JP2662390B2 - インシユリン類似体 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、皮下注射における速効作用が特徴的な新規
ヒトインシュリン類似体、およびこのようなインシュリ
ン類似体を含むインシュリン注射液および新規インシュ
リン類似体の調製方法に関する。 〔従来の技術〕 糖尿病の治療において多くの種類のインシュリン製剤
が当該技術に提案されてきている。これらのうち幾つか
は速効性であり、その他は大体延長作用を有する。 速効性インシュリン製剤は、たとえば高グリシン血症
性昏睡のような深刻な状態において、外科的手術の間、
妊娠の間および重大な感染症において使用されうる。さ
らに、速効性インシュリン製剤の多数回の毎日の注射
は、より長時間作用性インシュリンでコントロールする
ことが困難であることがわかった糖尿病患者のコントロ
ールを向上することもある。 近年では、健康な機器のβ細胞からのインシュリン分
泌に取り組むインシュリン治療、すなわち食事と関連す
るインシュリン供給および基礎的インシュリンレベルの
維持において興味が増してきている。臨床的所見によれ
ば、基礎的要求を満たすために延長化作用を有するイン
シュリンを１日１回注射し、主な食事の前に速効性イン
シュリンのより少ない量（小塊）の注射で補うことによ
り、糖尿病患者がほぼ正常のインシュリンおよびグルコ
ース濃度を得ることができることがわかっている。 速効性インシュリンはまた、中間体および長時間作用
インシュリンの遅延作用に加えてより強い初期作用が必
要な糖尿病患者の治療のために、中間体および長時間作
用インシュリンと混合して使用される。 最後に、速効性インシュリンは連続的インシュリン供
給システムに用いられる。 速効性インシュリン溶液の皮下注射により吸収が初期
に遅れるということが見られた（バインダー，ディアベ
テス ケア ７,No.2（1984）,188−189）。しかしなが
ら吸収が遅れた結果作用がゆっくり効きはじめるという
ことは、厳密な代謝調節を目指す場合には望ましくな
い。速効性インシュリン溶液と長時間作用性インシュリ
ン製剤とを混合すると、さらに、速効性インシュリンの
吸収率が低下するという結果になる。 したがって、皮下注射いたとき作用が早く始まり遅延
性のインシュリン製剤との混和性が向上した速効性イン
シュリン溶液が必要とされる。 公知の速効性インシュリン溶液の別の欠点は、インシ
ュリンが連続的インシュリン供給で使用されるインシュ
リン溶液中で小繊維状になり析出して、これにより機械
部品および供給用カテーテルを塞ぐ傾向にあることであ
る。 最後に、通常のインシュリンに耐性を有する患者の治
療に別のインシュリン製剤が必要である。 本発明の目的は、次の向上した特性： １）皮下注射または他の経路での投与により作用のより
速い開始、 ２）遅延性インシュリン製剤との向上した混和性、 ３）差し込み式供給システムに用いられたときの線維化
傾向が低いこと、および ４）耐性患者の治療に対する有用性（過剰に存在する抗
体に対する低い親和性）、 の１種以上を有する新規な速効性インシュリン溶液を提
供することである。 本発明の目的は後述する新規なヒトインシュリン類似
体の水性注射液により達成される。 多数のインシュリン類似体が過去に記載されている。
メルキ（Ｍrki）ら（Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Ch
em.,360（1979）,1619−1632）は、Ａ−鎖の２、５、
６、７、８および11番目とＢ−鎖の５、７、13および16
番目の１個のアミノ酸を置き換えたヒトインシュリンと
異なるヒトインシュリン類似体の合成について記載し興
味深いインシュリンの構造−活性関係に対する新しい洞
察を提供している。さらに研究は、インシュリン（Ｂ
（22）−Ｂ（26））の主なレセプター結合区域を変性し
てレセプター結合活性におけるこのような突然変異の影
響を調査している。しかしながら公知ヒトインシュリン
類似体は、本発明者が望むような性質を示さない。 硫酸化インシュリンは小繊維化が非常に低い傾向にあ
り〔アルビッサーら（Albisser et al.）、“点滴ポン
プに用いられるインシュリンの望ましい特性”、ゲリジ
ャン ジェイ．エル．（Gueriguian J.L.）ら、編；コ
ーエス ファルマコペイアル コンベンション、ロック
ウィル，メリーランド,pp84−95）そして低い抗原性を
示すことが知られている。しかしながら硫酸化インシュ
リンは、１分子につき平均4.5個の硫酸エステル基を含
む少なくとも９個の異なったインシュリン誘導体の異種
混合物である。硫酸化インシュリンはさらに低いインシ
ュリン活性を有し、天然インシュリンの約20％の活性で
ある。天然インシュリンと比較した硫酸化インシュリン
の別の欠点は、これらが化学的に変性されたアミノ酸残
基、すなわち天然に産生しないアミノ酸を不必要に含有
していることである。 それゆえ、本発明の別の目的は、均質で、硫酸化イン
シュリンより高い生理学的活性を有し、そしてさらに好
ましくは天然産生アミノ産を含むだけのインシュリン類
似体を提供することである。 ここで使用される“インシュリン類似体”は、Ａ
（７）CysとＢ（７）Cysの間およびＡ（20）CysとＢ（1
9）Cysの間にジスルフィド橋を有し、Ａ（６）CysとＡ
（11）Cysの間に内部ジスルフィド橋を有するヒトイン
シュリンと同様の分子構造を有しインシュリン活性を有
する化合物を意味する。 〔発明の構成および効果〕 本発明は、ヒトインシュリンの少なくとも１つのアミ
ノ酸残基を天然産生アミノ酸残基で置換した特定のイン
シュリン類似体が所望の速効性活性を示すという驚くべ
き事実に基づく。 最も広い見地において、ヒトインシュリンのアミノ酸
残基の１個以上を、天然産生アミノ酸残基で置換するこ
とにより形成され、二量体、三量体、六量体または重合
体への自己−会合がより少なく起こり、そしてヒトイン
シュリンのものより中性pHにおいて同じ電荷またはそれ
以上の大きな陰電荷を有する新規な速効性ヒトインシュ
リン類似体を提供するものである。 二量体、四量体、六量体または重合体への自己会合が
低い傾向になるために、ヒトインシュリンの特定の残基
が、分子におけるそれぞれの位置で天然アミノ酸残基よ
り一層親水性の他のアミノ酸残基で置換されるのが好ま
しい。また、インシュリン分子における特定の位置にお
いて、より大きなアミノ酸残基で置換することにより、
インシュリン分子が二量体、四量体、六量体または重合
体へ会合する傾向を低くすることになるであろう。 より詳しくは、本発明は次式I:（式中、Ｘはヒトインシュリンのアミノ酸残基または同
一もしくは異なったアミノ酸残基置換物であって、その
実効機能が中性pHにおいてヒトインシュリンと同じ電荷
またはそれより大きな陰電荷を分子に与えるものであ
り、ただし少なくとも１つのＸがインシュリン分子にお
けるそれぞれの位置でヒトインシュリンのアミノ酸残基
と異なり、そしてＡ（８）位のＸがHisまたはPheであ
り、Ａ（21）位のＸがAspであり、Ｂ（５）位のＸがAla
であり、Ｂ（９）位のＸがLeuであり、Ｂ（10）位のＸ
がAsnまたはLeuであり、Ｂ（12）位のＸがAsnでありま
たはＢ（26）位のＸがAlaの場合には残りのＸの少なく
とも１つがインシュリン分子のそれぞれの位置でヒトイ
ンシュリンのアミノ酸残基と異なり、そしてさらに、１
つ以上のアミノ酸残基はＡ−および／またはＢ−鎖のＮ
−および／またはＣ−末端から除去されていてもよ
い。）で表わされる新規のインシュリン誘導体を提供す
るものである。 好ましくは少なくともアミノ酸残基置換物の大部分が
ヒトインシュリン分子における相当する部位のアミノ酸
残基より親水性であり、さらに好ましくはすべてのアミ
ノ酸残基置換物が相当するヒトインシュリンアミノ酸残
基よりも親水性である。 親水性に関しては、シー．フレーメル（C.Frmme
l）,J.Theor−Biol.111（1984）,247−260（表１）が参
考になる。 前記式Ｉに関連して、好ましくは約７個以下のＸがヒ
トインシュリン分子における相当する位置のアミノ酸残
基と異なる。さらに好ましくは２〜４の置換物である。 アミノ酸残基置換物は、好ましくは、Asp、Glu、Se
r、Thr、HisおよびIleからなる群から選択され、より好
ましくは陰性に荷電されたアミノ酸残基、すなわちAsp
および／またはGluである。 新規ヒトインシュリン類似体は、ヒトインシュリンの
１種以上のヒドロキシアミノ酸の代わりに、またはヒト
インシュリンの１種以上のGlnおよびAsnの代わりに、As
pおよび／またはGluを含むのが好ましい。 新規ヒトインシュリン類似体は、さらに、脂肪族およ
び／または芳香族側鎖を有するヒトインシュリンのアミ
ノ酸残基１種以上の代わりにSerおよび／もしくはThrま
たはAspおよび／もしくはGluを含むのが好ましい。 新規ヒトインシュリン類似体は、また、脂肪族および
／または芳香族側鎖を有するヒトインシュリンのアミノ
酸残基１種以上の代わりにまたはヒトインシュリンのヒ
ドロキシアミノ酸１種以上の代わりにHisを含むことが
好ましい。 置換の好ましい位置はB9、B10、B12、B26、B27および
B28、好ましくはB9、B12、B27およびB28であり、これら
の位置において自己会合の低い傾向性と投与によるより
早い速効作用を得るには１つの置換で十分である。 B9位におけるアミノ酸残基置換物は、Asp、Pro、Gl
u、Ile、Leu、Val、His、Thr、Gln、Asn、Met、Tyr、Tr
pおよびPheからなる群から選択され、さらに好ましくは
Asp、Glu、Gln、AsnおよびHisからなる群から選択され
る。 B12位におけるアミノ酸残基置換物はIleおよびTyrか
らなる群から選択されうる。B10位におけるアミノ酸残
基置換物は、Asp、Arg、Glu、AsnおよびGlnからなる群
から選択され、B26、B27およびB28位においてはアミノ
酸残基置換物はAspまたはGluが好ましい。 インシュリン分子の残りの位置において少なくとも２
つの置換物（好ましくは上述の位置と組合せて）が向上
した特性を得るために必要であるように見える。これら
の位置において置換物は次のようである： 本発明のさらに好ましい化合物は、置換物が次の部位
にあるインシュリン類似体である： B27,B12,B9,（B27＋B9），（B27＋A21），（B27＋B1
2），（B12＋A21），（B27＋B17），（B27＋A13），（B
27＋B16），（B27＋A10），（B27＋B28），（B27＋B2
6），（B27＋B10），（B27＋B1），（B27＋B2），（B27
＋B5），（B27＋B14），（B27＋B18），（B27＋B20），
（B12＋B17），（B12＋A10），（B12＋A13），（B12＋B
16），（B12＋B1），（B12＋B2），（B12＋B5），（B12
＋B10），（B12＋B26），（B12＋B28），（B9＋B17），
（B9＋A13），（B9＋B16），（B9＋A8），（B9＋A9），
（B9＋A10），（B9＋B1），（B9＋B2），（B9＋B5），
（B9＋B10），（B9＋B12），（B9＋B14），（B9＋B2
8），（B9＋B18），（B9＋B20），（B9＋B26），（B27
＋B9＋A21），（B9＋B27＋A8），（B27＋B12,A21），
（B27＋B12＋B9），（B9＋B12＋B27＋B17），（B9＋B12
＋B27＋A13），（B9＋B12＋B27＋B16）および（B12＋B1
6＋B17＋B27＋A10＋A13）。 上記式Ｉの好ましい実施態様は次のとおりである。 （各式中、Ｘは前記のように定義されている。） 式Ｉに関して本発明による他の好ましいインシュリン
類似体は、B27位のＸがGluであるもの、B12位のＸがIle
またはTyrであるもの、A21位のＸがAspでありB27位がGl
uであるもの、B9位のＸがAspであるもの、A21位とB9位
のＸがAspでありB27位がGluであるもの、A8位のＸがHi
s、B9位はAspでありB27位はGluであるもの、B10位のＸ
がAspでありB28位のＸがAspであるもの、またはB9位の
ＸがAspでありそしてB27位がGluであるようなものであ
る。 本発明の第二の見地によれば、インシュリン活性を有
する注射液を提供するものである。本発明のインシュリ
ン注射液は上述のヒトインシュリン類似体または好まし
くは中性pHにてその医薬として許容されうる塩の水溶液
を含む。水性媒体は、たとえば塩化ナトリウムおよびグ
リセールの添加により等張化されうる。また、たとえば
酢酸塩もしくはクエン酸塩および保有剤たとえばｍ−ク
レゾール、フェノールもしくはメチル４−ヒドロキシベ
ンゾエートを添加してもよい。インシュリン溶液はさら
に亜鉛イオンを含んでもよい。 本発明のヒトインシュリン類似体は、これまで当業界
で公知であった速効性インシュリン溶液においてヒトま
たはブタインシュリンと置き換えることができる。 インシュリン類似体の調製 組換え体DNA技術の出現後、タンパク質工学について
の可能性は非常に大きくなってきている。いわゆる部位
特異的突然変異誘発技術により、もとからの遺伝子のコ
ドン１種以上を他の天然産生アミノ酸のコドンで置き換
えて天然産生タンパク質をコードする遺伝子を変えるこ
とが可能である。これに代わって、変性遺伝子を、非常
に良く知られた技術により全DNA配列を化学的に合成す
ることによって作ることもできる。天然タンパク質の遺
伝子のこのような操作の目的は、一般には、１つまたは
他の目指す方向に天然タンパク質の性質を変えることに
ある。 新規インシュリン類似体は、自然のヒトプロインシュ
リン遺伝子における適当な部位のコドンを所望のアミノ
酸残基置換物をエンコードするコドンにより置換してプ
ロインシュリン遺伝子を変えるか、または所望のヒトイ
ンシュリン類似体をエンコードする全DNA配列を合成す
ることにより調製されうる。次の所望のインシュリン類
似体をエンコードする新規の変性または合成遺伝子を適
当な表現ベクターへ挿入し、これを適当な宿主微生物た
とえば大腸菌、バチルス菌（Bacillus）または酵母へ移
すと所望の産物を生ずる。表現された産物は次いでこの
表現産物が細胞から分泌されるかそうでないかに従って
細胞または培養液から単離される。 新規インシュリン類似体は、メルキらにより記載され
た方法（Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.,360（197
9）,1619−1632）と同じ方法による化学的合成によって
も調製される。これらはまた、適当なアミノ酸残基置換
物を含む別々にインビトロ調製されたＡ−鎖およびＢ−
鎖から形成され、その際変性されたＡ−鎖およびＢ−鎖
は、公知方法（たとえば、チャンス（Chance）ら、リッ
クディ・エイチ（Rick DH）、グロス イー（Gross E）
（編）ペプチド：合成−構造−機能。プロシィーディン
グズ オブ ザ セブンス アメリカン ペプチド シ
ンポジウム，イリノイ州,pp721〜728）にしたがってジ
スルフィド橋を設けることにより一緒に連結される。 新規インシュリン類似体は、次式II:（式中、Qnはｎ個の天然産生アミノ酸残基を有するペプ
チド鎖であり、ＲはLysまたはArgであり、ｎは０〜33の
整数であり、ｍは０または１であり、Ｘは前記のように
定義されたものであり、ただしペプチド鎖−Qn−Ｒ−は
２個の隣接する塩基性アミノ酸残基を含まない。）で表
わされる生合成前駆体をトリプシンまたはトリプシン誘
導体の存在下にＬ−トレオニンエステルと反応させ、続
いて得られたヒトインシュリン類似体のトレオニンエス
テルを公知方法によりヒトインシュリン類似体へ転化す
ることにより調製されるのが好ましい。このいわゆる
“ペプチド転移”反応は米国特許第4,343,898号明細書
に記載されている（その記載事項は参考としてここへ加
えられている）。 ペプチド転移反応によりＢ鎖の29番目のアミノ酸とＡ
鎖の１番目のアミノ酸の間の−（Qn−Ｒ）ｍ−橋が削除
され、トレオニンエステル基はB29LysのＣ末端に連結す
る。 前記式IIの前駆体はヨーロッパ特許出願第0163529Aに
記載された方法と同じ方法で調製され、その記載はここ
に参考として加えられる。この方法により、問題となる
前駆体をエンコードするDNA配列が適当な表現ビヒクル
へ挿入され、これを酵母へ移すと正しく配置されたジス
ルフィド橋を有する所望の化合物を表現し分泌すること
ができる。表現された産物を次いで培養液から単離す
る。 本発明のインシュリン類似体は、また、次式III:（式中、ＶおよびＴはそれぞれLysまたはArgであり、Ｘ
は前記定義のものである。）で表わされる生合成前駆体
を水溶液中でトリプシンとカルボキシペプチダーゼＢと
反応させ、反応物溶液からヒトインシュリン類似体を回
収することによっても調製されうる。 上記式IIIの前駆体は、ヨーロッパ特許出願第8630213
3.3号に記載の方法と同じ方法により調製され、その記
載はここに参考のために加える。この方法により、前駆
体をエンコードするDNA配列を適当な酵母表現ビヒクル
へ挿入すると正しく配置されたジスルフィド橋を有する
表現産物が表現され培地へ分泌することができる。 本発明の第三の見地によれば、新規インシュリン類似
体を産生する方法を提供するものであり、この方法は、
インシュリン類似体の前駆体をエンコードするDNA配列
からなる複製可能な表現ビヒクルを含む酵母株を適当な
栄養培地で培養し、培地から前駆体を回収し、酵素的お
よび化学的インビトロ転化により新規インシュリン類似
体へ転化することからなる。 本発明はまた、新規インシュリン類似体の新規前駆
体、このような新規前駆体をエンコードするDNA配列、
このようなDNA配列を含む表現ビヒクルおよびこのよう
な表現ビヒクルで形質転換された酵母株を目指すもので
ある。 変性インシュリン類似体 本発明は、特定の誘導体または別の置換物が上述した
本発明の最終目標にほとんど影響しないという条件で、
このような誘導体または別の置換物を含むことを予定す
るものである。したがってアミノ酸残基における官能基
１種以上を誘導することができる。このような誘導体の
例は、インシュリン分子における残基のエステルまたは
アミド基へのそれ自体公知の転化、アルコール基のアル
コキシ基へのまたはその逆の転化、および選択的脱アミ
ド化である。例として、酸媒体中で加水分解によりA21A
snが脱アミド化されA21Aspとなり、または中性媒体中で
B3Asnが脱アミド化されてB3Aspとなる。 さらに、Ｎ−またはＣ−末端でアミノ酸残基を加える
かまたは除去することにより本発明インシュリン類似体
を変性することができる。本発明のインシュリン類似体
はＢ鎖のＮ末端で４個までのアミノ酸残基が不足しＢ−
鎖のＣ−末端で５個までのアミノ酸が不足してもよくイ
ンシュリン類似体の全体的性質には重大な影響はない。
このような変性されたインシュリン類似体の例は、B1Ph
eまたはB30Thrアミノ酸残基が欠除したインシュリン類
似体である。 また、天然産生アミノ酸残基を、上記最終的目標に重
大な影響を与えないという条件で、ポリペプチド鎖の１
っ以上の末端に加えてもよい。 本発明インシュリン類似体のポリペプチド鎖の末端に
おけるこのような欠除または添加は、本発明によるアミ
ノ酸置換物を有するインシュリン類似体においてインビ
トロで影響を及ぼしうる。これに代わって、本発明によ
る新規インシュリン類似体の遺伝子を、ポリペプチド鎖
の末端での余分のアミノ酸残基または欠除アミノ酸残基
に相当するコドンを加えるかまたは除去することのいず
れかにより変性してもよい。 用語 アミノ酸に用いられる略字はJ.Biol.Chem.243（196
8）,3558に記載されているものである。アミノ酸はＬ型
配置である。 以下の明細書に使用されているようにＢ（１−29）は
B1PheからB29Lysまでの短かくしたヒトインシュリンＢ
鎖を意味し、Ａ（１−21）はヒトインシュリンのＡ鎖を
意味する。 本発明の実施にしたがってヒトインシュリン分子にお
いて作られる置換物はヒトインシュリンに関連する接頭
語で示される。たとえば、B27Gluヒトインシュリンは、
Ｂ鎖の27番目にあるThrがGluに代わったヒトインシュリ
ン類似物を意味する。B27Glu、B9Aspヒトインシュリン
は、Ｂ鎖の27番目にあるThrがGluに代わりそしてＢ鎖の
９番目にあるSerがAspに代わったヒトインシュリン類似
物を意味する。B27Glu、Ｂ（１−29）−Ala−Ala−Lys
−Ａ（１−21）ヒトインシュリンは、短くしたＢ鎖（上
記参照）における27番目のThrがGluに代わり、そしてＢ
（１−29）鎖とＡ−鎖（Ａ（１−21））がペプチド配列
Ala−Ala−Lysにより連続されたインシュリン類似体の
前駆体（式II参照）を意味する。特記しない限りＢ（１
−29）鎖とＡ（１−21）鎖はヒトインシュリンにおける
ようにＡ（７）CysとＢ（７）Cys間およびＡ（20）Cys
とＢ（19）Cys間のそれぞれのジスルフィド橋により結
合されており、Ａ鎖はＡ（６）CysとＡ（11）Cys間の内
部ジスルフィド橋を含むものと理解されるべきである。 すでに指摘したように、本発明の目的は速効性インシ
ュリン注射液を提供することである。この目的に適合す
る試みにおいて、本発明者は、まず最初に、インシュリ
ン濃度において明らかに全く避けがたい差異を含めて、
デポー製剤または丸剤におけるインシュリンと循環系に
おけるインシュリンの間にかなりの違いがあることに気
が付いた。特に、血流におけるインシュリンは非常に薄
く、10-11〜10-8Mであり、単量体形であるが、幾らかは
二量体形であるかもしれない。さらに高濃度のインシュ
リンが膵臓のＢ細胞顆粒に貯蔵されており、通常の投与
可能な溶液においては、主にでないが、大部分不活性の
六量体形たとえばよく知られている２亜鉛六量体形であ
る。 溶液中のヒトインシュリンは、多くの分子形、すなわ
ち単量体、二量体、四量体および六量体で存在すること
が知られており（ブランデル（Blundell）ら、イン ア
ドバンシーズ インプロテイン ケミストリィ，アカデ
ミック プレス，ニューヨーク アンド ロンドン,Vo
l,26,pp.279−330,1972）、オリゴマー形が高いインシ
ュリン濃度で好ましくそして単量体がインシュリンの活
性形である。四量体および六量体は活性形ではなく、二
量体でさえ活性ではないかもしれない。本発明の基礎を
なす概念は、当該技術により認識される吸収の遅延現象
（バインダー（Binder）、ディアベテス ケア７,No.2
（1984）,188−199）が大部分、六量体、四量体および
二量体形から（活性な）単量体形へ解離するためにイン
シュリンに必要な時間が原因であるという発明者の知見
である。 本発明のヒトインシュリン類似体は、ただちに二量
体、四量体、六量体または重合体を形成しにくい分子構
造により、すなわち亜鉛イオンの存在または不存在に二
量体、四量体、六量体または重合体へ自己−会合する傾
向が低いことにより、その速効性を達成する。 インシュリンに存在するアミノ酸配列においてかなり
の種族間の違いから、インシュリン分子に存在するアミ
ノ酸残基のすべてがインシュリン活性に重大であるとい
うわけでなく、そしてインシュリン活性に必須でないア
ミノ酸の幾つかはインシュリン分子の物理特性に重要で
あるということが長年認められてきている。実際、モル
モットインシュリンは二量体化できないことが知られて
いる。硫酸化インシュリンおよびテトラニトロチロシン
インシュリンは二量体化しない。すなわち、ヒトインシ
ュリン分子において多くのアミノ酸残基はインシュリン
活性がほとんど低下することなく変化しうる。ここで予
定されるヒトインシュリン分子におけるアミノ酸置換物
は、インシュリン活性を損なうことなく二量体、四量
体、六量体または重合体の形成を妨げることを目指す。 式ＩのＡ鎖およびＢ鎖における置換が行なわれうる位
置でのアミノ酸残基はインシュリン活性に重大ではない
が、しかしヒトインシュリンが凝集して二量体、四量
体、六量体または重合体になるという能力、またはヒト
インシュリンの溶解性に対しては重要である。本発明ア
ミノ酸残基置換物は、二量体、四量体、六量体または重
合体への凝集を促進する隣接インシュリン分子間の原子
と原子の接触を妨害する。 置換の目的について期待されうるように、ヒトインシ
ュリン分子における特定の位置での変化は他のものより
効果的である。概して、Ｂ鎖において行なわれる１つの
置換で自己会合の傾向を減らすのに十分なこともある
し、一方、他の残基の少なくとも２つの変化が必要な場
合もある。Ａ−鎖における置換は主に解離した分子の溶
解性を向上するのに役立つ。アミノ酸残基置換を行なう
のに好ましい位置は、式Ｉで示されたようなインシュリ
ン分子において、B9、B12、B10、B26、B27およびB28単
独、相互に組合わせてまたはその他の置換と一緒のもの
である。 明らかに、非電荷または陽性に荷電したアミノ酸残基
を１つ以上の陰性に荷電したアミノ酸残基で置換するこ
とは、ヒトインシュリン類似体の電荷を中性pHでより陰
性にさせ、ヒトインシュリンに比較して等電点をより低
くすることになる。特色として本発明のヒトインシュリ
ン類似体はヒトインシュリンと比較して同じであるかま
たはより陰性の電荷（中性pHにて）とより低い等電点を
有する。 概して、１〜３個の置換が本発明の直接の目的、すな
わちより速効性のインシュリンを提供することを達成す
るであろうし、このようなものは本発明の好ましい態様
を構成する。２〜３個の置換基を用いることにより、保
護されたインシュリン製剤との向上した混和性が達成さ
れうる。しかしながら、本発明の直接の目的が、また、
３個より多数の置換基により達成されうることが有利で
あると信じられている。なぜならこれにより所望する第
二の目的も達成しうるからである。 特に、置換基の追加のレベル、すなわち４個または５
個の置換アミノ酸残基の存在は、ヒトインシュリン類似
体において小繊維化しにくかったり重合を妨げる結果と
なり、これはインシュリン溶液を連続した点滴に予定す
る場合に特に好ましい特性である。概して、本発明のヒ
トインシュリン類似体についてはインシュリン分子にお
いて約７個以下が予定されている。好ましくは２〜４個
の置換基である。 本発明インシュリン類似体の前駆体をエンコードする
遺伝子は、前記式II（またはIII）（式中、Ｘはすべて
ヒトインシュリンのアミノ酸残基である）のインシュリ
ン前駆体を、部位特異的変異誘発により所望の突然変異
をエンコードするコドンを挿入するかまたは置換するこ
とにより変性することにより調製されうる。インシュリ
ン類似体の前駆体をエンコードするDNA配列は、またイ
ンシュリン類似体前駆体遺伝子の全部または一部に相当
するオリゴヌクレオチドから酸素的合成によっても作ら
れうる。 次いで、インシュリン遺伝子の所望の突然変異を有す
る遺伝子を含むDNA配列を、TPIプロモーター（TPIP）
〔ティ・アールバー（T.Alber）とジィ・カワサキ（G.K
awasaki）、ヌクレオチド セクエンス オブ ザ ト
リオ−スホスフェート イソメラーゼ ジーン オブ
サッカロミセス セレビシアエ,J.Mol.Applied Genet.1
（1982）419−434〕、MFα１リーダー配列〔ジェイ．ク
ルジャン（J.Kurjan）とアイ．エルスコウィッツ（I.He
rskowitz）、ストラクチュア オブ ア イースト フ
ェロモンジーン（MFα１）；ア ピュータティブ アル
ファ−ファクター プレカーソル コンテインズ フォ
アタンデム コピーズ オブ マチュア アルファ−フ
ァクタ.Cell 30（1982）933−943〕およびサッカロミセ
ス セレビシアエ（S.cerevisiae）のTPIからの転写終
結配列（TPIT）をコードする断片と合わせる。これらの
断片は、遺伝子をエンコードする前駆体の高い割合での
転写を確実にし、そしてまた分泌経路へ前駆体を局在化
しその結果として増殖培地へ排出しうる予備前駆体をも
たらすことができる。表現単位はさらに複数の酵母２μ
オリジンおよび選択性マーカーLEU2を備える。 酵母におけるα−ファクターのインビボ成熟の間、MF
α１リーダーペプチドの最後（Ｃ末端）の６個のアミノ
酸（Lys−Arg−Glu−Ala−Glu−Ala）が、Lys−Arg配列
を識別するエンドペプチダーゼとGlu−Ala残基を除去す
るアミドペプチダーゼの連続作用によりα−ファクター
前駆体から除かれる〔ユリウス，ディ・（Julius,D）
ら、Cell 32 （1983）839−852〕。酵母アミノジペプ
チダーゼに対する必要性を排除するために、MFα１リー
ダーのＣ−末端Glu−Ala−Glu−Alaをコードする配列
を、インビトロ変異誘発によりMFα１リーダー配列から
除去する。以下の明細書において、“MFα1 リーダー”
は全リーダー配列を意味し、一方MFα1 リーダー（−Gl
u−Ala−Glu−Ala）はＣ末端Glu−Ala−Glu−Ala配列が
除かれたリーダー配列を意味する。 〔実施例〕 例１ Ｂ（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトイン
シュリンをエンコードする合成遺伝子の構築 Ｂ（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）の酵母
コドン最適化構造遺伝子を次のようにして構築する。 次の10個のオリゴヌクレオチドを、調節された多孔性
ガラス支持板上でホスホロアミダイト化学（phosphoram
idite chemistry）を用いて自動DNA合成機にて合成する
〔エス．エル．ビューケージ（S.L.Beaucage）およびエ
ム．エイチ．カルーサー（M.H.Caruthers）（1981）、T
etrahydron Letters 22,1859−1869〕。 I:AAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC 35−体 II:AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA 36−体 II:TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT 43−体 IV:GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC 42−体 V:TCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC 32−体 VI:ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT 34−体 VII:GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT 37−体 VIII:TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC 37−体 IX:TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT 36−体 X:CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG 33−体 ５個のデュープレックス（duplexes）Ａ−Ｅが第１図に
示すように上記10個のオリゴヌクレオチドから形成され
る。 デュープレックスＡ−Ｅの各々20pmoleが、相当する
一対の５′−ホスホリル化オリゴヌクレオチドＩ−Ｘか
ら、５分間90℃に加熱し続いて75分間室温まで冷却する
ことにより形成される。デュープレックスＥの33−体
（Ｘ）は、連結の間、自己相補性のXbaI一本鎖末端付近
での二量体化を避けるために５′−ホスホリル化されな
い。５つのデュープレックスを混合し、T4リガーゼで処
理する。２％寒天ゲル中の連結混合物を電気泳動後、合
成遺伝子を182/183bpバンドとして単離する。 得られた合成遺伝子を第１図に示す。 合成遺伝子を、pMT644からの4kb kpnl EcoR1断片と8k
bXba1−kpn1断片およびpKFN9からの0.3kb EcoR1−Hga1
断片と連結すると次の構造TPIP＋MFα１リーダー−Ｂ
（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）−TPITが得
られる。 プラスミドpMT644は、DNA配列TPIP−MFα１リーダー
−Ｂ（１−29）−Ａ（１−21）−TPITを含み、構築はデ
ンマーク特許第1293/85号明細書に記載されている。プ
ラスミドpKFN9の構築を次に記載する。 連結混合物を用いてコンピテント大腸菌株（r-,m+）
（MT 172）を形質転換する。アンピシリン耐性コロニー
30個を最小培地M9〔ティー．マニアティス（T.Maniati
s）ら、モレキュラークローニング，コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリィー,1982,p.68）を含むプ
レートに移すとLeu+コロニー８個が得られる。32P−Xba
1−EcoR1断片のマクサム−ギルバート配列決定により、
３つのプラスミドが所望の配列を有する遺伝子を含むこ
とがわかった。１つのプラスミドpKFN27が別の用途のた
めに選択される。 pKFN 27の構築を第２図に示す。 プラスミドpKFN9の構築 プラスミドpKFN9の構築の目的は、MFα１−リーダー
配列の直後にHga1部位を含むプロスミドを得ることであ
る。プロスミドpMT544（この構築はデンマーク特許第27
8185号明細書に記載されている）をXba1で切断し、約25
0塩基をExo IIIヌクレアーゼ処理で３′末端から除去す
る。Hga1配列を含む合成32−体挿入プライマー GGATAA
AA GAGAGGCGCG TCTGAAGCTCACTCをアニーリングして部分
的一本鎖のDNAとなる。二本鎖環状DNAはクレノウポリメ
ラーゼで充てんしT4リガーゼで連結することにより作ら
れる。大腸菌（r-,m+）（MT 172）形質転換後、突然変
異プラスミドを含むコロニーを、５′−32P−ラベルさ
れた32体の挿入プライマーを用いたコロニーハイブリッ
ド法により固定する。新しいHga1部位の出現を制限酵素
切断（EcoR1＋Hga1、Hind3＋Hga1）で確認する。再形質
転換後、“純粋な”突然変異体pKFN9を別の用途のため
に選択する。pKFN9の構築を第３図に示す。 例２ B27Gluヒトインシュリンの調製 B27Gluヒトインシュリンは、B27Glu,B（１−29）−Al
a−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをThr−DB
utでペプチド転移させ得られたトレオニンエステルをト
リフルオロ酢酸でアシドリシスすることにより調製され
る。調製は次の工程からなる： Ｉ、B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）インシュリンをエンコードする遺伝子の構築 プラスミドpKFN27を、合成インシュリン前駆体遺伝子
のちょうど下流の唯一つのXba1部位で直線化する。下記
の充てん工程によりXba1部位を破壊しないために、19−
体のHind3−Xbal二本鎖リンカーXba1 CTAGAAGAGCCCAAGACTAHind3 TTCTCGGGTTCTGATTCGA を直線化プラスミドの各端部に連結する。リンカーはXb
a1一本鎖端部でほ５′−ホスホリル化されているがHind
3端部では非ホスホリル化のままであり、これにより連
結工程の間およびDNA環化の間のリンカーの重合を避け
る（第４図参照）。 ５′−モノヌクレオチドを、Exo IIIヌクレアーゼ処
理により、得られた直線状二本鎖DNAの３′−端部から
除去する。Exo IIIヌクレアーゼ処理を23℃にて行な
い、この条件下で約250のヌクレオチドがDNAの各３′−
末端から除去される〔エル．グオ（L.Guo）およびアー
ル．ウー（R.Wu）（1983），メソード イン エムザイ
モロジイ 100,60−96〕。 ５′−ホスホリル化25−体の変異誘発プライマー ｄ
（GTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC）を突然変異部位までア
ニールする。T4リガーゼの存在下にクレノウポリメラー
ゼで充てん後、二本鎖DNAをXba1で消化する。次いで１
つの鎖に突然変異を有するヘテロデュープレックスの環
状DNAをT4リガーゼで形成する。 連結混合物を、アンピシリン耐性を選択する大腸菌
（r-,m+）（MT 172）へ形質転換する。 突然変異体を、５′−32P−ラベルされた25−体の変
異誘発プライマーを用いてコロニーハイブリッド法によ
り同定する。再形質転換後、得られたコロニーの１つか
らのプラスミドpKFN 37が0.5 kbXba1−EcoR1断片のDNA
配列決定により所望の突然変異を含むことがわかる（エ
ー，マキサム アンド ダブリュ，ギルバート（1980）
メソード イン エンザイモロジイ65,499−560）。 II、形質変換 サッカロミセス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT
663（E2−7B XE11−3C a/α，Δtpi/Δtpi、pep 4−31
pep 4−３）を、OD 600nm 0.6までYPGaL（１％バクト
酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、
１％ラクテート）で増殖する。 培養液100mlを遠心分離により採取し、水10mlで洗
い、再度遠心分離し、そして10mlの1.2Mソルビトール、
25mM Na2EDTA pH＝8.0 6.7mg/mlジチオトレイトール中
に再度懸濁する。懸濁液を30℃で15分間インキュベート
し、遠心分離し、細胞を10mlの1.2Mソルビトール、10mM
Na2 EDTA、0.1Mクエン酸ナトリウムpH＝5.8、2mgノボ
ザイム（Novozym） 234に再懸濁させる。懸濁液を30℃
で30分間インキュベートし、細胞を遠心分離により集
め、10mlの1.2Mソルビトールと10mlのCAS（1.2Mソルビ
トール、10mM CaCl2、10mMトリス（トリス＝トリス（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン）pH＝7.5）中で洗
い、2mlのCASに再懸濁させる。形質変換のために、0.1m
lのCAS−再懸濁液細胞をほぼ１μｇのプラスミドpKFN37
と混合し、室温で15分間放置する。1mlの20％ポリエチ
レングリコール4000、10mM CaCl2、10mMトリスpH＝7.5
を加え、混合物をさらに室温で30分間放置する。混合物
を遠心分離し、ペレットを0.1mlのSOS（1.2Mソルビトー
ル、33％v/v YPGaL、6.7mM CaCl2、14μg/mlロイシン）
に再懸濁し、30℃で２時間インキュベートする。次いで
懸濁液を遠心分離し、ペレットを0.5mlの1.2Mソルビト
ールに再懸濁する。52℃で6mlの表面寒天〔シャーマン
らのSC培地、（メソード イン イースト ジェネリッ
クス、コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ィ,1981）ロイシンを含まずそして1.2Mソルビトールと
2.5％寒天含有〕を加え、そして懸濁液を同じ寒天−固
化、ソルビトール含有媒地を含むプレートの表面へ注入
する。形質変換コロニーを30℃で３日後に採取し、再単
離しそして液体培養を始めるのに用いる。このような１
つの形質転換体KFN40（＝MT 663/pKFN 37）をさらに特
性決定するために選択する。 III、B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）インシュリン 前駆体の再現 酵母株KFN40をYPD培地（１％酵母抽出物、２％ペプト
ン、（両方ともディフコ ラボラトリーズDifco labora
tories社製）および２％グルコース）で増殖する。この
株の10％培養液を30℃でO.D.600が26になるまで振とう
する。遠心分離後、上清を逆相HPLCで分析し、13.5mg/
の前駆体を見出す。 上清中の類似体を低pHにて陽イオン交換カラム中で濃
縮し、続いて適当な緩衝液で脱着する。アルコール性ク
エン酸緩衝液で結晶化を行なう。 IV、ペプチド転移反応 0.2モル（47.1g）Thr−OBut,HOACをDMFに溶かして100
mlの溶液とし、76.5％v/v DMFの水溶液50mlを加え、そ
して粗製B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１
−21）ヒトインシュリン10gを混液中に溶かし、これを1
2℃にサーモスタット温度調節する。次いで、0.05M酢酸
カルシウム25ml中のトリプシン1gを加え、12℃で24時間
後混合物をアセトン２へ加え、沈でんしたペプチドを
遠心分離により単離し、減圧乾燥する。B27Glu,B30Thr
−OButヒトインシュリンを調製用HPLCカラムにて精製す
る（カラム材料としてシリカ−C18を有する）。 Ｖ、B27ヒトインシュリンへの転化 B27Glu,B30Thr−OButヒトインシュリンをトリフルオ
ロ酢酸100mlに溶かす。室温で２時間後、溶液を凍結乾
燥する。凍結乾燥した粉末をpH7にて47.5mMクエン酸ナ
トリウム400mlに溶かす。1M ZnCl2 2.4ml添化後pH5.5に
てペプチドが沈でんし、遠心分離により単離し、減圧乾
燥する。生成物を陰イオン交換クロマトグラフィにより
精製し、ゲル過により脱塩化する。収量:B27Gluヒト
インシュリン1.7g 例３ B9Aspヒトインシュリンの調製 B9Aspヒトインシュリンは、B9Asp,B（１−29）−Ala
−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをThr−OBu
tとペプチド転移させ、得られたトレオニンエステルを
トリフルオロ酢酸でアシドリシスすることにより調製さ
れる。 Ｉ、B9Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）
ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 この遺伝子は、23−体変異誘発プライマーｄ（CTTGTG
CGGTGACCACTTGGTTG）により示されるpKFN 27の部位特異
的変異誘発によりB27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys
−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝
子について記載したのと同じ方法で構築される。プラス
ミドpKFN 38が所望の突然変異を有するのがわかる。 II、形質転換 プラスミドpKFN 38は、例2.IIと同じ方法によりサッ
カロミセス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT 663へ
形質転換され、形質転換体KFN41を単離する。 III、B9Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンの発現 酵母株KFN41を例2.IIIに記載したようにYPD培地で増
殖する。2.5ml/のインシュリン類似体前駆体が上清中
に見出された。 IV、ペプチド転移 粗製B9Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリン7.4gを例2.IVに記載のようにペプ
チド転移するとB9Asp,B30Thr−OButヒトインシュリンが
得られる。 Ｖ、転化 B9Asp,B30Thr−OButヒトインシュリンを、例2.Vに記
載のようにしてB9Aspヒトインシュリンへ転化する。収
率:0.83g B9Aspヒトインシュリン。 例４ B9Asp,G27Gluヒトインシュリンの調製 B9Asp,B27Gluヒトインシュリンは、B9Asp,B27Glu,B
（１−21）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシ
ュリンをThr−OButでペプチド転移し、得られたトレオ
ニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシドリシスするこ
とにより調製される。 Ｉ、B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ
（１−21）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の
構築 pKFN 38（例３参照）からの367 bp EcoR1−Hind3断片
とpKFN 37（例２参照）からの140bp Hind3−Xbal断片
を、プラスミドpUC 13（このプラスミドは、ヴエイラVi
eiraら（1982）,Gene19,259−268によりpUC8とpUC9につ
いて記載されたようにして構築される）の大きなXba1−
EcoR1断片と連結する。連結混合物をアンピシリン耐性
を選択する大腸菌（MT 172）へ形質転換する。プラスミ
ドを多数の形質転換体から調製し、Pst1とHind3で消化
することにより分析する。正しい制御酵素パターンを示
す１つのプラスミドからの0.5kb Xba1−EcoR1断片を、p
MT644（デンマーク特許出願第1293/84号）からの7.8kb
Xba1−kpn1断片を4.3kb kpn1−EcoR1断片と連結する。
連結混合物をアンピシリン耐性を選択する大腸菌（MT17
2）へ形質転換する。得られたコロニーの１つからのプ
ラスミドpKFN43は、0.5kb Xba1−EcoR1断片のDNA配列決
定により所望のインシュリン誘導体前駆体の遺伝子を含
むことがわかる。pKFN43の構築を第５図に示す。 II、形質転換 例2.IIと同じ方法によりプラスミドpKFN38はサッカロ
ミセス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT663へ形質
転換され、この形質転換体KFN44を単離する。 III、B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ
（１−21）ヒトインシュリンの表現 酵母株KFN44を例2.IIIで記載したようにYPD培地中で
増殖する。7.3mg/のインシュリン類似体前駆体が上清
中で見られた。 IV、ペプチド転移 粗製B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ
（１−21）ヒトインシュリン12.7gを、例2.IV記載した
ようにペプチド転移するとB9Asp,B27Glu,B30Thr−OBut
ヒトインシュリンが得られる。 Ｖ、転化 B9Asp,B27Glu,B30Thr−OButヒトインシュリンを例2.V
に記載したようにB9Asp,B27Glu,B30Thrヒトインシュリ
ンへ転化しそして精製する。収量:1.0g B9Asp,B27Gluヒ
トインシュリン 例５ A8His,B9Asp,B27Gluヒトインシュリンの調製 A8His,B9Asp,B27Gluヒトインシュリンは、例２に記載
しているように、A8His,B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Al
a−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをThr−OB
utでペプチド転移し、得られたトレオニンエステルをト
リフルオロ酢酸でアシドリシスすることにより調製され
る。 Ｉ、A8His,B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys
−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝
子の構築 ギャップしたデュープレックス法〔ワイ．モリナガ
（Y.Morinaga），ティ．フランセシニ（T.Franceschin
i）、エス．イノウエ（S.Inouye）およびエム．イノウ
エ（M.Inouye）（1984），バイオテクロノジィ2,636−6
39〕を用いて変異誘発を示すオリゴヌクレオチドによ
り、この遺伝子を構築する。pUC13はMFα１リーダー配
列をエンコードするプラスミドを誘導し、B9Asp,B27Glu
ヒトインシュリン前駆体（第５図）をHpa IとXba Iで切
断する。大きな断片をNde Iで線状化されたプラスミド
と混合する。熱変性および冷却後、混合物はインシュリ
ン前駆体遺伝子に相当する範囲（Hpa I−Xba I）に一本
鎖“ウインドウ”を有するギャップしたデュープレック
スを含む。組合わせが不適当な37−体変異誘発プライマ
ーｄ（GAACAATGCTGTCACTCC−ATCTGCTCCTTGTACCAAT）を
ギャップしたデュープレックスとハイブリッドし続いて
クレノウポリメラーゼで充てんし連結する。混合物を用
いてアンピシリン耐性を選択する大腸菌（MT172）を形
質転換する。突然変異体を、18−体の５′−32p−ラベ
ルされたプローベｄ（AATGCTGTCACTCCATCA）を用いてコ
ロニーハイブリッド法により同定する。再形質転換後得
られたコロニーの１つからのプラスミドは、0.5kb Xba
I−EcoR IのDNA配列決定により所望の突然変異を含むこ
とがわかった。このプラスミドを用いて、pKFN43の構築
について例４に記載されたように酵母プラスミドpKFN10
2の構築を行なう。 II、形質転換 プラスミドpKFN102を、例2.IIと同じ方法によりサッ
カロミセス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT663へ
形質転換し、形質転換体KFN109を単離する。 III、A8His,B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys
−Ａ（１−21）ヒトインシュリンの表現 酵母株KFN109を、例2.IIIに記載したようにYPD培地で
培養する。21.5mg/のインシュリン類似体前駆体が上
清中に見出された。 IV−Ｖ、ペプチド転移および転化 22.0gの粗製A8His,B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−
Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンを例2.IV−Ｖ
に記載されているようにペプチド転移し、転化し、粗製
する。収量:A8His,B9Asp,B27Gluヒトインシュリン4.0g 例６ B12Ileヒトインシュリンの調製 B12Ileヒトインシュリンを、例２に記載のように、B1
2Ile,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒト
インシュリンをThr−OButでペプチド転移し、得られた
トレオニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシドリシス
することにより調製する。 Ｉ、B12Ile,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 MFα１リーダー（−Glu−Ala−Glu−Ala）−Ｂ（１−
29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）をエンコードするp
MT598（プラスミドpMT598の構築はヨーロッパ特許出願
第0163529Aに記載されている）の0.5kb EcoR1−Xba1断
片を、Xbal−EcoR1で切断されたM13 mp10 RFファージへ
挿入し、相当する一本鎖DNAをM13 mp10複製ファージか
ら精製する。一本鎖の鋳型DNAを変異誘発性27−体プラ
イマーNOR−92 d（GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC）およ
びM13ユニバーサル配列プライマーｄ（TCCCAGTCAC−GAC
GT）へハイブッドする。プライマーをdNTPおよびクレノ
ウポリメラーゼにより伸長し、T4DNAリガーゼで連結す
る。BstN1部位（Xba1−EcoR1断片では唯一）を破壊する
ために変異誘発プライマーKFN92が選択される。それゆ
え、未変異のEcoR1−Xba1断片に対し選択するために、
混合物をBstN1と続いてEcoR1およびXba1で切断し、EcoR
1とXba1切断pUC13ベクターに連結する。得られた形質転
換体、プラスミド、pMT760の１つから、インシュリンコ
ード配列においてBstN1部位が欠けているものを選択す
る。所望の突然変異した配列がマキサム・ギルバートDN
A配列決定法により確められた。プラスミドpMT760は、p
MT598からの同じ断片に相当する0.5kb EcoR1−Xba1配列
（上記参照）を、B12（Va1−Ile）での突然変異体のほ
かに含む。次いでこの突然変異配列を、pMT760の0.5kb
EcoR1−Xba1断片をpMT644からの7.8kb Xba1−Kpn1と4.3
kb Kpn1−EcoR1断片と連結することにより酵母発現プラ
スミド上に移しpMTAを形成する。 II−Ｖ、形質転換、発現、ペプチド転移、転化プラス
ミドpMTAを、例2.IIに記載のように酵母株MT663へ形質
転換し、この形質転換株MTAを例2.IIIに記載したように
増殖する。10.4mg/のインシュリン類似体前駆体が上
清中に見出された。10gの粗類似体前駆体を、例2.IV−
Ｖに記載のようにペプチド転移し、転化し、そして精製
する。収量:B12Ileヒトインシュリン1.3g 例７ B12Tyrヒトインシュリンの調製 B12Tyr,ヒトインシュリンを、例２に記載のように、B
12Tyr,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒト
インシュリンをThr−OButでペプチド転移し、得られた
トレオニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシドリシス
することにより調製される。 Ｉ、b12Tyr,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 KFN92の代わりにプライマーKFN93 d（GTAGA−GAGCTTC
GTACAGGTGTGAGCC）を用いるという唯一の例外以外はB12
Ile,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトイ
ンシュリンをエンコードする遺伝子の調製方法と同じ方
法で遺伝子を構築する。 II−IV、形質転換、表現、ペプチド転移、転化工程II
−IIIを例２に記載したように行なう。 1.7mg/のインシュリン類似体前駆体が上清中に見出
された。粗類似体前駆体を例2IV−Ｖに記載のようにし
てペプチド転移し、転化し、精製すると、B12Tyrヒトイ
ンシュリンが得られた。 例８ B10Aspヒトインシュリンの調製 B10Aspヒトインシュリンが、例２に記載のようにし
て、B10Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをThr−OButでペプチド転移し、得
られたトレオニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシド
リシスすることにより調製される。 Ｉ、B10Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 KFN92の代わりにプライマーKFN94 d（AGCTT−CCACCAG
ATCTGAGCCGCACAG）を用いるという唯一の例外以外は、B
12Ile,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒト
インシュリンをエンコードする遺伝子の調製方法と同じ
方法により遺伝子を構築する。 II−Ｖ、形質転換、表現、ペプチド転移、転化工程II
−IIIを例２に記載したようにして行なう。 36mg/のインシュリン類似体前駆体が上清中に見出
された。粗製類似体前駆体を、例2IV−Ｖに記載のよう
にして、ペプチド転移し、転化し、精製する。収量:B10
Aspヒトインシュリン7.6g。 例９ B28ヒトインシュリンの調製 B28ヒトインシュリンは、B28Asp,B（１−29）−Ala−
Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをThr−OMeで
ペプチド転移し、得られたトレオニンエステルを約８〜
12のpHで加水分解することにより調製される。 Ｉ、B28Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 MFα１リーダー（−Glu−Ala−Glu−Ala）−Ｂ−Ｃ−
ＡをエンコードするpMT462（プラスミドpMT462の構築は
デンマーク特許出願第1257/86号に記載されている）の
0.5kb EcoR1−Xba1断片、すなわち変性されたMFα１リ
ーダーにより先行されたヒトプロインシュリン遺伝子
を、Xba1−EcoR1で切断されたM13 mp10 RFファージへ挿
入し、相当する一本鎖DNAをM13 mp10複製ファージから
精製する。一本鎖鋳型DNAを変異誘発性41−体プライマ
ーNOR205 d（TTCCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGA
AGC）およびM13ユニバーサル配列プライマーｄ（TCCCAG
TCACGACGT）へハイブリッドする。プライマーをdNTPsと
クレノウポリメラーゼで伸長しT4 DNAリガーゼで連結す
る。 フェノールで抽出し、エタノールで沈澱および再懸濁
後、DNAを制限酵素Apa1,Xba1およびEcoR1で切断する。
別にフェノール抽出、エタノール沈でんおよび再懸濁
後、DNAをEcoR1−Xba1切断pUC13と連結する。連結混合
物を大腸菌（r-,m+）株へ形質転換し、プラスミドを幾
つかの形質転換体から調製する。プラスミド標本をEcoR
1とXba1で切断し、0.5および0.6kbの両方にバンドを示
すこれら標本を大腸菌へ再形質転換する。再形質転換体
から0.5挿入部を有するpU13のみを有する形質転換体が
選択される。 得られた形質転換体の１つから、B28（Pro→Asp）が
所望の突然変異を有するプラスミドpMT881を選択する。
変異配列はマキサム−ギルバートDNA配列決定により確
められる。次いで変異配列を、pMT881の0.5kb EcoR−Xb
a1断片をpMT644からの7.8kb Xba1−Kpn1と4.3kb Kpn1−
EcoR1断片と連結することにより酵母発現プラスミド上
へ移動してpMTA1を得る。 II、形質転換 プラスミドpMTA1を、例2.IIと同じ方法でサッカロミ
セス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT663へ形質転
換し、形質転換体MTA1を単離する。 III、B28Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンの発現 酵母株MTA1を例2.IIIに記載のようにYPD培地で増殖す
る。7.2mg/のインシュリン類似体前駆体が上清中に見
出される。 IV、ペプチド転移 粗B28Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）を、例2.IVに記載のようにして、Thr−OButの代わり
にThre−OMeを用いてペプチド転移するとB28Asp,B30Thr
−OMeヒトインシュリンが得られる。 Ｖ、転化 B28Asp,B30Thr−OMeヒトインシュリンを水中に分散さ
せて１％（w/v）とし、IN水酸化ナトリウムを添加してp
H値10.0とすることにより溶解する。pHを10.0にて24時
間25℃で一定に保つ。形成したB28Aspヒトインシュリン
を、塩化ナトリウム約８％（w/v）まで、酢酸ナトリウ
ム三水和物約1.4％（w/v）まで、および酢酸亜鉛二水和
物約0.01％（w/v）までを加えることにより沈でんさ
せ、続いて1N塩酸を加えてpH5.5にする。沈でん物を遠
心分離により単離し、陰イオン交換クロマトグラフィに
より精製し、ゲル過により脱塩化する。収量:0.2g B2
8Aspヒトインシュリン。 例10 A21Asp,B9Asp,B27Gluヒトインシュリンの調製 B9Asp,B27Gluヒトインシュリンを選択的脱アミド化
（37℃,pH2.5で14日間５％溶液の加水分解）することに
よりA21Asp,B9Asp,B27Gluヒトインシュリンを調製す
る。脱アミド化生成物を陰イオン交換クロマトグラフィ
により単離する。 例11 B27Glu,A21Aspヒトインシュリンの調製 B27Glu,A21Aspヒトインシュリンは、例２で記載した
ように、B27Glu,A21Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−
Ａ（１−21）をThr−OButでペプチド転移し、得られた
トレオニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシドリシス
することにより調製される。 B27Glu,A21Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１
−21）は、例10に記載したような、脱アミド化により、
B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）
（例２参照）から調製される。 本発明ヒトインシュリン類似体の特性決定 分子量の
決定〔ガットフロイント エイチ．（Gutfreund H.）バ
イオケミカル ジャーナル42（544）1948〕。 方法：ナウアー メンブレイン オスモメーター（Knau
er Membrane Osmometer）型:1.00メンブレイン：シュラ
イヒャー（Schleicher）とシェール（Schull） 型:R52 溶媒:0.05M NaCl pH7.5 温度:21℃ 結果：すべての型のインシュリンを濃度4mg/mlで測定す
る。 第 １ 表 インシュリンの型 分子
量 k ダル
トン ヒト 2Zn インシュリン 36±
２ ヒト Zn不含有インシュリン 29±
１ Zn不含有B27Gluヒトインシュリン 22±
１ − − B12Ileヒトインシュリン 17±
１ − − B27Glu,A21Aspヒトインシュリン 8±
１ − − B9Asp,B27Gluヒトインシュリン 6±
１ − − B9Aspヒトインシュリン 6±
１ − − B9Asp,B27Glu,A21Aspヒトインシュリン 6
±１ − − B9Asp,B27Glu,A8Hisヒトインシュリン 9±
３ − − B10Aspヒトインシュリン 12±
１ − − B28Aspヒトインシュリン 9±
２ 上記第１表から明らかなようにヒトインシュリン類似
体はヒトインシュリンと比較して著して低い分子量を有
し、このことは二量体、四量体または六量体への自己会
合が著しく低いかまたは幾つかの場合には欠除すること
もあることを意味する。 上記第２表から明らかなように注射部位からインシュ
リン類似体が50％消失するまでの時間はヒトインシュリ
ンと比較して実質的に短縮される。 インシュリン類似体の生物学的効力はヒトインシュリ
ンと匹適するかまたは若干減少するだけである。
ヒトインシュリン類似体、およびこのようなインシュリ
ン類似体を含むインシュリン注射液および新規インシュ
リン類似体の調製方法に関する。 〔従来の技術〕 糖尿病の治療において多くの種類のインシュリン製剤
が当該技術に提案されてきている。これらのうち幾つか
は速効性であり、その他は大体延長作用を有する。 速効性インシュリン製剤は、たとえば高グリシン血症
性昏睡のような深刻な状態において、外科的手術の間、
妊娠の間および重大な感染症において使用されうる。さ
らに、速効性インシュリン製剤の多数回の毎日の注射
は、より長時間作用性インシュリンでコントロールする
ことが困難であることがわかった糖尿病患者のコントロ
ールを向上することもある。 近年では、健康な機器のβ細胞からのインシュリン分
泌に取り組むインシュリン治療、すなわち食事と関連す
るインシュリン供給および基礎的インシュリンレベルの
維持において興味が増してきている。臨床的所見によれ
ば、基礎的要求を満たすために延長化作用を有するイン
シュリンを１日１回注射し、主な食事の前に速効性イン
シュリンのより少ない量（小塊）の注射で補うことによ
り、糖尿病患者がほぼ正常のインシュリンおよびグルコ
ース濃度を得ることができることがわかっている。 速効性インシュリンはまた、中間体および長時間作用
インシュリンの遅延作用に加えてより強い初期作用が必
要な糖尿病患者の治療のために、中間体および長時間作
用インシュリンと混合して使用される。 最後に、速効性インシュリンは連続的インシュリン供
給システムに用いられる。 速効性インシュリン溶液の皮下注射により吸収が初期
に遅れるということが見られた（バインダー，ディアベ
テス ケア ７,No.2（1984）,188−189）。しかしなが
ら吸収が遅れた結果作用がゆっくり効きはじめるという
ことは、厳密な代謝調節を目指す場合には望ましくな
い。速効性インシュリン溶液と長時間作用性インシュリ
ン製剤とを混合すると、さらに、速効性インシュリンの
吸収率が低下するという結果になる。 したがって、皮下注射いたとき作用が早く始まり遅延
性のインシュリン製剤との混和性が向上した速効性イン
シュリン溶液が必要とされる。 公知の速効性インシュリン溶液の別の欠点は、インシ
ュリンが連続的インシュリン供給で使用されるインシュ
リン溶液中で小繊維状になり析出して、これにより機械
部品および供給用カテーテルを塞ぐ傾向にあることであ
る。 最後に、通常のインシュリンに耐性を有する患者の治
療に別のインシュリン製剤が必要である。 本発明の目的は、次の向上した特性： １）皮下注射または他の経路での投与により作用のより
速い開始、 ２）遅延性インシュリン製剤との向上した混和性、 ３）差し込み式供給システムに用いられたときの線維化
傾向が低いこと、および ４）耐性患者の治療に対する有用性（過剰に存在する抗
体に対する低い親和性）、 の１種以上を有する新規な速効性インシュリン溶液を提
供することである。 本発明の目的は後述する新規なヒトインシュリン類似
体の水性注射液により達成される。 多数のインシュリン類似体が過去に記載されている。
メルキ（Ｍrki）ら（Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Ch
em.,360（1979）,1619−1632）は、Ａ−鎖の２、５、
６、７、８および11番目とＢ−鎖の５、７、13および16
番目の１個のアミノ酸を置き換えたヒトインシュリンと
異なるヒトインシュリン類似体の合成について記載し興
味深いインシュリンの構造−活性関係に対する新しい洞
察を提供している。さらに研究は、インシュリン（Ｂ
（22）−Ｂ（26））の主なレセプター結合区域を変性し
てレセプター結合活性におけるこのような突然変異の影
響を調査している。しかしながら公知ヒトインシュリン
類似体は、本発明者が望むような性質を示さない。 硫酸化インシュリンは小繊維化が非常に低い傾向にあ
り〔アルビッサーら（Albisser et al.）、“点滴ポン
プに用いられるインシュリンの望ましい特性”、ゲリジ
ャン ジェイ．エル．（Gueriguian J.L.）ら、編；コ
ーエス ファルマコペイアル コンベンション、ロック
ウィル，メリーランド,pp84−95）そして低い抗原性を
示すことが知られている。しかしながら硫酸化インシュ
リンは、１分子につき平均4.5個の硫酸エステル基を含
む少なくとも９個の異なったインシュリン誘導体の異種
混合物である。硫酸化インシュリンはさらに低いインシ
ュリン活性を有し、天然インシュリンの約20％の活性で
ある。天然インシュリンと比較した硫酸化インシュリン
の別の欠点は、これらが化学的に変性されたアミノ酸残
基、すなわち天然に産生しないアミノ酸を不必要に含有
していることである。 それゆえ、本発明の別の目的は、均質で、硫酸化イン
シュリンより高い生理学的活性を有し、そしてさらに好
ましくは天然産生アミノ産を含むだけのインシュリン類
似体を提供することである。 ここで使用される“インシュリン類似体”は、Ａ
（７）CysとＢ（７）Cysの間およびＡ（20）CysとＢ（1
9）Cysの間にジスルフィド橋を有し、Ａ（６）CysとＡ
（11）Cysの間に内部ジスルフィド橋を有するヒトイン
シュリンと同様の分子構造を有しインシュリン活性を有
する化合物を意味する。 〔発明の構成および効果〕 本発明は、ヒトインシュリンの少なくとも１つのアミ
ノ酸残基を天然産生アミノ酸残基で置換した特定のイン
シュリン類似体が所望の速効性活性を示すという驚くべ
き事実に基づく。 最も広い見地において、ヒトインシュリンのアミノ酸
残基の１個以上を、天然産生アミノ酸残基で置換するこ
とにより形成され、二量体、三量体、六量体または重合
体への自己−会合がより少なく起こり、そしてヒトイン
シュリンのものより中性pHにおいて同じ電荷またはそれ
以上の大きな陰電荷を有する新規な速効性ヒトインシュ
リン類似体を提供するものである。 二量体、四量体、六量体または重合体への自己会合が
低い傾向になるために、ヒトインシュリンの特定の残基
が、分子におけるそれぞれの位置で天然アミノ酸残基よ
り一層親水性の他のアミノ酸残基で置換されるのが好ま
しい。また、インシュリン分子における特定の位置にお
いて、より大きなアミノ酸残基で置換することにより、
インシュリン分子が二量体、四量体、六量体または重合
体へ会合する傾向を低くすることになるであろう。 より詳しくは、本発明は次式I:（式中、Ｘはヒトインシュリンのアミノ酸残基または同
一もしくは異なったアミノ酸残基置換物であって、その
実効機能が中性pHにおいてヒトインシュリンと同じ電荷
またはそれより大きな陰電荷を分子に与えるものであ
り、ただし少なくとも１つのＸがインシュリン分子にお
けるそれぞれの位置でヒトインシュリンのアミノ酸残基
と異なり、そしてＡ（８）位のＸがHisまたはPheであ
り、Ａ（21）位のＸがAspであり、Ｂ（５）位のＸがAla
であり、Ｂ（９）位のＸがLeuであり、Ｂ（10）位のＸ
がAsnまたはLeuであり、Ｂ（12）位のＸがAsnでありま
たはＢ（26）位のＸがAlaの場合には残りのＸの少なく
とも１つがインシュリン分子のそれぞれの位置でヒトイ
ンシュリンのアミノ酸残基と異なり、そしてさらに、１
つ以上のアミノ酸残基はＡ−および／またはＢ−鎖のＮ
−および／またはＣ−末端から除去されていてもよ
い。）で表わされる新規のインシュリン誘導体を提供す
るものである。 好ましくは少なくともアミノ酸残基置換物の大部分が
ヒトインシュリン分子における相当する部位のアミノ酸
残基より親水性であり、さらに好ましくはすべてのアミ
ノ酸残基置換物が相当するヒトインシュリンアミノ酸残
基よりも親水性である。 親水性に関しては、シー．フレーメル（C.Frmme
l）,J.Theor−Biol.111（1984）,247−260（表１）が参
考になる。 前記式Ｉに関連して、好ましくは約７個以下のＸがヒ
トインシュリン分子における相当する位置のアミノ酸残
基と異なる。さらに好ましくは２〜４の置換物である。 アミノ酸残基置換物は、好ましくは、Asp、Glu、Se
r、Thr、HisおよびIleからなる群から選択され、より好
ましくは陰性に荷電されたアミノ酸残基、すなわちAsp
および／またはGluである。 新規ヒトインシュリン類似体は、ヒトインシュリンの
１種以上のヒドロキシアミノ酸の代わりに、またはヒト
インシュリンの１種以上のGlnおよびAsnの代わりに、As
pおよび／またはGluを含むのが好ましい。 新規ヒトインシュリン類似体は、さらに、脂肪族およ
び／または芳香族側鎖を有するヒトインシュリンのアミ
ノ酸残基１種以上の代わりにSerおよび／もしくはThrま
たはAspおよび／もしくはGluを含むのが好ましい。 新規ヒトインシュリン類似体は、また、脂肪族および
／または芳香族側鎖を有するヒトインシュリンのアミノ
酸残基１種以上の代わりにまたはヒトインシュリンのヒ
ドロキシアミノ酸１種以上の代わりにHisを含むことが
好ましい。 置換の好ましい位置はB9、B10、B12、B26、B27および
B28、好ましくはB9、B12、B27およびB28であり、これら
の位置において自己会合の低い傾向性と投与によるより
早い速効作用を得るには１つの置換で十分である。 B9位におけるアミノ酸残基置換物は、Asp、Pro、Gl
u、Ile、Leu、Val、His、Thr、Gln、Asn、Met、Tyr、Tr
pおよびPheからなる群から選択され、さらに好ましくは
Asp、Glu、Gln、AsnおよびHisからなる群から選択され
る。 B12位におけるアミノ酸残基置換物はIleおよびTyrか
らなる群から選択されうる。B10位におけるアミノ酸残
基置換物は、Asp、Arg、Glu、AsnおよびGlnからなる群
から選択され、B26、B27およびB28位においてはアミノ
酸残基置換物はAspまたはGluが好ましい。 インシュリン分子の残りの位置において少なくとも２
つの置換物（好ましくは上述の位置と組合せて）が向上
した特性を得るために必要であるように見える。これら
の位置において置換物は次のようである： 本発明のさらに好ましい化合物は、置換物が次の部位
にあるインシュリン類似体である： B27,B12,B9,（B27＋B9），（B27＋A21），（B27＋B1
2），（B12＋A21），（B27＋B17），（B27＋A13），（B
27＋B16），（B27＋A10），（B27＋B28），（B27＋B2
6），（B27＋B10），（B27＋B1），（B27＋B2），（B27
＋B5），（B27＋B14），（B27＋B18），（B27＋B20），
（B12＋B17），（B12＋A10），（B12＋A13），（B12＋B
16），（B12＋B1），（B12＋B2），（B12＋B5），（B12
＋B10），（B12＋B26），（B12＋B28），（B9＋B17），
（B9＋A13），（B9＋B16），（B9＋A8），（B9＋A9），
（B9＋A10），（B9＋B1），（B9＋B2），（B9＋B5），
（B9＋B10），（B9＋B12），（B9＋B14），（B9＋B2
8），（B9＋B18），（B9＋B20），（B9＋B26），（B27
＋B9＋A21），（B9＋B27＋A8），（B27＋B12,A21），
（B27＋B12＋B9），（B9＋B12＋B27＋B17），（B9＋B12
＋B27＋A13），（B9＋B12＋B27＋B16）および（B12＋B1
6＋B17＋B27＋A10＋A13）。 上記式Ｉの好ましい実施態様は次のとおりである。 （各式中、Ｘは前記のように定義されている。） 式Ｉに関して本発明による他の好ましいインシュリン
類似体は、B27位のＸがGluであるもの、B12位のＸがIle
またはTyrであるもの、A21位のＸがAspでありB27位がGl
uであるもの、B9位のＸがAspであるもの、A21位とB9位
のＸがAspでありB27位がGluであるもの、A8位のＸがHi
s、B9位はAspでありB27位はGluであるもの、B10位のＸ
がAspでありB28位のＸがAspであるもの、またはB9位の
ＸがAspでありそしてB27位がGluであるようなものであ
る。 本発明の第二の見地によれば、インシュリン活性を有
する注射液を提供するものである。本発明のインシュリ
ン注射液は上述のヒトインシュリン類似体または好まし
くは中性pHにてその医薬として許容されうる塩の水溶液
を含む。水性媒体は、たとえば塩化ナトリウムおよびグ
リセールの添加により等張化されうる。また、たとえば
酢酸塩もしくはクエン酸塩および保有剤たとえばｍ−ク
レゾール、フェノールもしくはメチル４−ヒドロキシベ
ンゾエートを添加してもよい。インシュリン溶液はさら
に亜鉛イオンを含んでもよい。 本発明のヒトインシュリン類似体は、これまで当業界
で公知であった速効性インシュリン溶液においてヒトま
たはブタインシュリンと置き換えることができる。 インシュリン類似体の調製 組換え体DNA技術の出現後、タンパク質工学について
の可能性は非常に大きくなってきている。いわゆる部位
特異的突然変異誘発技術により、もとからの遺伝子のコ
ドン１種以上を他の天然産生アミノ酸のコドンで置き換
えて天然産生タンパク質をコードする遺伝子を変えるこ
とが可能である。これに代わって、変性遺伝子を、非常
に良く知られた技術により全DNA配列を化学的に合成す
ることによって作ることもできる。天然タンパク質の遺
伝子のこのような操作の目的は、一般には、１つまたは
他の目指す方向に天然タンパク質の性質を変えることに
ある。 新規インシュリン類似体は、自然のヒトプロインシュ
リン遺伝子における適当な部位のコドンを所望のアミノ
酸残基置換物をエンコードするコドンにより置換してプ
ロインシュリン遺伝子を変えるか、または所望のヒトイ
ンシュリン類似体をエンコードする全DNA配列を合成す
ることにより調製されうる。次の所望のインシュリン類
似体をエンコードする新規の変性または合成遺伝子を適
当な表現ベクターへ挿入し、これを適当な宿主微生物た
とえば大腸菌、バチルス菌（Bacillus）または酵母へ移
すと所望の産物を生ずる。表現された産物は次いでこの
表現産物が細胞から分泌されるかそうでないかに従って
細胞または培養液から単離される。 新規インシュリン類似体は、メルキらにより記載され
た方法（Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.,360（197
9）,1619−1632）と同じ方法による化学的合成によって
も調製される。これらはまた、適当なアミノ酸残基置換
物を含む別々にインビトロ調製されたＡ−鎖およびＢ−
鎖から形成され、その際変性されたＡ−鎖およびＢ−鎖
は、公知方法（たとえば、チャンス（Chance）ら、リッ
クディ・エイチ（Rick DH）、グロス イー（Gross E）
（編）ペプチド：合成−構造−機能。プロシィーディン
グズ オブ ザ セブンス アメリカン ペプチド シ
ンポジウム，イリノイ州,pp721〜728）にしたがってジ
スルフィド橋を設けることにより一緒に連結される。 新規インシュリン類似体は、次式II:（式中、Qnはｎ個の天然産生アミノ酸残基を有するペプ
チド鎖であり、ＲはLysまたはArgであり、ｎは０〜33の
整数であり、ｍは０または１であり、Ｘは前記のように
定義されたものであり、ただしペプチド鎖−Qn−Ｒ−は
２個の隣接する塩基性アミノ酸残基を含まない。）で表
わされる生合成前駆体をトリプシンまたはトリプシン誘
導体の存在下にＬ−トレオニンエステルと反応させ、続
いて得られたヒトインシュリン類似体のトレオニンエス
テルを公知方法によりヒトインシュリン類似体へ転化す
ることにより調製されるのが好ましい。このいわゆる
“ペプチド転移”反応は米国特許第4,343,898号明細書
に記載されている（その記載事項は参考としてここへ加
えられている）。 ペプチド転移反応によりＢ鎖の29番目のアミノ酸とＡ
鎖の１番目のアミノ酸の間の−（Qn−Ｒ）ｍ−橋が削除
され、トレオニンエステル基はB29LysのＣ末端に連結す
る。 前記式IIの前駆体はヨーロッパ特許出願第0163529Aに
記載された方法と同じ方法で調製され、その記載はここ
に参考として加えられる。この方法により、問題となる
前駆体をエンコードするDNA配列が適当な表現ビヒクル
へ挿入され、これを酵母へ移すと正しく配置されたジス
ルフィド橋を有する所望の化合物を表現し分泌すること
ができる。表現された産物を次いで培養液から単離す
る。 本発明のインシュリン類似体は、また、次式III:（式中、ＶおよびＴはそれぞれLysまたはArgであり、Ｘ
は前記定義のものである。）で表わされる生合成前駆体
を水溶液中でトリプシンとカルボキシペプチダーゼＢと
反応させ、反応物溶液からヒトインシュリン類似体を回
収することによっても調製されうる。 上記式IIIの前駆体は、ヨーロッパ特許出願第8630213
3.3号に記載の方法と同じ方法により調製され、その記
載はここに参考のために加える。この方法により、前駆
体をエンコードするDNA配列を適当な酵母表現ビヒクル
へ挿入すると正しく配置されたジスルフィド橋を有する
表現産物が表現され培地へ分泌することができる。 本発明の第三の見地によれば、新規インシュリン類似
体を産生する方法を提供するものであり、この方法は、
インシュリン類似体の前駆体をエンコードするDNA配列
からなる複製可能な表現ビヒクルを含む酵母株を適当な
栄養培地で培養し、培地から前駆体を回収し、酵素的お
よび化学的インビトロ転化により新規インシュリン類似
体へ転化することからなる。 本発明はまた、新規インシュリン類似体の新規前駆
体、このような新規前駆体をエンコードするDNA配列、
このようなDNA配列を含む表現ビヒクルおよびこのよう
な表現ビヒクルで形質転換された酵母株を目指すもので
ある。 変性インシュリン類似体 本発明は、特定の誘導体または別の置換物が上述した
本発明の最終目標にほとんど影響しないという条件で、
このような誘導体または別の置換物を含むことを予定す
るものである。したがってアミノ酸残基における官能基
１種以上を誘導することができる。このような誘導体の
例は、インシュリン分子における残基のエステルまたは
アミド基へのそれ自体公知の転化、アルコール基のアル
コキシ基へのまたはその逆の転化、および選択的脱アミ
ド化である。例として、酸媒体中で加水分解によりA21A
snが脱アミド化されA21Aspとなり、または中性媒体中で
B3Asnが脱アミド化されてB3Aspとなる。 さらに、Ｎ−またはＣ−末端でアミノ酸残基を加える
かまたは除去することにより本発明インシュリン類似体
を変性することができる。本発明のインシュリン類似体
はＢ鎖のＮ末端で４個までのアミノ酸残基が不足しＢ−
鎖のＣ−末端で５個までのアミノ酸が不足してもよくイ
ンシュリン類似体の全体的性質には重大な影響はない。
このような変性されたインシュリン類似体の例は、B1Ph
eまたはB30Thrアミノ酸残基が欠除したインシュリン類
似体である。 また、天然産生アミノ酸残基を、上記最終的目標に重
大な影響を与えないという条件で、ポリペプチド鎖の１
っ以上の末端に加えてもよい。 本発明インシュリン類似体のポリペプチド鎖の末端に
おけるこのような欠除または添加は、本発明によるアミ
ノ酸置換物を有するインシュリン類似体においてインビ
トロで影響を及ぼしうる。これに代わって、本発明によ
る新規インシュリン類似体の遺伝子を、ポリペプチド鎖
の末端での余分のアミノ酸残基または欠除アミノ酸残基
に相当するコドンを加えるかまたは除去することのいず
れかにより変性してもよい。 用語 アミノ酸に用いられる略字はJ.Biol.Chem.243（196
8）,3558に記載されているものである。アミノ酸はＬ型
配置である。 以下の明細書に使用されているようにＢ（１−29）は
B1PheからB29Lysまでの短かくしたヒトインシュリンＢ
鎖を意味し、Ａ（１−21）はヒトインシュリンのＡ鎖を
意味する。 本発明の実施にしたがってヒトインシュリン分子にお
いて作られる置換物はヒトインシュリンに関連する接頭
語で示される。たとえば、B27Gluヒトインシュリンは、
Ｂ鎖の27番目にあるThrがGluに代わったヒトインシュリ
ン類似物を意味する。B27Glu、B9Aspヒトインシュリン
は、Ｂ鎖の27番目にあるThrがGluに代わりそしてＢ鎖の
９番目にあるSerがAspに代わったヒトインシュリン類似
物を意味する。B27Glu、Ｂ（１−29）−Ala−Ala−Lys
−Ａ（１−21）ヒトインシュリンは、短くしたＢ鎖（上
記参照）における27番目のThrがGluに代わり、そしてＢ
（１−29）鎖とＡ−鎖（Ａ（１−21））がペプチド配列
Ala−Ala−Lysにより連続されたインシュリン類似体の
前駆体（式II参照）を意味する。特記しない限りＢ（１
−29）鎖とＡ（１−21）鎖はヒトインシュリンにおける
ようにＡ（７）CysとＢ（７）Cys間およびＡ（20）Cys
とＢ（19）Cys間のそれぞれのジスルフィド橋により結
合されており、Ａ鎖はＡ（６）CysとＡ（11）Cys間の内
部ジスルフィド橋を含むものと理解されるべきである。 すでに指摘したように、本発明の目的は速効性インシ
ュリン注射液を提供することである。この目的に適合す
る試みにおいて、本発明者は、まず最初に、インシュリ
ン濃度において明らかに全く避けがたい差異を含めて、
デポー製剤または丸剤におけるインシュリンと循環系に
おけるインシュリンの間にかなりの違いがあることに気
が付いた。特に、血流におけるインシュリンは非常に薄
く、10-11〜10-8Mであり、単量体形であるが、幾らかは
二量体形であるかもしれない。さらに高濃度のインシュ
リンが膵臓のＢ細胞顆粒に貯蔵されており、通常の投与
可能な溶液においては、主にでないが、大部分不活性の
六量体形たとえばよく知られている２亜鉛六量体形であ
る。 溶液中のヒトインシュリンは、多くの分子形、すなわ
ち単量体、二量体、四量体および六量体で存在すること
が知られており（ブランデル（Blundell）ら、イン ア
ドバンシーズ インプロテイン ケミストリィ，アカデ
ミック プレス，ニューヨーク アンド ロンドン,Vo
l,26,pp.279−330,1972）、オリゴマー形が高いインシ
ュリン濃度で好ましくそして単量体がインシュリンの活
性形である。四量体および六量体は活性形ではなく、二
量体でさえ活性ではないかもしれない。本発明の基礎を
なす概念は、当該技術により認識される吸収の遅延現象
（バインダー（Binder）、ディアベテス ケア７,No.2
（1984）,188−199）が大部分、六量体、四量体および
二量体形から（活性な）単量体形へ解離するためにイン
シュリンに必要な時間が原因であるという発明者の知見
である。 本発明のヒトインシュリン類似体は、ただちに二量
体、四量体、六量体または重合体を形成しにくい分子構
造により、すなわち亜鉛イオンの存在または不存在に二
量体、四量体、六量体または重合体へ自己−会合する傾
向が低いことにより、その速効性を達成する。 インシュリンに存在するアミノ酸配列においてかなり
の種族間の違いから、インシュリン分子に存在するアミ
ノ酸残基のすべてがインシュリン活性に重大であるとい
うわけでなく、そしてインシュリン活性に必須でないア
ミノ酸の幾つかはインシュリン分子の物理特性に重要で
あるということが長年認められてきている。実際、モル
モットインシュリンは二量体化できないことが知られて
いる。硫酸化インシュリンおよびテトラニトロチロシン
インシュリンは二量体化しない。すなわち、ヒトインシ
ュリン分子において多くのアミノ酸残基はインシュリン
活性がほとんど低下することなく変化しうる。ここで予
定されるヒトインシュリン分子におけるアミノ酸置換物
は、インシュリン活性を損なうことなく二量体、四量
体、六量体または重合体の形成を妨げることを目指す。 式ＩのＡ鎖およびＢ鎖における置換が行なわれうる位
置でのアミノ酸残基はインシュリン活性に重大ではない
が、しかしヒトインシュリンが凝集して二量体、四量
体、六量体または重合体になるという能力、またはヒト
インシュリンの溶解性に対しては重要である。本発明ア
ミノ酸残基置換物は、二量体、四量体、六量体または重
合体への凝集を促進する隣接インシュリン分子間の原子
と原子の接触を妨害する。 置換の目的について期待されうるように、ヒトインシ
ュリン分子における特定の位置での変化は他のものより
効果的である。概して、Ｂ鎖において行なわれる１つの
置換で自己会合の傾向を減らすのに十分なこともある
し、一方、他の残基の少なくとも２つの変化が必要な場
合もある。Ａ−鎖における置換は主に解離した分子の溶
解性を向上するのに役立つ。アミノ酸残基置換を行なう
のに好ましい位置は、式Ｉで示されたようなインシュリ
ン分子において、B9、B12、B10、B26、B27およびB28単
独、相互に組合わせてまたはその他の置換と一緒のもの
である。 明らかに、非電荷または陽性に荷電したアミノ酸残基
を１つ以上の陰性に荷電したアミノ酸残基で置換するこ
とは、ヒトインシュリン類似体の電荷を中性pHでより陰
性にさせ、ヒトインシュリンに比較して等電点をより低
くすることになる。特色として本発明のヒトインシュリ
ン類似体はヒトインシュリンと比較して同じであるかま
たはより陰性の電荷（中性pHにて）とより低い等電点を
有する。 概して、１〜３個の置換が本発明の直接の目的、すな
わちより速効性のインシュリンを提供することを達成す
るであろうし、このようなものは本発明の好ましい態様
を構成する。２〜３個の置換基を用いることにより、保
護されたインシュリン製剤との向上した混和性が達成さ
れうる。しかしながら、本発明の直接の目的が、また、
３個より多数の置換基により達成されうることが有利で
あると信じられている。なぜならこれにより所望する第
二の目的も達成しうるからである。 特に、置換基の追加のレベル、すなわち４個または５
個の置換アミノ酸残基の存在は、ヒトインシュリン類似
体において小繊維化しにくかったり重合を妨げる結果と
なり、これはインシュリン溶液を連続した点滴に予定す
る場合に特に好ましい特性である。概して、本発明のヒ
トインシュリン類似体についてはインシュリン分子にお
いて約７個以下が予定されている。好ましくは２〜４個
の置換基である。 本発明インシュリン類似体の前駆体をエンコードする
遺伝子は、前記式II（またはIII）（式中、Ｘはすべて
ヒトインシュリンのアミノ酸残基である）のインシュリ
ン前駆体を、部位特異的変異誘発により所望の突然変異
をエンコードするコドンを挿入するかまたは置換するこ
とにより変性することにより調製されうる。インシュリ
ン類似体の前駆体をエンコードするDNA配列は、またイ
ンシュリン類似体前駆体遺伝子の全部または一部に相当
するオリゴヌクレオチドから酸素的合成によっても作ら
れうる。 次いで、インシュリン遺伝子の所望の突然変異を有す
る遺伝子を含むDNA配列を、TPIプロモーター（TPIP）
〔ティ・アールバー（T.Alber）とジィ・カワサキ（G.K
awasaki）、ヌクレオチド セクエンス オブ ザ ト
リオ−スホスフェート イソメラーゼ ジーン オブ
サッカロミセス セレビシアエ,J.Mol.Applied Genet.1
（1982）419−434〕、MFα１リーダー配列〔ジェイ．ク
ルジャン（J.Kurjan）とアイ．エルスコウィッツ（I.He
rskowitz）、ストラクチュア オブ ア イースト フ
ェロモンジーン（MFα１）；ア ピュータティブ アル
ファ−ファクター プレカーソル コンテインズ フォ
アタンデム コピーズ オブ マチュア アルファ−フ
ァクタ.Cell 30（1982）933−943〕およびサッカロミセ
ス セレビシアエ（S.cerevisiae）のTPIからの転写終
結配列（TPIT）をコードする断片と合わせる。これらの
断片は、遺伝子をエンコードする前駆体の高い割合での
転写を確実にし、そしてまた分泌経路へ前駆体を局在化
しその結果として増殖培地へ排出しうる予備前駆体をも
たらすことができる。表現単位はさらに複数の酵母２μ
オリジンおよび選択性マーカーLEU2を備える。 酵母におけるα−ファクターのインビボ成熟の間、MF
α１リーダーペプチドの最後（Ｃ末端）の６個のアミノ
酸（Lys−Arg−Glu−Ala−Glu−Ala）が、Lys−Arg配列
を識別するエンドペプチダーゼとGlu−Ala残基を除去す
るアミドペプチダーゼの連続作用によりα−ファクター
前駆体から除かれる〔ユリウス，ディ・（Julius,D）
ら、Cell 32 （1983）839−852〕。酵母アミノジペプ
チダーゼに対する必要性を排除するために、MFα１リー
ダーのＣ−末端Glu−Ala−Glu−Alaをコードする配列
を、インビトロ変異誘発によりMFα１リーダー配列から
除去する。以下の明細書において、“MFα1 リーダー”
は全リーダー配列を意味し、一方MFα1 リーダー（−Gl
u−Ala−Glu−Ala）はＣ末端Glu−Ala−Glu−Ala配列が
除かれたリーダー配列を意味する。 〔実施例〕 例１ Ｂ（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトイン
シュリンをエンコードする合成遺伝子の構築 Ｂ（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）の酵母
コドン最適化構造遺伝子を次のようにして構築する。 次の10個のオリゴヌクレオチドを、調節された多孔性
ガラス支持板上でホスホロアミダイト化学（phosphoram
idite chemistry）を用いて自動DNA合成機にて合成する
〔エス．エル．ビューケージ（S.L.Beaucage）およびエ
ム．エイチ．カルーサー（M.H.Caruthers）（1981）、T
etrahydron Letters 22,1859−1869〕。 I:AAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC 35−体 II:AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA 36−体 II:TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT 43−体 IV:GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC 42−体 V:TCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC 32−体 VI:ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT 34−体 VII:GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT 37−体 VIII:TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC 37−体 IX:TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT 36−体 X:CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG 33−体 ５個のデュープレックス（duplexes）Ａ−Ｅが第１図に
示すように上記10個のオリゴヌクレオチドから形成され
る。 デュープレックスＡ−Ｅの各々20pmoleが、相当する
一対の５′−ホスホリル化オリゴヌクレオチドＩ−Ｘか
ら、５分間90℃に加熱し続いて75分間室温まで冷却する
ことにより形成される。デュープレックスＥの33−体
（Ｘ）は、連結の間、自己相補性のXbaI一本鎖末端付近
での二量体化を避けるために５′−ホスホリル化されな
い。５つのデュープレックスを混合し、T4リガーゼで処
理する。２％寒天ゲル中の連結混合物を電気泳動後、合
成遺伝子を182/183bpバンドとして単離する。 得られた合成遺伝子を第１図に示す。 合成遺伝子を、pMT644からの4kb kpnl EcoR1断片と8k
bXba1−kpn1断片およびpKFN9からの0.3kb EcoR1−Hga1
断片と連結すると次の構造TPIP＋MFα１リーダー−Ｂ
（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）−TPITが得
られる。 プラスミドpMT644は、DNA配列TPIP−MFα１リーダー
−Ｂ（１−29）−Ａ（１−21）−TPITを含み、構築はデ
ンマーク特許第1293/85号明細書に記載されている。プ
ラスミドpKFN9の構築を次に記載する。 連結混合物を用いてコンピテント大腸菌株（r-,m+）
（MT 172）を形質転換する。アンピシリン耐性コロニー
30個を最小培地M9〔ティー．マニアティス（T.Maniati
s）ら、モレキュラークローニング，コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリィー,1982,p.68）を含むプ
レートに移すとLeu+コロニー８個が得られる。32P−Xba
1−EcoR1断片のマクサム−ギルバート配列決定により、
３つのプラスミドが所望の配列を有する遺伝子を含むこ
とがわかった。１つのプラスミドpKFN27が別の用途のた
めに選択される。 pKFN 27の構築を第２図に示す。 プラスミドpKFN9の構築 プラスミドpKFN9の構築の目的は、MFα１−リーダー
配列の直後にHga1部位を含むプロスミドを得ることであ
る。プロスミドpMT544（この構築はデンマーク特許第27
8185号明細書に記載されている）をXba1で切断し、約25
0塩基をExo IIIヌクレアーゼ処理で３′末端から除去す
る。Hga1配列を含む合成32−体挿入プライマー GGATAA
AA GAGAGGCGCG TCTGAAGCTCACTCをアニーリングして部分
的一本鎖のDNAとなる。二本鎖環状DNAはクレノウポリメ
ラーゼで充てんしT4リガーゼで連結することにより作ら
れる。大腸菌（r-,m+）（MT 172）形質転換後、突然変
異プラスミドを含むコロニーを、５′−32P−ラベルさ
れた32体の挿入プライマーを用いたコロニーハイブリッ
ド法により固定する。新しいHga1部位の出現を制限酵素
切断（EcoR1＋Hga1、Hind3＋Hga1）で確認する。再形質
転換後、“純粋な”突然変異体pKFN9を別の用途のため
に選択する。pKFN9の構築を第３図に示す。 例２ B27Gluヒトインシュリンの調製 B27Gluヒトインシュリンは、B27Glu,B（１−29）−Al
a−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをThr−DB
utでペプチド転移させ得られたトレオニンエステルをト
リフルオロ酢酸でアシドリシスすることにより調製され
る。調製は次の工程からなる： Ｉ、B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）インシュリンをエンコードする遺伝子の構築 プラスミドpKFN27を、合成インシュリン前駆体遺伝子
のちょうど下流の唯一つのXba1部位で直線化する。下記
の充てん工程によりXba1部位を破壊しないために、19−
体のHind3−Xbal二本鎖リンカーXba1 CTAGAAGAGCCCAAGACTAHind3 TTCTCGGGTTCTGATTCGA を直線化プラスミドの各端部に連結する。リンカーはXb
a1一本鎖端部でほ５′−ホスホリル化されているがHind
3端部では非ホスホリル化のままであり、これにより連
結工程の間およびDNA環化の間のリンカーの重合を避け
る（第４図参照）。 ５′−モノヌクレオチドを、Exo IIIヌクレアーゼ処
理により、得られた直線状二本鎖DNAの３′−端部から
除去する。Exo IIIヌクレアーゼ処理を23℃にて行な
い、この条件下で約250のヌクレオチドがDNAの各３′−
末端から除去される〔エル．グオ（L.Guo）およびアー
ル．ウー（R.Wu）（1983），メソード イン エムザイ
モロジイ 100,60−96〕。 ５′−ホスホリル化25−体の変異誘発プライマー ｄ
（GTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC）を突然変異部位までア
ニールする。T4リガーゼの存在下にクレノウポリメラー
ゼで充てん後、二本鎖DNAをXba1で消化する。次いで１
つの鎖に突然変異を有するヘテロデュープレックスの環
状DNAをT4リガーゼで形成する。 連結混合物を、アンピシリン耐性を選択する大腸菌
（r-,m+）（MT 172）へ形質転換する。 突然変異体を、５′−32P−ラベルされた25−体の変
異誘発プライマーを用いてコロニーハイブリッド法によ
り同定する。再形質転換後、得られたコロニーの１つか
らのプラスミドpKFN 37が0.5 kbXba1−EcoR1断片のDNA
配列決定により所望の突然変異を含むことがわかる（エ
ー，マキサム アンド ダブリュ，ギルバート（1980）
メソード イン エンザイモロジイ65,499−560）。 II、形質変換 サッカロミセス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT
663（E2−7B XE11−3C a/α，Δtpi/Δtpi、pep 4−31
pep 4−３）を、OD 600nm 0.6までYPGaL（１％バクト
酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、
１％ラクテート）で増殖する。 培養液100mlを遠心分離により採取し、水10mlで洗
い、再度遠心分離し、そして10mlの1.2Mソルビトール、
25mM Na2EDTA pH＝8.0 6.7mg/mlジチオトレイトール中
に再度懸濁する。懸濁液を30℃で15分間インキュベート
し、遠心分離し、細胞を10mlの1.2Mソルビトール、10mM
Na2 EDTA、0.1Mクエン酸ナトリウムpH＝5.8、2mgノボ
ザイム（Novozym） 234に再懸濁させる。懸濁液を30℃
で30分間インキュベートし、細胞を遠心分離により集
め、10mlの1.2Mソルビトールと10mlのCAS（1.2Mソルビ
トール、10mM CaCl2、10mMトリス（トリス＝トリス（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン）pH＝7.5）中で洗
い、2mlのCASに再懸濁させる。形質変換のために、0.1m
lのCAS−再懸濁液細胞をほぼ１μｇのプラスミドpKFN37
と混合し、室温で15分間放置する。1mlの20％ポリエチ
レングリコール4000、10mM CaCl2、10mMトリスpH＝7.5
を加え、混合物をさらに室温で30分間放置する。混合物
を遠心分離し、ペレットを0.1mlのSOS（1.2Mソルビトー
ル、33％v/v YPGaL、6.7mM CaCl2、14μg/mlロイシン）
に再懸濁し、30℃で２時間インキュベートする。次いで
懸濁液を遠心分離し、ペレットを0.5mlの1.2Mソルビト
ールに再懸濁する。52℃で6mlの表面寒天〔シャーマン
らのSC培地、（メソード イン イースト ジェネリッ
クス、コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ィ,1981）ロイシンを含まずそして1.2Mソルビトールと
2.5％寒天含有〕を加え、そして懸濁液を同じ寒天−固
化、ソルビトール含有媒地を含むプレートの表面へ注入
する。形質変換コロニーを30℃で３日後に採取し、再単
離しそして液体培養を始めるのに用いる。このような１
つの形質転換体KFN40（＝MT 663/pKFN 37）をさらに特
性決定するために選択する。 III、B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）インシュリン 前駆体の再現 酵母株KFN40をYPD培地（１％酵母抽出物、２％ペプト
ン、（両方ともディフコ ラボラトリーズDifco labora
tories社製）および２％グルコース）で増殖する。この
株の10％培養液を30℃でO.D.600が26になるまで振とう
する。遠心分離後、上清を逆相HPLCで分析し、13.5mg/
の前駆体を見出す。 上清中の類似体を低pHにて陽イオン交換カラム中で濃
縮し、続いて適当な緩衝液で脱着する。アルコール性ク
エン酸緩衝液で結晶化を行なう。 IV、ペプチド転移反応 0.2モル（47.1g）Thr−OBut,HOACをDMFに溶かして100
mlの溶液とし、76.5％v/v DMFの水溶液50mlを加え、そ
して粗製B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１
−21）ヒトインシュリン10gを混液中に溶かし、これを1
2℃にサーモスタット温度調節する。次いで、0.05M酢酸
カルシウム25ml中のトリプシン1gを加え、12℃で24時間
後混合物をアセトン２へ加え、沈でんしたペプチドを
遠心分離により単離し、減圧乾燥する。B27Glu,B30Thr
−OButヒトインシュリンを調製用HPLCカラムにて精製す
る（カラム材料としてシリカ−C18を有する）。 Ｖ、B27ヒトインシュリンへの転化 B27Glu,B30Thr−OButヒトインシュリンをトリフルオ
ロ酢酸100mlに溶かす。室温で２時間後、溶液を凍結乾
燥する。凍結乾燥した粉末をpH7にて47.5mMクエン酸ナ
トリウム400mlに溶かす。1M ZnCl2 2.4ml添化後pH5.5に
てペプチドが沈でんし、遠心分離により単離し、減圧乾
燥する。生成物を陰イオン交換クロマトグラフィにより
精製し、ゲル過により脱塩化する。収量:B27Gluヒト
インシュリン1.7g 例３ B9Aspヒトインシュリンの調製 B9Aspヒトインシュリンは、B9Asp,B（１−29）−Ala
−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをThr−OBu
tとペプチド転移させ、得られたトレオニンエステルを
トリフルオロ酢酸でアシドリシスすることにより調製さ
れる。 Ｉ、B9Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）
ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 この遺伝子は、23−体変異誘発プライマーｄ（CTTGTG
CGGTGACCACTTGGTTG）により示されるpKFN 27の部位特異
的変異誘発によりB27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys
−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝
子について記載したのと同じ方法で構築される。プラス
ミドpKFN 38が所望の突然変異を有するのがわかる。 II、形質転換 プラスミドpKFN 38は、例2.IIと同じ方法によりサッ
カロミセス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT 663へ
形質転換され、形質転換体KFN41を単離する。 III、B9Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンの発現 酵母株KFN41を例2.IIIに記載したようにYPD培地で増
殖する。2.5ml/のインシュリン類似体前駆体が上清中
に見出された。 IV、ペプチド転移 粗製B9Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリン7.4gを例2.IVに記載のようにペプ
チド転移するとB9Asp,B30Thr−OButヒトインシュリンが
得られる。 Ｖ、転化 B9Asp,B30Thr−OButヒトインシュリンを、例2.Vに記
載のようにしてB9Aspヒトインシュリンへ転化する。収
率:0.83g B9Aspヒトインシュリン。 例４ B9Asp,G27Gluヒトインシュリンの調製 B9Asp,B27Gluヒトインシュリンは、B9Asp,B27Glu,B
（１−21）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシ
ュリンをThr−OButでペプチド転移し、得られたトレオ
ニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシドリシスするこ
とにより調製される。 Ｉ、B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ
（１−21）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の
構築 pKFN 38（例３参照）からの367 bp EcoR1−Hind3断片
とpKFN 37（例２参照）からの140bp Hind3−Xbal断片
を、プラスミドpUC 13（このプラスミドは、ヴエイラVi
eiraら（1982）,Gene19,259−268によりpUC8とpUC9につ
いて記載されたようにして構築される）の大きなXba1−
EcoR1断片と連結する。連結混合物をアンピシリン耐性
を選択する大腸菌（MT 172）へ形質転換する。プラスミ
ドを多数の形質転換体から調製し、Pst1とHind3で消化
することにより分析する。正しい制御酵素パターンを示
す１つのプラスミドからの0.5kb Xba1−EcoR1断片を、p
MT644（デンマーク特許出願第1293/84号）からの7.8kb
Xba1−kpn1断片を4.3kb kpn1−EcoR1断片と連結する。
連結混合物をアンピシリン耐性を選択する大腸菌（MT17
2）へ形質転換する。得られたコロニーの１つからのプ
ラスミドpKFN43は、0.5kb Xba1−EcoR1断片のDNA配列決
定により所望のインシュリン誘導体前駆体の遺伝子を含
むことがわかる。pKFN43の構築を第５図に示す。 II、形質転換 例2.IIと同じ方法によりプラスミドpKFN38はサッカロ
ミセス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT663へ形質
転換され、この形質転換体KFN44を単離する。 III、B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ
（１−21）ヒトインシュリンの表現 酵母株KFN44を例2.IIIで記載したようにYPD培地中で
増殖する。7.3mg/のインシュリン類似体前駆体が上清
中で見られた。 IV、ペプチド転移 粗製B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ
（１−21）ヒトインシュリン12.7gを、例2.IV記載した
ようにペプチド転移するとB9Asp,B27Glu,B30Thr−OBut
ヒトインシュリンが得られる。 Ｖ、転化 B9Asp,B27Glu,B30Thr−OButヒトインシュリンを例2.V
に記載したようにB9Asp,B27Glu,B30Thrヒトインシュリ
ンへ転化しそして精製する。収量:1.0g B9Asp,B27Gluヒ
トインシュリン 例５ A8His,B9Asp,B27Gluヒトインシュリンの調製 A8His,B9Asp,B27Gluヒトインシュリンは、例２に記載
しているように、A8His,B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Al
a−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをThr−OB
utでペプチド転移し、得られたトレオニンエステルをト
リフルオロ酢酸でアシドリシスすることにより調製され
る。 Ｉ、A8His,B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys
−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝
子の構築 ギャップしたデュープレックス法〔ワイ．モリナガ
（Y.Morinaga），ティ．フランセシニ（T.Franceschin
i）、エス．イノウエ（S.Inouye）およびエム．イノウ
エ（M.Inouye）（1984），バイオテクロノジィ2,636−6
39〕を用いて変異誘発を示すオリゴヌクレオチドによ
り、この遺伝子を構築する。pUC13はMFα１リーダー配
列をエンコードするプラスミドを誘導し、B9Asp,B27Glu
ヒトインシュリン前駆体（第５図）をHpa IとXba Iで切
断する。大きな断片をNde Iで線状化されたプラスミド
と混合する。熱変性および冷却後、混合物はインシュリ
ン前駆体遺伝子に相当する範囲（Hpa I−Xba I）に一本
鎖“ウインドウ”を有するギャップしたデュープレック
スを含む。組合わせが不適当な37−体変異誘発プライマ
ーｄ（GAACAATGCTGTCACTCC−ATCTGCTCCTTGTACCAAT）を
ギャップしたデュープレックスとハイブリッドし続いて
クレノウポリメラーゼで充てんし連結する。混合物を用
いてアンピシリン耐性を選択する大腸菌（MT172）を形
質転換する。突然変異体を、18−体の５′−32p−ラベ
ルされたプローベｄ（AATGCTGTCACTCCATCA）を用いてコ
ロニーハイブリッド法により同定する。再形質転換後得
られたコロニーの１つからのプラスミドは、0.5kb Xba
I−EcoR IのDNA配列決定により所望の突然変異を含むこ
とがわかった。このプラスミドを用いて、pKFN43の構築
について例４に記載されたように酵母プラスミドpKFN10
2の構築を行なう。 II、形質転換 プラスミドpKFN102を、例2.IIと同じ方法によりサッ
カロミセス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT663へ
形質転換し、形質転換体KFN109を単離する。 III、A8His,B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys
−Ａ（１−21）ヒトインシュリンの表現 酵母株KFN109を、例2.IIIに記載したようにYPD培地で
培養する。21.5mg/のインシュリン類似体前駆体が上
清中に見出された。 IV−Ｖ、ペプチド転移および転化 22.0gの粗製A8His,B9Asp,B27Glu,B（１−29）−Ala−
Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンを例2.IV−Ｖ
に記載されているようにペプチド転移し、転化し、粗製
する。収量:A8His,B9Asp,B27Gluヒトインシュリン4.0g 例６ B12Ileヒトインシュリンの調製 B12Ileヒトインシュリンを、例２に記載のように、B1
2Ile,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒト
インシュリンをThr−OButでペプチド転移し、得られた
トレオニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシドリシス
することにより調製する。 Ｉ、B12Ile,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 MFα１リーダー（−Glu−Ala−Glu−Ala）−Ｂ（１−
29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）をエンコードするp
MT598（プラスミドpMT598の構築はヨーロッパ特許出願
第0163529Aに記載されている）の0.5kb EcoR1−Xba1断
片を、Xbal−EcoR1で切断されたM13 mp10 RFファージへ
挿入し、相当する一本鎖DNAをM13 mp10複製ファージか
ら精製する。一本鎖の鋳型DNAを変異誘発性27−体プラ
イマーNOR−92 d（GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC）およ
びM13ユニバーサル配列プライマーｄ（TCCCAGTCAC−GAC
GT）へハイブッドする。プライマーをdNTPおよびクレノ
ウポリメラーゼにより伸長し、T4DNAリガーゼで連結す
る。BstN1部位（Xba1−EcoR1断片では唯一）を破壊する
ために変異誘発プライマーKFN92が選択される。それゆ
え、未変異のEcoR1−Xba1断片に対し選択するために、
混合物をBstN1と続いてEcoR1およびXba1で切断し、EcoR
1とXba1切断pUC13ベクターに連結する。得られた形質転
換体、プラスミド、pMT760の１つから、インシュリンコ
ード配列においてBstN1部位が欠けているものを選択す
る。所望の突然変異した配列がマキサム・ギルバートDN
A配列決定法により確められた。プラスミドpMT760は、p
MT598からの同じ断片に相当する0.5kb EcoR1−Xba1配列
（上記参照）を、B12（Va1−Ile）での突然変異体のほ
かに含む。次いでこの突然変異配列を、pMT760の0.5kb
EcoR1−Xba1断片をpMT644からの7.8kb Xba1−Kpn1と4.3
kb Kpn1−EcoR1断片と連結することにより酵母発現プラ
スミド上に移しpMTAを形成する。 II−Ｖ、形質転換、発現、ペプチド転移、転化プラス
ミドpMTAを、例2.IIに記載のように酵母株MT663へ形質
転換し、この形質転換株MTAを例2.IIIに記載したように
増殖する。10.4mg/のインシュリン類似体前駆体が上
清中に見出された。10gの粗類似体前駆体を、例2.IV−
Ｖに記載のようにペプチド転移し、転化し、そして精製
する。収量:B12Ileヒトインシュリン1.3g 例７ B12Tyrヒトインシュリンの調製 B12Tyr,ヒトインシュリンを、例２に記載のように、B
12Tyr,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒト
インシュリンをThr−OButでペプチド転移し、得られた
トレオニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシドリシス
することにより調製される。 Ｉ、b12Tyr,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 KFN92の代わりにプライマーKFN93 d（GTAGA−GAGCTTC
GTACAGGTGTGAGCC）を用いるという唯一の例外以外はB12
Ile,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトイ
ンシュリンをエンコードする遺伝子の調製方法と同じ方
法で遺伝子を構築する。 II−IV、形質転換、表現、ペプチド転移、転化工程II
−IIIを例２に記載したように行なう。 1.7mg/のインシュリン類似体前駆体が上清中に見出
された。粗類似体前駆体を例2IV−Ｖに記載のようにし
てペプチド転移し、転化し、精製すると、B12Tyrヒトイ
ンシュリンが得られた。 例８ B10Aspヒトインシュリンの調製 B10Aspヒトインシュリンが、例２に記載のようにし
て、B10Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをThr−OButでペプチド転移し、得
られたトレオニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシド
リシスすることにより調製される。 Ｉ、B10Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 KFN92の代わりにプライマーKFN94 d（AGCTT−CCACCAG
ATCTGAGCCGCACAG）を用いるという唯一の例外以外は、B
12Ile,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒト
インシュリンをエンコードする遺伝子の調製方法と同じ
方法により遺伝子を構築する。 II−Ｖ、形質転換、表現、ペプチド転移、転化工程II
−IIIを例２に記載したようにして行なう。 36mg/のインシュリン類似体前駆体が上清中に見出
された。粗製類似体前駆体を、例2IV−Ｖに記載のよう
にして、ペプチド転移し、転化し、精製する。収量:B10
Aspヒトインシュリン7.6g。 例９ B28ヒトインシュリンの調製 B28ヒトインシュリンは、B28Asp,B（１−29）−Ala−
Ala−Lys−Ａ（１−21）ヒトインシュリンをThr−OMeで
ペプチド転移し、得られたトレオニンエステルを約８〜
12のpHで加水分解することにより調製される。 Ｉ、B28Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンをエンコードする遺伝子の構築 MFα１リーダー（−Glu−Ala−Glu−Ala）−Ｂ−Ｃ−
ＡをエンコードするpMT462（プラスミドpMT462の構築は
デンマーク特許出願第1257/86号に記載されている）の
0.5kb EcoR1−Xba1断片、すなわち変性されたMFα１リ
ーダーにより先行されたヒトプロインシュリン遺伝子
を、Xba1−EcoR1で切断されたM13 mp10 RFファージへ挿
入し、相当する一本鎖DNAをM13 mp10複製ファージから
精製する。一本鎖鋳型DNAを変異誘発性41−体プライマ
ーNOR205 d（TTCCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGA
AGC）およびM13ユニバーサル配列プライマーｄ（TCCCAG
TCACGACGT）へハイブリッドする。プライマーをdNTPsと
クレノウポリメラーゼで伸長しT4 DNAリガーゼで連結す
る。 フェノールで抽出し、エタノールで沈澱および再懸濁
後、DNAを制限酵素Apa1,Xba1およびEcoR1で切断する。
別にフェノール抽出、エタノール沈でんおよび再懸濁
後、DNAをEcoR1−Xba1切断pUC13と連結する。連結混合
物を大腸菌（r-,m+）株へ形質転換し、プラスミドを幾
つかの形質転換体から調製する。プラスミド標本をEcoR
1とXba1で切断し、0.5および0.6kbの両方にバンドを示
すこれら標本を大腸菌へ再形質転換する。再形質転換体
から0.5挿入部を有するpU13のみを有する形質転換体が
選択される。 得られた形質転換体の１つから、B28（Pro→Asp）が
所望の突然変異を有するプラスミドpMT881を選択する。
変異配列はマキサム−ギルバートDNA配列決定により確
められる。次いで変異配列を、pMT881の0.5kb EcoR−Xb
a1断片をpMT644からの7.8kb Xba1−Kpn1と4.3kb Kpn1−
EcoR1断片と連結することにより酵母発現プラスミド上
へ移動してpMTA1を得る。 II、形質転換 プラスミドpMTA1を、例2.IIと同じ方法でサッカロミ
セス セレビシアエ（S.cerevisiae）株MT663へ形質転
換し、形質転換体MTA1を単離する。 III、B28Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）ヒトインシュリンの発現 酵母株MTA1を例2.IIIに記載のようにYPD培地で増殖す
る。7.2mg/のインシュリン類似体前駆体が上清中に見
出される。 IV、ペプチド転移 粗B28Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−2
1）を、例2.IVに記載のようにして、Thr−OButの代わり
にThre−OMeを用いてペプチド転移するとB28Asp,B30Thr
−OMeヒトインシュリンが得られる。 Ｖ、転化 B28Asp,B30Thr−OMeヒトインシュリンを水中に分散さ
せて１％（w/v）とし、IN水酸化ナトリウムを添加してp
H値10.0とすることにより溶解する。pHを10.0にて24時
間25℃で一定に保つ。形成したB28Aspヒトインシュリン
を、塩化ナトリウム約８％（w/v）まで、酢酸ナトリウ
ム三水和物約1.4％（w/v）まで、および酢酸亜鉛二水和
物約0.01％（w/v）までを加えることにより沈でんさ
せ、続いて1N塩酸を加えてpH5.5にする。沈でん物を遠
心分離により単離し、陰イオン交換クロマトグラフィに
より精製し、ゲル過により脱塩化する。収量:0.2g B2
8Aspヒトインシュリン。 例10 A21Asp,B9Asp,B27Gluヒトインシュリンの調製 B9Asp,B27Gluヒトインシュリンを選択的脱アミド化
（37℃,pH2.5で14日間５％溶液の加水分解）することに
よりA21Asp,B9Asp,B27Gluヒトインシュリンを調製す
る。脱アミド化生成物を陰イオン交換クロマトグラフィ
により単離する。 例11 B27Glu,A21Aspヒトインシュリンの調製 B27Glu,A21Aspヒトインシュリンは、例２で記載した
ように、B27Glu,A21Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−
Ａ（１−21）をThr−OButでペプチド転移し、得られた
トレオニンエステルをトリフルオロ酢酸でアシドリシス
することにより調製される。 B27Glu,A21Asp,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１
−21）は、例10に記載したような、脱アミド化により、
B27Glu,B（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）
（例２参照）から調製される。 本発明ヒトインシュリン類似体の特性決定 分子量の
決定〔ガットフロイント エイチ．（Gutfreund H.）バ
イオケミカル ジャーナル42（544）1948〕。 方法：ナウアー メンブレイン オスモメーター（Knau
er Membrane Osmometer）型:1.00メンブレイン：シュラ
イヒャー（Schleicher）とシェール（Schull） 型:R52 溶媒:0.05M NaCl pH7.5 温度:21℃ 結果：すべての型のインシュリンを濃度4mg/mlで測定す
る。 第 １ 表 インシュリンの型 分子
量 k ダル
トン ヒト 2Zn インシュリン 36±
２ ヒト Zn不含有インシュリン 29±
１ Zn不含有B27Gluヒトインシュリン 22±
１ − − B12Ileヒトインシュリン 17±
１ − − B27Glu,A21Aspヒトインシュリン 8±
１ − − B9Asp,B27Gluヒトインシュリン 6±
１ − − B9Aspヒトインシュリン 6±
１ − − B9Asp,B27Glu,A21Aspヒトインシュリン 6
±１ − − B9Asp,B27Glu,A8Hisヒトインシュリン 9±
３ − − B10Aspヒトインシュリン 12±
１ − − B28Aspヒトインシュリン 9±
２ 上記第１表から明らかなようにヒトインシュリン類似
体はヒトインシュリンと比較して著して低い分子量を有
し、このことは二量体、四量体または六量体への自己会
合が著しく低いかまたは幾つかの場合には欠除すること
もあることを意味する。 上記第２表から明らかなように注射部位からインシュ
リン類似体が50％消失するまでの時間はヒトインシュリ
ンと比較して実質的に短縮される。 インシュリン類似体の生物学的効力はヒトインシュリ
ンと匹適するかまたは若干減少するだけである。
【図面の簡単な説明】
第１図は例１においてＢ（１−29）−Ala−Ala−Lys−
Ａ（１−21）ヒトインシュリンをエンコードする合成遺
伝子の構築例を示す模式図、 第２図はpKFN27の構築例を示す模式図、 第３図はpKFN9の構築例を示す模式図、 第４図はpKFN37の構築例を示す模式図、 第５図はpKFN43の構築例を示す模式図 を表わす。
Ａ（１−21）ヒトインシュリンをエンコードする合成遺
伝子の構築例を示す模式図、 第２図はpKFN27の構築例を示す模式図、 第３図はpKFN9の構築例を示す模式図、 第４図はpKFN37の構築例を示す模式図、 第５図はpKFN43の構築例を示す模式図 を表わす。
フロントページの続き
(72)発明者 クイェルド ノルリス
デンマーク国，デーコー−2900 ヘレル
プ，アールマンス アレ 34
(72)発明者 モゲンス トリエル ハンセン
デンマーク国，デーコー−3540 リン
ゲ，モセバング ９
(56)参考文献 「生化学辞典」東京化学同人（1984年
４月10日，第１版）Ｐ．133−134
「日経バイオテクノロジー最新用語辞
典」（昭60．７．25，第１版）Ｐ．250
−251 「蛋白工学」の項
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ヒトインシュリンのアミノ酸配列中で、Ｂ鎖の９位
のアミノ酸残基（B9）、10位のアミノ酸残基（B10）、1
2位のアミノ酸残基（B12）、27位のアミノ酸残基（B2
7）及び28位のアミノ酸残基（B28）の内、少なくとも１
個のアミノ酸残基が天然にその位置に存在するアミノ酸
残基とは異るアミノ酸残基により置き換えられており、
所望によりさらに、Ａ鎖の８位のアミノ酸残基（A8）及
び21位のアミノ酸（A21）の内、少なくとも１個のアミ
ノ酸残基が天然にその位置に存在するアミノ酸残基は異
るアミノ酸残基により置き換えられており、該置換の生
味機能が中性pHにおいてヒトインシュリンの電荷より大
きな陰電荷を分子に与えるものであり、ただしＢ（９）
位のアミノ酸残基がLeuであり、Ｂ（10）位のアミノ酸
残基がAsnもしくはLeuでありまたはＢ（12）位のアミノ
酸残基がAsnである場合には、残りのアミノ酸残基の少
なくとも１つがインシュリン分子中のその位置でヒトイ
ンシュリンのアミノ酸残基と異なる、ヒトインシュリン
の生物学的活性を維持しており、且つ自己会合傾向がヒ
トインシュリンよりも低下しているヒトインシュリン類
似体。 ２．置換後のアミノ酸残基がAsp,Glu,Ser,Thr,His及び
／又はIleである、請求項１に記載のインシュリン類似
体。 ３．置換後のアミノ酸残基がAsp及び／又はGluである、
請求項１又は２に記載のインシュリン類似体。 ４．B9,B10,B12,B27及びB28のアミノ酸残基の少なくと
も１つが、その位置に天然に存在するアミノ酸残基とは
異る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインシュリ
ン類似体。 ５．B9,B12,B27及びB28のアミノ酸残基の少なくとも１
つが、その位置に天然に存在するアミノ酸とは異る、請
求項１〜４のいずれか１項に記載のインシュリン類似
体。 ６．B28のアミノ酸残基がAsp又はGluであり、そして他
のアミノ酸残基がヒトインシュリン分子中のものと同一
である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインシュ
リン類似体。 ７．B27のアミノ酸残基がGluであり、そして他のアミノ
酸残基がヒトインシュリン分子中のものと同一である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のインシュリン類似
体。 ８．B27のアミノ酸残基がGluであり、A21のアミノ酸残
基がAspであり、そして他のアミノ酸残基がヒトインシ
ュリン分子中のものと同一である、請求項１〜３のいず
れか１項に記載のアミノ酸類似体。 ９．B27のアミノ酸残基がGluであり、A21のアミノ酸残
基がAspであり、B9のアミノ酸残基がAspであり、そして
他のアミノ酸残基がヒトインシュリン分子中のものと同
一である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインシ
ュリン類似体。 １０．B9のアミノ酸残基がAspであり、そして他のアミ
ノ酸残基がヒトインシュリン分子中のものと同じであ
る、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインシュリン
類似体。 １１．A8のアミノ酸残基がHisであり、B9のアミノ酸残
基がAspであり、B27のアミノ酸残基がGluであり、そし
て他のアミノ酸残基がヒトインシュリン分子中のものと
同じである、請求項１又は２に記載のインシュリン類似
体。 １２．B9のアミノ酸残基がAspであり、B27のアミノ酸残
基がGluであり、そして他のアミノ酸残基がヒトインシ
ュリン分子中のものと同じである、請求項１〜３のいず
れか１項に記載のインシュリン類似体。 １３．B12のアミノ酸残基が11eであり、そして他のアミ
ノ酸残基がヒトインシュリン分子中のものと同じであ
る、請求項１又は２に記載のインシュリン類似体。 １４．B10のアミノ酸残基がAspであり、そして他のアミ
ノ酸残基がヒトインシュリン分子中のものと同じであ
る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインシュリン
類似体。
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