KR20210052443A - Igf-1 이형체를 발현하는 dna 컨스트럭트를 이용한 신경병증의 치료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신경병증의 치료용으로 사용될 수 있는 1 개 이상의 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트에 관한 것이다. 활성이 있는 성분인 DNA 컨스트럭트를 포함하는 약제학적 조성물 및 신경병증 치료용 DNA 컨스트럭트를 투여하는 방법이 본원에 추가적으로 제공된다. 본 발명은 신경병성 환자의 치료하는데 있어 안전하고 효과적인 방법을 제공한다.
Description
본 출원은 2018 년 7 월 17 일에 출원된 미국 가출원 번호 62/699,662에 우선권을 주장하며, 이에따라 그 전체가 참조로서 포함된다.
당해 출원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 포함하며 이에따라 그 전체가 참조로서 포함된다. 2019 년 7월 2일 생성된 상기ASCII 카피(copy)는, 38917US_CRF_sequencelisting.txt라 명명되며 47,265 바이트의 사이즈이다.
본 발명은 IGF-1 이형체를 발현하는 DNA 컨스트럭트를 이용한 신경병증의 치료에 관한 것이다.
신경병증은 신경 손상으로 인한 만성 병적 상태이다. 신경병증은 당뇨병의 일반적인 결과이며, 당뇨병 환자의 신경병증은 특히 당뇨병성(diabetic) 신경병증이라고 지칭된다. 신경병증은 또한 감염(infection) (예를 들면, 대상포진-후 신경통(post-herpetic neuralgia)으로 알려진 감염 후 발생하는 것과 관련된 신경병증과 동반되는, 헤르페스(herpes); 인간 면역결핍 바이러스(HIV)/에이즈(AIDS); 라임병(Lyme disease): 한센병(leprosy); 매독(syphilis); 및 대상포진(shingles)); 자가면역 질환(autoimmune disease) (예를 들면, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 루프스(systemic lupus), 및 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)); 유전적(genetic) 또는 유전되는(inherited) 질환 (예를 들면, 프리이드라이히 운동실조증(Friedreich's ataxia) 및 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease)); 아밀로이드증(amyloidosis); 요독증(uremia); 독소(toxin), 독(poison) 또는 약물에 대한 노출; 외상(trauma); 또는 부상(injury)으로 인한 신경 손상으로 인해 발생할 수도 있다. 일부 경우에, 원인은 알 수 없으며, 이 경우의 신경병증은 특발성(idiopathic) 신경병증이라 지칭된다.
원인에 관계없이, 신경병증은 통증 (신경병성 통증), 기타 감각적인 결함 (예를 들면, 부분적 또는 완전한 감각 상실을 포함하는, 마취(anesthesias); 및 무감각(numbness), 저림(tingling)을 포함하는, 감각이상(paresthesias) 등), 운동 결함 (예를 들면, 약함(weakness), 반사 작용(reflexes) 상실, 근육량(muscle mass) 상실, 경련(cramping), 기민성(dexterity) 상실, 등), 및 자율신경 장애(autonomic dysfunction) (예를 들면, 메스꺼움(nausea), 구토(vomiting), 발기부전(impotence), 현기증(dizziness), 변비(constipation), 설사(diarrhea), 등)와 같은 신경 손상 (예를 들면, 말초(peripheral) 신경병증, 두개골(cranial) 신경병증, 자율(autonomic) 신경병증, 국소(focal) 신경병증)의 해부학적 부위에 부분적으로 의존하는 특징적인 증상과 관련이 있다.
신경병증은 관련된 증상을 관리하는 조치로 일상적으로 치료되고, 병인이 알려진 경우에는, 신경병증의 근본이 되는 원인을 치료함으로서 일상적으로 치료된다. 예를 들면, 진통제, 또는 당뇨병, 자가면역 질환, 감염, 또는 비타민 결핍에 대한 의학적인 치료가 사용된다. 하지만, 이러한 방법은 신경 손상 그 자체는 치료하지 않는다.
따라서, 신경병증과 관련된 신경 손상을 예방하고 치료할 수 있는 효과적인 치료 방법에 대한 필요성이 존재한다.
다양한 성장 인자는 신경병증 치료에 대한 가능한 제제로 제안되었으며, Kessler와 동료들은 최근 당뇨병성 말초 신경병증에서 비 바이러스성 간세포 성장 인자 (HGF) 유전자 치료의 성공적인 이중-맹검(double-blind), 위약-대조(placebo-controlled), 인간 2 상 임상 시험을 보고했다(Kessler et al., Annals Clin. Transl. Neurology 2(5):465-478 (2015)). 또한 미국 특허 번호 9,963,493를 참조하며, 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
신경병증을 유발하는 광범위한 병인 및 광범위한 신경병증 임상 발표를 고려하면, HGF-발현 핵산 컨스트럭트로 당뇨병성 말초 신경병증을 치료하는 임상적 성공에도 불구하고, HGF 이외의 성장 인자 투여에 기반한 치료를 포함하는 추가적인 치료에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트가 신경병증과 관련된 증상을 치료하는데 효과적이라는 새로운 발견에 기반한다. IGF-1의 클래스 I, Ec 또는 클래스 I, Ea 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트가 클래스 II, Ea 또는 클래스 I, Eb 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트보다 더 효과적이라는 것이 추가로 증명되었다. 각각 IGF-1의 클래스 I, Ec 또는 클래스 I, Ea 이형체를 인코딩하는 2 개 유형의 DNA 컨스트럭트가 함께 투여될 때, 치료적인 효과는 더욱 더 강해진다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예는 신경병증이 있는 대상(subject)에게 IGF-1의 클래스 I, Ec 또는 클래스 I, Ea 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트를 개별적으로 또는 조합하여 투여함으로서 신경병증을 치료하는 방법으로 지정된다.
본 발명은 특이적으로 설계된 새로운 DNA 컨스트럭트를 추가적으로 제공하여 1 개의 벡터 내에 2 개의 IGF-1 이형체 (즉, 클래스 I, Ec 및 클래스 I, Ea)을 인코딩한다. DNA 컨스트럭트는 클래스 I, Ec 및 클래스 I, Ea 이형체 모두의 높은-수준의 발현을 유도하고 생체 내에서 신경병증과 관련된 증상을 효과적으로 치료하는 그것들의 능력에 기반하여 선별되고 선택되었다. 그것들의 치료 효과는 클래스 I, Ec 또는 클래스 I, Ea의 2 개의 이형체 중 오직 1 개만 인코딩하는 DNA 컨스트럭트의 효과보다 더 컸으며, 각각 클래스 I, Ec 또는 클래스 I, Ea를 인코딩하는 컨스트럭트의 2개의 유형의 동시-투여에 의해 증명된 효과와 유사했다.
따라서, 본 발명은 신경병증 치료를 위한 치료법에 기반하는 새로운 IGF-1을 제공한다.
구체적으로, 일 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 인간 IGF-1을 인코딩하는 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 제공한다: 인간 IGF-1 유전자의 엑손 1, 3 및 4 (서열번호 1)와 동일한 서열을 갖는 제 1 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트(degenerate); 인간 IGF-1 유전자의 인트론 4 (서열번호 2)와 동일한 서열을 갖는 제 2 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 절편(fragment); 인간 IGF-1 유전자의 엑손 5 및 6-1 (서열번호 3)과 동일한 서열을 갖는 제 3 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트; 인간 IGF-1 유전자의 인트론 5 (서열번호 4)와 동일한 서열을 갖는 제 4 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 절편; 및 인간 IGF-1 유전자의 엑손 6-2 (서열번호 5)와 동일한 서열을 갖는 제 5 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 제 4 폴리뉴클레오타이드 및 제 5 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 순서로 순차적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제 4 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 플라스미드 벡터를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는 pCK이다. 일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 pCK-IGF-1X6 또는 pCK-IGF-1X10이다.
일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는 pTx이다. 일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 pTx-IGF-1X6 또는 pTx-IGF-1X10이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공되는 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기에서 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ea 단백질 또는 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ec 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ea 단백질 및 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ec 단백질 모두를 인코딩한다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 18의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 II IGF-1 Ea 단백질 및 서열번호 20의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Eb 단백질을 인코딩하지 않는다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 18의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 II IGF-1 Ea 단백질도 서열번호 20의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Eb 단백질도 인코딩하지 않는다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ea 단백질을 인코딩하는 제 1 DNA 컨스트럭트, 및 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ec 단백질을 인코딩하는 제 2 DNA 컨스트럭트를 포함한다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 pCK-IGF-1X6 또는 pCK-IGF-1X10이다. 일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 pTx-IGF-1X6 또는 pTx-IGF-1X10이다.
본 발명의 일부 측면은 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트의 유효량을 신경병증을 갖는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 신경병증 치료 방법을 제공하며, 여기에서 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 최소 1 개의 인간 IGF-1 이형체를 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ea 단백질 또는 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ec 단백질을 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 18의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 II IGF-1 Ea 단백질 또는 서열번호 20의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Eb 단백질을 발현할 수 없다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 15의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다: 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 대상(subject)에게 투여하는 단계로서, 여기에서 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 17의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 17의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다: 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 대상(subject)에게 투여하는 단계로서, 여기에서 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 15의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계 및 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 동시에 수행된다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계 및 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 순차적으로 수행된다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 1 개 초과의 인간 IGF-1 이형체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ea 단백질 및 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ec 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 다음을 포함한다: 인간 IGF-1 유전자의 엑손 1, 3 및 4 (서열번호 1)와 동일한 서열을 갖는 제 1 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트(degenerate); 인간 IGF-1 유전자의 인트론 4 (서열번호 2)와 동일한 서열을 갖는 제 2 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 절편(fragment); 인간 IGF-1 유전자의 엑손 5 및 6-1 (서열번호 3)과 동일한 서열을 갖는 제 3 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트; 인간 IGF-1 유전자의 인트론 5 (서열번호 4)와 동일한 서열을 갖는 제 4 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 절편; 및 인간 IGF-1 유전자의 엑손 6-2 (서열번호 5)와 동일한 서열을 갖는 제 5 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 제 4 폴리뉴클레오타이드 및 제 5 폴리뉴클레오타이드는 5’에서 3' 순서로 순차적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제 4 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 플라스미드 벡터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는 pCK이다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는 pTx이다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 10의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 27의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 유효량은 대상(subject)의 통증을 감소시키기에 충분한 양이다.
일부 구현예에서, 대상(subject)은 신경병성 통증을 가진다. 일부 구현예에서, 대상(subject)은 당뇨병성 신경병증을 가진다.
일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트 또는 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 근육 내 주사를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 신경병증을 치료하는 의학적 방법에 사용하기위한 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 제공하며, 상기 방법은 신경병증을 갖는 대상(subject)에게 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기에서 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 적어도 1 개의 인간 IGF-1 이형체를 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ea 단백질 또는 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ec 단백질을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 18의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 II IGF-1 Ea 단백질 및 서열번호 20의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Eb 단백질 모두를 발현할 수 없다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 15의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 의학적인 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다: 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 대상(subject)에게 투여하는 단계로서, 여기에서 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 17의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 17의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 의학적인 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다: 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 대상(subject)에게 투여하는 단계로서, 여기에서 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 15의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계 및 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계 및 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 순차적으로 수행된다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 1 개 이상의 인간 IGF-1 이형체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ea 단백질 및 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ec 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 다음을 포함한다: 인간 IGF-1 유전자의 엑손 1, 3 및 4 (서열번호 1)와 동일한 서열을 갖는 제 1 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트(degenerate); 인간 IGF-1 유전자의 인트론 4 (서열번호 2)와 동일한 서열을 갖는 제 2 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 절편(fragment); 인간 IGF-1 유전자의 엑손 5 및 6-1 (서열번호 3)과 동일한 서열을 갖는 제 3 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트; 인간 IGF-1 유전자의 인트론 5 (서열번호 4)와 동일한 서열을 갖는 제 4 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 절편; 및 인간 IGF-1 유전자의 엑손 6-2 (서열번호 5)와 동일한 서열을 갖는 제 5 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 제 4 폴리뉴클레오타이드 및 제 5 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 순서로 순차적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 제 4 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 플라스미드 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는 pCK이다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는 pTx이다.
일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 10의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 27의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 유효량은 대상(subject)의 통증을 감소시키기에 충분한 양이다. 일부 구현예에서, 대상(subject)은 신경병성 통증을 가진다. 일부 구현예에서, 대상(subject)은 당뇨병성 신경병증을 가진다. 일부 구현예에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트 또는 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 근육 내 주사를 포함한다.
도 1은 선택적 전사 개시 부위 및 선택적 스플라이싱 부위를 포함하는 인간 IGF-1 유전자의 개략도이다. IGF-1 유전자로부터 자연적으로 생성되는 IGF-1 이형체는 클래스 I Ec (이형체 #1); 클래스 II Ea (이형체 #2); 클래스 I Eb (이형체 #3); 및 클래스 I Ea (이형체 #4)를 포함한다.
도 2a는 만성 수축 손상 (chronic constriction injury, CCI) 모델에서 IGF-1 이형체를 인코딩하는 다양한 DNA 컨스트럭트의 치료적인 효능을 테스트하기 위한 실험 프로토콜을 개략적으로 설명한다.
도 2b는 도 2a에 개략적으로 설명된 실험에서 Sham 마우스 또는 CCI 마우스에서 측정된 발 회피(paw withdrawal) 빈도를 보여주는 히스토그램이다. CCI 마우스에는 DNA 컨스트럭트 - (i) pCK 벡터, (ii) pCK-IGF-1 #1 (클래스 I Ec 이형체를 발현하는 컨스트럭트), (iii) pCK-IGF-1 #4 (클래스 I Ea 이형체를 발현하는 컨스트럭트), 또는 (iv) pCK-IGF-1 #1 및 pCK-IGF-1 #4 모두가 투여된다.
도 3a는 다양한 DNA 컨스트럭트로부터 생성되는 IGF-1 이형체의 생체 내 발현을 평가하기 위해 실시예 2에서 사용되는 실험 프로토콜을 개략적으로 설명한다.
도 3b는 IGF를 인코딩하지 않는 DNA 컨스트럭트 (오직 "pCK" 벡터); 이형체 #1을 인코딩하는 DNA 컨스트럭트 (클래스 I Ec 이형체); 이형체 #4를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트 (클래스 I Ea 이형체); 이형체 #1 (클래스 I Ec 이형체) 또는 #4 (클래스 I Ea 이형체)를 각각 인코딩하는, 2개의 컨스트럭트; 및 이중 발현 컨스트럭트 pCK-IGF-1X6 또는 pCK-IGF-1X10의 투여후에 발현되는 모든 인간 IGF-1의 이형체의 양을 측정하는 ELISA의 결과를 나타낸다.
도 3c는 IGF-1 이형체 #1 (클래스 I Ec 이형체) 및 #4 (클래스 I Ea 이형체)의 발현을 구별하기 위한 RT-PCR에 사용되는 앞방향/왼쪽 (L) 및 역방향/오른쪽 (R) 프라이머의 위치를 나타낸다.
도 3d는 이중 발현 컨스트럭트 pCK IGF-1X6 및 pCK IGF-1X10로부터 생성되는 이형체 #1 및 #4의 발현을 나타내는 RT-PCR 생성물의 아가로스 젤 전기영동을 나타낸다. pCK IGF-1X6 및 pCK-IGF-1X10 모두는 모든 이형체의 높은-수준의 발현을 유도하였다.
도 4a는 시험관 내의 293T 세포에서 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트로부터 발현되는 단백질을 평가하기 위해 실시예 2에서 사용되는 프로토콜을 개략적으로 설명한다.
도 4b는 (i) 이형체 #1을 인코딩하는 컨스트럭트, (ii) 이형체 #4를 인코딩하는 컨스트럭트, (iii) 이형체 #1 또는 #4를 각각 인코딩하는, 2 개의 컨스트럭트, (iv) 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X6, 또는 (v) 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X10의 시험관 내 형질감염(transfection) 후에 IGF-1 이형체 #1 및/또는 #4의 발현을 증명하는 웨스턴 블로팅(western blotting) 결과를 나타낸다.
도 5a는 CCI 동물 모델에서 기계적 이질통(mechanical allodynia)을 감소시키는데 있어서 다양한 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트의 효능을 테스트하기 위한 실시예 3에서 사용되는 실험 프로토콜을 개략적으로 설명한다.
도 5b는 도 5a에 개략적으로 설명된 실험에서 Sham 마우스 또는 CCI 마우스에서 측정된 발 회피의 빈도를 보여주는 히스토그램이다. CCI 마우스에는 DNA 컨스트럭트 - (i) pCK 벡터, (ii) pCK-IGF-1 #1 (클래스 I Ec 이형체를 발현하는 컨스트럭트), (iii) pCK-IGF-1 #4 (클래스 I Ea 이형체를 발현하는 컨스트럭트), 또는 (iv) pCK-IGF-1 #1 및 pCK-IGF-1 #4 모두, (v) 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X6, 또는 (vi) 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X10가 투여된다.
도 6a는 Sham 또는 신경 손상 동물 모델로부터 얻은 오른쪽 동측 좌골 신경(right ipsilateral sciatic nerve)의 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지를 제공한다. 신경 손상 동물 모델에는 pCK 벡터 또는 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X10가 투여된다.
도 6b는 pCK ("Crush-pCK")가 처리된 신경 손상 동물 및 pCK-IGF-1X10 ("Crush-pCK-IGF-1X10")가 처리된 신경 손상 동물의 뉴런 직경의 분포를 나타내는 그래프이다.
도면은 오직 실례의 목적으로 본 발명의 다양한 구현예를 묘사한다. 당업자는 본원에 예시된 컨스트럭트 및 방법의 대안적인 구현예가 본원에 설명된 발명의 원리로부터 벗어나지 않고 사용될 수 있다는 다음의 논의로부터 쉽게 인식할 것이다.
도 2a는 만성 수축 손상 (chronic constriction injury, CCI) 모델에서 IGF-1 이형체를 인코딩하는 다양한 DNA 컨스트럭트의 치료적인 효능을 테스트하기 위한 실험 프로토콜을 개략적으로 설명한다.
도 2b는 도 2a에 개략적으로 설명된 실험에서 Sham 마우스 또는 CCI 마우스에서 측정된 발 회피(paw withdrawal) 빈도를 보여주는 히스토그램이다. CCI 마우스에는 DNA 컨스트럭트 - (i) pCK 벡터, (ii) pCK-IGF-1 #1 (클래스 I Ec 이형체를 발현하는 컨스트럭트), (iii) pCK-IGF-1 #4 (클래스 I Ea 이형체를 발현하는 컨스트럭트), 또는 (iv) pCK-IGF-1 #1 및 pCK-IGF-1 #4 모두가 투여된다.
도 3a는 다양한 DNA 컨스트럭트로부터 생성되는 IGF-1 이형체의 생체 내 발현을 평가하기 위해 실시예 2에서 사용되는 실험 프로토콜을 개략적으로 설명한다.
도 3b는 IGF를 인코딩하지 않는 DNA 컨스트럭트 (오직 "pCK" 벡터); 이형체 #1을 인코딩하는 DNA 컨스트럭트 (클래스 I Ec 이형체); 이형체 #4를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트 (클래스 I Ea 이형체); 이형체 #1 (클래스 I Ec 이형체) 또는 #4 (클래스 I Ea 이형체)를 각각 인코딩하는, 2개의 컨스트럭트; 및 이중 발현 컨스트럭트 pCK-IGF-1X6 또는 pCK-IGF-1X10의 투여후에 발현되는 모든 인간 IGF-1의 이형체의 양을 측정하는 ELISA의 결과를 나타낸다.
도 3c는 IGF-1 이형체 #1 (클래스 I Ec 이형체) 및 #4 (클래스 I Ea 이형체)의 발현을 구별하기 위한 RT-PCR에 사용되는 앞방향/왼쪽 (L) 및 역방향/오른쪽 (R) 프라이머의 위치를 나타낸다.
도 3d는 이중 발현 컨스트럭트 pCK IGF-1X6 및 pCK IGF-1X10로부터 생성되는 이형체 #1 및 #4의 발현을 나타내는 RT-PCR 생성물의 아가로스 젤 전기영동을 나타낸다. pCK IGF-1X6 및 pCK-IGF-1X10 모두는 모든 이형체의 높은-수준의 발현을 유도하였다.
도 4a는 시험관 내의 293T 세포에서 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트로부터 발현되는 단백질을 평가하기 위해 실시예 2에서 사용되는 프로토콜을 개략적으로 설명한다.
도 4b는 (i) 이형체 #1을 인코딩하는 컨스트럭트, (ii) 이형체 #4를 인코딩하는 컨스트럭트, (iii) 이형체 #1 또는 #4를 각각 인코딩하는, 2 개의 컨스트럭트, (iv) 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X6, 또는 (v) 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X10의 시험관 내 형질감염(transfection) 후에 IGF-1 이형체 #1 및/또는 #4의 발현을 증명하는 웨스턴 블로팅(western blotting) 결과를 나타낸다.
도 5a는 CCI 동물 모델에서 기계적 이질통(mechanical allodynia)을 감소시키는데 있어서 다양한 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트의 효능을 테스트하기 위한 실시예 3에서 사용되는 실험 프로토콜을 개략적으로 설명한다.
도 5b는 도 5a에 개략적으로 설명된 실험에서 Sham 마우스 또는 CCI 마우스에서 측정된 발 회피의 빈도를 보여주는 히스토그램이다. CCI 마우스에는 DNA 컨스트럭트 - (i) pCK 벡터, (ii) pCK-IGF-1 #1 (클래스 I Ec 이형체를 발현하는 컨스트럭트), (iii) pCK-IGF-1 #4 (클래스 I Ea 이형체를 발현하는 컨스트럭트), 또는 (iv) pCK-IGF-1 #1 및 pCK-IGF-1 #4 모두, (v) 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X6, 또는 (vi) 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X10가 투여된다.
도 6a는 Sham 또는 신경 손상 동물 모델로부터 얻은 오른쪽 동측 좌골 신경(right ipsilateral sciatic nerve)의 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지를 제공한다. 신경 손상 동물 모델에는 pCK 벡터 또는 이중 발현 벡터 pCK-IGF-1X10가 투여된다.
도 6b는 pCK ("Crush-pCK")가 처리된 신경 손상 동물 및 pCK-IGF-1X10 ("Crush-pCK-IGF-1X10")가 처리된 신경 손상 동물의 뉴런 직경의 분포를 나타내는 그래프이다.
도면은 오직 실례의 목적으로 본 발명의 다양한 구현예를 묘사한다. 당업자는 본원에 예시된 컨스트럭트 및 방법의 대안적인 구현예가 본원에 설명된 발명의 원리로부터 벗어나지 않고 사용될 수 있다는 다음의 논의로부터 쉽게 인식할 것이다.
1.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 다음의 용어들은 하기 그것들에게 부여되는 의미를 갖는다.
용어 "IGF-1의 이형체(isoform of IGF-1)", "인간 IGF-1 이형체(human IGF-1 isoform)" 또는 "IGF-1 이형체(IGF-1 isoform)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 자연적으로 발생하는 인간의 pre-pro-IGF-1 폴리펩타이드, 또는 그들의 대립유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 또는 결실 변이체 중 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 pre-pro-IGF-1 폴리펩타이드는 클래스 I, Ec (서열번호 16); 클래스 II, Ea (서열번호 18); 클래스 I, Eb (서열번호 20); 및 클래스 I, Ea 이형체 (서열번호 14)을 포함한다.
용어 "이형체 #1(Isoform #1)", "클래스 I, Ec 이형체(Class I, Ec isoform)", "클래스 I, IGF-1 Ec 이형체(Class I, IGF-1 Ec isoform)" 또는 "클래스 I, IGF-1 Ec(Class I, IGF-1 Ec)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 서열번호 16의 폴리펩타이드를 지칭한다.
용어 "이형체 #2(Isoform #2)", "클래스 II, Ea 이형체(Class II, Ea isoform)", "클래스 II, IGF-1 Ea 이형체(Class II, IGF-1 Ea isoform)" 또는 "클래스 II, IGF-1 Ea(Class II, IGF-1 Ea)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 서열번호 18의 폴리펩타이드를 지칭한다.
용어 "이형체 #3(Isoform #3)", "클래스 I, Eb 이형체(Class I, Eb isoform)", "클래스 I, IGF-1 Eb 이형체(Class I, IGF-1 Eb isoform)" 또는 "클래스 I, IGF-1 Eb(Class I, IGF-1 Eb)"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 서열번호 20의 폴리펩타이드를 지칭한다.
용어 "이형체 #4(Isoform #4)", "클래스 I, Ea 이형체(Class I, Ea isoform)", "클래스 I, IGF-1 Ea 이형체(Class I, IGF-1 Ea isoform)" 또는 "클래스 I, IGF-1 Ea(Class I, IGF-1 Ea)"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 서열번호 14의 폴리펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료(treatment)"는 (a) 신경병증의 증상 억제; (b) 신경병증의 증상 완화; 및 (c) 신경병증의 증상 제거의 모든 활동을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경 세포의 성장 또는 신경 세포 사멸의 억제를 통해 신경병증을 치료할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료적으로 유효한 용량(therapeutically effective dose)" 또는 "유효량(effective amount)"은 그것이 투여되어 바람직한 효과를 생성하는 용량(dose) 또는 양(amount)을 지칭한다. 본 방법의 맥락에서, 치료적으로 유효한 양은 신경병증의 증상을 치료하기 위한 효과적인 양이다.
본원에 사용된 용어 "충분한 양(sufficient amount)"은 바람직한 효과를 생성하기 위한 충분한 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "디제너레이트 서열(degenerate sequence)" 또는 "디제너레이트(degenerate)"는 번역될 수 있는 핵산 서열을 지칭하여 참조 핵산 서열로부터 번역된 것과 동일한 아미노산 서열을 제공한다.
2.
기타 해석 규약(Other interpretational conventions)
본원에 언급된 범위는 언급된 종점(endpoint)을 포괄하는 범위 내의 모든 값에 대한 축약형(shorthand)으로 이해된다. 예를 들면, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50으로 구성된 그룹으로부터 임의의 숫자, 숫자들의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
3.
IGF-1 이형체를 발현하는 DNA 컨스트럭트
제 1 측면에서, 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트가 제공된다.
3.1.
IGF-1 이형체
도 1에 예시된 바와 같이, 인간 IGF-1 유전자는 거의 90kb의 게놈 DNA에 걸쳐있는 6 개의 엑손 (엑손 1, 2, 3, 4, 5, 및 6 (6-1 및 6-2))을 포함한다. 엑손 1 및 2는 상호 배타적인 리더 엑손 (mutually exclusive leader exons)으로, 각각 다양하게 사용되는 여러 프로모터 부위를 가지고 있다. 더욱이, IGF-1 유전자는 다수의 전사체 변이체를 생성하기 위해 차등적으로 스플라이싱 될 수 있다. 각각의 전사체 변이체는 가변적인 신호 전달 펩타이드 리더 서열을 가지는 상이한 pre-pro-IGF-1 단백질 ("IGF-1 이형체")을 인코딩한다. 그러나 모든 전사체 이형체는 프로세싱 후에 동일한 수용체를 사용하는 동일한 성숙한(mature) 70개의 아미노산인 IGF-1 펩타이드를 생성한다.
Pre-pro-IGF-1 펩타이드는 그것들의 리더, 또는 신호, 서열 및 그것들의 카르복시(carboxy) (C) -말단이 다르다. 엑손 1 또는 엑손 2의 통합은 상호 배타적이며 그것들 중 하나는 pre-pro-IGF-1 펩타이드의 리더 서열 역할을 한다; 다른 리더 엑손은 5'-UTR을 생성한다. Pre-pro-IGF-1 폴리펩타이드는 리더 및 E-펩타이드 카르복시-말단을 제거하여 성숙한 70개의 아미노산인 IGF-1을 생성하는 전사 후 단백질 분해적 절단을 겪는다.
엑손 1을 포함하는 전사체는 클래스 1 전사체 (예를 들면, 도 1의 클래스 I, Ec; 클래스 I, Eb; 및 클래스 I, Ea)라고 지칭되는 반면에 엑손 2를 포함하는 그것들은 클래스 2 전사체 (예를 들면, 도 1의 클래스 II, Ea)라고 지칭된다. 거의 모든 pre-pro 펩타이드는 27 개의 아미노산을 엑손 3으로부터 얻은 신호 전달 펩타이드에 엑손 1 또는 2의 포함(inclusion)으로부터 얻은 나머지 신호 서열과 함께 포함한다. 소수의 전사체는 22 개 아미노산의 더 짧은 신호 전달 펩타이드를 생성하는 엑손 3 내의 다른 전사 개시 부위를 이용한다. 엑손 3 및 4는 변하지 않으며 성숙한 IGF-1 펩타이드의 B, C, A, 및 D 도메인을 인코딩한다; 엑손 4는 성숙한 IGF-1 펩타이드의 3분의 2를 인코딩한다. 인간 Eb 펩타이드는 오직 엑손 4 및 5로만 구성되는 반면에 Ec는 엑손 4, 5, 및 6을 포함한다.
선택적 스플라이싱 및 전사의 상호 배타적인 개시는 다른 pre-pro-IGF-1 폴리펩타이드 (즉, IGF-1 이형체)의 생성하는 결과가 있는 도 1에 설명된다. 구체적으로, 최소한 엑손 1, 3/4, 5 및 6의 절편을 포함하는, 클래스 I, Ec IGF-1 이형체 (서열번호 16)은 서열번호 17의 서열을 포함하는 전사체로부터 생성된다. 최소한 엑손 2, 3/4 및 6의 절편을 포함하는, 클래스 II, Ea IGF-1 이형체 (서열번호 18)은 서열번호 19의 서열을 포함하는 전사체로부터 생성된다. 최소한 엑손 1, 3/4 및 5의 절편을 포함하는, 클래스 I, Eb IGF-1 이형체 (서열번호 20)은 서열번호 21의 서열을 포함하는 전사체로부터 생성된다. 최소한 엑손 1, 3/4 및 6의 절편을 포함하는, 클래스 I, Ea IGF-1 이형체 (서열번호 14)은 서열번호 15의 서열을 포함하는 전사체로부터 생성된다.
비록 다양한 전사체로부터 얻어진 성숙한 IGF-1 단백질은 다르지 않지만, 다양한 전사체 이형체는 다른 조절적인 역할을 가진다고 제시되어 왔다. 변이체 형태는 이형체에 대한 중추적 조절 역할을 나타내는 상이한 안정성, 결합 파트너, 및 활성을 가지고 있다. 이형체의 생물학적 중요성은 비록 불명확하게 남아있지만, 엑손 1을 갖는 클래스 I 이형체는 자가분비/측분비 형태이며 엑손 2를 갖는 클래스 II 이형체는 내분비 형태로 분비된다는 가설이 세워졌다. 이것은 클래스 II 전사체가 효율적인 분비와 관련된 전형적인 신호 펩타이드 모티프를 포함하는 반면, 클래스 I 전사체는 분비를 방해할 수 있는 더 긴 신호 펩타이드를 가지고 있다는 발견에 기반한다.
대부분의 조직은 클래스 I 전사체를 사용하는 것으로 여겨지지만, 간은 두 형태를 모두 사용하고 간의 클래스 II 전사체는 발달동안 우선적으로 강화된다. 발달동안 IGF-1 전사체의 풍부함(abundance)에 많은 변화들이 있다. 클래스 1, Ea는 활성 성장기 동안 가장 풍부한 형태이며 클래스 1, Eb는 초기 성장기 동안 성장판 전체에 걸쳐, 낮은 수준임에도 불구하고, 균일하게 발현되는 것으로 밝혀졌다.
3.2.
IGF-1 이형체를 발현하는 DNA 컨스트럭트
일 측면에서, 본 발명은 최소한 1 개의 인간 IGF-1 이형체를 발현할 수 있는 DNA 컨스트럭트를 제공한다. 일부 구현예에서, 각각 다른 IGF-1 이형체를 인코딩하는 1 개 이상의 DNA 컨스트럭트가 사용된다. 예를 들면, 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1)을 인코딩하는 제 1 컨스트럭트 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4)을 인코딩하는 제 2 컨스트럭트가 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 이형체 (즉, "이중 발현 컨스트럭트")을 발현하는 DNA 컨스트럭트가 사용된다. 예를 들면, 클래스 I, Ec 이형체 및 클래스 I, Ea 이형체 모두를 인코딩하는 단일 DNA 컨스트럭트가 사용될 수 있다.
3.2.1.
IGF-1 인코딩 서열
일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 IGF-1 이형체 중의 1 개의 코딩 서열을 포함한다. 예를 들면, DNA 컨스트럭트는 클래스 I, Ea (서열번호 15); 클래스 I, Eb (서열번호21); 클래스 I, Ec (서열번호17); 또는 클래스 II, Ea (서열번호19)을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 각각의 이형체 코딩 서열 (CDS)에 대한 발현 조절 서열을 포함함으로서, 1개 이상의 IGF-1 이형체를 발현할 수 있는 DNA 컨스트럭트인 이중 발현 컨스트럭트다. 일부 구현예에서, 컨스트럭트는 2 개의 코딩 서열 사이의 내부 리보솜 결합 부위(IRES)를 (예를 들면, (1) 발현 조절 서열-(2) 제 1 이형체의 코딩 서열-(3) IRES-(4) 제 2 이형체의 코딩 서열-(5) 전사 종결 서열의 순서로) 포함한다. IRES는 번역이 IRES 서열에서 시작되도록 허용하여, 그것에 의해 단일 컨스트럭트로부터 2 개의 단백질 생성물의 발현을 허용한다. 추가 구현예에서, 각각의 IGF-1 단일 이형체를 인코딩하는 복수의 컨스트럭트는 투여되는 대상(subject)에서 함께 사용되어 1 개 초과의 IGF-1 이형체의 발현을 유도한다.
바람직한 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 선택적 스플라이싱 부위를 포함함으로서 동시에 2 개 이상의 IGF-1 이형체를 발현할 수 있다. - 예를 들면, (i) 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1) 및 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2); (ii) 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1) 및 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3); (iii) 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1) 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4); (iv) 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2) 및 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3); (v) 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2) 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4); (vi) 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3) 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4)
예를 들면, DNA 컨스트럭트는 (i) 인간 IGF-1 유전자의 엑손 1, 3 및 4 (서열번호1)를 포함하는 제 1 서열 또는 제 1 서열의 디제너레이트 서열; (ii) 인간 IGF-1 유전자의 인트론 4 (서열번호2)를 포함하는 제 2 서열 또는 제 2 서열의 절편; (iii) 인간 IGF-1 유전자의 엑손 5 및 6-1 (서열번호3)을 포함하는 제 3 서열 또는 제 3 서열의 디제너레이트 서열; (iv) 인간 IGF-1 유전자의 인트론 5 (서열번호4)를 포함하는 제 4 서열 또는 제 2 서열의 절편; 및 (v) 인간 IGF-1 유전자의 엑손 6-2 (서열번호5)를 포함하는 제 5 서열 또는 제 5 서열의 디제너레이트 서열;을 포함할 수 있다. 인트론1 및 2는 선택적으로 스플라이싱 될 수 있고, 그 결과 2 개의 IGF-1 이형체가 생성된다 (예를 들면, 클래스 I, Ec 및 클래스 I, Ea).
일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 1 개 이상의 IGF-1 이형체를 발현할 수 있는 그것의 능력과 관련된 시험관 내 및/또는 생체 내에서 테스트된다. 바람직한 구현예에서, 클래스 I, Ec 및 클래스 I, Ea IGF-1 이형체 모두를 발현할 수 있는 DNA 컨스트럭트가 선택된다.
일부 구현예에서, 컨스트럭트는 인트론 4 (서열번호2)의 전체 서열 또는 그것의 절편을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 컨스트럭트는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 서열을 가지는 인트론 4의 절편을 포함한다.
일부 구현예에서, 컨스트럭트는 인트론 5 (서열번호 4)의 전체 서열, 또는 그것의 절편을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 컨스트럭트는 서열번호 8의 서열을 가지는 인트론 5의 절편을 포함한다.
(i) 인간 IGF-1 유전자의 엑손 1 내지 6 및 (ii) 인간 IGF-1 유전자의 인트론 1 및 2 또는 인트론 1 및 2의 다양한 절편에 해당하는 cDNA를 포함하는 다양한 DNA 컨스트럭트는 "IGF-1X"라 명명되고 고유 번호가 매겨진다. 출원인에 의해 테스트된 IGF-1X 컨스트럭트는 IGF-1X1, IGF-1X2, IGF-1X3, IGF-1X4, IGF-1X5, IGF-1X6, IGF-1X7, IGF-1X8, IGF-1X9 및 IGF-1X10를 포함하나, 이제 한정되지 않는다. 테스트된 컨스트럭트 사이에서, IGF-1X6 및 IGF-1X10는 클래스 I, Ec 및 클래스 I, Ea IGF-1 이형체를 모두 발현하는 것으로 밝혀졌다.
바람직한 구현예에서, IGF-1X6 (서열번호9) 또는 IGF-1X10 (서열번호10)이 사용된다. pCK 벡터에 클로닝 된 IGF-1X6 (서열번호9) 및 IGF-1X10 (서열번호10)는 각각 pCK-IGF-1X6 및 pCK-IGF-1X10라고 명명된다. pCK-IGF-1X6 ("DH5α_pCK-IGF1 X6")로 형질전환 된 대장균 (E. coli)은 2018 년 5 월 30 일에 부다페스트 조약의 조건에 따라 한국 생물자원센터 (KCTC, 한국생명공학연구원 (KRIBB) 대한민국, 56212, 전라북도 정읍시 입신길 181)에 수탁 번호 KCTC 13539BP로 기탁되었다. pCK-IGF-1X10 ("DH5α_pCK-IGF1 X10")로 형질전환 된 대장균 (E. coli)은 2018 년 5 월 30 일에 부다페스트 조약의 조건에 따라 한국 생물자원센터 (KCTC, 한국생명공학연구원 (KRIBB) 대한민국, 56212, 전라북도 정읍시 입신길 181)에 수탁 번호 KCTC 13540BP로 기탁되었다.
다른 바람직한 구현예에서, IGF-1X6 (서열번호9) 및 IGF-1X10 (서열번호10)는 pTx 벡터에 클로닝 된다. IGF 컨스트럭트는 각각 pTx-IGF-1X6 및 pTx-IGF-1X10로 명명된다.
본원에 기술된 IGF-1 이형체 또는 IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트는 야생형 인간 IGF-1 이형체로부터의 변형을 포함할 수 있다. 변형된 서열은 최대의 방식으로 변형된 서열이 야생형 인간 IGF-1 이형체 서열과 정렬될 때 최소 80% 동일성, 더 바람직하게는 최소 90% 동일성 및 가장 바람직하게는 최소 95% 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 본 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 구체적으로, 국립 생물 정보 센터 (NBCl, 베데스다, 메릴랜드 주) 웹사이트의 NCBI 기본 로컬 정렬 검색 도구 (BLAST)에 개시되고 서열 분석 프로그램 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용되는 정렬 알고리즘은 동일성 백분율을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
3.2.2.
벡터
본 발명의 IGF-1 이형체를 발현하는 DNA 컨스트럭트는 발현되는 서열과 작동 가능하게 연결된 1 개 이상의 조절 서열 (예를 들면, 프로모터 또는 인핸서)이 있는 벡터를 전형적으로 포함한다. 조절 서열은 IGF-1 이형체의 발현을 조절한다.
IGF-1 이형체의 1 개 이상의 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 컨스트럭트에서 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열 (프로모터, 신호 서열, 또는 전사 인자 결합 부위의 배열과 같은)과 제 2 핵산 서열 사이의 기능적인 연결을 지칭하며, 여기서 발현 조절 서열은 제 2 서열에 상응하는 핵산의 전사 및/또는 번역에 영향을 미친다.
전형적인 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드에 연결된 프로모터는 포유류 세포의 게놈 또는 포유류 바이러스로부터 얻은 프로모터 (예를 들면, CMV (사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아(vaccinia) 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV tk 프로모터, RSV 프로모터, EFl 알파 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL- 2 유전자 프로모터, 인간 IFN 유전자 프로모터, 인간 IL-4 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자 프로모터, 하지만 이에 한정되진 않음)를 포함하고, 상기 프로모터들은 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조절하며, 바람직하게는 동물, 보다 바람직하게는 포유류 세포에서 작동 가능하다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 유용한 프로모터는 인간 CMV (hCMV)의 IE (초기 즉시) 유전자로부터 얻어진 프로모터 또는 EF1 알파 프로모터, 가장 바람직하게는 hCMV IE 유전자-유래의 프로모터/인핸서 및 ATG 개시 코돈 직전의 서열에 걸친 엑손 1 및 엑손 2 서열의 전체적인 서열을 포함하는 5'-UTR (비번역 영역)이다.
본 발명에서 사용되는 발현 카세트는 예를 들면, 소 성장 호르몬 종결자 (Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), SV40-유래의 폴리아데닐레이션 서열 (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 polyA (Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), 베타-글로빈 polyA (Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK polyA (Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. 5 Biol. 5: 2104-2113 (1985)) 또는 폴리오마(polyoma) 바이러스 polyA (Batt, D. Band G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995))를 포함하는, 그러나 이에 한정되지 않는, 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 서열을 포함할 수 있다.
3.2.3.
비-바이러스 벡터
일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 1 개 이상의 IGF-1 이형체를 발현할 수 있는 비-바이러스 벡터이다.
전형적인 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 플라스미드이다. 현재의 바람직한 구현예에서, 플라스미드는 pCK, pCP, pVAXl, pTx 또는 pCY이다. 특히 바람직한 구현예에서, 플라스미드는 pCK이고, 세부 사항은 WO 2000/040737 및 Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 272:230-235 (2000)에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. pCK (Top10-pCK)로 형질전환 된 대장균(E. coli)은 2003 년 3 월 21 일에 부다페스트 조약의 조건에 따라 한국 미생물 문화원 (KCCM)에 기탁되었다 (수탁 번호: KCCM-10476). pCK-VEGF165 (즉, VEGF 코딩 서열이 있는 pCK 벡터 - Top10-pCK/VEGF165')로 형질전환 된 대장균(E. coli)은 1999 년 12 월 27 일에 부다페스트 조약의 조건에 따라 한국 미생물 문화원 (KCCM)에 기탁되었다 (수탁 번호: KCCM-10179).
pCK 벡터는 유전자 (예를 들면, IGF-1 유전자)의 발현이 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV)의 인핸서/프로모터 하에서 조절되는 것과 같이 구성되고, 세부사항은 Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272: 230 (2000); WO 2000/040737에 개시되며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. pCK 벡터는 인체에서 임상 시험을 위해 사용되었으며, 그것의 안전성과 유효성이 확인되었다 (Henry et al., Gene Ther. 18:788 (2011)).
바람직한 구현예에서, pCK 플라스미드는 클래스 I, Ec IGF-1 이형체 및/또는 클래스 I, Ea IGF-1 이형체에 대한 코딩 서열을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, pCK 플라스미드는 IGF-1X6 (즉, pCK-IGF-1X6) 또는 IGF-1 X10 (즉, pCK-IGF-1X10)를 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 플라스미드는 pCK로부터 유래된 플라스미드 벡터인, pTx (서열번호 26)이다. pTx는 pCK의 2 회의 순차적인 돌연변이 유발에 의해 생성되었다. 제 1 결실 돌연변이 유발 캠페인이 수행되어 카나마이신(Kanamycin) 내성 유전자 및 pCK의 ColE1 사이의 불필요한 서열이 제거되었다. 구체적으로, 결실 돌연변이 유발 PCR은 제 1 프라이머 쌍 (SEQ ID NOs: 22 및 23)을 사용하여 수행되었다. 카나마이신 저항 및 ColE1 사이의 228 베이스 페어 결실은 플라스미드를 시퀀싱 함으로서 확인되었다. 제 2 결실 돌연변이 유발 캠페인은 그 후에 HCMV 인트론 서열의 사이즈를 최적화하기 위하여, 제 2 프라이머 쌍(SEQ ID NOs: 24 및 25)을 사용하여 수행되었다. IE1 엑손 1 및 엑손 2 사이의 HCMV 인트론 서열 (421 베이스 페어)은 삭제되었고 결실은 시퀀싱을 수행함으로서 확인되었다.
특정 구현예에서, pTx 플라스미드는 IGF-1X6 (즉, pTx-IGF-1X6) 또는 IGF-1 X10 (즉, pTx-IGF-1X10)를 포함한다. 예를 들면, pTx-1X10 (SEQ ID NOs: 27)는 5'에서 ClaI 효소 및 3'에서 Sal1 효소로 잘라진 pTx에 IGF-1X10를 라이게이션 함으로서 생성된다.
3.2.4.
바이러스 벡터
다른 구현예에서, 기술 분야에 공지된 다양한 바이러스 벡터는 본 발명의 1 개 이상의 IGF-1 이형체를 전달하고 발현하도록 사용될 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스(retroviruses), 렌티바이러스(lentiviruses), 아데노바이러스(adenoviruses), 또는 아데노-부속 바이러스(adeno-associated viruses)를 사용하여 개발된 벡터는 본 발명의 일부 구현예에 사용될 수 있다.
(a)
레트로바이러스
비교적 큰 외인성 유전자를 운반할 수 있는 레트로바이러스는 그들의 게놈을 숙주 게놈으로 통합하고 넓은 숙주 스펙트럼을 갖는다는 의미에서 바이러스 유전자 전달 벡터로 사용되어왔다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 (예를 들면, 1 개 이상의 IGF-1 이형체의 코딩 서열)는 복제-결함 바이러스를 생성하기 위해 어떤 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈에 삽입되어, 레트로바이러스 벡터가 구축되었다. gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (긴 말단 반복) 및 W 성분은 포함하지 않는 패키징(packaging) 세포주가 구축되어 비리온(virion)이 생성된다 (Mann et al., Cell, 33:153-159 (1983)). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, LTR 및 W를 포함하는 재조합 플라스미드가 세포주에 도입될 때, W 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징 된 다음 배양 배지로 분비되도록 한다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지는 그 다음 수집되며, 선택적으로 농축되고 유전자 전달을 위해 사용된다.
2 세대 바이러스 벡터를 사용하는 성공적인 유전자 전달은 보고되어오고 있다. Kasahara et al. (Science, 266 :1373-1376 (1994))은 EPO (적혈구생성인자) 서열이 외피(envelope) 부위 대신에 삽입되고 순차적으로 새로운 결합 특성을 갖는 키메라 단백질을 생성하는, 몰로니(moloney) 쥐 백혈병 바이러스의 변이체를 제작하였다. 유사하게, 본 유전자 전달 시스템은 2-세대 레트로바이러스 벡터에 대한 구축 전략에 따라 구축될 수 있다.
(b)
렌티바이러스
렌티바이러스는 또한 본 발명의 일부 구현예에서 사용될 수 있다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 하위-클래스이다. 하지만, 렌티바이러스는 비-분열하는 세포의 게놈에 통합될 수 있는 반면, 레트로바이러스는 오직 분열하는 세포에만 감염될 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 대개 여러 개의 플라스미드로 형질전환 된 패키징 세포주, 일반적으로 HEK293로부터 생산된다. 플라스미드는 (1) 캡시드(capsid) 및 역전사효소와 같은 비리온 단백질을 인코딩하는 패키징 플라스미드, (2) 외인성 유전자를 포함하는 플라스미드 (예를 들면, 1 개 이상의 IGF-1 이형체의 코딩 서열)를 포함하여 타겟에 전달된다.
바이러스가 세포로 투입되면, RNA 형태의 바이러스 게놈은 역-전사되어 DNA를 생성하고, 그 후에 바이러스 통합 효소(integrase enzyme)에 의해 게놈 안으로 삽입된다. 따라서, 렌티바이러스 벡터와 함께 전달되는 외인성 요소는 게놈안에 남을 수 있고 세포가 분열될 때 세포의 후대로 전달된다.
(c)
아데노바이러스
아데노바이러스는 그것의 중간-사이즈 게놈, 조작의 용이성, 높은 역가, 넓은 표적-세포 범위, 및 높은 감염성 때문에 유전자 전달 시스템으로 일반적으로 사용되어왔다. 바이러스 게놈의 양쪽 끝은 바이러스 DNA 복제 및 패키징을 하기위해 필요한 cis-요소인 100 내지 200 bp의 ITRs (역 말단 반복)을 포함한다. El 부위 (ElA 및 ElB)는 바이러스 게놈 및 몇 가지 세포 유전자의 전사 조절을 담당하는 단백질을 인코딩한다. E2 부위 (E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질의 합성을 초래한다.
지금까지 개발된 아데노바이러스 벡터 중, E1 부위가 결실된 복제 불능인 아데노바이러스가 일반적으로 사용된다. 아데노바이러스 벡터의 결실된 E3 부위는 형질 전환 유전자(transgene)를 위한 삽입 부위를 제공할 수 있다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066- 1073 (1989)). 따라서, 디코린(decorin)-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (ElA 영역 및/또는 ElB 5 영역, 바람직하게는, ElB 영역) 또는 결실된 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 결실된 E4 영역에 삽입될 수 있다. 용어 "결실(deletion)"은 바이러스 게놈 서열을 참조하여 전체 결실 및 부분적 결실 또한 포함한다. 자연에서, 아데노바이러스는 야생형 게놈의 약 105%를 패키징 하고, 약 2 kb의 추가 DNA 용량을 제공할 수 있다 (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J. 6:1733- 1 739 (1987)). 이와 관련하여, 아데노바이러스에 삽입되는 상기에 기술된 외부 서열은 아데노바이러스 야생형 게놈에 추가로 삽입될 수 있다.
아데노바이러스는 공지된 혈청형(serotype) 또는 하위그룹A 내지 F중 임의의 것이 될 수 있다. 하위그룹 C의 아데노바이러스 유형 5는 본 발명에서 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 구축하기 위한 가장 바람직한 개시 물질이다. 아데노바이러스 유형 5에 관한 많은 생화학적 및 유전적 정보들이 공지되어 있다. 아데노바이러스 유전자 전달 시스템에 의해 전달되는 외래 유전자는 숙주 세포에 대한 에피솜(episomal), 및 유전독성이다. 따라서, 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료는 실질적으로 안전할 수 있다.
(d)
아데노-부속 바이러스 (AAV)
아데노-부속 바이러스는 비-분열 세포 및 다양한 유형의 세포를 감염시킬 수 있으므로, 본 발명의 유전자 전달 시스템을 구축하는데 유용도록 만든다. 아데노-부속 바이러스 벡터의 용도 및 준비에 대한 상세한 기술은 미국 특허 번호 10,308,958; 10,301,650; 10,301,648; 10,266,846; 10,265,417; 10,208,107; 10,167,454; 10,155,931; 10,149,873; 10,144,770; 10,138,295; 10,137,176; 10,113,182; 10,041,090; 9,890,365; 9,790,472; 9,770,011; 9,738,688; 9,737,618; 9,719,106; 9,677,089; 9,617,561; 9,597,363; 9,593,346; 9,587,250; 9,567,607; 9,493,788; 9,382,551; 9,359,618; 9,217,159; 9,206,238; 9,163,260; 9,133,483; 8,962,332에서 찾을 수 있으며, 그 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함되며, 5,139,941 및 4,797,368, 그 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
유전자 전달 시스템으로서 AAV에 대한 연구 결과는 LaFace et al., Viology, 162: 483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al., J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 전형적으로, 재조합 AAV 바이러스는 2 개의 AAV 말단 반복이 측면에 있는 (McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989) 관심 유전자 (즉, 전달될 관심 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, IGF-1 이형체의 코딩 서열)를 포함하는 플라스미드 및 말단 반복이 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 동시-형질감염 함으로서 제조된다 (McCarty et al., J. Viral., 65:2936-2945 (1991)).
(e)
기타 바이러스 벡터
기타 바이러스 벡터는 본 발명에서 유전자 전달 시스템으로 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "포유류 발현 벡터," In: 벡터: 분자 클로닝 벡터 및 그 용도에 대한 조사. Rodriguez 및 Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal 및 Sugden, "동물 DNA 바이러스로부터 얻은 유전자 전달을 위한 벡터: 전달된 유전자의 일시적 또는 안정적 발현," In: Kucherlapati R, ed. 유전자 전달. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104 (11): RS 5-62 (1999)) 및 단순 포진 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. 10 15 Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))와 같은 바이러스로부터 얻은 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 세포로 전달하기 위한 본 전달 시스템에서 사용될 수 있다.
4.
IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 포함하는 약제학적 조성물
또 다른 측면에서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
4.1.
투여에 적합한 약제학적 조성물 및 단위 투여 제형
정맥 내, 근육 내, 피부 내, 또는 피하 투여를 위해, DNA 컨스트럭트는 발열원이 없고 적절한 pH, 등장성(isotonicity) 및 안정성을 가지는 비경구적으로 허용되는 수용성 용액의 제형이 될 수 있다. 본 기술 분야의 관련자들은, 예를 들어, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 젖산화 링거 주사와 같은 등장성 운반체, 필요에 따라, 방부제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제를 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 1 개의 IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트를 포함한다. 예를 들면, DNA 컨스트럭트는 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1); 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2); 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3); 또는 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4)를 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 1 개 초과의 DNA 컨스트럭트를 포함하고, 각각은 1 개의 IGF-1 이형체를 인코딩한다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 (i) 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1)을 인코딩하는 제 1 DNA 컨스트럭트 및 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2)을 인코딩하는 제 2 DNA 컨스트럭트; (ii) 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1)을 인코딩하는 제 1 DNA 컨스트럭트 및 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3)을 인코딩하는 제 2 DNA 컨스트럭트; (iii) 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1)을 인코딩하는 제 1 DNA 컨스트럭트 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4)을 인코딩하는 제 2 DNA 컨스트럭트; (iv) 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2)을 인코딩하는 제 1 DNA 컨스트럭트 및 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3)을 인코딩하는 제 2 DNA 컨스트럭트; (v) 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2)을 인코딩하는 제 1 DNA 컨스트럭트 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4)을 인코딩하는 제 2 DNA 컨스트럭트; (vi) 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3)을 인코딩하는 제 1 DNA 컨스트럭트 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4)을 인코딩하는 제 2 DNA 컨스트럭트를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 1개 초과의 IGF-1 이형체를 발현할 수 있는 DNA 컨스트럭트인 이중 발현 컨스트럭트를 포함한다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 (i) 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1) 및 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2); (ii) 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1) 및 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3); (iii) 클래스 I, Ec 이형체 (이형체 #1) 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4); (iv) 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2) 및 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3); (v) 클래스 II, Ea 이형체 (이형체 #2) 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4); (vi) 클래스 I, Eb 이형체 (이형체 #3) 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4)을 발현할 수 있는 이중 발현 컨스트럭트를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 이중 발현 컨스트럭트, pCK-IGF-1X6 또는 pCK-IGF-1X10를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 이중 발현 컨스트럭트, pTx-IGF-1X6 또는 pTx-IGF-1X10를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들면, pCK-IGF-1X6 및 pCK-IGF-1X10 모두를 포함하는 2 개의 이중 발현 컨스트럭트를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들면, pTx-IGF-1X6 및 pTx-IGF-1X10 모두를 포함하는 2 개의 이중 발현 컨스트럭트를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 또 다른 치료 제제를 추가로 포함한다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 신경병증을 치료하는데 효과적인 또 다른 치료 제제를 추가로 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.45 mg/ml, 0.5 mg/ml, 또는 1 mg/ml의 농도인 액체 조성물 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 단위 투여 제형은 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 또는 1mg/ml의 농도인 약제학적 조성물의 2 ml을 포함하는 바이알이다. 일부 구현예에서, 단위 투여 제형은 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 또는 1mg/ml의 농도인 약제학적 조성물의 1 ml을 포함하는 바이알이다. 일부 구현예에서, 단위 투여 제형은 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 또는 1mg/ml의 농도인 약제학적 조성물의 1 ml 미만을 포함하는 바이알이다.
일부 구현예에서, 단위 투여 제형은 바이알(vial), 앰플(ampule), 병(bottle), 또는 미리 채워진 주사기(pre-filled syringe)이다. 일부 구현예에서, 단위 투여 제형은 본 발명의 DNA 컨스트럭트의 0.01 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.25 mg, 0.5 mg, 1 mg, 2.5 mg, 5 mg, 8mg, 10 mg, 12.5 mg, 16 mg, 24 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 또는 200 mg를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 투여 제형에서의 약제학적 조성물은 액체인 제형이다. 다양한 구현예에서, 단위 투여 제형은 약제학적 조성물의 0.1 ml 및 50 ml 사이를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 투여 제형은 약제학적 조성물의 0.25 ml, 0.5 ml, 1 ml, 2.5 ml, 5 ml, 7.5 ml, 10 ml, 25 ml, 또는 50 ml을 포함한다.
특정 구현예에서, 단위 투여 제형은 미리 채워진 주사기, 자동-주사기, 및 자동-주사 펜을 포함하는 피하, 피부 내, 또는 근육 내 투여에 적합한 단위 투여 제형 구현예에서의 약제학적 조성물의 0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml 또는 2 ml을 포함하는 바이알이며, 각각은 상기 본원에 기재된 약제학적 조성물의 미리 결정된 양을 포함한다.
다양한 구현예에서, 단위 투여 제형은 주사기 및 미리 결정된 양의 약제학적 조성물을 포함하는 미리 채워진 주사기이다. 특정 미리 채워진 주사기 구현예에서, 주사기는 피하 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 주사기는 자가투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 미리 채워진 주사기는 1회-사용 주사기이다.
다양한 구현예에서, 미리 채워진 주사기는 약 0.1 mL 내지 약 0.5 mL의 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 주사기는 약 0.5 mL의 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 주사기는 약 1.0 mL의 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 주사기는 약 2.0 mL의 약제학적 조성물을 포함한다.
특정 구현예에서, 단위 투여 제형은 자동-주사 펜이다. 자동-주사 펜은 본원에 기재된 바와 같이 약제학적 조성물을 포함하는 자동-주사 펜을 포함한다. 일부 구현예에서, 자동-주사 펜은 미리 결정된 용량의 약제학적 조성물을 전달한다. 다른 구현예에서, 자동-주사 펜은 구성되어 사용자에 의해 설정된 부피의 약제학적 조성물을 전달한다.
다양한 구현예에서, 자동-주사 펜은 약 0.1 mL 내지 약 0.5 mL의 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 자동-주사 펜은 약 0.5 mL의 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 자동-주사 펜은 약 0.1 mL의 약제학적 조성물을 포함한다. 다른 구현예에서, 자동-주사 펜은 약 5.0 mL의 약제학적 조성물을 포함한다.
4.2.
동결 건조된 DNA 제형
일부 구현예에서, 본 발명의 DNA 컨스트럭트는 동결 건조된 조성물로 제형화 된다. 특정 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 미국 특허 번호 8,389,492에 개시된 바와 같이 동결 건조되며, 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 동결 건조 전에 특정 부형제, 예를 들면, 탄수화물 및 염과 함께 제형화 된다. 진단 또는 치료 제제로 사용되는 DNA 컨스트럭트의 안정성은 안정된 양의 탄수화물을 포함하는 수용성 용액과 함께 동결 건조되기 전에 DNA 컨스트럭트를 제형화 함으로서 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, 다른 탄수화물이 조성물에 사용된다. 탄수화물은 자당(sucrose), 포도당(glucose), 유당(lactose), 트레할로스(trehalose), 아라비노스(arabinose), 오탄당(pentose), 리보스(ribose), 자일로스(xylose), 갈락토스(galactose), 육탄당(hexose), 이도스(idose), 만노스(mannose), 탈로스(talose), 칠탄당(heptose), 과당(fructose), 글루콘산(gluconic acid), 소르비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 메틸 a-글루코피라노시드(methyl a-glucopyranoside), 말토스(maltose), 이소아스코르브산(isoascorbic acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 락톤(lactone), 소르보스(sorbose), 글루카르산(glucaric acid), 에리트로스(erythrose), 트레오스(threose), 알로스(allose), 알트로스(altrose), 굴로스(gulose), 에리트룰로스(erythrulose), 리불로스(ribulose), 자일룰로스(xylulose), 프시코스(psicose), 타가토스(tagatose), 글루쿠론산(glucuronic acid), 갈락투론산(galacturonic acid), 만누론산(mannuronic acid), 글루코사민(glucosamine), 갈락토사민(galactosamine), 뉴라민산(neuraminic acid), 아라비난(arabinans), 프락탄(fructans), 퓨칸(fucans), 갈락탄(galactans), 갈락투로난(galacturonans), 글루칸(glucans), 만난(mannans), 자일란(xylans), 레반(levan), 후코이단(fucoidan), 카라기난(carrageenan), 갈락토카롤로스(galactocarolose), 펙틴(pectins), 펙트산(pectic acids), 아밀로스(amylose), 풀루란(pullulan), 글라이코겐(glycogen), 아밀로펙틴(amylopectin), 셀룰로스(cellulose), 덱스트란(dextran), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 푸스툴란(pustulan), 키틴(chitin), 아가로스(agarose), 케라틴(keratin), 콘드로이틴(chondroitin), 더마탄(dermatan), 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginic acid), 잔탄검(xantham gum), 또는 녹말(starch)과 같은, 모노-, 올리고-, 또는 다당류(polysaccharide)가 될 수 있다.
일련의 구현예에서, 탄수화물은 만니톨 또는 자당이다.
동결 건조 전의 탄수화물 용액은 물 내의 탄수화물에 해당하거나, 또는 완충액이 포함될 수 있다. 이러한 완충액의 예시는 인산염 완충 식염수(PBS), 히피스(HEPES), 트리스(TRIS) 또는 트리스/이디티에이(TRIS/EDTA)를 포함한다. 전형적으로 탄수화물 용액은 약 0.05% 내지 약 30% 자당, 전형적으로 0.1% 내지 약 15% 자당, 0.2% 내지 약 5%와 같이, 10% 또는 15% 자당, 바람직하게는 약 0.5% 내지 10% 사이 자당, 1% 내지 5% 자당, 1% 내지 3% 자당, 및 가장 바람직하게는 약 1.1% 자당의 최종 농도로 DNA 컨스트럭트와 결합된다.
본 발명의 DNA 제형은 또한 염, 예를 들면, 염화 나트륨 또는 염화 칼륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염은 염화 나트륨이다. 일부 구현예에서, DNA 제형의 염은 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 5%, 약 0.1% 내지 4%, 약 0.5% 내지 2% , 약 0.8% 내지 1.5%, 약 0.8% 내지 1.2% w/v로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 양으로 존재한다. 특정 구현예에서, DNA 제형의 염은 약 0.9% w/v의 양으로 존재한다.
동결 건조된 제형으로부터 재용해 된 액체 조성물 내의 DNA 컨스트럭트의 최종 농도는 약 1 ng/mL 내지 약 30 mg/mL이 될 수 있다. 예를 들면, 최종 농도는 약 1 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 약 1 μg/mL, 약 5 μg/mL, 약 10 μg/mL, 약 50 μg/mL, 약 100 μg/mL, 약 200 μg/mL, 약 400 μg/mL, 약 500 μg/mL, 약 600 μg/mL, 약 800 μg/mL, 약 1 mg/mL, 약 2 mg/mL, 약 2.5 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 3.5 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 4.5 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 5.5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 20 mg/mL, 또는 약 30 mg/mL이 될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, DNA 컨스트럭트의 최종 농도는 약 100 μg/mL 내지 약 2.5 mg/mL이다. 본 발명의 특정 구현예에서, DNA 컨스트럭트의 최종 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 1 mg/mL이다.
본 발명의 DNA 제형은 본 기술 분야에 공지된 표준 조건하에서 동결 건조된다. 본 발명의 DNA 제형의 동결 건조를 위한 방법은 (a) 플라스미드 DNA가 IGF-1 유전자, 또는 그것의 변이체를 포함하는 DNA 제형 (예를 들면, 플라스미드 DNA를 포함하는 DNA 제형), 염 및 탄수화물이 담긴 용기 (예를 들면, 바이알)를 동결 건조기에 적재하며, 동결 건조기는 약 5°C 내지 약 -50°C의 시작온도를 갖는 단계; (b) DNA 제형을 영하의 온도 (예를 들면, -10°C 내지 -50°C)로 냉각하는 단계; 및 (c) DNA 제형을 실질적으로 건조하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 DNA 제형의 동결 건조를 위한 조건 (예를 들면, 온도 및 기간)은 동결 건조 매개변수 (예를 들면, 동결 건조 기계의 유형, 사용되는 DNA의 양, 및 사용되는 용기의 사이즈)에 영향을 미치는 요인을 고려하여 본 기술 분야의 일반적인 당업자에 의해 조정될 수 있다.
동결 건조된 DNA 제형을 담은 용기는 그 후에 봉인되고 다양한 온도에서 연장된 기간 동안 저장될 수 있다 (예를 들면, 실온 내지 약 -180°C, 바람직하게는 약 2-8°C 내지 약 -80° C, 더 바람직하게는 약 -20°C 내지 약 -80°C, 및 가장 바람직하게는 약 -20°C). 특정 측면에서, 동결 건조된 DNA 제형은 약 2-8°C 내지 약 -80°C의 범위내에서 실질적인 활성을 잃지 않고 최소 6 개월의 기간동안 바람직하게 안정하다. 플라스미드 DNA 제형의 안정한 저장은 또한 연구 또는 플라스미드-기반 치료와 같이 사용하기 전에 장기간동안 안정적인 형태로 플라스미드 DNA를 저장하는 것과 일치할 수 있다. 저장 기간은 몇 개월, 1 년, 5 년, 10 년, 15년, 또는 최대 20 년 만큼 길 수 있다. 바람직하게 준비된 것은 최소 약 3년의 기간동안 안정하다.
5.
신경병증 치료 방법
또 다른 측면에서, 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트를 투여함으로서 신경병증을 치료하는 방법이 제시된다.
6.5.1.
이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트의 투여
방법은 치료적으로 효과적인 양의 인간 IGF-1 이형체를 발현하는 DNA 컨스트럭트를 대상(subject)에게 투여하는 것을 포함한다. 대상(subject)은 신경병증이 있는 사람 또는 동물일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 1 개의 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 제 1 DNA 컨스트럭트의 투여 또는 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 제 2 DNA 컨스트럭트의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제 1 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 제 1 DNA 컨스트럭트의 투여 및 제 2 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 제 2 DNA 컨스트럭트의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 이형체는 클래스 I, Ec (이형체 #1)이고 제 2 IGF-1 이형체는 클래스 I, Ea (이형체 #4)이다. 일부 구현예에서, 제 1 IGF-1 이형체는 클래스 I, Ea (이형체 #4)이고 두번째 IGF-1 이형체는 클래스 I, Ec (이형체 #1)이다. 제 1 및 제 2 DNA 컨스트럭트는 함께 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 이중 발현 컨스트럭트인 1 개 초과의 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 클래스 I, Ec (이형체 #1) 및 클래스 I, Ea 이형체s (이형체 #4) 모두를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 추가로 클래스 I, Eb 또는 클래스 II, Ea를 발현한다. 일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 클래스 I, Eb 또는 클래스 II, Ea를 발현할 수 없다. 일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 클래스 I, Ec (이형체 #1) 및 클래스 I, Ea 이형체 (이형체 #4)을 발현할 수 있지만, 임의의 다른 IGF-1 이형체는 발현할 수 없다.
일부 구현예에서, 방법은 다음을 포함하는 인간 IGF-1을 인코딩하는 DNA 컨스트럭트의 투여를 포함한다: 인간 IGF-1 유전자의 엑손 1, 3 및 4 (서열번호 1)와 같은 서열을 갖는 제 1 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트; 인간 IGF-1 유전자의 인트론 4 (서열번호 2)와 같은 서열을 갖는 제 2 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 절편; 인간 IGF-1 유전자의 엑손 5 및 6-1 (서열번호 3)와 같은 서열을 갖는 제 3 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트; 인간 IGF-1 유전자의 인트론 5 (서열번호 4)와 같은 서열을 갖는 제 4 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 절편; 및 인간 IGF-1 유전자의 엑손 6-2 (서열번호 5)와 같은 서열을 갖는 제 5 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 디제너레이트, 여기에서 제 1 폴리뉴클레오타이드, 제 2 폴리뉴클레오타이드, 제 3 폴리뉴클레오타이드, 제 4 폴리뉴클레오타이드 및 제 5 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 순서로 순차적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 방법은 pCK-IGF-1X6 또는 pCK-IGF-1X10의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 pTx-IGF-1X6 또는 pTx-IGF-1X10의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 제공되는 1 개 초과의 DNA 컨스트럭트의 투여를 포함한다.
5.1.1.
전달 방법
다양한 전달 방법은 IGF-1의 1 개 이상의 이형체를 발현하는 DNA 컨스트럭트를 투여하기 위해 사용될 수 있다.
5.1.1.1.
주사(Injection)
일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 액체 약제학적 조성물의 주사에 의해 투여된다.
현재 바람직한 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 근육 내 주사에 의해 투여된다. 일반적으로, DNA 컨스트럭트는 신경 손상 부위, 통증 부위 또는 환자가 인지하는 통증 부위, 또는 신경병성 질병의 다른 증상의 부위에 가깝게 근육 내 주사를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 대상(subject)의 손, 발, 다리, 또는 팔의 근육에 투여된다.
일부 구현예에서, 컨스트럭트는 피하 또는 피부 내에 주사된다.
일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 정맥 내 전달로 투여된다. 특정 구현예에서, 컨스트럭트는 역행성(retrograde) 정맥 내 주사로 주사된다.
5.1.1.2.
전기천공(Electroporation)
플라스미드 DNA의 생체 내 세포로의 형질전환 효율은 일부 경우에 주사 후 전기천공을 수행함으로서 개선될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 주사 후 전기천공으로 투여된다. 특정 구현예에서, 전기천공은 TriGrid™ 전달 시스템 (Ichor Medical Systems, Inc., 샌디에고, 미국)을 사용하여 투여된다.
5.1.1.3.
소노포레이션(Sonoporation)
일부 구현예에서, 소노포레이션이 사용되어 본 발명의 DNA 컨스트럭트의 형질전환 효율을 강화시킨다. 소노포레이션은 초음파를 사용하여 일시적으로 세포막을 투과화하여 DNA의 세포 흡수를 허용한다. DNA 컨스트럭트는 미세 기포 내에 통합되어 전신 순환으로 투여된 다음 초음파를 외부 적용할 수 있다. 초음파는 타겟 조직 내에서 미세 기포의 공동현상(cavitation)을 유도하여 컨스트럭트의 방출 및 형질감염을 초래한다.
5.1.1.4.
마그네토펙션(Magnetofection)
일부 구현예에서, 마그네토펙션이 사용되어 본 발명의 DNA 컨스트럭트의 형질감염 효율을 강화시킨다. 컨스트럭트는 자성을 지닌 나노 입자에 결합된 후에 투여된다. 고 구배(high gradient) 외부 자석의 적용은 복합물이 타겟에 포착되고 고정되는 것을 야기한다. DNA 컨스트럭트는 가교(cross linking) 분자의 효소적 절단, 전하 상호 작용 또는 기질의 분해에 의해 방출될 수 있다.
5.1.1.5.
리포좀(Liposome)
일부 구현예에서, 본 발명의 DNA 컨스트럭트는 리포좀에 의해 전달될 수 있다. 리포좀은 인지질이 과량의 수용성 매질에 현탁 될 때 자발적으로 형성된다. 리포좀-매개 DNA 전달은 Dos Santos Rodrigues et al., Int. J. Pharm. 566:717-730 (2019); Rasoulianboroujeni et al., Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 75:191-197 (2017); Xiong et al., Pharmazie 66(3):158-164 (2011); Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)에 기술된 바와 같이 성공적으로 진행되어 왔다. 리포좀을 사용하여 동물 세포를 형질 감염시키기 위한 상업적으로 접근 가능한 제제의 예에는 리포펙타민(Lipofectamine (Gibco BRL))이 포함된다. 본 발명의 DNA 컨스트럭트를 포획하는 리포좀은 세포 내 이입(endocytosis), 흡착(adsorption) 및 융합(fusion)과 같은 메커니즘에 의해 세포와 상호 작용한 다음 서열을 세포로 전달한다.
5.1.1.6.
형질감염(Transfection)
바이러스 벡터가 IGF-1을 인코딩하는 DNA 컨스트럭트를 전달하기 위해 사용될 때, 컨스트럭트는 본 기술 분야의 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 의해 세포 내로 전달될 수 있다. 바이러스 벡터를 사용하는 숙주 세포의 감염은 상기-언급된 인용된 문헌에 기술되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있다. 비-경구 투여의 경우, 정맥 내 주사, 복강 내 주사, 근육 내 주사, 피하 주사, 또는 국소 주사 등이 사용될 수 있다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 역행성 정맥 내 주사로 주사 될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 근육 내에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 신경병증에 의해 영향을 받는 근육을 타겟한다 (예를 들면, 신경병성 통증 또는 다른 증상).
5.1.2.
용량(Dose)
DNA 컨스트럭트는 치료적으로 효과적인 용량으로 투여될 수 있다. 본원에 기술된 방법에서, 치료적으로 효과적인 용량은 대상(subject)의 신경병증을 치료하기에 효과적인 용량이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 1 μg 내지 200 mg, 1 mg 내지 200 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 20 mg, 5 mg 내지 10 mg, 16 mg, 8 mg, 또는 4 mg의 총 용량으로 투여된다.
전형적인 구현예에서, 총 용량은 복수의 개별적인 주사 용량으로 분할된다. 일부 구현예에서, 총 용량은 복수의 동일한 주사 용량으로 분할된다. 일부 구현예에서, 총 용량은 동일하지 않은 주사 용량으로 분할된다.
다양한 분할된 용량 구현예에서, 총 용량은 4, 8, 16, 24, 32 또는 64의 다른 주사 부위에 투여된다.
일부 구현예에서, 주사 당 용량은 0.1 내지 20 mg, 1 내지 10 mg, 2 내지 8 mg, 또는 3 내지 8 mg이다. 특정 구현예에서, 주사 당 용량은 0.1 mg, 0.15 mg, 0.2 mg, 0.25 mg, 0.3 mg, 0.35 mg, 0.4 mg, 0.45 mg, 0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg, 8 mg, 16 mg, 또는 32 mg이다.
총 용량은 1 회 방문 또는 2 회 이상의 방문동안 투여될 수 있다.
전형적인 분할된 용량 구현예에서, 모든 복수의 주사 용량은 상호 1 시간 이내에 투여된다. 일부 구현예에서, 모든 복수의 주사 용량은 상호 1.5, 2, 2.5 또는 3 시간 이내에 투여된다.
방법의 다양한 구현예에서, 단일 단위의 용량으로 투여되거나 복수의 주사 용량으로 분할된 DNA 컨스트럭트의 총 용량은 대상(subject)에게 단 1 회 투여된다.
일부 구현예에서, 1 회, 2 회, 3 회 또는 4 회 방문에 걸쳐 총 용량의 DNA 컨스트럭트를 복수의 주사 부위로 투여하는 것은 단일 주기를 포함할 수 있다. 특히, 64 mg, 32 mg, 16 mg, 8 mg, 또는 4 mg의 DNA 컨스트럭트를 2 회 방문에 걸쳐 복수의 주사 부위로 투여하는 것은 단일주기를 포함할 수 있다. 2 회 방문은 3, 5, 7, 14, 21 또는 28 일의 간격이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 주기는 반복될 수 있다. 주기는 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 또는 그 이상 반복될 수 있다.
일부 구현예에서, 주기는 이전의 주기 후에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 이상 반복될 수 있다.
일부 구현예에서, 차후의 주기에 투여되는 총 용량은 이전의 주기에 투여된 총 용량과 동일하다. 일부 구현예에서, 차후의 주기에 투여되는 총 용량은 이전의 주기에 투여된 총 용량과 다르다.
현재의 바람직한 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 영향을 받은 사지 당 8 mg의 용량으로 투여되며, 다수의 근육 내 주사 및 다수의 방문으로 균등하게 분할되며, 여기서 임의의 단일 방문에서의 각각의 복수의 주사는 분리된 주사 부위에서 수행된다. 특정 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 영향을 받은 사지 당 8 mg의 용량으로 투여되며, 0 일에 사지 당 4 mg의 제 1 용량 및 14 일에 사지 당 4 mg의 제 2 용량으로 균등하게 분할되며, 여기서 제 1 및 제 2 용량의 각각은 다수의 주사 용량으로 균등하게 분할된다. 일부 구현예에서, 영향을 받은 사지 당 8 mg의 용량으로의 DNA 컨스트럭트의 투여는 1 회 주기를 구성한다. 주기는 1 회, 2 회, 3 회 또는 그 이상으로 반복될 수 있다.
투여되는 실제의 양, 및 투여 속도 및 시간-과정은 치료될 신경병증의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 전형적인 구현예에서, DNA 컨스트럭트는 신경병증의 증상, 예를 들면, 신경병성 통증을 감소시키는데 효율적인 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 양은 투여의 1 주 이내에 신경병증의 증상을 감소시키기에 효율적이다. 일부 구현예에서, 상기 양은 투여의 2 주, 3 주, 또는 4 주 이내에 신경병증의 증상을 감소시키기에 효율적이다.
일부 구현예에서, 컨스트럭트의 2 개의 다른 유형은 함께 투여되어 IGF-1의 2 개의 이형체의 발현을 유도한다. 예를 들면, 클래스 I, Ec 이형체를 인코딩하는 제 1 컨스트럭트 및 클래스 I, Ea 이형체를 인코딩하는 제 2 컨스트럭트. 일부 구현예에서, 클래스 I, Ec 이형체 및 클래스 I, Ea 이형체 모두를 인코딩하는 이중 발현 컨스트럭트는 전달되어 두 이형체 모두의 발현을 유도한다.
당업자에게 공지된 종래의 기술에 따르면, 약제학적 조성물은 상기 기술한 바와 같이 약제 학적으로 허용되는 담체 및/또는 운반체와 함께 제형화 될 수 있으며, 마지막으로 여러 형태의 단위 투여 제형 및 다중-투여 제형을 제공한다. 제형의 비-제한적인 예는 기름 또는 수용성 매질 중의 현탁액 또는 에멀젼, 추출물, 엘릭시르(elixir), 분말, 과립, 정제 및 캡슐을 포함 하나 이에 한정되지 않으며, 분산 제제 또는 안정제를 추가로 포함할 수 있다.
5.1.3.
변형(Variations)
최적의 투여 범위를 확인하는데 도움이 되도록 생체 내 및/또는 시험관 내 시험법이 선택적으로 사용될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 투여 경로 및 상태의 심각성에 따라 달라질 것이며, 전문가의 판단 및 각 대상(subject)의 상황에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 얻은 용량-반응 곡선으로부터 외삽법(extrapolation)에 의해 추정될 수 있다.
DNA 컨스트럭트는 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
5.2.
신경병증 환자
본원에 기술된 방법에서, 치료를 위해 선택되는 환자는 신경병증을 가지고 있다. 환자는 말초 신경병증, 두개골 신경병증, 자율 신경병증 또는 국소 신경병증을 가질 수 있다. 신경 병증은 질병, 부상, 감염 또는 비타민 결핍 상태로 인해 발생될 수 있다. 예를 들면, 신경 병증은 당뇨병, 비타민 결핍, 자가 면역 질환, 유전적 또는 유전되는 장애, 아밀로이드증, 요독증, 독소 또는 독, 외상 또는 부상, 종양에 의해 유발될 수 있고, 또는 특발성(idiopathic) 일 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 당뇨병성 말초 신경병증을 가진다.
환자는 통증 (신경병성 통증), 기타 감각적인 결함 (예를 들면, 감각 상실, 무감각, 저림, 등), 운동 결함 (예를 들면, 약함, 반사 작용 상실, 근육량 상실, 경련, 기민성 상실, 등), 및 자율신경 장애 (예를 들면, 메스꺼움, 구토, 발기부전, 현기증, 변비, 설사, 등)와 같은 신경병증과 연관된 1 개 이상의 증상을 가질 수 있다.
환자는 본원에 제공된 치료 방법에 추가하여 본 기술 분야에 공지된 1 개 이상의 치료 방법에 의해 치료될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 인간 환자 또는 신경병증이 있는 동물을 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 제시되어 본 발명을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것, 또는 하기 수행된 실험이 모두 또는 유일한 실험임을 나타내기 위해 의도되는 것이 아니다. 사용된 숫자 (예를 들면, 양, 온도, 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 만들어져 왔지만 일부 실험적인 오류 및 편차는 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부분은 중량부(parts by weight)이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 그 근처이다. 표준 약어는, 예를 들면, bp, 베이스 페어(s); kb, 킬로 베이스(s); pl, 피코 리터(s); s 또는 sec, 초(s); min, 분(s); h 또는 hr, 시(s); aa, 아미노산(s); nt, 뉴클레오타이드(s); 및 그와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 당 업계의 기술 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다.
실시예 1:
IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트는 쥐 CCI 신경병증 모델에서 기계적 이질통을 감소시켰다.
개별적인 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 DNA 컨스트럭트는 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 발현 플라스미드 pCK에 구축되었다.
구체적으로, 바이오니아 (한국)에서 제공하는 맞춤형 DNA 합성 공정을 통해 4 개의 폴리뉴클레오타이드 (SEQ ID NOS: 15, 17, 19 및 21)를 얻었다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 5' 링커, Cla I 및 3' 링커, Sal I으로 합성되었다. pCK 벡터 및 폴리뉴클레오타이드는 Cla I 및 Sal I 로 제한(restriction)되었다. 클래스 I, Ec (이형체 #1)을 인코딩하는 플라스미드 #1은 서열번호 17의 폴리뉴클레오타이드를 삽입함으로서 생성되었고, 그것은 클래스 I, Ec 이형체의 코딩 서열이며 pCK 벡터의 클로닝 부위에 IGF-1 유전자의 엑손 1, 3/4, 5 및 6의 적어도 일부를 포함한다. 클래스 II, Ea (이형체 #2)을 인코딩하는 플라스미드 #2는 서열번호 19의 폴리뉴클레오타이드를 삽입함으로서 생성되었고, 그것은 클래스 II, Ea 이형체의 코딩 서열이며 pCK 벡터의 클로닝 부위에 IGF-1 유전자의 엑손 2, 3/4, 및 6의 적어도 일부를 포함한다. 클래스 I, Eb (이형체 #3)을 인코딩하는 플라스미드 #3은 서열번호 21의 폴리뉴클레오타이드를 삽입함으로서 생성되었고, 그것은 클래스 I, Eb 이형체의 코딩 서열이며 pCK 벡터의 클로닝 부위에 IGF-1 유전자의 엑손 1, 3/4 및 5의 적어도 일부를 포함한다. 클래스 I, Ea (이형체 #4)을 인코딩하는 플라스미드 #4은 서열번호 15의 폴리뉴클레오타이드를 삽입함으로서 생성되었고 pCK 벡터의 클로닝 부위에 엑손 1, 3/4 및 6의 적어도 일부를 포함한다.
각각의 플라스미드로부터 각 IGF-1 이형체의 발현은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 테스트되고 확인되었다.
DNA 컨스트럭트의 치료적인 효과는 그 후에 CCI 마우스에서 테스트되었고, 그 모델은 신경병증을 연구하는데 널리 수용되는 모델이다. 좌골 신경의 만성 수축 손상 (CCI)에 의해 생성된 CCI 마우스 모델은 말초에 만성 신경 손상을 초래하는 여러 과정을 개시하는 것으로 알려져 있다. CCI 마우스는 또한 신경병성 통증을 가지는 것으로 알려져 있다. CCI 수술은 성체 수컷 ICR 마우스 (24 내지 26 g의 체중)를 대상으로 서울대학교(Seoul National University) 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use committee)의 승인을 받은 수술 및 실험 절차에 따라 수행되었다.
특히, 약 1 cm 길이의 무딘(blunt) 절개는 마취 하에 실시되어 일반적으로 둔근(gluteus) 및 대퇴 이두근(biceps femoris) 사이에 있는 오른쪽 좌골 신경이 노출되었다. 삼분기(trifurcation) 부위에 인접한 좌골 신경이 노출되면, 그것은 6-0 실크 (Ethicon) 봉합사(suture)를 사용하여 0.5 mm 간격으로 3 회의 느슨한 결찰(ligature)이 주어졌다. 결찰은 오른쪽 뒷다리가 눈에 띄게 경련 될 때까지 약간 조여졌다. 샴-오퍼레이티드(sham-operated) 마우스는 오른쪽 허벅지에서 동일한 절개를 받았지만 좌골 신경에는 결찰을 받지 않았다.
도 2a에 도식화된 바와 같이, 총 200 μg의 플라스미드 DNA는 CCI 수술 당일에 근육 내에 주사된다. 주사 된 플라스미드 DNA는 pCK (삽입 없는 벡터; "pCK") 200 ug 또는 pCK-IGF-1 200 ug이다. - (i) 플라스미드#1 (클래스 I, Ec IGF-1을 인코딩하는 "IGF-1#1") 200 μg; (ii) 플라스미드#4 (클래스 I, Ea IGF-1을 인코딩하는 "IGF-1#4") 200 μg 또는 (iii) 플라스미드#1 (클래스 I, Ec IGF-1을 인코딩하는 "IGF-1#1") 100 μg 및 플라스미드#4 ("IGF-1#4" encoding 클래스 I, Ea IGF-1을 인코딩하는 "IGF-1#4") 100 μg.
CCI 수술 1 주 후에, 기계적 이질통의 발생이 Von Frey의 필라멘트 테스트를 사용하여 평가되었다. 간단히 말해, 동물은 적응을 위해 금속 메쉬 바닥의 위에 있는 실린더에 개별적으로 배치되었다. 마우스의 기계적 민감성은 필라멘트 (0.16g)의 일정한 두께를 사용하여 뒷발을 자극함으로서 평가되었다. 테스트는 그 후에 매주 반복되었다. 결과는 IGF 1 클래스 I Ec를 발현하는 IGF-1 # 1의 주사가 벡터 단독과 비교하여 발 철회 빈도에서 측정 가능한 감소를 제공했음을 입증한다.
도 2b는 도 2a에 기술된 CCI 실험에서 측정된 발 회피의 빈도 (%)를 요약한 히스토그램이다. 결과는 (i) IGF 1 Class I Ec를 발현하는 IGF-1 #1의 주사가 벡터 단독 (pCK)과 비교하여 발 회피 빈도에서 측정 가능한 감소를 제공했음; (ii) IGF 1 Class I Ea를 발현하는 IGF-1 #4의 주사 또한 발 회피 빈도에서 측정 가능한 감소를 제공했음; 및 (iii) IGF-1 클래스 I Ec (IGF-1 #1) 및 클래스 I Ea (IGF-1 #4)를 함께 발현하는 DNA 컨스트럭트의 주사는 벡터 단독 (pCK)과 비교하여 더 크고, 통계적으로 유의미한 발 회피 빈도의 감소를 제공했음을 증명한다.
모든 값은 3 회의 독립적인 실험으로부터 평균 ± 표준 오차 평균 (SEM)으로 표시된다. 값 사이의 차이는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)에 이어 투키 사후검정(Tukey's post-hoc test) 또는 본페로니 다중 비교 테스트(Bonferroni's multiple comparison test)로 결정되었다.
실시예 2:
DNA 컨스트럭트는 IGF-1 클래스 I Ec 및 클래스 I Ea 이형체 모두를 발현할 수 있었다.
IGF-1 클래스 I Ec (IGF-1 #1)를 발현하는 DNA 컨스트럭트 및 클래스 I Ea (IGF-1 #4)를 함께 발현하는 또 다른 DNA 컨스트럭트는 상기 기술된 행동 실험에서 기계적 이질통에서 더 크고 통계적으로 더 중요한 영향을 미치기 때문에, 우리는 RNA 전사체의 선택적 스플라이싱을 통해 IGF-1 클래스 I Ec (IGF-1 #1) 및 클래스 I Ea (IGF-1 #4)를 모두 동시에 발현하도록 설계된 여러 플라스미드를 구축하였다. 특히, DNA 컨스트럭트는 엑손 1, 3/4, 5 및 6 및 IGF-1 유전자의 인트론 또는 그것들의 단편에 대한 서열을 포함하도록 생성되었다. 다른 변이체를 포함하는 여러 DNA 컨스트럭트는 생성되었고 그것들의 능력에 대한 테스트가 진행되어 IGF-1 클래스 I Ec 이형체 및 클래스 I Ea 이형체 모두가 발현되었다.
각각의 플라스미드는 pCK 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 삽입체를 포함하도록 플라스미드 백본으로서 pCK를 사용하여 구축되었다. 삽입체는 다음을 연결시킴으로서 생성되었다. (1) 인간 IGF-1 엑손 1, 3, 및 4 (서열번호1)를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (2) 제2 폴리뉴클레오타이드, IGF-1 인트론 4 (서열번호 2) 또는 그것의 절편 중 하나; (3) 엑손 5 및 6-1 (서열번호 3)을 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드; (4) 제4 폴리뉴클레오타이드, 인트론 5 (서열번호 4) 또는 그것의 절편 중 하나; 및 (5) 엑손 6-2 (서열번호 5의)를 인코딩하는 제5 폴리뉴클레오타이드, 여기에서 제1 폴리뉴클레오타이드, 제2 폴리뉴클레오타이드, 제3 폴리뉴클레오타이드, 제4 폴리뉴클레오타이드 및 제5 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 순서로 순차적으로 연결된다. 플라스미드는 인트론 4 및/또는 인트론 5의 절편의 크기에서 달랐다. 구체적으로, 서열번호 6은 벡터 pCK-IGF-1X6에서 사용되는 인트론 4 절편의 뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 서열번호 7은 벡터 pCK-IGF-1-X10에서 사용되는 인트론 4 절편의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 서열번호 8은 벡터 pCK-IGF-1X6 및 pCK-IGF-1X10에서 사용되는 인트론 5 절편의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
생체 내에서 다양한 컨스트럭트로부터 이형체 1 (클래스 I, Ec) 및 이형체 4 (클래스 I, Ea)의 발현을 테스트하기 위해, 9 주령 수컷 C57BL/6 수컷 마우스의 T.A. (전경골(tibialis anterior)) 근육에 50 μg 플라스미드가 주사 되었다. 그들의 전경골근은 주사 5 일 후에 채취되었다. 상기 골격근은 그 후에 폴리 프로필렌 페슬 (Bel-Art Scienceware)을 사용하여 단백질분해효소 억제제, 탈인산화효소 억제제 칵테일 (Roche Diagnostic Ltd.), 및 PMSF (Sigma)를 포함하는 용해 버퍼에서 균질화되었다. 샘플은 4°C에서 15 분 동안 12,000 rpm으로 원심 분리되었고, 총 단백질을 포함하는 상층액은 제조업체의 프로토콜에 명시된 대로 인간 IGF-1 ELISA (R&D Systems)에 사용되었다. 검출된 IGF-1의 수준은 BCA 단백질 분석 키트 (Thermo, 일리노이 주, 미국)로 측정되어 조직 유래의 단백질 추출물의 총량이 일반화(normalization)되었다. 실험적인 절차는 도 3a에 요약되어 있다.
도 3b에 도시된 바와 같이, 마우스 T.A 근육에서 인간 IGF-1 단백질의 총 발현 수준은 ELISA에 의해 결정되었다. 마우스가 단일 이형체 ("1" (클래스 I, Ec) 또는 "4" (클래스 I, Ea))을 발현하는 컨스트럭트의 50 ug, 이형체 #1 (클래스 I, Ec)을 발현하는 제 1 컨스트럭트의 25 ug 더하기 이형체 #4 (클래스 I, Ea)을 발현하는 제 2 컨스트럭트의 25 ug ("1+4"), 또는 두 이형체를 발현하는 컨스트럭트 pCK-IGF-1X6 ("X6") 또는 pCK-IGF-1X10 ("X10") 50 μg을 받았는지 여부에 관계없이, 인간 IGF-1 단백질의 총 발현 수준은 유사하였다.
우리는 RT-PCR을 사용하여 컨스트럭트가 이형체 #1 및 이형체 #4 모두에 대한 성숙한(mature) 전사체를 동시에 발현하는지 확인하였다. RT-PCR 반응은 엑손 3/4에 붙는 앞방향/왼쪽 프라이머 (L) 및 엑손 6에 붙는 역방향/오른쪽 프라이머 (R)로 수행되었다. 도 3c에 추가로 설명된 바와 같이, 이형체 # 1 (클래스 I, Ec)에 대한 전사체의 RT-PCR은 두 가지 앰플리콘 - 178 bp 앰플리콘 및 259 bp 앰플리콘을 생성하는 반면에, 이형체 #4 (클래스 I, Ea)에 대한 전사체의 RT-PCR은 129 bp의 단일 앰플리콘을 생성한다.
RT-PCR을 수행하기 위해, 골격근이 수집되었고, 폴리프로필렌 페슬 (Bel-Art Scienceware)을 사용하여 기계적으로 균질화 되었고, RNAiso plus (타카라(Takara))를 사용하여 추출되었다. RNA 정량은 나노드랍(nanodrop) 기기를 사용함으로서 수행되었다. 동일한 양의 RNA를 사용하여 Reverse Transcriptase XL (AMV) (타카라)를 통해 cDNA가 합성되었고, PCR은 도 3c에 제시된 앞방향 (TGA TCT AAG GAG GCT GGA (서열번호 28)) 및 역방향 (CTA CTT GCG TTC TTC AAA TG (서열번호 29)) 프라이머를 사용하여 수행되었다.
도 3d에 도시된 바와 같이, pCK-IGF-1X6 및 pCK-IGF-1X10은 이형체 #1 (178bp 및 259bp 밴드) 및 이형체 #4 (129bp 밴드) 모두에 대한 성숙한 전사체를 발현하였다. 이형체 #1 및 이형체 #4 모두에 대한 성숙한 전사체의 발현은 pCK-IGF-1X6 및 pCK-IGF-1X10 이외의 컨스트럭트에서는 검출되지 않았으며, 그에 대한 데이터는 본원에 제공되지 않는다.
2 개의 이형체 전사체가 모두 효과적으로 단백질로 번역되었다는 것을 확인하기 위하여, 도 4a에 도시된 바와 같이, 우리는 pCK-IGF-1-X6 또는 pCK-IGF-1-X10를 293T 세포에 형질감염 시켰다. 면역블랏팅(immunoblotting)을 위해, 세포는 플라스미드 DNA의 형질감염 2 일 (48 시간) 후에 준비되었고, 이어서 단백질분해효소 및 탈인산화효소 억제제 칵테일 (로슈 진단(Roche Diagnostic Ltd.))이 포함되어 있는 RIPA 버퍼를 사용하여 용해되었다. 동일한 양의 단백질이 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 분리되었고, 웨스턴 멤브레인 (PVDF)로 옮겨졌다. 멤브레인은 1% BSA (인비트로젠-깁코(Invitrogen-Gibco))가 들어있는 TBST (20 mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH 7.4, 0.9% 염화 나트륨, 및 0.1% 트윈20(Tween20))로 1 시간 동안 블락킹(blocking) 되었고, 밤새 4 °C에서 블락킹 용액에 희석된 1 차 항체로 탐침(probe) 되었다. IGF-1 이형체 1 및 이형체 4의 수준을 시험하기 위해 사용된 1 차 항체는 앱클론(Abclon) (한국)에서 제공되었고, IGF-1 및 베타-액틴(β-actin)에 대한 1 차 항체는 앱캠(Abcam) (영국) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미국)에서 구매하였다. TBST로 세척한 후에, 멤브레인은 실온에서 1 시간 동안 HRP-접합 염소 항-마우스 또는 토끼 IgG 2 차 항체 (시그마(Sigma))와 함께 인큐베이션(incubation) 되었다. 그 후 블랏(blot)은 TBST로 3 회 세척되었고, 단백질 밴드는 강화된 화학발광 시스템 (밀리포어(Millipore))로 시각화 되었다. 베타-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다.
도 4b에 제시된 웨스턴 블로팅(western blotting) 데이터는 pCK-IGF-1X6 및 pCK-IGF-1X10 모두가 단백질 수준의 IGF-1의 이형체를 발현한다는 것을 확인한다.
실시예 3:
IGF-1 클래스 I Ec 이형체 및 클래스 I Ea 이형체를 동시에 발현하는 DNA 컨스트럭트는 쥐 CCI 신경병증 모델에서 기계적 이질통을 감소시켰다.
실시예 1에 기술되어 있고, 도 5a에 도식화된 프로토콜을 사용하여, 우리는 쥐 CCI 신경병증 모델에서 기계적 이질통을 감소시키는 우리의 DNA 컨스트럭트의 능력을 테스트하였다.
도 5b는 발 회피 빈도를 나타내며, IGF-1 이형체 (IGF-1 #1, IGF-1 #4, IGF-1 #1 + #4, IGF-1X6, 및 IGF-1X10)을 인코딩하는 컨스트럭트의 동시적인 근육 내 주사 후에 기계적인 이질통에서 통계적으로 유의미한 감소를 증명하는 히스토그램이다. 특히, 기계적 이질통에서의 효과는 마우스에 IGF-1 이형체 #1 및 #4를 인코딩하는 컨스트럭트를 단독으로 투여하거나, 이중 발현 컨스트럭트 pCK-IGF-1X10을 주사했을 때 훨씬 더 좋았다.
실시예 4:
IGF-1 클래스 I Ec 이형체 및 클래스 I Ea 이형체를 동시에 발현하는 DNA 컨스트럭트는 쥐 신경 손상 모델에서 축삭(axon) 성장을 유도하였다.
DNA 컨스트럭트의 치료적인 효과는 신경 손상 모델에서 추가로 테스트되었다. 신경 손상 모델은 서울대학교(Seoul National University) 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use committee)의 승인된 외과 및 실험적 절차에 따라 성체 수컷 C57BL/6 마우스 (24 내지 26 g의 체중)로 생성되었다. 좌골 신경 손상을 유도하기 위해, 각 쥐의 오른쪽 좌골 신경은 절개에 의해 노출되었고 상기 신경은 미세 지혈 포셉(hemostatic forceps)으로 15 초 동안 손상되었다. 절개는 그 후에 5-0 검정 실크 봉합사를 사용하여 봉합되었다. 플라스미드 DNA 200 ug (pCK 200 ug, 또는 pCK-IGF-1X10 200 ug)의 총량은 좌골 신경 근방의 근육에서 신경 손상 당일에 근육 내로 투여되었다.
신경 손상 및 플라스미드 DNA 주사 후 4 주 (28 일)에, 쥐는 0.1 M 인산염 완충 식염수(PBS)에 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) + 2% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 관류하여 고정되었다. 오른쪽 동측 좌골 신경이 그 후에 준비되었고 고정 용액과 함께 4 시간 동안 추가로 인큐베이션 되었다. 고정된 조직은 0.1 M 인산염 완충 식염수(PBS)에 1% 사산화 오스뮴(osmium tetroxide)가 처리되었고, 이어서 밤새 2% 수용성 아세트산 우라닐(uranyl acetate)을 사용하여 en bloc 염색을 하였다. 다음 날, 조직은 30% 내지 100% 에탄올에서 10 분 동안 연속적인 계대에 의해 탈수되었고, 탈수된 조직은 그 후에 레진 화합물(resin compound)에 포매(embedding)되었다. 포매 과정 후에, 샘플은 Spurr 레진으로 중합되었고 건조 오븐에서 인큐베이션 되었다. 샘플은 그 후에 단면화 되었고 투과 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 시각화 되었다.
샴 동물, pCK가 처리된 동물, 및 pCK-IGF-1X10가 처리된 동물로부터 나온 샘플의 TEM 이미지는 도 6a에 제공된다. 이미지는 신경 손상 동물이 샴 동물과 비교하여 실질적인 신경 손상을 실질적으로 더 작은 축삭 직경과 함께 가진다는 것을 명백히 증명한다. 축삭 직경의 감소는 pCK-IGF-1X10의 투여에 의해 저해되지만, pCK의 투여에 의해서는 저해되지 않았다.
축삭 성장에서의 pCK-IGF-1X10의 효과는 뉴런 직경을 측정함으로서 정량화되었다. pCK ("Crush-pCK")가 처리된 신경 손상 동물 및 pCK-IGF-1X10 ("Crush-X10")가 처리된 신경 손상 동물에서의 뉴런 직경의 분포는 도 6b에 제공된다. 그래프는 pCK-IGF-1X10가 처리된 동물이 더 큰 직경을 갖는 뉴런을 가지고 있음을 명확히 한다. 이것은 pCK-IGF-1X10이 축삭 성장을 유도함으로서 신경 손상을 치료할 수 있음을 다시 확인한다.
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 문서는 각각의 개별적인 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문서가 모든 목적을 위해 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 표시된 것과 같이 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
다양한 특정 구현예가 설명되고 기술되는 동안, 상기 명세서는 제한적이지 않다. 본 발명(들)의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 다양한 변형들이 본 명세서를 검토함에 있어서 당업자들에게 명백해질 것이다.
<110> NEUROMYON INC.
<120> TREATMENT OF NEUROPATHY WITH DNA CONSTRUCTS EXPRESSING IGF-1
ISOFORMS
<130> PP190031KR
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<160> 29
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<210> 1
<211> 402
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga ag 402
<210> 2
<211> 1505
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc 180
tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac 240
atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagcc 300
cttggcaaat aatgtgatgt acccaagcct cagtttcatc agtaacattg ggataataat 360
aatatctacc acatcagttt gttgtcaaaa ttaagtagct catgcatata ctttgagatg 420
cttttcacat gcctgcataa agtaattgtt ggaccatcgt taatgtctgc cataattgca 480
cttaataaca aagcttgtaa cctttcaagt tctgagattc tacaatcttc caaagaaaat 540
aaaaggctaa tgggaactat tcaaaattca tattcagtag caagcataat taaacatgaa 600
acattaaaaa tagaaatttc tgtttggcta taagaatgcc tagacatttg taatgatcaa 660
aatctgcagg catcattttc taagagctag actgtaaaca aacctcagag gtaccaacta 720
tgccatcagt agtacataaa acatctgatg cacatttagt cacttgatcg atttctcttg 780
aatgagtgaa cgaatgaaca aatgaatata agagattaaa attttagcca ttaagtagaa 840
agaataagaa ctaaagagaa ggtaaaggag gaaaaagaga aggcaaggaa gttgagtaag 900
ggaagaaata gctctcgttt aagtattttg gggactctgt tgaaaaaaga aatgccaaca 960
tgtggtttta atctttggag ctagaactaa taatattgtg caaaagcaca agatgagaga 1020
tcaagaagtt caccatgaca ccttcgctgc ttcctggtct taaacctcag ctgaggctgg 1080
aagaggacca tggtggctta ttggagatgt gaccccaggg agcccctctg aaggatggaa 1140
ggggactggg caagacccaa cacacacaga acacagtagc cactggccag gcaggaagca 1200
aggatctcag aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag 1260
gcagattcat tctttctctt cccaggtgac ccagcgcctc ttggtttcta actggggagg 1320
gggtaggtgt caagagatga gtcccaaagt tctggaatgg tgggtcttgt gactgaggtc 1380
tagacccctc tccagcatga gtgctgtctc ctgcatcata tggagcctgg gcattctgag 1440
ctcattcaaa gggacaccat gggaaccact tgttctcaat gcaattattt ttgtgatgtt 1500
tacag 1505
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga gaaggaaagg aagtacattt 60
gaagaacgca agtag 75
<210> 4
<211> 15250
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
aggacaggag gattaaacag acagaggcaa ggatgatgag agaggagcag acagcaagaa 60
tgaaaagcag aaaatacaat agaggaaatg aagaaaagta ggcctgctgg agctagatga 120
tgatgtgatg gaaatagaag taacctttta gagaatctcg ctaagaaaca tggagaaaac 180
ggaaaagaaa aatgtaatgc cctagaaagc gcaaagaaag acagtggcaa aaatgaaaaa 240
aaaaaataaa aattataaaa gaggcaaaaa aagacacact attctctgcc tctaaaacac 300
aattaaataa aagaatttaa ataaaaatta aggcttctat atgcattttt aaattttgta 360
tgaatctgtt atggaagaat tgcctatgtc aatatatgtt cagagttaaa tattagcccc 420
aaatgctcag caagactgaa ttgtgtcata gaagttccca gattcccttt tcccgcaatg 480
tcattggagg ctgcatttct tagtcaagtc cagggtttag gccaaagggc atccggtatt 540
gcctaaaacc ctgtgaggtc tgtgaggtaa cttttgagaa gaggtcactg cactcttcat 600
cttttttgca ctttggaatc agatataaaa gatgtataag tttgctaggg ctgccataac 660
aaagtatcat aggctaggta gtttaaacca cagaaattga ttttttcata gttctgggag 720
ttgaaagtcc aaaatcaaag tatcagccct tgcaagggcc ttagagaagg ctctgtcatg 780
ggctcctccc ctcggcttgt aggtggcctc cttcttctcc ccctgtgtct tcacttcatc 840
ttccctccat acatatctct gtgtctaaac atcctctgtg tgaaacaaca ccagccaggt 900
tggatttggg cccaccccac tgacctcatt ttaacttaat tatctctgta aagactctgt 960
ctccaaatac agtcatattt tgacgtactg ggagttaggg cttcaacaca tgaatttgga 1020
cacaattcag ccagtgacag aagacttctg atctctgatg ataaccactg cattttgatt 1080
acagctccta gaaaacactc ccctccacca ccccaccaca gatctatttt tatatctgaa 1140
accctgagtt tctgctccat gagaacccca ggaacatact atgttagatc tggaagaagc 1200
ctcagaaatc cccttatttt gaagactagg acactgagat ccagaagtgg gtaaagatgt 1260
gcttgggttc taagctgctc ttcttttggc caggagacaa cagcacataa tcaaagtggg 1320
tcaactaaga aagaattcca gaaggaaaag agagggcaga aatgaaggga gagaatgaga 1380
gcaaaagtgc tggatttccc tgagggtgaa gaaaagttaa atagaatcac agaattcaga 1440
ttttagagat cttctccttc agatcccttg gtttaatcag taggattggg gtcttcatag 1500
ataataaagc aaaaactctc gccatcctcc aagttgtgaa ttagaagagc tgagaaaggg 1560
tacaagacgg aagttctcta ccaaacaaat ggtgacattt tggggtaaga atatgactaa 1620
cccagaagtg aagcatttca tccaagtagt ctattttgaa gatgtcatgg tataaaggaa 1680
cctcctttct gcctggtcct ccatgcctct gccatgcttt ttactccagg atcacccttt 1740
ctagtggttc actgaaaacc caggattact taaatatgat ggacatgttc acggctcaat 1800
ccaggaggaa aaggtcgaac tgaaagcatg ccaaagcccc acatgggagc caagccactg 1860
ctgctgtggt tgcaaagtgg atcctggctt atcagagcag agagaagcca ggctcgtgcc 1920
ttagcccaag tggccagtca ccttattcag gagatactaa gttctccagc taagacatcc 1980
atgctttggg accagctgca gacagaagcc aattcctact acaaccatca ccttagagta 2040
gcatatagac acagatggct cttcaaagga ccacagttcc atggaataac taagaattca 2100
tgtcctgtgg aaaggtttga ataaactata attataccca atcataaatt tcattcaaga 2160
agaactaaag caaaggcaaa gacagagaga agaaggaagg aaggagggag ggagggaggg 2220
aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaagggaa 2280
ggaagaacaa aaagactttc tagttaaaga atgcttaact agcaaactat gtactataag 2340
acagttcttt tcggaatgag ttttatcaac tctaaagcaa ttatcttgaa tgcctacatg 2400
tgattactga ataatatgaa ccaagaaaac agaaagaatc tatattatct ttccatttcc 2460
ttctttccag tatcaatacc caagcctcta gtgatacatg gcatataatg ttggatggat 2520
ggatggatgg atggatggat ggatggatgg atggatggat gaatggatgg ttggatggac 2580
aaatgagtaa cataggctga tgaatagtgg tagaaagaca caccataaaa acaagtggca 2640
cttctgagat gaaatgattc ctattctcct acacaagaca gtgaggcaag tacagagtaa 2700
aaaaggaaag gcataggagc tatgcttata caagtattgt atgtttggaa tttccttcgc 2760
tggccaaatt gaaattgttc aaggacctat tgctacaggt ggcaactggc taagaatttc 2820
atagtgaata ttatacacct attactcccc ttaatgtttc tttgaagtaa gcagaatatt 2880
aataatcatt taaaattcca gtgtttcaac ttcaattgtt tcctagggca aattgataat 2940
tgtgtgtaaa actaattgga atatgtatgg aataatcatc ctgaaataaa attggtgaaa 3000
agtatttgtt attgggcatc tacaatgtgc aaacctctgt actaggcatg aacaagagtt 3060
ataagcattg gagaggctaa aatatagtcc ttaaggctgg gcacagtggc tcatgcctgt 3120
aatcctagca ctttgggagg ccaaggcggg cagattgcct gagctcagga gttcaagacc 3180
agcctgggca acatagcgaa accccatctc tactaaaaat acaaaaaaat tacctgggca 3240
tggtggcacg cacctgtaat cccagctact caggaggctg aggcatgaga attccttgaa 3300
cctgggaggc agaggttgca gcgagccgag atcctgccgc tgcatcccag cttgggtgac 3360
agagtgagac tctgtctcaa aaaaaaatta aataataaat aaatagtaaa atacagtcat 3420
taagagtaca aaatgtagat tcagactacc tgggttcaaa tcttggctct tacttgcatt 3480
gtggctttgg gcagatcatg taacttatgt gtgcctcagt ttcctcatct gttaaatagg 3540
ggcaacaact gaatctacct tattcagttg ttgtgagggt ttattgagat tgtgtgtgtg 3600
tatgtgtgtg agtgtagtgt gtgcatgtgt gtgtctgtgc aaggagtggg aggtgtatat 3660
tcagagacac atattacagc acttaaaatg gtatctagca cttagtaagc attattcaag 3720
ttttagttaa cattatttta cttacctctg aaaattggag ctatgtgaaa aagaagttgg 3780
tctcctgaag tagaagccag tcttgtgtca ccaaaaactt caagcccaag cttgccaacg 3840
cttttccatg atgtggtagt agagtttcaa gcatgtggta ggataagaga actcaatgac 3900
ctaagaacca ttccaaccca gagaacccct ggttctatga ataattccaa cttaaatagg 3960
tagcttggct ctcccaagtg agagccattg cttctgtttc cgggtcatat aatgaacttt 4020
cagaaaacca ccatttttct caaccagtta aaattaagtg taatacgtgc tttcatttca 4080
tggtgcctgg ggaaaattta attgtagtat gaactccagt tattggtagt cttaagtaaa 4140
attgccaaaa taaatagaaa tgcaggatat ttctgggctc acacagcttc cgggacactt 4200
tagtttcttg ggctgccaat ccagtgcctt tcacaagcat ttgatctttt ttcaaacatc 4260
tcttgaaaac aaacaaaacc tcacacagct tctaatgtgt gcactgttcg aatgtaaggg 4320
tggaaaagga ggcaaagaaa tgagctccca aagagcaatt ccccttctct cgcctccatc 4380
ccttgacgac ctccctccca ctaaagggaa acattgtttt cttaggtaat aaattctgca 4440
atttctcaag tccattaaca tccactgggc aagatgagat ctattctttt tatttgccca 4500
taggaaaaga atagtgcttt tttgcaatat tcactagata acacagagtt gacttttaat 4560
ccaagggcaa cattgatagt ctctagttaa aggggaagcc ttcaggagca atgaaaagat 4620
taatagtttt agatgaagca gaatccaaat ccctttttat gagttttgaa atatccagtt 4680
tgtatgctca cctcaatact taaagcccag ttactgattc ctttggccta agcaagacag 4740
gtcaattttt aaagagggag tagctgaggt tagcaaaaat tctccaggtc cacaaaactt 4800
ccagacctgc aaggtgaaaa tcagcttttc tgtcatccct aaaggcctaa ctggaatcag 4860
aacttttccc tgatgcccac atatttggag gtcctttttt aatgggactc cttaatgcct 4920
ttagtgccat cccattttca tccagtgtcc aaaagaaatg atttaaaaat ataaacgtat 4980
gtttaaattc cagaagagag aaatggagat tgagaacaat agggaaatga tgagagctat 5040
gggaaaagag gtttatgagt ccatgtctga ttcttccaga gagcccctaa gaaagttctt 5100
atcataccag gaactcaatt ataactttca ttgcctattg ttagatgagt aacaggagct 5160
agaaaacatt ttggaaattc ccatctttat ttttttaact aatatgatta tagttttaag 5220
aaccattggt caagaagcta actttttaaa aagtggaagt atgatggtta gaaataagaa 5280
tgctaaaggt gcatcaagct gattttaatt ctaaatgtcc ttggcagcaa tttagaatct 5340
gtaataaact acaccaaaca gttttgaggg gaaggggatt agtttctccc cttccttcgt 5400
gtgtgtgtgt gcgcgtgtgt gtgtgtgcac ctttgtgttc tagcattgtt gcacccatta 5460
cagagctggg gggaactatt ttccaaaatt ataggtgaga acagtttctt ggattgtctt 5520
tcagtgaagg taaattcctc tgtaaaaact aaccatcatt cagtaaaaac tgcaggattc 5580
ctttgtcttc tcaaaagcct gtttctcatc ctaaattaaa aattattcag gaaatagaga 5640
ggacattatt ggaggggtgg aaataagttg gttttctttt tattgtatct tttgaggatc 5700
cagggacttc taccatttcc catctaacat acagagaagg attctctagg tccctgtcta 5760
tagactgcag taactttcct atagaaccaa tttgcaattt tagaaatttc taggtctaat 5820
tattgaccca ttacaaccaa aggtcaatgc atccagccaa tcttccttct atcatcccct 5880
gcccttactt ctattaggga ctgggattac aggcaaaacc catcaaatgc ctcttctacc 5940
actttcccat ttcttaacca ttagcctcta acttcctcta ttcagtttct catatgcttt 6000
catgcccatt gggtcagata aaggaacatt catttatttg agtaggcatc tgttatgatc 6060
actccggaaa aaagatgaca atgggttacc ttgtcctcct gggcttctct aactgacatg 6120
gtcaaaatgc ccatatgaag ataagatgtt aagagcaaga tttatgaaaa gctgagtatg 6180
atggcagctc ttgtctcata aaataactcg aaagttccca gtgaaagacc aagaaatttt 6240
acatcaaacc caaaccggcc aaatggtcca agcttccaag ctgggatcca tggctaaagt 6300
ttctacaaaa ttctgggtac aatgtataaa cattcacttg gggctttctg tctagccagc 6360
accaagaggt caagtaatca aggaccaact agccctgcca tctgtgaaaa tatgtgctat 6420
tttcacggct ttagttcaca attatggcaa gacaaaagtt ccaaataatt aggagcaaga 6480
ccatggcagg ttgacggttg agtaaggttc tcaatcagcc gacaattgta gagttgggga 6540
tgtgcaatgt ttatgtcatg gtgtaagtat gtggcatgct tgactagctt gtgaggcact 6600
ggaagactag aaggaatgaa aaatatgaat gaatcaataa atgcatagta taattactgt 6660
tattttgtca gtattgtttt acctaggtca ctattgaatg ctctgatttg tctctttata 6720
aataataata tgttttcttc ttcaaaagaa cactaggatg aaggtagagg tgcttttggc 6780
acaatgccac aattctgatt tttttaaaac tgtatgcatg cataaaatgt tcttgagcca 6840
ttctctgcct tggaatagca ctggctggca ttctgcatgt ttacttttat atgctgaagg 6900
cccccatcaa cctcaaacag aggcaaatca atttaacttc tcatagtgtt attttgttca 6960
tcctaaaagt tcaagagagc cttccaaact tccaaaattt ctctcaattc agtgaggagg 7020
aaaattcaga acacagcatt tgaatgttct gcccagattt gtcacacaca caaggaatga 7080
gtgaaagagg gcaacaccct ttcctcctaa ccctgtgaac tcatcactat tgcattgaaa 7140
tgacaccaaa aggtaaaaac cctaggcctc acatctccca agaacactgc aataggagtt 7200
actgcataca ccagtttaag taactctagc ataaattgta tgtcagatga aacaatggca 7260
ttttggaggc ttaagagaaa aagaataatc aaatccagtt tttaggtact aatgtgctga 7320
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ttccccaggc ttttaaacca ttttgataga gattttttac atcacaggca gaaatatttg 7680
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ggaataaagt cctctgattc ctggggattc ctagggatgc cccagtcact agaaaacaga 7800
gctgtaagtc cactctccca gcactcaacg gagctccgga aaccaaggag ctagctactg 7860
tttccccaca ttcagccaga gaaagggcag cactctagca tgcaaactgc tttgacaata 7920
gtaacaatta aaaagtaaat taaaaagaat cataatagct gatattgatt aggtacttgc 7980
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tcattcctgc aggaaattcg catccattaa atgagcattt cctggtttgc cactttgctc 8400
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tgaggtttcc agaaaaaaac gtgatgctgg gctaaccaaa actgtgtcca gtaagtacat 9300
atccctcact ctgttaaaga agcagccaca taaacaagga gtacacgttt ctcaaaatgt 9360
gcaccttgtt ctttggtttt gaagtcacat cccaaagtgc tgagtagatc gcatgaccct 9420
cgctttgcct ggctgccaga gaggaaaggc tgatccaact ctcctggaat ttgaacttgt 9480
gattccctga agtaaagaga tatcaaagtt gatactgaga catctaaatc atcctccacc 9540
atttcacatg tccccaggcc aagccagcaa aattgctata gcacatccct ttcaacaggt 9600
aaagggctga tatctgagcc ctctttccaa tcatccactg ctcttttctt ctcattttgc 9660
cctttttggg agcaggtcaa tgctgagtta gtactttatg ctgtacaata agctgctgat 9720
attccatgct ggacagaatt ttcccagtat tttttataga gtgccaggct tttcctagac 9780
ttcatgtcat acaatactta acttgtttgg agtgggtgga gatggaaaca tagtctattg 9840
aaaacatcac tgcttcctcc ctgaagttta aagagcctat ttttatcctt ttagattcta 9900
tctctcaggc aaaatctcat aaagataagt ggggaggaaa aaaagggggt tataatacct 9960
agggagtttg cttttgctaa ttgaatactg tgctcctaga cttctataaa taccattaca 10020
aatgggtccc agcttgtggt aatactcacc ctcctcattg agtcttctgt cccatggcac 10080
agcctttccc tccaaactag catctacccc catctggaag catgggcagc tcatgatatt 10140
atcaactatt gctattggaa agtgatttgg acttgaaagc actagatatt ttttacctct 10200
tggggaggca gtttagcaga gtggttaact ggtgagctcc agaatcagaa ggaataggtc 10260
caaattccaa ccactattac atctccatca taagaaatta ggcaagttgt ttatcctaag 10320
tttcagattc cttaaagata aaacagtcaa gacagtagta cttatccctg agagaagtat 10380
aggaaacaag aaaatatatg caatttacat acatactaca atccccagca catgacaaat 10440
gttcaagtaa tgggaactgt tattatttta gccctttgtc tatcagtttg ttcctctgtg 10500
acctcaagca cattactaaa tgttagcgag cttcagcttg tacgtgggac tgacaggaat 10560
aacaccgcat cacctcatgt ggtgattgta aggattcagt gatattattt tgtaaactgt 10620
aaagcctttg caaatgttaa gcaagattat tattattgcc gttgttatta gtcctcagtg 10680
atcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttggagacag agttttactc 10740
tgtcgccaag gctggaatgc agtggcacaa tctcagctca ctgcaacctc cgcctcctgg 10800
gttcaagcaa ttttcctgcc tcagcctcct gagtagctga aactacaggc acacgccacc 10860
acaccaggct aattttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccatgt tggccaggct 10920
ggtctccagc tcctgacctc aagtgatctg cccacctcgg cctcccaaag tgctgggatt 10980
acaggtgtga gccaccacac ctggcacagt aatcttaatt gaaaagtctg tggatagctt 11040
tccaaaggaa agcttggagc ttggataaga accaagagat aatgggagaa ggtgaatggc 11100
ctcttcaggg ccttttctag caccctaaat atgcgtgtct gtccataatg ggtaatcata 11160
tatatcacaa atcaaaccct ccacaaactt atttcctaat gtgtttgtta acctttcctt 11220
ctaaagggta aacttcttta accaacccca gtgagctgga ggatcaatgt tttcttaata 11280
gtcttacctt cgttggtgtc aataggaaac agtatttact cactactgtt ttccttttaa 11340
aaatctgtct agttgcatac tagaaacagt ttcagctggt ttgtttgtat tggacaagct 11400
gctgaagtga aaagtttttg cttgactgaa tgtgagacag tttcataact cttcaagaag 11460
tgcaccaaag gtgggtgcca gctctgatga cggctgcttc taacatgcct ccacttgccg 11520
cccattgtca agggtggctg gcgtaattaa gttaagacaa tgagcaaagc aacagatgca 11580
actgagacct agtccctgag tgcttttgtt ttgtcactgt cattgtctgc aacaaagaag 11640
tcacatgtga cagcctggga agagagccaa atgcaaacca gacgatatcc cagctggttt 11700
gaatggcctc caccgtgcac gtgtgtgcat gggaatcatg ctacttggta cagcatctgc 11760
ttcactcaag tgagtttcag cccatggctt tgctgtgatg ctgagacaga cccagaagaa 11820
acagaccagg gaatccctcc gctcagactt tacactttat accttgtgct ttgagagaaa 11880
agaaaaagaa tctctctatt ggagacaaaa aataggatgt atgtggttgg tcaatctaac 11940
ctcaattctt tttgctatag ccccccgcta atttaaagag tgaagcatag atggtatctt 12000
aatgttttct tgtagaaatt tgggattaat ttggcttgag aggaagaatg gagattaaac 12060
gctttatgag gctttctttt aatttgttcc catttcattc ctgaatattt tcttagtttg 12120
ggcattgcag atgtttaaag aacttcttat tttgagctgg tatgcctctt aaacagaaaa 12180
acaaaaggta aaattcaaat tagtgtgttt ctccgcctgt taattaattt ggttagtagt 12240
taggcagaga gatggcatcc ttaataatat ctattttgcg ggtttgatca gctacagacc 12300
atcaacagtg ttgattgaga attgaacaaa aacatttcaa ggagtttggg aacattaggg 12360
atgctattct gtggccccat gtgtccttct ctcatttttc tagagaactc ctataagaaa 12420
gcagaacacg gccaggcatg atggctcatg cctgtaatcc cagcacttca ggaggctgag 12480
gcaggcagat cacctgaggt caggagttca agaccagcct ggccaacatg gtgaaaccct 12540
atctctatta aaaatacaaa aaattagctg ggcatgatgg cgcgtgcctg taatcccagc 12600
tacttgggag gctgaggcag gagaatcact tgaactggga ggcaaaggtt gcagtgagcc 12660
tagatcacac cactgcactc cagcctgggt gacagagtga gactccaact caaaaaaaag 12720
aaagaaagaa agaaagaaag cagaacccaa tggaagatta agaacacaca tttagcttac 12780
gcctgtaata ccagcacttt gggaggccaa ggcgggtgga tcacaaggtc agaagttcga 12840
gaccaacctg gccaatatgg tgaaacccca tctctactaa aaagtacaaa aattagccat 12900
gcatggtggc aggcgtctgt aatcccagct actacagagg ctgaggcagg agaatcactt 12960
gaacccggga ggcagaggtt gcagtgagct gagaacgcgc cactgcactc cagcctgggt 13020
gacagagcga gactccatct caaaaaaaaa aaacaacaaa aaaaaacaaa acacaagttt 13080
actgggaact tagcagtaga tgctttgcac cacaacaaat gtatcttaag tggtcttttg 13140
tgatatttga gggaaagtgc cagaatttaa aacaaatggc atttcaagtt attctataca 13200
aatgcccagt ttctttctac catctttttt tcctttttgc agtggtcact gagctatttt 13260
agtgaatgtt tttacacaat gatgccatct tccttctact cagtcagtac aagatgttga 13320
ccatcgactc ataaaacact agctaccttt catgaaggac ttggtgataa ctctcatgtt 13380
ccaagtagaa ccggaaaaca tgtgtaagaa aacctgccga tccctatggg ccttggccaa 13440
taggtattat tcccaagggg tggcagttta tctttttccc cagccttcat attaaaacct 13500
ctcaccttct ccaggtctca ggtctgtgta atctcaaatg tgctttagct cctcacaata 13560
ttgtaactgt gtgggtgttc attaccttag ccagaagaca gtttacagat tccaggtctc 13620
atggagagaa cttttgtttt tggttatgaa cctcactgta taccaataat tatccattac 13680
atccttctgt agagggctct ctggctagag ataaaaccaa aaaaagaagt acctcaggtt 13740
tatgcatata aatgccagtt cctccttgat tttatttcaa aactcctgtc tacatacttt 13800
gcaatttaaa tacattcaag gataaagtaa taactgtagg aaaagtatta taatataatg 13860
acttagttct gcacatcaca agggggtccc tcatactcat tcattcattt cactcatttt 13920
acagatattt attgagcacc tgcaataacc tgcacactgc tctagacact gggactataa 13980
cagtaaacag acagatacat ctctggtctc acagggcttc tattctaagc aaaactcaat 14040
atccaggccg ggtgcagtgg ctcatgcctg gaatgccagc actttgggag accaaggcca 14100
ggcagatcac ctgagcccac tagttgaaga ccagcctggg caatatagca aaaccccgtc 14160
tctacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaattgtcaa ggcatggtgg catgcgcctg 14220
tggtcccagc tacttaggag gctgaggcag gaggattgtg taagcctggg aggcagaggt 14280
tgcagtgacc tgagatggca ccaccacact ccagcctggg caacagagtg agaccctgtc 14340
caaaaaaaaa aaaccctcac tatccttaag ataacatcat tgcttgttga tgagtgaatg 14400
ttaacaccaa attaggaacc caggactttt agtcttggca tggttacttt ccaataaaga 14460
tgacaatact aagaagagaa aaatgattta ataatgataa tagtggctaa tacttatgta 14520
gtgcttacca tgtgccaggt ctattgtaag tacttttata tatattaatt atttaatctt 14580
tgatcctata aggtagatat tattgttacc ctagtttata gatgaagaaa cggaaacaca 14640
agagattgcc actcatacaa gtttacacag ccagaaaata gaaaagctac gagttgagct 14700
cagcccagta tgtctatgat tttacagact caaaattaat tataagattt cctaatcttc 14760
gatttctgaa actctgcctt gctctagagg aaaacaagaa aaacaatgaa aaataaatgt 14820
ctctttttta caaaaattaa aacagaacaa actgcaataa aacaacagag gatgaatcca 14880
gaatgtgatt gatttttttt cttactagga aaggatctag aggccagaag gctggatttt 14940
tcaggatctc ctttcaatca atgaatctgt gatagaagca gatgaatcaa atctcatctt 15000
tgtgtgatta taaagctgtc tgtggtattc acgccaccag gggtacatag aagatgcctg 15060
agtgaggttt ggcaaaagta ctaagggcct gtccacctat acatgccctt ctcaggaaaa 15120
ccaaggttca agctctctat tagctcaact ggtaaggcgt aagacatgga aggttgaggc 15180
ccaatgttag aaatagatgg atacataaaa cttcatcaag ttaatgtcac tttttctcct 15240
ttatttatag 15250
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gaagtacatt tgaagaacgc aagtagaggg agtgcaggaa acaagaacta caggatgtag 60
60
<210> 6
<211> 375
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc 180
tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac 240
atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagag 300
aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag gcagattcat 360
tctttctctt cccag 375
<210> 7
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa caaacatggg ctttggtgtc 180
agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta gagagaaaag acttttaggt 240
gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga ttcattcttt ctcttcccag 300
300
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
ctttttctcc tttatttata g 21
<210> 9
<211> 933
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 9
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
acatccccat ctctttggtc actctgcatt gcaaatttcc cctcccaccg ctatggacga 600
tgtgatgatt ggaagatgtt acaaaacagt ggctaaacaa acatgggctt tggtgtcaga 660
caaaagtgaa gtcctggctt tctcacacac cagcttagag agaaaagact tttaggtgaa 720
tgtggcagga aagcgtgctt gctggggcaa aggcagattc attctttctc ttcccagtat 780
cagcccccat ctaccaacaa gaacacgaag tctcagagaa ggaaaggaag tacatttgaa 840
gaacgcaagt agctttttct cctttattta taggaagtac atttgaagaa cgcaagtaga 900
gggagtgcag gaaacaagaa ctacaggatg tag 933
<210> 10
<211> 858
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 10
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
acatccccat ctctttgcta aacaaacatg ggctttggtg tcagacaaaa gtgaagtcct 600
ggctttctca cacaccagct tagagagaaa agacttttag gtgaatgtgg caggaaagcg 660
tgcttgctgg ggcaaaggca gattcattct ttctcttccc agtatcagcc cccatctacc 720
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtagctt 780
tttctccttt atttatagga agtacatttg aagaacgcaa gtagagggag tgcaggaaac 840
aagaactaca ggatgtag 858
<210> 11
<400> 11
000
<210> 12
<400> 12
000
<210> 13
<400> 13
000
<210> 14
<211> 153
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
130 135 140
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
145 150
<210> 15
<211> 462
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac 420
gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac tacaggatgt ag 462
<210> 16
<211> 158
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys
145 150 155
<210> 17
<211> 477
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtag 477
<210> 18
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Ile Thr Pro Thr Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
20 25 30
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
35 40 45
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
50 55 60
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
65 70 75 80
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
85 90 95
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
100 105 110
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
130 135
<210> 19
<211> 414
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
atgattacac ctacagtgaa gatgcacacc atgtcctcct cgcatctctt ctacctggcg 60
ctgtgcctgc tcaccttcac cagctctgcc acggctggac cggagacgct ctgcggggct 120
gagctggtgg atgctcttca gttcgtgtgt ggagacaggg gcttttattt caacaagccc 180
acagggtatg gctccagcag tcggagggcg cctcagacag gcatcgtgga tgagtgctgc 240
ttccggagct gtgatctaag gaggctggag atgtattgcg cacccctcaa gcctgccaag 300
tcagctcgct ctgtccgtgc ccagcgccac accgacatgc ccaagaccca gaaggaagta 360
catttgaaga acgcaagtag agggagtgca ggaaacaaga actacaggat gtag 414
<210> 20
<211> 195
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu
145 150 155 160
Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys
165 170 175
Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys
180 185 190
Lys Gly Lys
195
<210> 21
<211> 588
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggttggccaa agacacatcc aggaggggaa 480
cagaaggagg ggacagaagc aagtctgcag atcagaggaa agaagaaaga gcagaggagg 540
gagattggaa gtagaaatgc tgaatgcaga ggcaaaaaag gaaaatga 588
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 22
agctggcaat tccggttcgc ttgctgcgtc agaccccgta 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 23
tacggggtct gacgcagcaa gcgaaccgga attgccagct 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 24
ctaatccata acatggctct agacttaagg cagcggcaga 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 25
tctgccgctg ccttaagtct agagccatgt tatggattag 40
<210> 26
<211> 3250
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 26
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatgt cgacctcgag tctagagggc 1380
ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1440
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 1500
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 1560
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggagtcga 1620
aattcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc 1680
gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc 1740
acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat 1800
gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt 1860
cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg 1920
cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg 1980
agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc 2040
aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag 2100
gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc 2160
ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag 2220
ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag 2280
aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg 2340
ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa 2400
tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc 2460
cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc 2520
aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgcgt cagaccccgt 2580
agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 2640
aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 2700
ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 2760
gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 2820
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 2880
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 2940
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 3000
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 3060
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 3120
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 3180
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 3240
tgctcacatg 3250
<210> 27
<211> 4108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide
<400> 27
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatat gggaaaaatc agcagtcttc 1380
caacccaatt atttaagtgc tgcttttgtg atttcttgaa ggtgaagatg cacaccatgt 1440
cctcctcgca tctcttctac ctggcgctgt gcctgctcac cttcaccagc tctgccacgg 1500
ctggaccgga gacgctctgc ggggctgagc tggtggatgc tcttcagttc gtgtgtggag 1560
acaggggctt ttatttcaac aagcccacag ggtatggctc cagcagtcgg agggcgcctc 1620
agacaggcat cgtggatgag tgctgcttcc ggagctgtga tctaaggagg ctggagatgt 1680
attgcgcacc cctcaagcct gccaagtcag ctcgctctgt ccgtgcccag cgccacaccg 1740
acatgcccaa gacccagaag gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt 1800
ctctctcttg tgcatgtggg tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta 1860
caagtcagaa aagctccttt gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa 1920
caaacatggg ctttggtgtc agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta 1980
gagagaaaag acttttaggt gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga 2040
ttcattcttt ctcttcccag tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga 2100
gaaggaaagg aagtacattt gaagaacgca agtagctttt tctcctttat ttataggaag 2160
tacatttgaa gaacgcaagt agagggagtg caggaaacaa gaactacagg atgtaggtcg 2220
acctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 2280
gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 2340
ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 2400
ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 2460
ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg 2520
ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc 2580
aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc 2640
cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa 2700
gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct 2760
ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac 2820
aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa 2880
tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac 2940
tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag 3000
cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt 3060
cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag 3120
gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc 3180
agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc 3240
cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc 3300
ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt 3360
tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccggttcgct 3420
tgctgcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3480
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3540
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3600
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3660
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3720
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3780
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3840
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3900
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3960
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 4020
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 4080
ggccttttgc tggccttttg ctcacatg 4108
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 28
tgatctaagg aggctgga 18
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 29
ctacttgcgt tcttcaaatg 20
Claims (67)
- 다음을 포함하는 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트:
인간 IGF-1 유전자의 엑손(exon) 1, 3 및 4 (서열번호 1)와 동일한 서열 또는 그것의 디제너레이트(degenerate)를 갖는 제1 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide);
인간 IGF-1 유전자의 인트론(intron) 4 (서열번호 2)와 동일한 서열 또는 그것의 절편(fragment)을 갖는 제2 폴리뉴클레오타이드;
인간 IGF-1 유전자의 엑손 5 및 6-1 (서열번호 3)과 동일한 서열 또는 그것의 디제너레이트를 갖는 제3 폴리뉴클레오타이드;
인간 IGF-1 유전자의 인트론 5 (서열번호 4)와 동일한 서열 또는 그것의 절편을 갖는 제4 폴리뉴클레오타이드; 및
인간 IGF-1 유전자의 엑손 6-2 (서열번호 5)와 동일한 서열 또는 그것의 디제너레이트를 갖는 제5 폴리뉴클레오타이드;
상기 제1 폴리뉴클레오타이드, 제2 폴리뉴클레오타이드, 제3 폴리뉴클레오타이드, 제 4 폴리뉴클레오타이드 및 제5 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 순서로 순차적으로 연결된다.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 폴리뉴클레오타이드인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, 상기 제 4 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 플라스미드 벡터를 추가로 포함하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제5항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pCK인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제6항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pCK-IGF-1X6 및 pCK-IGF-1X10으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제5항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pTx인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제8항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pTx-IGF-1X6 및 pTx-IGF-1X10으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 포함하는 약제학적 조성물.
- IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 포함하는 약제학적 조성물에 있어서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ea 또는 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ec를 인코딩하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ea 단백질 및 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ec 단백질을 모두 인코딩하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 18의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 II IGF-1 Ea 단백질 및 서열번호 20의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Eb 단백질 모두를 발현할 수 없는 것인, 약제학적 조성물.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 18의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 II IGF-1 Ea 단백질도 서열번호 20의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Eb 단백질도 발현할 수 없는 것인, 약제학적 조성물.
- 제11항에 있어서, 다음을 포함하는 약제학적 조성물:
서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ea 단백질을 인코딩하는 제1 DNA 컨스트럭트, 및
서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1Ec 단백질을 인코딩하는 제2 DNA 컨스트럭트.
- 제12항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 pCK-IGF-1X6 또는 pCK-IGF-1X10인 것인, 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 pTx-IGF-1X6 또는 pTx-IGF-1X10인 것인, 약제학적 조성물.
- 다음의 단계를 포함하는, 신경병증을 치료하는 방법:
신경병증을 가진 대상(subject)에 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트의 유효량을 투여하는 단계로서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 적어도 1 개의 인간 IGF-1 이형체를 발현할 수 있는 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ea 단백질 또는 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ec 단백질을 발현할 수 있는 것인, 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 18의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 II IGF-1 Ea 단백질 및 서열번호 20의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Eb 단백질 모두를 발현할 수 없는 것인, 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 15의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법.
- 제21항에 있어서, 다음의 단계를 추가로 포함하는 방법:
제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 대상(subject)에 투여하는 단계로서,
상기 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 17의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 17의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법.
- 제23항에 있어서, 다음의 단계를 추가로 포함하는 방법:
제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 대상(subject)에 투여하는 단계로서,
상기 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 15의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법.
- 제22항 또는 제24항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계 및 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 동시에 수행되는 것인, 방법.
- 제22항 또는 제24항에 있어서, 상기 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계 및 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 순차적으로 수행되는 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 1 개 초과의 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 것인, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ea 단백질 및 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ec를 인코딩하는 것인, 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 제 1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트가 다음을 포함하는 것인, 방법:
인간 IGF-1 유전자의 엑손 1, 3 및 4 (서열번호 1)와 동일한 서열 또는 그것의 디제너레이트를 갖는 제1 폴리뉴클레오타이드;
인간 IGF-1 유전자의 인트론 4 (서열번호 2)와 동일한 서열 또는 그것의 절편을 갖는 제2 폴리뉴클레오타이드;
인간 IGF-1 유전자의 엑손 5 및 6-1 (서열번호 3)과 동일한 서열 또는 그것의 디제너레이트를 갖는 제3 폴리뉴클레오타이드;
인간 IGF-1 유전자의 인트론 5 (서열번호 4)와 동일한 서열 또는 그것의 절편을 갖는 제4 폴리뉴클레오타이드; 및
인간 IGF-1 유전자의 엑손 6-2 (서열번호 5)와 동일한 서열 또는 그것의 디제너레이트를 갖는 제5 폴리뉴클레오타이드;
상기 제1 폴리뉴클레오타이드, 제2 폴리뉴클레오타이드, 제3 폴리뉴클레오타이드, 제4 폴리뉴클레오타이드 및 제5 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 순서로 순차적으로 연결된다.
- 제29항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드인 것인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 폴리뉴클레오타이드인 것인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드인 것인, 방법.
- 제18항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 플라스미드 벡터를 포함하는 것인, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pCK인 것인, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pTx인 것인, 방법.
- 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 10의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법.
- 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법.
- 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 27의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법.
- 제18항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량은 대상(subject)에서 통증을 감소시키는데 충분한 양인 것인, 방법.
- 제18항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 대상(subject)은 신경병성 통증을 가지는 것인, 방법.
- 제18항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 대상(subject)은 당뇨병성 신경병증을 가지는 것인, 방법.
- 제18항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트 또는 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 근육 내 주사를 포함하는 것인, 방법.
- 신경병증 치료의 의학적 방법에 이용하기 위한 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트:
상기 의학적 방법은 신경병증을 갖는 대상(subject)에 대해 유효량의 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계를 포함하고; 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 적어도 하나의 인간 IGF-1 이형체를 발현할 수 있다.
- 제43항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ea 단백질 또는 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ec 단백질을 발현할 수 있는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 18의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 II IGF-1 Ea 단백질 및 서열번호 20의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Eb 단백질 모두를 발현할 수 없는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제45항의 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 15의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제46항에 있어서, 상기 의학적 방법은 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 대상(subject)에 투여하는 단계를 추가적으로 포함하고; 상기 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 17의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 17의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제48항에 있어서, 상기 의학적 방법은 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 대상(subject)에 투여하는 단계를 추가적으로 포함하고; 상기 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 15의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제47항 또는 제49항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계 및 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 동시에 수행되는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제47항 또는 제49항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계 및 제 2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계는 순차적으로 수행되는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 1 개 초과의 인간 IGF-1 이형체를 인코딩하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제52항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 14의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ea 단백질 및 서열번호 16의 폴리펩타이드를 포함하는 클래스 I IGF-1 Ec 단백질을 인코딩하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 다음을 포함하는 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트:
인간 IGF-1 유전자의 엑손 1, 3 및 4 (서열번호 1)와 동일한 서열 또는 그것의 디제너레이트를 갖는 제1 폴리뉴클레오타이드;
인간 IGF-1 유전자의 인트론 4 (서열번호 2)와 동일한 서열을 또는 그것의 절편을 갖는 제2 폴리뉴클레오타이드;
인간 IGF-1 유전자의 엑손 5 및 6-1 (서열번호 3)과 동일한 서열 또는 그것의 디제너레이트를 갖는 제3 폴리뉴클레오타이드;
인간 IGF-1 유전자의 인트론 5 (서열번호 4)와 동일한 서열 또는 그것의 절편을 갖는 제4 폴리뉴클레오타이드; 및
인간 IGF-1 유전자의 엑손 6-2 (서열번호 5)와 동일한 서열 또는 그것의 디제너레이트를 갖는 제5 폴리뉴클레오타이드;
상기 제1 폴리뉴클레오타이드, 제2 폴리뉴클레오타이드, 제3 폴리뉴클레오타이드, 제4 폴리뉴클레오타이드 및 제5 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 순서로 순차적으로 연결된다.
- 제54항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 폴리뉴클레오타이드인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제54항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 폴리뉴클레오타이드인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제54항에 있어서, 상기 제4 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 플라스미드 벡터를 포함하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제58항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pCK인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제58항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pTx인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 10의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 서열번호 27의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량은 대상(subject)에서 통증을 감소시키는데 충분한 양인 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 대상(subject)은 신경병성 통증을 가지는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상(subject)은 당뇨병성 신경병증을 가지는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
- 제43항 내지 제66항에 있어서, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트를 투여하는 단계 또는 제2 IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트는 근육 내 주사를 포함하는 것인, IGF-1 인코딩 DNA 컨스트럭트.
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