CS275613B6 - Process for preparing insulin analogs - Google Patents

Process for preparing insulin analogs Download PDF

Info

Publication number
CS275613B6
CS275613B6 CS866310A CS631086A CS275613B6 CS 275613 B6 CS275613 B6 CS 275613B6 CS 866310 A CS866310 A CS 866310A CS 631086 A CS631086 A CS 631086A CS 275613 B6 CS275613 B6 CS 275613B6
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
asp
glu
human insulin
insulin
ala
Prior art date
Application number
CS866310A
Other languages
English (en)
Other versions
CS8606310A2 (en
Inventor
Jens Jorgen Veilgaard Brange
Kjeld Norris
Mogens Trier Hansen
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DK395685A external-priority patent/DK395685D0/da
Priority claimed from DK467785A external-priority patent/DK467785D0/da
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of CS8606310A2 publication Critical patent/CS8606310A2/cs
Publication of CS275613B6 publication Critical patent/CS275613B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

(57) Anotace :
l?ešenl se týká způsobu výroby insulinového analogu obecného vzorce I, kde X znamená zbytek aminokyseliny lidského insulinu nebo zbytek odlišné aminokyseliny a to v poloze A8, A9, AlO, A13, A21, B2, B5.B9, BlO, Bl2, B14, B16, B17, B18, B2O, B26, B27 a 1 B28, za předpokladu, alespoň jeden zbytek ve významu X ja odlišný v příslušné poloze od zbytku v molekule insulinu a v případě, že X v poloze A8 je His nebo Phe,
X v poloze A21 je Asp, X v poloze B5 je Ala, X v poloze B9 je Leu, X v poloze BIO je Asn nebo Leu, X v poloze Bl2 je Asn nebo X v poloze B26 je Ala, pak alespoň jeden ze zbývajících zbytků X je odlišný od zbytků aminokyselin v lidském insulinu v dané poloze molekuly lidského insulinu a mimoto z N-terminálniho a/nebo z C-terminálniho zakončeni řetězce A- a/nebo řetězce B může být odstraněn jeden nebo větši počet zbytků aminokyselin, tím, že se uvede do reakce prekursor insulinu s esterem L-threoninu za přítomnosti trypsinu nebo derivátu trypsinu s následnou přeměnou takto získaného threoninovóho esteru analogu lidského insulinu na analog lidského insulinu obecného vzorce I hydrolýzou a analog obecného vzorce I se z reakčni směsi izoluje.
ČS 275613 B6 .Z
CS 275513 B6
Vynález se týká způsobu výroby analogů insulinu, a to lidského insulinu, který má po podkožním podání rychlý nástup účinku. Získané roztoky insulinu, vhodné pro injekční podáni obsahuji shora uvedený analog.
Při léčbě cukrovky již bylo navrhováno mnoho typů insulinových přípravků. Některé z těchto prostředků mají rychlý účinek, jiná máji účinek více nebo méně prodloužený.
Insulinové preparáty a rychlým nástupem účinku Je možno užít v akutních situacích, jako jsou například hyperglykemické koma, nutnost chirurgického zákroku, těhotenství a závažné infekce. Mimoto Je možno opakovanými dávkami rychle účinkujícího insulinu několikrát denně často zvládnout cukrovku, u niž bylo těžké léčebného efektu dosáhnout při použiti insulinu s prodlouženým účinkem,
V posledních letech vzniká snaha zajistit takovou léčbu insulinem, která by pokud možno napodobovala vylučováni insulinu -buňkami zdravého organismu, aby totiž k uvolněni insulinu docházelo v závislosti na Jídle při zachováni stélé bazálni hladiny insulinu. Klinická zkoumáni prokázala, že Je diabetikovi možno zajistit téměř normálni koncentrace insulinu i glukózy jednou denní injekci insulinu s dlouhodobým účinkem k pokryti bazálni potřeby s injekčním doplněním malých množství Insulinu s rychlým nástupem účinku před hlavními jidly.
Insulinová deriváty s rychlým nástupem účinku Je rovněž možno podávat ve směsi s insulinovými deriváty se středně dlouhou nebo prodlouženou dobou účinku při léčbě diabetiků, jejichž stav vyžaduje silnější počáteční účinek kromě středně dlouhého a prodlouženého účinku.
Insulinové deriváty s rychlým nástupem účinku Je možno taká použít ve formě kontinuální infuse.
Po podkožní injekci insulinu s rychlým účinkem bylo možno pozorovat na počátku zpomalenou absorpci, jak bylo popsáno v publikaci Binder, Diabetes Care 7, č. 2 (1984), str. 188 až 199. Toto počáteční zpožděni absorpce, které má za následek pomalejší nástup účinku je však nežádoucí v případě, že je zapotřebí přesného řízeni metabolismu. Smísením insulinových roztoků s rychlým účinkem a insulinových roztoků z prodlouženým účinkem může mimoto dojit ke zpomalenému vstřebáváni insulinu s rychlým účinkem.
□e tedy zřejmé, že by bylo zapotřebí získat insulinové roztoky s rychlým účinkem a s rychlejším nástupem účinku po podkožní injekci se současnou zlepšenou mlsitelnosti s injekčními prostředky insulinu s protrahovaným účinkem.
Další nevýhodou známých insulinových roztoků s rychlým účinkem je tendence insulinu k tvorbě fibril a ke srážení z insulinových roztoků v průběhu jeho kontinuálního přivádění, Čimž dochází k ucpáni mechanických části a katetrů.
Mimoto by také bylo zapotřebí nalézt další insulinové přípravky pro léčbu nemocných, resistentnich proti normálnímu insulinu.
Předmětem vynálezu Je způsob výroby nového insulinového roztoku s rychlým účinkem S jednou nebo větším počtem následujících zlepšených vlastností:
1) rychlejší nástup účinku po podkožní injekci nebo po podáni jinou cestou,
2) zlepšená misitelnost s insulinovými prostředky s protrahovaným účinkem,
3) snížená tendence k vytvářeni fibril v případě, že se tohoto prostředku užije v implantovatelném přívodním systému a
4) použitelnost pro léčbu resistentnich nemocných (nizká afinita k již existujícím protilátkám).
Shora uvedeného cíle je možno dosáhnout při použití nového analogu lidského insulinu, který je možno získat způsobem podle vynálezu.
Byla již popsána dlouhá řada insulinových analogů. Mffrku a dalši v Hoppy-Seyler's Z. Physiol. Chem. 3S0 (1979), 1619 až 1632 popisuji syntézu analogů lidského Insulinu, která se liši od liského insulinu náhradou Jediné aminokyseliny v polohách 2, 5, 6, 7, 8 a 11 řetězce A a 5, 7, 13 a 16 řetězce B a zároveň poskytují možnost nových pohledů na vztahy mezi strukturou a účinností insulinu. V průběhu dalších studii byly modifikovány hlavni oblasti insulinu, které se váži na receptory [b(22)-B(26)J , aby bylo možno sledovat vliv těchto změn na účinnost vazby na receptory. Nové analogy insulinu však neměly vlastnosti, požadované uvedenými autory.
CS 275613 06
3θ známo, že insulinové deriváty, převedené na sulfát mají nižší tendenci k tvorbě fibril, jak bylo popsáno v publikaci Albisser a další, Desired Characteristic9 of insulin to be ušed in infusion pumpa v Guerigulan O.L. a další, US Pharmacopeial Convention, Rockwille, Maryland, str. 84 až 95 a mají malý antigenni účinek. Tyto typy insulinů jsou však heterogenní směsi alespoň devíti různých insulinových derivátů, které obsahuji průměrně 4,5 sulfátových esterových skupin v molekule. Sulfátované insuliny máji mimoto sníženou účinnost, ktsrá tvoři pouze přibližně 20 % účinnosti nativního insulinu. Dalši nevýhodou těchto derivátů ve srovnání s nativním insulinem je skutečnost, že zbytečně obsahuji zbytky aminokyselin, které jsou chemicky modifikovány, tj. aminokyseliny, které se v přírodním prostředí nevyskytuji.
Vynález si klade za úkol navrhnout způsob výroby takových analogů insulinu, které by byly homogenní, měly by vyšši biologickou účinnost než sulfatované Insuliny a mimoto by měly obsahovat pouze přírodně se vyskytující aminokyseliny.
Pod pojmem insulinové analogy sa v průběhu přihlášky rozumí látky s molekulovou strukturou, podobnou struktuře lidského insulinu s obsahem disulfidových můstků mezi A(7)Cys a B(7)Cys a mezi A(20)Cys a B(19)Cya a vnitřního disulfidového můstku mezi A(6)Cys a A(ll)Cys a 8 insulinovým účinkem.
Vynález je založen na překvapujícím zjištěni, že některé analogy insulinu, v nichž alespoň jeden zbytek aminokyseliny v lidském insulinu byl nahrazen přírodně se vyskytujícím zbytkem aminokyseliny mají požadovaný rychlý účinek.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat analogy lidského insulinu s rychlým účinkem, vytvořené náhradou jednoho nebo většího počtu aminokyselinových zbytků v molekule lidského insulinu přírodně se vyskytujícím zbytkem aminokyseliny, výsledný analog má menší sklon k samovolné tvorbě dimerů, tetramerů, hexamerů nebo polymerů a má stejný nebo vyšši negativní náboj při neutrálním pH než lidský insulin.
Aby bylo možno uskutečnit menši sklon k samovolné tvorbě dimerů, tetrsmerů, hexamerů, nebo polymerů, některé zbytky aminokyselin v lidském insulinu se s výhodou nahradí hydrofilnějšími zbytky aminokyselin. Také náhrada větším zbytkem vede v některých polohách ke sníženi sklonu k samovolné tvorbě dimerů, tetramerů, hexamerů, polymerů.
Předmětem vynálezu je způsob výroby insulinového analogu obecného vzorce I, kde
X znamená zbytek aminokyseliny lidského insulinu nebo zbytek odlišné aminokyseliny, a to v poloze
A8 His, Gly, Gin, Glu, Ser, Asn, Asp nebo Pro,
A9 Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gin, Asn, Ala nebo Pro,
A1O Ser, Leu, Pro, Val, His, Ale, Glu, Asp
A13 Pro, Ser, Val, Arg, His, Ala, Glu, Asp
A21 Asp, Glu, Ser nebo Thr,
Bl Glu, Asp, Thr, Ser nebo Gly,
82 Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly,
B5 Glu, Asp, Thr, Ser, Gin nebo Asn,
B9 Asp, Pro, Glu, Ile, Leu, Val, His, Thr,
BIO Asp, Arg, Glu, Αβη, Gin, Thr nebo Ser,
B12 Ile, Tyr, Asp nebo Glu,
B14 Glu, Asp, Asn, Gin, Ser, Thr nebo Gly
B16 Asp, Glu, Gin, Asn, Ser, Thr, His nebo
Bl7 Ser, Thr, Asn, Gin, Glu, Aap nebo His,
B18 Ser, Thr, Asn, Glu, Gin, Asp nebo His,
B20 Gin, Ser, Asn, Asp, Glu nebo Arg,
Thr, Gin nebo Asn,
Thr, Gly, Gin nebo Asn,
Gin, Ser nebo Asn,
Gin, Asn, Met, Tyr, Trp, Phe nebo Lys,
Arg,
B26, B27 a B28 Asp nebo Glu, za předpokladu, alespoň jeden zbytek ve významu X je odlišný v příslušné poloze od zbytku v molekule insulinu a v případě, že X v poloze A8 Je His nebo Phe,
CS 275513 85
X v poloze A21 je Asp,
X v poloze B5 je Ala,
X v poloze B9 je Leu,
X v poloze BIO je Asn nebo Leu,
X v poloze Bl2 je Asn nebo X v poloze B26 je Ala, pak alespoň jeden ze zbývajicich zbytků X je odlišný od zbytků aminokyseliny v lidském insulinu v dané poloze molekuly lidského insulinu a mimoto z N-terminólniho a/nebo z C-terminálniho zakončeni řetězce A- a/nebo řetězce B může být odstraněn jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin.
Ketězec A
GlylleValGluGlnCysCys XXX ČysSer X TyrGlnLeuGluAsnlyrCys X
2 3 4 5 6 |7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19|2O 21 i ř
X X AsnGln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu X X X Cys X GluArgGlyPhePhe X X · X LysThr
2 3 4 5 ó 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (I) řetězec B vyznačený tim, že se uvede do reakce prekursor insulinu obecného vzorce IX, v němž c| ε» x
Q znamená peptidový řetězec s obsahem n přírodně se vyskytujících aminokyselin,
R znamená Lys nebo Arg, znamená celé čislo 0 až 33, znamená 0 nebo 1 a má shora uvedený význam, s esterem L-threoninu za přítomnosti trypsinu nebo derivátu trypsinu s následnou přeměnou takto získaného threoninového esteru analogu lidského insulinu na analog lidského insulinu obecného vzorce I hydrolýzou a analog obecného vzorce I se z reakčni směsi izoluje.
3e také možno postupovat tak, že se uvede do reakce prekursor obecného vzorce XXI, v němž
V a S znamenají Lys nebo Arg a
X má význam uvedený v bodu 1,
Řetězec A
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 13 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 (II)
Řetězec B
Řetězec A
X X AsnGln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu XXX Cys X GluArgGlyFhePhe XXX LysThr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 .11 13 13 14 15 ló 17 13 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (III)
Řetězec B s trypsinem a karboxypeptidázou E ve vodném roztoku a analog lidského insulinu se z reakčni směsi izoluje.
S výhodou je alespoň většina aminokyselinových zbytků, užitá k substituci hydrofil nějši než zbytek aminokyseliny v molekule lidského insulinu a s výhodou jsou všechny aminokyselinové zbytky, užité k substituci hydrofilnějši než odpovídajíc! aminokyselinové zbytky lidského insulinu.
Pokud jde o hydrofilnost, jsou podrobnosti uvedeny v publikaci C. FrCmmel, 3. Theo Biol. 111, (1984), 247 až 260 (tabulka 1).
Ve shora uvedeném obecném vzorci I je s výhodou nejvýš sedm zbytků aminokyselin odlišných od zbytků aminokyselin v téže poloze v molekule lidského insulinu. Mejvýhod— nějši počet odlišných zbytků aminokyselin je 2 až 4.
Νονό analogy lidského insulinu s výhodou obsahuji Asp a/nebo Glu mi3to jedné nebo většího počtu hydroxyaminokyselin lidského insulinu nebo misto jednoho nebo většího počtu zbytků Gin a Asn v molekule lidského insulinu.
Analogy insulinu, získané způsobem podle vynálezu je možno zpracovávat na injekční roztoky s insulinovým účinkem. Injekční insulinové roztoky podle vynálezu obsahuji analo· gy lidského insulinu nebo některou z jejich soli, přijatelných z farmaceutického hlediska ve vodném roztoku, s výhodou za neutrálního pH. Vodné prostředí může být isotonické například přidáním chloridu sodného a glycerolu. Z pufrů je možno užit například acetáto vý nebo citrátový pufr a je také možno užit konservačniho činidla, například m-kresol, fenol nebo methyl-4-hydroxybenzoát. Insulinové roztoky mohou dále obsahovat zinečnató ionty.
Analogy lidského insulinu, vyrobené způsobem podle vynálezu je možno užit misto lidského insulinu nebo místo insulinu vepře pro dosaženi rychlého účinku insulinu.
Prekursory shora uvedeného obecného vzorce lij které,jeou výchozími produkty pro tuto reakci je možno připravit způsobem, který je analogický způsobu, popsanému v evropském patentovém spisu č. 01S3529A. Při prováděni tohoto způsobu se postupuje tak, že se sled DNA, který je kódem pro požadovaný prekursor veleni do vhodného prostředku pro expresi, který se pak přenese do kvasinek, čimž dojde k příslušné expresi a k vylučováni požadovaného prekursoru se správně uloženými disulfidovými můstky. Produkt exprese je pak možno izolovat ze živného prostředí.
Prekursory shora uvedeného vzorce III je možno získat způsobem, který Je analogický způsobu popsanému v evropské patentové přihlášce č. 86302133.3. Při prováděni tohoto způsobu se sled ONA, který je kódem pro prekursor včlení do vhodného prostředku pro expresi z kvasinek, prostředek se pak přenese do kvasinek, schopných exprese, čimž dojde k vylučováni produktu se správně uloženými disulfidovými můstky do prostředí, v němž jsou kvasinky pěstovány.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat nové insulinové analogy z jejich prekursorů při použiti DNA, která je kódem pro tyto nové prekursory, při použiti prostředků pro expresi s obsahem této DNA a kvasinkových kmenů, transformovaných těmito prostředky. Názvosloví
Zkratky, jichž je v průběhu přihlášky užito pro aminokyseliny, jsou zkratky, doporučené v □, Biol. Chem. 243, 1968, 3558. Aminokyseliny máji konfiguraci L.
Pokud jde o symboly, užité v popise vynálezu, znamená B(l-29) zkrácený řetězec B lidského insulinu od mista BlPhe do B29Lys a A(l-2l) znamená řetězec A lidského insulinu.
Substituce, provedené podle vynálezu jsou označovány před názvem insulin. Příkladem může být označeni B27Glu-lidský insulin, což znamená molekulu lidského insulinu v němž'Glu byl včleněn na misto Thr v poloze 27 řetězce B. B27Glu, B9Asp-lidský insulin znamená analog lidského insulinu, v němž Glu byl užit místo Ther v poloze 27 řetězce B a Asp byl užit misto Ser v poloze 9 řetězce B, B27Glu, B(1-29)Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidský insulin znamená prekursor insulinového analogu (vzorec II), v němž Glu byl užit místo Th v poloze 27 ve zkráceném řetězci B, přičemž řetězec B(l-29) a řetězec A jsou spolu spojeny peptidovým sledem Ala-Ala-Lys. Neni-li uvedeno jinak, rozumí se, že B(l-29) a řetězec A(l-21) jsou spolu spojeny disulfidovými můstky mezi A(7)Cys a B(7)Cys a mezi A(20) Cys a B(19)Cys jako v lidském insulinu a A-řetězec obsahuje vnitřní disulfidový můstek mezi A(6)Cys a A(ll)Cys.
3ak již bylo uvedeno, snahou vynálezu je navrhnout složení insulinových roztoků . pro injekční podáni, ve snaze o vyřešeni tohoto úkolu bylo nejprve zjištěno, že existuje podstatný rozdíl mezi insulinem v depotni formě nebo vo formě bolusu mezi insulinem v cirkulaci, rozdíl spočívá především v koncentraci tohoto insulinu. Insulin v krevním oběhu je vysoce zředěn a dosahuje ředění ÍO3·^ až 10“®, přičemž běži o monomer, nanejvýš se snad určité množství nachází ve formě dimeru. Daleko koncentrovanější insulin se nachází v B-buňkách slinivky břišní ve skladované formě a v roztoku, v němž se obvykle podává, se nachází většinou, i když ne zásadně v neaktivní hexamerni formě, například jako známý 2-zinkbexamer.
□e také známo, že lidský insulin se v roztoku vyskytuje v celé řadě molekulárních forem, a to jako monomer, dimer, tetramer a hexamer, jak bylo popsáno v publikaci Blundell a dalši, Advances in Protein Chemistry, Academie Press, New York and London, Sv.
26, str. 279 až 330, 1972, přičemž oligomerni formy jsou v případě vysokých koncentraci insulinu příznivější, monomer je pak účinnou formou insulinu.
Tetramer a hexamer nejsou účinné formy, dimer může být aktivní. Skutečnost, že se pomalejší absorpce, popsaná například v publikaci Binder, Diabetes Care 7, č. 2, 1984 často vyskytuje u koncentrovanějšioh roztoků, určených k pomalému uvolňováni insulinu je patrně možno vysvětlit tim, že je třeba určité doby k přeměně z hexameru, tetrameru a dimeru na účinnou monomerni formu.
Analogy lidského insulinu, vyrobené způsobem podle vynálezu jsou zajímavé tim, že rychlého účinku se dosahuje molekulární strukturou, z niž se netvoří snadno dimer, tetra· mer, hexamer nebo polymer, to znamená, že běží o látky se sníženou tendenci k samovolné tvorbě dimeru, tetrameru, hexameru nebo polymeru, a to af již v přítomnosti nebo v nepřítomnosti zinečnatých iontů, podstatných mezidruhových rozdílů mezi sledem aminokyselin, které v molekule insulinu existuji bylo již dávno usuzováno, že ne všechny zbytky aminokyselin, přítomné v molekule insulinu jsou zásadní pro dosaženi insulinového účinku a také to', že některé aminokyselinová zbytky, které nejsou podstatné pro dosažení insulinového účinku jsou důležité pro fyzikální vlastnosti molekuly insulinu. 3e například známo, že v případě insulinu morčete nedochází k tvorbě dimerů. Také sulfatovaný insulin a tetranitrotyrosininsulin nedimerizuje. 3e zřejmé, že celou řadu zbytků aminokyselin v molekule lidského insulinu je možno zaměnit bez podstatného poklesu insulinového účinku. Substituce ami nokyselin, prováděná způsobem podle vynálezu tedy směřuje k zamezení tvorby dimerů, tetramerů, hexamerů a polymerů bez ovlivněni insulinového účinku takto modifikované molekuly.
Zbytky aminokyselin v těch polohách řetězce A a B obecného vzorce I, v nichž může dojit k substituci nejsou zásadně důležité pro dosaženi insulinového účinku, jsou však důležité pro schopnost lidského insulinu tvořit dimery, tetramery, hexamery a polymery a pro rozpustnost lidského insulinu. Substituce, k nimž dochází pro provádění způsobu podle vynálezu mají za následek zábranu styčných mist mezi atomy v sousedních molekulách insulinu, která za běžných okolností usnadňuji tvorbu insulinových dimerů, tetramerů, hexamerů nebo polymerů,
Dak bylo možno očekávat, změny v některých polohách řetězce lidského insulinu jsou pro shora uvedené účely účinnější než změny jiné. Znamená to, že jediná substituce v řetězce B může k uvedenému účelu dostačovat, kdežto na jiných mistech může být zapotřebí k dosaženi téhož účinku provést alespoň dvě substituce. Substituce v řetězci A slouží převážně k zlepšeni rozpustnosti disociované molekuly. Výhodnými polohami pro substituci zbytků aminokyselin jsou polohy B9, B12, BIO, B26 a B27 jako takové nebo ve vzájemné kombinaci nebo spolu s dalši substituci zbytku aminokyselin na Jiných polohách molekuly lidského insulinu, jak je znázorněno v obecném vzorci I.
Substituce, spočívající v zavedeni zbytků negativnějších aminokyselin na místo původních bez náboje n'ebo s positivním nábojem má za následek negativnější náboj celé molekuly insulinu při neutrálním pH, přičemž se snižuje isoelektrický bod ve srovnání s lidským insulinem. 3e charakteristické, že analogy lidského insulinu, získané způsobem podle vynálezu mají tentýž nebo negativnější náboj při neutrálním pH a nižši isoelektrický bod než molekula lidského insulinu.
Obvykle je možno získat zavedením jedné nebo většího počtu negativněji nabitých zbytků aminokyselin misto nenabitých nebo positivně nabitých zbytků aminokyselin negativnější náboj celá molekuly insulinu při neutrálním pH a současně je možno snížit isoelektrický bod ve srovnání s molekulou lidského insulinu. 3e tedy charakteristické,
CS 275513 B6 že molekula insulinu po substitucí, provedené způsobem podle vynálezu za získáni příslušného analogu má tentýž nebo negativnější náboj při neutrálním pH a nižši isoelektrický bod než molekula lidského insulinu.
□edna až tři substituce obvykle dostačí k získáni analogu s rychlejším účinkem a tyto typy substituce tedy představuji výhodné provedení způsobu podle vynálezu. Při použití dvou až tři substituci je možno dosáhnout také zlepšené mísitelnosti s chráněnými insulinovými prostředky. 3e však zřejmé, že cíle vynálezu je možno dosáhnout i při větším počtu substituci, přičemž je současně možno dosáhnout ještě sekundárních žádoucích vlastností výsledného produktu.
Zejména může při další substituci, například 4 nebo 5 zbytky dojit získáni insulinového analogu, který má také menši sklon k tvorbě fibril, což je vlastnost zvláště žádoucí v případě, že je výsledný insulinový roztok určen k infusi. Obvykle však nemá být zapotřebí provést vice než 7 substituci pro získání insulinového analogu způsobem podle vynálezu. Výhodný počet je 2 až 4 substituce,
V následujícím textu znamená signální sled MF«Cl celý signální sled, kdežto “signální sled MF«ťl bez Glu-Ala-Glu-Ala- znamená sled, z něhož byly odstraněny na C-terminálnim zakončeni zbytky aminokyselin ve sledu Glu-Ala-Glu-Ala.
Způsob podle vynálezu bude osvětlen následujícími příklady.
Přiklad 1
Konstrukce syntetického genu, který je kódem pro B( l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidský insulin
Strukturální gen pro B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidský insulin byl zkonstruován při použiti kodonů z kvasinek následujícím způsobem:
Následujících 10 oligonukleotidů bylo syntetizováno na automatickém syntezátoru DNA při použiti metody na nosiči z porézního skla a při použiti fosforamiditu, jak bylo popsáno v publikaci S.L, Beucage a M.H. Carutherse (1981) v Tetrahedron Letters 22, str. 1859 až 1869:
I. AAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC
35- mer
II. AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA
36- mer
III. TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT
43-mer
IV. GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC
42-mer
V. TCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC
32-mer
VI. ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT
34-mer
VII. GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT
37- mer
VIII. TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC
37-mer
IX. TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT
36-mer
X: CTAGAGCCTGGGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG 33 mer
Ze shora uvedených 10 oligonukleotidů bylo vytvořeno 5 duplexů A-E tak, jak jsou uvedeny na obr. 1.
pmolů každého z duplexů A až E bylo vytvořeno z odpovídájících párů 5'-fosforylo váných oligonukleotidů I až X zahříváním 5 minut na 90 °C s následným zchlazením na teplo tu místnosti na dobu 75 minut. 33-mer (X) v duplexu E nebyl fosforylován na 5*-zakončeni, aby nedošlo k· dimerizaci na komplementárních zakončeních jednotlivých řetězců po štěpeni enzymem Xbal. Syntetický gen byl po smiseni pěti duplexů a následným působením 74-ligázy isolován jako pás o 182/183 párech bázi po elektroforéze ligečni směsi na 2% agarózovóm gelu.
Takto získaný syntetický gen je znázorněn na obr. 1
Syntetický gen byl navázán na fragment Kpnl-EcoRl o 4 kilobázich a na fragment Xbal -Kpnl o 8 kilobázich z pMT644 a na fragment EcoRlHgal 0 0,3 kilobázich z pKFN9 za vzniku následující struktury: TPIp-MF»6l signální sled-B(l-29)-Ala-Ala-Lye-A(l-21)-TPlY.
Plasmid pMT644 obsahuje sled DNA TPIp-MF«Cl signální sled-B(1-29)-Α(1-21)-ΤΡΙγ. Konstrukce plasmidu kPFN9 bude dále popsána.
Směs pak byla užita pro transformaci kompetentního kmene E. coli (r“, m+) (MTI72), 30 kolonii odolných proti ampicilinu bylo přeneseno na plotny s obsahem minimálního prostřed! M9 (T.Maniatis a další, Molecular Clonlng, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, str. 62), čimž bylo získáno 8 Leu+ kolonii. Pak bylo provedeno analyzováni sledu způso32 bem podle Maxama a Gilberta, bylo prokázáno, že sled P-Xbal-EcoRl-fragmentu je důkazem toho, že tři uvedené plasmidy obsahovaly gen s požadovaným sledem. 3eden z těchto pla3midů, pKNF27, byl zvolen pro ďalšl použiti.
Konstrukce plasmidu kPNF27 je znázorněna na obr. 2.
Konstrukce plasmidu pKFN9
Tento plasmid byl konstruován proto, aby bylo možno získat plasmid s místem pro působeni Hgal přímo za ukončením signálního sledu MF<41, Plasmid pMT544 byl rozštěpen enzymem Xbal a ze zakončeni 3'- bylo odštěpeno přibližně 250 bázi působením ExoIII nukleázy, současně byl plasmid rozštěpen působením enzymu Xbal. Pak byl připojen k DNA, která částečně obsahovala pouze Jeden řetězec 32-mer se sledem GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC s obsahem místa pro působeni enzymu Hgal. Působením Klenowovy polymerázy pak byla získána cirkulárni DNA s dvojitým řetězcem za současného působeni T4-ligázy. Po transformaci kolonii E. coli (r, m+) (MT 172) s obsahem plasmidu po mutaci bylo možno tyto kolonie 32 identifikovat hybridizací kolonii s 5*- P-označeným 32-merem. Výskyt nového mista pro působení Hgal bylo možno ověřit štěpením (EcoRi +Hgal, Hind3+Hgal). Po retransformaci byla vybrána čistá mutanta“ pKFN9 pro další použiti. Konstrukce pKFN9 je znázorněna na obr, 3.
Přiklad 2
Výroba B27Glu lidského insulinu
B27Glu-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (l-21)-lidského insulinu působením Thr-Obu a acidolyzou získaného esteru threoninu působením kyseliny trifluoroctóvé. Výroba se uskutečňuje v následujících stupních:
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulin
Plasmid kPKNF27 byl linearizován v jediném mistě působeni Xbal směrem dolů od inzulínového syntetického genu pro prekursor. Aby nedošlo ke zničeni mista působeni Xbal při vyplnění v dalším stupni, byl na linearizovaný plasmid na každém konci navázán vazný sled s dvojitým řetězcem, a to Xbal-Hind3 19-mer se sledem
Xbal Hind3
CTAGAAGAGCCCAAGACTA
TTCTCGGGTTCTGATTCGA
Linker byl fosforylován na v poloze 5'na jednoduchém zakončeni po působeni enzymu Xbal, byl však ponechán v nefosforylovaném stavu na zakončení Hind3, takže nemohlo dojit k polymeraci tohoto řetězce v průběhu vazby a cirkularizace DNA (obr.4).
5'-Mononukleotidy byly odstraněny z 3'-zakončení získané lineární DNA s dvojitým řetězcem působením nukleázy ExoIII. Působení nukleázou ExoIII bylo prováděno při teplotě 23 °C za podmínek, při nichž se z každého 3'-zakončenl DNA odstraní přibližně 250 nukleotidů [L.Guo a R.Wu (1983), Methods in Enzymology 100, str. 60 až 96j.
5'-Fosforylovený 25-met se sledem d(GTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC) se pak včlení do místa mutace. Po vyplněni působením Klenowovy polymerézy za přítomnosti T4-ligázy se ONA s dvojitým řetězcem štěpí působením Xbal. Pak se působením T4-ligázy vytvoří heteroduplexni cirkulárni DNA s mutaci jednoho řetězce.
Směs po ligaci byla užita k transformaci v E. coli (r , m+) (MT172) za současného použiti selekce na odolnost proti ampicilinu.
Mutanty byly identifikovány hybridizaci kolonii s 5'-32P-značeným 25-merem jako primerem mutageneze. Po retransformaci je možno prokázat, že plasmid pKNF37 z Jedné z výsledných kolonii obsahuje požadovanou mutaci, průkaz byl proveden zjištěním sledu □NA v Xbal-EcoRl-fragmentu o 0,5 kilobazich (A. Maxam a W.Gilbert (1980), v Methods in Enzymology 65, 499-560),
II. Transformace
S.· cerevisiae kmen MT663 (E2-7B X E11-3C a/z .delta tpi/delta t pi, pep 4-3/pep
4-3)‘byl pěstován na YPGal (1% Bacto extrakt z kvasnic, 2% Bacto pepton, 2% galaktóza',
1% laktát) do hustoty 0,6 při 600 nm. 100 ml kultury bylo odstraněno, promyto 10 ml vody a znovu uvedeno do suspenze v 10 ml 1,2 M sorbitolu, 25 mM Na2EDTA o pH 8,0 a 6,7 mg/ml dithiothreitolu. Suspenze byla inkubována při teplotě 30 °C 15 minut, pak byla odstraněna buňky byly znovu uvedeny do suspenze v 10 ml 1,2 M sorbitolu, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M citronanu sodného o pH 5,8, 2 mg Novozym 234. Suspenze byla inkubována 30 minut při teplotě 30 °C, buňky byly odděleny odstředěním, promyty v 10 ml 1,2 M sorbitolu a v 10 ml CAS (1,2 M sorbitolu, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris (Tris = tris(hydroxymethyl) aminomethan) při pH 7,5) a pak byly znovu uvedeny do suspenze ve 2 ml CAS, Pro transformaci bylo 0,1 ml buněk v CAS smiseno s přibližně 1 jig plasmidu pKFN37 a směs byla ponechána při teplotě místnosti 15 minut. Pak bylo přidáno 1 ml 20 % polyethylenglykolu 4 000, 10 mM CaClg, 10 mM Tris o pH 7,5 a směs byla ponechána dalších 30 minut při teplotě místnosti. Směs byla odstředěna a usazená vrstva byla znovu uvedena do suspenze v SOS (1,2 M sorbitol, 33% (obj.%) YPGaL, 6,7 mM CaCl2, 14 jjg/ml leucinu) a inkubuje se 2 hodiny při teplotě 30 °C. Suspenze se pak odstředí a usazenina se znovu uvede do suspenze v 0,5 ml 1,2 M sorbitolu, 6 ml agaru (prostředí SC, Sherman a dalši v Methods in Yaaet Genetice, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) bez leucinu, avšak s obsahem 1,2 M sorbitolu a 2,5 % agaru) při teplotě 52 °C a suspenze byla vlita na plotny s obsahem téhož tuhého agaru β obsahem sorbitolu. Kolonie transformantů byly izolovány po třech dnech inkubace při teplotě 30 °C a byly užity k založeni kultur v kapalném živném prostředí. Oeden z těchto transformantů, a to KFN40 (=MT663/pKFN37) byl užit k další charakterizaci.
III. Exprese B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulinového prekursoru
Kmen kvasinek KFN40 byl pěstován v prostředí YPD (1% extraktu z kvasnic, 2 % peptonu, (Difco Laboratories) a 2 % glukózy). 10 ml kultury uvedeného kmene bylo protřepáváno při teplotě 30 °C až do hustoty 26 při 600 nm. Po odstředění byl supernatant analyzován vysokotlakou kapalinovou chromatogrsfii v reversní fázi a byl prokázán obsah
13,5 mg/1 prekursoru.
IV. Transpeptidace
0,2 molu (47,1 g) Thr-OBu1, HOAC bylo rozpuštěno v dimethylformamidu na 100 ml roztoku, pak bylo přidáno 50 ml 76,5% (obj.%) dimethylformamidu ve vodě a 10 g surového B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidského insulinu bylo ve směsi rozpuštěno a směs byla uložena do thermostatu při teplotě 12 °C. Pak bylo přidáno 1 g trypsinu vs 25 ml 0,05 M octanu vápenatého a po 24 hodinách při teplotě 12 °C byla směs přidána ke 2 litrům ocetonu, vysrážené peptidy byly izolovány odstředěním a usušeny ve vakuu. B27Glu, BSOThr-OBu^-lidský insulin byl čištěn preparativni vysokotlakou kapalinovou chromatoCS 275513 B6 grafit na oxidu křemičitém-Cl8.
V. Přeměna na B27-lidský Insulin.
B27Glu,B30Thr-0But-lidský insulin byl rozpuštěn ve 100 ml kyseliny trifluoroctovó.
Po 2 hodinách stáni při teplotě místnosti byl roztok lyofilizován. Lyofilizovaný prášek byl rozpuštěn ve 400 ml citronanu sodného o koncentraci 47,5 mM pří pH 7. Peptidy byly vysráženy při pH 5,5 po přidáni 2,4 ml 1M ZnClg, izolovány odstředěním a usušeny ve vakuu. Produkt byl čištěn aniontoměničovou chromatografii a pak byl zbaven solí filtraci na gelu. Tímto způsobem bylo získáno 1,7 g B27-Glu-lidského insulinu.
Přiklad 3
Příprava B9Asp-lidského insulinu
B9Asp-lidský insulin byl získán transpeptidaci B9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)lidského insulinu působením Thr-0Buř a acidolysou takto získaného threoninového esteru působením kyseliny trifluoroctovó.
I. Konstrukce gehu, který je kódem pro B9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin
Tento gen byl zkonstruován stejným způsobem jak bylo popsáno pro gen, který je kódem pro B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin mutagenezou, specifickou pro určitou polohu při použiti pKFN27 a za řízeni 23-merem d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG).
Bylo prokázáno, že plasmid pKFN38 obsahuje požadovanou mutaci.
II. Transformace
Plasmid pKFN38 byl užit k transformaci kmene S. cerevisiae MT653 stejným způsobem jako v přikladu 2 II, byl získán transformant KFN41.
III. Exprese B9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Kmen kvasinek KFN41 byl pěstován na prostředí YPD, jak bylo popsáno v přikladu 2,
III. V supernanantu bylo nalezeno 2,5 mg/1 analogu prekursoru.
IV. Transpeptidace
7,4 g surového B9Asp,B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidskóho insulinu bylo podrobeno transpeptidaci způsobem podle přikladu 2,IV, čimž byl jako výsledný produkt získán B9Aep,B30Thr-0Bu''-lidský insulin.
V. Konverse
B9Asp,B3OThrOBu -lidský insulin byl přeměněn na B9Asp-lidský insulin způsobem popsaným v přikladu 2,V. Bylo získáno 0,83 g BSAsp-lidského insulinu.
Přiklad 4
Způsob výroby B9Asp,B27Glu-lidského insulinu
B9Asp,B27Glu-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B9Asp,B27Glu(Bl-21)Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidského insulinu působením Thr-OBu1 s následnou acidolysou získaného threoninového esteru působením kyseliny trifluoroctové.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B9Asp, B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin
Fragment plasmidu pKFN38 po štěpeni EcoRl-Hind3 o 367 párech bázi (přiklad 3) a fragment plasmidu pl<FN37 (přiklad 2) o 140 párech bázi Hind3Xbal se naváží na velký Xbal-EcoRl-fragment plasmidu pUC13 (tento plasmid byl zkonstruován a popsán jako v případě pUC8 a pUC9 v publikaci Vieira a dalši, Gene 19, str. 259 až 268 (1982), Směs vazbě byla užita k transformaci E. coli MT 172 a byla provedena selekce na odolnost proti ampicilinu. Z většího počtu transformantů byly připraveny plasmidy a tyto plasmidy byly analyzovány působením enzymů Pstl e HindS. Fragment Xbal-EcoRl o 0,5 kilobázich z jednoho plasmidu, v němž bylo možno prokázat správný sled míst pro působení enzymů byl navázán na fragment Xbal-Kpnl o 7,8 kilobázich a na fragment Kpnl-Eco R1 o 4,3 kilobázich, oba z plasmidu pMT644 (popsány v dánská patentové přihlášce č. 1293/84). Směs po vazbě byla užita k transformaci E. coli MT172 a kolonie byly izolovány podle odolnosti proti amplicinu. Plasmid pKFN43 z jedné z výsledných kolonii obsahoval gen pro požadovaný prekureor insulinového derivátu. Konstrukce plasmidu pKFN43 je. znázorněna na obr.5.
II. Transformace
Plasmid pKFN byl transformován v S. cerevisiae, kmen MT663 stejným způsobem jako v přikladu 2,11 a byl izolován transformant KFN44.
III. Exprese B9Asp,B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Kmen kvasinek KFN44 byl pěstován na prostřed! YPD stejně jako v přiladu 2,III.
V eupernatantu bylo prokázáno 7,3 mg/1 prekursoru insulinového analogu,
IV. Transpeptidace
12,7 g surového B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)- lidského insulinu se podrobi transpeptidaci způsobem, popsaným v přikladu 2, IV. za vzniku B9Asp,
B27Glu, B30Thr-0But-lidského insulinu.
V. Přeměna
B9Asp, B27Glu, BSOThr-OBu^lidský insulin byl převeden na B9Asp, B27Glu, B3OThrlidgký insulin a čištěn způsobem, popsaným v přikladu 2, V. Bylo získáno 1,0 g B9Asp, B27Glu-lídského insulinu.
Přiklad 5
Způsob výroby A8His, B9Asp, B27Glu-lidského insulinu
A8His, B9Asp, B27Glu-lidský insulin byl připraven transpeptidaci z 48His, B9Asp, B27Glu, B-(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského Insulinu působením Thr-0But s následnou acidolysou takto získaného threoninového esteru kyselinou trifluoroctovou podle přikladu 2.
1. Konstrukce genu, který je kódem pro A8His, B9Asp, B27Glu, B-(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (l-21)-lidský insulin.
Tento gen byl zkonstruován mutagenesi, cílenou na oligonukleotidy způsobem, popsaným v publikaci Y. Morinaga, T. Franceschini, S. Inouye a M. Inouye (1984), Blotechnology 2, 536 - 639. Plasmid, odvozený od pUCl3, který je kódem pro signální sled MG«£l a pro prekursor B9Asp, B27Glu-lidského insulinu (obr. 5), byl rozštěpen působením Hpal a Xbal. Velký fragment byl smísen s plasmidem, linearizovaným působením Ndel. Po denaturaci teplem a po zchlazeni 9měs obsahuje dvojité řetězce s mezerami s oknem'' v jednom řetězci v oblasti, která odpovídá genu pro prekursor insulinu (Hpal-Xbal). Mutagenický 37-mer d(GAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT) byl hybridisován na svrchu uvedený duplex vyplněním působením Klenowowy polymerázy s následnou vazbou. Směs byla užita k transformaci E. coli (MT172) a kolonie se podrobi selekci na odolnost proti amicilinu. Mutanty byly identifikovány hybridisacl kolonií 9 18-merem značeným radioaktivním fosforem na zakončeni 5', d(AATGCTGTCACTCCATCT). Po rétransformaci bylo možno prokázat, že plasmid z jedné z výsledných kolonii obsahoval požadovanou mutaci, zjištění bylo provedeno analýzou sledu DAN ve fragmentu Xba-I-EcoRI o velikosti 0,5 kb. Tento plasmid byl užit pro konstrukci kvasinkového plasmidu pKFN 102 způsobem, popsaným z přikladu 4 pro konstrukci plasmidu pKFN 43.
II. Transformace
Plasmid pKFNlO2 byl transformován do kmene S, cerevisiae MT663 stejným způsobem jako v přikladu 2, II a byl izolován produkt této transformace KFN109.
III. Exprese A8His, B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lya-A(l-21)-lidského insulinu.
Kmen kvasinek KFN109 byl pěstován na prostředí YPD způsobem, popsaným v příkladu
2, III. V supernatantu bylo možno prokázat 21,5 mg/1 prekursoru insulinového analogu.
IV. -V. Transpeptidace a přeměna
22,0 g surového A8His, B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidskóho insulinu bylo podrobeno transpeptidaci, přeměně a čištěni způsobem podle přikladu 2, IV-V. Tímto způsobem bylo získáno 4,0 g A8His, B9Asp, 827Glu-lidského insulinu.
Přiklad 6
Příprava Bl2Ile-lidského insulinu
Bl2Ile-lidský insulin byl připraven transpeptidaci Bl2Ile, B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu působením Thr-OBut s následnou acidolysou získaného threoninového esteru kyselinou trifluoroctovou způsobem, popsaným v přikladu 2.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro Bl2Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Fragment EcoRI-Xbal plasmidu pMT59B o velikosti 0,5 kb (konstrukce plasmidu pMT598 je popsána v zveřejněné patentové přihlášce č. 0164529A), který je kódem pro signální sled MFXíl (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) byl včleněn do fágu M13 mplO RF, rozštěpeného Xbal-EcoRI a odpovidajíci DNA s jednoduchým řetězcem byla čištěna od zbytků rekombinantniho fágu Ml3 mplO. DNA s jedním řetězcem byla hybridisována na mutagenní 27-mer NOR-92 d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC) a na universální M13 primer d(TCCCAGTCACGACGT). Pripery byly prodlouženy dNTP a Klenowovou polymerázou, vazba byla provedena T4 DNA-ligázou. Mutagenní primer KFN92 byl zvolen tak, aby došlo k odstraněni místa působeni BstNl, toto misto je jediné ve fragmentu Xba-EcoRl. Aby bylo možno provést selekci proti nemutovanému fragmentu EcoRI-Xbal, byla směs rozštěpena SstNl a postupně EcoRl a Xbal, načež byla navázána na vektor pUC13, rozštěpený EcoRl a Xbal. Z jednoho z transformentů byl zvolen plasmid pMT760, který neměl misto působeni SsNl ve sledu, který je kódem pro insulin. Požadovaný mutovaný sled byl ověřen analýzou sledu DNA podle Maxama a Gilberta. Plasmid pMT760 obsahuje sled EcoRI-Xbal o velikosti 0,5 kb, který odpovídá svrchu uvedenému témuž fragmentu z plasmidu pMT598 až na mutaci v poloze Bl2 (Val - Ile). Tento mutovaný sled byl pak přenesen do plasmidu pro expresi z kvasinek vazbou fragmentu EcoRI-Xbal o velikosti 0,5 kb plasmidu pMT760 na fragment XBal-Kpnl o velikosti 7,8 kb a na fragment Kpnl-EcoRl o velikosti 4,3 kb z plasmidu pMT644 za vzniku pMTA.
II. - V. Transformace, exprese, transpeptidace, přeměna
Plasmid pMTA byl transformován do kvasinkového kmene MTS63 způsobem, popsaným v příkladu 2, II a kmen transformantů MTA byl pěstován způsobem popsaným v přikladu 2,
III. V supernatantu bylo prokázáno 10,4 mg/1 prekursoru insulinového analogu. 10 g tohoto surového prekursoru bylo podrobeno transpeptidaci, přeměně a čištění podle přikladu 2, IV. - V. Výtěžek byl 1,3 g Bl2Ile-lidského insulinu.
Přiklad 7
Způsob výroby Bl2Tyr-lidského insulinu
Bl2Tyr-lidský insulin je možno získat transpeptidaci Bl2Tyr, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)~lldského insulinu působením Thr-OBu1 s následnou acidolysou získaného threoninového esteru kyselinou trifluoroctovou způsobem, popsaným v přikladu 2.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B12Tyr, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Gen byl zkonstruován způsobem, analogickým pro výrobu genu, který je kódem pro B12Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidskóho insulinu s tím rozdílem, že se užije primer KFN93 d(GTAGAGAGCTTCGTACAGGTGTGAGCC) misto KFN92.
II. až IV. Transformace, exprese, transpeptidace a přeměna
Stupně II a III se provádějí stejně jako v příkladu 2. V supernatantu je možno prokázat 1,7 mg/1 prekursoru insulinového analogu. Tento surový prekursor je pak možno podrobit transpeptidaci, přeměně a čištění způsobem podle přikladu 2, IV - V, čimž se ziská Bl2Tyr-lidský insulin.
Přiklad 8
Příprava BlOAsp-lidského insulinu
BlOAsp-lidský insulin byl připraven transpeptidaci BlOAsp, B(l-29)-Ala-Ala-LysA(l-21)-lidského insulinu působením Thr-OBu1· s následnou acidolysou získaného threoninovóho esteru kyselinou trifluoroctovou způsobem podle přikladu 2.
I, Konstrukce genu, který je kódem pro BlOAsp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidský insulin
Gen byl zkonstruován způsobem, analogickým způsobu výroby genu, který je kódem pro Bl2Ile, B( 1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidský insulin s tim rozdílem, že se užije primer KFN94 d(AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG) místo KFN92,
II. - V. Transformace, exprese, transpeptidace a přeměna
Stupně II-III byly provedeny způsobem podle příkladu 2. V supernatantu bylo možno prokázat 36 mg/1 prekursoru insulinového analogu. Tento surový prekursor byl podroben transpeptidaci, přeměněn a čistění způsobem podle příkladu 2, IV-V. Výtěžek byl 7,6 g BlOAsp-lidského insulinu.
Přiklad 9
Příprava B28Asp-lidského insulinu
B28Asp-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (l-2l)-lidského insulinu působením Thr-OMe s následnou hydrolýzou získaného thrloninové ho esteru při pH 8 až 12.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B28Asp, B(l-29)~Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin
Fragment EcoRl-Xbal plasmidu PMT 462 o velikosti 0,5 kb, který je kódem pro signální sled MF<C1 (mínus Glu-Ala-Glu-Ala)-8-C-A, tj. pro gen lidského proinsulinu, před nímž se nachází modifikovaný signální sled MF«Á1, byl včleněn do fágu Ml3 mplO RF rozštěpeného Xbal-EcoRl a odpovidajici DNA s jednoduchým řetězcem byla oddělena od rekombi nantního fágu Ml3 mplO, DNA s jednoduchým řetězcem byla pak jako templát hybridisována na 41-mer N0R205 d(TTCCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGAAGC) a na Ml3 universální primer d(TCCCAGTCACGACGT). Primery byly prodlouženy působením dNTP a Klenowovy polymerázy, vazba byla provedena T4 DNA-ligásou.
Po extrakci fenolem, vysráženým ethanolem po novém uvedeni do suspenze byla DNA rozštěpena restrikčními enzymy Apal, Xbal a EcoRl. Po další extrakci fenolem, vysráženi ethanolem a novém uvedeni do suspenze byla DNA navázána na pUC13, rozštěpeni EcoRlXbal. Směs po vazbě byla užita k transformaci E. coli (r”m+) a z celé řady transformantů byly připraveny plasmidy. Tyto plasmidy byly rozštěpeny působením EcoRl a Xbal a ty vzorky, které měly pásy při 0,5 a 0,6 kb, byly znovu užity k transformaci E. coli.
Z retransformace byly vybrány pouze transformanty, které obsahovaly pUC13 3 včleněným sledem o 0,5 kb.
Z jednoho z transformantů byl vybrán plasmid pMT881 9 požadovanou mutací v poloze B28 (Pro-^Asp). Mutovaný sled byl ověřen způsobem podle Maxama a Gilberta. Pak byl tento sled přenesen do plasmidu pro expresi z kvasinek navázáním fragmentu pMT881, a to EcoRl-Xbal o velikosti 0,5 kb na fragment Xbal-Kpnl o 7,8 kb a na fragment kpnl-EcoRl o 4,3 kb z plasmidu pMT644 za vzniku pMTAl.
II. Transformace
Plasmid pMTAl byl transformován v S. cerevisiae, kmen MT663 stejným způsobem jako v příkladu 2, II a byl izolován transformant MTAl.
III. Exprese B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Kmen kvasinek MTAl byl pěstován na prostředi YPO způsobem podle přikladu 2, III, Ze supernatantu bylo isolováno 7,2 mg/1 prekursoru insulinového analogu.
IV. Transpeptidace
Surový B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) byl podroben transpeptidaci způsobem podle přikladu 2, IV, avšak Thr-OBu* byl nahrazen Thr-OMe za vzniku B28Asp, B30Thr-0Me-lidského insulinu.
V. Přeměna
B28Asp, B30THr-0Me-lidský insulin byl dispergován ve vodě v množství 1 g/100 ml a byl rozpuštěn přidáním IN hydroxidu sodného do pH 10,0. Tato hodnota pH pak byla udr14 žována 24 hodin při teplotě 25 °C. Vzniklý B2BAsp-lidský insulin byl pak vysrážen přidáním chloridu sodného v koncentraci 8g/100 ml, trihydrátu octanu sodného do 1,4 g/100 ml a octanu zinečnatého ve formě dihydrátu do 0,01 g/100 ml s následným přidáním IN kyseliny chlorovodíkové do pH 5,5, Sraženina se isoluje odstředěním a čistí se chromatografii na aniontoměniči, načež se zbaví soli filtrací na gelu. Tímto způsobem se ziská 0,2 g B28Asp-lidského insulinu.
Přiklad 10
Příprava A2lAsp, B9Asp, B27Glu-lidského insulinu
A2lAsp, B9Asp, B27Glu-lidský insulin byl připraven z Q9Asp, B27Glu-lidskóho insulinu selektivní deamidací, která byla provedena hydrolýzou 5% roztoku 14 dnů při teplotě 37 °C a při pH 2,5. Deamidovaný produkt byl isolován chromatografií na aniontoměniči. Přiklad 11
Příprava B27Glu, A2lAgp-lidského insulinu
B27Glu, A21A9p-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B27Glu, A2lAsp, B(l29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) působení Thr-OBu1 s následnou acldolysou získaného thrioninového esteru působením kyseliny trifluoroctové způsobem podle příkladu 2.
B27Glu, A2lAsp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) je možno připravit z B27Glu, B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-2l) jako v přikladu 2 deamidací podle příkladu 10.
Charakterisace analogu lidského insulinu, vyrobeného způsobem podle vynálezu
Stanoveni molekulové hmotnosti (Gutfreund H., Biochemical Cloumal 42 (544) 1948).
Metoda: Onauer Membrán Osmometer
Typ: 1.00
Membrána: Schleicher a SchQll Typ: R52
Rozpouštědlo: 0,05 M NaCl, pH 7,5 Teplota: 21 °C.
Výsledky: Hodnoty jsou uvedeny v následující tabulce. Všechny typy insulinu byly měřeny v koncentraci 4 mg/ml.
Tabulka I typ insulinu molekulová hmotnost k jednotky lidský 2Zn insulin lidský Zn volný insulin
Zn volný B27Glu-lidský insulin
Zn volný B12Xle-lidský insulin
Zn volný B27Glu, A2lAsp-lidský insulin Zn volný B9Asp, B27Glu-lidský insulin Zn volný B9Asp-lidský insulin Zn volný B9Asp, B27Glu, A21Asp-lidský insulin Zn volný B9Asp, B27Glu, A8His-lidský insulin
36+2
29+1
22+1
17+1
8+1 6+1 6+1 6+1 9 + 3
CS 275613 86
Z toho, co je uvedeno v tabulce 1, je zřejmé, že analogy lidského insulinu mají značně nižší molekulovou hmotnost ve srovnáni s lidským insulinem, což znamená, že samovolné vytvářeni dimerů, tetramerů a hexamerů je méně vyjádřené a v některých případech k němu vůbec nedochází,
V následující tabulce budou uvedeny hodnoty pro biologický poločas a pro biologickou účinnost pro analogii lidského insulinu.
analog lidského insulinu poločas ' biologická účinnost ’ (% lidského insulinu) v % lidského insulinu
B27Glu-lidský insulin 78 101 (83 až 123)
B9Asp, B27Glu-lidský insulin 54 110 (90 až 193)
Bl2Ile-lidský insulin 78 91 (80 až 103)
B27Glu, A21Asp-lidský insulin 56 64 (58 až 71)
B9Asp-lidský insulin 52 80 (72 až 90)
A2lAsp, B9Asp, B27Glu-lidský insulin 56 75 (66 až 85)
A8His, B9Asp, B27Glu-lidský insulin 68 116 (101 až 135)
x) Biologický poločas je doba, do niž zmizl z místa podkožní injekce 50 % účinné látky u vepřů. Bylo užito metody podle publikace Binder 1969, Acata Pharmacol. Toxicol. (suppl. 2) 27:1-87.
xx) Pokus s hladinou glukózy v krvi u myši podle evropského lékopisu, pravděpodobnost 95 %.
Z tabulky 2 vyplývá, že biologický poločas pro insulinové analogy je daleko kratší než tatáž hodnota pro lidský insulin.
Biologická účinnost těchto analogii je srovnatelné s účinnosti lidského insulinu nebo je nepatrně nižši.

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    1. Způsob výroby insulinového analogu obecného vzorce I, kde X znamená zbytek aminokyselin lidského insulinu nebo zbytek odlišné aminokyseliny, a to v poloze
    A8 His, Gly, Gin, Glu, Ser, Asn, Asp nebo Pro,
    A9 Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gin, Asn, Ala nebo Pro,
    A10 Ser, Leu, Pro, Val. His , Ala , Glu, , Asp A13 Pro, Ser, Val, Arg, His , Ala , Glu, , Asp A21 Asp, Glu, Ser nebo Thr, Bl i Glu, Asp, Thr, Ser π lebo Gly. B2 , Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly. B5 1 Glu, Asp, Thr, Ser, Gin nebo , Asn, B9 , Asp, Pro, Glu, Xle, Leu, Val. His, Thr, BIO Asp, Arg. Glu, Asn, Gin , Thr nebo Ser, B12 Ile, Tyr. Asp nebo Glu, Bl4 Glu, Asp, Asn, Gin, Ser , Thr nebo Gly. B16 Asp, Glu, Gin, Asn, Ser , Thr , His nebo B17 Ser, Thr, Asn, Gin, Glu , Asp nebo His, B18 Ser, Thr, Asn, Glu r Gin . Asp nebo His, B20 Gin, Ser, Asn, Asp, Glu nebo Arg, B26 , B27 a B2 8 Asp nebo Glu 9
    Thr, Gin nebo Asn,
    Thr, Gly, Gin nebo Asn,
    Gin, Ser nebo Asn,
    Gin, Asn, Met, Tyr, Trp, Phe nebo Lys,
    Arg,
    CS 275613 86 za předpokladu alespoň jeden zbytek ve významu X je odlišný v přílušnó poloze od zbytku v molekule insulinu a v případě, že X v poloze A8 je His nebo Phe,
    X v poloze A21 je Asp,
    X v poloze B5 je Ala,
    X v poloze B9 je Leu,
    X v poloze BIO je Asn nebo Leu,
    X v poloze B12 je Asn nebo X v poloze B26 je Ala, pak alespoň jeden ze zbývajících zbytků X je odlišný od zbytků aminokyselin v lidském insulinu v dané poloze molekuly lidského insulinu a mimoto z N-terminálniho a/nebo z C-terminálniho zakončeni řetězce A- a/nebo řetězce B může být odstraněn jeden nebo větši počet zbytků aminokyselin.
    Řetězec A
    GlylleValGluGlnCysCys XXX CysSer X TyrGlnLeuGluAsnTyrCys X 1 2 3 4 5 6 8 y 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19)20 21 . 1 Z <5 . y
    X X AsnGln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu X X X Cys X GluArgGlyPhePhe X X -X LysTnr ! 2 3 4 5 6 7 8 y 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (I)
    Řetězec B vyznačující se tim, že se uvede do reakce prekursor insulinu obecného vzorce II, v němž Qn
    R n
    mi
    X znamená peptidový řetězec s obsahem £ přírodně se vyskytujících aminokyselin, znamená Lys nebo Arg, znamená celé čislo O až 33, znamená O nebo 1 a má shora uvedený význam.
    Řetězec A (II)
    Řetězec B s aeterem L-threoninu za přítomnosti trypsinu nebo derivátu trypsinu s následnou přeměnou takto získaného threoninového esteru analogu lidského insulinu na analog lidského insulinu obecného vzorce I hydrolýzou a analog obecného vzorce I se z reakčni směsi izoluje.
  2. 2. Způsob podle bodu 1 pro výrobu analogů lidského insulinu, vyznačující sa tím, že se uvede do reakce prekursor obecného vzorce III, v němž V a S znamenají Lys nebo Arg a
    X má význam, uvedený v bodu 1,
    Řetězec A
    X X AsnOln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu XXX Cys X GluArgGlyFhePhe XXX LysThr
    I 2
  3. 3 4 5 6 7 8 9 10 .11 13 13 14 15 ló 17 18 19 20 21 22 23 24 25 25 27 28 29 30 (III)
    Řetězec B a s trypsinem a karboxypeptidázou E ve vodném roztoku a analog lidského insulinu se z reakčni směsi izoluje,
  4. 4. Způsob podle bodu 1, vyznečujíci se tim, že se užije prekursorů obecného vzorce II nebo III, v nichž nejvýše sedm zbytků aminokyselin ve významu X je odlišný od zbytků aminokyselin v odpovídající poloze molekuly lidského insulinu.
  5. 5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tim,že se užije prekursorů obecného vzorce
    II nebo III lidského insulinu, v nichž zbytky aminokyselin ve významu X se voli Asp nebo Glu.
  6. 6. Způsob podle bodu 1, vyznačujíc! se tim, že se užije prekursorů obecného vzorce II nebo III, v nichž alespoň jeden ze zbytků X v polohách 8(9), B(10), B(12), B(26), B(27) nebo B(28) je odlišný od zbytky aminokyseliny v odpovidajici poloze molekuly lidského insulinu.
  7. 7. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tim,že se užije prekursorů insulinu obecného vzorce II nebo III, v nichž alespoň jeden ze zbytků X v polohách B(9), B(12),
    B(27) nebo B(28) je odlišný od zbytku aminokyseliny na odpovídájícím místě molekuly lidského insulinu.
  8. 8. Způsob podle bodu 1, vyznačujíc! se tim, že ee užije prekursorů insulinu obecného vzorce II nebo III, v nichž X v poloze B27 znamená Glu, X v poloze B12 znamená Ile nebo Tyr, X v poloze B9 znamená Asp, X v poloze A21 a v poloze B9 znamená Asp a v poloze B27 znamená Glu, X v poloze A8 znamená His, v poloze B9 znamená Asp a v poloze B27 znamená Glu, X v poloze BIO znamená Asp nebo X v poloze B9 znamená Asp a v poloze B27 znamená Glu nebo X v poloze B28 znamená Asp.
CS866310A 1985-08-30 1986-08-29 Process for preparing insulin analogs CS275613B6 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK395685A DK395685D0 (da) 1985-08-30 1985-08-30 Peptider
DK467785A DK467785D0 (da) 1985-10-14 1985-10-14 Peptider

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS8606310A2 CS8606310A2 (en) 1990-09-12
CS275613B6 true CS275613B6 (en) 1992-03-18

Family

ID=26067291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS866310A CS275613B6 (en) 1985-08-30 1986-08-29 Process for preparing insulin analogs

Country Status (25)

Country Link
US (1) US5618913A (cs)
EP (1) EP0214826B1 (cs)
JP (1) JP2662390B2 (cs)
KR (1) KR940000756B1 (cs)
CN (1) CN1029977C (cs)
AR (1) AR241801A1 (cs)
AT (1) ATE113061T1 (cs)
AU (1) AU593274B2 (cs)
CA (1) CA1306212C (cs)
CS (1) CS275613B6 (cs)
DD (1) DD268976A5 (cs)
DE (2) DE10075008I2 (cs)
ES (1) ES2001624A6 (cs)
FI (1) FI102182B1 (cs)
GR (1) GR862233B (cs)
HU (1) HU206518B (cs)
IE (1) IE66138B1 (cs)
IL (1) IL79887A (cs)
LU (1) LU90484I2 (cs)
NL (1) NL990042I2 (cs)
NO (2) NO177009C (cs)
NZ (1) NZ217406A (cs)
PH (1) PH25772A (cs)
PT (1) PT83278B (cs)
YU (2) YU46023B (cs)

Families Citing this family (221)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK437786D0 (da) * 1986-09-12 1986-09-12 Nordisk Gentofte Insulinprecursorer
FI884914A7 (fi) * 1987-02-25 1988-10-24 Novo Nordisk As Uusia insuliinijohdannaisia
US4992418A (en) * 1987-07-17 1991-02-12 Mount Sinai School Of Medicine Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin
US4992417A (en) * 1987-07-17 1991-02-12 Mount Sinai School Of Medicine Superactive human insulin analogues
CA1340772C (en) * 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
JPH03506023A (ja) * 1988-07-20 1991-12-26 ノボ　ノルデイスク　アクツイエセルスカプ ポリペプチド
DE3837825A1 (de) * 1988-11-08 1990-05-10 Hoechst Ag Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung
US5716927A (en) * 1988-12-23 1998-02-10 Novo Nordisk A/S Insulin analogs having a modified B-chain
AU641631B2 (en) * 1988-12-23 1993-09-30 Novo Nordisk A/S Human insulin analogues
US5514646A (en) * 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
FI914898A0 (fi) * 1989-04-20 1991-10-17 Sinai School Medicine Leverspecifika insulinanaloger.
US5208217A (en) * 1989-04-20 1993-05-04 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Hepatospecific insulin analogues
DK155690D0 (da) * 1990-06-28 1990-06-28 Novo Nordisk As Nye peptider
DK158390D0 (da) * 1990-07-02 1990-07-02 Novo Nordisk As Nye peptider
DK10191D0 (da) * 1991-01-22 1991-01-22 Novo Nordisk As Hidtil ukendte peptider
DK33591D0 (cs) * 1991-02-27 1991-02-27 Novo Nordisk As
ZA924448B (en) * 1991-06-21 1993-12-17 Lilly Co Eli Insulin Analogs
HUT71583A (en) * 1992-12-18 1995-12-28 Lilly Co Eli Insulin-analogs
DE122006000017I1 (de) * 1993-06-21 2006-06-29 Novo Nordisk As ASP-B28-Insulinkristalle
DK72793D0 (da) * 1993-06-21 1993-06-21 Novo Nordisk As Nyt produkt
US5474978A (en) * 1994-06-16 1995-12-12 Eli Lilly And Company Insulin analog formulations
US5504188A (en) * 1994-06-16 1996-04-02 Eli Lilly And Company Preparation of stable zinc insulin analog crystals
US5461031A (en) * 1994-06-16 1995-10-24 Eli Lilly And Company Monomeric insulin analog formulations
US5547929A (en) 1994-09-12 1996-08-20 Eli Lilly And Company Insulin analog formulations
AU3562195A (en) * 1994-10-04 1996-04-26 Novo Nordisk A/S Preparations containing aspb28 human insulin and nicotinamide
US5597893A (en) * 1994-10-31 1997-01-28 Eli Lilly And Company Preparation of stable insulin analog crystals
US5646242A (en) 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
US5693609A (en) * 1994-11-17 1997-12-02 Eli Lilly And Company Acylated insulin analogs
YU18596A (sh) * 1995-03-31 1998-07-10 Eli Lilly And Company Analogne formulacije monomernog insulina
US5631347A (en) * 1995-06-07 1997-05-20 Eli Lilly And Company Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein
US5700904A (en) * 1995-06-07 1997-12-23 Eli Lilly And Company Preparation of an acylated protein powder
ATE208208T1 (de) * 1996-06-20 2001-11-15 Novo Nordisk As Halogenid-enthaltende insulinzubereitungen
ZA984697B (en) 1997-06-13 1999-12-01 Lilly Co Eli Stable insulin formulations.
DE19726167B4 (de) * 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
AR020047A1 (es) 1997-10-24 2002-04-10 Lilly Co Eli Composiciones insolubles de insulina, formulaciones en suspension que incluyen dicha composicion insoluble de insulina; y el uso de dicha composicionpara preparar medicamentos y procedimiento para preparar dichas composiciones insolubles.
CO4970787A1 (es) 1997-12-23 2000-11-07 Lilly Co Eli Composiciones insolubles de insulina y derivados de insulina que controlan la glucosa sanguinea
NZ506447A (en) * 1998-02-23 2002-11-26 Neurocrine Biosciences Inc Peptide analogues of insulin with alanine substitutions and pharmaceutical use
DE19825447A1 (de) * 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
US6933272B1 (en) 1998-09-22 2005-08-23 Erik Helmerhorst Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments
AUPP609198A0 (en) * 1998-09-22 1998-10-15 Curtin University Of Technology Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments
IL143834A0 (en) 1999-01-06 2002-04-21 Genentech Inc Insulin-like growth factor (igf) i mutant variants
DE60016560T2 (de) 1999-01-06 2005-12-15 Genentech, Inc., South San Francisco Mutierte variante des insulin-ähnlichen wachstumsfaktor-i (igf-i)
US6746853B1 (en) * 1999-05-19 2004-06-08 Xencor, Inc. Proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes
CN1125081C (zh) 1999-09-08 2003-10-22 中国科学院上海生物化学研究所 重组天然和新型人胰岛素及其制备方法
US7022674B2 (en) * 1999-12-16 2006-04-04 Eli Lilly And Company Polypeptide compositions with improved stability
JP2003528149A (ja) 2000-03-24 2003-09-24 ジェネンテック・インコーポレーテッド 軟骨性疾患の治療のためのインスリンの使用
AU2001254621A1 (en) * 2000-05-05 2001-11-20 K.U. Leuven R And D Critical illness neuropathy
DE60133271T2 (de) 2000-05-16 2009-04-23 Genentech, Inc., South San Francisco Behandlung von knorpelerkrankungen
AR025646A1 (es) * 2000-09-13 2002-12-04 Beta Lab Sa Cepa de levaduras metilotroficas recombinantes productoras de un precursor de insulina, construcciones de adn y metodo para obtener la cepa.
US7638618B2 (en) 2001-02-20 2009-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
US7202059B2 (en) 2001-02-20 2007-04-10 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium
DE10114178A1 (de) 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
EP2243776A1 (en) 2001-10-12 2010-10-27 High Point Pharmaceuticals, LLC Substituted piperidines and their use for the treatment of diseases related to the histamine H3 receptor
ES2344448T3 (es) 2001-11-19 2010-08-27 Novo Nordisk A/S Proceso para preparar compuestos de insulina.
GB0206792D0 (en) 2002-03-22 2002-05-01 Leuven K U Res & Dev Normoglycemia
DE10227232A1 (de) 2002-06-18 2004-01-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
US7193035B2 (en) 2002-10-29 2007-03-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Crystals of insulin analogs and processes for their preparation
US7871607B2 (en) * 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
EP1615698B1 (en) 2003-04-11 2010-09-29 High Point Pharmaceuticals, LLC New amide derivatives and pharmaceutical use thereof
DE602004032237D1 (de) 2003-06-27 2011-05-26 Novo Nordisk As Behälter für medizinische flüssigkeiten mit hoher wasserdampfsperre
WO2005005477A2 (en) * 2003-07-11 2005-01-20 Novo Nordisk A/S Stabilised insulin compositions
US20060183667A1 (en) * 2003-07-11 2006-08-17 Novo Nordisk A/S Stabilised insulin compositions
EP2085406A1 (en) * 2003-07-25 2009-08-05 ConjuChem Biotechnologies Inc. Long lasting insulin derivatives and methods thereof
JP4463814B2 (ja) 2003-08-05 2010-05-19 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 新規のインスリン誘導体
EP2287184A3 (en) 2003-08-05 2011-08-10 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
JP4800959B2 (ja) * 2003-11-13 2011-10-26 ノヴォ ノルディスク アー／エス 糖尿病及び過食症を治療するためのｇｌｐ−１ペプチド及び短時間作用型インスリンペプチドを含む、非経口投与用の可溶性医薬組成物
US20060287221A1 (en) * 2003-11-13 2006-12-21 Novo Nordisk A/S Soluble pharmaceutical compositions for parenteral administration comprising a GLP-1 peptide and an insulin peptide of short time action for treatment of diabetes and bulimia
EP1687019B1 (en) 2003-11-20 2017-11-22 Novo Nordisk A/S Propylene glycol-containing peptide formulations which are optimal for production and for use in injection devices
JP5697831B2 (ja) 2003-12-03 2015-04-08 ノヴォ ノルディスク アー／エス 単鎖インシュリン
DE602004029496D1 (de) 2003-12-22 2010-11-18 Novo Nordisk As Offbehälter zur lagerung von pharmazeutischen flüssigkeiten
CA2552043A1 (en) 2004-01-21 2005-08-04 Novo Nordisk A/S Transglutaminase mediated conjugation of peptides
CA2910494C (en) 2004-07-19 2018-10-23 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
WO2006052670A2 (en) 2004-11-04 2006-05-18 Hunter Douglas Inc. Single-track stacking panel covering for an architectural opening
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
ES2435522T3 (es) 2005-02-02 2013-12-20 Novo Nordisk A/S Derivados de insulina
US8067362B2 (en) 2005-02-02 2011-11-29 Novo Nordisk As Insulin derivatives
JP5121707B2 (ja) 2005-07-04 2013-01-16 ハイ ポイント ファーマシューティカルズ，エルエルシー 新規医薬
WO2007015805A1 (en) 2005-07-20 2007-02-08 Eli Lilly And Company 1-amino linked compounds
ATE513921T1 (de) 2005-08-16 2011-07-15 Novo Nordisk As Verfahren zur herstellung reifer insulinpolypeptide
PL1926749T3 (pl) 2005-09-14 2011-12-30 Sanofi Aventis Deutschland Cięcie prekursorów insuliny przez wariant trypsyny
SI1951658T1 (sl) 2005-11-17 2012-11-30 Lilly Co Eli Antagonisti glukagonskega receptorja priprava interapevtska uporaba
EP1969004B1 (en) 2005-12-28 2011-08-10 Novo Nordisk A/S Compositions comprising an acylated insulin and zinc and method of making the said compositions
WO2007081824A2 (en) * 2006-01-06 2007-07-19 Case Western Reserve University Fibrillation resistant proteins
JP2009527526A (ja) * 2006-02-21 2009-07-30 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 単鎖インスリンのアナログとその製薬的製剤
ATE482977T1 (de) 2006-02-27 2010-10-15 Novo Nordisk As Insulinderivate
WO2007104786A1 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Novo Nordisk A/S Mixtures of amylin and insulin
SG170785A1 (en) 2006-03-28 2011-05-30 Transtech Pharma Benzothiazoles having histamine h3 receptor activity
EP2049475B1 (en) 2006-04-24 2012-02-01 Eli Lilly & Company Cyclohexyl substituted pyrrolidinones as inhibitors of 11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1
WO2007128815A1 (en) 2006-05-09 2007-11-15 Novo Nordisk A/S Insulin derivative
EP2386572B1 (en) 2006-05-09 2015-07-08 Novo Nordisk A/S Insulin derivative
SI2079732T1 (sl) 2006-05-29 2012-03-30 High Point Pharmaceuticals Llc benzodioksol il ciklopropilpiperazin il piridazin njegove soli in solvati in njegova uporaba kot antagonist histaminskega receptorja H
WO2007140619A1 (en) * 2006-06-08 2007-12-13 Diabecore Medical Inc. Derivatized insulin oligomers
DE102006031955A1 (de) * 2006-07-11 2008-01-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende
DE102006031962A1 (de) 2006-07-11 2008-01-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Amidiertes Insulin Glargin
CN101573133B (zh) 2006-07-31 2014-08-27 诺沃-诺迪斯克有限公司 Peg化延长的胰岛素
WO2008034881A1 (en) 2006-09-22 2008-03-27 Novo Nordisk A/S Protease resistant insulin analogues
WO2008043033A2 (en) * 2006-10-04 2008-04-10 Case Western Reserve University Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues
WO2008049711A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-02 Novo Nordisk A/S Peptide extended insulins
US10100098B2 (en) 2006-12-13 2018-10-16 Stelis Biopharma Private Limited Insulin production methods and proinsulin constructs
US20120214963A1 (en) * 2011-02-23 2012-08-23 Elona Biotechnologies Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs therefrom
CN101674812B (zh) 2007-04-30 2013-12-11 诺沃-诺迪斯克有限公司 干燥蛋白组合物的方法、干燥的蛋白组合物和包含干燥的蛋白的药物组合物
WO2008139496A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 Bigtec Private Limited Recombinant human insulin and a method thereof
EP2497462A1 (en) 2007-06-01 2012-09-12 Novo Nordisk A/S Stable non-aqueous pharmaceutical compositions
EP2164466A1 (en) 2007-06-01 2010-03-24 Novo Nordisk A/S Spontaneously dispersible preconcentrates including a peptide drug in a solid or semisolid carrier
US9034818B2 (en) 2007-06-13 2015-05-19 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulations comprising an insulin derivative
WO2009021956A2 (en) * 2007-08-13 2009-02-19 Novo Nordisk A/S Rapid acting insulin analogues
CN101778862B (zh) 2007-08-13 2014-12-17 诺沃-诺迪斯克有限公司 快速作用的胰岛素类似物
ES2526924T3 (es) 2007-08-15 2015-01-16 Novo Nordisk A/S Insulinas con una fracción acilo que comprende unidades repetitivas de aminoácidos que contienen alquilenglicol
EP2708554A1 (en) 2007-08-15 2014-03-19 Novo Nordisk A/S Insulin analogues with an acyl and alkylene glycol moiety
NZ603812A (en) 2007-11-20 2014-06-27 Ambrx Inc Modified insulin polypeptides and their uses
CA2711749A1 (en) 2008-01-09 2009-07-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
PT2910570T (pt) 2008-03-18 2017-01-24 Novo Nordisk As Análogos de insulina acilados, estabilizados contra proteases
EP2262539B1 (en) 2008-04-01 2015-07-15 Novo Nordisk A/S Insulin albumin conjugates
WO2009129250A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Case Western Reserve University Meal-time insulin analogues of enhanced stability
CN102065885A (zh) * 2008-04-22 2011-05-18 卡斯西部储备大学 同种型特异性的胰岛素类似物
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
TWI451876B (zh) 2008-06-13 2014-09-11 Lilly Co Eli 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物
KR20120129875A (ko) * 2008-07-31 2012-11-28 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체
US9200053B2 (en) 2008-07-31 2015-12-01 Case Western Reserve University Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24
PL2307441T3 (pl) 2008-08-07 2016-09-30 Sposób otrzymywania związków insuliny
DE102008051834A1 (de) 2008-10-17 2010-04-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
DE102009038210A1 (de) 2009-08-20 2011-03-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
DE102008053048A1 (de) 2008-10-24 2010-04-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
RS59913B1 (sr) 2008-10-17 2020-03-31 Sanofi Aventis Deutschland Kombinacija insulina i glp-1-agonista
ES2607003T3 (es) 2008-10-30 2017-03-28 Novo Nordisk A/S Tratamiento de diabetes mellitus utilizando inyecciones de insulina con una frecuencia de inyección inferior a la diaria
EP2362730A4 (en) 2008-11-21 2012-08-29 High Point Pharmaceuticals Llc Adamantyl BENZAMIDE CONNECTIONS
FR2943538B1 (fr) 2009-03-27 2011-05-20 Adocia Formulation a action rapide d'insuline recombinante humaine
US9018190B2 (en) 2009-03-27 2015-04-28 Adocia Functionalized oligosaccharides
TW201113032A (en) 2009-07-06 2011-04-16 Sanofi Aventis Deutschland Slow-acting insulin preparations
TW201105346A (en) 2009-07-06 2011-02-16 Sanofi Aventis Deutschland Heat-stable and vibration-stable insulin preparations
SG10201403840VA (en) 2009-07-06 2014-10-30 Sanofi Aventis Deutschland Aqueous insulin preparations containing methionine
CN102548583B (zh) 2009-07-31 2015-04-22 赛诺菲-安万特德国有限公司 包含胰岛素连接物缀合物的前药
PT2459171T (pt) 2009-07-31 2017-08-16 Sanofi Aventis Deutschland Composição de insulina de atuação longa
US8399407B2 (en) * 2009-09-17 2013-03-19 Case Western Reserve University Non-standard insulin analogues
PL2498801T3 (pl) 2009-11-13 2018-08-31 Sanofi Aventis Deutschland Kompozycja farmaceutyczna zawierająca desPro<sup>36</sup>eksendyno-4(1-39)-Lys6-NH2 i metioninę
SI2498802T1 (sl) 2009-11-13 2015-05-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Farmacevtski sestavek, ki vsebuje agonist GLP-1, inzulin in metionin
US8637096B2 (en) 2009-12-04 2014-01-28 Curtis C. Stojan Compositions and method for enhancing insulin activity
CN102762589A (zh) 2009-12-11 2012-10-31 卡斯西部储备大学 带有氯化氨基酸的胰岛素类似物
EP2460527A1 (en) 2010-01-21 2012-06-06 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
TW201141513A (en) 2010-04-14 2011-12-01 Sanofi Aventis Insulin-siRNA conjugates
RU2572214C2 (ru) 2010-05-10 2015-12-27 Ново Нордиск А/С Способ получения цинковых комплексов инсулина
CN103068842B (zh) 2010-06-16 2016-10-19 印第安纳大学研究及科技有限公司 对胰岛素受体具有高活性的单链胰岛素激动剂
CN102985440B (zh) * 2010-06-23 2016-10-26 诺沃-诺迪斯克有限公司 包含额外的二硫键的胰岛素衍生物
PH12013500241A1 (en) 2010-08-17 2013-03-11 Ambrx Inc Modified relaxin polypeptides and their uses
BR112013004756B1 (pt) 2010-08-30 2020-04-28 Sanofi Aventis Deutschland uso de ave0010 para a fabricação de um medicamento para o tratamento da diabetes melito tipo 2
EP2438930A1 (en) 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
DK2632478T3 (da) 2010-10-27 2019-10-07 Novo Nordisk As Behandling af diabetes melitus under anvendelse af insulinindsprøjtninger indgivet med varierende indsprøjtningsintervaller
US20130261051A1 (en) 2010-10-27 2013-10-03 Thue Johansen Treating Diabetes Melitus Using Insulin Injections Administered With Varying Injection Intervals
JP2013545782A (ja) 2010-12-14 2013-12-26 ノヴォ ノルディスク アー／エス 長時間作用型インスリンと組み合わせた速効型インスリン
US9447163B2 (en) * 2011-02-01 2016-09-20 Novo Nordisk A/S Purification of insulin
US10130684B2 (en) 2011-02-03 2018-11-20 Pharmedica Ltd. Oral dissolving films for insulin administration, for treating diabetes
WO2012115637A1 (en) 2011-02-23 2012-08-30 Elona Biotechnologies Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs
WO2012115638A1 (en) 2011-02-23 2012-08-30 Elona Biotechnologies Glargine proinsulin compositions and methods of producing glargine insulin analogs therefrom
US9187547B2 (en) 2011-03-15 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Human insulin analogues and derivatives comprising cysteine substitutions
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
CA2846413C (en) 2011-08-29 2021-11-02 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for use in glycemic control in diabetes type 2 patients
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
US20130231281A1 (en) 2011-11-02 2013-09-05 Adocia Rapid acting insulin formulation comprising an oligosaccharide
AU2012350586B2 (en) 2011-12-15 2017-02-02 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Human insulin analogue and acylated derivative thereof
CN104114183A (zh) 2011-12-20 2014-10-22 印第安纳大学研究及科技有限公司 用于治疗糖尿病的基于ctp的胰岛素类似物
CA2870313A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Novo Nordisk A/S Insulin formulations
US9884094B2 (en) 2012-05-01 2018-02-06 Novo Nordisk A/S Method of treating diabetes mellitus
WO2013173923A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Diamedica, Inc. Formulations of human tissue kallikrein-1 for parenteral delivery and related methods
ES2625548T3 (es) 2012-06-04 2017-07-19 DiaMedica Therapeutics Inc. Isoformas de glicosilación de la calicreína-1 tisular humana
US9593156B2 (en) 2012-09-26 2017-03-14 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analog dimers
BR112015010799B1 (pt) 2012-11-13 2023-01-17 Adocia Composição em solução aquosa, e, formulação farmacêutica
JP6735561B2 (ja) 2012-12-03 2020-08-05 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． Ｏ−グリコシル化カルボキシ末端部分（ｃｔｐ）ペプチド系のインスリンおよびインスリン類似体
US9867869B2 (en) 2012-12-12 2018-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Insulin derivatives for diabetes treatment
US9707275B2 (en) 2012-12-19 2017-07-18 Wockhardt Limited Stable aqueous composition comprising human insulin or an analogue or derivative thereof
AU2013368990B2 (en) 2012-12-26 2017-05-18 Wockhardt Limited Pharmaceutical composition
TWI641381B (zh) 2013-02-04 2018-11-21 法商賽諾菲公司 胰島素類似物及／或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物
JP6538645B2 (ja) 2013-03-14 2019-07-03 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ インスリン‐インクレチン複合物
JP2016519127A (ja) 2013-04-30 2016-06-30 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規投与レジメン
CN105579052A (zh) 2013-09-30 2016-05-11 沃克哈特有限公司 药物组合物
CN105636979B (zh) 2013-10-07 2020-01-10 诺和诺德股份有限公司 胰岛素类似物的新衍生物
RU2016132340A (ru) 2014-01-09 2018-02-14 Санофи Стабилизированные фармацевтические составы на основе инсулина аспарта
EP3091965A1 (en) 2014-01-09 2016-11-16 Sanofi Stabilized glycerol free pharmaceutical formulations of insulin analogues and/or insulin derivatives
CA2932877A1 (en) 2014-01-09 2015-07-16 Sanofi Stabilized pharmaceutical formulations of insulin analogues and/or insulin derivatives
FR3020947B1 (fr) 2014-05-14 2018-08-31 Adocia Composition aqueuse comprenant au moins une proteine et un agent solubilisant, sa preparation et ses utilisations
US9795678B2 (en) 2014-05-14 2017-10-24 Adocia Fast-acting insulin composition comprising a substituted anionic compound and a polyanionic compound
US9656017B2 (en) 2014-06-20 2017-05-23 Howard E. Greene Infusion delivery devices and methods
WO2016001862A1 (en) 2014-07-04 2016-01-07 Wockhardt Limited Extended release formulations of insulins
CN108271356A (zh) 2014-09-24 2018-07-10 印第安纳大学研究及科技有限公司 肠降血糖素-胰岛素缀合物
JP6829928B2 (ja) 2014-10-06 2021-02-17 ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティＣａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 二相性単鎖インスリン類似体
PH12017500935A1 (en) 2014-11-21 2017-11-27 Merck Sharp & Dohme Insulin receptor partial agonists
TWI758239B (zh) 2014-12-12 2022-03-21 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 甘精胰島素/利司那肽固定比率配製劑
TW201630622A (zh) 2014-12-16 2016-09-01 美國禮來大藥廠 速效胰島素組合物
CN105884879A (zh) * 2015-01-26 2016-08-24 漳州博欣生物技术有限公司 一种胰岛素类似物的化学合成方法
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
ES2908373T3 (es) 2015-08-25 2022-04-28 Novo Nordisk As Nuevos derivados de insulina y los usos médicos de los mismos
JO3749B1 (ar) 2015-08-27 2021-01-31 Lilly Co Eli تركيبات إنسولين سريعة المفعول
FR3043557B1 (fr) 2015-11-16 2019-05-31 Adocia Composition a action rapide d'insuline comprenant un citrate substitue
US20190142963A1 (en) 2016-04-15 2019-05-16 Richard D. DiMarchi Fgf21 c-terminal peptide optimization
GB201607918D0 (en) 2016-05-06 2016-06-22 Arecor Ltd Novel formulations
EP3922260A3 (en) 2016-05-24 2022-06-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists and glp-1 analogues
US10689430B2 (en) 2016-05-25 2020-06-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists
CN114478747B (zh) * 2016-08-02 2024-06-14 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人胰岛素或其类似物的酰化衍生物
US12527845B2 (en) 2016-09-29 2026-01-20 Arecor Limited Formulations
DK3554534T3 (da) 2016-12-16 2021-08-23 Novo Nordisk As Farmaceutisk sammensætning omfattende insulin
CA3054962A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Diamedica Inc. Dosage forms of tissue kallikrein 1
GB201707188D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Arecor Ltd Novel formulations
GB201707189D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Arecor Ltd Novel formulations
GB201707187D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Arecor Ltd Novel formulations
CN110662551B (zh) 2017-06-01 2023-07-18 伊莱利利公司 速效胰岛素组合物
SG11202001077UA (en) 2017-08-17 2020-03-30 Novo Nordisk As Novel acylated insulin analogues and uses thereof
JP7465813B2 (ja) 2018-04-04 2024-04-11 アレコル リミテッド インスリン化合物の送達のための医療用注入ポンプシステム
WO2019193351A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Arecor Limited Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound
IL277721B2 (en) 2018-04-04 2024-03-01 Arecor Ltd Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
WO2020051812A1 (zh) * 2018-09-12 2020-03-19 美药星（南京）制药有限公司 一种新型门冬胰岛素原的结构和制备门冬胰岛素的方法
KR20200082618A (ko) 2018-12-31 2020-07-08 주식회사 폴루스 인슐린 과발현용 램프 태그 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법
JP7518149B2 (ja) 2019-07-12 2024-07-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス 高濃度インスリン製剤
IL319162A (en) 2019-12-11 2025-04-01 Novo Nordisk As New insulin analogs and their use
AU2020418207A1 (en) 2019-12-30 2022-08-25 Gan & Lee Pharmaceuticals Co., Ltd. Long-acting GLP-1 compound
CN118598978A (zh) 2019-12-30 2024-09-06 甘李药业股份有限公司 胰岛素衍生物
GB202004814D0 (en) 2020-04-01 2020-05-13 Arecor Ltd Novel formulations
US20250340610A1 (en) 2022-01-28 2025-11-06 Gan & Lee Pharmaceuticals Co., Ltd. Acylated insulin
PE20251287A1 (es) 2022-05-18 2025-05-14 Protomer Tech Inc Compuestos aromaticos que contienen boro y analogos de insulina relacionados

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2252157C3 (de) * 1972-10-25 1976-03-18 Hoechst Ag Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten
US4652525A (en) * 1978-04-19 1987-03-24 The Regents Of The University Of California Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
US4565785A (en) * 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule
JPS55138391A (en) * 1979-04-13 1980-10-29 Shionogi & Co Ltd New synthetic method of peptide derivative
US4343898A (en) * 1980-02-11 1982-08-10 Novo Industri A/S Process for preparing esters of human insulin
US4340674A (en) * 1980-05-05 1982-07-20 The Upjohn Company Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces
US4351901A (en) * 1980-03-24 1982-09-28 Cetus Corporation Method for single nucleotide alteration
DK319780A (da) * 1980-07-24 1982-01-25 Forenede Bryggerier As Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner
ZA824218B (en) * 1981-06-29 1983-04-27 Cetus Corp Plasmid for producing human insulin
DK58285D0 (da) * 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
US5008241A (en) * 1985-03-12 1991-04-16 Novo Nordisk A/S Novel insulin peptides
DK129385A (da) * 1985-03-22 1986-09-23 Novo Industri As Peptider og fremstilling deraf
DK134189D0 (da) * 1989-03-20 1989-03-20 Nordisk Gentofte Insulinforbindelser
US5559094A (en) * 1994-08-02 1996-09-24 Eli Lilly And Company AspB1 insulin analogs

Also Published As

Publication number Publication date
FI102182B (fi) 1998-10-30
YU46023B (sh) 1992-12-21
EP0214826B1 (en) 1994-10-19
DE3650101T2 (de) 1995-02-23
HUT42526A (en) 1987-07-28
YU148486A (en) 1991-04-30
US5618913A (en) 1997-04-08
PT83278A (en) 1986-09-01
JP2662390B2 (ja) 1997-10-08
ES2001624A6 (es) 1988-06-01
NL990042I2 (nl) 2000-03-01
DD268976A5 (de) 1989-06-14
CA1306212C (en) 1992-08-11
EP0214826A2 (en) 1987-03-18
NO177009C (no) 1995-07-05
PT83278B (pt) 1989-03-30
EP0214826A3 (en) 1987-06-03
KR940000756B1 (ko) 1994-01-29
YU4188A (en) 1990-06-30
IE862317L (en) 1987-02-28
NO863474L (no) 1987-03-02
IE66138B1 (en) 1995-12-13
CS8606310A2 (en) 1990-09-12
NZ217406A (en) 1989-05-29
NO177009B (no) 1995-03-27
NO863474D0 (no) 1986-08-29
LU90484I2 (fr) 2000-02-21
FI863512L (fi) 1987-03-01
HU206518B (en) 1992-11-30
AU6206686A (en) 1987-03-05
IL79887A (en) 1991-11-21
IL79887A0 (en) 1986-11-30
FI102182B1 (fi) 1998-10-30
YU46857B (sh) 1994-06-24
NO2000005I1 (no) 2000-07-21
NL990042I1 (nl) 2000-02-01
CN1029977C (zh) 1995-10-11
CN86106574A (zh) 1988-08-03
KR870002165A (ko) 1987-03-30
DE10075008I2 (de) 2004-10-21
ATE113061T1 (de) 1994-11-15
AU593274B2 (en) 1990-02-08
PH25772A (en) 1991-10-18
JPS6253999A (ja) 1987-03-09
FI863512A0 (fi) 1986-08-29
GR862233B (en) 1986-12-31
AR241801A1 (es) 1992-12-30
DE10075008I1 (de) 2000-05-18
DE3650101D1 (de) 1994-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS275613B6 (en) Process for preparing insulin analogs
EP0419504B1 (en) Insulin analogues
EP0463072B1 (en) Novel insulin compounds
AU648670B2 (en) A-C-B Proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
JP2766999B2 (ja) プロペプチド
JP4519324B2 (ja) 共有結合で架橋されたインスリンダイマー
RU2176646C2 (ru) Инсулин и его производные с повышенной способностью связывать цинк
CA2006578A1 (en) Human insulin analogues
CZ295964B6 (cs) Nové deriváty inzulinu s rychlým začátkem působení, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje
CA2330183C (en) Novel insulin analogs with enhanced zinc binding
WO1988010299A1 (en) A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation
RU2104305C1 (ru) Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций
WO1992015611A1 (en) Novel insulin derivatives
DK159274B (da) Hurtigt virkende human insulinanaloger og injicerbare oploesninger med hurtigt indsaettende virkning indeholdende saadanne insulinanaloger

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20060829