform
umfaßt
das erfindungsgemäße VEGF-C-Polypeptid eine Nukleotidsequenz,
die mit einem Polynukleotid, das zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen
menschlichen VEGF-cDNA-Sequenz komplementär ist, unter den folgenden
beispielhaften stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert:
Hybridisierung bei 42 °C
in 50% Formamid, 5 × SSC,
20 mM Na·PO4, pH 6,8; und Waschen in 1 × SSC bei
55 °C für 30 Minuten;
und wobei die Polynukleotidsequenz ein Polypeptid kodiert, das menschlichen
VEGFR-2 und/oder VEGFR-3 bindet und stimuliert. Es ist ersichtlich,
daß Variationen
dieser exemplarischen Bedingungen auf Grundlage der Länge und
des GC- Nukleotidgehalts der
zu hybridisierenden Sequenzen auftreten. Formulierungen, die Standard
im Stand der Technik sind, sind zur Feststellung der geeigneten
Hybridisierungsbedingungen geeignet. Siehe Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (Zweite Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989) §§ 9.47-9.51.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
umfaßt das
VEGF-C-Polynukleotid ferner zusätzliche
Sequenzen, um die VEGF-C-Gentherapie zu erleichtern. In einer Ausführungsform
wird ein "nacktes" VEGF-C-Transgen
(d. h. ein Transgen ohne einen viralen, liposomalen oder anderen
Vektor zur Erleichterung der Transfektion) für die Gentherapie eingesetzt.
In dieser Ausführungsform
umfaßt
das VEGF-C-Polynukleotid bevorzugt eine geeignete Promotor- und/oder
Enhancer-Sequenz (z. B. Cytomegalovirus-Promotor/Enhancer [Lehner
et al., J. Clin. Microbiol., 29: 2494-2502 (1991); Boshart et al., Cell,
41: 521-530 (1985)]; Rous-Sarkom-Virus-Promotor [Davis et al., Hum.
Gene Ther. 4: 151 (1993)]; Tie-Promotor [Korhonen et al., Blood
68(5): 1828-1835 (1995)]; oder Affenvirus-40-Promotor zur Expression
in der Säugetier-Zielzelle,
wobei der Promotor zu der kodierenden Sequenz für VEGF-C stromaufwärts (d.
h. 5') funktionell
verbunden ist. Das VEGF-C-Polynukleotid beinhaltet vorzugsweise
darüber
hinaus eine geeignete Poly-A-Sequenz (z. B. die Poly-A-Sequenz des
SV40 oder des Gens des menschlichen Wachstumshormons), die stromabwärts (d.
h. 3') zu der kodierenden
Sequenz von VEGF-C funktionell verknüpft ist. Das Polynukleotid kann
ferner wahlweise Sequenzen umfassen, deren einzige gewünschte Funktion
darin besteht, die Produktion des Vektors, z.B. in Bakterien, in
großem Maßstab zu
erleichtern, wie beispielsweise einen bakteriellen Replikationsursprung
und eine Sequenz, die für
einen selektierbaren Marker ko diert. In einer bevorzugten Ausführungsform
werden solche Sonder-Sequenzen jedoch zumindest teilweise vor der Verabreichung
an Menschen gemäß den Verfahren der
Erfindung abgespalten. Man kann solche Polynukleotide herstellen
und verabreichen, um eine erfolgreiche Gentherapie unter Verwendung
von Verfahren zu erreichen, die in der Literatur für andere
Transgene beschrieben wurden. Siehe z. B. Isner et al., Circulation,
91:2687-2692 (1995); und Isner et al., Human Gene Therapy 7:989-1011
(1996); hier durch Inbezugnahme vollständig aufgenommen.
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Jeder
geeignete Vektor kann verwendet werden, um das VEGF-Transgen in den Wirt
einzuführen.
Beispielhafte Vektoren, die in der Literatur beschrieben wurden,
schließen
replikationsdefiziente retrovirale Vektoren ein, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf Lentivirus-Vektoren [Kim et al., J. Virol. 72(1): 811-816 (1998);
Kingsman & Johnson,
Scrip Magazine, October 1998, S. 43-46.]; adeno-assoziierte virale
Vektoren [Gnatenko et al., J. Investig. Med. 45: 87-98 (1997)]:
adenovirale Vektoren (sie z.B. US-Patent Nr. 5,792,453; Quantin
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet
et al, J. Clin. Invest., 90: 620-630 (1992); und Rosenfeld et al.,
Cell 68: 143-155 (1992)]; Lipofectin-vermittelter Gentransfer (BRL);
liposomale Vektoren [siehe z. B. US-Patent Nr. 5,631,237 (Liposomen,
die Sendai-Virusprotein
umfassen)]; und Kombinationen davon. Alle vorstehenden Dokumente
werden hier durch Inbezugnahme vollständig aufgenommen. Replikationsdefiziente adenovirale
Vektoren stellen eine bevorzugte Ausführungsform dar.
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In
Ausführungsformen,
die einen viralen Vektor einsetzen, beinhalten bevorzugte Polynukleotide weiterhin
einen geeigne ten Promotor und eine geeignete Poly-A-Sequenz, wie
oben beschrieben. Darüber
hinaus ist leicht ersichtlich, daß bei diesen Ausführungsformen
das Polynukleotid ferner Vektor-Polynukleotidsequenzen
(z. B. adenovirale Polynukleotidsequenzen) beinhaltet, die mit den
ein VEGF-C-Polypeptid kodierenden Sequenzen funktionell verbunden
sind.
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In
einer Ausführungsform
umfaßt
die zu verabreichende Zusammensetzung daher einen Vektor, wobei
der Vektor das VEGF-C-Polynukleotid
umfaßt. In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Vektor ein Adenovirus-Vektor. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
ist der Adenovirus-Vektor replikationsdefizient, d.h., er kann aufgrund
der Entfernung essentieller Virenreplikationssequenzen aus dem adenoviralen
Genom in einem Säugetierpatienten
nicht repliziert werden. Zum Beispiel sehen die Erfinder ein Verfahren
vor, bei dem der Vektor einen replikationsdefizienten Adenovirus
umfaßt,
wobei der Adenovirus das VEGF-C-Polynukleotid funktionell mit einem
Promotor verbunden und an beiden Enden von adenoviralen Polynukleotidsequenzen
flankiert umfaßt.
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Die
gemäß der Erfindung
zu verabreichende Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise (zusätzlich zu
dem Polynukleotid oder Vektor) eine pharmazeutisch annehmbare Trägerlösung wie
beispielsweise Wasser, Salzlösung,
phosphatgepufferte Salzlösung, Glucose
oder andere Träger,
die üblicherweise
verwendet werden, um Therapeutika intravaskulär zuzuführen. Eine Multi-Gentherapie ist ebenfalls
vorgesehen, wobei in diesem Fall die Zusammensetzung optional sowohl
das/den VEGF-C-Polynukleotid/Vektor als auch ein/einen anderes/anderen
Polynukleotid/Vektor umfaßt,
die ausgewählt
sind, um Restenose zu verhindern. Beispielhafte Kandidaten-Gene/Vektoren
für die Co-Transfektion
mit VEGF-C-Transgenen sind in der oben zitierten Literatur beschrieben,
einschließlich
Genen, die zytotoxische Faktoren, zytostatische Faktoren, endotheliale Wachstumsfaktoren
und Wachstums/Migrationsinhibitoren der glatten Muskulatur kodieren.
Wie in größerer Ausführlichkeit
unten beschrieben, ist ein VEGF-D-Transgen ein bevorzugter Kandidat
für die gemeinsame
Verabreichung mit dem VEGF-C-Transgen.
Insbesondere ist die gemeinsame Verabreichung eines VEGF-Transgens
ebenfalls vorgesehen.
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Die
durchgeführte "Verabreichung" kann durchgeführt werden
unter Verwendung jedes medizinisch annehmbaren Mittels zur Einführung eines Therapeutikums
direkt oder indirekt in das Gefäßsystem
eines Säugetierpatienten,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Injektionen; orale Aufnahme; intranasale oder topische Verabreichung
und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verabreichung
der das VEGF-C-Polynukleotid
umfassenden Zusammensetzung intravaskulär durchgeführt, beispielsweise durch intravenöse, intraarterielle
oder intrakoronararterielle Injektion.
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Besonders
bevorzugt kann die Zusammensetzung lokal verabreicht werden, z.
B. an den Ort der Angioplastie oder des Bypass. Zum Beispiel umfaßt die Verabreichung
einen kathetervermittelten Transfer der transgenhaltigen Zusammensetzung
in ein Blutgefäß des Säugetierpatienten,
insbesondere in eine Koronararterie des Säugetierpatienten. Beispielhafte
Materialien und Verfahren zur lokalen Zufuhr sind beschrieben in
Lincoff et al., Circulation 90: 2070-2084 (1994): und Wilensky et
al., Trends Cardiovasc. Med. 3: 163-170 (1093), die beide hier durch Inbezugnahme
aufgenommen sind. Beispielsweise wird die Zusammensetzung eines
Infusions-Perfusions- Ballonkatheters
(vorzugsweise eines mikroporösen
Ballonkatheters) verabreicht, wie beispielsweise jenen, die in der
Literatur für
intrakoronare Arzneimittelinfusionen beschrieben sind. Siehe z.
B. das US-Patent Nr. 5,713,860 (intravaskulärer Katheter mit Infusionsanordnung);
US-Patent Nr. 5,087,244; US-Patent Nr. 5,653,689; und Wolinsky et
al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475-481 (1900) (Wolinsky-Infusionskatheter);
und Lambert et al., Coron. Artery Dis. 4: 469-475 (1093). Die Verwendung
solcher Katheter für
die ortsgerichtete somatische Zellgentherapie ist zum Beispiel beschrieben
in Mazur et al., Texas Heart Institute Journal 21: 104-111 (1094),
hier durch Inbezugnahme aufgenommen. In einer Ausführungsform,
bei der das VEGF-C-Transgen in einem Adenovirus-Vektor zu verabreichen ist, wird der
Vektor bevorzugt in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger bei
einem Titer von 107-1013 Virenpartikeln,
und besonders bevorzugt bei einem Titer von 109-1011 Virenpartikeln verabreicht. Die adenovirale
Vektor-Zusammensetzung wird vorzugsweise über einen Zeitraum von 15 Sekunden
bis 30 Minuten, besonders bevorzugt 1 bis 10 Minuten, infundiert.
-
Zum
Beispiel beinhaltet ein beispielhaftes Protokoll bei Patienten mit
Angina pectoris aufgrund einer einzelnen oder mehrerer Läsionen in
Koronararterien, für
die auf Basis erster Befunde anhand eines Koronar-Angiogramms PTCA
verschrieben wurde, die Durchführung
von PTCA mittels eines 7F-Führungskatheters
gemäß klinischer
Praxisstandards unter Verwendung des femoralen Zugangs. Wenn ein
optimales Ergebnis mit PTCA allein nicht erreicht wird, wird ein
endovaskulärer
Stent ebenfalls implantiert. (Ein nicht optimales Ergebnis ist definiert als
verbleibende Stenose von >30%
des luminalen Durchmessers nach optischer Abschätzung, und Dissektion vom B-
oder C-Typ). Arterieller Gentransfer am Ort der Ballondilatation
wird mit einem replikationsdefizienten adenoviralen VEGF-C-Vektor
sofort nach der Angioplastie, jedoch vor der Stent-Implantation
unter Verwendung eines Infusions-Perfusions-Ballonkatheters durchgeführt. Die
Größe des Katheters
wird in Anpassung an den mittels Angiogramm gemessenen Durchmesser
der Arterie ausgewählt
und variiert z.B. von 3,0 bis 3,5F im Durchmesser. Der Ballon wird
auf den optimalen Druck aufgeblasen und der Gentransfer wird während einer 10minütigen Infusion
bei einer Rate von 0,5 ml/min mit einem Virustiter von 1,15 × 1010 durchgeführt.
-
Die
intravaskuläre
Verabreichung mit einem gelbeschichteten Katheter, wie er in der
Literatur zur Einführung
anderer Gene beschrieben worden ist, ist ebenfalls vorgesehen. Siehe
z. B. US-Patent Nr. 5,674,192 (Katheter, beschichtet mit hartnäckig anhaftendem
schwellbaren Hydrogelpolymer); Riessen et al., Human Gene Therapy
4: 749-758 (1993); und Steg et al., Circulation 96: 408-411 (1997)
und 90: 1648-1656 (1994). Kurz gesagt, wird DNA in Lösung (z.
B. das VEGF-C-Polynukleotid) ein oder mehrere Male ex vivo auf die
Oberfläche
eines aufgeblasen Angioplastiekatheter-Ballon, der mit einem Hydrogelpolymer
(z. B. Schieber mit Hydroplus, Mansfield Boston Scientific Corp.,
Watertown, MA) beschichtet ist, aufgebracht. Die Hydroplus-Beschichtung
ist ein hydrophiles Polyacrylsäure-Polymer, das mit
dem Ballon quervernetzt ist, um ein Hydrogel mit hohem Molekulargewicht
zu bilden, das fest an den Ballon angeheftet ist. Das DNA-beschichtete
Hydrogel wird vor der Deflation des Ballons trocknen gelassen. Die erneute
intravaskuläre
Inflation des Ballons während einer
Angioplastie-Maßnahme verursacht
den Transfer der DNA auf die Gefäßwand.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
ist eine dehnbare elastische Membran oder ähnliche Struktur, die auf einen
Ballon-Angioplastiekatheter
oder Stent montiert oder darin integriert ist zur Zuführung des
VEGF-C-Transgens einzusetzen. Siehe z. B. die US-Patente Nr. 5,707,385,
5,697,967, 5,700,286, 5,800,507 und 5,776,184.
-
In
einer anderen Variante ist die das VEGF-C-Transgen enthaltende Zusammensetzung extravaskulär zu verwenden,
z. B. unter Verwendung einer Vorrichtung, um einen Bereich des Gefäßes zu ummanteln
oder einzukapseln. Siehe z. B. die Veröffentlichung der internationalen
Patentanmeldung WO 98/20027, die eine Manschette beschreibt, die
(z. B. während
einer Bypass-Maßnahme)
um die Außenseite
einer Arterie herum angeordnet wird, um ein Transgen mittels eines
Plasmids oder Liposomen-Vektors
an die Arterienwand zuzuführen.
-
Endothelzellen
oder Endothel-Vorläuferzellen
können
auch ex vivo mit dem VEGF-C-Transgen transfiziert werden, und die
transfizierten Zellen werden an den Säugetierpatienten verabreicht.
Beispielhafte Verfahren zur Beimpfung eines Gefäßtransplantats mit genetisch
modifizierten Endothelzellen sind im US-Patent, 5,785,965 beschrieben.
-
Wenn
der Säugetierpatient
ein Gefäßtransplantat
empfängt,
kann die das VEGF-C-Transgen enthaltende Zusammensetzung direkt
an dem isolierten Gefäßsegment
angewendet werden, bevor es in vivo verpflanzt wird.
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In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetierpatienten
bereit, um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, wobei die
Behandlung den Schritt des Verabreichens einer ein VEGF-C-Polypeptid
enthaltenden Zusammensetzung an einen Säugetierpatienten, der behandlungsbedürftig ist,
um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, in einer
Menge umfaßt,
die bei der Verhinderung von Stenose oder Restenose des Blutgefäßes wirksam
ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
die Verabreichung das Implantieren eines intravaskulären Stents
in den Säugetierpatienten,
wobei der Stent mit der Zusammensetzung beschichtet oder imprägniert ist.
Beispielhafte Materialien zur Konstruktion des arzneimittelbeschichteten
oder arzneimittelimprägnierten
Stents sind in der oben zitierten Literatur beschriebenen und in
Lincoff et al., Circulation, 90: 2070-2084 (1994) in einer Übersicht
dargestellt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung
Mikropartikel, die aus biologisch abbaubaren Polymeren wie PGLA,
nicht-abbaubaren Polymeren oder biologischen Polymeren (z. B. Stärke) zusammengesetzt
sind, wobei die Partikel das VEGF-C-Polypeptid einschließen oder
damit imprägniert
sind. Solche Partikel werden der intravaskulären Wand unter Verwendung z.B.
eines Infusions-Angioplastie-Katheters
zugeführt.
Andere Techniken zur Erreichung einer lokal anhaltenden Arzneimittelzufuhr sind
in Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med. 3: 163-170 (1993), hier
durch Inbezugnahme aufgenommen, in einer Übersicht dargestellt.
-
Die
Verabreichung über
eine oder mehr intravenöse
Injektionen im Anschluß an
die Angioplastie- oder Bypass-Maßnahme ist ebenfalls vorgesehen. Die
Lokalisierung des VEGF-C-Polypeptids an den Ort der Maßnahme erfolgt
durch Expression von VEGF-C-Rezeptoren auf proliferierenden Endothelzellen.
Die Lokalisierung wird weiter erleichtert durch rekombinante Ex pression
des VEGF-C als Fusions-Polypeptid (z. B. fusioniert an ein Apolipoprotein B-100-Oligopeptid,
wie in Shih et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1436-1440 (1990)
beschrieben. Die gemeinsame Verabreichung von VEGF-C-Polynukleotiden
und VEGF-C-Polypeptiden ist ebenfalls vorgesehen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung die Verwendung eines VEGF-C-Polynukleotids
oder VEGF-C-Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung oder Verhinderung von Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes bereit.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform stellt
die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetierpatienten bereit, um
Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, wobei die
Behandlung den Schritt des Verabreichens einer ein Polynukleotid
enthaltenden Zusammensetzung an einen Säugetierpatienten, der behandlungsbedürftig ist,
um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, umfaßt, wobei
das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid eines
vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktor D (VEGF-D) umfaßt. Solche Verfahren werden
im wesentlichen wie hier in Bezug auf VEGF-C-kodierende Polynukleotide
beschrieben ausgeübt,
mit der Ausnahme, daß Polynukleotide eingesetzt
werden, die VEGF-D kodieren. Eine ausführliche Beschreibung des menschlichen VEGF-D-Gens
und -Proteins wird in Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.
95(2): 548.553 (1998); der Veröffentlichung
der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/07832, veröffentlicht
am 26. Februar 1998; und in der Genbank-Zugriffsnummer AJ000185
bereitgestellt. Eine cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenzen für Prä-Pro-VEGF-D
ist hier in den SEQ ID NO: 3 und 4 wiedergegeben. Aufgrund der wohlbekannten
Degeneration des genetischen Codes existieren natürlich viele
VEGF-D-kodierende Polynukleotidsequenzen, die alle nach den hier
gelehrten Verfahren eingesetzt werden können.
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Wie
hier ausführlich
in Bezug auf VEGF-C beschrieben, ist die Verwendung von Polynukleotiden,
die VEGF-D-Fragmente, VEGF-D-Analoga, VEGF-D-Allel-
und -Interspezies-Varianten und dergleichen kodieren, die in vivo
Anti-Restenose-Wirkungen von menschlichem VEGF-D besitzen, alle
als von der vorliegenden Erfindung umfaßt vorgesehen.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform stellt
die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetierpatienten bereit, um
Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, wobei die
Behandlung den Schritt des Verabreichens einer ein VEGF-D-Polypeptid
enthaltenden Zusammensetzung an einen Säugetierpatienten, der behandlungsbedürftig ist,
um Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern, in einer
Menge umfaßt,
die bei der Verhinderung von Stenose oder Restenose des Blutgefäßes wirksam
ist. Solche Verfahren werden im wesentlichen wie hier in Bezug auf VEGF-C-Polypeptide
beschrieben ausgeübt.
-
In
einem verwandten Aspekt stellt die Erfindung Materialien und Vorrichtungen
zur Ausübung der
oben beschriebenen Verfahren bereit.
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Gleichermaßen stellt
die Erfindung chirurgische Vorrichtungen bereit, die zur Behandlung
von Kreislaufstörungen
verwendet werden, wie beispielsweise intravaskuläre (endovaskuläre) Stents,
Ballonkatheter, Infusions-Perfusions-Katheter, extravaskuläre Manschetten,
elastomere Membranen und dergleichen, die durch Beschichten mit,
Imprägnieren mit,
Anheften an oder Einkapseln in der Vorrichtung einer Zusammensetzung
umfassend ein VEGF-C-Polynukleotid, ein VEGF-C-Polypeptid, ein VEGF-D-Polynukleotid und/oder
VEGF-D-Polypeptid verbessert worden sind.
-
Beispielsweise
stellt die Erfindung in einer Ausführungsform einen endovaskulären Stent
bereit, der gekennzeichnet ist durch eine Verbesserung, wobei der
Stent mit einer Zusammensetzung beschichtet oder imprägniert ist,
wobei die Zusammensetzung mindestens ein Anti-Restenose-Mittel umfaßt, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus VEGF-C-Polynukleotiden, VEGF-C-Polypeptiden, VEGF-D-Polynukleotiden
und VEGF-D-Polypeptiden.
Beispielhafte Stents, die in dieser Weise verbessert werden können, sind
beschrieben und dargestellt in den US-Patenten Nr. 5,800,507 und 5,697,967
(Medtronic, Inc., einen intraluminalen Stent beschreibend, der Fibrin
und ein eluierbares Arzneimittel umfaßt, das eine Behandlung von Restenose
bereitstellen kann); dem US-Patent Nr. 5,776,184 (Medtronic, Inc.,
einen Stent mit einer porösen
Beschichtung beschreibend, die ein Polymer und eine therapeutische
Substanz in einem Feststoff oder einem Feststoff/einer Lösung mit
dem Polymer umfaßt);
dem US-Patent Nr. 5,799,384 (Medtronic Inc., einen flexiblen zylindrischen
Metall-Stent beschreibend, der eine biokompatible polymere Oberfläche zur
Kontaktierung eines Körperlumens
aufweist); den US-Patenten Nr. 5,824,048 und 5,679,400; und dem
US Patent Nr. 5,779,729. Die Implantation solcher Stents bei konventionellen
Angioplastie-Techniken führt
zu weniger Restenose als die Implantati on von konventionellen Stents.
In diesem Sinne ist die Biokompatibilität des Stents verbessert.
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In
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung eine durch eine Verbesserung gekennzeichnete
extravaskuläre
Manschette zur Zuführung eines
therapeutischen Mittels an ein Blutgefäß bereit, wobei die Manschette
beschichtet oder imprägniert ist
mit einer Zusammensetzung oder diese einschließt, wobei die Zusammensetzung
mindestens ein Anti-Restenose-Mittel
umfaßt,
das ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus VEGF-C-Polynukleotiden, VEGF-C-Polypeptiden,
VEGF-D-Polynukleotiden und VEGF-D-Polypeptiden. Eine beispielhafte Manschette,
die in dieser Weise verbessert werden kann, ist beschrieben und
dargestellt in der Offenlegungsschrift der internationalen Patentanmeldung Nr.
WO 98/20027 (Eurogene, Ltd., Manschette, umfassend einen Körper, der
angepaßt
ist, um eine Dichtung um ein Gefäß bereitzustellen
und ein Reservoir zu bilden, um eine pharmazeutische Anti-Restenose-Formulierung
zu halten).
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In
noch einer weiteren Ausführungsform stellt
die Erfindung einen durch eine Verbesserung gekennzeichneten Polymerfilm
zum Einwickeln eines Stents bereit, wobei der Film beschichtet ist
mit oder imprägniert
ist mit einer Zusammensetzung, und wobei die Zusammensetzung mindestens
ein Anti-Restenose-Mittel
umfaßt,
das ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus VEGF-C-Polynukleotiden, VEGF-C-Polypeptiden,
VEGF-D-Polynukleotiden
und VEGF-D-Polypeptiden. Ein beispielhafter Film, der in dieser
Weise verbessert werden kann, ist beschrieben und dargestellt in
den US-Patenten Nr. 5,700,286 und 5,797,385 (Advanced Cardiovascular Systems,
Inc., Hüllen
aus bioabsorbierbarem polymeren Material, das mit einem Re stenose-verhindernden
therapeutischen Mittel beschichtet oder imprägniert ist und an einen endovaskulärer Stent
anbringbar ist).
-
Gleichermaßen beinhaltet
die Erfindung Kits, die erfindungsgemäße Verbindungen oder Zusammensetzungen
umfassen, die in einer Weise verpackt sind, die deren Verwendung
zur Ausübung
der erfindungsgemäßen Verfahren
erleichtert. In einer einfachsten Ausführungsform beinhaltet solch
ein Kit eine hier als geeignet zur Ausübung der Erfindung beschriebene
Verbindung oder Zusammensetzung (z.B. VEGF-C- oder VEGF-D-Polynukleotide
oder -Polypeptide), verpackt in einem Behälter wie beispielsweise einer
verschlossenen Flasche oder einem verschlossenen Gefäß, mit einem
an dem Behälter
befestigten oder in dem Paket enthaltenen Etikett, das die Verwendung
der Verbindung oder Zusammensetzung zur Ausübung der erfindungsgemäßen Verfahren
beschreibt. Bevorzugt ist die Verbindung oder Zusammensetzung in
einer Einheitsdosierform verpackt. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet
ein erfindungsgemäßer Kit
sowohl eine VEGF-C- als auch eine VEGF-D-Polynukleotid- oder -Polypeptid-Zusammensetzung,
die zusammen mit einer technischen Vorrichtung verpackt ist, die
zur Durchführung
der erfindungsgemäßen Verfahren
geeignet ist, wie beispielsweise einem Stent, einem Katheter, einer
extravaskulären
Manschette, einem Polymerfilm oder dergleichen. In einer anderen
Ausführungsform
beinhaltet ein erfindungsgemäßer Kit
sowohl eine VEGF-C- als auch eine VEGF-D-Polynukleotid- oder -Polypeptid-Zusammensetzung,
die zusammen mit einem Hydrogelpolymer oder Mikropartikelpolymer
oder anderen hier als für
die Zuführung des
VEGF-C/VEGF-D an den Patienten geeignet beschriebenen Trägers verpackt
ist.
-
Zusätzliche
Eigenschaften und Variationen der Erfindung werden für den Fachmann
aus der gesamten Beschreibung ersichtlich sein, und alle diese Eigenschaften
sind als Aspekte der Erfindung vorgesehen.
-
Gleichermaßen können hier
beschriebene Eigenschaften der Erfindung zu weiteren Ausführungsformen
neu kombiniert werden, die als Aspekte der Erfindung gedacht sind,
unabhängig
davon, ob die Kombination von Merkmalen oben spezifisch als ein
Aspekt oder eine Ausführungsform
der Erfindung aufgeführt
ist. Auch sollten nur solche Beschränkungen, die hier als kritisch
für die
Erfindung beschrieben sind, als solche angesehen werden; Variationen
der Erfindung ohne Beschränkungen,
die hier nicht als kritisch beschrieben sind, sind als Aspekte der
Erfindung vorgesehen.
-
Kurze Beschreibung
der Figuren
-
1 stellt
einen Querschnitt eines Blutgefäßes dar,
in das ein Arzneimittelzufuhr-Ballonkatheter einschließlich einer
schützenden
Hülle eingeführt wurde,
wobei die schützende
Hülle dazu
dient, den Ballon bei der Einführung
und Positionierung abzudecken.
-
2A stellt
eine perspektivische Sicht auf eine dehnbare Membran dar, die zwei
Schichten aufweist, die vor der Verbindung von Rändern der Schichten miteinander
räumlich
voneinander getrennt sind.
-
2B stellt
eine perspektivische Sicht auf die Membran aus 2A dar,
die zu einer Röhre
eingerollt wurde und zusammengefügte
gegenüberliegende
Ränder
aufwies.
-
Die 3A und 3B stellen,
perspektivisch (3A) und als Längsquerschnitt
(3B), schematische Ansichten von einer extravaskulären Manschette
dar, die einen Bereich eines Blutgefäßes umgibt.
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4A stellt
einen Querschnitt eines Drahtes dar, der mit einem Polymer oder
Gel beschichtet ist, das eine therapeutische Zusammensetzung beinhalten
(z. B. damit imprägniert
sein) kann.
-
4B stellt
eine perspektivische Ansicht eines intravaskulären Stents dar, der aus dem
Draht aus 4A gebildet wurde.
-
Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß, wenn
ein Gen, das menschlichen vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktor C (VEGF-C) kodiert, an ein Säugetier
verabreicht wird, das an einem Gefäßtrauma wie dem Trauma, das
bei einer konventionellen Ballon-Angioplastie-Maßnahme auftreten kann, leidet,
eine Restenose des verletzten Gefäßes vermindert oder eliminiert
ist. Ein in vivo kontrolliertes Experiment, das die Wirksamkeit eines
VEGF-C-Transgens für
die Verhinderung von Restenose zeigt, ist ausführlich in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 2 stellt eine "Side-by-side"-Vergleichsstudie
bereit, die zeigt, daß die
Anti-Restenose-Wirkungen von VEGF-C den Antirestenose-Wirkungen von in
vergleichbarer Weise verabreichtem VEGF überlegen sind.
-
Der
als vaskulärer
endothelialer Wachstumsfaktor C (VEGF-C) bezeichnete Wachstumsfaktor
sowie native menschliche, nicht-menschliche
Säugetier-
und Affen-Polynukleotidsequenzen, die VEGF-C und VEGF-C-Varianten
und -Analoga kodieren, sind ausführlich
in der internationalen Patentanmeldung Nummer PCT/US98/01973, eingereicht
am 2 Februar 1998 und veröffentlicht
als internationale Veröffentlichung
Nr. WO 98/33917; und in Joukov et al., EMBO J., 16(13): 3898-3911
(1997), beschrieben worden. Wie dort im Detail erklärt, wird
menschlicher VEGF-C in menschlichen Zellen zunächst als Prä-Pro-VEGF-C-Polypeptid aus 419 Aminosäuren hergestellt.
Eine cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz für menschlichen
Prä-Pro-VEGF-C sind in den
SEQ ID NO: 1 bzw. 2 wiedergegeben, und eine menschlichen VEGF-C
kodierende cDNA ist bei der American Type Culture Collection (ATCC),
10801 University Blvd., Manassas, VR 20110-2209 (USA) gemäß den Vorschriften
des Budapester Vertrags hinterlegt worden (Hinterlegungstag vom
24. Juli 1995 und ATCC-Zugriffsnummer 97231). VEGF-C-Sequenzen von
anderen Arten sind ebenfalls beschrieben worden. Siehe beispielsweise
die Genbank-Zugriffsnummern MMU73620 (Mus musculus) und CCY15837
(Coturnix coturnix).
-
Das
Prä-Pro-VEGF-C-Polypeptid
wird in mehreren Stufen prozessiert, um ein reifes und am meisten
aktives VEGF-C-Polypeptid von etwa 21-23 kD (wie durch SDS-PAGE
unter reduzierenden Bindungen festgestellt) herzustellen. Dieses
Processing beinhaltet die Abspaltung eines Signalpeptids (SEQ ID
NO: 2, Reste 1-31); die Abspaltung eines carboxyterminalen Peptids
(ungefähr
den Aminosäuren 228-419
der SEQ ID NO: 2 entsprechend und ein Muster von beabstandeten Cysteinresten
aufweisend, das an eine Balbiani-Ring-3-Protein(BR3P)-Sequenz [Dignam
et al., Gene 88: 133-40 (1990); Paulsson et al., J. Mol. Biol.,
211: 331-49 (1990)]) erinnert, um eine teilweise prozessierte Form
von etwa 29 kD herzustellen; und die Abspaltung (offenbar extrazellulär) eines
aminoterminalen Peptids (ungefähr
den Aminosäuren
32-103 der SEQ ID NO: 2 entsprechend), um eine vollständig prozessierte
reife Form von etwa 21-23 kD herzustellen. Versuchsergebnisse zeigen,
daß teilweise
prozessierte Formen von VEGF-C (z. B. die 29-kD-Form) in der Lage
sind, den Flt4-(VEGFR-3)-Rezeptor zu binden, wohingegen eine hochaffine
Bindung an VEGFR-2 nur bei vollständig prozessierten Formen von VEGF-C
auftritt. Es scheint, daß VEGF-C-Polypeptide
natürlicherweise
als nicht-disulfidverknüfte
Dimere assoziieren.
-
Darüber hinaus
ist gezeigt worden, daß die Aminosäuren 103-227 der SEQ ID NO:
2 nicht alle kritisch für
die Aufrechterhaltung der VEGF-C-Funktionen sind. Ein Polypeptid,
das aus den Aminosäuren
113-213 der SEQ ID NO: 2 besteht (und dem die Reste 103-112 und
214-227 fehlen), bewahrt die Fähigkeit,
VEGF-C-Rezeptoren zu binden und zu stimulieren, und es wird erwartet,
daß ein
Polypeptid, das von ungefähr
Rest 131 bis ungefähr
Rest 211 erreicht, die biologische VEGF-C-Aktivität bewahrt.
Der Cystein-Rest an Position 156 hat sich als wichtig für die VEGFR-2-Bindungsfähigkeit
erwiesen. VEGF-C-ΔC156-Polypeptide
(d. h. Analoga, denen dieses Cystein aufgrund von Deletion oder
Substitution fehlt) bleiben jedoch potente Aktivatoren von VEGFR-3.
Wenn die Anti-Restenose-Wirkungen von VEGF-C durch VEGRF-3 vermittelt
werden, ist zu erwarten, daß die
Verwendung von VEGF-C-ΔC156-Polypeptiden (und diese kodierenden Polynukleotiden) eine
Anti-Restenose-Wirksamkeit bereitstellt, während die VEGFR-2-vermittelten
Nebenwirkungen minimiert werden. Das Cystein an Position 165 der
SEQ ID NO: 2 ist wesentlich für
die Bindung von einem der Rezeptoren, wohingegen Analoga, denen
die Cysteine an den Positionen 83 oder 137 fehlen, mit nativem VEGF-C
um die Bindung mit beiden Rezeptoren konkurrieren und beide Rezeptoren
stimulieren.
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Ein
Alignment von menschlichem VEGF-C mit VEGF-C von anderen Arten (durchgeführt unter Verwendung
irgendeines allgemein akzeptierten Alignment-Algorithmus) legt zusätzliche
Reste nahe, bei denen Modifikationen eingeführt werden können (z.
B. Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen), ohne die biologische
Aktivität
von VEGF-C zu zerstören.
Jede Position, an der ausgerichtete VEGF-C-Polypeptide von zwei
oder mehr Arten verschiedene Aminosäuren aufweisen, insbesondere verschiedene
Aminosäuren
mit Seitenketten unterschiedlicher chemischer Beschaffenheit, ist
eine wahrscheinliche Position, die für Modifikationen ohne gleichzeitige
Elimination der Funktion empfänglich ist.
Ein beispielhaftes Alignment von menschlichem, murinem und Wachtel-VEGF-C
ist in 5 der PCT/US98/01973 wiedergegeben.
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Abgesehen
von den vorstehenden Überlegungen
wird es ersichtlich sein, das zahllose konservative Aminosäureaustausche
an einer Wildtyp-VEGF-C-Sequenz vorgenommen werden können, die
wahrscheinlich zu einem Polypeptid führen, das die biologischen
Aktivitäten
von VEGF-C bewahrt, insbesondere, wenn die Zahl solcher Austausche
klein ist. Mit "konservativen
Aminosäureaustauschen" ist die Substitution
einer Aminosäure
durch eine Aminosäure
mit einer Seitenkette von ähnlicher chemischer
Beschaffenheit gemeint. Ähnliche
Aminosäuren
zur Herstellung konservativer Austausche schließen jene ein, die eine saure
Seitenkette (Glutaminsäure,
Asparaginsäure);
eine basische Seitenkette (Arginin, Lysin, Histidin); eine polare
Amid-Seitenkette (Glutamin, Asparagin); eine hydrophobe aliphatische
Seitenkette (Leucin, Isoleucin, Valin, Alanin, Glycin); eine aromatische
Seitenkette (Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin); eine kleine Seitenkette
(Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin); oder eine aliphatische
Hydroxyl-Seitenkette
(Serin, Threonin) aufweisen. Die Addition oder Deletion von einer
oder mehr inneren Aminosäuren
ohne Zerstörung
der biologischen Aktivitäten
von VEGF-C ist ebenfalls vorgesehen.
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Ohne
an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen,
daß der
Mechanismus hinter der Wirksamkeit von VEGF-C hinsichtlich der Verhinderung
von Restenose mit der Fähigkeit
von VEGF-C in Zusammenhang steht, die Endothelialisierung des verletzten
Gefäßes (und/oder
des intravaskulären
Stents) ohne signifikante gleichzeitige Stimulation der Proliferation
der glatten Muskulatur bei dem Gefäß zu stimulieren. VEGF-C kann
auch die Proliferation glatter Muskelzellen hemmen. Entsprechend
können
in Frage kommende VEGF-C-analoge Polypeptide rasch zunächst auf ihre
Fähigkeit
zur Bindung und Stimulation der Autophosphorylierung von bekannten
VEGF-C-Rezeptoren
(VEGFR-2 und VEGFR-2) untersucht werden. Polypeptide, die einen
oder beide bekannte Rezeptoren stimulieren, sind in vitro rasch
auf ihre mitogene und/oder chemotaktische Aktivität gegenüber kultivierten
kapillaren oder arteriellen Endothelzellen untersucht (wie z. B.
in der WO 98/33917 beschrieben). Polypeptide mit mitogener und/oder
chemotaktischer Aktivität
werden dann in vivo wie hier beschrieben auf die Fähigkeit
zur Verhinderung von Restenose untersucht. Auf diese Weise werden
Varianten (Analoga) von natürlich
vorkommenden VEGF-C-Proteinen rasch gescreent, um festzustellen,
ob die Varianten die erforderliche biologische Aktivität aufwei sen,
um "VEGF-C-Polypeptide" zur Verwendung in
der vorliegenden Erfindung darzustellen oder nicht.
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Der
als vaskulärer
endothelialer Wachstumsfaktor D (VEGF-D) bezeichnete Wachstumsfaktor
sowie menschliche Sequenzen, die VEGF-D und VEGF-D-Varianten und
-Analoga kodieren, sind ausführlich
in der internationalen Patentanmeldung Nummer PCT/US97/14696, eingereicht
am 21. August 1997 und publiziert am 26 Februar 1998 als internationale
Veröffentlichung
Nummer WO 98/07832; und in Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 95(2): 548-553 (1998), die beide durch Inbezugnahme hier
vollständig
aufgenommen werden, beschrieben worden. Wie dort im Detail erklärt, wird
menschlicher VEGF-D in menschlichen Zellen zunächst als Prä-Pro-VEGF-D-Polypeptid aus
354 Aminosäuren hergestellt.
Eine cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz für menschlichen
Prä-Pro-VEGF-D sind
in den SEQ ID NO: 3 bzw. 4 wiedergegeben. VEGF-D-Sequenzen von anderen
Arten sind ebenfalls beschrieben worden. Siehe beispielsweise die Genbank-Zugriffsnummern
D89628 (Mus musculus) und AF014827 (Rattus norvegicus), hier durch
Inbezugnahme aufgenommen.
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Das
Prä-Pro-VEGF-D-Polypeptid
besitzt ein mutmaßliches
Signalpeptid aus 21 Aminosäuren
und wird offenbar proteolytisch in einer Weise prozessiert, die
dem Processing des Prä-Pro-VEGF-C analog ist.
Ein "rekombinant
gereiftes" VEGF-D,
dem die Reste 1-92 und 202-354 der SEQ ID NO: 4 fehlen, bewahrt
die Fähigkeit,
die Rezeptoren VEGFR-2 und VEGFR-3 zu aktivieren und scheint als
nicht-kovalent gebundene Dimere zu assoziieren. Bevorzugte VEGF-D-Polynukleotide
beinhalten daher die Polynukleotide, die eine Nukleotidsequenz umfassen,
die die Aminosäuren
93-201 der SEQ ID NO: 4 kodieren. Die Anlei tung, die oben für die Einführung funktionsbewahrender
Modifikationen in VEGF-C-Polynukleotide bereitgestellt wurde, ist
ebenfalls geeignet zur Einführung
funktionsbewahrender Modifikationen in VEGF-D-Polypeptide.
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Eine
therapeutische oder prophylaktische Behandlung von Restenose beinhaltet
die Verabreichung einer Zusammensetzung umfassend ein VEGF-C- oder
VEGF-D-Polynukleotid oder -Polypeptid oder Kombinationen davon (hier
manchmal allgemein als ein "therapeutisches
VEGF-C- oder VEGF-D-Mittel" bezeichnet)
an einen Säugetierpatienten
wie beispielsweise einen Menschen.
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Die "Verabreichung" kann durchgeführt führt werden
unter Anwendung jedes medizinisch annehmbaren Mittels zur Einführung eines
Therapeutikums direkt oder indirekt in das Gefäßsystem eines Säugetierpatienten,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Injektionen, orale Aufnahme, intranasale oder topische Verabreichung
und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verabreichung
der Zusammensetzung, umfassend die VEGF-C- oder VEGF-D-Polynukleotid-
oder Polypeptid-Zusammensetzung, intravaskulär, beispielsweise durch intravenöse, intraarterielle
oder intrakoronararterielle Injektion durchgeführt.
-
Besonders
bevorzugt kann die Zusammensetzung lokal verabreicht werden, zum
Beispiel an den Ort der Angioplastie oder des Bypass. Zum Beispiel
umfaßt
die Verabreichung einen kathetervermittelten Transfer einer therapeutischen
Zusammensetzung in ein Blutgefäß des Säugetierpatienten,
insbesondere in eine Koronararterie des Säugetierpatienten. Beispielhafte
Materialien und Verfahren zur lokalen Zuführung sind in einer Übersicht
in Lincoff et al., Circulation 90: 2070-2084 (1994); und Wilensky
et al., Trends Cardiovasc. Med. 3:163-170 (1993) dargestellt. Beispielsweise
wird die Zusammensetzung unter Anwendung von Infusions-Perfusions-Ballonkathetern
(vorzugsweise mikroporösen
Ballonkathetern), wie sie beispielsweise in der Literatur für die intrakoronare
Arzneimittelinfusion beschrieben sind, verabreicht. Siehe zum Beispiel
das US-Patent Nr. 5,713,860 (intravaskulärer Katheter mit Infusionsanordnung);
das US-Patent Nr. 5,087,244; das US-Patent Nr. 5,653,689; und Wolinsky
et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475-481 (1990) (Wolinsky-Infusionskatheter);
und Lambert et al., Coron. Artery Dis. 4: 469-475 (1993). Die Verwendung
solcher Katheter zur ortsgerichteten somatischen Zellgentherapie
ist z. B. in Mazur et al., Texas Heart Institute Journal 21: 104-111
(1994) beschrieben.
-
Zum
Beispiel beinhaltet ein beispielhaftes Protokoll bei Patienten mit
Angina pectoris aufgrund einer einzelnen oder mehrerer Läsionen in
Koronararterien, für
die auf Basis erster Befunde anhand eines Koronar-Angiogramms PTCA
verschrieben wurde, die Durchführung
von PTCA durch einen 7F-Führungskatheter
gemäß klinischer
Praxisstandards unter Verwendung des femoralen Zugangs. Wenn ein
optimales Ergebnis mit PTCA allein nicht erreicht wird, wird ein
endovaskulärer
Stent ebenfalls implantiert. (Ein nicht optimales Ergebnis ist definiert als
verbleibende Stenose von > 30%
des luminalen Durchmessers nach optischer Abschätzung, und Dissektion vom B-
oder C-Typ). Arterieller Gentransfer am Ort der Ballondilatation
wird sofort nach der Angioplastie, jedoch vor der Stent-Implantation
unter Verwendung eines Infusions-Perfusions-Ballonkatheters durchgeführt. Die
Größe des Katheters
wird in Anpassung an den mittels Angiogramm gemessenen Durch messer
der Arterie ausgewählt
und variiert z.B. von 3,0 bis 3,5F im Durchmesser. Der Ballon wird
auf den optimalen Druck aufgeblasen und der Gentransfer wird während einer
10minütigen
Infusion bei einer Rate von 0,5 ml/min mit einem Virustiter von
1,15 × 1010 durchgeführt.
-
Die
intravaskuläre
Verabreichung mit einem gelbeschichteten Katheter, wie er in der
Literatur zur Einführung
anderer Gene beschrieben worden ist, ist ebenfalls vorgesehen. Siehe
z. B. US-Patent Nr. 5,674,192 (Katheter, beschichtet mit hartnäckig anhaftendem
schwellbaren Hydrogelpolymer); Riessen et al., Human Gene Therapy
4: 749-758 (1993); und Steg et al., Circulation 96: 408-411 (1997)
und 90: 1648-1656 (1994), die alle durch Inbezugnahme hier aufgenommen
sind. Wie in 1 dargestellt, wird ein Katheter 10 bereitgestellt,
an dem an einem distalen Ende ein aufblasbarer Ballon 12 angebracht
ist. Der Ballon beinhaltet eine schwellbare Hydrogelpolymer-Beschichtung 14,
die in der Lage ist, eine Lösung,
umfassend ein therapeutisches VEGF-C- oder VEGF-D-Mittel, zu absorbieren.
Kurz gesagt, wird DNA in Lösung
(z. B. das VEGF-C- oder VEGF-D-Polynukleotid) ein oder mehrere Male
ex vivo auf die Oberfläche
eines aufgeblasen Angioplastiekatheter-Ballons, der mit einem Hydrogelpolymer (z.
B. Schieber mit Hydroplus, Mansfield Boston Scientific Corp., Watertown,
MA) beschichtet ist, aufgebracht. Die Hydroplus-Beschichtung ist
ein hydrophiles Polyacrylsäure-Polymer,
das mit dem Ballon quervernetzt ist, um ein Hydrogel mit hohem Molekulargewicht
zu bilden, das fest an den Ballon angeheftet ist. Das DNA-beschichtete
Hydrogel wird vor der Deflation des Ballons trocknen gelassen. Die
erneute intravaskuläre
Inflation des Ballons während
einer Angioplastie-Maßnahme
verursacht den Transfer der DNA auf die Gefäßwand. Somit wird, unter erneutem Hinweis
auf 1, der Katheter mit angeheftetem, beschichteten
Ballon in das Lumen 16 des Blutgefäßes 18 eingeführt, während er
durch eine schützende Hülle 20 abgedeckt
ist, um die Exposition des beschichteten Ballons gegenüber dem
Blut vor der Planierung am Ort einer Okklusion 22 zu minimieren. Wenn
das Instrument an der Behandlungsregion planiert worden ist, wird
die schützende
Hülle zurückgezogen
oder der Katheter wird nach vorne bewegt, um den Ballon zu exponieren,
der aufgeblasen wird, um den Ballon (und somit die Beschichtung)
in die Gefäßwand zu
pressen, wodurch der Transfer des therapeutischen VEGF-C- oder VEGF-D-Mittels
in das Gewebe hervorgerufen wird, in einer Weise, die analog ist
dem Auspressen von Flüssigkeit
aus einem zusammengepreßten
Schwamm oder der Übertragung
feuchter Farbe auf eine Oberfläche
durch Kontakt.
-
In
noch einer weiteren Ausführungsform
ist eine dehnbare elastische Membran, ein Film oder eine ähnliche
Struktur, montiert an oder integriert in einen Ballon-Angioplastiekatheter
oder Stent zur Zuführung
des therapeutischen VEGF-C- oder VEGF-D-Mittels einzusetzen. Siehe
z. B. die US-Patente Nr. 5,707,385, 5,697,967, 5,700,286, 5,800,507 und
5,776,184. Wie in den 2A-2B dargestellt,
wird ein einschichtiges 30 oder mehrschichtiges 30, 32 Blatt
oder elastisches Membranmaterial (2A) zu
einer röhrenförmigen Struktur 34 (2B)
geformt, z.B. durch Zusammenbringen und Aneinanderheften gegenüberliegender
Ränder des/der
Blattes/Blätter,
z. B. in einer überlappenden oder
einer angrenzenden Beziehung. Auf diese Weise kann das elastomere
Material um einen Katheterballon oder Stent herumgewickelt werden.
Eine therapeutische VEGF-C- oder VEGF-D-Zusammensetzung wird mit
der Membran unter Verwendung jedes geeigneten Mittels, einschließlich Spritzguß-, Beschichtungs-,
Diffusions- und Absorptionstech niken kombiniert. In der in der Figur
dargestellten mehrschichtigen Ausführungsform können die
Ränder
der zwei Schichten aneinandergefügt
werden, um eine flüssigkeitsdichte
Dichtung zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Schicht
des Materials zunächst
durch Strecken des Materials und Einführen mehrerer mikroskopischer
Löcher
oder Schlitze 36 verarbeitet. Nachdem die Schichten aneinandergefügt wurden,
kann das Blatt gestreckt und die therapeutische VEGF-C/D-Zusammensetzung
durch eines der Löcher
injiziert werden, um den Hohlraum, der zwischen den Schichten besteht,
zu füllen.
Das Blatt wird dann entspannt, was dazu führt, daß die Löcher sich schließen und
die therapeutische Zusammensetzung zwischen den Schichten eingeschlossen
ist, bis das Blatt erneut gedehnt wird. Dies tritt zum Beispiel
dann auf, wenn ein endovaskulärer Stent
oder Ballon, der von dem Blatt bedeckt ist, innerhalb des Lumens
eines stenosierten Blutgefäßes expandiert
wird. Der expandierte Stent oder Ballon preßt radial nach außen gegen
die innere Oberfläche 38 der
röhrenförmigen Blattabdeckung,
wodurch sich das Blatt dehnt, sich die Löcher öffnen und das therapeutische
Mittel den Wänden
des Gefäßes zugeführt wird.
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In
einer anderen Variante ist die Zusammensetzung, enthaltend das VEGF-C-
oder VEGF-D-Therapeutikum extravaskulär zu verabreichen, z. B. unter
Verwendung einer Vorrichtung, um einen Bereich des Blutgefäßes zu umgeben
oder einzukapseln. Siehe z. B. die Veröffentlichung der internationalen
Patentanmeldung WO 98/20027, hier durch Inbezugnahme aufgenommen,
die eine Manschette beschreibt, die (z. B. bei einer Bypass-Maßnahme)
um die Außenseite
einer Arterie angeordnet ist, um mittels eines Plasmids oder eines
Liposomen-Vektors ein Transgen an die Arterienwand zuzuführen. Wie
in den 3A und Ziffer 3B dargestellt,
eine extravaskuläre
Manschette 40, beinhaltend eine durch eine z. B. aus einem
biologisch abbaubaren oder biokompatiblen Material gebildete Wand 44 definierten
ausgesparten Raum 42. Die Manschette berührt die äußere Wand 46 eines
Blutgefäßes 48 an
den äußeren Fortsetzen 50 der
Manschette. Blut 52 fließt durch das Lumen des Blutgefäßes. Eine
längslaufender
Schlitz 54 in der flexiblen Manschette erlaubt es, die
Manschette zu deformieren und um das Gefäß herum anzuordnen und anschließend unter
Verwendung eines üblichen
Gewebeklebers, wie z. B. Thrombin-Kleber, abzudichten.
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In
einer weiteren Variante können
Endothelzellen oder Endothel-Vorläuferzellen ex vivo mit dem VEGF-C-
u VEFG-D-Transgen transfiziert werden, und die transfizierten Zellen
wie an den Säugetierpatienten
verabreicht. Beispielhafte Verfahren zur Beimpfung eines Gewebetransplantats
mit genetisch modifizierten Endothelzellen ist im US-Patent Nr. 5,785,965
beschrieben.
-
Wenn
der Säugetierpatient
ein Gewebetransplantat erhält,
kann die therapeutische VEGF-C- oder VEGF-D-Zusammensetzung direkt
an dem isolierten Gewebesegment angewendet werden, bevor es in vivo
verpflanzt wird.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist ein intravaskulärer
Stent in dem Säugetierpatienten
zu implantieren, wobei der Stent mit der therapeutischen VEGF-C/D-Gen/Protein-Zusammensetzung beschichtet
oder imprägniert
ist. Beispielhafte Materialien zur Konstruktion eines arzneimittelbeschichteten
oder arzneimittelimprägnierten
Stents sind in der oben zitierten Literatur beschrieben und in Lincoff
et al., Circulation 90: 2070-2084 (1994) in einer Übersicht
dargestellt worden. Wie in den 4A und 4B dargestellt,
wird ein metallener oder polymerer Draht 70 zur Bildung
eines Stents mit einer Zusammensetzung 72 wie beispielsweise
einem porösen
biokompatiblen Polymer oder Gel beschichtet, das mit einer therapeutischen
VEGF-C- oder VEGF-D-Zusammensetzung imprägniert ist (oder in diese hineingetaucht
werden kann oder auf andere Weise unmittelbar vor der Verwendung
leicht damit beschichtet werden kann). Das Kabel ist gewendelt, gewebt
oder auf andere Weise zu einem Stent 74 geformt, der zur
Implantation in das Lumen eines Gefäßes unter Verwendung konventioneller
Materialien und Techniken, wie beispielsweise der intravaskulären Angioplastie-Katheterisierung,
geeignet ist. Beispielhafte Stents, die auf diese Weise verbessert werden
können,
sind beschrieben und dargestellt in den US-Patenten Nr. 5,800,507 und 5,697,967 ((Medtronic,
Inc., einen intraluminalen Stent beschreibend, der Fibrin und ein
eluierbares Arzneimittel umfaßt,
das eine Behandlung von Restenose bereitstellen kann); dem US-Patent
Nr. 5,776,184 (Medtronic, Inc., einen Stent mit einer porösen Beschichtung
beschreibend, die ein Polymer und eine therapeutische Substanz in
einem Feststoff oder in Feststoff/Lösung mit dem Polymer umfaßt); dem
US-Patent Nr. 5,799,384 (Medtronic Inc., einen flexiblen zylindrischen
Metall-Stent beschreibend, der eine biokompatible polymere Oberfläche zur
Kontaktierung eines Körperlumens
aufweist); den US-Patenten Nr. 5,824,048 und 5,679,400; und dem
US Patent Nr. 5,779,729. Die Implantation solcher Stents bei konventionellen
Angioplastie-Techniken führt
zu weniger Restenose als die Implantation von konventionellen Stents.
In diesem Sinne ist die Biokompatibilität des Stents verbessert.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
die Zusammensetzung Mikropartikel, die aus biologisch abbaubaren
Polymeren wie PGLA, nicht-abbaubaren Polymeren oder biologischen
Polymeren (z. B. Stärke)
zusammengesetzt sind, wobei die Partikel das VEGF-C- oder VEGF-D-Polypeptid/Polynukleotid
einschließen
oder damit imprägniert sind.
Solche Partikel werden der intravaskulären Wand unter Verwendung z.B.
eines Infusions-Angioplastie-Katheters zugeführt. Andere Techniken zur Erreichung
einer lokal anhaltenden Arzneimittelzufuhr sind in Wilensky et al.,
Trends Cardiovasc. Med. 3: 163-170 (1993) in einer Übersicht
dargestellt.
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Die
Verabreichung über
eine oder mehr intravenöse
Injektionen im Anschluß an
die Angioplastie- oder Bypass-Maßnahme ist ebenfalls vorgesehen. Die
Lokalisierung des VEGF-C- oder VEGF-D-Polypeptids an den Ort der
Maßnahme
erfolgt durch Expression von VEGF-C/D-Rezeptoren auf proliferierenden
Endothelzellen. Die Lokalisierung wird weiter erleichtert durch
rekombinante Expression des VEGF-C oder VEGF-D als Fusions-Polypeptid (z. B. fusioniert
an ein Apolipoprotein B-100-Oligopeptid, wie
in Shih et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1436-1440 (1990)
beschrieben.
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Die
pharmazeutische Wirksamkeit von VEGF-C-Polynukleotiden, VEGF-C-Polypeptiden, VEGF-D-Polynukleotiden
und VEGF-D-Polypeptiden zur Verhinderung von Stenose oder Restenose
eines Blutgefäßes wird
in vivo z. B. unter Verwendung von Verfahren gezeigt, wie sie in
den folgenden Beispielen beschrieben sind, von denen einige prophetisch sind.
Die Beispiele tragen dazu bei, die Erfindung weiter zu beschreiben,
sind aber in keiner Weise dazu vorgesehen, den Schutzbereich der
Erfindung zu beschränken.
-
Beispiel 1
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Verwendung von adenovirusvermitteltem VEGF-C-Gentransfer
zur Verhinderung von Restenose
-
Die
folgenden Experimente, durchgeführt
in vivo in einem Kaninchen-Restenose-Modell, zeigen die Wirksamkeit
von adenovirusvermitteltem intravaskulären VEGF-C-Gentransfer zur
Verhinderung von Post-Angioplastie-Restenose.
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A. Material und Methoden
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1. Adenovirale Konstrukte
-
Ein
Adenovirus-Plasmid, enthaltend eine den vollständigen offenen Leserrahmen
menschlicher Prä-Pro-VEGF-C
kodierende cDNA, funktionell verknüpft mit einem Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor und einer
menschlichen Wachstumshormon-Poly-A-Signalsequenz, wurde wie folgt konstruiert.
Ein DNA-Fragment, umfassend eine CMV-Promotorsequenz, wurde durch
Verdauung des pcDNA3.1+-Vektors (Invitrogen) mit SalI und Auffüllen der
5'-Überhänge mit
dem Klenow-Enzym hergestellt. Der CMV-Promotor (die Nukleotide 5431-911)
wurde mit Hind III aus dem Vektor ausgeschnitten und isoliert. Eine
menschliche Vollängen-VEGF-C-cDNA, enthaltend
die in SEQ ID NC): 1 spezifizierte 1997-bp-Sequenz (sowie weniger
als 50 Basen zusätzlicher
nicht kodierender und Polylinkersequenzen) wurde mit Hind III und
Xho I aus einem VEGF-C-pREP7-Expressionsvektor [beschrieben in WO
98/33917] ausgeschnitten und isoliert. Ein menschliches Wachstumshormon-Poly-A-Signal
(860 Basenpaare) wurde mit SalI und BamHI aus einem αMHC-Vektor
ausgeschnitten. Der CMV-Promotor, die VEGF-C-cDNA und die hGH-Poly-A-Signalfragmente
wurden gleichzeitig in einen mit BamHI und EcoRV verdauten pCRII-Vektor
ligiert. Der ligierte CMV-Promotor und die VEGF-C-cDNA sind in SEQ
ID NO: 17 wiedergegeben. Das erhaltene Konstrukt wurde mit BglII
geöffnet
und teilweise mit BamHI verdaut. Die vollständige Transkriptionseinheit
wurde in den mit BglII geöffneten
pAdBglII-Vektor ligiert. Dieses Konstrukt [bezeichnet als pAdBglII-VEGF-C]
wurde dann verwendet, um unter Verwendung von homologen Standard-Rekombinationstechniken
rekombinante Adenoviren herzustellen, die die CMV-VEGF-C-hGH-Transkriptions
Einheit enthielten. [Barr et al., Gene Ther. 1: 51-58 (1994)]. Replikationsdefiziente
E1-E3-deletierte Adenoviren wurden in 293 Zellen hergestellt und
durch Ultrazentrifugation unter Verwendung von aus der Literatur
bekannten Techniken konzentriert. [Siehe z. B. Barr et al. (1994)].
Ein Kontroll-Plasmid, umfassend das funktionell mit demselben Promotor
verknüpfte
lacZ-Gen, wurde ebenfalls verwendet. [Laitinen M. et al., Hum. Gene
Ther. 9: 1481-1486 (1998)]. Der lacZ-Adenovirus besaß ein Kernansteuerungssignal,
um die β-Galaktosidase-Expression
auf den Kern zu richten. Replikationsdefiziente E1-E3-deletierte
Adenoviren wurden in 293 Zellen hergestellt und durch Ultrazentrifugation
konzentriert (Barr et al., 1994). Die Adenoviren-Zubereitungen wurden auf Abwesenheit
von Helferviren und bakterielle Kontaminanten analysiert.
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2. Tiermodell
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Weiße Neuseeland-Kaninchen
wurden für die
Gentransferstudien eingesetzt. Eine erste Gruppe von Kaninchen wurde über zwei
Wochen mit einer 0,25%-Cholesterin-Diät gefüttert, dann einer Ballon-Denudation
der Aorta ausgesetzt, dann drei Tage später dem adenovirusvermittelten
Gentransfer unterzogen. Eine zweite Gruppe von Kaninchen wurde lediglich
dem Gentransfer unterzogen. Die Tiere wurden 2 oder 4 Wochen nach
dem Gentransfer getötet. Die
Zahl von Experiment-(VEGF-C-) und Kontroll(lacZ-)Tieren in beiden
Studiengruppen betrug 6.
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In
der ersten Gruppe von Kaninchen wurde die gesamte Aorta, ausgehend
von der Spitze des Bogens, unter Verwendung eines 4,0-F-Arterien-Embolektomiekatheters
(Sorin Biomedical, Irvine, CA) denudiert. Der Katheter wurde über die
rechte Beckenarterie bis zum Aortenbogen eingeführt und aufgeblasen, und die
Aorta wurde zweimal denudiert.
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3. Gentransfer
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Der
Gentransfer wurde durchgeführt
unter Verwendung eines 3.9-F-Kanal-Ballonkatheters zur lokalen Arzneimittelzufuhr
(Boston Scientific Corp., Maple Grove, MA). Unter Verwendung einer
fluoroskopischen Kontrolle wurde der Ballonkatheter kaudal zur linken
Nierenarterie in einem von Nebenästen freien
Abschnitt über
eine perkutane 5-F-Einführhülle (Arrow
International, Reading, PA) in der rechten Carotiden-Arterie positioniert
und mit einer Mischung aus Kontrastmittel und Salzlösung auf
6 ATM inflatiert. Der anatomische Ort des Ballonkatheters wurde durch
Messung seines Abstandes von der Aortenöffnung der linken Nierenarterie
festgestellt. Virentiter von 1,15 × 1010 plaquebildenden
Einheiten (FU) wurden jedem Tier in einem Endvolumen von 2 ml (0,9% NaCl)
verabreicht, und der Gentransfer wurde für 10 Minuten (0,2 ml/min) bei
6 ATM Druck durchgeführt. In
einer zweiten Studiengruppe hatten die Tiere lediglich einen Gentransfer
und sie wurden 2 Wochen nach dem Gentransfer getötet. Die Zahl von Tieren in jeder
Studiengruppe (nur 0,9% NaCl; lacZ-Gentransfer; und VEGF-C-Gentransfer)
betrug 3. Alle Studien wurden vom Ausschuß für Tierversuche der Universität Kuopio
in Finnland genehmigt.
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4. Histologie
-
Drei
Stunden vor der Tötung
wurde den Tieren 50 mg BrdU, gelöst
in 40% Ethanol, intravenös
injiziert. Nach der Tötung
wurde der Aortenabschnitt, in dem Gentransfer durchgeführt worden
war, entfernt, behutsam mit Salzlösung gespült und in fünf gleiche Abschnitte aufgeteilt.
Das proximale Segment wurde in Flüssigstickstoff schockgefroren
und bei –70°C aufbewahrt.
Der nächste
Abschnitt wurde in 4% Paraformaldehyd/15% Saccharose (pH 7,4) für 4 Stunden
immersionsfixiert, in 15% Saccharose (pH 7,4) über Nacht gespült und in
Paraffin eingebettet. Das mediale Segment wurde in 4% Paraformaldehyd/phosphatgepufferter
Salzlösung
(PBS) (pH 7,4) für
10 Minuten immersionsfixiert, 2 Stunden in PBS gespült, in OCT-Verbindung (Miles)
eingebettet und bei –70°C aufbewahrt.
Das vierte Segment wurde in 70% Ethanol über Nacht immersionsfixiert
und in Paraffin eingebettet. Das distale Segment wurde direkt auf β-Galaktosidase-Aktivität in X-GAL-Färbungslösung bei
+37 °C für 16 Stunden
gefärbt,
in 4% Paraformaldehyd/15% Saccharose (pH 7,4) für 4 Stunden immersionsfixiert,
in 15% Saccharose über
Nacht gespült
und in Paraffin eingebettet. Paraffinschnitte wurden für den immunzytochemischen
Nachweis von glatten Muskelzellen (SMC), Makrophagen und Endothel
verwendet. Die Gentransfer-Effizienz wurde ermittelt unter Verwendung
der X-GAL-Färbung von
OCT-eingebetteten Geweben. BrdU-positive Zellen wurden nach Herstelleranweisungen
detektiert. Morphometrie wurde unter Verwendung von Hämatoxylin- Eosin-gefärbten Paraffinschnitte
unter Verwendung einer Bildanalysesoftware durchgeführt. Die Messung
wurde unabhängig
voneinander von zwei Beobachtern von mehreren Abschnitten gemacht, ohne
Kenntnis des Ursprungs der Abschnitte. Intima/Media(I/M)-Verhältnisse
wurden als Parameter für
die intimale Verdickung gewählt.
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B. Ergebnisse
-
Die
histologische Analyse der Ballon-denudierten Mäuse ergab, daß die lacZ-transfizierte
Kontrollgruppe zwei Wochen nach dem Gentransfer ein I/M-Verhältnis von
0,61 aufwies, was eine statistisch signifikante Differenz (p<0,05) gegenüber den VEGF-C-transfizierten
Gruppen (I/M-Verhältnis
von 0,40) darstellt. Die Tendenz, daß die VEGF-C-Gruppe kleinere
I/M-Verhältnisse
aufwies, hielt zu einem Zeitpunkt 4 Wochen nach dem Gentransfer
an.
-
In
der zweiten Gruppe von Kaninchen, die lediglich dem Gentransfer
zur Gefäßwand (ohne
endotheliale Denudation) ausgesetzt worden waren, betrug das I/M-Verhältnis in
der lacZ-Gruppe
nur 0,3, im Vergleich zu 0,15 für
die VEGF-C-Gruppe. Diese Differenz stellt ebenfalls eine statistisch
signifikante (p<0,05)
Hemmung der Neointima-Bildung bei der VEGF-C-Gruppe dar.
-
Die
BrdU-Markierung erlaubt die Analyse der Proliferation von glatten
Muskelzellen bei VEGF-C-transfizierten gegenüber Kontroll(lacZ)-Tieren.
Es wird erwartet, daß die
SMC-Proliferation in der VEGF-transfizierten Population vermindert
ist.
-
Die
vorangegangenen Daten zeigen, daß der VEGF-C-Gentransfer die
intimale Verdickung zu einem Zeitpunkt zwei Wochen nach einer Aorta-Denudation
und nach Gefäßwandschädigung,
die durch den Gentransferkatheter ohne Ballondenudation verursacht
wurde, signifikant verminderte. Diese Daten zeigen eine therapeutische
Eignung des VEGF-C-Gentransfers zur Verhinderung von Post-Angioplastie-Restenose.
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Beispiel 2
-
Vergleichsbeispiel, das
zeigt, daß die
Anti-Restenose-Wirkungen
von VEGF-C denen von VEGF überlegen
scheinen
-
Die
folgenden Experimente zeigen die Wirksamkeit von adenovirusvermitteltem
intravaskulären VEGF-
und VEGF-C-Gentransfer zur Verhinderung von Post-Angioplastie-Restenose,
und zeigen, daß VEGF-C
eine im Vergleich zu VEGF überlegene
therapeutische Wirksamkeit zu bieten schien.
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A. Material und Methoden
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1. Adenovirale Konstrukte
-
VEGF-Adenovirus
(muriner VEGF-A164; SEQ ID NO: 18) wurde
konstruiert unter Verwendung desselben Promotors wie bei dem VEGF-C-Konstrukt und
unter Anwendung ähnlicher
Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben. Das adenovirale VEGF-A169-Konstrukt wurde in 293T Zellen hergestellt
und im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben konzentriert,
und auf Freiheit von Helferviren, Lipopolysacchariden und bakteriellen
Kontaminanten analysiert.
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2. Tiermodell
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Dreiundsechzig
weiße
Neuseeland-Kaninchen wurden in zwei Hauptgruppen aufgeteilt, wobei die
erste über
zwei Wochen eine 0,25-Cholesterin-Diät und vor dem Gentransfer eine
Ballon-Denudation der Aorta erhielt, und die zweite Gruppe lediglich
den Gentransfer erhielt. Der Gentransfer wurde bei der ersten Gruppe
von Kaninchen drei Tage nach der Denudation durchgeführt, und
die Tiere wurden 2 oder 4 Wochen nach dem Gentransfer getötet. Die Zahl
der Kaninchen in jeder Studiengruppe (lacZ, VEGF und VEGF-C) betrug
zu beiden Zeitpunkten 6. In der zweiten Studiengruppe erhielten
die Kaninchen lediglich den Gentransfer, ohne Cholesterin-Diät oder Ballon-Denudation und wurden
2 oder 4 Wochen nach dem Gentransfer getötet. Die Zahl von Kaninchen
in jeder Studiengruppe (0,9% Salzlösung, lacZ, VEGF und VEGF-C)
betrug 3.
-
3. Gentransfer
-
Der
Gentransfer wurde gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
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4. Histologie
-
Die
Histologie wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschreiben durchgeführt, mit
folgenden Modifikationen: SMC wurde unter Verwendung von HHF35 (DAKO,
1:50-Verdünnung)
detektiert, Makrophagen wurden unter Verwendung von RAM-11 (DAKO,
1:50-Verdünnung)
detektiert, Endothel wurde unter Verwendung von CD31 (DAKO, 1:50-Verdünnung) detektiert
und T-Zellen wurden
unter Verwendung von MCA 805 (DAKO, 1:100-Verdünnung)
detektiert. Kontrollen für
die Immunfärbung
bein halteten Inkubationen mit klassen- und speziesangepaßten Immunglobulinen,
und Inkubationen, bei denen primäre
Antikörper,
wurden weggelassen. Morphometrie und Bildanalyse wurden durchgeführt unter
Verwendung der Software Image-Pro PlusTM und
einem Olympus-AX70-Mikroskop (Olympus Optical, Japan). Statistische
Analysen wurden unter Verwendung des ANOVA- und modifizierten t-Tests
durchgeführt.
P <0,05 wurde als
statistisch signifikant betrachtet.
-
B. Ergebnisse
-
Die
histologische Analyse der Ballon-denudierten Kaninchenaorta zeigt
eine intimale Verdickung und SMC-Proliferation. Zwei Wochen nach dem
Gentransfer wies die lacZ-Kontrollgruppe das höchste I/M-Verhältnis (0,57 ± 0,04)
auf, wogegen die VEGF-C- (0,38 ± 0,02) und VEGF-Gruppen (0,49 ± 0,17)
eine Abnahme der intimalen Verdickung zeigten. Die Differenz in
den I/M-Verhältnissen
zwischen den lacZ und den VEGV-C-Gruppen war an dem Zwei-Wochen-Zeitpunkt
signifikant (P <0,05),
wogegen jene zwischen lacZ- und VEGF-Gruppen nicht statistisch signifikant
waren. Die Tendenz, daß sowohl
die VEGF- als auch die VEGF-C-Gruppen kleinere I/M-Verhältnisse
aufwiesen, hielt über
den Vier-Wochen-Zeitpunkt an, als das I/M-Verhältnis 0,73 ± 0,16, 0,44 ± 0,14
bzw. 0,63 ± 0,21
für die
lacZ-, VEGF-C- und VEGF-Gruppen betrug. Hämatoxylin-Eosin- und Immunfärbung der
transfizierten Arterien zeigen, daß die intimale Verdickung in
allen Arterien vornehmlich aus SMC zusammengesetzt war.
-
Die
Verwendung von adenoviralen Vektoren kann zu immunologischen und
entzündlichen
Reaktionen führen,
teilweise, weil Adenoviren in hohen Titern die Expression von NFκB induziert und
eine CTL-Antwort aktiviert. Es wurden weder Anzeichen von Entzündung noch
von Schaumzellenakkumulation festgestellt, zurückhalten anhand von Makrophagen-
und T-Zell-Immunfärbung.
Darüber
hinaus wurden Viren in der Qualität für die klinische Gentherapie am
Menschen zusammen mit kurzen Expositionszeiten bei den transfizierten
Arterien verwendet, was ebenfalls die Abwesenheit von schweren Entzündungsreaktionen
in dieser Studie erklären
kann.
-
Der
Prozentanteil proliferierender Zellen wurde unter Verwendung von
BrdU-Markierung analysiert. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet,
obwohl die VEGF-C-Gruppe dazu neigte, niedrigere Proliferationsraten
aufzuweisen, was mit der Beobachtung übereinstimmt, daß VEGF-C-transduzierte
Arterien an beiden Zeitpunkten kleinere I/M-Verhältnisse aufwiesen. Zwei Wochen
nach der Ballondenudation betrug der Prozentanteil proliferierender
Zellen 1,8 ± 0,4,
2,2 ± 0,7
und 1,2 ± 0,0
für die
lacZ-, VEGF-C- bzw. VEGF-Gruppen, und nach vier Wochen betrug der
Prozentanteil proliferierender Zellen 0,3 ± 0,1, 1,2 ± 0,5 bzw.
0,3 ± 0,1
für die
lacZ-, VEGF-C- bzw.
VEGF-Gruppen. Erneutes endotheliales Wachstum wurde analysiert durch
Messung der Länge
von intaktem Endothel in histologischen Schnitten. Es wurden keine
signifikanten Unterschiede zwischen den Studiengruppen gefunden.
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Das
Potential von Adenoviren, eine Schädigung an der Gefäßwand und
eine Neointima-Bildung hervorzurufen, wurde getestet mittels Durchführung eines
Hoch-Titer-Adenovirus-Gentransfers zur intakten abdominalen Aorta
von Kaninchen ohne Ballondenudation. Kontroll-Kaninchen wurden in
derselben Weise mit 0,9% Salzlösung
behandelt. Die Positionierung des Gentransferkatheters verursachte
eine Schädigung
der inneren elastischen Lamina und eine moderate Induktion von Neointima-Bildung
nach der Maßnahme.
An dem Zwei-Wochen-Zeitpunkt betrug das I/M-Verhältnis
in der lacZ-Gruppe 0,24 ± 0,06,
in der Kontrollgruppe 0,28 ± 0,05,
in der VEGF-C-Gruppe 0,18 ± 0,07
und in der VEGF-Gruppe 0,15 ± 0,03. An
dem Vier-Wochen-Zeitpunkt wies die lacZ-Gruppe ein I/M-Verhältnis von
0,22 ± 0,13,
die VEGF-C-Gruppe von 0,13 ± 0,03
und die VEGF-Gruppe von 0,23 ± 0,11
auf.
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Diese
Studie zeigt eine vorteilhafte therapeutische Wirkung von intravaskulärem adenovirusvermittelten
VEGF-C-Gentransfer auf die Gefäßwand nach
einer Ballon-Verletzung, und vergleicht auch den adenovirusvermittelten
VEGF-C- und VEGF-Gentransfer
zur Verhinderung von Neointima-Bildung. Obwohl verschiedene Rezeptorbindungsprofile
von VEGF-C und VEGF zu verschiedenen biologischen Wirkungen in der
Gefäßwand geführt haben
mögen,
verminderten beide VEGFs die intimate Verdickung zwei Wochen nach
dem Gentransfer. Beide VEGFs sind daher potentielle Kandidaten für die vaskuläre Gentherapie
von Ischemischen atherosklerotischen Krankheiten. Nach diesem Versuch
scheint VEGF-C Restenose in diesem Modellsystem jedoch effizienter
zu verhindern als VEGF. Die im Vergleich zu VEGF überlegene
Fähigkeit
von VEGF-C, Restenose zu verhindern, könnte auf die Expression oder
Aktivität
von VEGFR-3 zurückzuführen sein,
der ein Rezeptor für
VEGF-C und VEGF-D, nicht jedoch für VEGF ist. Alternativ könnte die
offensichtliche Überlegenheit
einer durch VEGFR-1 vermittelten restenosefördernden Wirkung von VEGF zuzurechnen
sein oder auf differentielle Ligandeneffekte, vermittelt durch den
gemeinsamen Rezeptor VEGFR-2 (VEGF-C gegen VEGF) zurückzuführen sein,
von dem berichtet wird, daß er
in glatten Muskelzellen von Gefä ßen exprimiert
wird. [Siehe Grosskreutz et al., Microvasc. Res. 58(2): 128-136 (September
1990).
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Beispiel 3
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Expression von transfizierten
VEGFs in der Aortawand
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Unter
Verwendung der Aorta-Abschnitte von denselben Versuchstieren, die
in Beispiel 2 beschrieben wurden, wurde die mRNA-Expression von
lacZ, VEGF-C und VEGF (murines VEGF-A164)
in Aortagewebe nach Gentransfer analysiert. Gesamt-RNA wurde aus
transfizierten Aorta-Abschnitten unter Verwendung von Trizol-Reagenz
(Gibco-BRL) extrahiert, und 2 μg
RNA wurden zur cDNA-Synthese verwendet. Es wurden Primer für lacZ,
VEGF-C und VEGF hergestellt,
um zwischen endogenen und transduzierten Genen zu unterscheiden,
indem die 5'-Primer von
dem CMV-Promotor und die 3'-Primer
aus den kodierenden Regionen ausgewählt wurden.
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Für die lacZ-Amplifikation
waren die Primer: 5'-Primer
5'-TTGGAGGCCTAGGCTTTTGC-3' (SEQ ID NO: 5) und
3'-Primer 5'-ATRCTGTCGTCGTCCCCTCA-3' (SEQ ID NO: 6).
Der erste PCR-Zyklus war
eine anfängliche
Inkubation bei 96 °C
für 4 Minuten,
gefolgt von 80 °C
für 3 Minuten,
währenddessen die
DNA-Polymerase zugegeben
wurde. Dem folgten 30 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 45 Sekunden,
58 °C für 45 Sekunden
und 72 °C
für 50
Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension von 72 °C für 5 Minuten.
5 μl des
ersten PCR-Produkts wurden
verwendet für
die zweite PCR mit dem 5'-Primer 5'-GGTAGAAGACCCCAAGGACTTT-3' (SEQ ID NO: 7) und
dem 3'-Primer 5'-CGCCATTCGCCATTCAG-3' (SEQ ID NO: 8).
Der erste PCR-Zyklus war eine anfängliche Inkubation bei 96 °C für 3 Minuten, gefolgt
von 80 °C
für 3 Minuten,
gefolgt von 32 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 60 Sekunden, 58 °C für 15 Sekunden
und 72 °C
für 90
Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72 °C für 5 Minuten.
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Für die VEGF-C-Amplifikation
waren die Primer: 5'-Primer
5'-CTGCTTACTGGCTTATCG-3' (SEQ ID NO: 9) und
3'-Primer 5'-CCTGTTCTCTGTTATGTTGC-3' (SEQ ID NO: 10).
Der erste PCR-Zyklus
war eine anfängliche
Inkubation bei 96 °C
für 4 Minuten,
gefolgt von 80 °C
für 3 Minuten,
währenddessen
die DNA-Polymerase
zugegeben wurde. Dem folgten 39 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 30 Sekunden,
56 °C für 40 Sekunden
und 72 °C für 90 Sekunden,
gefolgt von einer abschließenden Extension
von 72 °C
für 5 Minuten.
5 μl des
ersten PCR-Produkts
wurden verwendet für
die zweite PCR mit dem 5'-Primer 5'-TCTCCAAAAAGCTACACCG-3' (SEQ ID NO: 11)
und dem 3'-Primer 5'-CAAGTGCATGGTGGAAGG-3' (SEQ ID NO: 12).
Der erste PCR-Zyklus war eine anfängliche Inkubation bei 96 °C für 3 Minuten,
gefolgt von 80 °C
für 3 Minuten,
gefolgt von 39 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 60 Sekunden, 57 °C für 30 Sekunden
und 72 °C
für 90
Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72 °C für 5 Minuten.
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Für die VEGF-Amplifikation
waren die Primer: 5'-Primer
5'-TCGATCCATGAACTTTCTGC-3' (SEQ ID NO: 13)
und 3'-Primer 5'-TTCGTTTAACTCARGCTGCC-3' (SEQ ID NO: 14).
Der erste PCR-Zyklus
war eine anfängliche
Inkubation bei 96 °C
für 4 Minuten,
gefolgt von 80 °C
für 3 Minuten,
gefolgt von 39 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 30 Sekunden, 53 °C für 40 Sekunden
und 72 °C
für 90
Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension von 72 °C für 5 Minuten.
5 μl des
ersten PCR-Produkts wurden verwendet für die zweite PCR mit dem 5'- Primer 5'-GACCCTGGCTTTACTGCTG-3' (SEQ ID NO: 15)
und dem 3'-Primer 5'-GGAACATTTACACGTCTGCG-3' (SEQ ID NO: 16).
Der erste PCR-Zyklus war eine anfängliche Inkubation bei 96 °C für 3 Minuten,
gefolgt von 80 °C
für 3 Minuten,
gefolgt von 39 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 °C für 60 Sekunden, 54 °C für 30 Sekunden
und 72 °C
für 90
Sekunden, gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72 °C für 5 Minuten.
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Die
mRNA von lacZ, VEGF-C und VEGF wurde bis zu vier Wochen nach dem
Gentransfer in Aortawandgewebe nachgewiesen.
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Die
Gentransfereffizienz wurde durch Feststellung der lacZ-Expression, analysiert
mittels X-Gal-Färbung
auf β-Galaktosidase
Aktivität,
in OCT-eingebetteten Gewebeschnitten ermittelt. Die Transfektionseffizienz
betrug 1,1 %± 0,5
und 0,3% ± 0,1,
zwei bzw. vier Wochen nach dem intravaskulären kathetervermittelten Gentransfer.
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Beispiel 4
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Expression
von VEGF-Rezeptoren in der Aortawand
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Unter
Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Versuchstieren wurde
die VEGFR-1-, VEGFR-2- und VEGFR-3-Expression in Aortagewebe durch
Immunfärbung
und In-situ-Hybridisierung analysiert. Eine Immunhistochemie wurde
durchgeführt unter
Verwendung des Klons sc-316 (Santa Cruz Biotechnology, 1:50-Verdünnung),
um VEGFR-1 zu detektieren, des Klons sc-6251 (Santa Cruz Biotechnology,
1:500-Verdünnung),
um VEGFR-2 zu detektieren und des Klons sc-637 Santa Cruz Biotechnology, 1:300-Verdünnung),
um VEGFR-3 zu detektieren. Kontrollen für Immunfärbungen beinhalteten Inkubationen
mit klassen- und speziesangepaßten
Immunglobulinen und Inkubationen, bei denen primäre Antikörper weggelassen wurden. Die
In-situ-Hybridisierung von VEGF-Rezeptor-mRNAs wurde ausgeführt unter
Verwendung von 33P-UTP-markierten Ribosonden.
Die Expression aller Rezeptoren wurde in Endothel lokalisiert. VEGFR-2
wurde auch in neointimalen SMCs exprimiert.
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Beispiel 5
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Verwendung nackter VEGF-C-Transgen-Therapie zur
Verhinderung von Restenose
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Die
in Beispiel 1 oder 2 beschriebenen Verfahren werden wiederholt,
mit den folgenden Modifikationen. Anstatt der Verwendung eines Adenovirus-Vektors
für die
Zufuhr des VEGF-C-Transgens wird
ein Säugetier-Expressionsvektor
für den
direkten Gentransfer (von nackter Plasmid-DNA) konstruiert. Die
für VEGF-C
kodierende Sequenz ist funktionell mit einem geeigneten Promotor
wie dem CMV-Promotor verbunden, und vorzugsweise mit einer geeigneten
Poly-A-Sequenz wie der Poly-A-Sequenz
von menschlichem Wachstumshormon verbunden. Beispielhafte VEGF-C-Vektoren
können
aus Vektoren modelliert werden, die in der Literatur zur Durchführung eines
vektorfreien Gentransfers für
andere Wachstumsfaktoren beschrieben wurden, indem eine für VEGF-C
kodierende Sequenz an die Stelle einer für VEGF kodierenden Sequenz
gesetzt wird. Siehe zum Beispiels Isner et al., Circulation 91:2687-2692
(1995); und Isner et al., Human Gene Therapy 7:989-1011 (1996),
durch Inbezugnahme hier aufgenommen] Vektor. Ein ähnliches
Konstrukt, das ein lacZ-Gen umfaßt, wird als Kontrolle verwendet.
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Ein
hydrogelbeschichteter Ballonkatheter (Boston Scientific) wird verwendet,
um das VEGF-C-Transgen im wesentlichen wie in Asahara at al., Circulation
94: 3291-3302 (15. Dezember 1996), durch Inbezugnahme hier aufgenommen,
beschrieben, durchgeführt.
Kurz gesagt, wird ein Angioplastie-Ballon ex vivo durch vollständiges Vorschieben des
entleerten Ballons durch eine schützende Teflonhülle (Boston
Scientific) präpariert.
Der Ballon wird inflatiert und eine konventionelle Pipette wird
verwendet, um das Transgen-Konstrukt (z. B. 50-5000 μg Transgen-DNA
in einer Salzlösung)
auf dem Hydrogelpolymer, das die äußere Oberfläche des aufgeblasenen Ballons
beschichtet, aufzutragen. Nachdem die Transgen-Lösung getrocknet ist, wird der
Ballon entleert, in die Schutzhülle
zurückgezogen
und erneut aufgeblasen, um den Blutfluß um die Ballonoberfläche zu minimieren,
bis der Ballon in der Zielarterie richtig positioniert ist.
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Das
Intima/Media (I/M)-Verhältnis
wird erneut als Parameter für
die intimale Verdickung verwendet. Ein vermindertes I/M-Verhältnis wird
bei Tieren, die mit dem VEGF-C-Transgenbeschichteten Ballonkatheter
behandelt wurden, als Hinweis auf die therapeutische Wirksamkeit
angesehen. Wie in Beispiel 2 beschrieben, kann der Vergleich der
therapeutischen Wirksamkeit des VEGF-C-Gentransfers mit anderen
Therapien wie dem VEGF-Gentransfer parallel durchgeführt werden.
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Beispiel 6
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Verwendung der VEGF-C-Gentherapie
zur Verhinderung von Restenose im Anschluß an eine Angioplastie mit
Stent
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Die
in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Verfahren werden
wiederholt mit der Modifikation, daß die anfängliche Ballon-Angioplastie begleitet
wird von der Implantation eines koronaren Stents unter Verwendung
konventioneller Verfahren. Das VEGF-C-Transgen wird gleichzeitig
oder unmittelbar vor oder nach der Stent-Implantation im wesentlichen
wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben zugeführt. Erhöhte Mengen
(z. B. zweifache bis zehnfach) des Transgens (im Vergleich zu Angioplastie
ohne Stent) und eine erhöhte
Transfektionszeit können
erwünscht
sein, wie in Van Belle et al., J. Am. Coll. Cardiol. 29:1371-1379
(Mai 1997), durch Inbezugnahme hier aufgenommen, beschrieben. Eine
verminderte neointimale Verdickung und/oder verminderte thrombotische
Okklusion in den VEGF-C-Gen-behandelten Tieren gegenüber Kontrolltieren,
die mit einem Markergen behandelt wurden, wird als Beweis für die Wirksamkeit
der VEGF-C-Gentherapie angesehen.
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Beispiel 7
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Verwendung einer extravaskulären Manschette
zur Verminderung von Gefäßstenose
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Eine
inerte Silikon-Manschette, wie beispielsweise in der Veröffentlichung
der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/20027 beschrieben, wird
operativ um die Carotisarterien von weißen Neuseeland-Kaninchen implantiert.
Die Manschette agiert als Reizmittel, das eine intimale Verdickung
induzieren wird, und enthält
ein Reservoir, das zur lokalen Zufuhr einer pharmazeutischen VEGF-C-Transgen-
oder -Protein-Formulierung geeignet ist. Ein Gentransfer wird fünf Tage
später
unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen VEGF-C-Adenoviruskonstrukts
oder Kontrollkonstrukts durch Injektion von 108-1011 pfu in die Manschette initiiert. Die Tiere
werden 14 oder 28 Tage später
getötet
und histologische Untersuchungen werden wie in Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt. Intima/Media-Dickeverhältnisse
[Yla-Herttuala et al., Arteriosclerosis 6:230-236 (Nutzen 186)]
werden als Hinweis auf Stenose verwendet. Verminderte I/M-Verhältnisse
in den VEGF-C-transfizierten
Kaninchen im Vergleich zu lacZ-Kontroll-Kaninchen zeigt die therapeutische
Wirksamkeit des VEGF-C-Gentransfers zur Verhinderung von arterieller
Stenose.
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Beispiel 8
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Verwendung von VEGF-C-Polypeptiden
zur Verminderung oder Verhinderung von Restenose
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Die
in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren werden wiederholt, mit der
Ausnahme, daß anstatt der
Behandlung der Versuchstiere mit einem Adenovirus enthaltend ein
VEGF-C-Transgen oder lacZ-Kontrolle, die Tiere mit einer Zusammensetzung,
die ein VEGF-C-Polypeptid in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger (z.
B. isotonische Salzlösung
mit Serumalbumin) umfaßt
oder mit Trägerlösung allein
als Kontrolle behandelt werden. Die Versuchstiere erhielten entweder
10, 100, 250, 500, 1000 oder 5000 μg eines VEGF-C-Polypeptids mittels
intraarterieller Infusion, wie beispielsweise in Beispiel 1 beschrieben.
Eine zweite Gruppe von Tieren erhielt zusätzlich eine Injektion des VEGF-C-Polypeptids
7 Tage später.
Die Tiere wurden getötet
und eine histologische Untersuchung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt.
Verminderte I/M-Verhältnisse
in den VEGF-C-behandelten Tieren gegenüber Kontrolltieren bilden einen
Hinweis auf die therapeutische Wirksamkeit der VEGF-C-Polypeptid-Behandlung.
Von der Wiederholung des Experiments unter Verwendung verschiedener VEGF-C-Formulierungen
mit anhaltender Abgabe und von Materialien, wie sie oben beschrieben
sind, wird erwartet, daß sie
die therapeutische Wirksamkeit des VEGF-C-Polypeptids weiter verbessert.
Darüber
hinaus ist als Variante der Erfindung insbesondere ein Behandlungsschema
vorgesehen, das die gleichzeitige Verabreichung von VEGF-C-Protein (zur
Bereitstellung einer sofortigen Therapie für das Zielgefäß) mit einem
VEGF-C-Transgen (um eine anhaltende Therapie über mehrere Tage oder Wochen bereitzustellen)
umfaßt.
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Beispiel 9
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Anti-Stenose/Anti-Restenose-Aktivität von VEGF-D
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Die
in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Verfahren werden
unter Verwendung einer Zusammensetzung wiederholt, die ein VEGF-D-Polynukleotid
oder VEGF-D-Polypeptid anstelle des VEGF-C-Polynukleotids/-Polypeptids
umfaßt,
um die Fähigkeit
von VEGF-D zu demonstrieren, Stenose oder Restenose eines Blutgefäßes zu verhindern.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung anhand spezifischer Ausführungsformen
beschrieben worden ist, ist ersichtlich, daß dem Fachmann Variationen
und Modifikationen begegnen werden, die alle als Aspekte der vorliegenden
Erfindung gedacht sind. Entsprechend sollten der Erfindung lediglich
die aus den Ansprüchen
ersichtlichen Beschränkungen auferlegt
werden.