CN112469732A - 使用胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的神经病变治疗 - Google Patents

使用胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的神经病变治疗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及如下的方法，即，通过给药将人类胰岛素样生长因子1异构体及人类肝细胞生长因子异构体加密的脱氧核糖核酸构建体来治疗神经病变的方法。并且，提供可用于多种脱氧核糖核酸构建体及并用疗法的包含上述脱氧核糖核酸构建体的药学组合物。本发明提供安全且有效治疗神经病变患者的方式。

Description

使用胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞 生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的神经病变治疗
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年7月17日提交且申请号为62/699,667的美国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
序列表
本申请包含通过EFS-Web提出的序列表，由此，其全部内容通过引用结合在本申请中。在2019年7月1日创建的ASCII副本的名称为37536US_CRF_sequencelisting.txt，大小为130163字节。
背景技术
神经病变是由神经损伤引起的慢性病理状况。神经病变是糖尿病的常见结果，糖尿病患者的神经病变被明确称为糖尿病性神经病变。神经病变也有可能因感染(infection)(例如，疱疹病毒，与在感染后发生的病变有关的神经病变为疱疹后神经痛；人类免疫缺陷病毒(HIV)/艾滋病(AIDS)；莱姆病；麻风病；梅毒；带状疱疹)；自身免疫病(例如，类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及格林巴利综合征)；遗传性或遗传疾病(例如，弗里德里希共济失调(Friedreich’s ataxia)及夏科-马里-图斯病(Charcot-Marie-Toothdisease))；淀粉样变性(amyloidosis)；尿毒症；毒素、毒药或药物；外伤；或受伤所引起的神经损伤而导致。在一部分情况下，无法得知原因，在此情况下，将神经病变称为特发性神经病变。
与原因无关，神经病变为与特定症状有关，其部分依赖如疼痛(神经性疼痛)、其他感觉缺陷(例如，包含部分或完全感觉丧失的麻醉；及包含麻木(numbness)和刺痛感(tingling)的感觉异常)、运动缺陷(例如，虚弱、反射丧失(loss of reflexes)、肌肉质量丧失(loss of muscle mass)、抽筋、灵活性下降(loss of dexterity)等)以及自主神经功能障碍(例如，恶心、呕吐、阳痿(impotence)、头晕、便秘、腹泻等)的神经损伤的解剖学部位(例如，末梢神经病变、颅骨神经病变、自主神经病变、局部(focal)神经病变)。
对神经病变的治疗通常采用管理相关症状的措施，在已知病因的情况下，通过治疗神经病变的根本原因来进行常规治疗。例如，使用止痛药或对于糖尿病、自身免疫性疾病、感染或维生素缺乏症的药物治疗。但是，这种方法本身不能治疗神经损伤。
因此，需要对于可以预防及治疗与神经病变有关的神经损伤的有效治疗方法。
已经提出了各种生长因子作为治疗神经病的可用制剂，Kessler及其同事最近报道了在糖尿病性末梢神经病变中成功进行的非病毒性肝细胞生长因子(肝细胞生长因子)基因治疗的双盲、安慰剂对照、人类2期临床试验。Kessler et al.，AnnalsClin.Transl.Neurology 2(5)：465-478(2015)。并且，参照美国专利第9,963,493号，其全部内容通过引用结合在本申请中。
尽管用肝细胞生长因子表达核酸构建体在治疗糖尿病性末梢神经病变方面取得了临床成功，但是存在引起神经病变的病因范围广泛以及神经病变的广泛临床表现，因此，仍然需要以包含使用肝细胞生长因子和其他治疗剂的治疗方法为主的其他治疗方法。
发明内容
技术问题
本发明以如下的新发现为基础，若组合可以表达人类胰岛素样生长因子1异构体的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建及可以表达人类肝细胞生长因子异构体的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体来给药，则有效治疗与神经病变有关的症状。上述两个脱氧核糖核酸构建体的组合物的治疗效果大于肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体自身的治疗效果(例如，VM202或pCK-HGF728)。本发明提供可用于并用疗法的将胰岛素样生长因子1异构体或肝细胞生长因子异构体加密的多种脱氧核糖核酸构建体。并且，本发明提供给药在生物体内有效治疗与神经病变有关的症状的脱氧核糖核酸构建体的方法。
因此，本发明提供使用胰岛素样生长因子1及肝细胞生长因子异构体来治疗神经病变的新的并用疗法。
技术方案
详细地，在一实施方式中，本发明提供神经病变治疗方法，上述神经病变治疗方法包括：步骤(1)，向患有神经病变的对象体给药能够表达人类胰岛素样生长因子1异构体的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量；以及步骤(2)，向上述对象体给药能够表达人类肝细胞生长因子异构体的第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体可表达包含序列14的多肽的I类(Class)IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体无法表达包含序列18的多肽的II类IGF-1Ea蛋白质及包含序列20的多肽的I类IGF-1Eb蛋白质。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。在一具体例中，上述方法还包括向上述对象体给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。在一具体例中，上述方法还包括向上述对象体给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。
在一具体例中，同时执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。在一具体例中，依次执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。在一具体例中，一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体包含序列14的多肽及序列16的多肽。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含：序列1的第一胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子1、3及4)或其的简并物；序列2的第二胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子4)或其的片段物；序列3的第三胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子5及6-1)或其的简并物；序列4的第四胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子5)或其的片段物；以及序列5的第五胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子6-2)或其的简并物，上述第一多核苷酸、上述第二多核苷酸、上述第三多核苷酸、上述第四多核苷酸及上述第五多核苷酸按从5’向3’的顺序依次连接。
在一具体例中，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列6的多核苷酸。在一具体例中，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列7的多核苷酸。在一具体例中，上述第四胰岛素样生长因子多核苷酸为序列8的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含质粒载体。在一具体例中，上述质粒载体为pCK。在一具体例中，上述质粒载体为pTx。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体按减少上述对象体的疼痛的充分的量给药。在一具体例中，上述对象体患有糖尿病性神经病变。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过向多个肌肉内注射给药。
在一具体例中，上述人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF或序列12的dHGF。
在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的的人类肝细胞生长因子异构体。在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类肝细胞生长因子异构体，上述两种人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF及序列12的dHGF。
在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含质粒载体，选择性地，上述质粒载体为pCK载体或pTx载体。
在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含：序列22的外显子1-4的第一肝细胞生长因子多核苷酸或其的简并物；序列25的内含子4的第二肝细胞生长因子多核苷酸或其的功能性片段物；以及序列23的外显子5-18的第三肝细胞生长因子多核苷酸或其的简并物，上述第二肝细胞生长因子多核苷酸位于上述第一肝细胞生长因子多核苷酸及上述第三肝细胞生长因子多核苷酸之间，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两个人类肝细胞生长因子异构体。
在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列13的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体联合给药。在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过肌肉内注射联合给药。
在一具体例中，分离执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。在一具体例中，给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
在一具体例中，上述方法还包括向上述对象体给药能够表达选自序列11的flHGF及序列12的dHGF的人类肝细胞生长因子异构体的第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体。
在一具体例中，上述方法包括：向患有神经病变的对象体给药包含序列13的多核苷酸的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤；以及向上述对象体给药包含序列10的多核苷酸或序列9的多核苷酸的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，给药上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
在一具体例中，上述方法包括：向患有神经病变的对象体给药包含序列33的多核苷酸的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤；以及向上述对象体给药包含序列10的多核苷酸或序列9的多核苷酸的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，给药上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
在一具体例中，上述方法包括：向患有神经病变的对象体给药包含序列13的多核苷酸的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤；以及向上述对象体给药加密序列15的多核苷酸的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及加密序列17的多核苷酸的第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，给药上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
在另一实施方式中，本发明提供药学组合物，上述药学组合物包含：能够表达至少一个人类胰岛素样生长因子1异构体的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体；能够表达至少一个人类肝细胞生长因子异构体的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体；以及药学上可接受的赋形剂。
在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密包含的序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密两个人类胰岛素样生长因子1异构体，上述两个人类胰岛素样生长因子1异构体为包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质及包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含：序列1的第一胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子1、3及4)或其的简并物；序列2的第二胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子4)或其的片段物；序列3的第三胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子5及6-1)或其的简并物；序列4的第四胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子5)或其的片段物；以及序列5的第五胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子6-2)或其的简并物，上述第一多核苷酸、上述第二多核苷酸、上述第三多核苷酸、上述第四多核苷酸及上述第五多核苷酸按从5’向3’方向依次连接。
在一具体例中，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列6的多核苷酸。在一具体例中，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列7的多核苷酸。在一具体例中，上述第四胰岛素样生长因子多核苷酸为序列8的多核苷酸。
在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体还包含质粒载体。在一具体例中，上述质粒载体为pCK。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体选自由pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10组成的组中。在一具体例中，上述质粒载体为pTx。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体选自由pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10组成的组中。
在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。
在一具体例中，上述至少一个人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF或序列12的dHGF。在一具体例中，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体均可表达序列11的flHGF及序列12的dHGF。
在一具体例中，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含：序列22的第一肝细胞生长因子多核苷酸(外显子1-4)或其的简并物；序列25的第二肝细胞生长因子多核苷酸(内含子4)或其的功能性片段物；以及序列23的第三肝细胞生长因子多核苷酸(外显子5-18)或其的简并物，上述第二肝细胞生长因子多核苷酸位于上述第一肝细胞生长因子多核苷酸与上述第三肝细胞生长因子多核苷酸之间，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两个人类肝细胞生长因子异构体。
在一具体例中，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列26-32及13中的一个多核苷酸。在一具体例中，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列13的多核苷酸。
在一具体例中，上述药学组合物包含：序列13的多核苷酸；以及序列9的多核苷酸。在一具体例中，上述药学组合物包含：序列13的多核苷酸；以及序列10的多核苷酸。在一具体例中，上述药学组合物包含序列13的多核苷酸；以及序列15的多核苷酸或序列17的多核苷酸。在一具体例中，上述药学组合物包含序列13的多核苷酸；序列15的多核苷酸；以及序列17的多核苷酸。
在一具体例中，上述药学组合物包含序列33的多核苷酸及序列9、序列10、序列15或序列17的多核苷酸。
在另一实施方式中，本发明提供治疗神经病变的试剂盒，上述试剂盒包含：第一药学组合物，包含能够表达至少一个人类胰岛素样生长因子1异构体的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体以及第一药学上可接受的赋形剂；以及第二药学组合物，包含能够表达至少一个人类肝细胞生长因子异构体的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体以及第二药学上可接受的赋形剂。
在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含两个人类胰岛素样生长因子1异构体，上述两个人类胰岛素样生长因子1异构体为包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质及包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含：序列1的第一胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子1、3、4)或其的简并物；序列2的第二胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子4)或其的片段物；序列3的第三胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子5及6-1)或其的简并物；序列4的第四胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子5)或其的片段物；以及序列5的第五胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子6-2)或其的简并物，上述第一多核苷酸、上述第二多核苷酸、上述第三多核苷酸、上述第四多核苷酸及上述第五多核苷酸按从5’向3’的顺序依次连接。
在一具体例中，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列6的多核苷酸。在一具体例中，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列7的多核苷酸。在一具体例中，上述第四胰岛素样生长因子多核苷酸为序列8的多核苷酸。
在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体还包含质粒载体。在一具体例中，上述质粒载体为pCK。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10。在一具体例中，上述质粒载体为pTx。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10。
在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。
在一具体例中，上述至少一个人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF或序列12的dHGF。在一具体例中，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体均可表达序列11的flHGF及序列12的dHGF。
在一具体例中，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含：序列22的第一肝细胞生长因子多核苷酸(外显子1-4)或其的简并物；序列25的第二肝细胞生长因子多核苷酸(内含子4)或其的功能性片段物；以及序列23的第三肝细胞生长因子多核苷酸(外显子5-18)或其的简并物，上述第二肝细胞生长因子多核苷酸位于上述第一肝细胞生长因子多核苷酸与上述第三肝细胞生长因子多核苷酸之间，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两个人类肝细胞生长因子异构体。
在一具体例中，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列26-32及13中的一个多核苷酸。在一具体例中，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列13的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一药学组合物包含序列9的多核苷酸，上述第二药学组合物包含序列13的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一药学组合物包含序列10的多核苷酸，上述第二药学组合物包含序列13的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一药学组合物包含序列15的多核苷酸及序列17的多核苷酸，上述第二药学组合物包含序列13的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一药学组合物包含序列9、序列10、序列15或序列17的多核苷酸，上述第二药学组合物包含序列33的多核苷酸。
在另一实施方式中，本发明提供第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，用于治疗神经病变的医疗方法，可表达人类胰岛素样生长因子1异构体，上述医疗方法包括：向患有神经病变的对象体给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤；以及向上述对象体给药能够表达人类肝细胞生长因子异构体的第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体可表达包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体无法表达包含序列18的多肽的II类IGF-1Ea蛋白质及包含序列20的多肽的I类IGF-1Eb蛋白质。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。在一具体例中，上述医学方法还包括向上述对象体给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的方法，上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。在一具体例中，上述医学方法还包括向上述对象体给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的方法，上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。
在一具体例中，同时执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。在一具体例中，依次执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。在一具体例中，上述一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体包含序列14的多肽及序列16的多肽。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含：序列1的第一胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子1、3、4)或其的简并物；序列2的第二胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子4)或其的片段物；序列3的第三胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子5及6-1)或其的简并物；序列4的第四胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子5)或其的片段物；以及序列5的第五胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子6-2)或其的简并物，上述第一多核苷酸、上述第二多核苷酸、上述第三多核苷酸、上述第四多核苷酸及上述第五多核苷酸按从5’向3’的顺序依次连接。
在一具体例中，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列6的多核苷酸。在一具体例中，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列7的多核苷酸。在一具体例中，上述第四胰岛素样生长因子多核苷酸为序列8的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含质粒载体。在一具体例中，上述质粒载体为pCK。在一具体例中，上述质粒载体为pTx。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体按减少上述对象体的疼痛的充分的量给药。在一具体例中，上述对象体患有糖尿病性神经病变。在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过多重的肌肉内注射给药。
在一具体例中，上述人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF或序列12的dHGF。在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类肝细胞生长因子异构体。在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类肝细胞生长因子异构体，上述两种人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF及序列12的dHGF。
在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含质粒载体，选择性地，上述质粒载体为pCK载体或pTx载体。在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含：序列22的第一肝细胞生长因子多核苷酸(外显子1-4)或其的简并物；序列25的第二肝细胞生长因子多核苷酸(内含子4)或其的功能性片段物；以及序列23的第三肝细胞生长因子多核苷酸(外显子5-18)或其的简并物，上述第二肝细胞生长因子多核苷酸位于上述第一肝细胞生长因子多核苷酸及上述第三肝细胞生长因子多核苷酸之间，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类肝细胞生长因子异构体。
在一具体例中，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列13的多核苷酸。
在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体联合给药。在一具体例中，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过肌肉内注射给药。在一具体例中，给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤分离执行。在一具体例中，给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
在一具体例中，上述医学方法还包括向上述对象体给药能够表达选自序列11的flHGF及序列12的dHGF的人类肝细胞生长因子异构体的第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
在另一实施方式中，本发明还提供第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体，用于治疗神经病变的方法，可表达人类肝细胞生长因子异构体，上述方法包括：向患有神经病变的对象体给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤；以及向上述对象体给药能够表达人类肝细胞生长因子异构体的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤。
附图说明
图1为示出包含转录起始位点及选择性剪接位点的人类胰岛素样生长因子1基因。从上述胰岛素样生长因子1基因自然生成的胰岛素样生长因子1异构体包含I类Ec(异构体#1)；I类IEa(异构体#2)；I类Eb(异构体#3)及I类Ea(异构体#4)。
图2A为简要示出试验将肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(VM202)及单一胰岛素样生长因子1异构体加密的脱氧核糖核酸构建体同时向慢性压迫性神经损伤(chronic constriction injury(CCI))模型给药的治疗功效的实验方式。
图2B为示出在图2A中说明的实验中，在慢性压迫性神经损伤小鼠或假手术小鼠中测定的缩脚的频率(％)的图表。向上述慢性压迫性神经损伤小鼠注射脱氧核糖核酸构建体-(i)pCK载体(“pCK”)、(ii)VM202(“VM202”)或(iii)VM202 plus(+)胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体-VM202及pCK-IGF-1#1(“1”)、VM202和pCK-IGF-1#2(“2”)、VM202和pCK-IGF-1#3(“3”)或VM202及pCK-IGF-1#4(“4”)。
图3A为简要示出在慢性压迫性神经损伤(CCI)模型中，试验对于加密肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(VM202)及单一胰岛素样生长因子1异构体的一个或两个脱氧核糖核酸构建体的同时给药的治疗功效的实验方式。
图3B为示出在图3A中说明的实验中，在慢性压迫性神经损伤小鼠或假手术小鼠中测定的缩脚的频率(％)的图表。向上述慢性压迫性神经损伤小鼠注射脱氧核糖核酸构建体-(i)pCK载体(“pCK”)、(ii)VM202(“VM202”)或(iii)VM202及胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体-VM202及pCK-IGF-1#l(“1”)、VM202及pCK-IGF-1#4(“4”)或VM202、pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4(“1+4”)。
图4简要示出在慢性压迫性神经损伤(CCI)模型中，试验对于肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(VM202)及两个胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4的依次给药的治疗功效的实验方式。
图4B为示出在图4A中说明的实验中，在慢性压迫性神经损伤小鼠中测定的缩脚的频率(％)的图表。向上述慢性压迫性神经损伤小鼠注射一个以上的脱氧核糖核酸构建体-(i)在第一次注射中，pCK载体及在第二次注射中，pCK载体(“pCK”)、(ii)在第一次注射中，pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4及在第二次注射中，pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4(“胰岛素样生长因子1≥胰岛素样生长因子1”)、(iii)在第一次注射中，VM202及在第二次注射中，pCK载体(“VM202≥pCK”)、(iv)在第一次注射中，pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4及在第二次注射中，pCK载体(“胰岛素样生长因子1≥pCK”)、(v)在第一次注射中，pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4及在第二次注射中，VM202(“胰岛素样生长因子1≥VM202”)、(vi)在第一次注射中，VM202及在第二次注射中，VM202(“VM202≥VM202”)或(vii)在第一次注射中，VM202及在第二次注射中，pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4(“VM202≥胰岛素样生长因子1异构体”)。
图5A为简要示出为了从多种脱氧核糖核酸构建体评价胰岛素样生长因子1异构体的生物体内表达而在实施例3中所使用的实验方式。
图5B为示出在注射对以下成分进行加密的脱氧核糖核酸构建体之后，测定表达的总人类胰岛素样生长因子1异构体的量的ELISA的结果。(载体单独，“pCK”)；pCK-IGF-1#l(“1”)；pCK-IGF-1#4(“4”)；pCK-IGF-1#1及pCK-IGF-1#4(“1+4”)及双重表达构建体pCK-IGF-1X6(“X6”)及pCK-IGF-1X10(“X10”)。
图6A示出为了区分胰岛素样生长因子1异构体#1(I类Ec异构体)及#4(I类Ea异构体)的表达而在RT-PCR中使用的正向(“F”)及反向(“R”)引物的位点。
图6B示出RT-PCR生成物的琼脂糖凝胶电泳，示出从双重表达构建体pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10的异构体#1及#4的表达。pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10均以高水平诱导两侧蛋白质的表达。
图7A简要说明在293T细胞中，在试验管内评价从胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的蛋白质表达的实施例3使用的方式。
图7B示出在将(i)pCK-IGF-1#1(“1”)、(ii)pCK-IGF-1#4(“4”)、(iii)两个单一表达构建体、pCK-IGF-1#1及pCK-IGF-1#4(“1+4”),(iv)双重表达构建体pCK-IGF-1X6(“X6”或(v)双重表达构建体pCK-IGF-1X10(“X10”)转染在试验管内之后，证明胰岛素样生长因子1异构体#1和/或#4的表达的蛋白质印迹结果。
图8A简要示出在慢性压迫性神经损伤动物模型中，在减少机械性触诱发痛(mechanical allodynia)的过程中，为了试验对于同时给药VM202及多种胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的的功效而在实施例4中使用的实验方式。
图8B为示出在图8A中说明的实验中，在假手术小鼠或慢性压迫性神经损伤小鼠中测定的缩脚的频率的图表。向上述慢性压迫性神经损伤小鼠注射一个以上的脱氧核糖核酸构建体-(i)pCK载体(“pCK”)、(ii)VM202(“VM202”)、(iii)VM202、pCK-IGF-1#1和pCK-IGF-1#4(“IGF-1#1+#4”)、(iv)VM202及pCK-IGF-1X6(“IGF-1X6”)及(v)VM202及pCK-IGF-1X10(“IGF-1X10”)。
图9A为简要示出在慢性压迫性神经损伤动物模型中，在减少机械性触诱发痛的过程中，为了试验对于同时给药表达HGF728的构建体及多种胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的功效而在实施例5中使用的实验方式。
图9B为示出在示出图9A中说明的实验中，假手术小鼠或慢性压迫性神经损伤小鼠中测定的缩脚的频率的图表。
图9C为示出在图9A中说明的实验中，在假手术小鼠或慢性压迫性神经损伤小鼠中测定的缩脚的阈值的图表。向上述慢性压迫性神经损伤小鼠注射一个以上的以下脱氧核糖核酸构建体载体单独(“CCI-pCK”)或(i)pCK-HGF728(“CCI-HGF728”)、(ii)pCK-HGF728及pCK-IGF-1#1(“CCI-HGF728+IGF-1#l”)、(iii)pCK-HGF728及pCK-IGF-1#4(“CCI-HGF728+IGF-1#4”)或(iv)pCK-HGF728及pCK-IGF-1X10(“CCI-HGF728+IGF-1X10”)。
附图仅用于说明本发明的多种具体实施例。本发明所属技术领域的普通技术人员可以从以下的研究轻松理解对于在本说明书中说明的结构的具体实施例可以在不超出说明书中说明的发明的原理的情况下使用。
具体实施方式
6.1.定义
只要没有其他定义，在本说明书中所使用的所有技术及科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员共同理解的含义相同。如在本说明书中所使用的，以下术语具有如下赋予的含义。
如在本说明书中所使用的，“胰岛素样生长因子1的异构体”、“人类胰岛素样生长因子1异构体”或“胰岛素样生长因子1异构体”为具有与人类自然发生的pre-pro-IGF-1多肽或其的同源突变体、剪接突变体或缺陷突变体中的一个氨基酸序列至少相同80％的氨基酸序列的多肽，能够相互交换使用。上述自然发生的pre-pro-IGF-1多肽包含I类，Ec(序列16)；II类，Ea(序列18)；I类，Eb(序列20)及I类，Ea异构体(序列14)。
术语“异构体#1”、“I类，Ec异构体”、“I类，胰岛素样生长因子1Ec异构体”或“I类，胰岛素样生长因子1Ec”为在本说明书中的序列16的多肽，能够相互交换使用。
术语“异构体#2”、“II类，Ea异构体”、“II类，胰岛素样生长因子1Ea异构体”或“II类，胰岛素样生长因子1Ea”为在本说明书中的序列18的多肽，能够相互交换使用。
术语“异构体#3”、“I类，Eb异构体”、“I类，胰岛素样生长因子1Eb异构体”或“I类，胰岛素样生长因子1Eb”为在本发明中的序列18的多肽，能够相互交换使用。
术语“异构体#4”、“I类，Ea异构体”、“I类，胰岛素样生长因子1Ea异构体”或“I类，胰岛素样生长因子1Ea”为在本说明书中的序列14的多肽，能够相互交换使用。
如在本说明书中使用，术语“治疗”为(a)神经病变的症状抑制；(b)神经病变的症状缓和以及(c)神经病变症状去除的所有行为。在一具体例中，本发明的组合物可通过神经细胞的生长或神经细胞凋亡的抑制治疗神经病变。
如在本说明书中使用，术语“VM202”为也被命名为pCK-HGF-X7的质粒脱氧核糖核酸，其包含pCK载体(序列24)及通过上述pCK载体克隆的肝细胞生长因子-X7(序列13)。VM202于2002年3月12日根据《布达佩斯条约》保藏在韩国微生物保护中心(KCCM)，保藏号为KCCM-10361。
如在本说明书中使用，术语“肝细胞生长因子的异构体”为具有与在包含人类在内的动物中自然发生的肝细胞生长因子多肽的氨基酸序列至少相同80％的氨基酸序列的多肽。上述术语包含具有与全长野生型肝细胞生长因子多肽至少相同80％的氨基酸序列的多肽，具有与自然发生的肝细胞生长因子等位突变体(variant)、剪接突变体或缺陷突变体至少相同80％的氨基酸序列的多肽。优选用于本发明的肝细胞生长因子的异构体包含选自由全长肝细胞生长因子(flHGF)(同义为fHGF)、缺陷变体肝细胞生长因子(dHGF)、NK1、NK2和NK4组成的组中的两种以上的异构体。根据本发明的更优选的具体例，在本说明书中说明的上述方法所使用的肝细胞生长因子的异构体包含flHGF(序列11)及dHGF(序列12)。
在本说明书中，术语“人类flHGF”、“flHGF”及“f肝细胞生长因子”是指由人类肝细胞生长因子蛋白质的氨基酸1-728构成的蛋白质，可以相互交换使用。flHGF的序列通过序列11提供。
在本说明书中，术语“人类dHGF”及“dHGF”是指通过人类肝细胞生长因子基因的选择性剪接(alternative splicing)生成的肝细胞生长因子蛋白质的缺陷突变体，能够相互交换使用。详细地，“人类dHGF”或“dHGF”是指在上述全长肝细胞生长因子序列中的α链的第一三环域中具有无关氨基酸(F、L、P、S及S)缺陷的人类肝细胞生长因子蛋白质。人类dHGF为723个氨基酸长度。人类dHGF的氨基酸序列通过序列12提供。
本发明中所使用的术语“治疗有效用量”或“有效量”为当给药时生成所需要的效果的给药量或量。在本发明的脉络中，治疗有效量为用于治疗神经病变的症状的有效量。上述量可以为通过其自身或与其他治疗剂的组合治疗神经病变的症状的有效量。
如在本说明书中所使用的，术语“充分的量”为用于生成优选效果的充分的量。上述量为可通过其自身或与其他治疗剂的组合生成所需要的效果的充分的量。
如在本说明书中使用，上述“简并序列”是指以提供与从参照核酸序列翻译的序列相同的氨基酸序列的方式翻译的核酸序列。
6.2.其他解释规则
在本发明中所引用的范围为对于在所引用的终点的上述范围内的所有值的简写。例如，1至50的范围包含选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50组成的组中的任意数字、数字的组合或子范围。
6.3.治疗神经病变的方法
在第一观点上，提供治疗神经病变的方法。在上述方法中，向患有神经病变的对象体给药可以表达类胰岛素样生长因子1异构体的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体以及可以表达人类肝细胞生长因子异构体的第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量。
6.3.1.胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体
在本说明书中提供的方法中，使用可以表达人类胰岛素样生长因子1的至少一个异构体的脱氧核糖核酸构建体。
如图1所示，上述人类胰岛素样生长因子1基因包含约全长为90kb的基因组脱氧核糖核酸的6个外显子(外显子1、2、3、4、5及6(6-1及6-2))。外显子1及2为互斥先导显子，分别具有以多种方式使用的多个启动子位点。并且，上述胰岛素样生长因子1基因可差分剪接来生成多重转录组变异体。各个转录组变异体编码具有可变信号肽先导序列的不同的pre-pro-IGF-1蛋白质(“胰岛素样生长因子1异构体”)。所有转录组异构体在处理之后，生成作为使用相同受体的相同成熟的70-氨基酸胰岛素样生长因子1肽。
在上述Pre-pro-IGF-1肽中，其的先导或信号、序列及其的羧基(C)-末端不同。外显子1或外显子2互斥，其中的一个起到Pre-pro-IGF-1肽的先导序列的作用。上述不同的先导外显子生成不同的5’-UTR。上述Pre-pro-IGF-1多肽在转录后，蛋白质分解切割，从而去除先导及E-肽羧基-末端来生成成熟的70-氨基酸的胰岛素样生长因子1。
包含外显子1的转录组被称为类1转录组(例如，图1的I类，Ec；I类，Eb及I类，Ea)，相反，包含外显子2的转录组也被称为类2转录组(例如，图1的II类，Ea)。从外显子3获取的信号肽中，几乎所有pre-pro肽包含27个氨基酸，以及源自包含外显子1或2的剩余信号序列。少数的转录组利用生成22个氨基酸的更短的信号传递肽的外显子3内的其他转录起始位点。外显子3及4不会改变，并加密成熟的胰岛素样生长因子1肽的B、C、A及D结合域，外显子4加密上述胰岛素样生长因子1肽的2/3。人类Eb肽仅由外显子4及5构成，相反，Ec包含外显子4、5及6(图1)。
转录的选择性剪接及互斥揭示在图1中示出，呈现出不同pre-pro-IGF-1多肽的结果(即，胰岛素样生长因子1异构体)。详细地，至少包含外显子1、3/4、5及6的片段物的I类，Ec胰岛素样生长因子1异构体(序列16)从包含序列17的序列的转录组生成。至少包含外显子2、3/4及6的II类，Ea胰岛素样生长因子1异构体(序列18)从包含序列19的序列的转录组生成。至少包含外显子1、3/4及5的片段物的I类，Eb胰岛素样生长因子1异构体(序列20)从包含序列21的序列的转录组生成。至少包含外显子1、3/4及6的片段物的I类，Ea胰岛素样生长因子1异构体(序列14)从包含序列15的序列的转录组生成。
虽然，从上述多种转录组获取的成熟的胰岛素样生长因子1蛋白质不同，但是，上述多种转录组异构体具有不同的调节作用。上述变异体形态保留呈现出不同的稳定性、结合伙伴及对于上述异构体的中心调节作用的活性。具有外显子1的I类异构体以自分泌/侧分泌形态分泌，具有外显子2的I类I异构体以内分泌形态分泌，但是，上述异构体的生物含义依然不明确。这基于包含与I类I转录组的有效分泌有关的典型的信号肽基元，相反，I类转录组具有可以妨碍分泌的更长的信号肽。
肝脏使用两种形态，即使肝脏II类转录组在发育过程中优先强化，大部分组织也使用I类转录组。在发育过程中，在胰岛素样生长因子1转录组的丰度中存在很多变化。类1，Ea在活性成长期间最为丰度，类1，Eb处于较低水平，但是，在初期生长期内，在生长板整体中均匀地表达。
提供可以表达人类胰岛素样生长因子1的至少一个异构体的脱氧核糖核酸构建体。上述单一表达构建体包含：pCK-IGF-1#l，作为包含对于胰岛素样生长因子1异构体#的编码序列的pCK载体；pCK-IGF-l#2，作为包含对于胰岛素样生长因子1异构体#2的编码序列的pCK载体；pCK-IGF-1#3，作为包含对于胰岛素样生长因子1异构体#3的编码序列的pCK载体；以及pCK-IGF-1#4，作为包含对于胰岛素样生长因子1异构体#4的编码序列的pCK载体，但并不局限于此。在一具体例中，使用编码分别不同的胰岛素样生长因子1异构体的一个以上的脱氧核糖核酸构建体。例如，同时使用编码I类，Ec异构体(异构体#1)的第一构建体及编码I类，Ea异构体(异构体#4)的第二构建体。例如，可同时使用pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4。
上述单一表达构建体包含：pTx-IGF-1#l，作为包含对于胰岛素样生长因子1异构体#1的编码序列的pTx载体；pTx-IGF-1#2，作为包含对于胰岛素样生长因子1异构体#2的编码序列的pTx载体；pTx-IGF-1#3，作为包含对于胰岛素样生长因子1异构体#3的编码序列的pTx载体；以及pTx-IGF-1#4，作为包含对于胰岛素样生长因子1异构体#4的编码序列的pTx载体，但并不局限于此。在一具体例中，使用编码分别不同的胰岛素样生长因子1异构体的一个以上的脱氧核糖核酸构建体。同时使用编码例如，I类，Ec异构体(异构体#1)的第一构建体及编码I类，Ea异构体(异构体#4)的第二构建体。例如，可同时使用pTx-IGF-1#1及pTx-IGF-1#4。
在一具体例中，使用表达两个以上的异构体脱氧核糖核酸构建体(即，“双重表达构建体”)。可以使用均编码例如，I类，Ec异构体及I类，Ea异构体的单一脱氧核糖核酸构建体。
在一具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体包含上述胰岛素样生长因子1异构体中的一个编码序列。例如，上述脱氧核糖核酸构建体可包含编码I类，Ea(异构体#4)(序列15)；I类，Eb(异构体#3)(序列2l)；I类，Ec(异构体#1)(序列17)；或II类，Ea(异构体#2)(序列19)的序列。
在一具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体包含对于各个异构体编码序列(CDS)的表达调节序列，由此，是作为可以表达一个以上的胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的双重表达构建体。在一具体例中，上述构建体在两个编码序列之间包含内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)，例如，按(1)表达调节序列-(2)第一异构体的编码序列-(3)内部核糖体进入位点-(4)第二异构体的编码序列-(5)转录终止序列的顺序。内部核糖体进入位点可以在内部核糖体进入位点序列中开始翻译，由此，可以从单一转录组表达两种蛋白质生成物。在另一具体例中，同时使用分别编码胰岛素样生长因子1的单一异构体的多个构建体来在给药的对象体中诱导胰岛素样生长因子1的一个以上的异构体的表达。
在优选的具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体包含选择性剪接位点，由此可以同时表达两个以上的胰岛素样生长因子1异构体，例如，(i)I类，Ec异构体(异构体#1)及II类，Ea异构体(异构体#2)；(ii)I类，Ec异构体(异构体#1)及I类，Eb异构体(异构体#3)；(iii)I类，Ec异构体(异构体#1)及I类，Ea异构体(异构体#4)；(iv)II类，Ea异构体(异构体#2)及I类，Eb异构体(异构体#3)；(v)II类，Ea异构体(异构体#2)及I类，Ea异构体(异构体#4)；(vi)I类，Eb异构体(异构体#3)及I类，Ea异构体(异构体#4)。
例如，上述脱氧核糖核酸构建体可包含：(i)包含人类胰岛素样生长因子1基因的外显子1、3及4的第一序列(序列1)或上述第一序列的简并序列；(ii)包含上述人类胰岛素样生长因子1基因的内含子的第二序列(序列2)或上述第二序列的片段物；(iii)包含上述人类胰岛素样生长因子1基因的外显子5及6-1的第三序列(序列3)或上述第三序列的简并序列；(iv)包含上述人类胰岛素样生长因子1基因的内含的第四序列(序列4)或上述第二序列的片段物；以及(v)包含上述人类胰岛素样生长因子1基因的外显子6-2的第五序列(序列5)或上述第五序列的简并序列。内含子4及5选择性地剪接，从而生成胰岛素样生长因子1的两种异构体(例如，I类，Ec及I类，Ea)。
在一具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体涉及在试验管内试验和/或可以在生物体内表达一个以上的胰岛素样生长因子1异构体的能力。在优选的具体例中，选择均可表达I类，Ec及I类，Ea胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体。
在一具体例中，上述构建体包含内含子4的整体序列(序列2)或其的片段。在优选的具体例中，上述构建体包含具有序列6或序列7的序列的内含子4的片段。
在一具体例中，上述构建体包含内含子5的整体序列(序列4)或其的片段。在优选具体例中，上述构建体包含具有序列8的序列的内含子的片段。
将包含与(i)上述人类胰岛素样生长因子1基因的外显子1-6及(ii)上述人类胰岛素样生长因子1基因的内含子4及5或内含子4及5的多种片段相对应的序列的多种脱氧核糖核酸构建体命名为在后面带有特定数字的“IGF-1X”。通过本发明人员试验的IGF-1X构建体包含IGF-1X1、IGF-1X2、IGF-1X3、IGF-1X4、IGF-1X5、IGF-1X6、IGF-1X7、IGF-1X8、IGF-1X9及IGF-1X10，但并不局限于此。在pCK载体克隆的上述IGF-1X构建体分别称为pCK-IGF-1Xl、pCK-IGF-1X2、pCK-IGF-1X3、pCK-IGF-1X4、pCK-IGF-1X5、pCK-IGF-1X6、pCK-IGF-1X7、pCK-IGF-1X8、pCK-IGF-1X9及pCK-IGF-1X10。在上述试验的构建体中，pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10均表达I类，Ec及I类，Ea胰岛素样生长因子1异构体。在pTx载体克隆的IGF-1X构建体分别称为pTx-IGF-1Xl、pTx-IGF-1X2、pTx-IGF-1X3、pTx-IGF-1X4、pTx-IGF-1X5、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X7、pTx-IGF-1X8、pTx-IGF-1X9及pTx-IGF-1X10。pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10均表达I类，Ec及I类，Ea胰岛素样生长因子1异构体。
在优选具体例中，使用IGF-1X6(序列9)或IGF-1X10(序列10)。向pCK载体内克隆的IGF-1X6(序列9)及IGF-1X10(序列10)分别被命名为pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10。根据《布达佩斯条约》，用pCK-IGF-1X6转化的大肠杆菌(E.coli)(“DH5a_pCK-IGF-1X6”)于2018年5月30日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC，生物科学与生物技术研究所(KRIBB)56212，韩国，全罗北道，井邑市，立新街181号)，保藏号为KCTC 13539BP。根据《布达佩斯条约》，用pCK-IGF-1X10转化的大肠杆菌(“DH5a_pCK-IGFlX10”)于2018年5月30日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC，生物科学与生物技术研究所(KRIBB)56212，韩国，全罗北道，井邑市，立新街181号)，保藏号为KCTC 13540BP。
在另一优选具体例中，使用在pTx载体(序列38)克隆的IGF-1X6(序列9)及IGF-1X10(序列10)。上述胰岛素样生长因子构建体分别被命名为pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10(序列39)。
加密在本说明书中说明的胰岛素样生长因子1异构体或胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体可以包含从野生型人类胰岛素样生长因子1异构体的变形。当通过最大的方式排序上述变形的序列与野生型人类胰岛素样生长因子1异构体序列时，上述变形的序列可包含具有80％相同性，更优选地，至少90％相同性，以及最优选地，至少95％相同性的序列。本领域已知用于比较的序列排序方法。详细地，在确定相同性百分比的过程中，可以使用在美国国家生物信息中心(National Center for Biological Information，位于马里兰州贝塞斯达)的NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)网站上揭示，并与序列分析程序blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx结合使用的排序算法。
6.3.2.肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体
在本说明书所提供的方法中，使用可以表达人类肝细胞生长因子的至少一个异构体的脱氧核糖核酸构建体。
肝细胞生长因子(HGF)为肝素结合糖蛋白，也被称为散射因子或肝细胞生成素A。肝细胞生长因子具有如多种细胞类型的体细胞有丝分裂诱导(mitogenesis)、细胞移动性促进(motogenesis)及形态形成(morphogenesis)的多种生物学效果。肝细胞生长因子通过位于染色体7q2l.l的包含18个外显子及17个内含子的基因加密。
上述肝细胞生长因子基因在外显子4及外显子5中间，通过选择性剪接加密肝细胞生长因子的两个异构体。上述两个异构体包含(1)具有以下结合域的包含728个氨基酸(序列11)的整个多肽肝细胞生长因子前体(“flHGF”)；N末端发夹环-Kringlel-Kringle2-Kringle3-Kringle4-失活的丝氨酸蛋白质水解酶以及(2)α链的第十三环域内5个氨基酸(即，F、L、P、S及S)缺失的包含723个氨基酸(序列12)的缺失的变异体肝细胞生长因子(“dHGF”)。flHGF及dHGF共享几种生物学功能，免疫学特性及集中生物学特性不相同。肝细胞生长因子的上述两个异构体为参照，如美国公开专利20140296142所示，被证明有效治疗糖尿病性神经病变。
本发明的特定具体例提供加密肝细胞生长因子的一个以上的异构体的给药方法。在一具体例中，使用均加密flHGF及dHGF的构建体。在一具体例中，使用加密flHGF或dHGF的构建体。具体地，可以使用包含序列33的多核苷酸的构建体。上述构建体可以包含具有一个以上的调节序列(例如，启动子或增强子)的载体，上述调节序列与加密flHGF、dHGF或均加密上述两种物质的编码序列以操作的方式连接。上述调节序列可以调节上述肝细胞生长因子异构体的表达。
在一具体例中，构建体可包含对于各个异构体的编码序列(CDS)的表达调节序列，由此，可以加密肝细胞生长因子的两个以上的异构体。代替性地，上述构建体在两个编码序列之间包含内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)，例如，按(1)表达调节序列；(2)第一异构体的编码序列；(3)内部核糖体进入位点；(4)第二异构体的编码序列；(5)转录中止序列的顺序包含。内部核糖体进入位点可以在内部核糖体进入位点序列中开始翻译，由此，可从单一构建体表达两种蛋白质生成物。代替性地，同时使用分别加密肝细胞生长因子的单一异构体的一个以上的构建体来在靶中诱导肝细胞生长因子的一个以上的异构体的表达。
在优选具体例中，构建体包含选择性剪接位点，由此，使用表达肝细胞生长因子的两个以上的不同异构体，即，flHGF及dHGF的构建体。加密肝细胞生长因子的两个异构体(flHGF及dHGF)的构建体比加密肝细胞生长因子的一个异构体(flHGF或dHGF)的构建体具有更高的(几乎250倍高的)表达效率，这已被证明在美国专利7,812,146号。
上述构建体可包含与人类肝细胞生长因子的外显子1-18及人类肝细胞生长因子基因的内含子4或其的片段相应的cDNA，上述内含子需要向上述cDNA的外显子4及外显子5插入。从上述构建体，肝细胞生长因子的两个异构体(flHGF及dHGF)可通过外显子4及外显子5之间的选择性剪接生成。在一具体例中，上述构建体包含内含子4的整个序列(序列25)。在一具体例中，上述构建体包含内含子4的片段。
包含人类肝细胞生长因子的外显子1-18及人类肝细胞生长因子基因的内含子4或与其片段相应的cDNA的构建体可通过在内含子4或其的片段中的选择性剪接加密肝细胞生长因子的两个异构体。具体地，上述构建体可包含选自由序列13及序列26至序列32组成的组中的核苷酸序列。序列26的核苷酸序列为71l3bp，与包含内含子4的整个序列的构建体相应。序列13及27-32的核苷酸序列与包含内含子4的多个片段的构建体相应。
包含人类肝细胞生长因子的外显子1-18及人类肝细胞生长因子基因的内含子4或与其的构建体相应的cDNA的多种脱氧核糖核酸构建体被明明为“HGF-X”，并在后面赋予数字。可用于本发明的多种具体例的HGF-X包含HGF-X1(序列26)、HGF-X2(序列27)、HGF-X3(序列28)、HGF-X4(序列29)、HGF-X5(序列30)，HGF-X6(序列31)、HGF-X7(序列13；VM202内肝细胞生长因子编码序列)及HGF-X8(序列32)，但并不局限于此。
如美国专利7,812,146所示，pCK-HGF-X7(即，VM202)被证明具有最高的表达效率。因此，包含HGF-X7的脱氧核糖核酸构建体可用于本发明的优选具体例。
在本发明中所使用的构建体可包括实质上与野生型人类肝细胞生长因子异构体的序列相同的核苷酸序列。当通过与一系列最大程度整合的序列比较算法中的一种来测定野生型人类肝细胞生长因子异构体的氨基酸序列或核苷酸序列时，实质性相同性至少为80％，更优选地，至少为90％，最优选地，至少为95％。用于比较的序列的整合方法本发明所属技术领域已公知。多种程序和整合算法如下：Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；Needleman and Wunsch，J.Mol.Bio.48：443(1970)；Pearson and Lipman，Methods in Mol.Biol.24：307-31(1988)；Higgins and Sharp，Gene 73：15 237-44(1988)；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151-3(1989)Corpet et al.，Nuc.Acids Res.16：10881-90(1988)；Huang et al.，Comp.Appl.BioSci.8：155-65(1992)；and Pearson etal.，Meth.Mol.Biol.24：307-31(1994).The NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)[Altschul 20et al.，J.Mol.Biol.215：403-10(1990)J可以在美国国家生物信息中心(National Center for Biological Information，马里兰州贝塞斯达)中的几个搜索源及网络上利用，序列分析程序可以与blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx连接使用。
6.3.3.载体
通常，加密在本说明书中说明的方法中所使用的胰岛素样生长因子1异构体或肝细胞生长因子异构体的脱氧核糖核酸构建体包含具有以与上述表达的序列可操作性的方式连接的一个以上的调节序列(例如，启动子或增强子)的载体。上述调节序列调节胰岛素样生长因子1的异构体或肝细胞生长因子的异构体的表达。
优选地，加密一个以上的胰岛素样生长因子1异构体或肝细胞生长因子异构体的多核苷酸在表达构建体中与启动子以操作的方式连接。术语“以操作的方式连接”是指核酸表达调节序列(如启动子、信号序列或一系列的转录因子结合位点)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中，上述表达调节序列对与第二序列相应的核酸的转录和/或翻译产生影响。
在一具体例中，优选地，与上述多核苷酸连接的启动子可以在动物，更优选地，在哺乳动物细胞中可以操作来调节多核苷酸的转录，源自哺乳动物细胞的基因组的启动子或哺乳动物病毒，例如，CMV(巨细胞病毒)启动子、腺病毒晚期(late)启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、β-肌动蛋白启动子、人类IL-2基因启动子、人类IFN基因启动子、人类IL-4基因启动子、人类淋巴病毒基因启动子和人类GM-CSF基因启动子，但并不局限于此。更优选地，在本发明中，有用的启动子为源自人类巨细胞病毒(hCMV)的早期即可(IE，immediatelyEarly)基因的启动子或EF1α启动子，最优选地，源自人类巨细胞病毒(hCMV)的IE(初期即刻)基因启动子/增强子及外显子1的整个序列及起始密码子之前的序列中包含外显子2序列的5'-UTR(非翻译区)。
例如，在本发明中所使用的表达试剂盒包含聚腺苷酸化序列，例如，牛生长激素终止剂(Gimmi，E.R.，et al.，Nucleic Acids Res.17：6983-6998(1989))、源自SV40的聚腺苷酸化序列(Schek，N，et al.，Mol.Cell Biol.12：5386-5393(1992))、HIV-l polyA(Klasens，B.I.F.，et al.，核酸s Res.26：1870-1876(1998))、b-globin polyA(Gil，A.，etal，Cell 49：399-406(1987))、HSV TK polyA(Cole，C.N.and T.P.Stacy，Mol.Cell.5Biol.5：2104-2113(1985))或多瘤病毒(polyoma)polyA(Batt，D.BandG.G.Carmichael，Mol.Cell.Biol.15：4783-4790(1995))，但并不局限于此。
6.3.3.I.非病毒性载体
在一具体例中，可表达人类胰岛素样生长因子1异构体的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体和/或可表达人类肝细胞生长因子异构体的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体为可表达胰岛素样生长因子1异构体或一个以上的肝细胞生长因子异构体的非病毒性载体。
在一具体例中，上述非病毒性载体为质粒。在优选具体例中，上述质粒为pCK、pCP、pVAXl、pTx或pCY。尤其，在优选具体例中，上述质粒为pCK，其详细内容揭示在WO 2000/040737及Lee et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.272：230-235(2000)，其全部内容通过引用结合在本申请中。根据《布达佩斯条约》，用pCK(ToplO-pCK)转化的大肠杆菌(E.coli)于2003年3月21日保藏在韩国微生物中心(KCCM)(保藏号为KCCM-10476)。根据《布达佩斯条约》，用pCK-VEGF165(即，具有VEGF编码序列的pCK载体–Top10-pCK/VEGF165')转化的大肠杆菌(E.coli)于1999年12月27日保藏在韩国微生物中心(KCCM)(保藏号为KCCM-10179)。
如Lee et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.272：230(2000)；及WO 2000/040737所示，上述pCK载体在人类巨细胞病毒(HCMV)的增强子/启动子下调节基因，例如，胰岛素样生长因子1基因或肝细胞生长因子基因的表达，其全部内容通过引用结合在本申请中。pCK载体用于人体临床试验，其安全性和有效性得到确认(Henry et al.，GeneTher.18：788(2011))。
在优选具体例中，上述pCK质粒包含对于I类，Ec胰岛素样生长因子1异构体和/或I类，Ea胰岛素样生长因子1异构体的编码序列。尤其，在优选具体例中，上述pCK质粒包含IGF-1X6(即，pCK-IGF-1X6)或IGF-1X10(即，pCK-IGF-1X10)。
在优选具体例中，上述pCK质粒包含对于flHGF和/或dHGF异构体的编码序列。尤其，在优选具体例中，上述pCK质粒包含HGF-X7(即，pCK-HGF-X7或VM202)。
在另一优选具体例中，上述质粒为作为源自pCK的质粒载体的pTx(序列38)。pTx是通过pCK的两次连续突变生成。执行第一缺陷突变诱发，以去除pCK的卡那霉素抗性基因及与ColE1之间不必要的序列。具体地，缺陷突变诱发PCR使用第一引物对(序列34及35)来执行。卡那霉素抗性及ColE1之间的228个碱基对通过对上述质粒进行测序来证实。接着，使用第二引物对(序列36及37)来执行上述第二缺陷突变诱发PCR，以将HCMV内含子序列的大小最优化。删除IE1外显子1及外显子2之间的HCMV内含子序列(421个碱基对)，并通过测序确认缺失。
在特定具体例中，上述pTx质粒包含IGF-1X6(即，pTx-IGF-1X6)或IGF-1X10(即，pTx-IGF-1X10)。例如，用ClaI酶在5’中切割以及用Sal1酶在3’中切割的pTx连接IGF-1X10来生成pTx-1X10(序列39)。
6.3.3.2.病毒性载体
在另一具体例中，本发明所属技术领域中的多种病毒性载体可用于传递并表达本发明的一个以上的胰岛素样生长因子1异构体或一个以上的肝细胞生长因子异构体。例如，将使用逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒来开发的载体用于本案发明的特定具体例。
(a)逆转录病毒
可传递相对较大的外源基因的逆转录病毒已被用作病毒性基因传递载体，因为它们将其基因组整合到宿主基因组中并具有广泛的宿主范围。
本发明的多核苷酸(例如，一个以上的胰岛素样生长因子1异构体的编码序列)为了生成逆转录病毒性载体而向特定病毒性序列的位点插入病毒性基因组来生成复制缺陷病毒。为了生成病毒颗粒(virion)，构建了虽然包含gag、pol及env基因，但并不包含LTR(长末端重复)及W成分的包装(packaging)细胞株(Mann et al.，Cell，33：153-159(1983))。当向上述细胞株导入包含本发明的多核苷酸、长末端重复及W的重组质粒时，上述W序列将上述重组质粒的个核糖核酸转录组包装成病毒颗粒之后，向培养基分泌(Nicolas andRubinstein“Retroviral vectors,”In：Vectors：A survey of molecular cloningvectors and their uses，Rodriguez and Denhardt(eds.)，Stoneham：Butterworth，494-513(1988))。收集包含上述重组的逆转录病毒的培养基之后，并选择性地浓缩并用于基因传递。
已经报道了使用第二代病毒性载体的成功的基因传递。Kasahara等(Science，266：1373-1376(1994))构建了莫洛尼(moloney)小鼠白血病(moloney murine leukemia)病毒的变异体，其中，向包膜(envelope)位点插入了EPO(促红细胞生成素)序列，结果，生成具有新的结合特性的嵌合蛋白。类似地，可以根据对于第二代逆转录病毒性载体的构建策略来构建本基因传递系统。
(b)慢病毒
慢病毒可用于本发明的一具体例。慢病毒是逆转录病毒的子类。但是，慢病毒不会分裂，而是可以整合到细胞的基因组中，而逆转录病毒只能被分裂细胞感染。
慢病毒性载体从通过几种质粒转化的包装细胞株生成，通常从HEK293生成。上述质粒包含(1)加密如壳体及逆转录酶的病毒颗粒蛋白质的包装质粒以及(2)含有外源基因的质粒(例如，一个以上的胰岛素样生长因子1异构体或一个以上的肝细胞生长因子异构体的编码序列)。
若病毒向细胞投入，则核糖核酸形态的病毒基因组逆转录来生成脱氧核糖核酸，之后，通过病毒整合酶向基因组内插入。因此，向上述病毒性载体传递的外源脱氧核糖核酸可留在基因组内，当细胞分裂时向细胞的后代传递。
(c)腺病毒
腺病毒因其中等大小的基因组、易于操作、高滴度、广泛的靶细胞范围及高的感染性而被普遍用作基因传递系统。上述病毒基因组的两末端包含100bp至200bp的ITRs(逆末端重复)，它们是用于病毒脱氧核糖核酸复制及包装而需要的cis-要素。El位点加密用于调节(ElA及ElB)病毒性基因组及几种细胞性基因的转录调节的蛋白质。E2位点(E2A及E2B)的表达导致用于病毒性脱氧核糖核酸复制的蛋白质的合成。
在迄今为止开发的腺病毒型载体中，通常使用E1位点缺失的复制缺陷型腺病毒。在病毒性载体内的缺失的E3位点可提供用于转基因(transgene)的插入位点(Thimmappaya，B.et al.，Cell，31：543-551(1982)；及Riordan，J.R.et al.，Science，245：1066-1073(1989))。因此，优选地，核心蛋白聚糖，即，加密核苷酸序列序列向上述缺失的E1区(E1A区和/或E1B5区，优选地，E1B区)或缺失的E3区插入。本发明的多核苷酸可向缺失的E4区域插入。术语“缺失(deletion)”还包括与病毒基因组序列有关的全部和部分缺失。在自然界中，腺病毒可以包装约105％的野生型基因组，并提供对于约2kb的脱氧核糖核酸的额外容量(extra capacity)(Ghosh-Choudhury et al.，EMBO J.6：1733-1739(1987))。与此相关地，向腺病毒插入的上述说明的外源序列可以向腺病毒野生型基因组追加插入。
上述腺病毒可以是任何已知的血清型或A至F亚型。C亚型的5型腺病毒是用于制备本发明中构建腺病毒基因传递系统的最优选的起始物质。关于5型腺病毒的许多生化和遗传信息已公知。通过腺病毒型基因传递系统传递的外源基因对宿主细胞是游离型(episomal)及遗传毒性。因此，使用腺病毒基因传递系统的基因治疗实相当安全。
(d)腺相关病毒(AAV)
腺相关病毒可感染非分裂细胞及各种类型的细胞，因此，可用于构建本发明的基因传递系统。对于腺相关病毒载体的使用和制备的详细说明揭示在美国专利号10,308,958；10,301,650；10,301,648；10,266,846；10,265,417；10,208,107；10,167,454；10,155,931；10,149,873；10,144,770；10,138,295；10,137,176；10,113,182；10,041,090；9,890,365；9,790,472；9,770,011；9,738,688；9,737,618；9,719,106；9,677,089；9,617,561；9,597,363；9,593,346；9,587,250；9,567,607；9,493,788；9,382,551；9,359,618；9,217,159；9,206,238；9,163,260；9,133,483；8,962,332，其全部内容通过引用结合在本申请中，揭示在美国专利号5,139,941及4,797,368，其全部内容通过引用结合在本申请中。
通过基因传递系统研究腺相关病毒的结果揭示在LaFace et al.，Viology，162：483486(1988)，Zhou et al.，Exp.Hematol.(NY)，21：928-933(1993)，Walsh et al.，J.Clin.Invest.，94：1440-1448(1994)and Flotte et al.，Gene Therapy，2：29-37(1995)。通常，重组腺相关病毒通过同时感染包含侧面附着有两个腺相关病毒末端重复体(terminal repeat)(McLaughlin et al.，1988；Samulski et al.，1989)的目标基因(即，传递的目标核苷酸序列，例如，胰岛素样生长因子1异构体的编码序列)的质粒及包含没有末端重复体的的野生型腺相关病毒编码序列的表达质粒(McCarty et al.，J.Viral.，65：2936-2945(1991))来制备。
(e)其他病毒性载体
其他病毒性载体可以作为本发明的基因传递系统使用。从如牛痘病毒(PuhlmannM.et al.，Human Gene Therapy 10：649-657(1999)；Ridgeway，“Mammalian expressionvectors,”In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors and theiruses.Rodriguez and Denhardt，eds.Stoneham：Butterworth，467-492(1988)；Baichwaland Sugden，“Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses：Transient and stable expression of transferred genes,”In：Kucherlapati R，ed.gene transfer.New York：Plenum Press，117-148(1986)and Coupar et al.，Gene，68：1-10(1988))、慢病毒(Wang G.et al.，J.Clin.Invest.104(11)：RS 5-62(1999))及单纯疱疹病毒(Chamber R.，et al.，Proc.Natl.10 15Acad.Sci USA 92：1411-1415(1995))的病毒获取的载体可用于向细胞传递本发明的多核苷酸的传递系统。
6.3.4.给药方法
可使用多种方法来给药上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体。
6.3.4.1.1.注射
在一具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体通过注射液体药学组合物来给药。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过一次注射同时给药。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过多重注射同时给药。在一具体例中，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过多次注射个别给药。
在优选具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体通过肌肉注射给药。通常，上述脱氧核糖核酸构建体通过与神经损伤位点、疼痛部位或患者识别的疼痛部位或与神经病变有关的其他症状的部位接近的肌肉注射给药。在一具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体向上述对象体的手、脚、腿、胳膊的肌肉给药。
在一具体例中，上述构建体向皮下或皮肤注射。在一具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体通过血管内传递给药。在特定具体例中，上述构建体通过逆行静脉注射给药。
6.3.4.1.2.电穿孔法
在特定情况下，向质粒脱氧核糖核酸的细胞的转化效率可以在注射后通过电穿孔法提高。因此，在一具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体在注射后通过电穿孔来给药。在特定具体例中，使用TriGridTM传递系统(Ichor Medical Systems，Inc.，San Diego，USA)来进行电穿孔。
6.3.4.1.3.超声波穿孔法
在一具体例中，使用超声波穿孔法来提高本发明脱氧核糖核酸构建体的转化效率。超声波穿孔法使用超声波暂时渗透细胞膜，以允许细胞吸收脱氧核糖核酸。可以将脱氧核糖核酸构建体整合到微泡中，并通过全身循环给药之后，可向外部施加超声波。上述超声波在靶组织内诱导上述微泡的气蚀现象来导致构建体的释放及转染。
6.3.4.1.4.磁转染(Magnetofection)
在一具体例中，使用磁转染来提高本发明的脱氧核糖核酸构建体的转化效率。上述构建体与磁性粒子相结合之后给药。若适用高梯度的外部磁场，则捕获上述复合体并固定在靶上。上述脱氧核糖核酸构建体可通过交联分子的酶切、电荷相互作用或上述底物的降解来释放。
6.3.4.1.5.脂质体
在一具体例中，本发明的脱氧核糖核酸构建体可通过脂质体传递。当磷脂悬浮在过量的水溶性介质中时，脂质体会自发形成。如Dos Santos Rodrigues et al.，Int.J.Pharm.566：717-730(2019)；Rasoulianboroujeni et al.，Mater Sci Eng C MaterBiol Appl.75：191-197(2017)；Xiong et al.，Pharmazie 66(3)：l58-l64(2011)；Nicolauand Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190(1982)and Nicolau et al.，MethodsEnzymol.，149：157-176(1987)所示，脂质体介质脱氧核糖核酸成功传递。使用脂质体来转染动物细胞的可商购获得的试药的例包括脂质转染胺(Lipofectamine(Gibco BRL))。捕获本发明的脱氧核糖核酸构建体的脂质体通过如内吞、吸附和融合的机制与细胞相互作用之后，向细胞传递上述序列。
6.3.4.1.6.转染法
当使用病毒性载体来传递胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体或肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体时，可通过本发明所属技术领域的多种病毒性感染方法传递上述构建体。使用病毒性载体的宿主细胞的感染在本发明所属技术领域中已公知。
本发明的药学组合物可以非口服给药。在非口服给药的情况下，可使用静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射或局部注射等。例如，上述药学组合物可通过逆行静脉注射给药。
优选地，本发明的药学组合物可以肌肉给药。在一具体例中，针对受到神经病变(例如，神经性疼痛或其他症状)的影响的肌肉给药。
6.3.5.给药量
上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体按治疗有效量给药。在本说明书中说明的方法中，脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量或给药量为可以自身、与脱氧核糖核酸构建体组合或与其他治疗剂组合来有效治疗上述对象体的神经病变的给药量。
在一具体例中，在本说明书中说明的方法可将上述脱氧核糖核酸构建体(胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体)按1μg至200mg、lmg至200mg、lmg至l00mg、lmg至50mg、lmg至20mg、2mg至l0mg、16mg、8mg、4mg或2mg的总给药量给药。
在一具体例中，向对象体给药的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的总给药量及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的总给药量相同。在特定具体例中，胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的总给药量及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的总给药量不同。在一具体例中，胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的总给药量根据肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的总给药量调节。在一具体例中，肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的总给药量根据胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的总给药量调节。
在一具体例中，各个脱氧核糖核酸构建体的总给药量分成多重的个别注射量。在一具体例中，上述总给药量按相同的注射量分成多个。在一具体例中，上述总给药量分成不均等注射量。
在多种划分的给药量中，各个脱氧核糖核酸构建体的总给药量向4、8、16、24、32或64个不同注射位点给药。
在一具体例中，每次各个注射的脱氧核糖核酸构建体的注射量为0.1mg及20mg之间、1mg及10mg之间、2mg及8mg之间或3mg及8mg之间。在特定具体例中，每次注射的各个脱氧核糖核酸构建体的给药量为0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、1mg、2mg、4mg、8mg、16mg或32mg。
在一具体例中，胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体同时给药。在此情况下，组合的两个脱氧核糖核酸构建体的给药量如下，即，每次注射0.1mg及20mg、1mg及10mg、2mg及8mg或3mg及8mg之间。在特定具体例中，组合的两个脱氧核糖核酸构建体的给药量如下，即，每次注射0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、1mg、2mg、4mg、8mg、16mg或32mg。
各个脱氧核糖核酸构建体或组合的脱氧核糖核酸构建体的总给药量可通过一次或两次以上的访问给药。
在通常的划分给药量的具体例中，多个注射量均可以在1小时内给药。在一具体例中，多个注射量均可以在1.5、2、2.5或3小时内给药。
在上述方法的多种具体例中，各个脱氧核糖核酸构建体的总给药量或组合的两个脱氧核糖核酸构建体的总给药量即便分为单一一元化的投入量或多个注射量，也仅向上述对象体一次性给药。
在一具体例中，各个脱氧核糖核酸构建体或组合的脱氧核糖核酸构建体的总给药量经过一次、两次、三次或四次的访问向多个注入部位注入为单一周期。例如，将64mg、32mg、16mg、8mg、4mg或2mg的各个脱氧核糖核酸构建体经过两次的访问向多个注射部位给药为单一周期。上述两次访问可以为3、5、7、14、21或28日的间隔。
在一具体例中，通过一次、两次、三次或四次的访问，将胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体向注射部位给药为单一周期。例如，经过两次的访问，将64mg、32mg、16mg、8mg、4mg或2mg的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体向多个注射部位给药以及将64mg、32mg、16mg、8mg、4mg或2mg的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体向多个注射部位给药为单一周期。上述两次的访问可以为3、5、7、14、21或28日的间隔。
在一具体例中，上述周期可以重复。上述周期可以为两次、三次、四次、五次、六次及其以上。
在一具体例中，上述周期可以在之前的周期后重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或12个月以上。
在一具体例中，在之后的周期中的纵给药量与之前周期的总给药量相同。在一具体例中，在之后周期中的总给药量与之前周期的总给药量不同。
在优选具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体(胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体或肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体)在每个患病的四肢按8mg的给药量，通过均等分割的多个肌肉注射及多次访问给药，其中，任意的单一访问中的上述多次注射在额外的注射部位中执行。在特定具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体(胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体或肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体)在每个患病的四肢按8mg的给药量，在当日(第0日)向各个四肢按4mg的第一给药量给药，在第十四日，向各个四肢，按4mg的第二给药量给药，其中，第一及第二给药量均等地分割成多个注射量。
在一具体例中，胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体可以同时或个别地，按受到影响的各个四肢(per affectedlimb)16mg的总给药量均等地分割成多个肌肉注射或多次访问来给药，在任意的单一访问中的多次注射在个别注射部位中执行。在一具体例中，胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体向患病的各个四肢，按8mg的给药量给药以及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体向患病的各个四肢，按8mg的给药量给药构成一个周期。上述周期可以重复一次、两次、三次以上。
实际给药量、给药速度及给药时间可根据治疗的神经病变的特性及重症程度改变。在一具体例中，一个以上的脱氧核糖核酸构建体按减少神经病变，例如，神经性疼痛的症状的有效量给药。在一具体例中，上述量在给药1周以内有效地减少神经病变的症状。在一具体例中，上述量在给药2周、3周或4周以内有效地减少神经病变的症状。
在一具体例中，同时给药两种不同类型的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体或两种不同类型的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体。在一具体例中，传递双重表达构建体来诱导两种胰岛素样生长因子1的异构体或肝细胞生长因子的表达。
根据本发明所属技术领域现有技术，如上所述，上述药物组合物可以与药学上可接受的载体和/或赋型剂一同被剂型化，最后，提供多种形态、单位给药剂型及多重给药剂型。上述剂型的非限定性例包括溶液、油或水溶性介质中的悬浮液或乳剂、提取物、酏剂、粉末、颗粒，片剂及胶囊剂，但并不局限于此，还可包括分散制剂或稳定剂。
使用生物体内和/或试验管内分析法来帮助确认最优给药方法。用于上述剂型的精密的给药量也根据给药路径及状态的严重性以及根据专家的判断及对象体的状态确定。有效量可以从在试验管内或动物模型试验系统中获取的给药量-反应曲线中，通过外推法推定。
上述脱氧核糖核酸构建体可以单独或与其他治疗剂组合来同时或依次给药。
6.3.6.神经病变患者
在本说明书中说明的方法中，为了治疗而选择的患者患有神经病变。上述患者可患有末梢神经病变、颅神经病变、自主分泌神经病变或局部神经病变。上述神经病变有可能因疾病、受伤、感染或维生素缺乏状态引起。例如，神经病变有可能因糖尿病、维生素缺乏症、自身免疫性疾病、遗传或遗传性疾病、淀粉样变性、尿毒症、毒素或毒药、外伤或受伤、肿瘤引起，也可以为特发性疾病。在一具体例中，上述患者患有糖尿病性末梢神经疾病。
上述患者可能患有如疼痛(神经性疼痛)、其他感觉缺陷(例如，感觉丧失、麻木、刺痛等)、运动缺陷(例如，虚弱、反射丧失、肌肉质量丧失、抽搐、灵活性下降等)以及自主神经功能障碍(例如，恶心、呕吐、阳痿、头晕、便秘、腹泻等)等的与神经疾病有关的一个以上的症状。
除本文提供的治疗方法外，患者还可通过本发明所属技术领域公知的一个以上的治疗方法进行治疗。
本发明的治疗方法可用于治疗患有神经疾病的人类患者或动物。
6.3.7.给药顺序
在本说明书中说明的方法包括给药可以表达人类胰岛素样生长因子1异构体的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤以及给药可以表达人类肝细胞生长因子异构体的第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤。上述治疗有效量为组合或个别治疗上述疾病的有效的量。
给药第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤可以同时或依次执行。在一具体例中，第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的给药及第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的给药个别执行，至少按数分钟间隔、数小时间隔、一天间隔、两天间隔、三天间隔、一周间隔、两周间隔、三周间隔、一个月间隔、两个月间隔、三个月间隔或六个月间隔执行。在一具体例中，给药第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤在给药第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤之前执行。在一具体例中，给药第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤在给药第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤之前执行。
在一具体例中，给药第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体、给药第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤或它们均重复。在一具体例中，上述步骤重复两次或三次以上。
上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体可以为在本说明书中提供的上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体或其的变形物中的一种。这可以表达一个以上的胰岛素样生长因子1异构体。这可以为加密一个胰岛素样生长因子1异构体，I类，Ec(序列16)；II类，Ea(序列18)；I类，Eb(序列20)；或I类，Ea异构体(序列14)的脱氧核糖核酸构建体。这可以为加密两个胰岛素样生长因子1异构体的双重表达脱氧核糖核酸构建体。在一具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体可以加密I类，Ec(序列16)及I类，Ea异构体s(序列14)。
上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体可以为在本说明书中提供的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体或其变形物中的一种。这可以表达一个以上肝细胞生长因子异构体。这可以为加密一个肝细胞生长因子异构体、flHGF(序列11)或dHGF(序列12)的脱氧核糖核酸构建体。这可以为加密两个肝细胞生长因子异构体的双重表达脱氧核糖核酸构建体。在优选具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体可包含序列13的多核苷酸。这可以为VM202。
上述方法还可包括给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体可以与上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体相同或不同。上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体可以为在本说明书中提供的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体或其的变形物中的一种。给药第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤可以同时或依次执行。在特定具体例中，同时给药可表达I类，Ec(序列16)的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及可表达I类，Ea异构体(序列14)的第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体。在一具体例中，第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的给药及第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的给药可以个别或至少按数分钟间隔、数小时间隔、一天间隔、两天间隔、三天间隔、一周间隔、两周间隔、三周间隔、一个月间隔、两个月间隔、三个月间隔或六个月间隔执行。
上述方法还可包括给药第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。上述第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体可以与上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体相同或不同。上述第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体可以为在本说明书中提供的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体或其的变形物中的一种。给药第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤可以同时或依次执行。例如，可表达flHGF(序列11)的第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体及可表达dHGF(序列12)的第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体可以同时给药。在一具体例中，第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的给药及第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的给药可以个别或者按至少数分钟间隔、数小时间隔、一天间隔、两天间隔、三天间隔、一周间隔、两周间隔、三周间隔、一个月间隔、两个月间隔、三个月间隔或六个月间隔执行。
在一具体例中，上述方法包括将VM202与pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10同时给药的步骤。在一具体例中，上述方法包括同时给药其他肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(例如，包含序列33的多核苷酸的构建体)及IGF-1X6或pCK-IGF-1X10的步骤。
在一具体例中，上述方法包括将VM202与pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10同时给药的步骤。在一具体例中，上述方法同时给药其他肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(例如，包含序列33的多核苷酸的构建体)及pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10的步骤。
在一具体例中，上述方法包括在给药VM202之后，给药pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10的步骤。在一具体例中，上述方法包括给药其他肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(例如，作为包含序列33的多核苷酸的构建体的pCK-HGF728)之后，给药pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10的步骤。在一具体例中，上述方法包括给药pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10之后，给药VM202或其他肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(例如，pCK-HGF728)的步骤。
在一具体例中，上述方法包括给药VM202之后，给药pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10的步骤。在一具体例中，上述方法包括给药其他肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(例如，作为包含序列33的多核苷酸的构建体的pCK-HGF728)之后，给药pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10的步骤。在一具体例中，上述方法包括给药pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10之后，给药VM202或其他肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(例如，pCK-HGF728)的步骤。
6.4.包含胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-1加密脱氧核糖核酸构建体的药学组合物
在另一实施方式中，提供包含胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的药学组合物。
6.4.1.药学组合物及注射用单位给药剂型
为了用作静脉注射、肌肉注射、皮肤注射或皮下注射用，上述脱氧核糖核酸构建体可以为具有非口服可接受、没有发热因子、适当的pH、等渗性及稳定性的使溶液形态。本发明所属技术领域的普通技术人员可以使用如氯化钠注射液、林格液、乳酸林格注射液的等渗赋型剂来制备适当的溶液。当需要时可以使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
在一具体例中，上述药学组合物包含加密一个胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体。例如，上述脱氧核糖核酸构建体可以表达I类，Ec异构体(异构体#1)；II类，Ea异构体(异构体#2)；I类，Eb异构体(异构体#3)；或I类，Ea异构体(异构体#4)。上述脱氧核糖核酸构建体可以为pCK-IGF-1#l、pCK-IGF-1#2、pCK-IGF-1#3或pCK-IGF-1#4。在一具体例中，上述脱氧核糖核酸构建体可以为pTx-IGF-1#l、pTx-IGF-1#2、pTx-IGF-1#3或pTx-IGF-1#4。
在一具体例中，上述药学组合物包含分别加密胰岛素样生长因子1异构体的一个以上的脱氧核糖核酸构建体。例如，上述药学组合物可包含(i)加密I类，Ec异构体(异构体#1)的第一脱氧核糖核酸构建体及加密II类，Ea异构体(异构体#2)的第二脱氧核糖核酸构建体；(ii)加密I类，Ec异构体(异构体#1)的第一脱氧核糖核酸构建体及加密I类，Eb异构体(异构体#3)的第二脱氧核糖核酸构建体；(iii)加密I类，Ec异构体(异构体#1)的第一脱氧核糖核酸构建体及加密I类，Ea异构体(异构体#4)的第二脱氧核糖核酸构建体；(iv)加密II类，Ea异构体(异构体#2)的第一脱氧核糖核酸构建体及加密I类，Eb异构体(异构体#3)的第二脱氧核糖核酸构建体；(v)加密II类，Ea异构体(异构体#2)的第一脱氧核糖核酸构建体及加密I类，Ea异构体(异构体#4)的第二脱氧核糖核酸构建体；(vi)加密I类，Eb异构体(异构体#3)的第一脱氧核糖核酸构建体及加密I类，Ea异构体(异构体#4)的第二脱氧核糖核酸构建体。
在一具体例中，上述药学组合物包含可以作为表达一个以上的胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的双重表达构建体。例如，上述药学组合物包含可以表达(i)I类，Ec异构体(异构体#1)及II类，Ea异构体(异构体#2)；(ii)I类，Ec异构体(异构体#1)及I类，Eb异构体(异构体#3)；(iii)I类，Ec异构体(异构体#1)及I类，Ea异构体(异构体#4)；(iv)II类，Ea异构体(异构体#2)及I类，Eb异构体(异构体#3)；(v)II类，Ea异构体(异构体#2)及I类，Ea异构体(异构体#4)；(vi)I类，Eb异构体(异构体#3)及I类，Ea异构体(异构体#4)的双重表达构建体。
在一具体例中，上述药学组合物包含作为双重表达构建体的pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10。在一具体例中，上述药学组合物包含作为双重表达构建体的pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10。在一具体例中，例如，上述药学组合物包含均具有pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10的两个双重表达构建体。在一具体例中，例如，上述药学组合物包含均具有pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10的两个双重表达构建体。
在一具体例中，上述药学组合物还包含加密一个肝细胞生长因子异构体的脱氧核糖核酸构建体。例如，上述脱氧核糖核酸构建体可以表达flHGF或dHGF。在一具体例中，上述药学组合物分别包含分别加密一个肝细胞生长因子异构体的一个以上的脱氧核糖核酸构建体。例如，上述药学组合物可包含加密flHGF的第一脱氧核糖核酸构建体及加密dHGF的第二脱氧核糖核酸构建体。
在一具体例中，上述药学组合物包含作为可以表达一个以上的肝细胞生长因子异构体的脱氧核糖核酸构建体的双重表达构建体。例如，上述药学组合物可以包含能够均表达flHGF及dHGF的双重表达构建体。
在优选具体例中，上述药学组合物包含作为双重表达构建体的pCK-HGF-X7(VM202)。在一具体例中，上述药学组合物包含分别加密flHGF或dHGF的两个肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体。在一具体例中，上述药学组合物包含可表达flHGF(pCK-HGF728)的一个肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体。
在一具体例中，上述药学组合物还包含其他治疗剂。例如，上述药学组合物还可包含有效治疗神经病变的其他治疗剂。
在其他多种具体例中，一个以上的脱氧核糖核酸构建体个别或组合来以0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml浓度的液体组合物存在。在一具体例中，上述单位给药剂型为个别或组合一个以上的脱氧核糖核酸构建体来包含具有0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或lmg/ml的浓度的2ml的上述药学组合物的小瓶。在一具体例中，上述单位给药剂型为个别或组合一个以上的脱氧核糖核酸构建体来包含具有0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或lmg/ml的浓度的1ml的上述药学组合物的小瓶。在一具体例中，上述单位给药剂型为个别或组合一个以上的脱氧核糖核酸构建体来包含具有0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或lmg/ml的浓度的小于1ml的上述药学组合物的小瓶。
在一具体例中，上述单位给药剂型为小瓶、安瓿瓶、瓶或预装注射器。在一具体例中，上述单位给药剂型包含0.01mg、0.1mg、0.2mg、0.25mg、0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、8mg、10mg、12.5mg、16mg、24mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg或200mg的本发明的一个以上的脱氧核糖核酸构建体。
在一具体例中，单位给药剂型内的上述药学组合物为液体形态。在多种具体例中，上述单位给药剂型包含0.1ml至50ml的上述药学组合物。在一具体例中，上述单位给药剂型包含0.25ml、0.5ml、1ml、2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、25ml或50ml的药学组合物。
在特定具体例中，上述单位给药剂型为将上述药学组合物作为单位给药剂型来包含0.5ml、1ml、1.5ml或2ml小瓶。符合皮下、皮肤或肌肉给药的具体例包括预先填充的注射器、自动注射器或自动注射笔，并包含上述上述药学组合物的已设定的量。
在多种具体例中，上述单位给药剂型为包括注射器及上述药学组合物的已设定的量的预先填充的(preloaded)注射器。在特定预先填充的注射器具体例中，上述注射器适用于皮下给药。在特定具体例中，上述注射器适合自我给药。在特定具体例中，上述预先填充的注射器为一次性注射器。
在多种具体例中，上述预先填充的注射器包含约为约为0.1ml至约为0.5ml的上述药学组合物。在特定具体例中，上述注射器包含约为0.5ml的药学组合物。在特定具体例中，上述注射器包含1.0ml的上述药学组合物。在特定具体例中，上述注射器包含约为2.0ml的上述药学组合物。
在特定具体例中，上述单位给药剂型为自动注射笔。如上所述，上述自动注射笔包括包含药学组合物的自动注射笔。在一具体例中，上述自动注射笔传递已设定体积的药学组合物。在另一具体例中，上述自动注射笔传递由使用人员设定的规定体积的药学组合物。
在多种具体例中，上述自动注射笔包含约为0.1ml至约为5.0ml的上述药学组合物。在特定具体例中，上述自动注射笔包含约为0.5ml的上述药学组合物。在特定具体例中，上述自动注射笔包含约为1.0ml的上述药学组合物。在另一具体例中，上述自动注射笔包含约为5.0ml的上述药学组合物。
6.4.2.冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型
在一具体例中，本发明的脱氧核糖核酸构建体被剂型化成冷冻干燥的组合物。在特定具体例中，如美国专利号8,389,492中所记载，脱氧核糖核酸构建体被冷冻干燥，其全部内容通过引用结合在本申请中。
在一具体例中，脱氧核糖核酸构建体使用特定赋型剂，例如，碳水化合物及盐来被剂型化，之后被冷冻干燥。作为诊断或治疗制剂利用的上述脱氧核糖核酸构建体的稳定性在被冷冻干燥之前，使用包含稳定化量的碳水化合物的水溶液来将上述脱氧核糖核酸构建体剂型化，由此可以增加。
上述碳水化合物可以为蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、己糖、偶糖、甘露糖、塔洛糖、庚糖、果糖、葡萄糖酸、山梨糖醇、甘露糖醇、甲基α-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、赤藓糖、核糖、木酮糖、阿胶、塔格糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺、神经氨酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、莱万、褐藻糖胶、角叉菜胶、半乳糖醛糖、果胶、果胶酸、直链淀粉、普鲁兰多糖、糖原、支链淀粉、纤维素、右旋糖酐、环糊精、石耳多糖、壳多糖、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原胶或淀粉的单糖、寡糖或多糖。
在一系列具体例中，上述碳水化合物是甘露醇和蔗糖。
冷冻干燥前的碳水化合物溶液可以与水中的碳水化合物对应或包含缓冲液。这种缓冲液的例包含临时酸盐缓冲盐水(PBS)、HEPES、TRIS或TRIS/EDTA。通常，上述碳水化合物溶液按约为0.05％至约为30％蔗糖，通常，0.1％至约为15％蔗糖，例如，0.2％至约为5％、10％或15％蔗糖，优选地，约为0.5％至10％的蔗糖、1％至5％蔗糖、1％至3％蔗糖，最优选地，约为1.1％蔗糖的最终浓度与脱氧核糖核酸构建体相结合。
本发明的脱氧核糖核酸剂型还包含盐，例如，NaCl或KCl。在一具体例中，上述盐为NaCl。在一具体例中，脱氧核糖核酸剂型的盐可以为选自由约为0.001％至约为10％、约为0.1％至5％、约为0.1％至4％、约为0.5％至2％、约为0.8％至1.5％、约为0.8％至1.2％w/v组成的组中的量。在特定具体例中，脱氧核糖核酸剂型的盐约为0.9％w/v。
从冷冻干燥的剂型重组的液体组合物内的一个以上的脱氧核糖核酸构建体的最终浓度可以为约为1ng/mL至约为30mg/mL。例如，上述最终浓度可以个别或组合成约为1ng/mL、约为5ng/mL、约为10ng/mL、约为50ng/mL、约为100ng/mL、约为200ng/mL、约为500ng/mL、约为1μg/mL、约为5μg/mL、约为10μg/mL、约为50μg/mL、约为100μg/mL、约为200μg/mL、约为400μg/mL、约为500μg/mL、约为600μg/mL、约为800μg/mL、约为1mg/mL、约为2mg/mL、约为2.5mg/mL、约为3mg/mL、约为3.5mg/mL、约为4mg/mL、约为4.5mg/mL、约为5mg/mL、约为5.5mg/mL、约为6mg/mL、约为7mg/mL、约为8mg/mL、约为9mg/mL、约为10mg/mL、约为20mg/mL或约为30mg/mL。本发明的在特定具体例中，一个以上的脱氧核糖核酸构建体的最终浓度个别或组合成约为100μg/mL至约为2.5mg/mL。本发明的在特定具体例中，一个以上的脱氧核糖核酸构建体的最终浓度个别或组合成约为0.5mg/mL至1mg/mL。
本发明的脱氧核糖核酸剂型在本发明所属技术领域的标准条件下冷冻干燥。冷冻干燥本发明的脱氧核糖核酸剂型的方法包括：步骤(a)，在容器(例如，小瓶)放入脱氧核糖核酸剂型(例如，包含本发明的一个以上的脱氧核糖核酸构建体的脱氧核糖核酸剂型)、盐及碳水化合物并放入冷冻干燥器，上述冷冻干燥器具有约为5℃至约为-50℃的起始温度；步骤(b)，将上述脱氧核糖核酸剂型冷却至0度以下的温度(例如，-10℃至-50℃)；以及步骤(c)，实质上干燥上述脱氧核糖核酸剂型。对于本发明的脱氧核糖核酸剂型的冷冻干燥的条件，例如，温度及期限可以由本发明所属技术领域的普通技术人员考虑冷冻干燥变量，例如，所使用的冷冻干燥机械的类型、所使用的脱氧核糖核酸的量及所使用的容器的大小来调节。
之后，在密封维持上述冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型的上述容器的多种温度(例如，室温至约为-180℃，优选地，约为2℃-8℃至约为-80℃，更优选地，约为-20℃至约为-80℃，最优选地，约为-20℃)的条件下保存规定时间。在特定观点下，优选地，上述冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型在约为2℃-8℃至约为-80℃的范围内，在至少6个月内没有活性损失的稳定。稳定保存的质粒脱氧核糖核酸剂型也与如研究或基于质粒的疗法的使用前以长期稳定形态保存质粒脱氧核糖核酸相应。保存时间可以为数个月、1年、5年、10年、15年或20年。优选地，上述制备物至少稳定约3年。
6.5.并用疗法用试剂盒
在另一实施方式中，本发明提供使用胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的并用疗法用试剂盒。
上述试剂盒可包含具有胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的第一药学组合物及包含肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的第二药学组合物。在一具体例中，上述第一药学组合物及上述第二药学组合物为包含在单一容器的相同药学组合物。在一具体例中，上述第一药学组合物及上述第二药学组合物为包含在两个以上的个别容器的额外的药学组合物。
上述第一药学组合物可包含本说明书中所提供的上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体中的一种。例如，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体可以为能够表达一个胰岛素样生长因子1异构体的单一表达脱氧核糖核酸构建体或表达两个胰岛素样生长因子1异构体的双重表达脱氧核糖核酸构建体。上述第二药学组合物可包含本说明书中所提供的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体中的一种。例如，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体可以为能够表达一个肝细胞生长因子异构体的单一表达脱氧核糖核酸构建体或表达两个肝细胞生长因子异构体的双重表达脱氧核糖核酸构建体。
上述试剂盒可包含胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体、肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体或两种的一个以上的单位给药量。
上述试剂盒还可包括给药上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体、肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体或两种的方法的指南。上述方法为本说明书中所提供的给药方法中的一种。
6.6.实施例
向本发明所属技术领域的普通技术人员提供对于在以下的实施例中揭示来形成本发明并使用的方法的完整的揭示及说明，而并非是限定本发明人员认为是自己的发明的范围、以下执行的实验并非为所有或唯一的实验。与所使用的数字(例如，量、温度等)相关地，努力保障了准确性，但还需要考虑一部分实验性错误及偏差。只要并未明确表示，部分为重量份(parts by weight)，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。标准缩略语可以如下，例如，bp，碱基对(s)、kb，千基(s)；pl，皮升(s)；s或sec，秒钟(s)；min，分钟(s)；h或hr，小时(s)；aa，氨基酸(s)；nt，核苷酸(s)等。
只要并未明确示出，本发明的执行可使用蛋白质化学、生物化学、重组脱氧核糖核酸技术及药学的通常技术。
6.6.1.实施例1：在小鼠慢性压迫性神经损伤神经病变模型中，胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的并用给药的治疗功效
在作为研究神经病变的广泛应用的模型的小鼠的慢性压迫性神经损伤模型(CCI)中试验了胰岛素样生长因子1-加密构建体及肝细胞生长因子-加密构建体的并用给药的治疗效果。慢性压迫性神经损伤小鼠模型因已知的导致对末梢神经带来慢性神经损伤的多个过程的坐骨神经的慢性压迫性神经损伤生成。慢性压迫性神经损伤小鼠也患有神经性疼痛。
详细地，购入出生后4周雄性ICR小鼠(体重24g至26g)并构建慢性压迫性神经损伤并用于试验上述效果。所有手术及试验过程受到了首尔大学动物保护与使用委员会的批准。为了在小鼠中执行慢性压迫性神经损伤，按约为l-cm长度进行钝切口(bluntdissection)来使存在于臀肌及股二头肌之间的右侧坐骨神经露出。若与一端三叉部位相邻的坐骨神经露出，则利用6-0丝线(Ethicon)缝合线来以0.5mm的间隔给其3个松散的结扎线(ligature)。当右后肢明显抽搐时，稍微收紧上述结扎线。假手术(sham-operated)小鼠在右大腿处接受了相同的切口，但未结扎坐骨神经。
在慢性压迫性神经损伤当日，将总200μg的脱氧核糖核酸构建体肌肉注射，通过冯弗雷的细丝测试(Von Frey’s filament)测定对机械刺激的疼痛灵敏性。向各个组注射的脱氧核糖核酸构建体的类型和量整理在以下表1中。
Figure BDA0002900127010000311
各个组由6个小鼠构成，执行2次以上的独立实验(平均±SEM；*，p＜0.05；**，p＜0.0l；***，p＜0.00l)。
在表1中，pCK-IGF-1#1、pCK-IGF-1#2、pCK-IGF-1#3及pCK-IGF-1#4为加密在pCK载体克隆的个别人类胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体。上述脱氧核糖核酸构建体使用标准分子克隆技术来在pCK载体中制备。详细地，四个多核苷酸(序列15、17、19及21)通过由Bioneer(韩国)提供的定制脱氧核糖核酸合成工序获得。上述多核苷酸通过5’交联剂、Cla I及3’交联剂、Sal I合成。pCK载体及上述多核苷酸被限定为Cla I及Sal I。向pCK载体的克隆部位插入包含I类，Ec异构体的编码序列及胰岛素样生长因子1基因的外显子1、3/4、5及6的至少一部分的序列17的多核苷酸来生成加密I类，Ec(异构体#1)的IGF-1#1。向pCK载体的克隆部位插入包含II类，Ea异构体的编码序列及胰岛素样生长因子1基因的外显子2、3/4及6的至少一部分的序列19的多核苷酸来生成加密II类，Ea(异构体#2)的IGF-1#2。向pCK载体的克隆部位插入包含I类，Eb异构体的编码序列及胰岛素样生长因子1基因的外显子1、3/4及5的至少一部分的序列21的多核苷酸来生成加密I类，Eb(异构体#3)的IGF-1#3。向pCK载体的克隆部位插入包含I类，Ea异构体的编码序列及胰岛素样生长因子1基因的外显子1、3/4及6的至少一部分的序列15的多核苷酸来生成加密I类，Ea(异构体#4)的IGF-1#4。针对各个质粒，在试验管及生物体内均试验各个胰岛素样生长因子1异构体的表达来确认。
在慢性压迫性神经损伤手术及上述脱氧核糖核酸构建体给药一周后，使用冯弗雷的细丝测试来评价机械性触诱发痛的发作并每周测定疼痛症状来呈现在图2A中。执行冯弗雷的细丝测试来测定小鼠的机械灵敏性。简单地，将动物放在金属网底板的上部的气缸以使动物适应。通过使用恒定厚度的细丝(0.16g)刺激后爪来评价小鼠的机械灵敏性。
图2B为概述在图2A中说明的慢性压迫性神经损伤实验中测定的缩脚频率(％)的图表。图2B的频率(％)为在慢性压迫性神经损伤手术后1周至4周内测定的平均值。上述结果证明与仅注射载体(pCK)相比，单独注射VM202或注射VM202与多种胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的组合显著减少缩脚频率。并且，若将VM202与pCK-IGF-l#l或pCK-IGF-1#4(即，可表达胰岛素样生长因子1异构体#1或胰岛素样生长因子1异构体#4的脱氧核糖核酸构建体)组合注射，则比VM202或VM202与IGF-l#2或IGF-l#3的组合注射显著减少。上述数据揭示当IGF异构体#1(I类，Ec)及IGF异构体#4(I类，Ea)与VM202一同给药时，治疗神经病变尤其有效。
测试了当在图2B提供的数据中最有效的IGF-l#l及IGF-l#4与它们的效果联合给药时是否可以得到提高。详细地，将50μg的IGF-l#1及50μg的IGF-l#4与VM202一同向慢性压迫性神经损伤小鼠给药并将缩脚频率如图3A测定。图3B提供的结果(1周至4周的平均)证明了当VM202与pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4同时注射，则和VM202与pCK-IGF-1#1的组合或VM202与pCK-IGF-1#4的组合相比，缩脚频率更为显著减少。上述数据揭示当IGF异构体#1(I类，Ec)及IGF异构体#4(I类，Ea)的组合与VM202同时给药时，具有更大的治疗功效。
6.6.2.实施例2：在小鼠慢性压迫性神经损伤神经病变中，胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的依次给药的治疗功效
慢性压迫性神经损伤神经病变小鼠如实施例1生成，并将其如表2分成7组。在慢性压迫性神经损伤手术当日，向慢性压迫性神经损伤小鼠肌肉注射总200μg的脱氧核糖核酸构建体(第一次注射)，在3周再次实施注射(第二次注射)。针对各个组，将在第一次注射及在第二次注射中给药的脱氧核糖核酸构建体概述在以下表2中。各个组由6个小鼠构成，执行2次以上的独立实验(平均±SEM；*，p＜0.05；**，p＜0.0l；***，p＜0.00l)。
Figure BDA0002900127010000321
在整个实验中，基于冯弗雷的细丝测试的每周测试测定机械性触诱发痛，由此试验上述注射物的治疗效果。实验过程概述在图4A。简单地，将动物分别放在金属网底板的顶部的气缸以使动物适应。通过使用恒定厚度的细丝(0.16g)刺激后爪来评价小鼠的机械灵敏性。之后，每周重复进行试验。
结果概述在图4B，并示出以每周为基准，在各个组中测定的缩脚频率(％)。在上述结果中，与胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体(即，IGF-1#1及IGF-1#4)的注射或肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(即，VM202)的注射与载体(pCK)相比，缩脚频率显著减少。并且，若在注射肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(即，VM202)之后，注射胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体(即，IGF-1#1及IGF-1#4)(VM202->IGF-异构体)，则缩脚频率进一步减少。基于这种第二次注射的追加减少在向VM202在IGF-1#l及IGF-1#4在VM202的第二次注射之前注射的(胰岛素样生长因子1异构体->VM202)或在VM202在VM202的第二次注射之前注射的(VM202->VM202)组中并未观测到。因此，若在注射VM202之后，注射IGF-1#l及IGF-l#4(VM202->胰岛素样生长因子1异构体)，则缩脚频率最为显著减少。
6.6.3.实施例3：均可表达胰岛素样生长因子1异构体#1(I类Ec)及异构体#4(I类Ea)的脱氧核糖核酸构建体
表达胰岛素样生长因子1I类Ec的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体(IGF-1#1)及加密I类Ea的第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体(IGF-1#4)一同在上述说明的行动实验中具有减少机械性触诱发痛的统计学显著的更大的能力，因此，本发明人员制备了通过核糖核酸转录组的选择性剪接来同时表达胰岛素样生长因子1I类Ec(异构体#1)及I类Ea(异构体#4)两个异构体的几个质粒。尤其，生成胰岛素样生长因子1基因的外显子1、3/4、5及6及内含子的序列或它们的片段的脱氧核糖核酸构建体。构建包括不同的变异的几种脱氧核糖核酸构建体来进行均表达胰岛素样生长因子1I类Ec异构体(异构体#1)及I类Ea异构体(异构体#4)的能力的试验。
各个质粒包含以使pCK以质粒为基础与pCK表达调节序列以可操作的方式连接的插入体。上述插入体使以下物质连接：(1)加密人类胰岛素样生长因子1外显子1、3及4的一多核苷酸(序列1)；(2)作为第二多核苷酸的胰岛素样生长因子1内含子4(序列2)或其的片段物；(3)加密外显子5及6-1的第三多核苷酸(序列3)；(4)作为第四多核苷酸的内含子5(序列4)或其的片段物；以及(5)加密外显子6-2的第五多核苷酸(外显子6-2序列5)，并使上述第一多核苷酸、上述第二多核苷酸、上述第三多核苷酸、上述第四多核苷酸及上述第五多核苷酸从5’向3’方向依次连接来生成。上述质粒的内含子4和/或内含子5的片段大小不同。尤其，序列6提供用于载体pCK-IGF-1X6的内含子4片段的核苷酸序列，序列7提供用于pCK-IGF-1-X10的内含子4片段的核苷酸序列。序列8提供用于pCK-IGF-1X6及pCK-IGFlX10的内含子5片段的核苷酸序列。
为了试验源自多种构建体的异构体#1(I类，Ec)及异构体#4(I类，Ea)的生物体内表达，向9周雄性C57BL/6小鼠，向胫前肌(tibialis anterior)注射了50μg质粒。在注射5日之后获取胫前肌。之后，在蛋白酶抑制剂、去磷酸化抑制剂混合物(Roche DiagnosticLtd.)及PMSF(Sigma)的溶解缓冲液中，使用聚丙烯杵(Bel-Art Scienceware)来将骨骼肌均质化。将样品在12000rpm中，在4℃温度条件下离心分离15分钟并按制造商的方式设定人类胰岛素样生长因子1ELISA(R&D Systems)来分析包含总蛋白质的上层液。所检测的胰岛素样生长因子1水平通过BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo，IL，USA)测定，将从组织获取的蛋白质提取物的总量标准化。实验过程概述在图5A中。
如图5B所示，在小鼠胫前肌的人类胰岛素样生长因子1蛋白质的总表达量通过ELISA确定。与上述小鼠否接受50μg的表达单一异构体(“1”(I类，Ec)或“4”(I类，Ea))的构建体、25μg的表达异构体#1(I类，Ec)的第一构建体以及25μg(“1+4”)的表达异构体#4(I类，Ea)的第二构建体或50μg的表达两侧异构体的构建体pCK-IGF-1X6(“X6”)或pCK-IGF-1X10(“X10”)无关，人类胰岛素样生长因子1蛋白质的总表达量类似。
本发明人员使用RT-PCR来确定上述构建体是否同时表达对于异构体#1及异构体#4的成熟的转录组。RT-PCR反应通过与外显子3/4相结合的正向引物(F)及与外显子6相结合的反向引物(R)来执行。如图6A所示，若进行对于异构体#1(I类，Ec)的转录组的RT-PCR，则生成两个扩增子(amplicon)，即，178bp扩增子及259bp扩增子，相反，若进行对于异构体#4(I类，Ea)的转录组的RT-PCR，则生成129bp的单一扩增子。
为了RT-PCR而收集骨骼肌，使用聚丙烯杵(Bel-Art Scienceware)来机械均质化，并在RNAiso plus(Takara)中提取。核糖核酸定量使用nanodrop设备来执行。使用逆转录酶XL(AMV)(Takara)来在相同量的核糖核酸中合成cDNA，如图6A所示的正向(TGA TCT AAGGAG GCT GGA)(序列40)及反向(CTA CTT GCG TTC TTC AAA TG)(SEQ ID.NO：41)引物来执行PCT。
如图6B所示，pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10表达对于异构体#1(l78bp及259bp条带)及异构体#4(l29bp条带)的成熟的转录酶。除pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10之外，对于异构体#1及异构体#4的成熟的转录组的表达未从其他构建体中检测到，本发明中未提供与此有关的数据。
为了确认上述两个异构体转录组两侧均有效地翻译成蛋白质，如图7A所示，本发明人员将pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10转染在293T细胞。为了免疫印迹，在质粒脱氧核糖核酸转印2日(48小时)之后，收集细胞，使用包含蛋白酶和去磷酸化抑制剂混合物(RocheDiagnostic Ltd.)的RIPA缓冲液将其溶解。相同量的蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离，并转移到蛋白质膜(PVDF)。上述膜在含有BSA(Invitrogen-Gibco)的TBST(20mMTris-HCl，pH7.4，0.9％NaCl及0.1％Tween20)中浸泡1小时，在夜间，被在4℃的温度条件下被浸泡溶液稀释的一抗探针处理。为了试验胰岛素样生长因子1异构体1及异构体4的水平而使用的一抗由Abclon(韩国)提供，对于胰岛素样生长因子1和β-肌动蛋白的一抗购自Abcam(英国)和Sigma-Aldrich(美国)。在通过TBST进行洗涤之后，在室温条件下，膜与HRP偶联的山羊抗小鼠或兔IgG二抗(Sigma)一同培养(incubation)1小时。之后，用TBST洗涤3次印迹，并用增强的化学发光系统(Millipore)观察上述蛋白质条带。β-肌动蛋白被用作上述对照组。
从图7B所示的蛋白质印迹数据确认了pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10均表达蛋白质水平的胰岛素样生长因子1的异构体。
6.6.4.实施例4：在小鼠慢性压迫性神经损伤神经病变模型中，基于均表达肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(VM202)及胰岛素样生长因子1异构体#1(I类Ec)及异构体#4(I类Ea)的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的联合给药的治疗功效
如在上述实施例1及实施例2中所示，若同时或依次给药VM202及胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，即，pCK-IGF-1#l及pCK-IGF-1#4,(即，可表达胰岛素样生长因子1异构体#1或胰岛素样生长因子1异构体#4的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体)，则在神经病变的小鼠慢性压迫性神经损伤模型中显著减少机械性触诱发痛。
本发明人员试验了是否使用在实施例3中制备的均可表达胰岛素样生长因子1异构体#1及胰岛素样生长因子1异构体#4的双重表达脱氧核糖核酸构建体来提供相同效果。具体地，将pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10与VM202一同在神经病变的小鼠慢性压迫性神经损伤模型中进行了试验。
Figure BDA0002900127010000351
将慢性压迫性神经损伤小鼠分成5个组，在慢性压迫性神经损伤当日，将总200μg的脱氧核糖核酸构建体(表3中提供)通过注射向肌肉给药。使用冯弗雷的细丝测试来在适当的时间测定对机械刺激的疼痛灵敏性。各个组由6只小鼠组成，执行2次以上的独立实验(平均±SEM；*，p＜0.05；**，p＜0.0l；***，p＜0.00l)。在慢性压迫性神经损伤手术1周后，使用冯弗雷的细丝测试评价机械性触诱发痛的发生，每周评价疼痛症状。实验过程概述在图8A中。
在慢性压迫性神经损伤手术后，在一周内测定的缩脚频率呈现在图8B中。上述数据证明同时向肌肉注射加密VM202及胰岛素样生长因子1异构体#1及#4的构建体(即，IGF-1#1及IGF-1#4；IGF-1X6及IGF-1X10)之后，机械性触诱发痛显著减少。尤其，当分别上述小鼠同时给药加密胰岛素样生长因子1异构体#1或#4的两个胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体或上述双重表达构建体pCK-IGF-1X10时，对于机械性触诱发痛的效果更为明显。这种效果在慢性压迫性神经损手术4周后的最后测定为止持续观察到。
6.6.5.实施例5：在小鼠慢性压迫性神经损伤神经病变模型中，均表达肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体(HGF728)及胰岛素样生长因子1异构体#1(I类Ec)及异构体#4(I类Ea)的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的联合给药的治疗功效
如在上述实施例1至实施例4中所示，若同时或依次给药VM202及胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，则在神经病变的小鼠慢性压迫性神经损伤模型中，机械性触诱发痛显著减少。进一步试验了与胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体组合的其他肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体，HGF728的治疗效果。
详细地，如实施例1生成在慢性压迫性神经损伤神经病变小鼠并分成5个组。如图9A所示，在慢性压迫性神经损伤手术当日，向肌肉注射总200μg的质粒脱氧核糖核酸。向各个组给药的脱氧核糖核酸构建体概述在表4中。
Figure BDA0002900127010000361
在慢性压迫性神经损伤手术1周后，使用冯弗雷的细丝测试来评价了机械性触诱发痛的发生。简单地，将动物放在金属网底板的上部的气缸以使小鼠适应。通过使用恒定厚度的细丝(0.16g)刺激后爪来评价小鼠的机械灵敏性。关于机械阈值，用不同厚度的细丝(0.04g～2.0g)刺激小鼠。之后，每周重复进行试验。
在慢性压迫性神经损伤手术1周后测定的缩脚频率及机械阈值呈现在图9B及图9C中，图9B示出频率(％)，图9C示出缩脚的阈值。所有数值通过从三次独立实验获取的平均±平均标准误差(SEM)显示。数值之间的差异通过单向方差分析(one-way ANOVA)、事后测试(Tukey’s post-hoc test)或多重比较测试(Bonferroni’s multiple comparison test)确定。
根据这种数据，若注射pCK-HGF728，则显著减少缩脚频率及缩脚阈值。当通过pCK-HGF728及pCK-IGF-1X10处理动物时，缩脚频率进一步减少，机械灵敏性的阈值进一步增加，这在统计方面显著。这种结果呈现pCK-HGF728的治疗效果也可通过pCK-IGF-1X10的联合给药提高。这种效果在慢性压迫性神经损手术2周后的最后测定为止持续观察到。
7.文献的引用合并(INCORPORATION BY REFERENCE)
在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请书及其他文件中，各自的个别出版物、专利、专利申请书及其他文件在所有目的作为参照结合在本申请中，与个别显示文件的相同程度，在所有目的其全部内容通过引用结合在本申请中。
8.等同技术方案(EQUIVALENTS)
例示并说明多种具体实施例，上述说明书并不时限制性。可理解的是，可在不超出(多个)本发明的思想及范围的范围内进行多种变更。在研讨本说明书时，普通技术人员可明确理解多种变形。
序列表
<110> HELIXMITH CO., LTD.
<120> 使用胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的神经病变治疗
<130> 33730-37536/WO (012WO)
<140>
<141>
<150> 62/699,667
<151> 2018-07-17
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 402
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga ag 402
<210> 2
<211> 1505
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc 180
tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac 240
atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagcc 300
cttggcaaat aatgtgatgt acccaagcct cagtttcatc agtaacattg ggataataat 360
aatatctacc acatcagttt gttgtcaaaa ttaagtagct catgcatata ctttgagatg 420
cttttcacat gcctgcataa agtaattgtt ggaccatcgt taatgtctgc cataattgca 480
cttaataaca aagcttgtaa cctttcaagt tctgagattc tacaatcttc caaagaaaat 540
aaaaggctaa tgggaactat tcaaaattca tattcagtag caagcataat taaacatgaa 600
acattaaaaa tagaaatttc tgtttggcta taagaatgcc tagacatttg taatgatcaa 660
aatctgcagg catcattttc taagagctag actgtaaaca aacctcagag gtaccaacta 720
tgccatcagt agtacataaa acatctgatg cacatttagt cacttgatcg atttctcttg 780
aatgagtgaa cgaatgaaca aatgaatata agagattaaa attttagcca ttaagtagaa 840
agaataagaa ctaaagagaa ggtaaaggag gaaaaagaga aggcaaggaa gttgagtaag 900
ggaagaaata gctctcgttt aagtattttg gggactctgt tgaaaaaaga aatgccaaca 960
tgtggtttta atctttggag ctagaactaa taatattgtg caaaagcaca agatgagaga 1020
tcaagaagtt caccatgaca ccttcgctgc ttcctggtct taaacctcag ctgaggctgg 1080
aagaggacca tggtggctta ttggagatgt gaccccaggg agcccctctg aaggatggaa 1140
ggggactggg caagacccaa cacacacaga acacagtagc cactggccag gcaggaagca 1200
aggatctcag aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag 1260
gcagattcat tctttctctt cccaggtgac ccagcgcctc ttggtttcta actggggagg 1320
gggtaggtgt caagagatga gtcccaaagt tctggaatgg tgggtcttgt gactgaggtc 1380
tagacccctc tccagcatga gtgctgtctc ctgcatcata tggagcctgg gcattctgag 1440
ctcattcaaa gggacaccat gggaaccact tgttctcaat gcaattattt ttgtgatgtt 1500
tacag 1505
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga gaaggaaagg aagtacattt 60
gaagaacgca agtag 75
<210> 4
<211> 15250
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
aggacaggag gattaaacag acagaggcaa ggatgatgag agaggagcag acagcaagaa 60
tgaaaagcag aaaatacaat agaggaaatg aagaaaagta ggcctgctgg agctagatga 120
tgatgtgatg gaaatagaag taacctttta gagaatctcg ctaagaaaca tggagaaaac 180
ggaaaagaaa aatgtaatgc cctagaaagc gcaaagaaag acagtggcaa aaatgaaaaa 240
aaaaaataaa aattataaaa gaggcaaaaa aagacacact attctctgcc tctaaaacac 300
aattaaataa aagaatttaa ataaaaatta aggcttctat atgcattttt aaattttgta 360
tgaatctgtt atggaagaat tgcctatgtc aatatatgtt cagagttaaa tattagcccc 420
aaatgctcag caagactgaa ttgtgtcata gaagttccca gattcccttt tcccgcaatg 480
tcattggagg ctgcatttct tagtcaagtc cagggtttag gccaaagggc atccggtatt 540
gcctaaaacc ctgtgaggtc tgtgaggtaa cttttgagaa gaggtcactg cactcttcat 600
cttttttgca ctttggaatc agatataaaa gatgtataag tttgctaggg ctgccataac 660
aaagtatcat aggctaggta gtttaaacca cagaaattga ttttttcata gttctgggag 720
ttgaaagtcc aaaatcaaag tatcagccct tgcaagggcc ttagagaagg ctctgtcatg 780
ggctcctccc ctcggcttgt aggtggcctc cttcttctcc ccctgtgtct tcacttcatc 840
ttccctccat acatatctct gtgtctaaac atcctctgtg tgaaacaaca ccagccaggt 900
tggatttggg cccaccccac tgacctcatt ttaacttaat tatctctgta aagactctgt 960
ctccaaatac agtcatattt tgacgtactg ggagttaggg cttcaacaca tgaatttgga 1020
cacaattcag ccagtgacag aagacttctg atctctgatg ataaccactg cattttgatt 1080
acagctccta gaaaacactc ccctccacca ccccaccaca gatctatttt tatatctgaa 1140
accctgagtt tctgctccat gagaacccca ggaacatact atgttagatc tggaagaagc 1200
ctcagaaatc cccttatttt gaagactagg acactgagat ccagaagtgg gtaaagatgt 1260
gcttgggttc taagctgctc ttcttttggc caggagacaa cagcacataa tcaaagtggg 1320
tcaactaaga aagaattcca gaaggaaaag agagggcaga aatgaaggga gagaatgaga 1380
gcaaaagtgc tggatttccc tgagggtgaa gaaaagttaa atagaatcac agaattcaga 1440
ttttagagat cttctccttc agatcccttg gtttaatcag taggattggg gtcttcatag 1500
ataataaagc aaaaactctc gccatcctcc aagttgtgaa ttagaagagc tgagaaaggg 1560
tacaagacgg aagttctcta ccaaacaaat ggtgacattt tggggtaaga atatgactaa 1620
cccagaagtg aagcatttca tccaagtagt ctattttgaa gatgtcatgg tataaaggaa 1680
cctcctttct gcctggtcct ccatgcctct gccatgcttt ttactccagg atcacccttt 1740
ctagtggttc actgaaaacc caggattact taaatatgat ggacatgttc acggctcaat 1800
ccaggaggaa aaggtcgaac tgaaagcatg ccaaagcccc acatgggagc caagccactg 1860
ctgctgtggt tgcaaagtgg atcctggctt atcagagcag agagaagcca ggctcgtgcc 1920
ttagcccaag tggccagtca ccttattcag gagatactaa gttctccagc taagacatcc 1980
atgctttggg accagctgca gacagaagcc aattcctact acaaccatca ccttagagta 2040
gcatatagac acagatggct cttcaaagga ccacagttcc atggaataac taagaattca 2100
tgtcctgtgg aaaggtttga ataaactata attataccca atcataaatt tcattcaaga 2160
agaactaaag caaaggcaaa gacagagaga agaaggaagg aaggagggag ggagggaggg 2220
aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaagggaa 2280
ggaagaacaa aaagactttc tagttaaaga atgcttaact agcaaactat gtactataag 2340
acagttcttt tcggaatgag ttttatcaac tctaaagcaa ttatcttgaa tgcctacatg 2400
tgattactga ataatatgaa ccaagaaaac agaaagaatc tatattatct ttccatttcc 2460
ttctttccag tatcaatacc caagcctcta gtgatacatg gcatataatg ttggatggat 2520
ggatggatgg atggatggat ggatggatgg atggatggat gaatggatgg ttggatggac 2580
aaatgagtaa cataggctga tgaatagtgg tagaaagaca caccataaaa acaagtggca 2640
cttctgagat gaaatgattc ctattctcct acacaagaca gtgaggcaag tacagagtaa 2700
aaaaggaaag gcataggagc tatgcttata caagtattgt atgtttggaa tttccttcgc 2760
tggccaaatt gaaattgttc aaggacctat tgctacaggt ggcaactggc taagaatttc 2820
atagtgaata ttatacacct attactcccc ttaatgtttc tttgaagtaa gcagaatatt 2880
aataatcatt taaaattcca gtgtttcaac ttcaattgtt tcctagggca aattgataat 2940
tgtgtgtaaa actaattgga atatgtatgg aataatcatc ctgaaataaa attggtgaaa 3000
agtatttgtt attgggcatc tacaatgtgc aaacctctgt actaggcatg aacaagagtt 3060
ataagcattg gagaggctaa aatatagtcc ttaaggctgg gcacagtggc tcatgcctgt 3120
aatcctagca ctttgggagg ccaaggcggg cagattgcct gagctcagga gttcaagacc 3180
agcctgggca acatagcgaa accccatctc tactaaaaat acaaaaaaat tacctgggca 3240
tggtggcacg cacctgtaat cccagctact caggaggctg aggcatgaga attccttgaa 3300
cctgggaggc agaggttgca gcgagccgag atcctgccgc tgcatcccag cttgggtgac 3360
agagtgagac tctgtctcaa aaaaaaatta aataataaat aaatagtaaa atacagtcat 3420
taagagtaca aaatgtagat tcagactacc tgggttcaaa tcttggctct tacttgcatt 3480
gtggctttgg gcagatcatg taacttatgt gtgcctcagt ttcctcatct gttaaatagg 3540
ggcaacaact gaatctacct tattcagttg ttgtgagggt ttattgagat tgtgtgtgtg 3600
tatgtgtgtg agtgtagtgt gtgcatgtgt gtgtctgtgc aaggagtggg aggtgtatat 3660
tcagagacac atattacagc acttaaaatg gtatctagca cttagtaagc attattcaag 3720
ttttagttaa cattatttta cttacctctg aaaattggag ctatgtgaaa aagaagttgg 3780
tctcctgaag tagaagccag tcttgtgtca ccaaaaactt caagcccaag cttgccaacg 3840
cttttccatg atgtggtagt agagtttcaa gcatgtggta ggataagaga actcaatgac 3900
ctaagaacca ttccaaccca gagaacccct ggttctatga ataattccaa cttaaatagg 3960
tagcttggct ctcccaagtg agagccattg cttctgtttc cgggtcatat aatgaacttt 4020
cagaaaacca ccatttttct caaccagtta aaattaagtg taatacgtgc tttcatttca 4080
tggtgcctgg ggaaaattta attgtagtat gaactccagt tattggtagt cttaagtaaa 4140
attgccaaaa taaatagaaa tgcaggatat ttctgggctc acacagcttc cgggacactt 4200
tagtttcttg ggctgccaat ccagtgcctt tcacaagcat ttgatctttt ttcaaacatc 4260
tcttgaaaac aaacaaaacc tcacacagct tctaatgtgt gcactgttcg aatgtaaggg 4320
tggaaaagga ggcaaagaaa tgagctccca aagagcaatt ccccttctct cgcctccatc 4380
ccttgacgac ctccctccca ctaaagggaa acattgtttt cttaggtaat aaattctgca 4440
atttctcaag tccattaaca tccactgggc aagatgagat ctattctttt tatttgccca 4500
taggaaaaga atagtgcttt tttgcaatat tcactagata acacagagtt gacttttaat 4560
ccaagggcaa cattgatagt ctctagttaa aggggaagcc ttcaggagca atgaaaagat 4620
taatagtttt agatgaagca gaatccaaat ccctttttat gagttttgaa atatccagtt 4680
tgtatgctca cctcaatact taaagcccag ttactgattc ctttggccta agcaagacag 4740
gtcaattttt aaagagggag tagctgaggt tagcaaaaat tctccaggtc cacaaaactt 4800
ccagacctgc aaggtgaaaa tcagcttttc tgtcatccct aaaggcctaa ctggaatcag 4860
aacttttccc tgatgcccac atatttggag gtcctttttt aatgggactc cttaatgcct 4920
ttagtgccat cccattttca tccagtgtcc aaaagaaatg atttaaaaat ataaacgtat 4980
gtttaaattc cagaagagag aaatggagat tgagaacaat agggaaatga tgagagctat 5040
gggaaaagag gtttatgagt ccatgtctga ttcttccaga gagcccctaa gaaagttctt 5100
atcataccag gaactcaatt ataactttca ttgcctattg ttagatgagt aacaggagct 5160
agaaaacatt ttggaaattc ccatctttat ttttttaact aatatgatta tagttttaag 5220
aaccattggt caagaagcta actttttaaa aagtggaagt atgatggtta gaaataagaa 5280
tgctaaaggt gcatcaagct gattttaatt ctaaatgtcc ttggcagcaa tttagaatct 5340
gtaataaact acaccaaaca gttttgaggg gaaggggatt agtttctccc cttccttcgt 5400
gtgtgtgtgt gcgcgtgtgt gtgtgtgcac ctttgtgttc tagcattgtt gcacccatta 5460
cagagctggg gggaactatt ttccaaaatt ataggtgaga acagtttctt ggattgtctt 5520
tcagtgaagg taaattcctc tgtaaaaact aaccatcatt cagtaaaaac tgcaggattc 5580
ctttgtcttc tcaaaagcct gtttctcatc ctaaattaaa aattattcag gaaatagaga 5640
ggacattatt ggaggggtgg aaataagttg gttttctttt tattgtatct tttgaggatc 5700
cagggacttc taccatttcc catctaacat acagagaagg attctctagg tccctgtcta 5760
tagactgcag taactttcct atagaaccaa tttgcaattt tagaaatttc taggtctaat 5820
tattgaccca ttacaaccaa aggtcaatgc atccagccaa tcttccttct atcatcccct 5880
gcccttactt ctattaggga ctgggattac aggcaaaacc catcaaatgc ctcttctacc 5940
actttcccat ttcttaacca ttagcctcta acttcctcta ttcagtttct catatgcttt 6000
catgcccatt gggtcagata aaggaacatt catttatttg agtaggcatc tgttatgatc 6060
actccggaaa aaagatgaca atgggttacc ttgtcctcct gggcttctct aactgacatg 6120
gtcaaaatgc ccatatgaag ataagatgtt aagagcaaga tttatgaaaa gctgagtatg 6180
atggcagctc ttgtctcata aaataactcg aaagttccca gtgaaagacc aagaaatttt 6240
acatcaaacc caaaccggcc aaatggtcca agcttccaag ctgggatcca tggctaaagt 6300
ttctacaaaa ttctgggtac aatgtataaa cattcacttg gggctttctg tctagccagc 6360
accaagaggt caagtaatca aggaccaact agccctgcca tctgtgaaaa tatgtgctat 6420
tttcacggct ttagttcaca attatggcaa gacaaaagtt ccaaataatt aggagcaaga 6480
ccatggcagg ttgacggttg agtaaggttc tcaatcagcc gacaattgta gagttgggga 6540
tgtgcaatgt ttatgtcatg gtgtaagtat gtggcatgct tgactagctt gtgaggcact 6600
ggaagactag aaggaatgaa aaatatgaat gaatcaataa atgcatagta taattactgt 6660
tattttgtca gtattgtttt acctaggtca ctattgaatg ctctgatttg tctctttata 6720
aataataata tgttttcttc ttcaaaagaa cactaggatg aaggtagagg tgcttttggc 6780
acaatgccac aattctgatt tttttaaaac tgtatgcatg cataaaatgt tcttgagcca 6840
ttctctgcct tggaatagca ctggctggca ttctgcatgt ttacttttat atgctgaagg 6900
cccccatcaa cctcaaacag aggcaaatca atttaacttc tcatagtgtt attttgttca 6960
tcctaaaagt tcaagagagc cttccaaact tccaaaattt ctctcaattc agtgaggagg 7020
aaaattcaga acacagcatt tgaatgttct gcccagattt gtcacacaca caaggaatga 7080
gtgaaagagg gcaacaccct ttcctcctaa ccctgtgaac tcatcactat tgcattgaaa 7140
tgacaccaaa aggtaaaaac cctaggcctc acatctccca agaacactgc aataggagtt 7200
actgcataca ccagtttaag taactctagc ataaattgta tgtcagatga aacaatggca 7260
ttttggaggc ttaagagaaa aagaataatc aaatccagtt tttaggtact aatgtgctga 7320
atctttagca catagcagca aaattgctag aatctggtgt ttcacttttt aaaataccac 7380
atttgaacct ttcagcaatt ccaaaatcaa ctccctctgc gaaagataat aagcttaaac 7440
attttttaaa tttaaaaatg taacacaaac aaacagctaa gcaaacaagc tgcccataaa 7500
atcaacagtc tggggagccc tgatcctgaa gtattttaca acatccttca tgactattaa 7560
aggcaacata aacacctctt gtcagcaagg gaaactaccc ttggcatttt tttttctttg 7620
ttccccaggc ttttaaacca ttttgataga gattttttac atcacaggca gaaatatttg 7680
aaatagagtc aggtggtagt ctttaaaaga gtaagaaagt tgctaagtca agataatctt 7740
ggaataaagt cctctgattc ctggggattc ctagggatgc cccagtcact agaaaacaga 7800
gctgtaagtc cactctccca gcactcaacg gagctccgga aaccaaggag ctagctactg 7860
tttccccaca ttcagccaga gaaagggcag cactctagca tgcaaactgc tttgacaata 7920
gtaacaatta aaaagtaaat taaaaagaat cataatagct gatattgatt aggtacttgc 7980
cctgtggcaa gagctatagg gaatcacctc atttaatctt cacatgaagc ttgcagagtg 8040
agtaccacaa ttatcactat tgtatagaca ggaaaactca ggctgagtat ggctaagtgt 8100
cttgccaacg tcttgggcta acaagcggtc aagcagaatc caaacccgag atagatagac 8160
cacagtgtgc taatcaagca ctgcactctc tcctgcattt cttagttgat atttaccata 8220
tacaatctgt cacttgtatg agatggcagg gggttctgtg ctatttgtcc ttgtagagaa 8280
taccacagga agaaagtaag cagccatgca atatttgctg ttgacctgaa ctccattcca 8340
tcattcctgc aggaaattcg catccattaa atgagcattt cctggtttgc cactttgctc 8400
aaacactttg cttggatctg gagaggatat agaagtgaag gaaatatgct acctgctctc 8460
aaggaactta tgttttagtg gagagacaaa catgcagaat ttactctaca gaacatcaat 8520
gcttgagcaa atgtagaccc agagagggct cttacagcac acaagccaga acagactgat 8580
ggtgctaaca attaggttca aggtttttct aaacagtaga ctctcctgca tacaactata 8640
ccgcatgcca ggtaaatgac tgagggttat tacatccaat tataacacca ctgtgatgta 8700
ggtgctctta ccccacactt tcattttaca gaagaggaaa ttgaggacag cacaatgtag 8760
tgattatcaa aggtcacacg actactgtgt gggagagcta ggatttaaac cagatgcata 8820
agatgaggtc ctccaagaaa cagaagatga gaaggtgtta aatgagcagg ggttttatta 8880
gggggaatta atgtgtgaac agaaataggg gaggataggc aaagccatca gattgcaagg 8940
caagcctaac cccaagggaa ggagagagag agagtagatt ggttggaaac atttttggtg 9000
ggtctatggt ctaaggaaag ttcagcaaag tcatcatgga gtttttgagc caaagttggg 9060
caatacagtt gcccaacaaa tttctgtgtt tctcagaaat aggtctgcct caatgtcccc 9120
accatacttg gtcactggct cttgggaggg gcctgccctg ttccaatcca ctagagccaa 9180
agaagagccg ttgtactggc agggggtggg ggaattccta caaccacata aaaagtgggg 9240
tgaggtttcc agaaaaaaac gtgatgctgg gctaaccaaa actgtgtcca gtaagtacat 9300
atccctcact ctgttaaaga agcagccaca taaacaagga gtacacgttt ctcaaaatgt 9360
gcaccttgtt ctttggtttt gaagtcacat cccaaagtgc tgagtagatc gcatgaccct 9420
cgctttgcct ggctgccaga gaggaaaggc tgatccaact ctcctggaat ttgaacttgt 9480
gattccctga agtaaagaga tatcaaagtt gatactgaga catctaaatc atcctccacc 9540
atttcacatg tccccaggcc aagccagcaa aattgctata gcacatccct ttcaacaggt 9600
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cctttttggg agcaggtcaa tgctgagtta gtactttatg ctgtacaata agctgctgat 9720
attccatgct ggacagaatt ttcccagtat tttttataga gtgccaggct tttcctagac 9780
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tctctcaggc aaaatctcat aaagataagt ggggaggaaa aaaagggggt tataatacct 9960
agggagtttg cttttgctaa ttgaatactg tgctcctaga cttctataaa taccattaca 10020
aatgggtccc agcttgtggt aatactcacc ctcctcattg agtcttctgt cccatggcac 10080
agcctttccc tccaaactag catctacccc catctggaag catgggcagc tcatgatatt 10140
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tggggaggca gtttagcaga gtggttaact ggtgagctcc agaatcagaa ggaataggtc 10260
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tttcagattc cttaaagata aaacagtcaa gacagtagta cttatccctg agagaagtat 10380
aggaaacaag aaaatatatg caatttacat acatactaca atccccagca catgacaaat 10440
gttcaagtaa tgggaactgt tattatttta gccctttgtc tatcagtttg ttcctctgtg 10500
acctcaagca cattactaaa tgttagcgag cttcagcttg tacgtgggac tgacaggaat 10560
aacaccgcat cacctcatgt ggtgattgta aggattcagt gatattattt tgtaaactgt 10620
aaagcctttg caaatgttaa gcaagattat tattattgcc gttgttatta gtcctcagtg 10680
atcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttggagacag agttttactc 10740
tgtcgccaag gctggaatgc agtggcacaa tctcagctca ctgcaacctc cgcctcctgg 10800
gttcaagcaa ttttcctgcc tcagcctcct gagtagctga aactacaggc acacgccacc 10860
acaccaggct aattttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccatgt tggccaggct 10920
ggtctccagc tcctgacctc aagtgatctg cccacctcgg cctcccaaag tgctgggatt 10980
acaggtgtga gccaccacac ctggcacagt aatcttaatt gaaaagtctg tggatagctt 11040
tccaaaggaa agcttggagc ttggataaga accaagagat aatgggagaa ggtgaatggc 11100
ctcttcaggg ccttttctag caccctaaat atgcgtgtct gtccataatg ggtaatcata 11160
tatatcacaa atcaaaccct ccacaaactt atttcctaat gtgtttgtta acctttcctt 11220
ctaaagggta aacttcttta accaacccca gtgagctgga ggatcaatgt tttcttaata 11280
gtcttacctt cgttggtgtc aataggaaac agtatttact cactactgtt ttccttttaa 11340
aaatctgtct agttgcatac tagaaacagt ttcagctggt ttgtttgtat tggacaagct 11400
gctgaagtga aaagtttttg cttgactgaa tgtgagacag tttcataact cttcaagaag 11460
tgcaccaaag gtgggtgcca gctctgatga cggctgcttc taacatgcct ccacttgccg 11520
cccattgtca agggtggctg gcgtaattaa gttaagacaa tgagcaaagc aacagatgca 11580
actgagacct agtccctgag tgcttttgtt ttgtcactgt cattgtctgc aacaaagaag 11640
tcacatgtga cagcctggga agagagccaa atgcaaacca gacgatatcc cagctggttt 11700
gaatggcctc caccgtgcac gtgtgtgcat gggaatcatg ctacttggta cagcatctgc 11760
ttcactcaag tgagtttcag cccatggctt tgctgtgatg ctgagacaga cccagaagaa 11820
acagaccagg gaatccctcc gctcagactt tacactttat accttgtgct ttgagagaaa 11880
agaaaaagaa tctctctatt ggagacaaaa aataggatgt atgtggttgg tcaatctaac 11940
ctcaattctt tttgctatag ccccccgcta atttaaagag tgaagcatag atggtatctt 12000
aatgttttct tgtagaaatt tgggattaat ttggcttgag aggaagaatg gagattaaac 12060
gctttatgag gctttctttt aatttgttcc catttcattc ctgaatattt tcttagtttg 12120
ggcattgcag atgtttaaag aacttcttat tttgagctgg tatgcctctt aaacagaaaa 12180
acaaaaggta aaattcaaat tagtgtgttt ctccgcctgt taattaattt ggttagtagt 12240
taggcagaga gatggcatcc ttaataatat ctattttgcg ggtttgatca gctacagacc 12300
atcaacagtg ttgattgaga attgaacaaa aacatttcaa ggagtttggg aacattaggg 12360
atgctattct gtggccccat gtgtccttct ctcatttttc tagagaactc ctataagaaa 12420
gcagaacacg gccaggcatg atggctcatg cctgtaatcc cagcacttca ggaggctgag 12480
gcaggcagat cacctgaggt caggagttca agaccagcct ggccaacatg gtgaaaccct 12540
atctctatta aaaatacaaa aaattagctg ggcatgatgg cgcgtgcctg taatcccagc 12600
tacttgggag gctgaggcag gagaatcact tgaactggga ggcaaaggtt gcagtgagcc 12660
tagatcacac cactgcactc cagcctgggt gacagagtga gactccaact caaaaaaaag 12720
aaagaaagaa agaaagaaag cagaacccaa tggaagatta agaacacaca tttagcttac 12780
gcctgtaata ccagcacttt gggaggccaa ggcgggtgga tcacaaggtc agaagttcga 12840
gaccaacctg gccaatatgg tgaaacccca tctctactaa aaagtacaaa aattagccat 12900
gcatggtggc aggcgtctgt aatcccagct actacagagg ctgaggcagg agaatcactt 12960
gaacccggga ggcagaggtt gcagtgagct gagaacgcgc cactgcactc cagcctgggt 13020
gacagagcga gactccatct caaaaaaaaa aaacaacaaa aaaaaacaaa acacaagttt 13080
actgggaact tagcagtaga tgctttgcac cacaacaaat gtatcttaag tggtcttttg 13140
tgatatttga gggaaagtgc cagaatttaa aacaaatggc atttcaagtt attctataca 13200
aatgcccagt ttctttctac catctttttt tcctttttgc agtggtcact gagctatttt 13260
agtgaatgtt tttacacaat gatgccatct tccttctact cagtcagtac aagatgttga 13320
ccatcgactc ataaaacact agctaccttt catgaaggac ttggtgataa ctctcatgtt 13380
ccaagtagaa ccggaaaaca tgtgtaagaa aacctgccga tccctatggg ccttggccaa 13440
taggtattat tcccaagggg tggcagttta tctttttccc cagccttcat attaaaacct 13500
ctcaccttct ccaggtctca ggtctgtgta atctcaaatg tgctttagct cctcacaata 13560
ttgtaactgt gtgggtgttc attaccttag ccagaagaca gtttacagat tccaggtctc 13620
atggagagaa cttttgtttt tggttatgaa cctcactgta taccaataat tatccattac 13680
atccttctgt agagggctct ctggctagag ataaaaccaa aaaaagaagt acctcaggtt 13740
tatgcatata aatgccagtt cctccttgat tttatttcaa aactcctgtc tacatacttt 13800
gcaatttaaa tacattcaag gataaagtaa taactgtagg aaaagtatta taatataatg 13860
acttagttct gcacatcaca agggggtccc tcatactcat tcattcattt cactcatttt 13920
acagatattt attgagcacc tgcaataacc tgcacactgc tctagacact gggactataa 13980
cagtaaacag acagatacat ctctggtctc acagggcttc tattctaagc aaaactcaat 14040
atccaggccg ggtgcagtgg ctcatgcctg gaatgccagc actttgggag accaaggcca 14100
ggcagatcac ctgagcccac tagttgaaga ccagcctggg caatatagca aaaccccgtc 14160
tctacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaattgtcaa ggcatggtgg catgcgcctg 14220
tggtcccagc tacttaggag gctgaggcag gaggattgtg taagcctggg aggcagaggt 14280
tgcagtgacc tgagatggca ccaccacact ccagcctggg caacagagtg agaccctgtc 14340
caaaaaaaaa aaaccctcac tatccttaag ataacatcat tgcttgttga tgagtgaatg 14400
ttaacaccaa attaggaacc caggactttt agtcttggca tggttacttt ccaataaaga 14460
tgacaatact aagaagagaa aaatgattta ataatgataa tagtggctaa tacttatgta 14520
gtgcttacca tgtgccaggt ctattgtaag tacttttata tatattaatt atttaatctt 14580
tgatcctata aggtagatat tattgttacc ctagtttata gatgaagaaa cggaaacaca 14640
agagattgcc actcatacaa gtttacacag ccagaaaata gaaaagctac gagttgagct 14700
cagcccagta tgtctatgat tttacagact caaaattaat tataagattt cctaatcttc 14760
gatttctgaa actctgcctt gctctagagg aaaacaagaa aaacaatgaa aaataaatgt 14820
ctctttttta caaaaattaa aacagaacaa actgcaataa aacaacagag gatgaatcca 14880
gaatgtgatt gatttttttt cttactagga aaggatctag aggccagaag gctggatttt 14940
tcaggatctc ctttcaatca atgaatctgt gatagaagca gatgaatcaa atctcatctt 15000
tgtgtgatta taaagctgtc tgtggtattc acgccaccag gggtacatag aagatgcctg 15060
agtgaggttt ggcaaaagta ctaagggcct gtccacctat acatgccctt ctcaggaaaa 15120
ccaaggttca agctctctat tagctcaact ggtaaggcgt aagacatgga aggttgaggc 15180
ccaatgttag aaatagatgg atacataaaa cttcatcaag ttaatgtcac tttttctcct 15240
ttatttatag 15250
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
gaagtacatt tgaagaacgc aagtagaggg agtgcaggaa acaagaacta caggatgtag 60
<210> 6
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc 180
tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac 240
atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagag 300
aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag gcagattcat 360
tctttctctt cccag 375
<210> 7
<211> 300
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa caaacatggg ctttggtgtc 180
agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta gagagaaaag acttttaggt 240
gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga ttcattcttt ctcttcccag 300
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
ctttttctcc tttatttata g 21
<210> 9
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 9
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
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gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
acatccccat ctctttggtc actctgcatt gcaaatttcc cctcccaccg ctatggacga 600
tgtgatgatt ggaagatgtt acaaaacagt ggctaaacaa acatgggctt tggtgtcaga 660
caaaagtgaa gtcctggctt tctcacacac cagcttagag agaaaagact tttaggtgaa 720
tgtggcagga aagcgtgctt gctggggcaa aggcagattc attctttctc ttcccagtat 780
cagcccccat ctaccaacaa gaacacgaag tctcagagaa ggaaaggaag tacatttgaa 840
gaacgcaagt agctttttct cctttattta taggaagtac atttgaagaa cgcaagtaga 900
gggagtgcag gaaacaagaa ctacaggatg tag 933
<210> 10
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 10
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
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gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
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tttctccttt atttatagga agtacatttg aagaacgcaa gtagagggag tgcaggaaac 840
aagaactaca ggatgtag 858
<210> 11
<211> 728
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
275 280 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305 310 315 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
325 330 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
340 345 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355 360 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595 600 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610 615 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645 650 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690 695 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
<210> 12
<211> 723
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg
165 170 175
Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg
180 185 190
Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr
195 200 205
Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly
210 215 220
Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe
225 230 235 240
Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg
245 250 255
Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His
260 265 270
Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met
275 280 285
Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln
290 295 300
Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro
305 310 315 320
Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro
325 330 335
Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
340 345 350
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg
355 360 365
Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln
370 375 380
Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln
385 390 395 400
Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp
405 410 415
Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu
420 425 430
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr
435 440 445
Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys
450 455 460
Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile
465 470 475 480
Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr
485 490 495
Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His
500 505 510
Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg
515 520 525
Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly
530 535 540
Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu
545 550 555 560
Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu
565 570 575
Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile
580 585 590
Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser
595 600 605
Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu
610 615 620
Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His
625 630 635 640
His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala
645 650 655
Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu
660 665 670
Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro
675 680 685
Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val
690 695 700
Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val
705 710 715 720
Pro Gln Ser
<210> 13
<211> 3679
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 13
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc 780
ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat 840
aaagcctgtt aacaaaacac aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat 900
gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg 960
cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa 1020
aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag 1080
ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta 1140
ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa 1200
gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg 1260
tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct 1320
caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 1380
agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 1440
gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 1500
tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 1560
taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1620
tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1680
aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1740
ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1800
caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1860
taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1920
ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1980
gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 2040
agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 2100
tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 2160
ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 2220
caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 2280
cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 2340
tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 2400
tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 2460
aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 2520
tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 2580
ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2640
tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2700
atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2760
tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2820
agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2880
ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2940
cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 3000
aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 3060
gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 3120
ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 3180
ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 3240
gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 3300
atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 3360
caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 3420
ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 3480
gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 3540
aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3600
tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3660
taaggtacca cagtcatag 3679
<210> 14
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
130 135 140
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
145 150
<210> 15
<211> 462
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac 420
gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac tacaggatgt ag 462
<210> 16
<211> 158
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys
145 150 155
<210> 17
<211> 477
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtag 477
<210> 18
<211> 137
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Met Ile Thr Pro Thr Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
20 25 30
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
35 40 45
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
50 55 60
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
65 70 75 80
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
85 90 95
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
100 105 110
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
130 135
<210> 19
<211> 414
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
atgattacac ctacagtgaa gatgcacacc atgtcctcct cgcatctctt ctacctggcg 60
ctgtgcctgc tcaccttcac cagctctgcc acggctggac cggagacgct ctgcggggct 120
gagctggtgg atgctcttca gttcgtgtgt ggagacaggg gcttttattt caacaagccc 180
acagggtatg gctccagcag tcggagggcg cctcagacag gcatcgtgga tgagtgctgc 240
ttccggagct gtgatctaag gaggctggag atgtattgcg cacccctcaa gcctgccaag 300
tcagctcgct ctgtccgtgc ccagcgccac accgacatgc ccaagaccca gaaggaagta 360
catttgaaga acgcaagtag agggagtgca ggaaacaaga actacaggat gtag 414
<210> 20
<211> 195
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu
145 150 155 160
Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys
165 170 175
Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys
180 185 190
Lys Gly Lys
195
<210> 21
<211> 588
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggttggccaa agacacatcc aggaggggaa 480
cagaaggagg ggacagaagc aagtctgcag atcagaggaa agaagaaaga gcagaggagg 540
gagattggaa gtagaaatgc tgaatgcaga ggcaaaaaag gaaaatga 588
<210> 22
<211> 482
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
ag 482
<210> 23
<211> 1675
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa gggggaccct ggtgtttcac 60
aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct cagtgttcag aagttgaatg 120
catgacctgc aatggggaga gttatcgagg tctcatggat catacagaat caggcaagat 180
ttgtcagcgc tgggatcatc agacaccaca ccggcacaaa ttcttgcctg aaagatatcc 240
cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcccgat ggccagccga ggccatggtg 300
ctatactctt gaccctcaca cccgctggga gtactgtgca attaaaacat gcgctgacaa 360
tactatgaat gacactgatg ttcctttgga aacaactgaa tgcatccaag gtcaaggaga 420
aggctacagg ggcactgtca ataccatttg gaatggaatt ccatgtcagc gttgggattc 480
tcagtatcct cacgagcatg acatgactcc tgaaaatttc aagtgcaagg acctacgaga 540
aaattactgc cgaaatccag atgggtctga atcaccctgg tgttttacca ctgatccaaa 600
catccgagtt ggctactgct cccaaattcc aaactgtgat atgtcacatg gacaagattg 660
ttatcgtggg aatggcaaaa attatatggg caacttatcc caaacaagat ctggactaac 720
atgttcaatg tgggacaaga acatggaaga cttacatcgt catatcttct gggaaccaga 780
tgcaagtaag ctgaatgaga attactgccg aaatccagat gatgatgctc atggaccctg 840
gtgctacacg ggaaatccac tcattccttg ggattattgc cctatttctc gttgtgaagg 900
tgataccaca cctacaatag tcaatttaga ccatcccgta atatcttgtg ccaaaacgaa 960
acaattgcga gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt 1020
gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac 1080
tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca 1140
tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt 1200
atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga 1260
tgattttgtt agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag 1320
ttgcagtgtt tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt 1380
ggcacatctc tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac 1440
tctgaatgag tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg 1500
ggattatggt ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat 1560
tgttcctggt cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata 1620
ttatgcaaaa tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag 1675
<210> 24
<211> 3756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 24
cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg 420
gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480
tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga 540
cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 600
accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 660
accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga 720
gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt atgcatgcta 780
tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg tgatggtata 840
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 900
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tatctctatt ggctatatgc 960
caatactctg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtcccat 1020
ttattattta caaattcaca tatacaacaa cgccgtcccc cgtgcccgca gtttttatta 1080
aacatagcgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1140
cggtagcggc ggagcttcca catccgagcc ctggtcccat gcctccagcg gctcatggtc 1200
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca caatgcccac 1260
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1320
agattgggct cgcaccgctg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1380
aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1440
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 1500
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 1560
ttgacacgaa gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattctgcag 1620
atatccagca cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 1680
ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 1740
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1800
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 1860
ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga 1920
aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag 1980
cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 2040
tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 2100
tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 2160
ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg 2220
tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 2280
tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 2340
gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 2400
cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca 2460
gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt 2520
tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 2580
agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 2640
agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga 2700
aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc 2760
ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca 2820
gctggcaatt ccggttcgct tgctgtccat aaaaccgccc agtctagcta tcgccatgta 2880
agcccactgc aagctacctg ctttctcttt gcgcttgcgt tttcccttgt ccagatagcc 2940
cagtagctga cattcatccg gggtcagcac cgtttctgcg gactggcttt ctacgtgaaa 3000
aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 3060
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 3120
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 3180
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 3240
ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 3300
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 3360
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 3420
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 3480
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 3540
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 3600
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 3660
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 3720
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatg 3756
<210> 25
<211> 4956
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
gtaagaacag tatgaagaaa agagatgaag cctctgtctt ttttacatgt taacagtctc 60
atattagtcc ttcagaataa ttctacaatc ctaaaataac ttagccaact tgctgaattg 120
tattacggca aggtttatat gaattcatga ctgatattta gcaaatgatt aattaatatg 180
ttaataaaat gtagccaaaa caatatctta ccttaatgcc tcaatttgta gatctcggta 240
tttgtgaaat aataacgtaa acttcgttta aaaggattct tcttcctgtc tttgagaaag 300
tacggcactg tgcaggggga gaggttgatt gtgaaaaatc agaggtagat gagaatctta 360
ctgagggctg agggttcttt aaccttggtg gatctcaaca ttggttgcac attaaaatca 420
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<210> 26
<211> 7113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
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<210> 31
<211> 4680
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 31
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<210> 32
<211> 2730
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 33
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<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 34
agctggcaat tccggttcgc ttgctgcgtc agaccccgta 40
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 35
tacggggtct gacgcagcaa gcgaaccgga attgccagct 40
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 36
ctaatccata acatggctct agacttaagg cagcggcaga 40
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 37
tctgccgctg ccttaagtct agagccatgt tatggattag 40
<210> 38
<211> 3250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 38
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatgt cgacctcgag tctagagggc 1380
ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1440
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 1500
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 1560
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggagtcga 1620
aattcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc 1680
gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc 1740
acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat 1800
gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt 1860
cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg 1920
cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg 1980
agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc 2040
aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag 2100
gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc 2160
ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag 2220
ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag 2280
aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg 2340
ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa 2400
tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc 2460
cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc 2520
aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgcgt cagaccccgt 2580
agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 2640
aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 2700
ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 2760
gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 2820
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 2880
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 2940
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 3000
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 3060
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 3120
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 3180
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 3240
tgctcacatg 3250
<210> 39
<211> 4108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 39
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatat gggaaaaatc agcagtcttc 1380
caacccaatt atttaagtgc tgcttttgtg atttcttgaa ggtgaagatg cacaccatgt 1440
cctcctcgca tctcttctac ctggcgctgt gcctgctcac cttcaccagc tctgccacgg 1500
ctggaccgga gacgctctgc ggggctgagc tggtggatgc tcttcagttc gtgtgtggag 1560
acaggggctt ttatttcaac aagcccacag ggtatggctc cagcagtcgg agggcgcctc 1620
agacaggcat cgtggatgag tgctgcttcc ggagctgtga tctaaggagg ctggagatgt 1680
attgcgcacc cctcaagcct gccaagtcag ctcgctctgt ccgtgcccag cgccacaccg 1740
acatgcccaa gacccagaag gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt 1800
ctctctcttg tgcatgtggg tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta 1860
caagtcagaa aagctccttt gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa 1920
caaacatggg ctttggtgtc agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta 1980
gagagaaaag acttttaggt gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga 2040
ttcattcttt ctcttcccag tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga 2100
gaaggaaagg aagtacattt gaagaacgca agtagctttt tctcctttat ttataggaag 2160
tacatttgaa gaacgcaagt agagggagtg caggaaacaa gaactacagg atgtaggtcg 2220
acctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 2280
gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 2340
ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 2400
ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 2460
ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg 2520
ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc 2580
aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc 2640
cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa 2700
gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct 2760
ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac 2820
aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa 2880
tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac 2940
tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag 3000
cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt 3060
cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag 3120
gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc 3180
agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc 3240
cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc 3300
ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt 3360
tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccggttcgct 3420
tgctgcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3480
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3540
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3600
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3660
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3720
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3780
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3840
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3900
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3960
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 4020
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 4080
ggccttttgc tggccttttg ctcacatg 4108
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 40
tgatctaagg aggctgga 18
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 41
ctacttgcgt tcttcaaatg 20

Claims (121)

1.一种神经病变治疗方法，其特征在于，上述方法包括：
向患有神经病变的对象体给药能够表达人类胰岛素样生长因子1异构体的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤；以及
向上述对象体给药能够表达人类肝细胞生长因子异构体的第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤。
2.根据权利要求1所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体能够表达包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体均无法表达包含序列18的多肽的II类IGF-1Ea蛋白质及包含序列20的多肽的I类IGF-1Eb蛋白质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的神经病变治疗方法，其特征在于，
还包括向上述对象体给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，
上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的神经病变治疗方法，其特征在于，
还包括向上述对象体给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，
上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。
8.根据权利要求5或7所述的神经病变治疗方法，其特征在于，同时执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
9.根据权利要求5或7所述的神经病变治疗方法，其特征在于，依次执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。
11.根据权利要求10所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体包含序列14的多肽及序列16的多肽。
12.根据权利要求10所述的神经病变治疗方法，其特征在于，
上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含：
序列1的第一胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子1、3、4)或其的简并物；
序列2的第二胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子4)或其的片段物；
序列3的第三胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子5及6-1)或其的简并物；
序列4的第四胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子5)或其的片段物；以及
序列5的第五胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子6-2)或其的简并物，
上述第一多核苷酸、上述第二多核苷酸、上述第三多核苷酸、上述第四多核苷酸及上述第五多核苷酸按从5’向3’顺序依次连接。
13.根据权利要求12所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列6的多核苷酸。
14.根据权利要求12所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列7的多核苷酸。
15.根据权利要求12所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第四胰岛素样生长因子多核苷酸为序列8的多核苷酸。
16.根据权利要求1至5中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含质粒载体。
17.根据权利要求16所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述质粒载体为pCK。
18.根据权利要求16所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述质粒载体为pTx。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。
20.根据权利要求12至18中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体按减少上述对象体的疼痛的充分的量给药。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述对象体患有糖尿病性神经病变。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过多重肌肉内注射给药。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF或序列12的dHGF。
25.根据权利要求24所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类肝细胞生长因子异构体。
26.根据权利要求25所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类肝细胞生长因子异构体，上述两种人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF及序列12的dHGF。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含质粒载体，选择性地，上述质粒载体为pCK载体或pTx载体。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，
上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含：
序列22的第一肝细胞生长因子多核苷酸(外显子1-4)或其的简并物；
序列25的第二肝细胞生长因子多核苷酸(内含子4)或其的功能性片段物；以及
序列23的第三肝细胞生长因子多核苷酸(外显子5-18)或其的简并物，
上述第二肝细胞生长因子多核苷酸位于上述第一肝细胞生长因子多核苷酸及上述第三肝细胞生长因子多核苷酸之间，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类肝细胞生长因子异构体。
29.根据权利要求28所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列13的多核苷酸。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体联合给药。
31.根据权利要求30所述的神经病变治疗方法，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过肌肉内注射联合给药。
32.根据权利要求1至29中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，分离执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
33.根据权利要求32所述的神经病变治疗方法，其特征在于，给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的神经病变治疗方法，其特征在于，还包括向上述对象体给药能够表达选自序列11的flHGF及序列12的dHGF的人类肝细胞生长因子异构体的第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
35.一种神经病变治疗方法，其特征在于，
包括：
向患有神经病变的对象体给药包含序列13的多核苷酸的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤；以及
向上述对象体给药包含序列10的多核苷酸或序列9的多核苷酸的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，
给药上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
36.一种神经病变治疗方法，其特征在于，
上述方法包括：
向患有神经病变的对象体给药包含序列33的多核苷酸的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤；以及
向上述对象体给药包含序列10的多核苷酸或序列9的多核苷酸的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，
给药上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
37.一种神经病变治疗方法，其特征在于，
上述方法包括：
向患有神经病变的对象体给药包含序列13的多核苷酸的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤；以及
向上述对象体给药加密序列15的多核苷酸的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及加密序列17的多核苷酸的第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，
给药上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
38.一种药学组合物，其特征在于，包含：
能够表达至少一个人类胰岛素样生长因子1异构体的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体；
能够表达至少一个人类肝细胞生长因子异构体的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体；以及
药学上可接受的赋形剂。
39.根据权利要求38所述的药学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
40.根据权利要求38或39所述的药学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。
41.根据权利要求40所述的药学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类胰岛素样生长因子1异构体，上述两种人类胰岛素样生长因子1异构体为包含序列14的多肽及序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
42.根据权利要求41所述的药学组合物，其特征在于，
上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含：
序列1的第一胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子1、3、4)或其的简并物；
序列2的第二胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子4)或其的片段物；
序列3的第三胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子5及6-1)或其的简并物；
序列4的第四胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子5)或其的片段物；以及
序列5的第五胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子6-2)或其的简并物，
上述第一多核苷酸、上述第二多核苷酸、上述第三多核苷酸、上述第四多核苷酸及上述第五多核苷酸按从5’向3’的顺序依次连接。
43.根据权利要求42所述的药学组合物，其特征在于，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列6的多核苷酸。
44.根据权利要求42所述的药学组合物，其特征在于，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列7的多核苷酸。
45.根据权利要求42所述的药学组合物，其特征在于，上述第四胰岛素样生长因子多核苷酸为序列8的多核苷酸。
46.根据权利要求42所述的药学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体还包含质粒载体。
47.根据权利要求46所述的药学组合物，其特征在于，上述质粒载体为pCK。
48.根据权利要求47所述的药学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体选自由pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10组成的组中。
49.根据权利要求46所述的药学组合物，其特征在于，上述质粒载体为pTx。
50.根据权利要求49所述的药学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体选自由pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10组成的组中。
51.根据权利要求48或50所述的药学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。
52.根据权利要求48或50所述的药学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。
53.根据权利要求38至52中任一项所述的药学组合物，其特征在于，上述至少一个人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF或序列12的dHGF。
54.根据权利要求53所述的药学组合物，其特征在于，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体均能够表达序列11的flHGF及序列12的dHGF。
55.根据权利要求54所述的药学组合物，其特征在于，
上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含：
序列22的第一肝细胞生长因子多核苷酸(外显子1-4)或其的简并物；
序列25的第二肝细胞生长因子多核苷酸(内含子4)或其的功能性片段物；以及
序列23的第三肝细胞生长因子多核苷酸(外显子5-18)或其的简并物，
上述第二肝细胞生长因子多核苷酸位于上述第一肝细胞生长因子多核苷酸及上述第三肝细胞生长因子多核苷酸之间，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类肝细胞生长因子异构体。
56.根据权利要求38至55中任一项所述的药学组合物，其特征在于，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列26-32及13中一个序列的多核苷酸。
57.根据权利要求56所述的药学组合物，其特征在于，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列13的多核苷酸。
58.一种药学组合物，其特征在于，包含：
序列13的多核苷酸；以及
序列9的多核苷酸。
59.一种药学组合物，其特征在于，包含：
序列13的多核苷酸；以及
序列10的多核苷酸。
60.一种药学组合物，其特征在于，包含：
序列13的多核苷酸；以及
序列15的多核苷酸或序列17的多核苷酸。
61.一种药学组合物，其特征在于，包含：
序列13的多核苷酸；
序列15的多核苷酸；以及
序列17的多核苷酸。
62.一种药学组合物，其特征在于，包含序列33的多核苷酸及序列9、序列10、序列15、序列17或序列39的多核苷酸。
63.一种神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述试剂盒包含：
第一药学组合物，包含能够表达至少一个人类胰岛素样生长因子1异构体的胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体以及第一药学上可接受的赋形剂；以及
第二药学组合物，包含能够表达至少一个人类肝细胞生长因子异构体的肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体以及第二药学上可接受的赋形剂。
64.根据权利要求63所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
65.根据权利要求63或64所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。
66.根据权利要求65所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类胰岛素样生长因子1异构体，上述两种人类胰岛素样生长因子1异构体为包含序列14的多肽及序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
67.根据权利要求66所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，
上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含：
序列1的第一胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子1、3、4)或其的简并物；
序列2的第二胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子4)或其的片段物；
序列3的第三胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子5及6-1)或其的简并物；
序列4的第四胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子5)或其的片段物；以及
序列5的第五胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子6-2)或其的简并物，
上述第一多核苷酸、上述第二多核苷酸、上述第三多核苷酸、上述第四多核苷酸及上述第五多核苷酸按从5’向3’顺序依次连接。
68.根据权利要求67所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列6的多核苷酸。
69.根据权利要求67所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列7的多核苷酸。
70.根据权利要求67所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述第四胰岛素样生长因子多核苷酸为序列8的多核苷酸。
71.根据权利要求63至70中任一项所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体还包含质粒载体。
72.根据权利要求71所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述质粒载体为pCK。
73.根据权利要求72所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含pCK-IGF-X6或pCK-IGF-1X10。
74.根据权利要求71所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述质粒载体为pTx。
75.根据权利要求74所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10。
76.根据权利要求73或75所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。
77.根据权利要求73或75所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。
78.根据权利要求63或77中任一项所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述至少一个人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF或序列12的dHGF。
79.根据权利要求78所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体均能够表达序列11的flHGF及序列12的dHGF。
80.根据权利要求79所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，
上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含：
序列22的第一肝细胞生长因子多核苷酸(外显子1-4)或其的简并物；
序列25的第二肝细胞生长因子多核苷酸(内含子4)或其的功能性片段物；以及
序列23的第三肝细胞生长因子多核苷酸(外显子5-18)或其的简并物，
上述第二肝细胞生长因子多核苷酸位于上述第一肝细胞生长因子多核苷酸及上述第三肝细胞生长因子多核苷酸之间，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类肝细胞生长因子异构体。
81.根据权利要求63至79中任一项所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列26-32及13中的一个多核苷酸。
82.根据权利要求81所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列13的多核苷酸。
83.根据权利要求63所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述第一药学组合物包含序列9的多核苷酸，上述第二药学组合物包含序列13的多核苷酸。
84.根据权利要求63所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述第一药学组合物包含序列10的多核苷酸，上述第二药学组合物包含序列13的多核苷酸。
85.根据权利要求63所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述第一药学组合物包含序列15的多核苷酸及序列17的多核苷酸，上述第二药学组合物包含序列13的多核苷酸。
86.根据权利要求63所述的神经病变治疗用试剂盒，其特征在于，上述第一药学组合物包含序列9、序列10、序列15或序列17的多核苷酸，上述第二药学组合物包含序列33的多核苷酸。
87.一种第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，用于治疗神经病变的医疗方法的用途，能够表达人类胰岛素样生长因子1异构体，其特征在于，上述医疗方法包括：
向患有神经病变的对象体给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤；以及
向上述对象体给药能够表达人类肝细胞生长因子异构体的第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤。
88.根据权利要求87所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体能够表达包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
89.根据权利要求87或88所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体均无法表达包含序列18的多肽的II类IGF-1Ea蛋白质及包含序列20的多肽的I类IGF-1Eb蛋白质。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。
91.根据权利要求90所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，
上述医疗方法还包括给药上述对象体给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，
上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。
92.根据权利要求87至89中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。
93.根据权利要求92所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，
上述医疗方法还包括向上述对象体给药第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤，
上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。
94.根据权利要求91或93所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，同时执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
95.根据权利要求91或93所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，依次执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第二胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
96.根据权利要求87至95中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。
97.根据权利要求96所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体包含序列14的多肽及序列16的多肽。
98.根据权利要求96所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，
上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含：
序列1的第一胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子1、3、4)或其的简并物；
序列2的第二胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子4)或其的片段物；
序列3的第三胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子5及6-1)或其的简并物；
序列4的第四胰岛素样生长因子多核苷酸(内含子5)或其的片段物；以及
序列5的第五胰岛素样生长因子多核苷酸(外显子6-2)或其的简并物，
上述第一多核苷酸、上述第二多核苷酸、上述第三多核苷酸、上述第四多核苷酸及上述第五多核苷酸按从5’向3’的顺序依次连接。
99.根据权利要求98所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列6的多核苷酸。
100.根据权利要求98所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第二胰岛素样生长因子多核苷酸为序列7的多核苷酸。
101.根据权利要求98所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第四胰岛素样生长因子多核苷酸为序列8的多核苷酸。
102.根据权利要求87至101中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含质粒载体。
103.根据权利要求102所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述质粒载体为pCK。
104.根据权利要求102所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述质粒载体为pTx。
105.根据权利要求87至104中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。
106.根据权利要求87至104中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。
107.根据权利要求87至106中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体按减少上述对象体的疼痛的充分的量给药。
108.根据权利要求87至107中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述对象体患有糖尿病性神经病变。
109.根据权利要求87至108中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过多次的肌肉内注射给药。
110.根据权利要求87至109中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF或序列12的dHGF。
111.根据权利要110所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密一个以上的人类肝细胞生长因子异构体。
112.根据权利要111所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类肝细胞生长因子异构体，上述两种人类肝细胞生长因子异构体为序列11的flHGF及序列12的dHGF。
113.根据权利要87至112中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含质粒载体，选择性地，上述质粒载体为pCK载体或pTx载体。
114.根据权利要87至113中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，
上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含：
序列22的第一肝细胞生长因子多核苷酸(外显子1-4)或其的简并物；
序列25的第二肝细胞生长因子多核苷酸(内含子4)或其的功能性片段物；以及
序列23的第三肝细胞生长因子多核苷酸(外显子5-18)或其的简并物，
上述第二肝细胞生长因子多核苷酸位于上述第一肝细胞生长因子多核苷酸及上述第三肝细胞生长因子多核苷酸之间，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体加密两种人类肝细胞生长因子异构体。
115.根据权利要114所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体包含序列13的多核苷酸。
116.根据权利要87至115中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体联合给药。
117.根据权利要116所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体及上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体通过肌肉内注射联合给药。
118.根据权利要87至115中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，单独执行给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
119.根据权利要118所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，给药上述第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤至少按3周间隔执行。
120.根据权利要87至119中任一项所述的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述医疗方法还包括向上述对象体给药能够表达选自序列11的flHGF及序列12的dHGF的人类肝细胞生长因子异构体的第二肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的步骤。
121.一种第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体，用于治疗神经病变的医疗方法的用途，能够表达人类肝细胞生长因子异构体，其特征在于，上述医疗方法包括：
向患有神经病变的对象体给药上述第一肝细胞生长因子-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤；以及
向上述对象体给药能够表达人类肝细胞生长因子异构体的第一胰岛素样生长因子1-加密脱氧核糖核酸构建体的治疗有效量的步骤。
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