CN1920021B - 胰岛素样生长因子结合蛋白-6介导的有活性胰岛素样生长因子-ⅱ的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种制备有活性多肽或者蛋白质的方法,包括:1)获得编码所述多肽或者蛋白质的基因序列,并获得编码该多肽或者蛋白质的伴侣分子的基因序列;2)用上述序列构建共表达载体;3)转化宿主细胞,使共表达载体表达该多肽或者蛋白质和该伴侣分子;和4)收集表达产物的复合物,其中含有该活性多肽或者蛋白质。本发明提供了通过构建共表达载体,转化宿主细胞,使胰岛素样生长因子-Ⅱ和IGFBP-6共表达,制得它们的复合物,其中胰岛素样生长因子-Ⅱ是正确折叠的有活性分子。本发明所得到的复合物可以用于制备药物。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学、生物化学、生物技术和药学领域,具体而言涉及蛋白质或者多肽的制备,尤其涉及有药物活性的蛋白质或者多肽的制备。本发明也关于胰岛素样生长因子-II的分子伴侣胰岛素样生长因子结合蛋白-6的应用。本发明也涉及蛋白质或多肽与其分子伴侣的共表达,特别地,涉及控制其分子数目按照一定比例的共表达。本发明提供了一种制备具有活性的胰岛素样生长因子-II的方法,包括构建含有胰岛素样生长因子-II基因和胰岛素样生长因子结合蛋白-6基因的表达载体,转化宿主,筛选出转化子;培养转化的宿主,共表达胰岛素样生长因子-II和胰岛素样生长因子结合蛋白-6;分离得到胰岛素样生长因子-II和胰岛素样生长因子结合蛋白-6复合体。本发明的方法和物质可以避免这些物质单独使用所带来的副作用,因此本发明也涉及制药学、临床药物学、生物制品等领域。
背景技术
随着分子生物学的不断进展,蛋白质之间的相互作用越来越成为研究的重点。这不仅有科学研究意义,而且对于开发新的生物制品药物,或者避免某些已有的生物制品药物的副作用有意义。
自从Anfinsen在1961年发现变性RNaseA分子在试管中能自发折叠成天然构象、恢复其生物学活性以来,人们一直认为蛋白质的一级结构决定其高级结构,即某特定蛋白质分子的氨基酸序列包含了构成其高级结构的全部信息。然而,这个原则仅仅给出了蛋白质折叠的热力学可能性,而折叠过程和折叠途径却仍然是个谜,参见朱玉贤,李毅,编著,现代分子生物学,高等教育出版社,1997年3月第1版,第352页。
生长因子(growth facter,GF)是是指一类具有激素样性质,能起促细胞分裂剂作用、刺激细胞分裂和繁殖的物质。一些生长因子作用于多种细胞,另一些作用于某一种类型的细胞。参见谭景莹,董志伟主编,英汉生物化学及分子生物学词典,科学出版社,2000年7月第1版,第416页。关于生长因子的定义尚未达成一致,但是它们在功能上是导致细胞增殖效应的因子。研究生长因子的作用机制及其信号传导途径,不仅对阐明细胞增殖、分化的分子生物学基础有重要意义,而且对于研究肿瘤等疾病的发病机制以及新的防治措施也有实用价值,因此受到高度重视,成为一个研究热点。由于某些生长因子基因工程的成功表达,一些生长因子目前已经开始在临床中应用。参见徐晓利,马涧泉主编,医学生物化学,人民卫生出版社,1998年10月第1版,第1033页到第1041页。
胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)是体内重要的生长因子,又称生长调节素(somatomedin),包括IGF-I和IGF-II,对胚胎及出生后机体的生长、发育具有重要的促进作用。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF binding protein,IGFBP)家族包括六种对IGF具有高亲和力的成员,命名为IGFBP-1~IGFBP-6,对IGF的活性有重要的调节作用.它们与IGF结合成大分子量的复合物,在血液循环中运输,既增加了IGF的稳定性,延长了半衰期,又限制了IGF自由通透血管进入组织局部,避免了IGF促生长活性的过度发挥.在组织局部IGFBPs以多种方式调节IGF的活性.
IGF-I是生长激素GH的下游因子,直接介导GH活性的发挥,对出生后机体的生长发育有重要的促进作用。所以重组IGF-I作为药物具有很高的临床应用价值。1987~2000年重组IGF-I作为药物进行了大量的临床实验,用于多种疾病的治疗,如Laronsyndrome(Laron氏侏儒症候群),脊髓侧索硬化症,运动神经元疾病,脑白质肾上腺营养不良症(ALD),I型和II型糖尿病,胰岛素阻抗综合症,骨质疏松及骨关节炎等。
但IGF-I单独用药会产生很多副反应,如水肿、关节痛、头痛、视网膜水肿、Bell’s麻痹等,最严重的是长期用药会诱发肿瘤的发生。(Jabri N,Schalch DS,SchwartzSL.1994 Adverse effects of recombinant human insulin-like growth factor Iin obese insulin-resistant type II diabetic patients.Diabetes.43:369-374.Young SCJ,Smith-Banks A,Underwood LE,Clemmons DR.1992 Effects ofrecombinant IGF-I and GH treatment upon serum IGF binding proteins incalorically restricted adults.J Clin Endocrinol Metab.75:603-608.Kupfer SR,Underwood LE,Baxter RC,Clemmons DR.1993 Enhancement of theanabolic effects of growth hormone and insulin-like growth factor-I by theuse of both agents simultaneously.J Clin Invest.91:391-397.Clemmons DR,Smith-Banks A,Celniker AC,Underwood LE.1992 Reversalof diet-induced catabolism by infusion of recombinant insulin-like growthfactor-I(IGF-I)in humans.J Clin Endocrinol Metab.75:234-238.)
近年的研究表明IGF-I和IGFBP-3联合用药可以有效的消除IGF-I单独用药时的副反应。这是因为联合用药模拟了IGF的生理存在状态,限制了IGF-I促生长活性的随意发挥,同时增加了IGF-I的稳定性,降低了给药浓度。(Sanders M,Moore J,Clemmons D,Sommer A,Adams S.Safety pharmacokinetics and biologic effectsof intravenous administration of rhIGFI/IGFBP-3 to healthy subjects.Proceedings of the 79th Annual Meeting of The Endocrine Society,Minneapolis,MN,1997.Geusens R,Bouillion PB,Rosen DM,et al.Musculoskeletal effectsof recombinant human insulin-like growth factor-I(rhIGF-I)/IGF bindingprotein-3(IGFBP-3)in hip fracture patients:results from a double-blind,placebocontrolled,phase II study.Proceedings of the Second Joint Meeting ofAmerican Society of Bone and Mineral Research-IBMS,San Francisco,CA,1998)。
IGF-II是胚胎期重要的生长因子,出生后主要以自分泌和旁分泌的方式在组织局部发挥促生长活性,对整个机体的生长和代谢影响很小。所以重组人IGF-II在局部组织损伤的修复治疗中有广阔的临床应用前景,如各种软组织损伤、骨折、脑缺血引起的脑组织损伤及神经元的病变。
但是,在IGF-II的体外表达中,存在形成聚合体的问题,使其活性丧失。而且有理由认为IGF-II单独作为药物在体内使用存在和IGF-I同样的问题,会产生多种副作用。因此,存在制备出具有生物学活性的IGF-II的需要,存在避免或者减弱IGF-II给药所引起的副作用的需要。
发明内容
本发明的首要目的在于满足上述这些具体需要,提供一种制备具有活性的IGF-II的方法。并且,在更广泛的意义上,本发明利用分子生物学的进展,提供一种在医疗等应用领域具有价值的具有活性的蛋白质或者多肽物质的制备方法。
第一个方面,本发明提供了制备活性蛋白质或者多肽的方法。
在一个实施方案中,本发明提供了制备活性蛋白质或者多肽的方法。该方法包括将目标蛋白或者目标多肽的编码序列重组进表达载体中,在合适的宿主中表达出重组蛋白或者重组多肽,检测重组蛋白或者重组多肽的生物学活性。如果检测到重组多肽或者重组蛋白质具有较低或者没有生物活性,则本方法进一步包括寻找这一现象的原因,包括进一步研究该重组多肽或者重组蛋白质的构象,确定是否分子伴侣在该多肽或者蛋白质的折叠中起作用。利用分子伴侣或者编码分子伴侣的基因获得有生物活性的重组多肽或者重组蛋白质。
在又一个实施方案中,本发明提供了制备活性蛋白质或者多肽的方法。该方法包括将目标蛋白或者目标多肽的编码序列和其分子伴侣的编码序列重组到一个表达载体中,用该表达载体转化合适的宿主,在合适的宿主中共表达出目标蛋白或者目标多肽以及分子伴侣,纯化出目标蛋白或者目标多肽和分子伴侣的复合物。
在再一个实施方案中,本发明提供了制备活性蛋白质或者多肽的方法。该方法包括将目标蛋白或者目标多肽的编码序列和其分子伴侣的编码序列分别重组进表达载体中,用这两种载体共转化合适的宿主,诱导这些分子的共表达,纯化出目标蛋白或者目标多肽与分子伴侣的复合物。
在更进一步的一个实施方案中,本发明提供了制备活性蛋白质或者多肽的方法。该方法包括将目标蛋白或者目标多肽的编码序列和其分子伴侣的编码序列重组进一个表达载体中,其中该载体中含有可以与宿主基因组进行同源重组的序列;用该表达载体转化合适的宿主,目标蛋白或者目标多肽的编码序列和其分子伴侣的编码序列整合到宿主基因组中;共表达出目标蛋白或者目标多肽以及分子伴侣,纯化出目标蛋白或者目标多肽和分子伴侣的复合物。
具体的,本发明所述共表达载体中的所述多肽的基因序列编码胰岛素样生长因子-II和所述伴侣分子的基因序列编码IGFBP-6。
所述复合物含有胰岛素样生长因子-II和IGFBP-6,其中所述胰岛素样生长因子-II是正确折叠的。
第二个方面,本发明提供了分子伴侣或者与其相关分子及其片段在制备有活性多肽或者蛋白质中的用途。
多肽链是线状合成的,必须折叠以获得正确的二级与三级结构。蛋白质或者多肽的折叠是重要的。在体内,很多新合成的蛋白质或者多肽不能自发地折叠成它们的天然构象(自组装,self-assembly),可能是由于折叠过程要求能量上不利的中间态的过渡或由于同时存在几种可能的稳定折叠途径,只有一种可以达到天然态。在这种情况下,正确的折叠由被称为分子伴侣(molecular chaperones)的分子来指导,它们可以结合在天然态包埋在蛋白质内部而在变性态暴露在蛋白质外的残基(暴露于溶剂的疏水残基)来识别变性态.正确的折叠反映了分子伴侣-底物结合与释放的一个周期.参见,R·M·特怀曼,著;陈淳,徐沁等译,高级分子生物学要义,科学出版社,2001,第270页到第271页.
因此,分子伴侣的编码基因或者其片段可以与该分子伴侣所指导的多肽或者蛋白质的编码基因重组进行共表达,产生有活性多肽或者蛋白质。
应用分子伴侣与目标多肽或者蛋白质的关联性,制备具有生物活性的目标多肽或者蛋白质是在本发明之内。也可以表征为应用分子伴侣或者正确折叠的多肽或者蛋白质。
具体地,本发明提出IGFBP-6作为伴侣分子在制备有活性的胰岛素样生长因子-II中的应用。
第三个方面,本发明提供了在上述方法中所形成的共表达载体、转化的宿主细胞、共表达产物等。
本发明提供了一种表达载体,含有编码IGF-II的核酸和编码IGFBP-6的核酸。在一个实施方案中,是采用IGF-II的cDNA和IGFBP-6的cDNA构建表达载体。
本发明提供了一种含有上述表达载体的细胞,比如酵母细胞。
本发明提供了一种由IGF-II和IGFBP-6两种多肽组成的复合物,是通过培养上述含有表达载体的细胞,比如酵母细胞;从细胞培养物中回收得到。
附图说明
图1是质粒构建示意图。
图2是pAO815-2(IGF-II-IGFBP-6)酶切鉴定结果。图中,1:BamHI+BglII双酶切(7.9Kb,4.0Kb,2.4Kb);2:λ/HindIII。
图3显示共表达对IGF-II产量的影响(诱导24hr)。图中,M:低分子量蛋白质marker;1:IGFBP-6单表达上清;2:IGF-II和IGFBP-6共表达上清;3:IGF-II单表达上清。
图4显示共表达对IGF-II结构的影响。图中,1:IGF-II单表达上清,还原加样buffer;2:IGF-II单表达上清,非还原加样buffer;3:IGF-II共表达上清,还原加样buffer;4:IGF-II共表达上清,非还原加样buffer。
图5显示共表达产物纯化结果。图中,M:低分子量蛋白maker;1:共表达上清;2:离子交换层析洗脱液;3:疏水交换层析洗脱液。
图6显示IGFBP-6二硫键折叠。图中,1:IGFBP-6溶于还原加样buffer;2:IGFBP-6溶于非还原加样buffer。
图7显示胰岛素家族三种多肽氨基酸序列的比较。图中,方框所标为高度同源的序列。IGF-I和proinsulin序列中阴影加粗处为进行突变的位点,突变后聚合体消失。箭头所指处为IGF-II中相应的带电荷氨基酸,是引起分子间相互作用的潜在位点。
图8:IGF-II分子二硫键的折叠。
图9A:BglII线性化载体后的同源重组。图9B:SalI线性化载体后的同源重组。
具体实施方式
1.定义和说明
蛋白质或者多肽必须折叠成它的天然构象(native conformation)。天然构象是其具有生物活性的构象。
在本发明中,蛋白质或者多肽是指由一系列氨基酸残基通过肽键连接起来的分子.术语,“蛋白质”和“多肽”,在本发明中不予以区分,将它们在本发明中替换使用.
在本发明中,“蛋白质或者多肽的折叠”,是指新合成的(或者变性的)多肽链构象的整体转变成独特三维构象的天然蛋白质或者多肽的过程。
在本发明中,“分子伴侣”是指指导多肽链正确折叠的物质。
IGF-II是胰岛素样生长因子-II的缩写,它是一种单链多肽,含有三个二硫键,由67个氨基酸残基组成。
IGFBP-6是胰岛素样生长因子结合蛋白(简称IGFBP)的一种,为单链多肽,由213个氨基酸残基组成。
由于重组IGF-II被认为在局部组织损伤的修复治疗中有广阔的临床应用前景,所以一直以来在寻求制备有活性的重组IGF-II的方法。
本发明的发明人此前也进行了酵母体系分泌表达IGF-II的工作,参见李旌军,黄秉仁,人胰岛素样生长因子II在甲醇营养型酵母P.pastoris中的表达分泌和性质研究,中国生物化学与分子生物学报,1999,15(6):893-898。但是,重组表达的IGF-I常常形成没有活性的聚合体,本发明人的酵母体系分泌表达IGF-II也得到的是没有活性的IGF-II。因此,本发明人期望得到有活性的重组IGF-II。
另外,本发明的发明人认为IGF-II作为药物在体内使用存在和IGF-I同样的问题,比如会产生多种副作用。
研究表明IGFBP-6是IGF-II特异的高亲和力结合蛋白(它对IGF-II的亲和力是对IGF-I的约100倍),如果IGFBP-6能与IGF-II共同给药将提高IGF-II的临床药用价值。因此,本发明人期望得到IGF-II与IGFBP-6的复合物。
基于以上需要,对在酵母体系中分泌表达IGF-II进行了进一步研究。在对IGF-II的晶体结构的研究中发现单独分泌表达的IGF-II形成了没有活性的聚合体,进一步的分析揭示这种聚合体是由于IGF-II分子间形成了二硫键。根据文献报道胰岛素和IGF-I在体外表达时也存在形成聚合体的问题。其机理是由于胰岛素和IGF-I分子中的带电荷氨基酸相互吸引,干扰了正在折叠的分子形成二硫键,导致没有配对的半胱氨酸形成分子间二硫键,引发聚合体。IGF-II的氨基酸组成与IGF-I和胰岛素有高度的同源性,也在相应的区域存在带电荷氨基酸,所以本发明的发明人认为IGF-II也是基于相同的机理形成聚合体。而且本发明人的实验也证实了聚合体中IGF-II分子间确实形成了二硫键。
由于IGF分子在体内是与IGFBP结合成复合物的形式在血液循环中运输的,而且IGFBP对IGF的生物活性也有重要的调节作用,两者的关系非常密切。所以,本发明的发明人认为IGFBP-6很可能对IGF-II的翻译加工过程也有调节作用。
基于以上两点,本发明人进行了IGF-II与IGFBP-6在酵母中共分泌表达。试验结果表明:1、IGFBP-6能帮助IGF-II形成正确的二硫键,并大大提高了IGF-II分泌表达的效率,具有分子伴侣的作用。2、两者成功实现了共分泌表达,并建立了分离纯化结合状态的复合物的工艺流程,为下一步作为重组药物的应用奠定了基础。
而且两者共表达与联合给药具有明显的优点:1.简化了重组药物生产及纯化的过程,2.得到的IGF-II具有正确的结构和活性,3.确保IGF-II都是以结合状态存在,避免了游离IGF-II随意发挥其促增殖活性。
2.实验
与IGFBP家族其他成员相比,IGFBP-6对IGF-II具有特异的高亲和力,这意味着IGFBP-6和IGF-II有着特殊的关系,IGFBP-6可以特异地抑制IGF-II促肿瘤细胞生长的活性,而对IGF-I活性的影响甚微。IGFBP-6在体内多种组织广泛分布,这对IGF-II的存在和活性有什么更深的意义,是本发明的发明人所关心的问题。本发明的发明人在以前的针对IGF-II的研究工作中发现,在Pp酵母中表达的IGF-II,由于二硫键不能正确配对导致分子间形成二硫键,使大部分IGF-II都以高度聚合体的形式存在。选用低拷贝的转化子降低表达量、高通氧条件下的发酵表达以及各种表达条件的优化都不能解决这一问题。这提示IGF-II的正确折叠可能需要分子伴侣的帮助才能完成。基于IGFBP-6与IGF-II的密切关系,本实验验证了IGFBP-6在IGF-II翻译、折叠过程中发挥的作用。
实验材料
1.pAO815-2IGF-II表达载体以及Mut+表型的GS115/pAO815-2IGF-II菌株是以前构建的,参见李旌军,黄秉仁,人胰岛素样生长因子II在甲醇营养型酵母P.pastoris中的表达分泌和性质研究[J],中国生物化学与分子生物学报,1999,15(6):893-898。
2.HRP显色底物:6mg二氨基联苯胺溶解于10ml 10mM Tris·Cl(pH 7.6),Whatman1号滤纸过滤后,加入10μl过氧化氢。使用前新鲜配制。
3.Tricine-SDS-PAGE用试剂
49.5%丙烯酰胺:48.02g丙烯酰胺,1.48g N,N’-二甲叉丙烯酰胺,以50ml温热的去离子水溶解,加水定容至100ml,Whatman1号滤纸过滤除杂质,室温避光保存。
凝胶buffer:3mol/L Tris·Cl(pH8.45),0.3%SDS。将36.3g Tris和0.3gSDS溶于80ml去离子水中,用HCl调pH至8.45,加水至100ml。
80%甘油:80ml甘油,加水至100ml,充分混匀。
1×阴极电泳buffer:0.1mol/L Tris·Cl(pH8.25),0.1mol/L Tricine,0.1%SDS。将1.21g Tris、1.79g Tricine及0.1g SDS溶于80ml去离子水中,用HCl调pH至8.25,加水定容至100ml。
1×阳极电泳buffer:0.2mol/L Tris·Cl(pH8.9)。将2.42g Tris溶于80ml去离子水中,用HCl调pH至8.9,加水定容至100ml。
10%APS:将1g过硫酸胺溶于10ml去离子水中,4℃短期保存。
TEMED:少量分装,4℃避光保存。
4×非还原加样buffer:0.2mol/L Tris·Cl(pH6.8),8%SDS,0.4%溴酚蓝,40%甘油。
4.蛋白质层析用试剂
bufferA:0.05mol/L醋酸钠buffer,62mmol/L氯化钠,1mmol/L EDTA调节pH至5.0
bufferB:0.05mol/L醋酸钠buffer,1mol/L硫酸铵,1mmol/L EDTA调节pH至5.0
实验方法和结果
实施例一.共表达载体pAO815-2(IGF-II-IGFBP-6)的构建
利用已有的表达载体pAO815-2IGF-II和pAO815-2IGFBP-6构建共表达载体pAO815-2(IGF-II-IGFBP-6),方法如图1所示,BglII和BamHI双酶切pAO815-2IGFBP-6,得到两拷贝的IGFBP-6表达单元,回收片段后,与经过BamHI线性化及CIP去磷酸化处理的表达载体pAO815-2IGF-II进行连接.挑取氨苄青霉素抗性阳性的克隆,制备质粒,根据质粒大小鉴定插入了目的片段的阳性克隆,再利用BglII和BamHI双酶切鉴定和筛选出两拷贝IGFBP-6表达单元按正确方向连入的重组表达载体pAO815-2(IGF-II-IGFBP-6).制备质粒,SalI使之线性化后,转化Pp菌株GS115.
克隆入表达载体中的IGFBP-6的cDNA序列:
AGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCAT TAGCTGCTCCAGCTAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCT GAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTG CCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCC AGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTTTGGATAAAAGACGGTGCCCAGGCTGCGGGCAAGGGGTGCAGGCGGGTTGTCCAGGGGGCTGCGTGGAGGAGGAGGATGGGGGGTCGCCAGCCGAGGGCTGCGCGGAAGCTGAGGGCTGTCTCAGGAGGGAGGGGCAGGAGTGCGGGGTCTACACCCCTAACTGCGCCCCAGGACTGCAGTGCCATCCGCCCAAGGACGACGAGGCGCCTTTGCGGGCGCTGCTGCTCGGCCGAGGCCGCTGCCTTCCGGCCCGCGCGCCTGCTGTTGCAGAGGAGAATCCTAAGGAGAGTAAACCCCAAGCAGGCACTGCCCGCCCACAGGATGTGAACCGCAGAGACCAACAGAGGAATCCAGGCACCTCTACCACGCCCTCCCAGCCCAATTCTGCGGGTGTCCAAGACACTGAGATGGGCCCATGCCGTAGACATCTGGACTCAGTGCTGCAGCAACTCCAGACTGAGGTCTACCGAGGGGCTCAAACACTCTACGTGCCCAATTGTGACCATCGAGGCTTCTACCGGAAGCGGCAGTGCCGCTCCTCCCAGGGGCAGCGCCGAGGTCCCTGCTGGTGTGTGGATCGGATGGGCAAGTCCCTGCCAGGGTCTCCAGATGGCAATGGAAGCTCCTCCTGCCCCACTGGGAGTAGCGGC
框内部分为Kozak序列;划线部分为α-factor信号肽的编码序列,共255bp,编码85个氨基酸的信号肽,用于引导IGFBP-6分泌表达;其他部分为IGFBP-6的编码序列,639bp编码213个氨基酸的IGFBP-6。
克隆入表达载体中的IGF-II的cDNA序列:
AGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCAT TAGCTGCTCCAGCTAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCT GAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTG CCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCC AGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTTTGGATAAAAGAGCTTACCGCCCCAGTGAGACCCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAG
框内部分为Kozak序列;划线部分为α-factor信号肽的编码序列,共255bp,编码85个氨基酸的信号肽,用于引导IGF-II的分泌表达;其他部分为IGF-II的编码序列,201bp,编码67个氨基酸的IGF-II。
在后附序列表中,序列SEQ ID NO:1表示IGF-II的编码序列;序列SEQ ID NO:2表示IGFBP-6的编码序列;序列SEQ ID NO:3表示α-factor信号肽的编码序列。
实验结果显示:BglII和BamHI双酶切pAO815-2IGFBP-6,可以得到大小约为4.4Kb、头→尾正确连接的两拷贝IGFBP-6表达单元,这一片段5’端为BglII粘性末端,3’端为BamHI的粘性末端.由于BglII和BamHI是同尾酶,在与经过BamHI线性化及CIP去磷酸化处理的表达载体pAO815-2IGF-II进行连接时,会以两种方向连入.利用BglII和BamHI双酶切可以鉴定出按5’→3’正确转录方向连入的重组克隆.正确方向的克隆中,载体上的BamHI末端与片段上的BglII末端连接后将不能再被两种酶切割,BglII和BamHI双酶切鉴定时将产生7.9Kb的头→尾连接的表达单元的片段(参见图2).由于载体大小的限制,只能构建两拷贝的共表达载体.在两拷贝的共表达载体pAO815-2(IGF-II-IGFBP-6)中,IGF-II和IGFBP-6以相等的拷贝数存在,每一个表达单元具有独立的启动子和转录终止序列,独立的进行转录和翻译,这样可以确保IGF-II和IGFBP-6以相等的分子数存在于表达上清中.以SalI使载体线性化后转化酵母菌,利用HIS4位点重组,可以保证所有的插入片段全部整合入酵母基因组中,进一步保证了IGF-II和IGFBP-6以等分子数进行表达.
实施例二.贴膜法筛选阳性共表达转化子
将MD板上长出的阳性转化子按顺序接种至新的MD板上,一块9cm直径的平板可以接种约30~40个克隆。28~30℃培养3~4天,克隆的直径可以达到约2~3mm。用一张直径6cm的圆形无菌的醋酸纤维素膜贴至平板上,使菌落黏附于醋酸纤维素膜上。在一个新鲜准备的BMMY板上,放置一张同样大小的无菌硝酸纤维素膜,将醋酸纤维素膜带有菌落的一面向上平贴于硝酸纤维素膜上,使两张膜重叠在一起,尽量排除两层膜以及平板之间的气泡。28~30℃诱导表达24hr,取出硝酸纤维素膜进行抗体的杂交。每次实验需同时制备两张完全一样的膜,进行两种抗体的杂交。吸附有分泌蛋白的硝酸纤维素膜封闭后,分别与羊抗IGF-II的多克隆抗体和羊抗IGFBP-6的多克隆抗体杂交,PBS-T洗膜后再将两张膜背靠背同时与HRP标记的二抗杂交,TBS-T洗膜后,加入HRP显色底物,显色后将膜晾干,避光保存。
贴膜法筛选共表达IGF-II和IGFBP-6的阳性克隆,一次实验可以完成30~40个克隆的筛选,是一种高效率的初步筛选方法。与两种抗体都有杂交信号的克隆共有8株,其中信号最强的有两株,另外6株信号较弱。将两株杂交信号强的克隆进行小规模培养:从MD板上挑取菌株,分别于10ml BMG培养基中28~30℃震荡培养至OD600≈10。室温离心收集菌体,重悬于10mlBMMY中,28~30℃继续振荡培养,每24h追加甲醇100μl,在诱导后72hr收获菌体,离心收集上清,进一步分析IGF-II和IGFBP-6的表达情况。500μl培养上清TCA沉淀浓缩后,经Tricine-SDS-PAGE分离。银染结果表明:表达上清中分别存在7.4KD、18KD和30KD的三条主带(参见图3中2道),分子量分别与在Pp酵母中单独表达时的IGF-II、IGFBP-6的降解片段及IGFBP-6全长一致。经Western blot鉴定,7.4KD的带与抗IGF-II多克隆抗体有杂交信号,18KD和30KD的带与抗IGFBP-6多克隆抗体有特异的杂交信号,说明这两株阳性转化子确实共表达了IGF-II和IGFBP-6。选定其中的一株进行下一步的分离纯化及性质的研究。
实施例三、摇瓶表达
SalI线性化的pAO815-2(IGF-II-IGFBP-6)转化GS115后,载体上的HIS4基因与酵母染色体上的his4基因发生同源重组,整合入酵母染色体,不影响酵母的AOX1启动子对甲醇的利用,所得到的阳性转化子应全部是Mut+表型。诱导表达时放大体积培养。刮取MD平板上的阳性克隆,接种于25ml YPD液体培养基,28~30℃,200~230rpm振荡培养20h后,将适量菌液转接于100ml BMG中继续培养过夜,使OD600≈10,室温离心1500×g,收集菌体,重悬于500ml BMMY,1%甲醇诱导培养72hr后,4℃,8000×g离心收集上清,4℃短期保存,如需长期保存,分装成小份后-20℃冻存。
共表达产物中IGF-II结构的鉴定和表达产量的分析
Mut+表型的GS115/pAO815-2IGF-II、GS115/pAO815-2(IGF-II-IGFBP-6)及GS115/pAO815-2IGFBP-6菌株按相同的摇瓶培养条件放大体积诱导。诱导前菌液的OD600值均约为10,使菌的状态保持一致。诱导24hr时收集菌液,取等量的表达上清TCA沉淀浓缩后,Tricine-SDS-PAGE分离,银染鉴定表达上清中蛋白的含量。结果如图3所示:共表达菌株诱导24hr时,已有相当含量的IGF-II分泌;而单表达IGF-II的菌株,诱导24hr时,IGF-II的表达却很低。说明IGFBP-6显著提高了IGF-II的翻译加工的效率。共表达对IGFBP-6的表达量却没有明显的影响,IGFBP-6依然被降解成18KD的片段,说明IGF-II与IGFBP-6的结合并没有使酶切位点受到保护。
诱导72hr后,IGF-II的表达量逐渐积累增加。取IGF-II单独表达上清和共表达上清,TCA沉淀浓缩,每种样品分别用1×还原加样buffer(含β-巯基乙醇)和1×非还原加样buffer(不含β-巯基乙醇)溶解,Tricine-SDS-PAGE分离,转膜后与羊抗人IGF-II多克隆抗体进行杂交。结果如图4所示:IGF-II单表达上清中,β-巯基乙醇可以打开分子间的二硫键,使样品中的IGF-II完全成为7.4KD的单体,非还原条件下IGF-II则以多种聚合体的形式存在,未见单体IGF-II条带,说明二硫键是聚合体形成的原因。共表达的样品则不受β-巯基乙醇的影响,还原和非还原的变性条件下,都以7.4KD的单体IGF-II为主要形式存在。所以共表达时,IGFBP-6具有分子伴侣的功能,帮助IGF-II实现了二硫键的正确折叠,防止了聚合体的形成。
实施例四、复合物的制备
1.凝胶的配制
2.电泳
灌制好凝胶后,分别将阴极电泳buffer和阳极电泳buffer加入电泳槽的上槽和下槽中,将电泳槽封好,避免阴极buffer和阳极buffer的混合,恒压100V电泳约3hr。
3.共表达产物的分离纯化
表达上清经4℃,8000×g离心10min后,收集上清。经0.22μm混合纤维素膜过滤后,用于层析。层析用所有试剂都需经0.22μm滤膜过滤除杂质,防止层析介质的堵塞。
表达上清采用FPLC系统的阳离子交换层析和疏水交换层析进行两步纯化。阳离子交换层析柱为自装柱:Amersham Bioscience公司的层析介质SP Sepharose Fast Flow装入XK26/20柱,柱体积50ml。疏水交换层析柱为自装柱:Amersham Bioscience公司的层析介质Phenyl Sepharose Fast Flow装入XK26/20柱,柱体积10ml.层析缓冲液见实验材料部分.
表达上清用10倍体积的bufferA稀释,调节pH至5.0后,以5ml/min上样于经250ml bufferA平衡的SP Sepharose Fast Flow,用bufferA将上样峰洗至基线后,用bufferB以5ml/min洗脱,收集洗脱液。阳离子交换层析的洗脱液以2ml/min上样于经100ml bufferB平衡的HiTrap Octyl Fast Flow,用bufferB将上样峰洗至基线后,用bufferA以2ml/min流速一步洗脱。Tricine-SDS-PAGE鉴定洗脱液。
共表达产物的层析性质的分析:
在疏水交换层析过程中,共表达样品表现出与单独表达的IGF-II和IGFBP-6不同的疏水性质。在1mol/L硫酸铵的上样条件下,单独表达的IGF-II样品和IGFBP-6样品都能够与较弱的疏水介质辛烷基琼脂糖(octyl sepharose)结合,在不含硫酸铵的bufferA洗脱条件下可以有效洗脱。相同的上样条件下,共表达样品则不能与辛烷基琼脂糖有效结合,需使用具有更强的疏水性的苯基琼脂糖介质(phenylsepharose)才能有效结合,不含硫酸铵的bufferA可以有效洗脱。而单独表达的IGF-II样品和IGFBP-6样品与苯基琼脂糖介质强有力的结合则必须使用20%~70%乙醇的极端洗脱条件,才能将其洗脱。这说明共表达的过程中IGF-II折叠形成了正确的结构,能够与IGFBP-6结合形成复合物,占据了蛋白表面的疏水性氨基酸,使复合物的疏水性大大减弱。
在分离纯化过程中IGF-II与IGFBP-6含量比值的变化也说明IGF-II与IGFBP-6以复合物的形式从疏水介质上洗脱。如图5和表1所示:在离子交换层析洗脱液中,IGF-II与IGFBP-6的含量比为38%:62%;在疏水交换层析洗脱液中,两者的比值降为28%:72%,接近两者的分子量的比值。说明疏水交换层析除去了大部分游离的蛋白,纯化出了结合状态的复合物。
表1:凝胶成像分析(与图5对应)
通过上述实验可以看出,IGF-II是人体重要的生长调节因子。虽然成熟的IGF-II是只有67个氨基酸的小肽,但对其晶体结构的解析至今尚未成功。自从Bell等人(BellGI,Merryweather JP,et al.Sequence of a cDNA clone encoding human preproinsulin-like growthfactor II.Nature.1984 Aug 30-Sep 5;310(5980):775-7.)于1984年成功克隆得到人IGF-II的cDNA序列以来,人IGF-II先后以不同的形式在多种表达体系中表达,但都因表达产量低、不能正确复性而未获得成功(Hammarberg B,Moks T,et al.Differential stability ofrecombinant human insulin-like growth factor II in Escherichia coli and taphylococcus aureus.JBiotechnol.1990 Jun;14(3-4):423-37.)。这制约着对IGF-II结构的研究。
本发明利用Pp酵母体系表达IGF-II的研究中,IGF-II可以以60mg/L的产量实现分泌表达。但在进一步的结构研究中却发现由于二硫键的错误折叠,IGF-II以高度聚合体的形式存在,大大制约了结构和功能的研究。
蛋白质二硫键的折叠不是自发进行的,需要内质网中的辅助分子及折叠酶的帮助才能完成。酵母细胞具有真核生物细胞所特有的分泌路径——内质网→高尔基体→质膜,内质网内拥有蛋白质折叠的辅助分子,蛋白质分泌表达的过程就是进行蛋白质的折叠和翻译后加工的过程,所以分泌的表达产物往往具有正确的构象和生物活性。IGFBP-6也是富含二硫键的蛋白,分子中共有16个半胱氨酸,形成8对二硫键,Pp酵母中表达的IGFBP-6没有形成分子间二硫键引发的聚合体(参见图6),说明在Pp酵母表达体系中由α-factor信号肽引导的蛋白分泌表达可以成功的实现蛋白质的折叠。
单独存在时发生聚合是胰岛素家族共同存在的问题。胰岛素和前胰岛素会自发聚集成六聚体,大大影响了药用胰岛素的吸收和血药浓度。聚合的原因是由于分子之间带电氨基酸的相互吸引。经过对胰岛素氨基酸的突变得到了具有生物活性的单体胰岛素,大大加快了药物的利用率。由于结构上的同源性,IGF-I也存在相似的问题。Bhabatosh等人在酿酒酵母中表达IGF-I时,IGF-I也形成了基于二硫键的聚合体,他们对IGF-I相应的带电氨基酸进行突变,消除了二硫键引发的聚合[34]。分析IGF-II的氨基酸组成,存在与胰岛素和IGF-I高度同源的带电氨基酸(参见图7),具有自发聚集的结构基础。很可能是同样的机制造成分子间自发聚集的倾向,干扰了新合成的IGF-II的折叠,导致二硫键的错配。
基于上述实验,说明IGFBP-6与IGF-II存在密切关系,IGFBP-6对体内IGF-II从翻译表达、运输到活性的调节都起重要的作用。本试验中IGFBP-6的存在,从机理上分析可能是通过有效隔离IGF-II分子之间的相互作用,使新合成的IGF-II有充分的时间和空间进行折叠,也可能是在IGF-II折叠过程中与之伴随起到分子伴侣的作用,使IGF-II二硫键得以正确折叠(参见图8),有效避免了聚合的发生。
本试验的结果证明了IGFBP-6可以有效的帮助IGF-II在翻译过程中的二硫键折叠,大大提高了IGF-II分泌表达的效率,两者能以复合物的形式共同表达。为下一步IGF-II和IGFBP-6的结构与功能的研究奠定了基础。
为实现IGFBP-6和IGF-II等分子数的表达,本发明从载体的构建和重组方式两方面进行了设计.首先,构建了两种基因表达单元的等拷贝数的表达载体,每个表达单元具有独立的转录启动子和转率终止子,从结构上保证了两种蛋白以相同的机率得到甲醇的诱导,起始转录和翻译.另外,在转化酵母菌时,如果用BglII酶切,线性化的载体利用载体上的5’AOX1和3’AOX1与酵母染色体上的5’AOX1和3’AOX1基因进行同源重组,外源基因有可能丢失.因为每一个表达单元的5’AOX1的都可以进行同源重组整合,就会使上游的表达单元丢失(图9A).而SalI线性化载体后,则利用载体上的HIS4基因与酵母染色体上的his4基因进行同源重组,这样所有插入的外源基因的表达单元都可以整合入酵母染色体,进一步确保两种蛋白以相同的拷贝数存在(图9B).本实验的结果表明两种相互作用的蛋白共表达而非融合表达,很好地实现两种蛋白的翻译加工,并以结合状态分泌表达.克服了融合表达时的一些缺陷,如:因外源基因过大导致的翻译提前终止,两种蛋白空间距离过近对折叠的不利影响等.为其他相互作用蛋白的共表达,提供了成功的经验.
IGF分子在血液循环和组织局部都是与IGFBP分子结合成复合体的形式存在的,这既有效保护了IGF免遭降解,又避免了IGF活性的过度发挥对机体造成的危害。作为药物的重组IGF-I的临床前实验结果表明,单独用药时致癌的副作用可以通过与IGFBP-3共同用药来消除。本实验共表达IGF-II和IGFBP-6,分离纯化出结合状态的复合物,解决了共同给药的问题,又大大提高了表达纯化的效率。
由于IGF分子在体内是与IGFBP结合成复合物的形式在血液循环中运输的,而且IGFBP对IGF的生物活性也有重要的调节作用,两者的关系非常密切。所以,IGFBP-6对IGF-II的翻译加工过程很可能也有调节作用。
IGF-II与IGFBP-6在酵母中共分泌表达实验结果表明:IGFBP-6能帮助IGF-II形成正确的二硫键,并大大提高了IGF-II分泌表达的效率,具有分子伴侣的作用;两者成功实现了共分泌表达,并可通过分离纯化工艺得到结合状态的复合物。而且两者共表达与联合给药具有明显的优点:1.简化了重组药物生产及纯化的过程,2.得到的IGF-II具有正确的结构和活性,3.确保IGF-II都是以结合状态存在,避免了游离IGF-II随意发挥其促增殖活性。
序列表
<160>3
<210>1
<211>201
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
gcttaccgcc ccagtgagac cctgtgcggc ggggagctgg tggacaccct ccagttcgtc 60
tgtggggacc gcggcttcta cttcagcagg cccgcaagcc gtgtgagccg tcgcagccgt 120
ggcatcgttg aggagtgctg tttccgcagc tgtgacctgg ccctcctgga gacgtactgt 180
gctacccccg ccaagtccga g 201
<210>2
<211>639
<212>DNA
<213>智人
<400>2
cggtgcccag gctgcgggca aggggtgcag gcgggttgtc cagggggctg cgtggaggag 60
gaggatgggg ggtcgccagc cgagggctgc gcggaagctg agggctgtct caggagggag 120
gggcaggagt gcggggtcta cacccctaac tgcgccccag gactgcagtg ccatccgccc 180
aaggacgacg aggcgccttt gcgggcgctg ctgctcggcc gaggccgctg ccttccggcc 240
cgcgcgcctg ctgttgcaga ggagaatcct aaggagagta aaccccaagc aggcactgcc 300
cgcccacagg atgtgaaccg cagagaccaa cagaggaatc caggcacctc taccacgccc 360
tcccagccca attctgcggg tgtccaagac actgagatgg gcccatgccg tagacatctg 420
gactcagtgc tgcagcaact ccagactgag gtctaccgag gggctcaaac actctacgtg 480
cccaattgtg accatcgagg cttctaccgg aagcggcagt gccgctcctc ccaggggcag 540
cgccgaggtc cctgctggtg tgtggatcgg atgggcaagt ccctgccagg gtctccagat 600
ggcaatggaa gctcctcctg ccccactggg agtagcggc 639
<210>3
<211>255
<212>DNA
<213>啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>3
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagctaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctttggata aaaga 255
Claims (6)
1.一种胰岛素样生长因子结合蛋白-6介导的有活性胰岛素样生长因子-II复合物的制备方法,包括:
1)获得编码多肽或者蛋白质IGF-II的基因序列,并获得编码该多肽或者蛋白质IGF-II的伴侣分子IGFBP-6的基因序列;
2)用上述序列构建共表达载体;
3)转化宿主细胞Pp酵母细胞,使共表达载体表达该多肽或者蛋白质IGF-II利该伴侣分子IGFBP-6;和
4)收集表达产物IGFBP-6和IGF-II的复合物,其中含有该活性多肽或者蛋白质IGF-II。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述共表达载体中的所述多肽或者蛋白质IGF-II的编码基因序列和所述伴侣分子IGFBP-6基因序列是等拷贝比例关系。
3.一种权利要求1或2中使用的共表达载体,含有胰岛素样生长因子-II和IGFBP-6的基因。
4.一种转化的宿主细胞,是通过用权利要求3所述的共表达载体转化。
5.一种构建权利要求1或2中使用的共表达载体的方法,包括:
将胰岛素样生长因子-II基因和IGFBP-6基因以等拷贝数量插入到表达载体中,使两种基因独立受到调控。
6.IGFBP-6作为伴侣分子在制备有活性的胰岛素样生长因子-II中的应用。
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