CS275613B6 - Process for preparing insulin analogs - Google Patents

Process for preparing insulin analogs Download PDF

Info

Publication number
CS275613B6
CS275613B6 CS866310A CS631086A CS275613B6 CS 275613 B6 CS275613 B6 CS 275613B6 CS 866310 A CS866310 A CS 866310A CS 631086 A CS631086 A CS 631086A CS 275613 B6 CS275613 B6 CS 275613B6
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
asp
glu
human insulin
insulin
ala
Prior art date
Application number
CS866310A
Other languages
English (en)
Other versions
CS8606310A2 (en
Inventor
Jens Jorgen Veilgaard Brange
Kjeld Norris
Mogens Trier Hansen
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DK395685A external-priority patent/DK395685D0/da
Priority claimed from DK467785A external-priority patent/DK467785D0/da
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of CS8606310A2 publication Critical patent/CS8606310A2/cs
Publication of CS275613B6 publication Critical patent/CS275613B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

(57) Anotace :
l?ešenl se týká způsobu výroby insulinového analogu obecného vzorce I, kde X znamená zbytek aminokyseliny lidského insulinu nebo zbytek odlišné aminokyseliny a to v poloze A8, A9, AlO, A13, A21, B2, B5.B9, BlO, Bl2, B14, B16, B17, B18, B2O, B26, B27 a 1 B28, za předpokladu, alespoň jeden zbytek ve významu X ja odlišný v příslušné poloze od zbytku v molekule insulinu a v případě, že X v poloze A8 je His nebo Phe,
X v poloze A21 je Asp, X v poloze B5 je Ala, X v poloze B9 je Leu, X v poloze BIO je Asn nebo Leu, X v poloze Bl2 je Asn nebo X v poloze B26 je Ala, pak alespoň jeden ze zbývajících zbytků X je odlišný od zbytků aminokyselin v lidském insulinu v dané poloze molekuly lidského insulinu a mimoto z N-terminálniho a/nebo z C-terminálniho zakončeni řetězce A- a/nebo řetězce B může být odstraněn jeden nebo větši počet zbytků aminokyselin, tím, že se uvede do reakce prekursor insulinu s esterem L-threoninu za přítomnosti trypsinu nebo derivátu trypsinu s následnou přeměnou takto získaného threoninovóho esteru analogu lidského insulinu na analog lidského insulinu obecného vzorce I hydrolýzou a analog obecného vzorce I se z reakčni směsi izoluje.
ČS 275613 B6 .Z
CS 275513 B6
Vynález se týká způsobu výroby analogů insulinu, a to lidského insulinu, který má po podkožním podání rychlý nástup účinku. Získané roztoky insulinu, vhodné pro injekční podáni obsahuji shora uvedený analog.
Při léčbě cukrovky již bylo navrhováno mnoho typů insulinových přípravků. Některé z těchto prostředků mají rychlý účinek, jiná máji účinek více nebo méně prodloužený.
Insulinové preparáty a rychlým nástupem účinku Je možno užít v akutních situacích, jako jsou například hyperglykemické koma, nutnost chirurgického zákroku, těhotenství a závažné infekce. Mimoto Je možno opakovanými dávkami rychle účinkujícího insulinu několikrát denně často zvládnout cukrovku, u niž bylo těžké léčebného efektu dosáhnout při použiti insulinu s prodlouženým účinkem,
V posledních letech vzniká snaha zajistit takovou léčbu insulinem, která by pokud možno napodobovala vylučováni insulinu -buňkami zdravého organismu, aby totiž k uvolněni insulinu docházelo v závislosti na Jídle při zachováni stélé bazálni hladiny insulinu. Klinická zkoumáni prokázala, že Je diabetikovi možno zajistit téměř normálni koncentrace insulinu i glukózy jednou denní injekci insulinu s dlouhodobým účinkem k pokryti bazálni potřeby s injekčním doplněním malých množství Insulinu s rychlým nástupem účinku před hlavními jidly.
Insulinová deriváty s rychlým nástupem účinku Je rovněž možno podávat ve směsi s insulinovými deriváty se středně dlouhou nebo prodlouženou dobou účinku při léčbě diabetiků, jejichž stav vyžaduje silnější počáteční účinek kromě středně dlouhého a prodlouženého účinku.
Insulinové deriváty s rychlým nástupem účinku Je možno taká použít ve formě kontinuální infuse.
Po podkožní injekci insulinu s rychlým účinkem bylo možno pozorovat na počátku zpomalenou absorpci, jak bylo popsáno v publikaci Binder, Diabetes Care 7, č. 2 (1984), str. 188 až 199. Toto počáteční zpožděni absorpce, které má za následek pomalejší nástup účinku je však nežádoucí v případě, že je zapotřebí přesného řízeni metabolismu. Smísením insulinových roztoků s rychlým účinkem a insulinových roztoků z prodlouženým účinkem může mimoto dojit ke zpomalenému vstřebáváni insulinu s rychlým účinkem.
□e tedy zřejmé, že by bylo zapotřebí získat insulinové roztoky s rychlým účinkem a s rychlejším nástupem účinku po podkožní injekci se současnou zlepšenou mlsitelnosti s injekčními prostředky insulinu s protrahovaným účinkem.
Další nevýhodou známých insulinových roztoků s rychlým účinkem je tendence insulinu k tvorbě fibril a ke srážení z insulinových roztoků v průběhu jeho kontinuálního přivádění, Čimž dochází k ucpáni mechanických části a katetrů.
Mimoto by také bylo zapotřebí nalézt další insulinové přípravky pro léčbu nemocných, resistentnich proti normálnímu insulinu.
Předmětem vynálezu Je způsob výroby nového insulinového roztoku s rychlým účinkem S jednou nebo větším počtem následujících zlepšených vlastností:
1) rychlejší nástup účinku po podkožní injekci nebo po podáni jinou cestou,
2) zlepšená misitelnost s insulinovými prostředky s protrahovaným účinkem,
3) snížená tendence k vytvářeni fibril v případě, že se tohoto prostředku užije v implantovatelném přívodním systému a
4) použitelnost pro léčbu resistentnich nemocných (nizká afinita k již existujícím protilátkám).
Shora uvedeného cíle je možno dosáhnout při použití nového analogu lidského insulinu, který je možno získat způsobem podle vynálezu.
Byla již popsána dlouhá řada insulinových analogů. Mffrku a dalši v Hoppy-Seyler's Z. Physiol. Chem. 3S0 (1979), 1619 až 1632 popisuji syntézu analogů lidského Insulinu, která se liši od liského insulinu náhradou Jediné aminokyseliny v polohách 2, 5, 6, 7, 8 a 11 řetězce A a 5, 7, 13 a 16 řetězce B a zároveň poskytují možnost nových pohledů na vztahy mezi strukturou a účinností insulinu. V průběhu dalších studii byly modifikovány hlavni oblasti insulinu, které se váži na receptory [b(22)-B(26)J , aby bylo možno sledovat vliv těchto změn na účinnost vazby na receptory. Nové analogy insulinu však neměly vlastnosti, požadované uvedenými autory.
CS 275613 06
3θ známo, že insulinové deriváty, převedené na sulfát mají nižší tendenci k tvorbě fibril, jak bylo popsáno v publikaci Albisser a další, Desired Characteristic9 of insulin to be ušed in infusion pumpa v Guerigulan O.L. a další, US Pharmacopeial Convention, Rockwille, Maryland, str. 84 až 95 a mají malý antigenni účinek. Tyto typy insulinů jsou však heterogenní směsi alespoň devíti různých insulinových derivátů, které obsahuji průměrně 4,5 sulfátových esterových skupin v molekule. Sulfátované insuliny máji mimoto sníženou účinnost, ktsrá tvoři pouze přibližně 20 % účinnosti nativního insulinu. Dalši nevýhodou těchto derivátů ve srovnání s nativním insulinem je skutečnost, že zbytečně obsahuji zbytky aminokyselin, které jsou chemicky modifikovány, tj. aminokyseliny, které se v přírodním prostředí nevyskytuji.
Vynález si klade za úkol navrhnout způsob výroby takových analogů insulinu, které by byly homogenní, měly by vyšši biologickou účinnost než sulfatované Insuliny a mimoto by měly obsahovat pouze přírodně se vyskytující aminokyseliny.
Pod pojmem insulinové analogy sa v průběhu přihlášky rozumí látky s molekulovou strukturou, podobnou struktuře lidského insulinu s obsahem disulfidových můstků mezi A(7)Cys a B(7)Cys a mezi A(20)Cys a B(19)Cya a vnitřního disulfidového můstku mezi A(6)Cys a A(ll)Cys a 8 insulinovým účinkem.
Vynález je založen na překvapujícím zjištěni, že některé analogy insulinu, v nichž alespoň jeden zbytek aminokyseliny v lidském insulinu byl nahrazen přírodně se vyskytujícím zbytkem aminokyseliny mají požadovaný rychlý účinek.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat analogy lidského insulinu s rychlým účinkem, vytvořené náhradou jednoho nebo většího počtu aminokyselinových zbytků v molekule lidského insulinu přírodně se vyskytujícím zbytkem aminokyseliny, výsledný analog má menší sklon k samovolné tvorbě dimerů, tetramerů, hexamerů nebo polymerů a má stejný nebo vyšši negativní náboj při neutrálním pH než lidský insulin.
Aby bylo možno uskutečnit menši sklon k samovolné tvorbě dimerů, tetrsmerů, hexamerů, nebo polymerů, některé zbytky aminokyselin v lidském insulinu se s výhodou nahradí hydrofilnějšími zbytky aminokyselin. Také náhrada větším zbytkem vede v některých polohách ke sníženi sklonu k samovolné tvorbě dimerů, tetramerů, hexamerů, polymerů.
Předmětem vynálezu je způsob výroby insulinového analogu obecného vzorce I, kde
X znamená zbytek aminokyseliny lidského insulinu nebo zbytek odlišné aminokyseliny, a to v poloze
A8 His, Gly, Gin, Glu, Ser, Asn, Asp nebo Pro,
A9 Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gin, Asn, Ala nebo Pro,
A1O Ser, Leu, Pro, Val, His, Ale, Glu, Asp
A13 Pro, Ser, Val, Arg, His, Ala, Glu, Asp
A21 Asp, Glu, Ser nebo Thr,
Bl Glu, Asp, Thr, Ser nebo Gly,
82 Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly,
B5 Glu, Asp, Thr, Ser, Gin nebo Asn,
B9 Asp, Pro, Glu, Ile, Leu, Val, His, Thr,
BIO Asp, Arg, Glu, Αβη, Gin, Thr nebo Ser,
B12 Ile, Tyr, Asp nebo Glu,
B14 Glu, Asp, Asn, Gin, Ser, Thr nebo Gly
B16 Asp, Glu, Gin, Asn, Ser, Thr, His nebo
Bl7 Ser, Thr, Asn, Gin, Glu, Aap nebo His,
B18 Ser, Thr, Asn, Glu, Gin, Asp nebo His,
B20 Gin, Ser, Asn, Asp, Glu nebo Arg,
Thr, Gin nebo Asn,
Thr, Gly, Gin nebo Asn,
Gin, Ser nebo Asn,
Gin, Asn, Met, Tyr, Trp, Phe nebo Lys,
Arg,
B26, B27 a B28 Asp nebo Glu, za předpokladu, alespoň jeden zbytek ve významu X je odlišný v příslušné poloze od zbytku v molekule insulinu a v případě, že X v poloze A8 Je His nebo Phe,
CS 275513 85
X v poloze A21 je Asp,
X v poloze B5 je Ala,
X v poloze B9 je Leu,
X v poloze BIO je Asn nebo Leu,
X v poloze Bl2 je Asn nebo X v poloze B26 je Ala, pak alespoň jeden ze zbývajicich zbytků X je odlišný od zbytků aminokyseliny v lidském insulinu v dané poloze molekuly lidského insulinu a mimoto z N-terminólniho a/nebo z C-terminálniho zakončeni řetězce A- a/nebo řetězce B může být odstraněn jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin.
Ketězec A
GlylleValGluGlnCysCys XXX ČysSer X TyrGlnLeuGluAsnlyrCys X
2 3 4 5 6 |7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19|2O 21 i ř
X X AsnGln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu X X X Cys X GluArgGlyPhePhe X X · X LysThr
2 3 4 5 ó 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (I) řetězec B vyznačený tim, že se uvede do reakce prekursor insulinu obecného vzorce IX, v němž c| ε» x
Q znamená peptidový řetězec s obsahem n přírodně se vyskytujících aminokyselin,
R znamená Lys nebo Arg, znamená celé čislo 0 až 33, znamená 0 nebo 1 a má shora uvedený význam, s esterem L-threoninu za přítomnosti trypsinu nebo derivátu trypsinu s následnou přeměnou takto získaného threoninového esteru analogu lidského insulinu na analog lidského insulinu obecného vzorce I hydrolýzou a analog obecného vzorce I se z reakčni směsi izoluje.
3e také možno postupovat tak, že se uvede do reakce prekursor obecného vzorce XXI, v němž
V a S znamenají Lys nebo Arg a
X má význam uvedený v bodu 1,
Řetězec A
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 13 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 (II)
Řetězec B
Řetězec A
X X AsnGln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu XXX Cys X GluArgGlyFhePhe XXX LysThr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 .11 13 13 14 15 ló 17 13 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (III)
Řetězec B s trypsinem a karboxypeptidázou E ve vodném roztoku a analog lidského insulinu se z reakčni směsi izoluje.
S výhodou je alespoň většina aminokyselinových zbytků, užitá k substituci hydrofil nějši než zbytek aminokyseliny v molekule lidského insulinu a s výhodou jsou všechny aminokyselinové zbytky, užité k substituci hydrofilnějši než odpovídajíc! aminokyselinové zbytky lidského insulinu.
Pokud jde o hydrofilnost, jsou podrobnosti uvedeny v publikaci C. FrCmmel, 3. Theo Biol. 111, (1984), 247 až 260 (tabulka 1).
Ve shora uvedeném obecném vzorci I je s výhodou nejvýš sedm zbytků aminokyselin odlišných od zbytků aminokyselin v téže poloze v molekule lidského insulinu. Mejvýhod— nějši počet odlišných zbytků aminokyselin je 2 až 4.
Νονό analogy lidského insulinu s výhodou obsahuji Asp a/nebo Glu mi3to jedné nebo většího počtu hydroxyaminokyselin lidského insulinu nebo misto jednoho nebo většího počtu zbytků Gin a Asn v molekule lidského insulinu.
Analogy insulinu, získané způsobem podle vynálezu je možno zpracovávat na injekční roztoky s insulinovým účinkem. Injekční insulinové roztoky podle vynálezu obsahuji analo· gy lidského insulinu nebo některou z jejich soli, přijatelných z farmaceutického hlediska ve vodném roztoku, s výhodou za neutrálního pH. Vodné prostředí může být isotonické například přidáním chloridu sodného a glycerolu. Z pufrů je možno užit například acetáto vý nebo citrátový pufr a je také možno užit konservačniho činidla, například m-kresol, fenol nebo methyl-4-hydroxybenzoát. Insulinové roztoky mohou dále obsahovat zinečnató ionty.
Analogy lidského insulinu, vyrobené způsobem podle vynálezu je možno užit misto lidského insulinu nebo místo insulinu vepře pro dosaženi rychlého účinku insulinu.
Prekursory shora uvedeného obecného vzorce lij které,jeou výchozími produkty pro tuto reakci je možno připravit způsobem, který je analogický způsobu, popsanému v evropském patentovém spisu č. 01S3529A. Při prováděni tohoto způsobu se postupuje tak, že se sled DNA, který je kódem pro požadovaný prekursor veleni do vhodného prostředku pro expresi, který se pak přenese do kvasinek, čimž dojde k příslušné expresi a k vylučováni požadovaného prekursoru se správně uloženými disulfidovými můstky. Produkt exprese je pak možno izolovat ze živného prostředí.
Prekursory shora uvedeného vzorce III je možno získat způsobem, který Je analogický způsobu popsanému v evropské patentové přihlášce č. 86302133.3. Při prováděni tohoto způsobu se sled ONA, který je kódem pro prekursor včlení do vhodného prostředku pro expresi z kvasinek, prostředek se pak přenese do kvasinek, schopných exprese, čimž dojde k vylučováni produktu se správně uloženými disulfidovými můstky do prostředí, v němž jsou kvasinky pěstovány.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat nové insulinové analogy z jejich prekursorů při použiti DNA, která je kódem pro tyto nové prekursory, při použiti prostředků pro expresi s obsahem této DNA a kvasinkových kmenů, transformovaných těmito prostředky. Názvosloví
Zkratky, jichž je v průběhu přihlášky užito pro aminokyseliny, jsou zkratky, doporučené v □, Biol. Chem. 243, 1968, 3558. Aminokyseliny máji konfiguraci L.
Pokud jde o symboly, užité v popise vynálezu, znamená B(l-29) zkrácený řetězec B lidského insulinu od mista BlPhe do B29Lys a A(l-2l) znamená řetězec A lidského insulinu.
Substituce, provedené podle vynálezu jsou označovány před názvem insulin. Příkladem může být označeni B27Glu-lidský insulin, což znamená molekulu lidského insulinu v němž'Glu byl včleněn na misto Thr v poloze 27 řetězce B. B27Glu, B9Asp-lidský insulin znamená analog lidského insulinu, v němž Glu byl užit místo Ther v poloze 27 řetězce B a Asp byl užit misto Ser v poloze 9 řetězce B, B27Glu, B(1-29)Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidský insulin znamená prekursor insulinového analogu (vzorec II), v němž Glu byl užit místo Th v poloze 27 ve zkráceném řetězci B, přičemž řetězec B(l-29) a řetězec A jsou spolu spojeny peptidovým sledem Ala-Ala-Lys. Neni-li uvedeno jinak, rozumí se, že B(l-29) a řetězec A(l-21) jsou spolu spojeny disulfidovými můstky mezi A(7)Cys a B(7)Cys a mezi A(20) Cys a B(19)Cys jako v lidském insulinu a A-řetězec obsahuje vnitřní disulfidový můstek mezi A(6)Cys a A(ll)Cys.
3ak již bylo uvedeno, snahou vynálezu je navrhnout složení insulinových roztoků . pro injekční podáni, ve snaze o vyřešeni tohoto úkolu bylo nejprve zjištěno, že existuje podstatný rozdíl mezi insulinem v depotni formě nebo vo formě bolusu mezi insulinem v cirkulaci, rozdíl spočívá především v koncentraci tohoto insulinu. Insulin v krevním oběhu je vysoce zředěn a dosahuje ředění ÍO3·^ až 10“®, přičemž běži o monomer, nanejvýš se snad určité množství nachází ve formě dimeru. Daleko koncentrovanější insulin se nachází v B-buňkách slinivky břišní ve skladované formě a v roztoku, v němž se obvykle podává, se nachází většinou, i když ne zásadně v neaktivní hexamerni formě, například jako známý 2-zinkbexamer.
□e také známo, že lidský insulin se v roztoku vyskytuje v celé řadě molekulárních forem, a to jako monomer, dimer, tetramer a hexamer, jak bylo popsáno v publikaci Blundell a dalši, Advances in Protein Chemistry, Academie Press, New York and London, Sv.
26, str. 279 až 330, 1972, přičemž oligomerni formy jsou v případě vysokých koncentraci insulinu příznivější, monomer je pak účinnou formou insulinu.
Tetramer a hexamer nejsou účinné formy, dimer může být aktivní. Skutečnost, že se pomalejší absorpce, popsaná například v publikaci Binder, Diabetes Care 7, č. 2, 1984 často vyskytuje u koncentrovanějšioh roztoků, určených k pomalému uvolňováni insulinu je patrně možno vysvětlit tim, že je třeba určité doby k přeměně z hexameru, tetrameru a dimeru na účinnou monomerni formu.
Analogy lidského insulinu, vyrobené způsobem podle vynálezu jsou zajímavé tim, že rychlého účinku se dosahuje molekulární strukturou, z niž se netvoří snadno dimer, tetra· mer, hexamer nebo polymer, to znamená, že běží o látky se sníženou tendenci k samovolné tvorbě dimeru, tetrameru, hexameru nebo polymeru, a to af již v přítomnosti nebo v nepřítomnosti zinečnatých iontů, podstatných mezidruhových rozdílů mezi sledem aminokyselin, které v molekule insulinu existuji bylo již dávno usuzováno, že ne všechny zbytky aminokyselin, přítomné v molekule insulinu jsou zásadní pro dosaženi insulinového účinku a také to', že některé aminokyselinová zbytky, které nejsou podstatné pro dosažení insulinového účinku jsou důležité pro fyzikální vlastnosti molekuly insulinu. 3e například známo, že v případě insulinu morčete nedochází k tvorbě dimerů. Také sulfatovaný insulin a tetranitrotyrosininsulin nedimerizuje. 3e zřejmé, že celou řadu zbytků aminokyselin v molekule lidského insulinu je možno zaměnit bez podstatného poklesu insulinového účinku. Substituce ami nokyselin, prováděná způsobem podle vynálezu tedy směřuje k zamezení tvorby dimerů, tetramerů, hexamerů a polymerů bez ovlivněni insulinového účinku takto modifikované molekuly.
Zbytky aminokyselin v těch polohách řetězce A a B obecného vzorce I, v nichž může dojit k substituci nejsou zásadně důležité pro dosaženi insulinového účinku, jsou však důležité pro schopnost lidského insulinu tvořit dimery, tetramery, hexamery a polymery a pro rozpustnost lidského insulinu. Substituce, k nimž dochází pro provádění způsobu podle vynálezu mají za následek zábranu styčných mist mezi atomy v sousedních molekulách insulinu, která za běžných okolností usnadňuji tvorbu insulinových dimerů, tetramerů, hexamerů nebo polymerů,
Dak bylo možno očekávat, změny v některých polohách řetězce lidského insulinu jsou pro shora uvedené účely účinnější než změny jiné. Znamená to, že jediná substituce v řetězce B může k uvedenému účelu dostačovat, kdežto na jiných mistech může být zapotřebí k dosaženi téhož účinku provést alespoň dvě substituce. Substituce v řetězci A slouží převážně k zlepšeni rozpustnosti disociované molekuly. Výhodnými polohami pro substituci zbytků aminokyselin jsou polohy B9, B12, BIO, B26 a B27 jako takové nebo ve vzájemné kombinaci nebo spolu s dalši substituci zbytku aminokyselin na Jiných polohách molekuly lidského insulinu, jak je znázorněno v obecném vzorci I.
Substituce, spočívající v zavedeni zbytků negativnějších aminokyselin na místo původních bez náboje n'ebo s positivním nábojem má za následek negativnější náboj celé molekuly insulinu při neutrálním pH, přičemž se snižuje isoelektrický bod ve srovnání s lidským insulinem. 3e charakteristické, že analogy lidského insulinu, získané způsobem podle vynálezu mají tentýž nebo negativnější náboj při neutrálním pH a nižši isoelektrický bod než molekula lidského insulinu.
Obvykle je možno získat zavedením jedné nebo většího počtu negativněji nabitých zbytků aminokyselin misto nenabitých nebo positivně nabitých zbytků aminokyselin negativnější náboj celá molekuly insulinu při neutrálním pH a současně je možno snížit isoelektrický bod ve srovnání s molekulou lidského insulinu. 3e tedy charakteristické,
CS 275513 B6 že molekula insulinu po substitucí, provedené způsobem podle vynálezu za získáni příslušného analogu má tentýž nebo negativnější náboj při neutrálním pH a nižši isoelektrický bod než molekula lidského insulinu.
□edna až tři substituce obvykle dostačí k získáni analogu s rychlejším účinkem a tyto typy substituce tedy představuji výhodné provedení způsobu podle vynálezu. Při použití dvou až tři substituci je možno dosáhnout také zlepšené mísitelnosti s chráněnými insulinovými prostředky. 3e však zřejmé, že cíle vynálezu je možno dosáhnout i při větším počtu substituci, přičemž je současně možno dosáhnout ještě sekundárních žádoucích vlastností výsledného produktu.
Zejména může při další substituci, například 4 nebo 5 zbytky dojit získáni insulinového analogu, který má také menši sklon k tvorbě fibril, což je vlastnost zvláště žádoucí v případě, že je výsledný insulinový roztok určen k infusi. Obvykle však nemá být zapotřebí provést vice než 7 substituci pro získání insulinového analogu způsobem podle vynálezu. Výhodný počet je 2 až 4 substituce,
V následujícím textu znamená signální sled MF«Cl celý signální sled, kdežto “signální sled MF«ťl bez Glu-Ala-Glu-Ala- znamená sled, z něhož byly odstraněny na C-terminálnim zakončeni zbytky aminokyselin ve sledu Glu-Ala-Glu-Ala.
Způsob podle vynálezu bude osvětlen následujícími příklady.
Přiklad 1
Konstrukce syntetického genu, který je kódem pro B( l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidský insulin
Strukturální gen pro B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidský insulin byl zkonstruován při použiti kodonů z kvasinek následujícím způsobem:
Následujících 10 oligonukleotidů bylo syntetizováno na automatickém syntezátoru DNA při použiti metody na nosiči z porézního skla a při použiti fosforamiditu, jak bylo popsáno v publikaci S.L, Beucage a M.H. Carutherse (1981) v Tetrahedron Letters 22, str. 1859 až 1869:
I. AAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC
35- mer
II. AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA
36- mer
III. TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT
43-mer
IV. GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC
42-mer
V. TCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC
32-mer
VI. ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT
34-mer
VII. GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT
37- mer
VIII. TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC
37-mer
IX. TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT
36-mer
X: CTAGAGCCTGGGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG 33 mer
Ze shora uvedených 10 oligonukleotidů bylo vytvořeno 5 duplexů A-E tak, jak jsou uvedeny na obr. 1.
pmolů každého z duplexů A až E bylo vytvořeno z odpovídájících párů 5'-fosforylo váných oligonukleotidů I až X zahříváním 5 minut na 90 °C s následným zchlazením na teplo tu místnosti na dobu 75 minut. 33-mer (X) v duplexu E nebyl fosforylován na 5*-zakončeni, aby nedošlo k· dimerizaci na komplementárních zakončeních jednotlivých řetězců po štěpeni enzymem Xbal. Syntetický gen byl po smiseni pěti duplexů a následným působením 74-ligázy isolován jako pás o 182/183 párech bázi po elektroforéze ligečni směsi na 2% agarózovóm gelu.
Takto získaný syntetický gen je znázorněn na obr. 1
Syntetický gen byl navázán na fragment Kpnl-EcoRl o 4 kilobázich a na fragment Xbal -Kpnl o 8 kilobázich z pMT644 a na fragment EcoRlHgal 0 0,3 kilobázich z pKFN9 za vzniku následující struktury: TPIp-MF»6l signální sled-B(l-29)-Ala-Ala-Lye-A(l-21)-TPlY.
Plasmid pMT644 obsahuje sled DNA TPIp-MF«Cl signální sled-B(1-29)-Α(1-21)-ΤΡΙγ. Konstrukce plasmidu kPFN9 bude dále popsána.
Směs pak byla užita pro transformaci kompetentního kmene E. coli (r“, m+) (MTI72), 30 kolonii odolných proti ampicilinu bylo přeneseno na plotny s obsahem minimálního prostřed! M9 (T.Maniatis a další, Molecular Clonlng, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, str. 62), čimž bylo získáno 8 Leu+ kolonii. Pak bylo provedeno analyzováni sledu způso32 bem podle Maxama a Gilberta, bylo prokázáno, že sled P-Xbal-EcoRl-fragmentu je důkazem toho, že tři uvedené plasmidy obsahovaly gen s požadovaným sledem. 3eden z těchto pla3midů, pKNF27, byl zvolen pro ďalšl použiti.
Konstrukce plasmidu kPNF27 je znázorněna na obr. 2.
Konstrukce plasmidu pKFN9
Tento plasmid byl konstruován proto, aby bylo možno získat plasmid s místem pro působeni Hgal přímo za ukončením signálního sledu MF<41, Plasmid pMT544 byl rozštěpen enzymem Xbal a ze zakončeni 3'- bylo odštěpeno přibližně 250 bázi působením ExoIII nukleázy, současně byl plasmid rozštěpen působením enzymu Xbal. Pak byl připojen k DNA, která částečně obsahovala pouze Jeden řetězec 32-mer se sledem GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC s obsahem místa pro působeni enzymu Hgal. Působením Klenowovy polymerázy pak byla získána cirkulárni DNA s dvojitým řetězcem za současného působeni T4-ligázy. Po transformaci kolonii E. coli (r, m+) (MT 172) s obsahem plasmidu po mutaci bylo možno tyto kolonie 32 identifikovat hybridizací kolonii s 5*- P-označeným 32-merem. Výskyt nového mista pro působení Hgal bylo možno ověřit štěpením (EcoRi +Hgal, Hind3+Hgal). Po retransformaci byla vybrána čistá mutanta“ pKFN9 pro další použiti. Konstrukce pKFN9 je znázorněna na obr, 3.
Přiklad 2
Výroba B27Glu lidského insulinu
B27Glu-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (l-21)-lidského insulinu působením Thr-Obu a acidolyzou získaného esteru threoninu působením kyseliny trifluoroctóvé. Výroba se uskutečňuje v následujících stupních:
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulin
Plasmid kPKNF27 byl linearizován v jediném mistě působeni Xbal směrem dolů od inzulínového syntetického genu pro prekursor. Aby nedošlo ke zničeni mista působeni Xbal při vyplnění v dalším stupni, byl na linearizovaný plasmid na každém konci navázán vazný sled s dvojitým řetězcem, a to Xbal-Hind3 19-mer se sledem
Xbal Hind3
CTAGAAGAGCCCAAGACTA
TTCTCGGGTTCTGATTCGA
Linker byl fosforylován na v poloze 5'na jednoduchém zakončeni po působeni enzymu Xbal, byl však ponechán v nefosforylovaném stavu na zakončení Hind3, takže nemohlo dojit k polymeraci tohoto řetězce v průběhu vazby a cirkularizace DNA (obr.4).
5'-Mononukleotidy byly odstraněny z 3'-zakončení získané lineární DNA s dvojitým řetězcem působením nukleázy ExoIII. Působení nukleázou ExoIII bylo prováděno při teplotě 23 °C za podmínek, při nichž se z každého 3'-zakončenl DNA odstraní přibližně 250 nukleotidů [L.Guo a R.Wu (1983), Methods in Enzymology 100, str. 60 až 96j.
5'-Fosforylovený 25-met se sledem d(GTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC) se pak včlení do místa mutace. Po vyplněni působením Klenowovy polymerézy za přítomnosti T4-ligázy se ONA s dvojitým řetězcem štěpí působením Xbal. Pak se působením T4-ligázy vytvoří heteroduplexni cirkulárni DNA s mutaci jednoho řetězce.
Směs po ligaci byla užita k transformaci v E. coli (r , m+) (MT172) za současného použiti selekce na odolnost proti ampicilinu.
Mutanty byly identifikovány hybridizaci kolonii s 5'-32P-značeným 25-merem jako primerem mutageneze. Po retransformaci je možno prokázat, že plasmid pKNF37 z Jedné z výsledných kolonii obsahuje požadovanou mutaci, průkaz byl proveden zjištěním sledu □NA v Xbal-EcoRl-fragmentu o 0,5 kilobazich (A. Maxam a W.Gilbert (1980), v Methods in Enzymology 65, 499-560),
II. Transformace
S.· cerevisiae kmen MT663 (E2-7B X E11-3C a/z .delta tpi/delta t pi, pep 4-3/pep
4-3)‘byl pěstován na YPGal (1% Bacto extrakt z kvasnic, 2% Bacto pepton, 2% galaktóza',
1% laktát) do hustoty 0,6 při 600 nm. 100 ml kultury bylo odstraněno, promyto 10 ml vody a znovu uvedeno do suspenze v 10 ml 1,2 M sorbitolu, 25 mM Na2EDTA o pH 8,0 a 6,7 mg/ml dithiothreitolu. Suspenze byla inkubována při teplotě 30 °C 15 minut, pak byla odstraněna buňky byly znovu uvedeny do suspenze v 10 ml 1,2 M sorbitolu, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M citronanu sodného o pH 5,8, 2 mg Novozym 234. Suspenze byla inkubována 30 minut při teplotě 30 °C, buňky byly odděleny odstředěním, promyty v 10 ml 1,2 M sorbitolu a v 10 ml CAS (1,2 M sorbitolu, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris (Tris = tris(hydroxymethyl) aminomethan) při pH 7,5) a pak byly znovu uvedeny do suspenze ve 2 ml CAS, Pro transformaci bylo 0,1 ml buněk v CAS smiseno s přibližně 1 jig plasmidu pKFN37 a směs byla ponechána při teplotě místnosti 15 minut. Pak bylo přidáno 1 ml 20 % polyethylenglykolu 4 000, 10 mM CaClg, 10 mM Tris o pH 7,5 a směs byla ponechána dalších 30 minut při teplotě místnosti. Směs byla odstředěna a usazená vrstva byla znovu uvedena do suspenze v SOS (1,2 M sorbitol, 33% (obj.%) YPGaL, 6,7 mM CaCl2, 14 jjg/ml leucinu) a inkubuje se 2 hodiny při teplotě 30 °C. Suspenze se pak odstředí a usazenina se znovu uvede do suspenze v 0,5 ml 1,2 M sorbitolu, 6 ml agaru (prostředí SC, Sherman a dalši v Methods in Yaaet Genetice, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) bez leucinu, avšak s obsahem 1,2 M sorbitolu a 2,5 % agaru) při teplotě 52 °C a suspenze byla vlita na plotny s obsahem téhož tuhého agaru β obsahem sorbitolu. Kolonie transformantů byly izolovány po třech dnech inkubace při teplotě 30 °C a byly užity k založeni kultur v kapalném živném prostředí. Oeden z těchto transformantů, a to KFN40 (=MT663/pKFN37) byl užit k další charakterizaci.
III. Exprese B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulinového prekursoru
Kmen kvasinek KFN40 byl pěstován v prostředí YPD (1% extraktu z kvasnic, 2 % peptonu, (Difco Laboratories) a 2 % glukózy). 10 ml kultury uvedeného kmene bylo protřepáváno při teplotě 30 °C až do hustoty 26 při 600 nm. Po odstředění byl supernatant analyzován vysokotlakou kapalinovou chromatogrsfii v reversní fázi a byl prokázán obsah
13,5 mg/1 prekursoru.
IV. Transpeptidace
0,2 molu (47,1 g) Thr-OBu1, HOAC bylo rozpuštěno v dimethylformamidu na 100 ml roztoku, pak bylo přidáno 50 ml 76,5% (obj.%) dimethylformamidu ve vodě a 10 g surového B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidského insulinu bylo ve směsi rozpuštěno a směs byla uložena do thermostatu při teplotě 12 °C. Pak bylo přidáno 1 g trypsinu vs 25 ml 0,05 M octanu vápenatého a po 24 hodinách při teplotě 12 °C byla směs přidána ke 2 litrům ocetonu, vysrážené peptidy byly izolovány odstředěním a usušeny ve vakuu. B27Glu, BSOThr-OBu^-lidský insulin byl čištěn preparativni vysokotlakou kapalinovou chromatoCS 275513 B6 grafit na oxidu křemičitém-Cl8.
V. Přeměna na B27-lidský Insulin.
B27Glu,B30Thr-0But-lidský insulin byl rozpuštěn ve 100 ml kyseliny trifluoroctovó.
Po 2 hodinách stáni při teplotě místnosti byl roztok lyofilizován. Lyofilizovaný prášek byl rozpuštěn ve 400 ml citronanu sodného o koncentraci 47,5 mM pří pH 7. Peptidy byly vysráženy při pH 5,5 po přidáni 2,4 ml 1M ZnClg, izolovány odstředěním a usušeny ve vakuu. Produkt byl čištěn aniontoměničovou chromatografii a pak byl zbaven solí filtraci na gelu. Tímto způsobem bylo získáno 1,7 g B27-Glu-lidského insulinu.
Přiklad 3
Příprava B9Asp-lidského insulinu
B9Asp-lidský insulin byl získán transpeptidaci B9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)lidského insulinu působením Thr-0Buř a acidolysou takto získaného threoninového esteru působením kyseliny trifluoroctovó.
I. Konstrukce gehu, který je kódem pro B9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin
Tento gen byl zkonstruován stejným způsobem jak bylo popsáno pro gen, který je kódem pro B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin mutagenezou, specifickou pro určitou polohu při použiti pKFN27 a za řízeni 23-merem d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG).
Bylo prokázáno, že plasmid pKFN38 obsahuje požadovanou mutaci.
II. Transformace
Plasmid pKFN38 byl užit k transformaci kmene S. cerevisiae MT653 stejným způsobem jako v přikladu 2 II, byl získán transformant KFN41.
III. Exprese B9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Kmen kvasinek KFN41 byl pěstován na prostředí YPD, jak bylo popsáno v přikladu 2,
III. V supernanantu bylo nalezeno 2,5 mg/1 analogu prekursoru.
IV. Transpeptidace
7,4 g surového B9Asp,B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidskóho insulinu bylo podrobeno transpeptidaci způsobem podle přikladu 2,IV, čimž byl jako výsledný produkt získán B9Aep,B30Thr-0Bu''-lidský insulin.
V. Konverse
B9Asp,B3OThrOBu -lidský insulin byl přeměněn na B9Asp-lidský insulin způsobem popsaným v přikladu 2,V. Bylo získáno 0,83 g BSAsp-lidského insulinu.
Přiklad 4
Způsob výroby B9Asp,B27Glu-lidského insulinu
B9Asp,B27Glu-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B9Asp,B27Glu(Bl-21)Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidského insulinu působením Thr-OBu1 s následnou acidolysou získaného threoninového esteru působením kyseliny trifluoroctové.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B9Asp, B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin
Fragment plasmidu pKFN38 po štěpeni EcoRl-Hind3 o 367 párech bázi (přiklad 3) a fragment plasmidu pl<FN37 (přiklad 2) o 140 párech bázi Hind3Xbal se naváží na velký Xbal-EcoRl-fragment plasmidu pUC13 (tento plasmid byl zkonstruován a popsán jako v případě pUC8 a pUC9 v publikaci Vieira a dalši, Gene 19, str. 259 až 268 (1982), Směs vazbě byla užita k transformaci E. coli MT 172 a byla provedena selekce na odolnost proti ampicilinu. Z většího počtu transformantů byly připraveny plasmidy a tyto plasmidy byly analyzovány působením enzymů Pstl e HindS. Fragment Xbal-EcoRl o 0,5 kilobázich z jednoho plasmidu, v němž bylo možno prokázat správný sled míst pro působení enzymů byl navázán na fragment Xbal-Kpnl o 7,8 kilobázich a na fragment Kpnl-Eco R1 o 4,3 kilobázich, oba z plasmidu pMT644 (popsány v dánská patentové přihlášce č. 1293/84). Směs po vazbě byla užita k transformaci E. coli MT172 a kolonie byly izolovány podle odolnosti proti amplicinu. Plasmid pKFN43 z jedné z výsledných kolonii obsahoval gen pro požadovaný prekureor insulinového derivátu. Konstrukce plasmidu pKFN43 je. znázorněna na obr.5.
II. Transformace
Plasmid pKFN byl transformován v S. cerevisiae, kmen MT663 stejným způsobem jako v přikladu 2,11 a byl izolován transformant KFN44.
III. Exprese B9Asp,B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Kmen kvasinek KFN44 byl pěstován na prostřed! YPD stejně jako v přiladu 2,III.
V eupernatantu bylo prokázáno 7,3 mg/1 prekursoru insulinového analogu,
IV. Transpeptidace
12,7 g surového B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)- lidského insulinu se podrobi transpeptidaci způsobem, popsaným v přikladu 2, IV. za vzniku B9Asp,
B27Glu, B30Thr-0But-lidského insulinu.
V. Přeměna
B9Asp, B27Glu, BSOThr-OBu^lidský insulin byl převeden na B9Asp, B27Glu, B3OThrlidgký insulin a čištěn způsobem, popsaným v přikladu 2, V. Bylo získáno 1,0 g B9Asp, B27Glu-lídského insulinu.
Přiklad 5
Způsob výroby A8His, B9Asp, B27Glu-lidského insulinu
A8His, B9Asp, B27Glu-lidský insulin byl připraven transpeptidaci z 48His, B9Asp, B27Glu, B-(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského Insulinu působením Thr-0But s následnou acidolysou takto získaného threoninového esteru kyselinou trifluoroctovou podle přikladu 2.
1. Konstrukce genu, který je kódem pro A8His, B9Asp, B27Glu, B-(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (l-21)-lidský insulin.
Tento gen byl zkonstruován mutagenesi, cílenou na oligonukleotidy způsobem, popsaným v publikaci Y. Morinaga, T. Franceschini, S. Inouye a M. Inouye (1984), Blotechnology 2, 536 - 639. Plasmid, odvozený od pUCl3, který je kódem pro signální sled MG«£l a pro prekursor B9Asp, B27Glu-lidského insulinu (obr. 5), byl rozštěpen působením Hpal a Xbal. Velký fragment byl smísen s plasmidem, linearizovaným působením Ndel. Po denaturaci teplem a po zchlazeni 9měs obsahuje dvojité řetězce s mezerami s oknem'' v jednom řetězci v oblasti, která odpovídá genu pro prekursor insulinu (Hpal-Xbal). Mutagenický 37-mer d(GAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT) byl hybridisován na svrchu uvedený duplex vyplněním působením Klenowowy polymerázy s následnou vazbou. Směs byla užita k transformaci E. coli (MT172) a kolonie se podrobi selekci na odolnost proti amicilinu. Mutanty byly identifikovány hybridisacl kolonií 9 18-merem značeným radioaktivním fosforem na zakončeni 5', d(AATGCTGTCACTCCATCT). Po rétransformaci bylo možno prokázat, že plasmid z jedné z výsledných kolonii obsahoval požadovanou mutaci, zjištění bylo provedeno analýzou sledu DAN ve fragmentu Xba-I-EcoRI o velikosti 0,5 kb. Tento plasmid byl užit pro konstrukci kvasinkového plasmidu pKFN 102 způsobem, popsaným z přikladu 4 pro konstrukci plasmidu pKFN 43.
II. Transformace
Plasmid pKFNlO2 byl transformován do kmene S, cerevisiae MT663 stejným způsobem jako v přikladu 2, II a byl izolován produkt této transformace KFN109.
III. Exprese A8His, B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lya-A(l-21)-lidského insulinu.
Kmen kvasinek KFN109 byl pěstován na prostředí YPD způsobem, popsaným v příkladu
2, III. V supernatantu bylo možno prokázat 21,5 mg/1 prekursoru insulinového analogu.
IV. -V. Transpeptidace a přeměna
22,0 g surového A8His, B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidskóho insulinu bylo podrobeno transpeptidaci, přeměně a čištěni způsobem podle přikladu 2, IV-V. Tímto způsobem bylo získáno 4,0 g A8His, B9Asp, 827Glu-lidského insulinu.
Přiklad 6
Příprava Bl2Ile-lidského insulinu
Bl2Ile-lidský insulin byl připraven transpeptidaci Bl2Ile, B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu působením Thr-OBut s následnou acidolysou získaného threoninového esteru kyselinou trifluoroctovou způsobem, popsaným v přikladu 2.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro Bl2Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Fragment EcoRI-Xbal plasmidu pMT59B o velikosti 0,5 kb (konstrukce plasmidu pMT598 je popsána v zveřejněné patentové přihlášce č. 0164529A), který je kódem pro signální sled MFXíl (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) byl včleněn do fágu M13 mplO RF, rozštěpeného Xbal-EcoRI a odpovidajíci DNA s jednoduchým řetězcem byla čištěna od zbytků rekombinantniho fágu Ml3 mplO. DNA s jedním řetězcem byla hybridisována na mutagenní 27-mer NOR-92 d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC) a na universální M13 primer d(TCCCAGTCACGACGT). Pripery byly prodlouženy dNTP a Klenowovou polymerázou, vazba byla provedena T4 DNA-ligázou. Mutagenní primer KFN92 byl zvolen tak, aby došlo k odstraněni místa působeni BstNl, toto misto je jediné ve fragmentu Xba-EcoRl. Aby bylo možno provést selekci proti nemutovanému fragmentu EcoRI-Xbal, byla směs rozštěpena SstNl a postupně EcoRl a Xbal, načež byla navázána na vektor pUC13, rozštěpený EcoRl a Xbal. Z jednoho z transformentů byl zvolen plasmid pMT760, který neměl misto působeni SsNl ve sledu, který je kódem pro insulin. Požadovaný mutovaný sled byl ověřen analýzou sledu DNA podle Maxama a Gilberta. Plasmid pMT760 obsahuje sled EcoRI-Xbal o velikosti 0,5 kb, který odpovídá svrchu uvedenému témuž fragmentu z plasmidu pMT598 až na mutaci v poloze Bl2 (Val - Ile). Tento mutovaný sled byl pak přenesen do plasmidu pro expresi z kvasinek vazbou fragmentu EcoRI-Xbal o velikosti 0,5 kb plasmidu pMT760 na fragment XBal-Kpnl o velikosti 7,8 kb a na fragment Kpnl-EcoRl o velikosti 4,3 kb z plasmidu pMT644 za vzniku pMTA.
II. - V. Transformace, exprese, transpeptidace, přeměna
Plasmid pMTA byl transformován do kvasinkového kmene MTS63 způsobem, popsaným v příkladu 2, II a kmen transformantů MTA byl pěstován způsobem popsaným v přikladu 2,
III. V supernatantu bylo prokázáno 10,4 mg/1 prekursoru insulinového analogu. 10 g tohoto surového prekursoru bylo podrobeno transpeptidaci, přeměně a čištění podle přikladu 2, IV. - V. Výtěžek byl 1,3 g Bl2Ile-lidského insulinu.
Přiklad 7
Způsob výroby Bl2Tyr-lidského insulinu
Bl2Tyr-lidský insulin je možno získat transpeptidaci Bl2Tyr, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)~lldského insulinu působením Thr-OBu1 s následnou acidolysou získaného threoninového esteru kyselinou trifluoroctovou způsobem, popsaným v přikladu 2.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B12Tyr, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Gen byl zkonstruován způsobem, analogickým pro výrobu genu, který je kódem pro B12Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidskóho insulinu s tím rozdílem, že se užije primer KFN93 d(GTAGAGAGCTTCGTACAGGTGTGAGCC) misto KFN92.
II. až IV. Transformace, exprese, transpeptidace a přeměna
Stupně II a III se provádějí stejně jako v příkladu 2. V supernatantu je možno prokázat 1,7 mg/1 prekursoru insulinového analogu. Tento surový prekursor je pak možno podrobit transpeptidaci, přeměně a čištění způsobem podle přikladu 2, IV - V, čimž se ziská Bl2Tyr-lidský insulin.
Přiklad 8
Příprava BlOAsp-lidského insulinu
BlOAsp-lidský insulin byl připraven transpeptidaci BlOAsp, B(l-29)-Ala-Ala-LysA(l-21)-lidského insulinu působením Thr-OBu1· s následnou acidolysou získaného threoninovóho esteru kyselinou trifluoroctovou způsobem podle přikladu 2.
I, Konstrukce genu, který je kódem pro BlOAsp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidský insulin
Gen byl zkonstruován způsobem, analogickým způsobu výroby genu, který je kódem pro Bl2Ile, B( 1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidský insulin s tim rozdílem, že se užije primer KFN94 d(AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG) místo KFN92,
II. - V. Transformace, exprese, transpeptidace a přeměna
Stupně II-III byly provedeny způsobem podle příkladu 2. V supernatantu bylo možno prokázat 36 mg/1 prekursoru insulinového analogu. Tento surový prekursor byl podroben transpeptidaci, přeměněn a čistění způsobem podle příkladu 2, IV-V. Výtěžek byl 7,6 g BlOAsp-lidského insulinu.
Přiklad 9
Příprava B28Asp-lidského insulinu
B28Asp-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (l-2l)-lidského insulinu působením Thr-OMe s následnou hydrolýzou získaného thrloninové ho esteru při pH 8 až 12.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B28Asp, B(l-29)~Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin
Fragment EcoRl-Xbal plasmidu PMT 462 o velikosti 0,5 kb, který je kódem pro signální sled MF<C1 (mínus Glu-Ala-Glu-Ala)-8-C-A, tj. pro gen lidského proinsulinu, před nímž se nachází modifikovaný signální sled MF«Á1, byl včleněn do fágu Ml3 mplO RF rozštěpeného Xbal-EcoRl a odpovidajici DNA s jednoduchým řetězcem byla oddělena od rekombi nantního fágu Ml3 mplO, DNA s jednoduchým řetězcem byla pak jako templát hybridisována na 41-mer N0R205 d(TTCCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGAAGC) a na Ml3 universální primer d(TCCCAGTCACGACGT). Primery byly prodlouženy působením dNTP a Klenowovy polymerázy, vazba byla provedena T4 DNA-ligásou.
Po extrakci fenolem, vysráženým ethanolem po novém uvedeni do suspenze byla DNA rozštěpena restrikčními enzymy Apal, Xbal a EcoRl. Po další extrakci fenolem, vysráženi ethanolem a novém uvedeni do suspenze byla DNA navázána na pUC13, rozštěpeni EcoRlXbal. Směs po vazbě byla užita k transformaci E. coli (r”m+) a z celé řady transformantů byly připraveny plasmidy. Tyto plasmidy byly rozštěpeny působením EcoRl a Xbal a ty vzorky, které měly pásy při 0,5 a 0,6 kb, byly znovu užity k transformaci E. coli.
Z retransformace byly vybrány pouze transformanty, které obsahovaly pUC13 3 včleněným sledem o 0,5 kb.
Z jednoho z transformantů byl vybrán plasmid pMT881 9 požadovanou mutací v poloze B28 (Pro-^Asp). Mutovaný sled byl ověřen způsobem podle Maxama a Gilberta. Pak byl tento sled přenesen do plasmidu pro expresi z kvasinek navázáním fragmentu pMT881, a to EcoRl-Xbal o velikosti 0,5 kb na fragment Xbal-Kpnl o 7,8 kb a na fragment kpnl-EcoRl o 4,3 kb z plasmidu pMT644 za vzniku pMTAl.
II. Transformace
Plasmid pMTAl byl transformován v S. cerevisiae, kmen MT663 stejným způsobem jako v příkladu 2, II a byl izolován transformant MTAl.
III. Exprese B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Kmen kvasinek MTAl byl pěstován na prostředi YPO způsobem podle přikladu 2, III, Ze supernatantu bylo isolováno 7,2 mg/1 prekursoru insulinového analogu.
IV. Transpeptidace
Surový B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) byl podroben transpeptidaci způsobem podle přikladu 2, IV, avšak Thr-OBu* byl nahrazen Thr-OMe za vzniku B28Asp, B30Thr-0Me-lidského insulinu.
V. Přeměna
B28Asp, B30THr-0Me-lidský insulin byl dispergován ve vodě v množství 1 g/100 ml a byl rozpuštěn přidáním IN hydroxidu sodného do pH 10,0. Tato hodnota pH pak byla udr14 žována 24 hodin při teplotě 25 °C. Vzniklý B2BAsp-lidský insulin byl pak vysrážen přidáním chloridu sodného v koncentraci 8g/100 ml, trihydrátu octanu sodného do 1,4 g/100 ml a octanu zinečnatého ve formě dihydrátu do 0,01 g/100 ml s následným přidáním IN kyseliny chlorovodíkové do pH 5,5, Sraženina se isoluje odstředěním a čistí se chromatografii na aniontoměniči, načež se zbaví soli filtrací na gelu. Tímto způsobem se ziská 0,2 g B28Asp-lidského insulinu.
Přiklad 10
Příprava A2lAsp, B9Asp, B27Glu-lidského insulinu
A2lAsp, B9Asp, B27Glu-lidský insulin byl připraven z Q9Asp, B27Glu-lidskóho insulinu selektivní deamidací, která byla provedena hydrolýzou 5% roztoku 14 dnů při teplotě 37 °C a při pH 2,5. Deamidovaný produkt byl isolován chromatografií na aniontoměniči. Přiklad 11
Příprava B27Glu, A2lAgp-lidského insulinu
B27Glu, A21A9p-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B27Glu, A2lAsp, B(l29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) působení Thr-OBu1 s následnou acldolysou získaného thrioninového esteru působením kyseliny trifluoroctové způsobem podle příkladu 2.
B27Glu, A2lAsp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) je možno připravit z B27Glu, B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-2l) jako v přikladu 2 deamidací podle příkladu 10.
Charakterisace analogu lidského insulinu, vyrobeného způsobem podle vynálezu
Stanoveni molekulové hmotnosti (Gutfreund H., Biochemical Cloumal 42 (544) 1948).
Metoda: Onauer Membrán Osmometer
Typ: 1.00
Membrána: Schleicher a SchQll Typ: R52
Rozpouštědlo: 0,05 M NaCl, pH 7,5 Teplota: 21 °C.
Výsledky: Hodnoty jsou uvedeny v následující tabulce. Všechny typy insulinu byly měřeny v koncentraci 4 mg/ml.
Tabulka I typ insulinu molekulová hmotnost k jednotky lidský 2Zn insulin lidský Zn volný insulin
Zn volný B27Glu-lidský insulin
Zn volný B12Xle-lidský insulin
Zn volný B27Glu, A2lAsp-lidský insulin Zn volný B9Asp, B27Glu-lidský insulin Zn volný B9Asp-lidský insulin Zn volný B9Asp, B27Glu, A21Asp-lidský insulin Zn volný B9Asp, B27Glu, A8His-lidský insulin
36+2
29+1
22+1
17+1
8+1 6+1 6+1 6+1 9 + 3
CS 275613 86
Z toho, co je uvedeno v tabulce 1, je zřejmé, že analogy lidského insulinu mají značně nižší molekulovou hmotnost ve srovnáni s lidským insulinem, což znamená, že samovolné vytvářeni dimerů, tetramerů a hexamerů je méně vyjádřené a v některých případech k němu vůbec nedochází,
V následující tabulce budou uvedeny hodnoty pro biologický poločas a pro biologickou účinnost pro analogii lidského insulinu.
analog lidského insulinu poločas ' biologická účinnost ’ (% lidského insulinu) v % lidského insulinu
B27Glu-lidský insulin 78 101 (83 až 123)
B9Asp, B27Glu-lidský insulin 54 110 (90 až 193)
Bl2Ile-lidský insulin 78 91 (80 až 103)
B27Glu, A21Asp-lidský insulin 56 64 (58 až 71)
B9Asp-lidský insulin 52 80 (72 až 90)
A2lAsp, B9Asp, B27Glu-lidský insulin 56 75 (66 až 85)
A8His, B9Asp, B27Glu-lidský insulin 68 116 (101 až 135)
x) Biologický poločas je doba, do niž zmizl z místa podkožní injekce 50 % účinné látky u vepřů. Bylo užito metody podle publikace Binder 1969, Acata Pharmacol. Toxicol. (suppl. 2) 27:1-87.
xx) Pokus s hladinou glukózy v krvi u myši podle evropského lékopisu, pravděpodobnost 95 %.
Z tabulky 2 vyplývá, že biologický poločas pro insulinové analogy je daleko kratší než tatáž hodnota pro lidský insulin.
Biologická účinnost těchto analogii je srovnatelné s účinnosti lidského insulinu nebo je nepatrně nižši.

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    1. Způsob výroby insulinového analogu obecného vzorce I, kde X znamená zbytek aminokyselin lidského insulinu nebo zbytek odlišné aminokyseliny, a to v poloze
    A8 His, Gly, Gin, Glu, Ser, Asn, Asp nebo Pro,
    A9 Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gin, Asn, Ala nebo Pro,
    A10 Ser, Leu, Pro, Val. His , Ala , Glu, , Asp A13 Pro, Ser, Val, Arg, His , Ala , Glu, , Asp A21 Asp, Glu, Ser nebo Thr, Bl i Glu, Asp, Thr, Ser π lebo Gly. B2 , Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly. B5 1 Glu, Asp, Thr, Ser, Gin nebo , Asn, B9 , Asp, Pro, Glu, Xle, Leu, Val. His, Thr, BIO Asp, Arg. Glu, Asn, Gin , Thr nebo Ser, B12 Ile, Tyr. Asp nebo Glu, Bl4 Glu, Asp, Asn, Gin, Ser , Thr nebo Gly. B16 Asp, Glu, Gin, Asn, Ser , Thr , His nebo B17 Ser, Thr, Asn, Gin, Glu , Asp nebo His, B18 Ser, Thr, Asn, Glu r Gin . Asp nebo His, B20 Gin, Ser, Asn, Asp, Glu nebo Arg, B26 , B27 a B2 8 Asp nebo Glu 9
    Thr, Gin nebo Asn,
    Thr, Gly, Gin nebo Asn,
    Gin, Ser nebo Asn,
    Gin, Asn, Met, Tyr, Trp, Phe nebo Lys,
    Arg,
    CS 275613 86 za předpokladu alespoň jeden zbytek ve významu X je odlišný v přílušnó poloze od zbytku v molekule insulinu a v případě, že X v poloze A8 je His nebo Phe,
    X v poloze A21 je Asp,
    X v poloze B5 je Ala,
    X v poloze B9 je Leu,
    X v poloze BIO je Asn nebo Leu,
    X v poloze B12 je Asn nebo X v poloze B26 je Ala, pak alespoň jeden ze zbývajících zbytků X je odlišný od zbytků aminokyselin v lidském insulinu v dané poloze molekuly lidského insulinu a mimoto z N-terminálniho a/nebo z C-terminálniho zakončeni řetězce A- a/nebo řetězce B může být odstraněn jeden nebo větši počet zbytků aminokyselin.
    Řetězec A
    GlylleValGluGlnCysCys XXX CysSer X TyrGlnLeuGluAsnTyrCys X 1 2 3 4 5 6 8 y 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19)20 21 . 1 Z <5 . y
    X X AsnGln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu X X X Cys X GluArgGlyPhePhe X X -X LysTnr ! 2 3 4 5 6 7 8 y 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (I)
    Řetězec B vyznačující se tim, že se uvede do reakce prekursor insulinu obecného vzorce II, v němž Qn
    R n
    mi
    X znamená peptidový řetězec s obsahem £ přírodně se vyskytujících aminokyselin, znamená Lys nebo Arg, znamená celé čislo O až 33, znamená O nebo 1 a má shora uvedený význam.
    Řetězec A (II)
    Řetězec B s aeterem L-threoninu za přítomnosti trypsinu nebo derivátu trypsinu s následnou přeměnou takto získaného threoninového esteru analogu lidského insulinu na analog lidského insulinu obecného vzorce I hydrolýzou a analog obecného vzorce I se z reakčni směsi izoluje.
  2. 2. Způsob podle bodu 1 pro výrobu analogů lidského insulinu, vyznačující sa tím, že se uvede do reakce prekursor obecného vzorce III, v němž V a S znamenají Lys nebo Arg a
    X má význam, uvedený v bodu 1,
    Řetězec A
    X X AsnOln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu XXX Cys X GluArgGlyFhePhe XXX LysThr
    I 2
  3. 3 4 5 6 7 8 9 10 .11 13 13 14 15 ló 17 18 19 20 21 22 23 24 25 25 27 28 29 30 (III)
    Řetězec B a s trypsinem a karboxypeptidázou E ve vodném roztoku a analog lidského insulinu se z reakčni směsi izoluje,
  4. 4. Způsob podle bodu 1, vyznečujíci se tim, že se užije prekursorů obecného vzorce II nebo III, v nichž nejvýše sedm zbytků aminokyselin ve významu X je odlišný od zbytků aminokyselin v odpovídající poloze molekuly lidského insulinu.
  5. 5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tim,že se užije prekursorů obecného vzorce
    II nebo III lidského insulinu, v nichž zbytky aminokyselin ve významu X se voli Asp nebo Glu.
  6. 6. Způsob podle bodu 1, vyznačujíc! se tim, že se užije prekursorů obecného vzorce II nebo III, v nichž alespoň jeden ze zbytků X v polohách 8(9), B(10), B(12), B(26), B(27) nebo B(28) je odlišný od zbytky aminokyseliny v odpovidajici poloze molekuly lidského insulinu.
  7. 7. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tim,že se užije prekursorů insulinu obecného vzorce II nebo III, v nichž alespoň jeden ze zbytků X v polohách B(9), B(12),
    B(27) nebo B(28) je odlišný od zbytku aminokyseliny na odpovídájícím místě molekuly lidského insulinu.
  8. 8. Způsob podle bodu 1, vyznačujíc! se tim, že ee užije prekursorů insulinu obecného vzorce II nebo III, v nichž X v poloze B27 znamená Glu, X v poloze B12 znamená Ile nebo Tyr, X v poloze B9 znamená Asp, X v poloze A21 a v poloze B9 znamená Asp a v poloze B27 znamená Glu, X v poloze A8 znamená His, v poloze B9 znamená Asp a v poloze B27 znamená Glu, X v poloze BIO znamená Asp nebo X v poloze B9 znamená Asp a v poloze B27 znamená Glu nebo X v poloze B28 znamená Asp.
CS866310A 1985-08-30 1986-08-29 Process for preparing insulin analogs CS275613B6 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK395685A DK395685D0 (da) 1985-08-30 1985-08-30 Peptider
DK467785A DK467785D0 (da) 1985-10-14 1985-10-14 Peptider

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS8606310A2 CS8606310A2 (en) 1990-09-12
CS275613B6 true CS275613B6 (en) 1992-03-18

Family

ID=26067291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS866310A CS275613B6 (en) 1985-08-30 1986-08-29 Process for preparing insulin analogs

Country Status (25)

Country Link
US (1) US5618913A (cs)
EP (1) EP0214826B1 (cs)
JP (1) JP2662390B2 (cs)
KR (1) KR940000756B1 (cs)
CN (1) CN1029977C (cs)
AR (1) AR241801A1 (cs)
AT (1) ATE113061T1 (cs)
AU (1) AU593274B2 (cs)
CA (1) CA1306212C (cs)
CS (1) CS275613B6 (cs)
DD (1) DD268976A5 (cs)
DE (2) DE3650101T2 (cs)
ES (1) ES2001624A6 (cs)
FI (1) FI102182B1 (cs)
GR (1) GR862233B (cs)
HU (1) HU206518B (cs)
IE (1) IE66138B1 (cs)
IL (1) IL79887A (cs)
LU (1) LU90484I2 (cs)
NL (1) NL990042I2 (cs)
NO (2) NO177009C (cs)
NZ (1) NZ217406A (cs)
PH (1) PH25772A (cs)
PT (1) PT83278B (cs)
YU (2) YU46023B (cs)

Families Citing this family (221)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK437786D0 (da) * 1986-09-12 1986-09-12 Nordisk Gentofte Insulinprecursorer
CA1339416C (en) * 1987-02-25 1997-09-02 Liselotte Langkjaer Insulin derivatives
US4992417A (en) * 1987-07-17 1991-02-12 Mount Sinai School Of Medicine Superactive human insulin analogues
US4992418A (en) * 1987-07-17 1991-02-12 Mount Sinai School Of Medicine Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin
CA1340772C (en) 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
KR900701842A (ko) * 1988-07-20 1990-12-04 헨리 브뢰늄 인간 인슐린 동족체와 그를 포함하는 제제
DE3837825A1 (de) * 1988-11-08 1990-05-10 Hoechst Ag Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung
US5716927A (en) * 1988-12-23 1998-02-10 Novo Nordisk A/S Insulin analogs having a modified B-chain
FI913037A7 (fi) * 1988-12-23 1991-06-20 Novo Nordisk As Ihmisen insuliinianalogit
US5514646A (en) * 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
US5208217A (en) * 1989-04-20 1993-05-04 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Hepatospecific insulin analogues
JPH04504858A (ja) * 1989-04-20 1992-08-27 マウント　シナイ　スクール　オブ　メディスン　オブ　ザ　シティー　ユニバーシティー　オブ　ニューヨーク 肝臓特異性インシュリン類似体
DK155690D0 (da) * 1990-06-28 1990-06-28 Novo Nordisk As Nye peptider
DK158390D0 (da) * 1990-07-02 1990-07-02 Novo Nordisk As Nye peptider
DK10191D0 (da) * 1991-01-22 1991-01-22 Novo Nordisk As Hidtil ukendte peptider
DK33591D0 (cs) * 1991-02-27 1991-02-27 Novo Nordisk As
CA2071382A1 (en) * 1991-06-21 1992-12-22 David N. Brems Insulin analogs
WO1994014461A1 (en) * 1992-12-18 1994-07-07 Eli Lilly And Company Insulin analogs
DK72793D0 (da) * 1993-06-21 1993-06-21 Novo Nordisk As Nyt produkt
EP0705275B1 (en) * 1993-06-21 1999-02-03 Novo Nordisk A/S Asp-b28 insulin crystals
US5461031A (en) * 1994-06-16 1995-10-24 Eli Lilly And Company Monomeric insulin analog formulations
US5474978A (en) * 1994-06-16 1995-12-12 Eli Lilly And Company Insulin analog formulations
US5504188A (en) * 1994-06-16 1996-04-02 Eli Lilly And Company Preparation of stable zinc insulin analog crystals
US5547929A (en) * 1994-09-12 1996-08-20 Eli Lilly And Company Insulin analog formulations
WO1996010417A1 (en) * 1994-10-04 1996-04-11 Novo Nordisk A/S PREPARATIONS CONTAINING AspB28 HUMAN INSULIN AND NICOTINAMIDE
US5597893A (en) * 1994-10-31 1997-01-28 Eli Lilly And Company Preparation of stable insulin analog crystals
US5646242A (en) 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
US5693609A (en) * 1994-11-17 1997-12-02 Eli Lilly And Company Acylated insulin analogs
YU18596A (sh) * 1995-03-31 1998-07-10 Eli Lilly And Company Analogne formulacije monomernog insulina
US5700904A (en) * 1995-06-07 1997-12-23 Eli Lilly And Company Preparation of an acylated protein powder
US5631347A (en) * 1995-06-07 1997-05-20 Eli Lilly And Company Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein
EP0921812B2 (en) * 1996-06-20 2011-12-21 Novo Nordisk A/S Insulin preparations containing a halogenide
PE79099A1 (es) 1997-06-13 1999-08-24 Lilly Co Eli Formulaciones de insulina estables
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
CA2306905A1 (en) 1997-10-24 1999-05-06 Eli Lilly And Company Fatty acid-acylated insulin analogs
CO4970787A1 (es) 1997-12-23 2000-11-07 Lilly Co Eli Composiciones insolubles de insulina y derivados de insulina que controlan la glucosa sanguinea
CN1241942C (zh) * 1998-02-23 2006-02-15 纽罗克里恩生物科学有限公司 使用胰岛素的肽类似物治疗糖尿病的方法
DE19825447A1 (de) * 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
US6933272B1 (en) 1998-09-22 2005-08-23 Erik Helmerhorst Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments
AUPP609198A0 (en) * 1998-09-22 1998-10-15 Curtin University Of Technology Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments
PT1141014E (pt) 1999-01-06 2005-04-29 Genentech Inc Variante mutante do factor de crescimento semelhante a insulina (igf-i)
PT1141015E (pt) 1999-01-06 2009-10-13 Genentech Inc Variantes mutantes do factor de crescimento do tipo insulina (igf)i
US6746853B1 (en) * 1999-05-19 2004-06-08 Xencor, Inc. Proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes
CN1125081C (zh) * 1999-09-08 2003-10-22 中国科学院上海生物化学研究所 重组天然和新型人胰岛素及其制备方法
US7022674B2 (en) * 1999-12-16 2006-04-04 Eli Lilly And Company Polypeptide compositions with improved stability
ATE328605T1 (de) 2000-03-24 2006-06-15 Genentech Inc Verwendung von insulin zur behandlung von knorpelkrankheiten
EP1292324A2 (en) * 2000-05-05 2003-03-19 Novo Nordisk A/S Critical illness neuropathy
DE60133271T2 (de) 2000-05-16 2009-04-23 Genentech, Inc., South San Francisco Behandlung von knorpelerkrankungen
AR025646A1 (es) * 2000-09-13 2002-12-04 Beta Lab Sa Cepa de levaduras metilotroficas recombinantes productoras de un precursor de insulina, construcciones de adn y metodo para obtener la cepa.
US7638618B2 (en) 2001-02-20 2009-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
US7202059B2 (en) 2001-02-20 2007-04-10 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium
DE10114178A1 (de) 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
EP1444219A1 (en) 2001-10-12 2004-08-11 Novo Nordisk A/S Substituted piperidines and their use for the treatment of diseases related to the histamine h3 receptor
BR0213583A (pt) 2001-11-19 2004-08-24 Novo Nordisk As Processo para preparar um composto de insulina, e, composto de insulina
GB0206792D0 (en) 2002-03-22 2002-05-01 Leuven K U Res & Dev Normoglycemia
DE10227232A1 (de) 2002-06-18 2004-01-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
US7193035B2 (en) 2002-10-29 2007-03-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Crystals of insulin analogs and processes for their preparation
WO2004089470A2 (en) 2003-04-11 2004-10-21 Novo Nordisk A/S New amide derivatives and pharmaceutical use thereof
US7871607B2 (en) * 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
JP4781264B2 (ja) 2003-06-27 2011-09-28 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 医療用液体組成物の高水分遮断容器
US20060183667A1 (en) * 2003-07-11 2006-08-17 Novo Nordisk A/S Stabilised insulin compositions
EP1644411A2 (en) * 2003-07-11 2006-04-12 Novo Nordisk A/S Stabilised insulin compositions
PL1648933T3 (pl) * 2003-07-25 2010-01-29 Conjuchem Biotechnologies Inc Długo działające pochodne insuliny i związane z tym sposoby
EP2287184A3 (en) 2003-08-05 2011-08-10 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
AU2004261353B2 (en) 2003-08-05 2009-12-10 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
WO2005046716A1 (en) * 2003-11-13 2005-05-26 Novo Nordisk A/S Soluble pharmaceutical compositions for parenteral administration comprising a glp-1 peptide and a insulin peptide of short time action for treatment of diabetes and bulimia
US20060287221A1 (en) 2003-11-13 2006-12-21 Novo Nordisk A/S Soluble pharmaceutical compositions for parenteral administration comprising a GLP-1 peptide and an insulin peptide of short time action for treatment of diabetes and bulimia
EP3300721B2 (en) 2003-11-20 2025-01-08 Novo Nordisk A/S Propylene glycol-containing peptide formulations which are optimal for production and for use in injection devices
WO2005054291A1 (en) 2003-12-03 2005-06-16 Novo Nordisk A/S Single-chain insulin
JP2007515235A (ja) 2003-12-22 2007-06-14 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 医薬液を保存するための、透明で、可撓性且つ不浸透性のプラスチック製容器
MXPA06008209A (es) 2004-01-21 2006-08-31 Novo Nordisk As Conjugacion de peptidos mediada por transglutaminasa.
US7875700B2 (en) 2004-07-19 2011-01-25 Biocon Limited Cation complexes of insulin compound conjugates, formulation and uses thereof
CN102140875B (zh) 2004-11-04 2014-11-26 亨特道格拉斯有限公司 用于建筑开口的单轨道层叠板体遮蔽件
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
US20080171695A1 (en) 2005-02-02 2008-07-17 Novo Nordisk A/S Insulin Derivatives
JP4933455B2 (ja) 2005-02-02 2012-05-16 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規のインスリン誘導体
ATE536344T1 (de) 2005-07-04 2011-12-15 High Point Pharmaceuticals Llc Histamine h3 receptor antagonisten
US8106090B2 (en) 2005-07-20 2012-01-31 Eli Lilly And Company 1-amino linked compounds
CN102660614A (zh) 2005-08-16 2012-09-12 诺沃-诺迪斯克有限公司 制备成熟胰岛素多肽的方法
JP5027812B2 (ja) 2005-09-14 2012-09-19 サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング トリプシンの変異体によるインスリン前駆体の切断
EP1951658B1 (en) 2005-11-17 2012-09-26 Eli Lilly & Company Glucagon receptor antagonists, preparation and therapeutic uses
US20090074882A1 (en) 2005-12-28 2009-03-19 Novo Nordisk A/S Insulin compositions and method of making a composition
WO2007081824A2 (en) * 2006-01-06 2007-07-19 Case Western Reserve University Fibrillation resistant proteins
US20090069216A1 (en) * 2006-02-21 2009-03-12 Novo Nordisk A/S Single-Chain Insulin Analogues and Pharmaceutical Formulations Thereof
ES2387955T3 (es) 2006-02-27 2012-10-04 Novo Nordisk A/S Derivados de insulina
US20090054305A1 (en) 2006-03-15 2009-02-26 Novo Nordisk A/S Mixtures of Amylin and Insulin
EP1999120B1 (en) 2006-03-28 2012-06-27 High Point Pharmaceuticals, LLC Benzothiazoles having histamine h3 receptor activity
PL2049475T3 (pl) 2006-04-24 2012-08-31 Lilly Co Eli Pirolidynony podstawione cykloheksylem jako inhibitory 11-betahydrokysterydu dehydrogenazy 1
WO2007128815A1 (en) 2006-05-09 2007-11-15 Novo Nordisk A/S Insulin derivative
KR101441444B1 (ko) 2006-05-09 2014-09-18 노보 노르디스크 에이/에스 인슐린 유도체
NZ571972A (en) 2006-05-29 2011-09-30 High Point Pharmaceuticals Llc 3- (1, 3-benz0di0x0l-5-yl) -6- (4-cyclopropylpiperazin-1-yl) -pyridazine, its salts and solvates and its use as histamine h3 receptor antagonist
WO2007140619A1 (en) * 2006-06-08 2007-12-13 Diabecore Medical Inc. Derivatized insulin oligomers
DE102006031962A1 (de) 2006-07-11 2008-01-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Amidiertes Insulin Glargin
DE102006031955A1 (de) * 2006-07-11 2008-01-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende
WO2008015099A2 (en) 2006-07-31 2008-02-07 Novo Nordisk A/S Pegylated, extended insulins
HUE029512T2 (en) 2006-09-22 2017-03-28 Novo Nordisk As Protease Resistant Insulin Analogs
WO2008043033A2 (en) * 2006-10-04 2008-04-10 Case Western Reserve University Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues
WO2008049711A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-02 Novo Nordisk A/S Peptide extended insulins
US10100098B2 (en) 2006-12-13 2018-10-16 Stelis Biopharma Private Limited Insulin production methods and proinsulin constructs
US20120214963A1 (en) * 2011-02-23 2012-08-23 Elona Biotechnologies Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs therefrom
US9387176B2 (en) 2007-04-30 2016-07-12 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
WO2008139496A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 Bigtec Private Limited Recombinant human insulin and a method thereof
US20100144592A1 (en) 2007-06-01 2010-06-10 Nove Nordisk A/S Stable Non-Aqueous Pharmaceutical Compositions
US20110144010A1 (en) 2007-06-01 2011-06-16 Novo Nordisk A/S Spontaneously Dispersible Preconcentrates Including a Peptide Drug in a Solid or Semisolid Carrier
ES2744384T3 (es) 2007-06-13 2020-02-24 Novo Nordisk As Formulación farmacéutica que comprende un derivado de insulina
JP2010535842A (ja) * 2007-08-13 2010-11-25 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 速効型インスリンアナログ
JP5710253B2 (ja) 2007-08-13 2015-04-30 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 速効型インスリンアナログ
WO2009022006A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Novo Nordisk A/S Insulins with an acyl moiety comprising repeating units of alkylene glycol containing amino acids
RU2514430C2 (ru) 2007-08-15 2014-04-27 Ново Нордиск А/С Аналоги инсулина с ацильной и алкиленгликолевой группировкой
CN101918026B (zh) 2007-11-20 2016-03-02 Ambrx公司 经修饰胰岛素多肽和其用途
WO2009087081A2 (de) 2008-01-09 2009-07-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit-/wirkungsprofil
KR20110004366A (ko) 2008-03-18 2011-01-13 노보 노르디스크 에이/에스 프로테아제 안정화되고, 아실화된 인슐린 유사체
JP5818681B2 (ja) 2008-04-01 2015-11-18 ノボ・ノルデイスク・エー／エス インスリンアルブミンコンジュゲート
WO2009129250A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Case Western Reserve University Meal-time insulin analogues of enhanced stability
US20110195896A1 (en) * 2008-04-22 2011-08-11 Case Western Reserve University Isoform-specific insulin analogues
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
TWI451876B (zh) 2008-06-13 2014-09-11 Lilly Co Eli 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物
KR20120129875A (ko) 2008-07-31 2012-11-28 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체
US9200053B2 (en) 2008-07-31 2015-12-01 Case Western Reserve University Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24
DK2307441T3 (da) 2008-08-07 2016-05-23 Biocon Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af insulinforbindelser
DE102009038210A1 (de) 2009-08-20 2011-03-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
DE102008051834A1 (de) 2008-10-17 2010-04-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
AU2009305472B2 (en) * 2008-10-17 2013-12-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Combination of an insulin and a GLP-1 agonist
DE102008053048A1 (de) 2008-10-24 2010-04-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
CN102202683A (zh) 2008-10-30 2011-09-28 诺沃-诺迪斯克有限公司 用少于每日一次的注射频率注射胰岛素来治疗糖尿病
JP2012509879A (ja) 2008-11-21 2012-04-26 ハイ ポイント ファーマシューティカルズ，リミティド ライアビリティ カンパニー アダマンチルベンズアミド化合物
US9018190B2 (en) 2009-03-27 2015-04-28 Adocia Functionalized oligosaccharides
FR2943538B1 (fr) 2009-03-27 2011-05-20 Adocia Formulation a action rapide d'insuline recombinante humaine
ES2614161T3 (es) 2009-07-06 2017-05-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Preparados acuosos de insulina que comprenden metionina
JP2012532177A (ja) 2009-07-06 2012-12-13 サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 熱及び振動安定性インスリン製剤
WO2011003823A1 (de) 2009-07-06 2011-01-13 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Langsamwirkende insulinzubereitungen
NZ597964A (en) 2009-07-31 2014-04-30 Sanofi Aventis Deutschland Long acting insulin composition
NZ598021A (en) 2009-07-31 2014-05-30 Sanofi Aventis Deutschland Prodrugs comprising an insulin linker conjugate
US8399407B2 (en) * 2009-09-17 2013-03-19 Case Western Reserve University Non-standard insulin analogues
RU2537239C2 (ru) 2009-11-13 2014-12-27 Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх Фармацевтическая композиция, включающая агонист glp-1, инсулин и метионин
KR101772372B1 (ko) 2009-11-13 2017-08-29 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 Ｇｌｐ-1 효능제 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 조성물
US8637096B2 (en) 2009-12-04 2014-01-28 Curtis C. Stojan Compositions and method for enhancing insulin activity
MX2012006568A (es) 2009-12-11 2012-12-17 Univ Case Western Reserve Analogos de insulina con aminoacidos clorados.
EP2460527A1 (en) 2010-01-21 2012-06-06 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
UY33326A (es) 2010-04-14 2011-12-01 Sanofi Aventis Conjugados de insulina-sirna
US20130143803A1 (en) 2010-05-10 2013-06-06 Novo Nordisk A/S Process for the Preparation of Insulin-Zinc Complexes
EP2582719B1 (en) 2010-06-16 2016-08-10 Indiana University Research and Technology Corporation Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
CN102985440B (zh) 2010-06-23 2016-10-26 诺沃-诺迪斯克有限公司 包含额外的二硫键的胰岛素衍生物
EP2605789B1 (en) 2010-08-17 2019-06-05 Ambrx, Inc. Modified relaxin polypeptides and their uses
BR112013004756B1 (pt) 2010-08-30 2020-04-28 Sanofi Aventis Deutschland uso de ave0010 para a fabricação de um medicamento para o tratamento da diabetes melito tipo 2
EP2438930A1 (en) 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
JP6049625B2 (ja) 2010-10-27 2016-12-21 ノヴォ ノルディスク アー／エス 様々な注射間隔を用いて施されるインスリン注射を使用する、真性糖尿病の治療
EP2632478B1 (en) 2010-10-27 2019-07-24 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections administered with varying injection intervals
JP2013545782A (ja) 2010-12-14 2013-12-26 ノヴォ ノルディスク アー／エス 長時間作用型インスリンと組み合わせた速効型インスリン
WO2012104339A1 (en) * 2011-02-01 2012-08-09 Novo Nordisk A/S Purification of insulin
US10130684B2 (en) 2011-02-03 2018-11-20 Pharmedica Ltd. Oral dissolving films for insulin administration, for treating diabetes
WO2012115638A1 (en) 2011-02-23 2012-08-30 Elona Biotechnologies Glargine proinsulin compositions and methods of producing glargine insulin analogs therefrom
WO2012115637A1 (en) * 2011-02-23 2012-08-30 Elona Biotechnologies Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs
JP2014509603A (ja) 2011-03-15 2014-04-21 ノヴォ ノルディスク アー／エス システイン置換を含むヒトインスリン類似体およびヒトインスリン誘導体
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
SI2750699T1 (sl) 2011-08-29 2015-11-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Farmacevtska kombinacija, za uporabo pri glikemični kontroli pri pacientih, ki imajo sladkorno bolezen tipa 2
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
US20130231281A1 (en) 2011-11-02 2013-09-05 Adocia Rapid acting insulin formulation comprising an oligosaccharide
CA2858253A1 (en) * 2011-12-15 2013-06-20 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. Human insulin analogue and acylated derivative thereof
WO2013096386A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Indiana University Research And Technology Corporation Ctp-based insulin analogs for treatment of diabetes
KR20150002777A (ko) 2012-04-11 2015-01-07 노보 노르디스크 에이/에스 인슐린 제제
WO2013164375A1 (en) 2012-05-01 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition
US20130315891A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Matthew Charles Formulations of human tissue kallikrein-1 for parenteral delivery and related methods
HRP20170673T1 (hr) 2012-06-04 2017-07-14 Diamedica Inc. Glikozilacijske izoforme kalikreina 1 iz ljudskog tkiva
WO2014052451A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analog dimers
EA034393B1 (ru) 2012-11-13 2020-02-03 Адосиа Состав инсулина быстрого действия, содержащий замещенное анионное соединение
JP6735561B2 (ja) 2012-12-03 2020-08-05 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． Ｏ−グリコシル化カルボキシ末端部分（ｃｔｐ）ペプチド系のインスリンおよびインスリン類似体
US9867869B2 (en) 2012-12-12 2018-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Insulin derivatives for diabetes treatment
MX360420B (es) 2012-12-19 2018-10-31 Wockhardt Ltd Una composicion acuosa estable que comprende insulina humana o un analogo o derivado de la misma.
US20150246129A1 (en) 2012-12-26 2015-09-03 Wockhardt Limited Pharmaceutical composition
TWI780236B (zh) 2013-02-04 2022-10-11 法商賽諾菲公司 胰島素類似物及/或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物
AU2014241743B2 (en) 2013-03-14 2018-07-05 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin-incretin conjugates
US10137172B2 (en) 2013-04-30 2018-11-27 Novo Nordisk A/S Administration regime
WO2015044922A1 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Wockhardt Limited Pharmaceutical composition
CN105636979B (zh) 2013-10-07 2020-01-10 诺和诺德股份有限公司 胰岛素类似物的新衍生物
US9895424B2 (en) 2014-01-09 2018-02-20 Sanofi Stabilized pharmaceutical formulations of insulin analogues and/or insulin derivatives
US9895423B2 (en) 2014-01-09 2018-02-20 Sanofi Stabilized pharmaceutical formulations of insulin aspart
EP3091995B1 (en) 2014-01-09 2024-03-20 Sanofi Stabilized pharmaceutical formulations of insulin aspart
FR3020947B1 (fr) 2014-05-14 2018-08-31 Adocia Composition aqueuse comprenant au moins une proteine et un agent solubilisant, sa preparation et ses utilisations
US9795678B2 (en) 2014-05-14 2017-10-24 Adocia Fast-acting insulin composition comprising a substituted anionic compound and a polyanionic compound
WO2015196174A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Greene Howard E Infusion delivery devices and methods
WO2016001862A1 (en) 2014-07-04 2016-01-07 Wockhardt Limited Extended release formulations of insulins
ES2822994T3 (es) 2014-09-24 2021-05-05 Univ Indiana Res & Tech Corp Conjugados de incretina-insulina
EP3204410B1 (en) 2014-10-06 2021-01-20 Case Western Reserve University Biphasic single-chain insulin analogues
CN108064173B (zh) 2014-11-21 2021-05-18 默沙东公司 胰岛素受体部分激动剂
BR112017012406A2 (pt) 2014-12-12 2018-07-31 Sanofi Aventis Deutschland formulação com relação fixa de insulina glargina/lixisenatida
TW201630622A (zh) 2014-12-16 2016-09-01 美國禮來大藥廠 速效胰島素組合物
CN105884879A (zh) * 2015-01-26 2016-08-24 漳州博欣生物技术有限公司 一种胰岛素类似物的化学合成方法
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
CA2996455A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives and the medical uses hereof
JO3749B1 (ar) 2015-08-27 2021-01-31 Lilly Co Eli تركيبات إنسولين سريعة المفعول
FR3043557B1 (fr) 2015-11-16 2019-05-31 Adocia Composition a action rapide d'insuline comprenant un citrate substitue
US20190142963A1 (en) 2016-04-15 2019-05-16 Richard D. DiMarchi Fgf21 c-terminal peptide optimization
GB201607918D0 (en) 2016-05-06 2016-06-22 Arecor Ltd Novel formulations
WO2017205191A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists and glp-1 analogues
US10689430B2 (en) 2016-05-25 2020-06-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists
US10815287B2 (en) 2016-08-02 2020-10-27 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Acylated derivative of human insulin or analogue thereof
AU2017334290B2 (en) 2016-09-29 2023-04-20 Arecor Limited Novel formulations
SI3554534T1 (sl) 2016-12-16 2021-09-30 Novo Nordisk A/S Farmacevtski sestavki, ki vsebujejo inzulin
EP3592377A4 (en) 2017-03-09 2021-02-17 Diamedica Inc. TISSUE KALLICREIN DOSAGE FORMS 1
GB201707187D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Arecor Ltd Novel formulations
GB201707189D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Arecor Ltd Novel formulations
GB201707188D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Arecor Ltd Novel formulations
CN110662551B (zh) 2017-06-01 2023-07-18 伊莱利利公司 速效胰岛素组合物
CA3071686A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Novo Nordisk A/S Novel acylated insulin analogues and uses thereof
CA3094237A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Arecor Limited Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound
CA3094308A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Arecor Limited Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound
KR102833828B1 (ko) 2018-04-04 2025-07-15 아레콜 리미티드 인슐린 화합물의 전달을 위한 의료용 주입 펌프 시스템
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
EP3845240B1 (en) 2018-09-12 2024-11-06 Amphastar Nanjing Pharmaceuticals, Inc. Pro-insulin aspart structure and method for preparing insulin aspart
KR20200082618A (ko) 2018-12-31 2020-07-08 주식회사 폴루스 인슐린 과발현용 램프 태그 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법
JP7518149B2 (ja) 2019-07-12 2024-07-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス 高濃度インスリン製剤
JP6995284B2 (ja) * 2019-12-11 2022-01-14 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規インスリン類似体およびそれらの使用
CN114901681B (zh) 2019-12-30 2024-04-09 甘李药业股份有限公司 胰岛素衍生物
MX2022008139A (es) 2019-12-30 2022-10-03 Gan & Lee Pharmaceuticals Co Ltd Compuestos de glp-1 de acción prolongada.
GB202004814D0 (en) 2020-04-01 2020-05-13 Arecor Ltd Novel formulations
CN118574842A (zh) 2022-01-28 2024-08-30 甘李药业股份有限公司 酰化胰岛素
AR129357A1 (es) 2022-05-18 2024-08-14 Protomer Tech Inc Compuestos aromáticos que contienen boro y análogos de insulina relacionados

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2252157C3 (de) * 1972-10-25 1976-03-18 Hoechst Ag Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten
US4652525A (en) * 1978-04-19 1987-03-24 The Regents Of The University Of California Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
US4565785A (en) * 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule
JPS55138391A (en) * 1979-04-13 1980-10-29 Shionogi & Co Ltd New synthetic method of peptide derivative
IE50892B1 (en) * 1980-02-11 1986-08-06 Novo Industri As Process for preparing insulin esters
US4340674A (en) * 1980-05-05 1982-07-20 The Upjohn Company Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces
US4351901A (en) * 1980-03-24 1982-09-28 Cetus Corporation Method for single nucleotide alteration
DK319780A (da) * 1980-07-24 1982-01-25 Forenede Bryggerier As Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner
ZA824218B (en) * 1981-06-29 1983-04-27 Cetus Corp Plasmid for producing human insulin
DK58285D0 (da) * 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
US5008241A (en) * 1985-03-12 1991-04-16 Novo Nordisk A/S Novel insulin peptides
DK129385A (da) * 1985-03-22 1986-09-23 Novo Industri As Peptider og fremstilling deraf
DK134189D0 (da) * 1989-03-20 1989-03-20 Nordisk Gentofte Insulinforbindelser
US5559094A (en) * 1994-08-02 1996-09-24 Eli Lilly And Company AspB1 insulin analogs

Also Published As

Publication number Publication date
HUT42526A (en) 1987-07-28
EP0214826A3 (en) 1987-06-03
CA1306212C (en) 1992-08-11
ATE113061T1 (de) 1994-11-15
IL79887A (en) 1991-11-21
IL79887A0 (en) 1986-11-30
YU46023B (sh) 1992-12-21
YU46857B (sh) 1994-06-24
CN86106574A (zh) 1988-08-03
HU206518B (en) 1992-11-30
FI863512A0 (fi) 1986-08-29
NO863474L (no) 1987-03-02
ES2001624A6 (es) 1988-06-01
NO177009C (no) 1995-07-05
NL990042I2 (nl) 2000-03-01
AU6206686A (en) 1987-03-05
FI102182B (fi) 1998-10-30
KR870002165A (ko) 1987-03-30
PT83278A (en) 1986-09-01
NO863474D0 (no) 1986-08-29
NL990042I1 (nl) 2000-02-01
US5618913A (en) 1997-04-08
NZ217406A (en) 1989-05-29
DD268976A5 (de) 1989-06-14
LU90484I2 (fr) 2000-02-21
DE10075008I2 (de) 2004-10-21
DE10075008I1 (de) 2000-05-18
PT83278B (pt) 1989-03-30
JPS6253999A (ja) 1987-03-09
FI102182B1 (fi) 1998-10-30
KR940000756B1 (ko) 1994-01-29
DE3650101D1 (de) 1994-11-24
FI863512L (fi) 1987-03-01
AR241801A1 (es) 1992-12-30
CS8606310A2 (en) 1990-09-12
PH25772A (en) 1991-10-18
YU4188A (en) 1990-06-30
IE66138B1 (en) 1995-12-13
YU148486A (en) 1991-04-30
NO2000005I1 (no) 2000-07-21
EP0214826B1 (en) 1994-10-19
CN1029977C (zh) 1995-10-11
AU593274B2 (en) 1990-02-08
GR862233B (en) 1986-12-31
DE3650101T2 (de) 1995-02-23
IE862317L (en) 1987-02-28
NO177009B (no) 1995-03-27
EP0214826A2 (en) 1987-03-18
JP2662390B2 (ja) 1997-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS275613B6 (en) Process for preparing insulin analogs
EP0419504B1 (en) Insulin analogues
EP0463072B1 (en) Novel insulin compounds
AU648670B2 (en) A-C-B Proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
JP2766999B2 (ja) プロペプチド
RU2176646C2 (ru) Инсулин и его производные с повышенной способностью связывать цинк
CA2006578A1 (en) Human insulin analogues
CA2330183C (en) Novel insulin analogs with enhanced zinc binding
WO1988010299A1 (en) A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation
RU2104305C1 (ru) Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций
WO1992015611A1 (en) Novel insulin derivatives
DK159274B (da) Hurtigt virkende human insulinanaloger og injicerbare oploesninger med hurtigt indsaettende virkning indeholdende saadanne insulinanaloger

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20060829