(57) Anotace :
l?ešenl se týká způsobu výroby insulinového analogu obecného vzorce I, kde X znamená zbytek aminokyseliny lidského insulinu nebo zbytek odlišné aminokyseliny a to v poloze A8, A9, AlO, A13, A21, B2, B5.B9, BlO, Bl2, B14, B16, B17, B18, B2O, B26, B27 a 1 B28, za předpokladu, alespoň jeden zbytek ve významu X ja odlišný v příslušné poloze od zbytku v molekule insulinu a v případě, že X v poloze A8 je His nebo Phe,
X v poloze A21 je Asp, X v poloze B5 je Ala, X v poloze B9 je Leu, X v poloze BIO je Asn nebo Leu, X v poloze Bl2 je Asn nebo X v poloze B26 je Ala, pak alespoň jeden ze zbývajících zbytků X je odlišný od zbytků aminokyselin v lidském insulinu v dané poloze molekuly lidského insulinu a mimoto z N-terminálniho a/nebo z C-terminálniho zakončeni řetězce A- a/nebo řetězce B může být odstraněn jeden nebo větši počet zbytků aminokyselin, tím, že se uvede do reakce prekursor insulinu s esterem L-threoninu za přítomnosti trypsinu nebo derivátu trypsinu s následnou přeměnou takto získaného threoninovóho esteru analogu lidského insulinu na analog lidského insulinu obecného vzorce I hydrolýzou a analog obecného vzorce I se z reakčni směsi izoluje.
ČS 275613 B6 .Z
CS 275513 B6
Vynález se týká způsobu výroby analogů insulinu, a to lidského insulinu, který má po podkožním podání rychlý nástup účinku. Získané roztoky insulinu, vhodné pro injekční podáni obsahuji shora uvedený analog.
Při léčbě cukrovky již bylo navrhováno mnoho typů insulinových přípravků. Některé z těchto prostředků mají rychlý účinek, jiná máji účinek více nebo méně prodloužený.
Insulinové preparáty a rychlým nástupem účinku Je možno užít v akutních situacích, jako jsou například hyperglykemické koma, nutnost chirurgického zákroku, těhotenství a závažné infekce. Mimoto Je možno opakovanými dávkami rychle účinkujícího insulinu několikrát denně často zvládnout cukrovku, u niž bylo těžké léčebného efektu dosáhnout při použiti insulinu s prodlouženým účinkem,
V posledních letech vzniká snaha zajistit takovou léčbu insulinem, která by pokud možno napodobovala vylučováni insulinu -buňkami zdravého organismu, aby totiž k uvolněni insulinu docházelo v závislosti na Jídle při zachováni stélé bazálni hladiny insulinu. Klinická zkoumáni prokázala, že Je diabetikovi možno zajistit téměř normálni koncentrace insulinu i glukózy jednou denní injekci insulinu s dlouhodobým účinkem k pokryti bazálni potřeby s injekčním doplněním malých množství Insulinu s rychlým nástupem účinku před hlavními jidly.
Insulinová deriváty s rychlým nástupem účinku Je rovněž možno podávat ve směsi s insulinovými deriváty se středně dlouhou nebo prodlouženou dobou účinku při léčbě diabetiků, jejichž stav vyžaduje silnější počáteční účinek kromě středně dlouhého a prodlouženého účinku.
Insulinové deriváty s rychlým nástupem účinku Je možno taká použít ve formě kontinuální infuse.
Po podkožní injekci insulinu s rychlým účinkem bylo možno pozorovat na počátku zpomalenou absorpci, jak bylo popsáno v publikaci Binder, Diabetes Care 7, č. 2 (1984), str. 188 až 199. Toto počáteční zpožděni absorpce, které má za následek pomalejší nástup účinku je však nežádoucí v případě, že je zapotřebí přesného řízeni metabolismu. Smísením insulinových roztoků s rychlým účinkem a insulinových roztoků z prodlouženým účinkem může mimoto dojit ke zpomalenému vstřebáváni insulinu s rychlým účinkem.
□e tedy zřejmé, že by bylo zapotřebí získat insulinové roztoky s rychlým účinkem a s rychlejším nástupem účinku po podkožní injekci se současnou zlepšenou mlsitelnosti s injekčními prostředky insulinu s protrahovaným účinkem.
Další nevýhodou známých insulinových roztoků s rychlým účinkem je tendence insulinu k tvorbě fibril a ke srážení z insulinových roztoků v průběhu jeho kontinuálního přivádění, Čimž dochází k ucpáni mechanických části a katetrů.
Mimoto by také bylo zapotřebí nalézt další insulinové přípravky pro léčbu nemocných, resistentnich proti normálnímu insulinu.
Předmětem vynálezu Je způsob výroby nového insulinového roztoku s rychlým účinkem S jednou nebo větším počtem následujících zlepšených vlastností:
1) rychlejší nástup účinku po podkožní injekci nebo po podáni jinou cestou,
2) zlepšená misitelnost s insulinovými prostředky s protrahovaným účinkem,
3) snížená tendence k vytvářeni fibril v případě, že se tohoto prostředku užije v implantovatelném přívodním systému a
4) použitelnost pro léčbu resistentnich nemocných (nizká afinita k již existujícím protilátkám).
Shora uvedeného cíle je možno dosáhnout při použití nového analogu lidského insulinu, který je možno získat způsobem podle vynálezu.
Byla již popsána dlouhá řada insulinových analogů. Mffrku a dalši v Hoppy-Seyler's Z. Physiol. Chem. 3S0 (1979), 1619 až 1632 popisuji syntézu analogů lidského Insulinu, která se liši od liského insulinu náhradou Jediné aminokyseliny v polohách 2, 5, 6, 7, 8 a 11 řetězce A a 5, 7, 13 a 16 řetězce B a zároveň poskytují možnost nových pohledů na vztahy mezi strukturou a účinností insulinu. V průběhu dalších studii byly modifikovány hlavni oblasti insulinu, které se váži na receptory [b(22)-B(26)J , aby bylo možno sledovat vliv těchto změn na účinnost vazby na receptory. Nové analogy insulinu však neměly vlastnosti, požadované uvedenými autory.
CS 275613 06
3θ známo, že insulinové deriváty, převedené na sulfát mají nižší tendenci k tvorbě fibril, jak bylo popsáno v publikaci Albisser a další, Desired Characteristic9 of insulin to be ušed in infusion pumpa v Guerigulan O.L. a další, US Pharmacopeial Convention, Rockwille, Maryland, str. 84 až 95 a mají malý antigenni účinek. Tyto typy insulinů jsou však heterogenní směsi alespoň devíti různých insulinových derivátů, které obsahuji průměrně 4,5 sulfátových esterových skupin v molekule. Sulfátované insuliny máji mimoto sníženou účinnost, ktsrá tvoři pouze přibližně 20 % účinnosti nativního insulinu. Dalši nevýhodou těchto derivátů ve srovnání s nativním insulinem je skutečnost, že zbytečně obsahuji zbytky aminokyselin, které jsou chemicky modifikovány, tj. aminokyseliny, které se v přírodním prostředí nevyskytuji.
Vynález si klade za úkol navrhnout způsob výroby takových analogů insulinu, které by byly homogenní, měly by vyšši biologickou účinnost než sulfatované Insuliny a mimoto by měly obsahovat pouze přírodně se vyskytující aminokyseliny.
Pod pojmem insulinové analogy sa v průběhu přihlášky rozumí látky s molekulovou strukturou, podobnou struktuře lidského insulinu s obsahem disulfidových můstků mezi A(7)Cys a B(7)Cys a mezi A(20)Cys a B(19)Cya a vnitřního disulfidového můstku mezi A(6)Cys a A(ll)Cys a 8 insulinovým účinkem.
Vynález je založen na překvapujícím zjištěni, že některé analogy insulinu, v nichž alespoň jeden zbytek aminokyseliny v lidském insulinu byl nahrazen přírodně se vyskytujícím zbytkem aminokyseliny mají požadovaný rychlý účinek.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat analogy lidského insulinu s rychlým účinkem, vytvořené náhradou jednoho nebo většího počtu aminokyselinových zbytků v molekule lidského insulinu přírodně se vyskytujícím zbytkem aminokyseliny, výsledný analog má menší sklon k samovolné tvorbě dimerů, tetramerů, hexamerů nebo polymerů a má stejný nebo vyšši negativní náboj při neutrálním pH než lidský insulin.
Aby bylo možno uskutečnit menši sklon k samovolné tvorbě dimerů, tetrsmerů, hexamerů, nebo polymerů, některé zbytky aminokyselin v lidském insulinu se s výhodou nahradí hydrofilnějšími zbytky aminokyselin. Také náhrada větším zbytkem vede v některých polohách ke sníženi sklonu k samovolné tvorbě dimerů, tetramerů, hexamerů, polymerů.
Předmětem vynálezu je způsob výroby insulinového analogu obecného vzorce I, kde
X znamená zbytek aminokyseliny lidského insulinu nebo zbytek odlišné aminokyseliny, a to v poloze
A8 His, Gly, Gin, Glu, Ser, Asn, Asp nebo Pro,
A9 Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gin, Asn, Ala nebo Pro,
A1O Ser, |
Leu, |
Pro, Val, |
His, Ale, |
Glu, |
Asp |
A13 Pro, |
Ser, |
Val, Arg, |
His, Ala, |
Glu, |
Asp |
A21 Asp, |
Glu, |
Ser nebo |
Thr, |
|
|
Bl Glu, |
Asp, |
Thr, Ser |
nebo Gly, |
|
|
82 Arg, |
His, |
Ala, Glu, |
Asp, Thr, |
Pro, |
Gly, |
B5 Glu, |
Asp, |
Thr, Ser, |
Gin nebo Asn, |
|
B9 Asp, |
Pro, |
Glu, Ile, |
Leu, Val, |
His, |
Thr, |
BIO Asp, |
Arg, |
Glu, Αβη, |
Gin, Thr |
nebo |
Ser, |
B12 Ile, |
Tyr, |
Asp nebo |
Glu, |
|
|
B14 Glu, |
Asp, |
Asn, Gin, |
Ser, Thr |
nebo |
Gly |
B16 Asp, |
Glu, |
Gin, Asn, |
Ser, Thr, |
His |
nebo |
Bl7 Ser, |
Thr, |
Asn, Gin, |
Glu, Aap |
nebo |
His, |
B18 Ser, |
Thr, |
Asn, Glu, |
Gin, Asp |
nebo |
His, |
B20 Gin, |
Ser, |
Asn, Asp, |
Glu nebo |
Arg, |
|
Thr, Gin nebo Asn,
Thr, Gly, Gin nebo Asn,
Gin, Ser nebo Asn,
Gin, Asn, Met, Tyr, Trp, Phe nebo Lys,
Arg,
B26, B27 a B28 Asp nebo Glu, za předpokladu, alespoň jeden zbytek ve významu X je odlišný v příslušné poloze od zbytku v molekule insulinu a v případě, že X v poloze A8 Je His nebo Phe,
CS 275513 85
X v poloze A21 je Asp,
X v poloze B5 je Ala,
X v poloze B9 je Leu,
X v poloze BIO je Asn nebo Leu,
X v poloze Bl2 je Asn nebo X v poloze B26 je Ala, pak alespoň jeden ze zbývajicich zbytků X je odlišný od zbytků aminokyseliny v lidském insulinu v dané poloze molekuly lidského insulinu a mimoto z N-terminólniho a/nebo z C-terminálniho zakončeni řetězce A- a/nebo řetězce B může být odstraněn jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin.
Ketězec A
GlylleValGluGlnCysCys XXX ČysSer X TyrGlnLeuGluAsnlyrCys X
2 3 4 5 6 |7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19|2O 21 i ř
X X AsnGln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu X X X Cys X GluArgGlyPhePhe X X · X LysThr
2 3 4 5 ó 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (I) řetězec B vyznačený tim, že se uvede do reakce prekursor insulinu obecného vzorce IX, v němž c| ε» x
Q znamená peptidový řetězec s obsahem n přírodně se vyskytujících aminokyselin,
R znamená Lys nebo Arg, znamená celé čislo 0 až 33, znamená 0 nebo 1 a má shora uvedený význam, s esterem L-threoninu za přítomnosti trypsinu nebo derivátu trypsinu s následnou přeměnou takto získaného threoninového esteru analogu lidského insulinu na analog lidského insulinu obecného vzorce I hydrolýzou a analog obecného vzorce I se z reakčni směsi izoluje.
3e také možno postupovat tak, že se uvede do reakce prekursor obecného vzorce XXI, v němž
V a S znamenají Lys nebo Arg a
X má význam uvedený v bodu 1,
Řetězec A
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 13 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 (II)
Řetězec B
Řetězec A
X X AsnGln X LeuCysGly X X Leu X Glu X Leu XXX Cys X GluArgGlyFhePhe XXX LysThr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 .11 13 13 14 15 ló 17 13 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (III)
Řetězec B s trypsinem a karboxypeptidázou E ve vodném roztoku a analog lidského insulinu se z reakčni směsi izoluje.
S výhodou je alespoň většina aminokyselinových zbytků, užitá k substituci hydrofil nějši než zbytek aminokyseliny v molekule lidského insulinu a s výhodou jsou všechny aminokyselinové zbytky, užité k substituci hydrofilnějši než odpovídajíc! aminokyselinové zbytky lidského insulinu.
Pokud jde o hydrofilnost, jsou podrobnosti uvedeny v publikaci C. FrCmmel, 3. Theo Biol. 111, (1984), 247 až 260 (tabulka 1).
Ve shora uvedeném obecném vzorci I je s výhodou nejvýš sedm zbytků aminokyselin odlišných od zbytků aminokyselin v téže poloze v molekule lidského insulinu. Mejvýhod— nějši počet odlišných zbytků aminokyselin je 2 až 4.
Νονό analogy lidského insulinu s výhodou obsahuji Asp a/nebo Glu mi3to jedné nebo většího počtu hydroxyaminokyselin lidského insulinu nebo misto jednoho nebo většího počtu zbytků Gin a Asn v molekule lidského insulinu.
Analogy insulinu, získané způsobem podle vynálezu je možno zpracovávat na injekční roztoky s insulinovým účinkem. Injekční insulinové roztoky podle vynálezu obsahuji analo· gy lidského insulinu nebo některou z jejich soli, přijatelných z farmaceutického hlediska ve vodném roztoku, s výhodou za neutrálního pH. Vodné prostředí může být isotonické například přidáním chloridu sodného a glycerolu. Z pufrů je možno užit například acetáto vý nebo citrátový pufr a je také možno užit konservačniho činidla, například m-kresol, fenol nebo methyl-4-hydroxybenzoát. Insulinové roztoky mohou dále obsahovat zinečnató ionty.
Analogy lidského insulinu, vyrobené způsobem podle vynálezu je možno užit misto lidského insulinu nebo místo insulinu vepře pro dosaženi rychlého účinku insulinu.
Prekursory shora uvedeného obecného vzorce lij které,jeou výchozími produkty pro tuto reakci je možno připravit způsobem, který je analogický způsobu, popsanému v evropském patentovém spisu č. 01S3529A. Při prováděni tohoto způsobu se postupuje tak, že se sled DNA, který je kódem pro požadovaný prekursor veleni do vhodného prostředku pro expresi, který se pak přenese do kvasinek, čimž dojde k příslušné expresi a k vylučováni požadovaného prekursoru se správně uloženými disulfidovými můstky. Produkt exprese je pak možno izolovat ze živného prostředí.
Prekursory shora uvedeného vzorce III je možno získat způsobem, který Je analogický způsobu popsanému v evropské patentové přihlášce č. 86302133.3. Při prováděni tohoto způsobu se sled ONA, který je kódem pro prekursor včlení do vhodného prostředku pro expresi z kvasinek, prostředek se pak přenese do kvasinek, schopných exprese, čimž dojde k vylučováni produktu se správně uloženými disulfidovými můstky do prostředí, v němž jsou kvasinky pěstovány.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat nové insulinové analogy z jejich prekursorů při použiti DNA, která je kódem pro tyto nové prekursory, při použiti prostředků pro expresi s obsahem této DNA a kvasinkových kmenů, transformovaných těmito prostředky. Názvosloví
Zkratky, jichž je v průběhu přihlášky užito pro aminokyseliny, jsou zkratky, doporučené v □, Biol. Chem. 243, 1968, 3558. Aminokyseliny máji konfiguraci L.
Pokud jde o symboly, užité v popise vynálezu, znamená B(l-29) zkrácený řetězec B lidského insulinu od mista BlPhe do B29Lys a A(l-2l) znamená řetězec A lidského insulinu.
Substituce, provedené podle vynálezu jsou označovány před názvem insulin. Příkladem může být označeni B27Glu-lidský insulin, což znamená molekulu lidského insulinu v němž'Glu byl včleněn na misto Thr v poloze 27 řetězce B. B27Glu, B9Asp-lidský insulin znamená analog lidského insulinu, v němž Glu byl užit místo Ther v poloze 27 řetězce B a Asp byl užit misto Ser v poloze 9 řetězce B, B27Glu, B(1-29)Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidský insulin znamená prekursor insulinového analogu (vzorec II), v němž Glu byl užit místo Th v poloze 27 ve zkráceném řetězci B, přičemž řetězec B(l-29) a řetězec A jsou spolu spojeny peptidovým sledem Ala-Ala-Lys. Neni-li uvedeno jinak, rozumí se, že B(l-29) a řetězec A(l-21) jsou spolu spojeny disulfidovými můstky mezi A(7)Cys a B(7)Cys a mezi A(20) Cys a B(19)Cys jako v lidském insulinu a A-řetězec obsahuje vnitřní disulfidový můstek mezi A(6)Cys a A(ll)Cys.
3ak již bylo uvedeno, snahou vynálezu je navrhnout složení insulinových roztoků . pro injekční podáni, ve snaze o vyřešeni tohoto úkolu bylo nejprve zjištěno, že existuje podstatný rozdíl mezi insulinem v depotni formě nebo vo formě bolusu mezi insulinem v cirkulaci, rozdíl spočívá především v koncentraci tohoto insulinu. Insulin v krevním oběhu je vysoce zředěn a dosahuje ředění ÍO3·^ až 10“®, přičemž běži o monomer, nanejvýš se snad určité množství nachází ve formě dimeru. Daleko koncentrovanější insulin se nachází v B-buňkách slinivky břišní ve skladované formě a v roztoku, v němž se obvykle podává, se nachází většinou, i když ne zásadně v neaktivní hexamerni formě, například jako známý 2-zinkbexamer.
□e také známo, že lidský insulin se v roztoku vyskytuje v celé řadě molekulárních forem, a to jako monomer, dimer, tetramer a hexamer, jak bylo popsáno v publikaci Blundell a dalši, Advances in Protein Chemistry, Academie Press, New York and London, Sv.
26, str. 279 až 330, 1972, přičemž oligomerni formy jsou v případě vysokých koncentraci insulinu příznivější, monomer je pak účinnou formou insulinu.
Tetramer a hexamer nejsou účinné formy, dimer může být aktivní. Skutečnost, že se pomalejší absorpce, popsaná například v publikaci Binder, Diabetes Care 7, č. 2, 1984 často vyskytuje u koncentrovanějšioh roztoků, určených k pomalému uvolňováni insulinu je patrně možno vysvětlit tim, že je třeba určité doby k přeměně z hexameru, tetrameru a dimeru na účinnou monomerni formu.
Analogy lidského insulinu, vyrobené způsobem podle vynálezu jsou zajímavé tim, že rychlého účinku se dosahuje molekulární strukturou, z niž se netvoří snadno dimer, tetra· mer, hexamer nebo polymer, to znamená, že běží o látky se sníženou tendenci k samovolné tvorbě dimeru, tetrameru, hexameru nebo polymeru, a to af již v přítomnosti nebo v nepřítomnosti zinečnatých iontů, podstatných mezidruhových rozdílů mezi sledem aminokyselin, které v molekule insulinu existuji bylo již dávno usuzováno, že ne všechny zbytky aminokyselin, přítomné v molekule insulinu jsou zásadní pro dosaženi insulinového účinku a také to', že některé aminokyselinová zbytky, které nejsou podstatné pro dosažení insulinového účinku jsou důležité pro fyzikální vlastnosti molekuly insulinu. 3e například známo, že v případě insulinu morčete nedochází k tvorbě dimerů. Také sulfatovaný insulin a tetranitrotyrosininsulin nedimerizuje. 3e zřejmé, že celou řadu zbytků aminokyselin v molekule lidského insulinu je možno zaměnit bez podstatného poklesu insulinového účinku. Substituce ami nokyselin, prováděná způsobem podle vynálezu tedy směřuje k zamezení tvorby dimerů, tetramerů, hexamerů a polymerů bez ovlivněni insulinového účinku takto modifikované molekuly.
Zbytky aminokyselin v těch polohách řetězce A a B obecného vzorce I, v nichž může dojit k substituci nejsou zásadně důležité pro dosaženi insulinového účinku, jsou však důležité pro schopnost lidského insulinu tvořit dimery, tetramery, hexamery a polymery a pro rozpustnost lidského insulinu. Substituce, k nimž dochází pro provádění způsobu podle vynálezu mají za následek zábranu styčných mist mezi atomy v sousedních molekulách insulinu, která za běžných okolností usnadňuji tvorbu insulinových dimerů, tetramerů, hexamerů nebo polymerů,
Dak bylo možno očekávat, změny v některých polohách řetězce lidského insulinu jsou pro shora uvedené účely účinnější než změny jiné. Znamená to, že jediná substituce v řetězce B může k uvedenému účelu dostačovat, kdežto na jiných mistech může být zapotřebí k dosaženi téhož účinku provést alespoň dvě substituce. Substituce v řetězci A slouží převážně k zlepšeni rozpustnosti disociované molekuly. Výhodnými polohami pro substituci zbytků aminokyselin jsou polohy B9, B12, BIO, B26 a B27 jako takové nebo ve vzájemné kombinaci nebo spolu s dalši substituci zbytku aminokyselin na Jiných polohách molekuly lidského insulinu, jak je znázorněno v obecném vzorci I.
Substituce, spočívající v zavedeni zbytků negativnějších aminokyselin na místo původních bez náboje n'ebo s positivním nábojem má za následek negativnější náboj celé molekuly insulinu při neutrálním pH, přičemž se snižuje isoelektrický bod ve srovnání s lidským insulinem. 3e charakteristické, že analogy lidského insulinu, získané způsobem podle vynálezu mají tentýž nebo negativnější náboj při neutrálním pH a nižši isoelektrický bod než molekula lidského insulinu.
Obvykle je možno získat zavedením jedné nebo většího počtu negativněji nabitých zbytků aminokyselin misto nenabitých nebo positivně nabitých zbytků aminokyselin negativnější náboj celá molekuly insulinu při neutrálním pH a současně je možno snížit isoelektrický bod ve srovnání s molekulou lidského insulinu. 3e tedy charakteristické,
CS 275513 B6 že molekula insulinu po substitucí, provedené způsobem podle vynálezu za získáni příslušného analogu má tentýž nebo negativnější náboj při neutrálním pH a nižši isoelektrický bod než molekula lidského insulinu.
□edna až tři substituce obvykle dostačí k získáni analogu s rychlejším účinkem a tyto typy substituce tedy představuji výhodné provedení způsobu podle vynálezu. Při použití dvou až tři substituci je možno dosáhnout také zlepšené mísitelnosti s chráněnými insulinovými prostředky. 3e však zřejmé, že cíle vynálezu je možno dosáhnout i při větším počtu substituci, přičemž je současně možno dosáhnout ještě sekundárních žádoucích vlastností výsledného produktu.
Zejména může při další substituci, například 4 nebo 5 zbytky dojit získáni insulinového analogu, který má také menši sklon k tvorbě fibril, což je vlastnost zvláště žádoucí v případě, že je výsledný insulinový roztok určen k infusi. Obvykle však nemá být zapotřebí provést vice než 7 substituci pro získání insulinového analogu způsobem podle vynálezu. Výhodný počet je 2 až 4 substituce,
V následujícím textu znamená signální sled MF«Cl celý signální sled, kdežto “signální sled MF«ťl bez Glu-Ala-Glu-Ala- znamená sled, z něhož byly odstraněny na C-terminálnim zakončeni zbytky aminokyselin ve sledu Glu-Ala-Glu-Ala.
Způsob podle vynálezu bude osvětlen následujícími příklady.
Přiklad 1
Konstrukce syntetického genu, který je kódem pro B( l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidský insulin
Strukturální gen pro B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidský insulin byl zkonstruován při použiti kodonů z kvasinek následujícím způsobem:
Následujících 10 oligonukleotidů bylo syntetizováno na automatickém syntezátoru DNA při použiti metody na nosiči z porézního skla a při použiti fosforamiditu, jak bylo popsáno v publikaci S.L, Beucage a M.H. Carutherse (1981) v Tetrahedron Letters 22, str. 1859 až 1869:
I. AAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC
35- mer
II. AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA
36- mer
III. TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT
43-mer
IV. GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC
42-mer
V. TCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC
32-mer
VI. ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT
34-mer
VII. GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT
37- mer
VIII. TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC
37-mer
IX. TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT
36-mer
X: CTAGAGCCTGGGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG 33 mer
Ze shora uvedených 10 oligonukleotidů bylo vytvořeno 5 duplexů A-E tak, jak jsou uvedeny na obr. 1.
pmolů každého z duplexů A až E bylo vytvořeno z odpovídájících párů 5'-fosforylo váných oligonukleotidů I až X zahříváním 5 minut na 90 °C s následným zchlazením na teplo tu místnosti na dobu 75 minut. 33-mer (X) v duplexu E nebyl fosforylován na 5*-zakončeni, aby nedošlo k· dimerizaci na komplementárních zakončeních jednotlivých řetězců po štěpeni enzymem Xbal. Syntetický gen byl po smiseni pěti duplexů a následným působením 74-ligázy isolován jako pás o 182/183 párech bázi po elektroforéze ligečni směsi na 2% agarózovóm gelu.
Takto získaný syntetický gen je znázorněn na obr. 1
Syntetický gen byl navázán na fragment Kpnl-EcoRl o 4 kilobázich a na fragment Xbal -Kpnl o 8 kilobázich z pMT644 a na fragment EcoRlHgal 0 0,3 kilobázich z pKFN9 za vzniku následující struktury: TPIp-MF»6l signální sled-B(l-29)-Ala-Ala-Lye-A(l-21)-TPlY.
Plasmid pMT644 obsahuje sled DNA TPIp-MF«Cl signální sled-B(1-29)-Α(1-21)-ΤΡΙγ. Konstrukce plasmidu kPFN9 bude dále popsána.
Směs pak byla užita pro transformaci kompetentního kmene E. coli (r“, m+) (MTI72), 30 kolonii odolných proti ampicilinu bylo přeneseno na plotny s obsahem minimálního prostřed! M9 (T.Maniatis a další, Molecular Clonlng, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, str. 62), čimž bylo získáno 8 Leu+ kolonii. Pak bylo provedeno analyzováni sledu způso32 bem podle Maxama a Gilberta, bylo prokázáno, že sled P-Xbal-EcoRl-fragmentu je důkazem toho, že tři uvedené plasmidy obsahovaly gen s požadovaným sledem. 3eden z těchto pla3midů, pKNF27, byl zvolen pro ďalšl použiti.
Konstrukce plasmidu kPNF27 je znázorněna na obr. 2.
Konstrukce plasmidu pKFN9
Tento plasmid byl konstruován proto, aby bylo možno získat plasmid s místem pro působeni Hgal přímo za ukončením signálního sledu MF<41, Plasmid pMT544 byl rozštěpen enzymem Xbal a ze zakončeni 3'- bylo odštěpeno přibližně 250 bázi působením ExoIII nukleázy, současně byl plasmid rozštěpen působením enzymu Xbal. Pak byl připojen k DNA, která částečně obsahovala pouze Jeden řetězec 32-mer se sledem GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC s obsahem místa pro působeni enzymu Hgal. Působením Klenowovy polymerázy pak byla získána cirkulárni DNA s dvojitým řetězcem za současného působeni T4-ligázy. Po transformaci kolonii E. coli (r, m+) (MT 172) s obsahem plasmidu po mutaci bylo možno tyto kolonie 32 identifikovat hybridizací kolonii s 5*- P-označeným 32-merem. Výskyt nového mista pro působení Hgal bylo možno ověřit štěpením (EcoRi +Hgal, Hind3+Hgal). Po retransformaci byla vybrána čistá mutanta“ pKFN9 pro další použiti. Konstrukce pKFN9 je znázorněna na obr, 3.
Přiklad 2
Výroba B27Glu lidského insulinu
B27Glu-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (l-21)-lidského insulinu působením Thr-Obu a acidolyzou získaného esteru threoninu působením kyseliny trifluoroctóvé. Výroba se uskutečňuje v následujících stupních:
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulin
Plasmid kPKNF27 byl linearizován v jediném mistě působeni Xbal směrem dolů od inzulínového syntetického genu pro prekursor. Aby nedošlo ke zničeni mista působeni Xbal při vyplnění v dalším stupni, byl na linearizovaný plasmid na každém konci navázán vazný sled s dvojitým řetězcem, a to Xbal-Hind3 19-mer se sledem
Xbal Hind3
CTAGAAGAGCCCAAGACTA
TTCTCGGGTTCTGATTCGA
Linker byl fosforylován na v poloze 5'na jednoduchém zakončeni po působeni enzymu Xbal, byl však ponechán v nefosforylovaném stavu na zakončení Hind3, takže nemohlo dojit k polymeraci tohoto řetězce v průběhu vazby a cirkularizace DNA (obr.4).
5'-Mononukleotidy byly odstraněny z 3'-zakončení získané lineární DNA s dvojitým řetězcem působením nukleázy ExoIII. Působení nukleázou ExoIII bylo prováděno při teplotě 23 °C za podmínek, při nichž se z každého 3'-zakončenl DNA odstraní přibližně 250 nukleotidů [L.Guo a R.Wu (1983), Methods in Enzymology 100, str. 60 až 96j.
5'-Fosforylovený 25-met se sledem d(GTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC) se pak včlení do místa mutace. Po vyplněni působením Klenowovy polymerézy za přítomnosti T4-ligázy se ONA s dvojitým řetězcem štěpí působením Xbal. Pak se působením T4-ligázy vytvoří heteroduplexni cirkulárni DNA s mutaci jednoho řetězce.
Směs po ligaci byla užita k transformaci v E. coli (r , m+) (MT172) za současného použiti selekce na odolnost proti ampicilinu.
Mutanty byly identifikovány hybridizaci kolonii s 5'-32P-značeným 25-merem jako primerem mutageneze. Po retransformaci je možno prokázat, že plasmid pKNF37 z Jedné z výsledných kolonii obsahuje požadovanou mutaci, průkaz byl proveden zjištěním sledu □NA v Xbal-EcoRl-fragmentu o 0,5 kilobazich (A. Maxam a W.Gilbert (1980), v Methods in Enzymology 65, 499-560),
II. Transformace
S.· cerevisiae kmen MT663 (E2-7B X E11-3C a/z .delta tpi/delta t pi, pep 4-3/pep
4-3)‘byl pěstován na YPGal (1% Bacto extrakt z kvasnic, 2% Bacto pepton, 2% galaktóza',
1% laktát) do hustoty 0,6 při 600 nm. 100 ml kultury bylo odstraněno, promyto 10 ml vody a znovu uvedeno do suspenze v 10 ml 1,2 M sorbitolu, 25 mM Na2EDTA o pH 8,0 a 6,7 mg/ml dithiothreitolu. Suspenze byla inkubována při teplotě 30 °C 15 minut, pak byla odstraněna buňky byly znovu uvedeny do suspenze v 10 ml 1,2 M sorbitolu, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M citronanu sodného o pH 5,8, 2 mg Novozym 234. Suspenze byla inkubována 30 minut při teplotě 30 °C, buňky byly odděleny odstředěním, promyty v 10 ml 1,2 M sorbitolu a v 10 ml CAS (1,2 M sorbitolu, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris (Tris = tris(hydroxymethyl) aminomethan) při pH 7,5) a pak byly znovu uvedeny do suspenze ve 2 ml CAS, Pro transformaci bylo 0,1 ml buněk v CAS smiseno s přibližně 1 jig plasmidu pKFN37 a směs byla ponechána při teplotě místnosti 15 minut. Pak bylo přidáno 1 ml 20 % polyethylenglykolu 4 000, 10 mM CaClg, 10 mM Tris o pH 7,5 a směs byla ponechána dalších 30 minut při teplotě místnosti. Směs byla odstředěna a usazená vrstva byla znovu uvedena do suspenze v SOS (1,2 M sorbitol, 33% (obj.%) YPGaL, 6,7 mM CaCl2, 14 jjg/ml leucinu) a inkubuje se 2 hodiny při teplotě 30 °C. Suspenze se pak odstředí a usazenina se znovu uvede do suspenze v 0,5 ml 1,2 M sorbitolu, 6 ml agaru (prostředí SC, Sherman a dalši v Methods in Yaaet Genetice, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) bez leucinu, avšak s obsahem 1,2 M sorbitolu a 2,5 % agaru) při teplotě 52 °C a suspenze byla vlita na plotny s obsahem téhož tuhého agaru β obsahem sorbitolu. Kolonie transformantů byly izolovány po třech dnech inkubace při teplotě 30 °C a byly užity k založeni kultur v kapalném živném prostředí. Oeden z těchto transformantů, a to KFN40 (=MT663/pKFN37) byl užit k další charakterizaci.
III. Exprese B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulinového prekursoru
Kmen kvasinek KFN40 byl pěstován v prostředí YPD (1% extraktu z kvasnic, 2 % peptonu, (Difco Laboratories) a 2 % glukózy). 10 ml kultury uvedeného kmene bylo protřepáváno při teplotě 30 °C až do hustoty 26 při 600 nm. Po odstředění byl supernatant analyzován vysokotlakou kapalinovou chromatogrsfii v reversní fázi a byl prokázán obsah
13,5 mg/1 prekursoru.
IV. Transpeptidace
0,2 molu (47,1 g) Thr-OBu1, HOAC bylo rozpuštěno v dimethylformamidu na 100 ml roztoku, pak bylo přidáno 50 ml 76,5% (obj.%) dimethylformamidu ve vodě a 10 g surového B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidského insulinu bylo ve směsi rozpuštěno a směs byla uložena do thermostatu při teplotě 12 °C. Pak bylo přidáno 1 g trypsinu vs 25 ml 0,05 M octanu vápenatého a po 24 hodinách při teplotě 12 °C byla směs přidána ke 2 litrům ocetonu, vysrážené peptidy byly izolovány odstředěním a usušeny ve vakuu. B27Glu, BSOThr-OBu^-lidský insulin byl čištěn preparativni vysokotlakou kapalinovou chromatoCS 275513 B6 grafit na oxidu křemičitém-Cl8.
V. Přeměna na B27-lidský Insulin.
B27Glu,B30Thr-0But-lidský insulin byl rozpuštěn ve 100 ml kyseliny trifluoroctovó.
Po 2 hodinách stáni při teplotě místnosti byl roztok lyofilizován. Lyofilizovaný prášek byl rozpuštěn ve 400 ml citronanu sodného o koncentraci 47,5 mM pří pH 7. Peptidy byly vysráženy při pH 5,5 po přidáni 2,4 ml 1M ZnClg, izolovány odstředěním a usušeny ve vakuu. Produkt byl čištěn aniontoměničovou chromatografii a pak byl zbaven solí filtraci na gelu. Tímto způsobem bylo získáno 1,7 g B27-Glu-lidského insulinu.
Přiklad 3
Příprava B9Asp-lidského insulinu
B9Asp-lidský insulin byl získán transpeptidaci B9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)lidského insulinu působením Thr-0Buř a acidolysou takto získaného threoninového esteru působením kyseliny trifluoroctovó.
I. Konstrukce gehu, který je kódem pro B9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin
Tento gen byl zkonstruován stejným způsobem jak bylo popsáno pro gen, který je kódem pro B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin mutagenezou, specifickou pro určitou polohu při použiti pKFN27 a za řízeni 23-merem d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG).
Bylo prokázáno, že plasmid pKFN38 obsahuje požadovanou mutaci.
II. Transformace
Plasmid pKFN38 byl užit k transformaci kmene S. cerevisiae MT653 stejným způsobem jako v přikladu 2 II, byl získán transformant KFN41.
III. Exprese B9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Kmen kvasinek KFN41 byl pěstován na prostředí YPD, jak bylo popsáno v přikladu 2,
III. V supernanantu bylo nalezeno 2,5 mg/1 analogu prekursoru.
IV. Transpeptidace
7,4 g surového B9Asp,B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidskóho insulinu bylo podrobeno transpeptidaci způsobem podle přikladu 2,IV, čimž byl jako výsledný produkt získán B9Aep,B30Thr-0Bu''-lidský insulin.
V. Konverse
B9Asp,B3OThrOBu -lidský insulin byl přeměněn na B9Asp-lidský insulin způsobem popsaným v přikladu 2,V. Bylo získáno 0,83 g BSAsp-lidského insulinu.
Přiklad 4
Způsob výroby B9Asp,B27Glu-lidského insulinu
B9Asp,B27Glu-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B9Asp,B27Glu(Bl-21)Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidského insulinu působením Thr-OBu1 s následnou acidolysou získaného threoninového esteru působením kyseliny trifluoroctové.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B9Asp, B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin
Fragment plasmidu pKFN38 po štěpeni EcoRl-Hind3 o 367 párech bázi (přiklad 3) a fragment plasmidu pl<FN37 (přiklad 2) o 140 párech bázi Hind3Xbal se naváží na velký Xbal-EcoRl-fragment plasmidu pUC13 (tento plasmid byl zkonstruován a popsán jako v případě pUC8 a pUC9 v publikaci Vieira a dalši, Gene 19, str. 259 až 268 (1982), Směs vazbě byla užita k transformaci E. coli MT 172 a byla provedena selekce na odolnost proti ampicilinu. Z většího počtu transformantů byly připraveny plasmidy a tyto plasmidy byly analyzovány působením enzymů Pstl e HindS. Fragment Xbal-EcoRl o 0,5 kilobázich z jednoho plasmidu, v němž bylo možno prokázat správný sled míst pro působení enzymů byl navázán na fragment Xbal-Kpnl o 7,8 kilobázich a na fragment Kpnl-Eco R1 o 4,3 kilobázich, oba z plasmidu pMT644 (popsány v dánská patentové přihlášce č. 1293/84). Směs po vazbě byla užita k transformaci E. coli MT172 a kolonie byly izolovány podle odolnosti proti amplicinu. Plasmid pKFN43 z jedné z výsledných kolonii obsahoval gen pro požadovaný prekureor insulinového derivátu. Konstrukce plasmidu pKFN43 je. znázorněna na obr.5.
II. Transformace
Plasmid pKFN byl transformován v S. cerevisiae, kmen MT663 stejným způsobem jako v přikladu 2,11 a byl izolován transformant KFN44.
III. Exprese B9Asp,B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Kmen kvasinek KFN44 byl pěstován na prostřed! YPD stejně jako v přiladu 2,III.
V eupernatantu bylo prokázáno 7,3 mg/1 prekursoru insulinového analogu,
IV. Transpeptidace
12,7 g surového B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)- lidského insulinu se podrobi transpeptidaci způsobem, popsaným v přikladu 2, IV. za vzniku B9Asp,
B27Glu, B30Thr-0But-lidského insulinu.
V. Přeměna
B9Asp, B27Glu, BSOThr-OBu^lidský insulin byl převeden na B9Asp, B27Glu, B3OThrlidgký insulin a čištěn způsobem, popsaným v přikladu 2, V. Bylo získáno 1,0 g B9Asp, B27Glu-lídského insulinu.
Přiklad 5
Způsob výroby A8His, B9Asp, B27Glu-lidského insulinu
A8His, B9Asp, B27Glu-lidský insulin byl připraven transpeptidaci z 48His, B9Asp, B27Glu, B-(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského Insulinu působením Thr-0But s následnou acidolysou takto získaného threoninového esteru kyselinou trifluoroctovou podle přikladu 2.
1. Konstrukce genu, který je kódem pro A8His, B9Asp, B27Glu, B-(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (l-21)-lidský insulin.
Tento gen byl zkonstruován mutagenesi, cílenou na oligonukleotidy způsobem, popsaným v publikaci Y. Morinaga, T. Franceschini, S. Inouye a M. Inouye (1984), Blotechnology 2, 536 - 639. Plasmid, odvozený od pUCl3, který je kódem pro signální sled MG«£l a pro prekursor B9Asp, B27Glu-lidského insulinu (obr. 5), byl rozštěpen působením Hpal a Xbal. Velký fragment byl smísen s plasmidem, linearizovaným působením Ndel. Po denaturaci teplem a po zchlazeni 9měs obsahuje dvojité řetězce s mezerami s oknem'' v jednom řetězci v oblasti, která odpovídá genu pro prekursor insulinu (Hpal-Xbal). Mutagenický 37-mer d(GAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT) byl hybridisován na svrchu uvedený duplex vyplněním působením Klenowowy polymerázy s následnou vazbou. Směs byla užita k transformaci E. coli (MT172) a kolonie se podrobi selekci na odolnost proti amicilinu. Mutanty byly identifikovány hybridisacl kolonií 9 18-merem značeným radioaktivním fosforem na zakončeni 5', d(AATGCTGTCACTCCATCT). Po rétransformaci bylo možno prokázat, že plasmid z jedné z výsledných kolonii obsahoval požadovanou mutaci, zjištění bylo provedeno analýzou sledu DAN ve fragmentu Xba-I-EcoRI o velikosti 0,5 kb. Tento plasmid byl užit pro konstrukci kvasinkového plasmidu pKFN 102 způsobem, popsaným z přikladu 4 pro konstrukci plasmidu pKFN 43.
II. Transformace
Plasmid pKFNlO2 byl transformován do kmene S, cerevisiae MT663 stejným způsobem jako v přikladu 2, II a byl izolován produkt této transformace KFN109.
III. Exprese A8His, B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lya-A(l-21)-lidského insulinu.
Kmen kvasinek KFN109 byl pěstován na prostředí YPD způsobem, popsaným v příkladu
2, III. V supernatantu bylo možno prokázat 21,5 mg/1 prekursoru insulinového analogu.
IV. -V. Transpeptidace a přeměna
22,0 g surového A8His, B9Asp, B27Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidskóho insulinu bylo podrobeno transpeptidaci, přeměně a čištěni způsobem podle přikladu 2, IV-V. Tímto způsobem bylo získáno 4,0 g A8His, B9Asp, 827Glu-lidského insulinu.
Přiklad 6
Příprava Bl2Ile-lidského insulinu
Bl2Ile-lidský insulin byl připraven transpeptidaci Bl2Ile, B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu působením Thr-OBut s následnou acidolysou získaného threoninového esteru kyselinou trifluoroctovou způsobem, popsaným v přikladu 2.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro Bl2Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Fragment EcoRI-Xbal plasmidu pMT59B o velikosti 0,5 kb (konstrukce plasmidu pMT598 je popsána v zveřejněné patentové přihlášce č. 0164529A), který je kódem pro signální sled MFXíl (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) byl včleněn do fágu M13 mplO RF, rozštěpeného Xbal-EcoRI a odpovidajíci DNA s jednoduchým řetězcem byla čištěna od zbytků rekombinantniho fágu Ml3 mplO. DNA s jedním řetězcem byla hybridisována na mutagenní 27-mer NOR-92 d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC) a na universální M13 primer d(TCCCAGTCACGACGT). Pripery byly prodlouženy dNTP a Klenowovou polymerázou, vazba byla provedena T4 DNA-ligázou. Mutagenní primer KFN92 byl zvolen tak, aby došlo k odstraněni místa působeni BstNl, toto misto je jediné ve fragmentu Xba-EcoRl. Aby bylo možno provést selekci proti nemutovanému fragmentu EcoRI-Xbal, byla směs rozštěpena SstNl a postupně EcoRl a Xbal, načež byla navázána na vektor pUC13, rozštěpený EcoRl a Xbal. Z jednoho z transformentů byl zvolen plasmid pMT760, který neměl misto působeni SsNl ve sledu, který je kódem pro insulin. Požadovaný mutovaný sled byl ověřen analýzou sledu DNA podle Maxama a Gilberta. Plasmid pMT760 obsahuje sled EcoRI-Xbal o velikosti 0,5 kb, který odpovídá svrchu uvedenému témuž fragmentu z plasmidu pMT598 až na mutaci v poloze Bl2 (Val - Ile). Tento mutovaný sled byl pak přenesen do plasmidu pro expresi z kvasinek vazbou fragmentu EcoRI-Xbal o velikosti 0,5 kb plasmidu pMT760 na fragment XBal-Kpnl o velikosti 7,8 kb a na fragment Kpnl-EcoRl o velikosti 4,3 kb z plasmidu pMT644 za vzniku pMTA.
II. - V. Transformace, exprese, transpeptidace, přeměna
Plasmid pMTA byl transformován do kvasinkového kmene MTS63 způsobem, popsaným v příkladu 2, II a kmen transformantů MTA byl pěstován způsobem popsaným v přikladu 2,
III. V supernatantu bylo prokázáno 10,4 mg/1 prekursoru insulinového analogu. 10 g tohoto surového prekursoru bylo podrobeno transpeptidaci, přeměně a čištění podle přikladu 2, IV. - V. Výtěžek byl 1,3 g Bl2Ile-lidského insulinu.
Přiklad 7
Způsob výroby Bl2Tyr-lidského insulinu
Bl2Tyr-lidský insulin je možno získat transpeptidaci Bl2Tyr, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)~lldského insulinu působením Thr-OBu1 s následnou acidolysou získaného threoninového esteru kyselinou trifluoroctovou způsobem, popsaným v přikladu 2.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B12Tyr, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Gen byl zkonstruován způsobem, analogickým pro výrobu genu, který je kódem pro B12Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidskóho insulinu s tím rozdílem, že se užije primer KFN93 d(GTAGAGAGCTTCGTACAGGTGTGAGCC) misto KFN92.
II. až IV. Transformace, exprese, transpeptidace a přeměna
Stupně II a III se provádějí stejně jako v příkladu 2. V supernatantu je možno prokázat 1,7 mg/1 prekursoru insulinového analogu. Tento surový prekursor je pak možno podrobit transpeptidaci, přeměně a čištění způsobem podle přikladu 2, IV - V, čimž se ziská Bl2Tyr-lidský insulin.
Přiklad 8
Příprava BlOAsp-lidského insulinu
BlOAsp-lidský insulin byl připraven transpeptidaci BlOAsp, B(l-29)-Ala-Ala-LysA(l-21)-lidského insulinu působením Thr-OBu1· s následnou acidolysou získaného threoninovóho esteru kyselinou trifluoroctovou způsobem podle přikladu 2.
I, Konstrukce genu, který je kódem pro BlOAsp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l)-lidský insulin
Gen byl zkonstruován způsobem, analogickým způsobu výroby genu, který je kódem pro Bl2Ile, B( 1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-lidský insulin s tim rozdílem, že se užije primer KFN94 d(AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG) místo KFN92,
II. - V. Transformace, exprese, transpeptidace a přeměna
Stupně II-III byly provedeny způsobem podle příkladu 2. V supernatantu bylo možno prokázat 36 mg/1 prekursoru insulinového analogu. Tento surový prekursor byl podroben transpeptidaci, přeměněn a čistění způsobem podle příkladu 2, IV-V. Výtěžek byl 7,6 g BlOAsp-lidského insulinu.
Přiklad 9
Příprava B28Asp-lidského insulinu
B28Asp-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (l-2l)-lidského insulinu působením Thr-OMe s následnou hydrolýzou získaného thrloninové ho esteru při pH 8 až 12.
I. Konstrukce genu, který je kódem pro B28Asp, B(l-29)~Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidský insulin
Fragment EcoRl-Xbal plasmidu PMT 462 o velikosti 0,5 kb, který je kódem pro signální sled MF<C1 (mínus Glu-Ala-Glu-Ala)-8-C-A, tj. pro gen lidského proinsulinu, před nímž se nachází modifikovaný signální sled MF«Á1, byl včleněn do fágu Ml3 mplO RF rozštěpeného Xbal-EcoRl a odpovidajici DNA s jednoduchým řetězcem byla oddělena od rekombi nantního fágu Ml3 mplO, DNA s jednoduchým řetězcem byla pak jako templát hybridisována na 41-mer N0R205 d(TTCCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGAAGC) a na Ml3 universální primer d(TCCCAGTCACGACGT). Primery byly prodlouženy působením dNTP a Klenowovy polymerázy, vazba byla provedena T4 DNA-ligásou.
Po extrakci fenolem, vysráženým ethanolem po novém uvedeni do suspenze byla DNA rozštěpena restrikčními enzymy Apal, Xbal a EcoRl. Po další extrakci fenolem, vysráženi ethanolem a novém uvedeni do suspenze byla DNA navázána na pUC13, rozštěpeni EcoRlXbal. Směs po vazbě byla užita k transformaci E. coli (r”m+) a z celé řady transformantů byly připraveny plasmidy. Tyto plasmidy byly rozštěpeny působením EcoRl a Xbal a ty vzorky, které měly pásy při 0,5 a 0,6 kb, byly znovu užity k transformaci E. coli.
Z retransformace byly vybrány pouze transformanty, které obsahovaly pUC13 3 včleněným sledem o 0,5 kb.
Z jednoho z transformantů byl vybrán plasmid pMT881 9 požadovanou mutací v poloze B28 (Pro-^Asp). Mutovaný sled byl ověřen způsobem podle Maxama a Gilberta. Pak byl tento sled přenesen do plasmidu pro expresi z kvasinek navázáním fragmentu pMT881, a to EcoRl-Xbal o velikosti 0,5 kb na fragment Xbal-Kpnl o 7,8 kb a na fragment kpnl-EcoRl o 4,3 kb z plasmidu pMT644 za vzniku pMTAl.
II. Transformace
Plasmid pMTAl byl transformován v S. cerevisiae, kmen MT663 stejným způsobem jako v příkladu 2, II a byl izolován transformant MTAl.
III. Exprese B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-lidského insulinu
Kmen kvasinek MTAl byl pěstován na prostředi YPO způsobem podle přikladu 2, III, Ze supernatantu bylo isolováno 7,2 mg/1 prekursoru insulinového analogu.
IV. Transpeptidace
Surový B28Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) byl podroben transpeptidaci způsobem podle přikladu 2, IV, avšak Thr-OBu* byl nahrazen Thr-OMe za vzniku B28Asp, B30Thr-0Me-lidského insulinu.
V. Přeměna
B28Asp, B30THr-0Me-lidský insulin byl dispergován ve vodě v množství 1 g/100 ml a byl rozpuštěn přidáním IN hydroxidu sodného do pH 10,0. Tato hodnota pH pak byla udr14 žována 24 hodin při teplotě 25 °C. Vzniklý B2BAsp-lidský insulin byl pak vysrážen přidáním chloridu sodného v koncentraci 8g/100 ml, trihydrátu octanu sodného do 1,4 g/100 ml a octanu zinečnatého ve formě dihydrátu do 0,01 g/100 ml s následným přidáním IN kyseliny chlorovodíkové do pH 5,5, Sraženina se isoluje odstředěním a čistí se chromatografii na aniontoměniči, načež se zbaví soli filtrací na gelu. Tímto způsobem se ziská 0,2 g B28Asp-lidského insulinu.
Přiklad 10
Příprava A2lAsp, B9Asp, B27Glu-lidského insulinu
A2lAsp, B9Asp, B27Glu-lidský insulin byl připraven z Q9Asp, B27Glu-lidskóho insulinu selektivní deamidací, která byla provedena hydrolýzou 5% roztoku 14 dnů při teplotě 37 °C a při pH 2,5. Deamidovaný produkt byl isolován chromatografií na aniontoměniči. Přiklad 11
Příprava B27Glu, A2lAgp-lidského insulinu
B27Glu, A21A9p-lidský insulin byl připraven transpeptidaci B27Glu, A2lAsp, B(l29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) působení Thr-OBu1 s následnou acldolysou získaného thrioninového esteru působením kyseliny trifluoroctové způsobem podle příkladu 2.
B27Glu, A2lAsp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) je možno připravit z B27Glu, B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-2l) jako v přikladu 2 deamidací podle příkladu 10.
Charakterisace analogu lidského insulinu, vyrobeného způsobem podle vynálezu
Stanoveni molekulové hmotnosti (Gutfreund H., Biochemical Cloumal 42 (544) 1948).
Metoda: Onauer Membrán Osmometer
Typ: 1.00
Membrána: Schleicher a SchQll Typ: R52
Rozpouštědlo: 0,05 M NaCl, pH 7,5 Teplota: 21 °C.
Výsledky: Hodnoty jsou uvedeny v následující tabulce. Všechny typy insulinu byly měřeny v koncentraci 4 mg/ml.
Tabulka I typ insulinu molekulová hmotnost k jednotky lidský 2Zn insulin lidský Zn volný insulin
Zn volný B27Glu-lidský insulin
Zn volný B12Xle-lidský insulin
Zn volný B27Glu, A2lAsp-lidský insulin Zn volný B9Asp, B27Glu-lidský insulin Zn volný B9Asp-lidský insulin Zn volný B9Asp, B27Glu, A21Asp-lidský insulin Zn volný B9Asp, B27Glu, A8His-lidský insulin
36+2
29+1
22+1
17+1
8+1 6+1 6+1 6+1 9 + 3
CS 275613 86
Z toho, co je uvedeno v tabulce 1, je zřejmé, že analogy lidského insulinu mají značně nižší molekulovou hmotnost ve srovnáni s lidským insulinem, což znamená, že samovolné vytvářeni dimerů, tetramerů a hexamerů je méně vyjádřené a v některých případech k němu vůbec nedochází,
V následující tabulce budou uvedeny hodnoty pro biologický poločas a pro biologickou účinnost pro analogii lidského insulinu.
analog lidského insulinu poločas ' biologická účinnost ’ (% lidského insulinu) v % lidského insulinu
B27Glu-lidský insulin |
78 |
101 |
(83 |
až |
123) |
B9Asp, B27Glu-lidský insulin |
54 |
110 |
(90 |
až |
193) |
Bl2Ile-lidský insulin |
78 |
91 |
(80 |
až |
103) |
B27Glu, A21Asp-lidský insulin |
56 |
64 |
(58 |
až |
71) |
B9Asp-lidský insulin |
52 |
80 |
(72 |
až |
90) |
A2lAsp, B9Asp, B27Glu-lidský insulin |
56 |
75 |
(66 |
až |
85) |
A8His, B9Asp, B27Glu-lidský insulin |
68 |
116 |
(101 až 135) |
x) Biologický poločas je doba, do niž zmizl z místa podkožní injekce 50 % účinné látky u vepřů. Bylo užito metody podle publikace Binder 1969, Acata Pharmacol. Toxicol. (suppl. 2) 27:1-87.
xx) Pokus s hladinou glukózy v krvi u myši podle evropského lékopisu, pravděpodobnost 95 %.
Z tabulky 2 vyplývá, že biologický poločas pro insulinové analogy je daleko kratší než tatáž hodnota pro lidský insulin.
Biologická účinnost těchto analogii je srovnatelné s účinnosti lidského insulinu nebo je nepatrně nižši.