CN113302202B - 利用表达胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的神经病变的治疗 - Google Patents

利用表达胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的神经病变的治疗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及编码可以治疗神经病变的1个人类胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体。在本发明中追加提供给药包含作为活性成分的脱氧核糖核酸构建体药剂学组合物及神经病变治疗用脱氧核糖核酸构建体的方法。本发明提供治疗神经病变患者的安全有效的方法。

Description

利用表达胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体 的神经病变的治疗
技术领域
本发明涉及利用表达胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的神经病变的治疗。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年7月17日提交且申请号为62/699,662的美国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
序列表
本申请包含通过EFS-Web提出的序列表，由此，其全部内容通过引用结合在本申请中。在2019年7月2日创建的ASCII副本(copy)的名称为37238US_CRF_sequencelisting.txt，大小为81920字节(bytes)。
背景技术
神经病变是由神经损伤引起的慢性病理状况。神经病变是糖尿病的常见结果，糖尿病患者的神经病变被明确称为糖尿病性(diabetic)神经病变。神经病变也有可能因感染(infection)(例如，疱疹后神经痛(post-herpetic neuralgia)，伴随与在感染后发生的病变有关的神经病变的疱疹病毒(herpes)；人类免疫缺陷病毒(HIV)/艾滋病(AIDS)；莱姆病(Lyme disease)；麻风病(leprosy)；梅毒(syphilis)；带状疱疹(shingles))；自身免疫病(autoimmune disease)(例如，类风湿关节炎(rheumatoid arthritis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus)及格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome))；遗传性(genetic)或遗传(inherited)疾病(例如，弗里德里希共济失调(Friedreich’s ataxia)及夏科-马里-图斯病(Charcot-Marie-Tooth disease))；淀粉样变性(amyloidosis)；尿毒症(uremia)；毒素(toxin)、毒或药物；外伤(trauma)；或受伤(injury)所引起的神经损伤而导致。在一部分情况下，无法得知原因，在此情况下，将神经病变称为特发性(idiopathic)神经病变。
与原因无关，神经病变部分依赖如疼痛(神经性疼痛)其他感觉缺陷(例如，包含部分或完全感觉丧失的麻醉(anesthesias)；及包含麻木(numbness)和刺痛感(tingling)的感觉异常(paresthesias)等)、运动缺陷(例如，虚弱(weakness)、反射(reflexes)丧失、肌肉质量(muscle mass)丧失、抽筋、灵活性(dexterity)下降等)以及自主神经功能障碍(autonomic dysfunction)(例如，恶心(nausea)、呕吐(vomiting)、阳痿(impotence)、头晕(dizziness)、便秘(constipation)、腹泻(diarrhea)等)的神经损伤(例如，末梢(peripheral)神经病变、颅骨(cranial)神经病变、自主(autonomic)神经病变、局部(focal)神经病变)的解剖学部位的特定症状有关。
对神经病变的治疗通常采用管理相关症状的措施，在已知病因的情况下，通过治疗神经病变的根本原因来进行常规治疗。例如，使用止痛药或对于糖尿病、自身免疫性疾病、感染或维生素缺乏症的药物治疗。但是，这种方法本身不能治疗神经损伤。
因此，存在对于可以预防及治疗与神经病变有关的神经损伤的有效治疗方法的必要性。
已经提出了各种生长因子作为治疗神经病的可用制剂，Kessler及其同事最近报道了在糖尿病性末梢神经病变中成功进行的非病毒性肝细胞生长因子(HGF)基因治疗的双盲(double-blind)、安慰剂对照(placebo-controlled)、人类2期临床试验。Kessler etal.，Annals Clin.Transl.Neurology 2(5)：465-478(2015)。并且，参照美国专利第9,963,493号，其全部内容通过引用结合在本申请中。
考虑到引起神经病变的病因范围广泛以及神经病变的广泛临床发表，尽管用肝细胞生长因子表达核酸构建体在治疗糖尿病性末梢神经病变方面取得了临床成功，仍然需要其他治疗，包含基于除肝细胞生长因子之外的生长因子给药的治疗。
发明内容
技术问题
本发明基于编码人类胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体治疗与神经病变有关的症状有效的新发现。进一步证明了与编码II类、Ea或I类、Eb异构体的脱氧核糖核酸构建体相比，编码IGF-1的I类、Ec或I类、Ea异构体的脱氧核糖核酸构建体更有效。当同时给药分别编码IGF-1的I类、Ec或I类、Ea异构体的2个类型的脱氧核糖核酸构建体时，治疗效果更佳明显。因此，在本发明的一部分实例中指定了向患有神经病变的对象(subject)个别或组合给药编码IGF-1的I类、Ec或I类、Ea异构体的脱氧核糖核酸构建体来治疗神经病变的方法。
在本发明中，追加提供特异性设计的新的脱氧核糖核酸构建体来在1个载生物体内编码2个胰岛素样生长因子1异构体(即，I类、Ec及I类、Ea)。脱氧核糖核酸构建体基于在诱导I类、Ec及I类、Ea异构体的高水平的表达的生物体内有效地治疗与神经病变有关的症状的能力来筛选并选择。与在I类、Ec或I类、Ea的2个异构体中仅编码1个的脱氧核糖核酸构建体相比，它们的治疗效果更为显著，与通过分别编码I类、Ec或I类、Ea的构建体的2个类型的同时给药证明的效果类似。
因此，本发明提供基于治疗神经病变的治疗方法的新的IGF-1。
技术方案
具体地，在一实施方式中，本发明提供包含如下物质的编码人类胰岛素样生长因子1的胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体：第一多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的外显子1、3及4(序列1)相同的序列或其的简并(degenerate)；第二多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的内含子4(序列2)相同的序列或其的片段(fragment)；第三多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的外显子5及6-1(序列3)相同的序列或其的简并；第四多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的内含子5(序列4)相同的序列或其的片段；以及第五多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的外显子6-2(序列5)相同的序列或其的简并，其中，第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸、第四多核苷酸及第五多核苷酸按从5’向3’顺序依次连接。
在一部分实例中，第二多核苷酸为序列6的多核苷酸。在一部分实例中，第二多核苷酸为序列7的多核苷酸。
在一部分实例中，第四多核苷酸为序列8的多核苷酸。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体还包含质粒载体。
在一部分实例中，质粒载体为pCK。在一部分实例中，胰岛素样生长因子编码脱氧核糖核酸构建体为pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10。
在一部分实例中，质粒载体为pTx。在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体为pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10。
在另一实施方式中，本发明提供包含本申请所提供的胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的药剂学组合物。
在另一实施方式中，提供包含胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的药剂学组合物，其中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体编码包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体均编码包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质及包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体不编码包含序列18的多肽的II类IGF-1Ea蛋白质及包含序列20的多肽的I类IGF-1Eb蛋白质。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体并不编码包含序列18的多肽的II类IGF-1Ea蛋白质及包含序列20的多肽的I类IGF-1Eb蛋白质。
在一部分实例中，药剂学组合物包含编码具有序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质的斗殴脱氧核糖核酸构建体及编码具有序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质的第二脱氧核糖核酸构建体。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体为pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10。在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体为pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10。
本发明的一部分实施方式提供包括向患有神经病变的对象(subject)给药有效量的第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤的神经病变治疗方法，其中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体可以表达一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。
在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体可以表达包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体无法表达包含序列18的多肽的II类IGF-1Ea蛋白质或包含序列20的多肽的I类IGF-1Eb蛋白质。
在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。在一部分实例中，方法还包括如下的步骤，向对象给药第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其中，第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。
在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。在一部分实例中，方法还包括如下的步骤，向对象给药第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其中，第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。
在一部分实例中，同时执行给药第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤。
在一部分实例中，依次执行给药第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤。
在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体编码大于一个的人类胰岛素样生长因子1异构体。在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体编码包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质及包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含：第一多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的外显子1、3及4(序列1)相同的序列或其的简并；第二多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的内含子4(序列2)相同的序列或其的片段；第三多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的外显子5及6-1(序列3)相同的序列或其的简并；第四多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的内含子5(序列4)相同的序列或其的片段；以及第五多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的外显子6-2(序列5)相同的序列或其的简并，其中，第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸、第四多核苷酸及第五多核苷酸按从5’向3’顺序依次连接。
在一部分实例中，第二多核苷酸为序列6的多核苷酸。在一部分实例中，第二多核苷酸为序列8的多核苷酸。
在一部分实例中，第四多核苷酸为序列8的多核苷酸。
在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体还包含质粒载体。在一部分实例中，质粒载体为pCK。在一部分实例中，质粒载体为pTx。
在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体酸。在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列27的多核苷酸。
在一部分实例中，有效量为减少对象的疼痛的充分的量。
在一部分实例中，对象患有神经性疼痛。在一部分实例中，对象患有糖尿病性神经病变。
在一部分实例中，给药第一胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体或第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤包括肌肉注射。
在另一实施方式中，本发明的内容可提供用于治疗神经病变的医学方法的胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，上述方法包括向患有神经病变的对象给药有效量的胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤，其中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体可以表达一个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体可以表达包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质或包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体无法表达包含序列18的多肽的II类IGF-1Ea蛋白质及包含序列20的多肽的I类IGF-1Eb蛋白质。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。在一部分实例中，医学方法还包括如下的步骤，向对象给药第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其中，第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列17的多核苷酸。在一部分实例中，医学方法还包括如下的步骤，向对象给药第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其中，第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列15的多核苷酸。
在一部分实例中，同时执行给药胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤。在一部分实例中，依次执行给药胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体编码1个以上的人类胰岛素样生长因子1异构体。在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体编码包含序列14的多肽的I类IGF-1Ea蛋白质及包含序列16的多肽的I类IGF-1Ec蛋白质。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含：第一多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的外显子1、3及4(序列1)相同的序列或其的简并；第二多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的内含子4(序列2)相同的序列或其的片段；第三多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的外显子5及6-1(序列3)相同的序列或其的简并；第四多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的内含子5(序列4)相同的序列或其的片段；以及第五多核苷酸，具有与人类胰岛素样生长因子1基因的外显子6-2(序列5)相同的序列或其的简并，其中，第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸、第四多核苷酸及第五多核苷酸按从5’向3’顺序依次连接。
在一部分实例中，第二多核苷酸为序列6的多核苷酸。在一部分实例中，第二多核苷酸为序列7的多核苷酸。在一部分实例中，第四多核苷酸为序列8的多核苷酸。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含质粒载体。在一部分实例中，质粒载体为pCK。在一部分实例中，质粒载体为pTx。
在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列10的多核苷酸。在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列9的多核苷酸。在一部分实例中，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体包含序列27的多核苷酸。
在一部分实例中，有效量为减少对象的疼痛的充分的量。在一部分实例中，对象患有神经性疼痛。在一部分实例中，对象患有糖尿病性神经病变。在一部分实例中，给药胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体或第二胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的步骤包括肌肉注射。
附图说明
图1为包含选择性转录起始位点及选择性剪接位点的人类胰岛素样生长因子1基因的简图。从IGF-1基因自然地生成的胰岛素样生长因子1异构体包含I类Ec(异构体#1)；I类IEa(异构体#2)；I类Eb(异构体#3)及I类Ea(异构体#4)。
图2a简要说明在慢性压迫性神经损伤(chronic constriction injury，CCI)模型中，用于测试编码胰岛素样生长因子1异构体的多种脱氧核糖核酸构建体的治疗功效的实验方案。
图2b为示出在简要说明的实验中，在假手术(Sham)小鼠或慢性压迫性神经损伤小鼠中测定的缩脚(paw withdrawal)频率的直方图。向慢性压迫性神经损伤小鼠均给药脱氧核糖核酸构建体-(i)pCK载体、(ii)pCK-IGF-1#1(表达I类Ec异构体的构建体)、(iii)pCK-IGF-1#4(表达I类Ea异构体的构建体)或(iv)pCK-IGF-1#1及pCK-IGF-1#4。
图3a简要说明为了评价从多种脱氧核糖核酸构建体生成的胰岛素样生长因子1异构体的生物体内表达而在实施例2中使用的实验方案。
图3b示出测定未编码胰岛素样生长因子的脱氧核糖核酸构建体(仅“pCK”载体)；编码异构体#1的脱氧核糖核酸构建体(I类Ec异构体)；编码异构体#4的脱氧核糖核酸构建体(I类Ea异构体)；分别编码异构体#1(I类Ec异构体)或#4(I类Ea异构体)的2个构建体以及在给药双重表达构建体pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10之后表达的所有人类胰岛素样生长因子1的异构体的量的ELISA的结果。
图3c示出用于区分胰岛素样生长因子1异构体#1(I类Ec异构体)及#4(I类Ea异构体)的表达的RT-PCR所使用的正向/左侧(L)及反向/右侧(R)引物的位点。
图3d示出表示从双重表达构建体pCKIGF-1X6及pCKIGF-1X10生成的异构体#1及异构体#4的表达的RT-PCR生成物的琼脂糖凝胶电泳。pCK IGF-1X6及pCK-IGF-1X10均诱导了所有异构体的高水平的表达。
图4a简要说明在试验管内的293T细胞中，为了评价从胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体表达的蛋白质而在实施例2中使用的方案。
图4b示出(i)编码异构体#1的构建体、(ii)编码异构体#4的构建体、(iii)分别编码异构体#1或异构体#4的2个构建体、(iv)双重表达载体pCK-IGF-1X6或(v)双重表达载体pCK-IGF-1X10在试验管内转染(transfection)后证明胰岛素样生长因子1异构体#1和/或异构体#4的表达的蛋白质免疫印迹(western blotting)结果。
图5a为简要说明在慢性压迫性神经损伤(CCI)动物模型中，在减少机械性触诱发痛(mechanical allodynia)的过程中，用于测试多种胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的功效的实施例3中所使用的实验方案。
图5b为示出在图5a中简要说明的假手术小鼠或慢性压迫性神经损伤小鼠中测定的缩脚的频率的直方图。向慢性压迫性神经损伤小鼠给药脱氧核糖核酸构建体-(i)pCK载体、(ii)pCK-IGF-1#1(表达I类Ec异构体的构建体)、(iii)pCK-IGF-1#4(表达I类Ea异构体的构建体)、(iv)pCK-IGF-1#1及及pCK-IGF-1#4以及(v)双重表达载体pCK-IGF-1X6或(vi)双重表达载体pCK-IGF-1X10。
图6a提供从假手术或神经损伤动物模型获取的右侧同侧坐骨神经(rightipsilateral sciatic nerve)的给药电子显微镜(TEM)图像。向神经损伤动物模型给药pCK载体或双重表达载体pCK-IGF-1X10。
图6b为示出处理pCK(“Crush-pCK”)的神经损伤动物及处理pCK-IGF-1X10(“Crush-pCK-IGF-1X10”)的神经损伤动物的神经直径的分布的图表。
附图仅是实例的目的，描述本发明的多种实例。本发明所属技术领域的普通技术人员可以从以下的研究轻松理解在本发明中例示的构建体及方法的代替性实例可以在不超出本发明中说明的发明的原理的情况下使用。
具体实施方式
1.定义
只要没有其他定义，在本说明书中所使用的所有技术及科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员共同理解的含义相同。如在本说明书中使用，婴喜爱术语具有如下赋予的含义。
术语“IGF-1的异构体(isoform of IGF-1)”、“人类胰岛素样生长因子1异构体(human IGF-1isoform)”或“胰岛素样生长因子1异构体(IGF-1isoform)”为具有与在本发明中相互交换使用的自然发生的人类的pre-pro-IGF-1多肽或其的等位基因突变体、剪接突变体或缺失突变体中的一个氨基酸序列至少相同80％的氨基酸序列的多肽。自然发生的Pre-pro-IGF-1多肽包含I类，Ec(序列16)；II类，Ea(序列18)；I类，Eb(序列20)及I类，Ea异构体(序列14)。
术语“异构体#1(Isoform#1)”、“I类，Ec异构体(Class I，Ec isoform)”、“I类，IGF-1Ec异构体(Class I，IGF-1Ec isoform)”或“I类，IGF-1Ec(Class I，IGF-1Ec)”为在本发明中相互交换使用的序列16的多肽。
术语“异构体#2(Isoform#2)”、“II类，Ea异构体(Class II，Eaisoform)”、“II类，IGF-1Ea异构体(Class II，IGF-1Eaisoform)”或“II类，IGF-1Ea(Class II，IGF-1Ea)”为在本发明中相互交换使用的序列18的多肽。
术语“异构体#3(Isoform#3)”、“I类，Eb异构体(Class I，Ebisoform)”，“I类，IGF-1Eb异构体(Class I，IGF-1Ebisoform)”或“I类，IGF-1Eb(Class I，IGF-1Eb)”为在本发明中相互交换使用的序列20的多肽。
术语“异构体#4(Isoform#4)”、“I类，Ea异构体(Class I，Eaisoform)”、“I类，IGF-1Ea异构体(Class I，IGF-1Eaisoform)”或“I类，IGF-1Ea(Class I，IGF-1Ea)”为在本发明中相互交换使用的序列14的多肽。
在本发明中所使用的术语“治疗(treatment)”为(a)神经病变的症状抑制；(b)神经病变的症状缓和以及(c)神经病变症状去除的所有活动。在一部分实例中，本发明的组合物可通过神经细胞的生长或神经细胞凋亡的抑制治疗神经病变。
本发明中所使用的“治疗有效用量(therapeutically effective dose)”或“有效量(effective amount)”为生成给药优选效果的剂量(dose)或量(amount)。在本发明的脉络中，治疗有效量为用于治疗神经病变的症状的有效量。
本发明中所使用的术语“充分的量(sufficient amount)”为用于生成优选效果的充分的量。
本发明中所使用的术语“简并序列(degenerate sequence)”或“简并(degenerate)”为可以翻译的核酸序列，提供与从参照核酸序列翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
2.其他解释规则(Other interpretational conventions)
本发明中所提及的范围为对于包含所提及的终点(endpoint)的范围内的所有值的缩略型(shorthand)。例如，1至50的范围包含选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50组成的组中的任意数字、数字的组合或子范围。
3.表达胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体
在第一实施方式中，本发明提供编码人类胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体。
3.1.胰岛素样生长因子1异构体
如图1所示，人类胰岛素样生长因子1基因包含全长为90kb的基因组脱氧核糖核酸的6个外显子(外显子1、2、3、4、5及6(6-1及6-2))。外显子1及2为互斥先导外显子(mutuallyexclusive leader exons)，分别具有以多种方式使用的多个启动子位点。进而，IGF-1基因为了生成多个转录组变异体而可以差分剪接。各个转录组变异体编码具有可变信号传递肽先导序列的不同的Pre-pro-IGF-1蛋白质(“胰岛素样生长因子1异构体”)。但是，所有转录组异构体在处理之后，生成作为使用相同受体的相同成熟(mature)的70个氨基酸的IGF-1肽。
在Pre-pro-IGF-1肽中，其的先导或信号、序列及其的羧基(carboxy)(C)-末端不同。外显子1或外显子2互斥，其中的一个起到Pre-pro-IGF-1肽的先导序列的作用。其他先导外显子生成5’-UTR。Pre-pro-IGF-1多肽去除先导及E-肽羧基-末端，在生成作为成熟的70个氨基酸的IGF-1的转录之后经过蛋白质分解切割。
包含外显子1的转录组被称为类1转录组(例如，图1的I类，Ec；I类，Eb及I类，Ea)，相反，包含外显子2的转录组也被称为类2转录组(例如，图1的I类I，Ea)。从外显子3获取的信号传递肽中，几乎所有pre-pro肽包含27个氨基酸，以及源自包含外显子1或2的剩余信号序列。少数的转录组利用生成22个氨基酸的更短的信号传递肽的外显子3内的其他转录起始位点。外显子3及4不会改变，并编码成熟的IGF-1肽的B、C、A及D结合域。外显子4编码成熟的IGF-1肽的2/3。人类Eb肽仅由外显子4及5构成，相反，Ec包含外显子4、5及6。
选择性剪接及转录的互斥揭示在具有生成其他Pre-pro-IGF-1多肽(即，胰岛素样生长因子1异构体)的结果的图1中进行说明。具体地，包含最少的外显子1、3/4、5及6的片段的I类，Ec胰岛素样生长因子1异构体(序列16)从包含序列17的序列的转录组生成。包含最少的外显子2、3/4及6的片段的II类，Ea胰岛素样生长因子1异构体(序列18)从包含序列19的序列的转录组生成。包含最少的外显子1、3/4及5的片段的I类，Eb胰岛素样生长因子1异构体(序列20)从包含序列21的序列的转录组生成。包含最少的外显子1、3/4及6的片段的I类，Ea胰岛素样生长因子1异构体(序列14)从包含序列15的序列的转录组生成。
虽然，从多种转录组获取的成熟的IGF-1蛋白质不同，但是，多种转录组异构体具有不同的调节作用。变异体形态具有呈现出对于异构体的关键的调节作用的不同的稳定性、结合伙伴及活性。异构体的生物重要性虽然并不明确，但如下假设：具有外显子1的I类异构体以自分泌/侧分泌形态分泌，具有外显子2的II类异构体以内分泌形态分泌。这基于包含与II类转录组的有效分泌有关的典型的信号肽基元，相反，I类转录组具有可以妨碍分泌的更长的信号肽。
大部分组织使用I类转录组，但肝使用两种形态，肝的II类转录组在发育过程中优先强化。在发育过程中，在IGF-1转录组的丰度(abundance)中存在很多变化。类1，Ea在活性成长期间最为丰度，类1，Eb在初期生长期内，在生长板整体中处于低的水平，即便如此，也会均匀地表达。
3.2.表达胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体
在一实施方式中，本发明提供可以表达最少1个人类胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体。在一部分实例中，使用编码分别不同的胰岛素样生长因子1异构体的1个以上的脱氧核糖核酸构建体。例如，同时使用编码I类，Ec异构体(异构体#1)的第一构建体及编码I类，Ea异构体(异构体#4)的第二构建体。在一部分实例中，使用表达2个以上的异构体(即，“双重表达构建体”)的脱氧核糖核酸构建体。例如，可使用均编码I类，Ec异构体及I类，Ea异构体的单一脱氧核糖核酸构建体。
3.2.1.胰岛素样生长因子1编码序列
在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体包含胰岛素样生长因子1异构体中的1个编码序列。例如，脱氧核糖核酸构建体可包含编码I类，Ea(序列15)；I类，Eb(序列21)；I类，Ec(序列17)；或II类，Ea(序列19)的序列。
在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体包含对于各个异构体编码序列(CDS)的表达调节序列，是作为可表达1个以上的胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的双重表达构建体。在一部分实例中，构建体包含2个编码序列之间的内部核糖体进入位点(IRES)(例如，按(1)表达调节序列-(2)第一异构体的编码序列-(3)内部核糖体进入位点-(4)第二异构体的编码序列-(5)转录终止序列的顺序)。内部核糖体进入位点允许在内部核糖体进入位点序列中开始翻译，由此，从单一构建体表达2个蛋白质生成物。在追加实例中，编码各个IGF-1单一异构体的多个构建体在给药的对象中同时使用，从而引导1个以上的胰岛素样生长因子1异构体的表达。
在优选的实例中，脱氧核糖核酸构建体包含选择性剪接位点，从而可同时表达2个以上的胰岛素样生长因子1异构体。例如，(i)I类，Ec异构体(异构体#1)及II类，Ea异构体(异构体#2)；(ii)I类，Ec异构体(异构体#1)及I类，Eb异构体(异构体#3)；(iii)I类，Ec异构体(异构体#1)及I类，Ea异构体(异构体#4)；(iv)I类I，Ea异构体(异构体#2)及I类，Eb异构体(异构体#3)；(v)II类，Ea异构体(异构体#2)及I类，Ea异构体(异构体#4)；(vi)I类，Eb异构体(异构体#3)及I类，Ea异构体(异构体#4)。
例如，脱氧核糖核酸构建体可包含：(i)包含人类胰岛素样生长因子1基因的外显子1，3及4(序列1)的第一序列或第一序列的简并序列；(ii)包含人类胰岛素样生长因子1基因的内含子4(序列2)的第二序列或第二序列的片段；(iii)包含人类胰岛素样生长因子1基因的外显子5及6-1(序列3)的第三序列或第三序列的简并序列；(iv)包含人类胰岛素样生长因子1基因的内含子5(序列4)的第四序列或第二序列的片段；以及(v)包含人类胰岛素样生长因子1基因的外显子6-2(序列5)的第五序列或第五序列的简并序列。内含子1及2可被选择性地剪接，结果，生成2个胰岛素样生长因子1异构体(例如，I类，Ec及I类，Ea)。
在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体在与可以表达1个以上的胰岛素样生长因子1异构体的其能力有关的试验管内和/或生物体内测试。在优选的实力中，选择可均表达I类，Ec及I类，Ea胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体。
在一部分实例中，构建体包含内含子4(序列2)的整体序列或其的片段。在优选的实例中，构建体包含具有序列6或序列7的序列的内含子4的片段。
在一部分实例中，构建体包含内含子5(序列4)的整体序列或其的片段。在优选的实例中，构建体包含具有序列8的序列的内含子5的片段。
包含与(i)人类胰岛素样生长因子1基因的外显子1至6及(ii)人类胰岛素样生长因子1基因的内含子1及2或内含子1及2的多种片段对应的cDNA的多种脱氧核糖核酸构建体被命名为“IGF-1X”并赋予识别号。由申请人测试的IGF-1X构建体包含IGF-1X1、IGF-1X2、IGF-1X3、IGF-1X4、IGF-1X5、IGF-1X6、IGF-1X7、IGF-1X8、IGF-1X9及IGF-1X10，但并不局限于此。在测试的构建体之间，IGF-1X6及IGF-1X10均表达I类，Ec及I类，Ea胰岛素样生长因子1异构体。
在优选的实例中，使用IGF-1X6(序列9)或IGF-1X10(序列10)。在pCK载体克隆的IGF-1X6(序列9)及IGF-1X10(序列10)分别被命名为pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10。根据《布达佩斯条约》，用pCK-IGF-1X6(“DH5α_pCK-IGF-1X6”)转化的大肠杆菌(E.coli)于2018年5月30日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC，生物科学与生物技术研究所(KRIBB)56212，韩国，全罗北道，井邑市，立新街181号)，保藏号为KCTC 13539BP。根据《布达佩斯条约》，用pCK-IGF-1X10(“DH5α_pCK-IGF-1X10”)转化的大肠杆菌(E.coli)于2018年5月30日，保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC，生物科学与生物技术研究所(KRIBB)56212，韩国，全罗北道，井邑市，立新街181号)，保藏号为KCTC 13540BP。
在另一优选的实例中，IGF-1X6(序列9)及IGF-1X10(序列10)在pTx载体中克隆。IGF构建体分别被命名为pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10。
编码在本发明中记述的胰岛素样生长因子1异构体或编码胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体可以包含从人类胰岛素样生长因子1异构体的变形。当通过最大的方式排序上述变形的序列与野生型人类胰岛素样生长因子1异构体序列时，变形的序列可包含具有80％相同性，更优选地，至少90％相同性，以及最优选地，至少95％相同的序列。本领域已知用于比较的序列排序方法。详细地，为了确定相同性百分比，可以使用在美国国家生物信息中心(National Center for Biological Information，马里兰州贝塞斯达)网站的基本本地排序搜索工具(BLAST)揭示并与序列分析程序blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx同时使用的排序算法。
3.2.2.载体
本发明的表达胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体包含以与表达的序列可操作的方式连接的1个以上的调节序列(例如，启动子或增强子)的载体。调节序列调节胰岛素样生长因子1异构体的表达。
优选地，编码胰岛素样生长因子1异构体的1个以上的异构体的多核苷酸在表达构建体中与启动子以可操作的方式相连接。术语“以可操作性的方式相连接(operativelylinked)”是指核酸表达调节序列(如启动子、信号序列或转录因子结合位点的排列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中，表达调节序列对与第二序列相应的核酸的转录和/或翻译产生影响。
在典型的实例中，与多核苷酸连接的启动子包含从哺乳动物细胞的基因组或从哺乳动物病毒获取的启动子(例如，CMV(巨细胞病毒(cytomegalovirus))启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘(vaccinia)病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白(metallothionein)启动子、β-肌动蛋白启动子、人类IL-2基因启动子、人I类FN基因启动子、人类IL-4基因启动子、人类淋巴毒素(lymphotoxin)基因启动子和人类GM-CSF基因启动子，但不限于此)，上述启动子调节多核苷酸的转录，优选地，可以在动物，更优选地，在哺乳动物细胞中操作。更优选地，在本发明中，有用的启动子为从人类巨细胞病毒(hCMV)的IE(初期即刻)基因获取的启动子或EF1α启动子，最优选地，源自hCMV IE基因的启动子/增强子和5'-UTR(非翻译区)，在ATG起始密码子之前的序列中包含外显子1和外显子2序列的整体序列。
例如，在本发明中所使用的表达试剂盒包含牛生长激素终止剂(Gimmi，E.R.，etal.，Nucleic Acids Res.17：6983-6998(1989))、源自SV40的聚腺苷酸化序列(Schek，N，etal.，Mol.Cell Biol.12：5386-5393(1992))、HIV-1polyA(Klasens，B.I.F.，et al.，Nucleic Acids Res.26：1870-1876(1998))、β-珠蛋白polyA(Gil，A.，et al，Cell 49：399-406(1987))，HSV TK polyA(Cole，C.N.and T.P.Stacy，Mol.Cell.5Biol.5：2104-2113(1985))或多瘤(polyoma)病毒polyA(Batt，D.Band G.G.Carmichael，Mol.Cell.Biol.15：4783-4790(1995))，但并不局限于此，可包含聚腺苷酸化(polyadenylation)序列。
3.2.3.非病毒载体
在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体为可以表达一个以上的胰岛素样生长因子1异构体的非病毒载体。
在典型的实例中，非病毒载体为质粒。在当前的优选的实例中，质粒为pCK、pCP、pVAXl、pTx或pCY。尤其，在优选的实例中，质粒为pCK，详细事项可以在WO 2000/040737及Lee et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.272：230–235(2000)查询，其全部内容通过引用结合在本申请中。根据《布达佩斯条约》，用pCK(Top10-pCK)转化的大肠杆菌(E.coli)于2003年3月21日保藏在韩国微生物中心(KCCM)(保藏号为KCCM-10476)。根据《布达佩斯条约》，用pCK-VEGF165(即，具有VEGF编码序列的pCK载体–Top10-pCK/VEGF165')转化的大肠杆菌(E.coli)于1999年12月27日保藏在韩国微生物中心(KCCM)(保藏号为KCCM-10179)。
构建pCK载体，从而在人类巨细胞病毒(HCMV)的增强子/启动子下调节基因(例如，IGF-1基因)的表达，详细事项揭示在Lee et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.272：230(2000)；WO 2000/040737，其全部内容通过引用结合在本申请中。pCK载体用于人体临床试验，其安全性和有效性得到确认(Henry et al.，Gene Ther.18：788(2011))。
在优选的实例中，pCK质粒包含对于I类，Ec胰岛素样生长因子1异构体和/或I类，Ea胰岛素样生长因子1异构体的编码序列。尤其，在优选的实例中，pCK质粒包含IGF-1X6(即，pCK-IGF-1X6)或IGF-1X10(即，pCK-IGF-1X10)。
在另一优选实施例中，质粒为作为源自pCK的质粒载体的pTx(序列26)。pTx是通过pCK的两次连续突变生成。执行第一缺陷突变诱发运动，以去除卡那霉素(Kanamycin)耐性基因及pCK的ColE1之间不必要的序列。具体地，缺陷突变诱发PCR使用第一引物对(SEQ IDNOs：22及23)来执行。卡那霉素抗性和ColE1之间的228个碱基对的缺失通过对该质粒进行测序来证实。使用第二引物对(SEQ ID NO：24及25)执行第二缺陷突变诱发运动，以优化HCMV内含子序列的大小。删除IE1外显子1和外显子2之间的HCMV内含子序列(421个碱基对)，并通过测序确认缺失。
在特定实例中，pTx质粒包含IGF-1X6(即，pTx-IGF-1X6)或IGF-1X10(即，pTx-IGF-1X10)。例如，pTx-1X10(SEQ ID NOs：27)通过在从5'向ClaI酶及从在3'向Sal1酶切割的pTx连接IGF-1X10来生成pTx-1X10(SEQ ID NO：27)。
3.2.4.病毒载体
在另一实例中，本发明所属技术领域中的多种病毒载体可用于传递并表达本发明的1个以上的胰岛素样生长因子1异构体。例如，可使用逆转录病毒(retroviruses)、慢病毒(lentiviruses)、腺病毒(adenoviruses)或腺相关病毒(adeno-associated viruses)开发的载体可用于本发明的一部分实例中。
(a)逆转录病毒
可转运携带相对较大的外源基因的逆转录病毒已被用作病毒基因传递载体，因为它们将其基因组整合到宿主基因组中并具有广泛的宿主谱。
本发明的多核苷酸(例如，一个以上的胰岛素样生长因子1异构体的编码序列)为了生成符合缺陷病毒，代替一种病毒序列，向病毒基因组插入来构建逆转录病毒载体。构建虽然包含gag、pol及env基因，但并不包含LTR(长末端重复)及W成分的包装(packaging)细胞株，从而生成病毒颗粒(virion)(Mann et al.，Cell，33：153-159(1983))。当向细胞株导入包含本发明的多核苷酸、长末端重复及W的重组质粒时，W序列将成重组质粒的RNA转录组包装成病毒粒子之后，向培养基分泌(Nicolas and Rubinstein“Retroviral vectors,”In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors and their uses，Rodriguez andDenhardt(eds.)，Stoneham：Butterworth，494-513(1988))。收集包含重组逆转录病毒的培养基之后，并选择性地浓缩并用于基因传递。
已经报道了使用第二代病毒载体的成功的基因传递。Kasahara et al.(Science，266：1373-1376(1994))构建了莫洛尼(moloney)小鼠白血病病毒的变异体，其中插入了EPO(促红细胞生成素)序列而不是包膜(envelope)位点，并生成具有新的结合特性的嵌合蛋白。类似地，可以根据对于第二代逆转录病毒载体的构建策略来构建本基因传递系统。
(b)慢病毒
慢病毒可用于本发明的一部分实例。慢病毒逆转录病毒的的子类。但是，慢病毒可以整合到非分裂细胞的基因组中，而逆转录病毒只能被分裂细胞感染。
慢病毒载体从通过几种质粒转化的包装细胞株生成，通常从HEK293转化。质粒包含(1)编码如壳体(capsid)及逆转录酶的病毒颗粒蛋白质的包装质粒以及(2)含有外源基因的质粒(例如，一个以上的IGF-1异构体的编码序列)来向靶传递。
若病毒向细胞投入，则RNA形态的病毒基因组逆转录来生成脱氧核糖核酸，之后，通过病毒整合酶(integrase enzyme)向基因组内插入。因此，与慢病毒一同传递的外源因素可留在基因组内，当细胞分裂时向细胞的后代传递。
(c)腺病毒
腺病毒因其中等大小的基因组、易于操作、高滴度、广泛的靶细胞范围及高的感染性而被普遍用作基因传递系统。病毒基因的两侧末端包含作为用于病毒脱氧核糖核酸复制及包装而需要的cis-要素的100至200bp的ITRs(逆末端重复)。El位点(ElA及ElB)编码负责病毒基因组及几种细胞基因的转录调节的蛋白质。E2位点(E2A及E2B)的表达导致用于病毒脱氧核糖核酸复制的蛋白质的合成。
在迄今为止开发的腺病毒载体中，通常使用其中E1位点缺失的复制缺陷型腺病毒。腺病毒载体的缺失的E3位点可提供用于转基因(transgene)的插入位点(Thimmappaya，B.et al.，Cell，31：543-551(1982)；及Riordan，J.R.et al.，Science，245：1066-1073(1989))。因此，优选地，核心蛋白聚糖，即，编码核苷酸序列向缺失的E1区(E1A区和/或E1B5区，优选地，E1B区)或缺失的E3区插入。本发明的多核苷酸可向缺失的E4区域插入。术语“缺失(deletion)”还包括相对于病毒基因组序列的全部和部分缺失。在自然界中，腺病毒可以包装约105％的野生型基因组，并提供约2kb的额外脱氧核糖核酸容量(Ghosh-Choudhuryet al.，EMBO J.6：1733-1 739(1987))。与此相关地，向腺病毒插入的上述外源序列可以向腺病毒野生型基因组追加插入。
腺病毒可以是任何已知的血清型(serotype)或A至F亚型。C亚型的5型腺病毒是在本发明中构建腺病毒基因传递系统的最优选的起始物质。关于5型腺病毒的许多生化和遗传信息已公知。通过腺病毒基因传递系统传递的外源基因对宿主细胞是游离型(episomal)及遗传毒性。因此，利用腺病毒基因传递系统的基因治疗实质上安全。
(d)腺相关病毒(AAV)
腺相关病毒可感染非分裂细胞及各种类型的细胞，因此，可用于构建本发明的基因传递系统。对于腺相关病毒载体的使用和准备的详细说明可以在美国专利号10,308,958；10,301,650；10,301,648；10,266,846；10,265,417；10,208,107；10,167,454；10,155,931；10,149,873；10,144,770；10,138,295；10,137,176；10,113,182；10,041,090；9,890,365；9,790,472；9,770,011；9,738,688；9,737,618；9,719,106；9,677,089；9,617,561；9,597,363；9,593,346；9,587,250；9,567,607；9,493,788；9,382,551；9,359,618；9,217,159；9,206,238；9,163,260；9,133,483；8,962,332中查询，其全部内容通过引用结合在本申请中，5,139,941及4,797,368、其全部内容通过引用结合在本申请中。
通过基因传递系统研究腺相关病毒的结果揭示在LaFace et al.，Viology，162：483486(1988)，Zhou et al.，Exp.Hematol.(NY)，21：928-933(1993)，Walsh et al.，J.Clin.Invest.，94：1440-1448(1994)及Flotte et al.，Gene Therapy，2：29-37(1995)。典型地，重组腺相关病毒通过通知转染包含侧面存在2个腺相关病毒通末端重复的(McLaughlin et al.，1988；Samulski et al.，1989)目标基因(即，传递的目标核苷酸序列，例如，胰岛素样生长因子1异构体的编码序列)的质粒及包含末端没有重复的野生型腺相关病毒编码序列的表达质粒来制备(McCarty et al.，J.Viral.，65：2936-2945(1991))。
(e)其他病毒载体
其他病毒载体可用于本发明中的基因传递系统。从如牛痘病毒(Puhlmann M.etal.，Human Gene Therapy 10：649-657(1999)；Ridgeway，“哺乳类载体”In：载体：调查分子克隆载体及其用途.Rodriguez及Denhardt，eds.Stoneham：Butterworth，467-492(1988)；Baichwal及Sugden，“用于传递从动物脱氧核糖核酸病毒获取的基因的载体：传递的基因的暂时性或稳定性表达”In：Kucherlapati R，ed.基传递.New York：Plenum Press，117-148(1986)及Coupar et al.，Gene，68：1-10(1988))、慢病毒(Wang G.et al.，J.Clin.Invest.104(11)：RS 5-62(1999))及单纯疱疹病毒(Chamber R.，et al.，Proc.Natl.10 15Acad.Sci USA92：1411-1415(1995))的病毒获取的载体可用于向细胞传递本发明的多核苷酸的本传递系统。
4.包含胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的药剂学组合物
在另一实施方式中，提供包含胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体的药剂学组合物。
4.1.符合给药的药剂学组合物及单位给药剂型
为了静脉、肌肉、皮肤内或皮下给药，可以将脱氧核糖核酸构建体配制成可接受非口服的水溶液，其不含热原且具有适当的pH、等渗性(isotonicity)及稳定性。例如，本发明所属技术领域的普通技术人员可使用如氯化钠注射液、林格注射液和乳酸林格注射液的等渗载体，根据需要，可使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂来制备适当的溶液。
在一部分实例中，药剂学组合物包含编码1个胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体。例如，脱氧核糖核酸构建体可表达I类，Ec异构体(异构体#1)；II类，Ea异构体(异构体#2)；I类，Eb异构体(异构体#3)；或I类，Ea异构体(异构体#4)。
在一部分实例中，药剂学组合物包含一个以上的脱氧核糖核酸构建体，编码大于一个的胰岛素样生长因子1异构体。例如，药剂学组合物可包含(i)编码I类，Ec异构体(异构体#1)的第一脱氧核糖核酸构建体及编码II类，Ea异构体(异构体#2)的第二脱氧核糖核酸构建体；(ii)编码I类，Ec异构体(异构体#1)的第一脱氧核糖核酸构建体及编码I类，Eb异构体(异构体#3)的第二脱氧核糖核酸构建体；(iii)编码I类，Ec异构体(异构体#1)的第一脱氧核糖核酸构建体及编码I类，Ea异构体(异构体#4)的第二脱氧核糖核酸构建体；(iv)编码II类，Ea异构体(异构体#2)的第一脱氧核糖核酸构建体及编码I类，Eb异构体(异构体#3)的第二脱氧核糖核酸构建体；(v)编码II类，Ea异构体(异构体#2)的第一脱氧核糖核酸构建体及编码I类，Ea异构体(异构体#4)的第二脱氧核糖核酸构建体；以及(vi)编码I类，Eb异构体(异构体#3)的第一脱氧核糖核酸构建体及编码I类，Ea异构体(异构体#4)的第二脱氧核糖核酸构建体。
在一部分实例中，药剂学组合物包含作为可以表达1个以上的胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的双重表达构建体。例如，药剂学组合物可包含能够表达(i)I类，Ec异构体(异构体#1)及II类，Ea异构体(异构体#2)；(ii)I类，Ec异构体(异构体#1)及I类，Eb异构体(异构体#3)；(iii)I类，Ec异构体(异构体#1)及I类，Ea异构体(异构体#4)；(iv)II类，Ea异构体(异构体#2)及I类，Eb异构体(异构体#3)；(v)II类，Ea异构体(异构体#2)及I类，Ea异构体(异构体#4)；(vi)I类，Eb异构体(异构体#3)及I类，Ea异构体(异构体#4)的双重表达构建体。
在一部分实例中，药剂学组合物包含双重表达构建体、pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10。在一部分实例中，药剂学组合物包含双重表达构建体、pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10。在一部分实例中，例如，药剂学组合物包含均具有pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10的2个双重表达构建体。在一部分实例中，例如，药剂学组合物包含均具有pTx-IGF-1X6及pTx-IGF-1X10的2个双重表达构建体。
在一部分实例中，药剂学组合物还包含其他治疗制剂。例如，药剂学组合物还可包含有效治疗神经病变的其他治疗制剂。
在多种实例中，脱氧核糖核酸构建体存在于浓度为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的液体组合物内。在一部分实例中，单位给药剂型为包含浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的2mL的药剂学组合物的小瓶。在一部分实例中，单位给药剂型为包含浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的1mL的药剂学组合物的小瓶。在一部分实例中，单位给药剂型为包含浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的小于1mL的药剂学组合物的小瓶。
在一部分实例中，单位给药剂型为小瓶(vial)、安瓿瓶(ampule)、瓶(bottle)或预先填充的注射器(pre-filled syringe)。在一部分实例中，单位给药剂型包含本发明的脱氧核糖核酸构建体的0.01mg、0.1mg、0.2mg、0.25mg、0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、8mg、10mg、12.5mg、16mg、24mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg或200mg。
在一部分实例中，在单位给药剂型中的药剂学组合物为液体剂型。在多种实例中，单位给药剂型包含0.1mL至50mL的药剂学组合物。在一部分实例中，单位给药剂型包含0.25mL、0.5mL、1mL、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL、25mL或50mL的药剂学组合物。
在特定实例中，单位给药剂型为包含包括预先填充的注射器、自动注射器及自动注射笔的符合皮下、皮肤内或肌肉的单位给药剂型实例中的药剂学组合物的0.5ml、1ml、1.5ml或2ml的小瓶，包含上述本发明中记载的药剂学组合物的预先确定的量。
在多种实例中，单位给药剂型为注射器及包含预先确定的量的药剂学组合物的预先填充的注射器。在特定预先填充的注射器实例中，注射器符合皮下给药。在特定实例中，注射器符合自我给药。在特定实例中，预先填充的注射器为一次性注射器。
在多种实例中，预先填充的注射器包含约为0.1mL至0.5mL的药剂学组合物。在特定实例中，注射器包含约为0.5mL的药剂学组合物。在特定实例中，注射器包含约为1.0mL的药剂学组合物。在特定实例中，注射器包含约为2.0mL的药剂学组合物。
在特定实例中，单位给药剂型为自动注射笔。如上所述，自动注射笔包括包含药剂学组合物的自动注射笔。在一部分实例中，自动注射笔传递预先确定容量的药剂学组合物。在另一实例中，自动注射笔传递由使用人员设定的体积的药剂学组合物。
在多种实例中，自动注射笔包含约为0.1mL至0.5mL的药剂学组合物。在特定实例中，自动注射笔包含约为0.5mL的药剂学组合物。在特定实例中，自动注射笔包含约为0.1mL的药剂学组合物。在另一实例中，自动注射笔包含约为5.0mL的药剂学组合物。
4.2.冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型
在一部分实例中，本发明的脱氧核糖核酸构建体被剂型化成冷冻干燥的组合物。在特定实例中，如美国专利号8,389,492中所记载，脱氧核糖核酸构建体被冷冻干燥，其全部内容通过引用结合在本申请中。
在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体在冷冻干燥之前，与特定赋型剂，例如，碳水化合物及盐一同被剂型化。作为诊断或治疗制剂使用的脱氧核糖核酸构建体的稳定性因在与包含稳定的量的碳水化合物的水溶性溶液一同冷冻干燥之前，将脱氧核糖核酸构建体剂型化，从而可以增加。
在一部分实例中，组合物中使用了不同的碳水化合物。碳水化合物可以为如蔗糖(sucrose)、葡萄糖(glucose)、乳糖(lactose)、海藻糖(trehalose)、阿拉伯糖(arabinose)、戊糖(pentose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、半乳糖(galactose)、己糖(hexose)、偶糖(idose)、甘露糖(mannose)、塔洛糖(talose)、庚糖(heptose)、果糖(fructose)、葡萄糖酸(gluconic acid)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露糖醇(mannitol)、甲基α-吡喃葡萄糖苷(methyl a-glucopyranoside)、麦芽糖(maltose)、异抗坏血酸(isoascorbic acid)、内酯(lactone)、山梨糖(sorbose)、葡糖二酸(glucaric acid)、赤藓糖(erythrose)、苏糖(threose)、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、赤藓糖(erythrulose)、核糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)、阿胶(psicose)、塔格糖(tagatose)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid)、半乳糖醛酸(galacturonic acid)、甘露糖醛酸(mannuronic acid)、葡萄糖胺(glucosamine)、半乳糖胺(galactosamine)、神经氨酸(neuraminic acid)、阿拉伯聚糖(arabinans)、果聚糖(fructans)、岩藻糖(fucans)、半乳聚糖(galactans)、半乳糖醛酸(galacturonans)、葡聚糖(glucans)、甘露聚糖(mannans)、木聚糖(xylans)、莱万(levan)、褐藻糖胶(fucoidan)、角叉菜胶(carrageenan)、半乳糖醛糖(galactocarolose)、果胶(pectins)、果胶酸(pectic acids)、直链淀粉(amylose)、普鲁兰多糖(pullulan)、糖原(glycogen)、支链淀粉(amylopectin)、纤维素(cellulose)、右旋糖酐(dextran)、环糊精(cyclodextrin)、石耳多糖(pustulan)、壳多糖(chitin)、琼脂糖(agarose)、角蛋白(keratin)、软骨素(chondroitin)、皮肤素(dermatan)、透明质酸(hyaluronic acid)、海藻酸(alginic acid)、黄原胶(xantham gum)或淀粉(starch)的单糖、寡糖或多糖(polysaccharide)。
在一系列实例中，碳水化合物是甘露醇和蔗糖。
冷冻干燥前的碳水化合物溶液可以与水中的碳水化合物对应或包含缓冲液。这种缓冲液的例示包含临时酸盐缓冲盐水(PBS)、HEPES、TRIS或TRIS/EDTA。典型地，碳水化合物溶液按约为0.05％至约为30％蔗糖，典型地，0.1％至约为15％蔗糖，如0.2％至约为5％，10％或15％蔗糖，优选地，约为0.5％至10％的蔗糖、1％至5％蔗糖、1％至3％蔗糖，最优选地，约为1.1％蔗糖的最终浓度与脱氧核糖核酸构建体相结合。
本发明的脱氧核糖核酸剂型还可包含盐，例如，氯化钠或氯化钾。在一部分实例中，盐为氯化钠。在一部分实例中，脱氧核糖核酸剂型的盐按选自由约为0.001％至约为10％、约为0.1％至5％、约为0.1％至4％、约为0.5％至2％、约为0.8％至1.5％、约为0.8％至1.2％w/v组成的组中的量存在。在特定实例中，脱氧核糖核酸剂型的盐存在约为0.9％w/v的量。
从冷冻干燥的剂型再溶解的液体组合物内的脱氧核糖核酸构建体的最终浓度可以为约为1ng/mL至约为30mg/ml。例如，最终浓度可以为约为1ng/mL、约为5ng/mL、约为10ng/mL、约为50ng/mL、约为100ng/mL、约为200ng/mL、约为500ng/mL、约为1μg/mL、约为5μg/mL、约为10μg/mL、约为50μg/mL、约为100μg/mL、约为200μg/mL、约为400μg mL、约为500μg/mL、约为600μg/mL、约为800μg/mL、约为1mg/ml、约为2mg/ml、约为2.5mg/ml、约为3mg/ml、约为3.5mg/ml、约为4mg/ml、约为4.5mg/ml、约为5mg/ml、约为5.5mg/ml、约为6mg/ml、约为7mg/ml、约为8mg/ml、约为9mg/ml、约为10mg/ml、约为20mg/ml或约为30mg/ml。
本发明的脱氧核糖核酸剂型在本发明所属技术领域的标准条件下冷冻干燥。用于本发明的脱氧核糖核酸剂型的冷冻干燥的方法可包括：步骤(a)，将装有质粒脱氧核糖核酸包含IGF-1基因或其变异体的脱氧核糖核酸剂型(例如，包含质粒脱氧核糖核酸的脱氧核糖核酸剂型)、盐及碳水化合物的容器(例如，小瓶)装载于冷冻干燥器，冷冻干燥器具有约为5℃至约为-50℃的起始温度；步骤(b)，将脱氧核糖核酸剂型冷却至零下的温度(例如，-10℃至-50℃)；以及步骤(c)，实质上干燥脱氧核糖核酸剂型的步骤。用于本发明的脱氧核糖核酸剂型的冷冻干燥的条件(例如，温度及时间)可以由本发明所属技术领域的普通技术人员考虑对冷冻干燥每个变数(例如，冷冻干燥机械的类型、所使用的脱氧核糖核酸的量及所使用的容器的尺寸)产生影响的因素来调解。
装有冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型的容器之后被密封，在多种温度条件下可以长时间储存(例如，室温至约为-180℃，优选地，约为2-8℃至约为-80℃，更优选地，约为-20℃至约为-80℃，最优选地，约为-20℃)。在特定实施方式中，冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型在约为2-8℃至约为-80℃的范围内不会丧失实际活性，最少在6个月内优选地稳定。质粒脱氧核糖核酸剂型的稳定储存与如研究或基于质粒的治疗的在使用之前，长时间以稳定的形态储存质粒脱氧核糖核酸相同。储存时间可以为几个月、1年、5年、10年、15年或最长20年。优选地，准备的剂型最少稳定约为3年。
5.神经病变治疗方法
在另一实施方式中，揭示给药编码人类胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体来治疗神经病变的方法。
6.5.1.给药编码异构体的脱氧核糖核酸构建体
方法包括向对象给药治疗有效的量的人类表达胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的步骤。对象可以为患有神经病变的人或动物。
在一部分实例中，方法包括给药编码1个人类胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的步骤。在一部分实例中，方法包括给药编码人类胰岛素样生长因子1异构体的第一脱氧核糖核酸构建体的步骤或给药编码人类胰岛素样生长因子1异构体的第二脱氧核糖核酸构建体的步骤。在一部分实例中，方法包括给药编码第一人类胰岛素样生长因子1异构体的第一脱氧核糖核酸构建体的步骤及给药编码第二人类胰岛素样生长因子1异构体的第二脱氧核糖核酸构建体的步骤。在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1异构体为I类，Ec(异构体#1)，第二胰岛素样生长因子1异构体为I类，Ea(异构体#4)。在一部分实例中，第一胰岛素样生长因子1异构体为I类，Ea(异构体#4)，第二胰岛素样生长因子1异构体为I类，Ec(异构体#1)。第一脱氧核糖核酸构建体及第二脱氧核糖核酸构建体可以同时或依次给药。
在一部分实例中，方法包括给药编码作为双重表达构建体的大于一个的人类胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的步骤。在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体均可表达I类，Ec(异构体#1)及I类，Ea异构体s(异构体#4)。在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体追加表达I类，Eb或II类，Ea。在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体无法表达I类，Eb或I类I，Ea。在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体可以表达，但是无法表达任意其他胰岛素样生长因子1异构体。
在一部分实例中，方法包括给药编码包含如下物质的人类胰岛素样生长因子1的脱氧核糖核酸构建体的步骤：具有如人类胰岛素样生长因子1基因的外显子1，3及4(序列1)的序列的第一多核苷酸或其的简并；具有如人类胰岛素样生长因子1基因的内含子4(序列2)的序列的第二多核苷酸或其的片段；具有如人类胰岛素样生长因子1基因的外显子5及6-1(序列3)的序列的第三多核苷酸或其的简并；具有如人类胰岛素样生长因子1基因的内含子5(序列4)的序列的第四多核苷酸或其的片段；以及具有如人类胰岛素样生长因子1基因的外显子6-2(序列5)的序列的第五多核苷酸或其的简并，其中，第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸、第四多核苷酸及第五多核苷酸按从5’向3’的顺序依次连接。
在一部分实例中，方法包括给药pCK-IGF-1X6或pCK-IGF-1X10的步骤。在一部分实例中，方法包括给药pTx-IGF-1X6或pTx-IGF-1X10的步骤。
在一部分实例中，方法包括给药本发明中所提供的1个以上的脱氧核糖核酸构建体的步骤。
5.1.1.传递方法
多种传递方法可用于给药表达IGF-1的1个以上的异构体的脱氧核糖核酸构建体。
5.1.1.1.注射(Injection)
在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体通过液体药剂学组合物的注射给药。
在当前优选实施例中，脱氧核糖核酸构建体通过肌肉注射给药。通常，脱氧核糖核酸构建体以接近神经损伤位点、疼痛部位或患者识别的疼痛部位或神经性疾病的其他症状的部位的方式通过肌肉注射给药。在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体向对象的手、脚、腿、胳膊的肌肉给药。
在一部分实例中，向皮下或皮肤内注射构建体。
在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体通过静脉传递给药。在特定实例中，构建体通过逆行(retrograde)静脉注射给药。
5.1.1.2.电穿孔(Electroporation)
在一部分情况下，向质粒脱氧核糖核酸的生物体内细胞的转化效率可以在注射后执行电穿孔来改善。因此，在一部分实例中，脱氧核糖核酸构建体在注射后通过电穿孔给药。在特定实例中，电穿孔使用TriGridTM传递系统(Ichor Medical Systems，Inc.，美国圣地亚哥)给药。
5.1.1.3.声孔效应(Sonoporation)
在一部分实例中，使用声孔效应来强化本发明的脱氧核糖核酸构建体的转化效率。声孔效应使用超声波暂时渗透细胞膜，以允许吸收脱氧核糖核酸的细胞。可以将脱氧核糖核酸构建体整合到微泡中，并通过全身循环给药之后，可向外部施加超声波。超声波在靶组织内诱导微泡的气蚀(cavitation)来导致构建体的释放及转染。
5.1.1.4.磁转染(Magnetofection)
在一部分实例中，使用磁转染来强化本发明脱氧核糖核酸构建体的转染效率。构建体与带有磁性的纳米粒子相结合之后给药。高梯度(high gradient)外部磁体的适用导致复合物被捕获并固定在靶上。脱氧核糖核酸构建体可以通过交联分子的酶切、电荷相互作用或底物的降解来释放。
5.1.1.5.脂质体(Liposome)
在一部分实例中，本发明的脱氧核糖核酸构建体可通过脂质体传递。当磷脂悬浮在过量的水溶性介质中时，脂质体会自发形成。如在Dos Santos Rodrigues et al.，Int.J.Pharm.566：717-730(2019)；Rasoulianboroujeni et al.，Mater Sci Eng C MaterBiol Appl.75：191-197(2017)；Xiong et al.，Pharmazie 66(3)：158-164(2011)；Nicolauand Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190(1982)及Nicolau et al.，MethodsEnzymol.，149：157-176(1987)中记述，脂质体介质脱氧核糖核酸传递成功进行。使用脂质体来转染动物细胞的可商购获得的制剂的例包括脂质转染胺(Lipofectamine(GibcoBRL))。捕获本发明的脱氧核糖核酸构建体的脂质体通过如内吞(endocytosis)、吸附(adsorption)和融合(fusion)的机制与细胞相互作用之后，向细胞传递序列。
5.1.1.6.转染(Transfection)
当为了传递编码IGF-1的脱氧核糖核酸构建体而使用病毒载体时，构建体可通过本发明所属技术领域的多种病毒感染方法向细胞内传递。使用病毒载体的宿主细胞的感染已记述在上述提及的引用文献。
优选地，本发明的药剂学组合物可以非口服给药。在非口服给药的情况下，可使用静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射或局部注射等。例如，药剂学组合物可通过逆行静脉注射给药。
优选地，本发明的药剂学组合物可以肌肉给药。在一部分实例中，给药针对受到神经病变的影响的肌肉(例如，神经性疼痛或其他症状)。
5.1.2.剂量(Dose)
脱氧核糖核酸构建体可按治疗有效的剂量给药。在本发明中记述的方法中，治疗有效的剂量为有效治疗对象的神经病变的剂量。
在本发明中记述的方法的一部分实施例中，脱氧核糖核酸构建体按1μg至200mg、1mg至200mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至20mg、5mg至10mg、16mg、8mg或4mg的总剂量给药。在典型的实例中，总剂量为分为多个个别注射疾病。在一部分实例中，总剂量分为多个相同注射剂量。在一部分实例中，总剂量分为不同的注射剂量。
在多种划分的剂量实例中，总剂量向4、8、16、24、32或64的不同注射位点给药。
在一部分实例中，每个注射剂量为0.1mg至20mg、1mg至10mg、2mg至8mg或3mg至8mg。在特定实例中，每个注射剂量为0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、1mg、2mg、4mg、8mg、16mg或32mg。
总剂量可以在一次或一次以上的访问期间给药。
在典型的划分的剂量实例中，多个注射剂量在1小时内给药。在一部分实例中，多个注射剂量在1.5、2、2.5或3小时内给药。
在方法的多种实例中，按单一单位的剂量给药或分为多个注射剂量的脱氧核糖核酸构建体的总剂量向对象仅给药一次。
在一部分实例中，经过1次、2次、3次或4次访问向多个注射位点给药总剂量的脱氧核糖核酸构建体可包括单一周期。尤其，经过2次访问向多个注射位点给药64mg、32mg、16mg、8mg或4mg的脱氧核糖核酸构建体可包括单一周期。2次访问可为3、5、7、14、21或28日的间隔。
在一部分实例中，周期可以重复。周期可以重复2次、3次、4次、5次、6次或其以上。
在一部分实例中，周期可以在之前的周期后重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或其以上。
在一部分实例中，在之后的周期给药的总剂量与在之前的周期给药的总剂量相同。在一部分实例中，在之后的周期给药的总剂量与在之前的周期给药的总剂量不同。
在当前的优选实例中，脱氧核糖核酸构建体在每个受到影响的四肢按8mg的剂量给药，通过多个肌肉注射及多次访问均等地分割，其中，在任意单一访问中的各个注射在分离的注射位点中执行。在特定实例中，脱氧核糖核酸构建体在每个受到影响的四肢按8mg的剂量给药，在0日，在每个四肢按4mg的第一剂量均等地分成以及在14日，在每个四肢按4mg的第二剂量均等地分割，其中，第一及第二剂量的按多个注射剂量均等地分割。在一部分实例中，在受到影响的每个四肢按8mg的剂量给药脱氧核糖核酸构建体构成1次周期。周期可以重复1次、2次、3次或其以上。
给药的实际量及给药速度及时间可根据治疗的神经病变的特性及重症程度改变。在典型的实例中，脱氧核糖核酸构建体按减少神经病变的症状，例如，减少神经性疼痛的有效的量给药。在一部分实例中，上述量在给药的1周以内有效地减少神经病变的症状。在一部分实例中，上述量在给药的2周、3周或4周以内有效地减少神经病变的症状。
在一部分实例中，构建体的2个不同类型一同给药来诱导IGF-1的2个异构体的表达。例如，编码I类，Ec异构体的第一构建体及编码I类，Ea异构体的第二构建体。在一部分实例中，均编码I类，Ec异构体及I类，Ea异构体的双重表达构建体传递来诱导两个异构体的表达。
根据本发明所属技术领域现有技术，如上所述，药物组合物可以与药学上可接受的载体和/或载体一同被剂型化，最后，提供多种形态的单位给药剂型及多重给药剂型。剂型的非限定性例包括油或水溶性介质中的悬浮液或乳剂、提取物，酏剂、粉末、颗粒，片剂及胶囊剂，但并不局限于此，还可包括分散制剂或稳定剂。
5.1.3.变形(Variations)
可以选择性地使用生物体内和/或试验管内试验法，以帮助确认最优的给药范围。用于剂型的准确的剂量可根据给药路径及状态的严重性改变，需要根据专家的判断及各个对象的情况确定。有效的剂量可以从在试验管内或动物模型试验系统中获取的剂量-反应曲线中，通过外推法(extrapolation)推定。
脱氧核糖核酸构建体可以单独或与其他治疗组合来同时或依次给药。
5.2.神经病变患者
在本发明中记述的方法中，为了治疗而选择的患者患有神经病变。患者可患有末梢神经病变、颅神经病变、自主神经病变或局部神经病变。神经病变有可能因疾病、受伤、感染或维生素缺乏引起。例如，神经病变有可能因糖尿病、维生素缺乏症、自身免疫性疾病、遗传或遗传性疾病、淀粉样变性、尿毒症、毒素或中毒、外伤或受伤、肿瘤引起，也可以为特发性(idiopathic)疾病。在一部分实例中，患者患有糖尿病性末梢神经病变。
患者可能会患有如疼痛(神经性疼痛)、其他感觉缺陷(例如，感觉丧失、麻木、刺痛等)、运动缺陷(例如，虚弱、反射丧失、肌肉质量丧失、抽搐、灵活性下降等)以及自主神经功能障碍(例如，恶心、呕吐、阳痿、头晕、便秘、腹泻等)等的与神经疾病有关的1个以上的症状。
除本文提供的治疗方法外，患者还可通过本发明所属技术领域公知的1个以上的治疗方法进行治疗。
本发明的治疗方法可用于治疗患有神经疾病的人类患者或动物。
实施例
向本发明所属技术领域的普通技术人员提供对于在以下的实施例中揭示来形成本发明并使用的方法的完整的揭示及说明，而并非是限定本发明人员认为是自己的发明的范围、以下执行的实验并非为所有或唯一的试验。与所使用的数字(例如，量、温度等)相关地，努力保障了准确性，但还需要考虑一部分实验性错误及偏差。只要并未明确表示，部分为重量份(parts by weight)，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。标准缩略语可以如下，例如，bp，碱基对(s)、kb，千基(s)；pl，皮升(s)；s或sec，秒钟(s)；min，分钟(s)；h或hr，小时(s)；aa，氨基酸(s)；nt，核苷酸(s)等。
只要并未明确示出，本发明的执行可使用蛋白质化学、生物化学、重组脱氧核糖核酸技术及药理学的通常方法。
实施例1：
编码胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体在小鼠慢性压迫性神经损伤模型中减少了机械性触诱发痛。
编码个别人类胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体使用标准分子克隆技术来构建在表达质粒pCK。
具体地，通过由Bioneer(韩国)提供的定制脱氧核糖核酸合成工序获得4个多核苷酸(SEQ ID NOS：15、17、19及21)。上述多核苷酸通过5’交联剂，Cla I及3’交联剂，Sal I合成。pCK载体及多核苷酸被限定(restriction)为Cla I及Sal I。编码I类，Ec(异构体#1)的质粒#1通过插入序列17的多核苷酸来生成，这是I类，Ec异构体的编码序列，在pCK载体的编码位点包含IGF-1基因的外显子1、3/4、5及6的至少一部分。编码II类，Ea(异构体#2)的质粒#2插入序列19的多核苷酸来生成，这是II类，Ea异构体的编码序列，在pCK载体的克隆位点包含IGF-1基因的外显子2、3/4及6的至少一部分。编码I类，Eb(异构体#3)的质粒#3插入序列21的多核苷酸来生成，这是I类，Eb异构体的编码序列，在pCK载体的克隆位点包含IGF-1基因的外显子1、3/4及5的至少一部分。编码I类，Ea(异构体#4)的质粒#4插入序列15的多核苷酸来生成，在pCK载体的克隆位置包含外显子1、3/4及6的至少一部分。
从各个质粒的各个胰岛素样生长因子1异构体的表达均在试验管内及生物体内测试并确认。
脱氧核糖核酸构建体的治疗效果之后在慢性压迫性神经损伤小鼠中测试，其模型为研究神经病变的广泛使用的模型。通过坐骨神经的慢性压迫性神经损伤(CCI)生成的慢性压迫性神经损伤小鼠模型表示对末梢神经带来慢性神经损伤的多个过程。慢性压迫性神经损伤小鼠也患有神经性疼痛。根据首尔大学(Seoul National University)动物保护与使用委员会(Institutional Animal Care and Use committee)的批准的手术及实验步骤，在成年雄性ICR小鼠(体重为24g至26g)中执行了慢性压迫性神经损伤手术。
尤其，在麻醉下实施约为1cm长的钝(blunt)切口，从而露出一般位于臀肌(gluteus)及股二头肌(biceps femoris)之间的右侧坐骨神经。若露出与三分叉病变(trifurcation)部位相邻的坐骨神经，则使用6-0丝线(Ethicon)缝合线(suture)来以0.5mm的间隔给其3个松散的结扎线(ligature)。稍微收紧结扎线，直到右后肢明显抽搐。假手术(sham-operated)小鼠在右大腿处接受了相同的切口，但未结扎坐骨神经。
如图2a所示，总200μg的质粒脱氧核糖核酸在进行慢性压迫性神经损伤手术当日向肌肉注射。所注射的质粒脱氧核糖核酸为200ug的pCK(没有插入的载体；“pCK”)或200ug的pCK-IGF-1。例如，(i)200μg的质粒#1(编码I类，Ec IGF-1的“IGF-1#1”)；(ii)200μg的质粒#4(编码I类，EaIGF-1的“IGF-1#4”)或100μg的(iii)质粒#1(编码I类，Ec IGF-1的“IGF-1#1”)及100μg的质粒#4(编码“IGF-1#4”encoding I类，EaIGF-1的“IGF-1#4”)。
在进行慢性压迫性神经损伤手术1周之后，机械性触诱发痛的发生使用冯弗雷的细丝测试评价了机械性触诱发痛的发生。简单地，将动物分别放在金属网底板的顶部的气缸以使动物适应。通过使用恒定厚度的细丝(0.16g)刺激后爪来评价小小鼠的机械灵敏性。测试之后每周重复进行。结果表明，与单独使用载体相比，注射表达IGF-1I类Ec的IGF-1#1可降低缩脚频率。
图2b为概述图2a所示的慢性压迫性神经损伤实验中测定的缩脚的频率(％)的直方图。结果表明，(i)与单独使用载体相比，注射表达IGF-1Class I Ec的IGF-1#1可降低缩脚频率；(ii)注射表达IGF-1Class I Ea的IGF-1#4也可降低缩脚频率；以及(iii)与单独使用载体相比，注射同时表达IGF-1I类Ec(IGF-1#1)及I类Ea(IGF-1#4)的脱氧核糖核酸构建体进一步、统计学上显著地减少缩脚频率。
所有值通过3次独立的实验，通过平均±标准误差平均(SEM)表示。值之间的差异通过单向方差分析(one-way ANOVA)、Tukey事后测试(Tukey’s post-hoc test)或Bonferroni多重比较测试确定。
实施例2：
脱氧核糖核酸构建体均可表达IGF-1I类Ec及I类Ea异构体。
表达IGF-1I类Ec(IGF-1#1)的脱氧核糖核酸构建体及表达I类Ea(IGF-1#4)的另一个脱氧核糖核酸构建体在上述记述的行动实验中，对机械性触诱发痛产生更明显且统计学显著地影响，因此，通过核糖核酸转录组的选择性剪接核糖核酸构建了以同时表达IGF-1I类Ec(IGF-1#1)及I类Ea(IGF-1#4)的方式设计的多个质粒。尤其，脱氧核糖核酸构建体包含外显子1、3/4、5及6及IGF-1基因的内含子或对于它们的片段的序列。生成包含其他变异体的多个脱氧核糖核酸构建体，进行对于它们能力的测试，从而均表达IGF-1I类Ec异构体及I类Ea异构体。
各个质粒包含以可操作的方式与pCK表达调节序列连接的插入体的方式使用pCK作为质粒主链来构建。插入体通过连接以下物质来生成。(1)编码人类胰岛素样生长因子1外显子1，3及4(序列1)的第一多核苷酸；(2)第二多核苷酸，IGF-1内含子4(序列2)或其的片段中的一个；(3)编码外显子5及6-1(序列3)的第三多核苷酸；(4)第四多核苷酸,内含子5(序列4)或其的片段中的一个；以及(5)编码外显子6-2(序列5)的第五多核苷酸，其中，第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸、第四多核苷酸及第五多核苷酸按从5’向3’的顺序依次连接。质粒的内含子4和/或内含子5的片段的大小不同。具体地，序列6提供在载体pCK-IGF-1X6中使用的内含子4片段的核苷酸序列，序列7提供在载体pCK-IGF-1-X10中使用的内含子4片段的核苷酸序列。序列8提供在载体pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10中使用的内含子5片段的核苷酸序列。
在生物体内，为了从多种构建体测试异构体1(I类，Ec)及异构体4(I类，Ea)的表达，向9周雄性小鼠C57BL/6周雄性小鼠的T.A.(胫前肌(tibialis anterior))注射50μg的质粒。它们的胫前肌在注射5日轴被采取。上述胫前肌之后使用聚丙烯杵(Bel-ArtScienceware)来在包含含有蛋白酶抑制剂、去磷酸化抑制剂混合物(Roche DiagnosticLtd.)及PMSF(Sigma)的溶解缓冲液中均质化。样品在4℃的温度条件下，通过12000rom进行离心分离15分钟，包含总蛋白质的上层液按制造商的方案中所揭示的内容用于人类胰岛素样生长因子1ELISA(R&D Systems)。所检测的IGF-1的水平通过BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo，美国伊利诺伊州)测定来将源自组织的蛋白质提取物的总量标准化(normalization)。实验步骤在图3a中概述。
如图3b所示，在小鼠T.A肌肉中，人类胰岛素样生长因子1蛋白质的总表达水平通过ELISA确定。与小鼠是否接受50ug的表达单一异构体(“1”(I类，Ec)或“4”(I类，Ea))的构建体、25ug的表达异构体#1(I类，Ec)的第一构建体以及25ug(“1+4”)的表达异构体#4(I类，Ea)的第二构建体或50μg的表达两个异构体的构建体pCK-IGF-1X6(“X6”)或pCK-IGF-1X10(“X10”)无关，人类胰岛素样生长因子1蛋白质的总表达水平类似。
使用RT-PCR来确认构建体是否同时表达对于异构体#1及异构体#4的成熟的(mature)转录组。RT-PCR反应通过附着在外显子3/4的正向/左侧引物(L)及附着在外显子6的反向/右侧引物(R)执行。如图3c所示，对于异构体#1(I类，Ec)的转录组的RT-PCR生成两种扩增子，例如，178bp扩增子及259bp扩增子，相反，对于异构体#4(I类，Ea)的转录组的RT-PCR生成129bp的单一扩增子。
为了执行RT-PCR而收集胫前肌，使用聚丙烯杵(Bel-Art Scienceware)来机械均质化，使用RNAiso plus(Takara)来提取。核糖核酸定量使用nanodrop设备来执行。使用相同量的核糖核酸来通过Reverse Transcriptase XL(AMV)(Takara)合成cDNA，PCR使用图3c所示的前方(TGA TCT AAG GAG GCT GGA(序列28))及后方(CTA CTT GCG TTC TTC AAA TG(序列29))引物来执行。
如图3d所示，pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10表达了对于异构体#1(178bp及259bp条带)及异构体#4(129bp条带)的成熟的转录组。对于异构体#1及异构体#4的成熟的转录组的表达未在除pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10之外的构建体中检测到，本发明中未提供与此有关的数据。
为了确认2个异构体转录组均有效地翻译成蛋白质，如图4a所示，将pCK-IGF-1-X6或pCK-IGF-1-X10转染在293T细胞。为了免疫印迹(immunoblotting)，细胞在质粒脱氧核糖核酸的转染2日(48小时)之后准备，接着，使用包含蛋白酶和去磷酸化抑制剂混合物(RocheDiagnostic Ltd.)的RIPA缓冲液将其溶解。相同量的蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离，并转移到蛋白质膜(PVDF)。膜在含有1％BSA(Invitrogen-Gibco)的TBST(20mM Tris-HCl，pH7.4，0.9％氯化钠及0.1％Tween20)中浸泡1小时，在夜间，被在4℃的温度条件下被浸泡溶液稀释的一抗探针(probe)。为了试验胰岛素样生长因子1异构体1及异构体4的水平而使用的一抗由Abclon(韩国)提供，对于IGF-1和β-肌动蛋白(β-actin)的一抗购自Abcam(英国)和Sigma-Aldrich(美国)。在通过TBST进行洗涤之后，膜在室温条件下，膜与HRP偶联的山羊抗小鼠或兔IgG二抗(Sigma)一同培养(incubation)1小时。之后，用TBST洗涤3次印迹(blot)，并用增强的化学发光系统(Millipore)观察蛋白质条带。β-肌动蛋白被用作上述对照组。
图4b所示的蛋白质免疫印迹(western blotting)数据确认pCK-IGF-1X6及pCK-IGF-1X10均表达蛋白质水平的IGF-1的异构体。
实施例3：
同时表达IGF-1I类Ec异构体及I类Ea异构体的脱氧核糖核酸构建体在小鼠慢性压迫性神经损伤神经病变模型中减少机械性触诱发痛。
使用实施例1中记述的图5a所示的方案，测试了在小鼠慢性压迫性神经损伤神经病变模型中减少机械性触诱发痛的脱氧核糖核酸构建体的能力。
图5b示出缩脚频率，是证明在同时将编码胰岛素样生长因子1异构体(IGF-1#1、IGF-1#4、IGF-1#1+#4、IGF-1X6及IGF-1X10)的构建体肌肉注射后，机械性触诱发痛的统计学显着减少的直方图。尤其，当向小鼠单独给药编码胰岛素样生长因子1异构体#1及#4的构建体或者注射双重表达构建体pCK-IGF-1X10时，在机械性触诱发痛中的效果更卓越。
实施例4：
同时表达IGF-1I类Ec异构体及I类Ea异构体的脱氧核糖核酸构建体在小鼠神经损伤模型中诱导轴突(axon)生长。
脱氧核糖核酸构建体的治疗效果在神经损伤模型中被追加测试。根据首尔大学(Seoul National University)动物保护与使用委员会(Institutional Animal Care andUse committee)的批准的手术及实验步骤，生成成年雄性C57BL/6小鼠(体重为24g至26g)。为了诱导坐骨神经损伤，各个小鼠的右侧坐骨神经通过切口露出，用止血钳(hemostaticforceps)将上述神经损伤15秒钟。切口之后使用5-0黑色缝合线缝合。质粒脱氧核糖核酸200ug(pCK 200ug或pCK-IGF-1X10 200ug)的总量在坐骨神经附近的肌肉神经损伤当日向肌肉给药。
在神经损伤及质粒脱氧核糖核酸注射后的4周(28日)，通过在0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中灌注2％多聚甲醛(paraformaldehyde)+2％戊二醛(glutaraldehyde)来固定小鼠。右侧同侧坐骨神经与之后准备的固定溶液一听追加培养4小时。固定的组织用0.1％磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1％四氧化锇(osmium tetroxide)处理，接着，在夜间，使用2％水溶性乙酸双氧铀(uranyl acetate)进行整体染色。第二天，组织在30％至100％乙醇中连续脱水10分钟，之后，将脱水的组织包埋(embedding)在树脂化合物(resin compound)中。在包埋过程中，样品与Spurr树脂聚合并在干燥箱中培养。之后，将样品切成薄片并使用透射电子显微镜(TEM)进行观察。
图6a提供假手术动物、经pCK处理的动物以及从经pCK-IGF-1X10处理的动物获得的样品。图像明确证明了与假手术动物相比，神经损伤动物同时具有明显的神经损伤以及更小的轴突直径。轴突直径的减少通过pCK-IGF-1X10的给药限制，但无法通过pCK的给药限制。
在轴突生长过程中的pCK-IGF-1X10的效果通过测定神经细胞直径来定量化。图6b提供经pCK(“Crush-pCK”)处理的神经损伤动物及经pCK-IGF-1X10(“Crush-X10”)处理的神经损伤动物中的神经细胞直径的分布。图表明确表示经pCK-IGF-1X10处理的动物具有更大直径的神经细胞。这再次确认了pCK-IGF-1X10可以通过诱导轴突生长来治疗神经损伤。
文献的引用合并
在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请书及其他文件中，各自的个别出版物、专利、专利申请书及其他文件在所有目的作为参照结合在本申请中，与个别显示文件的相同程度，在所有目的其全部内容通过引用结合在本申请中。
等同技术方案(EQUIVALENTS)
例示并说明多种具体实施例，上述说明书并不时限制性。可理解的是，可在不超出(多个)本发明的思想及范围的范围内进行多种变更。若检讨本说明书，则普通技术人员可明确理解多种变形。
序列表
<110> HELIXMITH CO., LTD.
<120> 利用表达胰岛素样生长因子1异构体的脱氧核糖核酸构建体的神经病变的治疗
<130> 33730-38917/US (013US)
<140>
<141>
<150> 62/699,662
<151> 2018-07-17
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 402
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
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ttagcccaag tggccagtca ccttattcag gagatactaa gttctccagc taagacatcc 1980
atgctttggg accagctgca gacagaagcc aattcctact acaaccatca ccttagagta 2040
gcatatagac acagatggct cttcaaagga ccacagttcc atggaataac taagaattca 2100
tgtcctgtgg aaaggtttga ataaactata attataccca atcataaatt tcattcaaga 2160
agaactaaag caaaggcaaa gacagagaga agaaggaagg aaggagggag ggagggaggg 2220
aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaagggaa 2280
ggaagaacaa aaagactttc tagttaaaga atgcttaact agcaaactat gtactataag 2340
acagttcttt tcggaatgag ttttatcaac tctaaagcaa ttatcttgaa tgcctacatg 2400
tgattactga ataatatgaa ccaagaaaac agaaagaatc tatattatct ttccatttcc 2460
ttctttccag tatcaatacc caagcctcta gtgatacatg gcatataatg ttggatggat 2520
ggatggatgg atggatggat ggatggatgg atggatggat gaatggatgg ttggatggac 2580
aaatgagtaa cataggctga tgaatagtgg tagaaagaca caccataaaa acaagtggca 2640
cttctgagat gaaatgattc ctattctcct acacaagaca gtgaggcaag tacagagtaa 2700
aaaaggaaag gcataggagc tatgcttata caagtattgt atgtttggaa tttccttcgc 2760
tggccaaatt gaaattgttc aaggacctat tgctacaggt ggcaactggc taagaatttc 2820
atagtgaata ttatacacct attactcccc ttaatgtttc tttgaagtaa gcagaatatt 2880
aataatcatt taaaattcca gtgtttcaac ttcaattgtt tcctagggca aattgataat 2940
tgtgtgtaaa actaattgga atatgtatgg aataatcatc ctgaaataaa attggtgaaa 3000
agtatttgtt attgggcatc tacaatgtgc aaacctctgt actaggcatg aacaagagtt 3060
ataagcattg gagaggctaa aatatagtcc ttaaggctgg gcacagtggc tcatgcctgt 3120
aatcctagca ctttgggagg ccaaggcggg cagattgcct gagctcagga gttcaagacc 3180
agcctgggca acatagcgaa accccatctc tactaaaaat acaaaaaaat tacctgggca 3240
tggtggcacg cacctgtaat cccagctact caggaggctg aggcatgaga attccttgaa 3300
cctgggaggc agaggttgca gcgagccgag atcctgccgc tgcatcccag cttgggtgac 3360
agagtgagac tctgtctcaa aaaaaaatta aataataaat aaatagtaaa atacagtcat 3420
taagagtaca aaatgtagat tcagactacc tgggttcaaa tcttggctct tacttgcatt 3480
gtggctttgg gcagatcatg taacttatgt gtgcctcagt ttcctcatct gttaaatagg 3540
ggcaacaact gaatctacct tattcagttg ttgtgagggt ttattgagat tgtgtgtgtg 3600
tatgtgtgtg agtgtagtgt gtgcatgtgt gtgtctgtgc aaggagtggg aggtgtatat 3660
tcagagacac atattacagc acttaaaatg gtatctagca cttagtaagc attattcaag 3720
ttttagttaa cattatttta cttacctctg aaaattggag ctatgtgaaa aagaagttgg 3780
tctcctgaag tagaagccag tcttgtgtca ccaaaaactt caagcccaag cttgccaacg 3840
cttttccatg atgtggtagt agagtttcaa gcatgtggta ggataagaga actcaatgac 3900
ctaagaacca ttccaaccca gagaacccct ggttctatga ataattccaa cttaaatagg 3960
tagcttggct ctcccaagtg agagccattg cttctgtttc cgggtcatat aatgaacttt 4020
cagaaaacca ccatttttct caaccagtta aaattaagtg taatacgtgc tttcatttca 4080
tggtgcctgg ggaaaattta attgtagtat gaactccagt tattggtagt cttaagtaaa 4140
attgccaaaa taaatagaaa tgcaggatat ttctgggctc acacagcttc cgggacactt 4200
tagtttcttg ggctgccaat ccagtgcctt tcacaagcat ttgatctttt ttcaaacatc 4260
tcttgaaaac aaacaaaacc tcacacagct tctaatgtgt gcactgttcg aatgtaaggg 4320
tggaaaagga ggcaaagaaa tgagctccca aagagcaatt ccccttctct cgcctccatc 4380
ccttgacgac ctccctccca ctaaagggaa acattgtttt cttaggtaat aaattctgca 4440
atttctcaag tccattaaca tccactgggc aagatgagat ctattctttt tatttgccca 4500
taggaaaaga atagtgcttt tttgcaatat tcactagata acacagagtt gacttttaat 4560
ccaagggcaa cattgatagt ctctagttaa aggggaagcc ttcaggagca atgaaaagat 4620
taatagtttt agatgaagca gaatccaaat ccctttttat gagttttgaa atatccagtt 4680
tgtatgctca cctcaatact taaagcccag ttactgattc ctttggccta agcaagacag 4740
gtcaattttt aaagagggag tagctgaggt tagcaaaaat tctccaggtc cacaaaactt 4800
ccagacctgc aaggtgaaaa tcagcttttc tgtcatccct aaaggcctaa ctggaatcag 4860
aacttttccc tgatgcccac atatttggag gtcctttttt aatgggactc cttaatgcct 4920
ttagtgccat cccattttca tccagtgtcc aaaagaaatg atttaaaaat ataaacgtat 4980
gtttaaattc cagaagagag aaatggagat tgagaacaat agggaaatga tgagagctat 5040
gggaaaagag gtttatgagt ccatgtctga ttcttccaga gagcccctaa gaaagttctt 5100
atcataccag gaactcaatt ataactttca ttgcctattg ttagatgagt aacaggagct 5160
agaaaacatt ttggaaattc ccatctttat ttttttaact aatatgatta tagttttaag 5220
aaccattggt caagaagcta actttttaaa aagtggaagt atgatggtta gaaataagaa 5280
tgctaaaggt gcatcaagct gattttaatt ctaaatgtcc ttggcagcaa tttagaatct 5340
gtaataaact acaccaaaca gttttgaggg gaaggggatt agtttctccc cttccttcgt 5400
gtgtgtgtgt gcgcgtgtgt gtgtgtgcac ctttgtgttc tagcattgtt gcacccatta 5460
cagagctggg gggaactatt ttccaaaatt ataggtgaga acagtttctt ggattgtctt 5520
tcagtgaagg taaattcctc tgtaaaaact aaccatcatt cagtaaaaac tgcaggattc 5580
ctttgtcttc tcaaaagcct gtttctcatc ctaaattaaa aattattcag gaaatagaga 5640
ggacattatt ggaggggtgg aaataagttg gttttctttt tattgtatct tttgaggatc 5700
cagggacttc taccatttcc catctaacat acagagaagg attctctagg tccctgtcta 5760
tagactgcag taactttcct atagaaccaa tttgcaattt tagaaatttc taggtctaat 5820
tattgaccca ttacaaccaa aggtcaatgc atccagccaa tcttccttct atcatcccct 5880
gcccttactt ctattaggga ctgggattac aggcaaaacc catcaaatgc ctcttctacc 5940
actttcccat ttcttaacca ttagcctcta acttcctcta ttcagtttct catatgcttt 6000
catgcccatt gggtcagata aaggaacatt catttatttg agtaggcatc tgttatgatc 6060
actccggaaa aaagatgaca atgggttacc ttgtcctcct gggcttctct aactgacatg 6120
gtcaaaatgc ccatatgaag ataagatgtt aagagcaaga tttatgaaaa gctgagtatg 6180
atggcagctc ttgtctcata aaataactcg aaagttccca gtgaaagacc aagaaatttt 6240
acatcaaacc caaaccggcc aaatggtcca agcttccaag ctgggatcca tggctaaagt 6300
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ccatggcagg ttgacggttg agtaaggttc tcaatcagcc gacaattgta gagttgggga 6540
tgtgcaatgt ttatgtcatg gtgtaagtat gtggcatgct tgactagctt gtgaggcact 6600
ggaagactag aaggaatgaa aaatatgaat gaatcaataa atgcatagta taattactgt 6660
tattttgtca gtattgtttt acctaggtca ctattgaatg ctctgatttg tctctttata 6720
aataataata tgttttcttc ttcaaaagaa cactaggatg aaggtagagg tgcttttggc 6780
acaatgccac aattctgatt tttttaaaac tgtatgcatg cataaaatgt tcttgagcca 6840
ttctctgcct tggaatagca ctggctggca ttctgcatgt ttacttttat atgctgaagg 6900
cccccatcaa cctcaaacag aggcaaatca atttaacttc tcatagtgtt attttgttca 6960
tcctaaaagt tcaagagagc cttccaaact tccaaaattt ctctcaattc agtgaggagg 7020
aaaattcaga acacagcatt tgaatgttct gcccagattt gtcacacaca caaggaatga 7080
gtgaaagagg gcaacaccct ttcctcctaa ccctgtgaac tcatcactat tgcattgaaa 7140
tgacaccaaa aggtaaaaac cctaggcctc acatctccca agaacactgc aataggagtt 7200
actgcataca ccagtttaag taactctagc ataaattgta tgtcagatga aacaatggca 7260
ttttggaggc ttaagagaaa aagaataatc aaatccagtt tttaggtact aatgtgctga 7320
atctttagca catagcagca aaattgctag aatctggtgt ttcacttttt aaaataccac 7380
atttgaacct ttcagcaatt ccaaaatcaa ctccctctgc gaaagataat aagcttaaac 7440
attttttaaa tttaaaaatg taacacaaac aaacagctaa gcaaacaagc tgcccataaa 7500
atcaacagtc tggggagccc tgatcctgaa gtattttaca acatccttca tgactattaa 7560
aggcaacata aacacctctt gtcagcaagg gaaactaccc ttggcatttt tttttctttg 7620
ttccccaggc ttttaaacca ttttgataga gattttttac atcacaggca gaaatatttg 7680
aaatagagtc aggtggtagt ctttaaaaga gtaagaaagt tgctaagtca agataatctt 7740
ggaataaagt cctctgattc ctggggattc ctagggatgc cccagtcact agaaaacaga 7800
gctgtaagtc cactctccca gcactcaacg gagctccgga aaccaaggag ctagctactg 7860
tttccccaca ttcagccaga gaaagggcag cactctagca tgcaaactgc tttgacaata 7920
gtaacaatta aaaagtaaat taaaaagaat cataatagct gatattgatt aggtacttgc 7980
cctgtggcaa gagctatagg gaatcacctc atttaatctt cacatgaagc ttgcagagtg 8040
agtaccacaa ttatcactat tgtatagaca ggaaaactca ggctgagtat ggctaagtgt 8100
cttgccaacg tcttgggcta acaagcggtc aagcagaatc caaacccgag atagatagac 8160
cacagtgtgc taatcaagca ctgcactctc tcctgcattt cttagttgat atttaccata 8220
tacaatctgt cacttgtatg agatggcagg gggttctgtg ctatttgtcc ttgtagagaa 8280
taccacagga agaaagtaag cagccatgca atatttgctg ttgacctgaa ctccattcca 8340
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aaacactttg cttggatctg gagaggatat agaagtgaag gaaatatgct acctgctctc 8460
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ggtgctaaca attaggttca aggtttttct aaacagtaga ctctcctgca tacaactata 8640
ccgcatgcca ggtaaatgac tgagggttat tacatccaat tataacacca ctgtgatgta 8700
ggtgctctta ccccacactt tcattttaca gaagaggaaa ttgaggacag cacaatgtag 8760
tgattatcaa aggtcacacg actactgtgt gggagagcta ggatttaaac cagatgcata 8820
agatgaggtc ctccaagaaa cagaagatga gaaggtgtta aatgagcagg ggttttatta 8880
gggggaatta atgtgtgaac agaaataggg gaggataggc aaagccatca gattgcaagg 8940
caagcctaac cccaagggaa ggagagagag agagtagatt ggttggaaac atttttggtg 9000
ggtctatggt ctaaggaaag ttcagcaaag tcatcatgga gtttttgagc caaagttggg 9060
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accatacttg gtcactggct cttgggaggg gcctgccctg ttccaatcca ctagagccaa 9180
agaagagccg ttgtactggc agggggtggg ggaattccta caaccacata aaaagtgggg 9240
tgaggtttcc agaaaaaaac gtgatgctgg gctaaccaaa actgtgtcca gtaagtacat 9300
atccctcact ctgttaaaga agcagccaca taaacaagga gtacacgttt ctcaaaatgt 9360
gcaccttgtt ctttggtttt gaagtcacat cccaaagtgc tgagtagatc gcatgaccct 9420
cgctttgcct ggctgccaga gaggaaaggc tgatccaact ctcctggaat ttgaacttgt 9480
gattccctga agtaaagaga tatcaaagtt gatactgaga catctaaatc atcctccacc 9540
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aaagggctga tatctgagcc ctctttccaa tcatccactg ctcttttctt ctcattttgc 9660
cctttttggg agcaggtcaa tgctgagtta gtactttatg ctgtacaata agctgctgat 9720
attccatgct ggacagaatt ttcccagtat tttttataga gtgccaggct tttcctagac 9780
ttcatgtcat acaatactta acttgtttgg agtgggtgga gatggaaaca tagtctattg 9840
aaaacatcac tgcttcctcc ctgaagttta aagagcctat ttttatcctt ttagattcta 9900
tctctcaggc aaaatctcat aaagataagt ggggaggaaa aaaagggggt tataatacct 9960
agggagtttg cttttgctaa ttgaatactg tgctcctaga cttctataaa taccattaca 10020
aatgggtccc agcttgtggt aatactcacc ctcctcattg agtcttctgt cccatggcac 10080
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acctcaagca cattactaaa tgttagcgag cttcagcttg tacgtgggac tgacaggaat 10560
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aaagcctttg caaatgttaa gcaagattat tattattgcc gttgttatta gtcctcagtg 10680
atcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttggagacag agttttactc 10740
tgtcgccaag gctggaatgc agtggcacaa tctcagctca ctgcaacctc cgcctcctgg 10800
gttcaagcaa ttttcctgcc tcagcctcct gagtagctga aactacaggc acacgccacc 10860
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ggtctccagc tcctgacctc aagtgatctg cccacctcgg cctcccaaag tgctgggatt 10980
acaggtgtga gccaccacac ctggcacagt aatcttaatt gaaaagtctg tggatagctt 11040
tccaaaggaa agcttggagc ttggataaga accaagagat aatgggagaa ggtgaatggc 11100
ctcttcaggg ccttttctag caccctaaat atgcgtgtct gtccataatg ggtaatcata 11160
tatatcacaa atcaaaccct ccacaaactt atttcctaat gtgtttgtta acctttcctt 11220
ctaaagggta aacttcttta accaacccca gtgagctgga ggatcaatgt tttcttaata 11280
gtcttacctt cgttggtgtc aataggaaac agtatttact cactactgtt ttccttttaa 11340
aaatctgtct agttgcatac tagaaacagt ttcagctggt ttgtttgtat tggacaagct 11400
gctgaagtga aaagtttttg cttgactgaa tgtgagacag tttcataact cttcaagaag 11460
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ttcactcaag tgagtttcag cccatggctt tgctgtgatg ctgagacaga cccagaagaa 11820
acagaccagg gaatccctcc gctcagactt tacactttat accttgtgct ttgagagaaa 11880
agaaaaagaa tctctctatt ggagacaaaa aataggatgt atgtggttgg tcaatctaac 11940
ctcaattctt tttgctatag ccccccgcta atttaaagag tgaagcatag atggtatctt 12000
aatgttttct tgtagaaatt tgggattaat ttggcttgag aggaagaatg gagattaaac 12060
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taggcagaga gatggcatcc ttaataatat ctattttgcg ggtttgatca gctacagacc 12300
atcaacagtg ttgattgaga attgaacaaa aacatttcaa ggagtttggg aacattaggg 12360
atgctattct gtggccccat gtgtccttct ctcatttttc tagagaactc ctataagaaa 12420
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atctctatta aaaatacaaa aaattagctg ggcatgatgg cgcgtgcctg taatcccagc 12600
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gacagagcga gactccatct caaaaaaaaa aaacaacaaa aaaaaacaaa acacaagttt 13080
actgggaact tagcagtaga tgctttgcac cacaacaaat gtatcttaag tggtcttttg 13140
tgatatttga gggaaagtgc cagaatttaa aacaaatggc atttcaagtt attctataca 13200
aatgcccagt ttctttctac catctttttt tcctttttgc agtggtcact gagctatttt 13260
agtgaatgtt tttacacaat gatgccatct tccttctact cagtcagtac aagatgttga 13320
ccatcgactc ataaaacact agctaccttt catgaaggac ttggtgataa ctctcatgtt 13380
ccaagtagaa ccggaaaaca tgtgtaagaa aacctgccga tccctatggg ccttggccaa 13440
taggtattat tcccaagggg tggcagttta tctttttccc cagccttcat attaaaacct 13500
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gcaatttaaa tacattcaag gataaagtaa taactgtagg aaaagtatta taatataatg 13860
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acagatattt attgagcacc tgcaataacc tgcacactgc tctagacact gggactataa 13980
cagtaaacag acagatacat ctctggtctc acagggcttc tattctaagc aaaactcaat 14040
atccaggccg ggtgcagtgg ctcatgcctg gaatgccagc actttgggag accaaggcca 14100
ggcagatcac ctgagcccac tagttgaaga ccagcctggg caatatagca aaaccccgtc 14160
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tggtcccagc tacttaggag gctgaggcag gaggattgtg taagcctggg aggcagaggt 14280
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caaaaaaaaa aaaccctcac tatccttaag ataacatcat tgcttgttga tgagtgaatg 14400
ttaacaccaa attaggaacc caggactttt agtcttggca tggttacttt ccaataaaga 14460
tgacaatact aagaagagaa aaatgattta ataatgataa tagtggctaa tacttatgta 14520
gtgcttacca tgtgccaggt ctattgtaag tacttttata tatattaatt atttaatctt 14580
tgatcctata aggtagatat tattgttacc ctagtttata gatgaagaaa cggaaacaca 14640
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cagcccagta tgtctatgat tttacagact caaaattaat tataagattt cctaatcttc 14760
gatttctgaa actctgcctt gctctagagg aaaacaagaa aaacaatgaa aaataaatgt 14820
ctctttttta caaaaattaa aacagaacaa actgcaataa aacaacagag gatgaatcca 14880
gaatgtgatt gatttttttt cttactagga aaggatctag aggccagaag gctggatttt 14940
tcaggatctc ctttcaatca atgaatctgt gatagaagca gatgaatcaa atctcatctt 15000
tgtgtgatta taaagctgtc tgtggtattc acgccaccag gggtacatag aagatgcctg 15060
agtgaggttt ggcaaaagta ctaagggcct gtccacctat acatgccctt ctcaggaaaa 15120
ccaaggttca agctctctat tagctcaact ggtaaggcgt aagacatgga aggttgaggc 15180
ccaatgttag aaatagatgg atacataaaa cttcatcaag ttaatgtcac tttttctcct 15240
ttatttatag 15250
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
gaagtacatt tgaagaacgc aagtagaggg agtgcaggaa acaagaacta caggatgtag 60
<210> 6
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc 180
tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac 240
atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagag 300
aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag gcagattcat 360
tctttctctt cccag 375
<210> 7
<211> 300
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa caaacatggg ctttggtgtc 180
agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta gagagaaaag acttttaggt 240
gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga ttcattcttt ctcttcccag 300
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
ctttttctcc tttatttata g 21
<210> 9
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 9
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
acatccccat ctctttggtc actctgcatt gcaaatttcc cctcccaccg ctatggacga 600
tgtgatgatt ggaagatgtt acaaaacagt ggctaaacaa acatgggctt tggtgtcaga 660
caaaagtgaa gtcctggctt tctcacacac cagcttagag agaaaagact tttaggtgaa 720
tgtggcagga aagcgtgctt gctggggcaa aggcagattc attctttctc ttcccagtat 780
cagcccccat ctaccaacaa gaacacgaag tctcagagaa ggaaaggaag tacatttgaa 840
gaacgcaagt agctttttct cctttattta taggaagtac atttgaagaa cgcaagtaga 900
gggagtgcag gaaacaagaa ctacaggatg tag 933
<210> 10
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 10
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
acatccccat ctctttgcta aacaaacatg ggctttggtg tcagacaaaa gtgaagtcct 600
ggctttctca cacaccagct tagagagaaa agacttttag gtgaatgtgg caggaaagcg 660
tgcttgctgg ggcaaaggca gattcattct ttctcttccc agtatcagcc cccatctacc 720
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtagctt 780
tttctccttt atttatagga agtacatttg aagaacgcaa gtagagggag tgcaggaaac 840
aagaactaca ggatgtag 858
<210> 11
<400> 11
000
<210> 12
<400> 12
000
<210> 13
<400> 13
000
<210> 14
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
130 135 140
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
145 150
<210> 15
<211> 462
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac 420
gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac tacaggatgt ag 462
<210> 16
<211> 158
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys
145 150 155
<210> 17
<211> 477
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtag 477
<210> 18
<211> 137
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Met Ile Thr Pro Thr Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
20 25 30
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
35 40 45
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
50 55 60
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
65 70 75 80
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
85 90 95
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
100 105 110
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
130 135
<210> 19
<211> 414
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
atgattacac ctacagtgaa gatgcacacc atgtcctcct cgcatctctt ctacctggcg 60
ctgtgcctgc tcaccttcac cagctctgcc acggctggac cggagacgct ctgcggggct 120
gagctggtgg atgctcttca gttcgtgtgt ggagacaggg gcttttattt caacaagccc 180
acagggtatg gctccagcag tcggagggcg cctcagacag gcatcgtgga tgagtgctgc 240
ttccggagct gtgatctaag gaggctggag atgtattgcg cacccctcaa gcctgccaag 300
tcagctcgct ctgtccgtgc ccagcgccac accgacatgc ccaagaccca gaaggaagta 360
catttgaaga acgcaagtag agggagtgca ggaaacaaga actacaggat gtag 414
<210> 20
<211> 195
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu
145 150 155 160
Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys
165 170 175
Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys
180 185 190
Lys Gly Lys
195
<210> 21
<211> 588
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggttggccaa agacacatcc aggaggggaa 480
cagaaggagg ggacagaagc aagtctgcag atcagaggaa agaagaaaga gcagaggagg 540
gagattggaa gtagaaatgc tgaatgcaga ggcaaaaaag gaaaatga 588
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 22
agctggcaat tccggttcgc ttgctgcgtc agaccccgta 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 23
tacggggtct gacgcagcaa gcgaaccgga attgccagct 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 24
ctaatccata acatggctct agacttaagg cagcggcaga 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 25
tctgccgctg ccttaagtct agagccatgt tatggattag 40
<210> 26
<211> 3250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 26
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatgt cgacctcgag tctagagggc 1380
ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1440
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 1500
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 1560
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggagtcga 1620
aattcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc 1680
gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc 1740
acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat 1800
gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt 1860
cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg 1920
cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg 1980
agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc 2040
aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag 2100
gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc 2160
ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag 2220
ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag 2280
aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg 2340
ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa 2400
tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc 2460
cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc 2520
aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgcgt cagaccccgt 2580
agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 2640
aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 2700
ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 2760
gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 2820
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 2880
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 2940
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 3000
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 3060
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 3120
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 3180
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 3240
tgctcacatg 3250
<210> 27
<211> 4108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 27
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatat gggaaaaatc agcagtcttc 1380
caacccaatt atttaagtgc tgcttttgtg atttcttgaa ggtgaagatg cacaccatgt 1440
cctcctcgca tctcttctac ctggcgctgt gcctgctcac cttcaccagc tctgccacgg 1500
ctggaccgga gacgctctgc ggggctgagc tggtggatgc tcttcagttc gtgtgtggag 1560
acaggggctt ttatttcaac aagcccacag ggtatggctc cagcagtcgg agggcgcctc 1620
agacaggcat cgtggatgag tgctgcttcc ggagctgtga tctaaggagg ctggagatgt 1680
attgcgcacc cctcaagcct gccaagtcag ctcgctctgt ccgtgcccag cgccacaccg 1740
acatgcccaa gacccagaag gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt 1800
ctctctcttg tgcatgtggg tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta 1860
caagtcagaa aagctccttt gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa 1920
caaacatggg ctttggtgtc agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta 1980
gagagaaaag acttttaggt gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga 2040
ttcattcttt ctcttcccag tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga 2100
gaaggaaagg aagtacattt gaagaacgca agtagctttt tctcctttat ttataggaag 2160
tacatttgaa gaacgcaagt agagggagtg caggaaacaa gaactacagg atgtaggtcg 2220
acctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 2280
gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 2340
ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 2400
ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 2460
ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg 2520
ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc 2580
aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc 2640
cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa 2700
gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct 2760
ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac 2820
aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa 2880
tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac 2940
tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag 3000
cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt 3060
cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag 3120
gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc 3180
agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc 3240
cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc 3300
ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt 3360
tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccggttcgct 3420
tgctgcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3480
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3540
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3600
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3660
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3720
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3780
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3840
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3900
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3960
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 4020
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 4080
ggccttttgc tggccttttg ctcacatg 4108

Claims (16)

1.一种胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，
包含：
第一多核苷酸，具有与SEQ ID NO：1所示的人类胰岛素样生长因子1基因的外显子1、3及4相同的序列或其的简并；
第二多核苷酸，具有与SEQ ID NO：2所示的人类胰岛素样生长因子1基因的内含子4相同的序列或其的片段；
第三多核苷酸，具有与SEQ ID NO：3所示的人类胰岛素样生长因子1基因的外显子5及6-1相同的序列或其的简并；
第四多核苷酸，具有与SEQ ID NO：4所示的人类胰岛素样生长因子1基因的内含子5相同的序列或其的片段；以及
第五多核苷酸，具有与SEQ ID NO：5所示的人类胰岛素样生长因子1基因的外显子6-2相同的序列或其的简并，
上述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸、第四多核苷酸及第五多核苷酸按从5’向3’顺序依次连接，且
上述胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体编码：
序列SEQ ID NO：14的I类IGF-1Ea蛋白质，及
序列SEQ ID NO：16的I类IGF-1Ec蛋白质。
2.根据权利要求1所述的胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第二多核苷酸为SEQ ID NO：6的多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第二多核苷酸为SEQ ID NO：7的多核苷酸。
4.根据权利要求1所述的胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，上述第四多核苷酸为SEQ ID NO：8的多核苷酸。
5.质粒载体，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体。
6.根据权利要求5所述的质粒载体，其特征在于，上述质粒载体为pCK。
7.根据权利要求6所述的质粒载体，其特征在于，上述质粒载体为：
pCK-IGF-1X6，其包含SEQ ID NO：9所示的多核苷酸，或
pCK-IGF-1X10，其包含SEQ ID NO：10所示的多核苷酸。
8.根据权利要求5所述的质粒载体，其特征在于，上述质粒载体为pTx。
9.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，上述质粒载体为：
pTx-IGF-1X6，其包含SEQ ID NO：9所示的多核苷酸，或
pTx-IGF-1X10，其包含SEQ ID NO：10所示的多核苷酸。
10.一种药剂学组合物，其特征在于，包含权利要求1至4中任一项所述的胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体。
11.一种药剂学组合物，其特征在于，包含权利要求5至9中任一项所述的质粒载体。
12.一种药剂学组合物，包含胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体编码：
SEQ ID NO：14的I类IGF-1Ea蛋白质，及
SEQ ID NO：16的I类IGF-1Ec蛋白质。
13.根据权利要求12所述的药剂学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体为：
pCK-IGF-1X6，其包含SEQ ID NO：9所示的多核苷酸，或
pCK-IGF-1X10，其包含SEQ ID NO：10所示的多核苷酸。
14.根据权利要求12所述的药剂学组合物，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体为：
pTx-IGF-1X6，其包含SEQ ID NO：9所示的多核苷酸，或
pTx-IGF-1X10，其包含SEQ ID NO：10所示的多核苷酸。
15.胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体在制造神经性疼痛或糖尿病性神经病变治疗用药剂学组合物中的用途，上述胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体编码：
序列SEQ ID NO：14的I类IGF-1Ea蛋白质，及
序列SEQ ID NO：16的I类IGF-1Ec蛋白质。
16.一种胰岛素样生长因子1编码脱氧核糖核酸构建体，其特征在于，包含：
SEQ ID NO：9所示的多核苷酸，或
SEQ ID NO：10所示的多核苷酸。
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