CN109891237B - 胰岛素制剂的生物测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及口服制剂中的胰岛素肽和液体制剂中的低亲和力胰岛素肽的生物测定法，其通过对磷酸化的Akt进行定量，从而在效力确定中避免赋形剂的干扰。

Description

胰岛素制剂的生物测定法
技术领域
本发明涉及针对口服制剂中的胰岛素肽和液体制剂中的低亲和力胰岛素肽的生物测定法。
序列表的援引并入
名称为“SEQUENCE LISTING”的序列表(6225字节)创建于2016年10月24日，并通过引用并入本文。
发明背景
生物测定法是生物学测定(体内测定、离体测定、基于细胞的体外测定、结合测定、生化测定等)，其用于各种目的，如工艺开发、工艺表征和产品开发；原料药(drugsubstance)或药物产品的产品发布测试；过程中控制和中间体测试；稳定性和产品完整性测试等。生物测定法也用作定性试验，即效力或生物鉴别试验。生物测定法易受许多变量的影响，因此活性在测定法之间可能不同。相对于标准，效力的绝对量度比活性量度更易变。因此，使用相对效力方法，其中相对于由类似材料构成的指定标准/参考来测量组分的活性。
效力是以产生给定强度的效果所需的量来表示的药物活性的量度。高效药物在低浓度下会引起特定反应，而较低效力的药物仅在较高浓度时才会引起相同的反应。效力取决于药物的亲和力和效能两者。亲和力是药物与受体结合的能力。效能是受体占据与在分子水平上启动反应的能力之间的关系。
效力的确定通常受基质的影响，这意味着制剂的赋形剂可干扰生物测定法的性能。这通常被称为“基质效应”。这代表了一个技术问题，因为在常规测定中，赋形剂的基质效应妨碍测试药物的效力。口服制剂中的胰岛素和液体制剂中的低亲和力胰岛素对生物测定法而言具有挑战性，因为这些制剂的赋形剂干扰测定法的性能，并且妨碍通过诸如胰岛素受体磷酸化测定和报道基因测定等常规测定来确定效力。
本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代方案。
发明内容
本发明涉及口服制剂中的胰岛素肽和液体制剂中的低亲和力胰岛素肽的生物测定法。
在一个方面，本发明涉及测量药物产品相对于原料药的效力的方法，其中该方法包括对磷酸化的Akt进行定量的步骤，其中所述药物产品是口服制剂中的胰岛素肽，或者是液体制剂中的低亲和力胰岛素肽。
本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
附图简述
图1：口服制剂中的A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素的InsR磷酸化测定。
图2：液体制剂中的A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素(低亲和力胰岛素)的InsR磷酸化测定。
图3：口服制剂中的A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素的报道基因测定。
图4：液体制剂中的A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素(低亲和力胰岛素)的pAkt测定。
图5：口服制剂中的A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素的pAkt测定。
图6：口服制剂中的A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素的pAkt测定。
图7：以下物质在pAkt测定中的效力：(i)A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素；(ii)A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素；(iii)A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素；以及人胰岛素。
发明详述
本发明涉及口服制剂中的胰岛素肽和液体制剂中的低亲和力胰岛素肽的生物测定法。
已令人惊讶地发现，磷酸化Akt(pAkt)生物测定法克服了传统生物测定法中遇到的赋形剂干扰问题，并且允许对口服制剂中的胰岛素肽或液体制剂中的低亲和力胰岛素肽进行效力确定。
本发明涉及测量药物产品相对于原料药的效力的方法，其中该方法包括对磷酸化的Akt进行定量的步骤，其中所述药物产品是口服制剂中的胰岛素肽，或者是液体制剂中的低亲和力胰岛素肽。
本发明涉及测量胰岛素肽的效力的方法。本发明的实用性在于其避免了赋形剂在包含胰岛素肽的口服制剂中或者在包含低亲和力胰岛素肽的液体制剂中的干扰。
除非在说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。
诸如生物测定法、生物学测定、生物评估、生物标准化、生物鉴别或效力等术语可互换使用。
本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
药物产品
如本文所用的术语“药物产品”(DP)意指与制剂中包含的赋形剂一起发挥药理学作用的活性药物成分(API)。
原料药
如本文所用的术语“原料药”(DS)意指发挥药理学作用的活性药物成分(API)。
胰岛素
如本文所用的术语“人胰岛素”意指人胰岛素激素，其结构和性质是众所周知的。人胰岛素具有两条多肽链，被命名为A链和B链。A链为21个氨基酸的肽而B链为30个氨基酸的肽，这两条链通过以下的二硫键连接：在A链的位置7上的半胱氨酸与B链的位置7上的半胱氨酸之间的第一桥，以及在A链的位置20上的半胱氨酸与B链的位置19上的半胱氨酸之间的第二桥。第三桥存在于A链的位置6和11上的半胱氨酸之间。
在人体内，该激素被合成为单链前体胰岛素原(前胰岛素原)，其由24个氨基酸的前肽以及随后的含有86个氨基酸的胰岛素原组成，其构型为：前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A，其中C为31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是该连接肽从A和B链上切割的切割位点。
如本文所用的“胰岛素”应被理解为人胰岛素或来自另一物种的胰岛素，如猪或牛胰岛素。
如本文所用的术语“亲本胰岛素”意指在对其施加根据本发明的任何修饰之前的胰岛素。
胰岛素肽
如本文所用的术语“胰岛素肽”意指作为人胰岛素或其具有胰岛素活性的类似物或衍生物的肽。
胰岛素类似物
如本文所用的术语“胰岛素类似物”意指经修饰的人胰岛素，其中该胰岛素的一个或多个氨基酸残基已经被其他氨基酸残基置换，并且/或者其中一个或多个氨基酸残基已从该胰岛素中删除，并且/或者其中一个或多个氨基酸残基已被添加和/或插入到该胰岛素中。
在一个实施方案中，胰岛素类似物包含相对于人胰岛素的少于10个氨基酸修饰(置换、缺失、添加(包括插入)及其任何组合)，或者相对于人胰岛素的少于9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰。
胰岛素分子中的修饰通过说明置换天然氨基酸残基的氨基酸残基所在的链(A或B)、其位置以及单字母或三字母代码来表示。
“连接肽”或“C肽”意指单链胰岛素原-分子的B-C-A多肽序列的连接部分“C”。在人胰岛素链中，C肽连接B链的位置30和A链的位置1，且其长度为35个氨基酸残基。该连接肽包括两个末端二碱性氨基酸序列，例如Arg-Arg和Lys-Arg，它们用作该连接肽从A和B链上切割以形成双链胰岛素分子的切割位点。
“desB30”或“B(1-29)”意指缺乏B30氨基酸的天然胰岛素B链或其类似物，而“A(1-21)”意指天然胰岛素A链。因此，例如，A21Gly,B28Asp,desB30人胰岛素是人胰岛素的一种类似物，其中A链中位置21处的氨基酸被甘氨酸置换，B链中位置28处的氨基酸被天冬氨酸置换，并且B链中位置30处的氨基酸缺失。
本文中如“A1”、“A2”和“A3”等术语分别表示在胰岛素A链中的位置1、2和3等位置上的氨基酸(从N端开始计数)。类似地，如“B1”、“B2”和“B3”等术语分别表示在胰岛素B链中的位置1、2和3等位置上的氨基酸(从N端开始计数)。通过采用氨基酸的单字母代码，如A21A、A21G和A21Q的术语分别表示在A21位置上的氨基酸为A、G和Q。通过采用氨基酸的三字母代码，相应的表示分别为A21Ala、A21Gly和A21Gln。
本文中，术语“A(0)”或“B(0)”分别表示在A1或B1的N端的氨基酸的位置。术语A(-1)或B(-1)分别表示在A(0)或B(0)的N端的第一个氨基酸的位置。因此，A(-2)和B(-2)分别表示在A(-1)和B(-1)的N端的氨基酸的位置，A(-3)和B(-3)分别表示在A(-2)和B(-2)的N端的氨基酸的位置，以此类推。术语A22或B31分别表示在A21或B30的C端的氨基酸的位置。术语A23或B32分别表示在A22或B31的C端的第一个氨基酸的位置。因此，A24和B33分别表示在A23和B32的C端的氨基酸的位置，以此类推。
本文中，术语“氨基酸残基”是在形式上已从羧基中去除羟基的氨基酸，和/或在形式上已从氨基中去除氢原子的氨基酸。
胰岛素类似物的实例是这样的胰岛素：其中B链位置28处的Pro被Asp、Lys、Leu、Val或Ala置换，并且/或者位置B29处的Lys被Pro、Glu或Asp置换。此外，位置B3处的Asn可以被Thr、Lys、Gln、Glu或Asp置换。位置A21处的氨基酸残基可以被Gly置换。还可以将一个或多个氨基酸添加至A链和/或B链的C端，例如Lys。位置B1处的氨基酸可以被Glu置换。位置B16处的氨基酸可以被Glu或His置换。胰岛素类似物的其他实例为缺失类似物，例如，其中人胰岛素中的B30氨基酸已经缺失的类似物(des(B30)人胰岛素)、其中人胰岛素中的B1氨基酸已经缺失的胰岛素类似物(des(B1)人胰岛素)、des(B28-B30)人胰岛素和des(B27)人胰岛素。其中A链和/或B链具有N端延伸的胰岛素类似物以及其中A链和/或B链具有C端延伸(如具有两个添加至B链的C端的精氨酸残基)的胰岛素类似物也是胰岛素类似物的实例。其他实例是包含所提到的突变的组合的胰岛素类似物。以下胰岛素类似物是胰岛素类似物的其他实例：其中位置A14处的氨基酸为Asn、Gln、Glu、Arg、Asp、Gly或His，位置B25处的氨基酸为His，并且其任选地还包含一个或多个另外的突变。以下人胰岛素的胰岛素类似物也是胰岛素类似物的实例：其中位置A21处的氨基酸残基为Gly，并且其中该胰岛素类似物在C端进一步延伸两个精氨酸残基。
胰岛素类似物的其他实例包括：DesB30人胰岛素；AspB28人胰岛素；AspB28,desB30人胰岛素；LysB3,GluB29人胰岛素；LysB28,ProB29人胰岛素；GlyA21,ArgB31,ArgB32人胰岛素；GluA14,HisB25人胰岛素；HisA14,HisB25人胰岛素；GluA14,HisB25,desB30人胰岛素；HisA14,HisB25,desB30人胰岛素；GluA14,HisB25,desB27,desB28,desB29,desB30人胰岛素；GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素；GluA14,HisB16,HisB25,desB30人胰岛素；HisA14,HisB16,HisB25,desB30人胰岛素；HisA8,GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素；HisA8,GluA14,GluB1,GluB16,HisB25,GluB27,desB30人胰岛素；以及HisA8,GluA14,GluB16,HisB25,desB30人胰岛素。
胰岛素衍生物
如本文所用的术语“胰岛素衍生物”意指经化学修饰的亲本胰岛素或其类似物，其中所述修饰是附接酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、PEG化等形式。本发明的人胰岛素衍生物的实例为人胰岛素B30苏氨酸甲酯；GlyA21,ArgB31,Arg-酰胺B32人胰岛素；NεB29-十四碳酰基desB30人胰岛素；NεB29-十四碳酰基人胰岛素；NεB29-癸酰基desB30人胰岛素；NεB29-十二碳酰基desB30人胰岛素；NεB29-3-(2-{2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基人胰岛素；LysB29(Nε-十六碳二酰基-γ-Glu)des(B30)人胰岛素)；NεB29-(Nα-(Sar-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)desB30人胰岛素；NεB29-羧基-十五碳酰基-L-谷氨酰基酰胺desB30人胰岛素；NεB29-十六碳二酰基-氨基-丁酰基desB30人胰岛素；NεB29-十六碳二酰基-L-Glu-酰胺desB30胰岛素；A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)；A14E,B16H,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)；A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)；A14E,B16H,B25H,B29K(Nε二十烷二酰基-γGlu),desB30人胰岛素(SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8)；A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)；A14E,B25H,desB27,B29K(Nε-(十八烷二酰基-gGlu),desB30人胰岛素(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)。
术语“PEG化胰岛素/胰岛素类似物/胰岛素衍生物”意指与胰岛素/胰岛素类似物/胰岛素衍生物缀合的PEG分子。应当理解，PEG分子可附接至胰岛素/胰岛素类似物/胰岛素衍生物多肽的任何部分，包括胰岛素/胰岛素类似物/胰岛脂衍生物的任何氨基酸残基或碳水化合物部分。
术语“半胱氨酸-PEG化胰岛素/胰岛素类似物/胰岛素衍生物”意指具有与引入“胰岛素/胰岛素类似物/胰岛素衍生物”中的半胱氨酸的巯基缀合的PEG分子的“胰岛素/胰岛素类似物/胰岛素衍生物”。
术语“聚乙二醇”或“PEG”意指聚乙二醇化合物或其衍生物，其具有或不具有偶联剂、偶联或活化部分(例如，具有硫醇、三氟甲磺酸酯、2,2,2-三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷，或优选具有马来酰亚胺部分)。诸如马来酰亚胺基单甲氧基PEG的化合物是本发明的活化PEG化合物的示例。
PEG是合适的聚合物分子，因为它与多糖如葡聚糖相比仅具有很少的能够交联的反应性基团。特别地，单官能PEG，例如甲氧基聚乙二醇(mPEG)，是有意义的，因为其偶联化学相对简单(只有一个反应性基团可用于与多肽上的连接基团缀合)。因此，发生交联的风险得以消除，得到的多肽缀合物更加均匀，并且聚合物分子与多肽的反应更容易控制。
为了实现聚合物分子与多肽的共价连接，聚合物分子的羟基端基以活化形式提供，即具有反应性官能团。合适的活化聚合物分子可商购获得，例如来自ShearwaterCorp.,Huntsville,Ala.,USA，或来自PolyMASC Pharmaceuticals plc,UK。或者，可通过本领域已知的常规方法激活聚合物分子，例如，如WO 90/13540中所公开的。在ShearwaterCorp.1997和2000Catalogs(Functionalized Biocompatible Polymers for Researchand pharmaceuticals,Polyethylene Glycol and Derivatives，通过引用并入本文)中描述了本发明使用的活化的直链或支链聚合物分子的具体实例。活化的PEG聚合物的具体实例包括以下直链PEG：NHS-PEG(例如SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG和SCM-PEG)和NOR-PEG)、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG和MAL-PEG，以及支链PEG，如PEG2-NHS，以及在美国专利No.5,932,462和美国专利No.5,643,575中描述的那些。
通过使用任何常规方法来进行多肽与活化的聚合物分子的缀合，例如，如下列参考文献(其也描述了用于激活聚合物分子的合适方法)所述：R.F.Taylor,(1991),"Proteinimmobilisation.Fundamental and applications",Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992),"Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking",CRC Press,BocaRaton；G.T.Hermanson等人(1993),"Immobilized Affinity Ligand Techniques",Academic Press,N.Y.。熟练技术人员将意识到，待使用的激活方法和/或缀合化学方法取决于多肽的连接基团(其实例在上文进一步给出)以及聚合物的官能团(例如，为胺、羟基、羧基、醛、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯砜或卤代乙酸酯)。
低亲和力胰岛素
本发明的低亲和力胰岛素意指具有低相对效力的胰岛素类似物和胰岛素衍生物，即，当按照pAkt测定法测量时，小于人胰岛素的效力的0.08％。
药物制剂
本发明药物组合物的给药可通过若干种给药途径进行，例如，经舌、舌下、颊部、口中、口服、胃肠中、经鼻、经肺给药，例如通过细支气管和肺泡或其组合，表皮、真皮、经皮、阴道、直肠、眼部给药，例如通过结膜，输尿管以及肠胃外给药，来给予需要这样的治疗的患者。
所述药物组合物可在若干个部位施用至需要这样的治疗的患者，例如，在局部部位，例如皮肤和粘膜部位，在避开吸收的部位，例如在动脉中、静脉中、心脏中给药，以及在与吸收有关的部位，例如在皮肤中、皮肤下、肌肉中或腹部中给药。
在本发明的一个实施方案中，所述药物制剂是液体制剂，在本发明的一个实施方案中，所述药物制剂是水性制剂，即包含水的制剂。这样的制剂通常是溶液或悬浮液。在本发明的其他实施方案中，所述药物制剂是水溶液。
术语“水性制剂”被定义为包含至少50％w/w水的制剂。类似地，术语“水溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，而术语“水性悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。
在本发明的一个实施方案中，所述药物制剂是口服制剂。在一个实施方案中，所述制剂包含通过干法制粒所制备的颗粒。在一个实施方案中，所述制剂包含通过碾压所制备的颗粒。在一个实施方案中，将来自碾压过程的模制品粉碎成颗粒。在一个实施方案中，术语“颗粒”是指一种或多种颗粒。在一个实施方案中，术语“颗粒”是指聚集成较大颗粒的颗粒。
在一些实施方案中，所述颗粒包含填充剂，如乳糖(例如喷雾干燥的乳糖、α-乳糖、β-乳糖、
Figure GDA0002038493720000101
各种等级的
Figure GDA0002038493720000102
Figure GDA0002038493720000103
或
Figure GDA0002038493720000104
)、微晶纤维素(各种等级的
Figure GDA0002038493720000105
Figure GDA0002038493720000106
Ming
Figure GDA0002038493720000107
或
Figure GDA0002038493720000108
)、其他纤维素衍生物、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、糊精、葡聚糖、麦芽糖糊精、右旋糖、果糖、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、糖、淀粉或改性淀粉(包括马铃薯淀粉、玉米淀粉和大米淀粉)、磷酸钙(例如碱式磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸二钙水合物)、硫酸钙、碳酸钙或海藻酸钠。在一些实施方案中，所述填充剂是微晶纤维素，如Avicel PH 101。
在一些实施方案中，所述颗粒包含粘合剂，如35乳糖(例如喷雾干燥的乳糖、α-乳糖、β-乳糖、
Figure GDA0002038493720000109
各种等级的
Figure GDA00020384937200001010
Figure GDA00020384937200001011
或
Figure GDA00020384937200001012
)、微晶纤维素(各种等级的
Figure GDA00020384937200001013
Figure GDA00020384937200001014
Ming
Figure GDA00020384937200001015
或
Figure GDA00020384937200001016
)、羟丙基纤维素、L-羟丙基纤维素(低取代的)、羟丙甲纤维素(HPMC)(例如Methocel E、F和K；Shin-Etsu,Ltd的Metolose SH；例如4,000cps等级的Methocel E和5Metolose 60SH；4,000cps等级的Methocel F和Metolose 65SH；4,000、15,000和100,000cps等级的MethocelK；以及4,000、15,000、39,000和100,000等级的Metolose 90SH)、甲基纤维素聚合物(例如Methocel A、Methocel A4C、Methocel A15C、Methocel A4M)、羟乙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、其他纤维素衍生物、蔗糖、糊精、麦芽糖糊精、10淀粉或改性淀粉(包括马铃薯淀粉、玉米淀粉和大米淀粉)、乳酸钙、碳酸钙、阿拉伯胶、海藻酸钠、琼脂、角叉菜胶、明胶、瓜尔胶、果胶、PEG或聚维酮。在一些实施方案中，所述粘合剂是聚维酮，如聚维酮K 90。
在一些实施方案中，所述颗粒包含崩解剂，如海藻酸、海藻酸盐、微晶纤维素、羟丙基纤维素、其他纤维素衍生物、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、羟基乙酸淀粉钠、淀粉、预胶化淀粉或羧甲基淀粉(例如
Figure GDA0002038493720000111
和
Figure GDA0002038493720000112
)。
在一些实施方案中，所述颗粒包含润滑剂，如硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙或其他金属硬脂酸盐、滑石、蜡、甘油酯、轻质矿物油、山萮酸甘油酯、氢化植物油、硬脂酰富马酸钠、聚乙二醇、烷基硫酸盐或苯甲酸钠。在一些实施方案中，所述组合物或颗粒包含润滑剂，如硅酸镁、滑石或胶体二氧化硅。在一些实施方案中，所述润滑剂是硬脂酸镁。
在一些实施方案中，所述颗粒包含一种或多种选自以下的赋形剂：结晶延迟剂，如聚维酮等；增溶剂(也称为表面活性剂)，如阴离子表面活性剂(例如普朗尼克(Pluronic)或聚维酮)、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂；着色剂，包括染料和颜料，如氧化铁红或氧化铁黄、二氧化钛和/或滑石；和/或pH控制剂，如柠檬酸、酒石酸、富马酸、柠檬酸钠、磷酸氢钙和/或磷酸氢二钠。
在一个实施方案中，所述制剂是固体剂型的形式。在一个实施方案中，所述制剂是片剂的形式。在本发明的一个实施方案中，口服制剂意指其中药物产品以800-10800nmol/片存在的制剂。在一个实施方案中，所述制剂是胶囊的形式。在一个实施方案中，所述制剂是囊剂的形式。
在另一个实施方案中，所述药物制剂是无需任何预先溶解即可备用的干燥制剂(例如，冷冻干燥的或喷雾干燥的)。
所述制剂可包含至少一种药学上可接受的赋形剂。如本文所用的术语“赋形剂”宽泛地指不同于活性药物成分的任何组分。赋形剂可以是惰性物质，就其本身基本上不具有任何治疗性和/或预防性作用而言它是惰性的。赋形剂可以用于各种目的，例如，作为递送剂、吸收促进剂、媒介物、填充剂(也称为稀释剂)、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、结晶延迟剂、酸化剂、碱化剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲液或缓冲剂、等渗剂、螯合剂、络合剂、表面活性剂、乳化剂和/或增溶剂、甜味剂、湿润剂、稳定剂或稳定化剂、着色剂、调味剂，和/或改善活性物质的给药和/或吸收。通过常规实验，本领域技术人员可以针对药物制剂的特别所需的性质选择上述赋形剂中的一种或多种，而没有任何过度负担。使用的每一种赋形剂的量可以在本领域常规范围内变化。
可用于配制口服剂型的技术和赋形剂在Handbook of PharmaceuticalExcipients,第6版,Rowe等人编,American Pharmaceuticals Association and thePharmaceutical Press,publications department of the Royal PharmaceuticalSociety of Great Britain(2009)和Remington:the Science and Practice ofPharmacy,第21版,Gennaro编,Lippincott Williams&Wilkins(2005)中描述。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的缓冲液。该缓冲液可选自乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、磷酸盐、磷酸氢盐和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、琥珀酸盐、天冬氨酸、天冬酰胺或其混合物。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂。在本发明的其他实施方案中，所述防腐剂选自苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、苄醇、氯丁醇、苯甲酸、咪脲、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵或其混合物。防腐剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂进一步包含等渗剂。该等渗剂可选自盐(例如氯化钠)，糖，如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖(包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐)，或糖醇，如氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)，醛醇(例如甘油(丙三醇)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)，聚乙二醇(例如PEG400)，或其混合物。糖醇包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿糖醇。
等渗剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第19版,1995。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂进一步包含螯合剂。在本发明的其他实施方案中，该螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸、EGTA的盐，及其混合物。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂进一步包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington:The Science and PracticeofPharmacy,第19版,1995。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂进一步包含选自高分子量聚合物或低分子量化合物的稳定剂。在本发明的其他实施方案中，该稳定剂选自聚乙二醇(例如，PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如，HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫代乙醇，以及不同的盐(例如氯化钠)。
本发明的药物组合物可进一步包含一定量的氨基酸碱，该量足以减少该组合物储存期间多肽或蛋白质引起的聚集体形成。
“氨基酸碱”意指氨基酸或氨基酸的组合，其中任何给定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。该氨基酸可以是精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸、乙硫氨酸和丁硫氨酸以及S-甲基-L半胱氨酸。
在本发明的其他实施方案中，当用作治疗剂的多肽是包含至少一个对甲硫氨酸残基向甲硫氨酸亚砜的氧化敏感的甲硫氨酸残基的多肽时，可添加甲硫氨酸(或其他含硫氨基酸或氨基酸类似物)以抑制这样的氧化。“抑制”意为甲硫氨酸氧化种类随时间的最小积累。抑制甲硫氨酸氧化导致更多地保留了其适当分子形式的多肽。可以使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。所添加的量应该是足以抑制甲硫氨酸残基氧化的量，使得甲硫氨酸亚砜的量符合监管机构的要求。通常，这意味着该组合物含有不超过约10％至约30％的甲硫氨酸亚砜。通常，这可以通过添加甲硫氨酸来实现，使得所添加的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的比例在约1:1至约1000:1，如10:1至约100:1的范围内。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂进一步包含表面活性剂。典型的表面活性剂(其中商品名的实例在方括号[]中给出)为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯[吐温20]、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯[吐温40]或聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯[吐温80]、泊洛沙姆如聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物[普朗尼克(Pluronic)F68/泊洛沙姆188]、聚乙二醇辛基苯基醚[Triton X-100]或聚氧乙二醇十二烷基醚[Brij 35]。表面活性剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂进一步包含蛋白酶抑制剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)和苯甲脒HCl，但也可以使用其他可商购获得的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的应用特别适用于包含蛋白酶的酶原或活化酶如FVIIa的药物组合物以抑制自催化反应。
本发明的制剂可进一步混入或附接至(例如通过共价、疏水和静电相互作用)药物载体、药物递送系统和先进药物递送系统，以便进一步增强化合物的稳定性、增加生物利用度、增加溶解度、降低不良反应、实现本领域技术人员公知的时间疗法，以及增加患者依从性，或其任何组合。载体、药物递送系统和先进药物递送系统的实例包括但不限于：聚合物，例如纤维素和衍生物；多糖，例如葡聚糖和衍生物；淀粉和衍生物；聚(乙烯醇)；丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物；聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物；聚乙二醇；载体蛋白质，例如白蛋白；凝胶，例如热胶凝体系，例如本领域技术人员公知的嵌段共聚体系；胶束；脂质体；微粒；纳米颗粒；液晶及其分散体；本领域技术人员公知的脂质-水体系中的相行为的L2相及其分散体；聚合物胶束；多重乳液；自乳化；自微乳化；环糊精及其衍生物；和树状聚体。
可借助于注射器，任选地借助于笔式注射器，通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行肠胃外给药。或者，可借助于输注泵进行肠胃外给药。进一步的选项是可以是用于以鼻或肺喷雾的形式施用化合物的溶液或悬浮液的组合物。作为更进一步的选项，还可使含有本发明的[蛋白质]化合物的药物组合物适应于例如通过无针注射或来自贴片(任选地离子电渗贴片)的经皮给药，或者经粘膜例如颊部给药。用于口服施用治疗性蛋白质和多肽的药物制剂可包括将活性化合物包封为纳米颗粒、微粒或其他种类的多颗粒剂型。进一步的选项是使用渗透增强剂，如表面活性化合物、细胞穿透肽、粘膜粘着性药物递送系统、螯合剂等。又一种选项可以是添加蛋白酶抑制剂。另一种选项是使用基于脂质的药物递送系统，如SEDDS、SMEDDS SNEDDS(自乳化、自微乳化或自纳米乳化药物递送系统)。上述药物递送系统可被配制成片剂或填充到合适的硬胶囊或软胶囊中，该胶囊可以被包覆以便以受控方式或在优选的肠段处释放活性化合物。
效力
如本文所用的术语“效力”意指基于与相关生物学性质相关的产物属性，使用适当定量生物测定法(也称为效力测定或生物学测定)测得的生物活性量度。
根据美国联邦法规，“效力”被定义为产品影响给定结果的特定能力。
相对效力(DP/DS)
如本文所用的术语“生物活性”或“活性”或“相对效力”(DP/DS)意为在生物测定法中使用的术语，该术语是指未知效力的测试样品(原料药)相比于药物产品(参考品)当在相同条件下进行测试时产生所需响应的能力。药物产品和原料药的效力的偏差不应超过30％，优选偏差应小于20％。
具体实施方式
通过以下本发明的非限制性实施方案进一步描述本发明：
1.测量药物产品相对于原料药的效力的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)使过表达胰岛素受体的细胞与所述药物产品或所述原料药接触；以及
(ii)对磷酸化的Akt进行定量；
其中所述药物产品是口服制剂中的胰岛素肽，或者是液体制剂中的低亲和力胰岛素肽。
2.根据实施方案1所述的方法，其包括(ii)用ELISA对磷酸化的Akt进行定量的步骤。
3.根据实施方案1所述的方法，其包括以下步骤：
(i)接种过表达胰岛素受体的细胞；
(ii)将所述药物产品或所述原料药加入/接触所述细胞；
(iii)裂解细胞；
(iv)将裂解物转移到预先用兔抗pAkt抗体包被的ELISA板中；
(v)通过小鼠抗pAkt抗体对所结合的pAkt进行定量；
(vi)通过HRP-抗小鼠IgG来检测小鼠抗Akt抗体；
(vii)添加HRP的底物；以及
(viii)测量显色。
4.根据实施方案1或3所述的方法，其中所述细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
5.根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(i)后，将细胞孵育过夜。
6.根据实施方案5所述的方法，其中将细胞在37℃下孵育过夜。
7.根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(ii)中，细胞与药物产品或原料药以2nM-20,000nM范围内的剂量接触。
8.根据实施方案1或3所述的方法，其中细胞与药物产品或原料药接触10分钟。
9.根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(iii)中，使细胞裂解30分钟。
10.根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(iv)中，兔抗pAkt抗体为磷酸-Akt(Ser473)(193H12)兔mAb。
11.根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(v)中，小鼠抗pAkt抗体为Akt1同种型特异性(2H10)小鼠mAb。
12.根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(vi)中为HRP-抗小鼠IgG。
13.根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(vii)中，HRP的底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。
14.根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(viii)中，在450nm处测量显色。
15.根据实施方案1所述的方法，其中Akt或蛋白激酶b(PKB)选自同工型Akt1、Akt2和Akt3。
16.根据实施方案15所述的方法，其中Akt为Akt1。
17.根据实施方案15所述的方法，其中Akt为Akt2。
18.根据实施方案15所述的方法，其中Akt为Akt3。
19.根据实施方案1所述的方法，其中胰岛素肽为胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
20.根据实施方案1所述的方法，其中药物产品相对于原料药的效力的偏差不应超过30％，且优选偏差小于20％。
21.根据实施方案1所述的方法，其中胰岛素肽为口服制剂中的胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
22.根据实施方案21所述的方法，其中胰岛素肽为进一步包含药学上可接受的赋形剂的口服制剂中的胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
23.根据实施方案21所述的方法，其中胰岛素衍生物选自：
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素；
A14E,B16H,B25H,29K(Nε二十烷二酰基-γGlu),desB30人胰岛素；
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素；以及
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε-(十八烷二酰基-gGlu),desB30人胰岛素。
24.根据实施方案23所述的方法，其中胰岛素衍生物为A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素。
25.根据实施方案23所述的方法，其中胰岛素衍生物为A14E,B16H,B25H,B29K(Nε二十烷二酰基-γGlu),desB30人胰岛素。
26.根据实施方案23所述的方法，其中胰岛素衍生物为A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素。
27.根据实施方案23所述的方法，其中胰岛素衍生物为A14E,B25H,desB27,B29K(Nε-(十八烷二酰基-gGlu),desB30人胰岛素。
28.根据实施方案22所述的方法，其中药学上可接受的赋形剂选自防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。
29.根据实施方案21所述的方法，其中将胰岛素类似物或胰岛素衍生物配制成片剂。
30.根据实施方案29所述的方法，其中将片剂溶解于缓冲液中。
31.根据实施方案30所述的方法，其中所述缓冲液为PBS或乙腈。
32.根据实施方案24所述的方法，其中A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素相对于人胰岛素的效力为0.0088。
33.根据实施方案26所述的方法，其中A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素相对于人胰岛素的效力为0.0064。
34.根据实施方案1所述的方法，其中胰岛素肽为液体制剂中的胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
35.根据实施方案34所述的方法，其中胰岛素肽为包含药学上可接受的赋形剂的液体制剂中的胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
36.根据实施方案1所述的方法，其中相对于人胰岛素，胰岛素类似物或胰岛素衍生物对胰岛素受体具有低亲和力。
37.根据实施方案1所述的方法，其中胰岛素类似物或胰岛素衍生物具有低的相对效力，即当按照pAkt测定法测量时，小于人胰岛素的效力的0.08％。
38.根据实施方案34所述的方法，其中胰岛素衍生物选自A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素和A14E,B16H,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素。
39.根据实施方案38所述的方法，其中胰岛素衍生物为A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素。
40.根据实施方案38所述的方法，其中胰岛素衍生物为A14E,B16H,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素。
41.根据实施方案35所述的方法，其中药学上可接受的赋形剂选自稀释剂、缓冲液、防腐剂、张度剂、等渗剂、螯合剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂、润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、膨胀剂(bulking agents)、金属离子、油性媒介物、蛋白质和/或两性离子和稳定剂。
42.根据实施方案41所述的方法，其中赋形剂为防腐剂。
43.根据实施方案42所述的方法，其中所述赋形剂为苯酚或甲酚。
44.根据实施方案39所述的方法，其中A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素相对于人胰岛素的效力为0.0006或0.06％。
45.根据实施方案1所述的方法，其中药物产品相对于原料药的效力是通过使用原料药和药物产品的EC50值计算的。
46.根据实施方案45所述的方法，其中药物产品相对于原料药的效力由EC50原料药/EC50药物产品计算。
实施例
该实验部分开始于缩写列表，随后为与生物测定法相关的部分。这些实施例用于说明本发明。
缩写列表
AEBSF：4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐
BHK：幼仓鼠肾细胞
CHO：中国仓鼠卵巢
CHO HIR：过表达人胰岛素受体的中国仓鼠卵巢细胞
DPBS：Dulbecco磷酸盐缓冲盐水
DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基
DP：药物产品
DS：原料药
ELISA：酶联免疫吸附测定
ERK：细胞外信号调节激酶
FCS：胎牛血清
FOXO：叉头框O
HRP：辣根过氧化物酶
HSA：人血清白蛋白
pAkt：磷酸化的Akt
PBS：磷酸盐缓冲盐水
P0、P1、P2：
MEM：极限必需培养基
MEM NEAA：极限必需培养基非必需氨基酸
MTX：氨甲蝶呤
RFU：相对荧光单位
RT：室温
SC：皮下
SD：标准偏差
SEM：平均值的标准误差
TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺
通用制备方法
为测定口服制剂中的胰岛素肽，将片剂(10800nmol/片或800nmol/片)溶解于15mLFalcon管中的含有0.5％FCS的10ml DPBS(Gibco，目录号14190)中。将管在血液管旋转器上在室温下转动3小时。将管在4℃下储存过夜。将不含沉淀物的悬浮液转移至新管中，随后进行测定。
A.胰岛素受体(InsR)磷酸化测定
细胞系和培养
用含有编码人胰岛素受体(HIR，+外显子11)的DNA的载体稳定转染CHO细胞。随后所选择的单克隆细胞系为CHO-hIR-A。在潮湿的5％CO2培养箱中，将细胞维持在培养瓶中的含有glutaMax、4.5g/L D-葡萄糖、丙酮酸钠、10％FBS、0.9％极限必需培养基(MEM)和0.004mg/ml MTX的DMEM中，并且每两天或每三天进行常规传代培养。在传代13-45之间使用细胞进行测定。
化学品和试剂
用于培养CHO细胞的培养基、FBS和化学品购自GIBCO。抗-HIR抗体(Mab IR83-14)由内部制备。铕标记的抗PY20抗体(DELFIA Eu-N1抗磷酸酪氨酸(PY20))购自
Figure GDA0002038493720000211
Figure GDA0002038493720000212
测定缓冲液、
Figure GDA0002038493720000213
增强溶液和
Figure GDA0002038493720000214
洗涤浓缩液购自
Figure GDA0002038493720000215
程序
使用TrypLETM选择试剂对CHO HIR细胞进行胰蛋白酶化，并将其在测定培养基(含有glutamax、4.5g/L D-葡萄糖、丙酮酸钠、9％FBS和0.9％MEM的DMEM)中稀释，计数，并接种于平底96孔组织培养板中，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。同时将96孔聚苯乙烯板在+4至+8℃下用Mab IR83-14(PBS，3μg/ml Mab83-14)包被过夜。去除包被缓冲液，并在振荡器(约300rpm)上添加冷Sabuf缓冲液(49.5mM TRIS，150.6mM NaCl，329.4mM山梨糖醇，0.46％BSA和0.05％叠氮化钠)至少持续2小时。将CHO HIR细胞在PBS中洗涤，并根据胰岛素类型，在37℃下用含有BSA的KREBS孵育缓冲液(0.11M NaCl，4.74mM KCl，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，5.6％Weltmann试剂，吐温20)中的含量逐渐增加的胰岛素刺激20-30分钟，随后在振荡器(约400rpm)上在室温下在裂解缓冲液(150.2mM NaCl，50mM Hepes，1％Triton-X100，0.2M原钒酸钠，3000KIU/ml抑肽酶和100mM AEBSF)中使细胞裂解2小时。将适量的细胞裂解物转移至Mab IR83-12包被的板上，并在振荡器(约300rpm)上孵育1小时，随后用
Figure GDA0002038493720000221
洗液洗涤三次。添加在
Figure GDA0002038493720000222
测定缓冲液中稀释至0.3μg/ml的标记抗PY20，并将板在+2至+8℃下孵育过夜。将板使用
Figure GDA0002038493720000223
洗液洗涤三次，然后添加
Figure GDA0002038493720000224
增强溶液，并在振荡器(约300rpm)上孵育至少1小时。使用Synergy2多模式读数器
Figure GDA0002038493720000225
以时间分辨模式来收集检测结果。
实施例1
口服制剂中的A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素的InsR磷酸化测定
将CHO细胞系转染以过表达人胰岛素受体。用DP(在溶解于含乙腈缓冲液中的片剂中以2700nmol/片配制的A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG desB30人胰岛素))或DS(A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG desB30人胰岛素)刺激细胞2分钟并使其裂解。使用ELISA对磷酸化的胰岛素受体进行定量。如图1所示，每个数据点代表三次重复的平均值以及标准偏差。数据显示在达到最大平台之前在所测试的最高浓度顶部来自片剂组分的干扰，因此该曲线无法拟合，并且无法计算效力。因此，该测定不适合测试在片剂中配制的胰岛素肽。
实施例2
液体制剂中的低亲和力胰岛素A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素的InsR磷酸化测定
将CHO细胞系转染以过表达人胰岛素受体。用DP(液体制剂中的A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG desB30人胰岛素))或DS(A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG desB30人胰岛素)刺激细胞2分钟并使其裂解。使用ELISA对磷酸化的胰岛素受体进行定量。如图2所示，在达到最大平台之前，在曲线顶部存在来自苯酚/甲酚的干扰。因此，该测定不适合测试液体制剂中的低亲和力胰岛素肽。
B.报道基因测定
细胞系和培养
根据制造商的手册，使用FuGene转染剂(Promega，目录号E2691)，用三种质粒来转染叙利亚仓鼠细胞系BHK-21[C-13](
Figure GDA0002038493720000231
CCL-10TM)。这三种质粒分别编码在上游激活物序列(UAS)调节下的胰岛素受体、GAL4-ELK1融合蛋白和萤火虫萤光素酶基因。使用选择剂(200μg/ml潮霉素，400μg/ml Zeocin和600μg/ml G418)产生稳定的细胞库。通过有限稀释来分离单细胞克隆，并选择表现最佳的克隆(克隆26)。随后在潮湿的5％CO2培养箱中，将选择的单克隆细胞系保持于培养瓶中的含有glutaMax、10％胎牛血清(FBS)、1％P/S和上述选择剂的DMEM中，并且每两天或每三天进行常规传代培养。
化学品和试剂
用于培养细胞的培养基、FBS和化学品购自GIBCO。
程序
用5ml维尔烯将细胞从细胞培养瓶中释放。将50,000个细胞以150μl/孔接种于白色96孔培养板(Perkin Elmer，目录号TC96 6005680)中的测定培养基[DMEM，谷氨酰胺，0.5％FBS]中。将板在37℃下在5％CO2培养箱中孵育过夜。将板清空，并添加100μl相关样品以刺激细胞。将板在37℃下在5％CO2培养箱中孵育5小时。将板从培养箱中取出，并使其在室温下静置15分钟。添加100μl/孔等份的Steady Glo(Promega，目录号E2550)。将板用TopSeal膜(PerkinElmer，目录号6050195)密封。将板用铝箔覆盖以使其避光，并在室温下振摇15分钟。在Envision读数器上对板进行分析。
实施例3
口服制剂中的A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素的报道基因测定
将BHK细胞系转染以过表达人胰岛素受体。该细胞系含有UAS(上游激活序列)萤光素酶质粒和确保过表达GAL4-ELK1的质粒。用DP(以10800nmol/片存在于片剂中的A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基γGlu-OEG-OEG desB30人胰岛素)或DS(A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG desB30人胰岛素)刺激细胞4小时。如图3所示，在达到最大平台之前在所测试的最高浓度顶部存在来自片剂组分的干扰，因此该曲线无法拟合，并且无法计算效力。因此，该测定不适合测试片剂中配制的胰岛素肽。
C.pAkt测定
胰岛素肽(类似物和衍生物)与胰岛素受体结合，其具有剂量依赖性作用。低于一定浓度时，该响应将由于过低而无法被测量(最小渐近线)，在较高浓度下该响应增加，并且在足够高的浓度下，该响应将不会进一步增加(最大渐近线)。剂量-响应曲线通常用四参数逻辑回归(4PL非线性回归模型)来拟合。其特征在于符合该曲线底部和顶部平台的S形、EC50和斜率因子(希尔斜率)。该曲线围绕其拐点对称。4PL方程为：F(x)＝D+(A-D)/(1+(x/C)^B)，其中：A＝最小渐近线；B＝希尔斜率(曲线的陡度)；C＝拐点(曲线上曲率改变方向或符号处的点，也被称为对应于50％最大响应的EC50)；D＝最大渐近线(Emax是激动剂的最大可能效果)。
术语“效力”是指EC50值。EC50越低，产生50％最大效果所需的药物浓度越低，且其效力越高。
对过表达人胰岛素受体的CHO细胞、H4IIE细胞系和原代大鼠脂肪细胞中的胰岛素受体下游多种细胞响应的敏感性(EC50值)的评估。对于信号传导，用媒介物或递增剂量的胰岛素处理细胞30分钟。按照说明，使细胞在适当的缓冲液中裂解，并通过Western印迹法或ELISA来确定胰岛素受体、Erk、Akt或Foxo的磷酸化。对于丝裂原活性，将H4IIE细胞与媒介物或增加剂量的胰岛素一起孵育，并通过检测胸苷掺入来测量细胞生长。对于大鼠游离脂肪细胞脂肪生成，将从胶原酶处理的附睾脂肪垫中分离出的原代脂肪细胞与H3标记的葡萄糖、媒介物或剂量渐增的人胰岛素一起孵育。2小时后，通过将脂质提取至Microscint-e中并使用顶部计数器测量放射性来测量葡萄糖的摄取和向脂质的转化。
对于所有方法：为了确定EC50值，使用Graphpad Prism软件将数据拟合至非线性4参数回归曲线。
Figure GDA0002038493720000251
Figure GDA0002038493720000261
发现Akt是灵敏的读出。无法使用其他灵敏的读出，如FOXO，因为很难产生用于FOXO磷酸化测定的抗体。
细胞系和培养
用含有编码人胰岛素受体(HIR，+外显子11)的DNA的载体稳定转染CHO细胞。随后选择的单克隆细胞系为CHO-hIR-A。在潮湿的5％CO2培养箱中，将细胞维持在培养瓶中的含有glutaMax、4.5g/LD-葡萄糖、丙酮酸钠、10％FBS、0.9％极限必需培养基(MEM)和0.004mg/ml MTX的DMEM中，并且每两天或每三天进行常规传代培养。在传代13-45之间使用细胞进行测定。
化学品和试剂
用于培养PTH CHO细胞的培养基、FBS和化学品购自GIBCO。抗体和TMB购自CellSignaling
Figure GDA0002038493720000262
程序
将10000个FCW128-5细胞/孔接种于平底96孔板(Nunc)中的100μL上述DMEM培养基中。将板在37℃、5％CO2下孵育过夜。将培养基更换为80μl/孔的饥饿培养基：含有0.5％HSA(Sigma)、1％P/S、1％MEM NEAA、4μg/ml MTX的DMEM，并在37℃、5％CO2下孵育5小时。随后在37℃、5％CO2下，用在饥饿培养基中每孔5x终浓度的20μl/孔的相关样品刺激细胞10分钟。将板置于冰上，排空，并用100μl/孔冷PBS洗涤，并再次排空。每孔添加20μl冷裂解缓冲液[(Biosource细胞提取缓冲液(Life Technologies)，1mM AEBSF(Life Technologies)，蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)]。将板在冰上孵育30分钟(混合三次)。将裂解物转移至预包被的ELISA板，用于测定pAkt含量(参见下文)。
将96孔半面积ELISA板(Costar)用50μl/孔的在DPBS(Gibco)中的0.5μg/ml抗磷酸-Akt兔mAb——克隆193H12(Cell Signalling)包被，并在4℃下孵育过夜。用125μl/孔洗涤缓冲液(DPBS+0.05％吐温20)洗涤ELISA板四次。添加125μl/孔封闭缓冲液(DPBS，0.05％吐温20，1％BSA)，并将板在室温下孵育2小时。将ELISA板洗涤四次。添加50μl/孔细胞裂解液，并将板在室温下振摇孵育过夜。将ELISA板洗涤四次。每孔添加50μl在封闭缓冲液中的0.7μg/ml抗磷酸-Akt小鼠mAb——克隆2H10(Cell Signalling)。将板在室温下孵育1小时。将ELISA板洗涤四次。每孔添加50μl以1:1000稀释的抗小鼠IgG，HRP连接的抗体(CellSignalling)。将板在室温下孵育30分钟。将ELISA板洗涤四次。每孔添加50μl TMB(Kem-En-Tec)。约8分钟后用每孔50μl 4M磷酸来终止反应。通过ENVISION读数器(Perkin Elmer)在450nm处对显色进行定量。分析结果受“生物学差异”的影响(例如，测定法中测定结果的居间精确度高达约15％被认为正常)。
实施例4
液体制剂中的低胰岛素A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素的pAkt测定
将CHO细胞系转染以过表达人胰岛素受体。用DP(在25mM苯酚和25mM间甲酚中以4200nmol/ml配制的用于SC递送的A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG desB30人胰岛素)或DS(A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEGdesB30人胰岛素)刺激细胞10分钟并使其裂解。使用ELISA对磷酸化的Akt1进行定量。如图4所示，数据点代表三次重复的平均值+/-SD。因此，在生物测定中，不存在来自赋形剂苯酚/甲酚的干扰。
下表中示出了所获得的相对效力。DP的效力与DS偏差2％。
胰岛素 相对效力 EC<sub>50</sub>(nM)
DS 1 619
DP 1.02 591
实施例5
口服制剂中的A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素的pAkt测定
将CHO细胞系转染以过表达人胰岛素受体。用DP(在溶解于含乙腈缓冲液中的片剂中的A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG desB30人胰岛素)或DS(A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG)desB30人胰岛素)刺激细胞10分钟并使其裂解。使用ELISA对磷酸化的Akt1进行定量。如图5a所示，数据点代表三次重复的平均值+/-SD。图5a)代表低剂量片剂(800nmol/片)。不存在来自片剂赋形剂的干扰。
下表中示出了所获得的相对效力。DP(800nmol片剂)的效力与DS偏差9％。
胰岛素 相对效力 EC<sub>50</sub>(nM)
DS 1 25
DP(800nmol) 0.91 25
图5b)代表高剂量片剂(10800nmol/片)。不存在来自片剂赋形剂的干扰。
下表中示出了所获得的相对效力。DP(10800nmol片剂)的效力与DS偏差22％。
Figure GDA0002038493720000281
Figure GDA0002038493720000291
实施例6
口服制剂中的A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素的pAkt测定
将CHO细胞系转染以过表达人胰岛素受体。用DP(溶解于含乙腈缓冲液中的2700nmol/片的A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG desB30人胰岛素)或DS(A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG desB30人胰岛素)刺激细胞10分钟并使其裂解。使用ELISA对磷酸化的Akt1进行定量。如图6所示，数据点代表三次重复的平均值+/-SD。因此，在生物测定中，不存在来自片剂组分的干扰。下表中示出了所获得的相对效力。DP的效力与DS偏差3％，这意味着相对效力(DP/DS)为优选的。
胰岛素 相对效力 EC<sub>50</sub>(nM)
DS 1 44
DP 0.97 47
比较实施例7
以下物质的pAkt测定：(i)A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素；(ii)A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素；(iii)A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素；以及人胰岛素
在用于通过对Akt的磷酸化水平进行定量来测量胰岛素类似物的效力的测定中，将三种人胰岛素类似物[(i)、(ii)和(iii)]与人胰岛素进行比较。将CHO细胞系转染以过表达人胰岛素受体。用胰岛素及其类似物刺激细胞10分钟并使其裂解。使用ELISA对磷酸化的Akt进行定量。使用SAS JMP 12.2.04参数逻辑回归(4PL)来计算效力。随后将相对效力计算为：EC50类似物或衍生物/EC50人胰岛素。这些类似物按以下顺序排序：A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG)desB30人胰岛素，A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)desB30人胰岛素和A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG)desB30人胰岛素，其中后者显示出最高效力。由图7可以看出，相对于人胰岛素，类似物A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素显示出0.64％的相对效力，类似物A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素显示出0.88％的相对效力，而类似物A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素显示出0.06％的相对效力。从该实施例可以明显看出，A14E,B16E,B25H,B29K(N(eps)二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素是低亲和力和低效力的胰岛素。该数据说明了该测定法在不同类似物的效力方面在非常宽泛的范围内起作用的能力。
Figure GDA0002038493720000301
效力的计算
通过用人胰岛素或其类似物以七种不同浓度刺激细胞来进行实验，制作具有顶部和底部平台的完整滴定曲线。每种浓度一式三份进行。
根据美国药典的第4.6节和欧洲药典7.0的第5.3节，使用SAS JMP 12.2.04参数逻辑回归(4PL)计算效力。也可以通过使用本领域的其他已知软件来计算效力。然而，分析结果受“生物学差异”的影响(例如，测定法中测定结果的居间精确度为15％是正常的)。
在4PL生物测定法中，将四参数逻辑(4PL)函数拟合于作为所研究产物的对数浓度的函数的所测得的测定响应。该4PL函数在JMP中具有以下参数化，其中x是剂量的自然对数：
Figure GDA0002038493720000311
其中
a为增长率；
b为拐点；
c为下渐近线；
d为上渐近线。
拐点b确定其中响应达到下渐近线与上渐近线之间的一半的值的对数剂量。原始剂量尺度上的相应值被表示为EC50，并由下式给出：
EC50＝exp(b)
如果曲线平行，则药物产品相对于原料药的相对效力为EC50值的比例，
Figure GDA0002038493720000312
当相对效力以百分比形式讨论时，以上数字乘以100％。
药物产品和原料药的效力不应偏差超过30％，并且优选地偏差应小于20％。
Figure IDA0002038493730000011
Figure IDA0002038493730000021
Figure IDA0002038493730000031
Figure IDA0002038493730000041
Figure IDA0002038493730000051
Figure IDA0002038493730000061
Figure IDA0002038493730000071

Claims (35)

1.测量药物产品相对于原料药的效力的方法，其中药物产品相对于原料药的效力是通过使用原料药和药物产品两者的EC50值由EC50原料药/EC50药物产品计算的，所述方法包括以下步骤：
(i)使过表达胰岛素受体的细胞与所述药物产品或所述原料药接触；以及
(ii)对磷酸化的Akt进行定量；
其中所述药物产品是口服制剂中的胰岛素肽，或者是液体制剂中的低亲和力胰岛素肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括(ii)用ELISA对磷酸化的Akt进行定量的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：
(i)接种过表达胰岛素受体的细胞；
(ii)将所述药物产品或所述原料药加入/接触所述细胞；
(iii)裂解细胞；
(iv)将裂解物转移到预先用兔抗pAkt抗体包被的ELISA板中；
(v)通过小鼠抗pAkt抗体对所结合的pAkt进行定量；
(vi)通过HRP-抗小鼠IgG来检测小鼠抗Akt抗体；
(vii)添加HRP的底物；以及
(viii)测量显色，
其中pAkt是磷酸化的Akt。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(i)后，将细胞孵育过夜。
6.根据权利要求5所述的方法，其中将细胞在37℃下孵育过夜。
7.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(ii)中，细胞与药物产品或原料药以2nM-20,000nM范围内的剂量接触。
8.根据权利要求1或3所述的方法，其中细胞与药物产品或原料药接触10分钟。
9.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(iii)中，使细胞裂解30分钟。
10.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(iv)中，兔抗pAkt抗体为磷酸-Akt(Ser473)(193H12)兔mAb。
11.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(v)中，小鼠抗pAkt抗体为Akt1同种型特异性(2H10)小鼠mAb。
12.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(vi)中为HRP-抗小鼠IgG。
13.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(vii)中，HRP的底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
14.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(viii)中，在450nm处测量显色。
15.根据权利要求1所述的方法，其中Akt选自同工型Akt1、Akt2和Akt3。
16.根据权利要求15所述的方法，其中Akt为Akt1。
17.根据权利要求15所述的方法，其中Akt为Akt2。
18.根据权利要求15所述的方法，其中Akt为Akt3。
19.根据权利要求1所述的方法，其中胰岛素肽为胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
20.根据权利要求1所述的方法，其中胰岛素肽为口服制剂中的胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中胰岛素肽为进一步包含药学上可接受的赋形剂的口服制剂中的胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
22.根据权利要求20所述的方法，其中胰岛素衍生物选自：
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε-十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素；
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε-二十烷二酰基-γGlu),desB30人胰岛素；
A14E,B25H,B29K(Nε-十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素；以及
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε-十八烷二酰基-gGlu),desB30人胰岛素。
23.根据权利要求21所述的方法，其中药学上可接受的赋形剂选自防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中药学上可接受的赋形剂为防腐剂。
25.根据权利要求20所述的方法，其中将胰岛素类似物或胰岛素衍生物配制成片剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中将片剂溶解于缓冲液中。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述缓冲液为PBS或乙腈。
28.根据权利要求1所述的方法，其中胰岛素肽为液体制剂中的胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中胰岛素肽为包含药学上可接受的赋形剂的液体制剂中的胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
30.根据权利要求1所述的方法，其中相对于人胰岛素，胰岛素类似物或胰岛素衍生物对胰岛素受体具有低亲和力。
31.根据权利要求1所述的方法，其中胰岛素类似物或胰岛素衍生物具有低的相对效力，即当按照pAkt测定法测量时，小于人胰岛素的效力的0.08％。
32.根据权利要求28所述的方法，其中胰岛素衍生物选自A14E,B16E,B25H,B29K(Nε-二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素和A14E,B16H,B25H,B29K(Nε-二十烷二酰基-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素。
33.根据权利要求29所述的方法，其中药学上可接受的赋形剂选自稀释剂、缓冲液、防腐剂、张度剂、等渗剂、螯合剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂、润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、膨胀剂、金属离子、油性媒介物、蛋白质和/或两性离子和稳定剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中赋形剂为防腐剂。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述赋形剂为苯酚或甲酚。
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