KR101293483B1

KR101293483B1 - 안지오포이에틴 1을 포함하는 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101293483B1
Application number: KR1020110111275A
Authority: KR
Inventors: 이은희; 조정현; 우진석
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-08-08
Also published as: KR20130046730A

Abstract

본 발명은 안지오포이에틴 1을 포함하는 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 안지오포이에틴 1이 골격근 세포의 증식 및 분화를 촉진하고, 골격근의 흥분-수축 기능에 필수적인 칼슘 조달 능력을 향상시킴을 규명하여, 이를 골격근 위축 또는 근육감소증을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.

Description

안지오포이에틴 1을 포함하는 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating muscle atrophy or sarcopenia comprising angiopoietin 1}

본 발명은 안지오포이에틴 1이 골격근 세포의 증식 및 분화를 촉진하고, 골격근의 흥분-수축 기능 (excitation-contraction couploing)에 필수적인 칼슘 조달 능력을 향상시키므로 이를 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료 용도로 사용하는 안지오포이에틴 1을 포함하는 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

안지오포이에틴 (angiopoietin, 또는 Ang) 단백질의 주된 역할은 혈관을 형성하는 혈관내피 세포 (endothelial cell)의 분화를 촉진하여 혈관신생 (angiogenesis)이 일어나게 하는 성장인자 (growth factor)인 것으로 알려져 있다. 최근에 Ang 단백질이 줄기 세포들이나 면역 세포들의 증식 (proliferation)에도 직간접적으로 영향을 미친다는 것이 알려졌다.

현재까지 4 종류의 Ang 단백질이 체내에 존재하는 것으로 알려져 있고, 이 중 Ang1과 Ang2는 혈관 성숙에 필수 단백질로 알려져 있다. 최근에, Ang1과 Ang2가 골격근을 만드는 줄기세포인 골격근 전구 세포 (myosatelite cell, skeletal muscle precursor cell, skeletal muscle progenitor cell 등의 다양한 이름으로 명명 되고 있음)에도 발현되는 것으로 알려졌다.

골격근 위축 (skeletal muscle atrophy, muscular atrophy, neurotrophic muscular atrophy, 또는 neurogenic muscular atrophy 등으로 명명)은 근육의 양이 부분적으로 줄거나 완전히 소실되는 현상을 보이며, 외상에 따른 탈신경에 의한 골격근 위축, 안정 와상이나 관절 고정 등에 의한 부동으로 발생하는 골격근 위축 (폐용성 골격근 위축 (muscle disuse atrophy))으로 나뉘고, 폐용성 골격근 위축은 앞으로의 고령화 사회에서는 보다 증가 추세이다. 골격근 위축은 각종 질병들에 의한 근육으로의 혈액 공급 감소, 또는 그에 따른 움직임과 운동 부족 (immobilization), 지속적인 체중 감소, 영양 불량 상태 (malnutrition or starvation), 근육에 연접한 탈신경 (denervation), 암, 에이즈, 울혈심부전 (congestive heart failure), 만성 폐쇄폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease), 신부전 (renal failure), 심각한 화상 (severe burns) 등에 의해 나타나, 그 자체로는 단시간에 생명을 위협하지는 않으나 삶의 질을 현격히 떨어뜨린다.

또한 골격근 위축과 같은 증상을 보이나 건강한 사람이 나이 (aging)가 들어감에 따라 나타나는 근육감소증 (sarcopenia) 역시 증가 추세이다.

고령화 사회에 증가 추세인 골격근 위축 및 근육감소증 (sarcopenia)을 예방하고 골격근 위축 환자의 골격근을 개선할 수 있는 효과적인 약제는 미비한 실정이다.

1. 미국 공개특허 제2005-0287151호, 2005.12.29 2. 대한민국 공개특허 제2001-0102932호, 2001.11.17

1. Rana Abou-Khalil et al. Cell Stem Cell, vol.5, pp.298-309, 2009.09.04

본 발명의 목적은 안지오포이에틴 1의 골격근 세포에서의 약제학적 용도를 규명함으로써 새로운 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료에 사용하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 안지오포이에틴 1(angiopoietin 1 또는 Ang1) 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 포함하는 골격근 위축(skeletal muscle atrophy) 또는 근육감소증(sarcopenia)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 안지오포이에틴 1이 골격근 세포의 증식 및 분화를 촉진하고, 흥분-수축 기작의 핵심 과정인 세포질 내 칼슘 조달 능력을 향상시키며, 흥분-수축 기작에 필수적인 칼슘과 연관된 단백질의 발현 역시 증가시킴을 규명함으로써 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 Ang1 존재에 의한 골격근 세포 증식의 증진 여부를 측정한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 Ang1 유무에 따른 12 시간 후 세포 수의 변화를 나타낸 것이고 (하단의 흰색 막대자는 100 μm), (B)는 (A)의 결과를 표준화비율 (%) 하여 막대 그래프로 도식화한 것이다. *는 Ang1 무처리 상태에서 12 시간 후 세포의 수를 0 시간 세포 수에 대해서 표준화비율로 나타낸 것과의 비교에서 유의차가 P<0.05 일 경우에 별표 (*)로 표시하였다.
도 2는 Ang1 존재에 의한 골격근 세포 분화의 증진을 나타내는 전자현미경 사진도이다 (하단의 흰색 막대자는 100 μm).
도 3은 Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포 (myotube)에서 골격근 수축을 유도하는 자극들에 의한 칼슘 이동 변화를 나타낸 것으로, (A)는 Ang1 (50 ng) 존재 하에서 골격근 세포를 증식 및 분화시켜 얻은 분화된 골격근 세포 (D-1)와, 증식은 Ang1 이 없는 상태에서 이루어지고 분화는 Ang1 이 있는 상태에서 이루어져 얻은 분화된 골격근 세포 (D0)에서, 카페인과 KCl을 처리한 결과이고, (B)는 (A)의 결과를 표준화비율 (1)하여 막대 그래프로 도식화한 것이다. *는 대조군와의 비교에서 유의차가 P<0.05 일 경우에 별표 (*)로 표시하였다. **는 D-1과의 비교에서 유의차가 P<0.05 일 경우에 별표 (*)로 표시하였다.
도 4는 Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포에서 휴지 상태의 세포질 내 칼슘 양을 측정한 것이다. *는 대조군과의 비교에서 유의차가 P<0.05 일 경우에 별표 (*)로 표시하였다
도 5는 Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포에서 칼슘 이동 통로로 역할을 하는 칼슘채널 및 칼슘-의존성 단백질의 발현을 측정한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 안지오포이에틴 1(angiopoietin 1 또는 Ang1) 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 포함하는 골격근 위축(skeletal muscle atrophy) 또는 근육감소증(sarcopenia)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 안지오포이에틴 1(angiopoietin 1 또는 Ang1)을 생쥐 골격근 (mouse hindlimb)에서 골격근 전구 세포(데스민 (desmin) 단백질을 발현하고 골격근 세포가 되기로 세포의 운명이 정해진 골격근 전구 세포임)를 분리하여 증식시켜 얻은 세포 (primary skeletal muscle cell)에 처리할 경우, Ang1을 처리하지 않은 골격근 세포에 비해 Ang1을 처리한 골격근 세포의 증식 및 분화가 촉진된다.

또한, Ang1 이 처리된 상태에서 증식되고 분화된 골격근 세포 (myotubes)는 골격근의 주요 기능인 흥분-수축 기작 (excitation-contraction coupling)의 핵심 과정인 세포질 내 칼슘 조달 (골격근막 탈분극에 따른 세포질 내 칼슘 증가) 능력이 현격하게 높아져 Ang1의 처리에 의해서 골격근의 흥분-수축 기능의 향상에 도움이 된다.

또한, 골격근 수축 과정의 신호 전달자인 칼슘의 조달 및 칼슘과 결합하는 단백질들의 발현 양을 조사한 결과, Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포에서 칼슘과 결합하여 각종 신호전달에 관여하는 칼모듈린 (calmodulin, CaM) 단백질과 외부에서 세포 내부로 칼슘을 조달할 수 있는 Orai1 칼슘채널 단백질의 양이 증가한다.

따라서, 안지오포이에틴 1은 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료적 용도로 사용할 수 있다.

상기 안지오포이에틴 1은 천연형 또는 재조합 안지오포이에틴 1, 또는 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 말한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 안지오포이에틴 1과 그 기능적 동등물 (functional equivalent) 및 기능적 유도체 (functional derivative)가 포함된다.

상기 " 기능적 동등물" 에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 안지오포이에틴 1과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.

"기능적 유도체" 는 상기 안지오포이에틴 1 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 안지오포이에틴-1과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 안지오포이에틴 1 단백질은 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 마우스로부터 기원하는 단백질이며, 예컨대, human Ang1 (Gene Bank accession 번호 NM_001146.3, U83508.1, AY121504.1, BC166662.1, BC152419.1, BC152411.1, EU831933.1, EU832028.1), human Ang1 variants (Gene Bank accession 번호 AY124380.1, AB084454.1, NM_001199859.1), mouse Ang1 (Gene Bank accession 번호 NM_009640.3, BC067410.1, U83509.1)로 공지된 서열을 가진 단백질을 말한다. 참고로, human Ang1과 mouse Ang1은 아미노산 서열상으로 97% homology를 나타낸다 (Davis S et al . Cell. 1996. 87(7):1161-9; Jones N et al ., Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. (4):257-67).

본 발명에 사용된 안지오포이에틴 1은 예를 들어 공지의 서열 (예, Gene Bank accession 번호 U83508, 미국 특허공보 제5,521,073호)로부터 당업자에 공지된 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다.

천연형의 안지오포이에틴 1은 당질화 단백질 (glycosylated protein)이다 (Davis et al ., Cell, 87, 1171-1180 (1996)). 따라서 유전자 재조합 방법에 의하여 단백질을 제조하는 경우 대장균 (E. coli)이나 곤충 세포를 이용하는 것보다 포유동물 세포를 이용하는 경우가 단백질의 활성도나 용해성 측면에서 천연형의 것과 유사할 것으로 여겨진다 (Spector et al ., In Cell, A Laboratory Manual; Protein expression and interactions, CSHL Press, 64-67 (1999)).

상기 재조합 안지오포이에틴 1 단백질은 통상의 컬럼 크로마토그라피 방법 등을 이용하여 분리할 수 있다. 또한 단백질의 정제 정도는 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE))등으로 확인할 수 있다.

본 발명의 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 안지오포이에틴 1은 당단백질로서 식염수 또는 완충액에 잘 용해되므로 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 안지오포이에틴 1을 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명은 또한 약학적 유효량의 안지오포이에틴 1을 포함하는 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 골격근 위축 또는 근육감소증의 치료 방법을 제공한다.

상기 골격근 위축 또는 근육감소증의 치료 방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

한편, 상기 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1>

(골격근 세포의 배양과 분화 유도)

생쥐 (mouse)의 골격근에서 일차 골격근 세포 (primary skeletal muscle cell)를 분리하고 세포 배양액 (F10 Nutrient Mixture 조성: 20% FBS, 100 units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 20 nM basic fibroblast growth factor (bFGF))을 처리하여 37℃ 조건의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 사용한 배양 접시로는 용도에 따라서 10-cm, 6-웰, 96-웰 접시를 사용하였고, 모든 접시는 Matrigel로 코팅하여 사용하였다.

일차 골격근 세포가 배양 접시의 70% 가량을 차지할 정도로 자랐을 때, 세포의 분화 (differentiation)를 유도하였다. 세포 분화액의 조성은 다음과 같다: 세포 배양액에서 20% FBS와 F-10 Nutrient Mixture 대신 5% heat-inactivated horse serum과 low-glucose DMEM을 사용하고, bFGF는 넣지 않았다. 분화는 18% CO₂ 배양기에서 실시하였다. 분화가 완성된 세포는 분화된 골격근 세포 (myotube)라 명명하였다.

(Ang1 의 처리)

Ang1 (50 ng 또는 100 ng, R&D Systems, Inc)은 세포 배양액에 섞어서 세포에 처리 하였으며, Ang1이 들어간 배양액을 24 시간마다 새롭게 교체하였다.

(세포 증식 측정)

일차 골격근 세포가 배양 접시에 30% 가량을 차지하고 있을 때, 배양 접시의 바닥 뒷면에 일정 표시를 하고, 표시한 부분에 존재하는 세포들에 대한 사진을 광학현미경과 컴퓨터를 통해 얻고 (0 hr), 그 부분에 존재하는 세포의 수를 측정하였다. 그 세포에 Ang1을 처리하고 12 시간 후에, 표시해 둔 같은 부분에 대한 세포 사진을 다시 얻고 (12 hrs) 세포 수를 다시 세어서, Ang1을 처리하기 전과 후의 세포 수 변화를 도식화하였다.

(단일 세포에서 칼슘 이동 측정)

칼슘과 결합하게 되면 칼슘이 결합되기 전과는 다른 파장의 형광을 내는 칼슘 형광 염색약 (Ca² ⁺dye)인 fluo-4 (5 μM)를 준비하여 골격근 분화세포에 45분 동안 37℃를 유지하면서 주입하였다 (incubation). 이때 분화세포는 이미징 용액 (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 25 mM HEPES, 6 mM 글루코우즈, 1.2 mM MgSO₄, 0.05% BSA (fraction V), pH 7.4.)이 처리된 상태이다. 세포 내의 칼슘 이동 측정을 위해 형광 현미경 (Nikon x40 oil-immersion objective, NA 1.30, ECLIPSE Ti, Nikon)을 사용하였다. 휴지 상태의 세포 내 절대적 칼슘 농도 (resting cytosolic Ca² ⁺concentration) 측정에는 fluo-4 대신에 fura-2를 사용하였다. 칼슘 형광 염색약의 형광 변화는 형광 현미경에 연결된 75-watt Xenon lamp (FSM150Xe, Bentham Instruments, Ltd)와 12-bit CCD 카메라 (DVC-340M-OO-CL, Digital Video Camera Company)를 사용하여 컴퓨터로 전송 되었고, fluo-4를 사용한 데이터의 경우에는 InCyt Im1 image acquisition and analysis software (v5.29, Intracellular Imaging Inc)를 이용하여 분석되었고, fura-2를 사용한 데이터의 경우에는 High-Speed InCyt Im2 image acquisition and analysis software (v5.29, Intracellular Imaging Inc)를 이용하여 분석되었다. 세포에 처리되는 각종 약물은 8-channel perfusion pipette (AutoMate Scientific)을 이용하여 세포에 자동 분사하였다.

(용해 세포 (myotube lysate) 용액 준비)

먼저 분화된 골격근 세포는 용해 용액 (lysis buffer 조성: 1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM Na₃VO₄, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 프로테아제 저해제 (1 μM 펩스타틴, 1 μM 류펩틴, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 20 mg/mL 아프로티닌, 1 μM 트립신 저해제))을 처리하여 용해시켰다 (solubilize). 이때 10-cm 배양 접시에서 자란 세포를 예로 들면, 300 ㎕의 용해 용액을 세포에 처리하여 12 시간 이상 4℃에서 용해시켰다.

(면역탁본검사: immunoblot assay)

세포 내 단백질의 양적 변화를 관찰하기 위해 면역탁본검사를 수행하였다. 상기 용해된 세포 용액 (30 ㎍의 용해 세포 용액)을 가지고 8% 또는 10% SDS-PAGE를 을 수행하였고, SDS-PAGE를 통해 젤에 펼쳐진 단백질들은 poly-vinylidenefluoride (PVDF) 막으로 옮겨 (100 V, 2 시간 동안) 5% 무지방 우유 (non-fat milk)를 1시간 동안 처리한 뒤, 해당 일차 항체를 처리 (3 내지 12 시간)하고 연이은 해당 이차 항체 (horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)를 45분 동안 처리한 후, 발색 반응 (SuperSignal ultrachemiluminescentsubstrate, Pierce)을 통해 시각화 및 분석하였다.

(데이터 분석: statistical analysis)

모든 데이터는 적어도 3번 이상의 다수 실험을 통해 얻어진 데이터들을 종합하여 평균±S.E.M.으로 표현하였다. 막대 그래프와 표의 수치는 표준화비율 (normalized ratio) 방식으로 표현하였다. 유의차 (significant differences)는 paired t-test (GraphPad InStat, v2.04)를 이용하여 수행하였고, 유의차는 P<0.05 일 경우에 별표 한 개 또는 두 개로 표시하였다. 그래프 작성은 Origin v7 프로그램 사용하였다.

<실험예 1> Ang1 존재에 의한 골격근 세포의 증식 및 분화 평가

Ang1 처리 시 골격근 세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 평가하였다. 도 1은 Ang1 존재에 의한 골격근 세포의 증식 여부를 측정한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 Ang1 유무에 따른 12 시간 후 세포 수의 변화를 나타낸 것이고, (B)는 (A)의 결과를 막대 그래프로 도식화한 것이다. (A)에서 Ang1 처리 전에 얻은 세포 사진 (0 hr)과 Ang1 처리 후 12 시간이 지난 후에 얻은 세포 사진 (12 hr)으로, 사진의 왼쪽 부분의 검은 표식은 동일한 부분에 대한 사진을 얻기 위한 표시이다. (B)는 0 hr 일 때 세포 수를 100%로 환산하고 그에 따른 증가분을 표현 (표준화비율)하였으며, Ang1을 처리하지 않고 12 시간 후에 얻은 세포 수에 비해 유의성 있는 세포 수의 증가는 별표 (*)로 표시하였다.

도 1A에 나타난 바와 같이, Ang1 처리 후 12 시간이 지난 후 (12hr)에 얻어진 세포의 수가 Ang1을 처리하지 않고 12 시간이 지난 후에 얻어진 세포의 수에 비해서 현저히 많음을 확인하였고, 이러한 증식의 증가 현상은 50 ng Ang1 으로도 충분함을 알 수 있었다(도 1B).

표 1은 Ang1 존재에 의한 골격근 세포의 증식 향상을 수치화한 것이다.

	0 시간 (%)	12 시간 (%)
무처리	100±6.67	149.22±6.34
50 ng Ang1	100±11.75	172.54±6.64^*
100 ng Ang1	100±11.76	168.63±10.76^*

*는 Ang1 무처리 상태에서 12 시간 후 세포의 수를 0 시간에서의 세포 수에 대해서 표준화비율 (% 증가)로 나타낸 것과의 비교에서 유의차가 P<0.05 일 경우를 의미한다.

도 2에서는 Ang1 (50 ng) 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포 (myotube)가 대조군(미처리군)에 비해 보다 현저하게 길고 굵게 분화되었다. 즉 Ang1 처리에 의해서 분화가 증진되었다.

요약하면, Ang1 존재 하에서, 골격근 세포의 증식 (proliferation)과 분화 (differentiation) 모두가 증진되었다. Ang1이 존재하는 상태에서 배양된 골격근 세포가 증식을 더 활발하게 하였다 (도 1, 표 1). Ang1에 의한 세포의 증식 향상은 매우 적은 양 (50 ng)의 Ang1으로 충분하였다 (도 1B, 표 1). Ang1이 존재하는 상태에서 보다 잘 분화된 골격근 세포(굵고 긴) 가 얻어졌다 (도 2).

<실험예 2> 골격근 세포에서 칼슘 이동 변화 평가

Ang1 존재 하에 증식되고 분화된 골격근 세포에서 골격근 수축을 유도하는 자극들에 의한 칼슘 이동에 미치는 효과를 측정하였다. 이를 위해, Ang1 (50 ng) 존재 하에서 증식되고 분화시켜 얻은 분화된 골격근 세포 (D-1)와, 증식은 Ang1 이 없는 상태에서 이루어지고 분화는 Ang1 이 있는 상태에서 이루어져 얻은 분화된 골격근 세포 (D0)에서, 카페인 (라이아노딘 수용체 칼슘채널 (ryanodine receptor calcium channel)을 활성화하여 골격근 수축에 필요한 칼슘이 근세포질세망 (sarcoplasmic reticulum (SR))에서 세포질로 나오게 함)과 KCl (막의 탈분극을 유도하여 막에 존재하는 다이하이드로피리딘 수용체 칼슘채널 (dihydropyridine receptor calcium chennel)을 활성화하고 이에 의해서 라이아노딘 수용체 칼슘채널을 활성화하여 골격근 수축에 필요한 칼슘을 근세포질세망으로부터 세포질로 나오게 함)을 처리하였다. 상기 결과는 도 3에 도시하였고, 도 3B에서 Ang1을 처리하지 않은 것에 비해 유의성이 있는 경우에 별표 한 개 (*), Ang1을 증식과 분화 과정 모두에서 처리한 세포, 즉 D-1에 비해 유의성이 있는 경우에 별표 두 개 (**)로 표시하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포에서 카페인과 KCl에 반응하여 증가하는 세포질의 칼슘량이 현저히 크고, 증식과 분화 과정 모두에서 Ang1이 처리된 경우 (D-1)에 골격근 수축을 유도하는 자극들에 의한 칼슘 이동 증가가 보다 많았다.

표 2는 Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포에서 골격근 수축 유도 자극들에 의한 칼슘 이동 증가를 수치화한 것이다.

	카페인	KCl
대조군	1.00±0.08	1.00±0.09
Ang1 (D-1)	1.67±0.05^*	1.48±0.10^*
Ang1 (D0)	1.39±0.11^{, *}	1.14±0.11^**

*는 대조군의 수치를 표준화비율 (1)로 나타낸 것과의 비교에서 유의차가 P<0.05 일 경우를 의미한다.

**는 D-1과의 비교에서 유의차가 P<0.05 일 경우를 의미한다.

요약하면, Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포 (myotube)가 골격근 수축을 유도하는 자극들에 보다 향상된 반응을 나타냈다. 카페인 (caffeine)은 라이아노딘 수용체 칼슘채널 (ryanodine receptor calcium chennel)을 활성화하여 골격근 수축에 필요한 칼슘을 근세포질세망 (sarcoplasmic reticulum (SR))으로부터 세포질로 나오게 하는데, 카페인에 대한 반응이 Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포에서 현저히 향상 되었다 (도 3A, 좌측). KCl은 막의 탈분극을 유도하여 막에 존재하는 다이하이드로피리딘 수용체 칼슘채널 (dihydropyridine receptor calcium chennel)을 활성화하고 이에 의해서 라이아노딘 수용체 칼슘채널을 활성화하여 골격근 수축에 필요한 칼슘을 근세포질세망으로부터 세포질로 나오게 하는데, KCl에 대한 반응이 Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포에서 현저히 향상되었다. (도 3A, 우측).

또한, Ang1이 증식과 분화 과정 모두에 존재할 때, Ang1 존재에 의한 향상된 칼슘 조달이 나타남을 확인하였다. 즉, 분화된 골격근 세포의 수축을 유도하는 자극들에 대한 보다 향상된 반응, 즉, 세포질로 골격근 수축에 필요한 칼슘 조달에 있어서의 향상은 Ang1이 증식 (proliferation)과 분화 과정 (differentiation) 모두에서 존재할 때보다 효과적이었다 (도 3B, 표 2).

도 4는 Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포에서 휴지 상태의 세포질 내 칼슘량을 측정한 결과로, Ang1 (50 ng) 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포 (D-1)의 휴지 상태 (resting state)에서 세포질에 존재하는 칼슘의 양이 보다 높았다. 즉, Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포는 보다 많은 칼슘 (골격근 수축에 필수적인)을 세포질에 보유하고 있음에 의해서 골격근 수축을 위해 보다 준비된 상태임을 확인하였다. Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포 (D-1)는 휴지 상태 (resting state)에서 세포질에 보다 많은 칼슘을 보유하고 있음을 확인하였다.

<실험예 3> 골격근 수축에 관여하는 단백질의 발현량 조사

Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포에서 칼슘채널 및 칼슘-의존성 단백질의 발현을 측정하였다. 이를 위해, 골격근에서 칼슘이동 통로로 역할을 하는 것으로 알려진 다양한 종류의 칼슘채널 단백질들과 칼슘-의존성 단백질들의 발현을 면역탁본검사로 확인하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, Ang1 존재 하에서 증식되고 분화된 골격근 세포는 외부 칼슘 유입 경로인 Orai1 칼슘채널과 칼슘-의존성 신호전달 단백질인 칼모듈린 (calmodulin)이 보다 많이 발현된 상태임을 확인하였다. 외부 칼슘 유입 경로인 Orai1 칼슘채널의 발현이 현격히 증가하였다. 칼슘에 결합하여 신호전달에 관여하는 칼슘-의존성 신호전달 단백질인 칼모듈린의 발현이 현격히 증가하였다.

Claims

안지오포이에틴 1(angiopoietin 1 또는 Ang1), 데스민 단백질(desmin)을 발현하는 골격근 전구 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며,
상기 골격근 전구 세포는 골격근 세포로의 증식 또는 분화를 촉진하기 위해 안지오포이에틴 1과 접촉되며,
상기 골격근 전구 세포에서 분화된 골격근 세포는 안지오포이에틴 1과 접촉하지 않은 골격근 세포 대비 칼모듈린 단백질과 Orai1 칼슘채널 단백질의 발현이 검출가능하게 증가된 것인 골격근 위축(skeletal muscle atrophy) 또는 근육감소증(sarcopenia)의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
안지오포이에틴 1은 인간 또는 마우스 유래인 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
조성물이 캅셀, 액제, 주사제, 연질캅셀제, 과립제, 또는 정제 중 어느 하나의 제형을 가지는 골격근 위축 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 조성물.
포유류의 골격근 전구 세포가 골격근 세포로 증식 또는 분화하는 조건에서, 증식 또는 분화 조절자로 안지오포이에틴 1(angiopoietin 1 또는 Ang1)을 포함하는 골격근 전구 세포의 증식 또는 분화 조절용 조성물.