KR20080021588A - 메카노 성장 인자 펩티드 및 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메카노 성장 인자 (MGF)라고 공지된, 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I) 스플라이싱 변이체의 C-말단을 형성하는 E 펩티드-유래의 생물학적 활성 폴리펩티드에 관한 것이다. 이들 펩티드는 천연 발생 E 펩티드에 비해 안정성이 개선되도록 변형된다.

메카노 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 스플라이싱 변이체, E 펩티드, 생물학적 활성, 안정성

Description

메카노 성장 인자 펩티드 및 이들의 용도 {MECHANO GROWTH FACTOR PEPTIDES AND THEIR USE}

본 발명은 메카노 성장 인자 (MGF, Mechano Growth Factor)라고 공지된, 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I) 스플라이싱 변이체의 C-말단을 형성하는 E 펩티드-유래의 생물학적 활성 폴리펩티드에 관한 것이다. 이들 펩티드는 천연 발생 E 도메인 펩티드에 비해 안정성이 개선되도록 변형된다.

포유동물 IGF-I 폴리펩티드에는 수많은 이소형(isoform)이 있으며, 이것들은 교호(交互) mRNA 스플라이싱으로 인해 생성된 것이다. 넓게는 간-유형 이소형 및 비(非)-간-유형 이소형의 2가지 유형이 있다. 간-유형 이소형은 간에서 발현될 수도 있고 그 외의 위치에서도 발현될 수 있으나, 그 외의 위치에서 발현되는 경우에는 간에서의 발현 수준과 동등하다. 이것들은 전신 작용을 하며, 주요 이소형은 포유동물에 존재한다. 비-간-유형 이소형은 덜 흔하며, 일부는 자가분비(autocrine)/측분비(paracrine) 작용을 한다고 여겨진다. 본 발명에서 기재하는 MGF 이소형은 비-간-유형이다.

MGF ([Yang et al, 1996], [McKoy et al, 1999])에서는 교호 스플라이싱이 상기 분자의 C-말단 부분의 리딩 프레임(reading frame)을 변화시키는 삽입체를 도입한다. 이러한 삽입체는 인간 MGF의 경우에 49개 염기쌍 길이이다. 52개 염기쌍 삽입체는 래트 MGF와 토끼 MGF에서 유사한 효과를 갖는다. 결과적으로, MGF는 간-유형 IGF-I보다 약간 더 길어지고 (리딩 프레임 쉬프트(shift)로 인해 종결 코돈이 더 뒤에 위치하기 때문임), C-말단 E 도메인이 여러가지 서열을 갖게 된다. 또한, 이것은 글리코실화가 없어서 전체적으로 더 작다.

인간 MGF의 C-말단은 때때로 Ec 펩티드 (서열 27)라 불리기도 하는 24개 아미노산 E 도메인에 의해 형성된다. 래트 MGF와 토끼 MGF에서 때때로 Eb 펩티드라 불리는 상응하는 E 도메인은 25개 아미노산 길이이다 (서열 13/서열 14). 간-유형 IGF-I는 대신에 C-말단에 Ea 펩티드를 함유한다. Ea 펩티드 및 Ec/Eb 펩티드의 서열은 상기 논의한 리딩 프레임 쉬프트 때문에 서로 관련이 없다. 현재 MGF C-말단이라 볼 수 있는 것을 갖는 스플라이싱 변이체의 존재는 츄(Chew) 등이 간암 환자에 대한 연구 동안에 간 조직에서 동정하여 최초로 알아내었지만 (1995), 이들은 이의 잠재적 기능 또는 치료적 유의성에 관하여는 전혀 조사하지 않았다.

골드스핀크(Goldspink) 및 동료들은 이미 MGF를 골격근 장애, 특히 근이영양증에 대한 사용, 심장 근육 장애에 대한 사용, 특히 허혈 또는 심장의 기계적 과부하에 대한 반응에 있어서의 심근 손상의 예방 또는 제한에서의 사용, 일반적으로는 신경계 장애의 치료, 및 특히 신경 복구에서의 사용과 관련하여 확인한 바 있다 (제WO 97/33997호, 제WO 01/136483호, 제WO 01/85781호, 제WO 03/066082호). 간-유형 IGF-I 및 MGF는 역할과 기능이 상이하다는 것이 점점 명확해지고 있다. 따라 서, 힐(Hill) 및 골드스핀크 (2003)는 래트의 전경골근에서 전기 자극에 의해 야기되는 기계적 손상 또는 부피바카인 주사로 인한 반응시에는 MGF가 신속하게 발현되지만, 이후에는 이것의 발현이 수일 내에 감소하는 것을 확인하였다. 반대로, 간-유형 IGF-I은 보다 서서히 상향조절되며, 이것의 증가는 MGF 발현의 감소와 균형을 이룬다. 추가로, 양(Yang) 및 골드스핀크 (2002)는 마우스 C2C12 근육 세포주를 시험관내 모델로서 사용하여, 인간 MGF의 C-말단 유래의 Ec 펩티드와 관련이 있고 말단에서 두번째 위치에는 천연 아르기닌이 아닌 히스티딘을 가지며 추가의 C-말단 시스테인을 갖는 24개 아미노산 펩티드가, 근육모세포 증식을 증가시키지만 근관(筋管) 형성은 억제한다는 점에서 성숙 IGF-I과는 구별되는 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 또한, 들루즈니에우스카(Dluzniewska) 등 (2005년 9월)도 말단에서 두번째 위치에 천연 아르기닌이 아닌 히스티딘을 가지며 위치 14 및 위치 15에 존재하는 L-아르기닌이 D-아르기닌으로 전환되어 약간 변형되고 C-말단 아미드화 및 PEG화(PEGylation)를 갖는 관련 펩티드의 강력한 신경보호 효과를 입증하였다.

발명의 요약

그러나, 본원 발명의 발명자들은 천연 인간 MGF C-말단 Ec 펩티드는 인간 혈장 중에서의 반감기가 짧다는 것을 알아냈다. 따라서, 안정화시키는 변형을 가하는 것이 의약품으로서의 용도를 위한 잠재력을 증대시킬 수 있다.

또한, 본원 발명의 발명자들은 안정화된 MGF C-말단 E 펩티드가 신경보호 및 심근보호 성질을 가지며 또한 정상 골격근 및 근이영양성 골격근의 강도를 증가시키는 능력을 보유함을 알아냈다.

따라서, 본 발명은

50개 이하의 아미노산 잔기를 포함하고,

인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I)의 메카노 성장 인자 (MGF) 이소형의 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열을 포함하고,

미변형 MGF E 펩티드에 비해 안정성이 증가되도록 하는 1종 이상의 변형이 혼입되어 있으며,

생물학적 활성을 보유하는

폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 포함하고 상기 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단이 비-야생형 아미노산 서열에 의해 연장되어 있는 연장된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 근육 장애의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드를 투여하여 근육 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 근육 장애는 예를 들어 골격근 장애 또는 심장 근육 장애일 수 있다.

본 발명은 또한 신경계 장애의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드를 투여하여 신경계 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 정의된 치료용 약제의 제조에 있어서 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 신경계 장애의 치료가 필요한 환자에게

50개 이하의 아미노산 잔기를 포함하고 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I)의 메카노 성장 인자 (MGF) 이소형의 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열을 포함하며 생물학적 활성을 보유하는 유효량의 폴리펩티드, 또는

상기 폴리펩티드를 포함하고 상기 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단이 비-야생형 아미노산 서열에 의해 연장되어 있으며 생물학적 활성을 보유하는 유효량의 연장된 폴리펩티드

를 투여하여 신경계 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 심장 근육 장애의 치료가 필요한 환자에게

50개 이하의 아미노산 잔기를 포함하고 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I)의 메카노 성장 인자 (MGF) 이소형의 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열을 포함하며 생물학적 활성을 보유하는 유효량의 폴리펩티드, 또는

상기 폴리펩티드를 포함하고 상기 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단이 비-야생형 아미노산 서열에 의해 연장되어 있으며 생물학적 활성을 보유하는 유효량 의 연장된 폴리펩티드

를 투여하여 심장 근육 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 신경계 장애 또는 심장 근육 장애의 치료용 약제의 제조에 있어서

50개 이하의 아미노산 잔기를 포함하고 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I)의 메카노 성장 인자 (MGF) 이소형의 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열을 포함하며 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드, 또는

상기 폴리펩티드를 포함하고 상기 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단이 비-야생형 아미노산 서열에 의해 연장되어 있으며 생물학적 활성을 보유하는 연장된 폴리펩티드

의 용도를 제공한다.

도 1 : 서열 정렬, 인간, 래트 및 토끼 MGF 및 인간, 래트 및 토끼 간-유형 IGF-I (서열 2의 아미노산 26 내지 110 및 서열 4 및 6의 아미노산 26 내지 111, 하기 참조) 각각의 서열의 일부에 의해 코딩되는 서열을 나타내며, C-말단에서의 MGF와 간-유형 IGF-I의 차이를 강조하였고; 인간 MGF에서의 49개 염기쌍 삽입물 및 래트/토끼 MGF에서의 52개 염기쌍 삽입물에 의해 생성되어 리딩 프레임 쉬프트 및 C-말단에서의 차이를 초래함.

도 2 : 안정성 및 생물학적 활성에 대한 알라닌 치환 및 C-말단 및 N-말단의 말단절단(truncation)의 효과 - 추가의 서열 정렬, 펩티드 1-6 (서열 15 내지 20) 및 짧은 펩티드 1-4 (서열 21 내지 서열 24)의 변형된 서열을 비교하고, 인간 혈장에서의 인큐베이션에 의해 측정된 안정성 및 근육 세포주에 대한 시험에 의해 측정된 생물학적 활성에 있어서의 변화의 영향을 상술함 (시험 절차의 세부사항에 대하여는 실시예 참조).

상기 도면에서, 좌측의 처음 두 개의 컬럼에는 펩티드들이 확인되어 있으며 이들의 서열이 제공됨으로써 치환에 의해 형성된 변화를 확인한다. 세 번째 컬럼에는 안정성에 대한 시험 결과가 제시되어 있으며 (세부사항에 대해서는 실시예 5 참조), 우측의 마지막 컬럼에는 생물학적 활성에 대한 시험 결과가 제시되어 있다 (또한, 세부사항에 대해서는 실시예 5 참조).

도 3 : 3주 후 안정화된 펩티드의 주사 후의 뮤린(murine) 근이영양성 근육 강도의 증가 -

(A) 안정화된 펩티드 (좌측 컬럼) 및 IGF (우측 컬럼)의 주사 후의 mdx 마우스의 근이영양성 근육 강축력(tetanic force)의 변화율(％).

(B) 안정화된 펩티드 (좌측 컬럼) 및 PBS 비히클 대조군 (우측 컬럼)의 주사 후의 mdx 마우스의 근이영양성 근육 강축력의 변화율(％).

도 4 : 안정화된 펩티드의 투여 후의 심근보호 - 안정화된 펩티드 (제3 컬럼, "Ec 도메인"이라고 지칭됨), 전장 MGF (제4 컬럼), 성숙 IGF-I (제2 컬럼) 및 대조군 제제 (제1 컬럼)의 경색된 양 심장으로의 투여 후에 달성된 박출율 비교.

도 5 : 심근경색 ( MI ) 후의 기능 보존을 나타내는 압력/부피 루프 데이타 - 정상 (좌측 위) 및 경색된 (MI) 뮤린 (우측 위) 심실의 경우, MI 심장 (우측 아래, "MGF 펩티드"라고 지칭됨) 및 정상 심장 (좌측 아래)에 전신적으로 전달된 안정화된 펩티드의 효과를 나타냄. 모든 패널은 Y-축 상에서 압력 (mmHg) 및 X-축 상에서 상대 부피 단위를 나타냄.

도 6 : 래트 뇌 슬라이스 시스템에서의 신경보호 효과 - 좌측에서 우측으로, 안정화된 펩티드 ("MGF"라고 지칭됨), IGF-I, TBH, TBH + 안정화된 펩티드 (24시간), TBH + IGF-I (24시간), TBH + 안정화된 펩티드 (48시간), TBH + IGF-I (48시간)로 처리한 후에 사멸된 세포의 비율(％).

도 7 : L형에서 D형으로 전환된 아르기닌 및 N-말단 PEG 화를 혼입하는 안정화된 펩티드의 더 큰 안정성을 입증하는 웨스턴 블럿 - 안정화된 펩티드의 안정성과 L형에서 D형으로의 전환 및 N-말단 PEG화가 결여된 상응하는 펩티드의 안정성을, 여러 시간 간격의 범위에서 신선한 인간 혈장에서의 인큐베이션에 의해 비교 조사하였다. 이어서, 웨스턴 블럿팅을 이용해서 A = O분; B = 30분; C = 2시간; D = 24시간의 시간 간격에서 각 펩티드의 생존을 평가하였다. L-D 전환 및 N-말단 PEG화를 갖는 펩티드에 대한 결과는 우측에 나타나 있으며, L형에서 D형으로의 전환 및 N-말단 PEG화가 결여된 펩티드에 대한 결과는 좌측에 나타나 있다.

도 8 : C2C12 근육 세포의 증식에 대한 8개 아미노산 C-말단 펩티드의 효과:

(A) DMGF 및 CMGF 펩티드: C2C12 세포는 DMEM (1000 mg/L 글루코스), BSA (10OO ㎍/ml) 및 IGF-I (2 ng/ml)를 함유하는 배지 중의 웰 당 2000개의 세포로 제공되었으며, 상기 세포를 36시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 알라마 블루(Alamar Blue) 검정을 이용해서 세포 증식을 평가하였다. 좌측 판독값 군은 2, 5, 50 및 100 ng/ml의 DMGF 펩티드 (세부사항에 대해서는 실시예 1.3.1 참조) 농도를 이용한 실험 결과를 나타낸다. 중간 판독값 군은 2, 5, 50 및 100 ng/ml의 CMGF 펩티드 (세부사항에 대해서는 실시예 1.3.1 참조) 농도를 이용한 실험 결과를 나타낸다. 우측 판독값 군은 2, 5, 50 및 100 ng/ml의 IGF-I 단독 (세부사항에 대해서는 실시예 1.5 참조)의 농도를 이용한 실험 결과를 나타낸다. Y-축 값은 알라마 블루 검정에서 형광에 관한 것이다 (535 nm의 파장에서 여기되고, 590 nm에서 측정함; 평균 + 표준 오차).

(B) 펩티드 A2, A4, A6 및 A8: 웰 당 500개 세포의 C2C12 근육 세포. 10％ FBS 중의 24시간 동안의 배양에 이어서 0.1％ BSA 중의 24시간 동안의 고갈(starvation), 24시간 동안의 자극 이후에 BrdU을 이용한 5시간 동안의 처치를 수행하였다. 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml 농도의 펩티드 A2, A4, A6 및 A8을 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml의 IGF-I와 함께 시험하였다 (우측 세트의 결과 참조). BrdU 혼입을 측정하여 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 세포를 함유하지 않는 대조군, 배지만을 함유하는 대조군, 5％ FBS를 함유하는 대조군, 및 BrdU를 함유하지 않는 대조군이 또한 제공되었다. Y-축 상의 값은 형광에 관한 것이다 (370 nm에서의 흡광도; 4개 웰에 대한 평균 + 표준 오차). 좌측의 첫 번째 컬럼은 세포가 존재하지 않는 대조군에 관한 것이다. 그 다음 4개는 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml 농도의 펩티드 A2에 관한 것이다. 그 다음 4개는 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml 농도의 펩티드 A4에 관한 것이다. 가운데 3개는 배지 (med)만을 함유하는 대조군, 5％ FBS를 함유하는 대조군 및 BrdU를 함유하지 않는 대조군에 관한 것이다. 그 다음 4개 는 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml 농도의 펩티드 A6에 관한 것이다. 그 다음 4개는 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml 농도의 펩티드 A8에 관한 것이다. 우측 결과 군은 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml 농도의 IGF-I (실시예 1.5 참조)에 관한 것이다.

도 9 : HSMM 세포의 증식에 대한 효과

(A) 펩티드 A5: 웰 당 500개 세포의 HSMM 세포. 10％ FCS 중의 24시간 동안의 배양에 이어서 혈청 무함유 배지 중의 2회 세척, 48시간 동안의 자극 이후에 BrdU를 이용한 5시간 동안의 처치를 수행하였다. 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5를 0.1, 1, lO 및 100 ng/ml의 IGF-I와 함께 시험하였다. BrdU 혼입을 측정하여 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 배지만을 함유하는 대조군, 세포를 함유하지 않는 대조군 (BLK), 백그라운드(background) 염색을 함유하는 대조군 (BG) 및 10％ FBS를 함유하는 대조군이 또한 제공되었다. Y-축 상의 값은 형광에 관한 것이다 (370 nm에서의 흡광도; 4개 웰에 따른 평균 + 표준 오차). 처음 5개의 컬럼은 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5에 관한 것이다. 그 다음 컬럼은 배지만을 함유하는 대조군에 관한 것이다. 그 다음 3개는 100, 10 및 0.1 ng/ml 농도의 IGF-I (실시예 1.5 참조) 단독에 관한 것이다. 그 다음 3개는 각각 10％ FBS를 함유하는 대조군, 백그라운드 염색을 함유하는 대조군 및 세포를 함유하지 않는 대조군에 관한 것이다. *는 배지 단독 대조군에 비해 P가 0.05 미만임을 의미한다.

(B) 펩티드 A5: 웰 당 500개 세포의 HSMM 세포. 10％ FCS 중의 24시간 동안의 배양에 이어서 혈청 무함유 배지 중의 2회 세척, 48시간 동안의 자극 이후에 BrdU를 이용한 5시간 동안의 처치를 수행하였다. 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5와 2 ng/ml의 IGF-I의 조합을 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml의 IGF-I와 함께 시험하였다. BrdU 혼입을 측정해서 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 2 ng/ml IGF-I가 보충된 배지를 함유하는 대조군, 세포를 함유하지 않는 대조군 (BLK) 및 10％ FBS를 함유하는 대조군이 또한 제공되었다. Y-축 상의 값은 형광에 관한 것이다 (370 nm에서의 흡광도; 4개 웰에 따른 평균 + 표준 오차). 처음 5개의 컬럼은 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5에 관한 것이다. 그 다음 3개는 100, 10 및 0.1 ng/ml 농도의 IGF-I (실시예 1.5 참조) 단독에 관한 것이다. 그 다음 3개는 각각 10％ FBS를 함유하는 대조군, 2 ng/ml IGF-I가 보충된 배지를 함유하는 대조군 및 세포를 함유하지 않는 대조군에 관한 것이다. *는 2 ng/ml IGF-I를 함유하는 배지 대조군에 비해 P가 0.01 미만임을 나타내고, **는 상기 대조군에 비해 P가 0.001 미만임을 나타낸다.

도 10 : HSMM 세포의 증식에 대한 효과

(A) 펩티드 A5: 웰 당 500개 세포의 HSMM 세포. 10％ FCS 중의 24시간 동안의 배양에 이어서 혈청 무함유 배지 중의 2회 세척, 48시간 동안의 자극 이후에 BrdU를 이용한 5시간 동안의 처치를 수행하였다. 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5를 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml의 IGF-I와 함께 시험하였다. BrdU 혼입을 측정하여 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 배지만을 함유하는 대조군, 세포를 함유하지 않는 대조군 (BLK), 백그라운드 염색 함유하는 대조군 (BG) 및 10％ FBS를 함유하는 대조군이 또한 제공되었다. Y-축 상의 값은 형광에 관한 것이다 (370 nm에서의 흡광도; 4개 웰에 따른 평균 + 표준 오차). 처음 5개의 컬럼은 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5에 관한 것이다. 그 다음 컬럼은 배지만을 함유하는 대조군에 관한 것이다. 그 다음 3개는 100, 10 및 0.1 ng/ml 농도의 IGF-I (실시예 1.5 참조) 단독에 관한 것이다. 그 다음 3개는 각각 10％ FBS를 함유하는 대조군, 백그라운드 염색을 함유하는 대조군 및 세포를 함유하지 않는 대조군에 관한 것이다. *는 배지 단독 대조군에 비해 P가 0.05 미만임을 의미한다.

(B) 펩티드 A5: 웰 당 500개 세포의 HSMM 세포. 10％ FCS 중의 24시간 동안의 배양에 이어서 혈청 무함유 배지 중의 2회 세척, 48시간 동안의 자극 이후에 BrdU를 이용한 5시간 동안의 처치를 수행하였다. 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5와 2 ng/ml IGF-I의 조합을 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml IGF-I와 함께 시험하였다. BrdU 혼입을 측정해서 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 2 ng/ml IGF-I가 보충된 배지를 함유하는 대조군, 세포를 함유하지 않는 대조군 (BLK), 백그라운드 염색을 함유하는 대조군 (BG) 및 10％ FBS를 함유하는 대조군이 또한 제공되었다. Y-축 상의 값은 형광에 관한 것이다 (370 nm에서의 흡광도; 4개 웰에 따른 평균 + 표준 오차). 처음 5개의 컬럼은 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5에 관한 것이다. 그 다음 컬럼은 2 ng/ml IGF-I만이 보충된 배지를 함유하는 대조군에 관한 것이다. 그 다음 3개는 100, 10 및 0.1 ng/ml 농도의 IGF-I (실시예 1.5 참조) 단독에 관한 것이다. 그 다음 3개는 각각 10％ FBS를 함유하는 대조군, 백그라운드 염색을 함유하는 대조군 및 세포를 함유하지 않는 대조 군에 관한 것이다. *는 2 ng/ml IGF-I를 함유하는 배지 대조군에 비해 P가 0.1 미만임을 의미한다.

도 11: HSMM 세포의 증식에 대한 효과

(A) 펩티드 A5: 웰 당 1000개 세포의 HSMM 세포. 10％ FCS 중의 24시간 동안의 배양에 이어서 혈청 무함유 배지 중의 2회 세척, 48시간 동안의 자극 이후에 BrdU를 이용한 5시간 동안의 처치를 수행하였다. 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5를 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml IGF-I와 함께 시험하였다. BrdU 혼입을 측정해서 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 배지만을 함유하는 대조군, 세포를 함유하지 않는 대조군 (BLk), 백그라운드 염색을 함유하는 대조군 (BG) 및 10％ FCS를 함유하는 대조군이 또한 제공되었다. Y-축 상의 값은 형광에 관한 것이다 (370 nm에서의 흡광도; 4개 웰에 대한 평균 + 표준 오차). 처음 5개의 컬럼은 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5에 관한 것이다. 그 다음 컬럼은 배지만을 함유하는 대조군에 관한 것이다. 그 다음 3개는 100, 10 및 0.1 ng/ml 농도의 IGF-I (실시예 1.5 참조) 단독에 관한 것이다. 그 다음 3개는 각각 10％ FCS를 함유하는 대조군, 백그라운드 염색을 함유하는 대조군 및 세포를 함유하지 않는 대조군에 관한 것이다.

(B) 펩티드 A5: 웰 당 1000개 세포의 HSMM 세포. 10％ FCS 중의 24시간 동안의 배양에 이어서 혈청 무함유 배지 중의 2회 세척, 48시간 동안의 자극 이후에 BrdU를 이용한 5시간 동안의 처치를 수행하였다. 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5와 2 ng/ml IGF-I의 조합을 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml IGF-I와 함 께 시험하였다. BrdU 혼입을 측정해서 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 2 ng/ml IGF-I가 보충된 배지를 함유하는 대조군, 세포를 함유하지 않는 대조군 (BLK), 백그라운드 염색을 함유하는 대조군 (BG) 및 10％ FBS를 함유하는 대조군이 또한 제공되었다. Y-축 상의 값은 형광에 관한 것이다 (370 nm에서의 흡광도; 4개 웰에 따른 평균 + 표준 오차). 처음 5개의 컬럼은 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 펩티드 A5에 관한 것이다. 그 다음 컬럼은 2 ng/ml IGF-I만이 보충된 배지를 함유하는 대조군에 관한 것이다. 그 다음 3개는 100, 10 및 0.1 ng/ml 농도의 IGF-I (실시예 1.5 참조) 단독에 관한 것이다. 그 다음 3개는 각각 10％ FBS를 함유하는 대조군, 백그라운드 염색을 함유하는 대조군 및 세포를 함유하지 않는 대조군에 관한 것이다. *는 2 ng/ml IGF-I를 함유하는 배지 대조군에 비해 P가 0.1 미만임을 의미한다.

서열 정보

인간, 래트 및 토끼 MGF DNA의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 서열 목록에서 서열 1/2, 3/4 및 5/6으로 제공되어 있다. 이들 서열은 리딩 프레임을 변화시키고 특징적인 MGF C-말단을 생성시키는 49/52개 염기쌍 삽입물을 비롯하여 IGF-I 유전자의 엑손 3/4/5/6에 의해 코딩되는 성숙 MGF를 나타낸다는 점에서 전장 MGF 서열로서 명명된다. 엑손 1 및 2는 별법의 리더 서열이다. 비교를 위해, 인간, 래트 및 토끼 간-유형 IGF-I로부터의 상응하는 DNA 및 아미노산 서열은 각각 서열 7/8, 9/10 및 11/12로 제공되어 있다. 엑손 4의 전방에 의해 코딩되는 서열의 처음 6개의 아미노산 서열의 비교는 도 1에 제시되어 있다.

래트 MGF의 C-말단으로부터의 천연 래트 Eb 펩티드의 서열 (25개 아미노산; 서열 4의 아미노산 87 내지 111)은 서열 13으로 제공되어 있다.

토끼 MGF의 C-말단으로부터의 천연 토끼 Eb 펩티드의 서열 (25개 아미노산; 서열 6의 아미노산 87 내지 111)은 서열 14로 제공되어 있다.

인간 MGF의 C-말단으로부터의 천연 인간 Ec 펩티드의 서열 (24개 아미노산; 서열 2의 아미노산 87 내지 110)은 서열 27로 제공되어 있다.

서열 27의 펩티드에서 유래된 변형된 서열은 서열 28 내지 32로서 제공되어 있다.

서열 28에서, 위치 5의 세린은 알라닌으로 대체되어 있다.

서열 29에서, 위치 12의 세린은 알라닌으로 대체되어 있다.

서열 30에서, 위치 18의 세린은 알라닌으로 대체되어 있다.

서열 31에서, 위치 14의 아르기닌은 알라닌으로 대체되어 있다.

서열 32에서, 위치 14의 아르기닌은 알라닌으로 대체되어 있으며, 또한 위치 15의 아르기닌도 알라닌으로 대체되어 있다.

천연 인간 Ec 펩티드는 그의 말단에서 두번째 위치에 아르기닌을 갖는다. 상기 말단에서 두번째 위치에 히스티딘을 갖는 천연 펩티드 변이체가 합성되었으며, 서열 15에 나타낸다. 이 펩티드는 또한 도 2에 펩티드 1로서 기재되어 있다. 서열 26은 상기 말단에서 두번째 위치에 아르기닌 대신에 히스티딘이 혼입된 전장 인간 MGF의 서열을 대표한다. 서열 25는 서열 26에 대한 DNA 코딩 서열인데, 여기서 상기 말단에서 두번째 위치의 히스티딘은 CAC에 의해 코딩되며, 나머지 서열은 서열 1에서와 동일하다.

서열 15의 펩티드에서 유래된 변형된 서열은 서열 16 내지 24로 제공되어 있다. 이들 서열과 서열 15의 펩티드를 서로 비교하여 도 2에 나타내었다.

펩티드 2 (서열 16)에서, 위치 5의 세린은 알라닌으로 대체되어 있다.

펩티드 3 (서열 17)에서, 위치 12의 세린은 알라닌으로 대체되어 있다.

펩티드 4 (서열 18)에서, 위치 18의 세린은 알라닌으로 대체되어 있다.

펩티드 5 (서열 19)에서, 위치 14의 아르기닌은 알라닌으로 대체되어 있다.

펩티드 6 (서열 20)에서, 위치 14의 아르기닌은 알라닌으로 대체되어 있으며, 또한 위치 15의 아르기닌도 알라닌으로 대체되어 있다.

짧은 펩티드 1 (서열 21)에서, 위치 14의 아르기닌은 알라닌으로 대체되어 있으며, 2개의 C-말단 아미노산이 제거되어 있다.

짧은 펩티드 2 (서열 22)에서, 위치 14의 아르기닌은 알라닌으로 대체되어 있으며, 4개의 C-말단 아미노산이 제거되어 있다.

짧은 펩티드 3 (서열 23)에서, 위치 14의 아르기닌은 알라닌으로 대체되어 있으며, 3개의 N-말단 아미노산이 제거되어 있다.

짧은 펩티드 4 (서열 24)에서, 위치 14의 아르기닌은 알라닌으로 대체되어 있으며, 5개의 N-말단 아미노산이 제거되어 있다.

또한, 서열 목록에는 8개의 아미노산으로 이루어진 4개의 펩티드 서열이 포함되어 있다.

서열 33은 상기 말단에서 두번째 위치에 히스티딘을 함유하는, 서열 15의 변 이체 서열의 8개의 C-말단 아미노산이다.

서열 34는 상기 말단에서 두번째 위치에 아르기닌을 함유하는, 서열 27의 천연 인간 MGF C-말단의 8개의 C-말단 아미노산이다.

서열 35는 위치 2에서 세린이 알라닌으로 치환된 서열 33의 서열이다. 따라서, 상기 서열은 서열 18 (펩티드 4)의 8개의 C-말단 아미노산에 상응한다.

서열 36은 위치 2에서 세린이 알라닌으로 치환된 서열 34의 서열이다. 따라서, 상기 서열은 서열 30의 8개의 C-말단 아미노산에 상응한다.

쉽게 찾아볼 수 있도록, 상기 서열을 또한 하기 표에 기재한다.

서열	설명("aa"는 "아미노산"을 나타냄)
1	전장 인간 IGF-1-Ec (=MGF) (뉴클레오티드 및 아미노산)
2	전장 인간 IGF-1-Ec (=MGF) (아미노산 단독)
3	전장 래트 IGF-1-Eb (=래트 MGF) (뉴클레오티드 및 아미노산)
4	전장 래트 IGF-1-Eb (=래트 MGF) (아미노산 단독)
5	전장 토끼 IGF-1-Eb (=토끼 MGF) (뉴클레오티드 및 아미노산)
6	전장 토끼 IGF-1-Eb (=토끼 MGF) (아미노산 단독)
7	전장 인간 간-유형 IGF-1 (뉴클레오티드 및 아미노산)
8	전장 인간 간-유형 IGF-1 (아미노산 단독)
9	전장 래트 간-유형 IGF-1 (뉴클레오티드 및 아미노산)
10	전장 래트 간-유형 IGF-1 (아미노산 단독)
11	전장 토끼 간-유형 IGF-1 (뉴클레오티드 및 아미노산)
12	전장 토끼 간-유형 IGF-1 (아미노산 단독)
13	서열 4의 aa 87 내지 111에 상응하는 합성 펩티드
14	서열 6의 aa 87 내지 111에 상응하는 합성 펩티드
15	Arg109→His (=서열 15 번호체계 이용시 Arg23→His)를 갖는 서열 2의 aa 87 내지 110에 상응하는 합성 펩티드
16	Ser5→Ala를 갖는 서열 15의 펩티드
17	Ser12→Ala를 갖는 서열 15의 펩티드
18	Ser18→Ala를 갖는 서열 15의 펩티드
19	Arg14→Ala를 갖는 서열 15의 펩티드
20	Arg14→Ala, Arg15→Ala를 갖는 서열 15의 펩티드
21	Arg14→Ala를 갖는 서열 15의 aa 1 내지 22에 상응하는 합성 펩티드
22	Arg14→Ala를 갖는 서열 15의 aa 1 내지 20에 상응하는 합성 펩티드
23	Arg14→Ala 및 Arg23→His를 갖는 서열 15의 aa 4 내지 24에 상응하는 합성 펩티드
24	Arg14→Ala 및 Arg23→His를 갖는 서열 2의 aa 6 내지 24에 상응하는 합성 펩티드
25	Arg109→His를 갖는 서열 1의 서열 (뉴클레오티드 및 아미노산)
26	Arg109→His를 갖는 서열 2의 서열 (아미노산 단독)
27	서열 2의 aa 87 내지 110에 상응하는 합성 펩티드
28	Ser5→Ala를 갖는 서열 27의 펩티드
29	Ser12→Ala를 갖는 서열 27의 펩티드
30	Ser18→Ala를 갖는 서열 27의 펩티드
31	Arg14→Ala를 갖는 서열 27의 펩티드
32	Arg14→Ala, Arg15→Ala를 갖는 서열 27의 펩티드
33	서열 15의 8개의 C-말단 아미노산에 상응하는 펩티드
34	서열 27의 8개의 C-말단 아미노산에 상응하는 펩티드
35	서열 18의 8개의 C-말단 아미노산에 상응하는 펩티드
36	서열 30의 8개의 C-말단 아미노산에 상응하는 펩티드

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 50개 이하의 아미노산 잔기 길이이다. 이는 예를 들어 10개 이하의 아미노산 길이, 30개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 아미노산 길이, 또는 35개 이하, 40개 이하, 45개 이하 또는 50개 이하의 아미노산 길이일 수 있다. 바람직하게는, 이는15개 내지 30개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 20개 내지 28개, 가장 바람직하게는 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 또한, 5개 내지 10개의 아미노산 길이, 즉 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 길이의 폴리펩티드, 특히 8개의 아미노산 길이의 폴리펩티드가 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는 IGF-I의 MGF 이소형의 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열을 포함한다. 상기 논의한 바와 같이, MGF 이소형은 IGF-I의 C-말단에서 발견되는 C-말단 E 펩티드의 리딩 프레임을 연장시키고 변화시켜 Ec 또는 Eb 펩티드를 생성하는 삽입체가 교호 스플라이싱에 의해 mRNA로 도입된 것이다. MGF 이소형은 전형적으로 서열 2, 서열 4, 또는 서열 6의 MGF 중 하나와 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상 또는 90％ 이상의 서열 동일성을 가질 것이다. 인간 MGF (서열 1 및 서열 2)에서, 삽입체는 49개 염기쌍이고, C-말단 E 펩티드는 24개 아미노산 길이인 Ec 펩티드 (서열 27)로 공지되어 있다. 래트 및 토끼 MGF (서열 3 내지 서열 6)에서, 삽입체는 49개 염기쌍이고, C-말단 E 펩티드는 25개 아미노산 길이인 Eb 펩티드 (서열 13 및 서열 14)로 공지되어 있다. 본 발명의 서열은 임의의 상기 MGF C-말단 E 펩티드 또는 임의의 다른 종의 MGF로부터 얻은 임의의 다른 C-말단 E 펩티드에서 유래될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드에 포함되는 서열 및 MGF 이소형의 C-말단 E 펩티드에서 유래된 서열은 생물학적 활성 및 안정성 (하기 참조)에 대한 요건을 만족시키는 한, 어떠한 방식으로는 상기 C-말단 E 펩티드에서 유래될 수 있다. 특히, 상기 서열은 정확히 C-말단 E 펩티드의 서열 (예를 들어 서열 13, 서열 14, 서열 27 또는 서열 34)을 가지며 단지 전장 MGF 분자 내에 존재하지 않는다는 점에서 MGF C-말단 E 펩티드에서 유래될 수 있다. 또한, 이는 다시 생물학적 활성 및 안정성 (하기 참조)에 대한 요건을 만족시키는 한, 펩티드의 서열이 변화된다는 점에서 (하기 "변형" 참조) MGF C-말단 E 펩티드에서 유래될 수 있다.

최대 길이 50개 아미노산 이하로, 폴리펩티드는 또한 C-말단 E 펩티드에서 유래된 서열에 대한 천연 MGF 서열 N-말단을 포함할 수 있다. 별법으로, 임의의 추가 서열은 MGF-유도되지 않을 수 있으며, 즉 이는 다시 생물학적 활성 및 안정성 (하기 참조)에 대한 요건을 만족시키는 한 임의의 서열일 수 있다.

C-말단 MGF E 펩티드에서 유래된 서열은 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상의 아미노산, 예를 들어 인간 C-말단 MGF Ec 펩티드의 경우 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개의 아미노산 또는 래트 또는 토끼 C-말단 MGF Eb 펩티드의 경우 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산을 포함할 수 있다. 별법으로, 이는 10개 이하의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 10개의 아미노산, 즉 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산, 특히 8개의 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 함께 조립되어 2개 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 더 큰 구조, 예를 들어 본 발명의 동일한 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드의 다중 카피 또는 상이한 것들의 혼합물을 형성할 수 있다. 폴리펩티드의 특성에 따라, 특히 이들이 어떠한 L-D 전환 (하기 참조)을 함유하든지, 이들 구조는 보통 코딩 DNA로부터의 표준 기술에 의한 재조합 발현에 의해 융합 단백질로서 만들어지거나, 합성에 의해 조립되거나, 융합 단백질로 발현된 후 적절히 화학 변형될 수 있다.

본 발명의 연장된 폴리펩티드

본 발명의 연장된 폴리펩티드는 비-야생형 서열에 의해 연장된 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. 이는 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단이 천연 MGF 서열을 나타낸다면, 상기 서열은 천연 MGF에서 그것에 인접하는 임의의 서열로 단순히 연결될 수 없다는 점에서, 임의의 연장 서열이 비-MGF 서열임을 의미한다. 이 외에도, 연장은 임의의 서열을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 임의의 길이의 아미노산 서열에 의해 C-말단 및 N-말단 중 어느 하나 또는 둘다에서 연장될 수 있다. 예를 들어, 연장은 5개 이하, 10개 이하, 20개 이하, 50개 이하, 또는 100개 이하 또는 200개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 전형적으로, 임의의 이러한 연장은 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 아미노산 길이와 같이 짧을 것이다. 연장은 예를 들어 엑소펩티다제 공격을 감소시키기 위하여 D형 아미노산 (하기 참조)을 함유하거나 또는 심지어 완전히 이것으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 둘다에서 1 내지 5개의 D형 아미노산에 의해 연장될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서는 C-말단에 추가의 시스테인 잔기가 혼입될 수 있다.

변형

본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 미변형 E 펩티드 (상기 폴리펩티드는 이로부터 유래된 서열을 포함함)에 비해 그의 안정성을 증가시키는 임의의 방식으로 변형될 수 있다. 안정성은 다양한 방식으로 증가될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 C-말단 및/또는 N-말단에 대한 변형 (예를 들어 PEG화 또는 다른 화학적 변형 또는 L-D형 아미노산 전환)은 고리화될 때 엑소펩티다제 공격에 대해 이를 보호할 것이고, 내부 변형 (예를 들어 치환, 결실, 삽입 및 내부 L-D형 전환)은 절단 부위를 파괴함으로써 엔도펩티다제에 의한 절단에 대해 이를 보호할 것이라고 여겨진다.

예를 들면, 다른 부위, 예를 들어 C-말단 및 C-말단과 N-말단 사이에서의 PEG화도 고려되지만, 바람직하게는 N-말단에서 PEG화의 위치가 제어될 수 있는 정도로 PEG화될 것이다. PEG화는 폴리펩티드로의 PEG의 공유 부착과 관련된다. 생성된 PEG화된 폴리펩티드가 생물학적 활성 및 안정성 (하기 참조)에 대한 요건을 만족시키는 한, PEG의 임의의 적합한 유형, 예를 들어 임의의 적합한 분자량을 사용할 수 있다.

안정화를 달성하기 위해서든지 아니든지, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 PEG화와 함께 또는 PEG화 대신에 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형으로는 글리코실화, 황산납화(sulphation), 아미드화 및 아세틸화 등이 있다. 특히, 바람직하게는 폴리펩티드가 N-말단에서 아세틸화되거나 C-말단에서 아미드화되거나 둘다이다. 별법으로 또는 추가로, 하나 이상의 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분, 바람직하게는 하나의 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분이 통상적으로는 N-말단에서 첨가될 수 있다.

추가로 또는 별법으로, 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드는 하나 이상의 D형 아미노산을 포함할 수 있다. 천연적으로, 아미노산은 L형으로 존재한다. D-형 아미노산을 삽입하는 것은 안정성을 개선시킬 수 있다. 전형적으로, 약간의, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 D형 아미노산을 사용할 수 있다. 그러나, 생성된 PEG화된 폴리펩티드가 생물학적 활성 및 안정성 (하기 참조)에 대한 요건을 만족시키는 한, 더 많은 수, 예를 들어 5개 내지 10개, 10개 내지 15개, 15개 내지 20개 또는 20개 이상을 사용할 수도 있다. 이러한 요건이 만족된다면, D형 아미노산을 사용하여 심지어 전체 폴리펩티드를 합성할 수 있다.

폴리펩티드의 임의의 위치에서 D형 아미노산을 사용할 수 있다. 서열 27의 인간 MGF C-말단 E 펩티드에서, 위치 14 및 위치 15에서의 아르기닌 중 하나 또는 둘다를 D형 아미노산으로 대체하는 것이 바람직하다. 또한, 서열 13 및 서열 14의 래트 및 토끼 서열 (위치 14, 위치 15 및 위치 16, 인간이 오직 2개의 아르기닌을 가지는 반면 래트/토끼 서열은 연속으로 3개의 아르기닌을 포함하기 때문에)에서 및 서열 15의 변이체 서열에서 상응하는 변화도 바람직하다.

입체화학적 및/또는 방향성(directional) 펩티드 이성질체가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 레트로 (RE) 펩티드를 사용할 수 있는데, 여기서 본 발명의 서열은 L-아미노산으로부터, 그러나 반대 순서로 조립된다. 별법으로, 레트로-인버소 (RI) 펩티드를 사용할 수 있으며, 여기서 서열은 역전되고 D-아미노산으로부터 합성된다.

추가로 또는 별법으로, D형 아미노산이 폴리펩티드의 한쪽 말단 또는 다른쪽 말단, 또는 둘다에 포함될 수 있다. 이는 엑소펩티다제 공격에 대해 보호하는 것을 도와줄 것이라고 여겨진다. 이는 MGF C-말단 E 펩티드에서 유래된 서열의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 둘다의 말단 아미노산, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 말단 아미노산을 D형으로 전환함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 이는 폴리펩티드의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 둘다에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가의 D형 아미노산을 첨가함으로써 달성할 수 있다. 이러한 추가의 아미노산은 천연 MGF에서의 MGF C-말단 E 펩티드에서 유래된 서열에 인접한 것과 상응할 수도 있고 아닐 수도 있다. 이러한 추가의 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있다. 이러한 방식으로 D형에 첨가할 수 있는 아미노산은 아르기닌이다. 예를 들어, D형 아르기닌 잔기가 N-말단, C-말단 또는 둘다에 첨가될 수 있다.

한 실시양태에서, 서열 27의 천연 인간 MGF C-말단 E 펩티드의 서열은 유지되나, 서열 27의 위치 14 및 위치 15에서의 아르기닌은 D형으로 전환되고 N-말단 PEG화가 제공된다. C-말단 아미드화가 제공될 수도 있다.

또다른 실시양태에서, 서열 15의 인간 MGF C-말단 E 펩티드 변이체의 서열은 유지되나, 서열 15에서의 아르기닌 14 및 아르기닌 15는 D형으로 전환되고 N-말단 PEG화가 제공된다.

몇몇 추가의 실시양태에서, 서열 15 또는 서열 27로부터의 8개의 C-말단 아미노산의 서열, 즉 서열 33 또는 서열 34의 서열이 사용되고 N-말단 PEG화가 제공되거나, 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분이 C-말단에 첨가된다. C-말단 아미드화가 제공될 수도 있다.

별법으로 또는 추가로, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 변형, 예를 들어 말단절단, 삽입, 내부 결실 또는 치환을 포함할 수도 있다.

말단절단과 관련하여, 또한 서열 15의 C-말단 8개 아미노산을 바탕으로 하는 더 짧은 펩티드가 활성임을 발견하였다. 그러나, 하기 실시예 5에서의 결과는 MQF C-말단과 관련된 더 긴 펩티드의 활성이 말단절단, 특히 상기 펩티드의 N-말단의 말단절단에 대해 매우 감수성일 수 있음을 암시한다. 서열 15의 펩티드의 N-말단에서, 3개 아미노산에 의한 말단절단은 실시예 5에 사용된 근육 세포 모델에서의 활성 손실을 야기하였다. 서열 15의 펩티드의 C-말단에서, 4개 아미노산에 의한 말단절단은 2개 아미노산에 의한 말단절단이 그렇지 않았던 것에도 불구하고 근육 세포 모델에서의 활성 손실을 야기하였다. 그러므로, 천연 인간, 래트 및 토끼 E 펩티드 서열의 경우에서 및 서열 15의 변이체 및 천연 펩티드의 길이와 유사한 길이를 갖는 본 발명의 다른 펩티드 (예를 들어 18개 이상의 아미노산)에서, 활성의 손실 없이 C-말단에서 1개, 2개 또는 3개 아미노산에 의해 말단절단하는 것이 가능할 것이라고 여겨진다. 또한, 활성의 손실 없이 N-말단에서 1 또는 2개 아미노산에 의해 말단절단하는 것이 가능할 것이라고 여겨진다.

삽입과 관련하여, 생성된 폴리펩티드가 생물학적 활성 및 안정성 (하기 참조)에 대한 요건을 만족시키고 50개 미만의 아미노산을 포함하는 한, 아미노산의 짧은 스트레치를 인간 C-말단 MGF E 펩티드의 것에서 유래된 서열로 삽입할 수 있다. 각 삽입체는 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 아미노산을 포함할 수 있다. 하나 이상의, 예를 들어 2개, 3개, 4개 또는 5개의 이러한 삽입이 존재할 수 있다.

내부 결실과 관련하여, 생성된 폴리펩티드가 생물학적 활성 및 안정성 (하기 참조)에 대한 요건을 만족시키는 한, 아미노산의 짧은 스트레치가 인간 C-말단 MGF E 펩티드의 것에서 유래된 내부 서열로부터 결실될 수 있다. 1개 이상의 이러한 결실, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 결실은 예를 들어 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 아미노산까지 행해질 수 있다.

치환과 관련하여, 생성된 폴리펩티드가 생물학적 활성 및 안정성 (하기 참조)에 대한 요건을 만족시키는 한, 원칙적으로 폴리펩티드 내의 임의의 아미노산이 임의의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 하나 이상의 이러한 치환, 예를 들어 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 이하 또는 20개 이하의 치환이 행해질 수 있다. 바람직하게는, MGF C-말단 E 펩티드에서 유래된 서열에서, 10개 이하의 치환, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 치환이 행해질 것이다. 바람직하게는, MGF C-말단 E 펩티드에서 유래된 서열에서, 아미노산 잔기의 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상 또는 90％ 이상이 상기 서열이 유도된 천연 MGF C-말단 E 펩티드에서와 동일할 것이다. 한 바람직한 접근법에서는, 폴리펩티드의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 둘다에 있는 잔기 (말단 잔기)가 치환된다. 이는 엑소펩티다제 공격에 대해 보호할 것이라고 여겨진다. 따라서, 예를 들어 N-말단 및 C-말단 위치에서, 또는 말단 위치에 직접 인접한 위치에서, 또는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 둘다로부터 3, 4 또는 5 위치 이하에서 잔기를 치환하는 것이 바람직할 수 있다.

치환은 안정성 또는 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예 5 및 도 2에서 논의된 결과는 서열 15의 펩티드의 위치 5, 위치 12, 위치 14 및 위치 18 중 하나 이상이 치환되는 것이 안정성을 증가시킬 수 있음을 암시한다. 동일한 결과는 위치 12, 위치 14 및 위치 18에서의 치환도 생물학적 활성을 증가시킬 수 있음을 보여준다. 그러므로, 서열 27 및 15의 펩티드의 위치 5, 위치 12, 위치 14 및 위치 18 및 서열 33 및 34의 위치 2 (이는 서열 a5 및 서열 27의 위치 18에 상응함)에서의 치환이 바람직하다. 서열 13 및 서열 14의 래트/토끼 MGF C-말단 E 펩티드의 위치 5, 위치 12, 위치 15 및 위치 19로의 상응하는 치환도 바람직하다.

서열 27 또는 서열 15의 위치 5, 위치 12, 위치 14 또는 위치 18, 서열 33 및 서열 34의 위치 2, 서열 13 및 서열 14의 위치 5, 위치 12, 위치 15 및 위치 19에서든 아니든, 실시예 5 및 도 2에 나타난 바와 같이, 천연 아미노산을 알라닌으로 치환하는 것은 한 바람직한 선택이다. 그러나, 다른 아미노산을 동일하게 사용할 수 있다.

별법으로 또는 추가로, 폴리펩티드는 안정성 또는 생물학적 활성에 유의한 효과를 주지 않는 치환을 포함할 수 있다. 이는 전형적으로 보존적 치환일 것이다. 보존적 치환은 예를 들어 하기 표에 따라 행해질 것이다. 제2 컬럼의 동일한 블럭에서의 아미노산, 바람직하게는 세번째 컬럼의 동일한 줄에서의 아미노산은 서로 치환될 수 있다.

지방족	비극성	GAP
		ILV
	극성-비전하	C S T M
		N Q
	극성-전하	D E
		K R
방향족		H F W Y

전형적으로, 본 발명의 폴리펩티드에서의 아미노산 서열 변형, 예를 들어 L-D 전환, 치환, 삽입 및 결실은 MGF C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열에서 발견될 것이다. 그러나, 상기 폴리펩티드가 추가의 MGF 서열을 함유하는 경우, 이는 별법으로 또는 추가로 추가의 서열에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드가 천연 MGF에서 E 펩티드의 서열 (예를 들어 서열 13, 서열 14 또는 서열 27)에 대한 N-말단인 추가의 MGF 서열을 함유한다면, 상기 서열에서는 변형이 발견될 수 있다.

별법으로 또는 추가로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드의 고리화에 의해서도 안정성이 증가될 수 있다. 이는 엑소펩티다제 공격에 대해 보호할 것이라고 여겨진다.

바람직한 본 발명의 폴리펩티드로는 하기의 것 등이 있다.

(i) 24개 아미노산 길이이고 서열 15의 서열을 가지나, 서열 15의 2개의 아르기닌 (위치 14 및 위치 15)을 L형에서 D형으로 전환시킴으로써 및 N-말단 PEG화에 의해 안정화된 펩티드.

(ii) 상기 (i)에서와 같으나 PEG화가 없는, 즉, 서열 15의 서열을 가지나, 서열 15의 2개의 아르기닌 (위치 14 및 위치 15)을 L형에서 D형으로 전환시킴으로써 안정화된 펩티드.

(iii) 실시예 5 및 도 2에서 펩티드 2, 3, 4 및 5 (서열 16 내지 서열 19)로 기재된 펩티드.

(iv) 서열 19의 서열을 가지나 (여기서 위치 14에서의 아르기닌이 알라닌으로 대체되어 있음) C-말단에서 2개의 아미노산에 의해 말단절단된, 실시예 5 및 도 2에서 짧은 펩티드 1 (서열 21)로 기재된 펩티드.

(v) 말단에서 두번째 위치에 히스티딘이 아닌 아르기닌을 함유하는, 상기 (i)의 펩티드와 상응하나 서열 27의 천연 인간 C-말단 펩티드를 바탕으로 하는 펩티드, 즉 서열 27의 서열을 가지나, 서열 27의 위치 14 및 위치 15에서 2개의 아르기닌을 L형에서 D형으로 전환시킴으로써 및 N-말단 PEG화에 의해 안정화된 펩티드.

(vi) 상기 (v)에서와 같으나 PEG화가 없는, 즉, 서열 27의 서열을 가지나 서열 27의 위치 14 및 위치 15에서 2개의 아르기닌을 L형에서 D형으로 전환시킴으로써 안정화된 펩티드.

(vii) 본원에서 서열 28 내지 서열 31로 나타낸, 말단에서 두번째 위치에 히스티딘이 아닌 아르기닌을 함유하는, 상기 (iii)의 펩티드와 상응하나 서열 27의 천연 인간 C-말단 펩티드를 바탕으로 하는 펩티드.

(viii) N-말단 PEG화 또는 N-말단 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분의 부착을 갖는 서열 33 내지 서열 36 중 임의의 서열의 펩티드.

(ix) C-말단 아미드화를 갖는 상기 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), 또는 (vii)의 펩티드 중 임의의 것, 특히 C-말단 아미드화를 갖는 상기 (ii) 및 (vi)의 펩티드, 즉 위치 14 및 위치 15에서 L-아르기닌의 D-아르기닌으로의 전환 및 C-말단 아미드화를 가지나 PEG화가 없는 서열 15 및 서열 27의 서열을 갖는 펩티드.

(x) C-말단에 추가의 시스테인 잔기를 갖는 상기 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii) 또는 (ix)의 펩티드 중 임의의 것.

(xi) N-말단에 추가의 D형 아르기닌 잔기를 갖는 상기 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii) 또는 (ix)의 펩티드 중 임의의 것.

본 발명에 따른 변형은 안정성 증가 뿐만 아니라 추가의 장점을 부여할 수 있다. 예를 들어, 이는 증가된 치료 활성을 부여하거나, 면역학적 관점에서 유리할 수 있다 (예를 들어 면역원성 감소를 통해). 이는 특히 L-D 전환 및/또는 입체화학적 및/또는 방향적 이성질체화 (상기 참조)와 관련된 변형에 적용된다.

생물학적 활성

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 생물학적 활성을 갖는다. 이러한 활성은 하기 기재로부터 선택될 수 있다.

마우스, 인간 또는 다른 포유동물의 근이영양성 및/또는 비-근이영양성 골격근의 근육 강도 증가 능력 (하기 실시예 2 참조). 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 펩티드는 근이영양성 및/또는 비-근이영양성 근육의 근육 강도 (예를 들어, 최대 얻을 수 있는 강축력에 의해 측정함)를 5％ 이상, 10％ 이상, 20％ 이상, 25％ 이상, 30％ 이상, 50％ 이상, 75％ 이상 또는 100％ 이상 증가시킬 수 있을 것이다.

양, 마우스, 인간 또는 다른 포유동물의 심근보호 능력 (하기 실시예 3 참조). 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 경색된 또는 기계적으로 과부하된 심장의 심근 손상을 예방하거나 제한하는 능력을 가질 것이다. 이는 압력/부피 루프에 의해, 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드가 투여되지 않은 경색된 심장과 비교하여 박출율을 증가시키는 능력을 참고하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 박출율을 1％ 이상, 2％ 이상, 3％ 이상, 4％ 이상, 5％ 이상, 6％ 이상, 7％ 이상, 8％ 이상, 9％ 이상 또는 10％ 이상 또는 그 이상으로 증가시키는 능력을 가질 것이다.

마우스, 게르빌루스쥐(gerbil), 인간 또는 다른 포유동물의 시험관내 또는 생체내 신경보호 능력 (하기 실시예 4 참조). 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 래트 기관형적 해마 배양물 및/또는 다른 유사한 시험관내 모델에서 세포 사멸을 감소시키는 능력을 가질 것이다. 바람직하게는, 산화성 스트레스를 유도하거나 다른 방식으로 손상을 유발하는 TBH 또는 기타 또다른 작용제에 노출된 후, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 상기 모델에서 세포 사멸을 20％ 이상, 25％ 이상, 30％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상 또는 90％ 이상 또는 그 이상으로 감소시키는 능력을 가질 것이다. 별법으로 또는 추가로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 신경보호 능력을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 전장 MGF (예를 들어, 서열 2, 4 또는 6)를 특징으로 하는 1종 이상의 생물학적 성질을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 제WO 97/33997호에서 확인된 MGF의 관능성 성질을 가질 수 있다. 특히, 골격근 조직의 성장을 유도하는 능력을 가질 수 있다. 유사하게, 본원에서 논의된 바와 같이, 골격근 복구에 필요한 단백질 합성을 상향조절하고/거나 골격근의 수반(satellite) (줄기) 세포를 활성화시키는 능력을 가질 수 있다.

이와 관련하여, 생물학적 활성을 평가하는 한 방법은 실시예 5.2.2에서 논의된 바와 같은 알라마르 블루 방법(Alamar Blue method)이다. 이 방법은 폴리펩티드를 단핵 근육모세포와 접촉시키고 이를 증식하도록 유발하는 정도를 평가하는 것을 포함한다. 이는 실시예에서 논의된 바와 같이 임의의 적합한 방식으로 (예를 들어 0 내지 3의 스케일) 스코어링될 수 있다. 활성은 또한 사이클린, 예컨대 세포 분열의 초기 마커인 사이클린 1D을 통해 측정될 수 있다. 활성은 또한 브로모데옥시 유리딘 (BrdU)의 사용을 통해 측정될 수 있다. BrdU는 DNA 복제 동안 티미딘을 그 자신으로 치환할 것이며, 이에 따라 DNA가 복제 진행 중인 세포를 확인하고, 복제 및 세포 분열이 얼마나 일어나는 가를 측정하는데 사용될 수 있다.

별법으로 또는 추가로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 제WO 01/136483호에서 이미 확인된 신경학적 성질을 가질 수 있다. 따라서, 이는 운동뉴런 구조를 수행하는 능력을 가질 수 있다. 특히, 이는 미처치 대상체에서의 동등한 상황과 비교하여 처치된 대상체에서 신경 적출 후 운동뉴런 손실을 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100％ 이하로 감소시킬 수 있다. 70％ 이상, 또는 80％ 이상 (즉 30％ 이하로 또는 20％ 이하로) 운동뉴런 손실을 감소시키는 것이 바람직하다. 구조의 정도는 임의의 적합한 기술, 예를 들어 공지된 기술, 예컨대 입체학을 이용하여 계산될 수 있다. 특정 시험으로서, 래트의 안면 신경 적출에 응하여 운동뉴런 구조를 측정하는 것에 의존하는, 제WO 01/136483호에 사용된 기술이 사용될 수 있다.

별법으로 또는 추가로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 심근의 근육 세포의 세포 사멸 또는 세포자멸(apoptosis)을 예방함으로써 허혈 또는 기계적 과부하 후 심근 손상을 예방하거나 제한하는 능력을 지칭하는, 제WO 03/060882호에서 확인된 성질을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 적용되는 심장 근육의 영역에서 세포자멸을 완벽하게 예방하는 능력을 가질 것이다. 그러나, 세포자멸은 또한 오직 부분적으로만 예방, 즉 제한할 수 있다. 본 발명의 처치 없이 발생되는 것과 비교하여 임의의 손상 감소가 달성되는 경우, 예를 들어, 사멸하는 세포의 수 또는 비율에 의해, 또는 기능이 손실된 근육의 면적 크기에 의해, 또는 혈액을 펌핑하는 심장의 전체 능력에 의해 측정되는 바와 같은 손상이 1％ 이상, 5％ 이상, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 50％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 감소되는 경우에 손상은 제한된다.

특히, 손상의 감소는 침습 방법을 최소로 사용하여 심박출량, 박출율 등을 결정함으로써 생체내 추정될 수 있다. 혈청 중 마커, 예컨대 크레아틴 키나제 및 트로포닌 T이 또한 검정될 수 있다. 이들은 상해 후 심장 근육에의 손상 정도를 결정하는 임상 상황에서 사용되는 파라미터이다.

세포자멸을 예방하는 능력은 임의의 적합한 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 실시예 4 및 도 3 및 6을 참고로, DNA 단편화에 의해 표시되는 심장 근육 세포 또는 심장-유사 세포주의 세포자멸을 예방하는 능력에 의해 측정될 수 있다. DNA 단편화에 의해 표시되는 세포자멸을 예방하는 능력은 예를 들어, 1, 2, 4, 6, 12, 24 또는 48시간 이하, 바람직하게는 12 내지 24시간, 더욱 바람직하게는 24시간 동안 삼투압 스트레스하에 세포를 두는 소르비톨 또는 또다른 작용제로 세포를 처리하고, 세포자멸과 관련된 단편화의 패턴이 관찰될 수 있는가를 조사함으로써 시험될 수 있다. 상기 방식으로 발현되는 본 발명의 MGF 폴리펩티드는 전형적으로 미처치 세포와 비교하여 소르비톨 처치 후 12 또는 24시간 후 상기 조건하에 DNA 단편화를 감소, 바람직하게는 제거할 것이다.

세포자멸에 대한 마커로서 작용하는 유전자의 발현 부재 또는 낮은 발현은 또한 세포자멸의 예방의 지표로서 작용할 수 있다. 적합한 마커 중 하나는 백스(Bax) 유전자이다. 유사하게, 세포자멸 조건하에 MGF-형질감염된 세포 중 항-세포자멸 마커의 증가된 발현은 본 발명의 폴리펩티드가 세포자멸을 예방하고 있다는 신호로서 받아들여질 수 있다. 적합한 항-세포자멸 마커 유전자 중 하나는 Bcl2이다. 세포자멸을 예방하는 능력은 또한 시험관내 근육세포의 세포 수 감소를 예방하는 MGF 폴리펩티드의 능력을 참고하여 측정될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드의 또다른 바람직한 특성은 심장 근육 세포에 비대성 표현형을 유도하는 능력이다. 특히, 이는 시험관내 일차 심장 근육세포 배양물 중 비대성 표현형을 유도하는 능력을 평가함으로써 시험될 수 있다. 이를 결정하는 바람직한 방법은 ANF (Atrial Natriuretic Factor) 및/또는 bMHC (Beta Myosin Heavy Chain)의 발현의 증가에 대해 시험하는 것이다. ANF는 비대성 상태에서 상향조절되는 배아 마커 유전자이다. bMHC는 근육에서 중요한 수축 단백질이다.

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드의 안정성

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 유래된 서열을 함유하는 천연 C-말단 MGF E 펩티드와 비교하여 안정성을 증가시켰다. 이러한 비교는 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드와 천연 C-말단 MGF E 펩티드를, 그의 단리된 미변형 형태 (예를 들어, MGF 분자의 나머지로부터 분리된, 서열 13, 서열 14, 27 또는 34의 미변형 형태 및 24-mer (서열 27) , 25-mer (서열 13/14) 또는 8-mer (서열 34)로서 단리된 형태)로 비교하여 이루어진다. 비교는 또한 서열 15 및 33의 히스티딘-함유 서열로 이루어질 수 있다. 안정성은 본원에서 논의되는 변형을 통해 임의의 정도로 증가될 수 있다.

안정성은 인간 혈장 중에서의 반감기에 의해 또는 임의의 다른 적합한 기술에 의해 평가될 수 있다. 특히, 안정성은 하기 실시예 5.1의 기술에 따라 신선한 인간 혈장 중 단백질분해성 절단에 대한 펩티드의 감수성을 평가함으로써 측정될 수 있으며, 여기서 혈장을 -70℃에서 사용할 때까지 저장하고, 펩티드 10 ㎍을 혈장 2 ml 및 PBS 7 ml에 첨가하고, 혼합물을 상이한 시간 간격으로 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 웨스턴 블럿팅을 사용하여 상기 시간 간격에 걸쳐 각 펩티드를 검출하였다 (도 7에서: A = 0분; B = 30분; C = 2시간; D = 24시간. L-D 전환 및 N-말단 PEG화를 갖는 펩티드에 대한 결과는 오른쪽에 나타내고; L형의 D형으로의 전환 및 N-말단 PEG화가 결핍된 펩티드에 대한 결과는 왼쪽에 나타냄). L-D 전환 및 N-말단 PEG화가 결핍된 펩티드의 상대적 적음은 30분 후, 2시간 직후 및 24시간 정각 또는 24시간 직후에 검출될 수 있었다. 대조적으로, L-D 전환 및 N-말단 PEG화를 갖는 펩티드는 매우 대량으로 2시간 및 24시간에 검출될 수 있었다.

안정성의 다른 측정은 시간에 따른 생물학적 활성의 손실을 결정하는 것에 기초할 수 있다. 이는 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 본원에서 논의되는 생물학적 활성의 임의의 측정에 대한 시험관내 검정을 통해 수행될 수 있다.

정량적으로, 상대적인 기간에서, 바람직한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 상응하는 미변형 MGF C-말단 E 펩티드와 비교하여 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 80％ 이상, 100％ 이상, 200％ 이상 또는 500％ 이상으로 증가되는 반감기를 가질 수 있다.

정량적으로, 절대적인 기간에서, 바람직한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 1시간 이상, 2시간 이상, 4시간 이상, 8시간 이상, 마지막 12시간, 24시간 이상 또는 48시간 이상 또는 그 이상의 반감기를 가질 수 있다.

별법으로, 안정성의 정성적 또는 유사정량적 측정이 실시예 5 및 도 2에서와 같이, 예를 들어 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드의 안정성을 0 내지 3의 스케일로 스코어링함으로써 사용될 수 있다. 상기 스케일로, 서열 15의 폴리펩티드는 1을 스코어링하였다. 특정 다른 변형된 본 발명의 폴리펩티드는 2 또는 3을 스코어링하였다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 상응하는 천연 MGF C-말단 E 펩티드보다 높게 상기 스케일로 일반적으로 스코어링할 것이다.

본 발명의 추가 펩티드

본 발명의 펩티드 중 많은 것들이 상기 논의된 바와 같이 안정화될 것이나, 서열 13, 14, 27 및 34의 천연 폴리펩티드 또는 서열 15 및 33의 히스티딘-함유 변이체를 비롯하여 불안정화된 폴리펩티드를 사용하는 것은 특정 환경하에서 가능할 수 있다. 본 발명에 따른 신경학적 및 심장 장애의 치료에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드가 상대적으로 빠르게 분해하는 것, 즉 상대적으로 짧은 기간 동안 그의 효과를 발휘하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 안정화는 상기 처치의 상황에서 필수적으로 요구되지는 않을 것이다.

안정화가 요구되지 않는 경우, 안정화시키는 변형이 없는 서열 13, 14, 27 및 34의 천연 폴리펩티드 또는 서열 15 또는 33의 히스티딘-함유 변이체를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 변형된 폴리펩티드가 또한 사용될 수 있다. 본원에서 논의되는 임의의 변형은 본 측면에서 이러한 변형이 증가된 안정성을 가져온다는 것이 필요되지 않는다는 것을 제외하고 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 치료

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 많은 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 광범위하게, 이러한 상태는 하기 세가지 영역으로 분류된다: 골격근 장애, 심장 근육 장애 및 신경계 장애. 그러나, 신경 및 근육 기능은 상호 의존적이므로, 이들은 이들 카테고리에서, 예를 들어 신경근육 장애의 영역에서 일부 중복될 수 있다.

신경계 장애는 일반적으로 두가지 카테고리, 즉 신경계 자체에 결함이 있는 신경원성 장애 및 근원성 또는 근육-관련 신경계 장애로 분류될 수 있다. 상기 두가지 카테고리는 모두 본 발명에 따라 치료될 수 있다.

본 발명에 따른 치료에 감수성이 있는 골격근 장애에는 뒤시엔느(Duchenne) 또는 벡커(Becker) 근이영양증, 안면견갑상완 근이영양증 (FSHD), 선천성 근이영양증 (CMD) 및 상염색체 근이영양증을 포함하나 이에 제한되지 않는 근이영양증, 및 관련된 진행성 골격근 무력 및 쇠약; 무용성 위축증, 글루코코르티코이드-유도된 위축증, 노화된 인간의 근위축증 및 척수 상해 또는 신경근육 질환에 의해 유도된 근위축증을 포함하나 이에 제한되지 않는 근위축증; 악액질, 예를 들어 암, AIDS, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성 염증 질환, 화상 등과 관련된 악액질; 근육 약화, 특히 특정 근육, 예를 들어 요도 괄약근, 항문 괄약근 및 골반 저근의 근육 약화; 노년 대상체의 근감소(sarcopenia) 및 허약(frailty)이 포함된다. 본 발명은 또한 외상 후의 근육 복구에 적용된다. 신경계 장애가 관련되는 한, 신경변성 장애의 치료가 하나의 가능성이다. 운동뉴런 장애, 특히 운동뉴런의 신경변성 장애의 치료가 또한 하나의 가능성이다.

신경학적 (신경근육 포함) 장애의 예로는 근위축성 측삭 경화증; 척수 근위축증; 진행성 척수 근위축증; 영아성 근위축증 또는 연소성 근위축증, 회백수염 또는 포스트-폴리오(post-polio) 증후군; 독소에의 노출, 운동뉴런 외상, 운동뉴런 병변 또는 신경 손상에 의해 야기되는 장애; 운동뉴런에 영향을 주는 상해; 및 노화와 관련된 운동뉴런 손실; 및 상염색체 및 또한 성(sex)-관련 근이영양증; 알쯔하이머병; 파킨슨병; 당뇨병성 신경병증; 말초 신경병증; 색전성 및 출혈성 뇌졸중; 및 알콜-관련 뇌 손상이 포함된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 중추 신경계 (CNS)의 유지에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 외상 후의 신경 복구에 적용된다.

신경 손상도 본 발명에 따라 치료될 수 있다. 본 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드는 전형적으로 복구를 수행하는 상기 손상 부위 주위에, 예를 들어 절단된 말초 신경의 두 말단 주위의 통로의 위치에 의해 위치할 것이다 (제WO 01/85781호 참조).

심장 장애에서, 심장 근육 단백질 합성의 촉진이 유리한 치료인 질환들이 언급될 수 있다: 심근증; 급성 심부전 또는 급성 발작 (심근염 또는 심근 경색 포함); 병리적 심장 비대증; 및 울혈성 심부전. 본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 또한 심박 혈액량 증가에 의한 심박출량의 개선에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 허혈 및/또는 기계적 과부하 후 심근 손상의 예방에 사용될 수 있다.

이 경우에, 심장의 허혈 또는 기계적 과부하의 개시 후 가능한 빨리, 예를 들어 허혈에 의한 심장 발작이 진단되자마자 일반적으로 투여될 것이다. 바람직하게는, 5, 10, 15, 30 또는 60분 내에, 또는 2 또는 5시간 내에 투여될 것이다. 바람직하게는, MGF 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 투여에 대한 허혈 또는 기계적 과부하는 일시적인 상태이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 심장 발작에 대응하여 투여된다. 본 발명의 치료는 심장 발작 환자가 양호하게 회복되어 정상의 활동적인 생활로 돌아오는데 특히 효과적일 것이다.

일부 환경하에, 본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드를 다른 제약 활성 작용제와 함께 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 IGF-I와 함께 사용될 수 있다 (실시예 1.5, 7 및 8 참조). 상기 조합된 사용은 다른 제약 활성 작용제 또는 작용제들과 함께 단일 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제 중 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드의 공동투여를 포함할 수 있거나, 동일한 부위에 또는 상이한 부위에 개별적, 순차적인 또는 동시 주사를 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드의 제조

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 펩티드 합성 (필요하다면, 얻어진 아미노산 서열에 적절한 화학적 변형 (예를 들어, PEG화)과 함께)의 표준 기술에 의해 수득될 것이다. D형 아미노산이 없는 경우, 폴리펩티드 및 연장된 폴리펩티드는 대신에 숙주 세포에서 적절한 코딩 DNA로부터 재조합 발현을 통해, 또한 표준 기술에 의해 수득될 수 있다.

임의의 원하는 정도의 단리 및 정제는 또한 표준 기술에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 연장된 폴리펩티드는 일반적으로 단리되거나 완벽하게 또는 부분적으로 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드의 제제는 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드를 제조되었던 제제보다 더 높은 농도로 함유하는 임의의 제제이다. 특히, 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드가 재조합적으로 수득되는 경우, 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드는 전형적으로 숙주 세포로부터 추출될 것이며, 주요 세포 성분이 제거될 것이다.

정제된 형태 중 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드는 제제 중 폴리펩티드 물질의 90％ 초과, 예를 들어 95％ 이하, 98％ 이하 또는 99％ 이하가 본 발명의 것인 제제의 일부를 일반적으로 형성할 것이다.

단리된 및 정제된 제제는 종종 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드를 함유하는 수용액일 것이다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 다른 형태, 예를 들어, 결정 또는 다른 건조 제제로서 정제되거나 단리될 수 있다.

조성물, 제제 , 투여 및 투여량

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 바람직하게는 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물의 형태로 제공된다. 특히, 이러한 조성물은 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물일 수 있다. 임의의 적합한 제약 제제가 사용될 수 있다.

예를 들어, 적합한 제제에는 항산화제, 완충제, 정균제, 살균성 항생제, 및 의도되는 수용자의 체액과 등장인 제제를 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함될 수 있다. 제제는 단위-용량 또는 다중-용량 용기에 존재할 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알은 사용 직전 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수만을 첨가하는 것이 요구되는 동결 또는 동결-건조 (동결건조) 상태로 저장될 수 있다.

상기 구체적으로 언급된 성분들 외에 본 발명의 제제는 당해 제약의 유형에 관한 당업계에 통상적인 다른 작용제를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 멸균, 발열인자-비함유 수성 및 비수용액이 바람직하다.

제제는 일반적으로 표준 제제화 기술에 의해 하기 논의되는 투여 방식에 따라 제제화될 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 치료될 상태에 따라 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 국소, 피부, 비경구, 근육내, 피하 또는 경피 투여; 또는 혈류로의 직접 주사 또는 점막 조직으로의 직접 도포에 의해 투여될 수 있다.

주사는 많은 환경하에 바람직한 경로, 예를 들어 피하, 비경구, 근육내 또는 정맥내 주사일 수 있다. 정맥내 주사는 많은 임상 환경하에 종종 바람직할 것이다. 일명 "무(無)-바늘" 주사 또는 경피 투여는 몇몇 환경하에 가능할 수 있다.

골격근 장애의 치료에서는 정맥내 및 근육내 주사가 바람직한 경로이다. 국소 투여는 또한 복부 근육을 강화시키기 위해 또는 다른 목적을 위해 예를 들어 패치를 통해 이루어진다.

심장 근육 장애의 치료에서 전달은 일반적으로 정맥내일 수 있다. 적절한 임상 환경하에 (예를 들어, 전문의 심장 단위에서) 예를 들어, 폴리펩티드를 심장으로 전달하기 위한 일명 "무-바늘" 주사 시스템을 이용하여 심장으로 직접 전달하는 것도 가능할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 본 발명의 연장된 폴리펩티드는 임의의 적합한 투여량으로 임의의 적합한 투여량 요법을 이용하여 전달될 수 있다. 당업자는 투여량 및 투여요법이 수많은 인자에 따라 치료될 특정 상태의 최적 치료를 위해 채택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 인자 몇몇은 치료될 대상체의 나이, 성별 및 임상 상태일 수 있다.

본 발명자들의 경험을 기초로, 0.2 내지 10 mg의 범위의 용량, 예를 들어 0.2 내지 0.8 mg, 바람직하게는 약 0.5 mg이 효과적일 수 있다고 추정한다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드를 1 mg/ml의 농도로 함유하는 용액은 0.1 내지 1 ml의 양으로 사용될 수 있다. 단일 또는 다중 용량은 당해 적용 및 임상 환경에 따라 달라질 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한다.

1. 펩티드

1.1 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4 및 실시예 6의 펩티드

실시예 2, 실시예 3, 실시예 4 및 실시예 6에서 사용된 펩티드는, 천연 서열 (서열 1, 서열 2 및 서열 27 참조)의 말단에서 두번째 아르기닌을 히스티딘으로 대체한 서열 15의 서열을 갖고, 위치 14 및 위치 15에서 천연 발생 L형 대신 D형 아르기닌의 사용 및 숙신산 가교를 통한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 유도체 (O'O-비스(2아미노프로필)폴리에틸렌 글리콜 1900) (제파민)에 N-말단의 공유 부착으로 안정화되고, C-말단에서 아미드화되었다.

1.2 실시예 5의 펩티드

실시예 5의 펩티드를, 표준 기술을 통해 펩티드 합성기를 이용하여 합성하는 영국 버밍엄에 소재한 알타 바이오사이언시즈(Alta Biosciences)로부터 수득하였다. 이들 펩티드는 PEG화되지 않고, L-D 전환이 없으며, C-말단에서 아미드화되었다.

또한, 상기 1.1과 동일한 L-D 전환을 하지만 PEG화되지 않은, 상기 1.1의 펩티드에 상응하는 펩티드의 안정성도 시험하였다 (하기 5.2.3 참조). 표준 기술을 통해 펩티드 합성기를 이용하여 상기 펩티드를 합성하였다. 생성물을 HPLC로 정제하고, MALDI-MS로 분석하였다.

1.3 실시예 7의 펩티드

1.3.1 실시예 7.1의 펩티드

실시예 7.1의 펩티드는 8개 아미노산 서열 Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys (서열 33)을 갖고, 안정성을 개선하기 위해 추가 변형되었다. 도 8에서 DMGF라고 지칭되는 펩티드에서, 상기 1.1과 같이 N-말단 PEG화를 통해 안정화를 달성하였다. 도 8에서 CMGF라고 지칭되는 펩티드에서, 헥산산의 N-말단 부착을 통해 안정화를 달성하였다. 또한, DMGF 및 CMGF 모두 C-말단에서 아미드화되었다.

1.3.2 실시예 7.2의 펩티드

실시예 7.2에서, 펩티드 A2, 펩티드 A4 및 펩티드 A6은 서열 Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-Arg-Lys (서열 34)을 가졌다. 펩티드 A2, 펩티드 A4 및 펩티드 A6은 C-말단에서 아미드화되었다. 펩티드 A2는 N-말단에서 미변형되었다. 펩티드 A4는 N-말단에 부착된 헥산산 부분을 가졌다. 펩티드 A6은 N-말단에 부착된 아미노-헥산산 부분을 가졌다.

펩티드 A8은 서열 Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys (서열 33)을 갖고, C-말단에서 아미드화되고, N-말단에 부착된 헥산산을 가졌다.

1.4 실시예 8의 펩티드

실시예 8에서 사용된 펩티드는, 천연 서열 (서열 1, 서열 2 및 서열 27 참조)의 말단에서 두번째 아르기닌을 히스티딘으로 대체한 서열 15의 서열을 갖고, 위치 14 및 위치 15에서 천연 발생 L형 대신 D형 아르기닌을 사용하여 안정화되고, C-말단에서 아미드화되었다. 실시예 8에서 사용된 펩티드는 PEG화되지 않았다.

1.5 IGF -I 펩티드

비교를 위해, IGF-I 펩티드를 사용하였다. 이는, 모든 스플라이싱 변이체에서 일반적이고 대략 70개의 아미노산 길이인, 엑손 3 및 엑손 4에 의해 코딩된 IGF-I 수용체 결합 도메인이다. 실시예 1 내지 실시예 4에서, 이는 영국 소재의 페프로테크, 이씨(PeproTech, EC)로부터 수득되었다. 실시예 6에서는, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (ER2 IGF-I)로부터 수득되었다. IGF-I 펩티드는 또한 실시 예 7에서도 사용되었다.

2. 근이영양성 근육에 안정화된 펩티드의 주사

근육내 주사 (화학적으로 안정화된 펩티드 17 ㎍을 함유하는 25 ㎕를 주 2회 주사)를 이용하여, 비-근이영양성 마우스의 전경골근에서 수 주 이내에 근육 강도를 25％ 초과 증가시켰다. 상기 근육은 반복적인 주사에 의해 물리적으로 손상될 수 있지만, mdx 마우스 (하기 참조)의 근육과 같이 질환에 걸리지는 않았다.

인간 뒤시엔느 근이영양증의 돌연변이와 동일한 유형인 mdx 마우스의 근이영양성 근육에서의 근육내 주사 (3주 동안 주 2회)로 약 35％ 이하의 보다 큰 증가가 기록되었다 (도 3A, 도 3B). 도 3A에서 나타난 바와 같이, IGF-I의 주사 결과 약 5％의 증가만이 이루어졌다. 동일한 기준으로, 안정화된 펩티드와 PBS 비히클-단독 대조군 사이의 비교 결과를 도 3B에 나타내었다.

근육 보호 및 복구와 관련한 이들 데이타는 안정화된 펩티드가 근이영양성 및 비-근이영양성 근육의 강도를 증가시키는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.

3. 안정화된 펩티드에 의한 심근보호 및 심근 복구

회선 관상 동맥의 연지에 카테터를 삽입하고, 국소 혀혈을 유도하는 미세구의 작은 볼루스를 주사하여 양 심장에 심근 경색 (MI)을 유도하였다. 전장 MGF (천연 C-말단 펩티드와, 엑손 3 및 엑손 4에 의해 코딩된 서열을 가짐, MGF 및 간-유형 IGF-I에 대해 공통됨) 또는 안정화된 펩티드를, 동물이 여전히 마취된 상태에서 동일한 카테터를 이용하여 15분 후에 주사하였다 (200 nm, 관상혈관내 주사). 대조군으로서, 성숙 간-유형 IGF-I를 사용하였다. 안정화된 펩티드를 단독으로 사 용한 결과, MI 후 심장초음파검사에 의한 측정 및 박출율의 전산화된 분석에 따라 살아있는 심근의 비율(％) 및 박출율이 현저히 증가한 것으로 밝혀졌다. 전장 MGF 또한 보다 작지만 유의한 효과를 가졌다. 성숙 간-유형 IGF-I는 더욱 작은 효과를 가졌다. 절차를 수행하기 1일 전 박출율과 비교하여 6일째 박출율의 변화율(％)을 나타낸 도 4에 결과를 제시하였다. 이에 따라, 안정화된 펩티드는 허혈 손상으로부터 심근을 보호하는 데 매우 효과적이었다.

마우스에 추가의 실험을 수행하였다. 이들 연구에서, 뮤린 심장의 좌전하방 (LAD) 관상 동맥을 라이게이션하여 MI를 발생시켰다. 이는 좌심실 확장을 유발하였고, 진행되어 심부전을 유발하였다. 전신적으로 투여된 안정화된 펩티드는, 혈액을 펌핑하는 심장의 능력 및 손상된 심장이 더이상 정맥환류를 처리하지 못할 때 유발되는 확장을 입증하는 압력/부피 루프 (도 5)에 의해 측정시, 심장의 강도 및 기능을 현저히 개선하였다. 이는 안정화된 펩티드의 전신적 투여에 의해 현저히 개선되었고, 이를 통해 심근벽이 보호되고, 그 두께가 증가하였다. 따라서, 심근경색 직후 환자를 치료하는 데 상당한 가능성이 있었다.

4. 허혈 및 일반적인 손상 후 안정화된 펩티드에 의한 신경보호

4.1 시험관내 신경보호 효과

래트 기관형적 해마 배양물에서 선택적인 뉴런 사멸의 매우-특성화된 모델을 이용하여 안정화된 펩티드의 신경보호 효과를 시험관내에서 입증하였다.

사르노우스카(Sarnowska) (2002)에 따른 일부 변형과 함께 스톱피니(Stoppini) 등 (1991)의 방법에 따라 7일 내지 10일된 위스타(Wistar) 래트로부터 해마 슬라이스를 제조하였다. 간단히 말해서, 래트를 베트부탈(Vetbutal)로 마취시키고, 빙냉하고, 참수하였다. 뇌를 빠르게 제거하여 빙냉 작업 용액 (pH 7.2: 2 mmol/L L-글루타민, 5 mg/ml 글루코스, 1％ 암포테리신 B, 0,4％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 HBSS/HEPES- (Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +} 무함유) 96％_에 두었다. 해마를 분리하고, 맥클라인(McIlwain) 조직 초퍼를 사용하여 400 ㎛ 슬라이스로 절단하였다. 6-웰 플레이트 내 밀리세포-CM 막 (밀리포어)을 32 ℃에서 30분 동안 공기 및 5％ CO₂의 습한 대기에서 배양 배지 (pH 7.2: 50％ DMEM, 25％ HBSS/HEPES, 25％ HS, 2 mmol/L L-글루타민, 5 mg/ml 글루코스, 1％ 암포테리신 B, 0.4％ 페니실린-스트렙타마이) 1 ml를 이용하여 미리 평형을 유지시켰다. 4개의 선택된 슬라이스를 각각의 막 위에 놓았다. 100％ 습도의 5％ CO₂ 대기 중 32 ℃에서 2주 동안 슬라이스를 배양하였다. 슬라이스의 생존력을 광학 현미경으로 매일 점검하고, 실험 당일에 추가로 요오드화프로피듐 스테이닝하여 평가하고, MC-10095 카메라 (칼 차이스 예나 게엠베하(Carl Zeiss Jena GmbH))가 장착된 형광현미경 (차이스 악시오베르트(Zeiss Axiovert) 25)으로 관찰하여 초기 PI 흡입을 기록하였다 (사르노우스카, 2002).

14일 후, 배양물에 30 mM TBH (tert-부틸 퍼옥시드)를 3시간 동안 첨가하여 산화 스트레스를 유도하였다. 이 후, 슬라이스를 신선한 배양 배지에 옮겼다. 실험 시작 24시간 및 48시간 후에 얻어진 세포 사멸을 평가하였다.

안정화된 펩티드, 또는 비교를 목적으로 한 재조합 IGF-I를 실험 시작시 100 ng/ml의 최종 농도로 배양 배지에 첨가하고, 상기 배지에 계속해서 두었다. MGF가 작용하는 경로를 조사하기 위해, 슬라이스를 TBH 및 MGF 또는 IGF-I 펩티드에 노출하기 1시간 전에 특이적 항-IGF-I 수용체 (AB-I) 차단 항체 (종양형성유전자)를 상기 배지에 포함시켰다. 제조사의 권고에 따른 항체 농도 (1000 ng/ml)를 이용하였다.

슬라이스의 자세한 화상을 수득하기 위해, 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (차이스 LSM 510)을 이용하였다. 요오드화프로피듐 (PI) 여기를 위해 헬륨-네온 레이저 (543 nm)를 이용하였다. 차이스 LSM 510 소프트웨어 패키지 v. 2.8을 이용하여 화상을 처리하였다. 수득 후, 화상 분석기 KS 300 (칼 차이스 예나 게엠베하)을 이용하여 조직 악화의 정량적 측정을 수행하였다.

TBH 투여 24시간 및 48시간 후, Pi-스테이닝된 배양물의 형광 화상에서 세포 손상을 정량하였다. 세포 사멸의 상대 정도를 다음과 같은 각각의 표준화된 CA1 영역으로부터 계산하였다: 사멸된 세포％ = (실험 형광 강도 (FI)-백그라운드 FI)/(최대 FI-백그라운드 FI) x 100 (여기서, 최대 FI는 100 mM 글루타메이트에 노출시켜 모든 세포를 사멸시킴으로써 얻어짐).

모든 측정은 5개의 개별 배양 제제에 대해 반복되었고, 8개의 슬라이스를 각 실험 조건에서 사용하였다. 결과간 차이의 통계적 유의성을 일원변량분석 및 이이서 더넷(Dunnet) 시험 (그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 3.02)을 이용하여 계산하였다.

상기에서 논의된 바와 같이 TBH (tert-부틸 히드로퍼옥시드)에 의한 국소 손 상을 유도한 후에 래트 뇌 슬라이스를 단리하였다. 처치 및 비-처치 뇌 슬라이스에서 얻어진 세포 사멸을 측정하였다. 이를 도 6에 예시하였다. 처치 펩티드의 부재시, TBH는 24시간 이내에 세포 약 60％를 사멸시켰지만, 안정화된 펩티드 (100 ng/ml)로 처치한 후, 85％의 보호가 관찰되었다. 또한 전장 MGF의 일부인 IGF-I 수용체 도메인 펩티드 (rIGF-I)도 또한 (상기에서 보고된 바와 같이) 신경보호되었다. 그러나, 이는 보다 적은 정도 (72％)였고, IGF-I의 보호 효과는 24시간 이하 동안만 현저한 반면, 안정화된 펩티드는 그의 신경보호 효과가 48시간 후에도 여전히 뚜렷히 관찰될 정도로 유의하게 장시간 작용하였다.

4.2 게르빌루스쥐 모델에서 신경보호 효과

뇌 허혈의 게르빌루스쥐 모델을 이용하여 다음 실험을 수행하였다. 신경보호를 평가하기 위해, 안정화된 펩티드 또는 IGF-I 수용체 결합 도메인을 투여한 후 뇌에 공초점 현미경 검사를 수행하였다. 게르빌루스쥐 뇌에서, 총경동맥의 양측 라이게이션으로 CA1 영역에서 특이적 해마 병변을 일정하게 생성하였고, 피라밋 뉴런은 허혈 3일 내지 4일 후 사멸하기 시작하였다.

체중 50 g 내지 60 g의 수컷 몽골 게르빌루스쥐를 사용하였다. 상술한 바와 같이 정상 체온 조건을 엄격히 제어하면서 N₂O:O₂ (70:30) 중 할로테인 마취하에 5분 동안 총경동맥의 라이게이션으로 허혈 발작을 수행하였다 (Domanska-Janik et al., 2004). 뇌혈류량을 레이저 도플러(Doppler) 유속측정기 (무로사(Muro, Inc.))로 연속적으로 모니터링하였다. 재관류하는 즉시 좌측 경동맥에 안정화된 펩티드 또는 IGF-I (PBS 중 1 ㎍/㎕)를 25 ㎍의 투여량으로 직접 주사하여 한 동물군이 이를 수용하였다. 겉보기 수술된 동물에 동일한 투여량의 펩티드를 주사하였다.

일반적으로, 상기 절차 10분 내지 15분 후, 처치된 동물은 그의 다리로 서있었고, 미처치 동물과 같이 거동하였다. 상기 동물을 1주일간 회복시킨 후, 이어서 펜토바르비탈 마취하에 PBS 중 빙냉 4％ 파라포름알데히드로 관류하였다. 헤마톡실린/에오신으로 스테이닝된, 파라핀-포배되고 고정된 10 mm-두께의 단면 상에서 조직학적 평가를 수행하였다. 관상 단면 내 생존한 손상되지 않은 뉴런의 평균 갯수로서, CA1 해마 영역에서의 세포 손상 정도를 차이스 악시오스코프(Zeiss Axioscop) 2로 정량화하였다. CA1 영역의 3개 이상의 한정된 300 ㎛ 영역을 MC 10095 카메라 (칼 차이스 예나 게엠베하)를 사용하여 캡쳐하고, 컴퓨터-보조 화상 분석 시스템 (KS 300, 칼 차이스 예나 게엠베하)에서 계수하였다.

대조군 동물에서, CA1 영역에서 스코어링된 길이 300 ㎛ 당 형태학상 손상되지 않은 뉴런의 평균 갯수는 121.25 ± 12.5 (평균 ±SD5, n=5)였다. 뉴런의 약 12％ (15.2 ± 5, n=7)만이 허혈 발작에서 생존한 미처치 동물과는 대조적으로, 재관류 직후 좌측 경동맥에 안정화된 MGF C-말단 펩티드의 주사 (25 ㎍의 단일 볼루스)는 매우 유의한 신경보호를 제공하였다. 주사된 면에서 83.2 ± 25 (n=10)개 (비-수행된 대조군 값의 74.5％)의 뉴런이, 반대측 면에서 65.8 ± 30 (n=10)개 (비-수행된 대조군 값의 54％)의 뉴런이 스코어링되었다. 따라서, 안정화된 MGF C-말단 펩티드로 처치하는 것은, CA1 해마 뉴런의 고분율을 허혈 발작에서 생존가능하 게 하였다. 대부분의 동물에서 상기 보호 효과는 앙측 모두에서 현저하였지만, 소수의 경우에는 주사된 (좌측) 면에서 주로 명백하였다.

대조적으로, IGF-I 펩티드 25 ㎍의 유사한 주사는 허혈후 CA1 뉴런의 생존에 거의 영향을 주지 않았다. 발작 7일 후, 19.2 ± 7.3개의 뉴런 (n=5)이 남았고, 이는 대조군 뉴런 세포 수의 단지 15.8％이었으며, 미처치된 허혈후 군과 유의하게 상이하지 않았다.

5. 변형된 펩티드의 생물학적 활성 및 안정성

5.1 L-D 전환 및 N-말단 PEG 화로 안정된 펩티드

상기 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 4에서 사용된 펩티드는 서열 15의 서열 (상기 말단에서 두번째 위치의 아르기닌을 히스티딘으로 대체한 것을 제외하고는 MGF의 인간 Ec 펩티드의 서열 (서열 27)에 상응함)을 갖고, 위치 14 및 위치 15에서 천연 발생 L형 대신 D형 아르기닌, 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 N-말단의 공유 부착을 이용하여 안정화되고, C-말단에서 아미드화되었다.

상기 펩티드의 생물학적 활성은 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 4에서 확인하였다.

그의 안정성을 도 7로 입증하였다. PEG화, 및 위치 14 및 위치 15에서 아르기닌의 L-D 전환 유무의 펩티드의 안정성을 신선한 인간 혈장에서 단백질분해성 절단에 대한 펩티드의 감수성을 평가하여 조사하였다.

혈장을 사용전까지 -70 ℃에서 저장하였다. 펩티드 10 ㎍을 혈장 2 ml 및 PBS 7 ml에 첨가하였다. 상기 혼합물을 상이한 시간 간격 동안 37 ℃에서 인큐베 이션하였다. 이어서, 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 특이성을 갖는 폴리클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블럿팅을 이용하여 상기 시간 간격에 걸쳐 각각의 펩티드를 검출하였다 (도 7에서는 A = 0분; B = 30분; C = 2시간; D = 24시간, L-D 전환 및 N-말단 PEG화된 펩티드의 결과를 우측에 나타내고, L형에서 D형으로의 전환 및 N-말단 PEG화가 결여된 펩티드의 결과를 좌측에 나타냄). L-D 전환 및 PEG화가 결여된 펩티드는 30분 후에는 상대적으로 거의 검출되지 않을 수 있었고, 2시간 후에는 매우 거의 검출되지 않을 수 있었으며, 24시간 후에는 전혀 또는 거의 전혀 검출되지 않을 수 있었다. 대조적으로, L-D 전환 및 PEG화된 펩티드는 24시간 후에도 다량 검출될 수 있었다.

5.2 추가의 펩티드 - 세린 또는 아르기닌의 알라닌으로의 대체 및 C-말단 및 N-말단의 말단절단

5.2.1 추가의 펩티드

여기서, 인간 MGF의 C-말단으로부터 천연 인간 Ec 펩티드의 서열은 서열 27로 제공되었다. 서열 15의 펩티드에서, 상기 말단에서 두번째 아미노산, 즉, 천연 펩티드 (서열 2 및 서열 27 참조)에서 아르기닌을 히스티딘으로 대체하였다. 서열 15의 펩티드는 도 2에서 펩티드 1로 기재되어 있다.

펩티드 2 내지 펩티드 6 및 짧은 펩티드 1 내지 짧은 펩티드 4라고 지칭된, 서열 15의 서열에서 유래된 추가로 변형된 서열은 서열 16 내지 서열 24로 제공되고, 도 2에서 서열 15의 서열과 대등하였다.

펩티드 2 (서열 16)에서, 위치 5에서 세린을 알라닌으로 대체하였다. 펩티 드 3 (서열 17)에서, 위치 12에서 세린을 알라닌으로 대체하였다. 펩티드 4 (서열 18)에서, 위치 18에서 세린을 알라닌으로 대체하였다. 펩티드 5 (서열 19)에서, 위치 14에서 아르기닌을 알라닌으로 대체하였다. 펩티드 6 (서열 20)에서, 위치 14에서 아르기닌을 알라닌으로 대체하고, 위치 15에서 아르기닌을 또한 알라닌으로 대체하였다. 짧은 펩티드 1 (서열 21)에서, 위치 14에서 아르기닌을 알라닌으로 대체하고, 2개의 C-말단 아미노산을 제거하였다. 짧은 펩티드 2 (서열 22)에서, 위치 14에서 아르기닌을 알라닌으로 대체하고, 4개의 C-말단 아미노산을 제거하였다. 짧은 펩티드 3 (서열 23)에서, 위치 14에서 아르기닌을 알라닌으로 대체하고, 3개의 N-말단 아미노산을 제거하였다. 짧은 펩티드 4 (서열 24)에서, 위치 14에서 아르기닌을 알라닌으로 대체하고, 5개의 N-말단 아미노산을 제거하였다.

5.2.2 추가의 펩티드의 생물학적 활성

단핵성 근육모세포 (수반 세포)의 복제를 유도하는 C-말단 펩티드의 능력을 측정함으로써 시험관내 시스템을 이용하여 생물학적 활성을 측정하였다. 알라마 블루(Alamar Blue) 방법을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 0 내지 3의 스케일로 평가되었고, 도 2에 결과를 나타내었다.

0 = 6시간에서 측정가능한 세포 수 증가 없음

1 = 4시간에서 유의한 세포 수 증가

2 = 2시간에서 유의한 세포 수 증가

3 = 1시간에서 유의한 세포 수 증가

유의 수준은 T 시험을 이용한 P>0.05의 수준이었다.

서열 15의 펩티드 (펩티드 1)는 반감기가 짧아서 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 펩티드 2 (서열 16) 및 짧은 펩티드 1 (서열 21)은 활성 스케일에서 1로 스코어링되었다. 펩티드 4 및 펩티드 5 (서열 18 및 서열 19)는 활성 스케일에서 2로 스코어링되었다. 펩티드 3 (서열 17)은 활성 스케일에서 3으로 스코어링되었다. 펩티드 6 (서열 20) 및 짧은 펩티드 2, 짧은 펩티드 3 및 짧은 펩티드 4 (서열 22, 서열 23 및 서열 24)는 측정가능한 활성을 나타내지 않았다 (스코어 0).

5.2.3 추가의 펩티드의 안정성

각각의 펩티드를 신선한 인간 혈장에 도입하고, 상기 실시예 5.1에서 논의된 웨스턴 블럿팅을 이용하여 각각의 펩티드의 안정성을 측정하였다. 생물학적 활성과 같이, 안정성은 0 내지 3의 스케일로 스코어링되었다. 도 2에 결과를 나타내었다.

안정성은 손상되지 않고, 특이적 항체에 결합된 펩티드의 양에 따라 하기 방식으로 측정되었다.

1 = 1/2시간 동안 검출가능한 항체 결합의 현저한 손실.

2 = 2시간 동안 검출가능한 결합의 현저한 손실

3 = 24시간 동안 항체 결합의 현저한 손실이 없음

서열 15의 펩티드 (펩티드 1)는 1로 스코어링되었다. 펩티드 6 (서열 20)도 또한 1로 스코어링되었다. 펩티드 3 및 펩티드 4 (서열 17 및 서열 18)는 2로 스코어링되었다. 펩티드 2 및 펩티드 5 (서열 16 및 서열 19)는 3으로 스코어링되었 다.

실시예 1 내지 실시예 4의 펩티드는 또한 상기 스케일에서 3으로 스코어링되었다. 동일하지만 PEG화가 결여된 펩티드도 또한 상기 스케일에서 3으로 스코어링되었다. 짧은 펩티드 2 내지 짧은 펩티드 4는 결국 생물학적 활성이 결여된 것으로 보이지만, 짧은 펩티드 1 내지 짧은 펩티드 4를 아직 시험하지 않았다.

6. 근이영양성 , ALS 및 건강한 인간 근육에서 근육 수반 세포 증식에 대한 안정화된 펩티드의 효과

상기 1.1의 안정화된 펩티드를 이 실험에서 사용하였다. 비교로써 상기 1.3의 IGF-I 펩티드를 사용하였다.

6.1 요약

증식/분화 검정에 사용되는 초대 인간 근육 세포 배양물은 선천성 근이영양증 (CMD), 안면견갑상완 근이영양증 (FSHD) 및 운동뉴런 질환 또는 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 환자의 생검, 및 건강한 근육에서 유래되었다. 세포 배양물을 2종의 펩티드로 처치하고, 면역세포화학 기술을 사용하여 분화 마커 데스민을 발현하는 세포를 검출하고, DAPI를 사용하여 핵의 총 수를 검출하였다. 크레아틴 포스포키나제 (CPK) 및 단백질 검정을 사용하여 펩티드 처치 후의 근원성 분화를 측정하였다. 안정화된 펩티드는 정상 (비-질환) 근육에 대해 줄기 (데스민 양성) 세포 증식을 상당히 증가시켰다 (정상 (비-질환) 사지의 경우 38.4±2.5％ → 57.9±3.2％, 정상 (비-질환) 두개안면 근육 생검의 경우 49.8±2.4％ → 68.8±3.9％). 초기 근육 줄기 세포 수는 근육이 쇠약한 환자에서 보다 낮지만, 안정화된 펩티드는 여전히 증가를 유도한다 (CMD: 10.4±1.7％ → 17.5±1.6％; FSHD: 11.7±1.3％ → 20.4±2.1％; 및 ALS: 4.8±1.1％ → 7.2±0.8％). 이러한 결과는 또한 안정화된 펩티드가 근관 형성에 대한 효과는 없지만 근육모세포 선조 세포 증식을 증가시키는 반면, 성숙 IGF-I는 분화를 증대시킨다는 것을 입증하였다.

6.2 인간 근육 유래 세포의 단리

인간 초대 근육 세포 배양물을 상기 기재된 문헌 [Lewis et al., 2000; Sinanan et al., 2004]에 따라 단리하였다. 요약하면, 사전동의에 따라, 두개안면 (교근) 근육 생검을 영국 런던에 소재한 이스트만 앤드 미들섹스 하스피탈(Eastman and Middlesex Hospital)에서 예정수술 동안 건강한 성인 및 CMD 환자로부터 수득하였다. 인간 하지 (외측광근) 근육 샘플을 영국 런던에 소재한 로얄 프리 하스피탈(Royal Free Hospital)에서 국소 마취 하에 바늘 생검에 의해 동의한 건강한 성인, FSHD 및 ALS 환자로부터 수득하였다. 생검을 상기 장애를 가진 다수의 환자로부터 풀링하여 초대 배양물에서 충분한 세포 수를 수득하였다. 이들을 항생제 (페니실린 100 U/ml; 스트렙토마이신 100 μg/ml; 훈기존 2.5 μg/ml; 인비트로겐) 보충된 DMEM (고글루코스; 인비트로겐(Invitrogen))으로 헹구고, 가위로 잘게 썰고, 조직 단편을 0.2％ 젤라틴 코팅된 (시그마-알드리치) T150 cm² 배양 플라스크 (헬레나 바이오사이언시즈(Helena Biosciences))에 플레이팅하였다. 체외이식 배양물을 DMEM, 20％ FCS (PAA 라보라토리즈(Laboratories)), 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml) (인비트로겐)으로 구성된 혈청-함유 성장 배지 (sGM) 중 에서 인큐베이션시키고, 5％ CO₂ 및 95％ 습윤 공기에서 37℃로 유지하였다. 체외이식편으로부터 단핵 세포의 이동의 제1 파동을 □-파로 명시하고, 이 개체군을 상기 연구 전반에 걸쳐 사용하였다. 트립신-EDTA (인비트로겐)를 사용하여 이동성 인간 근육 세포를 효소적으로 수확하고, 70-80％ 전면성장(confluency)이 될 때까지 sGM에서 계대배양하였다. 계대 횟수 x (P_x)는 전면성장에 이르지 못한 세포의 x번째 연속 수확으로 정의된다. 모든 실험은 P_{3 -5} 코호트를 사용하여 수행하였다. 이어서 증량된 세포를 하기 기재된 실험에 사용될 때까지 한랭 조건 하에 저장하였다. 각각의 질환 근육 배양물 및 2 종류의 건강한 근육에 사용된 처치 각각에 대해 6회 이상의 조작을 행하였다.

6.3 시험관내 근원성 선조( progenitor ) (줄기) 세포 집단의 측정

근원성 전구체의 수의 평가는 상기 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Sinanan et al., 2004] 참조). 세포를 4.5 x 10³개 세포 cm^-2의 초기 밀도로 젤라틴-코팅된 (0.2％) 13 mm 커버슬립 위에 재플레이팅하였다. FCS에서의 IGF 및 관련 단백질의 효과와의 혼동을 피하기 위해, EGF (10 ng/ml), bFGF (2 ng/ml), 인슐린 (5 ng/ml), 홀로-트랜스페린 (5 μg/ml), 나트륨 셀레나이트 (5 ng/ml), 덱사메타손 (390 ng/ml), 비타민 C (50 μg/ml), 비타민 H (D-비오틴; 250 ng/ml), 비타민 E (트롤록스(Trolox); 25 μg/ml) (시그마-알드리치), 알부맥스-1 (0.5 mg/ml) (인비트로겐), 페투인 (500 μg/ml) (클로네틱스/바이오휘태커(Clonetics/BioWhittaker)), 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml) (인비트로겐)으로 보충된 DMEM인 혈청-무함유 한정 배지 (dGM) 중에서 세포를 배양시켰다. 24시간 동안 부착시킨 후, rIGF-I (10 ng/ml)와 함께 및 이들 없이, 및 단일클론성 IGF-I 수용체 항체 (Ab-1, 100 μg/ml, 종양유전자)와 함께 및 이들 없이 안정화된 펩티드 (10 ng/ml)를 적절하게 dGM에 첨가하였다. 사용되는 펩티드는 종래 문헌 [Dluzniewska et al, 2005]에 기재된 바와 같이 합성된 MGF/IGF-IEc 펩티드 [24개 아미노산 잔기]의 E 도메인에 대한 안정화된 펩티드 (상기 1.1 및 1.3 참조) 및 인간 IGF-I 펩티드 [70개 아미노산 잔기] (시그마-알드리치 ER2 IGF-I)였다. 모든 배지는 2 내지 3일마다 교체하였다. 배양물을 면역세포화학 분석을 위해 다양한 시점에서 표본화하였다.

6.4 면역세포화학

적절한 시점에서, 세포를 10분 동안 메탄올로 고정시킨 다음 (-20℃), 10 내지 15분 동안 0.5％ 트리톤(Triton)-X100으로 세척 투과화하였다. 이어서 세포를 항체 희석 용액 (ADS; PBS + 10％ FCS, 0.025％ 나트륨 아지드, 0.1 M 리신) 중에 희석된 항-데스민 (1:100; 클론 D33, 덴마크 글로스트럽에 소재한 다코(DAKO)) 항체와 함께 60분 동안 인큐베이션시켰다. FITC (1:200; 잭슨 이뮤노리서치 라보라토리즈/스트라테크 사이언티픽(Jackson ImmunoResearch Laboratories/Stratech Scientific))에 결합된 특정 부류의 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 가시화하였다. 형광 소홈(minor-groove) DNA-결합 프로브인 DAPI (1.0 ng/ml; 시그마-알드리치)를 최종 항체 인큐베이션 단계 중에 도입함으로써 핵을 동정하였다. 글리세롤계 안티페이드 작용제인 시티플루오르(Citifluor) (시티플루오르 리미티드)를 커버슬립으 로 덮고, 투명 매니큐어로 밀봉하였다. 세포-연관 형광 및 형태구조는, 라이카(Leica) FW4000 화상 처리 소프트웨어가 장착된 라이카 DMIRB 도립현미경을 사용하여 각각 동시형광법 및 라이카 모듈레이션 콘트라스트(Leica Modulation Contrast: LMC) 현미경법에 의해 가시화하였다. 증식 검정을 위해, 모든 블루 및 그린 형광 양성 세포를 하나의 필드에서 계수하였다. 각 커버슬립에서 30 이상의 필드를 체계적 방식으로 계수하였고, 각 커버슬립에 대해 100개 이상의 세포를 계수하였다. 세포의 수를 DAPI 양성 세포의 총 수에 대한 데스민 양성 세포의 비율(％)로서 비교하였다.

6.5 크레아틴 포스포키나제 ( CPK ) 검정

이 검정은 이전에 공개된 프로토콜 (문헌 [Auluck et al., 2005])을 사용하여 수행하였다. CPK의 측정으로 근육발생의 정량적 비교가 가능하기 때문에 (문헌 [Goto et al., 1999]), 이는 근관 형성의 마커이다. 효소 CPK는 아데노신-5-디포스페이트 (ADP)의 가역적 인산화를 촉매하여 아데노신-5-트리포스페이트 (ATP) 및 유리 크레아틴을 형성한다. 반응은 무기 인의 형태, CPK 활성에 비례하는 반응의 최종 생성물을 결정함으로써 한 방향으로 일어나게 할 수 있다. 이는 무기 인산염의 생성에 기재한 비색 방법을 사용하여 측정된다 (문헌 [Fiske and Subbarow, 1925] 절차). 이어서 이를 배양물의 단백질 함량에 관하여 나타냈다.

상기 증량된 초대 인간 근육 세포 배양물을 0.2％ 젤라틴 코팅된 96-웰 플레이트에 10 x 10⁴개 세포/웰로 재플레이팅하였다. 세포를 70/80％ 전면성장이 될 때 까지 sGM 중에서 배양시킨 다음, 배지를 상기 기재된 문헌 [Dluzniewska et al, 2005]에 따라 합성된 안정화된 펩티드 [24개 아미노산 잔기] 및/또는 인간 IGF-I 펩티드 [70개 아미노산 잔기] (시그마-알드리치 IGF-I ER2)를 함유한 분화 배지 (DM; DMEM, 2％ FCS, 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml))로 교체하였다. 48시간 후, 세포를 빙냉 PBS로 2회 헹군 다음 -70℃의 0.5 mM 글리신 완충액 (pH 6.75)에 동결 저장하였다. 고정된 세포를 빠르게 해동하여 용해시키고, CPK 검정 키트 (시그마-알드리치)를 제조업자의 지침에 따라 사용하였다. 각 샘플의 단백질 농도는 피어스 마이크로 비씨에이 키트(Pierce Micro BCA Kit) (영국 노섬벌랜드에 소재한 퍼바이오 사이언스, 유케이 리미티드(PerBio Science, UK Ltd.))를 사용하여 알부민 표준 곡선에 대해 측정하였다.

6.6 통계적 분석

스태트뷰(StatView) 4.51 (영국 옥스포드에 소재한 에스에이에스 인스티튜트 인크., 차웰 사이언티픽 퍼블리싱 리미티드(SAS Institute Inc., Cherwell Scientific Publishing Ltd))을 사용하여 1-원 ANOVA 테스트를 수행한 다음 피셔(Fisher)의 PLSD 사후검정 테스트를 수행하였다. p<0.05를 유의한 것으로 간주하였다. 데이타를 2 종류의 건강한 근육을 포함한 각 증상에 대해 4개 유형의 실험에 대한 모든 조작 (최소 6번) 동안 수집하고, 평균±s.d로 나타냈다.

6.7 인간 근육 초대 배양물 중 근원성 전구체의 비율

근원성 (데스민 양성) 세포의 비율(％)을 테스트된 근육 모두에서 측정하였다 (하기 표 참조). 정상 (비-질환) 근육은 데스민 양성 세포를 상당한 비율로 함 유하는 반면, 질환 근육은 근원성 세포를 훨씬 낮은 비율로 함유한다.

[표]

펩티드의 부가 전에 근원성 ( 데스민 양성) 세포를 상이한 비율로 함유하는, 상이한 근육 공급원에서 유래된 인간 초대 근육 배양물
근육 유형	초대 배양물의 총 세포 중 데스민 양성 세포 비율(％)
정상 (비-질환) 두개안면	49.8±2.4％
정상 (비-질환) 사지	38.4±2.5％
CMD 사지	10.4±1.7％
ALS 사지	4.8±1.1％
FSHD 사지	11.7±1.3％

6.8 정상 (비-질환) 인간 초대 근육 선조 세포에 대한 효과

안정화된 펩티드는 정상 두개안면 (교근) 초대 배양물에서 증식 (데스민-연관 핵 대 총 핵의 비의 변화)을 상당히 증가시켰다 (49.8±2.4％ → 68.8±3.9％; p<0.0001). IGF-I는 또한 적당한 증가를 유도하였다 (49.8±2.4％ → 58.4±4.2％; p<0.0001). 흥미롭게도, 데스민 양성 세포 증식률에 대한 안정화된 펩티드의 효과는 IGF-I가 부가되었을 때 억제되는 것으로 밝혀졌다 (68.8±3.9％ → 59.5±4.2％; p<0.0001). 정상 하지 (사두근) 초대 배양물에서 발견된 효과는 두개안면 근육에서 발견된 효과와 비슷하다. 안정화된 펩티드는 근육 선조 세포 증식을 상당히 증가시켰다 (38.4±2.5％ → 57.9±3.2％; p<0.0001). IGF-I는 증식에 대해 단지 약간의 효과를 가지며 (38.4±2.5％ → 47.1±3.5％; p<0.0001), 2종의 펩티드를 조합하여 부가하는 경우에는 안정화된 펩티드에 대한 반응을 완벽하게 저지한다 (57.9±3.2％ → 38.8±0.6％; p<0.0001).

6.9 질환-상태 인간 초대 근육 유래 세포 증식에 대한 효과

안정화된 펩티드가 정상 근육에서 데스민 양성 세포의 수를 재생적으로 상당히 증가시킬 수 있다는 관찰에 이어서, 질환-상태 근육에 대한 효과를 조사하였다. 선천성 근이영양증 (CMD)에서 유래된 초대 배양물에서, 안정화된 펩티드는 근육 선조 세포 증식을 상당히 증가시키는 반면 (10.4±1.7％ → 17.5±1.6％; p<0.0001), IGF-I는 낮은 효과를 가졌다 (10.4±1.7％ → 13.2±1.7％; p=0.005). 2종의 펩티드를 조합하는 경우, 억제 효과가 또다시 정상 근육에 대해서와 같이 관찰되었으며, 안정화된 펩티드의 효과는 대조군 수준으로 감소되었다 (17.5±1.6％ → 13.1±1.2％; p=0.0001). 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 FSHD로부터의 근육 세포의 세포 증식에 대한 안정화된 펩티드의 효과는 유사한 결과를 야기하였다. 안정화된 펩티드는 이들 장애에서 데스민 발현 세포의 수를 현저히 증가시켰다 (ALS: 4.8±1.1％ → 7.2±0.8％; p=0.0002, FSHD: 11.7±1.3％ → 20.4±2.1％; p<0.0001). 정상 근육에 대한 경우와 같이, IGF-I는 또다시 미미한 효과를 가졌다 (ALS: 4.8±1.1％ → 4.7±1.4％; p=0.7719, FSHD: 11.7±1.3％ → 14.1±1.6％; p=0.0107). 2개의 이소형이 함께 사용되는 경우, MGF-유도된 데스민 발현 증가율은 또다시 억제되었다 (ALS: 7.2±0.8％ → 5.3±1.0％; p=0.0024, FSHD: 20.4±2.1％ → 14.5±1.4％; p<0.0001).

6.10 IGF -I 수용체와 관련된 MGF E 도메인에 의해 증가된 선조 세포 증식

정상 근육에서, 안정화된 펩티드에 의해 유도된 증식의 증가율은 항-IGFIR 항체의 존재에 의해 억제되지 않는다 (MGF 처치된 세포에서는 68.8±3.9％, MGF + Ab-I 처치된 세포에서는 71.1±6.2％; p=0.2472). 그러한 효과는 또한 CMD 및 ALS 근육 둘 다에 대해 관찰되었다 (CMD의 경우 17.5±1.6％ 대 16.7±1.8％, p=0.4589; ALS의 경우 7.2±0.8％ 대 6.5±0.8％, p=0.2933). 이는 MGF E 도메인의 작용이 IGF-I 수용체와 관련이 없음을 시사한다.

6.11 말단 분화 방지에 대한 MGF E 도메인의 효과

상기 6.4의 CPK 검정에서, 안정화된 펩티드는 초대 근육모세포 분화 및 근관 형성을 촉진시키지 않는다. 반대로, 데스민을 발현하는 세포의 수가 근육발생의 단계에서 IGF-I의 부가에 의해 감소됨에 따라, 10 ng/ml 농도의 IGF-I는 근관 형성을 명백하게 자극한다. 실제로, 10 ng/ml의 IGF-I의 존재 하에, 안정화된 펩티드는 효능제로서 작용하고, 투여량 의존 방식으로 근육모세포 융합 수용기에서 분화를 방지한다. 10 ng/ml의 전신적 IGF-I를 함유한 100 ng/ml의 안정화된 펩티드의 감소율은 동일한 양의 IGF-I를 함유한 10 ng/ml의 MGF보다 낮다.

6.12 결론

안정화된 펩티드는 CMD, FSHD 및 ALS를 가진 환자, 및 건강한 개체로부터의 초대 근육 배양물에서 선조 세포 증식을 상당히 유도하였다. 안정화된 펩티드는, IGF-I로 인해 상당히 가속화되는 과정인 근관 형성에는 영향을 미치지 않았다. 이는 생물학적 활성 MGF E 도메인이 성숙 IGF-I와 비교하여 다른 활성을 가진다는 것을 입증한다. 본 발명의 발견은 IGF-I 이소형의 상이한 작용이 아마도 다른 수용체를 통해 매개된다는 것을 시사한다. IGF-I 수용체의 차단은 MGF E 도메인이 IGF-I로의 상이한 신호전달 경로를 통해 수반 세포 증식을 증가시키고, 초기 수반 세포 활성화가 성숙 IGF-I에 의해 영향을 받는 과정과 별개 과정이라는 증거를 제 공한다.

신경학적 증상에서의 근육 쇠약 및 노화는 수반 세포의 손실 때문이라고 제시되어 왔다. 본 발명자들은 CMD, FSHD 및 ALS를 가진 환자로부터의 총 근육모세포에 대한 선조 (데스민 양성) 세포의 비가 건강한 개체로부터의 근육모세포의 비에 비해 낮다는 것을 입증하였다. 따라서, 근육이 수반 세포의 결여 때문에 퇴화하는 것인지 또는 수반 세포 활성화에 대한 몇몇 인자를 발현할 수 없기 때문에 퇴화하는 것인지는 논쟁의 여지가 있다. 본 발명자들은 노인들이 근육을 유지하는데 필요한 수준의 MGF를 발현할 수 없다는 것을 이미 입증하였으며 (문헌 [Hameed et al, 2004]), FSHD 및 ALS 환자에 대해서도 유사하게 밝혀졌다 (비공개된 결과).

근육 쇠약은 임의의 신경근육 질환을 앓는 환자의 사망의 주요 원인 중 하나이다. 근육 손실은 MGF의 발현 불능과 연관될 수 있으며, 인간 뒤시엔느 근이영양증에 대한 모델인 mdx 근이영양성 마우스의 근육은 기계적 자극 동안에서조차 MGF를 생성할 수 없다 (문헌 [Goldspink et al., 1996]). 데 바리(De Bari) 등은 간엽 줄기 세포가 mdx 마우스의 근이영양성 근육 내에 도입되는 경우, 근이영양증의 횡문근형질막 발현 및 또한 MGF 발현이 회복된다는 것을 발견하였다 (문헌 [De Bari et al., 2003]). 따라서, MGF의 생성은 세포막의 순응도에 따라 달라질 수 있으며, 일부 유형의 기계적전달 메카니즘, 예컨대 근이영양증 컴플렉스에 관련할 수 있다.

IGF-I는 신경영양성 인자이며, 신경변성 장애, 구체적으로 ALS에 대해 가능한 임상 용도를 갖는 것으로 얼마 동안 알려져 왔다. 동물 모델, 인간 재조합 IGF-I (성숙 IGF-I)의 전신적 전달의 사용은 동물 모델에서 ALS 환자를 치료하기 위해 사용되었다. 가장 최근에, AAV2 벡터에 의한 IGF-I 유전자 요법과 병용되는 경우, 운동이 ALS의 동물 모델의 치료시 약간의 상승작용적 효과를 갖는 것으로 보고되었다 (문헌 [Kaspar et al., 2005]).

그러나, 본원에 나타낸 데이타는 근육 유지 및 복구를 위해 요구되는 근육 수반 (줄기) 세포 풀을 보충하는 효과적인 방법을 제공하기 때문에, 통상의 IGF-I의 활성이 아닌 MGF의 활성이 근육 쇠약의 치료에 유용한 최상일 것이라고 제시한다. 이는 MGF 스플라이싱 변이체의 발현시에 명백한 손상이 있는 CMD, FSHD 및 ALS와 같은 장애에서 근육 퇴화에 대한 치료제로서의 본 발명의 펩티드의 용도를 지지한다. 또한, 본 발명의 펩티드의 사용으로 세포 치료 목적용 배양물에서 근육 수반 세포를 증가시킬 수 있다.

7. 8개 아미노산 펩티드로의 세포 증식 검정

7.1 DMGF 및 CMGF 펩티드

상기 1.3.1에 기재되어 있고, 도 8A에 DMGF 및 CMGF라고 지칭되는 8개 아미노산 펩티드를 DMEM (1000 mg/L 글루코스), BSA (100 ug/ml) 및 IGF-I (2 ng/ml)를 함유하는 배지 중에 웰 당 2000개 세포 밀도로, C2C12 근육 세포의 증식을 유도하는 능력에 대해 테스트하였다. 2, 5, 50 및 100 ng/ml의 IGF-I 단독 (도 8의 우측 세트의 결과 참조), 및 2, 5, 50 및 100 ng/ml 농도의 DMGF 및 CMGF를 테스트하였다 (도 8의 좌측 및 중간 세트의 결과 참조). 36시간 인큐베이션 후, 알라마르 블루(Alamar Blue) 검정을 사용하여 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 배지만 을 함유하는 대조군을 또한 제공하였다.

DMGF 및 CMGF 모두 세포 증식을 유도하였다. 결과는 알라마르 블루 검정에서의 형광에 대해 도 8A에 나타냈다. DMGF 및 CMGF에 대한 모든 값, 및 IGF-I 단독에 대한 값은 오직 배지에 대한 대조군 값과 통계학적으로 상이하였다. 증식 수준의 증가는 DMGF/CMGF의 증가된 농도로 관찰되었다.

7.2 펩티드 A2, A4, A6 및 A8

상기 1.3.2에 기재되어 있고, 도 8B에 A2, A4, A6 및 A8이라고 지칭되는 8개 아미노산 펩티드를 웰 당 500개 세포 밀도로, C2C12 근육 세포의 증식을 유도하는 능력에 대해 테스트하였다. 10％ FBS에서 24시간 동안 배양시킨 다음, 0.1％ BSA에서 24시간 동안 아사시키고, 24시간 동안 자극한 후에 5시간 동안 브래드유(BrdU)로 처리하였다. 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml의 IGF-I (도 8B의 우측 세트의 결과 참조), 및 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml 농도의 펩티드 A2, A4, A6 및 A8을 테스트하였다. 브래드유의 혼입량을 측정하여 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 세포 없이 배지만을 함유하는 대조군, 5％ FBS, 및 브래드유 무함유를 또한 제공하였다.

펩티드 A2, A4, A6 및 A8이 세포 증식을 유도하였다. 결과는 형광 (370 nm에서의 흡광도; 가로 4개 웰의 평균+표준오차)에 대해 도 8에 나타냈다.

8. 인간 초대 세포 ( HSMM )로의 세포 증식 검정

상기 1.4에 기재되어 있고, 도 9-11에 A5라고 지칭되는 24개 아미노산 펩티드를 인간 근육 선조 세포 (캠브렉스(Cambrex))의 증식을 유도하는 능력에 대해 테 스트하였다. 이들은 상업적으로 입수가능한 초대 인간 근육 세포, 즉, 인간 근육 줄기 (선조) 세포이다. 이들은 또한 때때로 인간 골격근 근육모세포 (HSMM)라고도 알려져 있다. 세포를 39년경 수컷 대상체로부터 수득하였다. hEGF, L-Glut, 덱사메타손, 항생제 및 10％ FCS로 보충된 SkGM2 배지 200 μl에서 24시간 동안 배양시켰다. 이어서 배양 배지를 제거하고, 세포를 혈청 무함유 배지로 2회 헹구었다.

A5를 hEGF, L-Glut, 덱사메타손 및 항생제로 보충된 캠브렉스 SkGM2 배지에서 웰 당 500개 세포 (도 9 및 10) 또는 1000개 세포 (도 11) 밀도로, 캠브렉스 HSMM의 증식을 유도하는 능력에 대해 테스트하였다. 0.1, 10 및 100 ng/ml의 IGF-I 단독 (도 9A, 10A 및 11A의 결과 참조), 및 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 A5를 테스트하였다 (도 9A, 10A 및 11A의 좌측 세트의 결과 참조). 0.1, 1, 10, 100 및 500 ng/ml 농도의 A5를 또한 2 ng/ml의 IGF-I의 존재 하에 테스트하였다 (도 9B, 10B 및 11B의 좌측 세트의 결과 참조). 48시간 인큐베이션 후, 세포를 5시간 동안 브래드유로 처리하였다. 브래드유의 혼입량을 측정하여 달성된 세포 증식의 수준을 평가하였다. 세포 없이 배지만을 함유하는 대조군, 5％ FBS, 및 브래드유 무함유를 또한 제공하였다.

IGF-I 단독으로는 임의의 투여량에서 HSMM의 증식에 대한 유의한 효과가 없었다 (도 9-11 참조). 48시간 후, A5 펩티드는 10 ng/ml 이하의 투여량으로 단리되어 사용되는 경우에 HSMM의 증식에 대한 유의한 효과 (P < 0.1)를 가졌다 (도 9A 및 10A). A5와 배합한 배지에 2 ng/ml의 IGF-I의 첨가는 보다 높은 신뢰 수준으로 HSMM의 증식에 대한 유의한 효과를 야기하였다 (P < 0.001; 도 9B, 10B 및 11B). 세포가 비교적 느리게 성장하는 경우, 펩티드와 함께 인큐베이션 기간을 72시간으로 증가시킬 것을 장려한다. 다음으로, 신호는 브래드유 노출 시간을 증가시킴으로써 증대될 것이다.

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Ala Gln Arg His Thr Asp 65 70 75 80 Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Thr Ser Arg Gly 85 90 95 Ser Ala Gly Asn Lys Thr Tyr Arg Met 100 105 <210> 11 <211> 471 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 11 gga ccg gag acg ctc tgc ggt gct gag ctg gtg gat gct ctt cag ttc 48 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 gtg tgt gga gac agg ggc ttt tat ttc aac aag ccc aca gga tac ggc 96 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 tcc agc agt cgg agg gca cct cag aca ggc atc gtg gat gag tgc tgc 144 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 ttc cgg agc tgt gat ctg agg agg ctg gag atg tac tgt gca ccc ctc 192 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 aag ccg gca aag gca gcc cgc tcc gtc cgt gcc cag cgc cac acc gac 240 Lys Pro Ala Lys Ala Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp 65 70 75 80 atg ccc aag act cag aag gaa gta cat ttg aag aac aca agt aga ggg 288 Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Thr Ser Arg Gly 85 90 95 agt gca gga aac aag aac tac agg atg tag gaagaccctt ctgaggagtg 338 Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met 100 105 aagaaggaca ggccaccgca ggaccctttg ctctgcacag ttacctgtaa acattggaat 398 accggccaaa aaataagttt gatcacattt caaagatggc atttccccca atgaaataca 458 caagtaaaca ttc 471 <210> 12 <211> 105 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 12 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ala Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp 65 70 75 80 Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Thr Ser Arg Gly 85 90 95 Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met 100 105 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Ser Gln Pro Leu Ser Thr His Lys Lys Arg Lys Leu Gln Arg Arg Arg 1 5 10 15 Lys Gly Ser Thr Leu Glu Glu His Lys 20 25 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Lys Met Lys Ser Gln Arg Arg Arg 1 5 10 15 Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu His Lys 20 25 <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu His Lys 20 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 16 Tyr Gln Pro Pro Ala Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu His Lys 20 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 17 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ala Gln Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu His Lys 20 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 18 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ala Thr Phe Glu Glu His Lys 20 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 19 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Ala Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu His Lys 20 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 20 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Ala Ala Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu His Lys 20 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 21 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Ala Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 22 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Ala Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe 20 <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 23 Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Ala Arg Lys Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Glu Glu His Lys 20 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 24 Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Ala Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu 1 5 10 15 Glu His Lys <210> 25 <211> 517 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 25 gga ccg gag acg ctc tgc ggg gct gag ctg gtg gat gct ctt cag ttc 48 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 gtg tgt gga gac agg ggc ttt tat ttc aac aag ccc aca ggg tat ggc 96 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 tcc agc agt cgg agg gcg cct cag aca ggc atc gtg gat gag tgc tgc 144 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 ttc cgg agc tgt gat cta agg agg ctg gag atg tat tgc gca ccc ctc 192 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 aag cct gcc aag tca gct cgc tct gtc cgt gcc cag cgc cac acc gac 240 Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp 65 70 75 80 atg ccc aag acc cag aag tat cag ccc cca tct acc aac aag aac acg 288 Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr 85 90 95 aag tct cag aga agg aaa gga agt aca ttt gaa gaa cac aag 330 Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu His Lys 100 105 110 tagagggagt gcaggaaaca agaactacag gatgtagaag acccttctga ggagtgaaga 390 aggacaggcc accgcaggac cctttgctct gcacagttac ctgtaaacat tggaataccg 450 gccaaaaaat aagtttgatc acatttcaaa gatggcattt cccccaatga aatacacaag 510 taaacat 517 <210> 26 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp 65 70 75 80 Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr 85 90 95 Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu His Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys 20 <210> 28 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Tyr Gln Pro Pro Ala Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys 20 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ala Gln Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys 20 <210> 30 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ala Thr Phe Glu Glu Arg Lys 20 <210> 31 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 31 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Ala Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys 20 <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 32 Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Ala Ala Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys 20 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 33 Gly Ser Thr Phe Glu Glu His Lys 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 35 Gly Ala Thr Phe Glu Glu His Lys 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Gly Ala Thr Phe Glu Glu Arg Lys 5

Claims (89)

1. 50개 이하의 아미노산 잔기를 포함하고,

   인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I)의 메카노 성장 인자 (MGF, Mechano Growth Factor) 이소형(isoform)의 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열을 포함하고,

   미변형 MGF E 펩티드에 비해 안정성이 증가되도록 하는 1종 이상의 변형이 혼입되어 있으며,

   생물학적 활성을 보유하는

   폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 근육 강도 증가 능력, 심근보호 능력 및 신경보호 능력으로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 1종 이상의 변형이 상기 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열에 존재하는 것인 폴리펩티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 1개 이상의 L형 아미노산이 상응하는 D형 아미노산으로 전환된 것을 포함하는 것인 폴리펩티드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 PEG화(PEGylation) 또는 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분의 부가를 포함하는 것인 폴리펩티드.
6. 제5항에 있어서, PEG화 또는 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분의 부가가 N-말단에 존재하는 것인 폴리펩티드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 폴리펩티드의 고리화를 포함하는 것인 폴리펩티드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 1개 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
9. 제8항에 있어서, 상기 치환이 알라닌 이외의 아미노산을 알라닌으로 대체하는 것을 포함하는 것인 폴리펩티드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 E 펩티드가 서열 13의 래트 Eb 펩티드 또는 서열 14의 토끼 Eb 펩티드인 폴리펩티드.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 E 펩티드가 서열 27의 인간 Ec 펩티드 또는 서열 15의 펩티드인 폴리펩티드.
12. 제11항에 있어서, 상기 변형이 PEG화 또는 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분의 부가를 포함하는 것인 폴리펩티드.
13. 제12항에 있어서, PEG화 또는 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분의 부가가 N-말단에 존재하는 것인 폴리펩티드.
14. 제11항에 있어서, 상기 변형이 1개 이상의 L형 아미노산이 상응하는 D형 아미노산으로 전환된 것을 포함하는 것인 폴리펩티드.
15. 제14항에 있어서, 서열 27 또는 서열 15의 위치 14 및 위치 15에 존재하는 아르기닌 잔기 중 하나 또는 둘다가 D형인 폴리펩티드.
16. 제15항에 있어서, 서열 27 또는 서열 15의 위치 14 및 위치 15에 존재하는 아르기닌 잔기가 둘다 D형인 폴리펩티드.
17. 제11항에 있어서, 상기 변형이 1개 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
18. 제17항에 있어서, 상기 치환이 위치 5, 위치 12, 위치 14 또는 위치 18에 존 재하는 것인 폴리펩티드.
19. 제18항에 있어서, 상기 치환이 알라닌 이외의 아미노산을 알라닌으로 대체하는 것을 포함하는 것인 폴리펩티드.
20. 제19항에 있어서, 상기 알라닌 치환이

    (a) 서열 15 또는 서열 27의 위치 5에서 세린의 알라닌으로의 치환,

    (b) 서열 15 또는 서열 27의 위치 12에서 세린의 알라닌으로의 치환,

    (c) 서열 15 또는 서열 27의 위치 14에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환, 및

    (d) 서열 15 또는 서열 27의 위치 18에서 세린의 알라닌으로의 치환

    중 하나 이상인 폴리펩티드.
21. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 펩티드가 서열 33 또는 서열 34의 폴리펩티드인 폴리펩티드.
22. 제21항에 있어서, 상기 변형이 PEG화 또는 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분의 부가를 포함하는 것인 폴리펩티드.
23. 제12항에 있어서, PEG화 또는 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분의 부가가 N-말단에 존재하는 것인 폴리펩티드.
24. 제20항에 있어서, 상기 변형이 1개 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
25. 제17항에 있어서, 상기 치환이 위치 2에 존재하는 것인 폴리펩티드.
26. 제25항에 있어서, 상기 치환이 알라닌 이외의 아미노산을 알라닌으로 대체하는 것을 포함하는 것인 폴리펩티드.
27. 제26항에 있어서, 상기 알라닌 치환이 (a) 위치 2에서 세린을 알라닌으로 치환하는 것인 폴리펩티드.
28. 제21항에 있어서, 서열 33, 서열 34, 서열 35 또는 서열 36의 서열로 이루어진 폴리펩티드.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 상기 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산 서열의 C-말단에서 1개 또는 2개의 아미노산의 말단절단(truncation)을 포함하는 것인 폴리펩티드.
30. 제29항에 있어서, 서열 21의 폴리펩티드 서열로 이루어진 폴리펩티드.
31. 제11항에 있어서, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 28, 서열 29, 서열 30 또는 서열 31의 폴리펩티드 서열로 이루어진 폴리펩티드.
32. 제11항에 있어서, 서열 15 또는 서열 27의 서열로 이루어지만, N-말단이 PEG화되어 있고, 서열 15 또는 서열 27의 위치 14 및 위치 15에 존재하는 아르기닌 잔기가 둘다 D형인 폴리펩티드.
33. 제11항에 있어서, 서열 15 또는 서열 27의 서열로 이루어지고, 서열 15 또는 서열 27의 위치 14 및 위치 15에 존재하는 아르기닌 잔기가 둘다 D형이고, PEG화되지 않은 폴리펩티드.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단이 아미드화된 폴리펩티드.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하고, 제1항의 폴리펩티드가 비-야생형 아미노산 서열 N-말단 및/또는 C-말단에 의해 연장되어 있는 연장된 폴리펩티드.
36. 제35항에 있어서, 상기 연장이 C-말단에서의 시스테인 잔기 및/또는 N-말단 에서의 D-아르기닌 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈장 중에서의 반감기로 측정한 안정성이 미변형 E 펩티드의 안정성보다 10％ 이상 더 높은 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드.
38. 제37항에 있어서, 인간 혈장 중에서의 반감기로 측정한 안정성이 미변형 E 펩티드의 안정성보다 50％ 이상 더 높은 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드.
39. 제38항에 있어서, 인간 혈장 중에서의 반감기로 측정한 안정성이 미변형 E 펩티드의 안정성보다 100％ 이상 더 높은 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈장 중에서의 반감기가 2시간 이상인 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드.
41. 제32항에 있어서, 인간 혈장 중에서의 반감기가 12시간 이상 또는 24시간 이상인 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드.
42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물.
43. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
44. 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드.
45. 근육 장애의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드를 투여하여 근육 장애를 치료하는 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 근육 장애가 골격근 장애인 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 근육 장애가 근이영양증 또는 관련된 진행성 골격근 무력 또는 쇠약, 근위축증, 악액질, 근육 약화; 노년 대상체에서의 근감소(sarcopenia) 또는 허약(frailty)이거나, 또는 상기 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드가 외상 후의 근육 복구를 목적으로 투여되는 것인 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 근이영양증이 뒤시엔느(Duchenne) 또는 벡커(Becker) 근이영양증, 안면견갑상완 근이영양증 (FSHD) 또는 선천성 근이영양증 (CMD)이거 나; 상기 근위축증이 무용성 위축증, 글루코코르티코이드-유도된 위축증, 노화된 대상체에서의 근위축증 또는 척수 상해 또는 신경근육 질환에 의해 유도된 근위축증이거나; 상기 악액질이 암, AIDS, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성 염증 질환 또는 화상과 관련이 있거나; 또는 상기 근육 약화가 요도 괄약근 및 항문 괄약근 또는 골반 저근에서 일어나는 것인 방법.
49. 제45항에 있어서, 상기 근육 장애가 심장 근육 장애인 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드가 허혈 또는 심장의 기계적 과부하에 대한 반응에 있어서의 심근 손상의 예방 또는 제한을 목적으로 투여되거나, 심장 근육 생성의 촉진, 심박 혈액량 증가에 의한 심박출량의 개선, 심근증의 치료, 급성 심부전 또는 급성 심장 발작에 대한 대응, 병리적 심장 비대증의 치료, 또는 울혈성 심부전의 치료를 위해 투여되는 것인 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 급성 심부전 또는 급성 발작이 심근염 또는 심근 경색을 포함하는 것인 방법.
52. 신경계 장애의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드를 투여하여 신경계 장애를 치료하는 방법.
53. 제52항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드가 신경계 장애 또는 신경계 손상과 관련된 뉴런 손실의 예방을 목적으로 투여되거나 또는 중추 신경계 (CNS)의 유지를 위해 투여되는 것인 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 뉴런 손실이 신경변성 장애, 신경 손상 또는 허혈과 관련이 있는 것인 방법.
55. 제54항에 있어서, 상기 장애가 근위축성 측삭 경화증; 척수 근위축증; 진행성 척수 근위축증; 영아성 근위축증 또는 연소성 근위축증, 회백수염 또는 포스트-폴리오(post-polio) 증후군; 독소에의 노출, 운동뉴런 외상, 운동뉴런 병변 또는 신경 손상에 의해 야기되는 장애; 운동뉴런에 영향을 주는 상해; 노화와 관련된 운동뉴런 손실; 상염색체 또는 성-관련 근이영양증; 알쯔하이머병; 파킨슨병; 당뇨병성 신경병증; 말초 신경병증; 색전성 졸중 또는 출혈성 졸중; 알콜-관련 뇌 손상이거나, 또는 상기 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드가 외상 후의 신경 복구를 목적으로 투여되는 것인 방법.
56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에서 정의된 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드의 용도.
57. 신경계 장애의 치료가 필요한 환자에게

    50개 이하의 아미노산 잔기를 포함하고 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I)의 메카노 성장 인자 (MGF) 이소형의 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열을 포함하며 생물학적 활성을 보유하는 유효량의 폴리펩티드, 또는

    상기 폴리펩티드를 포함하고 상기 폴리펩티드가 비-야생형 아미노산 서열 N-말단 및/또는 C-말단에 의해 연장되어 있으며 생물학적 활성을 보유하는 유효량의 연장된 폴리펩티드

    를 투여하여 신경계 장애를 치료하는 방법.
58. 제57항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 신경보호 능력인 방법.
59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드가 신경계 장애 또는 신경계 손상과 관련된 뉴런 손실의 예방을 목적으로 투여되거나 또는 중추 신경계 (CNS)의 유지를 위해 투여되는 것인 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 뉴런 손실이 신경변성 장애, 신경 손상 또는 허혈과 관련이 있는 것인 방법.
61. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 장애가 근위축성 측삭 경화증; 척수 근 위축증; 진행성 척수 근위축증; 영아성 근위축증 또는 연소성 근위축증, 회백수염 또는 포스트-폴리오 증후군; 독소에의 노출, 운동뉴런 외상, 운동뉴런 병변 또는 신경 손상에 의해 야기되는 장애; 운동뉴런에 영향을 주는 상해; 노화와 관련된 운동뉴런 손실; 상염색체 또는 성-관련 근이영양증; 알쯔하이머병; 파킨슨병; 당뇨병성 신경병증; 말초 신경병증; 색전성 졸중 또는 출혈성 졸중; 알콜-관련 뇌 손상이거나, 또는 상기 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드가 외상 후의 신경 복구를 목적으로 투여되는 것인 방법.
62. 심장 근육 장애의 치료가 필요한 환자에게

    50개 이하의 아미노산 잔기를 포함하고 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I)의 메카노 성장 인자 (MGF) 이소형의 C-말단 E 펩티드에서 유래된 아미노산의 서열을 포함하며 생물학적 활성을 보유하는 유효량의 폴리펩티드, 또는

    상기 폴리펩티드를 포함하고 상기 폴리펩티드가 비-야생형 아미노산 서열 N-말단 및/또는 C-말단에 의해 연장되어 있으며 생물학적 활성을 보유하는 유효량의 연장된 폴리펩티드

    를 투여하여 심장 근육 장애를 치료하는 방법.
63. 제62항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 심근보호 능력인 방법.
64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드가 허혈 또는 심장의 기계적 과부하에 대한 반응에 있어서의 심근 손상의 예방 또는 제한을 목적으로 투여되거나, 심장 근육 생성의 촉진, 심박 혈액량 증가에 의한 심박출량의 개선, 심근증의 치료, 급성 심부전 또는 급성 심장 발작에 대한 대응, 병리적 심장 비대증의 치료, 또는 울혈성 심부전의 치료를 위해 투여되는 것인 방법.
65. 제64항에 있어서, 상기 급성 심부전 또는 급성 발작이 심근염 또는 심근 경색을 포함하는 것인 방법.
66. 제57항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 E 펩티드가 서열 13의 래트 Eb 펩티드, 서열 14의 토끼 Eb 펩티드, 서열 27의 인간 Ec 펩티드, 서열 15의 펩티드, 또는 서열 33 또는 서열 34의 펩티드인 방법.
67. 제66항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드가 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 27, 서열 33 또는 서열 34의 서열을 포함하는 것인 방법.
68. 제59항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 서열이 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 27, 서열 33 또는 서열 34의 서열인 방법.
69. 제59항 내지 제61항, 제64항 및 제65항 중 어느 한 항에서 정의된 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제57항, 제58항, 제62항, 제63항 및 제66항 내 지 제68항 중 어느 한 항에서 정의된 폴리펩티드 또는 연장된 폴리펩티드의 용도.
70. 서열 27의 서열로 이루어지고, 서열 27의 위치 14 및 위치 15에 존재하는 아르기닌 잔기 중 하나 또는 둘다가 D형인 폴리펩티드.
71. 제70항에 있어서, 서열 27의 위치 14 및 위치 15에 존재하는 아르기닌 잔기가 둘다 D형인 폴리펩티드.
72. 서열 33, 서열 34, 서열 35 또는 서열 36의 서열로 이루어진 폴리펩티드.
73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단에 1개 내지 5개의 추가의 아미노산 및/또는 N-말단에 1개 내지 5개의 추가의 아미노산을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
74. 제73항에 있어서, 상기 추가의 아미노산 중 1개 이상이 D형 아미노산인 폴리펩티드.
75. 제74항에 있어서, 1개의 추가의 D형 아미노산이 N-말단에 존재하는 것인 폴리펩티드.
76. 제75항에 있어서, 상기 1개의 추가의 D형 아미노산이 D-아르기닌인 폴리펩티드.
77. 제76항에 있어서, C-말단에 추가의 아미노산이 존재하지 않는 것인 폴리펩티드.
78. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인인 1개의 추가의 아미노산이 C-말단에 존재하는 것인 폴리펩티드.
79. 제78항에 있어서, N-말단에 추가의 아미노산이 존재하지 않는 것인 폴리펩티드.
80. 서열 15 또는 서열 27의 서열, 및 C-말단의 1개의 추가의 시스테인 잔기, 및 임의로 C-말단의 1개 내지 4개의 추가의 아미노산 및/또는 N-말단의 1개 내지 5개의 추가의 아미노산의 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
81. 제80항에 있어서, 서열 15 또는 서열 27의 위치 14 및 위치 15에 존재하는 아르기닌 잔기 중 하나 또는 둘다가 D형인 폴리펩티드.
82. 제81항에 있어서, 서열 27 또는 서열 15의 위치 14 및 위치 15에 존재하는 아르기닌 잔기가 둘다 D형인 폴리펩티드.
83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 아미노산 중 1개 이상이 D형 아미노산인 폴리펩티드.
84. 제83항에 있어서, 1개의 D형 아미노산이 N-말단에 존재하는 것인 폴리펩티드.
85. 제84항에 있어서, 상기 1개의 D형 아미노산이 D-아르기닌인 폴리펩티드.
86. 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단이 아미드화된 폴리펩티드.
87. 제70항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화되어 있거나, 또는 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분이 부착되어 있는 것인 폴리펩티드.
88. 제87항에 있어서, PEG화 또는 헥산산 부분 또는 아미노-헥산산 부분의 부착이 N-말단에 존재하는 것인 폴리펩티드.
89. 제70항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화되지 않은 것인 폴리펩티 드.

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