KR20010102932A - 안지오포이에틴-1을 포함하는 제약 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 혈관 내피세포 보호용 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물은 여러 가지 원인에 의해 발생되는 혈관 내피세포의 손상을 방지하는 데 효과적이기 때문에 특히 2차적으로 발병하는 혈관 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

안지오포이에틴-1을 포함하는 제약 조성물 및 그의 용도 {Pharmaceutical Composition Comprising Angiopoietin-1 and Use Thereof}

혈관 내피세포 층을 정상 상태로 유지하는 것은 인간의 정상적인 혈관구조와기능을 유지하는데 있어 필수적인 생명현상이다. 혈관 내피세포 층이 손상되면 동맥경화, 재협착, 비정상적인 혈관의 긴장, 혈전 등의 혈관 관련질환이 생기게 된다. 이러한 병리현상을 유도하는 대표적인 위협 인자로는 방사선, 고지질, 고당질, 세균독소 및 염증물질 등이 있다.

혈관 내피세포에 특이적인 단백질 성장인자 및 그 수용체들은 혈관을 생성하고 그들의 기능을 정상적으로 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 서로 관련된 5 개의 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)들과 그들의 수용체인 VEGF-R1, VEGF-R2 및 VEGF-R3는 혈관신생(vasculogenisis)과 혈관생성(angiogenesis)에 모두 관여하는 것으로 알려져 있다. 안지오포이에틴-1과 안지오포이에틴-2 및 그들의 수용체인 Tie-2 수용체도 성숙 혈관의 형성, 혈관 생성 및 혈관분화에 관련되어 있다.

안지오포이에틴-1은 최초에 혈관 내피세포에 특이하게 존재하는 Tie-2 수용체의 리간드로서 분리되었다 (Davis et al., Cell, 87, 1171-1180 (1996); 미국특허공보 US5,521,073). 사람의 안지오포이에틴-1과 안지오포이에틴-2는 약 75kDa의 분자량을 갖는 분비 단백질로서 약 60%의 서열 상동성을 보인다. 이들 두 단백질에 대한 생쥐의 동족체들도 동정되었다. 안지오포이에틴-1과 안지오포이에틴-2는 모두 N-말단에 마이오신(myosin)과 약한 상동성을 보이는 코일드-코일 도메인을 가지고 있으며, C-말단에는 피브리노겐-유사 도메인을 가지고 있다. 구조적으로 코일드-코일은 두 개 내지 세 개의 알파 헬릭스가 서로 얽혀 있는 것을 말한다. 안지오포이에틴-1과 안지오포이에틴-2는 Tie-2 수용체에 유사한 친화도로 결합하는데, 이들 둘은 혈관계를 유지하는 데 있어서 상호 길항적으로 작용을 하는 것으로알려져 있다.

안지오포이에틴-1의 기능은 그동안 여러 각도에서 연구되었다. 안지오포이에틴-1은 혈관 내피세포 주위의 세포들을 내피세포 쪽으로 이동시켜 혈관을 형성하게 하고 또한 혈액의 유출을 감소시킨다 (Thurston et al., Science, 286, 2511-2514 (1999); Thurston et al., Nat. Med., 6, 460-463 (2000); Suri et al., Cell, 87, 1171-1180(1996)). 생체외 (in vitro) 실험 결과에 의하면 안지오포이에틴-1이 혈관 내피세포의 발아작용(sprouting), 화학적 이동(chemotactic migration) 및 네트워크 형성(network formation) 등에도 관여한다고 한다 (Koblizek et al., Current Biol., 8, 529-532 (1998); Witzenbichler et al., J. Biol. Chem., 29, 18514-18521 (1998); Papapetropoulos et al., Lab Invest., 79, 213-223(1999)).

안지오포이에틴-1은 티로신 카이네이즈의 일종인 Tie-2 수용체와의 결합을 통해 생리 작용을 매개하는 것으로 이해되고 있는데, 특히 혈관신생 내지 생성 (vasculogenesis & angiogenesis)을 촉진한다는 면에서 다른 혈관생성 촉진인자인 혈관내피 성장인자 (VEGF), 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF) 등과 그 기능을 공유한다고 할 수 있다 (Gerber et al., J. Biol. Chem., 273, 13313-13316 (1998); Karsan et al., Am. J. Pathol., 151, 1775-1784 (1997)).

우리 혈관계는 질병 기타 외부 원인들에 의하여 다양한 경로를 통해 손상을 입게 된다. 이러한 경우의 혈관계 보호 내지 재생도 혈관생성 못지 않게 중요한 생명 현상 중의 하나이다. 그러나, 혈관의 생성과 이미 생성된 혈관을 유지하는것은 그 생리적 기작이 다르다고 할 수 있다. 지금까지 안지오포이에틴-1에 대한 연구는 위에 설명한 혈관생성 활성에 집중되어 있었다. 이에 본 발명자들은 안지오포이에틴 단백질을 연구하던 중 놀라웁게도 안지오포이에틴-1 단백질이 여러 가지 부작용, 특히 혈관 내피세포의 비이상적 증식을 초래하지 아니하면서 방사선, 고지질, 고당질, 세균독소 및 염증물질 등의 혈관 손상 요인으로부터 혈관을 보호하는 효과가 뛰어남을 알게 되었다. 안지오포이에틴-1이 혈관 보호제로 사용되는 경우 혈관의 증식을 초래하지 않는다는 것은 VEGF가 혈관 내피세포를 증식시키므로서 발암의 위험이 지적되고 있는 점에 비추어 볼 때 안지오포이에틴-1이 갖는 매우 유용한 특징 중의 하나라고 할 수 있다 (Ferrara and Davis-Smyth, Endocrine. Rev., 18, 4-25 (1997)).

본 발명은 혈관 내피세포를 비이상적으로 증식시키지 않으면서 혈관 내피세포의 손상을 방지하는, 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명에서 유전자 재조합 기법으로 제조한 안지오포이에틴-1 (100 ng)을, myc에 대한 항체 (왼쪽) 또는 안지오포이에틴-1에 대한 항체 (오른쪽)로 웨스턴 블로팅한 결과를 나타낸 사진이다.

도 2는 1차 배양된 혈관 내피세포를 이용하여 여러 가지 혈관 손상 원인에 대한 안지오포이에틴-1의 혈관 내피세포 보호 효과를 측정한 위상차 현미경 사진이다.

도 3은 1차 배양된 혈관 내피세포를 이용하여, 데옥시뉴클로오티딜 트랜스퍼라제 매개 dUTP 닉(nick) 말단 표지 (terminal deoxynucleotidyl transfe rase-mediated dUTP nick-end labeling: TUNEL) 방법에 의하여 여러 가지 혈관 내피세포 손상 원인에 대한 안지오포이에틴-1의 혈관 내피세포 보호 효과를 측정한 대표적인 현미경 사진이다.

본 발명은 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 생체 내에서 혈관 내피세포의 손상을 방지하기 위한 제약 조성물에 관한 것이다.

생명체의 혈관계를 적정 상태로 유지하는 것은 매우 중요한 생명 현상 중의 하나이다. 그러나, 실제로는 다양한 경로를 통하여 생체 내의 혈관 내피세포가 손상을 입게 되는 바 그러한 원인 중 일부를 열거하자면 다음과 같은 것들을 들 수 있다.

가) 혈관 재협착의 방지나 항암 치료 등을 위하여 혈관에 방사선을 조사하는 경우,

나) 뇌부종이나 신부전증을 치료하기 위하여 고농도의 만니톨을 투여하는 경우 (Malek et al., Stroke. 1998;29:2631-2640),

다) 대량의 수액 전해질 및/또는 혈액을 공급하는 경우,

라) 높은 농도의 TNF-α 농도를 수반하는 염증의 경우,

마) 리포폴리사카라이드 (LPS) 농도가 증가하는 그람음성균의 감염에 따른 패혈증의 경우 (10 ㎍/㎖) (Bannerman and Goldbaum, Lab. Invest., 79, 1181-1199 (1999)),

바) 고농도의 산화 저밀도 지단백질 (OxLDL)을 수반하는 고지질 또는 고콜레스테롤증 (hypercholesterolemia)의 경우,

사) 높은 농도의 혈중 무기 및/또는 유기 화합물이 체내에서 유발되는 경우,

아) 높은 농도의 항암제, 항염증제, 항생제, 항바이러스성 약물을 투여하는 경우.

이러한 원인에 의한 혈관 내피세포의 손상은 각각의 경우 특이하고 독자적인 경로를 거치지만 손상의 정도가 심화되면 세포가 죽음에 이르게된다 (Haunstetter and Izumo, Circ. Res., 82, 1111-1129 (1998)).

본 발명자들은 최초로 안지오포이에틴-1이 상기 언급한 임상적 환경에서 혈관 내피세포가 손상되는 것을 방지하는 데 매우 효과적임을 실험으로서 입증하였다. 따라서, 본 발명은 상기 열거한 원인으로부터 혈관 내피세포를 보호하는 제약 조성물을 제공한다. 상기 제약 조성물은 특히 혈관의 손상을 수반하는 질환의 예방 및 치료시 혈관 손상 원인과 함께 병용 투여할 수 있다.

혈관을 새롭게 생성하는 것(vasculogenesis 및 angiogenesis)과 이미 생성된 혈관을 손상요인으로부터 보호한다는 것은 말 그대로 별개의 과정이다. 따라서, 어떠한 물질이 혈관 세포의 생성을 촉진시킨다고 하여 그 물질의 혈관을 손상으로부터 보호할 수 있다는 것을 의미하는 것은 아니다. 그나마 이제까지 연구된 안지오포이에틴-1의 생리 효과는 1차 배양된 혈관 내피를 이용하여 실험실에서 인위적으로 조작한 혈청 제거 조건에서 이루어진 것들로서 (Kim et al., Circ. Res., 86, 24-29 (2000); Papapetropoulos et al., J. Biol. Chem., 275, 9102-9105 (2000)), 실제로 우리 신체에서 혈청이 제거되는 일은 일어날 수가 없기 때문에 상기 연구 결과들은 안지오포이에틴-1을 실제 임상 단계에 적용할 수 있는 용도를 제시하였다고 보기 어렵다.

나아가, 기존의 안지오포이에틴-1에 대한 연구들은 대부분 1차 배양된 인간제대정맥 내피세포 (HUVECs)를 사용하였다. 그러나, 동맥혈관에 죽종이나 혈전이 생겨 혈류의 공급에 지장이 있으면 각 장기에 허혈성 질환이 초래되기 때분에 임상적 측면에서 본다면 정맥 혈관 내피세포보다는 동맥혈관 내피세포의 손상 방지가 훨씬 중요하다. 또한 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥의 혈관질환은 심장에 손상을 줄 수 있으므로 관상동맥 혈관 내피 세포의 손상방지는 이러한 의미에서 가장중요한 의미를 갖는다. 심장의 모세혈관 내피세포의 보호 또한 심장의 생리적 기능을 유지하는데 필수적이다.

이에 본 발명자들은 상기 제대정맥, 폐동맥, 관상동맥 혈관 및 심장의 모세혈관 등의 내피세포를 1차 배양하여 안지오포이에틴-1의 손상방지 효과를 측정하였다. 생체처럼 혈관 내피세포의 구조적 위치를 유지하면서 세포에 대한 손상정도를 측정할 수 있는 "동맥의 생체외 배양방법 (arterial explant culture)" 은 안지오포이에틴-1의 임상에서의 생체 적용을 감안할 때, 세포 배양보다 더욱 현실적인 응용에 가까운 모형이다 (Merrick et al., Transplant Immunol., 5, 3-9 (1997)). 본 발명자들은 이러한 장점을 활용하여 돼지 관상 동맥의 생체외 배양방법을 확립하고 (실시예 3), 안지오포이에틴-1의 손상방지 효과를 측정하였다 (표 7).

본 발명의 조성물에 포함되는 안지오포이에틴-1은 천연형 또는 재조합 안지오포이에틴-1 또는 이들과 실질적을 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 말한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 안지오포이에틴-1과 그 기능적 동등물 (functional equivalent) 및 기능적 유도체 (functional derivative)가 포함된다.

상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 안지오포이에틴-1과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다. "기능적 유도체"는 상기 안지오포이에틴-1 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 안지오포이에틴-1과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 안지오포이에틴-1 단백질은 포유동물, 바람직하게는 사람으로부터 기원하는 단백질이며, 가장 바람직하게는 Gene Bank Accession 번호, U83508로 공지된 서열을 가진 단백질을 말한다.

본 발명에 사용된 안지오포이에틴-1은 예를 들어 공지의 서열 (예, Gene Bank Accession 번호, U83508 또는 미국특허공보 제5,521,073)로부터 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 안지오포이에틴-1의 유전자를 역전사효소 PCR 증폭법으로 증폭한 후, 그 cDNA를 포유류 발현벡터에 도입하여 발현시켰다 (실시예 1). 그러나 상기 방법은 본 발명 안지오포이에틴-1을 제조하는 방법의 일 예 일뿐 안지오포이에틴-1의 제조 방법이 상기 실시예에 제한되는 것은 아니다. 당업자가 활용할 수 있는 모든 방법에 의하여 본 발명에 사용되는 안지오포이에틴-1을 제조할 수 있다. 안지오포이에틴-1의 제조 방법은 바람직하게는 유전자 재조합 기법에 의한 것이다 (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).

천연형의 안지오포이에틴-1은 당질화 단백질(glycosylated protein)이다 (Davis et al., Cell, 87, 1171-1180 (1996)). 따라서 유전자 재조합 방법에 의하여 단백질을 제조하는 경우 이. 콜라이 (E. coli)나 곤충 세포를 이용하는 것 보다 포유동물 세포를 이용하는 경우가 단백질의 활성도나 용해성 측면에서 천연형의 것과 유사할 것으로 여겨진다 (Spector et al., In Cell, A Laboratory Manual; Protein expression and interactions, CSHL Press, 64-67 (1999)). 이 점에서 포유동물 세포에서 생성되는 유전자 재조합 안지오포이에틴-1 단백질이 본 발명 조성물의 제조에 특히 적합하다.

재조합 안지오포이에틴-1 단백질은 통상의 컬럼 크로마토그라피 방법 등을 이용하여 분리할 수 있다. 또한 단백질의 정제 정도는 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 등으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서와 같이 융합 단백질로 발현된 안지오포이에틴-1의 경우 c-myc에 대한 항체를 이용하거나 본 발명자들이 개발한 안지오포이에틴-1의 폴리클로날 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅 함으로써 정제 정도를 확인할 수 있다 (Sambrook et al., In Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSHL Press, 18.60-18.75 (1987)).

도 1은 본 발명에서 유전자 재조합 방법으로 생성한 안지오포이에틴-1 (100 ng)을 SDS-PAGE (아크릴아미드 8.0%)로 전개시키고 니트로셀룰로스막으로 전기이동 시킨 후 myc 항체 (왼쪽) 또는 안지오포이에틴 항체 (오른쪽)를 이용하여 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 발현된 단백질은 아미노산 서열을 통해 예상한 분자량 58 kDa보다 큰 약 70 kDa의 단백질이었으며 이는 안지오포이에틴-1이 당질화가 일어난 것임을 의미하는 것이다.

본 발명에서는 안지오포이에틴-1의 혈관 보호 효과를 측정하기 위하여 인간 제대정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cells; HUVECs), 돼지 폐동맥 내피세포 (porcine pulmonary artery endothelial cells; PPAECs), 돼지 관상동맥 내피세포 (porcine coronary artery endothelail cells; PCAECs), 돼지 심장 미세 혈관 내피세포 (poricine cardiac microcapillary endothelial cells; PCMECs)등을 사용하였다. 상기 세포들을 문헌에 기재된 방법 또는 이에서 약간 변형된 방법 (돼지 관상 동맥의 조직외 배양)에 따라 배양하였다.

본 발명에서는 안지오포이에틴-1의 혈관 보호 효과를 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 지금까지 수행된 안지오포이에틴-1 관련 연구의 문제점은 대부분의 실험이 생체외 (in vitro) 내지 인위적 혈장 제거 하에서 이루어졌다는 것이다. 그러나 이러한 결과는 실 임상에 적용하기 곤란한 문제점이 있다. 따라서 본 발명자들은 상기 혈관 세포들의 조직 배양을 통하여 실 임상에 적용할 수 있는 안지오포이에틴-1의 혈관 보호효과를 측정하였다 (실시예 2 및 실시예 3 참조).

본 발명의 안지오포이에틴-1을 포함하는 제약 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여 할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 안지오포이에틴은 당단백질로서 식염수 또는 완충액에 잘 용해되므로 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 안지오포이에틴-1을 정맥내 투여 또는 동맥내 주입에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다. 안지오포이에틴-1은 생체 내 존재하는 단백질이므로 하기 언급된 농도 범위에서 안정하게 투여할 수 있다.

안지오포이에틴-1은 생체 외 실험에서 약 200 ng/㎖의 농도에서 여러 손상에 대하여 약 30-50 % 정도의 혈관 내피세포 손상 방지 효과를 보이며, 1일 약 0.5 ㎎ 내지 약 1.8 ㎎, 바람직하게는 약 0.9 mg 내지 약 1.3 mg을 투여할 수 있다. 그러나, 약물대사나 생체인 점을 고려하여 1일 2∼10㎎ 정도를 1회 또는 수회 분할 투여함으로써 목적하는 효과를 얻을 수 있다. 그러나, 최종 투여량 및 투여 횟수는 환자의 상태, 연령 등을 고려하여 임상의 판단에 따라 필요한 범위에서 따라 조정될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 정맥 내 투여가 효과적이다. 정맥 내 투여시 안지오포이에틴-1 단백질이 직접 혈관 내피세포에 접촉되며 Tie2 수용체에 작용하기 때문이다. 그러나, 보다 더 국부적으로 강력한 효과를 얻고자 한다면 그 장기 부위의 동맥에 카테타 (catheter)를 삽입하고 국부 동맥내 주입 방법을 사용할 수 있다. 1회 주사보다는 일정 시간 동안 주입하는 방법이 혈관 내피세포에서의 생체활용성을 높여 치료 효과를 높일 수 있다는 점에서 유리할 수 있다. 그러나, 본 발명의 효과를 보이는 한 그 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 안지오포이에틴-1을 함유하는 조성물은 상기와 같은 손상 원인과 함께 병용 투여되는 경우 혈관 내피세포 증식효과가 관찰되지 않았다. 즉, 안지오포이에틴-1을 손상 원인과 함께 병용 투여하는 경우 혈관의 손상에 기인한 손상을 방지할 수 있지만 세포를 증식시키지 않기 때문에 혈관 내피세포 증식에 따르는 부작용, 즉 암의 유발 등이 없고, 혈관 내피세포 투과성에도 작용이 없어 이에 따른 부종 및 염증 등이 일어나지 않는다. 이와 같은 점은 안지오포이에틴-1이 임상에 안전하게 적용될 수 있다는 것을 시사하는 매우 유용한 특징 중의 하나이다.

이하에서, 본 발명의 실시형태를 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

안지오포이에틴-1의 생산 및 정제

인간 안지오포이에틴-1 cDNA에 대한 염기서열을 미 보건성에서 제공하는 (Gene Bank Accession 번호, U83508) 정보에 의하여 확인하였다. 안지오포이에틴-1 유전자를 성인 심장 cDNA (Clontech)를 주형으로 하여 역전사효소 PCR 증폭법으로 획득하였다. 유전자를 증폭을 위하여, 상기 안지오포이에틴-1의 핵산번호 (296-321) 및 핵산번호 (1786-1810)에 기초한 하기 서열의 프라이머를 각각 주문 제작하였다 (제이오텍,(대전)).

센스: 5＇-GTGCTGGATCCACAATGACAGTTTTC-3′, 융합 단백질용 BamH1

안티센스: 5＇-GCTTTCAGATATCTAAAGGTCGAAT-3＇, 융합 단백질용 EcoR5

사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 가지고 있는 포유류 세포 발현벡터인 pcDNA 3.1/Myc-His (Invitrogen)에 판매자의 매뉴얼 방법에 따라 상기에서 획득한 안지오포이에틴-1 cDNA를 도입하였다. 상기 벡터를 CMV-Ang1-M-H라고 명명하였다. 이 벡터는 코딩 부분의 3'-말단에 오픈 리딩 프레임으로서 c-myc (EQKLISEEDL)과 6x His (HHHHHH)을 암호화하는 DNA (63bp)를 가지고 있다. 따라서 상기 벡터로부터 안지오포이에틴-1 단백질의 카르복시 말단에 c-myc과 6개의 His 아미노산이 존재하는 융합 단백질이 생성된다. 안지오포이에틴-1에 융합된 6개의 His 아미노산 잔기는 니켈에 대한 선택적 친화성이 매우 높기 때문에 니켈-친화성 컬럼을 이용하여 융합 단백질을 간편하게 정제할 수 있고, 또한 c-myc에 대한 항체를 이용하여 안지오포이에틴-1을 정성적으로 분석할 수 있다.

리포펙타민 플러스 (Gibco BRL)를 이용하여 CMV-Ang1-M-H 벡터를 COS-7L세포 (Gibco BRL, 11622-016)에 유전자 전이하였다. 이 세포를 2% CHO-S-SFMⅡ배지 (Gibco BRL)에서, 5% CO₂-95% 공기 조건을 유지하면서 72시간 동안 37.5℃에서 배양하였다. 세포의 상층 배양액을 Ni-NTA 아가로스 칼럼 (Qiagen)에 로딩하고, 250 mM 이미다졸 (pH 8.0) 완충액으로 용출하여 안지오포이에틴-1 재조합 단백질을 제 1단계 분리하였다. 용출액을 TBS 완충액 (0.05 M Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl) 으로 투석하고, Centricon 10 (Amicon)을 이용하여 4℃에서 농축하였다. 염 제거용 컬럼을 이용하여 농축된 안지오포이에틴-1 재조합 단백질에 포함된 염을 제거하고 TBS 완충액을 이용하여 재구성(reconstitution)하였다. 안지오포이에틴-1 단백질의 정제와 재구성을 위하여 사용한 모든 완충액은 0.05%의 CHAPS를 포함하였다.

안지오포이에틴-1 재조합 단백질의 정제 정도를 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 통해 확인하였다 (Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970); Spector et al., In Cell, A Laboratory Manual; Protein expression and interactions, CSHL Press, Section 59.2 (1999)). 상기 염색에서 하나의 밴드만이 관찰되었다.

상기 밴드가 안지오포이에틴-1인지를 확인하기 위하여 c-myc에 대한 항체 또는 안지오포이에틴-1의 폴리클로날 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅하였다 (Sambrook et al., In Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSHL Press, Section, 18.60-18.75 (1987)). 구체적으로, 상기 정제된 안지오포이에틴-1 단백질(100 ng)을 SDS-PAGE (8 %)로 전개시키고, 니트로셀룰로스 막으로 전기이동시켰다. 차단(blocking) (3% BSA와 2% 무지방(non-fat) 우유) 완충액으로 1시간 동안 반응시킨 후 1차 항체를 첨가하였다. 사용한 1차 항체의 농도는, 항-c-myc 항체 (1:2,000) 또는 항-안지오포이에틴-1 항체(1:1,000) 이었다. 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 2차 항체(1:2,000)로 1시간 동안 실온에서 다시 반응시켰다. 2차 항체는 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제가 결합된 항토끼 면역글로불린 항체 (Amersham) 또는 항생쥐 면역글로불린 항체이다. 전기화학발광 방법에 의해 인광시킨 후 포스포이미지(phosphoimage) 분석기 (LAS-1000, Fuji)를 이용하여 안지오포이에틴-1 밴드를 검출하였다.

결과를 도 1에 나타내었다. 약 70 kDa 크기의 단백질이 검출되었다. 안지오포이에틴-1 재조합 단백질의 아미노산 구성상 예측되는 분자량은 58 kDa이다.

천연 안지오포이에틴-1 단백질에는 당질화 부위가 여럿 존재한다. 재조합 안지오포이에틴-1 단백질에 PNGase-F를 제조 회사 (New England Biolab)의 지시에 의해 처리하였을 때, 처리전 분자량 약 70 kDa이 예상 분자량 58 kDa로 감소되었다. 상기 결과는 재조합 생성된 안지오포이에틴-1이 당질화된 단백질인 것임을 시사하는 것이다. 단백질의 당질화는 단백질의 활성도에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

실시예 2

혈관 내피세포의 배양

인간 제대정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cells; HUVECs)와 돼지 폐동맥 내피세포 (porcine pulmonary artery endothelial cells; PPAECs)를 자페 등의 방법에 의해 분리 배양하였다 (Jaffe et al., J. Clin. Invest., 52, 2745-2756, (1973)). 돼지 관상동맥 내피세포 (porcine coronary artery endothelail cells; PCAECs)를 곽 등의 (Kwak et al., Circulation, 101, 2317-2324 (2000)) 방법에 의해 분리 배양하였다.

돼지 심장 미세 혈관 내피세포 (poricine cardiac microcapillary endothelial cells; PCMECs)는 니시다 등의 방법에 의해 분리 배양하였다 (Nishida et al., Am. J. Pathol., 264, H639-H652 (1993)). 배양된 세포의 순도는, 인간 혈관 내피세포는 폰 빌레브란드 (von Willebrand) 인자 항체를 이용하여 면역 형광법으로 확인하였고, 돼지 혈관 내피세포는 Dil-표지된 아세틸화 저밀도 지단백질 (Molecular Probes) 또는 FITC-표지된 Ulex europaeus I 렉틴의 흡수도를 통해 확인하였다. 이때 95%이상 양성 반응을 보이는 세포들을 실험에 사용하였다.

HUVECs는 M199 배지에, 돼지 혈관 내피세포들은 DME 배지에서 배양하였으며 37℃, 5% CO₂- 95% 공기 조건하에서 20% 소혈청을 각각 첨가하여 배양하였다. 이 실험에 사용한 1차 배양세포들은 2주기와 4주기 사이의 세포들이었다.

실시예 3

돼지 관상동맥의 조직외 배양

돼지 관상 동맥의 조직외 배양은 메리크 등의 방법에 의하되 약간의 변형을 가하여 실시하였다 (Merrick et al., Transplant. Immunol., 5, 3-9, 23 (1997)). 도축장에서 분리한 돼지 심장의 좌측 관상동맥 기시부에서 전방 양측 심실 동맥의 중앙부까지 5-7 ㎝의 동맥을 조심스럽게 분리하여 완충액으로 세척한 뒤, 4℃ 하에서 실험실로 운반하였다. 분리된 관상동맥을 5 ㎜ 간격으로 절단하여 5% 소혈청이 들어있는 DME 배지에서 천천히 흔들면서 배양하였다. 방사선 조사를 위해서 현관을 세로로 절단하여 혈관 내피가 노출되도록 하였다.

실시예 4

혈관 내피세포의 손상 또는 손상의 유발

1차 배양된 혈관 내피세포들은 젤라틴 코팅된 24-웰 플레이트에 웰당 5 ×10⁴세포를 분주한 다음 10% 소혈청이 들어 있는 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 다음 혈청제거로 손상을 유발하였다. 이는 실험실적 방법이며 HUVECs와 다른 세포와의 비교실험에 준하였다.

절단된 돼지 관상동맥들은 24-웰 플레이트에 넣고 5% 소혈청이 들어있는 배지에서 1-2시간 동안 배양하였다. 임상적 적용을 감안하여 1차 배양된 혈관 내피세포 또는 조직외 배양된 관상동맥 내피세포의 손상나 손상을 유발하기 위하여 다음과 같은 방법을 실시하였다.

방사선 치료시 조사되는 방사선 해당 양을 방사전 조사를 위한 선형가속기 (linear accelerator)를 이용하여 조사하였다 (2 Gy/min for 5min, 6MV X-ray, Simens).

고농도 만니톨에 의한 혈관 손상을 유도하기 위하여 뇌부종 치료에 사용하는 만니톨의 최대농도를 감안하여 배양액 중의 만니톨 농도가 300 mOsm이 되도록 하였다 (Malek et al., Stroke, 29, 2631-2640 (1998)).

고지질에 의한 혈관 손상을 유도하기 위하여 혈중 OxLDL 농도를 감안하여 배양액의 OxLDL이 50 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖이 되도록 하였다 (Steinberg, J. Biol. Chem., 272, 20963-20966 (1997)).

염증에 의해 유발되는 혈관 손상을 유도하기 위하여 염증세포들에서 분비되어 국부적으로 증가하는 TNF-α (20 ㎍/㎖)를, 생존자극계를 차단하기 위한 시클로헥사미드 (20 ㎍/㎖)와 함께 동시에 처리하였다 (Ledgerwood et al., Lab.Invest., 79, 1041-1050 (1999)).

고당질에 의한 혈관 손상을 유도하기 위하여 그람 음성균의 감염에 따른 패혈증시에 증가하는 리포폴리사카라이드 (LPS) (10 ㎍/㎖)를, 생존자극계를 차단하기 위하여 시클로헥사미드 (20 ㎍/㎖)와 함께 동시에 처리하였다 (Bannerman and Goldbaum, Lab. Invest., 79, 1181-1199 (1999)).

실시예 5

혈관 내피세포의 손상 또는 손상의 측정

1차 배양된 세포의 손상량을 김 등의 방법에 의해 정량적으로 측정하였다 (Kim et al., Circ. Res., 86, 24-29 (2000)). 손상되거나 괴사되어 부유한 세포들을 채집하고, 일단 부착된 세포는 트립신 처리하여 떼어낸 다음 쿨터 카운터를 이용하여 부유한 세포수와 부착된 세포수를 측정하였다. 부착된 세포 중에도 고사된 세포가 있으므로 이를 측정하기 위하여 동일하게 처리하여 부착된 세포 중에서의 세포손상은 1% 파라포름알데히드로 고정한 후 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 dUTP 닉 말단 표지 (TUNEL) 측정 키트 (Oncor)를 이용하여 측정하였다. TUNEL 반응에 양성인 세포들을 400배 확대하여, 4 개의 지역에서 무작위로 250 여개씩 골라 세었다. 세포 손상율은 주어진 세포수에 대한 손상되어 부유한 세포수와 부착되어 손상한 세포수를 합한 수의 비율로 측정하였다.

조직외 배양된 돼지 관상동맥의 내피세포의 손상 및 손상 측정은 곽 등의방법에 의하였다 (Kwak et al., Circualtion, 101, 2317-2324 (2000)). 처리 후 동맥 절편을 완충액으로 씻어준 후 10% 중성 포르말린으로 고정하고 파라핀 포매하였다. 조직 절편의 두께는 8 ㎛이었다. 혈관 내피세포의 특수 염색을 위하여 CD31 단일항체 (Clone JC70A, DACO)를 이용하였고, TUNEL 방법으로 세포손상을 측정하였다. 염색한 관상동맥 절편들은 CCD 카메라와 모니터가 장착된 현미경을 이용하여 확대하여 혈관 내피세포수와 손상된 혈관 내피세포수를 세었다. 각 군마다 상이한 관상동맥으로부터 분리된 7-8개의 절편들을 이용하였다. 각 관상동맥 조직 절편은 375 ±4 (n=22)의 혈관 내피세포들을 포함하였다. 조직외 배양된 돼지 관상동맥의 혈관 내피 생존률은 [(CD31양성세포수-TUNEL 양성 내피 세포수)/375] ×100 으로 계산하였다.

도 2는 여러 손상 방법에 의해 손상된 1차 배양된 혈관 내피세포에 안지오포이에틴-1을 투여하여 세포의 손상을 방지하는 효과를 측정한 위상차 현미경 사진이다. 안지오포이에틴-1을 투여한 경우 혈관 내피세포의 손상이 효과적으로 방지되었다.

도 2에서 Control(음성대조군)은 손상을 주지 않은 대조군을, Insult는 각종 손상군을, Insult + Ang1은 각종 손상군에 안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖)을 투여한 군을 의미한다. 도 2에 나타낸 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다.

Serum Deprivation : 혈청제거, PCAECs에서 48시간 후

Irradiation : 방사선 조사 (10 Gy), PCAECs에서 48시간 후

Mannitol : 만니톨 처리 (300 mOSm), PPAECs에서 3시간 후

LPS : LPS (10 ㎍/㎖)와 시클로헥사미드 처리 (20 ㎍/㎖), PCAECs에서 24시 간 후

TNF-α : TNF-α (20 ㎍/㎖)와 시클로헥사미드 처리 (20 ㎍/㎖), PCMCECs에 서 24시간 후

OxLDL : OxLDL (50 ㎍/㎖) 처리, PCAECs에서 12시간 후

각종 손상에 따라 다른 형태의 세포손상이 관찰되었다. 안지오포이에틴-1 은 부유 손상 세포의 수를 감소시켰다.

도 3은 말단 데옥시뉴클로오티딜 트랜스퍼라제 매개 dUTP 닉(nick) 말단 표지(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL) 방법을 사용하여 여러 손상 방법에 의해 손상되는 1차 배양된 혈관 내피세포의 안지오포이에틴-1 투여에 의한 손상 방지 효과를 보여주는 사진이다.

도 3에서, Control(음성대조군)은 손상을 주지 않은 대조군을, Insult는 각종 손상군을, Insult + Ang1은 각종 손상군에 안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖)을 투여한 군을 의미한다. 도 3에 나타낸 용어는 도 2의 경우와 같다.

도 3에서도, 각종 손상에 따른 TUNEL 양성 세포의 증가가 관찰되었으며, 안지오포이에틴-1 투여에 의해 손상된 TUNEL 양성 세포의 수가 감소되었다.

실시예 6

혈청 제거시 유도되는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 방어 효과

배양된 혈관 내피세포를 이용하여 안지오포이에틴-1의 혈청 제거에 따른 세포손상 방지 효과를 측정하였다. 결과를 표1에 요약하였다. 혈청을 24시간 동안 제거한 경우 대조군의 세포손상이 3.1%에서 29.9%로 증가하였다. PPAECs, PCAECs와 PCMCECs에서 혈청을 48시간 동안 제거한 경우 대조군의 세포손상이 3.0 ~ 5.3%에서 18.6 ~ 29.9%로 증가하였다. 상기 혈청 제거와 함께 안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖)을 동시 투여하고 세포 손상율을 측정하였다. 안지오포이에틴-1은 HUVECs에서 51%, PPAECs에서 49%, PCAECs에서 45% 및 PCMCECs에서 50% 정도 세포손상을 감소시켰다 (표 1).

배양된 혈관 내피세포에서 혈청제거시 일어나는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 효과

시험세포	10% 혈청 대조군세포 고사율	혈청제거시 세포 고사율
		대조 완충액	안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖) 투여군
HUVECs(24시간 후)(n=6)	3.1±1.3	29.9*±3.1	14.8#±2.0
PPAECs(48시간 후)(n=6)	4.5±2.2	23.0*±3.3	11.8#±2.4
PCAECs(48시간 후)(n=6)	3.0±1.6	18.6*±2.5	10.3#±1.8
PCMCECs(48시간 후)(n=6)	5.3±1.3	29.6*±2.4	14.8#±2.7
평균±표준편차, 통계처리는 Stuent non-paired t-test*P<0.05 vs 대조군 ;#P<0.05 vs 대조완충액

실시예 7

방사선 조사시에 유도되는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 방어 효과

배양된 혈관 내피세포를 이용하여 안지오포이에틴-1의 방사선 조사에 따른 세포손상 방지 효과를 측정하였다. 결과를 표2에 요약하였다. 방사선을 조사하지 않은 HUVECs와 PCAECs의 혈관손상율은 24시간과 48시간 경과 후 약 4% 정도에 머물렀다. 그러나 방사선 10 Gy를 조사한 경우 각각 23.3%와 19.3%의 세포손상이 유발되었다 (표 2). 방사선 조사와 함께 안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖)를 동시 투여한 경우 HUVECs에서는 41%, PCAECs에서는 40%정도로 세포손상이 감소하였다 (표 2).

배양된 혈관 내피세포에서 방사선 조사시 발생하는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 효과

시험 세포	대조군세포손상율	방사선 조사(10 Gy)시 세포 손상율
		대조 완충액	안지오포이에틴-1 (200ng/㎖) 투여군
HUVECs(24시간 후)(n=6)	4.3±1.0	23.3*±3.5	13.7#±3.4
PCAECs(48시간 후)(n=6)	3.6±1.1	19.3*±2.0	11.5#±1.6
평균±표준편차, 통계처리는 Stuent non-paired t-test*P<0.05 vs 대조군 ;#P<0.05 vs 대조완충액

실시예 8

만니톨에 의해 유도되는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 방어 효과

배양된 혈관 내피세포를 이용하여 안지오포이에틴-1의 과량의 만니톨 투여에 따른 세포손상 방지 효과를 측정하였다. 결과를 표3에 요약하였다. 만니톨을 투여하지 않은 대조군 실험에 있어서, HUVECs, PCAECs 및 PCMCECs은 6시간 후에 약 1.4-2.2% 정도의 세포손상율을 보였다. 만니톨 (300 mOSm)을 투여한 경우의 세포손상율은 각각 41.95%, 24.7% 및 26.3%이었다. 그러나, 안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖)을 통시 투여한 경우 HUVECs에서는 32%, PCAECs에서는 41% 및 PCMCECs에서는 27% 만큼 세포손상이 감소되었다 (표 3).

배양된 혈관 내피세포에서 만니톨 투여시 발생하는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 효과

시험 세포	대조군세포 손상율	만니톨 (300mOSm) 투여시 세포 손상율
		대조 완충액	안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖) 투여군
HUVECs(6시간 후)(n=6)	2.2±0.7	41.9*±4.7	28.6#±5.1
PPAECs(6시간 후)(n=6)	1.4±0.4	24.7*±3.8	14.5#±2.7
PCMCECs(6시간 후)(n=6)	1.8±0.3	26.3*±2.7	19.3#±1.6
평균±표준편차, 통계처리는 Stuent non-paired t-test*P<0.05 vs 대조군 ;#P<0.05 vs 대조완충액

실시예 9

LPS에 의해 유도되는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 방어 효과

배양된 혈관 내피세포를 이용하여 안지오포이에틴-1의 과량의 만니톨 투여에 따른 세포손상 방지 효과를 측정하였다. 결과를 표4에 요약하였다. 만니톨을 투여하지 않은 음성대조군에 있어서, HUVECs 및 PCAECs는 12시간 후의 대조기간 동안 4% 정도의 세포손상이 발생하였다. LPS (10 ㎍/㎖)와 시클로헥사미드 (20 ㎍/㎖)를 투여한 실험군에서는 각각 33.6%와 25.5%의 세포손상이 유발되었다. 상기 만니톨과 함께 안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖)을 동시 투여한 경우 HUVECs에서 49% 및 PCAECs에서는 42%의 세포손상 감소 효과를 보였다 (표 4).

배양된 혈관 내피세포에서 리포폴리사카라이드(LPS) 투여시 발생하는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 효과

시험 세포	대조군세포 손상율	리포폴리사카라이드 (10 ㎍/㎖) 투여시 세포 손상율
		대조 완충액	안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖) 투여군
HUVECs(12시간 후)(n=6)	5.5±1.9	33.6*±3.4	17.0#±2.4
PCAECs(12시간 후)(n=6)	3.2±1.0	25.5*±3.6	14.8#±1.5
모든 배양된 세포에 시클로헥사미드 (20 ㎍/㎖)를 전처리하였음.평균±표준편차, 통계처리는 Stuent non-paired t-test*P<0.05 vs 대조군 ;#P<0.05 vs 대조완충액

실시예 10

TNF-α에 의해 유도되는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 방어 효과

배양된 혈관 내피세포를 이용하여 TNF-α에 의해 유도되는 세포손상에 대한안지오포이에틴-1의 세포손상 방지 효과를 측정하였다. 결과를 표5에 요약하였다. 음성 대조군 실험에서 TNF-α를 처리하지 않은 경우 HUVECs 및 PCMCECs는 24시간 후 약 6% 정도의 세포손상율을 나타내었다. TNF-α (20 ㎍/㎖)와 시클로헥사미드 (20 ㎍/㎖)를 투여한 경우 각각 34.5%와 36.1%의 세포손상이 유발되었다. 그러나 TNF-α와 함께 안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖)을 동시 투여한 경우 HUVECs에서 35% 및 PCMCECs에서는 37% 정도의 세포손상 감소 효과가 관찰되었다 (표 5).

배양된 혈관 내피세포에서 TNF-α 투여시 발생하는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 효과

시험 세포	10% 혈청 대조군세포 손상율	TNF-α (20㎍/㎖) 투여시 세포 손상율
		대조 완충액	안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖) 투여군
HUVECs(24시간 후)(n=6)	6.4±1.5	34.5*±3.9	22.3#±2.7
PCMCECs(24시간 후)(n=6)	5.1±1.0	36.1*±3.0	22.6#±3.2
모든 배양된 세포에 시클로헥사미드 (20 ㎍/㎖)를 전처리하였음.평균±표준편차, 통계처리는 Stuent non-paired t-test*P<0.05 vs 대조군 ;#P<0.05 vs 대조완충액

실시예 11

산화된 저밀도 지단백질(OxLDL)에 의해 유도되는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 방어 효과

배양된 혈관 내피세포를 이용하여 TNF-α에 의해 유도되는 세포손상에 대한안지오포이에틴-1의 세포손상 방지 효과를 측정하였다. 결과를 표6에 요약하였다. OxLDL을 처리하지 않은 음성대조군 실험에서 HUVECs 및 PCAECs는 12시간 후 약 4% 정도의 세포손상율을 보였다. OxLDL (50 ㎍/㎖)을 투여한 경우 각각 35.8%와 28.4%의 세포손상이 유발되었다. 그러나, OxLDL (50 ㎍/㎖)과 함께 안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖)를 동시 투여한 경우 HUVECs에서 41% 및 PCMCECs에서는 40% 정도의 세포손상 감소 효과가 관찰되었다 (표 6).

배양된 혈관 내피세포에서 OxLDL 투여시에 발생하는 세포손상에 대한 안지오포이에틴-1의 효과

시험 세포	대조군세포 손상율	OxLDL (50㎍/㎖) 투여시 세포 손상율
		대조 완충액	안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖) 투여군
HUVECs(12시간 후)(n=6)	4.6±1.1	35.8*±2.8	21.3#±2.1
PCAECs(12시간 후)(n=6)	3.1±0.7	28.4*±3.4	16.9#±2.7
평균±표준편차, 통계처리는 Stuent non-paired t-test*P<0.05 vs 대조군 ;#P<0.05 vs 대조완충액

실시예 12

돼지관상동맥에서 여러 유해물질이 일으키는 내피세포 손상에 대한 안지오포이에틴-1의 효과

조직외 배양된 돼지 관상동맥을 이용하여 여러 유해물질에 의해 유도되는 세포손상에 대한안지오포이에틴-1의 세포손상 방지 효과를 측정하였다. 결과를 표7에 요약하였다. 돼지 관상동맥을 분리하여 아무 처리도 하지 않은 채 조직외 배양을 실시하였을 때 12 내지 24시간 사이에 혈관 내피세포가 6-7%정도 사멸하었다. 이러한 배양상태에 상기 실시예의 방법대로 방사선 조사 (10 Gy), LPS (10 ㎍/㎖) 또는 OxLDL (100 ㎍/㎖) 처리를 하였다. 24시간 후에 세포 손상율을 측정한 경우 상기 자극에 대하여 각각 19%, 29% 또는 18%의 혈관 내피세포가 사멸되었으며, 만니톨 (300 mOSm) 처리 12시간 후에 는 38% 정도의 혈관 내피세포가 사멸되었다. 그러나, 동일 조건에서 안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖)을 동시 투여한 경우에는 방사선 조사시 7.2%, 만니톨 투여시 12.3%, LPS 투여시 14.9%, OxLDL 투여시 13.3%의 유의한 생존 증가 효과를 보였다 (표 7).

조직외 배양된 돼지 관상동맥에서 여러 유해물질에 의한 내피세포 손상에 대한 안지오포이에틴-1의 효과

유해 물질의 종류	대조군세포 생존율	유해물질 처리시의 세포 생존율
		대조 완충액	안지오포이에틴-1 (200 ng/㎖) 투여군
방사선 (10 Gy)(24시간 후)(n=5)	93.3±2.7	80.7*±2.2	87.9#±2.3
만니톨 (300 mOSm)(12시간 후)(n=5)	94.3±2.5	61.5*±5.3	76.1#±3.9
LPS (10 ㎍/㎖)(24시간 후)(n=5)	94.9±3.0	70.5*±4.6	85.4#±3.8
OxLDL (100 ㎍/㎖)(24시간 후)(n=5)	94.4±3.1	68.5*±3.2	81.8#±4.5
평균±표준편차, 통계처리는 Stuent non-paired t-test*P<0.05 vs 대조군 ;#P<0.05 vs 대조완충액

이상 상기 실시예에서 설명한 바와 같이 본 발명의 안지오포이에틴-1을 함유하는 제약 조성물은 여러 가지 원인에 의하여 생체 내 혈관 내피세포가 손상을 입는 것을 방지하는 효과가 뛰어나다. 따라서 상기 조성물은 혈관을 보호하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 특히 유용한 적용 분야는 암의 방사선 치료시, 뇌부종이나 급성 신부전 치료를 위한 만니톨 투여시 등과 같이 혈관 손상이 예견되는 치료방법에 있어서 안지오포이에틴-1을 함유하는 조성물을 병용 투여하거나, 박테리아성 패혈증 등 혈관 손상이 진행되는 질병에 있어서 추가적인 혈관의 손상을 방지하기 위한 목적으로 본 발명의 조성물을 사용하는 것이다.

Claims (9)

1. 혈관 내피세포를 증식시키지 않으면서 혈관의 손상 요인에 대하여 혈관 내피세포을 보호하는 것으로서, 상기 혈관의 손상 요인과 병용 투여되는 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
2. 혈관 내피세포를 증식시키지 않으면서 방사선 조사에 의한 혈관의 손상에 대하여 혈관 내피 세포를 보호하는 것으로서, 상기 방사선 조사와 병용 투여되는 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
3. 혈관 내피세포를 증식시키지 않으면서 만니톨 투여에 의한 혈관의 손상에 대하여 혈관 내피 세포를 보호하는 것으로서, 뇌부종이나 신부전시 만니톨과 병용 투여하기 위한 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
4. 혈관 내피세포를 증식시키지 않으면서 리포폴리사카라이드의 증가를 수반하는 패혈증에 동반되는 혈관 손상으로부터 혈관 내피 세포를 보호하는 것으로서, 패혈증 치료제와 병용 투여하기 위한 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
5. 혈관 내피세포를 증식시키지 않으면서 TNF-α의 증가를 수반하는 염증에 동반되는 혈관 손상에 대하여 혈관 내피 세포를 보호하는 것으로서, 염증 치료제와 병용 투여하기 위한 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
6. 혈관죽종 패쇄 치료를 위한 경피적 동맥 풍선 확장술시 투여하는, 혈관 내피세포를 증식시키지 않으면서 혈관 손상에 대하여 혈관 내피 세포를 보호하는, 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
7. 혈관 내피세포를 증식시키지 않으면서 산화 저밀도 (OxLDL)을 수반하는 고콜레스테롤증 (hypercholesterolemia)에 동반되는 혈관 손상에 대하여 혈관 내피 세포를 보호하는, 고콜레시트로증 치료제와 병용 투여하기 위한 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
8. 혈관 내피세포를 증식시키지 않으면서 항암제, 항생제 또는 항바이러스제의 투여에 의한 혈관 손상에 대하여 혈관 내피세포를 보호하는, 상기 약물과 병용 투여하기 위한 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
9. 혈관 내피세포를 증식시키지 않으면서 다량의 수액 전해질 및 혈액 공급시 수반되는 혈관 손상에 대하여 혈관을 보호하는, 상기 수액 전해질 및 혈액과 병용 투여하기 위한 안지오포이에틴-1 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.