KR20110004366A - 프로테아제 안정화되고, 아실화된 인슐린 유사체 - Google Patents

프로테아제 안정화되고, 아실화된 인슐린 유사체

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KR20110004366A
KR20110004366A KR1020107020828A KR20107020828A KR20110004366A KR 20110004366 A KR20110004366 A KR 20110004366A KR 1020107020828 A KR1020107020828 A KR 1020107020828A KR 20107020828 A KR20107020828 A KR 20107020828A KR 20110004366 A KR20110004366 A KR 20110004366A
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토마스 보글룸 켈드센
토마스 호에그-젠센
팔레 자콥센
티나 묄러 타그모스
티네 글렌도르프
야노스 티보르 코드라
패트릭 윌리엄 가리베이
쟈콥 스텐 페터슨
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노보 노르디스크 에이/에스
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Abstract

프로테아제에 내성을 나타내는 신규한 아실화된 인슐린 유사체는 폐 또는 경구로 효과적으로 투여될 수 있다. 인슐린 유사체는 B25H 및 A14E 또는 A14H를 함유한다.

Description

프로테아제 안정화되고, 아실화된 인슐린 유사체{PROTEASE STABILIZED, ACYLATED INSULIN ANALOGUES}
본 발명은 프로테아제에 대한 저항을 나타내는 신규의 아실화된 인슐린 유사체, 이러한 인슐린 유사체의 제조방법, 본 발명의 인슐린 유사체를 함유하는 인슐린 제제 및 이들 인슐린 유사체를 사용하여 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
당뇨병은 글루코오스를 이용하는 능력이 부분적으로 또는 완전히 상실되는 대사 장애이다. 전체 인구의 약 5%가 당뇨병을 겪고 있고, 이 질환은 전염병 비율에 접근한다. 1920년대에 인슐린의 도입 이후로, 지속적인 노력은 당뇨병의 치료를 개선시켰다. 당뇨병을 겪고 있는 사람들이 수십 년에 걸쳐 만성적 치료를 받았기 때문에, 안전하고, 편리하며 삶의 질을 개선하는 인슐린 제형에 대한 중대한 필요가 있다.
경구 경로는 약물 투여를 위해 단연코 가장 널리 사용되는 경로이며, 특히 만성 치료를 위해 일반적으로 환자들에 의해 매우 잘 받아들여진다. 그러나 치료 펩티드 또는 단백질의 투여는 종종 위장(GI)관 및 장점막에서 효소 분해, 약물 유출 펌프, 장 점막으로부터의 불충분하고 가변적인 흡수뿐만 아니라 간에서의 초회 통과 대사와 같은 몇몇 장애물 때문에 선호되는 경구 투여보다는 비경구 경로로 제한된다.
보통, 인슐린 제형은 피하주사에 의해 투여된다. 그러나, 다른 경로, 예컨대, 경구 또는 폐에 의한 투여가 환자의 수용 상태, 안전성 및 편의성 때문에 유리할 것이다. 일부 상업적으로 이용가능한 인슐린 제형은 작용의 빠른 개시를 특징으로 하며, 다른 제형은 비교적 느린 개시를 가지지만 더 또는 덜 지속되는 작용을 나타낸다. 시장에서 다른 지속 작용(작용의 프로파일)을 가지는 매우 다양한 인슐린이 있다는 것은 당뇨병 환자에게 매우 중요하다. 간단히 말하면, 인슐린은 짧은-, 중간의- 또는 장시간의-작용으로서 분류될 수 있다.
WO 2008/034881은, 적어도 2개의 소수성 아미노산이 인슐린 유사체가 아실화되지 않은 친수성 아미노산으로 치환된 특정 인슐린 유사체에 관한 것이다.
EP 2008/060733 및 EP 2008/060733은, 인슐린 유사체가 A21 아미노산에 C-말단에 연결된 아미노산 또는 펩티드에 의한 신장을 포함하는 특정의 아실화된 인슐린 유사체에 관한 것이다.
EP 2008/060734는, 아실 모이어티가 모 인슐린에 부착되고 상기 아실 모이어티가 아미노산을 함유하는 알킬렌 글리콜의 반복 단위를 포함하는 특정 아실화된 인슐린에 관한 것이다.
본 발명의 양태는, 경구로 투여될 때, 혈액 글루코오스 수준의 만족스러운 조절을 줄 수 있는 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는, 경구로 투여될 때, 글루코오스 수준의 지속된 저하를 제공할 수 있는 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는, 경구로 투여될 때, 글루코오스 수준의 지속된 저하를 제공할 수 있는 기저 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는, 경구로 투여될 때, 1일 2회 투여 후 혈액 글루코오스 수준의 만족스러운 조절을 제공할 수 있는 기저 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는, 경구로 투여될 때, 1일 1회 투여 후 혈액 글루코오스 수준의 만족스러운 조절을 제공할 수 있는 기저 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 친수성인 기저 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 인간 인슐린보다 더 친수성인 기저 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본원에서 설명되는 바와 같은 상대적 소수성(k'rel)에 의해 측정되는 바와 같이 인간 인슐린보다 덜 소수성인 기저 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본원에서 설명되는 바와 같은 상대적 소수성(k'rel)에 의해 측정되는 바와 같이, 동일한 아실 모이어티로 아실화된 유사한 비-프로테아제 안정화된 모 인슐린보다 덜 소수성인 기저 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 기저 인슐린 유사체의 K'rel은 바람직하게는 5 미만, 더 바람직하게는 3 미만, 더 바람직하게는 2 미만, 더 바람직하게는 1 미만, 더 바람직하게는 0.8 미만, 더 바람직하게는 0.6 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만, 더 바람직하게는 0.4 미만, 더 바람직하게는 0.3 미만, 더 바람직하게는 0.2 미만, 더 바람직하게는 0.1 미만이다.
본 발명의 다른 양태는, 경구로 투여될 때, 만족스러운 생체이용가능성을 가지는 기저 인슈린 유사체의 제공에 관한 것이다. 유사한 용량으로 주어진 프로테아제 안정화 돌연변이 없이 유사한 아실화된 인슐린의 생체이용가능성과 비교하여, 본 발명의 바람직한 화합물의 생체이용가능성은 비-프로테아제 안정화된 비교기의 것보다 적어도 10% 더 높고, 바람직하게는 20% 더 높고, 바람직하게는 25% 더 높고, 바람직하게는 30% 더 높고, 바람직하게는 35% 더 높고, 바람직하게는 40% 더 높고, 바람직하게는 45% 더 높고, 바람직하게는 50% 더 높고, 바람직하게는 55% 더 높고, 바람직하게는 60% 더 높고, 바람직하게는 65% 더 높고, 바람직하게는 70% 더 높고, 바람직하게는 80% 더 높고, 바람직하게는 90% 더 높고, 바람직하게는 100% 더 높고, 바람직하게는 100% 더 높다.
본 발명의 다른 양태는, 경구로 투여될 때, 만족스러운 생체이용가능성을 가지는 기저 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 화합물의 생체이용가능성은(i.v. 투여에 관해) 적어도 O.3%, 바람직하게는 >0.5%, 바람직하게는 >1%, 바람직하게는 >1.5%, 바람직하게는 >2%, 바람직하게는 >2.5%, 바람직하게는 >3%, 바람직하게는 >3.5%, 바람직하게는 >4%, 바람직하게는 >5%, 바람직하게는 >6%, 바람직하게는 >7%, 바람직하게는 >8%, 바람직하게는 >9%, 바람직하게는 >10%이다.
본 발명의 다른 양태는, 정맥 주사로 투여될 때, 만족스러운 효능을 가지는 기저 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다. 인간 인슐린의 효능과 비교하여, 본 발명의 바람직한 프로테아제 안정화된 인슐린 유사체의 효능은 바람직하게는 >5%, 바람직하게는 >10%, 바람직하게는 >20%, 바람직하게는 >30%, 바람직하게는 >40%, 바람직하게는 >50%, 바람직하게는 >75% 및 바람직하게는 >100%이다.
본 발명의 다른 양태는 폐로 투여될 때, 혈액 글루코오스 수준의 만족스러운 조절을 제공하는 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는, 폐로 투여될 때, 작용의 비교적으로 느린 개시 및/또는 더 또는 덜 지속되는 작용을 가지는 혈액 글루코오스 수준의 만족스러운 조절을 제공할 수 있는 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 폐 투여 후 만족스러운 지속된 작용을 가지는 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다. 유사한 양으로 주어진 프로테아제 안정화 돌연변이 없이 유사한 아실화된 인슐린과 비교하여, 본 발명의 바람직한 화합물의 작용의 지속 기간은 비교기의 그것보다 적어도 10% 더 길고, 바람직하게는 20% 더 길고, 바람직하게는 25% 더 길고, 바람직하게는 30% 더 길고, 바람직하게는 35% 더 길고, 바람직하게는 40% 더 길고, 바람직하게는 45% 더 길고, 바람직하게는 50% 더 길고, 바람직하게는 55% 더 길고, 바람직하게는 60% 더 길고, 바람직하게는 65% 더 길고, 바람직하게는 70% 더 길고, 바람직하게는 80% 더 길고, 바람직하게는 90% 더 길고, 바람직하게는 100% 더 길고, 바람직하게는 100% 이상 더 길다. 작용 시간은 혈액 글루코오스가 억제되는 시간으로써, 또는 적절한 약물동력학 특성, 예를 들어, t1 /2 또는 MRT (평균 체류 시간)을 측정함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 만족스러운 폐 생체이용가능성을 가지는 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다. 유사한 용량으로 주어진 프로테아제 안정화 돌연변이 없이 인간 인슐린의 생체이용가능성과 비교하여 또는 유사한 아실화된 인슐린과 비교하여, 본 발명의 바람직한 화합물의 생체이용가능성은 비교기의 그것보다 적어도 10% 더 높고, 바람직하게는 20% 더 높고, 바람직하게는 25% 더 높고, 바람직하게는 30% 더 높고, 바람직하게는 35% 더 높고, 바람직하게는 40% 더 높고, 바람직하게는 45% 더 높고, 바람직하게는 50% 더 높고, 바람직하게는 55% 더 높고, 바람직하게는 60% 더 높고, 바람직하게는 65% 더 높고, 바람직하게는 70% 더 높고, 바람직하게는 80% 더 높고, 바람직하게는 90% 더 높고, 바람직하게는 100% 더 높고, 바람직하게는 100% 이상 더 높다.
본 발명의 다른 양태는 증가된 명백한 생체내 효능을 가지는 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 경구 생체이용가능성을 가지는 지속된 작용의 인슐린의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 인간 인슐린의 안정성과 비교하여 증가된 단백질 가수분해 안정성을 가지는 인슐린 유사체의 제공에 관한 것이다. 인간 인슐린과 비교하여, 본 발명의 바람직한 화합물의 단백질 가수분해 안정성은 비교기의 그것보다 적어도 2배 더 안정하고, 바람직하게는 3배 더 안정하고, 바람직하게는 4배 더 안정하고, 바람직하게는 5배 더 안정하고, 바람직하게는 6배 더 안정하고, 바람직하게는 7배 더 안정하고, 바람직하게는 8배 더 안정하고, 바람직하게는 9배 더 안정하고, 바람직하게는 10배 더 안정하고, 바람직하게는 12배 더 안정하고, 바람직하게는 14배 더 안정하고, 바람직하게는 16배 더 안정하고, 바람직하게는 18배 더 안정하고, 바람직하게는 20배 더 안정하고, 바람직하게는 25배 더 안정하고, 바람직하게는 25배 이상 더 안정하다. 단백질 가수분해 안정성은 단백질 가수분해 효소(의 혼합물), 예를 들어, 본원에서 설명되는 장 효소의 추출물에 대한 인슐린의 노출에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 대상은 적어도 하나의 선행기술의 단점을 극복 또는 완화하거나, 또는 유용한 대안을 제공하는 것이다.
정의
용어 인슐린은 천연 발생 인슐린, 예를 들어, 인간 인슐린, 및 그것의 인슐린 유사체를 포함한다. 인간 인슐린은 2개의 폴리펩티드 사슬, 소위 각각 21개 및 30개의 아미노산 잔기를 함유하고, 2개의 시스틴 이황화 다리에 의해 서로 연결되는 A 및 B 사슬로 구성된다.
본원에서, 용어 아미노산 잔기는 수소 원자가 아미노기로부터 제거되고 및/또는 히드록시기가 카르복시기로부터 제거되고 및/또는 수소 원자가 머캅토기로부터 제거되는 아미노산을 포함한다. 불명확하게는, 아미노산 잔기는 아미노산을 지정할 수도 있다.
본원에서, 소수성 아미노산은 자연적으로 발생하는 아미노산 트립토판 (Trp, W), 페닐알라닌 (Phe, F), 발린 (Val, V), 이소류신 (Ile, I), 류신 (Leu, L) 및 티로신 (Tyr, Y) (괄호의 3글자 및 1글자 약어)으로서 이해되는 것이다.
본원에서, 친수성 아미노산은 상기 정의에 따르는 소수성 아미노산이 아닌 천연 아미노산으로서 이해되는 것이다. 한 구체예에서 본 발명에 따르는 친수성 산은 글루탐산 (Glu, E), 아스파르트산 (Asp, D), 히스티딘 (His, H), 글루타민 (Gln, Q), 아스파라긴 (Asn, N), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 프롤린 (Pro, P), 글리신 (Gly, G), 리신 (Lys, K) 및 아르기닌 (Arg, R)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 추가 구체예에서, 본 발명에 따르는 친수성 아미노산은 글루탐산 (Glu, E), 아스파르트산 (Asp, D), 히스티딘 (His, H), 글루타민 (Gln, Q), 아스파라긴 (Asn, N), 리신 (Lys, K) 및 아르기닌 (Arg, R)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본원에서, 용어 인슐린 유사체는 형식적으로 천연 인슐린에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실 및/또는 치환(대체)함으로써 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 첨가함으로써 자연적으로 발생하는 인슐린, 예를 들어, 인간 인슐린의 구조로부터 유도될 수 있는 분자 구조를 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 첨가된 및/또는 치환된 아미노산 잔기는 암호화할 수 있는 아미노산 잔기 또는 다른 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기 또는 순수하게 합성인 아미노산 잔기일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린과 비교하여 2개 이상의 돌연변이를 가진다.
본원에서, 용어 프로테아제 안정화된 인슐린은 덧붙여진 아실 모이어티가 없는 인슐린을 의미한다. 상기 프로테아제 안정화된 인슐린은 프로테아제로부터의 분해에 대해 개선된 안정성을 가진다.
본원에서, 용어 모 인슐린은 프로테아제로부터의 분해에 대한 안정성을 개선시키기 위해 덧붙여진 아실 모이어티가 없고 돌연변이가 없는 인슐린을 의미한다. 상기 모 인슐린은 인간 인슐린에 대해 선택적으로 돌연변이를 가진다. 따라서 모 인슐린은 또한 상기 정의된 바와 같은 인슐린 유사체이다. 본원에서, 용어 모 인슐린 및 비-프로테아제 안정화된 인슐린은 동일한 화합물을 포함한다.
본원에서, 용어 돌연변이는 아미노산 서열 내 어떤 변화(암호화 가능한 아미노산으로 치환 및 삽입뿐만 아니라 결실)를 포함한다.
본원에서, 용어 인간 인슐린의 A 사슬의 유사체 및 B 사슬의 유사체는 각각 인간 인슐린의 A 및 B 사슬에 대해서 각각 A 및 B 아미노산 사슬의 하나 이상의 치환, 결실 및 또는 연장(첨가)을 가지는 인간 인슐린의 A 및 B 사슬을 포함한다.
본원에서, A1, A2, A3 등과 같은 용어는 인슐린의 A 사슬에서 각각 위치 1, 2 및 3(N-말단 끝으로부터 카운팅)을 나타낸다. 유사하게, B1, B2, B3 등과 같은 용어는 인슐린의 B 사슬에서 각각 위치 1, 2 및 3(N-말단 끝으로부터 카운팅)을 나타낸다. 아미노산에 대한 한 글자 코드를 사용하여, A21A, A21G 및 A21Q와 같은 용어는 A21 위치의 아미노산이 각각 A, G 및 Q임을 지정한다. 아미노산에 대해 3글자 코드를 사용하여, 대응하는 표현은 각각 AlaA21, GlyA21 및 GlnA21이다.
본원에서, 용어 A(O) 또는 B(O)는 각각 A 또는 B 사슬에서 각각 A1 또는 B1 위치에 N-말단으로 이웃하는 위치를 나타낸다. 용어 A(-1) 또는 B(-1)은 각각 A(O) 또는 B(O)에 대해 N-말단에서 처음 아미노산의 위치를 나타낸다. 따라서 A(-2) 및 B(-2)는 각각 A(-1) 및 B(-1)에 대해 N-말단의 위치를 나타내고, A(-3) 및 B(-3)은 각각 A(-2) 및 B(-2)에 대해 N-말단의 위치를 나타낸다.
본원에서, desB29 및 desB30와 같은 용어는 각각 B29 또는 B30 아미노산 잔기를 결핍하는 인슐린 유사체를 나타낸다.
본원에서, 용어 "속효성 인슐린"은 보통의 또는 통상의 인간 인슐린보다 더 빠른 작용의 개시를 가지는 인슐린을 포함한다.
본원에서, 용어 "지속성 인슐린" 또는 용어 "기저 인슐린"은 보통의 또는 통상의 인간 인슐린보다 더 긴 작용의 지속을 가지는 인슐린을 포함한다. 바람직하게는, 작용 시간은 5시간 이상, 또는 8시간, 특히 적어도 9시간이다. 바람직하게는, 기저 인슐린은 적어도 10시간의 작용 시간을 가진다. 따라서 기저 인슐린은 약 8 내지 24 시간의 범위에서, 바람직하게는 약 9 내지 약 15시간의 범위에서 작용 시간을 가질 수 있다.
인슐린 유사체, 인슐린 및 A 및 B 사슬에서 위치의 넘버링이 행해져서 모 화합물은 그것을 사용한 넘버링을 가지는 인간 인슐린이다.
본원에서, 용어 "아실화된 인슐린"은 프로테아제 안정화된 인슐린에 링커를 통해 하나 이상의 아실 모이어티의 부착에 의한 인슐린의 변형을 포함한다.
인슐린 활성을 가지는 아실화된 인슐린은 예를 들어, 정맥 내 또는 피하 투여에 의한 적당한 투여 후, 예를 들어, 래트, 토끼, 또는 돼지 모델일 수 있는 적당한 동물 모델에서 측정되는 포유동물 내 혈액 글루코오스 또는 인슐린 수용체 결합 친화도를 낮추는 능력을 가지는 아실화된 인슐린을 의미한다.
본원에서, 용어 알킬은 포화된, 분지된 또는 직선의 탄화수소 기를 포함한다.
본원에서, 용어 알콕시는 라디칼 "알킬-O-"를 포함한다. 대표적인 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시 (예를 들어, 1-프로폭시 및 2-프로폭시), 부톡시 (예를 들어, 1-부톡시, 2-부톡시 및 2-메틸-2-프로폭시), 펜톡시 (1-펜톡시 및 2-펜톡시), 헥속시 (1-헥속시 및 3-헥속시), 등이다.
본원에서, 용어 알킬렌은 1 내지 12개의 탄소 원자를 가지는 포화된, 분지된 또는 직선의 2가 탄화수소 기를 포함한다. 대표적인 예는, 제한되는 것은 아니지만, 메틸렌; 1,2-에틸렌; 1,3-프로필렌; 1,2-프로필렌; 1,3-부틸렌; 1,4-부틸렌; 1,4-펜틸렌; 1,5-펜틸렌; 1,5-헥실렌; 1,6-헥실렌 등을 포함한다.
본원에서, 용어 "중성의 선형 아미노산"은 포함한다. 중성의 선형 아미노산의 비제한적 예.
본원에서, 용어 "고리 아미노산"은 포함한다. 고리 아미노산의 비제한적 예.
본원에서, 용어 "산성 아미노산"은 포함한다. 산성 아미노산의 비제한적 예.
본원에서, 용어 "지방산"은 적어도 2개의 탄소 원자를 가지고 포화 또는 불포화된 선형 또는 분지된, 지방족 카르복실산을 포함한다. 지방산의 비제한적 예는 미리스트산, 팔미트산, 및 스테아르산이다.
본원에서, 용어 "지방 2산"은 적어도 2개의 탄소 원자를 가지고 포화 또는 불포화된 선형 또는 분지된, 지방족 2카르복실산을 포함한다. 지방산의 비제한적 예는 숙신산, 헥산디온산, 옥탄디온산, 데칸디온산, 도데칸디온산, 테트라데칸디온산, 헥사데칸디온산, 헵타데칸디온산, 옥타데칸디온산, 및 아이코산디온산이다.
본원에서, 인슐린의 명명은 하기 원칙에 따라서 행해진다. 명칭은 인간 인슐린에 대해서 돌연변이 및 변형(아실화)으로서 주어진다. 아실 모이어티의 명명에 대해, 명명은 IUPAC 명명법에 따르며 다른 경우에 펩티드 명명법으로서 행해진다. 예를 들어, 아실 모이어티:
Figure pct00001
의 명명은, 예를 들어, "옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG", 또는 "17-카르복시헵타데칸오일-γGlu-OEG-OEG"일 수 있고,
OEG는 아미노산 NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2H에 대한 약칭 표기법이고,
γGlu는 아미노산 감마 글루탐산에 대한 약칭 표기법이다.
아미노산에 대한 다른 약칭 표기법은, 예를 들어,
PEG3은 NH2((CH2)2O)4CH2CH2CO2H이고
PEG7은 NH2(CCH2)2O)8CH2CH2CO2H이다.
예를 들어, 실시예 9의 인슐린(하기 주어진 서열/구조)은 인간 인슐린에서 위치 A14의 아미노산, Y가 E로 돌연변이되고, 인간 인슐린에서 위치 B25의 아미노산 F는 H로 돌연변이되고, 인간 인슐린에서 위치 B29의 아미노산 K는 B29의 리신 잔기에서 엡실론 질소 상의 아실화에 의해 변형되어 잔기 옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG에 의해 Nε을 표시하고, 인간 인슐린에서 위치 30의 아미노산 T는 결실되었음을 나타내는 "A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린"을 명명한다. 하기 화학식의 별표는 당해 잔기가 인간 인슐린과 비교하여 다른 것(즉, 돌연변이)을 나타낸다. 본 출원을 통해 본 발명의 바람직한 인슐린의 화학식 및 명칭이 주어진다.
Figure pct00002
본원에서, 용어 "화학적 안정성" 및 "높은 화학적 안정성"은 화학적으로, 본 발명의 인슐린이 요망되는 제형에서 충분히 안정하다는 것을 의미한다. 이는 화학적 분해 생성물이 단지 최종 약물 생성물의 유통기한을 손상하지 않는 양으로 형성되는 것이다. 화학적 분해 생성물은 탈아미드화 생성물, 이소아스파르테이트 형성, 다이머 형성, 라세미화 생성물, 탈수 과정으로부터 초래되는 생성물 등을 포함한다. 화학적 안정성은 오래된 샘플 또는 제형의 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
본원에서, 용어 "높은 물리적 안정성"은 인간 인슐린의 안정성의 50% 미만인 섬유화에 대한 경향을 포함한다. 섬유화는 섬유 형성이 주어진 조건에서 시작되기 전 지체 시간에 의해 설명될 수 있다.
인슐린 수용체 및 IGF-1 수용체 친화도와의 폴리펩티드는 적당한 결합 분석에서 인슐린 수용체 및 인간 IGF-1 수용체와 상호작용할 수 있는 폴리펩티드이다. 이러한 수용체 분석은 본 분야에서 잘 알려져 있고 실시예에서 추가로 설명된다. 본 발명의 아실화된 인슐린은 IGF-1 수용체에 결합하지 않을 것이고 또는 상기 수용체에 다소 낮은 친화도를 가질 것이다. 더 정확히 말하면, 본 발명의 아실화된 인슐린은 인간 인슐린과 실질적으로 동일한 규모 또는 더 적은 규모의 IGF-1 수용체에 대한 친화도를 가질 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"은 보통의 약학적 용도에 적합한, 즉 환자 등에서 심각한 부작용을 일으키지 않는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 및 치료하는"은 질병, 장애 또는 질환과 싸우는 목적을 위한 환자의 관리 및 보살핌을 의미한다. 본 용어는 질병, 장애 또는 질환의 진행의 지연, 증상 및 합병증의 완화, 및/또는 질병, 장애 또는 질환의 치료 또는 제거를 포함하는 것으로 의도된다. 치료되는 환자는 바람직하게는, 포유동물, 특히 인간이다.
본원에 사용되는 용어 "질병의 치료"는 진행된 질병, 질환 또는 장애를 가지는 환자의 관리 및 보살핌을 의미한다. 치료의 목적은 질병, 질환 또는 장애와 싸우는 것이다. 치료는 질병, 질환 또는 장애를 제거 또는 조절하기 위할 뿐 아니라 질병, 질환 또는 장애와 관련된 증상 또는 합병증을 완화하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "질병의 예방"은 질병의 임상적 개시 전에 질병이 진행할 위험에 있는 개체의 관리 및 보살핌으로서 정의된다. 예방의 목적은 질병, 질환 또는 장애의 발생과 싸우는 것이고, 증상 또는 합병증의 개시를 예방 또는 지연하고 관련된 질병, 질환 또는 장애의 발생을 예방 또는 지연하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "유효한 양"은 치료가 없을 때와 비교하여 유효하게 되는 환자의 치료를 위해 충분한 투약량을 의미한다.
POT는 Schizosaccharomyces pombe 트리오스 인산 이소머라아제 유전자이며, TPI1은 S. cerevisiae 트리오스 인산 이소머라아제 유전자이다.
리더는 프리펩티드(신호 펩티드) 및 프로펩티드로 구성되는 아미노산 서열을 의미한다.
용어 신호 펩티드는 단백질의 전구체 형태에서 N-말단 서열로서 존재하는 프리펩티드를 의미하는 것으로 이해된다. 신호 펩티드의 기능은 소포체에 전좌를 용이하게 하는 이종성의 단백질을 허용하는 것이다. 신호 펩티드는 통상적으로 이 과정의 진행에서 분리된다. 신호 펩티드는 단백질을 생성하는 효모 유기체와 이종성 또는 상동성일 수 있다. 효모 아스파르트 프로테아제 3(YAP3) 단일 펩티드 또는 어떤 기능적 유사체를 포함하는 본 발명의 DNA 구조체와 함께 사용될 수 있는 다수의 단일 펩티드(Egel-Mitani et al. (1990) YEAST 6 127-137 및 US 5,726,038) 및 MF α1 유전자의 α-인자 신호(Thomer (1981) in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern et al., eds, pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY 및 US 4,870,00).
본원에서, 용어 "프로-펩티드"는 배양 배지에 분비를 위해 소포체로부터 골지체 및 추가로 분비 소포로 보내지는 발현된 폴리펩티드를 허용하는 기능의 폴리펩티드 서열을 포함한다(즉, 세포벽을 가로질러 또는 적어도 효모 세포의 원형질외극으로 세포막을 통한 폴리펩티드의 이출). 프로-펩티드는 효모 α-인자 프로-펩티드일 수 있다, 미국 특허 4,546,082 및 4,870,008 참조. 또 다르게는, 프로-펩티드는 천연에서 발견되지 않는 프로-펩티드를 말하는 합성 프로-펩티드일 수 있다. 적당한 합성 프로-펩티드는 US 5,395,922; 5,795,746; 5,162,498 및 WO 98/32867에서 개시되는 것이다. 프로-펩티드는 바람직하게는 Lys-Arg 서열 또는 그것의 어떤 기능적 유사체와 같은 C-말단에서 엔도펩티다아제 가공을 함유할 것이다.
명확하게 표시되지 않는다면, 본원에서 언급되는 아미노산은 L-아미노산이다. 추가로, 펩티드의 아미노산 서열의 왼쪽 및 오른쪽 말단은 달리 특정되지 않는다면, 각각 N- 및 C-말단이다.
발명의 개요
단백질 가수분해에 대해 안정화되고(특정 돌연변이에 의해) B29-리신에서 아실화된 인슐린이 폐 또는 경구로 투여될 수 있는 지속성의 인슐린으로서 효능이 있고 지속성이 있고 높은 효능을 소유한다는 것이 발견되었다. 아실화는 혈청 알부민에 결합되고, 결과적으로 연장을 제공한다. 게다가, 본 발명의 아실화된 인슐린은 단백질 가수분해에 대해 안정화되지 않은 유사한 아실화된 인슐린과 비교하여 인슐린 수용체 친화도의 실질적인 감소를 나타낸다. 본 발명의 알부민-결합 인슐린의 인슐린 수용체 친화도의 이런 감소는 순환에서 아실화된 인슐린의 연장에 기여하는데, 인슐린이 수용체 활성화에서 흡수되고 분해되기 때문이다. 따라서, 본 발명의 인슐린의 제거는 감소된다. 인슐린 수용체 친화도의 감소는 아마, 예를 들어, 본원에 설명되는 바와 같은 저혈당성 클램프 기법(hyperinsulinaemic euglycaemic clamp)으로 측정되는 효능의 손실을 야기하지 않는다. 높은 알부민 결합 친화도 및 낮은 인슐린 수용체 친화도의 결합은, 따라서, 인슐린(기저 인슐린) 작용의 오랜 지속을 얻는데 유리하다. 게다가, 경구 투여 후, 이들 아실화된 인슐린은 유사한 공지된 아실화된 인슐린 보다 더 높은 정도의 생체이용가능성을 가지며, 이는 단백질 가수분해에 대해 안정하지 않다. 따라서, 이들 아실화된 인슐린 유사체는 경구 투여에 유용하다. 유사하게, 폐 투여 후, 이들 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 유사한 공지된 아실화된 인슐린 보다 더 높은 명확한 효능 및/또는 생체이용가능성을 나타내며, 이는 단백질 가수분해에 대해 안정화되어 있지 않다. 추가로, 이들 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 포유동물에 폐로 투여될 때 연장된 작용 시간 프로파일을 나타낸다. 따라서, 이들 아실화된 인슐린 유사체는 폐 투여에 유용하다.
단백질 가수분해에 대해 안정화된 상기 언급된 인슐린은 본원에서 지정된 프로테아제 안정화된 인슐린이다.
프로테아제 안정화된 인슐린 분자는 발명의 상세한 설명 부분에서 설명되는 바와 같이 인간 인슐린에 대해 다른 아미노산 잔기로 치환된 제한된 수의 자연 발생 아미노산 잔기들을 가진다.
한 구체예에서, 본 발명은 아실화된 인슐린에 관한 것이며, 프로테아제 안정화된 인슐린 유사체가 하나 이상의 다음의 결실 또는 치환으로 인간 인슐린으로부터 유도된다: 위치 A18에서 Q, 위치 A21에서 A, G 또는 Q, 위치 B1에서 G 또는 Q 또는 위치 B1에서 아미노산 잔기 없음, 위치 B3에서 Q, S 또는 T 또는 위치 B3에서 아미노산 잔기 없음, 위치 B13에서 Q, 위치 B27에서 아미노산 잔기 없음, 위치 B28에서 D, E 또는 R 및 위치 B30에서 아미노산 없음.
또한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 아실화된 인슐린 및 적당한 보조제 및 안정화, 보존 또는 등장에 적당한 하나 이상의 약제, 예를 들어, 아연 이온, 페놀, 크레졸, 파라벤, 염화나트륨, 글리세롤 또는 만니톨을 포함하는 약학적 제제에 관한 것이다. 본 제형의 아연 함량은 인슐린의 6개 분자 당 0 내지 약 6개일 수 있다. 약학적 제제의 pH 값은 약 4 내지 약 8.5, 약 4 내지 약 5 또는 약 6.5 내지 7.5일 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명은 포유동물에서 혈액 글루코오스 수준을 감소시키기 위한, 특히 당뇨병의 치료를 위한 약제로서 아실화된 인슐린의 사용에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 혈액 글루코오스 수준을 감소시키기 위한, 특히 당뇨병의 치료를 위한 약학적 제제의 제조를 위한 아실화된 인슐린의 사용에 관한 것이다.
추가 구체예에서, 본 발명은 이러한 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 아실화된 인슐린의 치료적으로 활성인 용량을 투여함으로써 포유동물에서 혈액 글루코오스 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 양태에서, 아실화된 인슐린은 어떤 적당한 비율로 하나 이상의 추가 활성 물질과 조합하여 투여된다. 이러한 추가 활성 약제는 인간 인슐린, 속효성 인슐린 유사체, 당뇨병 치료제, 고지혈증 치료제, 비만치료제, 고혈압치료제 및 당뇨병으로부처 초래되는 또는 관련된 합병증의 치료를 위한 약제로부터 선택될 수 있다.
한 구체예에서, 2개의 활성 성분은 혼합된 약학적 제제로서 투여된다. 다른 구체예에서, 2개의 성분은 동시에 또는 순차적으로 분리되어 투여된다.
한 구체예에서, 본 발명의 아실화된 인슐린은 속효성 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체와 함께 투여될 수 있다. 이러한 속효성 인슐린 유사체는 위치 B28에서 아미노산 잔기가 Asp, Lys, Leu, Val, 또는 Ala이고, 위치 B29에서 아미노산 잔기가 Lys 또는 Pro, des(B28-B30) 인간 인슐린, des(B27) 인간 인슐린 또는 des(B30) 인간 인슐린, 유사체이며, 위치 B3의 아미노산 잔기는 Lys이고 위치 B29에서 아미노산 잔기는 Glu 또는 Asp일 수 있다. 본 발명의 아실화된 인슐린 및 초속효성 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체는 약 90%의 아실화된 인슐린 대 약 10%의 초속효성 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체, 바람직하게는 약 70%의 아실화된 인슐린 대 약 30%의 초속효성 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 50%의 아실화된 인슐린 대 약 50%의 초속효성 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체의 비율로 혼합될 수 있다(% 중량 백분율).
본 발명의 아실화된 인슐린은 또한 당뇨병 치료제와 함께 조합치료에서 사용될 수 있다.
당뇨병 치료제는 인슐린, WO 98/08871, WO 99/43706, US 5424286, WO 00/09666, WO 2006/097537, PCT/EP2008/061755 및 PCT/EP2008/061830에서 설명되는 GLP-1(1-37) (글루카곤 유사 펩티드-1), GLP-2, 엑센딘-4(1-39), 그것의 인슐린 친화성 분획, 그것의 인슐린 친화성 유사체 및 인슐린 친화성 유도체를 포함할 것이다. GLP-1(1-37)의 인슐린친화성 분획은 전체 서열이 GLP-1(1-37)의 서열에서 발견될 수 있고 적어도 하나의 말단 아미노산이 결실된 인슐린친화성 펩티드이다.
본 발명의 아실화된 인슐린은 또한 티아졸리딘디온, 메트포르민 및 다른 경구 치료를 위한 2형 당뇨병 약학적 제제와 같은 경구 당뇨병치료제와 함께 조합투여에 사용될 수 있다.
게다가, 본 발명의 아실화된 인슐린은 하나 이상의 비만치료제 또는 식욕 조절제와 조합하여 투여될 수 있다.
한 구체예에서 본 발명은 본 발명의 아실화된 인슐린 및 안정화, 보존 또는 등장에 적당한 하나 이상의 약제, 예를 들어, 아연 이온, 페놀, 크레졸, 파라벤, 염화나트륨, 글리세롤 또는 만니톨과 같은 적당한 보조제 및 첨가제를 포함하는 폐의 약학적 제제에 관한 것이다.
식이요법 및/또는 운동, 하나 이상의 상기-언급된 화합물 및 선택적으로 하나 이상의 다른 활성 물질과 함께 아실화된 인슐린의 어떤 적당한 조합은 본 발명의 범주 내인 것으로 이해되어야 한다.
인슐린의 안정성 및 용해도 특성은 현재 인슐린 치료에 대한 중요한 기본적인 양태이다. 본 발명은 안정한, 아실화된 인슐린을 제공함으로써 이들 문제를 다루며, 아실화는 분자 유연성을 감소시키고 동시에 섬유화 경향을 감소시키고 pH 침전 지역을 제한 또는 변형시킨다.
본 발명의 아실화된 인슐린은 예를 들어, 인간 인슐린 및 아실화된 인간 인슐린과 비교하여 그것의 비교적으로 높은 생체이용가능성 때문에 특히 폐 또는 경구 투여가 의도된다. 추가로, 아실화된 인슐린은 지속된 인슐린 활성을 가질 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 단백질 가수분해에 대해 안정화된 인슐린은 본원에서 지정된 프로테아제 안정화된 인슐린이다. 본 발명의 아실화된 인슐린은 본원에서 설명되는 아실화된 상기 프로테아제 안정화된 인슐린이다.
상기 프로테아제 안정화된 인슐린은 본원에서 지정된 모 인슐린 또는 비-프로테아제 안정화된 인슐린인 인슐린 화합물로부터 유도된다.
한 구체예에서, 모 인슐린은 a) 인간 인슐린; b) 위치 B28에서 아미노산 잔기는 Pro, Asp, Lys, Leu, Val, 또는 Ala이고 위치 B29에서 아미노산 잔기는 Lys 또는 Pro이고 선택적으로 위치 B30에서 아미노산 잔기는 결실되는 인간 인슐린의 인슐린 유사체; c) des(B28-B30) 인간 인슐린, des(B27) 인간 인슐린 또는 des(B30) 인간 인슐린인 인슐린 유사체; d) 위치 B3에서 아미노산 잔기는 Lys이고, 위치 B29에서 아미노산 잔기는 Glu 또는 Asp인 인간 인슐린의 인슐린 유사체; e) 위치 A21에서 아미노산 잔기는 Gly이고 인슐린 유사체는 2개의 아르기닌 잔기를 가지는 C-말단에서 추가로 연장되는 인간 인슐린의 인슐린 유사체; f) 위치 B30에서 아미노산 잔기가 트레오닌 메틸 에스테르로 치환되는 인슐린 유도체; 및 g) des(B30) 인간 인슐린의 위치 B29에서 리신의 Nε 위치에 테트라데칸오일 사슬이 부착되는 인슐린 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된다. 각각의 이들 군은 특정 구체예이다.
다른 구체예에서, 모 인슐린은 인간 인슐린, desB30 인간 인슐린; AspB28 인간 인슐린; AspB28,DesB30 인간 인슐린; LysB3,GluB29 인간 인슐린; LysB28,ProB29 인간 인슐린; GlyA21, ArgB31 ArgB32 인간 인슐린; 및 desB30, ArgB31, ArgB32 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
더 구체적으로, 프로테아제 안정화된 인슐린은 모 인슐린에 대하여 A 및/또는 B 사슬의 2개 이상의 돌연변이를 가지는 인슐린 분자이다. 놀랍게도, 인슐린에서 2개 이상의 프로테아제 자리 내에 또는 그곳과 인접하여 2개 이상의 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환함으로써, 모 인슐린과 비교하여 단백질 가수분해적에 더 안정한 인슐린 유사체(즉, 프로테아제 안정화된 인슐린)이 획득된다는 것이 발견되었다. 넓은 양태에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은, 적어도 2개의 소수성 아미노산이 모 인슐린에 대하여 친수성 아미노산으로 치환되었고, 치환은 모 인슐린의 2개 이상의 프로테아제 절단 자리와 자리 내에 또는 그곳과 인접하여 있고, 이러한 인슐린 유사체는 선택적으로 하나 이상의 추가의 돌연변이를 추가로 포함하는 인슐린 유사체이다.
다른 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 인슐린 유사체이며,
● 위치 A12에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고 및/또는 위치 A13에서 아미노산은 His, Asn, Glu 또는 Asp이고 및/또는 위치 A14에서 아미노산은 Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly 또는 His이고 및/또는 위치 A15에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고,
● 위치 B24에서 아미노산은 His이고 및/또는 위치 B25에서 아미노산은 His이고 및/또는 위치 B26에서 아미노산은 His, Gly, Asp 또는 Thr이고 및/또는 위치 B27에서 아미노산은 His, Glu, Gly 또는 Arg이고 및/또는 위치 B28에서 아미노산은 His, Gly 또는 Asp이고, 선택적으로 추가로 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다.
다른 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 B27의 돌연변이와 조합하여, 선택적으로 다른 돌연변이와 조합하여 B25H 또는 B25N 돌연변이를 포함하는 유사체이다.
다른 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 B27에서 돌연변이와 조합하여, 선택적으로 다른 돌연변이와 조합하여 B25H 또는 B25N 돌연변이를 포함하는 유사체이다. 위치 B27에서 돌연변이는, 예를 들어, Glu 또는 Asp일 수 있다.
B25 및 B27 돌연변이를 둘 다 포함하는 이들 프로테아제 안정화된 아실화된 인슐린 유사체는 유리한 특성을 가진다.
다른 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 식 1의 A-사슬 아미노산 서열을 포함하는 인슐린 유사체이다:
(식 1)(SEQ ID No:1)
Figure pct00003
및 식 2의 B-사슬 아미노산 서열:
식 (2) (SEQ ID No: 2)
Figure pct00004
상기식에서
XaaA (-2)는 없거나 또는 Gly이고;
XaaA (-1)은 없거나 또는 Pro이고;
XaaA0은 없거나 또는 Pro이고;
XaaA8은 Thr 및 His으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA12는 Ser, Asp 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA13은 Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA14는 Tyr, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA15는 Gln, Asp 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA18은 Asn, Lys 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA21은 Asn 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB (-2)는 없거나 또는 Gly이고;
XaaB (-1)는 없거나 또는 Pro이고;
XaaB0은 없거나 또는 Pro이고;
XaaB1은 없거나 또는 Phe 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB2는 없거나 또는 Val이고,
XaaB3은 없거나 또는 Asn 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB4는 Gln 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB10은 His, Asp, Pro 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고,
XaaB16은 Tyr, Asp, Gln, His, Arg, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB24는 Phe 및 His으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB25는 Asn, Phe 및 His으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB26은 없거나 또는 Tyr, His, Thr, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB27은 없거나 또는 Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고,
XaaB28은 없거나 또는 Pro, His, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB29는 없거나 또는 Lys, Arg 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는, XaaB29는 없거나 또는 Lys 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB30은 없거나 또는 Thr이고,
XaaB31은 없거나 또는 Leu이고;
XaaB32는 없거나 또는 Glu이고;
C-말단은 선택적으로 아미드로서 유도될 수 있고;
A-사슬 아미노산 서열 및 B-사슬 아미노산 서열은 A-사슬의 위치 7에서 시스테인과 B-사슬의 위치 7에서 시스테인 사이, A-사슬의 위치 20에서 시스테인과 B-사슬의 위치 19에서 시스테인 사이의 이황화 다리에 의해 연결되고, A-사슬의 위치 6 및 11의 시스테인은 이황화 다리에 의해 연결된다.
다른 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 식 3의 A-사슬 아미노산 서열:
(식 3) (SEQ ID No: 3)
Figure pct00005
및 식 4의 B-사슬 아미노산 서열을 포함하는 인슐린 유사체이다:
(식 4) (SEQ ID No: 4)
Figure pct00006
상기식에서
XaaA8은 Thr 및 His으로부터 독립적으로 선택되고,
XaaA12는 Ser, Asp 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA13은 Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA14는 Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA15는 Gln, Asp 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA18은 Asn, Lys 및 Gln로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA21은 Asn, 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB1은 Phe 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB3은 Asn 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB4는 Gln 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB10은 His, Asp, Pro 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB16은 Tyr, Asp, Gln, His, Arg, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB24는 Phe 및 His으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB26는 없거나 또는 Tyr, His, Thr, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB27은 없거나 또는 Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고,
XaaB28은 없거나 또는 Pro, His, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고,
XaaB29는 없거나 또는 Lys, Arg 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는, XaaB29는 없거나 또는 Lys 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB30은 없거나 또는 Thr이고,
C-말단은 선택적으로 아미드로서 유도될 수 있고;
A-사슬 아미노산 서열 및 B-사슬 아미노산 서열은 A-사슬의 위치 7에서 시스테인과 B-사슬의 위치 7에서 시스테인 사이, A-사슬의 위치 20에서 시스테인과 B-사슬의 위치 19에서 시스테인 사이의 이황화 다리에 의해 연결되고, A-사슬의 위치 6 및 11에서 시스테인은 이황화 다리에 의해 연결된다.
다른 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 인슐린 유사체이며,
XaaA8은 Thr 및 His으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA12는 Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA13은 Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA14는 Asp, His, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA15는 Gln 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA18은 Asn, Lys 및 Gln로부터 독립적으로 선택되고;
XaaA21은 Asn, 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB1은 Phe 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB3은 Asn 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB4는 Gln 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB10은 His, Asp, Pro 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB16은 Tyr, Asp, Gln, His, Arg, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB24는 Phe 및 His로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB25는 Phe, Asn 및 His으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB26은 Tyr, Thr, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB27은 Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB28은 Pro, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB29는 Lys 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고;
XaaB30은 없거나 또는 Thr이고,
C-말단은 선택적으로 아미드로서 유도될 수 있고,
A-사슬 아미노산 서열 및 B-사슬 아미노산 서열은 A-사슬의 위치 7에서 시스테인과 B-사슬의 위치 7에서 시스테인 사이, A-사슬의 위치 20에서 시스테인과 B-사슬의 위치 19에서 시스테인 사이의 이황화 다리에 의해 연결되고, A-사슬의 위치 6 및 11에서 시스테인은 이황화 다리에 의해 연결된다.
프로테아제 안정화된 인슐린의 다른 예는 하기에서 언급된다.
"프로테아제" 또는 "프로테아제 효소"는 예를 들어, 위(펩신), 장 내강(키모트립신, 트립신, 엘라스타아제, 카르복시펩티다아제 등) 또는 GI 관의 점막 표면(아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제, 엔테로펩티다아제, 디펩티딜 펩티다아제, 엔도펩티다아제 등), 간(인슐린 분해 효소, 카텝신 D 등), 및 다른 조직과 같은 인간 신체의 다양한 조직에서 발견되는 단백질 및 펩티드를 분해하는 분해 효소이다.
단백질 가수분해에 안정한 인슐린 유사체(또한 지정된 프로테아제 안정화된 인슐린)는 본원에서 인간 인슐린에 대해 하나 이상의 프로테아제에 의해 더 느리게 분해되는 인슐린 유사체로서 이해된다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 모 인슐린에 대해 하나 이상의 프로테아제에 의해 더 느리게 분해된다. 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 펩신(예컨대, 이소형 펩신 A, 펩신 B, 펩신 C 및/또는 펩신 F), 키모트립신(예컨대, 이소형 키모트립신 A, 키모트립신 B 및/또는 키모트립신 C), 트립신, 인슐린-분해 효소(IDE), 엘라스타아제(예컨대, 이소형 췌장 엘라스타아제 I 및/또는 II), 카르복시펩티다아제(예를 들어, 이소형 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 A2 및/또는 카르복시펩티다아제 B), 아미노펩티다아제, 카텝신 D 및 래트, 피그 또는 인간으로부터 유래된 장 추출물에 존재하는 다른 효소로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소에 의한 분해에 대해 안정화된다.
한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 키모트립신, 트립신, 인슐린-분해 효소(IDE), 엘라스타아제, 카르복시펩티다아제, 아미노펩티다아제 및 카텝신 D로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소에 의한 분해에 대해 안정화된다. 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 키모트립신, 카르복시펩티다아제 및 IDE로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나이상의 효소에 의한 분해에 대해 안정화된다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 키모트립신 및 카르복시펩티다아제로부터 선택되는 하나 이상의 효소에 의한 분해에 대해 안정화된다.
T1 /2은 키모트립신, 펩신 및/또는 카르복시펩티다아제 A와 같은 프로테아제 효소에 대해 프로테아제 안정화된 인슐린의 단백질 가수분해 안정성의 측정으로서 실시예에서 설명되는 바와 같이 결정될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, T1 /2은 인간 인슐린에 대해 증가된다. 추가 구체예에서, T1 /2은 모 인슐린에 대해 증가된다. 또한 추가 구체예에서, T1 /2은 모 인슐린에 대해 적어도 2-배로 증가된다. 또한 추가 구체예에서, T1 /2은 모 인슐린에 대해 적어도 3-배로 증가된다. 또한 추가 구체예에서, T1 /2은 모 인슐린에 대해 적어도 4-배로 증가된다. 또한 추가 구체예에서, T1 /2은 모 인슐린에 대해 적어도 5-배로 증가된다. 또한 추가 구체예에서, T1 /2은 모 인슐린에 대해 적어도 10-배로 증가된다.
단백질 가수분해 안정성을 측정하는 또 다른 방법은 비교기, 예를 들어, 인간 인슐린에 대한 상대적 안정성을 측정하는 것이다. 상대적 안정성은 T1 /2/T1 /2(비교기)로서 정의되며, T1 /2/T1 /2(비교기)는 각각 분해 분석에서 유사체 및 비교기의 반감기이다. 실시예 섹션에서, 래트의 십이지장으로부터 추출한 효소 혼합물에 대해 본 발명의 선택된 인슐린의 상대적 안정성이 주어진다(아실화 없이 인간 인슐린 및 프로테아제-저항 인슐린에 대해).
프로테아제 절단 자리(또한 본원에서 프로테아제 자리로서 언급됨)는 프로테아제에 의해 인식되는 아미노산 잔기 및/또는 펩티드 결합이 프로테아제에 의해 분해되는 아미노산 잔기로서 이해되는 것이다. 프로테아제 절단 자리는 HPLC, MS 또는 LC-MS 분석에 의해 및/또는 프로테아제 절단 자리가 결정되도록 하기 위한 프로테아제 효소의 효소 특이성을 기초로 한 예측에 의해 분해 "핫-스팟"을 결정함으로써 결정될 수 있다. 당업자는 예를 들어, Handbook of Proteolytical Enzymes, 2nd ed, Barrett, A.J., Rawlmgs, N.D., Woesner, J.F. editors, Elsevier Academic Press 2004에서 설명되는 바와 같이, 예를 들어 효소 특이성을 기초로 프로테아제 절단 자리를 결정하는 방법을 알 것이다. 예를 들어, 키모트립신은 방향족 잔기(Trp, Tyr, Phe 또는 Leu)에 대한 펩티드 결합 C-말단을 절단하는 것으로 예측되며, 다음은 Pro이 아니다. 유사하게, 트립신은 염기성 잔기 Lys 또는 Arg에 대한 펩티드 결합 C-말단을 절단하는 것으로 예측되며, 다음은 Pro이 아니고, 엘라스타아제는 Ala, Val, Gly 또는 Ser에 대한 잔기 C-말단을 절단하는 것으로 예측되고 카르복시펩티다아제 A는 임의의 C-말단 아미노산을 제거할 것이지만, Arg, Lys 또는 Pro은 아니다. 인슐린-분해 효소(IDE)는 인간 인슐린 B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14 및 A14-15의 다음 위치를 절단하는 것으로 예측된다.
용어 프로테아제 절단 자리 "내에 또는 그곳과 인접하여" 아미노산을 치환하는은 본원에서 프로테아제 절단 자리가 되는 것으로 결정된 모 인슐린의 위치 내에 또는 그곳과 인접하여 아미노산의 치환을 나타내는 것으로 사용된다. 한 구체예에서, 인슐린 상의 2개 이상의 프로테아제 자리 내에 또는 그곳과 인접하여 2개 이상의 소수성 아미노산이 치환되며, 상기 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된다. 추가 구체예에서, 인슐린 상의 2개 이상의 프로테아제 자리 내에서 2개 이상의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된다. 또한 추가 구체예에서, 인슐린 상의 2개 이상의 프로테아제 자리 다음에 위치되는 2개 이상의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된다. 또한 추가 구체예에서, 인슐린 상에서 2 이상의 프로테아제 자리로부터 2개 아미노산으로 떨어져서 위치되는 2개 이상의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된다. 또한 추가 구체예에서, 인슐린 상의 2개 이상의 프로테아제 자리로부터 3개 아미노산으로 떨어져서 위치되는 2개 이상의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된다. 또한 추가 구체예에서, 인슐린 상에서 2개 이상의 프로테아제 자리로부터 4개까지의 아미노산으로 떨어져서 위치되는 2개 이상의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된다. 또한 추가 구체예에서, 인슐린 상의 2개 이상의 프로테아제 자리로부터 또는 자리에서 1, 2 또는 3개 아미노산으로 떨어져서 위치되는 2개 이상의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된다. 또한 추가 구체예에서, 인슐린 상의 2개 이상의 프로테아제 자리로부터 또는 자리에서 1 또는 2개 아미노산으로 떨어져서 위치되는 2개 이상의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된다. 또한 추가 구체예에서, 인슐린 상의 2개 이상의 프로테아제 자리 다음에 또는 자리에 위치되는 2개 이상의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된다.
프로테아제 안정화된 인슐린은 모 인슐린의 순전하와 다른 순전하를 가질 수 있다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 순전하는 모 인슐린의 순전하보다 더 포지티브하다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 순전하는 모 인슐린의 순전하보다 더 네가티브하다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 포지티브 순전하는 수용액에서 측정되는 바와 같이 0.5 내지 5이다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 포지티브 순전하는 1 내지 5이다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 포지티브 순전하는 1 내지 4이다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 포지티브 순전하는 1 내지 3이다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 포지티브 순전하는 2 내지 3이다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 네가티브 순전하는 수용액에서 측정되는 바와 같이 -0.5 내지 -5이다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 네가티브 순전하는 -1 내지 -5이다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 네가티브 순전하는 -1 내지 -4이다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 네가티브 순전하는 -1 내지 -3이다. 한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린의 평균 네가티브 순전하는 -2 내지 -3이다.
한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 인간 인슐린에 대해서 증가된 용해도를 가질 수 있다. 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 3-9에서 인간 인슐린에 대해서 증가된 용해도를 가진다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 4-8.5에 대해서 증가된 용해도를 가진다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 4-8에서 인간 인슐린에 대해서 증가된 용해도를 가진다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 4.5-8에서 인간 인슐린에 대해서 증가된 용해도를 가진다. 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 5-8에서 인간 인슐린에 대해서 증가된 용해도를 가진다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 5.5-8에서 인간 인슐린에 대해서 증가된 용해도를 가진다. 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 6-8에서 인간 인슐린에 대해서 증가된 용해도를 가진다.
한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 2-4에서 인간 인슐린에 대해서 증가된 용해도를 가진다.
한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 모 인슐린에 대해 증가된 용해도를 가질 수 있다. 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 3-9에서 모 인슐린에 대해서 증가된 용해도를 가진다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 4-8.5에서 모 인슐린에 대해 증가된 용해도를 가진다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 4-8에서 모 인슐린에 대해 증가된 용해도를 가진다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 4.5-8에서 모 인슐린에 대해 증가된 용해도를 가진다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 5-8에서 모 인슐린에 대해 증가된 용해도를 가진다. 또한 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 5.5-8에서 모 인슐린에 대해 증가된 용해도를 가진다. 추가 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 6-8에서 모 인슐린에 대해 증가된 용해도를 가진다.
한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 pH 2-4에서 모 인슐린에 대해 증가된 용해도를 가진다.
"주어진 pH에서 증가된 용해도"는 프로테아제 안정화된 인슐린의 더 큰 농도가 모 인슐린에 대해 용액의 pH에서 수용액 또는 완충 용액에 용해하는 것을 의미한다. 용액에 함유된 인슐린이 용해되는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
한 구체예에서, 용액은 30,000 g에서 20분 동안 원심분리될 수 있고 그 후 상청액에서 인슐린 농도는 RP-HPLC에 의해 결정될 수 있다. 이 농도는 조성물을 만들기 위해 원래 사용되는 인슐린 농도에 대한 실험적 오차 내에서 동일하고, 그 후 인슐린은 본 발명의 조성물에서 완전히 용해된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 인슐린의 용해도는 조성물이 함유되는 용기를 육안으로 시험함으로써 간단하게 결정될 수 있다. 용액이 육안으로 맑고 미립자 물질이 용기의 측면/바닥에 현탁 또는 침전되지 않는다면 인슐린은 가용성이다.
프로테아제 안정화된 인슐린은 측정시와 비교할 때 모 인슐린에 대해 증가된 명확한 효능 및/또는 생체이용가능성을 가질 수 있다.
시험관내 효능에서 인슐린을 측정하기 위한 표준 분석은 당업자에게 공지되어 있고 그 중에서도 (1) 인슐린의 상대적 효능이 세포막에 존재하는 인슐린 수용체에 특이적으로 결합된 125I-인슐린의 50%를 대체하는 것이 요구되는 인슐린 대 인슐린 유사체의 비율로서 정의되는, 인슐린 방사선수용체측정법, (2) 지방생성 분석, 예를 들어, 래트 지방세포, 여기서 상대적 인슐린 효능은 유기-추출 물질(즉, 지질)로 [3-3H] 글루코오스의 최대 변환의 50%를 달성하기 위해 요구되는 인슐린 대 인슐린 유사체의 비율로서 정의된다, (3) 분리된 지방 세포에서 글루코오스 산화 분석, 여기서 인슐린 유사체의 상대적 효능은 [14CO2]로 글루코오스-1-[14C]의 최대 변환의 50%를 달성하기 위한 인슐린 대 인슐린 유사체의 비율로서 정의된다, (4) 인슐린 또는 인슐린 유사체가 특정 항-인슐린 항체에 결합하는 125I-인슐린과 경쟁하는 것에 의한 인슐린 방사면역측정법, 및 (5) 동물 혈장 샘플에서 항체에 인슐린 또는 인슐린 유사체의 결합을 측정하는 다른 방법, 예컨대, 특정 인슐린 항체를 소유하는 ELISA 분석을 포함한다.
증가된 명백한 생체내 효능은 유사한 용량으로 주어지는 프로테아제 안정화 돌연변이 없이 유사한 인슐린과 함께 혈액 글루코오스 vs. 당해 인슐린의 시간 프로파일의 비교에 의해 측정/생각될 수 있다. 본 발명의 인슐린은 비교기에 대해 증가된 혈액 글루코오스 저하 효과를 가질 것이다.
인슐린 생체이용가능성을 측정하기 위한 표준 분석은 당업자에게 공지되어 있고 특히 동일 종에서 폐 또는 경구 및 정맥으로(i.v.) 투여되는 당해 인슐린의 농도에 대한 곡선하 상대적 면적(AUC)의 측정을 포함한다. 혈액(혈장) 샘플에서 인슐린 농도의 양은 예를 들어, 항체 분석(ELISA)을 사용하여 또는 질량 분석법에 의해 행해질 수 있다. 폐 투여는 몇몇 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 인슐린은 점적에 의해 래트에, 또는 건조 분말 흡입제에 의해 돼지에 투여될 수 있다.
프로테아제 안정화된 인슐린은 선택적으로 하나 이상의 소수성 아미노산이 소수성 아미노산으로 추가 치환될 수 있는 추가 프로테아제 자리에 대해 분석될 수 있다. 프로테아제 안정화된 인슐린은 모 인슐린, 제 1 변형 인슐린과 비교하여 프로테아제 자리에서 적어도 2개의 친수성 산을 가지는 인슐린 유사체일 수 있으며, 이는 제 1 변형 인슐린의 새로운 프로테아제 자리에서 적어도 하나의 아미노산을 추가로 가지며, 적어도 하나의 소수성 아미노산은 적어도 하나의 친수성 아미노산으로 치환되었다.
편의상, 본원은 삽입 어구 글리신 (Gly & G), 프롤린 (Pro & P), 알라닌 (Ala & A), 발린 (Val & V), 류신 (Leu & L), 이소류신 (Ile & I), 메티오닌(Met & M), 시스테인 (Cys & C), 페닐알라닌 (Phe & F), 티로신 (Tyr & Y), 트립토판 (Trp & W), 히스티딘 (His & H), 리신 (Lys & K), 아르기닌 (Arg & R), 글루타민 (Gln & Q), 아스파라긴 (Asn & N), 글루탐산 (Glu & E), 아스파르트산 (Asp & D), 세린 (Ser & S) 및 트레오닌 (Thr & T)으로 통상 3 레터 코드 & 1 레터 코드에 의한 암호화 가능한, 천연 아미노산의 명칭을 따른다. 타이핑 오류에 기인하여 통상적으로 사용되는 코드로부터의 일탈이 있다면, 통상적으로 사용되는 코드가 사용된다. 본 발명의 인슐린에 존재하는 아미노산은 바람직하게는, 핵산에 의해 코딩될 수 있는 아미노산이다. 한 구체예에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 Gly, Glu, Asp, His, Gln, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg 및/또는 Pro에 의해 치환되고 및/또는 Gly, Glu, Asp, His, Gln, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg 및/또는 Pro은 인슐린 또는 인슐린 유사체에 첨가된다. 한 구체예에서, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 Glu, Asp, His, Gln, Asn, Lys 및/또는 Arg에 의해 치환되고 및/또는 Glu, Asp, His, Gln, Asn, Lys 및/또는 Arg는 인슐린 또는 인슐린 유사체에 첨가된다.
한 구체예에서, 하기 화합물: A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H desB30 인간 인슐린; A14E, B16E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B28D, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A8H, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A8H, A14E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A8H, A14E, B1E, B25H, desB30 인간 인슐린; A8H, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A8H, A14E, B16E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26D, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, B28D, desB30 인간 인슐린; A14E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14D, B25H, desB30 인간 인슐린; B25N, B27E, desB30 인간 인슐린; A8H, B25N, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B28E, desB30 인간 인슐린; B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; B1E, B25H, B27E, desb30 인간 인슐린; A8H, B1E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A8H, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; B25N, B27D, desB30 인간 인슐린; A8H, B25N, B27D, desB30 인간 인슐린, B25H, B27D, desB309 인간 인슐린; A8H, B25H, B27D, desB30 인간 인슐린; A(-1)P, A(O)P, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B(-1)P, B(O)P, B25H, desB30 인간 인슐린; A(-1)P, A(O)P, A14E, B(-1)P, B(O)P, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B30T, B31L, B32E 인간 인슐린; A14E, B25H 인간 인슐린; A14E, B16H B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B10P, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B10E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B4E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14H, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14H, B10E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13H, A14E, B10E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13H, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B24H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린; A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30 인간 인슐린; A13H, A14E, B1E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13N, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13N, A14E, B1E, B25H, desB30 인간 인슐린; A(-2)G, A(-1)P, A(O)P, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(O)P, B25H, desB30 인간 인슐린; A(-2)G, A(-1)P, A(O)P, A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(O)P, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B27R, B28D, B29K, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27R, B28D, B29K, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26T, B27R, B28D, B29K, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27R, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27H, desB30 인간 인슐린; A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30 인간 인슐린; A13E, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A12E, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A15E, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13E, B25H desB30 인간 인슐린,; A12E, B25H, desB30 인간 인슐린; A15E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26D, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27R, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27N, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27D, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27Q, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27G, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27K, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27P, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27S, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27T, desB30 인간 인슐린; A13R, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13N, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13D, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13Q, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13E, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13G, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13H, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13K, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13P, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13S, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A13T, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B16R, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B16D, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B16Q, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B16E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14R, B25H, desB30 인간 인슐린; A14N, B25H, desB30 인간 인슐린; A14D, B25H, desB30 인간 인슐린; A14Q, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14G, B25H, desB30 인간 인슐린; A14H, B25H, desB30 인간 인슐린; A8H, B10D, B25H 인간 인슐린; 및 A8H, A14E, B10E, B25H, desB30 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이 구체예는, 선택적으로 A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린, B25H, desB30 인간 인슐린, 및 B25N, desB30 인간 인슐린을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 하기 화합물 A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B16E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G desB30 인간 인슐린; B25H, desB30 인간 인슐린 및 A14E, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 추가로 desB27 돌연변이를 함유하는 상기 군 중 어떤 것으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 하기 화합물 A14E, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, B16E, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29R desB30 인간 인슐린 및 B25H, desB27, desB30 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 추가로 화학적 안정성을 개선시키기 위해 위치 A21 및/또는 B3에서 하기 돌연변이 A21G, desA21, B3Q, 또는 B3G를 함유하는 상기 군 중 어떤 것으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 하기 프로테아제 안정화된 인슐린 A14E, A21G, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B16E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27 desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린; A21G, B25H, desB30 인간 인슐린 및 A21G, B25N, desB30 인간 인슐린으로부터 선택되고, 바람직하게는, 이는 하기 프로테아제 안정화된 인슐린 A14E, A21G, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B16E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27 desB30 인간 인슐린; A21G B25H, desB30 인간 인슐린 및 A21G, B25N, desB30 인간 인슐린으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 B29K의 엡실론 질소 위치의 B29 위치에서 아실화된다.
바람직한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 A1의 알파 질소 위치의 A1 위치에서 아실화된다.
바람직한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 A1의 알파 질소 위치의 A1 위치에서 아실화되고, 프로테아제 안정화된 인슐린은 B29R 돌연변이를 포함한다.
프로테아제 안정화된 인슐린은, 예컨대 미국 특허 6,500,645에 개시된 바와 같은 잘 공지된 기술에 의해 적당한 숙주 세포에서 당해 인슐린을 암호화하는 DNA 서열을 발현함으로써 생성된다. 프로테아제 안정화된 인슐린은 직접 발현되거나 또는 B-사슬에서 N-말단 확장을 가지는 전구체 분자이다. 이 N-말단 확장은 직접적으로 발현된 생성물의 수율을 증가시키는 기능을 가질 수 있고 15개 까지의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. N-말단 확장은 배양 브로스로부터 분리후 시험관내에서 분리되고 따라서 B1 다음에 절단 자리를 가질 것이다. 본 발명에 적당한 종류의 N-말단 확장은 미국 특허 5,395,922호, 및 유럽 특허 765,395A에서 개시된다.
프로테아제 안정화된 인슐린에 대한 폴리뉴클레오티드 서열 암호화는 확립된 표준 방법, 예컨대, Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22 1859-1869에 의해 설명되는 포스포아미다이트 방법, 또는 Matthes et al . (1984) EMBO Journal 3: 801-805에 의해 기술되는 방법에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 포스포아미다이트 방법에 따라서, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 자동 DNA 합성장치에서 합성되고, 정제, 중복 및 결찰되어 합성 DNA 구조체를 형성한다. DNA 구조체를 제조하는 현재 바람직한 방법은 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 또한 혼합된 게놈, cDNA, 및 합성 기원일 수 있다. 예를 들어, 리더 펩티드를 암호화하는 게놈 또는 cDNA 서열은 A 및 B 사슬을 암호화하는 게놈 또는 cDNA 서열에 결합될 수 있고, 그 후 DNA 서열이 잘 공지된 과정에 따르는 상동 재조합에 대해 요망되는 아미노산 서열을 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드를 삽입함으로써 또는 바람직하게는 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 요망되는 서열을 발생시킴으로써 자리에서 변형될 수 있다.
재조합 방법은 전형적으로 선택된 미생물 또는 숙주 세포에서 복제가능하고 프로테아제 안정화된 인슐린을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 옮기는 벡터의 사용할 것이다. 재조합 벡터는 자동 복제 벡터, 즉, 염색체 외의 독립체로서 존재하는 벡터, 염색체 복제와 독립한 복제, 예를 들어, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니-염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자기-복제를 보증하기 위한 어떤 수단을 함유할 수 있다. 또 다르게는, 벡터는 숙주세포에 도입될 때, 게놈에 통합되고 그것이 통합되는 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다. 게다가, 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 숙주 세포의 게놈에 도입되는 전체 DNA를 함께 함유하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포존이 사용될 수 있다. 벡터는 선형 또는 폐환 플라스미드일 수 있고, 바람직하게는 숙주 세포의 게놈에 벡터의 안정한 통합 또는 게놈과 독립한 세포에서 벡터의 자동 복제를 허용하는 요소(들)을 함유할 것이다.
재조합 발현 벡터는 효모에서 복제가능하다. 벡터를 효모에서 복제가능하게 하는 서열의 예는 효모 플라스미드 2 μm 복제 유전자 REP 1-3 및 복제의 기원이다.
벡터는 형질변환된 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 선택가능한 마커는 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양 요구체에 대한 원영양성 등을 제공하는 생성물의 유전자이다. 박테리아 선택가능한 마커의 예는 Bacillus subtilis 또는 Bacillus licheniformis 또는 암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 수여하는 마커로부터의 dal 유전자이다. 섬질의 진균 숙주 세포에서 사용을 위한 선택가능한 마커는 amdS (아세트아미다아제), argB (오르니틴 카르바모일트랜스퍼라아제), pyrG (오르니틴-5'-포스페이트 데카르복실라아제) 및 trpC (안트라닐레이트 신타아제)를 포함한다. 효모 숙주 세포를 위한 적당한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이다. 효모를 위한 적합화된 선택가능한 마커는 Schizosaccharomyces pompe TPI 유전자 (Russell (1985) Gene 40: 125-130)이다.
벡터에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 적당한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 돌연변이, 끝이 잘리고, 혼성화된 프로모터를 포함하는 선택의 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떤 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 상동 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 획득될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에서 전사를 지시하기 위한 적당한 프로모터의 예는, E. coli lac 오페론, Streptomyces coelicolor 아가라아제 유전자 (dagA), Bacillus subtilis 레반수크라아제 유전자 (sacS), Bacillus licheniformis 알파-아밀라아제 유전자(amyL), Bacillus stearothermophilus 말토제닉 아밀라아제 유전자(amyM), Bacillus amyloliquefaciens 알파-아밀라아제 유전자(amyQ), 및 Bacillus licheniformis 페니실리나아제 유전자 (penP)로부터 획득되는 프로모터이다. 섬질 진균 숙주 세포에서 전사를 지시하기 위한 적당한 프로모터의 예는 Aspergillus oryzae TAKA 아밀라아제, Rhizomucor miehei 아스파르트 프로테이나아제, Aspergillus niger 중성 알파-아밀라아제, 및 Aspergillus niger 산 안정성 알파-아밀라아제를 위한 유전자로부터 획득되는 프로모터이다. 효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 Saccharomyces cerevisiae Ma1, TPI, ADH 또는 PGK 프로모터이다.
프로테아제 안정화된 인슐린을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 전형적으로 적당한 터미네이터에 작동가능하게 연결될 것이다. 효모에서, 적당한 터미네이터는 TPI 터미네이터 (Alber et al (1982) J Mol . Appl Genet. 1: 419-434)이다.
프로테아제 안정화된 인슐린, 프로모터 및 터미네이터 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결합하고 선택된 숙주에서 복제에 필요한 정보를 함유하는 적당한 벡터에 그것들을 삽입하기 위해 사용된 과정은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 벡터가 본 발명의 인슐린을 암호화하는 전체 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조체를 우선 제조하고, 이후에 적당한 발현 벡터에 이 분획을 삽입함으로써, 또는 개개 요소에 대한 유전 정보를 함유하는 DNA 단편(예컨대, 단일, 프로-펩티드, 연결 펩티드, A 및 B 사슬)을 순차적으로 삽입한 후 결합함으로써 구성될 수 있다.
프로테아제 안정화된 인슐린을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 숙주 세포에 도입되어서 벡터는 염색체 구성요소로서 또는 자기-복제 염색체외 벡터로서 유지된다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 일어나는 돌연변이에 기인하는 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 어떤 자손을 포함한다. 숙주 세포는 단세포 미생물, 예를 들어, 원핵생물, 또는 단세포가 아닌 미생물, 예를 들어, 진핵생물일 수 있다. 유용한 단세포 세포는, 제한되는 것은 아니지만, Bacillus 세포, Streptomyces 세포를 포함하는 그램 양성 박테리아, 또는 그램 음성 박테리아, 예컨대, E. coli 및 Pseudomonas sp와 같은 박테리아 세포이다. 진핵생물 세포는 포유동물, 곤충, 식물, 또는 진균 세포일 수 있다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 효모 유기체는 본 발명의 단일 사슬 인슐린의 많은 양을 생성하는 배양에서 어떤 적당한 효모 유기체일 수 있다. 적당한 효모 유기체의 예는 효모 종 Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Sacchoromyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp ., 및 Geotrichum fermentans으로부터 선택되는 균주이다.
효모 세포의 형질전환은 예를 들어, 원형질체 형성 후 그 자체가 공지된 방식으로 형질전환에 의해 달성될 수 있다. 세포를 배양하는데 사용된 배지는 효모 유기체를 성장시키는데 적당한 어떤 통상적인 배지일 수 있다. 분비된 인슐린, 정확히 처리된 형태의 배지에서 존재할 이것의 중요 부분은 원심분리법, 여과 또는 이온 교환 매트릭스에 의한 또는 역상 흡수 매트릭스에 의한 인슐린 전구체를 포획에 의해 배지로부터 효모 세포를 분리하는 단계, 염, 예를 들어, 암모늄 설페이트에 의해 상청액 또는 여액의 단백질 성분을 침전시킨 후 다양한 크로마토그래피 과정, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등에 의한 정제를 포함하는 통상적인 과정에 의해 배지로부터 회수될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 아실화된 인슐린은 프로테아제 안정화된 인슐린 분자에서 리신 아미노산 잔기에 부착되어 있는 단지 하나의 아실화 기를 가지면서 모노-치환된다.
한 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린에 부착되어 있는 아실 모이어티는 하기 일반식을 가진다:
(일반식 I)
Acy-AA1n-AA2m-AA3p-,
상기식에서, n은 0 또는 1 내지 3의 범위에 있는 정수이고; m은 0 또는 1 내지 10의 범위에 있는 정수이고, p는 0 또는 1 내지 10의 범위에 있는 정수이고, Acy은 약 8 내지 약 24개의 탄소 원자를 포함하는 지방산 또는 지방 2산이고; AA1은 중성의 선형 또는 고리형 아미노산 잔기이고; AA2는 산성 아미노산 잔기이고; AA3은 중성의, 알킬렌글리콜-함유 아미노산 잔기이고; AA1, AA2 및 AA3이 상기 일반식에서 나타나는 순서는 독립적으로 서로 바뀌어질 수 있고; AA2는 상기 일반식에 따라서 몇 번 발생할 수 있고(예를 들어, Acy-AA2-AA32-AA2-); AA2는 상기 일반식에 따라서 독립적으로(= 다르게) 몇 번 발생할 수 있고(예를 들어, Acy-AA2-AA32-AA2-); Acy, AA1, AA2 및/또는 AA3 사이의 연결은 형식적으로는 각각의 Acy, AA1, AA2 및 AA3로부터 수소 원자 또는 히드록실기(물)의 제거에 의해 획득될 수 있는 아미드(펩티드) 결합이고; 프로테아제 안정화된 인슐린에 부착은 상기 일반식 (I)의 아실 모이어티에서 AA1, AA2, 또는 AA3 잔기의 C-말단 끝으로부터 또는 상기 일반식 (I)의 모이어티에 존재하는 AA2 잔기의 측쇄(들) 중 하나로부터 나올 수 있다.
다른 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린에 부착되어 있는 아실 모이어티는 일반식 (I) Acy-AA1n-AA2m-AA3p-을 가지며, AA1은 Gly, D- 또는 L-Ala, βAla, 4-아미노부티르산, 5-아미노발레르산, 6-아미노헥산산, D- 또는 L-Glu-α-아미드, D- 또는 L-Glu-γ-아미드, D- 또는 L-Asp-α-아미드, D- 또는 L-Asp-β-아미드, 또는 하기 화학식 중 하나의 기로부터 선택되고:
Figure pct00007
상기식에서 수소 원자 및/또는 히드록실기는 제거되었고, q는 0, 1, 2, 3 또는 4이고, 이 구체예에서, AA1은 또 다르게는, 7-아미노헵탄산 또는 8-아미노옥탄산일 수 있다.
다른 구체예에서, 프로테아제 안정화된 인슐린에 부착되는 아실 모이어티는 일반식 (I) Acy-AA1n-AA2m-AA3p-을 가지며, AA1은 상기 정의된 바와 같고 AA2는 L- 또는 D-Glu, L- 또는 D-Asp, L- 또는 D-호모Glu 또는 하기 중 하나로부터 선택되고:
Figure pct00008
상기식에서 수소 원자 및/또는 히드록실 기는 제거되었고, 화살표는 AA1, AA2, AA3의 아미노기에서, 또는 프로테아제 안정화된 인슐린의 아미노기에서 부착지점을 나타낸다.
한 양태에서, 중성 고리 아미노산 잔기 지정된 AA1은 포화된 6-원 카르보고리 환을 함유하고, 선택적으로 질소 헤테로 원자를 함유하는 아미노산이고, 바람직하게는 환은 시클로헥산 환 또는 피페리딘 환이다. 바람직하게는, 이 중성 고리 아미노산의 분자량은 약 100 내지 약 200 Da의 범위에 있다.
아미노산 잔기 지정된 AA2는 2개의 카르복실산 기 및 1개의 1차 또는 2차 아미노기를 포함하는 약 200 Da 이하의 분자량을 가지는 아미노산이다. 또 다르게는, 아미노산 잔기 지정된 AA2는 1개의 카르복실산 기 및 1차 또는 2차 술폰아미드기를 포함하는 약 250 Da 이하의 분자량을 가지는 아미노산이다.
중성의, 알킬렌글리콜-함유 아미노산 잔기 지정된 AA3은 한편으로는 카르복실산 작용기 및 다른 한편으로는 아미노기 작용기를 함유하는 알킬렌글리콜 모이어티, 선택적으로 올리고- 또는 폴리알킬렌글리콜 모이어티이다.
본원에서, 용어 알킬렌글리콜 모이어티는 모노-알킬렌글리콜 모이어티뿐만 아니라 올리고-알킬렌글리콜 모이어티를 포함한다. 모노- 및 올리고알킬렌글리콜은모노- 및 올리고에틸렌글리콜 계, 모노- 및 올리고프로필렌글리콜 계 및 모노- 및 올리고부틸렌글리콜 계 사슬, 즉, 반복 단위 -CH2CH2O-, -CH2CH2CH2O- 또는 -CH2CH2CH2CH2O-에 기초한 사슬을 포함한다. 알킬렌글리콜 모이어티는 단순분산(잘 정의된 길이/분자량에 의함)이다. 모노알킬렌글리콜 모이어티는 각 말단에서 다른 기를 함유하는 -OCH2CH2O-, -OCH2CH2CH2O- 또는 -OCH2CH2CH2CH2O-를 포함한다.
본원에 언급되는 바와 같은, AA1, AA2 및 AA3이 일반식 (I)(Acy-AA1n-AA2m-AA3p-)에 의한 아실 모이어티에서 나타나는 순서는 독립적으로 교환될 수 있다. 결과적으로, 일반식 Acy-AA1n-AA2m-AA3p-는 또한 예를 들어, 일반식 Acy-AA2m-AA1n-AA3p-, 일반식 Acy-AA2-AA3n-AA2-, 및 일반식 Acy-AA3p-AA2m-AA1n-과 같은 모이어티를 포함하며, Acy, AA1, AA2, AA3, n, m 및 p는 본원에 정의된 바와 같다.
본원에 언급되는 바와 같은, 모이어티 Acy, AA1, AA2 및/또는 AA3 사이의 연결은 형식적으로 그것들이 형식적으로 만들어지는 것으로부터 모 화합물로부터 물의 제거에 의해 아미드 결합(펩티드 결합) 형성(-CONH-)에 의해 얻어진다. 이는 일반식 (I)(Acy-AA1n-AA2m-AA3p-, Acy, AA1, AA2, AA3, n, m 및 p는 본원에 정의된 바와 같음)을 가지는 아실 모이어티에 대해 완전한 일반식을 얻기 위한 것을 의미하며, 이는 형식적으로 용어 Acy, AA1, AA2 및 AA3에 대해 주어진 화합물을 취하고 그것으로부터 수소 및/또는 히드록실을 제거하고, 형식적으로 자유 말단에서 이렇게 획득된 구성 요소를 연결한다.
본 발명의 아실화된 인슐린 유사체에 존재할 수 있는 일반식 Acy-AA1n-AA2m-AA3p-의 아실 모이어티의 비제한적, 특정 예는 하기이다:
Figure pct00009
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Figure pct00024
Figure pct00025
일반식 Acy-AA1n-AA2m-AA3p-의 아실 모이어티의 어떤 상기의 비-제한적 특정 예는 인슐린 유사체의 어떤 상기 비-제한적 특정예에 존재하는 리신 잔기의 엡실론 아미노기에 부착되어 이에 의해 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 추가 구체예가 제공될 수 있다.
일반식 Acy-AA1n-AA2m-AA3p-의 아실 모이어티의 어떤 상기 비-제한적 특정 예는 인슐린 유사체의 어떤 상기 비-제한적 특정 예에 존재하는 A1 잔기의 알파 아미노기에 부착되어 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 추가 특정예를 제공할 수 있다.
프로테아제 안정화된 인슐린은 인슐린 유사체에서 리신 잔기에 또는 N-말단 위치에 일반식 Acy-AA1n-AA2m-AA3p-의 요망되는 기를 도입함으로써 본 발명의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린으로 변환될 수 있다. 일반식 Acy-AA1n-AA2m-AA3p-의 요망되는 기는 어떤 편리한 방법에 의해 도입될 수 있고 많은 방법이 이러한 반응을 위한 선행 기술에 개시된다. 더욱 상세하게는 본원의 실시예로부터 나타난다.
구체예에서, 본 발명은 EP 07114387.9에서 기술되는 화합물, 즉, 아실 모이어티가 모 인슐린에 부착되고 상기 아실 모이어티는 알킬렌 글리콜 함유 아미노산의 반복 단위를 포함하며, 모 인슐린에서 단지 하나의 리신 잔기(K & Lys)가 있는 아실화된 인슐린과 관련되지 않는다.
약학 조성물
본 발명의 아실화된 인슐린은, 피하, 비강, 경구 또는 폐로 투여될 수 있다.
피하 투여를 위해, 본 발명의 아실화된 인슐린은 공지된 인슐린의 제형과 유사하게 제형으로 된다. 게다가, 피하 투여를 위해, 본 발명의 아실화된 인슐린은 공지된 인슐린의 투여와 유사하게 투여되며, 일반적으로 의사는 이 과정에 익숙하다.
본 발명의 아실화된 인슐린은 순환하는 인슐린 수준 및/또는 순환하는 글루코오스 수준을 낮추는데 효과적인 양으로 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여는 당뇨병 또는 고혈당증과 같은 장애를 치료하는데 효과적일 수 있다. 인슐린의 효과적인 용량을 달성하는 것은 본 발명의 약 0.5 μg/kg 내지 약 50 μg/kg의 아실화된 인슐린의 흡입되는 양의 투여를 필요로 한다. 치료적으로 유효한 양은 인슐린 수준, 혈액 글루코오스 수준, 환자의 신체 상태, 환자의 폐 상태 등을 포함하는 인자를 고려할 지식이 있는 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 아실화된 인슐린은 느린 흡수 및/또는 그것의 감소된 전신 제거를 달성하기 위한 흡입에 의해 전달될 수 있다. 유사한 입자 크기 및 유사한 수준의 폐 침착이 비교될 때 다른 흡입 장치는 전형적으로 유사한 약물 동력학을 제공한다.
본 발명의 아실화된 인슐린은 흡입에 의한 치료제의 투여를 위해 당업계에 공지된 다양한 흡입 장치 중 어떤 것에 의해 전달될 수 있다. 이들 장치는 정량 흡입기, 네뷸라이저, 건조분말 발생기, 분무기 등을 포함한다. 바람직하게는, 이것 중 아실화된 인슐린은 건조 분말 흡입기 또는 분무기에 의해 전달된다. 본 발명의 아실화된 인슐린을 투여하기 위한 흡입 장치의 몇몇 바람직한 특징이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은, 유리하게는 믿을 수 있고, 재생가능하고, 정확하다. 흡입 장치는 양호한 호흡능력을 위해 세입자 또는 에어로졸, 예를 들어, 약 10 μm 미만, 예를 들어, 약 1-5 μm를 전달해야 한다. 본 발명의 실행에 적당한 상업적으로 이용가능한 흡입 장치의 일부 구체적 예는 Turbohaler™ (Astra), Rotahaler®(Glaxo), Diskus®(Glaxo), Spiros™ 흡입기(Dura), Inhale Therapeutics에 의해 시판되는 장치, AERx™(Aradigm), Ultravent® 네뷸라이저(Mallinckrodt), Acorn II® 네뷸라이저(Marquest Medical Products), Ventolin® 정량 흡입기(Glaxo), Spinhaler® 분말 흡입기(Fisons) 등이다.
당업자에게 인식될 바와 같이, 본 발명의 아실화된 인슐린의 제형, 전달되는 제형의 양 및 단일 용량의 투여의 지속기간은 사용되는 흡입 장치의 종류에 의존한다. 네뷸라이저와 같은 일부 에어로졸 전달 시스템에 대해, 시스템이 활성화되기 위한 투여 빈도 및 시간의 길이는 에어로졸에서 아실화된 인슐린의 농도에 주로 의존할 것이다. 예를 들어, 더 짧은 기간의 투여는 네뷸라이저 용액에서 아실화된 인슐린의 더 높은 농도에서 사용될 수 있다. 정량 흡입기와 같은 장치는 더 높은 에어로졸 농도를 만들 수 있고 아실화된 인슐린의 요망되는 양을 전달하는데 더 짧은 기간 동안 작동될 수 있다. 분말 흡입기와 같은 장치는 주어진 투입량의 약제가 장치로부터 방출될 때까지 활성 약제를 전달한다. 이런 종류의 흡입기에서, 분말의 주어진 양에서 본 발명의 인슐린 아실화된 인슐린의 양은 단일 투여로 전달되는 용량을 결정한다.
흡입 장치에 의해 전달되는 제형에서 본 발명의 아실화된 인슐린의 입자 크기는 폐, 및 바람직하게는 하기도 또는 폐포에 도달하는 인슐린의 능력과 관련하여 중요하다. 바람직하게는, 본 발명 이온의 아실화된 인슐린은 제형으로 되어 전달된 아실화된 인슐린의 적어도 약 10%가 폐에서, 바람직하게는 약 10 내지 약 20%, 또는 그 이상으로 침착된다. 입으로 호흡하는 인간에 대한 폐 침착의 최대 효율은 약 2 μm 내지 약 3 μm의 입자 크기로 획득된다는 것이 공지되어 있다. 입자 크기가 약 5 μm 이상일 때, 폐 침착은 실질적으로 감소된다. 약 1 μm 이하의 입자 크기는 폐 침착이 감소되는 것을 야기하며, 치료적으로 효과적으로 되는데 충분한 질량으로 입자를 전달하는 것이 어렵게 된다. 따라서, 흡입에 의해 전달되는 아실화된 인슐린의 입자는 약 10 μm 미만, 더 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm의 범위에 있는 입자 크기를 가진다. 아실화된 인슐린의 제형은 선택된 흡입 장치에서 요망되는 입자 크기를 얻기 위해 선택된다.
건조 분말로서 투여에 유리하게는 본 발명의 아실화된 인슐린은 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 μm의 입자 크기를 가지는 미립자 형태로 제조된다. 바람직한 입자 크기는 환자의 폐의 폐포에 전달에 대해 효과적이다. 바람직하게는, 건조 분말은 주로 생성된 입자로 구성되어 입자의 대부분은 요망되는 범위에서 크기를 가진다. 유리하게는, 적어도 약 50%의 건조 분말이 약 10 μm 미만의 직경을 가지는 입자로 만들어지다. 이러한 제형은 본 발명의 아실화된 인슐린 및 다른 요망되는 성분을 함유하는 용액의 분무 건조, 밀링, 또는 임계점 축합에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에 유용한 입자를 생성하는데 적당한 다른 방법은 또한 당업계에 공지되어 있다.
입자는 보통 용기에서 건조 분말 제형으로부터 분리되고 그 후 담체 기류를 통해 환자의 폐에 수송된다. 전형적으로, 통용되는 건조 분말 흡입기에서, 고체를 분쇄하기 위한 힘은 오직 환자의 흡입에 의해 제공된다. 다른 종류의 흡입기에서, 환자의 흡입에 의해 발생되는 공기 흐름은 입자를 분쇄하는 임펠러 모터를 활성화한다.
건조 분말 흡입기로부터 투여를 위한 본 발명의 아실화된 인슐린의 제형은 전형적으로 파생물을 함유하는 잘게 나누어진 건조 분말을 포함하지만, 분말은 또한 팽화제, 담체, 부형제, 다른 첨가제 등을 포함할 수 있다. 첨가제는, 예를 들어, 특정 분말 흡입기로부터 전달에 요구되는 분말을 희석하기 위해, 제형의 처리를 촉진하기 위해, 제형에 유리한 분말 특성을 제공하기 위해, 흡입 장치로부터 분말의 분산을 촉진하기 위해, 제형을 안정화하기 위해(예를 들어, 항산화제 또는 완충제), 또는 제형에 맛을 제공하기 위해 아실화된 인슐린의 건조 분말 제형에 포함될 수 있다. 유리하게는, 첨가제는 환자의 기도에 불리하게 영향을 미치지 않는다. 아실화된 인슐린은 분자 수준에서 첨가제와 함께 혼합될 수 있고 또는 고체 제형은 첨가제의 입자와 함께 혼합 또는 입자에서 코팅된 아실화된 인슐린의 입자를 포함할 수 있다. 전형적 첨가제는 모노-, 디-, 및 다당류, 당 알코올 및 다른 폴리올, 예컨대, 락토오스, 글루코오스, 라피노오스, 멜레치토스, 락티톨, 말티톨, 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 전분, 또는 그것의 조합; 계면활성제, 예컨대, 소르비톨, 디포스파티딜 콜린, 또는 레시틴 등을 포함한다. 전형적으로 팽창제와 같은 첨가제는 상기 기술된 목적에 효과적인 양으로, 종종 제형의 약 50중량% 내지 약 90중량%로 존재된다. 인슐린 유사체 단백질과 같은 단백질의 제형을 위한 당업계에 공지된 추가 약제는 또한 제형에 포함될 수 있다.
본 발명의 아실화된 인슐린을 포함하는 스프레이는 압력하에 노즐을 통해 아실화된 인슐린의 현탁액 또는 용액을 강제함으로써 생성될 수 있다. 노즐 크기 및 배치, 사용된 압력 및 액체 공급 속도는 요망되는 산출량 및 입자 크기를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 전자분사는 예를 들어, 모세관 또는 노즐 공급과 관련된 전기장에 의해 만들어질 수 있다. 유리하게는, 분무기에 의해 전달되는 인슐린 콘쥬게이트의 입자는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm의 범위에서 입자 크기를 가진다.
분무기와 함께 사용에 적당한 본 발명의 아실화된 인슐린의 제형은 전형적으로 용액의 ml 당 아실화된 인슐린의 약 1 mg 내지 약 500 mg의 농도에서 수용액 중에 아실화된 인슐린을 포함할 것이다. 선택된 아실화된 인슐린 및 의학적 조언자에게 공지된 다른 인자에 의존하여, 상한은, 예를 들어, 용액의 ml 당 아실화된 인슐린의 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 120, 100 또는 50 mg이 낮춰질 수 있다. 제형은 부형제, 완충제, 등장제, 보존제, 계면활성제 및 바람직하게는 아연과 같은 약제를 포함할 수 있다. 제형은 또한 완충제, 환원제, 거대 단백질, 또는 탄수화물과 같은 아실화된 인슐린의 안정화를 위한 부형제 또는 약제를 포함할 수 있다. 인슐린 콘쥬게이트를 제형으로 하는데 유용한 거대 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 아실화된 인슐린을 제형으로 하는데 유용한 전형적인 탄수화물은 수크로오스, 만니톨, 락토오스, 트레할로오스, 글루코오스, 등을 포함한다. 아실화된 인슐린 제형은 또한 계면활성제를 포함할 수 있고, 이는 에어로졸을 형성하는 용액의 원자화에 의해 야기되는 인슐린 콘쥬게이터의 표면-유발된 덩어리를 감소 또는 예방할 수 있다. 다양한 통상적인 계면활성제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 및 폴리옥시- 에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르가 사용될 수 있다. 양은 일반적으로 제형의 약 0.001 내지 약 4중량%의 범위에 있을 것이다.
본 발명의 아실화된 인슐린을 함유하는 약학 조성물은 또한 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜-유사 주사기에 의해 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 또 다르게는, 비경구 투여는 인퓨전 펌프에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 아실화된 인슐린의 주사가능한 조성물은 적절한 성분을 용해 및 혼합하는 단계를 수반하는 약학 산업의 통상적인 기술을 사용하여 제공되어 요망되는 최종 생성물이 제공될 수 있다. 따라서, 한 공정에 따라서, 아실화된 인슐린은 제조되는 조성물의 최종 부피보다 다소 적은 물의 양으로 용해된다. 아연, 등장제, 보존제 및/또는 완충제는 필요하다면 첨가되고 용액의 pH 값은 -필요하다면- 산, 예를 들어, 염산, 또는 염기, 예를 들어, 필요하다면 수용성 수산화나트륨을 사용하여 조절된다. 최종적으로, 용액의 부피는 물로 조절되어 성분의 요망되는 농도를 제공한다.
본 발명의 추가 구체예에서, 완충제는 아세트산 나트륨, 탄산 나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 제2인 산나트륨, 인산수소이나트륨, 인산 나트륨, 및 트리스(히드록시메틸)아미노-메탄, 비신, 트리신, 말산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 그것의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이들 특정 완충제의 각각의 하나는 본 발명의 또 다른 구체예를 구성한다.
본 발명의 추가 구체예에서, 제형은 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미드우레아, 클로로헥시딘, 데히드로아세트산나트륨, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 벤조토늄 클로라이드, 클로르펜신(3-(4-클로로페녹시)-1,2-프로판디올) 또는 그것의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있는 약학적으로 허용가능한 보존제를 추가로 포함한다. 본 발명의 추가 구체예에서, 보존제는 약 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가 구체예에서, 보존제는 약 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가 구체예에서, 보존제는 약 5 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가 구체예에서, 보존제는 약 10 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 이들 특정 보존제의 각각의 하나는 본 발명의 또 다른 구체예를 구성한다. 약학 조성물에서 보존제의 사용은 당업자에게 잘-공지되어 있다. 편의를 위해 참고문헌은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995으로 구성된다.
본 발명의 추가 구체예에서, 제형은 추가로 염(예를 들어, 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산(예를 들어, L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판 또는 트레오닌), 알디톨 (예를 들어, 글리세롤 (글리세린), 1,2-프로판디올 (프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올 또는 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜 (예를 들어, PEG400) 또는 그것의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있는 등장제를 추가로 포함한다. 모노-, 디-, 또는 다당류와 같은 어떤 당, 또는 예를 들어, 프럭토오스, 글루코오스, 만노오스, 소르보스, 자일로오스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 수용성 전분, 히드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na을 포함하는 수용성 글루칸이 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 당 첨가제는 수크로오스이다. 당 알코올은 적어도 하나의 -OH 기를 가지는 C4-C8 탄화수소로서 정의되고, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서, 당 알코올 첨가제는 만니톨이다. 상기 언급된 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 액체 제제에서 가용성이고 본 발명의 방법을 사용하여 달성되는 안정화 효과를 불리하게 초래하지 않는 한 사용되는 양에 고정된 제한은 없다. 한 구체예에서, 당 또는 당 알코올 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 150 mg/ml이다. 본 발명의 추가 구체예에서, 등장제는 약 1 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가 구체예에서, 등장제는 약 1 mg/ml 내지 7 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가 구체예에서, 등장제는 약 8 mg/ml 내지 24 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가 구체예에서, 등장제는 약 25 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재한다. 이들 특정 등장제의 각각의 하나는 본 발명의 또 다른 구체예를 구성한다. 약학 조성물에서 등장제의 사용은 당업자에게 잘-공지되어 있다. 편의를 위해 참고문헌은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995로 구성된다.
전형적인 등장제는 염화나트륨, 만니톨, 디메틸 술폰 및 글리세롤이며, 전형적인 보존제는 페놀, m-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트 및 벤질알코올이다.
적당한 완충제의 예는 아세트산 나트륨, 글리실글리신, HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) 및 인산나트륨이다.
본 발명의 아실화된 인슐린의 비강 투여를 위한 조성물은, 예를 들어, 유럽 특허 No 272,097에서 기술되는 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 함유하는 경구 제제는 그 자체가 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 편리하게는 경구로 투여될 수 있는 본 발명의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 함유하는 제제를 제조하는 한 방법은 WO 2008/145728에서 설명되는 과정과 유사한 과정을 사용하는 것에 의한다.
본 발명의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 함유하는 경구 제제를 제조하는 다른 방법은 본 발명의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린 (a), 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린에 대한 적어도 하나의 극성 유기 용매 (b), 적어도 하나의 친유성 성분 (c), 및 선택적으로 계면활성제 (d) 및/또는 적어도 하나의 고체 친수성 성분(e)을 포함하는 물이 없는 액체 또는 반고체 약학 조성물을 제조하는 것이다. 이는 유성 용액의 형태일 수 있다. 또 다르게는, 적어도 하나의 고체 친수성 성분(d)은 적어도 하나의 고체 친수성 폴리머이다. 또 다르게는, 적어도 하나의 고체 친수성 성분을 포함하는 약학 조성물은 계면활성제가 없고, 상기 계면활성제는 적어도 8인 HLB 값을 가지며, 즉, 적어도 8인 HLB 값을 가지며 조성물에서 존재하는 계면활성제는 없다.
예를 들어, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 함유하는 약학 조성물은 물이 없는 유성 용액 및/또는 SEDDS 또는 SMEDDS 약학 조성물 일 수 있다.
또 다르게는, 상기 약학 조성물은 약물 전달 시스템을 스스로 에멀젼화한다(본원에서 SEDDS로 표기).
상기 약학 조성물에 필요한 극성 유기 용매의 상대적으로 낮은 전체량을 초래하는 약학 조성물의 극성 유기 용매에서 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 높은 용해도는 캡슐 물질과 함께 약학 조성물의 양립 가능성을 개선시킬 수 있음이 믿어진다.
약학 조성물은 친유성 성분, 계면활성제 및 극성 유기 용매 및 선택적으로 고체 친수성 성분(e)을 포함하는 담체를 함유할 수 있다. 고체 친수성 성분이 존재한다면, 친유성 성분 및 계면활성제로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분은 액체 또는 반-고체이다. 액체 친수성 성분(e)이 존재한다면, 친유성 성분과 계면활성제는 둘 다 고체일 수 있다. 예를 들어, 계면활성제는 액체 또는 반고체이다. 한 양태에서, 고체 친수성 성분이 존재한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "담체"는 생물학적 막을 가로질러 또는 생물학적 유체 내에서 치료적으로 활성인 수용성 폴리펩티드를 수송하는 약학적으로 허용가능한 비히클을 말한다. 담체는 친유성 성분 및 극성의 유기 용매, 및 선택적으로 고체 친수성 성분 및/또는 계면활성제를 포함한다. 수성 매질, 예를 들어, 물, 물을 함유하는 유체, 또는 위장관의 위액과 같은 포유동물의 생체내 매질과 분산 또는 희석되어 접촉될 때, 담체는 자발적으로 에멀젼 또는 콜로이드 구조를 생성할 수 있다. 콜로이드 구조는 도메인, 액적, 미셀, 혼합된 미셀, 소포 및 나노입자를 포함하는 고체 또는 액체 입자일 수 있다.
예를 들어, 약학 조성물이 수성 매질과 접촉할 때, 에멀젼, 예컨대, 마이크로에멀젼이 자발적으로 형성된다. 특히, 에멀젼 또는 마이크로에멀젼은 전달 시스템이 경구로 섭취될 때 포유동물의 소화관에서 형성된다. 앞서 언급한 성분에 더하여, 자발적으로 분산가능한 전농축은 또한 선택적으로 다른 부형제, 예컨대, 완충제, pH 조절제, 안정화제 및 이러한 약학적 용도에 적절하게 되는 당업자에게 인식된 다른 보조제를 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "물이 없는"는 약학적 조성물의 제조 동안 물이 첨가되지 않는 조성물을 말한다. 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린 및/또는 약학 조성물 내의 하나 이상의 부형제는 약학 조성물을 제조하기 전 그것에 결합되는 소량의 물을 가질 수 있다. 예를 들어, 물이 없는 약학 조성물은 10% w/w 미만의 물, 예를 들어, 5% w/w 미만의 물, 예를 들어, 4% w/w 미만의 물, 예를 들어, 3% w/w 미만의 물, 예를 들어, 2% w/w 미만의 물, 예를 들어, 1% w/w 미만의 물을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "마이크로에멀젼 전농축"은 경구 적용 후 수성 매질에서, 예를 들어, 물 또는 위장 유체에서 자발적으로 마이크로에멀젼, 예를 들어, 수중유 마이크로에멀젼을 형성하는 조성물을 의미한다. 조성물은 예를 들어, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100 또는 더 높은 희석으로 수성 매질에서 희석시 자기-에멀젼화한다.
아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 높은 용해도에 기인하여, SEDDS의 극성 유기 용매의 전체량은 한편으로는 캡슐 물질과 제형의 양립 가능성을 개선시키고 다른 한편으로는 조성물의 더 양호한 설계 공간을 제공하도록 낮게 유지될 수 있다.
약학 조성물은 친유성 성분 및 유기 극성 성분을 포함한다. 약물 전달 시스템의 성분은 어떤 상대적 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 약물 전달 시스템은, 예를 들어, 30%, 20%, 15% 또는 10% 미만의 담체의 조성물의 40중량% 이하의 극성 유기 성분을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 약물 전달 시스템은 담체의 전체 조성물의 5중량% 내지 40중량%의 극성 유기 용매를 포함한다. 또한 추가 양태에서, 약물 전달 시스템은 담체의 전체 조성물의 10중량% 내지 30중량%의 극성 유기 용매를 포함한다.
약학 조성물은 비-분말 조성물의 형태, 즉, 반-고체 또는 액체 형태일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "액체"는 실온("RT")에서 액체 상태이고, 예를 들어, 20℃ 이하의 융점을 가지는 성분 또는 조성물을 의미한다. 본원에서 사용되는 실온(RT)은 대략 20-25℃를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "반-고체"는 실온에서 액체가 아니며, 예를 들어, 실온 내지 약 40℃의 융점을 가지는 성분 또는 조성물에 관한 것이다. 반고체는 물질의 고체와 액체 상태 모두의 품질 및/또는 속성을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "고형화"는 고체 또는 반-고체를 만드는 것을 의미한다.
반-고체 또는 액체 조성물의 예는, 예를 들어, 오일, 용액, 액체 또는 반고체 SEDDS 및 액체 또는 반고체 SEDDS의 형태인 약학 조성물이다.
"SMEDDS" (self-micro-emulsifying drug delivery system의 약어)는 본원에서 GI 관에서 만나게 되는 가벼운 교반 또는 소화 운동성의 조건 하에서 수성 매질에 노출될 때 친수성 성분, 계면활성제, 선택적으로 보조 계면활성제 및 수중유 마이크로에멀젼을 급격히 형성하는 약물의 등방성 혼합물로서 정의된다.
"SEDDS" (self emulsifying drug delivery systems의 약어)는 본원에서 GI 관에서 만나게 되는 가벼운 교반 또는 소화 운동성의 조건하에서 수성 매질에 노출될 때 친수성 성분, 계면활성제, 선택적으로 보조계면활성제 및 괜찮은 수중유 에멀젼을 자발적으로 형성하는 약물로서 정의된다.
본원에서 사용되는, 용어 "마이크로에멀젼"은 그것의 성분이 수성 매질과 접촉할 때 자발적으로 또는 실질적으로 자발적으로 형성된 투명 또는 반투명, 약간 불투명의, 오팔색의, 불투명하지 않은 또는 실질적으로 불투명하지 않은 콜로이드 분산을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "에멀젼"은 그것의 성분이 수성 매질과 접촉할 때 자발적으로 또는 실질적으로 자발적으로 형성된 약간 불투명, 오팔색 또는 불투명한 콜로이드 분산을 말한다.
마이크로에멀젼은, 표준 광 산란 기술에 의해, 예를 들어, MALVERN ZETASIZER Nano ZS를 사용하여 측정되는 바와 같이 약 500 nm 미만, 예를 들어, 약 400 nm 미만 또는 300 nm 미만, 200 nm 미만, 100 nm 미만, 및 약 2-4 nm 초과의 평균 직경의, 예를 들어, 고체 또는 액체 상태(예를 들어, 액체 지질 입자 또는 액적)의 열역학적으로 안정하며 균질하게 분산된 입자 또는 도메인을 함유한다. 본원에서 사용되는 용어 "도메인 크기"는 반복 산란 단위를 말하며, 예를 들어, 소각 X-ray에 의해 측정될 수 있다. 한 양태에서, 도메인 크기는 400 nm 미만이고, 다른 양태에서, 300 nm 미만이고, 또 다른 양태에서, 200 nm 미만이다.
전농축을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "자발적으로 분산가능한"은 수성 매질로 희석될 때, 조성물의 성분이 수성 매질과 접촉할 때, 예를 들어, 단기간의 시간 동안, 예를 들어 10초 동안 손으로 단순 진탕에 의해 마이크로에멀젼, 에멀젼 및 다른 콜로이드 시스템과 같은 콜로이드 구조를 생성할 수 있는 조성물을 말한다. 한 양태에서, 본 발명에 따르는 자발적으로 분산가능한 농축은 SEDDS 또는 SMEDDS이다.
본원에서 사용되는 용어 "친유성 성분"은 물보다 오일과 더 양립가능한 물질, 재료 또는 성분을 말한다. 친유성 특성을 가지는 물질은 물에서 불용성 또는 거의 불용성이지만 오일 또는 다른 비극성 용매에서는 용이하게 가용성이다. 용어 "친유성 성분"은 하나 이상의 친유성 물질을 포함할 수 있다. 다양한 친유성 성분은 자발적으로 분산가능한 전농축의 친유성 상을 구성할 수도 있고 오일상, 예를 들어, 수중유 에멀젼 또는 마이크로에멀젼을 형성할 수도 있다. 실온에서, 자발적으로 분산가능한 전농축의 친유성 성분 및 친유성 상은 고체, 반고체 또는 액체일 수 있다. 예를 들어, 고체 친유성 성분은 페이스트, 과립 형태, 분말 또는 플레이크로서 존재할 수 있다. 하나 이상의 부형제가 친유성 성분을 포함한다면, 친유성 성분은 액체, 고체 또는 둘 다의 혼합물 일 수 있다.
한 양태에서, 친유성 성분은 적어도 20% w/w의 양인 약학 조성물로 존재한다. 추가 양태에서, 친유성 성분은 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 80% 또는 적어도 90% w/w의 양으로 존재한다. 예를 들어, 친유성 성분은 약 5중량% 내지 약 90중량%의 조성물, 예를 들어, 약 15% 내지 약 60%, 예를 들어, 약 20% 내지 약 40%로 존재할 수 있다. 고체 친유성 성분, 즉, 실온에서 고체 또는 반고체인 친유성 성분의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 하기를 포함한다:
1. 모노-, 디- 및 트리글리세라이드의 혼합물, 예컨대, 수소화된 coco-글리세라이드(약 33.5℃ 내지 약 37℃의 융점 (m.p.)), Sasol Germany제의 WITEPSOL HI5(Witten, 독일)로서 상업적으로 이용가능; 지방산 트리글리세라이드의 예, 예를 들어, C10-C22 지방산 트리글리세라이드는 식물성 오일과 같은 천연 및 수소화된 오일을 포함한다;
2. 에스테르, 예컨대 프로필렌 글리콜 (PG) 스테아레이트, Gattefosse Corp제의 MONOSTEOL (약 33℃ 내지 약 36℃의 m.p.) (Paramus, NJ)로부터 상업적으로 이용가능, 디에틸렌 글리콜 팔미토 스테아레이트, Gattefosse Corp제의 HYDRINE (약 44.5℃ 내지 약 48.5℃의 m.p.)로서 상업적으로 이용가능;
3. 폴리글리코실화된 포화된 글리세라아드, 예컨대, 수소화된 팜/팜커넬유 PEG-6 에스테르(약 30.5℃ 내지 약 38℃의 m.p.), Gattefosse Corp 또는 Gelucire 33/01제의 LABRAFIL M2130 CS로부터 상업적으로 이용가능;
4. 지방 알코올, 예컨대, 미리스틸 알코올 (약 39℃의 m.p.), Cognis Corp제의 LANETTE 14로서 상업적으로 이용가능(Cincinnati, OH), 지방 알코올과 함께 지방산의 에스테르, 예를 들어, 세틸 팔미테이트(약 5O℃의 m.p.); 이소소르비드 모노라우레이트, 예를 들어, Uniqema제(New Castle, Delaware)의 상표명 ARLAMOL ISML 하에서 상업적으로 이용가능, 예를 들어, 약 43℃의 융점을 가짐;
5. PEG-지방 알코올 에테르, 폴리옥시에틸렌 (2) 세틸 에테르를 포함, 예를 들어, 약 33℃의 융점을 가지는 Uniqema제의 BRIJ 52로서 상업적으로 이용가능, 또는 폴리옥시에틸렌 (2) 스테아릴 에테르, 예를 들어, 약 43℃의 융점을 가지는 Uniqema제의 BRIJ 72로서 상업적으로 이용가능;
6. 소르비탄 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 모노팔미테이트 또는 소르비탄 모노스테아레이트, 예를 들어, Uniqema제의 SPAN 40 또는 SPAN 60으로서 상업적으로 이용가능하고, 각각 약 약 43℃ 내지 48℃ 또는 약 53℃ 내지 57℃ 및 41℃ 내지 54℃의 융점을 가짐; 및
7. 글리세릴 모노-C6-C14-지방산 에스테르. 이것들은 식물성 오일로 글리세롤을 에스테르화한 후 분자증류에 의해 획득된다. 모노글리세라이드는, 제한되는 것은 아니지만, 대칭(즉, β-모노글리세라이드) 및 비대칭 모노글리세라이드(α-모노글리세라이드)를 둘 다 포함한다. 그것들은 또한 균일한 글리세라이드(여기서, 지방산 구성물은 주로 단일 지방산으로 구성된다) 및 혼합된 글리세라이드(즉, 여기서, 지방산 구성물은 다양한 지방산으로 구성된다)를 포함한다. 지방산 구성물은 예를 들어, C8-C14의 사슬 길이를 가지는 포화 및 불포화된 지방산을 포함할 수 있다. 특히 글리세릴 모노 라우레이트, 예를 들어, Sasol North America (Houston, TX)제의 IMWITOR 312로서 상업적으로 이용가능, (약, 56℃-60℃의 m.p.), 글리세릴 모노 디코코에이트, Sasol제의 IMWITOR 928로서 상업적으로 이용가능 (약 33℃-37℃의 m.p.), 모노글리세릴 시트레이트, IMWITOR 370로서 상업적으로 이용가능, (약 59 내지 약 63℃의 m.p.), 또는 글리세릴 모노 스테아레이트, 예를 들어, Sasol제의 IMWITOR 900로서 상업적으로 이용가능(약 56℃-61℃의 m.p.) 또는 자기-에멀젼화 글리세롤 모노 스테아레이트, 예를 들어, Sasol제의 IMWITOR 960로서 상업적으로 이용가능(약 56℃-61℃의 m.p.)가 적당하다.
실온에서 액체인 액체 친유성 성분, 즉 친유성 성분의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 하기를 포함한다:
1. 모노-, 디- 및 트리글리세라이드의 혼합물, 예컨대, 중간쇄 모노- 및 디글리세라이드, 글리세릴 카프릴레이트/카프레이트, Abitec Corp (Columbus, OH)제의 CAPMUL MCM로서 상업적으로 이용가능;
2. 글리세릴 모노- 또는 디 지방산 에스테르, 예를 들어,C6-C18, 예를 들어 C6-C16, 예를 들어, C8-C10, 예를 들어, C8, 지방산, 또는 그것의 아세틸화된 유도체, 예를 들어, Eastman Chemicals(Kingsport, TN)제의 MYVACET 9-45 또는 9-08 또는 Sasol제의 IMWITOR 308 또는 312;
3. 프로필렌 글리콜 모노- 또는 디- 지방산 에스테르, 예를 들어, C8-C20, 예를 들어 C8-C12, 지방산, 예를 들어, Abitec Corp.제의 LAUROGLYCOL 90, SEFSOL 218, 또는 CAPRYOL 90 또는 CAPMUL PG-8 (프로필렌 글리콜 카프릴레이트와 동일),
4. 오일, 예컨대, 홍화씨오일, 참깨 오일, 아몬드 오일, 땅콩 오일, 팜 오일, 윗점 오일, 옥수수 오일, 피마자 오일, 코코넛 오일, 면실 오일, 대두 오일, 올리브 오일 및 미네랄 오일;
5. 지방산 또는 알코올, 예를 들어, C8-C20, 포화된 또는 모노- 또는 디-불포화된, 예를 들어, 올레산, 올레일 알코올, 리놀레산, 카프린산, 카프릴산, 카프론산, 테트라데칸올, 도데칸올, 데칸올;
6. 중간쇄 지방산 트리글리세라이드, 예를 들어, C8-C12, 예를 들어, MIGLYOL 812, 또는 장쇄 지방산 트리글리세라이드, 예를 들어, 식물성 오일;
7. 트랜스에스테르화된 에톡실화된 식물성 오일, 예를 들어, Gattefosse Corp제의 LABRAFIL M2125 CS로서 상업적으로 이용가능;
8. 지방산 및 일차 알코올의 에스테르화된 화합물, 예를 들어, C8-C20, 지방산 및 C2-C3 알코올, 예를 들어, 에틸 리놀레이트, 예를 들어, Nikko Chemicals (Tokyo, Japan)제의 NIKKOL VF-E로서 상업적으로 이용가능, 에틸 부티레이트, 에틸 카프릴레이트 올레산, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트 및 에틸 카프릴레이트;
9. 에센셜 오일, 또는 식물 그것의 특유의 향을 제공하는 휘발성 오일의 어떤 종류, 예컨대, 스피어민트 오일, 클로브 오일, 레몬 오일 및 페퍼민트 오일,
10. 에센셜 오일의 분획 또는 구성요소, 예컨대, 멘톨, 카르바크롤 및 티몰;
11. 합성 오일, 예컨대, 트리아세틴, 트리부티린,
12. 트리에틸 시트레이트, 아세틸 트리에틸 시트레이트, 트리부틸 시트레이트, 아세틸 트리부틸 시트레이트,
13. 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 예를 들어, 디글리세릴 모노올레이트, 예를 들어, Nikko Chemicals제의 DGMO-C, DGMO-90, DGDO; 및
14. 소르비탄 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 모노라우레이트, 예를 들어, Uniqema제의 SPAN 20으로서 상업적으로 이용가능.
15. 인지질, 예를 들어, 알킬-0-인지질, 디아실 포스파티드 산, 디아실 포스파티딜 콜린, 디아실 포스파티딜 에탄올아민, 디아실 포스파티딜 글리세롤, 디-O-알킬 포스파티드 산, L-알파-리소포스파티딜콜린 (LPC), L-알파-리소포스파티딜 에탄올아민(LPE), L-알파-리소포스파티딜글리세롤 (LPG), L-알파-리소포스파티딜이노시톨 (LPI), L-알파-포스파티드산(PA), L-알파-포스파티딜콜린 (PC), L-알파-포스파티딜에탄올아민(PE), L-알파-포스파티딜글리세롤 (PG), 카르디올리핀(CL), L-알파-포스파티딜이노시톨 (Pl), L-알파-포스파티딜세린 (PS), 리소-포스파티딜콜린, 리소-포스파티딜글리세롤, LARODAN제의 상업적으로 이용가능한 sn-글리세로포스포릴콜린, 또는 Lipoid GmbH제의 상업적으로 이용가능한 대두 인지질(Lipoid S100).
예를 들어, 친유성 성분은 모노-, 디-, 및 트리글리세라이드로 구성되는 군으로부터 하나 이상 선택된다. 한 양태에서, 친유성 성분은 모노- 및 디글리세라이드로 구성되는 군으로부터 하나 이상 선택된다. 또한 추가 양태에서, 친유성 성분은 Capmul MCM 또는 Capmul PG-8이다. 또한 추가 양태에서, 친유성 성분은 Capmul PG-8이다.
용어 "극성 유기 용매"는 본원에서 한 양태에서 O-H 또는 N-H 결합을 함유하는 친수성, 수용성 탄소-함유 용매, 또는 그것의 혼합물인 "극성의 양성자성 유기 용매"를 말한다. 극성은 용매의 유전상수 또는 쌍극자 모멘트에 반영된다. 용매의 극성은 용해가능한 화합물의 종류 및 혼합 가능한 다른 용매 또는 액체 화합물을 결정한다. 전형적으로, 극성 유기 용매는 극성 화합물에 가장 잘 용해하고 비-극성 용매는 비-극성 화합물에 가장 잘 용해한다: "비슷한 것끼리 잘 용해한다". 무기염과 같은 강한 극성 화합물(예를 들어, 염화 나트륨)은 단지 매우 극성인 용매에 용해한다.
극성 유기 용매는 용매로부터 선택될 수 있으며, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 다른 용매보다 상기 극성 유기 용매에서 더 양호한 용해도를 나타낸다.
따라서, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 PEG200과 같은 물이 없는 약학적으로 허용가능한 극성 유기 용매에서 높은 정도로 용해될 수 있다. 예를 들어, 적어도 20% (w/w)의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 물이 없는 약학적으로 허용가능한 극성의 유기 용매에 용해하며, 즉, 극성의 유기 용매에 20% w/w의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린이 첨가될 때, 맑은 용액이 획득된다. 다른 양태에서, 적어도 25%, 30%, 40% 또는 50% (w/w)의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 물이 없는 약학적으로 허용가능한 극성 유기 용매에서 용해한다.
극성의 유기 용매는 따라서 O-H 또는 N-H 결합을 함유하는 친수성, 수용성 탄소-함유 용매, 또는 그것의 혼합물을 말할 수 있다. 극성은 용매의 유전상수 또는 쌍극자 모멘트에 반영된다. 용매의 극성은 용해가능한 화합물의 종류 및 혼합가능한 다른 용매 또는 액체 화합물과 함께 결정한다. 전형적으로, 극성 용매는 극성 화합물을 가장 잘 용해하고 비-극성 용매는 비-극성 화합물을 가장 잘 용해한다: "비슷한 것끼리 잘 용해한다". 무기염(예를 들어, 염화나트륨)과 같은 강한 극성 화합물은 단지 매우 극성인 용매에서 용해한다.
예를 들어, 극성 유기 용매는 20 이상, 바람직하게는 20-50의 범위에서 유전 상수를 가지는 용매이다. 다른 극성 유기 용매의 예는 기준으로서 물과 함께 표 1에서 열거한다.
선택된 극성 유기 용매 및 기준으로서 물의 유전상수(정적인 유전율)(Handbook of Chemistry and Physics, CMC Press, 유전상수는 정전기장 또는 상대적으로 낮은 빈도로 측정되며, 완화는 일어나지 않는다)
용매(온도, 켈빈) 유전상수, ε*
물(293.2) 80.1
프로판트리올[글리세롤](293.2) 46.53
에탄디올[에틸렌 글리콜](293.2) 41.4
1,3-프로판디올(293.2) 35.1
메탄올(293.2) 33.0
1,4-부탄디올(293.2) 31.9
1,3-부탄디올(293.2) 28.8
1,2-프로판디올[프로필렌 글리콜](303.2) 27.5
에탄올(293.2) 25.3
이소프로판올[2-프로판올, 이소프로필 알코올](293.2) 20.18
본 문맥에서, 1,2-프로판디올 및 프로필렌 글리콜은 서로 바꾸어 사용된다. 본 문맥에서, 프로판트리올 및 글리세롤은 서로 바꾸어 사용된다. 본 문맥에서, 에탄디올 및 에틸렌 글리콜은 서로 바꾸어 사용된다.
예를 들어, 극성 유기 용매는 폴리올로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본원에 사용되는 용어 "폴리올"은 다양한 히드록실기를 함유하는 화학 화합물을 말한다.
한 양태에서, 극성 유기 용매는 디올 및 트리올로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본원에서 사용되는 용어 "디올"은 2개의 히드록실기를 함유하는 화학적 화합물을 말한다. 본원에 사용되는 용어 "트리올"은 3개의 히드록실기를 함유하는 화학적 화합물을 말한다.
예를 들어, 극성 유기 용매는 글리세롤 (프로판트리올), 에탄디올 (에틸렌 글리콜), 1,3-프로판디올, 메탄올, 1,4-부탄디올, 1,3-부탄디올, 프로필렌 글리콜 (1,2-프로판디올), 에탄올 및 이소프로판올, 또는 그것의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 대안에서, 극성 유기 용매는 프로필렌 글리콜 및 글리세롤로 구성되는 군으로부터 선택된다. 글리세롤은 높은 투약량에서 조차도 생체적합하고 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린에 대해 높은 용매 수용력을 가진다. 또 다르게는, 극성의 유기 용매는 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이들 극성 유기 용매는 낮은 점성을 가지며, 중간 용량에서 생체적합성이 있고, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린에 대해 매우 극성인 유기 용매 수용력을 가진다.
극성 유기 용매는 바람직하게는, 예를 들어, 메일라드 반응에 기인하여 용해된 폴리펩티드의 화학적 퇴보를 최소화하기 위한 다른 환원성 불순물의 낮은 함량에 의한 높은 순도를 가져야 한다. 글리실 글리신 및 에틸렌 디아민과 같은 스캐빈저 분자는 폴리펩티드의 퇴보를 감소시키기 위해 폴리올과 같은 극성 유기 용매(들)을 포함하는 제형에 첨가될 수 있는 반면, 항산화제는 추가 환원성 불순물의 형성 속도를 감소시키기 위해 첨가될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 극성 유기 용매는 1-50% w/w, 예를 들어, 5-40% w/w, 예를 들어, 5-30% w/w의 양으로 약학 조성물에서 존재한다. 또 다르게는, 유기 극성 용매는 10-30% w/w, 예를 들어, 10-25% w/w의 양으로, 예를 들어, 약 20% w/w 또는 약 15% w/w의 양으로 존재한다.
예를 들어, 극성 유기 극성 용매는 프로필렌 글리콜이고 1-50% w/w, 예를 들어, 5-40% w/w, 예를 들어, 10-30% w/w, 예를 들어, 10-25% w/w, 예를 들어, 10-20% w/w, 예를 들어, 약 20% w/w 또는 약 15% w/w의 양으로 약학 조성물에서 존재한다.
예를 들어, 극성 유기 용매는 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 그것의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
고체 친수성 성분은 실온에서 약학 조성물 고체 또는 반-고체를 만들기 위해 또는 만드는 것을 돕기 위해 약학 조성물에 첨가될 수 있다. 친수성 성분은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 하나 이상의 부형제가 친수성 성분을 포함한다면, 친수성 성분은 액체, 고체 또는 둘 다의 혼합물일 수 있다.
고체 친수성 성분이 존재할 때, 약학 조성물은 약 1중량% 내지 약 25중량%의 고체 친수성 성분, 예를 들어, 약 2% 내지 약 20%, 예를 들어, 약 3% 내지 약 15%, 예를 들어, 약 4% 내지 약 10%를 포함할 수 있다.
친수성 성분의 예는 일반적으로 화학식 H(OCH2CH2)nOH에 따르는 산화에틸렌의 폴리머인 PEG이며, 여기서 n은 폴리머의 평균 분자량과 서로 관련한다.
약학 조성물을 제조하는데 유용한 PEG의 종류는 그것의 물질의 상태에 의해 분류되며, 즉, 물질은 실온 및 압력에서 고체 또는 액체 형태로 존재한다. 본원에 사용되는 "고체 PEG"는 분자량을 가지는 PEG를 말하며 물질은 실온 및 압력에서 고체 상태로 존재한다. 예를 들어, 1,000 내지 10,000 사이의 범위에서 분자량을 가지는 PEG는 고체 PEG이다. 이러한 PEG는, 제한되는 것은 아니지만, PEG 1000, PEG 1550, PEG 2000, PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 또는 PEG 8000을 포함한다. 특히 유용한 고체 PEG는 1,450 내지 8,000 사이의 분자량을 가지는 것이다. PEG 1450, PEG 3350, PEG 4000, PEG 8000, 그것의 유도체 및 그것의 혼합물이 고체 PEG로서 특히 유용하다. 다양한 분자량의 PEG는 Dow Chemicals (Danbury, CT)제의 CARBOWAX SENTRY 시리즈로서 상업적으로 이용가능하다. 게다가, 고체 PEG는 결정질 구조, 또는 폴리머 매트릭스, PEG와 동일한 구조를 가지지만 사슬 길이 및 말단 기에 대해 또한 적당한 폴리에틸렌 옥사이드("PEO")를 가진다. 다양한 등급의 PEO가 Dow Chemicals PEO로부터 POLYOX로서 상업적으로 이용가능하며, 예를 들어, 약 100,000 내지 7,000,000의 범위에서 분자량을 가진다. 친수성 성분은 PEG, PEO, 및 앞서 언급한 어떤 조합을 포함할 수 있다.
친수성 성분은 선택적으로 저급 알칸올, 예를 들어 에탄올을 포함할 수 있다. 에탄올의 사용이 필수적이지 않은 반면, 이는 담체에서 폴리펩티드의 용해도를 개선시키고, 저장 특성을 개선시키고 및/또는 약물 침전의 위험을 감소시킨다.
또 다른 대표적인 양태에서, 담체의 친수성 성분은 단일 친수성 성분, 예를 들어, 고체 PEG, 예를 들어, PEG 1450, PEG 3350, PEG 4000 및 PEG 8000로 구성된다. 본 대표적인 양태에서, 마이크로에멀젼 성분의 친수성 상은 단일 친수성 물질로 구성된다. 예를 들어, 담체가 PEG 3350을 포함하였다면, 담체는 친수성 물질, 예를 들어, 저급 알칸올(C1-C4인 저급 알킬), 예컨대, 에탄올 또는 물을 함유한다.
또 다른 대안적인 대표적 양태에서, 담체의 친수성 성분은 고체 PEG의 혼합물로 구성된다. 예를 들어, 친수성 성분은 PEG 1450, PEG 3350, PEG 4000, PEG 8000, 그것의 유도체 및 어떤 조합 및 그것의 혼합물을 포함한다.
한 양태에서, 담체는 하나 이상의 계면활성제, 즉, 선택적으로 계면활성제의 혼합물; 또는 계면장력 감소시키는 표면활성제를 포함한다. 계면활성제는, 예를 들어, 비이온성, 이온성 또는 양쪽성이다. 계면활성제는 부산물 또는 그것의 제제에 수반되는 미반응된 출발 물질을 함유하는 복합 혼합물일 수 있으며, 예를 들어, 폴리옥시에틸화에 의해 만들어지는 계면활성제는 다른 부산물, 예를 들어, PEG를 함유할 수 있다. 계면활성제 또는 계면활성제들은 적어도 8의 친수성-친유성 평형(HLB) 값을 가진다. 예를 들어, 계면활성제는 8-30, 예를 들어, 12-30, 12-20 또는 13-15의 평균 HLB 값을 가질 수 있다. 계면활성제는 천연에서 액체, 반고체 또는 고체일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "계면활성제"는 특히, 액체 대 기체, 액체 대 액체, 액체 대 용기 또는 액체 대 어떤 고체와 같이 표면 및 경계면에서 흡착할 수 있는 세제를 말한다. 계면활성제는 세제, 예컨대, 에톡실화된 피마자 오일, 폴리글리콜화된 글리세라이드, 아세틸화된 모노글리세라이드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트-20, 폴록사머, 예컨대, 폴록사머 188 및 폴록사머 407, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 유도체, 예컨대, 알킬화 및 알콕실화된 유도체(tweens, 예를 들어, Tween-20 또는 Tween-80), 모노글리세라이드 또는 그것의 에톡실화된 유도체, 디글리세라이드 또는 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세롤, 콜산 또는 그것의 유도체, 레시틴, 알코올 및 인지질, 글리세로인지질 (레시틴, 세팔린, 포스파티딜 세린), 글리세로글리코지질 (갈락토피란-소이드), 스핑고인지질 (스핑고미엘린), 및 스핑고글리코지질(세라마이드 갱글리오사이드), DSS (도큐세이트 나트륨, CAS 등록번호[577-11-7]), 도큐세이트 칼슘, CAS 등록번호[128-49-4]), 도큐세이트 칼륨, CAS 등록번호[7491-09-0]), SDS (도데실 황산 나트륨 또는 라우릴 황산 나트륨), 디팔미토일 포스파티드산, 카프릴산 나트륨, 담즙산 및 그것의 염 및 글리신 또는 타우린 콘쥬게이트, 우루소데옥시콜린산, 콜산 나트륨, 데옥시콜산 나트륨, 타우로콜산 나트륨, 글리콜산 나트륨, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트, 음이온성(알킬아릴-술포네이트) 1가 계면활성제, 팔미토일 리소포스파티딜-L-세린, 리소인지질 (예를 들어, 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르), 리소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알킬, 알콕실(알킬 에스테르) 알콕시(알킬 에테르)-유도체, 예를 들어, 리소포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 콜린인 극성 헤드기의 변형의 라우릴 및 미리스토일 유도체, 에탄올아민, 포스파티드산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨, 및 양으로 하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 리소포스파티딜세린 및 리소-포스파티딜트레오닌, 양성 계면활성제(예를 들어, N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판-술포네이트, 3-콜라미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 도데실포스포콜린, 미리스토일 리소포스파티딜콜린, 달걀 리졸레시틴), 양이온성 계면활성제(4가 암모늄 염기)(예를 들어, 세틸-트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비-이온성 계면활성제(예를 들어, 알킬 글루코시드 유사 도데실 β-D-글루코피라노사이드, 도데실 β-D-말토사이드, 테트라데실 β-D-글루코-피라노사이드, 데실 β-D-말토사이드, 도데실 β-D-말토사이드, 테트라데실 β-D-말토사이드, 헥사데실 β-D-말토사이드, 데실 β-D-말토트리오사이드, 도데실 β-D-말토트리오사이드, 테트라데실 β-D-말토트리오사이드, 헥사데실 β-D-말토트리오사이드, n-도데실-수크로오스, n-데실-수크로오스, 지방 알코올 에톡실레이트(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 유사 옥타에틸렌 글리콜 모노 트리데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노 도데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노 테트라데실 에테르), 폴리에틸렌옥시드/폴리프로필렌옥시드 블록 공중합체 (Pluronics/Tetronics, Triton X-100) 에톡실화된 소르비탄 알카노에이트 계면활성제(예를 들어, Tween-40, Tween-80, Brij-35)로서 블록 공중합체, 푸시딘산 유도체(예를 들어, 타우로-디히드로푸시딘산 나트륨 등), 장-쇄 지방산 및 그것의 염 C8-C20 (예를 들어, 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 N-아실화된 유도체, 또는 리신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화된 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘 및 중성 또는 산성 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 디펩티드의 N-아실화된 유도체, 중성 아미노산 및 2개의 하전된 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 트리펩티드의 N-아실화된 유도체로부터 선택될 수 있고, 또는 계면활성제는 이미다졸린 유도체, 또는 그것의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
고체 계면활성제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 하기를 포함한다,
1. 천연 또는 수소화된 피마자 오일 및 에틸렌 옥사이드의 반응 생성물. 천연 또는 수소화된 피마자 오일은 생성물로부터 PEG 성분의 선택적 제거와 함께 약 1:35 내지 약 1:60의 몰비로 에틸렌 옥사이드와 반응될 수 있다. 다양한 이러한 계면활성제는, 예를 들어, 약 50 내지 60의 비누화 값, 약 1 미만의 산 값, 물 함량, 즉, Fischer, 약 2% 미만, 약 1.453-1.457의 nD 60, 및 약 14-16의 HLB를 가지는 PEG40 수소화된 피마자 오일인 BASF Corp (Mt Olive, NJ)의 CREMOPHOR 시리즈를 상업적으로 이용가능하다.
2. 폴리옥시에틸렌 스테아르산 에스테르를 포함하는 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 예컨대, Uniqema의 MYRJ 시리즈, 예를 들어, 약 47℃의 m.p.를 가지는 MYRJ 53.
MYRJ 시리즈의 특정 화합물은, 예를 들어, 약 47℃의 m.p.를 가지는 MYRJ 53 및 MYRJ 52로서 이용가능한 PEG-40-스테아레이트이다.
3. Uniqema의 TWEEN 시리즈, 예를 들어, TWEEN 60을 포함하는 소르비탄 유도체,
4. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 및 블록 공중합체 또는 폴록사머, 예를 들어, BASF의 Pluronic F127, Pluronic F68,
5. 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예를 들어, Uniqema의 BRIJ 시리즈로서 공지되고 상업적으로 이용가능한 C12-C18 알코올의 폴리옥시에틸렌 글리콜 에테르, 예를 들어, 폴리옥실 10- 또는 20-세틸 에테르 또는 폴리옥실 23-라우릴 에테르, 또는 20-올레일 에테르, 또는 폴리옥실 10-, 20- 또는 100-스테아릴 에테르. BRIJ 시리즈로부터 특히 유용한 생성물은 BRIJ 58; BRIJ 76; BRIJ 78; BRIJ 35, 즉, 폴리옥실 23 라우릴 에테르, 및 BRIJ 98, 즉, 폴리옥실 20 올레일 에테르이다. 이들 생성물은 약 32℃ 내지 약 43℃의 m.p.를 가진다.
6. 약 36℃의 m.p.를 가지는 Eastman Chemical Co로부터 이용가능한 수용성 토코페릴 PEG 숙신산 에스테르, 예를 들어, TPGS, 예를 들어, 비타민 E TPGS
7. 예를 들어, 5-35 [CH2-CH,-O] 단위, 예를 들어, 20-30 단위를 가지는 PEG 스테롤 에테르, 예를 들어, Chemron (Paso Robles, CA)로부터의 SOLULAN C24 (콜레스-24 및 세테스-24), 또한 사용될 수 있는 유사한 생성물은 Nikko Chemicals의 NIKKOL BPS-30 (폴리에톡실화된 30 피토스테롤) 및 NIKKOL BPSH-25 (폴리에톡실화된 25 피토스탄올)로서 공지되고 상업적으로 이용가능한 것이다;
8. 예를 들어, 글리세롤 4-10의 글리세롤 단위, 또는 4, 6 또는 10 글리세롤 단위의 범위를 가지는 폴리글리세롤 지방산 에스테르. 예를 들어, 데카-/헥사-/테트라글리세릴 모노스테아레이트, 예를 들어, Nikko Chemicals의 DECAGLYN, HEXAGLYN 및 TETRAGLYN이 특히 적당하다,
9. 알킬렌 폴리올 에테르 또는 에스테르, 예를 들어, 각각 GELUCIRE 44/14 및 GELUCIRE 50/13인 라우로일 마크로골-32 글리세라이드 및/또는 스테아로일 마크로골-32 글리세라이드,
10. 포화된 C10 내지 C22의 폴리옥시에틸렌 모노 에스테르, 예컨대 C18 치환된, 예를 들어, 히드록시 지방산; 예를 들어, PEG 약 예를 들어, 600-900, 예를 들어, 660 달톤 MW의 12 히드록시 스테아르산 PEG 에스테르, 예를 들어, BASF (Ludwigshafen, 20 Germany)의 SOLUTOL HS 15. BASF technical leaflet MEF 151 E (1986)에 따라서, SOLUTOL HS 15는 약 70중량% 폴리에톡실화된 12-히드록시스테아레이트 및 약 30중량% 비에스테르화된 폴리에틸렌 글리콜 성분을 포함한다. 이는 90 내지 110의 수소화 값, 53 내지 63의 비누화 값, 최대 1의 산값, 및 0.5중량%의 최대 물 함량을 가진다.
11. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-알킬 에테르, 예를 들어, C12 내지 C18 알코올의 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-에테르, 예를 들어, Nikko Chemicals의 NIKKOL PBC 34로서 상업적으로 이용가능한 폴리옥시에틸렌-20-폴리옥시프로필렌-4-세틸에테르,
12. 예를 들어, Uniqema의 상표명 ATLAS G 1821 및 Nikko Chemicals의 NIKKOCDS-6000P 하에서 상업적으로 이용가능한 폴리에톡실화된 디스테아레이트; 및
13. 레시틴, 예를 들어, 대두 인지질, 예를 들어, Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Germany)의 LIPOID S75 로서 상업적으로 이용가능 또는 달걀 인지질, Nattermann Phospholipid (Cologne, Germany)의 PHOSPHOLIPON 90으로서 상업적으로 이용가능.
액체 계면활성제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 모두 Uniqema로부터 이용가능한 TWEEN 20, TWEEN 40 및 TWEEN 80과 같은 소르비탄 유도체, SYNPERONIC L44, 및 폴리옥실 10-올레일 에테르, 및 폴리옥시에틸렌 함유 계면활성제, 예를 들어, PEG-8 카프릴/카프린 글리세라이드(예를 들어, Gattefosse로부터 이용가능한 Labrasol)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 약 0중량% 내지 약 95중량%의 계면활성제, 예를 들어, 약 5중량% 내지 약 80중량%, 예를 들어, 약 10중량% 내지 약 70중량%, 예를 들어, 약 20중량% 내지 약 60중량%, 예를 들어, 약 30중량% 내지 약 50중량%를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 및 블록 공중합체 또는 폴록사머, 예를 들어, BASF의 Pluronic F127, Pluronic F68이다.
한 양태에서, 계면활성제는 폴록사머이다. 추가 양태에서, 계면활성제는 폴록사머 188, 폴록사머 407 및 폴록사머 407 및 폴록사머 188의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 함유 계면활성제, 예를 들어, PEG-8 카프릴/카프린 글리세라이드(예를 들어, Gattefosse로부터 이용가능한 Labrasol)이다.
한 양태에서, 계면활성제는 라우로일 폴리옥실글리세라이드(예를 들어, Gattefosse로부터 이용가능한 Gelucire 44/14)이다
한 양태에서, 계면활성제는 BASF의 Cremophor RH40 이다.
특정 양태에서, 약학 조성물은 약학 조성물에서 흔히 발견되는 추가 부형제를 포함할 수 있고, 예를 들어, 이러한 부형제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 항산화제, 항균제, 효소 억제제, 안정화제, 보존제, 향미제, 감미제 및 본원에 참고로써 포함되는 Handbook of Pharmaceutical Excipients , Rowe et al., Eds, 4'h Edition, Pharmaceutical Press (2003)에 기술되는 바와 같은 다른 성분을 포함한다.
이들 추가 부형제는 전체 약학 조성물의 약 0.05-5중량%의 양일 수 있다. 항산화제, 항균제, 효소 억제제, 안정화제 또는 보존제는 전형적으로 전체 약학 조성물의 약 0.05-1중량% 이하를 제공한다. 감미제 또는 향미제는 전형적으로 전체 약학 조성물의 약 2.5중량% 또는 5중량% 이하를 제공한다.
항상화제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 아스코르브산 및 그것의 유도체, 토코페롤 및 그것의 유도체, 부틸 히드록실 아니솔 및 부틸 히드록실 톨루엔을 포함한다.
한 양태에서, 조성물은 완충제를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "완충제"는 다르게는 화학 반응에 기인하여 발생하는 바와 같이 시간에 걸쳐 변화하는 조성물의 pH의 경향을 감소시키는 약학 조성물 중의 화학적 화합물을 말한다. 완충제는 인산나트륨, TRIS, 글리신 및 시트레이트 나트륨과 같은 화학물질을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "보존제"는 항균 활성(성장 및 물질대사)을 방지 또는 지연시키기 위한 약학 조성물에 첨가되는 화학적 화합물을 말한다. 약학적으로 허용가능한 보존제의 예는, 페놀, m-크레졸 및 페놀과 트리크레졸의 혼합물이다.
본원에서 사용되는 용어 "안정화제"는 펩티드를 안정화시키기 위해, 즉, 이러한 조성물의 유통기한 및/또는 사용시간을 증가시키기 위해 약학 조성물을 함유하는 펩티드에 첨가되는 화학물질을 말한다. 약학 조성물에 사용되는 안정화제의 예는 L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 글리실글리신, 에틸렌디아민, 시트레이트, EDTA, 아연, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 및 알파-토코페롤 및 l-아스코르브산과 같은 항산화제이다.
추가 양태에서, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 함유하는 약학 조성물을 제조하는 과정은 약물 및 극성 유기 용매, 친유성 성분, 및 선택적으로 계면활성제 및/또는 친수성 성분을 밀접한 혼합물로 만드는 단계를 포함한다. 예를 들어, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린 및 담체는, 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 80℃로 가열한 다음, 실온으로 냉각시켜 고형화함으로써 액화될 수 있다.
담체는 극성 유기 용매, 친유성 성분, 및 선택적으로 계면활성제 및/또는 친수성 성분을 유도된 인슐린 펩티드와 함께 밀접한 혼합물로 만드는 단계 전에 개별적으로 제조될 수 있다. 또 다르게는, 담체의 하나 이상의 성분은 폴리펩티드와 함께 혼합될 수 있다.
아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 극성 유기 용매에서 용해될 수 있고, 그 후 지질 성분 및 선택적으로 계면활성제와 혼합될 수 있다.
또 다르게는, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 함유하는 SEDDS 또는 SMEDDS (이는 캡슐에, 예를 들어, 장용 코팅 캡슐, 연질 캡슐, 장용 연질 캡슐에 채워질 수 있다)와 같은 약학적 조성물을 제조하는 과정은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 극성 유기 용매에서 유도된 인슐린 펩티드를 용해하는 단계 및
(b) 친유성 성분, 계면활성제 및 선택적으로 친수성 성분과 혼합하는 단계.
예를 들어, 약학 조성물을 제조하기 위한 과정은 낮은 온도(예를 들어, 실온 또는 실온 이하)에서 수행된다.
약학 조성물을 제조할 때, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은, 예를 들어, 하기 방법을 사용하여 극성 유기 용매에 용해될 수 있다:
a) 선택적으로 부형제를 포함하는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 수용액을 제공하는 단계,
b) 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 pI 이상 또는 이하의 1 단위, 또 다르게는 2 단위 및 또 다르게는 2.5 pH 단위 인 표적 pH 로 pH 값을 조절하는 단계,
c) 냉동- 및 분무 건조와 같은 통상적인 건조 기술에 의해 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린으로부터 물을 제거하는 단계(탈수 단계), 및
d) 예를 들어, 교반, 텀블링 또는 다른 혼합 방법에 의한 상기 극성 비수성 용매에 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 혼합 및 용해 단계,
e) 선택적으로 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 비-수성 용액의 여과 또는 원심분리로 용해되지 않은 무기염을 제거하는 단계,
f) 선택적으로 예를 들어, 고체 방습제를 첨가 또는 진공 건조에 의해 잔여량의 물을 제거하는 단계.
예를 들어, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 하기 방법에 의해 극성 유기 용매에 용해된다:
a) 선택적으로 아연 및 글리실글리신과 같은 안정화제를 함유하는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 수용액을 제공하는 단계,
b) 예를 들어, 염산 또는 수산화나트륨과 같은 비-휘발성 염기 또는 산을 용액에 첨가함으로써 폴리펩티드의 pI 이상 또는 이하의 1 단위, 또 다르게는 2 단위 및 또 다르게는 2.5 pH 단위로 pH 값을 조절하는 단계,
c) 냉동- 및 분무 건조와 같은 통상적인 건조 기술에 의해 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린으로부터 물을 제거하는 단계(탈수 단계), 및
d) 예를 들어, 교반, 텀블링 또는 다른 혼합 방법에 의한 상기 극성 비수성 용매에 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 혼합 및 용해 단계,
e) 선택적으로 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 비-수성 용액의 여과 또는 원심분리로 용해되지 않은 무기염을 제거하는 단계,
f) 선택적으로 예를 들어, 고체 방습제를 첨가 또는 진공 건조에 의해 잔여량의 물을 제거하는 단계.
"휘발성 염기"는 약간의 팽창을 위해 실온에서 65 Pa 이상의 수증기압을 가지는 염기 또는 실온에서 65 Pa 이상의 수증기압을 가지는 염기를 포함하는 수성 공비 혼합물을 가열 및/또는 감압 시 증발할 염기를 의미한다. 휘발성 염기의 예는 수산화 암모늄, 수산화 테트라알킬암모늄, 2차 아민, 3차 아민, 아릴 아민, 지방족 아민 또는 탄산수소 암모늄 또는 조합이다. 휘발성 염기의 예는, 저급 지방족 아민, 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 및 그것의 염과 같은 중탄산염, 탄산염, 암모니아, 히드라진 또는 유기염기일 수 있다. 추가로, 휘발성 염기는 수산화암모늄, 에틸아민 또는 메틸아민 또는 그것의 조합일 수 있다.
"휘발성 산"은 약간의 확장을 위해 예를 들어, 실온에서 65 Pa 이상의 수증기압을 가지는 산 또는 실온에서 65Pa 이상의 수증기압을 가지는 산을 포함하는 수성 공비혼합물을 가열 및/또는 감압시 증발할 산을 의미한다. 휘발성 산의 예는 탄산, 포름산, 아세트산, 프로피온산 및 부티르산이다.
본원에서 언급되는 "비 휘발성 염기"는 예를 들어, 실온에서 65Pa 이하의 수증기압을 가지는 염기를 가열시 증발하지 않거나 또는 단지 부분적으로 증발하는 염기를 의미한다. 비휘발성 염기는 알칼리금속염, 알칼리금속 수산화물, 알칼리토금속염, 알칼리토금속 수산화물 및 아미노산 또는 그것의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 비-휘발성 염기의 예는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 및 산화칼슘이다.
본원에서 언급되는 "비 휘발성 산"은, 예를 들어, 실온에서 65Pa 이하의 수증기압을 가지는 염기를 가열시 증발하지 않거나 또는 단지 부분적으로 증발하는 산을 의미한다. 비-휘발성 산의 예는 염산, 인산 및 황산이다.
아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 조성물의 약 40중량% 이하, 예컨대, 조성물의 약 20중량% 이하, 또는 약 0.01중량%, 예컨대 약 0.1중량%, 또 다르게는 약 0.01중량% 내지 약 20중량%, 또 다르게는 약 1중량% 내지 20중량% 또는 약 1% 내지 10중량%의 양으로 존재할 수 있다. 그러나, 폴리펩티드의 특정 수준의 선택은 극성 유기 용매 또는 선택적 친수성 성분 또는 사용된 계면활성제 또는 그것의 혼합물에서 폴리펩티드의 용해도, 투여 방식 및 환자의 크기 및 질환을 포함하는 약학 분야에 잘-공지된 인자에 따라서 제조될 것이다.
예를 들어, 약학적 제형은 0.1 % w/w 내지 30 % w/w의 농도로 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 포함한다.
각 단위 투약량은 적당하게 0.1 mg 내지 300 mg의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린 폴리펩티드, 예를 들어, 약 0.1 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 예를 들어, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 5 mg 내지 300 mg을 함유할 것이다. 예를 들어, 각 단위 투약량은 10 mg 내지 300 mg, 예를 들어, 10 mg 내지 100 mg 또는 20 mg 내지 300 mg, 예를 들어, 20 mg 내지 100 mg의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 함유한다. 이러한 단위 투약 형태는 치료의 특정 목적에 의존하여 1일 1-5회 투여에 적당하다.
아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 극성 유기 용매에서 용해 전 pH 최적화되어 극성 유기 용매에서 용해도를 개선한다.
용어 "pH 최적화된"을 사용할 때, 이는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린이 수용액에서 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 pI로부터 적어도 1 pH 단위인 표적 pH에서 탈수되었음을 의미한다. 따라서, 표적 pH는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 등전점 위로 1 pH 단위 이상이다. 또 다르게는, 표적 pH는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 등전점 밑으로 1 pH 단위 이상이다. 따라서, 표적 pH는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 pI 이상 또는 이하로 1.5 pH 단위, 예를 들어, pI 이상 또는 이하로 2.0 pH 단위, 예를 들어, pI 이상 또는 이하로 2.5 pH 단위일 수 있다.
아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린과 관련되어 본원에서 사용된 용어 "탈수된"은 수용액으로부터 건조된 유도된 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 말한다. 본원에서 사용되는 용어 "표적 pH"는 탈수된 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린이 대략 40 mg/ml 이상의 농도에서 순수한 물 내에서 다시 수화될 때 확립될 수성 pH를 말한다. 표적 pH는 전형적으로 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린이 건조에 의해 회수되는 것으로부터 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 수용액의 pH와 동일할 것이다. 그러나, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린 용액의 pH는, 용액이 휘발성 산 또는 염기를 함유한다면, 표적 pH와 동일하지 않을 것이다. 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 pH 히스토리는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 양에 대한 결정소일 것이고, 이는 극성 유기 용매에서 용해될 수 있음이 확인되었다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드의 pI"는 폴리펩티드의 등전점을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "등전점"은 펩티드와 같은 거대분자의 전반적인 순전하가 0인 pH 값을 의미한다. 펩티드에서 몇몇의 하전된 기가 있을 수 있고, 등전점에서 모든 이들 전하의 합은 0이다. 등전점 이상의 pH에서, 펩티드의 전반적인 순전하는 네가티브일 것인 반면, 등전점 이하의 pH 값에서, 펩티드의 전반적인 순전하는 포지티브일 것이다.
단백질의 pI는 등전점전기분획영동법과 같은 전기영동 기술에 의해 실험적으로 결정될 수 있다:
pH 기울기는 폴라아크릴아미드 겔과 같은 항대류성 배지에서 확립된다. 단백질이 시스템에 도입될 때, 이는 겔을 가로질러 적용되는 전기장의 영향하에서 이동할 것이다. 양으로 하전된 단백질은 음극으로 이동할 것이다. 결국, 이동하는 단백질은 그것의 전기적 하전이 0인 경우 pH 기울기에서 어떤 지점에 도달하고 이는 포커싱되는 것으로 언급된다. 이것은 단백질의 등전위 pH(pI)이다. 단백질은 그 후 겔에 고정되고 염색된다. 단백질의 pI는 그 후 공지된 pI 값을 가지는 마커 분자에 대하여 겔에서 단백질의 위치의 비교에 의해 결정될 수 있다.
주어진 pH 값에서 단백질의 순전하는 통상적인 방법에 의해 당업자에 의해 이론적으로 추정될 수 있다. 본질적으로, 단백질의 순전하는 단백질 아스파르테이트(β-카르복실 기), 글루타메이트(δ-카르복실기), 시스테인(티올기), 티로신 (페놀기), 히스티딘 (이미다졸 측쇄), 리신 (ε-암모늄 기) 및 아르기닌 (구아니디늄 기)에서 하전된 아미노산의 조각전하(fractional charge)의 합과 동등하다. 추가적으로, 이는 또한 단백질 말단기(α-NH2 및 α-COOH)의 전하를 고려해야만 한다. 이온화가능한 기의 조각전하는 고유 pKa 값으로부터 계산될 수 있다.
건조, 즉 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린의 탈수는 예를 들어, 분무-, 냉동-, 진공-, 개방- 및 접촉건조와 같은 어떤 통상적인 건조 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린 용액은 실험 부분에서 언급되는 바와 같이 건조 시험(중량 측정)에서 손실에 의해 계산/측정된 약 10% 이하, 예를 들어, 약 8% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하의 물 함량을 얻도록 분무 건조된다.
예를 들어, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린은 분무 건조 또는 냉동 건조된다.
본 발명의 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 함유하는 조성물은 인슐린에 민감한 상태의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 그것들은 예를 들어, 때때로 중대한 수술을 겪은 심각하게 부상당한 사람 및 사람들에서 나타나는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 고지혈증의 치료에 사용될 수 있다. 어떤 환자의 최적 용량 수준은 다른 약물과 가능한 조합, 및 치료되어야 하는 상태의 중증도에서 사용된 특정 인슐린 유도체의 효능, 환자의 연령, 체중, 신체 활동, 및 식이요법의 효능을 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 본 발명의 아실화된 인슐린의 1일 투약량은 공지된 인슐린 조성물에 대한 것과 유사한 방법으로 당업자에 의해 각 개별 환자에 대해 결정되는 것으로 권해진다.
본 발명의 바람직한 특징
본 발명의 특징은 하기와 같다:
1. 형식적으로는 비-프로테아제 안정화된 인슐린(모 인슐린)으로 구성되며, 적어도 하나의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산이 치환되었고, 상기 치환은 비-프로테아제 안정화된 인슐린(모 인슐린)의 하나 이상의 프로테아제 절단 자리 내에 또는 그곳과 인접하여 있고, 안정화된 인슐린에서 단지 하나의 리신 잔기가 있는 경우 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 더 포함하고, 아실 모이어티(moiety)가 프로테아제 안정화된 인슐린에서 리신 잔기에 또는 N-말단 위치에 부착되어 있는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
2. 프로테아제 안정화된 인슐린은 형식적으로 비-프로테아제 안정화된 인슐린(모 인슐린)으로 구성되며, 적어도 2개의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환되었고, 상기 치환은 비-프로테아제 안정화된 인슐린(모 인슐린)의 두개 이상의 프로테아제 절단 자리 내에 또는 그곳과 인접하여 있고, 이러한 프로테아제 안정화된 인슐린은 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 추가로 포함하며, 단, 안정화된 인슐린에서 단지 하나의 리신 잔기가 있고, 아실 모이어티는 프로테아제 안정화된 인슐린의 리신 잔기에 부착되어 있는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
3. 프로테아제 안정화된 인슐린은 형식적으로 비-프로테아제 안정화된 인슐린(모 인슐린)으로 구성되며, 적어도 2개의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환되었고, 상기 치환은 비-프로테아제 안정화된 인슐린(모 인슐린)의 두 개 이상의 프로테아제 절단 자리 내에 또는 그곳과 인접하여 있고, 이러한 프로테아제 안정화된 인슐린은 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 추가로 포함하며, 단, 안정화된 인슐린에서 단지 하나의 리신 잔기가 있고, 아실 모이어티는 프로테아제 안정화된 인슐린의 리신 잔기에 또는 N-말단 위치에 부착되어 있는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
4. 프로테아제 안정화된 인슐린은 아실화된 모 인슐린에 대해 증가된 용해도를 가지는 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 인슐린.
5. 인슐린의 B-사슬은 모 인슐린에 대해 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 인슐린.
6. 인슐린의 B-사슬이 모 인슐린에 대해서 많아야 1, 2 또는 3개의 돌연변이를 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 인슐린.
7. 프로테아제 안정화된 인슐린의 A 사슬이 인간 인슐린의 A 사슬과 동일한 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 인슐린.
8. 모 인슐린에 대해 인슐린의 A-사슬은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 인슐린의 B-사슬이 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 인슐린.
9. 모 인슐린에 대해 인슐린의 A-사슬은 적어도 2개의 돌연변이를 포함하고, 인슐린의 B-사슬은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 인슐린.
10. 인슐린은 처음 변형된 프로테아제 안정화된 인슐린의 프로테아제 자리에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함하며, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 적어도 하나의 소수성 아미노산이 적어도 하나의 친수성 아미노산으로 치환되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 인슐린.
11. 위치 A12에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고; 및/또는 위치 A13에서 아미노산은 His, Asn, Glu 또는 Asp이고; 및/또는 위치 A14에서 아미노산은 Tyr, Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly 또는 His이고; 및/또는 위치 A15에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고, 위치 B24에서 아미노산은 His이고; 및/또는 위치 B25에서 아미노산은 His 또는 Asn이고, 및/또는 위치 B26에서 아미노산은 His, Gly, Asp 또는 Thr이고; 및/또는 위치 B27에서 아미노산은 His, Glu, Asp, Gly 또는 Arg이고; 및/또는 위치 B28에서 아미노산은 His, Gly, Glu 또는 Asp이고; 이는 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 더 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
12. 위치 A12의 아미노산은 Glu 또는 Asp이고; 및/또는 위치 A13의 아미노산은 His, Asn, Glu 또는 Asp이고; 및/또는 위치 A14에서 아미노산은 Tyr, Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly 또는 His이고; 및/또는 위치 A15에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고; 및/또는 위치 B16에서 아미노산은 Tyr, His 또는 Glu이고; 및/또는 위치 B24에서 아미노산은 His이고; 및/또는 위치 B25에서 아미노산은 His 또는 Asn이고; 및/또는 위치 B26에서 아미노산은 His, Gly, Asp 또는 Thr이고; 및/또는 위치 B27에서 아미노산은 His, Glu, Asp, Gly, Lys, Arg 또는 결실이고; 및/또는 위치 B28에서 아미노산은 His, Gly, Glu, Asp, 또는 없고(결실) 및/또는 위치 B29에서 아미노산은 Lys, Arg, 또는 없고(결실); 이는 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이 및 바람직하게는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 추가로 포함하고, 위치 A12에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고; 및/또는 위치 A13에서 아미노산은 His, Asn, Glu 또는 Asp이고; 및/또는 위치 A14에서 아미노산은 Tyr, Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly 또는 His이고; 및/또는 위치 A15에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고, 위치 B24에서 아미노산은 His이고, 및/또는 위치 B25에서 아미노산은 His 또는 Asn이고; 및/또는 위치 B26에서 아미노산은 His, Gly, Asp 또는 Thr이고; 및/또는 위치 B27에서 아미노산은 His, Glu, Asp, Gly 또는 Arg이고; 및/또는 위치 B28에서 아미노산은 His, Gly, Glu, 또는 Asp이고; 이는 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 추가로 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
13. 위치 A14에서 아미노산은 Glu, Asp 또는 His이고, 위치 B25에서 아미노산은 His 또는 Asn이고 이는 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 추가로 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
14. 위치 A14에서 아미노산은 Glu, Asp 또는 His이고, 위치 B25에서 아미노산은 His 또는 Asn이고 위치 B30에서 아미노산은 결실되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
15. 위치 A14에서 아미노산은 Glu, Asp 또는 His이고, 위치 B16에서 아미노산은 His 또는 Glu이고, 위치 B25에서 아미노산은 His이고, 위치 B30에서 아미노산은 결실되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
16. 위치 A14에서 아미노산은 Glu, Asp 또는 His이고, 위치 B25에서 아미노산은 His이고 위치 B30에서 아미노산은 결실되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
17. 위치 A14에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고 위치 B28에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고, 선택적으로 위치 B30에서 아미노산 잔기가 없는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
18. 하나 이상의 추가 돌연변이는 A8His, A18Gln, A21Gln, A21Gly, B1Glu, B1Gln, B3Gln, B10Pro, B14Thr, B16Glu, B17Ser, B26Asp, B27Glu, B27Asp, B28Asp, B28Glu, 및 desB30으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
19. 추가 돌연변이가 desB30인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
20. A14는 Glu인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
21. B25는 Asn인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
22. B25는 His인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
23. B25는 Asn이고 B27은 Glu 또는 Asp인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
24. B25는 Asn이고 B27은 Glu인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
25. 모 단백질에 대하여 하나 이상의 프로테아제 효소에 대해 증가된 안정성을 나타내는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
26. 모 단백질에 대하여 두 개 이상의 프로테아제 효소에 대해 증가된 안정성을 나타내는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
27. 모 인슐린은 a) 인간 인슐린, b) 인간 인슐린의 인슐린 유사체(위치 B28에서 아미노산 잔기는 Pro, Asp, Lys, Leu, Val 또는 Ala이고, 위치 B29에서 아미노산 잔기는 Lys 또는 Pro이고, 선택적으로 위치 B30에서 아미노산 잔기는 결실된다), c) des(B26-B30) 인간 인슐린, des(B27-B30) 인간 인슐린, des(B28-B30) 인간 인슐린, des(B29-B30) 인간 인슐린, des(B27) 인간 인슐린 또는 des(B30) 인간 인슐린, d) 인간 인슐린의 인슐린 유사체(위치 B3에서 아미노산 잔기는 Lys이고 위치 B29에서 아미노산 잔기는 Glu 또는 Asp이다), e) 인간 인슐린의 인슐린 유사체(위치 A21에서 아미노산 잔기는 Gly이고, 인슐린 유사체는 2개의 Arg 잔기를 가지는 C-말단에서 추가로 연장된다), f) 인슐린 유사체(위치 B30에서 아미노산 잔기는 트레오닌 메틸 에스테르로 치환된다), g) 인슐린 유도체(des(B30) 인간 인슐린의 리신의 Nε 위치에서 테트라데칸오일 사슬이 부착된다)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
28. 하나 이상의 추가 돌연변이는 인슐린의 화학적 안정성을 향상시키기 위해 선택되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
29. 하나 이상의 추가 돌연변이는 A18Gln, A21Gln, A21Gly 및 B3Gln으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
30. 식 1의 A-사슬 아미노산 서열, 즉,: XaaA(-2)-XaaA(-1)-XaaA0-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaA13-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21 (SEQ ID No: 1), 및 식 2의 B-사슬 아미노산 서열, 즉,: XaaB(-2)-XaaB(-1)-XaaB0-XaaB1-XaaB2-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB30-XaaB31-XaaB32 (SEQ ID No: 2)를 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린, 여기서 XaaA (-2)는 없거나 또는 Gly이고; XaaA (-1)은 없거나 또는 Pro이고; XaaA0은 없거나 또는 Pro이고; XaaA8은 Thr 및 His으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA12는 Ser, Asp 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고, XaaA13은 Leu, Thr, Asn, Asp Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA14는 Tyr, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA15는 Gln, Asp 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA18은 Asn, Lys 및 Gln로부터 독립적으로 선택되고; XaaA21은 Asn 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB (-2)는 없거나 또는 Gly이고; XaaB (-1)은 없거나 또는 Pro이고; XaaB0는 없거나 또는 Pro이고; XaaB1은 없거나 또는 Phe 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB2는 없거나 또는 Val이고; XaaB3은 없거나 Asn 및 Gln로부터 독립적으로 선택되고; XaaB4는 Gln 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB10은 His, Asp, Pro 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB16은 Tyr, Asp, Gln His, Arg, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB24는 Phe 및 His으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB25는 Phe, Asn 및 His으로부터 독립적으로 선택되고, XaaB26은 없거나 또는 Tyr, His, Thr, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고; XaaB27은 없거나 또는 Thr, Asn, Asp, Gln, His, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB28은 없거나 또는 Pro, His, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고; XaaB29는 없거나 또는 Lys 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB30은 없거나 또는 Thr이고; XaaB31은 없거나 또는 Leu이고; XaaB32는 없거나 또는 Glu이고; C-말단은 선택적으로 아미드로서 유도될 수 있고, A-사슬 아미노산 서열 및 B-사슬 아미노산 서열은 A-사슬의 위치 7에서 시스테인과 B-사슬의 위치 7에서 시스테인 사이, 및 A-사슬의 위치 20에서 시스테인과 B-사슬의 위치 19에서 시스테인 사이의 이황화 다리에 의해 연결되고, A-사슬의 위치 6과 11에서 시스테인은 이황화 다리에 의해 연결되고; 선택적으로 N-말단 A-사슬 아미노산 서열은 3-7개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열에 의해 C-말단 B-사슬 아미노산 서열에 연결되어 단일 사슬 인슐린 분자를 형성하며, 선택적으로 B-사슬의 N-말단은 1-10개의 아미노산으로 연장되고, XaaA8이 Thr이고 XaaA12이 Ser이고 XaaA13이 Leu이고 XaaA14가 Tyr이면, XaaA15는 Glu 또는 Asp이고, XaaB24가 Phe이고 XaaB25가 Phe이고 XaaB26이 Tyr이고 XaaB27이 Thr이고 XaaB28이 Pro이면 XaaB29은 Gln이다.
31. 식 3의 A-사슬 아미노산 서열, 즉 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaA13-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21 (SEQ ID No: 3), 및 식 4의 B-사슬 아미노산 서열, 즉, XaaB1-Val-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-His-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB30 (SEQ ID No: 4)을 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린, 여기서 XaaA8은 Thr 및 His으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA12는 Ser, Asp 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA13은 Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA14는 Tyr, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA15는 Gln, Asp 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA18은 Asn, Lys 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA21은 Asn, 및 Gln로부터 독립적으로 선택되고, XaaB1은 Phe 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB3은 Asn 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고, XaaB4는 Gln 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB10은 His, Asp, Pro 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB16은 Tyr, Asp, Gln, His, Arg, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB24는 Phe 및 His으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB25는 Phe, Asn 및 His으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB26은 없거나 또는 Tyr, His, Thr, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고; XaaB27은 없거나 또는 Thr, Asn, Asp, Gln, His, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB28은 없거나 또는 Pro, His, Gly 및 Asp으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB29는 없거나 Lys 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB30은 없거나 또는 Thr이고; C-말단은 선택적으로 아미드로서 유도체화될 수 있고, A-사슬 아미노산 서열 및 B-사슬 아미노산 서열은 A-사슬의 위치 7에서 시스테인과 B-사슬의 위치 7에서 시스테인 사이, 및 A-사슬의 위치 20에서 시스테인과 B-사슬의 위치 19에서 시스테인 사이의 이황화 다리에 의해 연결되고, A-사슬의 위치 6 및 11에서 시스테인은 이황화 다리에 의해 연결된다.
32. XaaA8은 Thr 및 His으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA12는 Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA13은 Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고, XaaA14는 Tyr, Asp, His, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA15는 Gln 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA18은 Asn, Lys 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; XaaA21은 Asn, 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB1은 Phe 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB3은 Asn 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB4는 Gln 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB10은 His, Asp, Pro 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB16은 Tyr, Asp, Gln, His, Arg, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB24는 Phe 및 His으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB25는 Phe, Asn 및 His으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB26은 Tyr, Thr, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고; XaaB27은 Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, 및 Glu으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB28은 Pro, Gly 및 Asp로부터 독립적으로 선택되고; XaaB29는 Lys 및 Gln으로부터 독립적으로 선택되고; XaaB30은 없거나 또는 Thr이고; C-말단은 선택적으로 아미드로서 유도체화될 수 있고, A-사슬 아미노산 서열과 B-사슬 아미노산 서열은 A-사슬의 위치 7에서 시스테인과 B-사슬의 위치 7에서 시스테인 사이, 및 A-사슬의 위치 20에서 시스테인과 B-사슬의 위치 19에서 시스테인 사이의 이황화 다리에 의해 연결되고, A-사슬의 위치 6과 11에서 시스테인은 이황화 다리에 의해 연결되는 것이 가능한 정도로 앞 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
33. 프로테아제 안정화된 인슐린에서, 위치 A14에서 아미노산은 Glu 또는 His이고(즉, 한 글자 코드에 따라서 E 또는 H), 위치 B25에서 아미노산은 His이고, 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함하며, 아실 모이어티는 위치 B29의 리신 잔기에서 ε 아미노기에 부착되는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
34. 프로테아제 안정화된 인슐린에서, 위치 B25에서 아미노산은 His 또는 Asn이고, 위치 B27에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고, 이는 선택적으로 다음의 추가 돌연변이 A8H, A14E/D, B1E/D, B28E/D, 및 desB30 중 하나 이상을 추가로 포함하고, 아실 모이어티는 위치 B29의 리신 잔기에서 ε 아미노기에 부착되는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
35. 프로테아제 안정화된 인슐린에서, 위치 A14에서 아미노산은 Tyr, Glu 또는 His이고 (즉, 한 글자 코드에 따라서 Y, E 또는 H), 위치 B25의 아미노산은 Asn이고, 위치 B27에서 아미노산은 Glu 또는 Asp이고, 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 추가로 포함하고, 아실 모이어티는 위치 B29의 리신 잔기에서 ε 아미노기에 부착되는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
36. 프로테아제 안정화된 인슐린이 A14E 돌연변이를 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따라서 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
37. 프로테아제 안정화된 인슐린에서, 위치 B25에서 돌연변이를 제외하고, 단지 앞 절에서 언급된 위치 A14에서 돌연변이가 있는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
38. 프로테아제 안정화된 인슐린이 A14H 돌연변이를 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
39. 프로테아제 안정화된 인슐린 유사체는 desB30 돌연변이를 포함하는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
40. 프로테아제 안정화된 인슐린 내의 하나 이상의 추가 돌연변이가 A(-1)P, A(O)P, A8H, A21G, B(-1)P, B(O)P, B1E, B1Q, B16E, B26D, B27E, B28D, desB30, B31L 및 B32E로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
41. 위치 A14 및 B25의 돌연변이를 제외하고, 프로테아제 안정화된 인슐린은 앞 절에서 언급된 돌연변이 중 단지 하나를 가지는 것이 가능한 정도로 앞 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
42. 위치 A14 및 B25의 돌연변이를 제외하고, 프로테아제 안정화된 인슐린은 2번째 앞 절에서 언급된(즉, 40절에서 언급) 돌연변이 중 정확히 2개를 가지는 것이 가능한 정도로 마지막 절 이외의(즉, 41절 제외) 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
43. 위치 A14 및 B25의 돌연변이를 제외하고, 프로테아제 안정화된 인슐린은 앞 절에서 언급된(즉, 40 절에서 언급) 돌연변이 중 정확히 3개를 가지는 것이 가능한 정도로 마지막 2절 이외의(즉, 41절 및 42절 제외) 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
44. 위치 A14 및 B25의 돌연변이를 제외하고, 단지 추가 돌연변이는 desB30인 것이 가능한 정도로 마지막 2절 이외의(즉, 41절 및 42절 제외) 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
45. 프로테아제 안정화된 인슐린의 A 사슬 중의 C 말단 아미노산 잔기는 A21 아미노산 잔기인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
46. 프로테아제 안정화된 인슐린은 A8H, B25N, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, A18L, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린; A14E, B28D, desB30 인간 인슐린; A14E, B28E, desB30 인간 인슐린; B25N, B27E, desB30 인간 인슐린; B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린 A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B16H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, desB30 인간 인슐린 및 A21G, B25H, desB30 인간 인슐린로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
47. 프로테아제 안정화된 인슐린에 부착되는 아실 모이어티는 일반식 (I) Acy-AA1n-AA2m-AA3p-을 가지고, Acy, AA1, AA2, AA3, n, m 및 p는 상기 정의한 바와 같은 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
48. Acy은 지방산, 바람직하게는 미리스트산 또는 스테아르산, 더 바람직하게는 미리스트산인 것이 가능한 정도로 앞 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
49. Acy은 지방 2산, 바림직하게는 지방(α,ω) 2염기산, 더 바람직하게는 헵타데칸디온산, 헥사데칸디온산, 옥타데칸디온산, 노나데칸디온산, 도코산디온산, 에이코산디온산인 앞 선 절 중 마지막 절을 제외한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
50. Acy은 ω-(테트라졸-5-일)-지방산, 바람직하게는 15-(1H-테트라졸-5-일)펜타데칸산, 16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데칸산, 17-(1H-테트라졸-5-일)헵타데칸산, 18-(1H-테트라졸-5-일)옥타데칸산 또는 19-(1H-테트라졸-5-일)노나데칸산인 앞 절 중 마지막 절을 제외한 어떤 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
51. AA1은 트라넥사민산 또는 글리신인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
52. AA1은 트라넥사민산인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
53. n은 0 또는 1인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
54. n은 0인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
55. n은 1인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
56. AA2는 γGlu, αGlu, βAsp, αAsp, γ-D-Glu, α-D-Glu, β-D-Asp, α-D-Asp, 또는 하기 화학식의 아미노산이고:
Figure pct00026
,
화살표는 AA1, AA2, AA3 또는 B29 리신 잔기의 ε-아미노기 또는 프로테아제 안정화된 인슐린의 N-말단 위치에서 부착지점을 나타내는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
57. AA2는 γGlu, βAsp, γ-D-Glu, β-D-Asp, 또는 하기 화학식의 아미노산이고:
Figure pct00027
화살표는 AA1, AA2, AA3의 아미노기 또는 B29 리신 잔기의 ε-아미노기 또는 프로테아제 안정화된 인슐린의 N-말단 위치에서 부착 지점을 나타내는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
58. AA2는 γGlu, γ-D-Glu, 또는 다음 화학식의 아미노산이고:
Figure pct00028
, 화살표는 AA1, AA2, AA3의 아미노기 또는 B29 리신 잔기의 ε-아미노기 또는 프로테아제 안정화된 인슐린의 N-말단 위치에서 부착지점을 나타내는 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
59. m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
60. m이 0, 1, 2, 3, 또는 4인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
61. m이 4인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
62. m은 3인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
63. m은 2인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
64. m은 1인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
65. m은 0인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
66. AA3은 하기 중 어떤 것으로부터 선택되며,
Figure pct00029
r은 1, 2, 3, 5, 7, 11, 23 또는 27인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
67. r은 1, 3, 5, 또는 7인 앞 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
68. r은 1인, 앞 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
69. r은 3인, 한 절을 제외한 앞 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
70. r은 5인, 두 절을 제외한 앞 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
71. r은 7인, 세 절을 제외한 앞 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
72. p는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10인 것이 가능한 정도로 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
73. p는 0, 1, 2, 3 또는 4인 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
74. p는 0, 1, 또는 2인 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
75. p는 0 또는 2인 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
76. p는 0인 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
77. p는 1인 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
78. p는 2인 앞 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
79. 특정 예에서와 같이 본 명세서에서 구체적으로 언급된 화합물 중 어떤 하나, 특히 하기 실시예 1 et seq 중 어떤 하나인 앞선 생성물 절 중 어떤 하나에 따르는 화합물.
80. 본 명세서에서 구체적으로 언급된 프로테아제 안정화된 인슐린 중 어떤 것에 부착된 본 명세서에 구체적으로 언급된 아실 모이어티의 특정 예 중 어떤 하나인, 앞선 생성물 절 중 어떤 한 절에 따르는 화합물.
81. 당뇨병의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 앞선 생성물 절 중 어떤 한 절에 따르는 화합물의 사용.
82. 당뇨병의 치료를 위해 폐에 투여될 수 있는 약학 조성물의 제조를 위한 앞선 생성물 절 중 어떤 한 절에 따르는 화합물의 사용.
83. 당뇨병의 치료를 위해 폐에 투여될 수 있고 오랜 작용 효과를 제공할 수 있는 약학 조성물의 제조를 위한 앞선 생성물 절 중 어떤 한 절에 따르는 화합물의 사용.
84. 당뇨병의 치료를 위해 폐에 투여될 수 있는 분말 약학 조성물의 제조를 위한 앞선 생성물 절 중 어떤 한 절에 따르는 화합물의 사용.
85. 당뇨병의 치료를 위해 폐에 투여될 수 있는 액체 약학 조성물의 제조를 위한 앞선 생성물 절 중 어느 한 절에 따르는 화합물의 사용.
86. 당뇨병의 치료를 위해 경구로 투여될 수 있는 약학 조성물의 제조를 위한 앞선 생성물 절 중 어느 한 절에 따르는 화합물의 사용.
87. 앞선 생성물 절 중 어느 한 절에 따르는 화합물의 치료적으로 효과적인 양을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법.
88. 앞선 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 뿐만 아니라 인간 인슐린을 함유하는 조성물.
89. 앞선 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린 뿐만 아니라 인슐린 아스파르트를 함유하는 조성물.
90. 앞선 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린 뿐만 아니라 인슐린 Lispro를 함유하는 조성물.
91. 앞선 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린 뿐만 아니라 인슐린 Glulisine을 함유하는 조성물.
92. 인슐린 유사체에 관한 상기 절 중 어느 한 절에 따르는 프로테아제 안정화된 인슐린 및 약학적으로 허용가능한 담체의 생물학적으로 활성인 양을 포함하는 약학 조성물.
93. 인슐린 유사체에 관한 상기 절 중 어떤 한 절에 따르는 프로테아제 안정화된 인슐린 또는 상기 절 중 어떤 한 절에 따르는 약학 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능장애, 1형 당뇨병, 비만, 신드롬 X 또는 이상지질혈증의 치료, 예방 또는 완화를 위한 방법.
94. 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능장애, 1형 당뇨병, 비만, 신드롬 X 또는 이상지질혈증의 치료 또는 예방을 위한 약학 제형을 위한 인슐린 유사체에 관한 상기 절 중 어떤 한 절에 따르는 프로테아제 안정화된 인슐린의 치료적으로 유효한 양의 사용.
95. 앞의 생성물 절 중 어느 한 절에 따르는 아실화된 인슐린의 치료적으로 유효한 양을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료방법.
본원에서 설명되는 하나 이상의 절, 또한 선택적으로 하기 청구항 중 하나 이상과 조합은 추가 항을 초래하고 본 발명은 상기 항 및 청구항의 모든 가능한 조합에 관한 것이다.
본원에 인용되는 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 전체가 참고로써 그리고, 각 참고문헌이 개별적이고 구체적으로 참고로써 포함되는 것과 동일한 정도로 본원에 포함되며, 본원에서 그것 전체로 설명된다(법에 의해 허용되는 최대 정도로).
모든 주제 및 부제는 본원에서 단지 편의상 사용되며 어떤 방법으로 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본원에서 제공되는 어떤 및 모든 예, 또는 대표적인 언어(예를 들어, "예컨대")는 단지 본 발명을 더 명확하게 하는 것으로 의도되며, 달리 주장되지 않는다면, 본 발명의 범주의 제한을 제기하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실행에 필수적으로 어떤 청구되지 않는 요소를 나타내는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본원에서 본래 문서의 인용 및 포함은 단지 편의를 위해 행해지며 이러한 특허 문헌의 유효함, 특허가능성 및/또는 강제성의 어떤 관점을 반영하지 않는다. 본원에서 참고의 언급은 그것들이 선행기술을 구성하는 것을 허용하는 것은 아니다.
본원에서, 단어 "포함하다"는 "포함하다", "함유하다" 또는 "이해하다"를 넓게 의미하는 것으로 이해되어야 한다(EPO guidelines C 4. 13).
본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 첨부되는 청구항에 인용되는 대상사실의 모든 변형 및 동등물을 포함한다.
실시예
하기 실시예는, 제한 없이 설명의 방법에 의해 제공된다.
본원에서 사용되는 약어는 다음과 같다: βAla은 베타-알라닐이고, Aoc는 8-아미노옥탄산이고, tBu은 tert-부틸이고, DCM은 디클로로메탄이고, DIC는 디이소프로필카르보디이미드이고, DIPEA = DIEA는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, DMF는 N,N-디메틸포름아미드이고, DMSO는 디메틸 술폭시드이고, EtOAc는 에틸 아세테이트이고, Fmoc는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐이고, γGlu는 감마 L-글루타밀이고, HCl은 염산이고, HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸이고, NMP는 N-메틸피롤리돈이고, MeCN은 아세토니트릴이고, OEG는 [2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸카르보닐이고, Su는 숙신이미딜-1-일 = 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일이고, OSu는 숙신이미딜-1-일옥시= 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시이고, RPC는 역상 크로마토그래피이고, RT는 실온이고, TFA는 트리플루오로아세트산이고, THF는 테트라히드로푸란이고, TNBS는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산이고, TRIS는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄이고 TSTU는 0-(N-숙신이미딜)-1,1,3,3-테트란메틸우로늄 테트라플루오로보레이트이다.
하기 실시예 및 일반 과정은 본 명세서 및 합성 반응식에서 확인되는 중간체 화합물 및 최종 생성물을 언급한다. 본 발명의 화합물의 제조는 하기 실시예를 사용하여 상세하게 설명되지만, 본 발명의 화합물의 제조에서 그것의 일반적 적용 가능성에 대하여 개시된다. 때때로, 반응은 본 발명의 개시된 범주 내에서 포함되는 각 화합물에서 설명되는 바와 같이 적용가능하지 않을 수도 있다. 이것이 일어나기 위해 화합물은 당업자에 의해 용이하게 인식될 것이다. 이 경우에 반응은 당업자에게 공지된 통상적인 변형에 의해, 즉 방해 기의 적절한 보호에 의해, 다른 통상적인 시약으로 변경함으로써, 또는 반응 조건의 일상적인 변형에 의해 성공적으로 수행될 수 있다. 또 다르게는, 본원에서 개시되는 또는 달리 통상적인 다른 반응은 본 발명의 대응하는 화합물의 제조에 적용가능할 것이다. 모든 제조 방법에서, 모든 출발 물질은 공지되어 있고 또는 공지된 출발 물질로부터 용이하게 제조될 수 있다. 모든 온도는 섭씨에서 설명되며, 달리 나타내지 않는다면, 모든 부분 및 백분율은 수율이 언급될 때 중량부이고 모든 부분은 용매 및 용리액이 언급될 때 부피부이다.
본 발명의 화합물은 당업계에서 전형적인 하기 과정 중 하나 이상을 사용함으로써 정제될 수 있다. 이들 과정은 -필요하다면- 기울기, pH, 염, 농도, 흐름, 컬럼 등에 의해 변형될 수 있다. 불순물 프로파일, 당해 인슐린의 용해도 등과 같은 인자에 의존하여, 이들 변형은 용이하게 인식될 수 있고 당업자에 의해 만들어질 수 있다.
산성 HPLC 또는 탈염 후, 화합물은 순수한 부분의 동결건조에 의해 분리된다. 중성 HPLC 또는 음이온 교환 크로마토그래피 후, 화합물은 탈염되고, 등전 pH에서 침전되고, 또는 산성 HPLC에 의해 정제된다.
전형적인 정제 과정:
HPLC 시스템은 하기로 구성되는 Gilson 시스템이다: Model 215 액체 핸들러, 모델 322-H2 펌프 및 모델 155 UV 검출기. 검출은 전형적으로 210 nm 및 280 nm에서이다. Akta Purifier FPLC 시스템 (Amersham Biosciences)은 하기로 구성된다: 모델 P-900 Pump, 모델 UV-900 UV 검출기, 모델 pH/C-900 pH 및 전도도 검출기, 모델 Frac-950 Frction 수집기. UV 검출은 214 nm, 254 nm 및 276 nm에서 이다.
산성 HPLC :
컬럼 : Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4
유속: 8 ml/min
완충제 A: 아세토니트릴 중에서 0.1 % TFA
완충제 B: 물 중에서 0.1 % TFA
기울기: 0.0 - 5.0 min: 10% A
5.00 - 30.0 min: 10% A 내지 90% A
30.0 - 35.0 min: 90% A
35.0 - 40.0 min: 100% A
중성 HPLC :
컬럼 : Phenomenex, Jupiter, C4 5μm 250 x 10.00 mm, 300 Å
유속: 6 ml/min
완충제 A: 5 mM TRIS, 7.5 mM (NH4)2SO4, pH = 7.3, 20% CH3CN
완충제 B: 60% CH3CN, 40% 물
기울기: 0 - 5 min 10% B
5 - 35 min: 10-60% B
35 - 39 min: 60% B
39 - 40 min: 70% B
40 - 43.5 min: 70% B
음이온 교환 크로마토그래피:
컬럼 : RessourceQ, 1 ml
유속: 6 ml/min
완충제 A: 0.09% NH4HCO3, 0.25% NH4OAc, 42.5% 에탄올 pH 8.4
완충제 B: 0.09% NH4HCO3, 2.5% NH4OAc, 42.5% 에탄올 pH 8.4
기울기: 30 컬럼 부피 동안 100% A 내지 100% B
탈염 :
컬럼 : HiPrep 26/10
유속: 10 ml/min, 6 컬럼 부피
완충제 : 1O mM NH4HCO3
일반식 II의 아실화 시약의 고체상 합성을 위한 일반 과정:
일반식 (II)
Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Act,
상기식에서 Acy, AA1, AA2, AA3, n, m, 및 p는 상기 정의된 바와 같고 Act는 N-히드록시숙신이미드(OSu), 또는 1-히드록시벤조트리아졸과 같은 활성 에스테르의 이탈기이고, 아실 모이어티의 Acy 및 AA2 모이어티 내의 카르복실산은 tert-부틸 에스테르로서 보호된다.
본 발명에 따르는 일반식 (II)의 화합물은 고체상 펩티드 합성의 당업자에게 잘 알려진 과정을 사용하여 고체 지지체에서 합성될 수 있다. 이 과정은 폴리스티렌 2-클로로트리틸클로라이드 수지에 Fmoc 보호된 아미노산의 부착을 포함한다. 부착은, 예를 들어, 트리에틸 아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민과 같은 3차 아민의 존재하에서 자유 N-보호된 아미노산을 사용하여 수행될 수 있다(하기 참고문헌 참조). 이 아미노산의 C-말단 끝(이는 수지에 부착됨)은 본 발명의 모 인슐린에 커플링되는 합성 서열의 끝이다. 수지에 Fmoc 아미노산의 부착 후, Fmoc 기는, 예를 들어, 피페리딘 또는 디에틸아민과 같은 2차 아민을 사용하여 탈보호된 다음 다른(또는 동일한) Fmoc 보호된 아미노산의 커플링 및 탈보호된다. 합성 서열은 헥사데칸디온산, 헵타데칸디온산, 옥타데칸디온산 또는 에이코산디온산 모노-tert-부틸 에스테르와 같은 모노-tert-부틸 보호된 지방(α,ω) 2염기산의 커플링에 의해 종결된다. 수지로부터 화합물의 절단은 0.5-5% TFA/DCM (디클로로메탄 중의 트리플루오로아세트산), 아세트산 (예를 들어, DCM, 또는 HOAc/트리플루오로에탄올/DCM 1:1:8에서 10%), 또는 DCM 중의 헥사플루오로이소프로판올과 같은 희석된 산을 사용하여 수행된다(예를 들어, "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z. Doerwald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, "Peptides: Chemistry and Biology", N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 또는 "The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG, 및 그것에 인용된 참고문헌 참조). 이는 tert-부틸 에스테르가 카르복실산 보호기가 탈보호되지 않는 화합물에서 존재함을 보장한다. 최종적으로, C-말단 카르복시기(수지로부터 방출됨)는, 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르(OSu)로서 활성화되고, 직접적으로 또는 본 발명의 모 인슐린에 부착에서 커플링 시약으로서 정제 후 사용된다. 이 과정은 실시예 9에서 명확하게 된다.
또 다르게는, 상기식 (II)의 아실화 시약은 하기 기술되는 고체상 합성에 의해 제조될 수 있다.
헥산데칸디온산, 헵타데칸디온산, 옥타데칸디온산 또는 에이코산디온산 모노-tert-부틸 에스테르와 같은 모노-tert-부틸 보호된 지방 2산은, 예를 들어, 하기 설명되는 바와 같은 OSu-에스테르 또는 HOBt- 또는 HOAt- 에스테르와 같은 당업자에게 공지된 어떤 다른 활성화된 에스테르로서 활성화된다. 이 활성 에스테르는 DIPEA 또는 트리에틸아민과 같은 적당한 염기의 존재하에서 THF, DMF, NMP (또는 용매 혼합물)와 같은 적당한 용매에서 아미노산 AA1, 모노-tert-부틸 보호된 AA2, 또는 AA3 중 하나와 커플링된다. 중간체는, 예를 들어, 추출 과정 또는 크로마토그래피 과정에 의해 분리된다. 결과 중간체는 다시 활성화되고(상기 설명한 바와 같음) 상기 설명한 바와 같은 아미노산 AA1 모노-tert-부틸 보호된 AA2, 또는 AA3 중 하나와 커플링된다. 이 과정은 요망되는 보호된 중간체 Acy-AA1n-AA2m-AA3p-OH가 획득될 때까지 반복된다. 이는 차례로 활성화되어 일반식 (II) Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Act의 아실화 시약을 얻는다. 이 과정은 실시예 21에서 명확해진다.
상기 방법 중 어떤 것에 의해 제조되는 아실화 시약은 OSu 에스테르로서 활성화 후 탈보호될 수 있다(tert-부틸). 이는 OSu-활성화된 tert-부틸 보호된 아실화 시약의 TFA 처리에 의해 행해질 수 있다. 어떤 프로테아제 안정화된 인슐린의 아실화 후, 본 발명의 결과의 비보호된 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린이 얻어진다. 이는 예를 들어 하기 실시예 16에서 명확해진다.
상기 방법 중 어떤 것에 의해 제조되는 시약이 OSu 에스테르로서 활성화 후 탈보호되지 않을 때(tert-부틸), 어떤 프로테아제 안정화된 인슐린의 아실화는 본 발명의 대응하는 tert-부틸 보호된 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 얻는다. 본 발명의 비보호된 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 얻기 위해, 보호된 인슐린은 탈보호되어야 한다. 이는 본 발명의 탈보호된 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린을 얻기 위해 TFA 처리에 의해 행해질 수 있다. 이는 예를 들어, 하기 실시예 1 및 2에서 명확해진다.
인슐린의 리신 잔기의 아실화(엡실론 위치에서)가 요망된다면, 아실화는 알칼린 pH에서 수행된다(예를 들어, pH 10, 10.5, 또는 11). 이는, 예를 들어, 하기 실시예 1 및 2에서 명확해진다.
인슐린의 A-사슬 N-말단 위치(A1)의 아실화가 요망된다면, 아실화는 중성 pH에서 수행된다(예를 들어, pH 7, 7.5, 8, 또는 8.5). 이는 하기 실시예 38 및 44에서 명확해진다.
본 발명의 아실화된 , 프로테아제 안정화된 인슐린의 제조를 위한 일반 과정(A)
일반 과정(A)은 첫번째 실시예에서 명확해진다.
실시예 1, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε - 헥사데칸디오일 ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00030
A14E, B25H, desB30 인간 인슐린 (500 mg)을 100 mM 수성 Na2CO3 (5 mL)에 용해하였고, pH를 1 N NaOH로 10.5로 조절하였다. 헥사데칸디온산 tert-부틸 에스테르 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 아세토니트릴(10 WN%)에 용해하였고 인슐린 용액에 첨가하고 따뜻한 탭 하에서 약하게 가열하여 침전을 피하고 실온에서 30분 동안 두었다. 혼합물을 동결건조시켰다. 고체를 빙냉된 95% 트리플루오로아세트산(5% 물을 함유)에 용해하였고 30분 동안 얼음에 두었다. 혼합물을 진공에서 농축하였고 디클로로메탄으로부터 재증발시켰다. 잔여물을 물에 용해하였고, pH를 중성(6-7)으로 조절하였고 혼합물을 동결건조시켰다.
결과 인슐린을 공급원 15Q 21 ml 컬럼에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였고, 수회 실행하고, 15 mM 트리스, 50v/v% 에탄올, pH 7.5 (아세트산)에서 15 내지 300mM 암모늄 아세테이트의 기울기로 용리하였다. 순수한 분획의 최종 탈염을 0.1v/v % TFA, 50 v/v % 에탄올로 등용매로 용리하면서 RPC 3 mL 컬럼에서 수행하였다. 결과된 순수한 인슐린을 동결건조하였다.
LC-MS (전기분무) m/z = 1483 2 (M+4)/4. 계산치 1483.5
실시예 2, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 옥타데칸디올 -γ Glu ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00031
A14E, B25H, desB30 인간 인슐린 (2 g)을 10OmM 수성 Na2CO3 (10 mL)에 용해하였고, DMSO (4 mL)를 첨가하였다. pH를 1 N NaOH tert-부틸 옥탄데칸디오일-L-Glu(OSu)-OtBu (WO 2005/012347에서 설명한 바와 같이 제조)에 의해 10.5로 조절하였다. 더 많은 10OmM 수성 Na2CO3 (20 mL)를 첨가한 후 THF (20 mL)를 첨가하였다. 1.5 시간 후, 몇 방울의 메틸아민을 첨가하였고, 혼합물을 이후에 아세트산으로 산성화하였다. 혼합물을 분취 HPLC로 정제하였고 동결건조하여 디-tert-부틸 에스테르로서 표제 인슐린을 얻었다. 이를 디클로로메탄 및 트리플루오로아세트산 1:1(50ml)에 용해하였다. 혼합물을 2시간 동안 남기고 진공에서 농축하였다. 소량의 물 및 아세토니트릴의 첨가 후, 혼합물을 분취 HPLC로 정제하였다. 순수한 분획을 동결건조하였다. 이것으로 313 mg의 표제 인슐린을 얻었다.
MALDI-TOF MS m/z = 6089 (M+1). 계산치: 6089
실시예 3, 일반 과정(A):
A14E, B25H, B29K(N ε 에이코산디오일 -γ Glu ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00032
본 인슐린을 에이코산디온산 모노-tert-부틸 에스테르 및 tert-부틸 이코산디오일-L-Glu(OSu)-OtBu를 통해 에이코산디온산으로부터 출발하여 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다.
MALDI-TOF MS m/z = 6120 (M+1). 계산치. 6117.
실시예 4, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 3- 카르복시 -5- 옥타데칸디오일아미노벤조일 ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00033
본 인슐린을 5-(17-tert-부톡시카르보닐헵타-데칸오일아미노)이소프탈산 모노-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르로부터 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다(WO 2006/082204에서 설명한 바와 같이 제조).
LC-MS. 1531 (M+4), Mw 6124 (디콘볼루션됨). 계산치. 1531 (M+4), 6122.
실시예 5, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε -N- 옥타데칸디오일 -N-(2- 카르복시에틸 )글리실), desB30 인간 인슐린
이 인슐린을 tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에틸)-Gly-OSu로부터 출발하여 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다(WO 2005/012347에서 설명한 바와 같이 제조).
LC-MS (전기분무). m/z. 1522.52 (M+4). 계산치. 1523.
실시예 6, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε (N- 옥타데칸디오일 -N- 카르복시메틸 )-베타- 알라닐 ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00035
이 인슐린을 tert-부틸 옥타데칸디오일-N-(tert-부톡시카르보닐메틸)-βAla-OSu로부터 출발하여 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다(WO 2005/012347에서 설명한 바와 같이 제조).
MALDI-TOF MS m/z = 6088 (M+1). 계산치 6089.
실시예 7, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 4-([4-({19- 카르복시노나데칸오일아미노 } 메틸 )트랜스-시클로헥산-카르보닐]-γ Glu ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00036
이 인슐린을 2-({4-[(19-tert-부톡시카르보닐-노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산카르보닐}아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디-옥소피롤리딘-1-일) 에스테르로부터 출발하여 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다.
LC-MS (전기분무) m/z 6260. 계산치: 6255
2-({4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산카르보닐}아미노)-펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르의 제조:
1. tert -부틸 에이코산디온산의 OSu 활성화
tert-부틸 이코산디온산(5.0 g)을 THF (50 ml) 및 DMF (30 ml)에 용해하였다. TSTU (4.53 g) 및 DIPEA (2.65 ml)를 첨가하였다. 혼합물을 3일 동안 교반한 다음 진공에서 농축하였다. 고체 잔여물을 아세토니트릴로부터 재결정화하여 이코산디온산 tert-부틸 에스테르를 제공하였다(5.52 g, 89%).
LC-MS (전기분무) m/z 440 [M-56 (= tert-Bu)]
2. 트라넥사민산의 커플링
THF (100 ml) 중의 이코산디온산 tert-부틸 에스테르 N-히드록시숙신이미드 에스테르(5.52 g)의 용액에 트라넥사민산(1.75g)을 첨가하였다. 침전물을 얻었다. DMF (75 ml), 물 (25 ml) 및 DMSO (50 ml) 및 몇 방울의 DIPEA를 첨가하는 것에 의해 용액을 얻기 위한 시도는 성공적이지 않았다. 현탁액을 밤새 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축하였다. 고체 잔여물에 THF를 첨가하였고 침전물을 여과하였다. 여액을 농축하였고 고체 잔여물을 아세토니트릴에서 재결정화하여 4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산-카르복실산을 백색 결정질 화합물로서 제공하였다(5.56g, 93%).
LC-MS (전기분무) m/z 538 (M+1)
3. 4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산-카르복실산의 OSu 활성화
THF (100 ml) 중의 4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산카르복실산 (5.56 g)의 용액에 아세토니트릴(25 ml) 중의 TSTU (3.42 g)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 후 진공에서 농축하였다. 고체 잔여물을 아세토니트릴로부터 재결정화하여 4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산카르복실산 2,5-디-옥소피롤리딘-1-일 에스테르를 제공하였다(5.76 g, 88%)
LC-MS (전기분무): m/z 635 (M+1)
4. H-Glu-OtBu 및 OSu 활성화의 커플링
THF (150 ml) 중의 4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산카르복실산 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 에스테르의 용액에 물 중의 H-Glu-OtBu (1.84 g)의 용액 및 몇 방울의 DIPEA를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하였고 그 후 진공에서 농축하였다. 잔여물을 뜨거운(60℃) THF에서 용해하였고 여과하였다. 냉각한 여액에 150 ml까지 THF를 첨가하였고 아세토니트릴(25 ml) 중에 용해된 TSTU (2.98 g)를 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 교반 후 농축하였다. 잔여물을 아세토니트릴로부터 재결정화하여 백색 고체, 2-({4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산카르보닐}아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르 (6.8 g, 92%)를 얻었다.
LC-MS (전기분무) m/z 820 (M+1)
실시예 8, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 헵타데칸디오일 -γ Glu ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00037
이 인슐린을 헵타-데칸디온산 모노-tert-부틸 에스테르 및 tert-부틸 헵탄디오일-L-Glu(OSu)-OtBu을 통해 헵탄데칸디온산으로부터 출발하여 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다 (WO 2006/082204에서 설명한 바와 같이 제조)
LC-MS (전기분무) m/z: 1519 (M+4). 계산치: 1519
실시예 9, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 옥타데칸디오일 -γ Glu - OEG - OEG ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00038
밤새 굶긴 수컷 위스타 래트에서 본 화합물의 경구 효과는 하기 도 2a 및 도 2b에서 주어진다.
본 인슐린을 17-((S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)에톡시]에틸카르바모일}메톡시)에톡시]에틸-카르바모일}프로필카르바모일)헵탄데칸산 tert-부틸 에스테르 (또 다른 명칭 tert-부틸 옥타데칸디오일-Glu(OEG-OEG-OSu)-OtBU)로부터 출발하여 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다.
LC-MS (전기분무) m/z 1596 (M+4). 계산치: 1596.
본 발명의 제조를 위한 구성요소를 하기에 설명하는 바와 같이 제조하였다:
Figure pct00039
출발 수지: 2-클로로트리틸 수지, 1.60 mmol/g
1.O g의 수지를 DCM(10 ml)에서 30분 동안 팽창시켰다.
1. Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산에 의한 아실화:
O.39 g (O.63 eq, 1.0 mmol)의 Fmoc-8-아미노-3,6 디옥사옥탄산(Fmoc-OEG-OH)을 DCM(15ml)에 용해하였고 수지에 첨가하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA) (0.44 ml, 2.5 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 볼텍싱한 다음 메탄올(2ml)을 첨가하였고 혼합물을 추가 15분 동안 볼텍싱하였다. 수지를 여과하였고 NMP (2x8 ml) 및 DCM (8x8 ml)으로 세척하였다
20% 피페리딘/NMP (8 ml)을 첨가하였고, 10분 방치하였고, 한 번 반복하였다. NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml), 및 NMP (5x8 ml)로 여과 및 세척하였다. 포지티브 TNBS 테스트로 붉은색 수지를 얻었다.
2. Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산에 의한 아실화
0.78 g (2 eq, 2.0 mmol)의 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산을 NMP/DCM 1:1 (10 ml)에 용해하였다. 0.28g (2.2eq, 2.4mmol)의 HOSu를 첨가한 후 0.37 ml (2.2 eq, 2.4 mmol)의 DIC를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 두었고 그 후 수지에 첨가하였고 최종적으로 0.407 ml (2.2 eq)의 DIEA를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 볼텍싱하였고, 여과하고 NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml), 및 NMP (5x8 ml)로 세척하였다. 포지티브 TNBS 시험으로 무색의 수지를 제공하였다.
20% 피페리딘/NMP (10ml)을 첨가하였고, 10분 동안 두고, 한번 반복하였다. 여과하였고 NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml), 및 NMP (5x8 ml)로 세척하였다. 포지티브 TNBS 시험으로 붉은색의 수지를 제공하였다.
Fmoc-Glu-OtBu로 아실화
0.86 g (2 eq, 2.0 mmol)의 Fmoc-Glu-OtBu를 NMP/DCM 1:1 (10 ml)에 용해하였다. 0.32g (2.2 eq, 2.4 mmol)의 HOBT를 첨가한 후 0.37 ml (2.2 eq, 2.4 mmol)의 DIC를 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 두었고 그 후 수지에 옮기고 최종적으로 0.407 ml (2.2 eq)의 DIEA를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 볼텍싱하였고, 여과하고 NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml), 및 NMP (5x8 ml)으로 세척하였다. 포지티브 TNBS 시험으로 무색의 수지를 제공하였다.
20% 피페리딘/NMP (10ml)를 첨가하였고, 10분 동안 두었고, 한번 반복하였다. 여과하고 NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml), 및 NMP (5x8 ml)로 세척하였다. 포지티브 TNBS 시험으로 붉은색의 수지를 제공하였다.
옥타데칸디온산 모노 tert-부틸 에스테르에 의한 아실화
0.75 g (2eq, 2.Ommol) 옥탄데칸디온산 모노 tert-부틸 에스테르를 NMP/DCM 1:1 (10 ml)에 용해하였다. 0.32g (2.2eq, 2.4mmol) HOBT를 첨가한 후 0.37 ml (2.2 eq, 2.4 mmol)의 DIC를 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 두었고 그 후 수지에 옮기고 최종적으로 0.41 ml (2.2 eq)의 DIEA를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 볼텍싱하였고, 여과하고 NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml), 및 NMP (5x8 ml)로 세척하였다.
TFA로 분해
8 ml의 5% TFA/DCM를 수지에 첨가하였고 반응 혼합물을 2시간 동안 볼텍싱하였고, 여과하고 여액을 수집하였다. 더 많은 5% TFA/DCM (8 ml)를 수지에 첨가하였고, 혼합물을 10분 동안 볼텍싱하였고, 여과하고, 수지를 DCM (2x10 ml)으로 세척하였다. 합한 여액 및 세척물을 약 800 ul의 DIEA를 사용하여 염기성으로 pH 조절하였다. 혼합물을 진공에서 증발시켜 오일(3.5g)을 얻었다. 디에틸에테르(30ml)를첨가하였고 용해되지 않은 오일을 디켄팅에 의해 분리하였고 진공에서 증발시켰다. 이것으로 1.1 g의 오일로서 17-{(S)-1-tert-부톡시-카르보닐-3-[2-(2-{[2-(2-카르복시메톡시에톡시)에틸카르바모일]메톡시}에톡시)에틸카르바모일]프로필-카르바모일}헵타데칸산 tert-부틸 에스테르 (또 다른 명칭: tert-부틸 옥타데칸디오일-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU)를 얻었다.
LC-MS (Sciex100 API) m/z = 846.6 (M+1)+
OSu-활성화:
상기 tert-부틸 옥타데칸디오일-Glu(OEG-OEG-OH)-OtBU (0.63 g)를 THF (35 ml)에 용해하였다. DIEA (0.255 ml, 2 eq)를 첨가한 후 TSTU (0.45 g, 2 eq )를 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (250 ml) 및 수성 NaHSO4 (3 x 100 ml) 사이로 나누었다. 유기층을 건조시키고 (MgSO4) 진공으로 농축하여 0.65 g의 17-((S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)-에톡시]에틸카르바모일}메톡시)에톡시]에틸카르바모일}프로필카르바모일)헵타데칸산 tert-부틸 에스테르 (또 다른 명칭 tert-부틸 옥타데칸디오일-Glu(OEG-OEG-OSu)-OtBu)를 오일로서 얻었다.
LC-MS m/z = 943.4 (M+1)
실시예 10, 일반 과정(A):
A14E, B25H, B29K(N ε 미리스틸 ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00040
이 인슐린을 1-테트라데칸오일-피롤리딘-2,5-디온으로부터 출발하여 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다.
MALDI-TOF MS: m/z = 5873.6. 계산치: 5872.9
실시예 11, 일반 과정(A) :
A14E, B25H, B29K(N ε 에이코산디오일 -γ Glu -γ Glu ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00041
이 인슐린을 (S)-2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)부티릴아미노]펜탄디온산 5-tert-부틸 에스테르 1-(2,5-디-옥소피롤리딘-1-일) 에스테르로부터 출발하여 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다.
MALDI-TOF MS: m/z = 6242.5. 계산치: 6245.2.
(S)-2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)부티릴-아미노]펜탄디온산 5-tert-부틸 에스테르 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르의 제조.
1. (S)-2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)부티릴아미노]-펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르
THF (100 ml) 중의 (S)-2-(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르 (WO 2005/012347에서 설명한 바와 유사하게 제조) (4.1 g)의 용액에 물 (20 ml) 중의 H-Glu-OtBu (1.47 g)의 용액을 첨가하였다. pH를 DIPEA에 의해 8로 조절하였다. 혼합물을 1.5시간 동안 교반 후 농축하였다. 잔여물을 DCM으로부터 재결정화하여 백색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다(2.81 g, 61 %).
LC-MS m/z = 769 (M+1)
(S)-2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)부티릴아미노]펜탄디온산 5-tert-부틸 에스테르 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르
아세토니트릴(80 ml) 중의 (S)-2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)부티릴-아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 (2.81 g)의 용액에 아세토니트릴 (20 ml) 중의 TSTU (1.32 g)의 용액을 첨가하였다. pH를 DIPEA에 의해 8로 조절하였다. 1.5시간 동안 교반 후, 혼합물을 농축하였다. 잔여물을 아세토니트릴로부터 재결정화하여 표제 화합물(1.7 g, 54%)을 제공하였다.
LC-MS. m/z = 866.4 (M+1).
실시예 12, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 4-([4-({19- 카르복시노나데칸오일아미노 } 메틸 )트랜스-시클로헥산-카르보닐]-γ Glu -γ Glu ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00042
이 인슐린을 2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-({4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산카르보닐}아미노)부티릴아미노]-펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르로부터 출발하여 상기 설명한 바와 유사하게 제조하였다.
LC-MS (전기분무): m/z: 6386 (M+1). 계산치: 6384
2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-({4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]-시클로헥산카르보닐}아미노)부티릴아미노]펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르의 제조.
1. 2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-({4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산카르보닐}아미노)부티릴아미노]펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르
THF (100 ml) 중의 2-({4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산카르보닐}-아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르 (5.0 g)의 용액에 물(25 ml) 중의 H-Glu-OtBu (1.36 g)의 용액을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 진공에서 농축하였다. 잔여물을 물로부터 침전시켰고 여과하였고 진공에서 건조시켜 표제 화합물을 제공하였다(4.63 g, 84%)
LC-MS m/z = 740 (M-3x56, 3xt-Bu의 손실)
2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-({4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]시클로헥산-카르보닐}아미노)부티릴아미노]펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르
THF (150 ml) 중의 2-[4-tert-부톡시카르보닐-4-({4-[(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)메틸]-시클로헥산카르보닐}아미노)부티릴아미노]펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 (4.6 g)의 용액에 TSTU (1.68 g)를 첨가하였다. DIPEA (0.97 ml)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 진공에서 농축하였다. 잔여물을 아세토니트릴로부터 결정화하여 고체로서 표제 화합물을 얻었다(4.4 g, 87%)
LC-MS m/z = 837 (M-3x56, 3xt-Bu의 손실)
실시예 13, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 옥타데칸디오일 -γ Glu -γ Glu ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00043
밤새 굶긴 수컷 위스타 래트에서 본 화합물의 경구 효과는 하기 도 7에서 주어진다.
LC-MS: m/z = 1555 (M+4)/4.
실시예 14, 일반 과정(A):
A14E, B28D, B29K(N ε 옥타데칸디오일 -γ Glu ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00044
MALDI-TOF MS: m/z = 6118
실시예 15, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 옥타데칸디오일 -γ Glu - PEG7 ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00045
MALDI-TOF MS m/z = 6510
실시예 16, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 에이코산디오일 -γ Glu - OEG - OEG ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00046
밤새 굶긴 수컷 위스타 래트에서 본 화합물의 경구 효과는 하기 도 3에서 주어진다.
MALDI-TOF MS: m/z = 6407
이 실시예에 대한 중간체 아실화 시약을 하기에서 설명하는 바와 같이 제조하였다:
단계 1 : 19-{(S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-[2-(2-{[2-(2-카르복시메톡시-에톡시)-에틸카르바모일]-메톡시}-에톡시)-에틸카르바모일]-프로필카르바모일}-노나데칸산 tert-부틸 에스테르
Figure pct00047
에탄올 (40 ml) 중의 2-(19-tert-부톡시카르보닐노나데칸오일아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르 (2.50 g, (WO 2005/012347에서 설명하는 바와 유사하게 제조) 및 [2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세트산 (1.47 g, 또 다른 명칭 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 다이머, IRIS Biotech GmbH, Cat No PEG1221)의 용액에 DIPEA (1.26 ml)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였고 그 후 진공에서 농축하였다. 잔여물에 수성 0.1 N HCl (150 ml) 및 에틸 아세테이트 (200 ml)를 첨가하였다. 층을 분리하였고, 수층을 에틸아세테이트(100 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하였고, 건조시키고(황산 마그네슘), 진공에서 농축하여 오일을 제공하여, 이를 그대로 두어서 결정화하였다. 수율 96% (3.1 g) LC-MS (전기분무) m/z = 874.49
단계 2: 19-((S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)-에톡시]에틸카르바모일}메톡시)에톡시]에틸카르바모일}프로필카르바모일)노나데칸산 tert-부틸 에스테르
Figure pct00048
아세토니트릴 (50 ml) 중의 19-{(S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-[2-(2-{[2-(2-카르복시메톡시에톡시)에틸카르바모일]-메톡시}에톡시)에틸카르바모일]프로필카르바모일}노나데칸산 tert-부틸 에스테르 (3.1 g)의 용액에 TSTU (1.39 g) 및 DIPEA (0.91 ml)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였고 그 후 진공에서 농축하였다. 잔여물에 수성 0.1 N HCl (100 ml) 및 에틸 아세테이트 (200 ml)를 첨가하였다. 층을 분리하였고 수층을 에틸 아세테이트 (50 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하였고, 건조시키고(황산 마그네슘) 진공에서 농축하여 오일을 제공하였다. 수율 99% (3.4 g). LC-MS (전기분무). m/z. 971.8.
단계 3: 19-((S)-1-카르복시-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)에톡시]에틸-카르바모일}메톡시)에톡시]에틸카르바모일}프로필카르바모일)노나데칸산:
Figure pct00049
19-((S)-1-tert-부톡시카르보닐-3{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)에톡시]에틸-카르바모일}메톡시)에톡시]에틸카르바모일}프로필카르바모일)노나데칸산 tert-부틸 에스테르 (3.4 g)를 TFA (75 ml) 중에서 45분 동안 교반하였고 그 후 진공에서 농축하였다. 잔여물을 3회 톨루엔으로 농축하여 고체를 얻었다. 잔여물을 2-프로판올 중에서 결정화하였고 여과하여 백색의 결정질 화합물을 제공하였다. 수율 80% (2.4 g). LC-MS (전기분무): m/z: 859.44.
옥타데칸디온산 분획(실시예 26 및 다른 실시예에서 사용함)과 함께 유사한 아실화 시약을 유사하게 제조할 수 있다.
실시예 17, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 에이코산디오일 -γ Glu -(3-(2-{2-[2-(2- 아미노에톡시 ) 에톡시 ] 에톡시 } 에톡시 )- 프로피오닐 -γ Glu ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00050
ES-MS: m/z = 1626 (M+4)
실시예 18, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 헥사데칸디오일 -γ Glu - OEG - OEG ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00051
MALDI-TOF MS m/z = 6348
실시예 19, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00052
MALDI-TOF MS m/z = 6062
실시예 20, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 헵타데칸디오일 - γ Glu - OEG - OEG ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00053
ES-MS m/z = 1592 (M+4)
실시예 21, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00054
ES-MS: m/z = 1620 (M+4)
중간체 아실화 시약 옥타데칸디오일-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-OSu (남은 카르복실산 상의 보호기로서 tert-부틸 에스테르와 함께)를 하기에서 설명하는 바와 같이 제조하였다:
옥타데칸디온산 tert -부틸 에스테르 2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일 에스테르
Figure pct00055
옥타데칸디온산 모노-tert-부틸 에스테르 (4.2 g, 0.011 mol)를 THF (2OmL) 중에서 용해하였고, 아세토니트릴(20 mL) 중의 TSTU (4 g, 0.013 mol)를 첨가하였고 용액의 pH를 DIPEA의 적가로 8로 조절하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, HCl (2M)로 pH 3으로 산성화하고 진공에서 증발시켰다. 잔여 오일을 이후에 에틸 아세테이트 및 HCl (0.1 M) 사이로 나누었다. 유기층을 건조시키고(MgSO4), 여과하였고 진공에서 증발건조시켰다. 이것으로 5.2 g의 옥타데칸디온산 tert-부틸 에스테르 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 에스테르를 오일로서 얻었고, 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용할 수 있었다. LC-MS (전기분무) m/z = 468 (M+1) 및 412 (M+1 - tBu)
(S)-2-(17- tert - 부톡사르보닐헵타데칸오일아미노 )- 펜탄디온산 1- tert -부틸 에스테르 .
Figure pct00056
옥타데칸디온산 tert-부틸 에스테르 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 에스테르 (7 g, 0.015 mol)를 THF (80 mL) 중에 용해하였고 Na2CO3 (0.1 M, 40 mL) 중의 H-Glu-O1Bu (3.7 g, 0.0165 mol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, HCl (2M)로 pH 3으로 산성화하였고 진공에서 증발시켰다. 잔여물을 에틸 아세테이트 및 HCl (0.1 M) 사이에서 나누었다. 유기층을 건조시키고 (MgSO4), 여과하였고 진공에서 증발건조시켰다. 백색 침전물의 형성을 야기한 아세토니트릴(30 mL)을 첨가하고, 여과에 의해 분리하였고, 건조시켜 3.75 g의 (S)-2-(17-tert-부톡사르보닐헵타데칸오일아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르를 얻었다. LC-MS (전기분무) m/z = 556 (M+1).
아세토니트릴 여액의 증발로 추가 2.6g의 생성물을 분리하였다.
(S)-2-(17- tert - 부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노 ) 펜탄디온산 1- tert -부틸 에스테르 5-(2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 에스테르
Figure pct00057
(S)-2-(17-tert-부톡사르보닐헵타데칸오일아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 (3g, 0.005 mol)를 THF (100 mL) 중에서 용해하였고 아세토니트릴(30 mL) 중의 TSTU (1.78 g, 0 006 mol)의 용액에 첨가하였다. pH를 DIPEA의 적가로 8로 조절하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, HCl (2M)로 pH 3까지 산성화하였고 진공에서 증발시켰다. 잔여 오일을 이후에 에틸 아세테이트 및 HCl (0.1 M) 사이에서 나누었다. 유기층을 건조시키고(MgSO4), 여과하였고 진공에서 증발시켜 건조시켰다. 이것으로 백색 고체(2.75 g)의 (S)-2-(17-tert-부톡시카르보닐-헵타데칸오일아미노)-펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르를 얻었다. LCMS (전기분무) m/z = 653 (M+1)
(S)-2-[(S)-4- tert - 부톡시카르보닐 -4-(17- tert - 부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노 ) 부티릴아미노 ]- 펜탄디온산 1- tert -부틸 에스테르
Figure pct00058
(S)-2-tert-부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 에스테르 (0.5 g, 0.766 mmol)를 아세토니트릴(20 mL) 중에서 용해하였다. 이 용액을 아세토니트릴(20 mL)에 용해하였다. 이 용액을 물(30 mL) 중의 H-Glu-OtBu (0 171g, 0 84 mmol)의 용액에 첨가하였다. pH를 DIPEA에 의해 10으로 조절하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 다음, HCl (2M)로 pH 7로 산성화하였고 진공에서 증발시켰다. 잔여물을 에틸 아세테이트 및 HCl (0.1 M) 사이에서 나누었다. 유기층을 건조시켰고(MgSO4), 여과하였고, 진공에서 증발시켜 건조시켰다. 이것으로 (S)-2-[(S)-4-tert-부톡시-카르보닐-4-(17-tert-부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노)부티릴아미노]펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르를 오일로서 얻었다.
LC-MS (전기분무): m/z = 741 (M+1).
(S)-2-[(S)-4- tert - 부톡시카르보닐 -4-(17- tert - 부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노 ) 부티릴아미노 ]- 펜탄디온산 5- tert -부틸 에스테르 1-(2.5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 에스테르
Figure pct00059
(S)-2-[(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-(17-tert-부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노)부티릴아미노]-펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 (8g, 10.79 mmol)를 아세토니트릴(40 mL) 중에서 용해하였고 아세토니트릴(40mL) 중의 TSTU (3.89 g, 12.95 mmol)의 용액을 첨가하였다. pH를 DIPEA의 적가로 8로 조절하였다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반한 후, HCl (2M)에 의해 pH 3으로 산성화하였고 진공에서 증발시켰다. 이것으로 오일을 제공하였고, 이후에 에틸아세테이트와 HCl(0.1 M) 사이에서 나누었다. 유기층을 건조시켰고(MgSO4), 여과하였고 진공에서 증발건조시켰다. 이것으로 8.2 g의 (S)-2-[(S)-4- tert - 부톡시카르보닐 -4-(17- tert - 부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노 )- 부티릴아미노 ) 펜탄디온산 5- tert -부틸 에스테르 1-(2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 에스테르를 고체로서 얻었다.
(S)-2-{(S)-4- tert - 부톡시카르보닐 -4-[(S)-4- tert - 부톡시카르보닐 -4-(17-tert-부 톡시카르 보닐- 헵타데칸오일아미노 ) 부티릴아미노 ] 부티릴아미노 } 펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르
Figure pct00060
(S)-2-[(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-(17-tert-부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노)부티릴아미노]-펜탄디온산 5-tert-부틸 에스테르 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르 (4g, 4.77 mmol)을 아세토니트릴(30mL) 중에서 용해하였고 Na2CO3 (0.1 M, 20 mL) 중의 H-Glu-OtBu (1.07 g, 5.25 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반한 다음, HCl (2M)에 의해 pH 7로 중화하였고 진공에서 증발시켰다. 잔여 오일을 이후에 에틸 아세테이트 및 HCl (0.1 M) 사이로 나누었다. 유기층을 건조시키고(MgSO4), 여과하였고 진공에서 여과하였다. 잔여물(4 g)을 아세토니트릴 중에 용해하였고 활성탄소로 처리하였다. 여과 및 건조증발 후 진공에서 밤새 건조하여, 2.8 g의 (S)-2-((S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-[(S)-4-tert-부톡시-카르보닐-4-(17-tert-부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노)부티릴아미노]부티릴아미노}-펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르를 결정질 고체로서 얻었다. LC-MS (전기분무): m/z = 927 (M+1).
(S)-2-((S)-4- tert - 부톡시카르보닐 -4-{(S)-4- tert - 부톡시카르보닐 -4-[(S)-4-tert-부 톡시카르 보닐-4-(17- tert - 부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노 ) 부티릴아미노 ]부티릴아미노] 부티릴아미노 )- 펜탄디온산 1- tert -부틸 에스테르
Figure pct00061
(S)-2-{(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-[(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-(17-tert-부톡시카르보닐헵타데칸오일-아미노)부티릴아미노]부티릴아미노}펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 (2.8 g, 3.02 mmol)를 상기 설명한 바와 동일한 방법을 사용하여 TSTU (1.0 g, 3.325 mmol)로 활성화하였고, 미정제 (S)-2-{(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-[(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-(17-tert-부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노)-부티릴아미노]부티릴아미노}-펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 에스테르를 제공하였다. LC-MS (전기분무): m/z = 1024 (M+1)
1.3 g의 이 화합물을 아세토니트릴(40 mL)에 용해하였고 물(30 mL) 중의 H-Glu-OtBu (0.28 g, 1.39 mmol)의 용액에 첨가하였고, pH를 DIPEA에 의해 9.3으로 조절하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, HCl (2M)에 의해 pH 7로 중화하였고 그 후 진공에서 증발시켜 거의 건조시켰다. 잔여물을 물로 처리하여 백색 침전물을 제공하였고, 이를 여과하였다. 진공에서 밤새 건조시킨 후, 1.1 g의 (S)-2-((S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-{(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-[(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-[(S)-4-tert-부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노}부티릴아미노]부티릴아미노}부티릴아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르를 분리하였고, 부수적 양의 출발 물질을 함유하였다. LC-MS (전기분무) m/z = 1111.9 (M+1)
(S)-2-((S)-4- tert - 부톡시카르보닐 -4-{(S)-4- tert - 부톡시카르보닐 -4-[(S)-4-tert-부 톡시카르 보닐-4-(17- tert - 부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노 ) 부티릴아미노 ]부티릴아미노} 부티릴아미노 )- 펜탄디온산 1- tert - 부틸에스테르 -5-(2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 에스테르
Figure pct00062
(S)-2-((S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-{(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-[(S)-4-tert-부톡시카르보닐-4-(17-tert-부톡시카르보닐헵타데칸오일아미노)부티릴아미노]부티릴아미노}부티릴아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 (0.1g, 0.09 mmol)를 활성화를 위한 동일한 방법을 사용하여 1시간 동안 실온에서 아세토니트릴 용액 중의 TSTU (29.8 mg, O.099 mmol)로 활성화하였고, 상기 설명한 바와 같이 워크업하였다. 이것으로 추가 정제 없이 인슐린 아실화를 위해 사용될 수 있는 100mg 미정제 활성화된 생성물을 얻었다. LC-MS (전기분무) m/z = 1208 (M+1)
실시예 22, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00063
MALDI-TOF MS: m/z = 6373
실시예 23, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B27E, B29K(N ε 옥타데칸디오일 - γ Glu - OEG - OEG ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00064
MALDI-TOF MS: m/z = 6407
실시예 24, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00065
밤새 굶긴 수컷 위스타 래트에서 본 화합물의 경구 효과는 하기 도 6에서 주어진다.
MALDI-TOF MS: m/z = 6188
실시예 25, 일반 과정 (A):
A14E, B16H, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00066
밤새 굶긴 수컷 위스타 래트에서 본 화합물의 경구 효과는 하기 도 4에서 주어진다.
MALDI-TOF MS m/z = 6352
실시예 26, 일반 과정 (A):
A14E, B16E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00067
MALDI-TOF MS: m/z = 6345
실시예 27, 일반 과정 (A):
A14E, B16H, B25H, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00068
밤새 굶긴 수컷 위스타 래트에서 본 화합물의 경구 효과는 하기 도 5에서 주어진다.
MALDI-TOF MS: m/z = 6041
실시예 28, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00069
ES-MS: m/z = 1598 (M+4)
실시예 29, 일반 과정 (A):
A14E, B16E, B25H, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00070
MALDI-TOF MS: m/z = 6028
실시예 30, 일반 과정 (A):
A14E, B16H, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00071
ES-MS: m/z = 1581 (M+4)
실시예 31, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00072
ES-MS: m/z = 1484 (M+4)
실시예 32, 일반 과정 (A):
A14E, B16H, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00073
ES-MS: m/z = 1548 (M+4)
실시예 33, 일반 과정 (A):
A14E, B16H, B25H, B29K(N(엡스)에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00074
ES-MS- m/z= 1596 (M+4)
실시예 34, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-OEG-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00075
ES-MS: m/z = 1592 (M+4)
실시예 35, 일반 과정 (A):
A14E, A18L, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00076
MALDI-TOF MS: m/z = 6405
실시예 36, 일반 과정 (A):
A14E, A18L, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00077
MALDI-TOF MS: m/z = 6377
실시예 37, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00078
MALDI-TOF MS m/z = 6433
실시예 38, 일반 과정 (A):
A1G(Nα옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린
Figure pct00079
A14E, B25H, B29R, desB30 인슐린 (500 mg 88 μmol)을 O.1 M NaHCO3, pH 8 (5 mL) 중에 용해하였다. ω-카르복시헵타데칸오일-γ-L-글루타밀-OEG-OEG-OSu (65 mg, 88 μmol)를 THF/MeCN 1:1 (5 mL)에 용해하였고 인슐린 용액에 첨가하였다. 30분 후, 반응을 2M 수성 메틸아민(0.5 mL)의 첨가로 퀀칭하였다. 용매를 진공에서 증발시켰고, 고체를 소량의 물/MeCN에 재용해하였다. 주요 생성물 피크를 C18 컬럼 상에서, 완충제 A: 물 중의 0.1 % TFA, 완충제 B: MeCN 중의 0.1% TFA, 기울기 30-55 % 완충제 B로 45분에 걸쳐 RP-HPLC의 사용에 의해 분리하였다. 생성물 분획을 진공에서 부분적으로 증발시켰고 냉동건조시켜 59 mg 생성물 (10 %)을 제공하였다. LC-MS 분석: M4 + = 1602.7, 계산치: 1602.6. 두 단계의 표준 아미노산 서열 분석은 A1에서 아실화를 확인하는 F-V을 나타내었다.
실시예 39, 일반 과정 (A):
A14E, B1F(Nα옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), B25H, B29R, desB30 인간 인슐린
Figure pct00080
이 화합물을 상기 실시예(실시예 38)로부터 부산물로서 분리하였다. LCMS 분석 M4 + = 1602.5, 계산치 1602.6. 두 단계의 표준 아미노산 서열 분석은 B1에서 아실화를 확인하는 G-I를 나타내었다.
실시예 40, 일반 과정 (A):
A1G(Nα헥사데칸디오일-γGlu), A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린
Figure pct00081
ES-MS: m/z = 1523 (M+4)
이 화합물을 아실화 시약으로서 ω-카르복시펜타데칸오일-γ-L-글루타밀(OSu)을 사용하여 상기(실시예 38) 설명한 A1-아실화와 유사하게 제조하였다. 생성물은 LCMS를 나타내었다: M4 + = 1523.2, 계산치 1523.0. 두 단계의 표준 아미노산 서열 분석은 A1에서 아실화를 확인하는 F-V를 나타내었다.
실시예 41, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-Abu-Abu-Abu-Abu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00082
ES-MS: m/z = 1286 (M+5)
본 실시예를 위한 아실화 시약을, 2-클로로트리틸 수지에 Fmoc 보호된 4-아미노부티르산의 부착으로 출발한 후 탈보호 및 3 Fmoc 보호된 4-아미노부티르산, 실시예 9에 설명된 바와 같이 Fmoc-Glu-OtBu 및 옥타데칸디온산 모노 tert-부틸 에스테르의 순차적 부착으로 실시예 9에서 제조한 시약과 유사하게 제조하였다.
실시예 42, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nα에이코산디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00083
MALDI-TOF-MS m/z = 5987
실시예 43, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nα4-[16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데칸오일술파모일]부탄오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00084
ES-MS m/z = 1530 (M+4)
중간체 아실화 시약의 제조:
Figure pct00085
4-[16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데칸오일술파모일]부탄산(500 mg, WO 2006/005667에서 설명한 바와 같이 제조)을 에탄올(20 ml) 중에서 용해하였고, TSTU (381 mg), 및 DIPEA (542 μl)를 첨가하였고 결과 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축하였고, 잔여물을 0.25M HCl과 함께 교반하였다. 고체를 여과에 의해 분리하였고, 물로 세척하고 진공에서 건조시켜 580 mg (91%)의 아실화 시약을 얻었다.
아실화 반응:
A14E, B25H, desB30 인간 인슐린 (500 mg)을 0.1M 수성 탄산나트륨(10 mL) 및 에탄올(4mL) 중에서 용해하였다. pH를 1 N NaOH에 의해 10.8로 조절하였다. 상기 아실화 시약을 THF (2mL) 중에서 용해하였고 에탄올 (2 mL)을 10분 간격으로 2부분으로 첨가하였다. 결과 혼합물을 1시간 동안 서서히 교반하였고 물(50mL)로 희석하였다. 결과 인슐린을 pH 5.5까지 1 N HCl의 첨가에 의해 침전시켰다. 침전물을 원심분리에 의해 분리하였고 HPLC로써 정제하였다. 순수한 분획을 풀링하였고 동결건조하였다.
실시예 44, 일반 과정 (A):
A1G(Nα옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), A14E, A21G, B25H, desB30 인간 인슐린
Figure pct00086
MALDI-TOF-MS m/z = 6321
실시예 45, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00087
MALDI-TOF-MS: m/z = 6130
실시예 46, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B27K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB28, desB29, desB30 인간 인슐린
Figure pct00088
MALDI-TOF-MS: m/z = 6181
실시예 47, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε(5-에이코산디오일아미노이소프탈산)), desB30 인간 인슐린
Figure pct00089
MALDI-TOF-MS: m/z = 6150
실시예 48, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00090
MALDI-TOF-MS m/z = 5959
실시예 49, 일반 과정 (A):
A14E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00091
ES-MS: m/z = 1598 (M+4)
실시예 50, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00092
MALDI-TOF-MS: m/z = 6216
실시예 51, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00093
ES-MS m/z = 1559 (M+4)
실시예 52, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00094
MALDI-TOF-MS m/z = 6278
실시예 53, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-Aoc), desB30 인간 인슐린
Figure pct00095
MALDI-TOF-MS: m/z = 6126
실시예 54, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00096
ES-MS: m/z = 6055 (디콘볼루션됨)
실시예 55, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00097
ES-MS: m/z = 6220 (디콘볼루션됨)
실시예 56, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00098
MALDI-TOF-MS: m/z = 6101
실시예 57, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00099
MALDI-TOF-MS m/z = 6277
실시예 58, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B16H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00100
ES-MS: m/z = 1516 (M+4)
실시예 59, 일반 과정 (A):
A1G(Nα옥타데칸디오일), A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린
Figure pct00101
ES-MS m/z = 1498 (M+4)
실시예 60, 일반 과정 (A):
A14E, B16H, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00102
ES-MS m/z = 1523 (M+4)
실시예 61, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B27K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB28, desB29, desB30 인간 인슐린
Figure pct00103
MALDI-TOF MS: m/z = 6208
실시예 62, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00104
ES-MS: m/z = 1587(M+4)
하기 실시예에서 본 발명의 아실화된 인슐린은 유사하게 제조될 수 있다:
실시예 63, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00105
실시예 64, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00106
실시예 65, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00107
실시예 66, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00108
실시예 67, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε도코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00109
실시예 68, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε도코산디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00110
실시예 69, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε아이코산디오일-γGlu-OEG-OEG-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00111
실시예 70, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG-yGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00112
실시예 71, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε(N-아이코산디오일-N-카르복시메틸)-βAla), desB30 인간 인슐린
Figure pct00113
실시예 72, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε3-[2-(2-{2-[2-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)에톡시]에톡시}에톡시)-에톡시]프로피오닐-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00114
실시예 73, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε3-[2-(2-{2-[2-(19-카르복시노나데칸오일아미노)에톡시]에톡시}에톡시)-에톡시]프로피오닐-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00115
실시예 74, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)-프로피오닐), desB30 인간 인슐린
Figure pct00116
실시예 75, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)-프로피오닐-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00117
실시예 76, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε아이코산디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)-프로피오닐), desB30 인간 인슐린
Figure pct00118
실시예 77, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε4-([4-({17-카르복시노나데칸오일아미노}메틸)트랜스-시클로헥산-카르보닐]-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00119
실시예 78, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε4-([4-({17-카르복시헵타데칸오일아미노}메틸)트랜스-시클로헥산-카르보닐]-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00120
실시예 79, 일반 과정 (A):
A14E, B28D, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00121
실시예 80, 일반 과정 (A):
A14E, B28D, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00122
실시예 81, 일반 과정 (A):
A14E, B28D, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00123
실시예 82, 일반 과정 (A):
A14E, B28D, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00124
실시예 83, 일반 과정 (A):
A14E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00125
실시예 84, 일반 과정 (A):
A14E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00126
실시예 85, 일반 과정 (A):
A14E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-yGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00127
실시예 86, 일반 과정 (A):
A14E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00128
실시예 87, 일반 과정 (A):
A14E, B28E, B29K(Nε 에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00129
실시예 88, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B28E, B29K(Nε 헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00130
실시예 89, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00131
실시예 90, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00132
실시예 91, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00133
실시예 92, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B28E, B29K(N ε 옥타데칸디오일 -γ Glu - OEG - OEG ), desB30 인간 인슐린
Figure pct00134
실시예 93, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00135
실시예 94, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00136
실시예 95, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00137
실시예 96, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00138
실시예 97, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00139
실시예 98, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00140
실시예 99, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00141
실시예 100, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00142
실시예 101, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00143
실시예 102, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00144
실시예 103, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00145
실시예 104, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00146
실시예 105, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00147
실시예 106, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00148
실시예 107, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00149
실시예 108, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00150
실시예 109, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00151
실시예 110, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00152
실시예 111, 일반 과정 (A):
A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00153
실시예 112, 일반 과정 (A):
A14E, B28D, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00154
실시예 113, 일반 과정 (A):
A14E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00155
실시예 114, 일반 과정 (A):
B25N, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00156
실시예 115, 일반 과정 (A):
B25N, B27E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00157
실시예 116, 일반 과정 (A):
B25N, B27E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00158
실시예 117, 일반 과정 (A):
B25N, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00159
실시예 118, 일반 과정 (A):
B25N, B27E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00160
실시예 119, 일반 과정 (A):
B25N, B27E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00161
실시예 120, 일반 과정 (A):
A8H, B25N, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00162
실시예 121, 일반 과정 (A):
A8H, B25N, B27E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00163
실시예 122, 일반 과정 (A):
A8H, B25N, B27E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00164
실시예 123, 일반 과정 (A):
A8H, B25N, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00165
실시예 124, 일반 과정 (A):
A8H, B25N, B27E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00166
실시예 125, 일반 과정 (A):
A8H, B25N, B27E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00167
실시예 126, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε(N-아이코산디오일-N-카르복시메틸)-βAla-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00168
실시예 127, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε(N-옥타데칸디오일-N-카르복시메틸)-βAla-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00169
실시예 128, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε(N-헥사데칸디오일-N-카르복시메틸)-βAla-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00170
실시예 129, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(N ε 옥타데칸디오일 - vGlu -2-[(3- f2 -[2-(3- 아미노프로폭시 )에톡시] 에톡시 }프로필- 카르바모일 ) 메톡시 ]아세틸), desB30 인간 인슐린
Figure pct00171
[(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필카르바모일)메톡시]아세트산을 설면한 바와 같이 제조할 수 있고(Eur . J. Med Chem 2007, 42, 114) ω-(tert-부틸-카르복시헵타데칸오일-γ-L-글루타밀(OSu)-OtBu)와 반응시켰다. 생성물을 TSTU를 사용하여 활성화할 수 있고 pH 10.5에서 0.1 M Na2CO3 중의 A14E, B25H, desB30 인간 인슐린과 커플링하여 생성물을 제공하였다.
실시예 130, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필-카르바모일)메톡시]아세틸), desB30 인간 인슐린
Figure pct00172
[(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필카르바모일)메톡시]아세트산을 설명한 바와 같이 제조할 수 있고(Eur . J. Med Chem 2007, 42, 114) ω-(tert-부틸-카르복시노나데칸오일-γ-L-글루타밀(OSu)-OtBu과 반응시켰다. 생성물을 TSTU를 사용하여 활성화할 수 있고 pH 10.5에서 0.1 M Na2CO3 중의 A14E, B25H, desB30 인간 인슐린과 커플링하여 생성물을 제공하였다.
실시예 131, 일반 과정 (A):
A14E, B16H, B25H, B29K(N ε 옥타데칸디오일 -γ Glu -2-[(3-(2-[2-(3- 아미노프로폭시 ) 에톡시 ] 에톡시 )프로필- 카르바모일 ) 메톡시 ]아세틸), desB30 인간 인슐린
Figure pct00173
[(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필카르바모일)메톡시]아세트산을 설명한 바와 같이 제조할 수 있고(Eur . J. Med Chem 2007, 42, 114) ω-(tert-부틸-카르복시헵타데칸오일-γ-L-글루타밀(OSu)-OtBu과 반응시켰다. 생성물을 TSTU를 사용하여 활성화할 수 있고 pH 10.5에서 0.1 M Na2CO3 중의 A14E, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린과 커플링하여 생성물을 제공하였다.
실시예 132, 일반 과정 (A):
A14E, B16H, B25H, B29K(N ε 에이코산디오일 -γ Glu -2-[(3-{2-[2-(3- 아미노프 로폭시) 에톡시 ] 에톡시 )프로필- 카르바모일 ) 메톡시 ]아세틸), desB30 인간 인슐린
Figure pct00174
[(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필카르바모일)메톡시]아세트산을 설명한 바와 같이 제조할 수 있고(Eur . J. Med . Chem . 2007, 42, 114) ω-(tert-부틸-카르복시노나데칸오일-γ-L-글루타밀(OSu)-OtBu와 반응시켰다. 생성물을 TSTU를 사용하여 활성화할 수 있고 pH 10.5에서 0.1 M Na2CO3 중의 A14E, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린과 커플링하여 생성물을 제공하였다.
실시예 133, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00175
실시예 134, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00176
실시예 135, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
실시예 136, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00178
실시예 137, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00179
실시예 138, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00180
실시예 139, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00181
실시예 140, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00182
실시예 141, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00183
실시예 142, 일반 과정 (A):
B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00184
실시예 143, 일반 과정 (A):
A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00185
실시예 144, 일반 과정 (A):
A21G, B25H, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00186
실시예 145, 일반 과정 (A):
A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00187
실시예 146, 일반 과정 (A):
A21G, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00188
실시예 147, 일반 과정 (A):
A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00189
실시예 148, 일반 과정 (A):
A21G, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00190
실시예 149, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00191
실시예 150, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00192
실시예 151, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00193
실시예 152, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00194
실시예 153, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00195
실시예 154, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00196
실시예 155, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00197
실시예 156, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00198
실시예 157, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00199
실시예 158, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00200
실시예 159, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00201
실시예 160, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00202
실시예 161, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린
Figure pct00203
실시예 162, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00204
실시예 163, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00205
실시예 164, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00206
실시예 165, 일반 과정 (A):
A14E, A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00207
실시예 166, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00208
실시예 167, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00209
실시예 168, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린
Figure pct00210
실시예 169, 일반 과정 (A):
A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린
Figure pct00211
실시예 170, 일반 과정 (A):
A1G(Nα옥타데칸디오일-γGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린
Figure pct00212
실시예 171, 일반 과정 (A):
A1G(Nα에이코산디오일-γGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린
Figure pct00213
실시예 172, 일반 과정 (A):
A1G(Nα옥타데칸디오일-γGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린
Figure pct00214
실시예 173, 일반 과정 (A):
A1G(Nα에이코산디오일-γGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린
Figure pct00215
실시예 174, 일반 과정 (A):
A1G(Nα옥타데칸디오일), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린
Figure pct00216
실시예 175, 일반 과정 (A):
A1G(Nα에이코산디오일), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린
Figure pct00217
실시예 176, 일반 과정 (A):
A1G(Nα옥타데칸디오일), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린
Figure pct00218
실시예 177, 일반 과정 (A):
A1G(Nα에이코산디오일), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린
Figure pct00219
실시예 178, 본 발명의 선택된 인슐린 유도체의 인슐린 수용체 친화도
인간 인슐린 수용체에 대해 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 친화도는 SPA 분석(Scintillation Proximity Assay) 마이크로타이터 플레이트 항체 포획 분석에 의해 결정한다. SPA-PVT 항체-결합 비드, 항-마우스 시약(Amersham Biosciences, Cat No PRNQ0017)을 25 ml의 결합 완충제(100 mM HEPES pH 7.8; 100 mM 염화나트륨, 10 mM MgSO4, 0.025% Tween-20)와 혼합한다. 단일 Packard Optiplate (Packard No. 6005190)에 대한 시약 혼합은 2.4 μl의 1:5000 희석 정제된 재조합 인간 인슐린 수용체(엑손 11이 있거나 또는 없음), 100 μl의 시약 혼합 당 5000 cpm에 대응하는 A14Tyr[125I]-인간 인슐린의 저장 용액의 양, 12 μl의 1:1000 희석의 F12 항체, 3 ml의 SPA-비드 및 결합 완충제로 전체 12ml로 구성된다. 전체 100 μl의 시약 혼합을 그 후 Packard Optiplate의 각 웰에 첨가하고 인슐린 유도체의 일련의 희석을 적절한 샘플로부터 Optiplate에서 만든다. 샘플을 그 후 16시간 동안 배양하는 한편 약하게 진탕시킨다. 층을 그 후 1분 동안 원심분리에 의해 분리하고 플레이트를 Topcounter에서 카운팅한다. 결합 데이터를 GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego CA)의 비선형 회귀 알고리즘을 사용하여 적합화하였고, 친화도는 인간 인슐린의 친화도에 대해 표현한다(백분율(%)).
관련 분석을 또한 사용하고, 여기서 결합 완충제는 또한 생리적 조건을 모방하기 위해 4.5% HSA를 함유한다.
본 발명의 선택된 인슐린의 인슐린 수용체 친화도
Figure pct00220
실시예 179. 본 발명의 인슐린 유도체의 소수성
인슐린 유도체의 소수성을 등용매 용리 조건 하에서 역상 HPLC 실행에 의해 발견한다. 인슐린 유도체의 용리 시간을 인간 인슐린 (본원에서 지정된 HI) 또는 동일 조건 하에서 공지된 소수성을 가지는 다른 유도체의 그것과 비교한다. 소수성, k'rel을 k'relderiv -((tderiv-t0)/(tref-t0))*k'relref 로서 계산한다. 참고로서 HI를 사용: k'relref = k'relHI = 1. HPLC 시스템의 빈시간, t0는 5 μl의 0.1 mM NaNO3를 주입함으로써 결정된다. 실행 조건:
컬럼: Lichrosorb RP-C18, 5μm, 4 x 250 mm
완충제 A: 0.1 M 인산나트륨 pH 7.3, 10 vol% CH3CN
완충제 B: 50 vol% CH3CN
주입 부피: 5 μl
실행 시간: 최대 60 분
처음 기울기를 실행한 후, 유도체 및 참고(예를 들어, HI)를 실행하기 위한 등용매 용리 수준을 선택하고, 등용매 용리 조건 하에서 유도체 및 참고의 용리 시간을 상기 식을 사용하여 k'relderiv를 계산하였다.
Figure pct00221
실시예 180, 래트에 인슐린 유도체의 폐 전달
프로토콜:
시험 물질을 방울 점적 방법에 의해 폐에 투여할 것이다. 간략하게, 수컷 위스타 래트(대략 250 g)를 6.6 ml/kg 피하주사 초회량 다음에 30분의 간격으로 3.3 ml/kg 피하주사의 3회 유지 용량으로서 주어진 대략 60 ml 펜타닐/디히드로덴즈페리돌/-도미컴으로 마취시킨다. 마취의 유발 10분 후, 기초 샘플을 꼬리 정맥으로부터 얻은 다음(t = -20 분) 기초 샘플을 시험 물질의 투여(t=0) 바로 전에 얻는다. t=0에서, 시험 물질을 한쪽의 폐 안으로 기도내로 투여한다. 둥근 단부를 가지는 특수 캐뉼라를 200 ul 공기 및 시험 물질(1 ml/kg)을 함유하는 주사기에 장착한다. 구멍을 통해, 캐뉼라를 기도에 삽입하고 주요 기관지 중 하나의 앞쪽으로 보낸다-단지 분기점을 통과한다. 삽입 동안, 기도내 위치를 확인하기 위해 외부로부터 목을 만져본다. 주사기의 내용물을 주사한 후 2초 멈춘다. 그 후에, 캐뉼라를 천천히 뒤로 당긴다. 시험 동안 래트를 마취된 채로 유지하고(4 또는 8시간을 위한 혈액 샘플) 실험 후 안락사시킨다.
도 8 및 9는 각각 유사한 것과 비교하여 본 발명의 인슐린의 기도내 점적으로부터 혈액 글루코오스 저하 효과 및 혈장 인슐린 농도(실시예 9), 외에 선행기술의 비-프로테아제 저항 인슐린(실시예 183)을 나타낸다.
실시예 181, 미니-돼지에 인슐린 유도체의 폐 전달
프로토콜:
돼지에 정맥주사 및 혈액 샘플링을 위한 중심정맥 카테터를 설치하였다. 돼지를 폐 실험 전, 즉, 투여 전날에 굶겼고, 오후 섭식으로부터 남은 음식을 섭식 후 대략 한 시간 후에 제거하였고, 투여일에, 돼지에게 먹이를 주지 않는다. 카테터의 효능을 식염수 첨가된 10 IU/ml 헤파린으로 실험 전 확인한다.
폐 투여 후, 글루코오스 용액을 저혈당증을 예방하기 위해 정맥주사를 위해 준비시켜야 하며, 즉, 4-5개의 주사기(20 ml)를 멸균 20 % 글루코오스로 채우고, 사용을 위한 준비를 한다. 저혈당증의 진단은 임상적 증상 및 글루코미터(Glucocard X-meter)에서 혈액 글루코오스 측정에 기초한다. 치료는 느린 정맥주사 50-100 ml 20% 글루코오스 (10-20 g 글루코오스)로 구성된다. 글루코오스는 효과까지 5-10분에 걸쳐 분획으로 주어진다.
돼지를 실험의 첫번째 부분 동안 굶겼지만(24시간 까지), 물에 대한 접근은 자유롭게 했다. 16시간 후 혈액 샘플 카테터를 5000 IU/ml 헤파린으로 채웠고, 주머니에 넣고 돼지를 방출하였다. 24시간 후, 혈액 샘플 돼지를 음식과 사과의 2배의 배급량으로 먹이를 준다. 돼지를 24시간 내지 48시간 굶기지 않는다.
화합물 및 폐 투여
폐 투여를 위한 분말
인슐린 분말을 실험 전 날 건조 분말 장치(PennCentury™ Model DP-4, 주문형 돼지 장치)의 8개의 개별 분말 챔버로 무게를 단다. 모든 챔버를 투여까지 온도 및 습도가 조절된 연구실에서 알루미늄 호일로 둘러싼 용기 내의 건조제 물질 상에서 그것들을 유지함으로써 빛 및 습도로부터 보호되도록 유지한다.
가장 최근의 개별 동물 체중에 기초하여, 전달 장치는 약간의 분말 체류가 예상되는 바와 같이 25 nmol/kg로 미리 설치하였다.
로딩 용량 = (분말의 중량 + (장치 및 분말의 중량 - 장치의 중량))/2
마취
Domitor ® Vet inj (메데토미데인 1 mg/ml), 0.15 ml/10 kg = 0.4 ml/돼지의 정맥주사에 의해, 돼지를 진정시킨다.
바로 다음에, Rapinovet Vet. inj. (프로포폴 10 mg/ml)를 충분한 깊이의 마취가 얻어질 때까지 서서히 정맥주사로 주사한다. 일반적으로, 2-3 ml/10 kg이 충분하지만, 배양이 가능할 때까지 한번에 1-2 ml로 보충이 필요할 수도 있다. 아트로핀 (1 mg/ml)을 0.5 ml/돼지에서 근육주사로 투여하고 기도삽관 전 5분 동안 작업한다.
기도삽관 동안, 돼지를 약간 상승된 전면의 복부 위치에 두고, 국소 마취제Xylocaine® kutanspray (리도카인 10 mg/dosis)를 후두개에 분사하고, 돼지를 후두경 및 일회용 튜브 크기 8.0 mm (ID)를 사용하여 기관삽입한다. 튜브 중 2 부분을 함께 단단히 압박하였다.
폐 투여 동안 장치 위치
투여 동안 PennCentury™ 장치의 위치는 기도내 튜브의 끝 바로 바깥쪽이어햐 하고 이는 기관삽관 전 장치에서 측정되어야 한다(이를 측정할 때 L-조각을 연결하는 단계를 기억). 투여 동안, PennCentury™ 장치의 끝은 기관지경으로 확인한 두측 오른쪽에 주어지는 기관지 바로 아래의 기도에 위치해야 한다.
인공 호흡
호흡 빈도를 10/ min 으로 설정하고 호흡 깊이는 250 ml /숨으로 설정한다. 인공호흡기를 투여시간을 최적화하기 위해 "베이비" 백에 장착한다. 마취 장치를 L-조각을 통해 기도내 튜브에 연결된 필터에 연결한다. PennCentury™ 장치를 L-장치를 통해 도입하고, 이는 투여 동안 호흡 깊이 및 빈도를 조절할 것이다.
투여 기술
PennCentury™ 장치는 상기 설명한 바와 같이 위치되어야 한다. 돼지를 조절가능한 PennCentury 에어펌프 (모델 AP-1)를 사용하여 흡입 동안 수동 투여에 의해 PennCentury™ 장치로 투여한다(한번에 하나씩). 각 돼지는 전체 용량이 주어지는 것을 보장하기 위해 8회 연속 호흡-강제 흡입 동안 8개의 에어 스프레이가 주어진다(4 mL로 에어 펌프 설정). 챔버는 장치에 분말이 들러붙는 것을 피하기 위해 스프레이 사이에서 부드럽게 두드린다. 새로운 전달 튜브를 각 돼지에 대해 사용한다. 흡입에 대한 시간은 매우 중요하며, 상기 스프레이는 흡입의 매우 초기에 주어져야 한다(50mL 흡입에서 출발을 위한 목적).
도미토의 효과를 대응하기 위해, Antisedan® Vet inj (아티파메졸 5 mg/ml)을 투여 바로 후 근육내 주사 (0.4 ml /돼지)로서 주사할 것이고, 돼지를 그것의 우리에 되돌리고 마취에서 깨어나도록 한다.
유지 분석
방출된 용량은 챔버의 전체 함량이어야 하고, 투여 후 장치는 어떤 잔여 분말과 함께 다시 무게를 달고, 남은 분말을 9 ml의 0.01 N HCl med 0.05 % (w/v) Tween 80 추출 완충제로 추출하고 분석으로 보낸다.
혈액 샘플링
투여 후, 혈액 샘플을 다음의 시점에 중심정맥 카테터로부터 취할 것이다:
-10, 0, 10, 20, 40, 60, 90, 120, 150, 180, 240 (4 h), 300 (5 h), 360 (6 h), 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 24 h, 32 h 및 48 h
샘플을 3방향 스톱콕을 취하고, 폐혈액을 동물에 다시 주사한다. 샘플 크기는 EDTA로 코팅된 튜브에서 수집된 0.8 ml의 혈액이다. 각 혈액 샘플 후, 카테터를 10 IU/ml 헤파린과 함께 5 ml의 멸균 0.9 % NaCl로 씻어낸다. 튜브를 혈액 및 항응고제(EDTA)의 충분한 혼합을 보장하기 위해 최소 8회 부드럽게 기울이고, 1분 후 그것을 젖은 얼음에 둔다. 튜브를 샘플링 후 1시간 내에 3000 rpm 및 4℃에서 10분 동안 교반시킨다. 샘플을 피펫팅까지 젖은 얼음에 보관한다.
실험 후 카테터의 폐쇄
멸균 식염수(10 ml 중의 1g 암피실린 = 100 mg/ml) 중에 용해한 암피실린(10 mg/kg = 100mg/ml 용액의 0.1 ml/kg) 으로 단일 정맥 처리는 혈액 샘플링을 위해 사용한 카테터를 통해 주어진다. 두 개의 카테터를 10 IU/ml까지의 농도로 4-5 ml의 멸균 0.9 % NaCl 첨가된 헤파린으로 씻는다. 카테터를 라텍스 주사 막이 있는 새로운 루어-락으로 폐쇄한다. 4-5 ml 멸균 0.9% NaCl을 막을 통해 주사한다. 최종적으로, 0.8 ml의 헤파린, 5000 IU/ml를 안전장치로서 카테터를 통해 주사한다. 무균기술은 응고의 증가된 위험을 가지는 카테터에서 박테리아 성장을 피하기 위해 요구된다.
혈액 샘플의 분석
Biosen 자동분석기에서 혈장 내 글루코오스 농도의 측정을 위해 10 μl의 혈장을 500 μl의 EBIO 완충 용액안으로 피펫팅한다.
혈장 샘플을 또한 PK 변수를 계산하기 위해 면역분석에 의해 외인성 인슐린에 대해 분석한다.
상기 프로토콜에 따라서 미니- 피그에 실시예 9의 인슐린의 폐 투여
도 10 및 11는 A14E 및 B25H 돌연변이를 안정화하는 프로테아제(선행기술의 인슐린)없이, 동일한 인슐린과 비교하여 실시예 9의 인슐린의 약물동력학 프로파일을 나타낸다. 데이터는 동일한 실험의 것이고, 도 10은 처음 250분의 데이터를 나타내고, 도 11은 전체 24시간(1440분) 시간-과정을 나타낸다.
실시예 9의 인슐린에 대한 약물동력학 데이터를 A14E 및 B25H 돌연변이를 안정화시키는 프로테아제(선행기술의 인슐린) 없이 동일한 인슐린과 비교하였다. 데이터는 정맥투여에 대한 동일한 실험, 반감기(T1/2) 및 생체이용가능성(Fit)의 것이다:
Figure pct00222
실시예 182, 십이지장 내강 효소를 사용하는 인슐린 유사체의 저하
SPD 래트로부터 십이지장 내강 효소(십이지장 내강 내용물의 여과에 의해 제조됨)를 사용하는 인슐린 유사체의 저하. 분석을 인슐린 유사체 및 표준에 대해 이용가능한 16개 웰을 가지는 96 웰 플레이트(2ml)에서 로봇에 의해 수행한다. 인슐린 유사체~15 μM를 100 mM 헤페스, 37℃에서 pH=7.4에서 십이지장 효소와 함께 배양하고, 샘플을 1, 15, 30, 60, 120 및 240분 후 취하고, 반응을 TFA의 첨가로 퀀칭한다. 각 시점에 무결함 인슐린 유사체를 RP-HPLC에 의해 결정한다. 반감기의 저하는 데이터의 지수 적합화에 의해 결정되고, 각 분석에서 기준 인슐린, A14E, B25H, desB30 인간 인슐린 또는 인간 인슐린에 대해 결정된 반감기를 정상화한다. 저하를 위해 첨가된 효소의 양은 기준 인슐린의 저하를 위한 반감기가 60분 내지180분인 것이다. 결과는 래트 십이지장에서 인슐린 유사체에 대한 저하 반감기를 동일 실험으로부터 기준 인슐린의 저하 반감기로 나눈 것으로서 주어진다(저하율에 대해).
Figure pct00223
래트 약물동력학:
정맥주사 래트 PK:
마취시킨 래트를 다양한 용량으로 인슐린 유사체를 정맥주사로(i.v.) 투여하고 사용한 화합물의 혈장 농도를 4시간 동안의 특정된 간격 또는 투여 후 그 이상에서 면역분석법 또는 질량 분석법을 사용하여 측정한다. 약물동력학 변수를 이후에 WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)를 사용하여 계산한다.
대략 200그램의 무게가 나가는 굶기지 않은 수컷 위스타 래트를 사용한다.
체중을 측정하고 래트를 이후에 Hypnorm/Dormicum으로 마취시킨다(각 화합물을 개별적으로 멸균수에서 1:1로 희석시킨 후 혼합하고, 실험일에 신선하게 제조한다). 마취를 2 ml/kg Hypnorm/Doricum 혼합물 피하주사로 시작한 후 30분 간격으로 1 ml/kg 피하주사의 2회의 유지량 및 45분 간격으로 1 ml/kg 피하주사의 2회의 유지량을 투여한다. 래트를 가볍게 마취시킨 것을 유지하기 위해서 필요하다면 추가 투여(들)을 통해 1-2 ml/kg sc를 공급한다. 한 방에서 다른 방으로 동물들을 이동시키는 것에 의한 스트레스를 피하기 위해 래트를 보유하는 방에서 무게를 재고 최초 마취를 수행한다.
경구의 래트 PK
위관영양법:
의식이 있는 래트를 인슐린 유사체로 경구투여한다. 사용한 화합물의 혈장 농도 및 혈액 글루코오스의 변화를 투여 후 4-6 시간 동안 특정 간격으로 측정한다. 약물동력학 변수를 이후에 WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)를 사용하여 계산한다.
250-300 g의 무게가 나가는 수컷 스프래그-돌리 래트(Taconic)를 ~18h 동안 굶기고 시험 화합물 또는 비히클로 경구투여한다.
경구 위관영양법을 위해 사용한 제형의 조성물은 하기와 같다(중량%):
45% 프로필렌 글리콜 (Merck)
33% Capmul MCM C10 (Abitec)
11% 폴록사머 407 (BASF)
11% 폴리에틸렌글리콜 3350 Ultra (Fluka)
첨가한 인슐린의 양은 Capmul MCM C10, 폴록사머 407 및 PEG 3350로부터 동일하게 차감되고, 45%의 약물 부하 상수와 독립적인 프로필렌 글리콜의 양을 유지하기 위해 프로필렌 글리콜로부터는 아니다.
중성 인슐린(pH 7.4로부터 냉동-건조)을 약한 교반하에서 실온에서 프로필렌 글리콜 내에 용해한다. 인슐린 및 인슐린의 양에 따라서, 프로필렌 글리콜에 용해하는데 몇 시간이 걸릴 수 있다. 결과 용액은 맑아야 한다. 다른 첨가물, Capmul, 폴록사머 및 PEG3350을 혼합하고 58℃에서 함께 용융시키고 또한 맑고, 약간 황색인 용액을 초래해야 한다. 그 후 인슐린 프로필렌 글리콜 용액을 35℃로 가온하고 용융한 첨가물을 마그네틱 교반하에서 부분적으로 첨가한다. 결과된 혼합물은 35℃에서 맑고 균질해야 하고 냉장고에 저장 후 반고체를 초래해야 한다. 제조 후, SEDDS 조성물을 고형화를 위해 5℃로 냉각시킨다.
전체 혈액 글루코오스 농도의 결정을 위한 혈액 샘플을 꼬리 끝의 모세혈관의 천자에 의해 헤파린화된 10 μl 모세관에서 수집한다. 혈액 글루코오스 농도를 Biosen 자동분석기(EKF Diagnostic Gmbh, Germany)를 사용하여 글루코오스 옥시다아제 방법에 의해 500 μl 분석 완충제로 희석 후 측정한다. 평균 혈액 글루코오스 농도 과정(평균 ± SEM)을 각 화합물에 대해 만든다.
샘플을 혈장 인슐린 농도의 결정을 위해 수집한다. 100 μl 혈액 샘플을 EDTA를 함유하는 냉각한 튜브에 회수한다. 샘플을 원심분리(7000 rpm, 4℃, 5분)할 때까지 얼음에 유지하고, 혈장을 Micronic 튜브로 피펫팅한 다음 분석까지 20℃에서 냉동한다. 인슐린 유사체의 혈장 농도를 개별 유사체에 대해 적절하거나 또는 승인된 것으로 고려되는 면역분석법을 사용하여 분석 및 기술부에서 측정한다.
혈액 샘플을 t=-10 (단지 혈액 글루코오스에 대해), t=-1 (투여 바로 전) 및 투여 후 4-6 시간 동안의 특정된 간격에 회수한다.
장내 주사:
마취시킨 래트를 인슐린 유사체로 장내로(공장으로) 투여한다. 사용한 화합물의 혈장 농도 및 혈액 글루코오스의 변화를 4시간 또는 투여 후 그 이상 동안 특정 간격으로 측정한다. 약물동력학 변수를 이후에 WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)를 사용하여 계산한다.
18시간 동안 굶긴 250-300 g의 무게가 나가는 수컷 스프래그-돌리 래트(Taconic)를 처음 용량으로서 Hypnorm-Dormicum 피하주사 (0.079 mg/ml 펜타닐 시트레이트, 2.5 mg/ml 플루아니손 및 1.25 mg/ml 미다졸람) 2 ml/kg(시험 물질 투여 전 시점-60분), 20분 후 1 ml/kg 다음에 40분마다 1 ml/kg를 사용하여 마취시킨다.
장내주사 모델에서 시험되어야 하는 인슐린을 상기 위관영양법 모델을 위해 제형화함으로써 제형화한다.
마취시킨 래트를 37℃에서 안정된 동물용 가온 담요에 둔다. 20 cm 폴리에틸렌 카테터 장착된 1-ml 시린지를 인슐린 제형 또는 비히클로 채운다. 4-5 cm 정중부 절개를 복벽에 한다. 카테터를 장벽의 관통에 의해 맹장으로부터 중간 공장 ~50cm에 부드럽게 삽입한다. 장 내용물이 존재한다면, 적용 부위를 ± 10 cm 이동시킨다. 카테터 끝을 장분절의 내강 내의 약 2 cm에 놓고 결찰의 사용 없이 고정한다. 장을 복강 및 복벽에 조심스럽게 두고 피부를 각 층에서 오토클립으로 폐쇄한다. 시점 0에, 래트에 0.4 ml/kg의 시험 화합물 또는 비히클을 카테터를 통해 투여한다.
전체 혈액 글루코오스 농도의 결정을 위한 혈액 샘플을 꼬리 끝의 모세혈관의 천자에 의해 헤파린화된 10 μl 모세관에서 수집한다. 혈액 글루코오스 농도를 Biosen 자동분석기 (EKF Diagnostic Gmbh, Germany)를 사용하여 글루코오스 옥시다아제 방법에 의해 500 μl 분석 완충제의 희석 후 측정한다. 평균 혈액 글루코오스 농도 과정(평균± SEM)을 각 화합물에 대해 만든다.
샘플을 혈장 인슐린 농도의 결정을 위해 수집한다. 100 μl 혈액 샘플을 EDTA를 함유하는 냉각 튜브에 회수한다. 샘플을 원심분리(7000 rpm, 4℃, 5 분) 할 때까지 얼음에서 유지하고, 혈장을 Micronic 튜브에 피펫팅한 후 분석까지 20℃에서 냉동시킨다. 인슐린 유사체의 혈장 농도를 개개의 유사체에 대해 적절하게 고려되거나 승인된 면역분석법으로 측정한다.
혈액 샘플을 t=-10 (단지 혈액 글루코오스), t=-1 (투여 바로 전) 및 투여 후 4시간 이상 동안 특정 간격으로 회수한다.
Figure pct00224
래트 약물동력학:
본 발명의 선택된 아실화된 인슐린의 혈액 글루코오스 vs. 경구 투여 후 시간 프로파일(상기 설명한 바와 같음)을 하기 나타낸다:
실시예 183
선행기술의 인슐린에서 밤새 굶긴 수컷 위스타 래트의 경구 효과, 즉:
Figure pct00225
B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린을 하기 도 1에서 제공한다.
실시예 184
인간 인슐린에 대한 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 효능
실험일에 238-383 g 무게가 나가는 스프레그 돌리 수컷 래트를 고정 실험을 위해 사용한다. 래트를 조절된 주변 조건하에서 먹이에 자유롭게 접근시키고 고정 실험 전에 밤새(3pm부터) 굶긴다.
실험 프로토콜:
래트를 수술 절차 적어도 1주일 전 동안 동물 시설에 적응시킨다. 고정실험 대략 1주 전에, Tygon 카테터를 경정맥(주입을 위해) 및 경동맥(혈액 샘플링을 위해)에 할로탄 마취 하에서 삽입하고 외부화하고 목 뒤에 고정한다. 래트를 수술 후 Streptocilin vet. (Boehringer Ingelheim; 0.15 ml/래트, 근육주사)를 제공하고 회복 기간 동안 동물 치료실(25℃)에 둔다. 무통증을 얻기 위해, 마취동안 아노르핀(0.06mg/래트, 피하주사)을 투여하고, 마취로부터 완전한 회복 후 리마딜(1.5 mg/kg, 피하주사)을 투여하고 다시 2일 동안 1일 1회 투여한다.
실험일 7 am에 밤새 굶긴(전날 3pm부터) 래트를 무게를 재고 샘플링 주사기 및 주입 시스템(Harvard 22 Basic pumps, Harvard, 및 Perfectum Hypodermic glass syringe, Aldrich)에 연결한 다음 개개의 클램프 우리에 두었으며, 그것들을 실험 시작 45분 전 동안 쉬게 하였다. 래트는 전체 실험 동안 그것들의 평소의 잠자리로 자유롭게 이동할 수 있고 음용수에 자유롭게 접근시켰다. 혈장 글르코오스 수준이 10분 간격으로 측정되는 30분의 기본 기간 후, 시험되는 인슐린 유도체 및 인간 인슐린(래트 당 1 용량 수준, 용량 수준 당 n = 6-7)을 300분 동안 일정한 속도로 주입한다(정맥주사). 선택적으로 시험되는 인슐린 유도체의 프라이밍 볼루스 주입을 혈장에서 즉시 정상 상태 수준에 도달하기 위해 투여한다. 프라이밍 볼루스 주입의 용량을 약물동력학 당업자에 의해 정맥주사 볼루스 약물동력학으로부터 얻은 명확한 데이터에 기초하여 계산할 수 있다. 혈장 글루코오스 수준을 10분 간격으로 측정하고 20% 수성 글루코오스의 주입을 적혈구를 유지하기 위해 조절한다. 재현탁한 적혈구의 샘플을 각 래트로부터 풀링하고, 경동맥 카테터를 통해 약 1/2 ml 부피로 되돌린다.
각 실험일에, 시험되는 개개의 인슐린 유도체의 용액 및 인간 인슐린 용액의 샘플을 고정 실험 전 및 마지막에 취하고, 펩티드의 농도를 HPLC로 확인한다. 래트 인슐린 및 C-펩티드뿐만 아니라 시험되는 인슐린 유도체 및 인간 인슐린의 혈장 농도를 연구 전 및 마지막의 적절한 시점에 측정한다. 래트를 과용량의 펜토바르비탈을 사용하여 실험의 마지막에 죽인다.
서열 목록
SEQ ID Nos. 5-11는 상기 특정 실시예에서 나타낸 본 발명의 화합물에 존재하는 A 사슬에 대한 서열이고 SEQ ID Nos. 12-29는 상기 특정 실시예에 나타낸 본 발명의 화합물에 존재하는 B 사슬에 대한 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVO NORDISK A/S <120> Protease stabilized, acylated insulin analogues <130> 7777.504-WO <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified Insulin A chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is absent or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is absent or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is absent or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Thr or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is Ser, Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is Tyr, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is Gln, Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Asn, Lys or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Asn or Gln <400> 1 Xaa Xaa Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Leu Glu Xaa Tyr Cys Xaa 20 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified Insulin B chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is absent or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is absent or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is absent or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is absent Phe or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is absent or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is absent, Asn or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Gln or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is His, Asp, Pro or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is Tyr, Asp, Gln, His, Arg or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Phe or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Phe, Asn or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is absent, Tyr, His, Thr, Gly or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is absent, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is absent, Pro, His, Gly or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is absent, Lys, Arg or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is absent or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is absent or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is absent or Glu <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu 1 5 10 15 Ala Leu Xaa Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa 35 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified insulin A chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Thr or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ser, Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is Gln, Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is Asn, Lys or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Asn or Gln <400> 3 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Glu Xaa Tyr Cys Xaa 20 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified insulin B chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Phe or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Asn or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Gln or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is His, Asp, Pro or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Tyr, Asp, Gln, His, Arg or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Phe or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is absent, Tyr, His, Thr, Gly or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is absent, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is absent, Pro, His, Gly or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is absent, Lys, Arg or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is absent or Thr <400> 4 Xaa Val Xaa Xaa His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Xaa 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 5 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 6 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 7 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 8 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 9 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Leu Tyr Cys Asn 20 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 10 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 11 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 12 Glu Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys 20 25 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 13 Glu Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Glu Glu Lys 20 25 <210> 14 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 14 Glu Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Glu Lys 20 25 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 15 Glu Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Glu Glu Lys 20 25 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 16 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 17 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 17 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 18 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 18 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 19 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 19 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Glu Pro Lys 20 25 <210> 20 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 20 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Pro Lys 20 25 <210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 21 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Gly Gly Gly Arg 20 25 <210> 22 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 22 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Gly Gly Gly Lys 20 25 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 23 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Lys 20 25 <210> 24 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 24 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Asn Tyr Glu Pro Lys 20 25 <210> 25 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 25 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Arg 20 25 <210> 26 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 26 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys 20 25 <210> 27 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 27 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr His Arg 20 25 <210> 28 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 28 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys 20 25 <210> 29 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 29 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25

Claims (12)

  1. 형식적으로는 비-프로테아제 안정화된 인슐린(모 인슐린)으로 구성되며, 적어도 하나의 소수성 아미노산이 친수성 아미노산으로 치환되었고, 상기 치환은 비-프로테아제 안정화된 인슐린(모 인슐린)의 하나 이상의 프로테아제 절단 자리 내에 또는 그곳과 인접하여 있고, 안정화된 인슐린에서 단지 하나의 리신 잔기가 있는 경우 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 더 포함하고, 아실 모이어티(moiety)가 프로테아제 안정화된 인슐린에서 리신 잔기에 또는 N-말단 위치에 부착되어 있는, 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
  2. 제 1 항에 있어서, 비-프로테아제 안정화된 인슐린의 적어도 2개의 소수성 아미노산은 친수성 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아실 모이어티는 프로테아제 안정화된 인슐린의 리신 잔기에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항에 있어서, 아실 모이어티는 프로테아제 안정화된 인슐린의 A-사슬 N-말단 잔기의 아미노기에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 안정화된 인슐린은 A8H, B25N, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, A18L, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B28E, desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린; A14E, B28D, desB30 인간 인슐린; A14E, B28E, desB30 인간 인슐린; B25N, B27E, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B16H, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; B25H, desB30 인간 인슐린; A21G, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB30 인간 인슐린 및 A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아실화된 프로테아제.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 안정화된 인슐린에 부착되어 있는 아실 모이어티는 일반식 (I) Acy-AA1n-AA2m-AA3p-를 가지며, n은 0 또는 1 내지 3의 범위에 있는 정수이고; m은 0 또는 1 내지 10의 범위에 있는 정수이고; p는 0 또는 1 내지 10의 범위에 있는 정수이고; Acy은 약 8 내지 약 24개의 탄소 원자를 포함하는 지방산 또는 지방 2산이고; AA1은 중성의 선형 또는 고리형 아미노산 잔기이고; AA2는 산성 아미노산 잔기이고; AA3은 중성의, 알킬렌글리콜-함유 아미노산 잔기이고; AA1, AA2 및 AA3이 상기 일반식에서 나타나는 순서는 독립적으로 서로 바뀌어질 수 있고; AA2는 상기 일반식에 따라서 몇 번 발생할 수 있고(예를 들어, Acy-AA2-AA32-AA2-); AA2는 상기 일반식에 따라서 독립적으로(= 다르게) 몇 번 발생할 수 있고(예를 들어, Acy-AA2-AA32-AA2-); Acy, AA1, AA2 및/또는 AA3 사이의 연결은 형식적으로는 각각의 Acy, AA1, AA2 및 AA3로부터 수소 원자 또는 히드록실기(물)의 제거에 의해 획득될 수 있는 아미드(펩티드) 결합이고; 프로테아제 안정화된 인슐린에 부착은 상기 일반식 (I)의 아실 모이어티에서 AA1, AA2, 또는 AA3 잔기의 C-말단 끝으로부터 또는 상기 일반식 (I)의 아실 모이어티에 존재하는 AA2 잔기의 측쇄(들) 중 하나로부터 나올 수 있는 것을 특징으로 하는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 명세서에 구체적으로 언급된 화합물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항에 있어서, A14E, B25H, B29K(Nε-헥사데칸디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε3-카르복시-5-옥타데칸디오일아미노벤조일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε-N-옥타데칸디오일-N-(2-카르복시에틸)글리실), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε(N-옥타데칸디오일-N-카르복시메틸)-베타-알라닐), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε4-([4-({19-카르복시노나데칸오일아미노}메틸)트랜스-시클로헥산카르보닐]-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε헵타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε미리스틸), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε4-([4-({19-카르복시노나데칸오일아미노}메틸)트랜스-시클로헥산카르보닐]-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B28D, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-PEG7), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}-에톡시)프로피오닐-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε헵타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B16E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B16E, B25H, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, B29K(N(엡스)에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-OEG-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, A18L, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, A18L, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A1G(Nα옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린; A14E, B1F(Nα옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), B25H, B29R, desB30 인간 인슐린; A1G(Nα헥사데칸디오일-γGlu), A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-Abu-Abu-Abu-Abu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nα에이코산디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nα4-[16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데칸오일술파모일]부탄오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε도코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε도코산디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε아이코산디오일-γGlu-OEG-OEG-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε(N-아이코산디오일-N-카르복시메틸)-βAla), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε3-[2-(2-{2-[2-(17-카르복시헵타데칸오일아미노)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]프로피오닐-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε3-[2-(2-{2-[2-(19-카르복시노나데칸오일아미노)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]-프로피오닐-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε아이코산디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε4-([4-({17-카르복시노나데칸오일-아미노}메틸)트랜스-시클로헥산카르보닐]-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε4-([4-({17-카르복시헵타데칸오일아미노}메틸)트랜스-시클로헥산카르보닐]-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B28D, B29K(Nε 헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B28D, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B28D, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B28D, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B28D, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B28E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25N, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25N, B27E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25N, B27E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25N, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; B25N, B27E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; B25N, B27E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A8H, B25N, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A8H, B25N, B27E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A8H, B25N, B27E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A8H, B25N, B27E, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A8H, B25N, B27E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A8H, B25N, B27E, B29K(Nε헥사데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε(N-아이코산디오일-N-카르복시메틸)-βAla-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε(N-옥타데칸디오일-N-카르복시메틸)-βAla-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε(N-헥사데칸디오일-N-카르복시메틸)-βAla-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필카르바모일)메톡시]아세틸), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필카르바모일)메톡시]아세틸), desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필카르바모일)메톡시]아세틸), desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-아미노프로폭시)에톡시]에톡시}프로필카르바모일)메톡시]아세틸), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A1G(Nα옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), A14E, A21G, B25H, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB28, desB29, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε(5-에이코산디오일아미노이소프탈산)), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-Aoc), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, desB27, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B16H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A1G(Nα옥타데칸디오일), A14E, B25H, B29R, desB30 인간 인슐린; A14E, B16H, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B27K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB28, desB29, desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 인간 인슐린; A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu-OEG-OEG), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, A21G, B25H, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε옥타데칸디오일), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일-γGlu), desB30 인간 인슐린; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nε에이코산디오일), desB30 인간 인슐린; A1G(Nα옥타데칸디오일-γGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A1G(Nα에이코산디오일-γGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A1G(Nα옥타데칸디오일-γGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린; A1G(Nα에이코산디오일-γGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린; A1G(Nα옥타데칸디오일), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A1G(Nα에이코산디오일), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 인간 인슐린; A1G(Nα옥타데칸디오일), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린 및 A1G(Nα에이코산디오일), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
  9. 약제로서 사용을 위한 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
  10. 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능장애, 1형 당뇨병, 비만, 신드롬 X 또는 이상지질혈증의 치료 또는 예방에 사용을 위한 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따르는 아실화된 프로테아제 안정화된 인슐린.
  11. 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능장애, 1형 당뇨병, 비만, 신드롬 X 또는 이상지질혈증의 치료 또는 예방을 위한 약학 제형의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따르는 프로테아제 안정화된 인슐린의 치료적으로 유효한 양의 사용.
  12. 본원에서 설명된 어떤 신규한 특징 또는 특징들의 조합.
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