CN112088017A - 用于裸脱氧核糖核酸基因疗法的经冷冻干燥的药剂学组合物 - Google Patents

用于裸脱氧核糖核酸基因疗法的经冷冻干燥的药剂学组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供在冷冻干燥期间，形成均匀且秀丽(elegant)的滤饼并维持脱氧核糖核酸(DNA)质粒的稳定性的新的经冷冻干燥的药剂学组合物。新的经冷冻干燥剂型可以在制药学可接受的溶液中实现脱氧核糖核酸结构的均匀重组，从而可以使活性成分完全复原，将效力(potency)的部分损失最小化，可通过准确且一贯的方式实现活性成分的给药。在本发明中还提供经冷冻干燥的药剂学组合物的制备方法及用于多种疾病的治疗的组合物的给药方法。

Description

用于裸脱氧核糖核酸基因疗法的经冷冻干燥的药剂学组合物
技术领域
本发明涉及如下的新的经冷冻干燥的药剂学组合物，即，在冷冻干燥期间，形成均匀且秀丽的(elegant)滤饼并维持脱氧核糖核酸(DNA)质粒的稳定性。
与相关申请有关的交叉引用
本申请要求于2018年7月19日提交且申请号为第62/700655的美国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
序列表
本申请包括通过EFS-Web提出的序列表，其全部内容通过引用结合在本申请中。在2019年7月16日制订的ASCII副本的名称为40319US_CRF_序列表(40319US_CRF_sequencelisting)，大小为125979字节。
背景技术
有实际的临床证据表明，伴随未被病毒或病毒样颗粒(称之为裸“naked”脱氧核糖核酸或核糖核酸(RNA)结构体(constructs))包装(packaged)的核酸结构体(construct)的直接体内(in vivo)传递的基因疗法(gene therapy)可以有效治疗多种疾病。例如，有证据表明，表达人类肝细胞生长因子(HGF)蛋白质的2个异构体(isoform)(即，也被称之为“VM202”的pCK-HGF-X7)的脱氧核糖核酸质粒结构体(construct)的直接肌肉内注射(intramuscular injection)可以有效治疗神经性疼痛(neuropathic pain)。在Ⅱ期临床试验中，若向糖尿病性周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy)患者的小腿肌肉注射VM202，则疼痛明显减轻，若以2周间隔治疗2日，则在3个月内，症状缓解至足以改善生活质量的程度。Kessler et al.，Annals Clin.Transl.Neurology 2(5)：465-478(2015)。相同的上述脱氧核糖核酸质粒结构体也具有有效治疗肌萎缩侧索硬化(ALS，amyotrophiclateral sclerosis)患者。在I期临床试验中，肌萎缩侧索硬化患者的一半左右在给药VM202之后维持了稳定或得到改善的状态，这意味着在1个月、2个月及三个月，分别有47％、50％及24％的对象(subjects)不会经历表示肌萎缩侧索硬化患者的身体功能的肌萎缩侧索硬化功能评定量表修订(ALSFRS-R，Amyotrophic Lateral Sclerosis FunctionalRating Scale-revised)分数的减少或者经历分数的增加，与过去对照组相比，效果更佳显著。Robert L.Sufitet al.，Amyotrophic Lateral Sclerosis and FrontoemporalDegeneration 18：269-278(2017)。
但是，即使用于直接注射的2个反义寡核苷酸药物(鞘内注射(intrathecalinjection)用诺西那生钠(nusinersen)及静脉注射(intravenous injection)用依特立生(eteplirsen)最近得到批准，实质上，几乎没有对人类基因疗法批准的裸脱氧核糖核酸或核糖核酸结构体(construct)。因此，即使对于用于实验室使用的裸核酸的剂型化的数十年的经验，以及对于用于接近体外基因治疗的核酸的剂型化的最近的经验，作为用于直接治疗传递的药剂学产品(pharmaceutical product)，几乎不执行将脱氧核糖核酸剂型化的研究。尤其，几乎不执行对于为了允许在多种保存(storage)条件下的核酸活性成分的稳定性或将用于给药的剂型的均匀重组(reconstitution)而减少所需要的赋型剂(excipients)或污染物负荷(contaminant load)的方法等的研究。这种属性不仅对更好及更具有再现性的基于脱氧核糖核酸药物的治疗效果(therapeutic efficacy)及稳定性极为重要，而且，也同样对扩大药物的生产及分配的经济效果重要。
因此，需要将提供稳定性(stability)、安全性(safety)及经济效果得到提高的基于裸脱氧核糖核酸的药物的药剂学产品的剂型化。
发明内容
根据一实施方式，本发明提供在冷冻干燥期间，维持脱氧核糖核酸结构体(例如，质粒)的稳定性的新的经冷冻干燥的药剂学组合物。具体地，上述剂型(formulation)在冷冻干燥期间减少从更稳定的超螺旋形态(supercoiledform)向稍微稳定的开环(opencircular)及线性形态的脱氧核糖核酸结构体的立体结构变化(conformationalchange)。上述新的经冷冻干燥的剂型可以在在制药学可接受的溶液中实现脱氧核糖核酸结构的均匀重组，从而可以使活性成分完全复原，将效力(potency)的部分损失最小化，可通过准确且一贯的方式实现活性成分的给药。并且，上述新的经冷冻干燥的剂型在冷冻干燥之后可生成均匀且秀丽(elegant)滤饼外观(cake appearance)，由此，可在外观上检查基于脱氧核糖核酸的药物的质量。
在一部分实例中，上述新的经冷冻干燥的剂型包含质粒脱氧核糖核酸，上述药剂学组合物在冷冻干燥之前获取包含如下物质的液体组合物(liquid)组合物：a.第一质粒(firstplasmid)的脱氧核糖核酸；b.磷酸钾缓冲液，PH值范围为7.0至9.0；c.浓度范围为0％至3％(w/v)的甘露醇；d.浓度为0.5％以上且1.1％(w/v)以下的蔗糖；以及e.浓度范围为0.1％至0.9％(w/v)的氯化钠。上述第一质粒可选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组合物。
在一部分实例中，上述第一质粒为VM202。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒(secondplasmid)的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-HGF-X7。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物选自由VM202、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1Ec。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1Ea。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸。上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1X6。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1X10。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pCK-SDF-1α。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10组成的组中。
在一部分实例中，上述液体组合物中的上述质粒脱氧核糖核酸的至少90％呈超螺旋形状。在一部分实例中，上述液体组合物中的上述质粒脱氧核糖核酸的至少92.5％呈超螺旋形状。上述液体组合物中的上述质粒脱氧核糖核酸的至少95％呈超螺旋形状。在一部分实例中，上述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少97％呈超螺旋形状。在一部分实例中，上述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少98％呈超螺旋形状。
在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组(reconstitution)30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少90％维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组(reconstitution)30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少92.5％维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组(reconstitution)30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少95％维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组(reconstitution)30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少97％维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组(reconstitution)30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少98％维持超螺旋状态。
在一部分实例中，在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下保存3日至7日之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少90％维持超螺旋状态。在一部分实例中，在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下保存3日至7日之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少92.5％维持超螺旋状态。在一部分实例中，在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下保存3日至7日之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少95％维持超螺旋状态。
在一部分实例中，在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少80％维持超螺旋状态，在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组之前，在40℃的温度条件下储存10周。
在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物包含液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少90％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物包含液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少92.5％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物包含液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少95％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.1mg/ml至1mg/ml的第一质粒脱氧核糖核酸。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.25mg/ml至0.75mg/ml的第一质粒脱氧核糖核酸。上述液体组合物包含浓度范围为0.4mg/ml至0.6mg/ml的第一质粒脱氧核糖核酸。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为0.5mg/ml的第一质粒脱氧核糖核酸。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.1mg/ml至1mg/ml的第二质粒脱氧核糖核酸。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.25mg/ml至0.75mg/ml的第二质粒脱氧核糖核酸。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.4mg/ml至0.6mg/ml的第二质粒脱氧核糖核酸。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为0.5mg/ml的第二质粒脱氧核糖核酸。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为5mM至15mM的磷酸钾。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为7.5mM至12.5mM的磷酸钾。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为9mM至11mM的磷酸钾。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为10mM的磷酸钾。
在一部分实例中，上述液体组合物包含pH值范围为7.0至8.5的磷酸钾缓冲液。在一部分实例中，上述液体组合物包含pH值范围为7.0至8.0的磷酸钾缓冲液。在一部分实例中，上述液体组合物包含pH值为8.0的磷酸钾缓冲液。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为1.5％(w/v)至3％(w/v)的甘露醇。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为2％(w/v)至3％(w/v)的甘露醇。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为2％(w/v)的甘露醇。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.75％(w/v)至1.1％(w/v)的蔗糖。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.9％(w/v)至1.0％(w/v)的蔗糖。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为1.0％(w/v)的蔗糖。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.1％(w/v)至0.75％(w/v)的氯化钠。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.1％(w/v)至0.6％(w/v)的氯化钠。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.4％(w/v)至0.5％(w/v)的氯化钠。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为0.45％(w/v)的氯化钠。
本发明的一部分实例涉及包含质粒脱氧核糖核酸的经冷冻干燥的药剂学组合物，上述药剂学组合物在经冷冻干燥之前，通过对包含以下物质的液体组合物进行冷冻干燥来获取：a.0.5mg/ml的浓度的第一质粒的脱氧核糖核酸；b.pH值为8.0的10mM的磷酸钾缓冲液；c.2％(w/v)的浓度的甘露醇；d.1.0％(w/v)的浓度的蔗糖；以及e.0.45％(w/v)的浓度的氯化钠，至少95％的质粒脱氧核糖核酸呈螺旋形状，上述质粒脱氧核糖核酸的至少90％在上述经冷冻干燥的药剂学组合物的重组重组后，在25℃的温度条件下储存7日之后，以超螺旋形状形态残存。上述第一质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为VM202。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-HGF-X7。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1Ec。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1Ea。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1X6。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1X10。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pCK-SDF-1α。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx IGF-1X6及pTx-IGF-1X10。
根据本发明的一部分实施方式，本发明设计通过在水(water)中溶解上述经冷冻干燥的药剂学组合物来制备的重组的组合物。
在一部分实例中，上述重组的组合物在450nm中的吸光度(light absorbance)为0.002以下。在一部分实例中，在上述重组的组合物在450nm中的吸光度为0.001或小于0.001。在一部分实例中，上述吸光度在重组的当前测定。在一部分实例中，在上述重组的组合物在450nm中的吸光度在储存经冷冻干燥的药剂学组合物之后，测定10周。
根据本发明的一部分实施形态，本发明涉及包含单位剂量(unit dose)内的质粒脱氧核糖核酸的经冷冻干燥的药剂学组合物，上述药剂学组合物在经冷冻干燥之前，通过对包含以下物质的液体组合物进行冷冻干燥来获取：a.0.5mg/ml的浓度的第一质粒的脱氧核糖核酸；b.pH值为8.0的10mM磷酸钾缓冲液；c.2％(w/v)的浓度的甘露醇；d.1.0％(w/v)的浓度的蔗糖；以及e.0.45％(w/v)的浓度的氯化钠，上述经冷冻干燥的药剂学组合物存在于小瓶内(vial)，上述小瓶包含整体中的2.5mg的质粒脱氧核糖核酸。上述第一质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为VM202。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-HGF-X7。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1Ec。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1Ea。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1X6。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1X10。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为pCK-SDF-1α。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx IGF-1X6及pTx-IGF-1X10组成的组中。
根据本发明的一部分实施方式，本发明涉及通过在水中溶解经冷冻干燥的药剂学组合物来制备的重组的组合物。
根据本发明的一部分实施方式，本发明涉及包括如下步骤的经冷冻干燥的药剂学组合物的制备方法，上述经冷冻干燥的药剂学组合物包含质粒脱氧核糖核酸：制备液体组合物的步骤；以及通过对上述液体组合物进行冷冻干燥来制备经冷冻干燥的药剂学组合物的步骤，上述液体组合物包含：a.第一质粒的脱氧核糖核酸；b.PH值范围为7.0至9.0的磷酸钾缓冲液；c.浓度范围为0％(w/v)至3％(w/v)的甘露醇；d.浓度为0.5％(w/v)以上且1.1％(w/v)以下的蔗糖；以及e.浓度范围为0.1％(w/v)至0.9％(w/v)的氯化钠，上述第一质粒(first plasmid)可选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
在一部分实例中，上述第一质粒为VM202。在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-HGF-X7。在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1X6。在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1X10。在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1Ec。在一部分实例中，上述第一质粒为pTx-IGF-1Ea。在一部分实例中，上述第一质粒为pCK-SDF-1α。
在一部分实例中，上述冷冻干燥的步骤包括：装载上述液体组合物的步骤(i)；冷冻步骤(ii)；第一干燥步骤(iii)；以及第二干燥步骤(iv)。
在一部分实例中，上述装载步骤在5℃的温度条件下执行。
在一部分实例中，上述冷冻步骤在-50℃至-20℃范围内，在温度上升的期间执行。
在一部分实例中，上述第一干燥步骤在-20℃的温度条件下执行。
在一部分实例中，上述第二干燥步骤在-20℃至20℃范围内，在温度上升的期间执行。
在一部分实例中，上述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少90％呈超螺旋形状。在一部分实例中，上述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少92.5％呈超螺旋形状。在一部分实例中，上述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少95％呈超螺旋形状。在一部分实例中，上述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少97％呈超螺旋形状。
在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少90％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少92.5％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少95％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少97％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少98％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。
在一部分实例中，在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下储存3日至7日之后，至少90％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下储存3日至7日之后，至少92.5％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下储存3日至7日之后，至少95％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。
在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟后，至少80％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态，上述经冷冻干燥的药剂学组合物在重组之前，在40℃的温度条件下储存10周。
在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物包含上述液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少90％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物包含上述液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少92.5％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。在一部分实例中，上述经冷冻干燥的药剂学组合物包含上述液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少95％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.1mg/ml至1mg/ml的质粒。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为0.25mg/ml至0.75mg/ml的第一质粒。在一部分实例中，上述液体组合物包含0.4mg/ml至0.6mg/ml的范围的浓度的第一质粒。在一部分实例中，上述液体组合物包含0.5mg/ml的浓度的第一质粒。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为5mM至15mM的的磷酸钾。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为7.5mM至12.5mM的磷酸钾。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为9mM至11mM的磷酸钾。在一部分实例中，上述液体组合物包含10mM的浓度的磷酸钾。
在一部分实例中，上述液体组合物包含pH值范围为7.0至8.5的磷酸钾缓冲液。在一部分实例中，上述液体组合物包含pH值范围为7.0至8.0的磷酸钾缓冲液。在一部分实例中，上述液体组合物包含pH值为8.0的磷酸钾。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为1.5％(w/v)至3％(w/v)的甘露醇。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度范围为2％(w/v)至3％(w/v)的甘露醇。在一部分实例中，上述液体组合物包含2％(w/v)的浓度的甘露醇。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为0.75％(w/v)以上且1.1％(w/v)以下的蔗糖。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为0.9％(w/v)以上且1.1％(w/v)以下的蔗糖。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为1.0％(w/v)的蔗糖。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度在0.1％(w/v)至0.75％(w/v)范围内的氯化钠。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度在0.1％(w/v)至0.6％(w/v)范围内的氯化钠。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度在0.4％(w/v)至0.5％(w/v)范围内的氯化钠。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为0.45％(w/v)的氯化钠。
根据本发明的另一实施方式，本发明涉及治疗疾病的方法，本发明包括向患有疾病的患者给药重组的药物的有效量的步骤，上述重组的药物通过重组本发明的上述经冷冻干燥的药剂学组合物来生成。
在一部分实例中，上述治疗疾病的方法还包括在水中溶解上述经冷冻干燥的药剂学组合物来生成上述重组的药物的步骤。
在一部分实例中，上述重组的药物在450nm(A450)中的吸光度为0.003以下。在一部分实例中，上述吸光度为0.002以下。在一部分实例中，上述吸光度为0.001或小于0.001。
在一部分实例中，上述疾病选自由神经病(neuropathy)、缺血性疾病(ischemicdisease)、肌肉萎缩(muscle atrophy)、血管病(vascular disease)及心脏病(heartdisease)组成的组中。在一部分实例中，上述疾病选自由缺血性肢体病(ischemiclimb disease)、糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)、肌萎缩性侧束硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、周围血管疾病(peripheralvascular disease)及冠心病(coronary artery disease，CAD)组成的组中。
在一部分实例中，上述给药步骤包括上述重组的药物的肌肉注射(intramuscularinjection)。
解决问题的方案
1.定义
只要并未特殊定义，在本发明中所使用的所有技术及科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员一般理解的含义。如在本说明书中使用，以下的术语具有以下的含义。
在本发明中所使用的术语“液体组合物(liquid composition)”是指包含质粒脱氧核糖核酸及至少一个药剂学可接受的赋型剂，如本发明中所记载，为了生成经冷冻干燥的药剂学组合物而可以冷冻干燥的液体形态的组合物。
在本发明中所使用的术语“经冷冻干燥的组合物(lyophilized composition)”或“经冷冻干燥的药剂学组合物(lyophilized pharmaceutical composition)”是指通过冷冻干燥制备的干燥形态的任意组合物或药剂学组合物。“冷冻干燥的(Lyophilizing)”或“冷冻干燥(lyophilization)”是指在真空条件下被冷冻的状态下，在脱水之后广范围进行任意冷冻工序，具有本发明所属技术领域的普通技术人员所理解的含义。经冷冻干燥的组合物为了注射而可以重组。
在本说明书中所使用的术语“重组的(reconstituted)”或“重组(reconstitution)”是指为了保存及储存而复原到之前发生改变的物质的原来形态，例如，再水化(rehydration)，即，复原到之前经冷冻干燥并储存的脱氧核糖核酸质粒剂型的液体状态。本发明的经冷冻干燥的组合物可以在生成适合药剂学给药的稳定溶液的任意水溶液(aqueoussolution)中重组。这种水溶液包含杀菌水(sterilewater)、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(TE，Tris-EDTA)、磷酸盐缓冲溶液(PBS，phosphate-bufferedsaline)、Tris缓冲液及生理盐水(normalsaline)，但并不局限于此。
在本说明书中所使用的术语“分离的(isolated)”或“生物纯化(biologicallypure)”是指如在其原本状态下发现，实质上在物质中没有Z正常伴随的成分的物质。因此，在本发明中所使用的分离的质粒脱氧核糖核酸实质上在如细菌蛋白，脂质或细胞壁成分的原位(insitu)环境条件下不具有正常与质粒脱氧核糖核酸有关的成分。
在本说明书中所使用的术语“VM202”是指在pCK载体(序列5)及pCK载体包含被克隆的肝细胞生长因子-X7(序列13)的还被称为pCK-HGF-X7的质粒脱氧核糖核酸。根据《布达佩斯条约》，VM202于2002年3月12日保藏在韩国微生物保护中心(KCCM)中，保藏号为KCCM-10361。
在本说明书中所使用的术语“肝细胞生长因子的异构体(isoforms of HGF)”是指与在动物中自然产生的肝细胞生长因子多肽的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列的多肽。上述术语包含与任意全长(fulllength)野生型肝细胞生长因子多肽具有至少80％相同的氨基酸序列的多肽，包含自然产生的肝细胞生长因子等位基因变异(allelicvariant)或缺失变体(deletion variant)具有至少80％相同的氨基酸序列的多肽。在本发明中优选使用的肝细胞生长因子的异构体包含选自由全长肝细胞生长因子(full-lengthHGF，flHGF)(作为同义词，fHGF)、缺失变体肝细胞生长因子(deleted variant HGF,dHGF)、NK1、NK2及NK4组成的组中的2个以上的异构体。根据本发明的更加优选的实例，在本发明中记载的方法中所使用的肝细胞生长因子的异构体包含全长肝细胞生长因子(序列1)及缺失肝细胞生长因子(序列2)。
术语“人类全长肝细胞生长因子(human fl HGF)”、“全长肝细胞生长因子”及“全肝细胞生长因子”为了意味着由人类肝细胞生长因子蛋白质氨基酸1-728构成的蛋白质而在本发明中相互交换使用。在序列1中提供全长肝细胞生长因子的序列。
术语“人类缺失肝细胞生长因子(human dHGF)”及“缺失肝细胞生长因子”为了是指通过人类肝细胞生长因子基因的选择性剪接(alte核糖核酸tive splicing)生成的肝细胞生长因子蛋白质的缺失的变体而在本发明中相互交换使用。具体地，“人类缺失肝细胞生长因子”或“缺失肝细胞生长因子”是指从全长肝细胞生长因子序列，在α链(chain)的第一个链域中(三环域)缺失5个氨基酸(F、L、P、S及S)的人类肝细胞生长因子蛋白质。人类缺失肝细胞生长因子为723个氨基酸长度。在序列2中提供人类缺失肝细胞生长因子的氨基酸序列。
在本说明书中所使用的术语“胰岛素样生长因子-1的异构体(isoform of IGF-1)”、“人类胰岛素样生长因子-1异构体(human IGF-1isoform)”或“胰岛素样生长因子-1异构体(IGF-1isoform)”是指与在自然产生的人类pre-pro-胰岛素样生长因子-1多肽中的一个氨基酸序列或其的等位基因变异、剪接变体或缺失变体具有至少80％相同的氨基酸序列的多肽。自然产生的pre-pro-胰岛素样生长因子-1多肽包含I类，Ec(序列25)；II类，Ea(序列27)；I类，Eb(序列29)；及I类，Ea异构体(序列23)。
术语“异构体#1(Isoform#1)”、“I类，Ec异构体(Class I，Ec isoform)”、“I类，胰岛素样生长因子-1Ec异构体(Class I，IGF-1Ec isoform)”或“I类，胰岛素样生长因子-1Ec(Class I，IGF-1Ec)”为了指称在序列25的多肽而在本发明中相互交换使用。
术语“异构体#2(Isoform#2)”、“II类，Ea异构体(Class II，Ea isoform)”、“II类，胰岛素样生长因子-1Ea异构体(Class II，IGF-1Ea isoform)”或“II类，胰岛素样生长因子-1Ea(Class II，IGF-1Ea)”为了指称在序列27的多肽而在本发明中相互交换使用。
术语“异构体#3(Isoform#3)”、“I类，Eb异构体(Class I，Eb isoform)”、“I类，胰岛素样生长因子-1Eb异构体(Class I，IGF-1Eb isoform)”或“I类，胰岛素样生长因子-1Eb(Class I，IGF-1Eb)”为了指称在序列29的多肽而在本发明中相互交换使用。
术语“异构体#4(Isoform#4)”、“I类，Ea异构体(Class I，Ea isoform)”、“I类，胰岛素样生长因子-1Ea异构体(Class I，IGF-1Ea isoform)”或“I类，胰岛素样生长因子-1Ea(Class I，IGF-1Ea)”为了指称序列23的多肽而在本发明中相互交换使用。
在本说明书中所使用的术语“治疗(treatment)”是指(a)一直疾病的症状；(b)缓和疾病的症状及(c)去除疾病的症状中的至少一种。在一部分实例中，本发明的组合物可以治疗与神经病、缺血性疾病、肌肉萎缩或心脏病有关的症状。
在本说明书中所使用的“术语治疗有效剂量(therapeutically effectivedose)”或“有效量(effective amount)”是指给药并发挥出优选效果的剂量(dose)或量(amount)。在本发明的脉络中，治疗有效量(therapeuticallyeffectiveamount)为有效治疗疾病的症状的量。准确的剂量或量依赖于治疗目的，本发明所属技术领域的普通技术人员可以使用现有技术来确认(例如，参照Lloyd(1999)The Art，Science and Technologyof Pharmaceutical Compounding)。
在本说明书中所使用的术语“充分的量(sufficient amount)”是指发挥出所需要的效果的充分的能量。
在本说明书中所使用的术语“简并序列(degenerate sequence)”是指以提供与从参考核酸序列翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列的方式翻译的核酸序列。
2.其他解释规则(Other interpretational conventions)
应当理解，在本发明中所引用的范围包括所引用的终点，是对范围内的所有值的简写(shorthand)。例如，1至50的范围意味着包含选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50组成的组中的任意数字(number)、数字的组合或以下范围。
只要并未其他定义，对于具有一个以上的立体中心的化合物的提及意图各个立体同分异构体及它们的立体同分异构体的所有组合。
3.经冷冻干燥的药剂学组合物
在第一个实施方式中揭示经冷冻干燥的药剂学组合物。上述经冷冻干燥的药剂学组合物包含质粒脱氧核糖核酸，经冷冻干燥前通过对包含以下物质的液体组合物进行冷冻干燥来获取：a.第一质粒的质粒脱氧核糖核酸；PH值范围为7.0至9.0的磷酸钾缓冲液；c.浓度范围为0％(w/v)至3％(w/v)范围的甘露醇；d.浓度为0.5％(w/v)以上且1.1％(w/v)以下的蔗糖；以及e.浓度范围为0.1％(w/v)至0.9％(w/v)的氯化钠。
上述第一质粒(first plasmid)可选自由VM202、pTx-肝细胞生长因子-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
3.1.质粒脱氧核糖核酸
上述液体组合物包含作为药剂学组合物的活性成分的质粒脱氧核糖核酸。上述质粒脱氧核糖核酸可包含用于基因疗法的遗传物质。具体地，上述质粒脱氧核糖核酸可以矫正缺陷基因或转录体的功能，或者，可编码多肽、正义或反义寡核苷酸或核糖核酸(编码或非编码(non-coding)；例如，小干扰核糖核酸(siRNA)、短发夹核糖核酸(shRNA)、微核糖核酸及其反义对应物(例如，安塔够妙(antagoMiR))。包含用于基因疗法的本发明所属技术领域的任意质粒脱氧核糖核酸的剂型属于本发明的范围内。
上述液体组合物可包含上述经冷冻干燥的药剂学组合物的之后的重组能够对上述重组的药物的治疗作用提供有效浓度的浓度中的质粒脱氧核糖核酸。上述质粒脱氧核糖核酸的浓度可根据包括所传递的组合物的量、治疗已经、对象(subject)的年龄及体重、传递方法及给药路径等在内的多种因素调节。
具体地，上述液体组合物可包含0.1mg/ml至5mg/ml、0.1mg/ml至3mg/ml、0.1mg/ml至2mg/ml、0.1mg/ml至1mg/ml、0.25mg/ml至0.75mg/ml、0.4mg/ml至0.6mg/mlmg/ml的浓度或0.5mg/ml的浓度的质粒脱氧核糖核酸。
上述质粒脱氧核糖核酸可以为3000至15000个碱基对、3000至10000个碱基对、3000至9000个碱基对、3000至8000个碱基对、3000至7000个碱基对、3000至6000个碱基对、3000至5000个碱基对、4000至8000个碱基对、4000至7500个碱基对、4000至6000个碱基对、6000至9000个碱基对或7000至8000个碱基对长度的多核苷酸。
3.1.1.载体
在本发明的方法中所使用的质粒脱氧核糖核酸包含具有与典型表达的序列以可工作的方式相连接的一个以上的调节序列(例如，促进剂或增强子)的载体。上述调节序列调节蛋白质(例如，肝细胞生长因子或胰岛素样生长因子-1的一个以上的异构体)的表达。
优选地，编码蛋白质的多核苷酸在表达结构体中与启动子以可进行工作的方式相连接。术语“以可进行工作的方式相连接”是指核酸表达控制序列(nucleic acidexpression control sequence)(如启动子、信号序列或多个转录因子结合部位)的第二个核酸序列之间的功能性连接，其中，表达控制序列对于转录和/或第二个序列相应的核酸的翻译产生影响。
在典型的实例中，与多核苷酸相连接的启动子为了控制多核苷酸的转录，优选地，可以在动物，更优选地，可以在哺乳动物细胞中进行工作，包含哺乳动物细胞的基因组或从哺乳动物病毒衍生的启动子，例如，包含巨细胞病毒(CMV，cytomegalovirus)启动子、腺病毒晚期启动子(adenovirus late promoter)、牛痘病毒7.5K启动子(vaccinia virus 7.5Kpromoter)、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子(metallothionein promoter)、β-肌动蛋白启动子(beta-actin promoter)、人类白细胞介素-2(IL-2)基因启动子、人类干扰素(IFN)基因启动子、人类白细胞介素-4(IL-4)基因启动子、人类淋巴毒素基因启动子(human lymphotoxin gene promoter)及人类GM-CSF基因启动子，但并不局限于此。更优选地，对本发明有用的启动子为人类巨细胞病毒(human CMV，hCMV)或EF1α启动子的前早期(IE，immediately early)基因，最优选地，是从人类巨细胞病毒前早期基因来源的启动子/增强子及来源于包含在ATG启动密码子之前经过序列的外显子1及外显子2的全部序列的5'-非翻译区(UTR，untranslated region)的启动子。
在本发明中所使用的表达盒可包含聚腺苷酸化序列，例如，包含牛生长激素终止剂(bovine growth hormone terminator)(Gimmi，E.R.，et al.，Nucleic Acids Res.17:6983-6998(1989))、SV40来源的聚腺苷酸化序列(SV40-derived polyadenylationsequence)(Schek，N，et al.，Mol.Cell Biol.12:5386-5393(1992))，HIV-1polyA(Klasens，B.I.F.，et al.，Nucleic Acids Res.26:1870-1876(1998))、HIV-1polyA(Klasens，B.I.F.，et al.，Nucleic Acids Res.26:1870-1876(1998))、β-球蛋白A(Gil，A.，et al，Cell 49:399-406(1987))、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)聚合A(Cole，C.N.and T.P.Stacy，Mol.Cell.5Biol.5:2104-2113(1985))或多瘤病毒聚合A(Batt，D.Band G.G.Carmichael，Mol.Cell.Biol.15:4783-4790(1995))，但并不局限于此。
在当前优选实例中，上述载体为pCK、pCP、pVAX1、pTx或pCY。尤其，在优选实例中，上述载体为pCK，其细部事项可从WO 2000/040737及Lee et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.272:230–235(2000)找出，两者的全文均作为参考引用在本发明。根据布达佩斯条约，转化为pCK(Top10-pCK)的肠杆菌已于2003年3月21日保藏在韩国微生物保护中心(KCCM)中(保藏号：KCCM-10476)。根据布达佩斯条约，转化成pCK-VEGF165的大肠杆菌(即，具有VEGF编码序列的pCK载体-Top10-pCK/VEGF165')已于1999年12月27日保藏在韩国微生物保护中心(KCCM)中(保藏号：KCCM-10179)。
上述pCK载体使基因，例如，肝细胞生长因子基因或胰岛素样生长因子-1基因的表达因人类巨细胞病毒(HCMV)的增强子/启动子下得到调节，在Lee et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.272:230(2000)；WO 2000/040737中揭示细部事项，两者的全文均作为参考引用在本发明。pCK载体用于对人体的临床试验，其的稳定性及功效(efficacy)得到了确认(Henry et al.，Gene Ther.18:788(2011))。
在另一优选实例中，上述载体为作为pCK的质粒载体来源的pTx(序列15)。pTx通过pCK的2个的依次连续的诱变(mutagenesis)生成。为了去除卡那霉素抗性基因(Kanamycinresistance gene)和pCK的ColE1之间的不必要的序列而执行第一次缺失诱变(mutagenesis)活动。具体地，使用第一对引物(序列17及序列18)来执行缺失诱变聚合酶链式反应(deletion mutagenesis PCR)。通过排序质粒来确认卡那霉素抗性与ColE1之间的228各碱基对的缺失。之后，为了将人类巨细胞病毒内含子序列的大小最优化而使用第二对引物(序列19及序列20)来执行第二次缺失诱变活动。有IE1外显子1与外显子2之间的人类巨细胞病毒内含子序列(421碱基对)缺失，通过排血确认了上述缺失。
3.1.2.编码人类肝细胞生长因子的质粒脱氧核糖核酸
在一部分实例中，上述质粒脱氧核糖核酸编码人类肝细胞生长因子或其的变体。
肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)为也被公知为散射因子(scatterfactor)或肝素A(hepatopoietin-A)的肝素结合糖蛋白。编码人类肝细胞生长因子的内源基因(endogenous gene)位于染色体7q21.1，包含18个的外显子及17个的内含子(Seki T.，et al.，Gene 102:213-219(1991))。从肝细胞生长因子基因越转录6kb的转录体，之后，合成由728个氨基酸构成的多肽肝细胞生长因子前体(全长肝细胞生长因子)。同时，由723个的氨基酸构成的缺失肝细胞生长因子前体的多肽通过肝细胞生长因子基因的选择性剪接合成。生物学不活性的前体可通过蛋白酶(protease)转换为活性形态的二硫键连接的异二聚体(heterodimer)。在异二聚体中，具有高分子量(high molecular weight)的α链(chain)形成如4个三环域(kringle domains)及血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)的预活化肽区(preactivated peptide region)的N末端发夹环(N-terminal hairpinloop)。由约为80个氨基酸构成的三重二硫键连接的环结构的三环域在蛋白质-蛋白质相互作用中起到重要作用。低分子量(low molecular weight)β链形成失活的丝氨酸蛋白酶样结构域(inactive serine protease-like domain)。由723个的氨基酸构成的缺失肝细胞生长因子是在α链的第一个三环域中缺失5个氨基酸，即，缺失F.L.P.S及S的多肽。
例如，肝细胞生长因子具有包括如下功能的多种生物学功能：功能1)，将上皮细胞(epithelial cell)衍生成管型结构(tubular structure)；功能2)，在体外及体内中，从内皮细胞(endothelial cell)刺激血管形成(vascularization)；功能3)，因其的抗凋亡活性(anti-apoptosis activity)而使肝及肾再生；功能4)，肾、卵巢及睾丸的器官形成(organogenesis)；功能5)，调节骨形成(osteogenesis)；功能6)，刺激红系造血前体细胞(erythroid hematopoietic precursor cell)的生长及分化；以及功能7)，神经细胞轴突发芽(axon sprouting)(Stella，M.C.and Comoglio，P.M.，The International Journalof Biochemistry&Cell Biology 31:1357–1362(1999))。以这些多种功能为基础，编码肝细胞生长因子或肝细胞生长因子的基因或其的变体可以作为治疗剂所开发。
实质上，如美国专利号7812146、8338385及8389492及美国公开号20140296142及20160250291所记载，编码人类肝细胞生长因子的一个以上的异构体的质粒为了治疗多种疾病而开发使用，在本说明书中，其内容通过引用结合在本发明中。上述质粒可用于本发明的揭示内容的多种实例。
具体地，上述质粒包含对于各个异构体编码序列(CDS)的表达调节序列，由此，可以表达肝细胞生长因子的2个以上的异构体。在一部分实例中，例如，上述结构体按(1)表达调节序列；(2)第一个异构体的编码序列；(3)核糖体内部进入位点(IRES，internalribosomal entry site)；(4)第二个异构体的编码序列；以及(5)转录终止序列的顺序包含2个的编码序列之间的核糖体内部进入位点。核糖体内部进入位点可以在核糖体内部进入位点序列中开始进行翻译，来允许从单一结构体表达需要的2个基因。在另一实例中，将肝细胞生长因子的单一异构体加密的多个结构体为了在给药对象中衍生肝细胞生长因子的一个以上的异构体的表达而一同使用。
本发明的优选实例中，包含选择性剪接部位，由此，使用2种以上的不同类型的肝细胞生长因子的异构体，即，同时表达全长肝细胞生长因子及缺失肝细胞生长因子的结构体。已在通过引用结合在本发明的美国专利第7812146号中认证，与编码肝细胞生长因子的1个异构体(在全长肝细胞生长因子或缺失肝细胞生长因子中的一种)的结构体相比，通过选择性剪接编码肝细胞生长因子的2个的异构体(全长肝细胞生长因子及缺失肝细胞生长因子)的结构体具有更高的(几乎250倍)表达效率。在典型的实例中，上述结构体包含：(i)，包含人类肝细胞生长因子基因的外显子1-外显子4的第一序列(序列3)或第一序列的简并序列(degenerate sequence)；(ii)，包含人类肝细胞生长因子基因的内含子4的第二序列(序列6)或第二序列的片段(fragment)；以及(iii)包含人类肝细胞生长因子基因的外显子5-外显子18的第三序列(序列4)或第三序列的简并序列。通过外显子4与外显子5之间的选择性剪接，可从结构体生成肝细胞生长因子的2个的异构体(全长肝细胞生长因子及缺失肝细胞生长因子)。
在一部分实例中，上述结构体包含全部序列的内含子4。在一部分实例中，上述结构体包含内含子4的片段(fragment)。在优选实例中，上述结构体包含选自由序列7至序列14组成的组中的核苷酸序列。序列7的核苷酸序列与编码全长肝细胞生长因子及缺失肝细胞生长因子的7113bp多核苷酸相应，包含内含子4的整个序列。序列8至序列14的核苷酸序列与编码全长肝细胞生长因子及缺失肝细胞生长因子的多核苷酸相应，包含内含子4的片段(fragment)。
包含与人类肝细胞生长因子的外显子1-外显子18及人类肝细胞生长因子基因的内含子4相应的互补脱氧核糖核酸(cDNA)或其的片段(fragment)的多种核酸结构体被命名为“肝细胞生长因子-X”，接着，如在美国专利第7812146号中所记载，附有识别号。由申请人测试的肝细胞生长因子-X包含肝细胞生长因子-X1(序列7)、肝细胞生长因子-X2(序列8)、肝细胞生长因子-X3(序列9)、肝细胞生长因子-X4(序列10)、肝细胞生长因子-X5(序列11)、肝细胞生长因子-X6(序列12)、肝细胞生长因子-X7(序列13)及肝细胞生长因子-X8(序列14)，但并不局限于此。
已认证，通过外显子4与外显子5之间的选择性剪接，可从各个结构体生成肝细胞生长因子的2个的异构体(即，全长肝细胞生长因子及缺失肝细胞生长因子)。并且，在多个肝细胞生长因子结构体中，如美国专利第7812146号所记载，肝细胞生长因子-X7表示肝细胞生长因子的2个的异构体(即，全长肝细胞生长因子及缺失肝细胞生长因子)的最高水平的表达，其全部内容通过引用结合在本发明中。因此，包含肝细胞生长因子-X7的核酸结构体可以在本发明的优选实例中使用。
尤其，在优选实例中，包含肝细胞生长因子-X7表达序列的pCK质粒在本发明的方法中作为核酸结构体使用。具体地，可以使用pCK-肝细胞生长因子-X7(也称之为“VM202”)。pCK-肝细胞生长因子-X7为在pCK载体(序列5)及pCK载体包含克隆的肝细胞生长因子-X7(序列13)的结构体。根据布达佩斯条约，pCK-肝细胞生长因子-X7已于2002年3月12日保藏在韩国微生物保护中心(KCCM)中。
在本发明中记载的方法中所使用的肝细胞生长因子异构体的氨基酸序列及核苷酸序列还包含实质上与野生型人类肝细胞生长因子异构体的序列相同的氨基酸序列及核苷酸序列。野生型人类肝细胞生长因子异构体的氨基酸序列或核苷酸序列与序列最大程度整列来包含具有至少80％相同性，更优选地，具有至少90％的相同性，最优选地，具有至少95％的相同性的序列。本发明所属技术领域的普通技术人员公知用于比较的序列整列方法。具体地，在国家生物信息中心(NBCl，National Center for Biological Information，Bethesda，Md.)网页的国家生物信息中心基本的局部比对搜索工具(BLAST，Basic LocalAlignment Search Tool)中揭示并与序列分析程序blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx相连接来使用的比对算法(alignment algorithm)可用于确定同源性。
3.1.3.编码胰岛素样生长因子-1的质粒脱氧核糖核酸
在一部分实施例中，上述质粒脱氧核糖核酸变大人类胰岛素样生长因子-1或其的变体。
胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor 1，IGF-1)是对儿童的成长起到重要作用，且对成人具有蛋白同化作用(anabolic effects)的胰岛素分子结构类似的激素。包含经由几乎90kb的基因组脱氧核糖核酸的6个的外显子(外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5及外显子6(6-1及6-2))。外显子1及外显子2为相互排他性前导序列(leader)外显子，分别具有可变性使用的多个启动子部位。并且，胰岛素样生长因子-1基因为了生成多个转录体变体(transcript variant)而不同地进行剪接。各个转录体变体编码具有可变信号肽前导序列(variable signaling peptide leader sequence)的不同的pre-pro-胰岛素样生长因子-1蛋白质(胰岛素样生长因子-1异构体)。但是，所有转录体异构体在加工之后发生使用相同受体的相同成熟的70-氨基酸胰岛素样生长因子-1肽。上述pre-pro-胰岛素样生长因子-1肽在其的前导序列(leader)或信号、序列及其的羟基(C)末端不相同。外显子1或外显子2的插入相互排他性，其中的一个起到pre-pro-胰岛素样生长因子-1肽的前导序列的功能，其他前导序列外显子生成其他5'-非翻译区。上述pre-pro-胰岛素样生长因子-1多肽在转录后经过蛋白质分解性切断去除前导序列及E-肽羟基末端来生成成熟的70-氨基酸胰岛素样生长因子-1。
包含外显子1的转录体被称为1类转录体(例如，I类，Ec；I类，Eb；及I类，Ea)，相反，包含外显子2转录体被称为2类转录体(例如，II类，Ea)。几乎所有pre-pro肽在外显子3来源的信号传递肽(signaling peptide)包含27个氨基酸，上述外显子具有从包含外显子1或外显子2衍生的剩余信号序列。在生成22个氨基酸的更短信号传递肽的外显子3内，少数的转录体利用不同的转录开始位点。外显子3及外显子4不发生改变，并编码成熟的胰岛素样生长因子-1肽的B、C、A及D域。外显子4编码成熟的胰岛素样生长因子-1肽的3分之2。上述人类Eb肽仅有外显子4及5构成，相反，Ec包含外显子4、外显子5及外显子6。
选择性剪接及相互排他性开始导致不同的pre-pro-胰岛素样生长因子-1多肽(即，胰岛素样生长因子-1异构体)生成。具体地，包含至少外显子1、外显子3、外显子4、外显子5及外显子6的片段的I类，Ec胰岛素样生长因子-1异构体(序列25)从包含序列26的序列的转录体生成。包含至少外显子2、外显子3、外显子4及外显子6的II类，Ea胰岛素样生长因子-1异构体(序列27)从包含序列28的序列的转录体生成。至少包含外显子1、外显子3、外显子4及外显子5的I类，Eb胰岛素样生长因子-1异构体(序列29)从包含序列30的序列的转录体生成。至少包含外显子1、外显子3、外显子4及外显子6的片段的I类，Ea胰岛素样生长因子-1异构体(序列23)从包含序列24的序列的转录体生成。
从多种转录体衍生的成熟的胰岛素样生长因子-1蛋白质不相同，但是，多种转录体异构体具有不同的调节作用。上述变体形态具有呈现出对于不同的稳定性、结合伴侣(binding partners)及异构体的主要调节作用的活性。具有外型1的I类异构体以自分泌(autocrine)、旁分泌(paracrine)形态分泌，具有外显子2的II类异构体以内分泌(endocrine)形态分泌，异构体的生物学重要性并不分明。II类转录体包含与有效分泌有关的典型的信号肽基序，相反，I类转录体以具有有可能妨碍分泌的更长信号传递肽的表达为基础。
如美国申请的16/513560号和/或第16/513564号所记载，编码人类胰岛素样生长因子-1的一个以上的异构体的质粒为了治疗神经病(neuropathy)而开发并试验，其全部内容通过引用结合在本发明中。上述质粒可在本发明的揭示内容的多种实例中使用。
具体地，在一部分实例中，上述质粒包含胰岛素样生长因子-1异构体中的一个编码序列。例如，上述脱氧核糖核酸结构体可包含编码I类，Ea(序列24)；I类，Eb(序列30)；I类，Ec(序列26)；或II类，Ea(序列28)的序列。
在一部分实例中，上述脱氧核糖核酸结构体包含对于各个异构体编码序列(CDS)的表达调节序列，由此，是可表达一个以上的胰岛素样生长因子-1异构体的作为脱氧核糖核酸结构体的双重表达结构体。在一部分实例中，例如，上述结构体按(1)表达调节序列；(2)第一个异构体的编码序列；(3)核糖体内部进入位点；(4)第二个异构体的编码序列；以及(5)转录终止序列的顺序包含2个的编码序列之间的核糖体内部进入位点，核糖体内部进入位点在核糖体内部进入位点序列开始进行翻译，允许从单一转录体表达2个蛋白质生成物。在另一实例中，分别编码胰岛素样生长因子-1的单一异构体的多个结构体为了在给药对象中衍生胰岛素样生长因子-1的一个以上的异构体的表达而一同使用。
在优选实例中，通过包含选择性剪接部位来同时表达脱氧核糖核酸结构体2个以上的胰岛素样生长因子-1异构体，例如，(i)I类，Ec异构体(Isoform#1)及II类，Ea异构体(Isoform#2)；(ii)I类，Ec异构体(Isoform#1)及I类，Eb异构体(Isoform#3)；(iii)I类，Ec异构体(Isoform#1)及I类，Ea异构体(Isoform#4)；(iv)II类，Ea异构体(Isoform#2)及I类，Eb异构体(Isoform#3)；(v)II类，Ea异构体(Isoform#2)及I类，Ea异构体(Isoform#4)；(vi)I类，Eb异构体(Isoform#3)及I类，Ea异构体(Isoform#4)。
例如，脱氧核糖核酸结构体可包含：(i)包含人类胰岛素样生长因子-1基因的外显子1、外显子3及外显子4的第一序列(序列31)或第一序列的简并序列；(ii)包含人类胰岛素样生长因子-1基因的内含子4的第二序列(序列32)或第二序列的片段；(iii)包含人类胰岛素样生长因子-1基因的外显子5及外显子6-1的第三序列(序列33)或第三序列的简并序列；(iv)包含人类胰岛素样生长因子-1基因的内含子5的第四序列(序列34)或第二序列的片段；以及(v)包含人类胰岛素样生长因子-1基因的外显子6-2的第五序列(序列35)或第五序列的简并序列。内含子4及内含子5可以被选择性地剪接，结果，生成胰岛素样生长因子-1的2个的异构体(例如，I类，Ec及I类，Ea)。
在一部分实例中，脱氧核糖核酸结构体与表达一个以上的胰岛素样生长因子-1异构体的能力有关地在体外和/或体内中进行试验。在优选的实例中，选择均可表达I类，Ec及I类，Ea胰岛素样生长因子-1异构体的脱氧核糖核酸结构体。
包含(i)人类胰岛素样生长因子-1基因的外显子1-6及(ii)人类胰岛素样生长因子-1基因的内含子4及内含子5或内含子4及与内含子5的多个片段相应的互补脱氧核糖核酸的多种NA结构体根据识别号被命名为“胰岛素样生长因子-1X”。由申请人员进行试验的胰岛素样生长因子-1X结构体包含胰岛素样生长因子-1X1、胰岛素样生长因子-1X2、胰岛素样生长因子-1X3、胰岛素样生长因子-1X4、胰岛素样生长因子-1X5、胰岛素样生长因子-1X6、胰岛素样生长因子-1X7、胰岛素样生长因子-1X8、胰岛素样生长因子-1X9及胰岛素样生长因子-1X10，但并不局限于此。在试验的结构体中，确认了胰岛素样生长因子-1X6及胰岛素样生长因子-1X10均表达I类，Ec及I类，Ea胰岛素样生长因子-1异构体。
在优选实例中，使用胰岛素样生长因子-1X6(序列21)或胰岛素样生长因子-1X10(序列22)。在胰岛素样生长因子-1X6(序列21)及pCK载体克隆的胰岛素样生长因子-1X10(序列22)分别被命名为pCK-胰岛素样生长因子-1X6及pCK-胰岛素样生长因子-1X10。根据《布达佩斯条约》，转化成pCK-胰岛素样生长因子-1X6的大肠杆菌细胞(DH5α_pCK-IGF1 X6)于2018年5月30日保藏在韩国典型培养物保藏中心(Korea Collection for TypeCultures，KCTC，韩国生物科学与技术研究所(KRIBB)，56212，全罗北道井邑市立新街181)，保藏号为KCTC13539BP。根据《布达佩斯条约》，转化成pCK-胰岛素样生长因子-1X10的大肠杆菌细胞(DH5α_pCK-IGF1 X10)于2018年5月30日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KoreaCollection for Type Cultures，KCTC，韩国生物科学与技术研究所(KRIBB)，56212，全罗北道井邑市立新街181)，保藏号为KCTC 13540BP。
在一部分实例中，pTx质粒包含胰岛素样生长因子-1X6(即，pTx-IGF-1X6)或胰岛素样生长因子-1X10(即，pTx-IGF-1X10)。例如，在从在5'中的ClaI酶及在3'中的Sal1酶分解的pTx中，可使用通过绑扎(ligating)胰岛素样生长因子-1X10来生成的pTx-IGF-1X10(序列16)。
在一部分实例中，pTx质粒包含胰岛素样生长因子-1Ec或胰岛素样生长因子-1Ea。例如，在pTx中，通过绑扎胰岛素样生长因子-1Ec(序列26)来生成pTx-IGF-1Ec，在pTx中，通过绑扎胰岛素样生长因子-1Ea(序列24)来生成pTx-IGF-1Ea。质粒分别表达胰岛素样生长因子-1Ec异构体(序列25)或胰岛素样生长因子-1Ea异构体(序列23)。
编码在本发明中所记载的胰岛素样生长因子-1异构体的胰岛素样生长因子-1异构体或质粒可以从野生型人类胰岛素样生长因子-1异构体变形。当变形的序列与野生型人类胰岛素样生长因子-1异构体序列最大程度比对时，变形的序列可包含具有至少80％的相同性，更优选地，具有至少90％的相同性，最优选地，具有至少95％的相同性的序列。本发明所属技术领域的普通技术人员公知用于比较的序列整列方法。具体地，在国家生物信息中心(NBCl，National Center for Biological Information，Bethesda，Md.)网页的国家生物信息中心基本的局部比对搜索工具(BLAST，Basic Local Alignment Search Tool)中揭示并与序列分析程序blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx相连接来使用的比对算法(alignment algorithm)可用于确定同源性。
3.1.4编码基质细胞衍生因子1α的质粒脱氧核糖核酸
也被公知为C-X-C基序趋化因子12(C-X-C motif chemokine 12，CXCL12)的基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)是通过人类染色体10号的CXCL12基因编码的趋化因子蛋白质。这在众多细胞组织及细胞类型中非常普遍地(ubiquitously)表达。基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)及基质细胞衍生因子1β(SDF-1β)为属于趋化因子(chemokine)族的小细胞因子(cytokine)，它们的成员使白血球活性化并经常通过如脂多糖(lipopolysaccharide)、肿瘤坏死因子(TNF)或白细胞介素-1(IL1)的促炎性(proinflammatory)刺激衍生。基质细胞衍生因子1通过相同的基因的选择性剪接来生成为基质细胞衍生因子1α/CXCL12a及基质细胞衍生因子1β/CXCL12b的2个形态。
如全部内容通过引用结合在本发明的美国专利第15/514244号中所记载，编码人类基质细胞衍生因子1的一个以上的异构体的基质为了治疗末梢血管疾病而被开发并试验。具体地，当编码基质细胞衍生因子1α的多核苷酸与编码人类肝细胞生长因子的多核苷酸一同给药时，有效促进血管内皮细胞(vascular endotherlial cell)移动及血管形成(angiogenesis)。
编码基质细胞衍生因子1的一个以上的异构体的质粒可以在本发明的内容的多个实例中使用。在一部分实例中，使用编码美国专利第15/514244号中所揭示的一个以上的的基质细胞衍生因子1的质粒。在一部分实例中，使用包含基质细胞衍生因子1α的编码序列的质粒。在一部分实例中，使用包含基质细胞衍生因子1β的编码序列的质粒。在一部分实例中，均使用基质细胞衍生因子1α及基质细胞衍生因子1β。在特定实例中，使用包含序列36的序列的质粒。
3.2.缓冲液(Buffer)
液体组合物为了维持药剂学组合物的pH而还包含缓冲液(buffer)。上述缓冲液(buffer)可包含为本发明所属技术领域中的缓冲液化合物，例如，三羟甲基甲胺基丙磺酸，N,N-二羟乙基甘氨酸(Bicine)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，三羟甲基甲基甘氨酸(Tricine)，三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPSO)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，TES，MPOS，哌嗪-1,4-二乙磺酸，甲胂酸钠(Cacodylate)或2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)。上述缓冲液(buffer)可包含柠檬酸(citric acid)、磷酸一钾(monopotassium phosphate)、硼酸(boric acid)或二乙基巴比妥酸(diethyl barbituric acid)。上述缓冲液可以为磷酸缓冲盐溶液(PBS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸(TRIS/EDTA)缓冲液。上述缓冲液可以为其他磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffers)可以包含磷酸二氢钠(monobasic dihydrogen phosphate)与其磷酸氢二钾(dibasic monohydrogen phosphate)的混合物。
具体地，上述缓冲液(buffer)可以为磷酸钾缓冲液。上述磷酸钾缓冲液可包含浓度为5mM至15mM、7.5mM至12.5mM、9mM至11mM或10mM的磷酸钾。
在上述液体组合物中所包含的缓冲液的pH值可以为pH7至pH9。在一部分实例中，上述pH值为7.0至8.5或8.0。在一部分实例中，上述pH值为7.0至8.0。
在一部分实例中，上述液体组合物包含PH值7至pH值9的7.5mM至12mM磷酸钾缓冲液。在一部分实例中，上述液体组合物包含pH值7.0至pH值8.0的7.5mM至12mM的磷酸钾缓冲液。在一部分实施例中，上述液体组合物包含pH值7.0至pH值8.5的9mM至11mM的磷酸钾缓冲液。在一部分实例中，上述液体组合物包含pH值8.0的10mM磷酸钾缓冲液。
3.3.碳水化合物(Carbohydrate)
在经冷冻干燥的药剂学组合物中，在冷冻干燥之前，质粒脱氧核糖核酸的稳定性可通过包含稳定量(stabilzing amount)的碳水化合物的水溶液(aqueous solution)将质粒脱氧核糖核酸剂型化来增加。上述碳水化合物可以为甘露醇(mannitol)或蔗糖(sucrose)。
可向液体组合物添加上述碳水化合物，以具有约0.05％至约30％、约0.1％至约15％、约0.2％至约15％、约0.2％至约10％、约0.5％至约10％、约1％至约5％、约1％至约3％、约0.75％及1.1％、约0.9％及1.1％、约1.0％或约1.1％的碳水化合物的最终浓度。
在一部分实例中，上述液体组合物具有大于0.1％及小于15％、大于0.2％及小于10％、大于0.3％及小于7.5％、大于0.5％及小于5％、大于0.5％及小于3％、大于0.5％及小于2％、大于0.5％及小于1.1％、大于0.75％及小于1.1％、大于0.9％及小于1.1％或1.0％的至少一个的碳水化合物的最终浓度。
具体地，上述液体组合物可具有约0.05％至约30％、约0.1％至约15％、约0.2％至约15％、约0.2％至约10％、约0.5％至约10％、约1％至约5％、约1％至约3％、约0.75％至约1.1％、约0.9％至约1.1％或约1.0％的蔗糖的最终浓度。
在一部分实例中，上述液体组合物具有大于0.1％及小于15％、大于0.2％及小于10％、大于0.3％及小于7.5％、大于0.5％及小于5％、大于0.5％及小于3％、大于0.5％及小于2％、大于0.5％及小于1.1％、大于0.75％及小于1.1％、大于0.9％及小于1.1％或1.0％的蔗糖的最终浓度。
在一部分实例中，上述液体组合物具有小于5％、小于4％及小于3％的甘露醇的最终浓度。在一部分实例中，上述液体组合物具有0％至10％、1％至9％、2％至7.5％、2％至3％、2％至5％、2％至4％、0％至3％、0％至2％、1％至2％、1.5％至3％或2％的甘露醇的最终浓度。
在一部分实例中，上述液体组合物具有大于0％及小于10％、大于0％及小于7.5％、大于0％及小于5％、大于0％及小于4％、大于0％及小于3％或大于0％及2.5％或大于1％及小于2.5％的甘露醇的最终浓度。
在一部分实例中，上述液体组合物具有大于0.5％及小于1.1％的蔗糖的最终浓度，具有大于0％及小于3％的甘露醇的最终浓度。在一部分实例中，上述液体组合物具有0.7％至1.1％的蔗糖的最终浓度，具有1.5％至3％或2％的甘露醇的最终浓度。在一部分实例中，上述液体组合物具有0.9％至1.1％的蔗糖的最终浓度及1.5％至3％或2％甘露醇的最终浓度。在一部分实例中，上述液体组合物具有在1.0％中蔗糖的最终浓度及1.5％至3％,2％至3％或2％的甘露醇的最终浓度。
在一部分实例中，上述组合物使用其他碳水化合物。碳水化合物可以为如蔗糖(sucrose)、葡萄糖(glucose)、乳糖(lactose)、海藻糖(trehalose)、阿拉伯糖(arabinose)、戊糖(pentose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、半乳糖(galactose)、己糖(hexose)、艾杜糖(idose)、甘露糖(mannose)、塔洛糖(talose)、庚糖(heptose)、果糖(fructose)、葡萄糖酸(gluconic acid)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、甲基α-吡喃葡萄糖苷(methyl a-glucopyranoside)、麦芽糖(maltose)、异抗坏血酸(isoascorbicacid)、抗坏血酸(ascorbic acid)、内酯(lactone)、山梨糖(Sorbose)、葡糖二酸(glucaricacid)、赤藓糖(erythrose)、苏糖(threose)、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、赤藓酮糖(erythrulose)、核酮糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)、阿洛酮糖(psicose)、塔格糖(tagatose)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid)、半乳糖醛酸(galacturonic acid)、甘露糖醛酸(mannuronic acid)、氨基葡萄糖(glucosamine)、半乳糖胺(galactosamine)、神经氨酸(neuraminic acid)、阿拉伯聚糖(arabinans)、果聚糖(fructans)、岩藻聚糖(fucans)、半乳聚糖(galactans)、半乳糖醛酸(galacturonans)、葡聚糖(glucans)、甘露聚糖(mannans)、木聚糖(xylans)、果聚糖(levan)、岩藻依聚糖(fucoidan)、角叉菜胶(carrageenan)、半乳卡罗聚糖(galactocarolose)、果胶(pectins)、果胶酸(pectic acids)、直链淀粉(amylose)、支链淀粉(pullulan)、糖原(glycogen)、胶淀粉(amylopectin)、纤维素(cellulose)右旋糖酐(dextran)、环糊精(cyclodextrin)、石耳多糖(pustulan)、几丁质(chitin)、琼脂糖(agarose)、(keratin)、软骨素(chondroitin)、皮肤素(dermatan)、透明质酸(hyaluronic acid)、海藻酸(alginic acid)、黄原胶(xantham gum)或淀粉(starch)的单糖、寡糖或多糖。
3.4.盐(Salt)
上述液体组合物还包含盐。上述盐可以为氯化钠或氯化钾。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度大于0.1％及小于0.9％、大于0.25％及小于0.75％、大于0.4％及小于0.6％、大于0.4％及小于0.5％的浓度或0.45％的盐。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为0.1％至0.9％、0.1％至0.6％、0.25％至0.75％、0.4％至0.6％、0.4％至0.5％或0.45％的盐。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度大于0.1％及小于0.9％、大于0.25％及小于0.75％、大于0.4％及小于0.6％、大于0.4％及小于0.5％或0.45％的氯化钠。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为0.1％至0.9％、0.1％至0.6％、0.25％至0.75％、0.4％至0.6％、0.4％至0.5％或0.45％的氯化钠。
在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度大于0.1％及小于0.9％、大于0.25％及小于0.75％、大于0.4％及小于0.6％、大于0.4％及小于0.5％或0.45％的氯化钾。在一部分实例中，上述液体组合物包含浓度为0.1％至0.9％、0.25％至0.75％、0.4％至0.6％、0.4％至0.5％或0.45％的氯化钾。
在一部分实例中，上述组合物使用其他盐(salt)。盐(salt)可以为一价阳离子卤化物盐(monovalent cationic halide salt)(例如，氯化钠(sodium chloride)、氯化钾(potassium chloride)、溴化钠(sodium bromide)、氯化锂(lithium chloride)、碘化钠(sodium iodide)、溴化钾(potassium bromide)、溴化锂(lithium bromide)、氟化钠(sodium fluoride)、氟化钾(potassium fluoride)、氟化锂(lithium fluoride)和/或碘化锂(lithium iodide))及二价(divalent)或三价(trivalent)盐(例如，氯化钙(calciumchloride)、氯化镁(magnesium chloride)、硫酸钙(calcium sulfate)、硫酸钠(sodiumsulfate)、硫酸镁(magnesium sulfate)、三氯化铬(chromium trichloride)、硫酸铬(chromium sulfate)、柠檬酸钠(sodium citrate)、氯化铁(III)(Iron(III)chloride)、氯化钇(III)(Yttrium(III)chloride)、磷酸钾(potassium phosphate)、硫酸钾(potassiumsulfate)、氯化钾(potassium chloride)、醋酸钠(sodium acetate)、磷酸钠(sodiumphosphate)、磷酸钾(potassium phosphate)、氯化亚铁(ferrous chloride)、氯化铁(ferric chloride))或它们的组合。
4.冷冻干燥条件
本发明的经冷冻干燥的组合物通过对本发明中记载的液体组合物进行冷冻干燥来生成。上述液体组合物可以在本发明所属技术领域中公知的标准冷冻干燥条件或其的变形下经冷冻干燥。
对本发明的液体组合物进行冷冻干燥的方法可包括：步骤(a)，在约5℃至约-50℃的开始温度条件下装载装有液体组合物的容器；步骤(b)，通过零下的温度(例如，-10℃至-50℃)的温度条件冷却(cooling)脱氧核糖核酸剂型；以及步骤(c)，实际使脱氧核糖核酸剂型干燥。本发明的脱氧核糖核酸剂型的冷冻干燥条件，例如，温度及持续时间可以考虑对冷冻干燥参数产生影响的因素，例如，所使用的冷冻干燥机器的类型、所使用的脱氧核糖核酸的量及所使用的容器的大小来由本发明所属技术领域的普通技术人员进行调节。
在一部分实例中，步骤(b)冷却(cooling)及步骤(c)干燥在改变温度的情况下执行。例如，可将温度从-50℃上升至-40℃、从-50℃上升至-30℃、从-50℃上升至-20℃，从-50℃上升至-10℃或从-50℃上升至0℃并执行冷冻(freezing)步骤。在一部分实例中，冷冻步骤可以将温度从-40℃减少至-50℃，从-30℃减少至-50℃，从-20℃减少至-50℃，从-10℃减少至-50℃，从0℃减少至-50℃或从5℃减少至-50℃并执行。在一部分实例中，冷冻步骤在将温度减少之后提升温度并执行。
当一部分非晶生成物(如甘露醇或甘氨酸)第一次被冷冻时，将形成具有不完全结晶化的亚稳定(metastable)游离状态。这种产品可以从称为退火(annealing)的热处理工序(thermaltreatmentprocess)获益。在进行退火期间，产品温度为了获得更完整的结晶化而循环(cycled)(例如，几小时内，从-40℃上升至-20℃，之后，再次下降至-40℃；从-50℃上升至-20℃并维持2小时，之后，导入真空；或者从-50℃上升至-20℃，之后，再次下降至-50℃)。退火具有更大的结晶成长和与此相应的更短的干燥时间的追加优点。在非晶相(amorphousphase)中捕获的水(water)可以在第二次干燥期间被去除。
在一部分实例中，干燥步骤按(i)第一次干燥步骤及(ii)第二次干燥步骤的两步骤执行。
在一部分实例中，第一次干燥维持温度或者提升或降低温度并执行。在一部分实例中，将温度维持在-50℃、-40℃、-30℃、-20℃、-10℃或0℃并执行第一次干燥。在一部分实例中，第二次干燥维持温度或者提升或降低温度并执行。在一部分实例中，第二次干燥可将温度从-50℃上升至20℃、从-40℃上升至20℃、从-30℃上升至20℃、从-20℃上升至20℃、从-10℃上升至20℃、从-50℃上升至10℃、从-40℃上升至10℃、从-30℃上升至10℃、从-20℃上升至10℃、从-10℃上升至10℃并执行。
在冷冻干燥工序期间，有可能发生相分离(phaseseparation)。例如，纯结晶相(crystalline phase)可以与饱和非晶相(amorphus phase)分离。结晶相(crystallinephase)可包含冰或其他任意结晶化赋型剂。因此，在第一次干燥期间，纯冰相将除其他结晶相及任意饱和非晶相之外的部分去除。为了有效去除维持滤饼结构及脱氧核糖核酸稳定性并不发生结合的水而可以调节第一次干燥条件。第一次干燥(升华)是在比产品的临界崩溃温度更低的更清爽的温度环境下执行的缓慢工序。升华为了推进从固体向气体的相变化而需要热能。当对产品进行冷冻干燥(freeze drying)时，均需要考虑传导(conduction)、对流(convection)及辐射(radiation)三种热传递(heattransfer)方法。
各个液体组合物具有固有的临界温度(critical temperature)。为了避免发生崩溃，在第一次干燥过程中，组合物需要维持小于上述临界温度的温度条件。温度依赖于病边界面中的蒸气压，结果，上述蒸气压依赖于向组合物的热传递速度(通过调节架子温度来控制)及系统真空等级设定点。在第一次干燥期间，系统压力和架子温度以计算适当产品温度的方式组合设定及控制。若设定温度及压力参数，则之后继续执行第一次干燥，直到所有冰晶完成升华。
除在第一次干燥期间升华的游离的(free)冰之外，留有与生成物相结合的相当量的水分子。上述水分子为在第二次干燥期间被去除(解析)的水。所有游离的并在第一次干燥期间被去除，因此，没有融化或崩溃的隐患，产品的温度将显著增加。实质上，第二次干燥在进行第一次步骤期间开始，在升温(elevatedtemperature)(典型地，20℃至50℃范围)中，解析(desorption)将更迅速地进行。第二次干燥速度依赖于产品温度。系统真空可以继续保持与进行第一次干燥期间所使用的相同的水平，低的真空水平不会减少第二次干燥时间。
继续进行第二次干燥，直到为了生成物长时间储存而具有可接受的水分含量。根据适用，典型地，完全干燥的产品的水分含量为0.5％至3％。在大部分情况下，产品越干燥，储存寿命(shelflife)越长。但是，实质上，特定复合生物学产品为了获得最优的储存结果而过度干燥，因此，需要适当控制第二次干燥工序。
第二次干燥步骤可将温度从-50℃上升至20℃、从-40℃上升至20℃、从-30℃上升至20℃、从-20℃上升至20℃、从-10℃上升至20℃、从-50℃上升至10℃、从-40℃上升至10℃、从-30℃上升至10℃、从-20℃上升至10℃、从-10℃上升至10℃并执行。
5.在单位剂量中经冷冻干燥的组合物
本发明的另一实施方式为在单位剂量(unit dose)中的经冷冻干燥的药剂学组合物。在一部分实例中，单位剂量形态(unit dosage form)为小瓶(vial)、安瓿(ampule)、瓶(bottle)或预装注射器(pre-filled syringe)。在一部分实例中，单位剂量包含约50μg至1g的质粒脱氧核糖核酸、100μg至1g的质粒脱氧核糖核酸、100μg至100mg的质粒脱氧核糖核酸、1mg至100mg的质粒脱氧核糖核酸、10mg至100mg的质粒脱氧核糖核酸或10mg至50mg的质粒脱氧核糖核酸。单位剂量可包含约10μg、50μg、100μg、1mg、10mg、100mg或1g的质粒脱氧核糖核酸。上述单位剂量形态可包含0.01mg、0.1mg、0.2mg、0.25mg、0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、8mg、10mg、12.5mg、16mg、24mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg或200mg的质粒脱氧核糖核酸。
在典型地实例中，单位剂量形态为包含在重组后适合给药的50mg、10mg、7.5mg、5mg、1mg、100μg或50μg的经冷冻干燥的药剂学组合物的小瓶。上述给药包括使用分别包含上述预先确定量的药剂学组合物的预装注射器(preloaded syringes)、自动注射器(auto-injectors)及自动注射笔(auto-inject pens)来进行的皮下(subcutaneous)、皮内(intradermal)或肌肉内(intramuscular)给药。
容器(container)内的单位剂量可基于多种因素，例如，活性成分(activeingredient)(例如，质粒脱氧核糖核酸)、治疗的疾病、对象(subject)、路径(route)及给药方法来确定。单位剂量看基于包括临川试验的体外或体内研究来确定。
容器(container)内的单位剂量可以在多种温度(例如，室温至约-180℃，优选地，约2-8℃至约-80℃，更优选地，约-20℃至约-80℃，最优选地，约-20℃)条件下长时间密封及储存。
优选地，储存于容器的经冷冻干燥的脱氧核糖核酸组合物在约2-20℃至约-80℃的范围内，在至少1个月、3个月、6个月或1年内不会丧失显著活性(significant acitivty)并保持稳定。保存时间可以为数个月、1年、5年、10年、15年或最大20年。优选地，上述剂型(preparation)至少在约3年内稳定。
6.经冷冻干燥的组合物的特征
本发明作为药剂学产品，提供具有一个以上的需要的特性的经冷冻干燥的药剂学组合物。上述特性在多种储存条件下包含活性成分的稳定性及效力(potency)、滤饼形成(cake formation)、用于给药的剂型(formulation)的均匀重组(reconstitution)及少量污染等。在本发明中所提供的多种特性为了选择优选的经冷冻干燥的组合物或者为了经冷冻干燥的组合物的理想储存条件而使用。
在上述经冷冻干燥的组合物中，质粒脱氧核糖核酸的稳定性能够以本发明所属技术领域公知的方法来确定。尤其，稳定性能够以质粒脱氧核糖核酸的立体结构(conformation)，例如，这些是否以更加稳定的超螺旋(supercoiled)形态存在或者以稍微稳定的开环(open circle)及线性(linear)形态存在来确定。质粒脱氧核糖核酸的立体结构(conformation)可通过包含质粒脱氧核糖核酸的样品的毛细管电泳确定。与开环及线性形态相比，呈超螺旋形态的脱氧核糖核酸含量可以在多个条件下测定。例如，呈超螺旋形态的脱氧核糖核酸含量可以在冷冻干燥前、冷冻干燥期间或冷冻干燥后或者经冷冻干燥的组合物的重组前、重组期间或重组后确定。呈超螺旋形态的脱氧核糖核酸含量为了选择稳定的经冷冻干燥的组合物以及为了确定异常储存条件而可以在不同的温度条件下储存之前、储存期间或储存之后确定。
确定质粒脱氧核糖核酸的稳定性的另一方法以脱氧核糖核酸浓度为基础。可采用本发明所属技术领域公知的测定脱氧核糖核酸浓度的多种方法。例如，脱氧核糖核酸浓度能够以260nm的吸光度(light absorbance)为基础测定。上述方法为了在样品中进一步更良好地定量化脱氧核糖核酸浓度而追加伴随污染物质的测定。
滤饼外观(cake appearance)为经冷冻干燥的产品的另一重要特性。通常，均匀(uniform)且秀丽(elegant)的滤饼外观优选。例如，非理想滤饼外观很难以外观检查为基础确定产品质量，或者很难使容器内的全部亮的活性成分复原，由此，有可能对产品质量产生影响。并且，滤饼的部分或完整地回熔(meltback)有可能导致活性成分的不稳定性及分解。回熔为滤饼崩溃的一种形态，因从固体至液体的相变化而发生。即，在小瓶中存在不完全升华(从固体状态变为蒸汽状态)。这种变化有可能伴随药物物质(drug substance)的物理形态及水袋(moisture of pocket)的变化。
滤饼外观可通过能够伴随照片拍摄的外观检查确定。能够以过去的先例为基础执行外观检查。在判断产品质量之前，用于外观检查的强力性能验证程序(qualificationprogram)较为重要。性能验证程序(qualification program)可基于过去经验或公开的信息。例如，对于特定医药品的外观检查准则可根据基于由美国食品药品监督管理局(USFood and Drug Administration)出版的“Lyophilization of Parenterals:Guide ToInspections of Lyophilization of Parenterals(7/93)”检查准则中所提供的信息开发特定医药品。
有可能对医药品的质量产生影响的经冷冻干燥的生成物或其他特性为溶解经冷冻干燥的生成物来获取的重组的药物的浊度(turbidity)。重组的药物的浊度可以与在经冷冻干燥的组合物中的活性成分的复原有关。通常，完全的溶解，即，重组的药物的低的浊度优选。不完全溶解有可能导致药剂学组合物的活性成分的浪费及用于给药重组的药物的注射器的堵塞。
重组的药物的浊度可通过外观检查或在特定波长，例如，在450nm及650nm中测定吸光度来测定。吸光度(light absorbance)可使用本发明所属技术领域中可使用的装置，例如，使用Molecular Devices ThermoMAX microplate来测定。
重组时间为有可能与药品的质量有关的其他因子。通常，短的重组时间优选。在向患者给药的期间，一般使用在线过滤器(in-line filters)，因此，若药物并不完全溶解，则在使用人员步骤中，增加的重组时间有可能导致效力(potency)的部分丧失。例如，经冷冻干燥的生成物的重组所需要的时间可通过测定重组后在多个时间点的重组的药物的浊度来确定。例如，浊度可以在1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、1小时、2小时或其以上后测定。
冷冻干燥后的残留水分也较为重要。在经冷冻干燥的组合物中，为了测定残留水分而可以采用本发明所属技术领域公知的多种方法。例如，Karl Fisher Coulometer C20(Mettler Toledo)可用于水分含量分析。在经冷冻干燥的组合物中，水袋有可能导致更大的不稳定性和增加的生成物分解。因此，少量水分含量优选。
7.利用经冷冻干燥的组合物的疾病治疗的方法
使用经冷冻干燥的组合物治疗疾病的方法属于本发明的范围内。
7.1.经冷冻干燥的组合物的重组
可使用如使用旋流法(swirling method)、机械轨道振动器(orbital shaker)的方法或以静止状态维持小瓶的方法的多种重组方法。
用于给药的重组的药物的最终浓度可根据包含所传递的剂型的量、对象的年龄及体重、传递方法及路径及所传递的抗原的免疫原性(immunogenicity)的多种因素调节。
本发明的经冷冻干燥的组合物可通过能够接受的溶液，例如，水、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸、磷酸缓冲盐溶液、三羟甲基氨基甲烷或生理盐水以约10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml或0.05mg/ml的最终浓度重组。
7.2.重组的药物的给药
本发明的重组的药物为了治疗多种疾病而可以向哺乳动物对象(mammaliansubject)给药。本发明的重组的经冷冻干燥的组合物通过多种传递方式，例如，通过口服(orally)或非口服(parenteral)，例如，静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、心内膜内(intraendocardial)、心肌内(intramyocardial)、心包内(intrapericardial)、心室内(intraventricular)、关节内(intraarticular)、皮内(intradermal)、脑内(intracerebral)、肾内(intrarenal)、肝内(intrahepatic)、脾脏内(intrasplenic)、淋巴管内(intralymphatic)、皮下(subcutaneous)、腹腔内(intraabdominal)、睾丸内(intratesticular)、卵巢内(intraovarian)、子宫内(intrauterine)、胸骨(sternal)、器官内(intrathoracic)、胸腔内(intraplueral)、胸内(intrathoracic)、静脉内(intradural)、脊椎内(intraspinal)、骨髓内(intramedullary)、壁内(intramural)、皮质内(intrascorionic)、动脉内注射(arterial injection)或注入(infusion)、直肠(rectal)、鼻腔内(intranasal)、吸入(inhalational)或眼内(intraocular)的局部(topically)给药。在特定实例中，传递方法为肌肉内(intramuscular)、心肌内(intramyocardial)、静脉内(intravenous)、脑内(intracerebral)或肾内(intrarenal)。
在典型实例中，核酸结构体通过液体药剂学组合物的注射给药。在当前优选实例中，多核苷酸结构体通过肌肉注射给药。典型地，多核苷酸结构体在受影响部位通过肌肉注射给药。在一部分实例中，多核苷酸结构体向对象的四肢(limbs)、心脏或其他身体部位的肌肉给药。
在一部分实例中，上述结构体向皮下(subcutaneously)或皮内(intradermally)注射。在一部分实例中，上述多核苷酸结构体通过血管内传递给药。在特定实例中，上述结构体通过逆行静脉注射(retrograde intravenous injection)给药。
本发明的重组的经冷冻干燥的组合物的典型的每日服用量需要根据包含治疗的状态、所选择的给药路径、患者个人的年龄、性别及体重、患者症状程度的多种相关因子确定，需要理解的是，应当按单一剂量或分割剂量给药。多核苷酸结构体按治疗有效量给药。
在本发明中所记载的方法的一部分实例中，多核苷酸结构体按1μg至200mg、1mg至200mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至20mg、5mg至10mg、16mg、8mg或4mg的总剂量给药。
在典型的实例中，总剂量被分成多个个别注射剂量。在一部分实例中，总剂量分成多个相同注射剂量。在一部分实例中，总剂量分成不均等的注射剂量。
在多种分割剂量(divided dose)实例中，总剂量向4、8、16、24或32个不同的注射部位给药。
在一部分实例中，注射剂量为0.1mg-5mg。在特定实例中，注射剂量为0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg或0.5mg。
总给药剂量可在第一次访问或二次以上访问期间给药。
在典型的分割剂量实例中，多个注射剂量相互在1小时内给药。在一部分实例中，所有注射剂量相互在1.5小时、2小时、2.5小时或3小时内给药。
在本发明的多种实例中，按单一一元化的剂量(unitary dose)给药或分成多个注射剂量来给药，总剂量的多核苷酸结构体仅向对象给药一次。
在一部分实例中，经1次、2次、3次或4次访问，向多个注射部位的总量的多核苷酸结构体的给药可包括单一周期。尤其，可包括将2次访问的32mg、16mg、8mg或4mg的多核苷酸结构体向多个注射比武诶给药的单一周期。2次访问可以为3日、5日、7日、14日、21日或28日间隔。
在一部分实例中，周期可以反复。周期可以按2次、3次、4次、5次、6次或其以上反复。
在一部分实例中，周期在之前周期之后，可以按1月、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月、12月或其以上反复。
在一部分实例中，在后续周期中给药的总剂量与在之前周期给药的总剂量相同。在一部分实例中，在后续周期给药的总量量与之前周期给药的总剂量不相同。
在当前优选实例中，核酸结构体向受影响的四肢(limbs)按8mg的剂量给药，按多个肌肉注射及多个访问相同地分割，任意单一访问中的多个注射分别在不同的注射部位中执行。在特定实例中，核酸结构体向受影响的四肢(limbs)按8mg的剂量给药，在0日向四肢(limbs)按4mg的第一剂量给药，在14日向四肢(limbs)按4mg的第二剂量均等地分割，其中，第一剂量及第二剂量按多个注射剂量均等地分割。
实际给药的量及速度及给药的时间经过根据治疗疾病的属性(nature)及症状程度改变。在典型的实例中，多核苷酸结构体按减少疾病的症状，例如，减少痛症有效的量给药。在一部分实例中，上述量在给药1周以内有效地减少症状。在一部分实例中，上述量在给药2周、3周或4周内有效地减少症状。
质粒脱氧核糖核酸可按治疗状态同时或依次、单独或与其他质粒脱氧核糖核酸一同组合给药。
在一部分实例中，重组的组合物包含编码人类肝细胞生长因子的质粒脱氧核糖核酸。重组的药物为了多种治疗，例如，为了治疗通过质粒脱氧核糖核酸的给药可以治疗的疾病而给药。质粒脱氧核糖核酸可编码如人类肝细胞生长因子的治疗基因。上述疾病包括缺血性或肝病、冠心病(coronary artery disease，“CAD”)、肌萎缩性侧束硬化症(amytrophic lateral sclerosis，“ALS”)、周边动脉疾病(peripheral artery disease，“糖尿病溃疡(diabetic ulcer)”)及糖尿病周围神经病变(diabetic peripheralneuropathy，“DPN”)或因疾病、负伤、感染或维生素缺乏症状态而导致的神经病(neuropathy)，但并不局限于此。例如，神经病有可能因糖尿病、维生素缺乏症、自身免疫性疾病、遗传和遗传疾病、淀粉样变性(amyloidosis)、尿毒症(uremia)、毒素(toxins)或毒(poisons)、外伤(trauma)或伤害(injury)、肿瘤(tumors)而引发或特发性(idiopathic)。在美国专利号7812146、7838505、7745174、8338385、8389492及美国申请号12/59137、14/355、792、15/030999中记载的方法可通过给药经冷冻干燥的组合物来治疗疾病而采用。本发明中所提供的参考文献的全部内容通过引用结合在本发明中。
在一部分实例中，重组的组合物包含编码人类胰岛素样生长因子-1的质粒脱氧核糖核酸。重组的药物为了治疗多种疾病，例如，为了治疗通过编码人类胰岛素样生长因子-1的质粒脱氧核糖核酸或人类胰岛素样生长因子-1蛋白质的给药可以治疗的疾病而给药。上述疾病包括因疾病、负伤、感染或维生素缺乏症状态而导致的神经病，但并不局限于此。例如，神经病有可能因糖尿病、维生素缺乏症、遗传和遗传疾病、淀粉样变性、尿毒症、毒素或毒、外伤或伤害、肿瘤而引发或特发性。在一部分实例中，编码人类胰岛素样生长因子-1蛋白质的质粒(pTx-IGF-1)为了进行治疗而与编码人类肝细胞生长因子的其他质粒(例如，VM202)一同给药。在美国申请号16/513560及/或16/513564中记载的方法可通过给药经冷冻干燥的组合物来治疗疾病而采用。
在一部分实例中，重组的组合物包含编码人类基质细胞衍生因子1α的质粒脱氧核糖核酸。质粒为了治疗疾病而单独或与其他质粒脱氧核糖核酸一同给药。在一部分实例中，编码人类基质细胞衍生因子1α的质粒(例如，pCK-SDF-1α)为了治疗疾病而与编码人类肝细胞生长因子的其他质粒脱氧核糖核酸(例如，VM202)一同给药。上述疾病包括如周围血管疾病(peripheral vescular disease)的血管病，但并不局限于此。在美国专利号15/514244中记载的方法可通过给药包含人类基质细胞衍生因子1α的质粒来治疗疾病而采用。
附图说明
图1提供从VM202的毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)的例示性结构。上述结果呈现出两个峰，一个为超螺旋形态(supercoliedform)，另一个为开环(opencircleform)。
图2A-图2D为与退火步骤的有无无关地，从第一次小规模冷冻干燥循环提供对于多种剂型的液体状态的低温环境(subambient)差示扫描量热仪(DSC)分析结果。具体地，图2A提供对于KP8M2SN的结果，图2B提供对于KP8MS3N的结果，图2C提供对于KP8MT3N的结果，而且，图2D提供对于对照组(Control)的结果。在图表中示出玻璃转移温度(glasstransition temperature，Tg')、共结熔融温度(eutectic melting temperature，Te)及失透温度(devitrification temperature，Td)。
图3提供KP8M2SN、KP8MS3N、KP8MT3N及对照组的第一次冷冻干燥循环期间温度(左侧y轴)及压力(右侧y轴)的延时变化。
图4A-图4C为从冷冻干燥前(图4A)、冷冻干燥后(图4B)及重组后(图4C)第一次小规模冷冻干燥循环提供包含多种剂型的小瓶的照片。
图5为从在冷冻干燥前或重组后第一次小规模冷冻干燥循环提供来自VM202剂型的毛细管电泳(CE)的结果。
图6A-图6D为与退火步骤的有无无关地，从第二次小规模冷冻干燥循环提供对于多种剂型的液体状态的低温环境(subambient)差示扫描量热仪分析结果。具体地，图6A提供对于4MSN的结构，图6B提供对于3MSN的结果，图6C提供对于2MSN的结果，而且，图6D提供对于对照组的结果。
图7提供4MSN、3MSN、2MSN及对照组的第一组的第二次冷冻干燥循环期间的温度(左侧y轴)及压力(右侧y轴)的延时变化。
图8A-图8C为从在冷冻干燥前(图8A)、冷冻干燥后(图8B)及重组后(图8C)的第二次小规模冷冻干燥循环提供包含4MSN、3MSN、2MSN及对照组的第一组的小瓶的照片。
图9为从冷冻干燥前或重组后第二次小规模冷冻干燥循环提供来自4MSN、3MSN、2MSN及对照组的第一组的毛细管电泳(CE)的结果。
图10提供4MSN、3MSN、2MSN及对照组的第二组的第二次冷冻干燥循环的第二个循环期间的温度(左侧y轴)及压力(右侧y轴)的延时变化。
图11A-图11B为从冷冻干燥前(图11A)及冷冻干燥后(图11B)第二次小规模冷冻干燥循环的第二个循环提供包含4MSN、3MSN、2MSN及对照组的第二组的小瓶的照片。图11C-图11F示出重组后包含4MSN(图11C)、3MSN(图11D)、2MSN(图11E)及对照组(图11F)的第二组的小瓶的照片。
图12为从冷冻干燥前或重组后第二次小规模冷冻干燥循环的第二各循环提供来自4MSN、3MSN、2MSN及对照组的第二组的毛细管电泳(CE)的结果。
图13提供2MSN及2M1SN的冷冻干燥循环期间的温度(左侧y轴)及压力(右侧y轴)的延时变化。
图14A-图14B提供包含冷冻干燥前(图14A)及冷冻干燥后(图14B)2MSN或2M1SN的小瓶的照片。图14C-图14D示出包含重组后2MSN(图14C)及2M1SN(图14D)的小瓶的照片。
图15提供来自冷冻干燥前或重组后2MSN及2M1SN的毛细管电泳(CE)的结果。
图16A-图16B提供包含在T＝0重组后，在25℃温度条件下储存3日(图16A)或7日(图16B)之后的4MSN、3MSN、2MSN及对照组的小瓶的照片。
图17A-图17B提供来自在25℃温度条件下保存3日(图17A)或7日(图17B)之后的4MSN、3MSN、2MSN及对照组的毛细管电泳(CE)的结果。
图18A-图18C提供包含在25℃(图18A)温度条件下、40℃(图18B)温度条件下或5℃(图18C)温度条件下储存10周的上述经冷冻干燥的剂型的重组前或重组轴的4MSN、3MSN、2MSN及对照组的小瓶的照片。
图19提供来自在40℃温度条件下储存10周之后的4MSN、3MSN、2MSN及对照组的毛细管电泳(CE)的结果。
图20A-图20C提供当上述剂型在5℃(图20A)、25℃(图20B)或40℃(图20C)温度条件下储存时，以对于4MSN、3MSN、2MSN及对照组的毛细管电泳(CE)结果为基础测定的呈超螺旋形态的脱氧核糖核酸百分比的延时变化。
图21A-图21C提供当上述剂型在5℃(图21A)、25℃(图21B)或40℃(图21C)条件下储存时，以对于4MSN、3MSN、2MSN及对照组的毛细管电泳(CE)结果为基础测定的开环脱氧核糖核酸百分比的延时变化。
图22A-图22B提供包含重组后的3日期间，在25℃温度条件下储存的2MSN(图22A)或2M1SN(图22B)的小瓶的照片。图22C-图22D提供包含重组后的7日期间，在25℃温度条件下储存的2MSN(图22C)或2M1SN(图22D)的小瓶的照片。
图23A-图23B提供来自在3日(图23A)或7日(图23B)期间，在25℃温度条件下储存后的2MSN及2M1SN的毛细管电泳(CE)结果。
图24A-图24C提供在25℃(图24A)、40℃(图24B)或5℃(图24C)温度条件下储存10周的上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含2MSN或2M1SN的小瓶的照片。
图25提供来自在40℃温度条件下储存10周之后的2MSN及2M1SN的毛细管电泳(CE)的结果。
图26A-图26C提供当上述剂型在5℃(图26A)、25℃(图26B)或40℃(图26C)温度条件下储存时，以对于2MSN及2M1SN的毛细管电泳(CE)结果为基础来测定的呈超螺旋形态的脱氧核糖核酸百分比的延时变化。
图27A-图27C提供当上述剂型在5℃(图27A)、25℃(图27B)或40℃(图27C)温度条件下储存时，以对于2MSN及2M1SN的毛细管电泳(CE)结果为基础测定的开环脱氧核糖核酸百分比的延时变化。
图28提供在实施例2中使用的冷冻干燥循环期间的温度(左侧y轴)及压力(右侧y轴)的延时变化。
图29提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例2的F1的小瓶的照片。
图30提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例2的F2的小瓶的照片。
图31提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例2的F3的小瓶的照片。
图32提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例2的F4的小瓶的照片。
图33提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例2的F5的小瓶的照片。
图34提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例2的F6的小瓶的照片。
图35提供来自实施例2的F1、F2、F3、F4及F5的毛细管电泳(CE)的结果。
图36提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例3的F1的小瓶的照片。
图37提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例3的F2的小瓶的照片。
图38提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例3的F3的小瓶的照片。
图39提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例3的F4的小瓶的照片。
图40提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例3的F5的小瓶的照片。
图41提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例3的F6的小瓶的照片。
图42提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例3的F7的小瓶的照片。
图43提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例3的F8的小瓶的照片。
图44提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例3的F9的小瓶的照片。
图45提供来自实施例3的F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8及F9的毛细管电泳(CE)的结果(表40)。
图46提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例4的F1的小瓶的照片。
图47提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例4的F2的小瓶的照片。
图48提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例4的F3的小瓶的照片。
图49提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例4的F4的小瓶的照片。
图50提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例4的F5的小瓶的照片。
图51提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例4的F6的小瓶的照片。
图52提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例4的F7的小瓶的照片。
图53提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例4的F8的小瓶的照片。
图54提供经白色背景(左侧)或黑色背景(右侧)，在上述经冷冻干燥的剂型的重组前或后包含实施例4的F9的小瓶的照片。
图55提供来自实施例4的F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8及F9的毛细管电泳(CE)的结果(表44)。
上述附图仅按例示目的示出本发明的多种实施例。本发明所属技术领域的普通技术人员从以下的讨论容易理解在本发明中叙述的结构及方法的代替性实施例不超出本发明中记载的本发明的原理并被利用。
具体实施方式
实施例
以下的实施例为了向本发明所属技术领域的普通技术人员提供对于制备并使用本发明的方法的完整的揭示(disclosure)及说明而提供，以下实施例并不限定本发明所属技术领域的普通技术人员认为是他们的发明的范围，并且，以下实施例并不表示执行以下实施例的所有或唯一试验。与所使用的数字(例如，量，温度等)有关地，为了保障准确性而进行了努力，但是需要考虑一部分试验的误差及偏差。除非另有规定，部分(parts)为重量份(parts by weight)，分子量为重均分子量(weight average molecular weight)，温度为摄氏温度，压力为大气压或接近大气压。标准缩略语，例如，bp为碱基对(base pair(s))，kb为千碱基(kilobase(s))，pl为微微升(picoliter(s))，s或sec为秒钟(second(s))，min为分钟(minute(s))，h或hr为小时(hour(s))，aa为氨基酸(amino acid(s))，nt为核苷酸(nucleotide(s))等。
除非另有规定，本发明的实施例为本发明所属技术领域的技术方案，可以使用蛋白质化学(protein chemistry)、生物化学(biochemistry)、重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA techniques)及药理学(pharmacology)方法。
实施例1：VM202的经冷冻干燥组合物(lyophilized composition)(研究001)
1.1包含VM202的试验的药剂学组合物(pharmaceutical composition)
如以下表1所示，制备(prepared)包含VM202的多种剂型(fomulation)。作为活性成分的上述VM202质粒(plasmid)从在0.9％氯化钠中包含1.6mg/mL的VM202或在0.9％氯化钠中包含1.3mg/mL的VM202的冷冻储存物(stock)获取。
表1
Figure GDA0002771863040000301
*对照组(control)为在美国专利第8389492号中记述的剂型(formulation)，其全部内容通过引用结合在本申请中。
**KP8MS3N及2MSN为相同组合物的经冷冻干燥的剂型。
上述剂型(formulation)通过使用市场中销售的物质及装置，例如，磷酸二氢钾(Potassium Phosphate monobasic)(Spectrum，样本编号PO200)、磷酸氢二钾(PotassiumPhosphate dibasic)(EMD，样本编号PX1570-1)、甘露醇(Mannitol)(J.T.Baker，样本编号2553-05)、蔗糖(Sucrose)(J.T.Baker，样本编号4074-05)、氯化钠(Sodium Chloride)(Millipore，样本编号1.06404.5000)及海藻糖(Trehalose)(Pfanstiehl，样本编号T-104-04)、透析盒(dialysis cassette)(Thermo Scientific，样本编号66380(10000MWCO))、玻璃小瓶(glassvials)(3cc或20cc玻璃小瓶(Schott型I硼硅酸盐(borosilicate)，样本编号68000316或68000321))、及塞子(stoppers)(13mM或20mM单通溶解塞(single-vent lyostopper)、
Figure GDA0002771863040000312
(West Pharmaceutical，样本编号19700034或19700311))来制备(prepared)。也使用了如葡聚糖(Dextran)(MP Biomedicals，样本编号101514)、氢氧化锂(Lithium Hydroxide)(Sigma Aldrich，样本编号L4533-100G)及磷酸(Phosphoric acid)(J.T.Baker，样本编号0262-01)的赋型剂(excipients)。
1.2多种剂型(formulation)的小规模(smallscale)试验
1.2.1样品制备(samplepreparation)
为了生成多种剂型(formulation)，从-70℃保存条件取出在0.9％氯化钠中装有1.6mg/mL的VM202的小瓶来在周边环境温度(ambient temperature，周边温度)进行解冻。
用于第一次小规模试验的样品：之后，在2-8℃的温度条件下，在24小时期间，对靶剂型缓冲液(targetformulationbuffer)(10mM磷酸钾(potassiumphosphate)，2％甘露醇，1.0％蔗糖，0.1％氯化钠，pH值为8.0)，通过10000倍以上的体积交换(volumeexchange)，使用10000MWCO Thermo透析盒来对KP8M2SN(参照表1)进行透析来制备。在透析之后，通过剂型缓冲液(formulationbuffer)，将KP8M2SN的浓度调节为0.5mg/mL的VM202。
稀释上述药物(drug substance)来制备KP8MS3N、KP8MT3N及对照组(control)。具体地，通过向下列表2提供的0.85mL的稀释缓冲液(dilutionbuffer)(KP8MS3N用缓冲液2次、KP8MT3N用缓冲液3次及对照组用缓冲液8次)稀释1.7mL的VM202(即，在0.9％氯化钠中的VM202)。在上述稀释后，对包含0.45％氯化钠的剂型缓冲液(formulation buffer)、KP8MS3N及KP8MT3N分别调节各自的剂型(formulation)，缓冲液(formulation buffer)，以使其各自含有0.5mg/mL的VM202。
用于第二次小规模试验的样品：通过向下一表2提供的0.42mL的稀释缓冲液(4MSN用缓冲液4次、3MSN用缓冲液5次及2MSN用缓冲液6次)稀释0.84mL的上述药物物质(即，在0.9％氯化钠中的VM202)来制备4MSN、3MSN及2MSN。在稀释之后，除对照组(Control)之外的剂型(formulation)使用包含0.45％氯化钠的各自的剂型缓冲液(formulation buffer)来被调节成包含0.5mg/mL的VM202。
表2
Figure GDA0002771863040000311
用于加速稳定性试验(acceleratedstabilitytest)的样品制备：为了加速稳定性试验额还制备了额外的剂型(formulation)组。为了上述额外的剂型组，通过向上述表2提供的稀释缓冲液，将药物物质(即，在0.9％氯化钠中的VM202)按2：1的比例(4MSN用缓冲液4次、3MSN用缓冲液5次、2MSN用缓冲液6次、2M1SN用缓冲液7次及对照组用缓冲液8次)进行稀释来制备4MSN、3MSN、2MSN、2M1SN及对照组。在稀释之后，除对照组之外的所有剂型(formulation)通过包含0.45％氯化钠的各自的剂型缓冲液(formulation buffer)被调节成含有0.5mg/mL的VM202。
在0.9％氯化钠及1.1％蔗糖中，使用0.5mg/mL的葡聚糖来制备了代理剂型(surrogateformulation)。
样品的冷冻干燥：将浓度调节成0.5mg/mL之后，在无菌条件下(asepticcondition)，通过0.2μm的PES过滤器(小规模及加速稳定性研究(accelerated stabilitystudy))或醋酸纤维素(CA)过滤器(还加速稳定性研究(acceleratedstabilitystudy))对剂型化的(formulated)VM202进行杀菌过滤。所有样品在无菌条件下，为了在生物安全柜(biosafety cabinet)中进行小规模冷冻干燥，按每小瓶(vial)0.75mL的填充体积(fillvolume)填充在杀菌的3cc小瓶。或者，为了稳定的加速研究，按每小瓶5mL的填充体积(fill volume)填充在杀菌的20cc小瓶。具体地，在安全柜(NuAirebiological safetycabinet，等级II类A/B3型号NU-425-600)下，作为真空过滤系统(vacuum filtrationsystem)(Corning，1L Vacuum Filter/Storage Bottle System，0.2μm CA膜，样本编号431-205；Thermo scientific，Rapid Flow Filter Unit，0.2μm的PES膜，样本编号567-0020)，使用注射器过滤器(PALL Life Science，Acrodisc 13mm，0.2μmPES膜，样本编号4602)来填充(filled)上述剂型(formulation)。
在填充之后，通过杀菌塞子(stopper)部分堵塞(stoppered)上述小瓶，使用在表3中记述的循环，为了冷冻干燥(freeze-drying)而装在冷冻干燥器(lyophilizer)(VirTis，型号25L Genesis SQ Super XL-70)。为了小规模冷冻干燥(lyophilization)，在进行干燥工序(drying process)期间，代理小瓶(surrogatevial)用于完全包围VM202小瓶，这是为了从相邻的小瓶提供具有比较性的(comparable)光照射热传递(irradiation thermaltransfer)。
表3
Figure GDA0002771863040000321
Figure GDA0002771863040000331
在冷冻干燥之后，在600mtorr的部分真空条件下，用塞子完全堵塞(stoppered)上述小瓶，通过铝封(aluminum seals)进行压接(crimped)并附着标签(labeled)。标签包含与项目、日期、培养温度、储存条件及时间点(time point)有关的信息。在贴标签(labeling)之后，将样品各自放在稳定性条件。
1.2.2用于多种剂型(formulation)的试验的分析(assay)
为了评价上述冷冻干燥的剂型(formulation)的相对稳定性而将其暴露在多种压力条件。为了施加样品预热压力，将所有剂型(formulation)在5℃、25℃或40℃的温度条件下保存10周。为了评价重组(reconstitution)后的稳定性，通过被过滤的(filtered)注射用水(waterforinjection，WFI)，使用5.0mL的目标体积(targetvolume)来在生物安全柜中重组样品(reconstituted)，并再次进行堵塞(restoppered)之后进行了再次密封(resealed)。重组后，在25℃的温度条件下保存样品3日或7日。在本试验中，所进行试验的多种条件如表4所示。
表4
Figure GDA0002771863040000332
在不同的条件下，为了分析多种剂型(formulation)的稳定性而执行了如下的分析。
(1)外观检查(visual inspection)：在黑色背景及白色背景执行了外观检查。获取了数字照片。
(2)紫外线分光光度法(UVSpectrophotometry)：通过lidfactor为10的ImplenNanophotometer执行了紫外线分光光度法。上述试验样品的质粒脱氧核糖核酸浓度通过在230nm、260nm、280nm及350nm中测定吸光度(absorbance)来确定。使用ViroMed的UV/Vis协议来执行浓度分析。使用以下的方程式来执行计算。
浓度(μg/mL)＝[(D-E)/C]×(B/A)
复原(Recovery)＝(低μg/mL)/(高μg/mL)×100％
OD260nm/OD280nm＝D/F
OD260nm/OD230nm＝D/G
其中，
A＝为了稀释而获取的样品的重量。
B＝用于稀释的样品及缓冲液的总重量。
C＝在1cm路径长度(pathlength)试管(cuvette)中的0.005％溶液的吸光系数(extinctioncoefficient)(0.02)。
D＝在260nm中的最大光学密度(optical density for the maximum)。
E＝在350nm中测定的吸光度。
F＝在280nm中测定的吸光度。
G＝在230nm中测定的吸光度。
使用基准(Acceptance Criteria)：
D应属于0.5OD至1.5OD单位的范围。
复原应为98％以上。
OD260nm/OD280nm＝应属于1.8至2.0的范围。
OD260nm/OD230nm＝应为1.1以上。
(3)毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)：安装有P/AceTM MDQ紫外线探测器模块的Beckman Coulter，ProteomeLabTM PA 800毛细管电泳设备用于质粒脱氧核糖核酸结构分析(超螺旋(supercoiled)脱氧核糖核酸的纯度)。使用32Karat软件(版本7.0)来分析了结果。在毛细管电泳分析之前，向具有50μm内部直径(零件号477441)及8μm开口窗(aperture window)的40cm毛细管涂敷的Beckman Coulter Neutral在20psi中，通过高效液相色谱法(HPLC)超纯水(ultrapure grade water)启动(running)1分钟之后，在20psi中，通过100mM磷酸(pH2.6)进行冲洗来维持原本状态(conditioned)。上述分离在14分钟期间，通过适用17kV的恒压来实现。0.5mg/mL浓度的样品40μL为了进行分析而添加在聚乙烯插件(insert)。适用以下的参数(parameter)。
·压力/注入时间(injection time)：0.5psi/11秒钟。
·分离缓冲液/压力：100mM磷酸(pH2.60)，85％/20psi；60秒钟。
·洗涤缓冲液/压力：高效液相色谱法超纯水(ultrapure grade water)/20psi；60秒钟。
·探测器波长：254nm。
·分离电压：17KV；0.17分钟；14分钟。
VM202的例示性(exemplary)毛细管电泳结果呈现在图1中。
(4)浊度(Turbidity)：使用Molecular Devices ThermoMAX酶标仪(microplatereader)来在450nm及650nm中测定样品吸光度(absorbance)并确定浊度。
(5)低温环境(subambient)差示扫描量热仪分析：使用具有Intercooler II的Pyris Diamond差示扫描量热仪，在-60℃的温度条件下对大致10μL的各个剂型(formulation)进行冷冻。5℃/分钟的缓变率(ramp rate)中，将上述样品加热至25℃，在嘉文(warming)过程中，记录热流动(heat flow)。并且，执行包括退火(annealing)步骤的程序。上述退火步骤通过按5℃/分钟的缓变率将样品加温至-15℃来执行。
(6)卡尔—费休(Karl Fisher)水分分析：将Karl Fisher Coulometer C20(Mettler Toledo)用于水分含量(moisture content)分析。AquaStar Water StandardOven 1％用于确定系统准确度。为了进行分析，在去除盖之前，将样品小瓶放置在室温条件。在添加样品之前和之后，为了确定用于分析的经冷冻干燥的粉末的量而称重了称量盘(weigh boat)的重量。大致10-160mg的物质用于分析。
1.2.3KP8M2SN、KP8MS3N及KP8MT3N的分析(第一次小规模试验)
低温环境(subambient)差示扫描量热仪分析：在冷冻干燥工序(process)之前，为了把握(characterize)候补剂型(formulation)的特性而通过低温环境(subambient)差示扫描量热仪(differential scanning calorimetry；DSC)分析了按0.5mg/mL剂型化的(formulated)VM202，即，KP8M2SN、KP8MS3N、KP8MT3N及对照组(表1)的10μL样品。分析的信号具有在瘪塌温度(Tg′，collapse temperature)、失透温度(Td，devitrificationtemperature)及冷冻状态下具有VM202的多种剂型(formulation)的退火的优点。图2A-D示出在没有VM202的退火的情况下(左侧)或在具有VM202的退火的情况下(右侧)的用于KP8M2SN(图2A)、KP8MS3N(图2B)、KP8MT3N(图2C)及对照组(图2D)的第一次小规模冷冻干燥的液体状态的差示扫描量热仪结果。在-44℃条件下观察到了上述KP8M2SN的玻璃转移(glasstransition)(Tg′)温度。对照组的共结熔融温度(Te，eutectic meltingtemperature)为～-21℃。在所有剂型(formulation)中观察到了失透温度(Td)，在退火之后消失。一部分添加剂(additives)呈现出在退火之后消失的失透信号，因此，冷冻干燥循环1(表3)在第一次小规模的冷冻(freezing)器件包括退火步骤。
使冷冻温度(freezing temperature)从-50℃向-20℃增加(ramping)并维持2小时之后，导入真空可以诱导退火及甘露醇结晶化(crystallization)。第一次干燥通过80mTorr腔室压力(表3)，在-20℃架子(shelf)温度(24小时)条件下执行。在20℃的架子温度条件下，第二次干燥去除在第一次干燥步骤期间未被升华的残存物(residual water)。
图3示出在第一次小规模试验的冷冻干燥工序期间的温度(左侧y轴)及压力(右侧y轴)的延时(time-lapse)图。当施加真空时，因基于升华的热损失，上述生成物(product)温度下降到-36℃以下。皮氏计(pirani gauge)值在确认第一次干燥工序的完成的第一次干燥步骤期间的30小时与电容压力计(capacitance manometer)读取值(reading)合并。开始进行第二次干燥并还干燥样品13小时。整个循环持续了46小时，在完成第一次干燥之后，在直接开始第二次干燥的情况下，可将整个循环减少至43小时。
在完成第一次小规模冷冻干燥循环之后，在600torr真空压力下用塞子堵塞所有小瓶。从腔室取出上述冷冻干燥物(lysophilate)来进行分析。KP8M2SN的冷冻干燥滤饼(lysophilizedcake)外观上优秀(elegant)。其他滤饼，尤其，对照组(Control)呈现出瘪塌的迹象。重组的样品(reconstituted sample)透明(clear)，可以与冷冻干燥前(pre-lyophilization)样品进行比较(comparable)(图4A-图4C)。上述滤饼的水分含量分比为1.37％(KP8M2SN)、2.40％(KP8MS3N)、1.44％(KP8MT3N)及1.25％(对照组)。
在各个样品中，VM202的浓度在将来自第一次小规模冷冻干燥循环的样品重组之后测定。上述结果趁现在表5中。上述结果呈现出各个样品按类似的浓度包含VM202。
表5
Figure GDA0002771863040000351
毛细管电泳：对于重组的样品，通过毛细管电泳，对生成物纯度进行了还研究。在毛细管电泳之后，色谱图(chromatograms)及峰面积(％)数据呈现在图5及表6。毛细管电泳分析结果呈现出在冷冻干燥及重组之后，在KP8M2SN、KP8MT3N及对照组中的超螺旋峰面积(supercoiled peakarea)的减少。KP8MS3N在冷冻干燥及重组之后具有最高的超螺旋峰面积。
表6
Figure GDA0002771863040000361
简单地，上述结果呈现出与包含0.5％蔗糖及0.45％氯化钠的KP8MS3N或包含0.5％海藻糖及0.45％氯化钠的KP8MT3N相比，包含1.0％蔗糖及0.1％氯化钠的KP8M2SN生成更好的冷冻干燥滤饼(lyophilization cake)。上述结果还呈现通过毛细管电泳测定包含0.5％蔗糖及0.45％氯化钠的KP8MS3N时，具有最少量的分解(degradation)。这意味着与包含海藻糖的剂型(formulation)(KP8MT3N)相比，包含蔗糖的剂型(formulation)(KP8M2SN及KP8MS3N)具有更好的特性(例如，优秀的滤饼(elegantcake)形成及稳定性)。
1.2.4 4MSN、3MSN及2MSN的第一组分析(第二次小规模冷冻干燥循环)
基于上述第一次小规模冷冻干燥循环的结果，下一个冷冻干燥循环(第二次小规模试验)维持蔗糖(0.5％)及氯化钠(0.45％)浓度，同时，在KP8MS3N中改变甘露醇的浓度，由此，将重点放在提高滤饼外观(cakeappearance)。
在冷冻干燥工序之前，为了把我候补剂型(formulation)的特性，通过低温环境(subambient)差示扫描量热仪分析了在0.5mg/mL中剂型化的(formulated)VM202，即，4MSN、3MSN、2MSN及对照组(表1)的10μL样品。图6A-D示出来自第二次小规模冷冻干燥试验的液体状态的上述差示扫描量热仪结果。对照组(图6D)示出～-21℃的共结熔融温度(Te)。失透温度(Td)在所有剂型(formulation)中观察到(左侧没有退火)，在退火之后消失(右侧)。因观察到失透信号，冷冻干燥循环2(表3)在第二次小规模试验的冷冻(freezing)期间包括退火步骤。
将上述冷冻温度从-50℃向-20℃增加(ramping)并维持2小时之后，导入真空可以诱导退火及甘露醇结晶化。第一次干燥通过50mTorr腔室压力(表3)，在-20℃架子温度(25小时)条件下执行。在20℃的架子温度条件下，第二次干燥去除在第一次干燥步骤期间未被升华的残存物。
图7示出在第二次小规模试验工序期间的温度(左侧y轴)及压力(右侧y轴)的延时图。当施加真空时，因基于升华的热损失，上述生成物(product)温度下降到-37℃以下。皮氏计值在确认完成第一次干燥工序的第一次干燥步骤期间的23小时与电容压力计读取值合并。开始进行第二次干燥并还干燥上述样品13小时。整个循环持续47小时，在完成第一次干燥之后，在直接开始第二次干燥的情况下，整个循环可以减少至42小时。
若完成上述循环，则从上述冷冻干燥器取出样品并进行分析。通过外观检查，4MSN呈现出优秀的滤饼(elegantcake)。3MSN及2MSN呈现出存在收缩的(shrinkage)良好的滤饼(decentcake)，相反，对照组呈现出冷冻干燥后的滤饼的瘪塌的迹象。重组后，上述样品透明(clear)且无色，可以与冷冻干燥前样品进行比较(comparable)(图8A-C)。滤饼的水分含量为2.51％(4MSN)、2.15％(3MSN)、2.01％(2MSN)及1.12％(对照组)。
在重组来自第二次小规模冷冻干燥循环的样品之后，在各个样品中测定VM202的浓度，并将结果呈现在图7。上述结果呈现出各个样品按类似的浓度包含VM202。
表7
Figure GDA0002771863040000371
毛细管电泳：对于上述重组的样品，通过毛细管电泳，对生成物的纯度进行了还研究。来自上述毛细管电泳的色谱图(chromatograms)和被整理成表的结果(tabularresults)详细地呈现在图9和表8。4MSN及3MSN示出在超螺旋峰面积(supercoiledpeakarea)中的最少的分解(degradation)，相反，2MSN及对照组在冷冻干燥及重组之后呈现出超螺旋峰的减少。
表8
Figure GDA0002771863040000372
这些结果意味着4MSN(在pH值为8.0中的10mM磷酸钾、4％甘露醇、0.5％蔗糖、0.45％氯化钠)在第二次小规模冷冻干燥循环中，生产了基于毛细管电泳的最优的(best)冷冻干燥滤饼及最少量的分解。
1.2.5 4MSN、3MSN及2MSN的第二组分析(第二次小规模冷冻干燥循环)
通过被设计成在腔室压力50mTorr中，在-20℃温度条件下的第一次干燥架子温度及在腔室压力50mTorr中，在20℃温度条件下的第二次干燥夹子温度(表3)的第二次小规模冷冻干燥循环，制备了4MSN、3MSN、2MSN及对照组的其他组。图10示出在循环期间获取的温度及压力的延时图。当施加真空时，因基于升华的热损失的生成物(product)温度下降到-37℃以下。皮氏计值在第一次干燥期间的75小时与电容压力计读取值合并。开始进行第二次干燥并还干燥样品13小时。整个循环持续87小时。
若完成上述循环，则从冷冻干燥器取出样品来进行分析。通过外观检查，4MSN呈现出优秀的滤饼(elegantcake)。3MSN及2MSN也呈现出具有收缩(shrinkage)的良好的滤饼(decentcake)，相反，对照组在冷冻干燥后呈现出滤饼瘪塌的迹象。当重组时，除对照组之外的所有(formulation)的一部分小瓶呈现出模糊感(haziness)，相反，在冷冻干燥前，所有样品均透明(clear)(图11A-F)。上述滤饼的水分含量为0.97％(4MSN)、0.95％(3MSN)、1.69％(2MSN)及1.06％(对照组)。
浊度(turbidity)：浓度及浊度结果呈现在表9中。所有样品在重组后呈现出类似的浓度值。在冷冻干燥前及重组后，所有剂型(formulation)未被检测到浊度。
表9
Figure GDA0002771863040000381
毛细管电泳：对于上述重组的样品，通过毛细管电泳，对生成物的纯度进行了还研究。来自毛细管电泳的色谱图(chromatograms)及峰百分比呈现在图12及
Figure GDA0002771863040000383
10。4MSN、3MSN及对照组在冷冻干燥及重组后，其超螺旋峰面积明显(significant)减少。2MSN在冷冻干燥及重组后，在上述超螺旋峰面积中呈现出最少的分解(degradation)。
表10
Figure GDA0002771863040000382
上述结果意味着2MSN(在pH值为8.0中的10mM磷酸钾、2％甘露醇、0.5％蔗糖、0.45％氯化钠)在用于第二次小规模试验的额外的实验中，通过毛细管电泳生产最少量的分解(degradation)。
在上述冷冻干燥循环中生产的样品为了加速稳定性研究(acceleratedstability study)而使用了10周。
1.2.6 2MSN及2M1SN的分析
若考虑到包含2％甘露醇、0.5％蔗糖及0.45％氯化钠的KP8MS3N及2MSN在第一次及特定第二次小规模试验中呈现出通过毛细管电泳测定的最少量的分解(degradation)，则甘露醇(2％)及氯化钠(0.45％)浓度维持相同的浓度并改变蔗糖浓度，由此，还将上述KP8MS3N及2MSN剂型(formulation)最优化。具体地，制备包含2％甘露醇、0.45％氯化钠及1.0％蔗糖的2M1SN剂型(formulation)并与2MSN进行比较来分析。
使用将2M1SN及2MSN用于加速稳定性研究类似的冷冻干燥循环参数(parameter)来进行冷冻干燥。图13示出上述循环的温度及压力测定值。当施加真空时，因基于升华热损失，上述生成物(product)温度下降到-41℃以下。皮氏计值在第一次干燥期间的60小时与电容压力计读取值合并。开始进行第二次干燥并还干燥上述样品13小时。整个循环持续76小时，在完成第一次干燥之后，在直接开始进行第二次干燥的情况下，整个循环可以减少至70小时。
在冷冻干燥后，2M1SN呈现出优秀的滤饼(elegantcake)，2MSN呈现出具有少许收缩(shrinkage)的良好的滤饼(decentcake)(图14)。当重组时，2M1SN生产透明(clear)溶液，相反，2MSN呈现出模糊感(haziness)。在冷冻干燥之前，剂型均透明(clear)。上述滤饼的水分含量为1.31％(2MSN)及1.44％(2M1SN)。
浊度(turbidity)：对于剂型(formulation)，评价了浓度及浊度，其结果呈现在表11中。所有样品在重组后呈现出类似的值。为了上述还的加速稳定性研究，在450nm中的浊度测定被确定为可以更好的评价剂型(formulation)的差异。在冷冻干燥前及重组后，未检测到对于2M1SN的浊度。在2MSN重组后，在450nm中观察到浊度的显著(significant)增加。
表11
Figure GDA0002771863040000391
毛细管电泳：对于上述重组的样品，通过毛细管电泳，对生成物的纯度还进行了研究。来自毛细管电泳的色谱图(chromatograms)及被整理成表的结果(tabular results)详细呈现在图15及表12中。2MSN在冷冻干燥及重组后呈现出超螺旋峰面积的减少。2M1SN在冷冻干燥及重组后呈现出在超螺旋峰面积中的最少的分解(degradation)。
表12
Figure GDA0002771863040000392
在上述冷冻干燥周期中生成的上述样品为了进一步的加速稳定性研究而使用了10周。
1.3 4MSN、3MSN、2MSN及对照组的加速稳定性研究
在冷藏(5±3℃)、周边环境(ambient)(25±3℃)及加速化的(accelerated)(40±3℃)温度及周边环境温度条件下，在3日或7日期间，重组VM202剂型(formulation)的不同的保存条件下对冷冻干燥的VM202剂型(formulation)、4MSN、3MSN、2MSN及对照组的稳定性进行了评价。
在生物学安全柜中，将来自上述加速稳定性研究的经冷冻干燥的样品通过5mL的过滤水(filtered water)重组，并再次进行堵塞(re-stoppered)之后进行了再次密封(resealed)，在3日及7日期间，在25℃温度条件下进行培养。在3日及7日之后，从上述培养箱取出上述经培养的(incubated)样品来通过外观(visual)分析、浓度分析及毛细管电泳分析进行分析。
外观分析(visual inspection)：当与T＝0进行比较时，在重组后的3日(图16A)及7日(图16B)，在25℃的温度条件下，在储存上述剂型(formulation)4MSN、3MSN、2MSN及对照组之后，未观察到外观性(visual)外观的变化。
在各个时间点中，为了确定VM202的浓度，而在260nm中对分析了样品的吸光度。在3日及7日期间，在25℃的温度条件下保存之后，各个剂型(formulation)的浓度与在T＝0获取的结果类似(表13)。所有样品为目标浓度值的5％以内。因此，温度压力在VM202浓度未引发大的变化。
表13
Figure GDA0002771863040000401
毛细管电泳：在温度保存(temperature storage)期间，为了监控生成物纯度而使用毛细管电泳分析。在储存之后，上述剂型的毛细管电泳色谱图(chromatograms)及被整理成表的结果(tabular results)详细呈现在图17A-B及表14。所有剂型(即，4MSN、3MSN、2MSN及对照组)在25℃的温度条件下，储存3日至7日之后，呈现出超螺旋峰面积的减少。2MSN呈现出从3日至7日仅具有超螺旋峰面积的1.1％减少的最优的稳定性。
表14
Figure GDA0002771863040000402
上述冷冻干燥的VM202剂型(formulation)在5℃、25℃及40℃的温度条件下保存了10周(表4)。在各个时间点，从温度保存(temperature storage)中取出样品来进行外观(visually)评价。拍摄上述小瓶的照片，对滤饼形状进行了样品评价。所有经冷冻干燥的滤饼完整地(intact)维持，与温度条件无关，当保存时，未呈现处任何变化的迹象(对照组滤饼被举起(lifted)维持)。之后，将上述样品通过5mL的过滤水(filtered water)重组，并对透明度(clarity)及沉淀进行了评价。与T＝0进行比较时，对于4MSN、3MSN及2MSN的大部分的样品在透明度方面呈现出略微的差异。在10周期间，5℃(图18C)、25℃(图18A)及40℃(图18B)保存后的各个剂型(formulation)的外观呈现在图18A-C。
在温度压力期间，为了评价经冷冻干燥的VM202的稳定性，执行了浓度、浊度水分含量及毛细管电泳分析。
在各个时间点，重组样品并为了在小瓶确定VM202的浓度而在260nm中分析了吸光度。表15示出温度保存(temperature storage)10周的后，在经冷冻干燥的样品中，VM202的浓度与T＝0中获取的结果类似。因此，温度压力未在VM202浓度中引发大的变化。
表15
Figure GDA0002771863040000411
浊度(turbidity)：各个样品的浊度也在研究的各个时间点中进行了评价。上述结果详细地呈现在表16。重组的剂型(formulation)、4MSN、3MSN及2MSN的浊度与温度条件无关，在保存10周之后未显著(significantly)改变。
表16
Figure GDA0002771863040000412
水分含量分析在各个时间点执行。表17概述(outline)温度保存(temperaturestorage)10周后，对于水分含量的结果。在5℃、25℃及40℃中保存10周之后，观察到基于温度的水分含量的略微减少。保存温度越高，水分含量越低。2MSN在加速稳定性研究中的水分含量最高。
表17
Figure GDA0002771863040000413
毛细管电泳：毛细管电泳分析用于监控生成物穿度。在40℃温度条件下，在培养10周之后，毛细管电泳色谱图及峰面积值分别呈现在图19及表18。所有剂型在重组之后，在40℃温度条件下保存10周之后，与T＝0相比，呈现出开环峰面积(open circle peak area)的相应的增加和超螺旋峰面积(supercoiled peak area)的显著(significant)减少。2MSN呈现出最高的超螺旋峰面积，与零(zero)时间点相比，上述值通过40℃温度保存10周的情况下更显著(significantly)减少。在包含3％及4％甘露醇的剂型(formulation)及对照组剂型(formulation)中观察到更高水平的开环峰面积。
表18
Figure GDA0002771863040000414
Figure GDA0002771863040000421
通过标准偏差加权，包含偏差误差条，在多种温度条件下超过10周的毛细管电泳超螺旋形状峰纯度的倾向详细呈现在图20A-C、5℃(图20A)、25℃(图20B)或40℃(图20C)。在高温(elevated temperature)中进行培养之后，观察到纯度的显著(significant)差异。如图20A-C所示，包含2％甘露醇及0.45％氯化钠的2MSN在40℃的温度条件下保存之后呈现出最高水平的纯度。
在不同温度条件下保存之后，通过毛细管电泳检测的开环峰不纯物的倾向也呈现在图21A-图21C。在5℃温度条件下，观察到开环峰面积的略微增加。但是，在25℃条件以上中，所有剂型(formulation)呈现出相当多的分解(degradation)。在40℃温度条件下培养之后，在4MSN、3MSN及对照组中观察到更高水平的开环峰不纯物。与此相比，2MSN在所有温度条件下实质上呈现出更少的分解(degradation)。
1.4 2MSN及2M1SN的加速稳定性研究
冷冻干燥的VM202剂型(formulation)、2MSN及2M1SN的稳定性也通过在周边环境温度(25℃)条件下培养3日或7日之后进行了评价。在生物学安全柜中，通过5mL的过滤水(filtered water)将样品重组，并再次进行堵塞之后进行了再次密封，在3日及7日期间，在25℃温度条件下进行培养。在3日及7日之后，从培养箱中取出培养的样品来通过外观(visual)分析、浓度分析及毛细管电泳分析进行分析。
外观检查(visual inspection)：在两个时间点中分别执行检查(图22A-D)。在重组后，在25℃温度条件下，在保存3日及7日之后，在2MSN中观察到模糊感(haziness)。2M1SN在两个时间点均维持透明(clear)。
在各个时间点中，为了确定VM202的浓度而在260nm中分析了样品的吸光度。在两个剂型(formulation)中，VM202浓度在T＝0及重组后3日及7日内，在25℃温度条件下培养之后，如目标所示(表19)。因此，温度压力在VM202浓度并未引发大的变化。
表19
Figure GDA0002771863040000422
毛细管电泳：在温度保存后，对于样品，通过毛细管电泳对生成物纯度进行分析。在保存后，样品的毛细管电泳色谱图及峰面积结果呈现在图23A-B及表20中，两个剂型(formulation)在保存后呈现出类似的超螺旋峰面积。与2MSN相比，2M1SN呈现出超螺旋峰面积。
表20
Figure GDA0002771863040000423
Figure GDA0002771863040000431
保存期间的稳定性：为了进一步的加速稳定性研究，在5℃、25℃及40℃温度条件下，观察了冷冻干燥的VM202剂型(formulation)10周(表4)。在各个时间点中，从温度保存(temperaturestorage)获取样品来进行外观评价。拍摄上述小瓶的照片，样品对滤饼形状进行了评价。通过5mL的过滤水(filteredwater)将样品重组并对透明度(clarity)及沉淀进行了评价。所有经冷冻干燥的滤饼完整地维持，与温度条件无关，当保存时并未呈现出任何变化迹象。在保存10周之后，在重组的2MSN中观察到模糊感(haziness)。在10周内，在5℃、25℃及40℃条件下保存后，各个剂型(formulation)的外观外观呈现在图24A-C。
在温度压力下，为了评价冷冻干燥的VM202的稳定性而执行了浓度、浊度、水分含量及毛细管电泳分析。
在各个时间点中，将样品重组，为了在小瓶中确定VM202的浓度而在260nm中分析了吸光度。表21示出温度保存(temperaturestorage)10周之后，在冷冻干燥的样品中，VM202的浓度与T＝0中获取的结果类似。因此，温度压力并不对VM202浓度引发大的变化。
表21
Figure GDA0002771863040000432
各个样品的浊度也对2个不同的波长在各个时间点中进行了评价。工作人员在各个样品中外观发现了模糊感(haziness)，但是，当在650nm波长中测定时，在浊度方面并未观察到显著差异。因此，为了评价剂型(formulation)之间的浊度的差异，450nm较为适当。来自上述评价的结果详细呈现在表22中。2MSN与温度保存条件无关的，在450nm中呈现出适当的吸光度。2M1SN在所有温度条件下，在450nm中呈现出低的吸光度。
表22
Figure GDA0002771863040000433
水分含量分析也在各个时间点中执行。表23示出温度保存(temperaturestorage)10周之后，对于水分含量的结果。在5℃、25℃及40℃条件下保存10周之后，除在表示略微增加的水分含量(1.56％)的5℃温度条件下保存的2M1SN之外，在所有样品中均观察到类似的水分含量。
表23
Figure GDA0002771863040000434
Figure GDA0002771863040000441
毛细管电泳分析用于监控生成物纯度。在40℃温度条件下，在培养10周之后，毛细管电泳色谱图及峰面积值分别呈现在图25及表24中，两个剂型(formulation)在40℃温度条件下保存10周之后，与重组后的T＝0相比，开环峰面积将相应增加，超螺旋峰面积也将显著(significant)减少。2M1SN呈现出最高的超螺旋峰面积，但是，与零(zero)相比，上述值在40℃的温度跳进下保存10周的过程中显著(significantly)降低。在2MSN中观察到更高水平的开环峰面积。
表24
Figure GDA0002771863040000442
在多种温度条件下，经过10周的毛细管电泳，超螺旋形状峰纯度倾向详细呈现在图26A-C，5℃(图26A)、25℃(图26B)或40℃(图26C)。在高温(elevatedtemperature)培养后，在纯度方面存在显著(significant)差异。如表24所示，包含1％蔗糖及0.45％氯化钠的2M1SN在40℃温度条件下保存后呈现出最高水平的纯度。
在温度保存(temperaturestorage)期间，通过毛细管电泳检测的开环峰不纯物的倾向呈现在图27A-图27C、5℃(图27A)、25℃(图27B)或40℃(图27C)。上述图示出与增加的温度保存(temperaturestorage)相应的开环峰的增加。在40℃温度条件下培养之后，在2MSN中观察到更高水平的开环峰不纯物。2M1SN在所有温度条件下呈现出更少的开环峰，但遵循与2MSN相同的倾向。
1.5试验结果的概述
在冷冻干燥之前，包含质粒脱氧核糖核酸(VM202)的所有进行试验的剂型(formulation)在没有变色或可视微粒(particulate)的情况下维持透明状态。并且，毛细管电泳(CE)结果与所有组合物的高的纯度相同。
使用6个不同的(formulation)(KP8M2SN、KP8MS3N(＝2MSN)、KP8MT3N、4MSN、3MSN及对照组)，对VM202执行第一次及第二次小规模冷冻干燥试验，其中，生成物(product)在3cc玻璃小瓶填充0.75mL。使用在20cc玻璃小瓶填充5mL的第二次小规模冷冻干燥的相同的4个剂型(formulation)(4MSN、3MSN、2MSN及对照组)来执行对于VM202的加速稳定性研究，从在小规模冷冻干燥研究获取的数据确定冷冻干燥参数(parameter)。并且，在基于初期加速稳定性研究的数据的还加速稳定性研究中对2个不同的剂型(formulation)(2MSN及2M1SN)进行了试验。冷冻干燥循环从在低温环境(subambient)差示扫描量热仪分析之后获取的结果设计。在退火后，被确定为去除失透温度，因此，在冷冻干燥循环中包括退火步骤。
在冷冻干燥之后，对除包含0.9％氯化钠及1.1％蔗糖的对照组之外的所有组合物观察到优秀(elegant)或良好的(decent)滤饼。上述对照组为在美国专利第8389492号中记述的剂型(formulation)，其全部内容通过引用结合在本申请中。
但是，在冷冻干燥的组合物重组之后，除2M1SN(在pH值为8.0中得10mM磷酸钾、2％甘露醇、1％蔗糖、0.45％氯化钠)之外的所有进行试验的组合物呈现出模糊感(hazy)。在重组后，在25℃温度条件下，将重组的组合物保存3日及7日之后，一直维持图模糊感(haziness)。在重组后及重组后的3日及7日期间内，在25℃温度条件下保存之后，仅有2M1SN维持透明(clear)，在本申请的整个内容中，在2M1SN中没有VM202的浓度变化。
毛细管电泳评价VM202生成物纯度极为有效。在冷冻干燥及重组后，所有剂型(formulation)均在超螺旋峰面积中呈现出减少趋势。在25℃及40℃温度条件下保存之后，在所有剂型(formulation)中均观察到超螺旋峰面积的减少。但是，2M1SN在历时10周的稳定性研究期间呈现出与开环峰百分比的最少增加相应的最高超螺旋峰百分比。
上述结果意味着在20cc小瓶中，当按5mL的填充体积(fillvolume)，在pH值为8.0、2％甘露醇、1％蔗糖、0.45％氯化钠中，与10mM磷酸钾一同被剂型化(formulated)成0.5mg/mL浓度时，冷冻干燥的VM202在冷冻干燥及储存之后，维持优秀的(elegant)滤饼外观及最高水平的纯度(超螺旋脱氧核糖核酸)(在表25中的2M1SN)。随燃在更高的温度条件下，对于VM202的不稳定性速度持续增加，但是，与其他进行试验的剂型(formulation)相比，在上述2M1SN剂型(formulation)中观察到更少的分解(degradation)。
表25
剂型代码 缓冲液 pH 膨胀剂 稳定剂 VM202浓度(mg/mL)
2M1SN 10mM磷酸钾 8.0 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5
实施例2：VM202的冷冻干燥的组合物(lyophilized composition)(研究002)
为了试验在pH和/或膨胀剂(bulking agents)及稳定剂(stabilizers)的浓度中，在具有略微变化的剂型(formulation)中的VM202的质量，冷冻干燥后的医药品(drugproduct)剂型(formulation)中的VM202的质量，生成包含VM202的多种冷冻干燥的剂型(formulation)并进行了分析。
2.1实验设计
材料：在本研究中检查的活性药物成分(activepharmaceutical ingredient，API)为VM202。在本研究中所使用的材料呈如下结构：用于将VM202剂型化(formulate)并进行分析的化学物质和材料如下：
表26
Figure GDA0002771863040000451
Figure GDA0002771863040000461
剂型参数(formulationparameter)：在本研究中，固定有如下参数。
(1)填充体积(fill volume)：5mL
(2)API浓度：0.5mg/mL
(3)缓冲液浓度：10mM磷酸钾
(4)蔗糖浓度：1％
在上述剂型(formulation)中，检查了如下的剂型参数(formulationparameter)。
(1)pH：7.0，8.0及9.0
(2)甘露醇浓度：1％及2％
(3)氯化钠浓度：0.45％、0.6％及0.9％
在以下表27中列举的剂型(formulation)为了进行分析而制备。
表27：用于冷冻干燥及分析研究的剂型矩阵
Figure GDA0002771863040000462
2.2剂型制备(formulationpreparation)
2.2.1小规模研究
为了以达到表27的目标剂型(formulation)pH值的方式稀释药物物质(Drugsubstance：DS)来确定需要的缓冲液pH值而执行小规模试验。为了保存药物物质，代替药物物质，通过0.9％氯化钠安慰剂(与药物物质相同的剂型)执行小规模研究稀释(small-scale study dilution)。上述0.9％氯化钠安慰剂为了进一步呈现药物物质剂型(formulation)组合物而在不调节pH的情况下制备。稀释缓冲液组合物(表28)基于从1.6mg/mL至0.5mg/mL的药物物质稀释来计算。在小规模试验中呈现出在通过剂型缓冲液(formulation buffer)进行稀释之后，所有最终剂型(formulation)呈现出表27的目标pH值或接近其的pH值。但是，随着剂型(formulation)F3(9.0)的pH超出磷酸盐的缓冲范围，观察到pH向下移动。为了最好地补充这一点，选择了更高的pH稀释剂缓冲液(9.5)。在小规模试验中，在稀释之后变为pH9.2，在24小时及48小时后分别减少成pH9.1及pH8.5。
为了达成在本研究中的目标pH值，在冷冻干燥1日之内制备剂型(formulation)，监控了在重组后的pH变化。将表28所示的稀释缓冲液用于制备剂型(formulation)。
表28：起始稀释缓冲液(Starting Dilution Buffer)组合(物)
Figure GDA0002771863040000463
Figure GDA0002771863040000471
2.2.2冷冻干燥
在从眼镜蛇(Cobra)提供的0.9％氯化钠中，在-70℃温度保存下取出1.6mg/mL的VM202来在5℃温度条件下进行了整夜(overnight)解冻。在21mL的稀释缓冲液(dilutionbuffer)(表28)中，将35mL的药物物质稀释成1.0mg/mL的浓度。在稀释之后，测定了pH及活性药物成分浓度。尽管是使用安慰剂(placebo)的小规模试验的结果，在VM202的存在下，剂型(formulation)并不生成目标pH值，因此，在48mL的稀释缓冲液中，对1.0mg/ml药物物质进行稀释的期间(表29)，起始稀释缓冲液(starting dilution buffer)的pH还被调节成0.5mg/ml的最终浓度。
表29：为了从pH及1mg/mL至0.5mg/mL的稀释而使用的稀释缓冲液的量
Figure GDA0002771863040000472
在稀释之后，使用0.2μm醋酸纤维素过滤器来对剂型(formulation)进行杀菌过滤，在BSC中，通过5mL填充体积(fill volume)(2.5mg剂量)，填充在作为20cc玻璃(glass)的发热源被去除的(depyrogenated)小瓶。在填充之后，用塞子部分堵塞(stoppered)小瓶，为了冷冻干燥(freeze-drying)而装入冷冻干燥器。为了完全包围包含VM202药物物质的小瓶而使用了空的(empty)小瓶。在冷冻干燥后，在取出小瓶之前，在600Torr的部分真空的冷冻干燥腔室内完全堵塞上述小瓶。将小瓶卷边(cripmed)，并贴上(labeled)标签之后，将其放置于-70℃温度条件。将各个剂型的一个小瓶放置于5℃温度条件。将每个剂型的1个小瓶以5mL的过滤的Milli-Q水重组并与冷冻干燥前(pre-lyo)样品一同进行了分析。
2.2.3分析方法
如表30所示，在不同的时间点分析了冷冻干燥的剂型(formulation)。
表30
Figure GDA0002771863040000473
Figure GDA0002771863040000481
外观检查(visual inspection)：外观检查对黑色背景及白色背景在白色光源(13W荧光灯管)下执行。获取了所有剂型(formulation)的数字照片。
浓度测定(A260)：通过Beckman Coulter DU800，通过路径长度(path length)为1cm的石英试管(quartz cuvette)来执行了分光光度法(spectrophotometry)分析。试验样品的质粒脱氧核糖核酸浓度通过在230、260、280及350nm中测定吸光度来确定。使用Helixmith的UV/Vis协议来执行浓度分析。使用以下方程式来执行计算。
浓度(μg/mL)＝[(D-E)/C]×(B/A)
复原(Recovery)＝(低μg/mL)/(高μg/mL)×100％
OD260nm/OD280nm＝D/F
OD260nm/OD230nm＝D/G
其中：
A＝为了稀释而获取的样品的重量
B＝用于稀释的样品及缓冲液的总重量
C＝在1cm路径长度(pathlength)试管(cuvette)中的0.005％溶液的吸光数(extinctioncoefficient)(0.02)
D＝在260nm中的最大光学密度(optical density for the maximum)
E＝在350nm中测定的吸光度
F＝在280nm中测定的吸光度
G＝在230nm中测定的吸光度
使用基准(Acceptance Criteria)：
D应属于0.5OD至1.5OD单位的范围。
复原(recovery)应为98％以上。
OD260nm/OD280nm＝应属于1.8至2.0的范围。
OD260nm/OD230nm＝应为1.1以上。
pH：通过以具有校正斜率(calibrationslope)的95％或其以上的3种pH标准溶液(pH4、pH7及pH10)校正的(calibrated)
Figure GDA0002771863040000482
pHMeter(VWR Scientific，样本编号SB70P)来执行pH分析。样品并不调节温度，通过周边环境温度进行平衡化(equilibrate)并进行测定。
浊度(turbidity)测定(A350、A450、A650)：浊度使用Beckman Coulter DU800来在350、450及650nm中测定样品吸光度(absorbance)并确定。A650＞0.01的剂型(formulation)呈现一般增加的浊度。
毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis)：在分析之前，将毛细管将Milli-Q水、0.1N的NaOH、0.1N的HCl及Milli-Q水再一次分别按20psi启动(running)10分钟来维持原本状态(conditioned)(维持原本状态总共持续40分钟)。为了分析0.5mg/mL的浓度的样品40μL而装入聚乙烯插件(insert)。
设备：Beckman Coulter PA 800+毛细管电泳(S/N 3063309)
毛细管(capillary)：中性的被涂敷的毛细管(neutralcoatedcapillary)，50μmI.D，40cm总长度，30cm有效长度，8μm虹膜(Beckman Coulter P/N 477441，批号M812134)
数据分析：32Karat(版本9.0)
压力/注入时间：0.5psi/11秒钟
分离缓冲液(separationbuffer)/压力：100mM磷酸(pH2.60)，85％/20psi；60秒钟
洗涤缓冲液(washbuffer)/压力：Milli-Q水/20psi；60秒钟
测定(detection)：在254nm中的紫外线
分离电压(separationvoltage)：17KV；增加(ramp)0.17分钟；14分钟
剩余水分含量(Residual Moisture Content)：将Karl Fisher Coulometer C20(Mettler Toledo)用于水分含量分析。使用Apura Water Standard Oven 1％来确定系统准确度。为了进行分析而去除盖子之前，将样品小瓶放置于常温。各个分析大致需要100mg的物质。
2.3试验结果的概述
上述部分(section)概述在多种剂型(formulation)中的冷冻干燥的VM202质量(quality)。
2.3.1冷冻干燥循环概述(profile)
之前设计的冷冻干燥循环(Lyo Cycle)为了在多种剂型(formulation)中对2.5mg剂量的VM202进行冷冻干燥而使用。从冷冻温度(freezing temperature)的-50℃至-20℃的增加(ramping)及抽(pull)真空之前之前维持2小时来进行退火(annealing)。上述退火工序帮助非晶(amorphous)赋型剂的结晶化(crystallization)。若在形成真空的时间内，未达到设定点，则因可以中断程序的用于上述试验的冷冻干燥器的独特的特征，使用开始进行第一次干燥，起初被抽至100mTorr且最终被调节成真空的第一次干燥的开始步骤。第一次干燥以50mTorr腔室压力(表31)，在-20℃(～53.4小时)的架子温度下执行。在20℃的架子温度中的第二次干燥去除在第一次干燥步骤期间内未生化的残存物(residualwater)。
表31：冷冻干燥循环参数(parameters)
Figure GDA0002771863040000491
*因软件的限制，第一次干燥时间从3240分钟变更为3200分钟。在进行第二次干燥之前，皮氏计(Pirani gauge)和电容压力计(capacitance manometer)进行了合并。
图28示出整个冷冻干燥循环的流程。当施加真空时，因从升华的热损失，上述生成物温度约降低成-40℃。皮氏计值在约为41小时与电容压力计读取值合并，这意味着第一次干燥工序的完成。在整个循环的62小时后，在20℃温度条件下开始第二次干燥，对样品还进行干燥13小时。整个循环约持续了75小时。
所测定滤饼的水分含量呈现在表32。
表32：水分含量结果
剂型代码 水分含量(％)
F1 2.30
F2 1.51
F3 1.78
F4 1.90
F5 2.39
F6 3.02
2.3.2冷冻干燥研究
外观检查(Visual inspection)：在冷冻干燥之后，F1、F2及F3呈现仅具有略微收缩(shrinkage)的良好的滤饼(decentcake)。F5呈现出显著的滤饼收缩(cakeshrinkage)。在F4(图32)及F6(图34)观察到滤饼的总瘪塌(collapse)。作为重组的液体样品的F1(图29)、F2(图30)、F3(图31)、F4(图32)及F5(图33)透明(clear)且无色(colorless)，没有可视微粒(particulates)，可以与冷冻干燥前(pre-lyo)对照组进行比较(comparable)。在重组后，F6具有模糊感(hazy)。
浓度(A260 )：如表33所示，所有样品在冷冻干燥前及重组后均处于其的目标浓度。
表33：浓度结果
Figure GDA0002771863040000501
pH及重组时间：因剂型(formulation)F3的缓冲限制，F3的pH在填充过程中并不稳定，而是迅速减少。当分析冷冻干燥前(pre-lyo)样品时，样品已从pH9.0减少至pH8.7。在重组后，与冷冻干燥前(pre-lyo)对照组进行比较来观察pH值的还减少(Δ＝-0.4)。与冷冻干燥前对照组相比，在重组之后，F1、F2、F4、F5、F6剂型(formulation)呈现出相同的pH值(Δ≤0.1)。重组的时间分析呈现出经冷冻干燥的滤饼在1分钟至1.2分钟之间被溶解(dissolved)。pH及重组小时结果详细呈现在表34中。
表34：pH及重组时间结果
Figure GDA0002771863040000502
Figure GDA0002771863040000511
浊度(turbidity)(A350、A450、A650)：在重组之后，在350nm、450nm及650nm中均观察到浊度(turbidity)的略微增加。如以下表35所示，其他所有剂型(formulation)并为呈现显著的(significant)浊度。
表35：浊度(Turbidity)结果
Figure GDA0002771863040000512
注(note)：为了获取样品的浊度值，而获取水的吸光度，将A650≥0.01考虑成浑浊(turbid)。
毛细管区带电泳(CZE，Capillary Zone Electrophoresis)：对于重组的样品，通过毛细管区带电泳，对生成物纯度进一步进行了研究。因浊度，并未对F6进行了分析。毛细管区带电泳的电泳图(electropherograms)及被整理成表的结果(tabular results)分别详细呈现在图35和表36中。与冷冻干燥前(pre-lyo)(99.1％-100.0％)相比，在重组后，所有剂型呈现出超螺旋峰的相应的减少(97.5％-99.0％)和开环峰的略微增加。与其他剂型相比，F4及F5呈现出0.4％以下的开环峰百分比的最小增加。除滤饼外观不良的(poor)剂型之外，当前剂型(F1)在冷冻干燥前(100％)及冷冻干燥后(98.6％)呈现出最高纯度。
表36：毛细管区带电泳结果
Figure GDA0002771863040000513
结论：本研究的目的如下，即，在冷冻干燥后，与在pH值为8.0中的2％甘露醇、1％蔗糖、0.45％氯化钠一同在作为10mM磷酸钾中的0.5mg/mL VM202的药物剂型(drugproduct formulation)中评价VM202的质量，不仅如此，从药物剂型评价pH和/或膨胀剂(bulking agents)及稳定剂(stabilizers)的浓度具有略微变化的剂型中的VM202的质量。在本研究中执行的分析方法包括毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis；CZE)、对于透明度(clarity)及滤饼外观(cake appearance)的外观检查(visualinspection)、浊度(turbidity)、浓度(A260)、pH及水分含量分析(Karl Fischer)，这些均是用于生成物的有效的稳定性指示分析(stability-indicating assays)。
在本发明的经冷冻干燥的剂型研究中，VM202按填充体积(fill volume)5mL，在每个小瓶中以2.5mg进行了评价。为了通过对于大规模VM202的稀释法(dilution method)确立适当剂型的制备步骤，通过0.9％氯化钠安慰剂(placebo)来执行小规模pH试验。
在冷冻干燥前，VM202的所有剂型透明，且没有可视(visible)微粒(particulate)，浓度为目标(target)浓度。在冷冻干燥及重组后，还观察到减少，同时，在pH9.0中的10mM磷酸钾剂型的pH在填充(fill)期间并不稳定，而是迅速减少。对于呈现出最高百分比的超螺旋形状峰的药物剂型和冷冻干燥前的所有剂型的毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis)结果呈现出高的纯度。
在冷冻干燥后，对药物剂型以及在更高的pH及更低的pH中对药物剂型观察到良好的(decent)滤饼。在重组之后，具有最高浓度的氯化钠的剂型呈现出模糊感(haziness)，但剩余剂型透明且无色，没有可视微粒，可以与冷冻干燥前(pre-lyo)对照组进行比较(comparable)。在重组后，呈现出超螺旋形状峰的相应减少，且所有剂型呈现出开环峰的略微增加。除滤饼外观不良的(poor)剂型之外，药物剂型在冷冻干燥之后，通过毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis)呈现出最高纯度。
从本研究获取的结果意味着在20cc小瓶中，按5mL的填充体积(fill volume)，在pH值为8.0、2％甘露醇、1％蔗糖、0.45％氯化钠中与10mM磷酸钾一同以0.5mg/mL冷冻干燥之后，冷冻干燥的VM202维持良好的滤饼外观及最高水平的纯度(超螺旋形状脱氧核糖核酸)。
实施例3.pTx-IGF-1X10的冷冻干燥的组合物
在冷冻干燥后剂型中，为了pTx-IGF-1X10的质量，而生成包含pTx-IGF-1X10的多种冷冻干燥的剂型并进行了分析。接着，在表37中列举的剂型为了进行分析而制备。
表37
剂型代码 缓冲液 pH 膨胀剂 稳定剂 PTX-IGF-1X10浓度
F1 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F2 10mM磷酸钾 7 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F3 10mM磷酸钾 9 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F4 10mM磷酸钾 8 1％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F5 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.60％氯化钠 0.5mg/ml
F6 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.90％氯化钠 0.5mg/ml
F7 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.2％氯化钠 0.5mg/ml
F8 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 0.5％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F9 10mM磷酸钾 8 3％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
3.1试验结果的概述
外观检查(Visual inspection)：在冷冻干燥后，F1、F2、F7、F8及F9呈现出仅具有略微收缩(shrinkage)的良好(decent)的滤饼。F5呈现出显著的滤饼收缩。F3呈现出泼洒(splashing)形态。在F4及F6中观察到滤饼的纵瘪塌(collapse)。作为重组的液体样品的F1(图36)、F2(图37)、F3(图38)、F4(图39)、F5(图40)、F6(图41)、F7(图42)、F8(图43)及F9(图44)透明且无可，没有可视微粒，可以与冷冻干燥前(pre-lyo)对照组进行比较(comparable)。为了确定样品的浊度(turbidity)(透明度；Clarity)，而将样品与Turbidity 4000NTU校正标准(calibration standard)I、II、III、IV进行了比较。具有“<I透明度(Clarity)”的剂型可被评价为并不浑浊。
浓度(A260)：如以下表38所示，所有样品在冷冻干燥前及重组后，处于目标浓度(target concentration)。
表38：浓度结果
Figure GDA0002771863040000531
pH及重组时间：在重组后，F3的pH值从pH9.0减少至pH7.6。与冷冻干燥前对照组进行比较，在重组后，F1、F2、F4、F5，F6、F7、F8、F9剂型呈现出相同的pH值(Δ≤0.5)。重组的时间分析呈现出冷冻干燥的滤饼在1分钟20秒钟及4分钟05秒钟之间溶解(dissolved)。pH及重组小时结果详细地呈现在表39中。
表39：pH及重组时间结果
Figure GDA0002771863040000532
毛细管电泳(Capillary Electrophoresis；CE)：对于重组的样品，通过毛细管电泳，对生成物纯度进行了还研究。毛细管电泳的电泳图(electropherograms)及被整理成表的结果(tabular results)分别详细地呈现在图45和表40。与冷冻干燥前(pre-lyo)相比，在重组之后，呈现出超螺旋形状峰的相应减少，以及除F3之外的所有剂型的开环峰的略微增加(0.5-3％)。除滤饼外观不良的(poor)剂型之外，当前剂型(F1)在冷冻干燥后呈现出超螺旋峰的最低减少。
表40：毛细管电泳结果
Figure GDA0002771863040000541
实施例4.pCK-SDF-1α的冷冻干燥的组合物
4.1实验设计
在冷冻干燥后，在剂型中，为了pCK-SDF-1α的质量，而生成包含pCK-SDF-1α的多种冷冻干燥的剂型并进行了分析。在以下表41中列举的剂型为了进行分析而制备。
表41
剂型代码 缓冲液 pH 膨胀剂 稳定剂 pCK-SDF-1α浓度
F1 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F2 10mM磷酸钾 7 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F3 10mM磷酸钾 9 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F4 10mM磷酸钾 8 1％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F5 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.60％氯化钠 0.5mg/ml
F6 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.90％氯化钠 0.5mg/ml
F7 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 1.0％蔗糖，0.2％氯化钠 0.5mg/ml
F8 10mM磷酸钾 8 2％甘露醇 0.5％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
F9 10mM磷酸钾 8 3％甘露醇 1.0％蔗糖，0.45％氯化钠 0.5mg/ml
4.2.试验结果的概述
外观检查(visual inspection)：在冷冻干燥后，F1、F2、F3、F7、F8及F9呈现出仅具有略微收缩(shrinkage)的良好(decent)的滤饼。F5呈现出显著的(significant)滤饼收缩(shrinkage)。在F4及F6中观察到滤饼的总瘪塌(collapse)。作为重组的液体样品的F1(图46)、F2(图47)、F3(图48)、F4(图49)、F5(图50)、F6(图51)、F7(图52)、F8(图53)及F9(图54)透明且无色，没有可视微粒，可以与冷冻干燥前(pre-lyo)对照组进行比较(comparable)。为了确定样品的浊度(turbidity)(透明度；Clarity)，而将样品与Turbidity 4000NTU校正标准(calibration standard)I、II、III、IV进行了比较。具有“<I透明度(Clarity)”的剂型可以被评价为并不浑浊。
浓度A260：如以下表42所示，在冷冻干燥前及重组后，所有样品处于目标浓度(target concentration)。
表42：浓度结果
Figure GDA0002771863040000551
pH及重组时间：在重组之后，F3的pH值从pH9.0减少至pH7.9。与冷冻干燥前(pre-lyo)对照组相比，在重组之后，F1、F2、F4，F5、F6、F7、F8、F9剂型呈现出相同的pH值(Δ≤0.5)。重组的时间分析呈现出冷冻干燥的滤饼在1.5分钟至4分钟之间溶解(dissolved)。pH及重组小时结果详细地呈现在以下表43中。
表43：pH及重组时间结果
Figure GDA0002771863040000552
毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)：对于重组的样品，通过毛细管电泳，对生成物纯度进行了还研究。毛细管电泳的电泳图(electropherograms)及被整理成表的结果(tabular results)分别详细地呈现在图55和表44中。与冷冻干燥前(pre-lyo)相比，在重组之后，所有剂型呈现出超螺旋形状峰的相应增加以及开环峰的略微增加(0.5-2％)。除滤饼外观不良的(poor)剂型之外，当前剂型(F1)在冷冻干燥之后呈现出超螺旋峰的最低减少。
表44：毛细管电泳结果
Figure GDA0002771863040000561
文献的引用(INCORPORATION BY REFERENCE)
在本申请中引用的所有刊物，专利，专利申请书及其他文献中，每个刊物、专利、专利申请或其他文件在所有目的上通过个别参照结合在本申请，在所有目的上，其全文通过参照结合在本申请。
等同技术方案(EQUIVALENTS)
虽然示出并说明了多个特定实例，但并不局限于上述说明书。需要理解在不超出本发明的思想(spirit)及范围的情况下，可以进行多种变更。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，可基于本说明书进行多种变形。
序列表：
Figure GDA0002771863040000562
Figure GDA0002771863040000571
Figure GDA0002771863040000581
Figure GDA0002771863040000591
Figure GDA0002771863040000601
Figure GDA0002771863040000611
Figure GDA0002771863040000621
Figure GDA0002771863040000631
Figure GDA0002771863040000641
Figure GDA0002771863040000651
Figure GDA0002771863040000661
Figure GDA0002771863040000671
Figure GDA0002771863040000681
Figure GDA0002771863040000691
Figure GDA0002771863040000701
Figure GDA0002771863040000711
Figure GDA0002771863040000721
Figure GDA0002771863040000731
Figure GDA0002771863040000741
Figure GDA0002771863040000751
Figure GDA0002771863040000761
Figure GDA0002771863040000771
Figure GDA0002771863040000781
Figure GDA0002771863040000791
Figure GDA0002771863040000801
Figure GDA0002771863040000811
Figure GDA0002771863040000821
Figure GDA0002771863040000831
Figure GDA0002771863040000841
Figure GDA0002771863040000851
Figure GDA0002771863040000861
Figure GDA0002771863040000871
Figure GDA0002771863040000881
Figure GDA0002771863040000891
Figure GDA0002771863040000901
Figure GDA0002771863040000911
序列表
<110> HELIXMITH CO., LTD.
<120> 用于裸脱氧核糖核酸基因疗法的经冷冻干燥的药剂学组合物
<130> 33730-40319/WO (014WO)
<140>
<141>
<150> 62/700,655
<151> 2018-07-19
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 728
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
275 280 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305 310 315 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
325 330 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
340 345 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355 360 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595 600 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610 615 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645 650 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690 695 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
<210> 2
<211> 723
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg
165 170 175
Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg
180 185 190
Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr
195 200 205
Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly
210 215 220
Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe
225 230 235 240
Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg
245 250 255
Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His
260 265 270
Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met
275 280 285
Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln
290 295 300
Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro
305 310 315 320
Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro
325 330 335
Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
340 345 350
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg
355 360 365
Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln
370 375 380
Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln
385 390 395 400
Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp
405 410 415
Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu
420 425 430
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr
435 440 445
Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys
450 455 460
Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile
465 470 475 480
Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr
485 490 495
Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His
500 505 510
Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg
515 520 525
Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly
530 535 540
Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu
545 550 555 560
Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu
565 570 575
Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile
580 585 590
Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser
595 600 605
Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu
610 615 620
Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His
625 630 635 640
His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala
645 650 655
Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu
660 665 670
Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro
675 680 685
Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val
690 695 700
Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val
705 710 715 720
Pro Gln Ser
<210> 3
<211> 482
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
ag 482
<210> 4
<211> 1675
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa gggggaccct ggtgtttcac 60
aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct cagtgttcag aagttgaatg 120
catgacctgc aatggggaga gttatcgagg tctcatggat catacagaat caggcaagat 180
ttgtcagcgc tgggatcatc agacaccaca ccggcacaaa ttcttgcctg aaagatatcc 240
cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcccgat ggccagccga ggccatggtg 300
ctatactctt gaccctcaca cccgctggga gtactgtgca attaaaacat gcgctgacaa 360
tactatgaat gacactgatg ttcctttgga aacaactgaa tgcatccaag gtcaaggaga 420
aggctacagg ggcactgtca ataccatttg gaatggaatt ccatgtcagc gttgggattc 480
tcagtatcct cacgagcatg acatgactcc tgaaaatttc aagtgcaagg acctacgaga 540
aaattactgc cgaaatccag atgggtctga atcaccctgg tgttttacca ctgatccaaa 600
catccgagtt ggctactgct cccaaattcc aaactgtgat atgtcacatg gacaagattg 660
ttatcgtggg aatggcaaaa attatatggg caacttatcc caaacaagat ctggactaac 720
atgttcaatg tgggacaaga acatggaaga cttacatcgt catatcttct gggaaccaga 780
tgcaagtaag ctgaatgaga attactgccg aaatccagat gatgatgctc atggaccctg 840
gtgctacacg ggaaatccac tcattccttg ggattattgc cctatttctc gttgtgaagg 900
tgataccaca cctacaatag tcaatttaga ccatcccgta atatcttgtg ccaaaacgaa 960
acaattgcga gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt 1020
gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac 1080
tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca 1140
tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt 1200
atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga 1260
tgattttgtt agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag 1320
ttgcagtgtt tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt 1380
ggcacatctc tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac 1440
tctgaatgag tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg 1500
ggattatggt ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat 1560
tgttcctggt cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata 1620
ttatgcaaaa tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag 1675
<210> 5
<211> 3756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 5
cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg 420
gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480
tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga 540
cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 600
accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 660
accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga 720
gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt atgcatgcta 780
tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg tgatggtata 840
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 900
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tatctctatt ggctatatgc 960
caatactctg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtcccat 1020
ttattattta caaattcaca tatacaacaa cgccgtcccc cgtgcccgca gtttttatta 1080
aacatagcgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1140
cggtagcggc ggagcttcca catccgagcc ctggtcccat gcctccagcg gctcatggtc 1200
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca caatgcccac 1260
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1320
agattgggct cgcaccgctg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1380
aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1440
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 1500
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 1560
ttgacacgaa gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattctgcag 1620
atatccagca cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 1680
ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 1740
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1800
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 1860
ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga 1920
aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag 1980
cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 2040
tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 2100
tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 2160
ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg 2220
tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 2280
tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 2340
gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 2400
cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca 2460
gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt 2520
tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 2580
agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 2640
agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga 2700
aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc 2760
ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca 2820
gctggcaatt ccggttcgct tgctgtccat aaaaccgccc agtctagcta tcgccatgta 2880
agcccactgc aagctacctg ctttctcttt gcgcttgcgt tttcccttgt ccagatagcc 2940
cagtagctga cattcatccg gggtcagcac cgtttctgcg gactggcttt ctacgtgaaa 3000
aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 3060
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 3120
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 3180
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 3240
ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 3300
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 3360
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 3420
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 3480
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 3540
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 3600
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 3660
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 3720
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatg 3756
<210> 6
<211> 4956
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
gtaagaacag tatgaagaaa agagatgaag cctctgtctt ttttacatgt taacagtctc 60
atattagtcc ttcagaataa ttctacaatc ctaaaataac ttagccaact tgctgaattg 120
tattacggca aggtttatat gaattcatga ctgatattta gcaaatgatt aattaatatg 180
ttaataaaat gtagccaaaa caatatctta ccttaatgcc tcaatttgta gatctcggta 240
tttgtgaaat aataacgtaa acttcgttta aaaggattct tcttcctgtc tttgagaaag 300
tacggcactg tgcaggggga gaggttgatt gtgaaaaatc agaggtagat gagaatctta 360
ctgagggctg agggttcttt aaccttggtg gatctcaaca ttggttgcac attaaaatca 420
cctgctgcaa gcccttgacg aatcttactt agaagatgac aacacagaac aattaaatca 480
gaatctctgg ggagaatagg gcaccagtat tttttgagct cccaccatga ttccaaagtg 540
cagccaaatt tgagaaccac tgctaaaagc tcaagcttca gattgaccag cttttccatc 600
tcacctatcg cctaaagacc aaattggata aatgtgttca ttacgacaga tgggtactat 660
ttaaagatga gtaaacacaa tatacttagg ctcgtcagac tgagagtttt aatcatcact 720
gaggaaaaac atagatatct aatactgact ggagtattag tcaaggctta tttcacacac 780
aattttatca gaaaccaaag tagtttaaaa cagctctccc cttattagta atgcattgga 840
gggtttactt taccatgtac cttgctgagc actgtacctt gttaatctca tttacttgta 900
atgagaacca cacagcgggt agttttattg gttctatttt acctacatga caaaactgaa 960
gcataaaaac acttagtaag ttttcagtgt catgcacaac taggaagtga catggccaga 1020
atataagccc agtcaccatc actctataac ctgcgctttt aacaacttca gggcatgaca 1080
catttggccg gtcagtagaa cccatgctgt gatttgtttt tgcagtggtg gtgatgactg 1140
ccttgttgaa tccacttttt attctattcc attttgggga cacaattctg caagatgatt 1200
cttcattagg aaacagagat gagttattga ccaacacaga aagaaaaaga gtttgttgct 1260
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ctgatcatct ctacaacatt tcaataacag aaaacaacaa ttttcaaaat tagttactta 1380
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<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
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catataaggt gtaagatgtt aaaggttatg gttacactca gtgcacaggt aagctaatag 3900
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
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<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
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gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt 2640
ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt 2700
attttaacat ataaggtacc acagtcatag 2730
<210> 15
<211> 3250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 15
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatgt cgacctcgag tctagagggc 1380
ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1440
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 1500
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 1560
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggagtcga 1620
aattcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc 1680
gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc 1740
acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat 1800
gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt 1860
cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg 1920
cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg 1980
agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc 2040
aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag 2100
gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc 2160
ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag 2220
ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag 2280
aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg 2340
ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa 2400
tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc 2460
cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc 2520
aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgcgt cagaccccgt 2580
agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 2640
aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 2700
ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 2760
gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 2820
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 2880
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 2940
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 3000
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 3060
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 3120
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 3180
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 3240
tgctcacatg 3250
<210> 16
<211> 4108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 16
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatat gggaaaaatc agcagtcttc 1380
caacccaatt atttaagtgc tgcttttgtg atttcttgaa ggtgaagatg cacaccatgt 1440
cctcctcgca tctcttctac ctggcgctgt gcctgctcac cttcaccagc tctgccacgg 1500
ctggaccgga gacgctctgc ggggctgagc tggtggatgc tcttcagttc gtgtgtggag 1560
acaggggctt ttatttcaac aagcccacag ggtatggctc cagcagtcgg agggcgcctc 1620
agacaggcat cgtggatgag tgctgcttcc ggagctgtga tctaaggagg ctggagatgt 1680
attgcgcacc cctcaagcct gccaagtcag ctcgctctgt ccgtgcccag cgccacaccg 1740
acatgcccaa gacccagaag gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt 1800
ctctctcttg tgcatgtggg tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta 1860
caagtcagaa aagctccttt gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa 1920
caaacatggg ctttggtgtc agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta 1980
gagagaaaag acttttaggt gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga 2040
ttcattcttt ctcttcccag tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga 2100
gaaggaaagg aagtacattt gaagaacgca agtagctttt tctcctttat ttataggaag 2160
tacatttgaa gaacgcaagt agagggagtg caggaaacaa gaactacagg atgtaggtcg 2220
acctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 2280
gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 2340
ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 2400
ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 2460
ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg 2520
ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc 2580
aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc 2640
cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa 2700
gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct 2760
ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac 2820
aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa 2880
tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac 2940
tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag 3000
cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt 3060
cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag 3120
gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc 3180
agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc 3240
cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc 3300
ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt 3360
tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccggttcgct 3420
tgctgcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3480
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3540
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3600
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3660
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3720
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3780
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3840
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3900
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3960
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 4020
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 4080
ggccttttgc tggccttttg ctcacatg 4108
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 17
agctggcaat tccggttcgc ttgctgcgtc agaccccgta 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 18
tacggggtct gacgcagcaa gcgaaccgga attgccagct 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 19
ctaatccata acatggctct agacttaagg cagcggcaga 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 20
tctgccgctg ccttaagtct agagccatgt tatggattag 40
<210> 21
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 21
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
acatccccat ctctttggtc actctgcatt gcaaatttcc cctcccaccg ctatggacga 600
tgtgatgatt ggaagatgtt acaaaacagt ggctaaacaa acatgggctt tggtgtcaga 660
caaaagtgaa gtcctggctt tctcacacac cagcttagag agaaaagact tttaggtgaa 720
tgtggcagga aagcgtgctt gctggggcaa aggcagattc attctttctc ttcccagtat 780
cagcccccat ctaccaacaa gaacacgaag tctcagagaa ggaaaggaag tacatttgaa 840
gaacgcaagt agctttttct cctttattta taggaagtac atttgaagaa cgcaagtaga 900
gggagtgcag gaaacaagaa ctacaggatg tag 933
<210> 22
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 22
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
acatccccat ctctttgcta aacaaacatg ggctttggtg tcagacaaaa gtgaagtcct 600
ggctttctca cacaccagct tagagagaaa agacttttag gtgaatgtgg caggaaagcg 660
tgcttgctgg ggcaaaggca gattcattct ttctcttccc agtatcagcc cccatctacc 720
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtagctt 780
tttctccttt atttatagga agtacatttg aagaacgcaa gtagagggag tgcaggaaac 840
aagaactaca ggatgtag 858
<210> 23
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
130 135 140
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
145 150
<210> 24
<211> 462
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac 420
gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac tacaggatgt ag 462
<210> 25
<211> 158
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys
145 150 155
<210> 26
<211> 477
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtag 477
<210> 27
<211> 137
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
Met Ile Thr Pro Thr Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
20 25 30
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
35 40 45
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
50 55 60
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
65 70 75 80
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
85 90 95
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
100 105 110
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
130 135
<210> 28
<211> 414
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
atgattacac ctacagtgaa gatgcacacc atgtcctcct cgcatctctt ctacctggcg 60
ctgtgcctgc tcaccttcac cagctctgcc acggctggac cggagacgct ctgcggggct 120
gagctggtgg atgctcttca gttcgtgtgt ggagacaggg gcttttattt caacaagccc 180
acagggtatg gctccagcag tcggagggcg cctcagacag gcatcgtgga tgagtgctgc 240
ttccggagct gtgatctaag gaggctggag atgtattgcg cacccctcaa gcctgccaag 300
tcagctcgct ctgtccgtgc ccagcgccac accgacatgc ccaagaccca gaaggaagta 360
catttgaaga acgcaagtag agggagtgca ggaaacaaga actacaggat gtag 414
<210> 29
<211> 195
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu
145 150 155 160
Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys
165 170 175
Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys
180 185 190
Lys Gly Lys
195
<210> 30
<211> 588
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggttggccaa agacacatcc aggaggggaa 480
cagaaggagg ggacagaagc aagtctgcag atcagaggaa agaagaaaga gcagaggagg 540
gagattggaa gtagaaatgc tgaatgcaga ggcaaaaaag gaaaatga 588
<210> 31
<211> 402
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga ag 402
<210> 32
<211> 1505
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc 180
tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac 240
atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagcc 300
cttggcaaat aatgtgatgt acccaagcct cagtttcatc agtaacattg ggataataat 360
aatatctacc acatcagttt gttgtcaaaa ttaagtagct catgcatata ctttgagatg 420
cttttcacat gcctgcataa agtaattgtt ggaccatcgt taatgtctgc cataattgca 480
cttaataaca aagcttgtaa cctttcaagt tctgagattc tacaatcttc caaagaaaat 540
aaaaggctaa tgggaactat tcaaaattca tattcagtag caagcataat taaacatgaa 600
acattaaaaa tagaaatttc tgtttggcta taagaatgcc tagacatttg taatgatcaa 660
aatctgcagg catcattttc taagagctag actgtaaaca aacctcagag gtaccaacta 720
tgccatcagt agtacataaa acatctgatg cacatttagt cacttgatcg atttctcttg 780
aatgagtgaa cgaatgaaca aatgaatata agagattaaa attttagcca ttaagtagaa 840
agaataagaa ctaaagagaa ggtaaaggag gaaaaagaga aggcaaggaa gttgagtaag 900
ggaagaaata gctctcgttt aagtattttg gggactctgt tgaaaaaaga aatgccaaca 960
tgtggtttta atctttggag ctagaactaa taatattgtg caaaagcaca agatgagaga 1020
tcaagaagtt caccatgaca ccttcgctgc ttcctggtct taaacctcag ctgaggctgg 1080
aagaggacca tggtggctta ttggagatgt gaccccaggg agcccctctg aaggatggaa 1140
ggggactggg caagacccaa cacacacaga acacagtagc cactggccag gcaggaagca 1200
aggatctcag aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag 1260
gcagattcat tctttctctt cccaggtgac ccagcgcctc ttggtttcta actggggagg 1320
gggtaggtgt caagagatga gtcccaaagt tctggaatgg tgggtcttgt gactgaggtc 1380
tagacccctc tccagcatga gtgctgtctc ctgcatcata tggagcctgg gcattctgag 1440
ctcattcaaa gggacaccat gggaaccact tgttctcaat gcaattattt ttgtgatgtt 1500
tacag 1505
<210> 33
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga gaaggaaagg aagtacattt 60
gaagaacgca agtag 75
<210> 34
<211> 15250
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
aggacaggag gattaaacag acagaggcaa ggatgatgag agaggagcag acagcaagaa 60
tgaaaagcag aaaatacaat agaggaaatg aagaaaagta ggcctgctgg agctagatga 120
tgatgtgatg gaaatagaag taacctttta gagaatctcg ctaagaaaca tggagaaaac 180
ggaaaagaaa aatgtaatgc cctagaaagc gcaaagaaag acagtggcaa aaatgaaaaa 240
aaaaaataaa aattataaaa gaggcaaaaa aagacacact attctctgcc tctaaaacac 300
aattaaataa aagaatttaa ataaaaatta aggcttctat atgcattttt aaattttgta 360
tgaatctgtt atggaagaat tgcctatgtc aatatatgtt cagagttaaa tattagcccc 420
aaatgctcag caagactgaa ttgtgtcata gaagttccca gattcccttt tcccgcaatg 480
tcattggagg ctgcatttct tagtcaagtc cagggtttag gccaaagggc atccggtatt 540
gcctaaaacc ctgtgaggtc tgtgaggtaa cttttgagaa gaggtcactg cactcttcat 600
cttttttgca ctttggaatc agatataaaa gatgtataag tttgctaggg ctgccataac 660
aaagtatcat aggctaggta gtttaaacca cagaaattga ttttttcata gttctgggag 720
ttgaaagtcc aaaatcaaag tatcagccct tgcaagggcc ttagagaagg ctctgtcatg 780
ggctcctccc ctcggcttgt aggtggcctc cttcttctcc ccctgtgtct tcacttcatc 840
ttccctccat acatatctct gtgtctaaac atcctctgtg tgaaacaaca ccagccaggt 900
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cacaattcag ccagtgacag aagacttctg atctctgatg ataaccactg cattttgatt 1080
acagctccta gaaaacactc ccctccacca ccccaccaca gatctatttt tatatctgaa 1140
accctgagtt tctgctccat gagaacccca ggaacatact atgttagatc tggaagaagc 1200
ctcagaaatc cccttatttt gaagactagg acactgagat ccagaagtgg gtaaagatgt 1260
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tcaactaaga aagaattcca gaaggaaaag agagggcaga aatgaaggga gagaatgaga 1380
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ataataaagc aaaaactctc gccatcctcc aagttgtgaa ttagaagagc tgagaaaggg 1560
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cctcctttct gcctggtcct ccatgcctct gccatgcttt ttactccagg atcacccttt 1740
ctagtggttc actgaaaacc caggattact taaatatgat ggacatgttc acggctcaat 1800
ccaggaggaa aaggtcgaac tgaaagcatg ccaaagcccc acatgggagc caagccactg 1860
ctgctgtggt tgcaaagtgg atcctggctt atcagagcag agagaagcca ggctcgtgcc 1920
ttagcccaag tggccagtca ccttattcag gagatactaa gttctccagc taagacatcc 1980
atgctttggg accagctgca gacagaagcc aattcctact acaaccatca ccttagagta 2040
gcatatagac acagatggct cttcaaagga ccacagttcc atggaataac taagaattca 2100
tgtcctgtgg aaaggtttga ataaactata attataccca atcataaatt tcattcaaga 2160
agaactaaag caaaggcaaa gacagagaga agaaggaagg aaggagggag ggagggaggg 2220
aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaagggaa 2280
ggaagaacaa aaagactttc tagttaaaga atgcttaact agcaaactat gtactataag 2340
acagttcttt tcggaatgag ttttatcaac tctaaagcaa ttatcttgaa tgcctacatg 2400
tgattactga ataatatgaa ccaagaaaac agaaagaatc tatattatct ttccatttcc 2460
ttctttccag tatcaatacc caagcctcta gtgatacatg gcatataatg ttggatggat 2520
ggatggatgg atggatggat ggatggatgg atggatggat gaatggatgg ttggatggac 2580
aaatgagtaa cataggctga tgaatagtgg tagaaagaca caccataaaa acaagtggca 2640
cttctgagat gaaatgattc ctattctcct acacaagaca gtgaggcaag tacagagtaa 2700
aaaaggaaag gcataggagc tatgcttata caagtattgt atgtttggaa tttccttcgc 2760
tggccaaatt gaaattgttc aaggacctat tgctacaggt ggcaactggc taagaatttc 2820
atagtgaata ttatacacct attactcccc ttaatgtttc tttgaagtaa gcagaatatt 2880
aataatcatt taaaattcca gtgtttcaac ttcaattgtt tcctagggca aattgataat 2940
tgtgtgtaaa actaattgga atatgtatgg aataatcatc ctgaaataaa attggtgaaa 3000
agtatttgtt attgggcatc tacaatgtgc aaacctctgt actaggcatg aacaagagtt 3060
ataagcattg gagaggctaa aatatagtcc ttaaggctgg gcacagtggc tcatgcctgt 3120
aatcctagca ctttgggagg ccaaggcggg cagattgcct gagctcagga gttcaagacc 3180
agcctgggca acatagcgaa accccatctc tactaaaaat acaaaaaaat tacctgggca 3240
tggtggcacg cacctgtaat cccagctact caggaggctg aggcatgaga attccttgaa 3300
cctgggaggc agaggttgca gcgagccgag atcctgccgc tgcatcccag cttgggtgac 3360
agagtgagac tctgtctcaa aaaaaaatta aataataaat aaatagtaaa atacagtcat 3420
taagagtaca aaatgtagat tcagactacc tgggttcaaa tcttggctct tacttgcatt 3480
gtggctttgg gcagatcatg taacttatgt gtgcctcagt ttcctcatct gttaaatagg 3540
ggcaacaact gaatctacct tattcagttg ttgtgagggt ttattgagat tgtgtgtgtg 3600
tatgtgtgtg agtgtagtgt gtgcatgtgt gtgtctgtgc aaggagtggg aggtgtatat 3660
tcagagacac atattacagc acttaaaatg gtatctagca cttagtaagc attattcaag 3720
ttttagttaa cattatttta cttacctctg aaaattggag ctatgtgaaa aagaagttgg 3780
tctcctgaag tagaagccag tcttgtgtca ccaaaaactt caagcccaag cttgccaacg 3840
cttttccatg atgtggtagt agagtttcaa gcatgtggta ggataagaga actcaatgac 3900
ctaagaacca ttccaaccca gagaacccct ggttctatga ataattccaa cttaaatagg 3960
tagcttggct ctcccaagtg agagccattg cttctgtttc cgggtcatat aatgaacttt 4020
cagaaaacca ccatttttct caaccagtta aaattaagtg taatacgtgc tttcatttca 4080
tggtgcctgg ggaaaattta attgtagtat gaactccagt tattggtagt cttaagtaaa 4140
attgccaaaa taaatagaaa tgcaggatat ttctgggctc acacagcttc cgggacactt 4200
tagtttcttg ggctgccaat ccagtgcctt tcacaagcat ttgatctttt ttcaaacatc 4260
tcttgaaaac aaacaaaacc tcacacagct tctaatgtgt gcactgttcg aatgtaaggg 4320
tggaaaagga ggcaaagaaa tgagctccca aagagcaatt ccccttctct cgcctccatc 4380
ccttgacgac ctccctccca ctaaagggaa acattgtttt cttaggtaat aaattctgca 4440
atttctcaag tccattaaca tccactgggc aagatgagat ctattctttt tatttgccca 4500
taggaaaaga atagtgcttt tttgcaatat tcactagata acacagagtt gacttttaat 4560
ccaagggcaa cattgatagt ctctagttaa aggggaagcc ttcaggagca atgaaaagat 4620
taatagtttt agatgaagca gaatccaaat ccctttttat gagttttgaa atatccagtt 4680
tgtatgctca cctcaatact taaagcccag ttactgattc ctttggccta agcaagacag 4740
gtcaattttt aaagagggag tagctgaggt tagcaaaaat tctccaggtc cacaaaactt 4800
ccagacctgc aaggtgaaaa tcagcttttc tgtcatccct aaaggcctaa ctggaatcag 4860
aacttttccc tgatgcccac atatttggag gtcctttttt aatgggactc cttaatgcct 4920
ttagtgccat cccattttca tccagtgtcc aaaagaaatg atttaaaaat ataaacgtat 4980
gtttaaattc cagaagagag aaatggagat tgagaacaat agggaaatga tgagagctat 5040
gggaaaagag gtttatgagt ccatgtctga ttcttccaga gagcccctaa gaaagttctt 5100
atcataccag gaactcaatt ataactttca ttgcctattg ttagatgagt aacaggagct 5160
agaaaacatt ttggaaattc ccatctttat ttttttaact aatatgatta tagttttaag 5220
aaccattggt caagaagcta actttttaaa aagtggaagt atgatggtta gaaataagaa 5280
tgctaaaggt gcatcaagct gattttaatt ctaaatgtcc ttggcagcaa tttagaatct 5340
gtaataaact acaccaaaca gttttgaggg gaaggggatt agtttctccc cttccttcgt 5400
gtgtgtgtgt gcgcgtgtgt gtgtgtgcac ctttgtgttc tagcattgtt gcacccatta 5460
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tcagtgaagg taaattcctc tgtaaaaact aaccatcatt cagtaaaaac tgcaggattc 5580
ctttgtcttc tcaaaagcct gtttctcatc ctaaattaaa aattattcag gaaatagaga 5640
ggacattatt ggaggggtgg aaataagttg gttttctttt tattgtatct tttgaggatc 5700
cagggacttc taccatttcc catctaacat acagagaagg attctctagg tccctgtcta 5760
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tattgaccca ttacaaccaa aggtcaatgc atccagccaa tcttccttct atcatcccct 5880
gcccttactt ctattaggga ctgggattac aggcaaaacc catcaaatgc ctcttctacc 5940
actttcccat ttcttaacca ttagcctcta acttcctcta ttcagtttct catatgcttt 6000
catgcccatt gggtcagata aaggaacatt catttatttg agtaggcatc tgttatgatc 6060
actccggaaa aaagatgaca atgggttacc ttgtcctcct gggcttctct aactgacatg 6120
gtcaaaatgc ccatatgaag ataagatgtt aagagcaaga tttatgaaaa gctgagtatg 6180
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acatcaaacc caaaccggcc aaatggtcca agcttccaag ctgggatcca tggctaaagt 6300
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ccatggcagg ttgacggttg agtaaggttc tcaatcagcc gacaattgta gagttgggga 6540
tgtgcaatgt ttatgtcatg gtgtaagtat gtggcatgct tgactagctt gtgaggcact 6600
ggaagactag aaggaatgaa aaatatgaat gaatcaataa atgcatagta taattactgt 6660
tattttgtca gtattgtttt acctaggtca ctattgaatg ctctgatttg tctctttata 6720
aataataata tgttttcttc ttcaaaagaa cactaggatg aaggtagagg tgcttttggc 6780
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ttctctgcct tggaatagca ctggctggca ttctgcatgt ttacttttat atgctgaagg 6900
cccccatcaa cctcaaacag aggcaaatca atttaacttc tcatagtgtt attttgttca 6960
tcctaaaagt tcaagagagc cttccaaact tccaaaattt ctctcaattc agtgaggagg 7020
aaaattcaga acacagcatt tgaatgttct gcccagattt gtcacacaca caaggaatga 7080
gtgaaagagg gcaacaccct ttcctcctaa ccctgtgaac tcatcactat tgcattgaaa 7140
tgacaccaaa aggtaaaaac cctaggcctc acatctccca agaacactgc aataggagtt 7200
actgcataca ccagtttaag taactctagc ataaattgta tgtcagatga aacaatggca 7260
ttttggaggc ttaagagaaa aagaataatc aaatccagtt tttaggtact aatgtgctga 7320
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atcaacagtc tggggagccc tgatcctgaa gtattttaca acatccttca tgactattaa 7560
aggcaacata aacacctctt gtcagcaagg gaaactaccc ttggcatttt tttttctttg 7620
ttccccaggc ttttaaacca ttttgataga gattttttac atcacaggca gaaatatttg 7680
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gtaacaatta aaaagtaaat taaaaagaat cataatagct gatattgatt aggtacttgc 7980
cctgtggcaa gagctatagg gaatcacctc atttaatctt cacatgaagc ttgcagagtg 8040
agtaccacaa ttatcactat tgtatagaca ggaaaactca ggctgagtat ggctaagtgt 8100
cttgccaacg tcttgggcta acaagcggtc aagcagaatc caaacccgag atagatagac 8160
cacagtgtgc taatcaagca ctgcactctc tcctgcattt cttagttgat atttaccata 8220
tacaatctgt cacttgtatg agatggcagg gggttctgtg ctatttgtcc ttgtagagaa 8280
taccacagga agaaagtaag cagccatgca atatttgctg ttgacctgaa ctccattcca 8340
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gcttgagcaa atgtagaccc agagagggct cttacagcac acaagccaga acagactgat 8580
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ggtgctctta ccccacactt tcattttaca gaagaggaaa ttgaggacag cacaatgtag 8760
tgattatcaa aggtcacacg actactgtgt gggagagcta ggatttaaac cagatgcata 8820
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gggggaatta atgtgtgaac agaaataggg gaggataggc aaagccatca gattgcaagg 8940
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gttcaagcaa ttttcctgcc tcagcctcct gagtagctga aactacaggc acacgccacc 10860
acaccaggct aattttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccatgt tggccaggct 10920
ggtctccagc tcctgacctc aagtgatctg cccacctcgg cctcccaaag tgctgggatt 10980
acaggtgtga gccaccacac ctggcacagt aatcttaatt gaaaagtctg tggatagctt 11040
tccaaaggaa agcttggagc ttggataaga accaagagat aatgggagaa ggtgaatggc 11100
ctcttcaggg ccttttctag caccctaaat atgcgtgtct gtccataatg ggtaatcata 11160
tatatcacaa atcaaaccct ccacaaactt atttcctaat gtgtttgtta acctttcctt 11220
ctaaagggta aacttcttta accaacccca gtgagctgga ggatcaatgt tttcttaata 11280
gtcttacctt cgttggtgtc aataggaaac agtatttact cactactgtt ttccttttaa 11340
aaatctgtct agttgcatac tagaaacagt ttcagctggt ttgtttgtat tggacaagct 11400
gctgaagtga aaagtttttg cttgactgaa tgtgagacag tttcataact cttcaagaag 11460
tgcaccaaag gtgggtgcca gctctgatga cggctgcttc taacatgcct ccacttgccg 11520
cccattgtca agggtggctg gcgtaattaa gttaagacaa tgagcaaagc aacagatgca 11580
actgagacct agtccctgag tgcttttgtt ttgtcactgt cattgtctgc aacaaagaag 11640
tcacatgtga cagcctggga agagagccaa atgcaaacca gacgatatcc cagctggttt 11700
gaatggcctc caccgtgcac gtgtgtgcat gggaatcatg ctacttggta cagcatctgc 11760
ttcactcaag tgagtttcag cccatggctt tgctgtgatg ctgagacaga cccagaagaa 11820
acagaccagg gaatccctcc gctcagactt tacactttat accttgtgct ttgagagaaa 11880
agaaaaagaa tctctctatt ggagacaaaa aataggatgt atgtggttgg tcaatctaac 11940
ctcaattctt tttgctatag ccccccgcta atttaaagag tgaagcatag atggtatctt 12000
aatgttttct tgtagaaatt tgggattaat ttggcttgag aggaagaatg gagattaaac 12060
gctttatgag gctttctttt aatttgttcc catttcattc ctgaatattt tcttagtttg 12120
ggcattgcag atgtttaaag aacttcttat tttgagctgg tatgcctctt aaacagaaaa 12180
acaaaaggta aaattcaaat tagtgtgttt ctccgcctgt taattaattt ggttagtagt 12240
taggcagaga gatggcatcc ttaataatat ctattttgcg ggtttgatca gctacagacc 12300
atcaacagtg ttgattgaga attgaacaaa aacatttcaa ggagtttggg aacattaggg 12360
atgctattct gtggccccat gtgtccttct ctcatttttc tagagaactc ctataagaaa 12420
gcagaacacg gccaggcatg atggctcatg cctgtaatcc cagcacttca ggaggctgag 12480
gcaggcagat cacctgaggt caggagttca agaccagcct ggccaacatg gtgaaaccct 12540
atctctatta aaaatacaaa aaattagctg ggcatgatgg cgcgtgcctg taatcccagc 12600
tacttgggag gctgaggcag gagaatcact tgaactggga ggcaaaggtt gcagtgagcc 12660
tagatcacac cactgcactc cagcctgggt gacagagtga gactccaact caaaaaaaag 12720
aaagaaagaa agaaagaaag cagaacccaa tggaagatta agaacacaca tttagcttac 12780
gcctgtaata ccagcacttt gggaggccaa ggcgggtgga tcacaaggtc agaagttcga 12840
gaccaacctg gccaatatgg tgaaacccca tctctactaa aaagtacaaa aattagccat 12900
gcatggtggc aggcgtctgt aatcccagct actacagagg ctgaggcagg agaatcactt 12960
gaacccggga ggcagaggtt gcagtgagct gagaacgcgc cactgcactc cagcctgggt 13020
gacagagcga gactccatct caaaaaaaaa aaacaacaaa aaaaaacaaa acacaagttt 13080
actgggaact tagcagtaga tgctttgcac cacaacaaat gtatcttaag tggtcttttg 13140
tgatatttga gggaaagtgc cagaatttaa aacaaatggc atttcaagtt attctataca 13200
aatgcccagt ttctttctac catctttttt tcctttttgc agtggtcact gagctatttt 13260
agtgaatgtt tttacacaat gatgccatct tccttctact cagtcagtac aagatgttga 13320
ccatcgactc ataaaacact agctaccttt catgaaggac ttggtgataa ctctcatgtt 13380
ccaagtagaa ccggaaaaca tgtgtaagaa aacctgccga tccctatggg ccttggccaa 13440
taggtattat tcccaagggg tggcagttta tctttttccc cagccttcat attaaaacct 13500
ctcaccttct ccaggtctca ggtctgtgta atctcaaatg tgctttagct cctcacaata 13560
ttgtaactgt gtgggtgttc attaccttag ccagaagaca gtttacagat tccaggtctc 13620
atggagagaa cttttgtttt tggttatgaa cctcactgta taccaataat tatccattac 13680
atccttctgt agagggctct ctggctagag ataaaaccaa aaaaagaagt acctcaggtt 13740
tatgcatata aatgccagtt cctccttgat tttatttcaa aactcctgtc tacatacttt 13800
gcaatttaaa tacattcaag gataaagtaa taactgtagg aaaagtatta taatataatg 13860
acttagttct gcacatcaca agggggtccc tcatactcat tcattcattt cactcatttt 13920
acagatattt attgagcacc tgcaataacc tgcacactgc tctagacact gggactataa 13980
cagtaaacag acagatacat ctctggtctc acagggcttc tattctaagc aaaactcaat 14040
atccaggccg ggtgcagtgg ctcatgcctg gaatgccagc actttgggag accaaggcca 14100
ggcagatcac ctgagcccac tagttgaaga ccagcctggg caatatagca aaaccccgtc 14160
tctacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaattgtcaa ggcatggtgg catgcgcctg 14220
tggtcccagc tacttaggag gctgaggcag gaggattgtg taagcctggg aggcagaggt 14280
tgcagtgacc tgagatggca ccaccacact ccagcctggg caacagagtg agaccctgtc 14340
caaaaaaaaa aaaccctcac tatccttaag ataacatcat tgcttgttga tgagtgaatg 14400
ttaacaccaa attaggaacc caggactttt agtcttggca tggttacttt ccaataaaga 14460
tgacaatact aagaagagaa aaatgattta ataatgataa tagtggctaa tacttatgta 14520
gtgcttacca tgtgccaggt ctattgtaag tacttttata tatattaatt atttaatctt 14580
tgatcctata aggtagatat tattgttacc ctagtttata gatgaagaaa cggaaacaca 14640
agagattgcc actcatacaa gtttacacag ccagaaaata gaaaagctac gagttgagct 14700
cagcccagta tgtctatgat tttacagact caaaattaat tataagattt cctaatcttc 14760
gatttctgaa actctgcctt gctctagagg aaaacaagaa aaacaatgaa aaataaatgt 14820
ctctttttta caaaaattaa aacagaacaa actgcaataa aacaacagag gatgaatcca 14880
gaatgtgatt gatttttttt cttactagga aaggatctag aggccagaag gctggatttt 14940
tcaggatctc ctttcaatca atgaatctgt gatagaagca gatgaatcaa atctcatctt 15000
tgtgtgatta taaagctgtc tgtggtattc acgccaccag gggtacatag aagatgcctg 15060
agtgaggttt ggcaaaagta ctaagggcct gtccacctat acatgccctt ctcaggaaaa 15120
ccaaggttca agctctctat tagctcaact ggtaaggcgt aagacatgga aggttgaggc 15180
ccaatgttag aaatagatgg atacataaaa cttcatcaag ttaatgtcac tttttctcct 15240
ttatttatag 15250
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
gaagtacatt tgaagaacgc aagtagaggg agtgcaggaa acaagaacta caggatgtag 60
<210> 36
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 36
atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60
gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120
agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180
gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240
gagtacctgg agaaagcttt aaacaagtaa 270

Claims (135)

1.一种经冷冻干燥的药剂学组合物，包含质粒脱氧核糖核酸，其中在冷冻干燥之前，通过对包含以下物质的液体组合物进行冷冻干燥来获取：
a.第一质粒的脱氧核糖核酸，第一质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中；
b.磷酸钾缓冲液，PH值范围为7.0至9.0；
c.浓度范围为0％(w/v)至3％(w/v)的甘露醇；
d.浓度大于0.5％(w/v)且小于1.1％(w/v)的蔗糖；以及
e.浓度范围为0.1％(w/v)至0.9％(w/v)的氯化钠。
2.权利要求1的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为VM202。
3.权利要求2的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
4.权利要求1的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中第一质粒为pTx-HGF-X7。
5.权利要求4的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
6.权利要求1的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1Ec。
7.权利要求6的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
8.权利要求1的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中第一质粒为pTx-IGF-1Ea。
9.权利要求8的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
10.权利要求1的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中第一质粒为pTx-IGF-1X6。
11.权利要求10的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
12.权利要求1的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中第一质粒为pTx-IGF-1X10。
13.权利要求12的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pCK-SDF-1α组成的组中。
14.权利要求1的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pCK-SDF-1α。
15.权利要求14的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10组成的组中。
16.权利要求1至15之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物中的上述质粒脱氧核糖核酸的至少90％呈超螺旋形状。
17.权利要求16的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物中的上述质粒脱氧核糖核酸的至少95％呈超螺旋形状。
18.权利要求17的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少97％呈超螺旋形状。
19.权利要求18的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少98％呈超螺旋形状。
20.权利要求1至19之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少90％维持超螺旋状态。
21.权利要求20的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少95％维持超螺旋状态。
22.权利要求21的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少97％维持超螺旋状态。
23.权利要求22的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少98％维持超螺旋状态。
24.权利要求1至23之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下保存3日至7日之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少90％维持超螺旋状态。
25.权利要求24的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下保存3日至7日之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少95％维持超螺旋状态。
26.权利要求1至25之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，上述质粒脱氧核糖核酸的至少80％维持超螺旋状态，上述经冷冻干燥的药剂学组合物在重组之前，在40℃的温度条件下储存10周。
27.权利要求1至26之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述经冷冻干燥的药剂学组合物包含液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少90％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。
28.权利要求27的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述经冷冻干燥的药剂学组合物包含液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少95％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。
29.权利要求1至28之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.1mg/ml至1mg/ml的第一质粒。
30.权利要求29的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.25mg/ml至0.75mg/ml的第一质粒。
31.权利要求30的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.4mg/ml至0.6mg/ml的第一质粒。
32.权利要求1至31之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度为0.5mg/ml的第一质粒。
33.权利要求1至32之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为5mM至15mM的磷酸钾。
34.权利要求33的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为7.5mM至12.5mM的磷酸钾。
35.权利要求34的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为9mM至11mM的磷酸钾。
36.权利要求1至35之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度为10mM的磷酸钾。
37.权利要求1至36之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含pH值范围为7.0至8.0的磷酸钾缓冲液。
38.权利要求37的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含pH值为8.0的磷酸钾缓冲液。
39.权利要求1至38之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为2％(w/v)至3％(w/v)的甘露醇。
40.权利要求39的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度为2％(w/v)的甘露醇。
41.权利要求1至40之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.75％(w/v)至1.1％(w/v)的蔗糖。
42.权利要求41的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.9％(w/v)至1.0％(w/v)的蔗糖。
43.权利要求42的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度为1.0％(w/v)的蔗糖。
44.权利要求1至43之任一项的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.1％(w/v)至0.75％(w/v)的氯化钠。
45.权利要求44的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.1％(w/v)至0.6％(w/v)的氯化钠。
46.权利要求45的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.4％(w/v)至0.5％(w/v)的氯化钠。
47.权利要求46的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述液体组合物包含浓度为0.45％(w/v)的氯化钠。
48.一种经冷冻干燥的药剂学组合物，包含质粒脱氧核糖核酸，其中所述药剂学组合物在经冷冻干燥之前，通过对包含以下物质的液体组合物进行冷冻干燥来获取：
a.0.5mg/ml的浓度的第一质粒的脱氧核糖核酸，上述第一质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中；
b.pH值为8.0的10mM的磷酸钾缓冲液；
c.2％(w/v)的浓度的甘露醇；
d.1.0％(w/v)的浓度的蔗糖；以及
e.0.45％(w/v)的浓度的氯化钠，
上述液体组合物中的至少95％的质粒脱氧核糖核酸呈超螺旋形状，上述质粒脱氧核糖核酸的至少90％在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下储存7日之后，以超螺旋形状形态残存。
49.权利要求48的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为VM202。
50.权利要求49的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
51.权利要求48的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-HGF-X7。
52.权利要求51的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
53.权利要求48的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1Ec。
54.权利要求53的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
55.权利要求48的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1Ea。
56.权利要求55的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
57.权利要求48的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1X6。
58.权利要求57的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
59.权利要求48的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1X10。
60.权利要求59的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pCK-SDF-1α组成的组中。
61.权利要求48的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pCK-SDF-1α。
62.权利要求61的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10组成的组中。
63.一种重组的组合物，其通过在水中溶解权利要求1至62之任一项所述的经冷冻干燥的药剂学组合物来制备。
64.权利要求63所述的重组的组合物，其中所述重组的组合物在450nm中的吸光度为0.002以下。
65.权利要求64所述的重组的组合物，其中所述重组的组合物在450nm中的吸光度为0.001或小于0.001。
66.权利要求64至65之任一项所述的重组的组合物，其中所述吸光度在重组的当天测定。
67.权利要求64至65之任一项所述的重组的组合物，其中所述吸光度在储存经冷冻干燥的药剂学组合物之后，测定10周。
68.一种经冷冻干燥的药剂学组合物，包含单位剂量内的质粒脱氧核糖核酸，其中所述药剂学组合物在经冷冻干燥之前，通过对包含以下物质的液体组合物进行冷冻干燥来获取：
a.0.5mg/ml的浓度的第一质粒的脱氧核糖核酸，上述第一质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中；
b.pH值为8.0的10mM的磷酸钾缓冲液；
c.2％(w/v)的浓度的甘露醇；
d.1.0％(w/v)的浓度的蔗糖；以及
e.0.45％(w/v)的浓度的氯化钠，
上述经冷冻干燥的药剂学组合物存在于小瓶内，上述小瓶包含整体中的2.5mg的质粒脱氧核糖核酸。
69.权利要求68的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为VM202。
70.权利要求69的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
71.权利要求68的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-HGF-X7。
72.权利要求71的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
73.权利要求68的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1Ec。
74.权利要求73的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
75.权利要求68的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1Ea。
76.权利要求75的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
77.权利要求68的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1X6。
78.权利要求77的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中。
79.权利要求68的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1X10。
80.权利要求79的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pCK-SDF-1α组成的组中。
81.权利要求68的经冷冻干燥的药剂学组合物，其中所述第一质粒为pCK-SDF-1α。
82.权利要求81的经冷冻干燥的药剂学组合物，其还包含第二质粒的脱氧核糖核酸，上述第二质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10组成的组中。
83.一种重组的组合物，其通过在水中溶解权利要求68至82之任一项所述的经冷冻干燥的药剂学组合物来制备。
84.一种经冷冻干燥的药剂学组合物的制备方法，上述经冷冻干燥的药剂学组合物包含质粒脱氧核糖核酸，其包括：
制备液体组合物的步骤；以及
通过对上述液体组合物进行冷冻干燥来制备经冷冻干燥的药剂学组合物的步骤，
上述液体组合物包含：
a.第一质粒的脱氧核糖核酸，第一质粒选自由VM202、pTx-HGF-X7、pTx-IGF-1Ec、pTx-IGF-1Ea、pTx-IGF-1X6、pTx-IGF-1X10及pCK-SDF-1α组成的组中；
b.磷酸钾缓冲液，PH值范围为7.0至9.0；
c.浓度范围为0％(w/v)至3％(w/v)的甘露醇；
d.浓度为0.5％以上(w/v)且1.1％以下(w/v)的蔗糖；以及
e.浓度范围为0.1％(w/v)至0.9％(w/v)的氯化钠。
85.权利要求84的方法，其中所述第一质粒为VM202。
86.权利要求84的方法，其中所述第一质粒为pTx-HGF-X7。
87.权利要求84的方法，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1Ec或pTx-IGF-1Ea。
88.权利要求84的方法，其中所述第一质粒为pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10。
89.权利要求84的方法，其中所述第一质粒为pCK-SDF-1α。
90.权利要求84至89之任一项的方法，其中所述冷冻干燥的步骤包括：
装载上述液体组合物的步骤(i)；
冷冻步骤(ii)；
第一干燥步骤(iii)；以及
第二干燥步骤(iv)。
91.权利要求90的方法，其中所述装载步骤在5℃的温度条件下执行。
92.权利要求84至91之任一项的方法，其中所述冷冻步骤在-50℃至-20℃范围内，在温度上升的期间执行。
93.权利要求92的方法，其中所述冷冻步骤包括退火步骤。
94.权利要求84至93的方法，其中所述第一干燥步骤在-20℃的温度条件下执行。
95.权利要求84至93之任一项的方法，其中所述第二干燥步骤在-20℃至20℃范围内，在温度上升的期间执行。
96.权利要求84至95之任一项的方法，其中所述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少90％呈超螺旋形状。
97.权利要求96的方法，其中所述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少95％呈超螺旋形状。
98.权利要求96的方法，其中所述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少97％呈超螺旋形状。
99.权利要求98的方法，其中所述液体组合物中的质粒脱氧核糖核酸的至少98％呈超螺旋形状。
100.权利要求84至99之任一项的方法，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少90％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。
101.权利要求100的方法，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少95％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。
102.权利要求100的方法，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少97％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。
103.权利要求102的方法，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少98％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。
104.权利要求84至103之任一项的方法，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下储存3日至7日之后，至少90％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。
105.权利要求104的方法，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组后，在25℃的温度条件下储存3日至7日之后，至少95％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态。
106.权利要求105的方法，其中在上述经冷冻干燥的药剂学组合物重组30分钟之后，至少80％的质粒脱氧核糖核酸维持超螺旋状态，上述经冷冻干燥的药剂学组合物在重组之前，在40℃的温度条件下储存10周。
107.权利要求84至106之任一项的方法，其中所述经冷冻干燥的药剂学组合物包含液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少90％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。
108.权利要求107的方法，其中所述经冷冻干燥的药剂学组合物包含液体组合物中的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸的总量的至少95％的量的呈超螺旋形状的脱氧核糖核酸。
109.权利要求84至107之任一项的方法，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.1mg/ml至1mg/ml的第一质粒。
110.权利要求109的方法，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.25mg/ml至0.75mg/ml的第一质粒。
111.权利要求110的方法，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.4mg/ml至0.6mg/ml的第一质粒。
112.权利要求111的方法，其中所述液体组合物包含浓度为0.5mg/ml的第一质粒。
113.权利要求84至112之任一项的方法，其中所述液体组合物包含浓度范围为5mM至15mM的磷酸钾。
114.权利要求113的方法，其中所述液体组合物包含浓度范围为7.5mM至12.5mM的磷酸钾。
115.权利要求114的方法，其中所述液体组合物包含浓度范围为9mM至11mM的磷酸钾。
116.权利要求84至113之任一项的方法，其中所述液体组合物包含浓度为10mM的磷酸钾。
117.权利要求84至116之任一项的方法，其中所述液体组合物包含pH值范围为7.0至8.0的磷酸钾缓冲液。
118.权利要求117的方法，其中所述液体组合物包含pH值为8.0的磷酸钾。
119.权利要求84至118之任一项的方法，其中所述液体组合物包含浓度范围为2％(w/v)至3％(w/v)的甘露醇。
120.权利要求119的方法，其中所述液体组合物包含浓度为2％(w/v)的甘露醇。
121.权利要求84至120之任一项的方法，其中所述液体组合物包含浓度为0.75％(w/v)以上且1.1％(w/v)以下的蔗糖。
122.权利要求121的方法，其中所述液体组合物包含浓度为0.9％以上(w/v)且1.1％(w/v)以下的蔗糖。
123.权利要求122的方法，其中所述液体组合物包含浓度为1.0％(w/v)的蔗糖。
124.权利要求84至123的方法，其中所述液体组合物包含浓度范围为0.1％(w/v)至0.75％(w/v)的氯化钠。
125.权利要求124的方法，其中所述液体组合物包含浓度在0.1％(w/v)至0.6％(w/v)范围内的氯化钠。
126.权利要求125的方法，其中所述液体组合物包含浓度在0.4％(w/v)至0.5％(w/v)范围内的氯化钠。
127.权利要求126的方法，其中所述液体组合物包含浓度为0.45％(w/v)的氯化钠。
128.一种治疗疾病的方法，其包括向患有疾病的患者给药重组的药物的有效量的步骤，上述重组的药物通过重组权利要求1至49或权利要求68至69之任一项所述的上述经冷冻干燥的药剂学组合物来生成。
129.权利要求128的方法，其还包括在水中溶解权利要求1至62或权利要求68至82之任一项所述的上述经冷冻干燥的药剂学组合物来生成上述重组的药物的步骤。
130.权利要求128至129之任一项的方法，其中所述重组的药物在450nm(A450)中的吸光度为0.003以下。
131.权利要求130的方法，其中所述重组药物在450nm(A450)中的吸光度为0.002以下。
132.权利要求131的方法，其中所述重组药物在450nm(A450)中的吸光度为0.001或小于0.001。
133.权利要求128至132之任一项的方法，其中所述疾病选自由神经病、缺血性疾病、肌肉萎缩、血管病及心脏病组成的组中。
134.权利要求133的方法，其中所述疾病选自由缺血性肢体病、糖尿病周围神经病变、肌萎缩性侧束硬化症、周围血管疾病及冠心病组成的组中。
135.权利要求128至134之任一项的方法，其中所述给药步骤包括上述重组的药物的肌肉注射。
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