KR20230141965A - 플라스미드 dna를 포함하는 액체제형 약제학적 조성물 - Google Patents
플라스미드 dna를 포함하는 액체제형 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 플라스미드 DNA를 포함하는 액체제형 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 플라스미드 DNA를 포함하는 액체 제형은, 약제학적 유효성분인 플라스미드 DNA의 보관안정성의 면에서 우수한 효능을 나타내는 바, 제품의 안정성 및 안전성이 우수한 약제학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 특허출원은 2022년 3월 24일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0036970호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 플라스미드 DNA를 포함하는 액체제형 약제학적 조성물에 관한 것이다.
바이러스 또는 바이러스-유사 입자로 패키지화(packaged)되지 않은 핵산 컨스트럭트(소위 "네이키드(naked)" DNA 또는 RNA 컨스트럭트(constructs))의 직접적인 in vivo 전달을 수반하는 유전자 요법(gene therapy)이 다양한 질병의 치료에 효과적일 수 있다는 실질적인 임상적 증거가 있다. 예를 들어, 인간 HGF 단백질의 2개의 이형체(isoform)(즉, "VM202"로도 지칭되는 pCK-HGF-X7)를 발현하는 DNA 플라스미드 컨스트럭트(construct)의 직접적인 근육 내 주사(intramuscular injection)는 신경병증성 통증(neuropathic pain)의 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. II상 임상 시험에서, 당뇨병성 말초 신경병증(diabetic peripheral neuropathy) 환자의 종아리 근육에 VM202를 주사하면 통증이 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 2주 간격으로 2일 치료하면 3개월 동안 삶의 질이 향상될 정도의 증상 완화를 제공하기에 충분하였다. Kessler et al., Annals Clin. Transl. Neurology 2(5):465-478 (2015). 상기 동일한 DNA 플라스미드 컨스트럭트는 또한 근위축성 측삭 경화증(ALS; amyotrophic lateral sclerosis) 환자를 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다. I상 임상 시험에서, ALS 환자의 거의 절반 가까이가 VM202 투여 후 안정되거나 또는 개선된 상태를 유지하였고, 이는 1개월, 2개월 및 3개월에 각각 47%, 50% 및 24%의 대상(subject)이 ALS 환자의 신체적 기능을 나타내는 ALSFRS-R(Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale-revised) 점수의 감소를 경험하지 않거나 또는 점수의 향상을 경험한 것으로 나타났으며, 이는 과거 대조군에서 관찰된 것보다 더 나은 것이다. Robert L. Sufit et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontoemporal Degeneration 18:269-278 (2017).
그러나 이러한 DNA 또는 RNA 컨스트럭트 물질의 물리·화학적 안정성은 최종 제제와 제형(formulation & dosage form), 및 보관 조건 등에 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 통상적으로 약제학적 제형은 보관안정성을 위하여 동결건조 제형으로 제공이 되나, 이를 환자에 투여하기 위해서는 주사용수를 이용하여 재구성(reconstitution)되어야 한다. 이러한 약물의 재구성시 정확한 매뉴얼이 지켜지지 않으면 약물이 균일하게 재구성될 수 없고, 약물의 손실이 일어나거나, 또는 투여과정에서 오염이 발생할 우려가 있다. 따라서, 약물의 제공시 동결건조된 형태가 아닌 액체제형으로 제공되는 경우 안전성과 상품경쟁력을 제고할 수 있다. 따라서, 안정성과 안전성이 우수한 네이키드-DNA 기반 약물의 액체 제형의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 플라스미드 DNA를 포함하는 액체 제형을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 플라스미드 DNA를 포함하는 액체 제형을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "액체 제형(liquid formulation)"은 플라스미드 DNA 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하고, 본원에 기재된 바와 같은 액체 형태의 약제학적 조성물을 의미한다.
본 발명의 액체 제형은 플라스미드 DNA의 종류에 상관없이 사용될 수 있는 플라스미드 DNA의 범용적인 액체 제형에 관한 것이므로, 본 발명의 액체 제형의 목적은 본 발명의 일 구현예로 사용된 플라스미드 DNA (예컨대, VM202)를 위한 액체 제형으로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 인간 HGF 또는 이의 변이체를 인코딩한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 VM202일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 프로모터를 추가적으로 포함한다. 상기 플라스미드 DNA 내에서 프로모터는 단백질을 코딩하는 핵산분자와 작동적으로 결합되어 있다. 본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 발현 벡터의 형질전환 여부 및 단백질 발현을 평가하기 위한 선택표지로서 선택가능 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다.
선택가능 마커 유전자로는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린 등에 대한 내성 유전자가 있다. 리포터 유전자로는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 또는 녹색형광 단백질 등의 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 물리적 수단은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 폭격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 상기 화학적 수단은 콜로이드 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀 (micelle), 혼합된 마이셀, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 또한, 상기 생물학적 수단은 상술한 렌티바이러스, 레트로바이러스 등, DNA 또는 RNA 벡터의 사용을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, "VM202"는 pCK 벡터(서열번호 6) 및 pCK 벡터에 클로닝된 HGF-X7(서열번호 13)를 포함하는, pCK-HGF-X7로도 불리는 플라스미드 DNA를 의미한다. VM202는 2002년 3월 12일 기탁번호 KCCM-10361로 한국미생물보존센터(KCCM)에 부다페스트 조약에 따라 기탁되었다.
본원에 사용된 용어 "HGF의 이형체(isoforms of hepatocyte growth factor (HGF))"는 동물에서 자연적으로 발생하는 HGF 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 용어는 임의의 전장 (full length) 야생형 HGF 폴리펩타이드와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고, 자연적으로 발생하는 HGF 대립유전자 변이체(allelic variant), 스플라이스 변이체(splice variant) 또는 결실 변이체(deletion variant)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명에서 HGF의 이형체는 전장 HGF(full-length HGF, flHGF), 결실된 변이체 HGF(deleted variant HGF, dHGF), NK1, NK2 및 NK4로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 이형체를 포함한다. 본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 본원에 기재된 방법에 사용되는 HGF의 이형체는 flHGF(서열번호 1) 및 dHGF(서열번호 2)를 포함한다.
용어 "인간 flHGF(human flHGF)", "flHGF " 및 "fHGF"는 인간 HGF 단백질의 아미노산 1-728로 구성된 단백질을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. flHGF의 아미노산 서열은 서열번호 1 에 제공된다
용어 "인간 dHGF(human dHGF)"및 "dHGF"는 인간 HGF 유전자의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성된 HGF 단백질의 결실된 변이체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 구체적으로, "인간 dHGF" 또는 "dHGF"는 전장 HGF 서열로부터 알파 사슬(chain)의 첫 번째 크링글 도메인(kringle domain)에서 5 개의 아미노산(F, L, P, S 및 S)이 결실된 인간 HGF 단백질을 의미한다. 인간 dHGF는 723개 아미노산 길이이다. 인간 dHGF의 아미노산 서열은 서열번호 2 에 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 SDF-1, IGF-1, c-Met, 이의 단편/이형체/변이체를 인코딩한다.
본 발명의 용어 SDF-1 (stromal cell-derived factor 1)은 C-X-C 모티프 케모카인 12 (CXCL12)로도 알려져 있으며, CXCL12 유전자에 의해 인코딩되는 케모카인 단백질이다. SDF-1은 많은 세포와 조직에서 발현되고, SDF-1 alpha와 SDF-1 beta로 구별된다. SDF-1은 혈관신생, 상처 치유, 신경 발달 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
인간 SDF-1 alpha의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 21에 제공된다.
상기 인간 SDF-1 alpha를 인코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 17에 제공된다.
본 발명의 용어 IGF-1 (인슐린유사 성장인자 1, Insulin like growth factor 1)는 소마토메딘 C (somatomedin C)라고도 불리며, 인슐린과 분자 구조가 유사한 호르몬이다. IGF-1은 어린 시절의 성장기 발달에 세포증식의 촉진과 관련해서 중요한 역할을 하기도 한다. IGF-1은 IGF1 유전자에 의해 인코딩되고, 다양한 유형의 세포의 성장을 자극하고 세포 사멸을 억제하며, 세포의 단백질 생산을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
인간 IGF-1의 Ea 아이소폼의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 19에 제공된다.인간 IGF-1의 Ec 아이소폼의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 20에 제공된다.
본 발명의 용어 c-Met 단백질은 티로신-단백질 키나제 Met(tyrosine-protein kinase Met) 또는 간세포 성장 인자 수용체(hepatocyte growth factor receptor, HGFR)라고 불리기도 하는 단백질이다. C-Met은 MET 유전자에 의해 인코딩되며, 티로신 키나아제 활성을 가지고 있는 배아 발달, 조직 형성, 세포 분열 및 상처 치유에 필수적인 키나아제 수용체이다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 pCK-SDF-1a (WO2016/048105A1), pTx-IGF-1X10 (WO2020/016655A2), pCMV3-cMet-flag (Sino Biological Inc., China), 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 pTx는 pCK로부터 유래된 플라스미드 벡터이다. pTx는 pCK의 2개의 순차적 연속의 돌연변이 유발(mutagenesis)에 의해 생성되었다. 카나마이신 내성 유전자 (Kanamycin resistance gene)와 pCK의 ColE1 사이의 불필요한 서열 제거 및 HCMV 인트론 서열 길이 최적화를 통해 생성되었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 pCMV3는 CMV 프로모터에 의해 유도되는 포유류의 단백질 발현을 위한 벡터이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 약제학적 조성물의 활성 성분으로 플라스미드 DNA를 포함한다. 상기 플라스미드 DNA는 유전자 요법을 위한 유전 물질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 플라스미드 DNA는 결함 유전자 또는 전사체의 기능을 교정할 수 있거나 폴리펩타이드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNA(코딩 또는 비-코딩 (non-coding); 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 및 그들의 안티센스 대응물질(예를 들어, antagoMi R))를 코딩할 수 있다. 유전자 요법에 사용되는 당업계에 공지된 임의의 플라스미드 DNA를 함유하는 제형은 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 플라스미드 DNA를 0.01-5 mg/mL의 농도로 포함한다. 보다 구체적으로는 0.01 내지 5 mg/ml, 0.01 내지 3 mg/ml, 0.01 내지 2 mg/ml, 0.01 내지 1 mg/ml, 0.01 내지 0.75 mg/ml, 0.01 내지 0.6 mg/ml, 0.01 내지 0.5 mg/ml의 농도, 0.1 내지 5 mg/ml, 0.1 내지 3 mg/ml, 0.1 내지 2 mg/ml, 0.1 내지 1 mg/ml, 0.1 내지 0.75 mg/ml, 0.1 내지 0.6 mg/ml, 0.1 내지 0.5 mg/ml의 농도, 0.2 내지 5 mg/ml, 0.2 내지 3 mg/ml, 0.2 내지 2 mg/ml, 0.2 내지 1 mg/ml, 0.2 내지 0.75 mg/ml, 0.2 내지 0.6 mg/ml, 0.2 내지 0.5 mg/ml의 농도, 0.3 내지 5 mg/ml, 0.3 내지 3 mg/ml, 0.3 내지 2 mg/ml, 0.3 내지 1 mg/ml, 0.3 내지 0.75 mg/ml, 0.3 내지 0.6 mg/ml, 0.3 내지 0.5 mg/ml의 농도, 또는 0.5 mg/ml의 농도로 플라스미드 DNA를 포함할 수 있다.
상기 플라스미드 DNA는 2,000 내지 15,000개의 염기쌍, 2,000 내지 10,000개의 염기쌍, 2,000 내지 9,000개의 염기쌍, 2,000 내지 8,000개의 염기쌍, 2,000 내지 7,000개의 염기쌍, 2,000 내지 6,000개의 염기쌍, 2,000 내지 5,000개의 염기쌍, 3,000 내지 15,000개의 염기쌍, 3,000 내지 10,000개의 염기쌍, 3,000 내지 9,000개의 염기쌍, 3,000 내지 8,000개의 염기쌍, 3,000 내지 7,000개의 염기쌍, 3,000 내지 6,000개의 염기쌍, 3,000 내지 5,000개의 염기쌍, 4,000 내지 8,000개의 염기쌍, 4,000 내지 7,500개의 염기쌍, 4,000 내지 6,000개의 염기쌍, 6,000 내지 9,000개의 염기쌍, 또는 7,000 내지 8,000개의 염기쌍의 길이의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 플라스미드 DNA는 본원에 제공된 범위 내에 속하는 길이의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 액체 제형은 플라스미드 DNA의 안정성을 향상시키기 위한 것이다. 상기 플라스미드 DNA의 안정성은 당업계에 공지된 방법에 기초하여 결정될 수 있다. 특히, 안정성은 플라스미드 DNA의 입체구조(conformation), 예를 들어 이들이 보다 안정적인 수퍼코일된 (supercoiled) 형태로 존재하는지 또는 덜 안정적인 오픈 원형(open circle) 및 선형(linear) 형태로 존재하는 지에 기초하여 결정될 수 있다. 플라스미드 DNA의 입체구조(conformation)는 플라스미드 DNA를 함유하는 샘플의 모세관 전기영동 또는 HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography)에 의해 결정될 수 있다. 오픈 원형 및 선형 형태와 비교하여 슈퍼코일된 DNA 함량은 다양한 조건에서 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 플라스미드 DNA의 적어도 90%는 슈퍼코일 형성된 (supercoiled) 것이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 액체 조성물 내의 상기 플라스미드 DNA의 적어도 92.5%는 슈퍼코일 형성된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에 있어서, 상기 액체 조성물 내의 상기 플라스미드 DNA의 적어도 95%는 슈퍼코일 형성된 것이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 액체 조성물 내의 플라스미드 DNA의 적어도 97%는 슈퍼코일 형성된 것이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 액체 조성물 내의 플라스미드 DNA의 적어도 98%는 슈퍼코일 형성된 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 액체 조성물은 약제학적 조성물의 pH를 유지하기 위해 버퍼(buffer)를 추가로 포함한다. 상기 버퍼(buffer)는 당업계에 공지된 버퍼 화합물, 예컨대 TAPS, 바이신(Bicine), 트리스(Tris), 트리신(Tricine), TAPSO, HEPES, TES, MPOS, PIPES, 카코딜레이트(Cacodylate) 또는 MES를 포함할 수 있다. 상기 버퍼(buffer)는 시트르산 (citric acid), 인산칼륨(monopotassium phosphate), 붕산(boric acid) 또는 디에틸 바르비투르 산(diethyl barbituric acid)을 함유할 수 있다. 상기 버퍼는 PBS, HEPES, TRIS 또는 TRIS/EDTA 버퍼일 수 있다. 상기 버퍼는 다른 포스페이트 버퍼일 수 있다. 인산염 버퍼(Phosphate buffers)는 일염기성 이수소 인산염(monobasic dihydrogen phosphate)과 이염기성 일수소 인산염(dibasic monohydrogen phosphate)의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 버퍼(buffer)는 Potassium phosphate 버퍼일 수 있다. 상기 Potassium phosphate 버퍼는 약 30-50 mM, 약 35-50 mM, 약 40-50 mM, 약 45-50 mM, 약 30-45 mM, 약 35-45 mM, 약 40-45 mM, 약 30-40 mM, 약 35-40 mM, 또는 약 40 mM의 농도로 Potassium phosphate를 포함할 수 있다.
상기 액체 조성물에 함유된 버퍼는 pH 약 7 내지 9일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 pH는 약 7 내지 9, 약 7.5 내지 9, 약 8 내지 9, 약 7 내지 8.5, 약 7.5 내지 8.5, 약 8 내지 8.5, 약 7 내지 8, 약 7.5 내지 8, 또는 약 8 이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 약 30-50 mM Potassium phosphate, pH가 약 7.5-8.5 이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 염을 추가로 포함한다. 상기 염은 NaCl일 수 있다. 상기 NaCl은 약 0.5-1.5%, 약 0.5-1.4%, 약 0.5-1.3%, 약 0.5-1.2%, 약 0.5-1.1%, 약 0.5-1.0%, 약 0.5-0.9%, 약 0.6-1.5%, 약 0.6-1.4%, 약 0.6-1.3%, 약 0.6-1.2%, 약 0.6-1.1%, 약 0.6-1.0%, 약 0.6-0.9%, 약 0.7-1.5%, 약 0.7-1.4%, 약 0.7-1.3%, 약 0.7-1.2%, 약 0.7-1.1%, 약 0.7-1.0%, 약 0.7-0.9%, 약 0.8-1.5%, 약 0.8-1.4%, 약 0.8-1.3%, 약 0.8-1.2%, 약 0.8-1.1%, 약 0.8-1.0%, 약 0.8-0.9%, 또는 0.9%의 농도로 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 약 40 mM Potassium phosphate를 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 약 0.9% NaCl를 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형의 pH는 약 8.0이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 약 40 mM Potassium phosphate, 약 0.9% NaCl를 포함하고, pH가 약 8.0일 수 있다. 본 명세서에서 상기 본 발명의 일 양태에 따른 액체 제형은 A 제형으로 명명되었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드는 2-8℃에서 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 보관 후에도 80-100 SC% (supercoiled %), 85-100 SC%, 90-100 SC%, 또는 95-100 SC%를 유지하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드는 15-30℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 보관 후에도 80-100 SC%, 81-100 SC%, 82-100 SC%, 83-100 SC%, 84-100 SC%를 유지하는 것이다. 상기 보관 온도는 15-30℃, 16-30℃, 17-30℃, 18-30℃, 19-30℃, 20-30℃, 21-30℃, 22-30℃, 23-30℃, 24-30℃, 25-30℃, 15-28℃, 16-28℃, 17-28℃, 18-28℃, 19-28℃, 20-28℃, 21-28℃, 22-28℃, 23-28℃, 24-28℃, 25-28℃, 15-27℃, 16-27℃, 17-27℃, 18-27℃, 19-27℃, 20-27℃, 21-27℃, 22-27℃, 23-27℃, 24-27℃, 25-27℃, 15-26℃, 16-26℃, 17-26℃, 18-26℃, 19-26℃, 20-26℃, 21-26℃, 22-26℃, 23-26℃, 24-26℃, 25-26℃, 또는 25℃ 이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 상기 액체 제형은 플라스미드 DNA의 안정성을 향상시키기 위하여 안정화량의 당을 포함하는 수용액을 포함한다. 상기 당은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 또는 솔비톨일 수 있다.
따라서, 본 발명의 상기 액체 제형은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 솔비톨, 루이신, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 수크로오스 약 1-2%, 트레할로스 약 0.5-2%, 솔비톨 약 0.01-1%, 루이신 약 0.05-0.5%, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함한다.본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 수크로오스 약 1.5%, 트레할로스 약 0.5~1.5%, 솔비톨 약 0.05~0.25%, 루이신 약 0.1~0.5%, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따른 플라스미드 DNA의 액체 제형에 있어서, 본 발명의 액체 제형은 상술한 일 양태에 따른 액체 제형에 만니톨을 약 0.15 내지 1.5%을 추가적으로 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 만니톨을 약 0.15 내지 1.5%, 약 0.15 내지 1.25%, 약 0.15 내지 1.0%, 약 0.15 내지 0.75, 약 0.15 내지 0.5%, 약 0.15 내지 0.25%, 약 0.25 내지 1.5%, 약 0.25 내지 1.25%, 약 0.25 내지 1.0%, 약 0.25 내지 0.75, 약 0.25 내지 0.5%, 약 0.3 내지 1.25%, 약 0.3 내지 1.0%, 약 0.3 내지 0.75, 약 0.3 내지 0.5%, 약 0.5 내지 1.25%, 약 0.5 내지 1.0%, 약 0.5 내지 0.75%, 약 1.5%, 약 1.25%, 약 1.0%, 약 0.75%, 약 0.5%, 또는 약 0.25%의 농도로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 상기 본 발명의 일 양태에 따른 액체 제형은 B 제형으로 명명되었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 2-8℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 보관 후에도 90-100 SC%를 유지하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 15-30℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 보관 후에도 60-100, 70-100, 75-100, 76-100, 77-100, 78-100, 79-100, 또는 80-100 SC%를 유지하는 것이다. 상기 보관 온도는 15-30℃, 16-30℃, 17-30℃, 18-30℃, 19-30℃, 20-30℃, 21-30℃, 22-30℃, 23-30℃, 24-30℃, 25-30℃, 15-28℃, 16-28℃, 17-28℃, 18-28℃, 19-28℃, 20-28℃, 21-28℃, 22-28℃, 23-28℃, 24-28℃, 25-28℃, 15-27℃, 16-27℃, 17-27℃, 18-27℃, 19-27℃, 20-27℃, 21-27℃, 22-27℃, 23-27℃, 24-27℃, 25-27℃, 15-26℃, 16-26℃, 17-26℃, 18-26℃, 19-26℃, 20-26℃, 21-26℃, 22-26℃, 23-26℃, 24-26℃, 25-26℃, 15-25℃, 16-25℃, 17-25℃, 18-25℃, 19-25℃, 20-25℃, 21-25℃, 22-25℃, 23-25℃, 24-25℃, 또는 25℃ 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 플라스미드 DNA의 액체 제형에 있어서, 본 발명의 액체 제형은 상술한 일 양태에 따른 액체 제형에 만니톨 약 0.001 내지 0.3%, 솔비톨 약 0.05 내지 0.5%, 수크로스 약 0.05 내지 0.5%, 트레할로스 약 0.15 내지 3%, 루이신(leucine) 약 0.01 내지 1%, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것이다.
본 명세서에서 상기 본 발명의 일 양태에 따른 액체 제형은 C 제형으로 명명되었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 만니톨을 약 0.001 내지 0.3%, 약 0.005 내지 0.3%, 약 0.01 내지 0.3%, 약 0.02 내지 0.3%, 약 0.03 내지 0.3%, 약 0.04 내지 0.3%, 약 0.05 내지 0.3%, 약 0.001 내지 0.25%, 약 0.005 내지 0.25%, 약 0.01 내지 0.25%, 약 0.02 내지 0.25%, 약 0.03 내지 0.25%, 약 0.04 내지 0.25%, 약 0.05 내지 0.25%, 약 0.001 내지 0.2%, 약 0.005 내지 0.2%, 약 0.01 내지 0.2%, 약 0.02 내지 0.2%, 약 0.03 내지 0.2%, 약 0.04 내지 0.2%, 약 0.05 내지 0.2%, 약 0.001 내지 0.15%, 약 0.005 내지 0.15%, 약 0.01 내지 0.15%, 약 0.02 내지 0.15%, 약 0.03 내지 0.15%, 약 0.04 내지 0.15%, 약 0.05 내지 0.15%, 약 0.001 내지 0.1%, 약 0.005 내지 0.1%, 약 0.01 내지 0.1%, 약 0.02 내지 0.1%, 약 0.03 내지 0.1%, 약 0.04 내지 0.1%, 약 0.05 내지 0.1%, 약 0.001 내지 0.075%, 약 0.005 내지 0.075%, 약 0.01 내지 0.075%, 약 0.02 내지 0.075%, 약 0.03 내지 0.075%, 약 0.04 내지 0.075%, 약 0.05 내지 0.075%, 약 0.001 내지 0.07%, 약 0.005 내지 0.07%, 약 0.01 내지 0.07%, 약 0.02 내지 0.07%, 약 0.03 내지 0.07%, 약 0.04 내지 0.07%, 약 0.05 내지 0.07%, 약 0.001 내지 0.06%, 약 0.005 내지 0.06%, 약 0.01 내지 0.06%, 약 0.02 내지 0.06%, 약 0.03 내지 0.06%, 약 0.04 내지 0.06%, 약 0.05 내지 0.06%, 약 0.001 내지 0.05%, 약 0.005 내지 0.05%, 약 0.01 내지 0.05%, 약 0.02 내지 0.05%, 약 0.03 내지 0.05%, 약 0.04 내지 0.05%, 약 0.01%, 약 0.03%, 약 0.05%, 약 0.07%, 약 0.075%, 또는 약 0.1%의 농도로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 솔비톨을 약 0.05 내지 0.5%, 약 0.075 내지 0.5%, 약 0.1 내지 0.5%, 약 0.125 내지 0.5%, 약 0.15 내지 0.5%, 약 0.2 내지 0.5%, 약 0.25 내지 0.5%, 약 0.3 내지 0.5%, 약 0.35 내지 0.5%, 약 0.4 내지 0.5%, 약 0.05%, 0.075%, 약 0.1%, 또는 약 0.15%의 농도로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 수크로스를 약 0.05% 내지 0.5%, 약 0.075 내지 0.5%, 약 0.1 내지 0.5%, 약 0.125 내지 0.5%, 약 0.15 내지 0.5%, 약 0.2 내지 0.5%, 약 0.25 내지 0.5%, 약 0.3 내지 0.5%, 약 0.35 내지 0.5%, 약 0.4 내지 0.5%, 약 0.05%, 0.075%, 약 0.1%, 0.15%, 약 0.2%, 또는 약 0.3%의 농도로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 트레할로스를 약 0.15 내지 3%, 약 0.15 내지 2.5%, 약 0.15 내지 2%, 약 0.15 내지 1.75%, 약 0.15 내지 1.5%, 약 0.15 내지 1.25%, 약 0.15 내지 1%, 약 0.15 내지 0.8%, 약 0.15 내지 0.75%, 약 0.15 내지 0.7%, 약 0.15 내지 0.6%, 약 0.15 내지 0.5%, 약 0.25 내지 3%, 약 0.25 내지 2.5%, 약 0.25 내지 2%, 약 0.25 내지 1.75%, 약 0.25 내지 1.5%, 약 0.25 내지 1.25%, 약 0.25 내지 1%, 약 0.25 내지 0.8%, 약 0.25 내지 0.75%, 약 0.25 내지 0.7%, 약 0.25 내지 0.6%, 약 0.25 내지 0.5%, 약 0.5 내지 3%, 약 0.5 내지 2.5%, 약 0.5 내지 2%, 약 0.5 내지 1.75%, 약 0.5 내지 1.5%, 약 0.5 내지 1.25%, 약 0.5 내지 1%, 약 0.5 내지 0.8%, 약 0.5 내지 0.75%, 약 0.5 내지 0.7%, 약 0.5 내지 0.6%, 약 0.75 내지 3%, 약 0.75 내지 2.5%, 약 0.75 내지 2%, 약 0.75 내지 1.75%, 약 0.75 내지 1.5%, 약 0.75 내지 1.25%, 약 0.75 내지 1%, 약 0.75 내지 0.8%, 약 1 내지 3%, 약 1 내지 2.5%, 약 1 내지 2%, 약 1 내지 1.75%, 약 1 내지 1.5%, 약 1 내지 1.25%, 약 1.25 내지 3%, 약 1.25 내지 2.5%, 약 1.25 내지 2%, 약 1.25 내지 1.75%, 약 1.25 내지 1.5%, 약 1.5 내지 3%, 약 1.5 내지 2.5%, 약 1.5 내지 2%, 약 1.5 내지 1.75%, 0.5%, 약 1.0%, 약 1.25%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 또는 약 3%의 농도로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 루이신을 약 0.01 내지 1%, 약 0.01 내지 0.9%, 약 0.01 내지 0.8%, 약 0.01 내지 0.7%, 약 0.01 내지 0.6%, 약 0.01 내지 0.5%, 약 0.01 내지 0.4%, 약 0.01 내지 0.3%, 약 0.01 내지 0.2%, 약 0.01 내지 0.1%, 약 0.03 내지 1%, 약 0.03 내지 0.9%, 약 0.03 내지 0.8%, 약 0.03 내지 0.7%, 약 0.03 내지 0.6%, 약 0.03 내지 0.5%, 약 0.03 내지 0.4%, 약 0.03 내지 0.3%, 약 0.03 내지 0.2%, 약 0.03 내지 0.1%, 약 0.05 내지 1%, 약 0.05 내지 0.9%, 약 0.05 내지 0.8%, 약 0.05 내지 0.7%, 약 0.05 내지 0.6%, 약 0.05 내지 0.5%, 약 0.05 내지 0.4%, 약 0.05 내지 0.3%, 약 0.05 내지 0.2%, 약 0.05 내지 0.1%, 약 0.075 내지 1%, 약 0.075 내지 0.9%, 약 0.075 내지 0.8%, 약 0.075 내지 0.7%, 약 0.075 내지 0.6%, 약 0.075 내지 0.5%, 약 0.075 내지 0.4%, 약 0.075 내지 0.3%, 약 0.075 내지 0.2%, 약 0.075 내지 0.1%, 약 0.08 내지 1%, 약 0.08 내지 0.9%, 약 0.08 내지 0.8%, 약 0.08 내지 0.7%, 약 0.08 내지 0.6%, 약 0.08 내지 0.5%, 약 0.08 내지 0.4%, 약 0.08 내지 0.3%, 약 0.08 내지 0.2%, 약 0.08 내지 0.1%, 약 0.09 내지 1%, 약 0.09 내지 0.9%, 약 0.09 내지 0.8%, 약 0.09 내지 0.7%, 약 0.09 내지 0.6%, 약 0.09 내지 0.5%, 약 0.09 내지 0.4%, 약 0.09 내지 0.3%, 약 0.09 내지 0.2%, 약 0.09 내지 0.1%, 약 0.01%, 약 0.03%, 약 0.05%, 약 0.075%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.2%, 또는 약 0.3%의 농도로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 만니톨 약 0.05%, 솔비톨 약 0.15%, 수크로오스 약 0.3%, 트레할로스 약 1.5%, 루이신 약 0.1%, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 2-8℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 또는 9개월 보관 후에도 90-100, 91-100, 92-100, 93-100, 또는 94-100 SC%를 유지하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 15-30℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 또는 9개월 보관 후에도 80-100, 81-100, 82-100, 83-100, 84-100, 85-100의 SC%를 유지하는 것이다. 상기 보관 온도는 15-30℃, 16-30℃, 17-30℃, 18-30℃, 19-30℃, 20-30℃, 21-30℃, 22-30℃, 23-30℃, 24-30℃, 25-30℃, 15-28℃, 16-28℃, 17-28℃, 18-28℃, 19-28℃, 20-28℃, 21-28℃, 22-28℃, 23-28℃, 24-28℃, 25-28℃, 15-27℃, 16-27℃, 17-27℃, 18-27℃, 19-27℃, 20-27℃, 21-27℃, 22-27℃, 23-27℃, 24-27℃, 25-27℃, 15-26℃, 16-26℃, 17-26℃, 18-26℃, 19-26℃, 20-26℃, 21-26℃, 22-26℃, 23-26℃, 24-26℃, 25-26℃, 15-25℃, 16-25℃, 17-25℃, 18-25℃, 19-25℃, 20-25℃, 21-25℃, 22-25℃, 23-25℃, 24-25℃, 또는 25℃ 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 플라스미드 DNA의 액체 제형에 있어서, 상기 액체 제형은 만니톨 약 0.001 내지 0.3%, 솔비톨 약 0.05 내지 0.5%, 수크로스 약 0.05 내지 0.5%, 트레할로스 약 0.15 내지 3%, 루이신 약 0.045-0.055%, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 만니톨을 약 0.001 내지 0.3%, 약 0.005 내지 0.3%, 약 0.01 내지 0.3%, 약 0.02 내지 0.3%, 약 0.03 내지 0.3%, 약 0.04 내지 0.3%, 약 0.05 내지 0.3%, 약 0.001 내지 0.25%, 약 0.005 내지 0.25%, 약 0.01 내지 0.25%, 약 0.02 내지 0.25%, 약 0.03 내지 0.25%, 약 0.04 내지 0.25%, 약 0.05 내지 0.25%, 약 0.001 내지 0.2%, 약 0.005 내지 0.2%, 약 0.01 내지 0.2%, 약 0.02 내지 0.2%, 약 0.03 내지 0.2%, 약 0.04 내지 0.2%, 약 0.05 내지 0.2%, 약 0.001 내지 0.15%, 약 0.005 내지 0.15%, 약 0.01 내지 0.15%, 약 0.02 내지 0.15%, 약 0.03 내지 0.15%, 약 0.04 내지 0.15%, 약 0.05 내지 0.15%, 약 0.001 내지 0.1%, 약 0.005 내지 0.1%, 약 0.01 내지 0.1%, 약 0.02 내지 0.1%, 약 0.03 내지 0.1%, 약 0.04 내지 0.1%, 약 0.05 내지 0.1%, 약 0.001 내지 0.075%, 약 0.005 내지 0.075%, 약 0.01 내지 0.075%, 약 0.02 내지 0.075%, 약 0.03 내지 0.075%, 약 0.04 내지 0.075%, 약 0.05 내지 0.075%, 약 0.001 내지 0.07%, 약 0.005 내지 0.07%, 약 0.01 내지 0.07%, 약 0.02 내지 0.07%, 약 0.03 내지 0.07%, 약 0.04 내지 0.07%, 약 0.05 내지 0.07%, 약 0.001 내지 0.06%, 약 0.005 내지 0.06%, 약 0.01 내지 0.06%, 약 0.02 내지 0.06%, 약 0.03 내지 0.06%, 약 0.04 내지 0.06%, 약 0.05 내지 0.06%, 약 0.001 내지 0.05%, 약 0.005 내지 0.05%, 약 0.01 내지 0.05%, 약 0.02 내지 0.05%, 약 0.03 내지 0.05%, 약 0.04 내지 0.05%, 약 0.01%, 약 0.03%, 약 0.05%, 약 0.07%, 약 0.075%, 또는 약 0.1%의 농도로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 약 30-39 mM, 약 31-39 mM, 약 32-39 mM, 약 33-39 mM, 약 34-39 mM, 약 34-39 mM, 약 35-39 mM, 약 36-39 mM, 약 37-39 mM, 약 30-38.5 mM, 약 31-38.5 mM, 약 32-38.5 mM, 약 33-38.5 mM, 약 34-38.5 mM, 약 34-38.5 mM, 약 35-38.5 mM, 약 36-38.5 mM, 약 37-38.5 mM, 약 30-38 mM, 약 31-38 mM, 약 32-38 mM, 약 33-38 mM, 약 34-38 mM, 약 34-38 mM, 약 35-38 mM, 약 36-38 mM, 약 37-38 mM, 약 30-37.5 mM, 약 31-37.5 mM, 약 32-37.5 mM, 약 33-37.5 mM, 약 34-37.5 mM, 약 34-37.5 mM, 약 35-37.5 mM, 약 36-37.5 mM, 약 37-37.5 mM, 약 30-37.3 mM, 약 31-37.3 mM, 약 32-37.3 mM, 약 33-37.3 mM, 약 34-37.3 mM, 약 34-37.3 mM, 약 35-37.3 mM, 약 36-37.3 mM, 약 37-37.3 mM, 약 36 mM, 약 37 mM, 약 37.3 mM, 약 37.5 mM, 약 38 mM, 또는 약 39 mM 의 농도로 Potassium phosphate를 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 NaCl를 약 0.8-1.5%, 약 0.85-1.5%, 약 0.9-1.5%, 약 0.95-1.5%, 약 0.97-1.5%, 약 0.975-1.5%, 약 0.98-1.5%, 약 0.8-1.25%, 약 0.85-1.25%, 약 0.9-1.25%, 약 0.95-1.25%, 약 0.97-1.25%, 약 0.975-1.25%, 약 0.98-1.25%, 약 0.8-1.2%, 약 0.85-1.2%, 약 0.9-1.2%, 약 0.95-1.2%, 약 0.97-1.2%, 약 0.975-1.2%, 약 0.98-1.2%, 약 0.8-1.1%, 약 0.85-1.1%, 약 0.9-1.1%, 약 0.95-1.1%, 약 0.97-1.1%, 약 0.975-1.1%, 약 0.98-1.1%, 약 0.8-1.0%, 약 0.85-1.0%, 약 0.9-1.0%, 약 0.95-1.0%, 약 0.97-1.0%, 약 0.975-1.0%, 약 0.98-1.0%, 약 0.8 %, 약 0.9%, 약 0.95%, 또는 약 1.0%의 농도로 포함하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형은 약 37 mM Potassium phosphate, 약 1.0% NaCl, 만니톨 약 0.05%, 솔비톨 약 0.15%, 수크로오스 약 0.3%, 트레할로스 약 1.5%, 루이신 약 0.05%, 또는 이들의 조합을 포함하고, pH 약 8.0이다.
본 명세서에서 상기 본 발명의 일 양태에 따른 액체 제형은 D 제형으로 명명되었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 2-8℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 또는 9개월 보관 후에도 90-100, 91-100, 92-100, 93-100, 94-100, 95-100, 95-100, 96-100 SC%를 유지하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 15-30℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 또는 9개월 보관 후에도 80-100, 81-100, 82-100, 83-100, 84-100, 85-100, 86-100, 87-100, 88-100, 또는 89-100 SC%를 유지하는 것이다. 상기 보관 온도는 15-30℃, 16-30℃, 17-30℃, 18-30℃, 19-30℃, 20-30℃, 21-30℃, 22-30℃, 23-30℃, 24-30℃, 25-30℃, 15-28℃, 16-28℃, 17-28℃, 18-28℃, 19-28℃, 20-28℃, 21-28℃, 22-28℃, 23-28℃, 24-28℃, 25-28℃, 15-27℃, 16-27℃, 17-27℃, 18-27℃, 19-27℃, 20-27℃, 21-27℃, 22-27℃, 23-27℃, 24-27℃, 25-27℃, 15-26℃, 16-26℃, 17-26℃, 18-26℃, 19-26℃, 20-26℃, 21-26℃, 22-26℃, 23-26℃, 24-26℃, 25-26℃, 15-25℃, 16-25℃, 17-25℃, 18-25℃, 19-25℃, 20-25℃, 21-25℃, 22-25℃, 23-25℃, 24-25℃, 또는 25℃ 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 일 양태에 따른 상기 액체 제형(A 제형 내지 D 제형)은 플라스미드 DNA의 SC% (supercoiled %)의 변화를 억제한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 조성물에 포함된 플라스미드 DNA SC% (supercoiled %)는 최초 측정치를 기준으로 2-8℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 보관 후에도 80-100%, 85-100%, 90-100%, 또는 95-100%의 측정치를 유지한다. 예컨대, 본 발명의 액체 제형 조성물에 포함된 플라스미드 DNA SC%의 최초 측정치가 90 SC%인 경우, 2-8℃에서 6개월 후 상기 액체 제형에서 다시 측정한 플라스미드 DNA SC%는 72 SC% 내지 90 SC%일 수 있다. 상기 '최초 측정치'는 본 발명의 액체 제형에 플라스미드 DNA를 첨가한 직후에 측정한 플라스미드 DNA의 SC%를 의미한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 액체 제형 조성물에 포함된 플라스미드 DNA SC% (supercoiled %)는 최초 측정치를 기준으로 15-30℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 보관 후에도 70-100%, 75-100%, 80-100%, 81-100%, 82-100%, 83-100%, 84-100%, 또는 85-100%의 측정치를 유지한다.
예컨대, 본 발명의 액체 제형 조성물에 포함된 플라스미드 DNA SC%의 최초 측정치가 90 SC%인 경우, 30℃에서 6개월 후 다시 측정한 플라스미드 DNA SC%는 63 SC% 내지 90 SC%일 수 있다.
상기 보관 온도는 15-30℃, 16-30℃, 17-30℃, 18-30℃, 19-30℃, 20-30℃, 21-30℃, 22-30℃, 23-30℃, 24-30℃, 25-30℃, 15-28℃, 16-28℃, 17-28℃, 18-28℃, 19-28℃, 20-28℃, 21-28℃, 22-28℃, 23-28℃, 24-28℃, 25-28℃, 15-27℃, 16-27℃, 17-27℃, 18-27℃, 19-27℃, 20-27℃, 21-27℃, 22-27℃, 23-27℃, 24-27℃, 25-27℃, 15-26℃, 16-26℃, 17-26℃, 18-26℃, 19-26℃, 20-26℃, 21-26℃, 22-26℃, 23-26℃, 24-26℃, 25-26℃, 15-25℃, 16-25℃, 17-25℃, 18-25℃, 19-25℃, 20-25℃, 21-25℃, 22-25℃, 23-25℃, 24-25℃ 또는 25℃이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 상기 액체 제형은 단위 용량 형태로 바이알(vial), 앰플(ampule), 병(bottle), 또는 사전-충전형 주사기(프리필드 시린지, pre-filled syringe)로 제작된 것이다.
본 발명의 일 양태에 따른 액체 제형은 다양한 질병을 치료하기 위해 포유 동물 대상(mammalian subject)에게 투여될 수 있다. 본 발명의 액체 제형은 다양한 전달 방법에 의해, 예를 들어, 경구(orally) 또는 비경구 (parenteral) 경로, 예컨대 정맥 내(intravenous), 근육 내(intramuscular), 심내막 내(intraendocardial), 심근 내(intramyocardial), 심강 내(intrapericardial), 심실 내(intraventricular), 관절 내(intraarticular), 피내(intradermal), 뇌내(intracerebral), 신장 내(intrarenal), 간내(intrahepatic), 비장 내(intrasplenic), 림프관 내(intralymphatic), 피하(subcutaneous), 복강 내(intraabdominal), 고환 내(intratesticular), 난소 내(intraovarian), 자궁 내(intrauterine), 흉골(sternal), 기관 내(intratracheal), 흉강 내(intraplueral), 흉관 내(intrathoracic), 경막 내(intradural), 척수 내(intraspinal), 골수 내(intramedullary), 벽 내 (intramural), 융모막 내(intrascorionic) 및 동맥 내 주사(arterial injection) 또는 주입(infusion), 또는 직장(rectal), 비강 내(intranasal), 흡입(inhalational) 또는 안구 내(intraocular)를 통한 국소(topically) 투여에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 전달 방법은 근육 내(intramuscular), 심근 내 (intramyocardial), 정맥 내(intravenous), 뇌내(intracerebral) 또는 신장 내(intrarenal)이다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 핵산 컨스트럭트는 액체 약제학적 조성물의 주사에 의해 투여된다. 구체적인 구현예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트는 근육 내 주사에 의해 투여된다. 전형적으로, 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트는 영향을 받는 부위에 가까이 근육 내 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트는 대상의 사지(limbs), 심장, 또는 다른 신체 부위의 근육에 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 상기 컨스트럭트는 피하(subcutaneously) 또는 피내(intradermally)로 주사된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트는 혈관 내 전달에 의해 투여된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 컨스트럭트는 역행성 정맥 주사(retrograde intravenous injection)에 의해 주사된다.
본 발명의 액체 제형의 조성물의 전형적인 일일 복용량은 치료될 상태, 선택된 투여 경로, 환자 개인의 연령, 성별, 및 체중, 및 환자 증상의 중증도를 포함하는 다양한 관련 인자에 비추어 결정되어야 하며, 단일 용량 또는 분할 용량으로 투여될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트는 치료적 유효 용량으로 투여된다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트는 1 μg 내지 200 mg, 1 mg 내지 200 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 20 mg, 5 mg 내지 10 mg, 16 mg, 8 mg 또는 4 mg의 총 용량에서 투여된다.
전형적인 구현예에 있어서, 총 용량은 복수의 개별 주사 용량으로 분할된다. 일부 구현예에 있어서, 총 용량은 복수의 동일한 주사 용량으로 분할된다. 일부 구현예에 있어서, 총 용량은 균등하지 않은 주사 용량으로 분할된다.
다양한 분할된 용량(divided dose) 구현예에 있어서, 총 용량은 4, 8, 16, 24 또는 32개의 상이한 주사 부위에 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 주사 용량은 0.1 - 5 mg이다. 특정 구현예에 있어서, 주사 용량은 0.1 mg, 0.15 mg, 0.2 mg, 0.25 mg, 0.3 mg, 0.35 mg, 0.4 mg, 0.45 mg 또는 0.5 mg이다.
총 투여 용량은 1회 방문 동안 또는 2회 이상의 방문 동안 투여될 수 있다.
전형적인 분할된 용량 구현예에 있어서, 모든 복수의 주사 용량은 서로 1시간 이내에 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 모든 복수의 주사 용량은 서로 1.5, 2, 2.5 또는 3시간 내에 투여된다.
본 방법의 다양한 구현예에 있어서, 단일 일원화된 용량(unitary dose)으로 투여되든지 또는 복수의 주사 용량으로 분할되어 투여되든지, 총 용량의 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트는 대상에게 한 번만 투여된다.
일부 구현예에 있어서, 1회, 2회, 3회 또는 4회 방문에 걸쳐 복수의 주사 부위로의 총 용량의 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트의 투여는 단일 주기를 포함할 수 있다. 특히, 2회 방문에 걸친 32 mg, 16 mg, 8 mg 또는 4 mg의 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트를 복수의 주사 부위로의 투여는 단일 주기를 포함할 수 있다. 2회 방문은 3, 5, 7, 14, 21 또는 28일 간격일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 주기는 반복될 수 있다. 주기는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상으로 반복될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 주기는 이전 주기 후에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 이상으로 반복될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 후속 주기에서 투여되는 총 용량은 이전 주기에 투여된 총 용량과 동일하다. 일부 구현 예에 있어서, 후속 주기에 투여되는 총 용량은 이전 주기에 투여된 총 용량과 상이하다.
현재 바람직한 구체예에 있어서, 핵산 컨스트럭트는 영향받은 사지(limbs) 당 8 mg의 용량으로 투여되며, 복수의 근육 내 주사 및 복수의 방문으로 동일하게 분할되며, 임의의 단일 방문에서의 복수의 주사 각각이 별도의 주사 부위에서 수행된다. 특정 구현예에 있어서, 핵산 컨스트럭트는 영향을 받은 사지(limbs) 당 8 mg의 용량으로 투여되며, 0일에 사지(limbs) 당 4 mg의 제 1 용량 및 14일에 사지(limbs) 당 4 mg의 제 2 용량으로 균등하게 분할되고, 여기서 제 1 및 제 2 용량 각각은 복수의 주사 용량으로 균등하게 분할된다.
실제 투여된 양 및 속도 및 투여의 시간-경과는 치료되는 질병의 속성(nature) 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 전형적인 구현예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트는 질병의 증상, 예를 들어 통증을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양은 투여 1주일 이내에 증상을 감소시키는 데 효과적이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 양은 투여 후 2주, 3주 또는 4주 내에 증상을 감소시키는 데 효과적이다.
플라스미드 DNA는 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로, 단독으로 또는 다른 플라스미드 DNA와 함께 조합하여 투여될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 액체 제형의 약제학적 조성물은 인간 HGF를 코딩하는 플라스미드 DNA를 포함한다. 액체 제형의 약제학적 조성물은 다양한 질병, 예를 들어 플라스미드 DNA의 투여에 의해 이전에 치료 가능한 것으로 입증된 질병을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 플라스미드 DNA는 인간 HGF와 같은 치료 유전자를 코딩할 수 있다. 이 질병은 허혈성 또는 간 질환, 관상 동맥 질환(coronary artery disease, "CAD"), 근위축성 측삭 경화증(amytrophic lateral sclerosis, "ALS"), 말초 동맥 질환 (peripheral artery disease, "당뇨병성 궤양(diabetic ulcer)") 및 당뇨병성 말초 신경 병증(diabetic peripheral neuropathy, "DPN") 또는 질병, 부상, 감염 또는 비타민 결핍 상태로 인한 신경 병증(neuropathy)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 신경 병증은 당뇨병, 비타민 결핍, 자가 면역 질환, 유전적 또는 유전성 장애, 아밀로이드증(amyloidosis), 요독증(uremia), 독소 (toxins) 또는 독(poisons), 외상(trauma) 또는 상해(injury), 종양(tumors)에 의해 유발될 수 있거나 또는 특발성(idiopathic)일 수 있다. 본원에 제공된 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명에 따른 플라스미드 DNA를 포함하는 액체 제형은, 약제학적 유효성분인 플라스미드 DNA의 보관안정성의 면에서 우수한 효능을 나타내는 바, 제품의 안정성 및 안전성이 우수한 약제학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 액체 제형 A의 장기안정성을 시험한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 액체 제형 B 및 C를 도출하기 위하여 각 인자의 영향에 대한 통계처리를 통하여 해석한 결과를 나타낸 도이다. (*KP=Potassium Phosphate, N=NaCl, MT=Mannitol, SR=Sucrose, TH=Trehalose, LC=Leucine)
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 최적 액체 제형을 도출하기 위하여 통계처리를 통해 해석한 결과, 도출한 조성을 나타낸 도이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 플라스미드 DNA의 장기안정성 향상을 위한 최적 액체 제형을 도출하기 위하여 통계처리를 통해 해석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 단위 용량 형태에 따른 보관안정성의 차이 유무를 확인하기 위하여, 본 발명의 액체 제형을 바이알 및 사전-충전형 주사기로 제조하였을 때에 플라스미드 DNA의 안정성을 비교하여 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 액체 제형 B 및 C를 도출하기 위하여 각 인자의 영향에 대한 통계처리를 통하여 해석한 결과를 나타낸 도이다. (*KP=Potassium Phosphate, N=NaCl, MT=Mannitol, SR=Sucrose, TH=Trehalose, LC=Leucine)
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 최적 액체 제형을 도출하기 위하여 통계처리를 통해 해석한 결과, 도출한 조성을 나타낸 도이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 플라스미드 DNA의 장기안정성 향상을 위한 최적 액체 제형을 도출하기 위하여 통계처리를 통해 해석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 단위 용량 형태에 따른 보관안정성의 차이 유무를 확인하기 위하여, 본 발명의 액체 제형을 바이알 및 사전-충전형 주사기로 제조하였을 때에 플라스미드 DNA의 안정성을 비교하여 나타낸 도이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
| AVE | Average |
| BDP | Bulk Drug Product |
| CMO | Contract Manufacturing Organization |
| DNA | Deoxyribonucleic Acid |
| DP | Drug Product |
| DS | Drug Substance |
| GMP | Good Manufacturing Practice |
| HX | Helixmith Co., Ltd. |
| N/A | Not Applicable |
| OC% | Open-Circular pDNA Configuration |
| pDNA | Plasmid DNA |
| SC% | Supercoil pDNA Configuration |
| ALD | A사 |
| WBU | W사 |
| CB | C사 |
실시예 1. 플라스미드 DNA 액체 제형 A의 개발
본 발명자들은 총 5회에 걸쳐 본 발명의 플라스미드 DNA 액체 제형 A를 스크리닝하였다. 5회의 스크리닝 중에 사용된 component prepartion, BDP 제조, 바이알 포장(vial filling), 샘플링, 및, SC% 분석은 모두 동일하게 진행되었다. 본 실시예에서 사용된 Vial은 BDP Formulation 최대 7일전, Vial wash Protocol에 따라 wash하여 70℃ Dry Oven에 보관 후 사용하였으며, Rubber-stopper의 경우 Vendor (West-DAIKYO SEIKO)에서 Sterilization이 완료되어, 개봉 후 바로 시험에 사용하였다.
BDP 제조 (Bulk Drug Product Formulation)
본 실시예에 사용된 1X buffer, 2X buffer는 각 최하 BDP (Bulk Drug Product) 제조 시작 최대 7일전에 제조되었다. 2X buffer의 경우 NaCl 미첨가, buffer strength, Mannitol, Sucrose conc. X 2로 제조되었다. (단, Final Formulation의 NaCl 농도가 0.9%인 경우 2X buffer도 0.9% NaCl, 1.1%인 경우 2X buffer는 1.3% NaCl로 제조)
1X buffer의 경우 Final Formulation 조성과 모두 동일하였다.
본 시험은 Small Scale buffer(100mL) 제조이며, 실제 상업 생산 Process의 제조 오차를 감안하여, 1X, 2X buffer는 제조 오차 범위는 ~2%로 진행하였다.
본 시험에 사용한 API는 A사 생산 VM202 DS(lot no. 88084) 시료를 사용하였으며, -70℃ Deep Freezer에서 2-8℃ Refrigerator로 옮겨 20-24시간 해동한 후 사용되었다.
해동한 DS는 2X, 1X buffer와 혼합하여, Final pDNA Concentration 0.48-0.52 mg/mL(Target 0.5mg/mL)의 BDP로 제조되었다.
BDP 제조 과정 및 샘플링 & 분석 절차는 아래 표 2와 같다.
| No. | Procedure |
| 1 | 여러가지 제형을 기준으로2X, 1X buffer 각각 제조 |
| 2 | BSC를 키고 2X, 1X, DS 시료를 준비- DS는 BDP formulation 하루 전에 2~8℃ 냉장고에서 해동을 실시한다. |
| 3 | Corning 150mL storage bottle에 DS (A사) 20mL 첨가 후 현재 volume 기록(A) |
| 4 | 20mL 2X buffer (B) 첨가 후 Mixing |
| 5 | 5min 이상 Roller mixer에서 Mixing 후 Nano drop을 통해 Total Nucleic acid 농도 측정 (C) |
| 6 | (((A+B) * (C/500) - A-B))의 공식에 해당 값을 넣어 첨가해야 하는 1X buffer 양 계산 (D) |
| 7 | BSC에서 계산한 1X buffer양을 첨가 |
| 8 | 2min 이상 Roller mixer에서 Mixing 후 Nano drop을 통해 Total Nucleic acid 농도 3회 측정 (E) |
| 9 | E의 값이 0.48 - 0.52 mg/mL의 기준치를 만족하면 10 step진행,E>0.52인 경우, 6번 공식에 C 대신 E, A+B대신 A+B+D를 대입하여, 추가로 첨가해야 하는 1X buffer volume 계산한 후, 1X buffer 추가로 첨가하여 다시 Total Nucleic Acid 농도 3회 측정 D<0.48인 경우, 시료 폐기 후 해당 BDP Formulation step 1 부터 재 진행 |
| 10 | 제조 완료된 시료에서 Day 0 시료 500ul 샘플링후 -70℃ deep freezer 보관 |
| 11 | 샘플링 후 남은 시료를 20mL vial에 5mL씩 분주하여, 70℃ oven에 배치 후 시간 기록(F) |
| 12 | Day 1, 3, 5, 7, 10에 F와 같은 시간에 BSC에서 300ul 샘플링 진행 |
| 13 | 샘플링 한 샘플은 -70℃ deep freezer 보관 |
| 14 | 분석할 샘플은 SC% 분석 1 시간 전 2~8℃ 냉장고에서 해동 |
| 15 | SC%(by HPLC)를 분석하여 기록 |
1 내지 5회차 스크리닝에 사용된 제형 리스트는 하기 표 3 내지 7과 같았다.
| Buffering agent, pH screening | ||||||||
| No. | Formulation code | Buffer | pH | Strength(mM) | Excipient 1 (Mannitol) | Excipient 2 (Sucrose) | Salt (NaCl) | API (mg/mL) |
| 1 | PA6.8 | Potassium Phosphate | 6.8 | 0.5 | 2% | 1% | 0.45% | 0.5 |
| 2 | PB6.8 | 1 | ||||||
| 3 | PC6.8 | 5 | ||||||
| 4 | PD6.8 | 10 | ||||||
| 5 | PA7.4 | 7.4 | 0.5 | |||||
| 6 | PB7.4 | 1 | ||||||
| 7 | PC7.4 | 5 | ||||||
| 8 | PD7.4 | 10 | ||||||
| 9 | PA8.0 | 8.0 | 0.5 | |||||
| 10 | PB8.0 | 1 | ||||||
| 11 | PC8.0 | 5 | ||||||
| 12 | PD8.0 | 10 | ||||||
| 13 | HA6.8 | Histidine | 6.8 | 0.5 | ||||
| 14 | HB6.8 | 1 | ||||||
| 15 | HC6.8 | 5 | ||||||
| 16 | HD6.8 | 10 | ||||||
| 17 | TA6.8 | Tris | 6.8 | 0.5 | ||||
| 18 | TB6.8 | 1 | ||||||
| 19 | TC6.8 | 5 | ||||||
| 20 | TD6.8 | 10 | ||||||
| 21 | TA7.4 | 7.4 | 0.5 | |||||
| 22 | TB7.4 | 1 | ||||||
| 23 | TC7.4 | 5 | ||||||
| 24 | TD7.4 | 10 | ||||||
| 25 | TA8.0 | 8.0 | 0.5 | |||||
| 26 | TB8.0 | 1 | ||||||
| 27 | TC8.0 | 5 | ||||||
| 28 | TD8.0 | 10 | ||||||
| 29 | CA6.8 | Sodium Citrate | 6.8 | 0.5 | ||||
| 30 | CB6.8 | 1 | ||||||
| 31 | CC6.8 | 5 | ||||||
| 32 | CD6.8 | 10 | ||||||
| 33 | CA7.4 | 7.4 | 0.5 | |||||
| 34 | CB7.4 | 1 | ||||||
| 35 | CC7.4 | 5 | ||||||
| 36 | CD7.4 | 10 | ||||||
| Excipient Screening | ||||||||
| No. | Formulation code | Buffer | pH | Strength(mM) | Excipient 1 (Mannitol) | Excipient 2 (Sucrose) | Salt (NaCl) | API (mg/mL) |
| 1 | PMS0.1X | Potassium Phosphate | 8.0 | 5 | 0.2% | 0.1% | 0.45% | 0.5 |
| 2 | PMS0.5X | 1% | 0.5% | |||||
| 3 | PMS1X | 2% | 1% | |||||
| 4 | PMS2X | 4% | 2% | |||||
| 5 | PN45 | 40 | - | - | 0.45% | |||
| 6 | P20/MS | 20 | 2% | 1% | 0.45% | |||
| Salt Screening | |||||||
| No. | Formulation code | Buffer | pH | Strength(mM) | Salt (NaCl) | Salt (MgCl2) | API (mg/mL) |
| 1 | PN45 | Potassium Phosphate | 8.0 | 40 | 0.45% | - | 0.5 |
| 2 | PN45M | 0.45% | 0.01% | ||||
| 3 | PN9 | 0.9% | - | ||||
| 4 | PN9M1 | 0.9% | 0.001% | ||||
| 5 | PN9M5 | 0.9% | 0.005% | ||||
| Double Buffer Screening | ||||||
| No. | Formulation code | Buffer | pH | Strength(mM) | Salt (NaCl) | API (mg/mL) |
| 1 | P40 | Potassium Phosphate (ctrl) | 8.0 | 40 | 0.9% | 0.5 |
| 2 | P40 | |||||
| 3 | PT3:1 | Potassium phosphate, Tris |
8.0 | Phosphate 40mM, Tris 40mM |
||
| 4 | PT1:3 | 8.0 | ||||
| 5 | PT8.1 | 8.1 | ||||
| 6 | PT8.4 | 8.4 | ||||
| 7 | PT8.7 | 8.7 | ||||
4회차 스크리닝은 2회에 걸쳐 진행된 실험이기에, P40 ctrl은 2회분 제조 및 분석되었다.
| 장기 안정성 시험의 최종 후보군. | ||||||
| No. | Formulation code | Buffer | pH | Strength(mM) | Salt (NaCl) | API (mg/mL) |
| 1 | P40 | Potassium Phosphate | 8.0 | 40 | 0.9% | 0.5 |
| 2 | P60 | 60 | ||||
| 3 | P100 | 100 | 1.1% | |||
스크리닝 분석 방법고온조건은 pDNA SC% 분해를 가속화하므로, 본 실시예에서는 Liquid DP vial들을 70℃ 오븐(Oven)에 보관 후, day 0, day 1, day 3, day 5에 시료를 샘플링하여, SC%(by HPLC)를 분석하였다. 분석 샘플은 샘플링 직후 -70℃ Deep Freezer에 보관하였으며, 샘플 분석 1시간 전 2-8℃ cold Room에서 해동 후 HPLC 분석을 진행하였다.
샘플 분석 시간과 비용을 절감하기 위하여, pDNA SC%가 10% 미만인 샘플의 경우, 해당 샘플 이후에 샘플링 된 시료에 대하여는 분석을 실시하지 않았다.
장기 안정성 시험 (Long-term Stability Study)
본 발명자들은 액체 제형의 장기 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 온도 조건에서 안정성을 확인하고자 2-8, 25, 37℃의 조건을 설정하고 1달 간격으로 SC%를 분석하였다. 2-8℃는 시료는 HX cold room에 정치 보관하였고, 25℃ 시료는 실온 정치 보관하였으며, 37℃ 시료는 37℃ Incubator에 정치 보관하였다.
샘플링 조건을 일정하게 유지하기 위하여, 1 vial (5 ml filling)에서 최대 4번의 샘플링만 진행하고 Final pH 측정 후 폐기하였다.
이외의 조건은 기존 1 내지 4회차 스크리닝 조건과 모두 동일하였다.
스크리닝 분석 결과
실시예 1-1. 1회차 스크리닝 (Buffering agent, pH Screening)
본 발명자들은 VM202 pDNA를 원료로 사용하여, 안정하게 유지할 수 있는 buffering agent의 종류와 pH 범위를 설정하고자 하였다.
먼저, 다양한 Buffering agent의 효과를 확인하기 위하여, Potassium Phosphate, Tris, Histidine, Sodium Citrate를 buffering agent로 사용하였다.
각각의 Buffering agent에서 가능한 pH 범위를 적용하여, Final Formulation List를 선정하였다. (단, pH는 문헌 자료 (Antoine Al-Achi, 2013)를 고려하여, pH 8.0이 넘지 않는 범위에서 설정하였다.)
1회차 스크리닝의 SC%(by HPLC) 분석결과는 아래 표 8에 나타낸 바와 같다.
| No. | Formulation code | SC% | Final pH | |||
| Day 0 | Day 1 | Day 3 | Day 5 | |||
| 1 | PA6.8 | 94 | 22 | 6.20 | ||
| 2 | PB6.8 | 94 | 35 | 6.43 | ||
| 3 | PC6.8 | 94 | 48 | 6.68 | ||
| 4 | PD6.8 | 94 | 39 | 6.63 | ||
| 5 | PA7.4 | 94 | 44 | 6.54 | ||
| 6 | PB7.4 | 94 | 60 | 4.2 | 6.80 | |
| 7 | PC7.4 | 94 | 75 | 11 | 7.02 | |
| 8 | PD7.4 | 94 | 69 | 11 | 7.15 | |
| 9 | PA8.0 | 94 | 56 | 4 | 6.68 | |
| 10 | PB8.0 | 94 | 68 | 7 | 6.91 | |
| 11 | PC8.0 | 94 | 74.4 | 35 | 5.3 | 7.30 |
| 12 | PD8.0 | 94 | 79 | 38 | 11 | 7.57 |
| 13 | HA6.8 | 94 | 0 | 6.91 | ||
| 14 | HB6.8 | 94 | 4.4 | 6.84 | ||
| 15 | HC6.8 | 94 | 6 | 6.52 | ||
| 16 | HD6.8 | 94 | 10 | 6.31 | ||
| 17 | TA6.8 | 94 | 5.79 | |||
| 18 | TB6.8 | 94 | 5.89 | |||
| 19 | TC6.8 | 94 | 6.4 | 6.19 | ||
| 20 | TD6.8 | 94 | 8.9 | 2.6 | 6.56 | |
| 21 | TA7.4 | 94 | 6.14 | |||
| 22 | TB7.4 | 94 | 6.04 | |||
| 23 | TC7.4 | 94 | 13.9 | 10 | 7.28 | |
| 24 | TD7.4 | 94 | 4.8 | 4.1 | 7.49 | |
| 25 | TA8.0 | 94 | 6.02 | |||
| 26 | TB8.0 | 94 | 10 | 6.79 | ||
| 27 | TC8.0 | 94 | 41 | 5.4 | 7.95 | |
| 28 | TD8.0 | 94 | 32.9 | 4.1 | 8.1 | |
| 29 | CA6.8 | 94 | 6.33 | |||
| 30 | CB6.8 | 94 | 59 | 6.40 | ||
| 31 | CC6.8 | 94 | 60 | 17 | 6.76 | |
| 32 | CD6.8 | 94 | 66 | 6.93 | ||
| 33 | CA7.4 | 94 | 6.20 | |||
| 34 | CB7.4 | 94 | 6.39 | |||
| 35 | CC7.4 | 94 | 37 | 6.59 | ||
| 36 | CD7.4 | 94 | 41 | 6.55 | ||
VM202 pDNA의 SC%는pH 가 8.0에 가까울수록 높은 경향을 보였으며, 그 중에서도 Potassium Phosphate를 buffering agent로 사용하였을 경우에 가장 안정하였다. 구체적으로, PC8.0, 및 PD8.0에서 3일 동안 SC%가 30% 이상으로 유지되었으며, PC7.4와PD7.4에서도 1일차 SC% 60% 이상 유지되었으나, 3일차 SC%는 10% 정도로 PC8.0, PD8.0보다 SC% 안정성이 감소함을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로 분석하여 볼 때, 동일한 Buffer를 사용한 경우에는 pH가 높을수록 SC%의 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다.
또한 Buffer strength가 높을수록, 제조 시 pH를 장기간 유지하는 것을 확인하였다. (PC8.0, PD8.0, TC8.0, TD8.0결과 참조) 따라서 동일한 buffer일 때, pH와 Buffer strength가 높을수록 SC%의 안정성이 높아짐을 확인하였다.
Buffer의 종류 또한 SC%의 안정성에 영향을 미치며, VM202 pDNA는 Potassium phosphate buffer와 Sodium Citrate buffer에서 높은 안정성을 보임을 확인할 수 있었다.
상기의 결과들을 종합하여 볼 때, VM202 Liquid formulation에 가장 적합한 buffer는 Potassium phosphate buffer pH 8.0의 조건으로 판단되었다.
실시예 1-2. 2회차 스크리닝 (Excipient Screening)
상기 1회차 스크리닝 결과를 (Potassium phosphate, pH 8.0)바탕으로, pDNA의 Stabilizer로서 사용되는 Mannitol, Sucrose의 농도를 다양하게 처리하여 pDNA 안정성에 기여하는 최적의 Excipient 농도 범위를 탐색하고자 하였다.
상기 1회차 스크리닝에서 확인한 최적의 buffering agent인 Potassium Phosphate, pH 8.0을 기본 조성으로 진행하였다.
Mannitol, Sucrose의 농도를 다양하게 하여, pDNA의 안정성을 비교하였다.
2회차 스크리닝의 SC%(by HPLC) 분석결과는 아래 표 9과 같았다.
| No. | Formulation code | SC% | Final pH | |||
| Day 0 | Day 1 | Day 3 | Day 5 | |||
| 1 | PMS0.1 | 94 | 74.5 | 25.4 | 9.4 | 7.48 |
| 2 | PMS0.5 | 94 | 73.7 | 25.6 | 6.1 | 7.41 |
| 3 | PMS1 | 94 | 74.4 | 24 | 5.3 | 7.40 |
| 4 | PMS2 | 94 | 71 | 23 | 4.6 | 7.37 |
| 5 | PN45 | 95 | 73 | 48 | 12 | 7.84 |
| 6 | P20/MS | 95 | 73 | 17 | 7.6 | |
PMS0.1, PMS0.5, PMS1, PMS2에서 5일 동안 pDNA의 SC% 유의미한 차이가 확인되지 않았다.또한, PN45, P20/MS에서는 둘 다 1일차 SC% 70% 이상 유지되었으나, 3일차 SC%는 PN45가 P20/MS에 비해 30% 이상 안정성이 증가함을 보였다. 상기 결과를 바탕으로 분석하여 볼 때, VM202 (A사 Non-GMP 생산 시료)의 SC%는 Mannitol, Sucrose의 농도와는 무관하다는 것을 확인하였다. (PMS0.1, PMS2 결과 참조)
또한 PN45의 Day 3 SC%가 P20/MS의 Day 3 SC%보다 30% 가량 높은 것으로 추측하여 볼 때, Mannitol과 Sucrose의 함량보다 Buffer Strength가 pDNA SC% 안정성에 더 큰 영향을 미치는 것으로 판단되었다. (PN45, P20/MS pDNA SC% 결과 참조)
따라서, 3회차 스크리닝에서는 Mannitol과 Sucrose를 Formulation 조성에서 제거하여도 된다고 판단하였다.
실시예 1-3. 3회차 스크리닝 (Salt screening)
본 발명자들은 pDNA의 depurination이 발생할 때, pDNA의 인산기(phosphate group)가 가지는 음성 전하(negative charge)를 Salt가 중화(neutralization)시켜 안정하게 한다는 참조문헌을 근거로 하여, VM202의 pDNA SC% 안정성에 기여하는 최적의 Salt 종류 및 농도 범위를 탐색하고자 하였다.
상기 1회차 및 2회차 스크리닝 결과를 바탕으로 하여, 40 mM potassium phosphate, 0.45% NaCl, pH 8.0을 기본 조성으로 하였다.
본 발명자들은 NaCl과 MgCl2와 같은 Salt가 pDNA 안정성에 영향을 준다는 학술 자료를 근거로 하여, NaCl과 MgCl2의 농도를 다양하게 하여 실험을 수행하였다.
마지막으로, VM202의 주사형태인 근육 주사(intramuscular injection)에 대해 주사가 가능한 Osmolality를 고려하여 Salt의 농도 범위를 설정하였다. (이상적으로는 280~360 mOsm/kg, 바람직하게는 <600 mOsm/kg)
3회차 스크리닝의 SC%(by HPLC) 분석결과는 아래 표 10과 같았다.
| No. | Formulation code | Osmolality (mOsm/kg) |
SC% | Final pH | |||
| Day 0 | Day 1 | Day 3 | Day 5 | ||||
| 1 | PN45 | 225 | 95 | 73 | 48 | 12 | 7.84 |
| 2 | PN45M | 226 | 95 | 77 | 57 | 29 | 7.78 |
| 3 | PN9 | 366 | 95 | 92 | 82 | 44 | 7.90 |
| 4 | PN9M1 | 366 | 95 | 89 | 77 | 7.84 | |
| 5 | PN9M5 | 367 | 95 | 86.5 | 72 | 7.89 | |
VM202 pDNA는 NaCl 농도가 증가함에 따라 pDNA의 SC% 안정성이 증가함을 확인하였다. (PN45, PN9 결과 참조) 또한, NaCl의 농도가 0.9%인 경우에 pDNA의 SC% 안정성이 크게 증가하는 것을 확인하였다.
MgCl2의 경우, NaCl이 0.45%인 경우 약 10%가량의 SC% 증대 효과를 보였지만, 시간이 지남에 따라 MgCl2가 물과 반응하여 Mg(OH)2로 석출되는 것을 확인할 수 있었다.
40 mM potassium phosphate, 0.9% NaCl에 최대한으로 녹일 수 있는 MgCl2는 0.01%이며, 이 이상은 석출되는 것을 확인하였다.
PN9M1, PN9M5 5일차에서는 MgCl2가 석출되었다. (HPLC 분석 종료)
상기 결과를 바탕으로 분석하여 볼 때, NaCl의 농도가 높아짐에 따라 SC% 안정성이 크게 증가하는 것을 확인하였다. (PN45, PN9 결과 참조)
또한 MgCl2의 경우에는 수용액 상태에서 일정 농도(PN45M조건) 이상에서는 Mg(OH)2로 석출되는 모습을 보였다. 이는 본 Round에 사용된 조건이 pH 8.0으로 높은 pH이며, 따라서 높은 (OH)- 이온농도로 인하여 Mg(OH)2가 형성된 것으로 판단되었다. 따라서 PN45M의 Salt 농도 이상에서는 Mg(OH)2로 인해 pDNA의 SC% 안정성을 높이지 못하는 것을 확인하였다.
상기의 결과들을 종합하여 볼 때 Salt를 NaCl 0.9%로 단독으로 넣어주는 것이pDNA의 SC% 안정성이 가장 높았으며 (Day5 기준 SC%: 44%), 3회차 스크리닝까지의 결과를 바탕으로 보았을 때, VM202 pDNA (A사)의 액체 제형의 최적의 조성은 40 mM potassium phosphate, 0.9% NaCl로 판단되었다.
실시예 1-4. 4회차 스크리닝 Round 4 Screening (Double buffer screening)
본 발명자들은 Potassium phosphate와 Tris, 두 가지 완충제(Double buffering agent)를 사용했을 때 pDNA SC%가 Potassium Phosphate의 한 가지 완충제를 사용했을 때보다 더 안정한지 확인하고, 1회차 내지 3회차 스크리닝에서 pH가 높을수록 pDNA가 안정환 된 것을 근거로 하여, 두 가지 완충제(Double buffering agent)를 사용하여 pH 상향 조절 후, pDNA가 더욱 안정화되는지 확인하고자 하였다.
먼저 두 가지 완충제는 기존에 사용한 phosphate buffer와 Tris buffer를 다른 비율로 혼합하여 pDNA를 액체 제형 형태로 조제하였다.
1회차 스크리닝의 결과에서 pH가 높으면 pDNA가 더 안정했던 결과를 토대로 phosphate, Tris를 혼합하여 pH 8.0보다 높게 제조하여 pDNA 안정성을 시험하고자 하였다.
NaCl 농도는 3회차 스크리닝 결과를 참고로 하여 0.9%로 고정하였다.
4회차 스크리닝의 SC% (by HPLC) 분석결과는 아래 표 11과 같았다.
| No. | Formulation code | pH (Day 0) |
SC% | Final pH | |||
| Day 0 | Day 1 | Day 3 | Day 5 | ||||
| 1 | P40 | 8.00 | 94 | 92 | 82 | 44 | 8.07 |
| 2 | P40 | 8.03 | 94 | 81 | 60 | 54 | 8.02 |
| 3 | PT3:1 | 7.97 | 94 | 81 | 57 | 29 | 8.01 |
| 4 | PT1:3 | 8.02 | 94 | 66 | 14 | 5 | 8.03 |
| 5 | PT8.1 | 8.12 | 94 | 80 | 41 | 16 | 8.12 |
| 6 | PT8.4 | 8.36 | 94 | 82 | 54 | 36 | 8.33 |
| 7 | PT8.7 | 8.72 | 94 | 84 | 72 | 55 | 8.66 |
pH 8.0 고정, Phosphate, Tris 비율을 변화시킨 실험에서는 phosphate 비율이 높을수록 pDNA 가 안정한 것을 확인하였다. (P/T 3:1, P/T 1:3 결과 참조)Phosphate, 및 Tris 비율을 고정하고, pH를 변화시킨 실험에서는 pH가 높을수록 pDNA가 안정한 것을 확인하였다.최종적으로 Double buffer를 사용했을 때, phosphate, Tris ratio 1:1, pH 8.7에서의 pDNA 안정성은 phosphate 40mM, pH 8.0과 유사한 결과를 보였다.
4회차 스크리닝을 통해 Phosphate의 비율이 높을수록 pDNA SC%의 안정성이 장기간 유지됨을 확인하였다.
Phosphate와 Tris의 비율이 동일한 경우, pH가 높을 때 pDNA가 더 안정함을 확인하였다.
따라서 double buffer formulation의 경우 phosphate buffer의 비율을 높일수록, formulation pH가 높을수록 pDNA의 안정성이 높아짐을 확인하였다.
하지만, P40과 P/T8.7의 SC% 안정성이 유사하다는 것을 확인하였다. 이는 Double buffer의 효과가 기존 single buffer formulation과 대비하여 pDNA SC% 안정성에 유의미한 차이가 없다는 것을 의미한다. 또한 double buffer를 사용할 경우 각 buffer strength를 40mM씩 사용하기 때문에, Osmolarity가 증가한다.
따라서, 상기의 결과를 토대로 기존 single buffer, phosphate 40mM, pH 8.0이 가장 적합하다고 판단된다.
실시예 1-5. 5회차 스크리닝 (최종 후보군의 Long-term Stability)
1회차 내지 4회차 스크리닝을 통하여, 선정된 40mM Phosphate, NaCl 0.9%, pH 8.0 formulation과 추가 Lead Candidates의 여러 온도에서 장기안정성을 확인하고자 하였다.
선정된 40mM phosphate, NaCl 0.9%, pH8.0 조건에 buffering agent와 Salt의 Saturation Point를 확인하기 위하여, 60mM Phosphate, NaCl 0.9%/100mM Phosphate, NaCl 1.1%의 조건을 추가하여 장기 안정성 시험을 진행하였다.
우선 DP 보관 온도인 2-8℃, 가속(accelerated) 조건인 25℃, 가혹(stress) 조건인 37℃에서 시간대 별로 샘플링하여 확인하였다.
샘플링 조건을 일정하게 유지하기 위하여, 1 vial (5 ml filling)에서 최대 4번의 샘플링만 진행하고, 남은 시료는 Final pH 측정 후, 폐기하였다.
장기 안정성 시험의 계획은 아래 표 12에 기재하였다.
| Formulation code | Temperature Conditions (℃) | Time Point (month) | ||||
| T0 | T1 | T2 | T3 | T6 | ||
| P40 | 2-8 | X | X | X | X | X |
| 25 | X | X | X | X | X | |
| 37 | X | X | X | X | X | |
| P60 | 2-8 | X | X | X | X | X |
| 25 | X | X | X | X | X | |
| 37 | X | X | X | X | X | |
| P100 | 2-8 | X | X | X | X | X |
| 25 | X | X | X | X | X | |
| 37 | X | X | X | X | X | |
5회차 스크리닝의 SC% (by HPLC) 분석결과는 아래 표 13 및 도 1에 나타내었다.
| Formulation code | Temperature Conditions (℃) | Time Point (month) | ||||
| T0 | T1 | T2 | T3 | T6 | ||
| P40 | 2-8 | 96.8 | 97.5 | 95.8 | 94.2 | 96.3 |
| 25 | 96.8 | 94 | 93.2 | 89.5 | 83.0 | |
| 37 | 96.8 | 89 | 81.5 | 75.9 | 67.7 | |
| P60 | 2-8 | N/A | 96.6 | N/A | N/A | N/A |
| 25 | N/A | 94.4 | N/A | N/A | N/A | |
| 37 | N/A | 85 | N/A | 85.8 | N/A | |
| P100 | 2-8 | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A |
| 25 | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | |
| 37 | N/A | 83.8 | N/A | N/A | 64.5 | |
- N/A의 경우 미분석을 뜻함P40, P60 그리고 P100의 조성 모두 각각의 온도 조건 보관 후 유사한 SC%인 것을 확인하였다.
P40의 경우 25℃, 6개월 보관 후 SC%가 80% 이상임을 확인하였다 (VM202 DP의 Acceptance Criteria 이상).
이에 따라, 앞서 예상한 대로, 해당 조성의 경우 2-8℃에 보관할 경우 18개월 이상 안정할 것으로 판단하였으며, 실제 6개월간 2-8℃에 보관한 경우 T0 시점과 SC%가 1%도 차이 나지 않는 것을 확인하였다.
가혹(stress) 조건인 37℃ 조건에서는 약 2개월가량 SC% 80%를 유지하는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, P40, P60, P100 모든 조건에서 SC%의 분석 결과는 유사하다는 것을 확인하였다. 이를 통해, Phosphate Buffer Strength와 NaCl의 VM202 pDNA SC% 안정성은 40mM, 0.9%, pH 8.0에서 최대로 유지되는 것으로 판단되며, NaCl이나 pH 안정성은 SC%의 더 이상의 영향은 주지 못하는 것으로 판단되었다.
따라서 상기의 결과를 바탕으로 P40의 Formulation(pH 8.0, Phosphate 40mM, NaCl 0.9%)이 VM202 DP 최종 제형으로 가장 적합하다고 판단된다.
실시예 1의 결론
총 4회차의 스크리닝과 1회차의 6개월간의 안정성 시험 결과를 통해 목표했던(25℃, 3개월 보관, SC% 80% 이상) 안정성을 가진 VM202 액체 제형을 성공적으로 개발하였다.
본 실시예를 통하여, VM202 pDNA 안정성에는 pH뿐 아니라 Buffering agent의 종류도 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 학술 자료에 근거하여 NaCl보다 더욱 DNA를 안정하게 유지시킬 것으로 예상한 MgCl2의 경우, Mg(OH)2를 형성하면서 석출되어, DNA 안정성에 기여하지 못했다. 이는 학술 자료와 달리 VM202 제형이 pH 8.0으로 상대적으로 높은 pH로, 높은 (OH)- 이온으로 Mg(OH)2가 형성되기 때문인 것으로 판단된다.
또한 6개월 안정성 시험을 통하여, VM202 pDNA는 Phosphate buffer 40mM, NaCl 0.9%, pH 8.0 조성은 25℃, 6개월 보관후에도 안정하게 유지됨(SC% 83%)을 확인하였다.
최종 도출된 조성은 필요한 경우, 장기 안정성 시험(18개월)을 통하여 2-8℃ 보관 안정성을 추가로 확인할 예정이며, 최종 도출된 조성을 근거로 하여 추후 상업생산에 적용할 수 있는 조성 범위를 파악할 예정이다.
본 실시예 1에서 5회차의 스크리닝을 통하여, 최종 도출된 조성은 아래 표 14와 같다.
| Ingredient | Concentration | Purpose |
| VM202 DS | 0.5mg/mL | Active Pharmaceutical Ingredient |
| Potassium Phosphate | 40mM | Buffering Agent |
| NaCl | 0.9% | Stabilizer |
| To the final pH of 8.0 | ||
최종 도출된 조성은(40mM Potassium Phosphate, 0.9% NaCl, pH 8.0) 25℃ 보관 조건에서 3개월간 DP spec의 기준을 상회하는 안정성을 보였으며(89.5% SC), 이 제형은2-8℃ 보관 조건에서 18개월 이상 안정할 것으로 판단된다.최종 도출된 조성을 근거로 하여, 추후 상업생산에 적용할 수 있는 조성 범위를 파악할 예정이다.
실시예 2: 플라스미드 DNA 액체 제형 B 및 C의 개발
상기 실시예 1을 통하여 도출된 액체 제형의 조성을 C사, W사, 및 Helixmith에서 생산한 VM202 DS에 적용한 경우, A사 생산 VM202 DS의 경우와 SC% 안정성이 상이한 것을 확인하였다. 따라서, A사에서 생산한 VM202 DS에 국한되어 있던 액체 제형의 한계를 확장하고자 본 실험을 진행하였다. 실시예 1에서 확립된 A사 VM202 DS에 적용된 액체 제형은 액체 제형 A(Formulation A)라 명명하였다.
이전 실시예와 마찬가지로, VM202 DP의 안정성은 VM202의 품질을 결정하는 요소 중 하나인 SC% 비율로 평가하였다.
VM202 DS의 기본적인 특성은 동일할 것으로 판단하여, 상기 실시예 1을 통해 선정된 액체 제형 A 조성을 기반으로 하여 본 실시예의 스크리닝을 진행하였다.
액체 제형 A의 스크리닝 결과를 참고하여 액체 제형 B (Formulation B)를 선정하였으며, DoE를 통하여 각각의 excipient가 최적의 농도를 가지는 액체 제형 C (Formulation C)를 선정하였다.
본 스크리닝의 안정성 목표는 DP Spec(SC% 85%) 기준을 20-25℃ 보관 조건에서 3 개월 이상 유지하는 것으로 하였다. 해당 목표 설정은 보관 온도가 높아질수록, pDNA의 SC%의 분해가 가속된다는 연구를 기반으로 하여, 20-25℃에서 3개월동안 안정한 경우, DP 보관 온도인 2-8℃에서는 18개월 이상 안정할 것이라 가정하여 선정하였다.
또한 개발 기간 단축을 위하여, pDNA를 70℃에서 5일동안 노출(가속조건) 시킴으로써, pDNA 분해속도를 촉진시킨 후 SC%를 분석하였고, 장기 안정성 시험의 경우 2-8℃, 20-25℃, 37℃에 보관 후 2주 단위(2-8℃는 1달 단위)로 샘플링하여, 3개월간 SC%를 측정하였다. (2-8℃는 3년 계획)
본 실시예에서 진행된 총 4회차의 스크리닝은 실시예 1과 동일하게 component prepartion, BDP 제조, 바이알 포장(vial filling), 샘플링, 및, SC% 분석 과정으로 진행되었다.
시험에 사용된 Vial은 실제 생산공정과 최대한 동일하게BDP Formulation 최대 2일전 Vial wash Protocol에 따라 wash하여 70℃ Dry Oven에 보관 후 사용하였으며, Rubber-stopper의 경우 Vendor(West-DAIKYO SEIKO)에서 Sterilization이 완료되어, 개봉 후 바로 시험에 사용하였다.
제형의 제조
본 실시예에 사용한 1X buffer, 2X buffer는 각 회차 BDP 제조 시작 최대 3일전에 제조되었다.
2X buffer의 경우, buffer strength, Mannitol, Sucrose, Sorbitol, Trehalose, Leucine, Arginine conc. X 2로 제조되었다. (단, NaCl 농도는 Final 조성의 NaCl 농도(A)를 기준으로 다음식에 대입하여 계산된 값으로 진행하였다.
*(A x 2) - 0.9 = 2X buffer의 NaCl conc.
1X buffer의 경우 Final Formulation 조성과 모두 동일하다.
본 실시예는 Small Scale buffer (100 mL) 제조이며, 실제 상업 생산 Process의 제조 오차를 감안하여, 1X, 2X buffer는 제조 오차 범위는 ~2%로 진행하였다.
본 실시예에 사용된 API는 A사 생산 VM202 DS(lot no. 88084), C사 생산 VM202 DS (lot no. 2017#0042U), Helixmith 자체생산 VM202 DS, W사 생산 VM202 DS(lot no. DEV19-035,049,061,068) 시료를 사용하였으며, -70℃ Deep Freezer에서 2-8℃ Refrigerator로 옮겨 20-24시간 해동한 후 사용되었다.
해동한 DS는 2X, 1X buffer와 Mixing하여, Final pDNA Concentration 0.48-0.52 mg/mL(Target 0.5mg/mL)의 BDP로 제조되었다.
BDP 제조 과정 및 샘플링 및 분석 절차는 아래 표 15와 같다.
| No. | Procedure |
| 1 | Table 7-12의 Formulation List를 기준으로2X, 1X buffer 각각 제조 |
| 2 | BSC를 키고 2X, 1X, DS 시료를 준비- DS는 BDP formulation 하루 전에 2~8℃ 냉장고에서 해동을 실시한다. |
| 3 | SPL 50mL Conical tube에 DS 5-7mL 첨가 후 현재 volume 기록(A) |
| 4 | DS와 동일한 Volume의 2X buffer (B) 첨가 후 Mixing |
| 5 | 5min 이상 Roller mixer에서 Mixing 후 Nano drop을 통해 Total Nucleic acid 농도 측정 (C) |
| 6 | (((A+B) * (C/500) - A-B))의 공식에 해당 값을 넣어 첨가해야 하는 1X buffer 양 계산 (D) |
| 7 | BSC에서 계산한 1X buffer양을 첨가 |
| 8 | 2min 이상 Roller mixer에서 Mixing 후 Nano drop을 통해 Total Nucleic acid 농도 3회 측정 (E) |
| 9 | E의 값이 0.48 - 0.52 mg/mL의 기준치를 만족하면 10 step진행,E>0.52인 경우, 6번 공식에 C 대신 E, A+B대신 A+B+D를 대입하여, 추가로 첨가해야 하는 1X buffer volume 계산한 후, 1X buffer 추가로 첨가하여 다시 Total Nucleic Acid 농도 3회 측정 D<0.48인 경우, 시료 폐기 후 해당 BDP Formulation step 1 부터 재 진행 |
| 10 | pH를 8.0으로 맞춘 후, vacuum filter로 BDP filtering 실시 (DOE부터 적용) |
| 11 | 제조 완료된 시료에서 Day 0 시료 500ul 샘플링후 -70℃ deep freezer 보관 |
| 12 | 샘플링 후 남은 시료를 20mL vial에 5mL씩 분주하여, 70℃ oven에 배치 후 시간 기록(F) |
| 13 | Day 1, 3, 5에 F와 같은 시간에 BSC에서 200ul 샘플링 진행 |
| 14 | 샘플링 한 샘플은 -70℃ deep freezer 보관 |
| 15 | 분석할 샘플은 SC% 분석 1 시간 전 2~8℃ 냉장고에서 해동 |
| 16 | SC%(by HPLC)를 분석하여 기록 |
1 내지 4회차 스크리닝에 사용된 제형 리스트는 아래 표 16 내지 표 21과 같다.
| No. | DS source | Formulation code | pH | K phosphate (mM) | Salt (NaCl) | Excipient (%) | API (mg/mL) |
| 1 | C사 | CBCON | 8.0 | 40 | 0.9% | - | 0.5 |
| 2 | M05 | Mannitol (0.5) | |||||
| 3 | M15 | Mannitol (1.5) | |||||
| 4 | S05 | Sucrose (0.5) | |||||
| 5 | S15 | Sucrose (1.5) | |||||
| 6 | SB05 | Sorbitol (0.5) | |||||
| 7 | SB15 | Sorbitol (1.5) | |||||
| 8 | T05 | Trehalose (0.5) | |||||
| 9 | T15 | Trehalose (1.5) | |||||
| 10 | L025 | Leucine (0.25) | |||||
| 11 | L05 | Leucine (0.5) | |||||
| 12 | A005 | Arginine (0.05) | |||||
| 13 | ALD | ALCON | - |
앞선 액체 제형 A에 관한 실시예에서 액체 제형개발에 최적의buffer는 Potassium phosphate로 선정하였으므로, 본 실시예에는 buffer는 Potassium phosphate로 고정하였다.
| No. | DS source | Formulation code | K phosphate (mM) | pH | Salt (NaCl) | Excipient 1 (%) | Excipient 2 (Arginine) | API (mg/mL) |
| 1 | C사 | CON | 40 | 8.0 | 0.38% | - | - | 0.5 |
| 2 | M025 | Mannitol (0.25) | - | |||||
| 3 | M025A | Mannitol (0.25) | 0.0025% | |||||
| 4 | S025 | Sucrose (0.25) | - | |||||
| 5 | S025A | Sucrose (0.25) | 0.0025% | |||||
| 6 | T025 | Trehalose (0.25) | - | |||||
| 7 | T025A | Trehalose (0.25) | 0.0025% | |||||
| 8 | SB025 | Sorbitol (0.25) | - | |||||
| 9 | SB025A | Sorbitol (0.25) | 0.0025% | |||||
| 10 | L025 | Leucine (0.25) | - | |||||
| 11 | L025A | Leucine (0.25) | 0.0025% |
| No. | DS Source |
Formulation code | K phosphate (mM) | pH | Salt (NaCl) |
Excipient | API (mg/mL) |
| 1 | C사 | CON | 40 | 8.0 | 0.9% | - | 0.5 |
| 2 | M025 | Mannitol 0.25% | |||||
| 3 | S025 | Sucrose 0.25% | |||||
| 4 | T025 | Trehalose 0.25% | |||||
| 5 | SB025 | Sorbitol 0.25% | |||||
| 6 | L025 | Leucine 0.25% |
| DOE; Random Design | |||||||||
| No. | K phosphate (mM) | Salt (NaCl) (%) |
pH | Excipient (%) | API (mg/mL) |
||||
| Mannitol | Sucrose | Sorbitol | Trehalose | Leucine | |||||
| 1 | 20 | 0.45 | 7.8 | 0.15 | 0.25 | 0.3 | 1.5 | 0.5 | 0.5 |
| 2 | 20 | 0.45 | 7.8 | 0.15 | 0.25 | 0.3 | 1.5 | 0.5 | |
| 3 | 20 | 0.9 | 7.9 | 0.25 | 0.05 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | |
| 4 | 20 | 0.9 | 7.9 | 0.25 | 0.05 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | |
| 5 | 40 | 0.45 | 7.9 | 0.05 | 0.25 | 1.5 | 0.5 | 0.1 | |
| 6 | 40 | 0.45 | 7.9 | 0.05 | 0.25 | 1.5 | 1.5 | 0.1 | |
| 7 | 20 | 0.9 | 7.8 | 0.05 | 0.25 | 1.5 | 0.3 | 0.3 | |
| 8 | 20 | 0.9 | 7.8 | 0.05 | 0.25 | 1.5 | 0.3 | 0.3 | |
| 9 | 30 | 0.675 | 7.9 | 0.15 | 0.15 | 0.9 | 0.9 | 0.3 | |
| 10 | 30 | 0.675 | 7.9 | 0.15 | 0.15 | 0.9 | 0.9 | 0.3 | |
| 11 | 20 | 0.9 | 8 | 0.05 | 0.15 | 0.3 | 1.5 | 0.1 | |
| 12 | 20 | 0.9 | 8 | 0.05 | 0.15 | 0.3 | 1.5 | 0.1 | |
| 13 | 40 | 0.9 | 7.8 | 0.25 | 0.25 | 0.3 | 0.9 | 0.1 | |
| 14 | 40 | 0.9 | 7.8 | 0.25 | 0.25 | 0.3 | 0.9 | 0.1 | |
| 15 | 40 | 0.45 | 8 | 0.25 | 0.05 | 0.3 | 1.5 | 0.3 | |
| 16 | 40 | 0.45 | 8 | 0.25 | 0.05 | 0.3 | 1.5 | 0.3 | |
| 17 | 40 | 0.9 | 8 | 0.15 | 0.05 | 1.5 | 0.3 | 0.1 | |
| 18 | 40 | 0.9 | 8 | 0.15 | 0.05 | 1.5 | 0.3 | 0.1 | |
| 19 | 40 | 0.9 | 7.8 | 0.05 | 0.05 | 0.9 | 1.5 | 0.5 | |
| 20 | 40 | 0.9 | 7.8 | 0.05 | 0.05 | 0.9 | 1.5 | 0.5 | |
| 21 | 30 | 0.9 | 8 | 0.25 | 0.25 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | |
| 22 | 30 | 0.9 | 8 | 0.25 | 0.25 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | |
| 23 | 40 | 0.45 | 7.8 | 0.25 | 0.15 | 1.5 | 0.3 | 0.5 | |
| 24 | 40 | 0.45 | 7.8 | 0.25 | 0.15 | 1.5 | 0.3 | 0.5 | |
| 25 | 20 | 0.675 | 7.8 | 0.25 | 0.05 | 1.5 | 1.5 | 0.1 | |
| 26 | 20 | 0.675 | 7.8 | 0.25 | 0.05 | 1.5 | 1.5 | 0.1 | |
| 27 | 40 | 0.675 | 8 | 0.05 | 0.25 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | |
| 28 | 40 | 0.675 | 8 | 0.05 | 0.25 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | |
| 29 | 20 | 0.45 | 8 | 0.25 | 0.25 | 0.9 | 0.3 | 0.1 | |
| 30 | 20 | 0.45 | 8 | 0.25 | 0.25 | 0.9 | 0.3 | 0.1 | |
| 31 | 20 | 0.45 | 8 | 0.05 | 0.05 | 1.5 | 0.9 | 0.5 | |
| 32 | 20 | 0.45 | 8 | 0.05 | 0.05 | 1.5 | 0.9 | 0.5 | |
| 33 | 30 | 0.45 | 7.8 | 0.05 | 0.05 | 0.3 | 0.3 | 0.1 | |
| 34 | 30 | 0.45 | 7.8 | 0.05 | 0.05 | 0.3 | 0.3 | 0.1 | |
| Long-term Stability Study of Formulation B, Formulation C & Comparison Formulation A | |||||||||||
| Formulation Type | DS source | Formulation Code | K phosphate (mM) | pH | NaCl (%) | Mannitol | Sucrose | Sorbitol | Trehalose | Leucine | API (mg/ml) |
| C | HX | HX1C | 40 | 8.0 | 0.9 | 0.05% | 0.3% | 0.15% | 1.5% | 0.1% | 0.5 |
| HX2C | |||||||||||
| W사 | W사1C | ||||||||||
| W사2C | |||||||||||
| ALD | ALDC | ||||||||||
| B | HX | HX1B | 40 | 8.0 | 0.9 | 0.25% | - | - | - | - | |
| HX2B | - | - | - | - | |||||||
| W사 | W사1B | - | - | - | - | ||||||
| W사2B | - | - | - | - | |||||||
| ALD | ALDB | - | - | - | - | ||||||
| A | HX | HX1A | 40 | 8.0 | 0.9 | - | - | - | - | - | |
| HX2A | - | - | - | - | - | ||||||
| W사 | W사1A | - | - | - | - | - | |||||
| W사2A | - | - | - | - | - | ||||||
| ALD | ALDA | - | - | - | - | - | |||||
| Scale-up process adjustment | ||||||||||||
| Formulation Type | DS source | Formulation Code | K phosphate (mM) | pH | NaCl (%) | Mannitol | Sucrose | Sorbitol | Trehalose | Leucine | Filter O/X |
API (mg/ml) |
| C | HX | HXCW | 40 | 8.0 | 0.9 | 0.05% | 0.3% | 0.15% | 1.5% | 0.1% | O | 0.5 |
| HXCWO | X | |||||||||||
| A | HX | HXAW | 40 | 8.0 | 0.9 | - | - | - | - | - | O | |
| HXAWO | X | |||||||||||
BDP제조 후, pH를 8.0으로 맞추었고 Supor EKV-Mini Kleenpak Capsules filter (Pall co,.LTD)를 사용하여 filtering 실시 후, vial로 분획(aliquot)을 진행하였다.
분석 (Analysis)
High temperature는 pDNA SC% degradation을 가속화하므로, 본 시험에서는 Liquid DP vials를 70℃ Oven에 보관 후, day 0, day 5에 시료를 샘플링하여, SC%(by HPLC)를 분석하였다. (Round 3의 경우 day 0, 1, 3, 5 샘플링)
분석 샘플은 샘플링 직후 -70℃ Deep Freezer에 보관하였으며, 샘플 분석 1시간 전 2-8℃ cold Room에서 해동 후 HPLC 분석을 진행하였다.
샘플 분석 시간과 비용을 절감하기 위하여, pDNA SC%가 10% 미만인 샘플의 경우 해당 샘플 이후에 샘플링된 시료에 대하여는 분석을 실시하지 않았다.
장기 안정성 시험 (Long-term Stability Study)
다양한 온도 조건에서 장기 안정성을 확인하고자 2-8, 20-25, 37℃의 조건을 설정하고 2주 간격(2-8℃의 경우, 1달)으로 시료를 샘플링하여, SC%를 분석하였다.
2-8℃는 시료는 HX cold room에 정치 보관하였고, 25℃ 시료는 530호 실험실에 실온 정치 보관하였으며, 37℃ 시료는 37℃ Incubator에 정치 보관하였다.
샘플링 조건을 일정하게 유지하기 위하여, 1 vial(5ml filling)에서 최대 200ul씩, 5번의 샘플링만 진행하고 폐기하였다.
스케일-업 절차 조정 시험 (Scale-up process adjustment study)
Small scale (~15 ml BDP) process에서 Large scale (150 ml BDP) process로 scale-up 하여 pDNA의 SC% 안정성을 확인하였다. SC% 안정성 확인 방법은 실시예 1과 동일하게 진행하였다.
각 액체 제형 A, 및 C 조성에서 Filter Process의 유/무가 pDNA의 SC% 안정성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, BDP제조 후, Fiter 사용 유/무로 나누어서 실험을 수행하였다.
실시예 2-1. 1회차 스크리닝 (Excipient)
실시예 1에서 확립한 액체 제형 A의 조성의 효능이 A사 DS에만 국한되어 있는 점을 고려하여, C사나 W사등 다른 CMO에서 생산한 VM202 DS에도 액체 제형 A + A사 DS와 유사한 안정성을 가지는 조성을 개발하고자 하였다. 이를 위하여, 여러 부형제(Excipient)를 첨가하여 A사 이외의 다양한 생산처에서 생산된 VM202 pDNA에도 SC%를 안정성을 증대시킬 수 있는 부형제(Excipient)의 종류와 농도 range를 확인하고자 하였다.
시험 디자인
다양한 부형제(Excipient)의 효과를 확인하기 위하여, Mannitol, Sucrose, Sorbitol, Trehalose, Leucine, Arginine을 각각 적절한 농도 별로 처리한 후 유의미한 범위를 확인하였다.
각각의 부형제(excipient)의 농도 범위는 FDA에서 승인한 component of biosimilars 자료 조사(Reference참고) 및 문헌자료 (Rev Bras Otorrinolaringol, 2006;72(3):400-6)를 고려하여 선정하였다.
결과
1회차 프리-스크리닝 1내지 3의 osmolality 및 SC%(by HPLC) 분석결과는 아래 표 22 내지 24와 같다.
| No. | Formulation code | Initial pH | Osmolality (mOsm/kg) | SC% | Final pH | |
| Day 0 | Day 5 | |||||
| 1 | CON | 7.96 | 367 | 97.1 | 21.4 | 7.96 |
| 2 | M05 | 7.97 | 388 | 51 | 7.82 | |
| 3 | M15 | 7.93 | 438 | 50.5 | 7.77 | |
| 4 | S05 | 7.95 | 376 | 33 | 7.94 | |
| 5 | S15 | 7.96 | 406 | 39.4 | 7.92 | |
| 6 | SB05 | 7.95 | 384 | 97.2 | 15 | 7.77 |
| 7 | SB15 | 7.95 | 434 | 11.3 | 7.72 | |
| 8 | T05 | 7.93 | 373 | 41.1 | 7.94 | |
| 9 | T15 | 7.93 | 396 | 96.8 | 44.5 | 7.92 |
| 10 | L025 | 7.96 | 383 | 40 | 7.95 | |
| 11 | L05 | 7.96 | 401 | 30.2 | 7.97 | |
| 12 | A005 | 8.64 | 369 | 96.9 | 51.2 | 8.53 |
| 13 | ALDCON | 7.97 | 367 | 96.2 | 35.1 | 7.98 |
프리-스크리닝 1 내지 3에 걸쳐서 Osmolality는 각 부형제(Excipient) 농도가 중복되는 경우를 고려하여, 프리-스크리닝 1에서만 측정하였다. VM202 pDNA의 SC%는 Mannitol이 포함되었을 시(0.5%, 1.5% 모두 비슷한 결과), Sucrose, Trehalose의 농도가 높을수록, 또는 pH가 높을수록(A005 결과 참조) 높은 경향을 보였다.
| No. | Formulation code | Initial pH | SC% | Final pH | |
| Day 0 | Day 5 | ||||
| 1 | CON | 8.07 | 96.5% | 5.1 | 8.02 |
| 2 | M025 | 8.07 | 30.9 | 7.92 | |
| 3 | M025A | 8.07 | 30.7 | 7.95 | |
| 4 | S025 | 8.03 | 9.9 | 8 | |
| 5 | S025A | 8.07 | 97.3 | 10.2 | 8.02 |
| 6 | T025 | 8.04 | 10.8 | 8 | |
| 7 | T025A | 8.07 | 11 | 8.03 | |
| 8 | SB025 | 8.05 | 16.3 | 7.9 | |
| 9 | SB025A | 8.08 | 96.8 | 14.6 | 7.92 |
| 10 | L025 | 8.05 | 18.5 | 8.01 | |
| 11 | L025A | 8.07 | 18.1 | 8 | |
프리-스크리닝 2의 경우 NaCl의 농도를 0.38%로 진행하였다. 본 Pre-screening 2의 목적은 Pre-screening 1에서 확인한 A005의 SC% 안정성 증가의 이유가 Arginine으로 인한 pH 증가에 의한 것인지, Arginine 자체의 효과인지를 확인함에 있다.이를 확인하기 위하여, 기존 부형제(Excipient)들에 더하여 Arginine을 추가로 첨가(0.0025%) 한 그룹과 첨가하지 않은 그룹으로 나눈 후, pH는 모두 8.0으로 맞추어(pH 증가로 인한 영향을 제거) Arginine 자체의 SC% 증가 효과를 확인하고자 하였다. 그 결과 Arginine 첨가에 따른 SC%의 안정성 증대 효과는 없었다.
프리-스크리닝 1에서 확인한 A005의 SC% 안정성 증가는 pH의 증가로 인한 것이며, Arginine 자체로는 효과가 없음을 확인하였다. 따라서 Arginine은 이후 제형 조성에서 제외하도록 하였다.
| No. | Formulation code | Initial pH | SC% | Final pH | |
| Day 0 | Day 5 | ||||
| 1 | CON | 7.91 | 96.5 | 6.5 | 7.91 |
| 2 | M025 | 7.9 | 35.3 | 7.83 | |
| 3 | S025 | 7.91 | 12.3 | 7.9 | |
| 4 | T025 | 7.9 | 14.7 | 7.91 | |
| 5 | SB025 | 7.9 | 19.8 | 7.8 | |
| 6 | L025 | 7.91 | 22.7 | 7.92 | |
프리-스크리닝 3의 경우에는 좀 더 가혹조건에서의 안정성을 확인하기 위하여 pH 7.9조건으로 진행하였다.대조군 조건인 액체 제형 A 조성(Control)과 비교하였을 때, M025가 가장 높은 수준으로 SC%의 증대를 보였으며, 나머지 Excipient들도 유의미한 SC%의 안정성 증대를 확인하였다.
검토
첨가한 부형제(Excipient) 중 Mannitol에서 가장 높은 SC%의 증대 효과를 확인하였으며, SC%의 증가량은 Mannitol 첨가량 0.25~1.5%까지 유사한 것을 확인하였다. Mannitol의 효과는 0.25%에서 Saturation 된다고 가정하여, DoE 실험의 Mannitol 농도 범위는 0.05~0.25%로 설정하였다.
또한 기존 액체 제형 A (Formulation A) 조성에 Mannitol 0.25%만 첨가한 액체 제형 B (Formulation B)를 선정하여 DoE를 통해 개발할 액체 제형 C (Formulation C) 조성과 비교하고자 하였다.
나머지 부형제(Excipient)도 동일한 원리로 Saturation Point를 잡아(최대 1.5%) 농도 범위를 설정하였으며, Sorbitol과 Leucine의 경우 농도가 낮을수록 SC%가 높은 것을 고려하여, 각각 0.05~0.25, 0.1~0.5%의 범위로 농도를 설정하였다.
추가적으로 Mannitol, Sorbitol과 같은 mono-saccharide보다 Sucrose, Trehalose와 같은 Di-saccharide에서 pH buffering이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다.
상기의 결과들을 종합하여 볼 때, A사 VM202 DS에만 국한되어 있던 기존 Formulation A의 조성에 추가적인 부형제(Excipient)를 첨가함으로써, C사, W사등 다른 생산처에서 생산된 VM202 DS에도 적용가능한 새로운 Formulation 조성의 개발 가능성을 확인하였다. 또한 각 부형제(Excipient)가 SC% 안정성에 영향을 미치는 농도 범위를 설정하여, DoE 실험의 효율을 극대화하고자 하였다.
실시예 2-2. 2회차 시험 디자인 (Design of Experiment, DoE)
1회차 프리-스크리닝에서 선정한 부형제(excipient) 후보군들과 그 농도범위를 활용하여, VM202 pDNA를 안정화하는 최적의 부형제(excipient) 조성을 DoE를 통해 선정하고자 한다.
시험 디자인
1회차 부형제 스크리닝에서 확인한 여러 부형제들의 pDNA 안정성 증대 효과를 바탕으로 상호간 조합시에 미치는 영향 및 주요한 부형제 인자를 확인하고자 농도 범위를 다양하게 조합하여 pDNA의 안정성을 비교하였다.
DOE는 무작위로 디자인하고 2회 반복으로 진행하였다.
DOE를 통해 확인하는 부형제(Excipient)들은 다음과 같았다.
: Mannitol, Sucrose, Sorbitol, Trehalose, Leucine
2회차 DOE의 SC%(by HPLC) 분석결과는 아래 표 25와 같았다.
| DoE No. | SC (%) | |
| Day 0 | Day 5 | |
| 1 | 98.1 | 4.2 |
| 2 | 4.0 | |
| 3 | 8.2 | |
| 4 | 9.4 | |
| 5 | 10.6 | |
| 6 | 11.9 | |
| 7 | 4.4 | |
| 8 | 6.8 | |
| 9 | 5.3 | |
| 10 | 7.7 | |
| 11 | 18.4 | |
| 12 | 17.0 | |
| 13 | 19.4 | |
| 14 | 97.2 | 14.4 |
| 15 | 10.0 | |
| 16 | 10.3 | |
| 17 | 18.5 | |
| 18 | 20.0 | |
| 19 | 7.0 | |
| 20 | 7.2 | |
| 21 | 6.5 | |
| 22 | 6.8 | |
| 23 | 4.8 | |
| 24 | 5.6 | |
| 25 | 14.9 | |
| 26 | 10.7 | |
| 27 | 10.7 | |
| 28 | 9.4 | |
| 29 | 9.9 | |
| 30 | 10.9 | |
| 31 | 3.4 | |
| 32 | 3.2 | |
| 33 | 8.1 | |
| 34 | 8.6 | |
통계처리를 통하여 해석한 상기의 결과 DATA는 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.도 2a는, 7가지 인자 (KP~LC)의 변화가 pDNA의 %SC에 미치는 영향을 확인하기 위해 통계적 설계를 통해 실험을 진행한 결과를 보여준다. 통계적 가설검증 기준 p=0.05를 적용하였을 때 MT와 TH를 제외한 나머지 모든 주요인자가 %SC에 직접적인 영향을 미치고 있고, 교호 및 스퀘어 인자로 pH*MT와 TH*TH가 %SC에 영향이 있음을 확인할 수 있었다. 구체적으로 KP(Potassium Phosphate), N(NaCl), pH는 선정한 범위 내에서 농도가 높을수록 pDNA 안정성이 증가하는 것으로 판단되었다.SR(Sucrose), LC(Leucine)의 경우 선정한 범위 내에서 농도가 낮을수록 pDNA 안정성이 증가하는 것으로 판단되었다.
MT(Mannitol)의 경우 pH와의 교호작용으로 인해, pH 값이 높을 때는 MT의 농도가 낮을 때 pDNA 안정성이 가장 증가하는 것으로 판단하였다.
이에 따라서 각 인자가 %SC에 미치는 영향을 구현한 모델 방정식을 도출하였고 이를 도 2b에 나타내었다.
상기의 해석을 근거로 하여, 도출한 Optimal 조성은 도 3a 및 도3b에 나타내었다.
검토
도 3a에 나타낸 바와 같이, %SC에 영향을 미치는 인자들은 KP, N, pH, MT, SR, TH, 및 LC 총 7개였고 이들을 이용하여 가장 적합한 모델을 도출한 결과, solution 1인 것으로 확인되었다. solution 1을 이용한 모델을 적용하여, 방적식을 통계적으로 풀이한 결과, 95% 신뢰수준에서 %SC 통계치인 평균값이 분포하는 범위가 19.209~22.845 정도임을 추산할 수 있었다. 또한, 향후 %SC 개개의 값은 95% 신뢰수준에서 17.451~26.603 사이에 분포할 수 있음을 예측할 수 있었다.
상기 결과로부터 Data를 통하여 도출된 3가지 조성 중, SC%가 가장 높은 1번 조성(solution 1)을 선정하였다.
또한, 본 발명자들은 각 인자들의 범위내에서 y값 즉 %SC를 최대화 할 수 있는 방향으로 각 인자들의 농도 또는 값을 결정하였다(도 3b).
Sorbitol의 경우에는 DOE결과, sorbitol이 pDNA의 SC% 안정성에 미치는 영향이 미비하므로, DOE sorbitol 조건에서 중간 값인 0.15%로 고정하였다.
실시예 2-3. 액체 제형 C (Formulation C: Potassium phosphate 40 mM, NaCl 0.9%, pH 8.0, Mannitol 0.05%, Sorbitol 0.15%, Sucrose 0.3%, Trehalose 1.5%, Leucine 0.1%)의 제조 및 제형 A, B, C의 비교 (70℃에서 장기 안정성 시험)
해당 액체 제형 C 조성의 냉장 조건 (2-8℃), 상온 보관 조건(20-25℃), 가혹 조건(37℃)하의 안정성을 확인하기 위하여, 장기 안정성 시험을 진행하였다.
앞선 스크리닝을 통해 선정한 액체 제형 B, C조성의 pDNA 장기 안정성 확인 및 VM202 DS 생산처와 액체 제형 A, B, C 조합에 따른 pDNA 안정성을 확인하고자 하였다.
시험 디자인
1회차 프리-스크리닝을 통하여, Mannitol이 단일 부형제로서 가장 큰 pDNA 안정화 효과를 가지는 것을 확인하였다.
기존 액체 제형 A 조성에 Mannitol 0.25%만 첨가한 액체 제형 B 조성과, DoE를 통하여 개발한 액체 제형 C 조성을 HX와 W사에서 생산한 2 lot의 VM202 DS에 적용하여 기존 Control 조건인 액체 제형 A와 비교하고자 하였다.
70℃에서 액체 제형 A, B, C에 대한 장기 안정성 시험은 Day 0, 1, 3, 5에서 샘플링하여 SC%를 확인하였다.
3회차 장기 안정성 시험의 시험계획은 표 26에 나타내었다.
| Formulation Code | Temp Conditions (℃) |
Time Point(month) | |||||||||||||||||
| T0 | T0.5 | T1 | T1.5 | T2 | T2.5 | T3 | T4.5 | T6 | T12 | T15 | T18 | T21 | T24 | T27 | T30 | T33 | T36 | ||
| HX1C | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| HX2C | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| W사1C | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| W사2C | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| HX1B | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| HX2B | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| W사1B | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| W사2B | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
- Time point T0.5 = 0.5 month(2weeks)를 의미한다.결과
3회차 실험의 SC%(by HPLC) 분석결과는 아래 표 27 및 표 28과 같다.
| Comparison of Formulation A, B, C at 70℃ | ||||||
| Formulation Type | DS source | Formulation Code | SC % | |||
| Day 0 | Day 1 | Day 3 | Day 5 | |||
| C | HX | HX1C | 97.3 | 82.1 | 46.0 | 25.0 |
| HX2C | 31.4 | 12.1 | ||||
| W사 | W사1C | 95.4 | 71.6 | 36.6 | 19.4 | |
| W사2C | 36.6 | |||||
| ALD | ALDC | 96.2 | 82.9 | 45.4 | 25.9 | |
| B | HX | HX1B | 97.3 | 82.4 | 44.2 | 20.3 |
| HX2B | 54.4 | 37.0 | ||||
| W사 | W사1B | 74.9 | 46.1 | 29.3 | ||
| W사2B | 28.5 | |||||
| ALD | ALDB | 70.8 | 22.7 | 6.6 | ||
| A | HX | HX1A | 66.6 | 27.4 | 13.1 | |
| HX2A | 14.6 | |||||
| W사 | W사1A | 43.9 | 13.9 | 7.4 | ||
| W사2A | ||||||
| ALD | ALDA | 61.8 | 22.7 | 8.9 | ||
| Formulation Code | Temp Conditions (℃) |
Time Point(month) | |||||||||||||||||
| T0 | T0.5 | T1 | T1.5 | T2 | T2.5 | T3 | T4.5 | T6 | T12 | T15 | T18 | T21 | T24 | T27 | T30 | T33 | T36 | ||
| HX1C | 2-8 | 97.6 | 97.5 | 97.7 | 97.1 | 95.3 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| 20-25 | 96.5 | 95.6 | 95.0 | 94.5 | 92.8 | N/A | N/A | N/A | |||||||||||
| 37 | 91.0 | 86.9 | 85.8 | 81.3 | 77.7 | 70.5 | |||||||||||||
| HX2C | 2-8 | 97.7 | 97.2 | 96.3 | 95.9 | 95.0 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| 20-25 | 94.4 | 92.8 | 92.2 | 90.9 | 89.4 | 87.9 | 84.4 | 81.1 | |||||||||||
| 37 | 88.0 | 77.9 | 78.1 | 72.1 | 75.2 | 59.8 | |||||||||||||
| W사1C | 2-8 | 96.5 | 96.8 | 95.9 | 94.6 | 93.4 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| 20-25 | 93.4 | 9.5 | 88.9 | 87.5 | 87.2 | 84.7 | - | - | |||||||||||
| 37 | 84.7 | 76.6 | 76.8 | 72.9 | 70.2 | 63.8 | |||||||||||||
| W사2C | 2-8 | 97.3 | 97.0 | 96.5 | 95.7 | 94.7 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| 20-25 | 94.6 | 91.9 | 90.8 | 89.4 | 88.8 | 87.4 | 81.9 | 78.7 | |||||||||||
| 37 | 85.7 | 75.6 | 77.3 | 68.4 | 69.3 | 60.0 | |||||||||||||
| HX1B | 2-8 | 96.0 | 96.8 | 97.1 | 95.0 | 94.5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| 20-25 | 94.5 | 92.8 | 87.7 | 85.8 | 84.3 | 79.5 | 70.3 | 61.3 | |||||||||||
| 37 | 83.7 | 69.4 | 50.6 | 47.6 | 37.9 | 29.0 | |||||||||||||
| HX2B | 2-8 | 96.0 | 95.3 | 95.0 | 94.7 | 94.7 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| 20-25 | 94.3 | 93.7 | 93.0 | 92.6 | 91.3 | 89.6 | 87.7 | 85.5 | |||||||||||
| 37 | 87.0 | 85.5 | 80.9 | 78.9 | 83.0 | 72.0 | - | - | |||||||||||
| W사1B | 2-8 | 96.1 | 95.4 | 95.7 | 94.5 | - | 94.0 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |||
| 20-25 | 94.2 | 92.6 | 91.0 | 89.7 | 89.5 | 86.4 | 83.2 | 79.6 | |||||||||||
| 37 | 82.4 | 74.7 | 69.2 | 67.0 | 65.5 | 61.1 | |||||||||||||
| W사2B | 2-8 | 96.9 | 96.9 | 95.8 | 95.5 | 92.0 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||||
| 20-25 | 92.3 | 90.1 | 87.5 | 85.5 | 85.2 | 82.0 | 79.1 | 76.3 | |||||||||||
| 37 | 82.5 | 75.0 | 76.7 | 68.4 | 66.5 | 58.4 | |||||||||||||
- day 1, 3, 5 시료와 2-8℃ 샘플의 경우 일부시료만 분석하였음.
- 해당 시료 분석이 불가한 경우 N/A로 표시하였음
표 27에서 확인할 수 있듯이, 액체 제형 C는 70℃ 5일차 결과에서 HX, W사, ALD 생산 DS 모두에서 유사한 안정성을 보였으며(평균 SC 20.6%), 액체 제형 B의 경우 A사(SC 6.6%)에서 액체 제형 A는 전체적으로 낮은 SC%(9.8%) 안정성을 가지는 것을 확인하였다.
이는 표 28의 장기 안정성 결과에서도 유사하였으며, 액체 제형 C의 경우 HX, W사 모든 lot의 DS에서 37℃ 12주차에 60.0-70.5%의 SC%를 보였으며, 반면 액체 제형 B의 경우 29.0-72.0%로 DS lot간의 큰 차이를 보이는 것을 확인하였다.
25℃ 장기안정성 결과의 경우, 액체 제형 C가 6개월 평균 SC% 79.4%, 액체 제형 B 평균 SC% 75.7%로 액체 제형 C에서 VM202 pDNA가 더 안정하게 유지됨을 확인하였다.
검토
상기 결과를 바탕으로 분석하여 볼 때, DoE를 통하여 개발한 조성인 액체 제형 C가 액체 제형 B보다 DS lot 간에 따른 편차가 적고, 상온 조건(20-25℃)에서 더 안정되게 VM202 pDNA SC%를 유지하는 것으로 판단된다.
또한 액체 제형 C의 경우, 해당 시험의 목표였던 25℃, 3개월 보관 시, SC% 85% 이상의 조건도 충족한다. (3개월 보관 시 평균 86.7%)
따라서 3회차 스크리닝을 통하여, 이전 A사 생산 VM202 DS에 국한되어 있던 액체 제형을 HX, W사 등에서 생산한 VM202 DS에도 적용할 수 있는 액체 제형인 액체 제형 C를 성공적으로 개발하였다.
추가로 상기의 실험이 모두 small scale에서 진행된 것을 감안하여, Scale-up 조건에서도 해당 결과가 재현되는지 확인하고자 한다.
실시예 2-4. 4회차 스케일-업 절차 조정 (Scale-up A, C)
1 내지 3회차를 통하여 개발한 액체 제형 C 조성을 Scale-up 조건 하에서도 그대로 적용할 수 있는지 확인 및 Filter Process 유무에 따른 SC% 안정성을 확인하기 위하여 아래와 같은 시험을 수행하였다.
시험 디자인
이전 20 mL Scale로 진행하였던 액체 제형 절차를 Scale-up하여, 300mL Scale로 조정하였다.
Filter Process 유무에 따른 영향을 확인하기 위하여, 제조한 300mL의 BDP를 150mL씩 나누어 150mL은 Filtration 진행, 150mL은 Filtration 없이 Vial에 filling 하여 가혹 시험을 진행하였다.
상기 과정을 액체 제형 C와 A에 적용하여, 각각의 경우에 Scale-up과 filter process 유무에 따른 영향 확인하였다.
4회차 스케일-업 절차 조정의 70℃ 가혹 시험은 Day 0, 1, 3, 5에서 샘플링하여 SC%를 확인하였다.
결과
4회차 스크리닝의 SC% (by HPLC) 분석결과는 아래 표 29와 같았다.
| Scale-up process adjustment | |||||||
| Formulation Type | DS source | Formulation Code | With or Without Filter Process |
SC% | |||
| Day 0 | Day 1 | Day 3 | Day 5 | ||||
| C | HX | HXCW | W | 97.4 | 35.5 | 13.7 | |
| HXCWO | WO | 82.1 | 39.4 | 15.8 | |||
| A | HX | HXAW | W | 96.5 | 8.9 | 4.1 | |
| HXAWO | WO | 40.6 | 21.7 | ||||
표 29에서 확인할 수 있듯이, 액체 제형 C의 경우 Filter Process 유무와 관계없이 SC%가 일정하게 유지되는 것을 확인하였다. 반면, 액체 제형 A의 경우 Filter Process를 사용한 경우 day 3 SC %가 8.9%로 Filter Process가 없는 경우(40.6%)에 비교하여 pDNA SC%가 30%이상 확연히 차이나는 것을 확인
검토
실제 생산과정에서 Bioburden이나 Sterility issue로 인해 Filter Process는 필수적이기 때문에, Filter Process 적용이 가능한 액체제형의 개발이 필요하다.
해당 회차 시험을 통해 액체 제형 C의 경우 Filter Process 적용시에도 SC%를 안정하게 유지하는 것으로 확인하였다. (반면, 액체 제형 A의 경우 Filter Process 적용시, SC% 안정성을 유지하지 못하는 것으로 확인)
따라서 해당 실시예를 통해 실제 생산 절차에도 적용이 가능한 액체 제형인 액체 제형 C를 성공적으로 개발하였다.
실시예 2의 결론
총 4회차의 스크리닝을 통해 다양한 생산처에서 생산된 VM202 DS에 적용 가능하며(Round 1-2), 해당 시험의 Target SC% 안정성도 충족하고(3회차), 마지막으로 실제 생산 Process에도 적용가능한(4회차) VM202 액체 제형을 성공적으로 개발하였다.
액체 제형 C의 25℃ 장기안정성 결과의 경우(3회차), 12주차에 평균 SC% 86.7%로 목표한 85%를 상회하는 것을 확인하였다.
또한 본 실시예를 통하여, VM202 pDNA의 안정성은 제조된 환경, lot별로 차이를 보이며, Filter Process 유무 또한 pDNA 안정성에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 따라서 추후 액체 제형을 실제 생산에 도입 시, VM202 DS가 어떠한 공정을 통해 생산되었는지, 생산에 도입되는 Filter의 재질이나, Process Time등이 최종 액체 DP의 안정성에 영향을 미칠 수 있다는 것이 함께 고려되어야 할 것으로 판단된다.
최종 도출된 조성인 액체 제형 C 조성은 필요한 경우, 장기 stability test(36개월)를 통하여 2-8℃ 보관 안정성을 추가로 확인할 예정이며, 최종 도출된 조성을 근거로 하여 추후 상업생산에 적용할 수 있는 조성 범위를 파악할 예정이다.
총 4 회차의 시험을 통하여, 도출된 조성은 아래 표 30과 같다.
| Development | Ingredient | Concentration | Purpose |
| Formulation B | VM202 DS | 0.5mg/mL | Active Pharmaceutical Ingredient |
| Potassium Phosphate | 40mM | Buffering Agent | |
| NaCl | 0.9% | Stabilizer | |
| Mannitol | 0.25% | ||
| Formulation C | VM202 DS | 0.5mg/mL | Active Pharmaceutical Ingredient |
| Potassium Phosphate | 40mM | Buffering Agent | |
| NaCl | 0.9% | Stabilizer | |
| Mannitol | 0.05% | ||
| Sucrose | 0.3% | ||
| Sorbitol | 0.15% | ||
| Trehalose | 1.5% | ||
| Leucine | 0.1% | ||
| To the final pH of 8.0 | |||
DoE를 통해 구축한 최종 도출 조성인 액체 제형C는 (40mM Potassium Phosphate, 0.9% NaCl, pH 8.0, Mannitol 0.05%, Sucrose 0.3%, Sorbitol 0.15%, Trehalose 1.5%, Leucine 0.1%) 20-25℃ 보관 조건에서 3개월간 DP spec의 기준을 상회하는 안정성을 보였으며(86.7% SC), 이 제형은 2-8℃ 보관 조건에서 18개월 이상 안정할 것으로 판단된다.최종 도출된 조성을 근거로 하여, 추후 상업생산에 적용할 수 있는 조성을 개발할 예정이다.
실시예 3: 플라스미드 DNA 액체 제형 D의 개발
이전 실시예 1 및 2를 통하여, 도출된 액체 제형 B 및 C 조성을 W사, Helixmith에서 생산한 VM202 DS에 적용시에 동결건조 제형 대비 상당수준 안정성을 가지는 액상제형을 개발하였음을 확인한 바 있다.
본 실시예에서는 액체 제형 C 조성에 RSM(반응표면설계) 방법을 이용하여 VM202에 가장 안정적인 최적의 조성을 도출하기 위한 시험을 진행하였으며, RSM을 통해 도출된 최적의 액상 제형은 액체 제형 D라 명명하였다.
이전 실시예와 마찬가지로, VM202 DP의 안정성은 VM202의 품질을 결정하는 요소 중 하나인 SC% 비율로 평가하였다.
액체 제형 C 조성을 개량하여 진행한 본 연구는 각 조성의 인자간 주효과, 교호작용, 곡률효과를 확인하였으며 추가 개량을 통해 최적의 조성을 도출하여 적용하는 것으로 본 시험이 진행되었다.
이전 실시예에서 DoE를 통하여 각각의 excipient가 최적의 농도를 가지는 액체 제형 C를 선정하였고, 액체 제형 C를 통해 확인된 각 인자간 반응을 고려하여 추가적으로 조성을 개량하였다.
본 시험의 안정성 목표는 DP Spec(SC% 85%) 기준을 20-25℃ 보관 조건에서 3 개월 이상 유지하는 것으로 한다. 해당 목표 설정은 보관 온도가 높아질수록, pDNA의 SC%의 분해가 가속된다는 연구를 기반으로 하여, 20-25℃에서 3개월동안 안정한 경우, DP 보관 온도인 2-8℃에서는 18개월 이상 안정할 것이라 가정하여 선정하였다.
개량한 조성인 액체 제형 D는 액체 제형 C를 control(대조군)으로 하여 장기 안정성 시험을 수행하였으며, 샘플들은 2-8℃은 4주 단위, 20-25℃, 37℃에 보관 후 2주 단위로 샘플링하여, 3개월간 SC%를 측정하였다. (2-8℃는 3년 계획)
시험의 순서(Workflow)는 아래 표 31 과 같았다.
| Round No. | Experiment Objective | Purpose |
| 1 | Design of Experiment (RSM) | pDNA안정성 측면에서 각 인자간 조합할 수 있는 최종 조성 도출 (Potassium phosphate, Sodium chloride, Leucine의 최적 조성 (Best case) |
| - Formulation D 도출 | ||
| 2 | Long-term Stability Study | 선정한 Formulation D의 장기 안정성 및 Formulation C와 냉장조건, 가속조건, 가혹조건 비교 |
시험 개요본 시험에서 진행된 총 3회차의 스크리닝은 동일한 Components preparation, BDP Formulation, Vial filling, 샘플링, SC% Analysis 과정으로 진행되었다.
본 시험에 사용된 Vial은 실제 생산공정과 최대한 동일하게BDP Formulation 최대 2일전 Vial wash Protocol에 따라 wash하여 70℃ Dry Oven에 보관 후 사용하였으며, Rubber-stopper의 경우 Vendor(West-DAIKYO SEIKO)에서 Sterilization이 완료되어, 개봉 후 바로 시험에 사용하였다.
제조
시험에 사용한 1X buffer, 2X buffer는 각 시험 회차의 BDP Formulation 시작 최대 3일전에 제조되었다.
2X buffer의 경우, buffer strength, Mannitol, Sucrose, Sorbitol, Trehalose, Leucine, Arginine conc. X 2로 제조되었다. 단, NaCl 농도는 Final 조성의 NaCl 농도(A)를 기준으로 다음식에 대입하여 계산된 값으로 진행하였다.
*(A x 2) - 0.9 = 2X buffer의 NaCl conc.
1X buffer의 경우 Final Formulation 조성과 모두 동일하다.
본 시험은 Small Scale buffer(100 mL) 제조이며, 실제 상업 생산 Process의 제조 오차를 감안하여, 1X, 2X buffer는 제조 오차 범위는 ~2%로 진행하였다.
시험에 사용한 API는 A사 생산 C사 생산 Helixmith 자체생산 VM202 DS(lot: 8th,9th) W사 생산 VM202 DS(W사1: 1912063, W사2: 1912073) 시료를 사용하였으며, -70℃ Deep Freezer에서 2-8℃ Refrigerator로 옮겨 16-18시간 해동한 후 사용되었다.
해동한 DS는 2X, 1X buffer와 Mixing하여, Final pDNA Concentration 0.48-0.52 mg/mL(Target 0.5mg/mL)의 BDP로 제조되었다.
BDP 제조 과정 및 샘플링 및 분석 절차는 아래 표 32와 같다.
| No. | Procedure |
| 1 | Table 7-12의 Formulation List를 기준으로2X, 1X buffer 각각 제조 |
| 2 | BSC를 키고 2X, 1X, DS 시료를 준비- DS는 BDP formulation 하루 전에 2~8℃ 냉장고에서 해동을 실시한다. |
| 3 | SPL 50mL Conical tube에 DS 5-7mL 첨가 후 현재 volume 기록(A) |
| 4 | DS와 동일한 Volume의 2X buffer (B) 첨가 후 Mixing |
| 5 | 5min 이상 Roller mixer에서 Mixing 후 Nano drop을 통해 Total Nucleic acid 농도 측정 (C) |
| 6 | (((A+B) * (C/500) - A-B))의 공식에 해당 값을 넣어 첨가해야 하는 1X buffer 양 계산 (D) |
| 7 | BSC에서 계산한 1X buffer양을 첨가 |
| 8 | 2min 이상 Roller mixer에서 Mixing 후 Nano drop을 통해 Total Nucleic acid 농도 3회 측정 (E) |
| 9 | E의 값이 0.48 - 0.52 mg/mL의 기준치를 만족하면 10 step진행,E>0.52인 경우, 6번 공식에 C 대신 E, A+B대신 A+B+D를 대입하여, 추가로 첨가해야 하는 1X buffer volume 계산한 후, 1X buffer 추가로 첨가하여 다시 Total Nucleic Acid 농도 3회 측정 D<0.48인 경우, 시료 폐기 후 해당 BDP Formulation step 1 부터 재 진행 |
| 10 | pH를 8.0으로 맞춘 후, vacuum filter로 BDP filtering 실시 (DOE부터 적용) |
| 11 | 제조 완료된 시료에서 Day 0 시료 500ul 샘플링후 -70℃ deep freezer 보관 |
| 12 | 샘플링 후 남은 시료를 20mL vial에 5mL씩 분주하여, 70℃ oven에 배치 후 시간 기록(F) |
| 13 | Day 1, 3, 5에 F와 같은 시간에 BSC에서 200ul 샘플링 진행 |
| 14 | 샘플링 한 샘플은 -70℃ deep freezer 보관 |
| 15 | 분석할 샘플은 SC% 분석 1 시간 전 2~8℃ 냉장고에서 해동 |
| 16 | SC%(by HPLC)를 분석하여 기록 |
1회차 스크리닝에 사용된 RSM formulation list는 아래 표 33과 같았다.
| RSM; Random Design | |||||||||
| No. | K phosphate (mM) | Salt (NaCl) (%) |
Leucine(%) | pH | Excipient (%) | API (mg/mL) |
|||
| Mannitol | Sucrose | Sorbitol | Trehalose | ||||||
| 1 | 37 | 0.85 | 0.095 | 8 | 0.05 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | 0.5 |
| 2 | 50 | 0.85 | 0.095 | ||||||
| 3 | 37 | 1 | 0.095 | ||||||
| 4 | 50 | 1 | 0.095 | ||||||
| 5 | 37 | 0.925 | 0.05 | ||||||
| 6 | 50 | 0.925 | 0.05 | ||||||
| 7 | 37 | 0.925 | 0.14 | ||||||
| 8 | 50 | 0.925 | 0.14 | ||||||
| 9 | 43.5 | 0.85 | 0.05 | ||||||
| 10 | 43.5 | 1 | 0.05 | ||||||
| 11 | 43.5 | 0.85 | 0.14 | ||||||
| 12 | 43.5 | 1 | 0.14 | ||||||
| 13 | 43.5 | 0.925 | 0.095 | ||||||
| 14 | 43.5 | 0.925 | 0.095 | ||||||
| 15 | 43.5 | 0.925 | 0.095 | ||||||
2회차 장기 안정성 시험에 사용된 액체 제형 C 및 D의 조성은 아래 표 34와 같다.
| Formulation C,D | |||||||||
| - | K phosphate (mM) | Salt (NaCl)(%) |
pH | Leucine(%) | Mannitol(%) | Sucrose(%) | Sorbitol(%) | Trehalose(%) | API (mg/mL) |
| Formulation C | 40 | 0.9 | 8 | 0.1 | 0.05 | 0.3 | 0.15 | 1.5 | 0.5 |
| Formulation D | 37 | 1.0 | 8 | 0.05 | 0.05 | 0.3 | 0.15 | 1.5 | 0.5 |
분석High temperature는 pDNA SC% degradation을 가속화하므로, Liquid DP vials를 70℃ Oven에 보관 후, day 0, day 5에 시료를 샘플링하여, SC%(by HPLC)를 분석하였다. 분석 샘플은 샘플링 직후 -70℃ Deep Freezer에 보관하였으며, 샘플 분석 1시간 전 2-8℃ cold Room에서 해동 후 HPLC 분석을 진행하였다.
장기 안정성 시험
다양한 온도 조건에서 장기 안정성을 확인하고자 2-8, 20-25, 37℃의 조건을 설정하고 표 36에 기재된 샘플링 plan에 따라 시료를 샘플링하여, SC%를 분석하였다.
2-8℃는 시료는 HX cold room에 정치 보관하였고, 25℃ 시료는 530호 실험실에 실온 정치 보관하였으며, 37℃ 시료는 37℃ Incubator에 정치 보관하였다.
샘플링 조건을 일정하게 유지하기 위하여, 1 vial(5ml filling)에서 최대 100ul씩, 10번의 샘플링만 진행하고 폐기하였다.
시험결과 및 검토
실시예 3-1: 1회차 시험 디자인 (RSM; 반응표면설계)
이전 연구에서 개발을 완료한 Formulation C를 이용하여 각 인자들이 pDNA 안정성에 기여하는 최적의 조성을 확보하기 위하여 반응표면설계를 디자인하였다. 이는 각 excipient 및 buffering agent, pH, salt등의 여러 인자간 주효과, 교호작용, 곡률효과등을 확인하여 도출할 수 있는 최적의 조성 및 조합을 확인할 목적으로 진행하였다.
시험 디자인
이전 실시예 1 및 2에서 도출된 액체 제형 C의 최종 조성에 대한 equation 확보 및 각 인자간 안정성에 영향을 미치는 정도를 확인하였다.
확보한 데이터를 이용하여 RSM을 설계시 확인할 수 있는 각 인자간 교호작용 등을 고려하여 최종 조성의 개량을 진행하여 pDNA 안정성측면에서의 적용할 수 있는 인자간 조합, 즉 Best case의 조성을 확보하였다.
DOE를 통해 확인하고자 하는 최적 조성의 target은 다음과 같다.
: Potassium phosphate, Sodium Chloride, 및 Leucine
1회차 시험 디자인(RSM)을 이용한SC% (by HPLC) 분석결과는 아래 표 35와 같다.
| No. | Formulation code | SC% | |
| Day 0 | Day 5 | ||
| 1 | RSM1 | 95.3 | 15.5 |
| 2 | RSM2 | 8.7 | |
| 3 | RSM3 | 95.4 | 16.6 |
| 4 | RSM4 | 13.3 | |
| 5 | RSM5 | 18.8 | |
| 6 | RSM6 | 7 | |
| 7 | RSM7 | 16.9 | |
| 8 | RSM8 | 12 | |
| 9 | RSM9 | 7.7 | |
| 10 | RSM10 | 9.8 | |
| 11 | RSM11 | 8.1 | |
| 12 | RSM12 | 8.9 | |
| 13 | RSM13 | 7.8 | |
| 14 | RSM14 | 9.3 | |
| 15 | RSM15 | 9.7 | |
결과통계처리를 통하여 해석한 상기의 결과 DATA는 도 4 및 도 5에 나타내었다.
검토
도 4는 pDNA 조제에 사용한 인자들 (e.g., KP, NaCl, pH 등) 각각이 %SC에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 도 4를 살펴보면, SB를 제외한 나머지 인자들이 %SC에 일정부분 영향을 미침을 알 수 있었다. 이중에서 특별히 강력한 영향을 미치는 인자는 시각적 평가의 정도를 고려할 때 Potassium phosphate(KP), Sodium Chloride(N), Leucine(LC)로 볼 수 있었다. 따라서 이들 3가지 인자를 RSM 디자인을 통한 제형 최적화에 사용하였고, 3가지 인자를 제외한 나머지 excipient들은 이전 연구에서의 액체 제형 C DOE를 통해 최적의 조성을 확보한 상태이므로 액체 제형 C와 조성을 동일하게 하였다.
나머지 부형제들의 조성은 각 인자간 주효과, 교호작용 등의 여부에 따라 최적 조성을 선정하였다.
도 5는 Leucine을 0.06%으로 고정시킨 후 NaCl와 KP의 농도 변화가 %SC에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 5에 나타난 바와 같이, Sodium Chloride(NaCl, N)의 농도가 높을수록, Potassium phosphate(KP)가 낮을수록 %SC는 높아짐을 알 수 있다. 구체적으로, Potassium phosphate(KP), Sodium Chloride(NaCl, N), Leucine(LC)은 Leucine(LC) 값이 0.06% 인 경우에 Potassium phosphate(KP), Sodium Chloride(N)의 최적의 농도범위는 각각 37.0~37.3 mM, 0.975~1.0% 임을 확인할 수 있다. 따라서, 이를 기준으로 Leucine의 upper limit은 0.055%로 설정하였고 최종 농도는 0.05%로 설정하였다 (Leucine range : 0.045~0.055%).
최종 도출된 액체 제형 D의 조성은 다음과 같았다.
액체 제형 D : Potassium phosphate 37 mM, NaCl 1.0%, pH 8.0, Mannitol 0.05%, Sorbitol 0.15%, Sucrose 0.3%, Trehalose 1.5%, Leucine 0.05%
2회차 장기간 안정성 시험 (액체 제형 D)
시험 개요
앞선 DOE를 통해 선정한 액체 제형 D 조성의 pDNA 장기 안정성 확인 및 액체 제형 C와의 pDNA 장기안정성을 확인하기 위하여 본 시험을 수행하였다.
시험디자인
기존 액체 제형 C조성에서 Potassium phosphate, Sodium Chloride, Leucine의 농도를 개량하여 액체 제형 D 조성을 확보하였고, 이를 적용하여 액체 제형 C를 Control 조성으로 하여 비교하고자 하였다.
액체 제형 C 및 D 시험은 2-8℃은 4주 단위, 20-25℃, 37℃에 보관 후 2주 단위로 샘플링하여, 3개월간 SC%를 측정하였다. (2-8℃는 2년 계획)
사용한 DS는 HX DS 2 lot, W사 DS 2 lot으로 총 4 lot을 이용하여 실험을 수행하였다.
2회차 장기안정성 시험의 시험 계획은 아래 표 36에 기재하였다.
| Formulation Code | Temp Conditions (℃) |
Time Point(month) | ||||||||||||||
| T0 | T0.5 | T1 | T1.5 | T2 | T2.5 | T3 | T4.5 | T6 | T9 | T12 | T15 | T18 | T21 | T24 | ||
| HX1D | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| HX2D | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| W사1D | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| W사2D | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| HX1C | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| HX2C | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| W사1C | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| W사2C | 2-8 | X | - | X | - | X | - | X | - | X | X | X | X | X | X | X |
| 20-25 | X | X | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | |
| 37 | X | X | X | X | X | X | X | - | - | - | - | - | - | - | - | |
- Time point T0.5 = 0.5 month(2weeks)를 의미한다.시험결과
2회차 시험의 SC%(by HPLC) 분석결과는 아래 표 37과 같았다.
| Formulation Code | Temp Conditions (℃) |
Time Point(month) | |||||||||
| T0 | T0.5 | T1 | T1.5 | T2 | T2.5 | T3 | T4.5 | T6 | T9 | ||
| HX1D | 2-8 | 97.5 | 97 | 97.2 | 96.8 | 96.7 | |||||
| 20-25 | 97.5 | 96.5 | |||||||||
| 37 | 97.5 | 96.9 | 89.3 | 87.3 | 81.5 | 79.6 | |||||
| HX2D | 2-8 | 97.5 | 96.9 | 97.2 | 96.9 | 96.6 | |||||
| 20-25 | 97.5 | 97.1 | 96.7 | 93.7 | 93.1 | 91.3 | 91.1 | ||||
| 37 | 97.5 | 91.7 | 85.8 | 81.6 | 79.6 | 74.8 | |||||
| W사1D | 2-8 | 97 | 96.6 | 96.9 | 96.9 | 97.0 | |||||
| 20-25 | 97 | 97 | 96.8 | 96 | 95 | 94.1 | 93.8 | ||||
| 37 | 97 | 94.7 | 90.1 | 85 | 80.4 | 77.6 | |||||
| W사2D | 2-8 | 96.5 | 97.2 | 97.6 | 97.2 | 97.0 | |||||
| 20-25 | 96.5 | 96.9 | 97.5 | 95.6 | 94.8 | 94.3 | 94.0 | ||||
| 37 | 96.5 | 94.5 | 94.1 | 95.1 | 94 | 77.8 | |||||
| HX1C | 2-8 | 97.5 | 97.3 | 97.4 | 96.8 | 96.0 | 95.7 | ||||
| 20-25 | 97.5 | 96.3 | 96.2 | 95 | 94.5 | 94 | |||||
| 37 | 97.5 | 92.3 | 87.9 | 85.4 | 82 | 75.9 | 70.5 | ||||
| HX2C | 2-8 | 97.8 | 97.1 | 97.0 | 96.3 | 95.8 | 94.2 | ||||
| 20-25 | 97.8 | 95.2 | 94.3 | 93 | 91.2 | 90.3 | 87.9 | 86.4 | 83.3 | ||
| 37 | 97.8 | 89.3 | 80.8 | 78 | 73.9 | 69.8 | 59.8 | ||||
| W사1C | 2-8 | 96.8 | 96.8 | 96.3 | 95.5 | 93.4 | 92.4 | ||||
| 20-25 | 96.8 | 95 | 93.3 | 92.4 | 91.1 | 90.4 | 84.7 | ||||
| 37 | 96.8 | 89.2 | 82.6 | 80.7 | 72.9 | 72.5 | 63.8 | ||||
| W사2C | 2-8 | 97.5 | 97.0 | 969. | 96.3 | 94.7 | 93.6 | ||||
| 20-25 | 97.5 | 95.3 | 94.2 | 93 | 92.1 | 91.5 | 87.4 | 85.9 | 84.8 | ||
| 37 | 97.5 | 89.7 | 82.3 | 80.8 | 74.7 | 71.8 | 60 | ||||
- 액체 제형 D (HX1, 25℃)는 4주차에서 drop, 액체 제형 C(HX1,25℃)는 6주차에서 drop 하였다.
| Formulation Code | Temp Conditions (℃) |
Time Point(month) | ||||||||
| T0 | T0.5 | T1 | T1.5 | T2 | T2.5 | T3 | T4.5 | T6 | ||
| Formulation D | 2-8 | 97.1 | 96.9 | 97.2 | 97.0 | |||||
| 20-25 | 97.1 | 96.8 | 96.5 | 94.8 | 94.3 | 93.2 | 92.8 | 92.5 | 89.8 | |
| 37 | 97.1 | 94.4 | 89.8 | 84.8 | 81.4 | 77.5 | 71.9 | |||
| Formulation C | 2-8 | 97.3 | 97.1 | 96.6 | 96.2 | 95.0 | ||||
| 20-25 | 97.3 | 95.5 | 94.5 | 93.3 | 92.2 | 91.4 | 89.4 | 86.4 | 84.1 | |
| 37 | 97.3 | 83.4 | 81.2 | 91.2 | 76.7 | 72.5 | 66.4 | |||
표 38에서 확인할 수 있듯이, 액체 제형 C는 20-25℃, 24주차 결과에서 평균 84.1의 % SC 안정성을 보이는 반면, 액체 제형 D의 경우 20-25℃, 24주차 결과에서 89.8% SC 안정성을 보이는 것으로 확인하였다. 이는 또한 액체 제형 C는 37℃, 12주차 결과에서 평균 66.4% SC 안정성을 보이는 반면, 액체 제형 D의 경우 37℃, 12주차 결과에서 71.9% SC 안정성을 보이는 것으로 확인하였다.
검토
상기 결과를 바탕으로 분석하여 볼 때, RSM을 통하여 액체 제형 C를 개량한 조성인 액체 제형 D는 액체 제형 C보다 상온 조건(20-25℃)에서 5.9% SC 안정성이 증가하는 것을 확인하였고, 가속조건인 37℃에서는 5.5% SC 안정성이 증가하는 것을 확인하였다.
또한 액체 제형 C의 경우, 해당 시험의 목표였던 25℃℃ 3개월 보관 시, SC% 85% 이상의 조건도 충족하였으며(89.4 %SC) 액체 제형 D는 이보다 더 증가한 92.8 %SC 안정성을 보임을 확인하고 개량된 최종 조성을 확보하였다. (3개월 보관 시 평균 %)
따라서, 액체 제형 C보다도 훨씬 pDNA의 안정성이 유지될 수 있는 최적의 조성인 액체 제형 D 조성을 성공적으로 개발하였다.
실시예 3의 결론
본 실시예 3을 통하여, pDNA 안정성 측면에서 도출해 낸 최종 조성인 액체 제형 D는 이전 연구에서 확인한 액체 제형 C와 비교하여 가속조건인 25℃와 가혹조건인 37℃에서 훨씬 더 안정적으로 pDNA를 안정하게 유지할 수 있는 조성임을 확인하였다.
실제 액체 제형 C 조성이 VM202 DP spec 기준인 25℃, 3개월에서 85%(% SC)를 상회한 89.4%를 보이는 반면, 이를 개량한 조성인 액체 제형 D는 25℃, 3개월에서 92.8%를 보이므로 더 안정적으로 액상상태에서 pDNA의 안정성을 유지할 수 있는 제형을 개발하였다.
개량 전 조성인 액체 제형 C가 다양한 생산처에서 생산된 VM202 DS에 적용이 가능하고, 해당 시험의 Target SC% 안정성도 충족하며, 실제 생산 Process에도 적용가능함을 확인하였기 때문에, 이를 개량하여 추가 개발한 액체 제형 D 조성 역시 동일한 효과를 보이면서 안정성 측면에서 더 높은 안정성을 확인할 수 있었다.
이는 액체 제형 조성간 synergy를 통해 pDNA의 안정성을 높일 수 있는 최적의 조합임을 확인하였으며, DP 보관온도인 냉장조건에서 더욱 안정하게 최대 2년 이상 안정하게 유지될 수 있는 것으로 추측된다.
실시예 4: 프리필드 시린지 제형의 장기안정성 시험
본 발명자들은 상기 실시예 1 내지 3을 통하여 개발된 액체 제형 C 및 D를 이용하여 프리필드 시린지의 제형으로 제조하였을 때의 장기안정성에 대한 시험을 수행하였다.
플라스미드 DNA 0.5 mg/ml로 포함하는 액체 제형 C 및 D를 각각 바이알과, 프리필드 시린지의 제형으로 제조하고, 시험은 2-8℃에서 4주 단위로 샘플링하여 3개월간 SC%를 측정하였다. 결과는 표 39 및 도 6에 나타내었다.
| Formulation | Presentation | Time (Week) | |||||||
| 0 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 | 24 | 36 | ||
| C | Vial | 97.6 | 97.5 | 97.7 | 97.1 | 95.3 | 95.7 | ||
| 97.7 | 97.2 | 96.3 | 95.9 | 95.0 | 94.2 | ||||
| 96.5 | 96.8 | 95.9 | 94.6 | 93.4 | 92.4 | ||||
| 97.3 | 97.0 | 96.5 | 95.7 | 94.7 | 93.6 | ||||
| 97.3 | 97.0 | 97.1 | 96.4 | 96.7 | |||||
| 97.9 | 96.9 | 97.6 | 96.7 | 96.5 | |||||
| 97.1 | 96.8 | 96.7 | 96.3 | ||||||
| 97.6 | 97.0 | 97.2 | 96.8 | ||||||
| 96.6 | 96.3 | 96.3 | 95.6 | 95.3 | 94.6 | 96.2 | |||
| 96.3 | 96.5 | 96.9 | |||||||
| Average (vial) | 97.2 | 96.9 | 96.8 | 96.1 | 95.3 | 94.6 | 95.4 | 94.0 | |
| PFS | 96.6 | 96.3 | 96.4 | 96.0 | 96.3 | 96.2 | 95.8 | ||
| 96.3 | 96.7 | 96.3 | |||||||
| Average (PFS) | 96.5 | 96.5 | 96.4 | 96.0 | 96.3 | 96.2 | 95.8 | ||
| D | Vial | 97.5 | 97.0 | 97.2 | 96.8 | 96.7 | |||
| 97.5 | 96.9 | 97.2 | 96.9 | 96.6 | |||||
| 97.0 | 96.6 | 96.9 | 96.9 | 97.0 | |||||
| 96.5 | 97.2 | 97.6 | 97.2 | 97.0 | |||||
| 96.3 | 96.5 | 96.7 | |||||||
| Average (vial) | 97.0 | 96.8 | 97.2 | 97.0 | 96.8 | ||||
| PFS | 96.3 | 96.6 | 96.6 | ||||||
| Average (PFS) | 96.3 | 96.6 | 96.6 | ||||||
표 39 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 바이알(vial)과 프리필드 시린지는 모두 2-8℃에서 6개월(24주) 이상 보관하여도 약 95% 이상의 SC%를 유지하였으므로, 프리필드 시린지의 형태로 제작하여도 보관안정성에는 차이가 없음을 알 수 있었다.
실시예 5: 다양한 플라스미드를 이용한 제형 C 및 D에서의 안정성 시험
실시예2 및 3에서 개발된 액체제형 C 및 D에 대해, VM202 외 다른 플라스미드에서도 동일한 안정성을 보이는지 확인하기 위해 실험을 진행하였다. 플라스미드로는 pCK-SDF-1a (WO2016/048105A1), pTx-IGF-1X10 (WO2020/016655A2), 및 pCMV3-cMet-flag (Sino Biological Inc., China)를 사용하였다. 실험방법은 기존 실시예와 동일하게 진행하였다. 세 가지 플라스미드의 C 및 D 액체제형에 대해 각각 2-8℃및 25℃에서 4주간 보관하여 SC%를 측정하였다.
결과는 하기 표 40에 나타내었다.
| pCK-SDF-1a | |||||
| Formulation | Temperature (℃) | DP lot no. | 0 week | 2 weeks | 4 weeks |
| C | 2-8 | FCV220715-PI01 | 81.4 | 81.7 | 81.4 |
| 25 | 81.4 | 80.6 | 79.0 | ||
| D | 2-8 | FDV220715-PI01 | 79.8 | 79.6 | 79.3 |
| 25 | 79.8 | 78.9 | 77.0 | ||
| pTx-IGF-1X10 | |||||
| Formulation | Temperature (℃) | DP lot no. | 0 week | 2 weeks | 4 weeks |
| C | 2-8 | FCV220715-PM01 | 98.6 | 99.0 | 99.1 |
| 25 | 98.6 | 98.8 | 98.0 | ||
| D | 2-8 | FDV220715-PM01 | 98.3 | 99.1 | 99.1 |
| 25 | 98.3 | 98.7 | 98.0 | ||
| pCMV3-cMet-flag | |||||
| Formulation | Temperature (℃) | DP lot no. | 0 week | 2 weeks | 4 weeks |
| C | 2-8 | FCV220715-PC01 | 92.3 | 91.3 | 92.0 |
| 25 | 92.3 | 90.6 | 91.1 | ||
| D | 2-8 | FDV220715-PC01 | 94.6 | 94.0 | 94.5 |
| 25 | 94.6 | 92.9 | 93.0 | ||
표 40에 나타낸 바와 같이, 상기 세 가지 플라스미드는 모두 C 또는 D 액체제형에서 높은 안정성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 pCK-SDF-1a의 경우 초기 조성인 0.9% NaCl에 잠깐만 노출되어도 상당히 안정성이 저하되지만 (SC%가 80%로 급감), C 또는 D 제형에서 4주 동안 SC%의 큰 감소없이 매우 안정하게 유지되는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 C 또는 D 액체제형, 특히 D 액체제형은 아주 불안정한 플라스미드 DNA도 안정하게 유지할 수 있는 제형임이 증명되었다.
실시예 6: 다양한 플라스미드를 이용한 프리필드 시린지 제형의 장기안정성 시험
상기 실시예 5에서 사용한 pCK-SDF-1a (WO2016/048105A1), pTx-IGF-1X10 (WO2020/016655A2), 및 pCMV3-cMet-flag (Sino Biological Inc., China)의 세 가지 플라스미드를 액체제형 D를 이용하여 프리필드 시린지의 제형으로 제조하여 4주간 보관하였을 때의 안정성을 SC%로 측정하였다.
결과는 표 41에 나타내었다.
| pCK-SDF-1a | |||||
| Formulation | Temperature (℃) | DP lot no. | 0 week | 2 weeks | 4 weeks |
| D | 2-8 | FDS220715-PI01 | 79.8 | 79.6 | 79.6 |
| 25 | 79.8 | 79.3 | 78.3 | ||
| pTx-IGF-1X10 | |||||
| Formulation | Temperature (℃) | DP lot no. | 0 week | 2 weeks | 4 weeks |
| D | 2-8 | FDS220715-PM01 | 98.3 | 98.8 | 99.0 |
| 25 | 98.3 | 98.6 | 97.8 | ||
| pCMV3-cMet-flag | |||||
| Formulation | Temperature (℃) | DP lot no. | 0 week | 2 weeks | 4 weeks |
| D | 2-8 | FDS220715-PC01 | 94.6 | 93.9 | 94.5 |
| 25 | 94.6 | 93.2 | 94.1 | ||
표 41에 나타낸 바와 같이, 실시예 5의 결과와 마찬가지로, D 제형을 프리필드 시린지 제형으로 4주간 보관시에도 세 가지 플라스미드 모두 매우 안정함을 확인할 수 있었다.
Claims (20)
- 30-50 mM Potassium phosphate, 0.5-1.5% NaCl, 및 플라스미드 DNA를 포함하고, pH가 7.5-8.5인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 제형은 40 mM Potassium phosphate를 포함하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 제형은 0.9% NaCl를 포함하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 제형의 pH는 8.0인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라드미드 DNA는 20-30℃에서 6개월 보관 후에도 80-100 SC% (supercoiled %)를 유지하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 제형은, 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 솔비톨, 루이신, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 제형은 수크로오스 1-2%, 트레할로스 0.5~2%, 솔비톨 0.01-1%, 루이신 0.05-0.5%, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 0.01-5 mg/mL의 농도로 포함하는, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 제형은 만니톨 0.15 내지 1.5%을 추가적으로 포함하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제9항에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 2-8℃에서 적어도 6개월 보관 후에도 90-100 SC%를 유지하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제9항에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 15-30℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 보관 후에도 60-100 SC%를 유지하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 제형은 만니톨 0.001 내지 0.3%, 솔비톨 0.05 내지 0.5%, 수크로스 0.05 내지 0.5%, 트레할로스 0.15 내지 3%, 루이신(leucine) 0.01 내지 1%, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제12항에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 2-8℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 또는 9개월 보관 후에도 90-100 SC%를 유지하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제12항에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 20-30℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 또는 9개월 보관 후에도 80-100 SC%를 유지하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 제형은 만니톨 0.001 내지 0.3%, 솔비톨 0.05 내지 0.5%, 수크로스 0.05 내지 0.5%, 트레할로스 0.15 내지 3%, 루이신 0.045-0.055%, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제15항에 있어서, 상기 액체 제형은 37-37.3 mM Potassium phosphate를 포함하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제15항에 있어서, 상기 액체 제형은 0.975-1.0% NaCl를 포함하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제15항에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 2-8℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 또는 9개월 보관 후에도 90-100 SC%를 유지하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제15항에 있어서, 상기 액체 제형 내 플라스미드 DNA는 20-30℃에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 또는 9개월 보관 후에도 80-100 SC%를 유지하는 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 제형은 바이알(vial), 앰플(ampule), 병(bottle), 또는 사전-충전형 주사기(pre-filled syringe)로 제작된 것인, 플라스미드 DNA의 액체 제형.
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