DE69737479T4

DE69737479T4 - Glp-1 derivate

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Publication number: DE69737479T4
Application number: DE69737479T
Authority: DE
Inventors: Liselotte Bjerre Knudsen; Per Olaf SøRENSEN; Per Franklin Nielsen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2010-05-06
Anticipated expiration: 2017-08-23
Also published as: NL300422I1; AU732957B2; CA2468374C; BR9711437A; EP1826216A1; CZ62999A3; UA72181C2; NL300422I2; ES2283025T3; CZ300837B6; NO2019036I1; WO1998008871A1; JP2001011095A; IL128332A; PL331896A1; KR20000035964A; AU732957C; BRPI9711437B8; EP0944648B1; NO990950D0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Derivate von menschlichem gluconartigem Peptid-1 (glucon-like peptide-1; GLP-1) und Fragmente davon und Analoga derartiger Fragmente, die ein lang anhaltendes Wirkungsprofil aufweisen, und Verfahren zu der en Herstellung und Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Peptide werden weithin in der medizinischen Praxis verwendet, und, da sie durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden können, ist es zu erwarten, dass ihre Bedeutung auch in den kommenden Jahren zunimmt. Werden native Peptide oder Analoga davon therapeutisch verwendet, ist im Allgemeinen zu finden, dass sie eine hohe Clearance aufweisen. Eine hohe Clearance eines Therapeutikums ist in Fällen, in welchen es erwünscht ist, über eine längere Zeitdauer einen hohen Blutgehalt davon beizubehalten, ungünstig, da dann wiederholte Verabreichungen nötig sind. Beispiele für Peptide, die eine hohe Clearance aufweisen, sind: ACTH, Corticotropin-freisetzender Faktor, Angiotensin, Calcitonin, Insulin, Glucagon, glucagonartiges Peptid-1, glucagonartiges Peptid-2, insulinartiger Wachstumsfaktor-1, insulinartiger Wachstumsfaktor-2, gastrisches inhibitorisches Peptid, Wachstumshormon-freisetzender Faktor, Hypophysenadenylatcyclase-aktivierendes Peptid, Sekretin, Enterogastrin, Somatostatin, Somatotropin, Somatomedin, Paratropin, Thrombopoietin, Erythropoietin, Hypothalamus-freisetzende Faktoren, Prolactin, Thyrotropine, Endorphine, Enkephaline, Vasopressin, Oxytozin, Opioide und Analoga davon, Superoxiddismutase, Interferon, Asparaginase, Arginase, Arginindeaminase, Adenosindeaminase und Ribonuklease. In einigen Fällen ist es möglich, das Freisetzungsprofil von Peptiden durch Anwenden von geeigneten Arzneimitteln zu beeinflussen, jedoch weist diese Vorgehensweise verschiedene Nachteile auf und ist nicht allgemein anwendbar.
Die Hormone, die die Insulinabsonderung regulieren, gehören zu der so genannten Enteroinselachse, die eine Gruppe von Hormonen bezeichnet, die als Reaktion auf die Gegenwart und Absorption von Nähstoffen im Darm von der Magen-Darm-Schleimhaut freigesetzt werden, die eine frühe und wirksam gemachte Insulinfreisetzung fördern. Die Verbesserungswirkung auf die Insulinabsonderung, die so genannte Inkretin-Wirkung, ist möglicherweise für eine normale Glucosetoleranz bedeutsam. Viele der Magen-Darm-Hormone, einschließlich Gastrin und Sekretin (Cholecystokinin ist beim Menschen nicht insulinotrop) sind insulinotrop, jedoch handelt es sich bei den einzigen physiologisch Wichtigen, denjenigen, die für die Inkretin-Wirkung verantwortlich sind, um das glucoseabhängige insulinotrope Polypeptid, GIP, und das glucagonartige Peptid-1 (GLP-1). Aufgrund seiner insulinotropen Wirkung fand das 1973 isolierte GIP (1) unter Diabetologen sofort beträchtliches Interesse. Jedoch wurden in den darauffolgenden Jahren zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, die klar darauf hinwiesen, dass eine fehlerhafte Absonderung von GIP an der Krankheitsentstehung von insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) oder nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) nicht beteiligt war (2). Des Weiteren wurde gefunden, dass ein insulinotropes Hormon, GIP, bei NIDDM nahezu unwirksam war (2). Das andere Inkretin-Hormon, GLP-1, ist die wirksamste insulinotrope Substanz, die bekannt ist (3). Anders als GIP ist es beim Stimulieren der Insulinabsonderung bei NIDDM-Patienten überraschend wirksam. Zudem und im Gegensatz zu den anderen insulinotropen Hormonen (möglicherweise mit Ausnahme von Sekretin) hemmt es auch wirksam die Glucagonabsonderung. Aufgrund dieser Aktionen weist es insbesondere bei Patienten mit NIDDM ausgeprägte Blutglucose-senkende Wirkungen auf.
GLP-1, ein Produkt des Proglucagons (4), ist eines der jüngsten Vertreter der Sekretin-VIP-Familie, ist jedoch als wichtiges Darmhormon mit regulatorischer Funktion beim Glucosestoffwechsel und der Magen-Darm-Absonderung und dem Magen-Darm-Stoffwechsel schon etabliert (5). Das Glucagongen wird in der Bauchspeicheldrüse und im Darm verarbeitet. In der Bauchspeicheldrüse (9) führt die Verarbeitung zur Bildung und gleichzeitigen Absonderung von 1) Glucagon selbst, das die Positionen 33-61 von Proglucagon (PG) einnimmt; 2) einem N-terminalen Peptid mit 20 Aminosäuren (PG(1-30)), häufig als Gilcetinverwandtes Bauchspeicheldrüsenpeptid, GRPP, bezeichnet (10 11); 3) einem Hexapeptid, entsprechend PG(64-69); 4) und schließlich des so genannten Hauptproglucagonfragments (PG(72-158)), in welchem die beiden glucagonartigen Sequenzen verborgen sind (9). Glucagon scheint das einzige biologisch aktive Produkt zu sein. Im Gegensatz dazu ist es in der Darmschleimhaut Glucagon, das in einem größeren Molekül verborgen ist, während die beiden glucagonartigen Peptide getrennt gebildet werden (8). Die folgenden Produkte werden gleichzeitig gebildet und abgesondert: 1) Glicentin, entsprechend PG(1-69), wobei die Glucagonsequenz die Reste Nr. 33–61 einnimmt (12); 2) GLP-1(7-36)amid (PG(78-107))amid (13), nicht wie ursprünglich angenommen PG(72-107)amid oder 108, das inaktiv ist). Kleine Mengen an C-terminalen Glycin-verlängerten, jedoch gleichermaßen bioaktiven GLP-1(7-37), (PG(78-108)) werden ebenfalls gebildet (14); 3) intervenierendes Peptid-2 (PG(111-122)amid) (15); und 4) GLP-2(PG(126-158)) (15, 16). Eine Glicentinfraktion wurde weiter zu GRPP (PG(1-30)) und Oxyntomodulin (PG(33-69)) (17, 18) aufgespaltet. Unter diesen Peptiden weist GLP-1 die auffälligsten biologischen Aktivitäten auf.
Aus der mit Glicentin/Enteroglucagon gleichzeitigen Absonderung, folgt dass die vielen Studien der Enteroglucagonabsonderung (6, 7) zu einem gewissen Grad auch für die GLP-1-Absonderung gelten, jedoch wird GLP-1 mit einer Plasma-Halbwertszeit im Menschen von 2 Min. schneller metabolisiert (19). Kohlenhydrat- oder fettreiche Mahlzeiten stimulieren vermutlich infolge der direkten Wechselwirkung von noch nicht absorbierten Nährstoffen mit den Kleinzotten der L-Zellen vom offenen Typ der Darmschleimhaut die Absonderung (20). Endokrine oder neuronale Mechanismen, die die GLP-1-Absonderung fördern, können vorliegen, wurden jedoch im Menschen bisher noch nicht aufgezeigt.
Die Inkretin-Funktion von GLP-1(29-31) wurde in Versuchen mit dem GLP-1-Rezeptorantagonisten, Exendin 9-39, der die durch orale Glucose in Ratten ausgelösten Inkretin-Wirkung drastisch reduziert, deutlich veranschaulicht (21, 22). Das Hormon zeigt eine direkte Wechselwirkung mit den β-Zellen über den GLP-1-Rezeptor (23), der zu der Glucagon/VIP/Calcitonin-Familie von G-Proteingekuppelten 7-Transmembran-umspannenden Rezeptoren gehört. Die Bedeutung des GLP-1-Rezeptors beim Regulieren der Insulinabsonderung wurde in jüngsten Versuchen veranschaulicht, in welchen eine gezielte Spaltung des GLP-1-Rezeptorgens in Mäusen durchgeführt wurde. Tiere, die für die Spaltung homozygot waren, hatten eine stark verschlechterte Glucosetoleranz und Nüchternhyperglykämie, und selbst heterozygote Tiere waren glucoseintolerant (24). Der Signalübertragungsmechanismus (25) bringt hauptsächlich die Aktivierung von Adenylatcyclase mit sich, jedoch waren auch Erhöhungen des intrazellulären Ca²⁺ beträchtlich (25, 26). Die Wirkung des Hormons ist am Besten als Potenzierung von glucosestimulierter Insulinfreisetzung zu beschreiben (25), jedoch ist der Mechanismus, der Glucose- und GLP-1-Stimulierung verbindet, nicht bekannt. Er kann eine calciuminduzierte Calciumfreisetzung mit sich bringen (26, 27). Wie schon erwähnt, wird die insulinotrope Wirkung von GLP-1 in diabetischen γ-Zellen bewahrt. Die Beziehung von Letzterem zu dem Vermögen, eine „Glucosekompetenz” zu vermitteln, zu isolierten insulinabsondernden Zellen (26, 28), die auf Glucose oder GLP-1 allein schlecht, jedoch vollständig auf eine Kombination der beiden ansprechen, ist ebenfalls nicht bekannt. Gleichermaßen wichtig jedoch hemmt das Hormon auch wirksam die Glucagonabsonderung (29). Der Mechanismus ist nicht bekannt, scheint jedoch über benachbarte Insulin- oder Somatostatinzellen paracrin zu sein. Auch ist die glucagonostatische Wirkung glucoseabhängig, so dass die hemmende Wirkung abnimmt, wenn die Blutglucose abnimmt. Aufgrund dieser Doppelwirkung ist, wenn die Plasma-GLP-1-Konzentrationen entweder durch eine erhöhte Absonderung oder durch exogene Infusion zunehmen, das Molverhältnis von Insulin zu Glucagon im Blut, das über die Portalzirkulation die Leber erreicht, stark erhöht, wodurch die Leberglucoseproduktion abnimmt (30). Infolgedessen nehmen die Blutglucosekonzentrationen ab. Aufgrund der Glucoseabhängigkeit der insulinotropen und glucagonostatischen Wirkungen ist der glucosesenkende Effekt selbstbeschränkend, und das Hormon verursacht ungeachtet der Dosis keine Hypoglykämie (31). Die Wirkungen werden in Patienten mit Diabetes mellitus bewahrt (32), in welchen Infusionen von leicht supraphysiologischen Dosen von GLP-1 Blutglucosewerte trotz der schlechten metabolischen Steuerung und des Sekundärversagens von Sulfonylharnstoff vollständig normalisiert (33). Die Bedeutung der glucagonostatischen Wirkung wird durch den Fund veranschaulicht, dass GLP-1 ohne Restkapazität der β-Zell-Absonderung auch Blutglucose in Patienten mit Diabetes Typ 1 senkt (34).
Zusätzlich zu seinen Wirkungen auf die Langerhans-Inseln wirkt sich GLP-1 stark auf den Magen-Darm-Trakt aus. In physionlogischen Mengen infundiert, hemmt GLP-1 wirksam die Pentagastrin-induzierte sowie die durch Mahlzeiten induzierte Magensäureabsonderung (35, 36). Es hemmt auch die Entleerungsgeschwindigkeit des Magens und die Absonderung des Bauchspeicheldrüsenenzyms (36). Ähnliche hemmende Wirkungen auf die Magen- und Bauchspeicheldrüsenabsonderung und -beweglichkeit können beim Menschen durch Perfusion des Ileums mit kohlenhydrat- oder lipidhaltigen Lösungen ausgelöst werden (37, 38). Gleichzeitig wird die GLP-1-Absonderung stark stimuliert, und es wurden Vermutungen angestellt, dass GLP-1 zumindest teilweise für diese so genannte „Ileum-Brems”-Wirkung verantwortlich sein kann. Tatsächlich legen jüngste Studien nahe, dass die Ileum-Brems-Wirkungen von GLP-1 physiologisch bedeutender als seine Wirkungen auf die Langerhans-Inseln sind. Folglich beeittflusst GLP-1 in Dosis-Wirkungs-Studien die Entleerungsgeschwindigkeit des Magens bei Infusionsgeschwindigkeiten, die mindestens so niedrig wie diejenigen sind, die zum Beeinflussen der Inselabsonderung erforderlich sind (39).
GLP-1 scheint eine Wirkung auf die Nahrungsaufnahme zu haben. Eine intraventrikuläre Verabreichung von GLP-1 hemmt hochgradig die Nahrungsaufnahme in Ratten (40, 42). Diese Wirkung scheint äußerst spezifisch zu sein. So ist N-terminal-verlängertes GLP-1(PG 72-107)amid inaktiv, und geeignete Dosen des GLP-1-Antagonisten Exendin 9-39 heben die Wirkungen von GLP-1 auf (41). Eine akute periphere Verabrei chung von GLP-1 hemmt die Nahrungsaufnahme in Ratten nicht akut (41, 42). Jedoch bleibt die Möglichkeit bestehen, dass aus den L-Zellen des Darms abgesondertes GLP-1 auch als Sättigungssignal wirken kann.
Nicht nur insulinotrope Wirkungen, sondern auch die Wirkungen von GLP-1 auf den Magen-Darm-Trakt werden in diabetischen Patienten bewahrt (43) und können durch Mahlzeiten induzierte Glucoseabweichungen unterstützen, jedoch bedeutender auch die Nahrungsmittelaufnahme beeinflussen. es zeigte sich, dass intravenös kontinuierlich für eine Dauer von einer Woche verabreichtes GLP-1 mit 4 ng/kg/Min. ohne erhebliche Nebenwirkungen die glykämische Steuerung in NIDDM-Patienten drastisch verbessert (44). Das Peptid ist nach einer subkutanen Verabreichung voll aktiv (45), wird jedoch hauptsächlich aufgrund des Abbaus durch Dipeptidylpeptidase-IV-artige Enzyme rasch abgebaut (46, 47).
Die Aminosäuresequenz von GLP-1 ist u. a. von Schmidt et al. (Diabetologia 28 704–707 (1985) bereitgestellt. Obwohl die interessanten pharmakologischen Eigenschaften von GLP-1(7-37) und Analoga davon in den letzten Jahren viel Aufmerksamkeit erregten, ist nur wenig über die Struktur dieser Moleküle bekannt. Die Sekundärstruktur von GLP-1 in Mizellen wurde von Thorton et al. (Biochemistry 33 3532–3539 (1994)) beschrieben, jedoch wird in normaler Lösung GLP-1 als sehr flexibles Molekül betrachtet. Überraschenderweise fanden wir, dass eine Derivatisierung dieses relativ kleinen und sehr flexiblen Moleküls zu Verbindungen führte, deren Plasmaprofil sehr viel länger anhielt und die immer noch Aktivität beibehielten.
GLP-1 und GLP-1-Analoga und Fragmente davon sind möglicherweise u. a. bei der Behandlung von Diabetes Typ 1 und Typ 2 nützlich. Jedoch beschränkt die hohe Clearance die Nützlichkeit dieser Verbindungen und folglich besteht immer noch eine Notwenigkeit für Verbesserungen auf diesem Gebiet. Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Derivate von GLP-1 und Analoga davon bereitzustellen, die ein lang anhaltendes Wirkungsprofil in Bezug auf GLP-1(7-37) aufweisen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Derivate von GLP-1 und Analoga davon bereitzustellen, die eine niedrigere Clearance als GLP-1(7-37) aufweisen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein eine erfindungsgemäße Verbindung umfassendes Arzneimittel bereitzustellen und eine Verbindung der Erfindung zu verwenden, um ein derartiges Mittel bereitzustellen. Auch ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von insulinabhängiger und nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus bereitzustellen.
Literaturangaben

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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Menschliches GLP-1 ist ein Peptid mit 37 Aminosäureresten, das von Präproglucagon stammt, das u. a. in den L-Zellen des Distalileums, in der Bauchspeicheldrüse und im Gehirn synthetisiert wird. Die Verarbeitung von Präproglucagon zum Erhalt von GLP-1(7-36)amid, GLP-1(7-37) und GLP-2 findet hauptsächlich in den L-Zellen statt. Ein einfaches System wird zum Beschreiben von Fragmenten und Analoga dieses Peptids verwendet. So bezeichnet z. B. Gly⁸-GLP-1(7-37) ein GLP-1-Fragment, das durch Deletieren der Aminosäurereste Nr. 1 bis 6 und Substituieren des natürlich vorkommenden Aminosäurerests in Position 8 (Ala) durch Gly formal von GLP-1 abgeleitet ist. Gleichermaßen bezeichnet Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37) GLP-1(7-37), in welchem die ε-Aminogruppe des Lys-Rests in Position 34 tetradecanoyliert worden ist. Wird in diesem Text auf C-terminal verlängerte GLP-1-Analoga Bezug genommen, ist, wenn nicht anders angegeben, der Aminosäurerest in Position 38 Arg, ist wenn nicht anders angegeben, der optionale Aminosäurerest in Position 39 ebenfalls Arg und ist, wenn nicht anders angegeben, der optionale Aminosäurerest in Position 40 Asp. Falls sich ein C-terminal verlängertes Analogon auf Position 41, 42, 43, 44 oder 45 verlängert, ist, wenn nicht anders angegeben, die Aminosäuresequenz dieser Verlängerung wie in der entsprechenden Sequenz im menschlichen Präproglucagon.
In ihrem breitesten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Derivate von GLP-1 und Analoga davon. Die erfindungsgemäßen Derivate weisen interessante pharmakologische Eigenschaften auf, insbesondere weisen sie ein länger anhaltendes Wirkungsprofil als die Ursprungspeptide auf.
Im vorliegenden Text wird die Bezeichnung „ein Analogon” verwendet, um ein Peptid zu bezeichnen, in welchem ein oder mehrere Aminosäurereste des Ursprungspeptids durch einen anderen Aminosäurerest substituiert worden sind und/oder wobei ein oder mehrere Aminosäurereste des Ursprungspeptids deletiert worden sind und/oder wobei ein oder mehrere Aminosäurereste an das Ursprungspeptid addiert worden sind. Eine derartige Addition kann entweder am N-terminalen Ende oder am C-terminalen Ende des Ursprungspeptids oder an beidem stattfinden.
Der Ausdruck „Derivat” wird im vorliegenden text verwendet, um ein Peptid zu bezeichnen, in welchem ein oder mehrere der Aminosäurereste des Ursprungspeptids, z. B. durch Alkylierung, Acylierung, Esterbildung oder Amidbildung chemisch modifiziert worden sind.
Der Ausdruck „ein GLP-1-Derivat” wird im vorliegenden Text verwendet, um ein Derivat von GLP-1 oder ein Analogon davon zu bezeichnen. Im vorliegenden Text wird das Ursprungspeptid, von welchem ein derartiges Derivat formal abgeleitet ist, an manchen Stellen als die „GLP-1-Einheit” des Derivats bezeichnet.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, in welchem mindestens ein Aminosäurerest des Ursprungspeptids einen angelagerten lipophilen Substituenten aufweist, mit der Maßgabe, dass, falls nur ein lipophiler Substituent vorliegt und dieser Substituent am N-terminalen oder C-terminalen Aminosäurerest des Ursprungspeptids angelagert ist, dieser Substituent dann eine Alkylgruppe oder eine Gruppe, die eine ω-Carbonsäuregruppe aufweist, ist.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein GLP-1-Derivat mit nur einem lipophilen Substituenten.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein GLP-1-Derivat mit nur einem lipophilen Substituenten, wobei der Substituent eine Alkylgruppe oder eine Gruppe ist, die eine ω-Carbonsäuregruppe aufweist und am N-terminalen Aminosäurerest des Ursprungspeptids angelagert ist.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein GLP-1-Derivat mit nur einem lipophilen Substituenten, wobei der Substituent eine Alkylgruppe oder eine Gruppe ist, die eine ω-Carbonsäuregruppe aufweist und am C-terminalen Aminosäurerest des Ursprungspeptids angelagert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie beschrieben in Anspruch 1, betrifft die vorliegende Erfindung ein Derivat von GLP-1(7-37) oder ein Analogon von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nur einen lipophilen Substituenten aufweist, der an einen Aminosäurerest angelagert ist, bei welchem es sich nicht um den N-terminalen oder C-terminalen Aminosäurerest handelt.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, in welchem zwei lipophile Substituenten vorliegen.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, in welchem zwei lipophile Substituenten vorliegen, wobei einer am N-terminalen Aminosäurerest angelagert ist, während der andere am C-terminalen Aminosäurerest angelagert ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, wie beschrieben in Anspruch 3, betrifft die vorliegende Erfindung ein Derivat von GLP-1(7-37) oder ein Analogon von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nur zwei lipophile Substituenten aufweist, die an die Aminosäurereste angelagert sind, bei welchen es sich nicht um die N-terminalen oder die C-terminalen Aminosäurereste handelt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, wie beschrieben in Anspruch 2, betrifft die vorliegende Erfindung ein Derivat von GLP-1(7-37) oder ein Analogon von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nur zwei lipophile Substituenten aufweist, wobei einer am C-terminalen Aminosäurerest angelagert ist, während der andere an einem Aminosäurerest angelagert ist, bei welchem es sich nicht um die N-terminalen oder die C-terminalen Aminosäurereste handelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wie beschrieben in Anspruch 4, betrifft die vorliegende Erfindung ein Derivat eines Analogons von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist und wobei das Analogon GLP-1(7-C) ist, wobei C 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 und 45 beträgt, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nur einen lipophilen Substituenten aufweist, der am C-terminalen Aminosäurerest angelagert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem der lipophile Substituent 4 bis 40 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt 8 bis 25 Kohlenstoffatome umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent in einer derartigen Weise an einen Aminosäurerest angelagert ist, dass eine Carboxygruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests bildet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent in einer derartigen Weise an einen Aminosäurerest angelagert ist, dass eine Aminogruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe des Aminosäurerests bildet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter an das Ursprungspeptid angelagert ist.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent – wahlweise durch einen Abstandhalter – an die ε-Aminogruppe eines im Ursprungspeptid enthaltenen Lys-Rests angelagert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem es sich um eine unverzweigte Alkan-α,ω-dicarbonsäuregruppe mit 1 bis 7 Methylengruppen, vorzugsweise zwei Methylengruppen handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist, wobei der Abstandhalter eine Brücke zwischen einer Aminogruppe des Ursprungspeptids und einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten bildet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem es sich um einen Aminosäurerest außer Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist. Im vorliegenden text wird der Ausdruck „ein Dipeptid wie Gly-Lys” verwendet, um ein Dipeptid zu bezeichnen, in welchem der C-terminale Aminosäurerest Lys, His oder Trp, vorzugsweise Lys ist, und in welchem der N-terminale Aminosäurerest ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Ala, Arg, Asp, Asn, Gly, Glu, Gln, Ile, Leu, Val, Phe und Pro.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem es sich um einen Aminosäurerest außer Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist, und in welchem eine Carboxygruppe des Ursprungspeptids eine Amidbindung mit einer Aminogruppe eines Lys-Rests oder eines einen Lys-Rest enthaltenden Dipeptids bildet und die andere Aminogruppe des Lys-Rests oder eines einen Lys-Rest enthaltenden Dipeptids eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe des lipophilen Substituenten bildet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem es sich um einen Aminosäurerest außer Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist, und wobei eine Aminogruppe des Ursprungspeptids eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe des Aminosäurerest- oder Dipeptid-Abstandhalters bildet und eine Aminogruppe des Aminosäurerest- oder Dipeptid-Abstandhalters eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe des lipophilen Substituenten bildet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem es sich um einen Aminosäurerest außer Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist, und wobei eine Carboxygruppe des Ursprungspeptids eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerest-Abstandhalters oder Dipeptid-Abstandhalters bildet und die Carboxygruppe des Aminosäurerest-Abstandhalters oder Dipeptid-Abstandhalters eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten bildet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem es sich um einen Aminosäurerest außer Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist, und wobei eine Carboxygruppe des Ursprungspeptids eine Amidbindung mit einer Aminogruppe eines Abstandhalters, bei welchem es sich um Asp oder Glu handelt, oder eines einen Asp- oder Glu-Rest enthaltenden Dipeptid-Abstandhalters, bildet und eine Carboxygruppe des Abstandhalters eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten bildet.
In einer weiteren bevorztugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, der ein teilweise oder vollständig hydriertes Cyclopentanophenathrengerüst umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe handelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine geradkettige oder verzweigte Fettsäure handelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Acylgruppe, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend CH₃(CH₂)_nCO-, wobei n eine ganze Zahl von 4 bis 38, vorzugsweise eine ganze Zahl von 4 bis 24 ist, stärker bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, umfassend CH₃(CH₂)₆CO-, CH₃(CH₂)₈CO-, CH₃(CH₂)₁₀CO-, CH₃(CH₂)₁₂CO-, CH₃(CH₃)₁₄CO-, CH₃(CH₂)₁₆CO-, CH₃(CH₂)₁₈CO-, CH₃(CH₂)₂₀CO- und CH₃(CH₂)₂₂CO-, handelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Acylgruppe einer geradkettigen oder verzweigten Alkan-α,ω-dicarbonsäure handelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Acylgruppe, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend HOOC(CH₂)_mCO-, wobei m eine ganze Zahl von 4 bis 38, vorzugsweise eine ganze Zahl von 4 bis 24 ist, stärker bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, umfassend HOOC(CH₂)₁₄CO-, HOOC(CH₂)₁₆CO-, HOOC(CH₂)₁₆CO-, HOOC(CH₂)₂₀CO- und HOOC(CH₂)₂₂CO-, handelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_p((CH₂)_qCOOH)CHNH-CO(CH₂)₂CO- handelt, wobei p und q ganze Zahlen sind und p + q eine ganze Zahl von 8 bis 33, vorzugsweise von 12 bis 28 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_rCO-NHCH(COOH)(CH₂)₂CO- handelt, wobei r eine ganze Zahl von 10 bis 24 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_sCO-NHCH((CH₂)₂COO)CO- handelt, wobei s eine ganze Zahl von 8 bis 24 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel COOH(CH₂)_tCO- handelt, wobei t eine ganze Zahl von 8 bis 24 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)_uCH₃ handelt, wobei u eine ganze Zahl von 8 bis 18 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel -NHCH(COO)(CH₂)₄NH-COCH((CH₂)₂COOH)NH-CO(CH₂)_wCH₃ handelt, wobei w eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)₄CH(COO)NH-CO(CH₂)_xCH₃ handelt, wobei x eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)₂CH(COO)NHCO(CH₂)_yCH₃ handelt, wobei y 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten, der negativ geladen sein kann. Ein derartiger lipophiler Substituent kann z. B. ein Substituent sein, der eine Carboxygruppe aufweist.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, dessen Ursprungspeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend GLP-1(1-45) oder einem Analogon davon.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, abgeleitet von einem GLP-1-Fragment, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-36)amid, GLP-1(7-37), GLP-1(7-38), GLP-1(7-39), GLP-1(7-40) und GLP-1(7-41) oder einem Analogon davon.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich veranschaulicht ist ein GLP-1-Analogon, abgeleitet von einem GLP-1-Analogon, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend GLP-1(1-35), GLP-1(1-36), GLP-1(1-36)amid, GLP-1(1-37), GLP-1(1-38), GLP-1(1-39), GLP-1(1-40) und GLP-1(1-41) oder einem Analogon davon.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich veranschaulicht ist ein GLP-1-Derivat, wobei die Bezeichnung Analogon Derivate umfasst, in welchen insgesamt bis zu fünfzehn, vorzugsweise bis zu zehn Aminosäurereste mit einem beliebigen α-Aminosäurerest ausgetauscht worden sind.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich veranschaulicht ist ein GLP-1-Derivat, wobei die Bezeichnung Analogon Derivate umfasst, in welchen insgesamt bis zu fünfzehn, vorzugsweise bis zu zehn Aminosäurereste mit einem beliebigen α-Aminosäurerest, der durch den genetischen Kode kodiert werden kann, ausgetauscht worden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei die Bezeichnung Analogon Derivate umfasst, in welchen insgesamt bis zu sechs Aminosäurereste mit einem anderen α-Aminosäurerest, der durch den genetischen Kode kodiert werden kann, ausgetauscht worden sind.
Beschrieben hier, jedoch nicht ausdrücklich beansprucht ist ein Ursprungspeptid für ein erfindungsgemäßes Derivat, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Arg²⁶-GLP-1(7-37); Arg³⁴-GLP-1(7-37); Lys³⁶-GLP-1(7-37); Arg^26,36Lys³⁶-GLP-1(7-37); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(7-39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7-40); Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7-37); Arg³⁴Lys³⁶-GLP-1(7-37); Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7-39); Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7-40); Arg^26,36Lys^36,39-GLP-1(7-39); Arg^26,34Lys^36,40-GLP-1(7-40); Gly⁸Arg26-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg³⁴-GLP-1(7-37); Gly⁸Lys-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(7-39); Gly^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7-40); Gly⁸Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg³⁴Lys³⁶-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7-39); Gly⁸Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7-40); Gly⁸Arg^26,34Lys^36,39-GLP-1(7-39) und Gly⁸Arg^26,34Lys^36,40-GLP-1(7-40).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein Ursprungspeptid für ein erfindungsgemäßes Derivat ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(7-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(7-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(7-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(7-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(7-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(7-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(7-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(1-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(1-39); Arg^26,3aLys⁴⁰GLP-1(1-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(1-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(1-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(1-43); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(1-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(1-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(2-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(2-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(2-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(2-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(2-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(2-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(2-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(2-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(3-33); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(3-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(3-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(3-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(3-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(3-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(3-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(3-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(4-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(4-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(4-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(4-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(4-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(4-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(4-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(4-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(5-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(5-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(5-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(5-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(5-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(5-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(5-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(5-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(6-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(6-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(6-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(6-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(6-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(6-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(6-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(6-45); Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(1-38); Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(1-38); Arg^26,34Lys^36,38GLP-1(1-38); Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys^36,38GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg²⁶Lys³⁹GLP-1(1-39) Arg³⁴Lys³⁹GLP-1(1-39); Arg^26,34Lys^36,39GLP-1(1-39); Arg²⁶Lys³⁹GLP-1(7-39); Arg³⁴Lys³⁹GLP-1(7-39) und Arg^26,34Lys^36,39GLP-1(7-39).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei das Ursprungspeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Arg²⁶-GLP-1(7-37), Arg³⁴-GLP-1(7-37), Lys³⁶-GLP-1(7-37), Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37), Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7-37), Arg³⁴Lys³⁶-GLP-1(7-37), Gly⁸Arg²⁶-GLP-1(7-37), Gly⁸Arg³⁴-GLP-1(7-37), Gly⁸Lys³⁶-GLP-1(7-37), Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37), Gly⁸Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7-37) und Gly⁸Arg³⁴Lys³⁶-GLP-1(7-37).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei das Ursprungspeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Arg²⁶Lys³⁸-GLP-1(7-38), Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38), Arg^26,34Lys^36,38-GLP-1(7-38), Gly⁸Arg²⁶Lys³⁸-GLP-1(7-38) und Gly⁸Arg^26,34Lys^36,38-GLP-1(7-38).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei das Ursprungspeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7-39), Arg^26,34Lys^36,39-GLP-1(7-39), Gly⁸Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7-39) und Gly⁸Arg^26,34Lys^36,39GLP-1(7-39).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei das Ursprungspeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7-40), Arg^26,34Lys^36,40-GLP-1(7-40)Gly⁸Arg³⁴Lys⁴⁰ GLP-1(7-40) und Gly⁸Arg^26,34Lys^36,40-GLP-1(7-40).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, das ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend:
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Lys^26,34bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-35);
Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-35);
Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-35);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-35);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36)amid;
Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36)amid;
Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36)amid;
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg²⁶Lys^3a(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-39);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37);
Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38);
Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-39);
Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys^3a(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶-bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36);
Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36);
Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-35);
Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-35);
Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-35);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38);
Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-39);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-39);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys^26,34-bis(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37):
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys^26,34-bis(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys^26,34bis(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
Lys^26,34-bis(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl)-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys²⁶ ^, ³⁴-bis(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl)}GLP-1(7-38);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))Arg^3a-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-39);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys^26,34bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys^26,34-bis(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys^26,34bis(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸tys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))Arg³⁴-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))Arg³⁴-GLP-1(7-39);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys^26,34-bis(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(lithocheloyl))-GLP-1(7-39);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(choloyl))Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(choloyl))Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40);
Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36);
Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36);
Lys^26,34-bis(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36);
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
Lys^26,34-bis(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Lys^26,34-bis(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Lys^26,34-bis(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-37);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-38);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-39);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-39);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly⁸Arg²⁶Lys³⁴(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40);
Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Gly⁸Lys²⁶(N^ε-(lithocholoyl))Arg³⁴-GLP-1(7-40);
Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40) und
Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40).
In einer weiteren bevorzugten Ausfizhrungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, das ein GLP-1-Derivat und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikulum oder einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen GLP-1-Derivats zur Herstellung eines Medikaments, das ein lang anhaltendes Wirkungsprofil in Bezug auf GLP-1(7-37) aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen GLP-1-Derivats zur Herstellung eines Medikaments mit lang anhaltendem Wirkungsprofil zur Behandlung von nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen GLP-1-Derivats zur Herstellung eines Medikaments mit lang anhaltendem Wirkungsprofil zur Behandlung von insulinabhängiger Diabetes mellitus.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen GLP-1-Derivats zur Herstellung eines Medikaments mit lang anhaltendem Wirkungsprofil zur Behandlung von Fettsucht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von insulinabhängiger oder nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus bei einem eine derartige Behandlung benötigenden Patienten, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines GLP-1-Derivats nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger an einen Patienten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Zum Erhalt eines zufrieden stellenden lang anhaltenden Wirkungsprofils des GLP-1-Derivats umfasst der an die GLP-1-Einheit angelagerte lipophile Substituent vorzugsweise 4-40 Kohlenstoffatome, insbesondere 8-25 Kohlenstoffatome. Der Lipophile Substituent kann an die Aminogruppe der GLP-1-Einheit durch eine Carboxygruppe des lipophilen Substituenten angelagert sein, die eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests, an welchem sie angelagert ist, bildet. Alternativ dazu kann der lipophile Substituent an den Aminosäurerest in einer derartigen Weise angelagert sein, dass eine Aminogruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe des Aminosäurerests bildet. Als weitere Variante kann der lipophile Substituent mit der GLP-1-Einheit über eine Esterbindung verknüpft sein. Formal kann der Ester entweder durch Reaktion zwischen einer Carboxygruppe der GLP-1-Einheit und einer Hydroxygruppe des zukünftigen Substituenten oder durch Reaktion zwischen einer Hydroxygruppe der GLP-1-Einheit und einer Carboxygruppe des zukünftigen Substituenten gebildet werden. Als weitere Alternative kann der lipophile Substituent eine Alkylgruppe sein, die in eine primäre Aminogruppe der GLP-1-Einheit eingebracht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der lipophile Substituent durch einen Abstandhalter in einer derartigen Weise an die GLP-1-Einheit angelagert, dass eine Carboxygruppe des Abstandhalters eine Amidbindung mit einer Aminogruppe der GLP-1-Einheit bildet. Beispiele für geeignete Abstandhalter sind Bernsteinsäure, Lys, Glu oder Asp oder ein Dipeptid wie Gly-Lys. Ist der Abstandhalter Bernsteinsäure, kann eine Carboxygruppe davon eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests und die andere Carboxygruppe davon eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten bilden. Ist der Abstandhalter Lys, Glu oder Asp, kann die Carboxygruppe davon eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests und die Aminogruppe davon eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe des lipophilen Substituenten bilden. Wird Lys als der Abstandhalter verwendet, kann in manchen Fällen ein weiterer Abstandhalter zwischen die ε-Aminogruppe von Lys und den lipophilen Substituenten eingefügt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein derartiger weiterer Abstandhalter Bernsteinsäure, die mit der ε-Aminogruppe von Lys und mit einer im lipophilen Substituenten vorliegenden Aminogruppe eine Amidbindung bildet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist ein derartiger weiterer Abstandhalter Glu oder Asp, das mit der ε-Aminogruppe von Lys eine Amidbindung und mit einer im lipophilen Substituenten vorliegenden Carboxygruppe, d. h. der lipophile Substituent ist ein N^ε-acylierter Lysinrest, eine andere Amidbindung bildet.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der lipophile Substituent eine Gruppe auf, die negativ geladen sein kann. Eine bevorzugte Gruppe, die negativ geladen sein kann, ist eine Carbonsäuregruppe.
Das Ursprungspeptid kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das das Züchten einer Wirtszelle, die eine das Polypeptid kodierende DNA-Sequenz enthält und das Polypeptid in einem geeigneten Nährmedi um unter die Expression des Peptids ermöglichenden Bedingungen exprimieren kann, hergestellt werden, wonach das resultierende Peptid aus der Kultur gewonnen wird.
Bei dem zum Züchten der Zellen verwendeten Medium kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Medium, das zum Wachsen der Wirtszellen geeignet ist, wie Minimal- oder Komplexmedien, die geeignete Ergänzungsstoffe enthalten, handeln. Geeignete Medien sind im Handel erhältlich oder können gemäß (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection) veröffentlichten Rezepturen hergestellt werden. Das durch die Zellen hergestellte Peptid kann dann durch herkömmliche Prozeduren, einschließlich Abtrennen der Wirtszellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen der proteinhaltigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats durch ein Salz, z. B. Ammoniumsulfat, Reinigung je nach fraglichem Peptidtyp durch eine Vielfalt an chromatogafischen Verfahren, z. B. Ionenaustauschchromatogaphie, Gelfiltrationschromatogafie, Affinitätschromatogaphie oder dergleichen aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
Die das Ursprungspeptid kodierende DNA-Sequenz kann geeigneterweise genomischen oder cDNA-Ursprungs sein, der z. B. durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Durchmustern auf das gesamte Peptid oder einen Teil des Peptids kodierende DNA-Sequenzen durch Hybridisierung unter Verwendung von geeigneten Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken erhalten wird (siehe z. B. Sambrook, J, Fritsch, EF und Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). Die das Peptid kodierende DNA-Sequenz kann durch etablierte Standardverfahren, z. B. das Phosphoamiditverfahren, beschrieben von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859–1869, oder das Verfahren, beschrieben von Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801–805 auch synthetisch hergestellt werden. Die DNA-Sequenz kann auch durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von spezifischen Primern, z. B. wie beschrieben in US 4,683,202 oder Saiki et al., Science 239 (1988), 487–491, hergestellt werden.
Die DNA-Sequenz kann in einen beliebigen Vektor eingefügt werden, der günstigerweise rekombinanten DNA-Prozeduren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen ist. So kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, deren Replikation von der Chromosomenreplikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid sein. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, der beim Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welches) er integriert wurde, repliziert wird.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in welchem die das Peptid kodierende DNA-Sequenz mit zusätzlichen für eine Transkription der DNA erforderlichen Segmenten wie einen Promotor funktionsfähig verknüpft ist. Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die in der Wirtszelle der Wahl zusätzliche transkriptionelle Aktivität zeigt, und von Genen abgeleitet sein, die Proteine entweder homolog oder heterolog zur Wirtszelle kodieren. Beispiele für geeignete Promotoren zum Leiten der Transkription der das Peptid der Erfindung kodierenden DNA in einer Vielfalt von Wirtszellen sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z. B. Sambrook et al., vorstehend.
Die das Peptid kodierende DNA-Sequenz kann gegebenenfalls auch mit einem geeigneten Terminator, Polyadenylierungssignalen, Transktriptionsverstärkersequenzen und Translationsverstärkersequenzen funktionsfähig verbunden sein. Der rekombinante Vektor der Erfindung kann ferner eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren.
Der Vektor kann auch eine selektierbare Markierung, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ausgleicht oder eines, das Resistenz gegen ein Arzneimittel, z. B. Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Hygromycin oder Methotrexat verleiht, sein.
Zum Leiten eines Ursprungspeptids der vorliegenden Erfindung in den sekretorischen Weg der Wirtszelle, kann eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als Leadersequenz, Präprosequenz oder Präsequenz) im rekombinanten Vektor bereitgestellt sein. Die sekretorische Signalsequenz ist an die DNA-Sequenz gebunden, die das Peptid in korrektem Leseraster kodiert. Sekretorische Signalsequenzen befinden sich üblicherweise an der 5'-Position der das Peptid kodierenden DNA-Sequenz. Die sekretorische Signalsequenz kann diejenige sein, die normalerweise mit dem Peptid verbunden ist, oder von einem Gen stammen, das ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
Die Verfahren, die zum Ligieren der das vorliegende Peptid kodierenden DNA-Sequenzen, des Promotors und wahlweise des Terminators und/oder von sekretorischen Signalsequenzen und zu deren Einfügen in geeignete Vektoren, die die zur Replikation nötigen Informationen enthalten, verwendet werden, sind dem Fachmann bekannt (vgl. z. B. Sambrook et al., vorstehend).
Die Wirtszelle, in welche die DNA-Sequenz oder der rekombinante Vektor eingebracht wird, kann eine beliebige Zelle sein, die das vorliegende Peptid herstellen kann und schließt Bakterien-, Hefe-, Pilz- und höhere eukaryontische Zellen ein. Beispiele für geeignete Wirtszellen, die bekannt sind und auf dem Fachgebiet verwendet werden, sind ohne Beschränkung E. coli, Saccharomyces cerevisiae oder BHK- oder CHO-Zelllinien des Säugers.
Beispiele für Verbindungen, die als erfindungsgemäße GLP-1-Einheiten nützlich sein können, sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 87/06941 (The General Hospital Corporation) beschrieben, die ein GLP-1(7-37) und funktionelle Derivate davon umfassendes Peptidfragment und dessen Verwendung als insulinotrope Mittel betrifft.
Ferner sind GLP-1-Analoga in der Internationalen Patentanmeldung Nr. 90/11296 (The General Hospital Corporation) beschrieben, die Peptidfragmente, die GLP-1(7-36) und funktionelle Derivate davon umfassen und eine insulinotrope Aktivität aufweisen, die die insulinotrope Aktivität von GLP-1(1-36) oder GLP-1(1-37) übersteigt, und deren Verwendung als insulinotrope Mittel betrifft.
Die Internationale Patentanmeldung Nr. 91/11457 (Buckley et al.) offenbart Analoga der aktiven GLP-1-Peptide 7-34, 7-35, 7-36 und 7-37, die ebenfalls als erfindungsgemäße GLP-1-Einheiten nützlich sein können.
Arzneimitel
Arzneimittel, die ein erfindungsgemäßes GLP-1-derivat enthalten, können eine derartigen Behandlung benötigenden Patienten parenteral verabreicht werden. Die Parenterale Verabreichung kann durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion mithilfe einer Spritze, wahlweise einer penförmigen Spritze durchgeführt werden. Alternativ dazu kann die parenterale Verabreichung mithilfe einer Infusionspumpe durchgeführt werden. Eine weitere Variante ist eine Zusammensetzung, die ein Pulver oder eine Flüssigkeit zur Verabreichung des GLP-1-Derivats in Form eines Nasen- oder Pulmonalsprays sein kann. Als noch weitere Variante können die GLP-1-Derivate der Erfindung auch transdermal, z. B. von einem Pflaster, wahlweise einem iontophoretischen Pflaster, oder transmukosal, z. B. bukkal verabreicht werden.
Arzneimittel, die ein GLP-1-Derivat der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch herkömmliche Techniken, z. B. wie beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985 oder in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. Auflage, 1995, hergestellt werden.
So können die injizierbaren Zusammensetzungen des GLP-1-Derivats der Erfindung unter Verwendung der herkömmlichen Techniken der pharmazeutischen Industrie hergestellt werden, die das wie geeignete Lösen und Mischen der Inhaltsstoffe zum Erhalt des gewünschten Endprodukts, bedingen.
Gemäß einer Prozedur wird das GLP-1-Derivat in einer Wassermenge gelöst, die etwas weniger als das Endvolumen der herzustellenden Zusammensetzung beträgt. Ein isotonisches Mittel, ein Konservierungsmittel und ein Puffer werden nach Bedarf zugesetzt, und der pH-Wert der Lösung wird – gegebenenfalls – unter Verwendung einer Säure, z. B. von Salzsäure, oder einer Base, z. B. einer wässrigen Natriumhydroxidlösung nach Bedarf eingestellt. Schließlich wird das Volumen der Lösung mit Wasser eingestellt, um die gewünschte Konzentration der Inhaltsstoffe zu erhalten.
Beispiele für isotonische Mittel sind Natriumchlorid, Mannit und Glycerin.
Beispiele für Konservierungsmittel sind Phenol, m-Cresol, Methyl-p-hydroxybenzoat und Benzylalkohol.
Beispiele für geeignete Puffer sind Natriumacetat und Natriumphosphat.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Bestandteilen können Lösungen, die ein erfindungsgemäßes GLP-1-Derivat enthalten, auch ein oberflächenaktives Mittel enthalten, um die Löslichkeit und/oder die Stabilität des GLP-1-Derivats zu verbessern.
Eine Zusammensetzung zur nasalen Verabreichung von bestimmten Peptiden kann z. B. wie im Europäischen Patent Nr. 272097 (an Novo Nordisk A/S) oder in WO 93/18785 beschrieben hergestellt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das GLP-1-Derivat in Form einer Zusammensetzung bereitgestellt, die zur Verabreichung durch Injektion geeignet ist. Eine derartige Zusammensetzung kann entweder eine gebrauchsfertige injizierbare Lösung oder eine Menge einer festen Zusammensetzung, z. B. eines lyophilisierten Produkts, die/das in einem Lösungsmittel zu lösen ist, bevor es injiziert werden kann, sein. Die injizierbare Lösung enthält vorzugsweise nicht weniger als etwa 2 mg/ml, vorzugsweise nicht weniger als etwa 5 mg/ml, stärker bevorzugt nicht weniger als etwa 10 mg/ml des GLP-1-Derivats und vorzugsweise nicht mehr als etwa 100 mg/ml des GLP-1-Derivats.
Die GLP-1-Derivate dieser Erfindung können bei der Behandlung von verschiedenen Erkrankungen verwendet werden. Das besondere zu verwendende GLP-1-Derivat und der optimale Dosisgehalt für den jeweiligen Patienten hängt von der zu behandelnden Erkrankung und von einer Vielfalt an Faktoren, einschließlich der Wirksamkeit des spezifischen eingesetzten Peptidderivats, des Alters, Körpergewichts, der Körperaktivität und der Ernährung des Patienten, von einer möglichen Kombination mit anderen Arzneimitteln und von der Schwere des Falls ab. Es wird empfohlen, dass die Dosierung des GLP-1-Derivats der Erfindung für jeden einzelnen Patienten vom Fachmann bestimmt wird.
Insbesondere ist es vorgesehen, dass das GLP-1-Derivat zur Herstellung eines Medikaments mit einem lang anhaltenden Wirkungsprofil zur Behandlung von nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus und/oder zur Behandlung von Fettsucht nützlich ist.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch nicht als Beschränkung des Schutzumfangs betrachtet werden sollen. Die in der vorangehenden Beschreibung und in den folgenden beispielen offenbarten Merkmale können sowohl getrennt als auch in Kombination davon Material zum Verwirklichen der Erfindung in unterschiedlichen Formen davon sein.
BEISPIELE

Die folgenden Akronyme für im Handel erhältliche Chemikalien werden verwendet:

DMF:	N,N-Dimethylformamid.
NMP:	N-Methyl-2-pyrrolidon.
EDPA:	N-Ethyl-N,N-diisopropylamin.
EGTA:	Ethylenglycolbis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure.
GTP:	Guanosin-5'-triphosphat.
TFA:	Trifluoressigsäure.
THF:	Tetrahydrofuran
Myr-ONSu:	Tetradecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
Pal-ONSu:	Hexadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
Ste-ONSu	Octadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
HOOC-(CH₂)₆-COONSu:	ω-Carboxyheptansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
HOOC-(CH₂)₁₀-COONSu:	ω-Carboxyundecansäure 2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
HOOC-(CH₂)₁₂-COONSu:	ω-Carboxytridecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
HOOC-(CH₂)₁₄-COONSu:	ω-Carboxypentadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
HOOC-(CH₂)₁₆-COONSu:	ω-Carboxyheptadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
HOOC-(CH²)₁₈-COONSu:	ω-Carboxynonadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.

Abkürzungen:

PDMS:

Plasmadesorptionsmassenspektrometrie

MALDI-MS:

Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisierungs-massenspektrometrie

HPLC:

Hochleistungsflüssigchromatographie

amu:

Atommasseneinheiten

Analytisches
Plasmadesorptionsmassenspektrometrie
Probenpräparation
Die Probe wird in 0,1% TFA/EtOH (1:1) mit einer Konzentration von 1 μg/μl gelöst. Die Probenlösung (5–10 μl) wird auf ein Nitrocellulosetarget (Bio-ion AB, Uppsala, Schweden) gegeben, und man lässt es auf der Targetoberfläche für eine Dauer von 2 Minuten absorbieren. Das Target wird anschließend mit 2 × 25 μl 0,1% TFA gespült und geschleudert. Schließlich wird das Nitrocellulosetarget in ein Targetkarussel gegeben und in das Massenspektrometer eingebracht.
MS-Analyse:
Eine PDMS-Analyse wurde unter Verwendung eines Laufzeitgeräts des Typs Bio-ion 20 (Bio-ion Nordic AB, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Eine Beschleunigungsspannung von 15 kV wurde angelegt, und durch den Beschuss der Nitrocelluloseoberfläche mit 252-Cf-Spaltfragmenten gebildete Molekülionen wurden zu einem Stoppdetektor hin beschleunigt. Das erhaltene Laufzeitspektrum wurde unter Verwendung der H⁺- und NO⁺-Ionen mit einem m/z von 1 bzw. 30 zu einem tatsächlichen Massenspektrum kalibriert. Die Massenspektrendaten wurden im Allgemeinen für 1,0 × 10⁶ Spaltereignisse, entsprechend 15–20 Minuten, akkumuliert. Die zugeordneten Massen Aller entsprechen isotop gemittelten Molekularmassen. Die Genauigkeit der Massenbestimmung ist im Allgemeinen besser als 0,1%.
MALDI-MS
Eine MALDI-TOF-MS-Analyse wurde unter Verwendung eines Geräts des Typs Voyager RP (PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA), ausgestattet mit einer verzögerten Extraktion und betrieben in linearem Modus, durchgeführt. alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure wurde als Matrix verwendet, und die Massenbestimmungen basierten auf einer externen Kalibrierung.
Beispiel 1
Synthese von Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37).
Die Titelverbindung wurde aus GLP-1(7-37) synthetisiert. Ein Gemisch aus GLP-1(7-37) (25 mg, 7,45 μm), EDPA (26,7 mg, 208 μm), NMP (520 μl) und Wasser (260 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Myr-ONSu (2,5 mg, 7,67 μm) in NMP (62,5 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt, wonach man es für eine Dauer von 20 Min. stehen ließ. Eine zusätzliche Menge Myr-ONSu (2,5 mg, 7,67 μm) in NMP (62,5 μl) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch für eine Dauer von 5 Min. sanft geschüttelt. Nach einer Gesamtreaktionszeit von 40 Min. wurde die Reaktion durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (12,5 mg, 166 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (12,5 ml) abgeschreckt. Die Titelverbindung wurde aus dem Reaktionsgemisch durch HPLC unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems isoliert, Ausbeute: 1,3 mg (entsprechend 4,9% der theoretischen Ausbeute). Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgadient betrug in 60 Minuten 0–100%. Das isolierte Produkt wurde durch PDMS analysiert und der m/z-Wert für das prototierte Molekülion als 3567,93 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3566,9 + 3 amu (theoretischer Wert: 3565,9 amu). Die Acylierungsposition (Lys26) wurde durch enzymatische Spaltung der Titelverbindung mit V8-Protease von Staphylococcus aureus und anschließende Massenbestimmung der Peptidfragmente durch PDMS bestätigt.
Zusätzlich zur Titelverbindung wurden zwei andere GLP-1-Derivate unter Verwendung derselben Chromatografiesäule und eines flacheren Gradienten (35–38% Acetonitril in 60 Minuten) aus dem Reaktionsgemisch isoliert, siehe Beispiel 2 und 3.
Beispiel 2
Synthese von Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37).
Die Titelverbindung wurde durch HPLC aus dem in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionsgemisch iso liert. Eine PDMS-Analyse ergab ein protoniertes Molekülion mit einem m/z von 3567,713. Das Molekulargewicht wurde folglich als 3566,73 amu (theoretischer Wert: 3565,9 amu) befunden. Die Acylierungsstelle wurde auf der Basis des Fragmentierungsmusters bestimmt.
Beispiel 3
Synthese von Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37).
Die Titelverbindung wurde durch HPLC aus dem in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionsgemisch isoliert. Eine PDMS-Analyse ergab ein protoniertes Molekülion mit einem m/z von 3778,4 + 3. Das Molekulargewicht wurde folglich als 3777,4 + 3 amu (theoretischer Wert: 3776,1 amu) befunden.
Beispiel 4
Synthese von Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-37).
Die Titelverbindung wurde aus Arg³⁴-GLP-1(7-37) synthetisiert. Ein Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7-37) (5 mg, 1,47 μm), EDPA (5,3 mg, 41,1 μm), NMP (105 μl) und Wasser (50 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Myr-ONSu (0,71 mg, 2,2 μm) in NMP (17,8 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine Dauer von 20 Min. stehen gelassen. Nach einer Gesamtreaktionszeit von 30 Min. wurde die Reaktion durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (25 mg, 33,3 μm) in 50%igem, wässrigem Ethanol (2,5 ml) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. Eine PDMS-Analyse ergab ein protoniertes Molekülion mit einem m/z von 3594,93. Das Molekulargewicht wurde folglich als 3593,93 amu (theoretischer Wert: 3593,9 amu) befunden.
Beispiel 5
Synthese von Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37).
Die Titelverbindung wurde aus Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37), das von QCB erworben wurde, synthetisiert. Ein Gemisch aus Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37) (1,3 mg, 0,39 μm), EDPA (1,3 mg, 10 μm), NMP (125 μl) und Wasser (30 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Myr-ONSu (0,14 mg, 0,44 μm) in NMP (3,6 ml) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 15 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (0,1 mg, 1,33 μm) in 50%igem, wässrigem Ethanol (10 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt, und die Titelverbindung (60 μg, 4%) wurde isoliert.
Beispiel 6
Synthese von Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37)-OH (5,0 mg, 1,477 μmol), EDPA (5,4 mg, 41,78 μmol), NMP (105 μl) und Wasser (50 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Myr-ONSu (0,721 mg, 2,215 μmol) in NMP (18 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 45 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,5 mg, 33,3 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (250 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (1,49 mg, 28%) wurde isoliert und Das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3595 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3594 ± 3 amu (theoretischer Wert 3594 amu).
Beispiel 7
Synthese von Lys^26,34bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (70 mg, 20,85 μmol), EDPA (75,71 mg, 585,8 μmol), NMP (1,47 ml) und Wasser (700 μL) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₈-COONSu (27,44 mg, 62,42 μmol) in NMP (686 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (34,43 mg, 458,7 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (3,44 ml) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (8,6 mg, 10%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 4006 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 4005 ± 3 amu (theoretischer Wert 4005 amu).
Beispiel 8
Synthese von Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-36)-OH (5,06 mg, 1,52 μmol), EDPA (5,5 mg, 42,58 μmol), NMP (106 μl) und Wasser (100 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₈-COONSu (1,33 mg, 3,04 μmol) in NMP (33,2 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 2,5 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,50 mg, 33,34 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (250 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,46 mg, 8%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3652 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3651 ± 3 amu (theoretischer Wert 3651 amu).
Beispiel 9
Synthese von Arg^26,34Lys³³(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (5,556 mg, 1,57 μmol), EDPA (5,68 mg, 43,96 μmol), NMP (116,6 μl) und Wasser (50 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₈-COONSu (1,38 mg, 3,14 μmol) in NMP (34,5 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 2,5 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,5 mg, 33,3 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (250 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,7 mg, 12%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3866 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3865 ± 3 amu (theoretischer Wert 3865 amu).
Beispiel 10
Synthese von Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7-37)-OH (5,04 mg, 1,489 μmol), EDPA (5,39 mg, 41,70 μmol), NMP (105 μl) und Wasser (50 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₈-COONSu (1,31 mg, 2,97 μmol) in NMP (32,8 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 30 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,46 mg, 32,75 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (246 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (1,2 mg, 22%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3709 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3708 ± 3 amu (theoretischer Wert 3708 amu).
Beispiel 11
Synthese von Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxyheptadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7-37)-OH (5,8 mg, 1,714 μmol), EDPA (6,20 mg, 47,99 μmol), NMP (121,8 μl) und Wasser (58 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₆-COONSu (2,11 mg, 5,142 μmol) in NMP (52,8 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,83 mg, 37,70 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (283 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,81 mg, 13%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3681 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3680 ± 3 amu (theoretischer Wert 3680 amu).
Beispiel 12
Synthese von Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyheptadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37)-OH (3,51 mg, 1,036 μmol), EDPA (3,75 mg, 29,03 μmol), NMP (73,8 μl) und Wasser (35 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₆-COONSu (1,27 mg, 3,10 μmol) in NMP (31,8 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 2 Std. und 10 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (1,71 mg, 22,79 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (171 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,8 mg, 21%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3682 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3681 ± 3 amu (theoretischer Wert 3681 amu).
Beispiel 13
Synthese von Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(ω-carboxyheptadecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (5,168 mg, 1,459 μmol), EDPA (5,28 mg, 40,85 μmol), NMP (108,6 μl) und Wasser (51,8 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₆-COONSu (1,80 mg, 4,37 μmol) in NMP (45 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 2 Std. und 15 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,41 mg, 32,09 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (241 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,8 mg, 14%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3838 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3837 ± 3 amu (theoretischer Wert 3837 amu).
Beispiel 14
Synthese von Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyheptadecanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-36)-OH (24,44 mg, 7,34 μmol), EDPA (26,56 mg, 205,52 μmol), NMP (513 μl) und Wasser (244,4 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₆-COONSu (9,06 mg, 22,02 μmol) in NMP (1,21 ml) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 30 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reak tion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (12,12 mg, 161,48 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (1,21 ml) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (7,5 mg, 28%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3625 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3624 ± 3 amu (theoretischer Wert 3624 amu).
Beispiel 15
Synthese von Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37)-OH (4,2 mg, 1,24 μmol), EDPA (4,49 mg, 34,72 μmol), NMP (88,2 μl) und Wasser (42 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₀-COONSu (1,21 mg, 3,72 μmol) in NMP (30,25 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 40 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,04 mg, 27,28 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (204 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,8 mg, 18%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3598 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3597 ± 3 amu (theoretischer Wert 3597 amu).
Beispiel 16
Synthese von Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (5,168 mg, 1,46 μmol), EDPA (5,28 mg, 40,88 μmol), NMP (108,6 μl) und Wasser (51,7 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₀-COONSu (1,43 mg, 4,38 μmol) in NMP (35,8 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,41 mg, 32,12 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (241 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,85 mg, 16%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3753 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3752 ± 3 amu (theoretischer Wert 3752 amu).
Beispiel 17
Synthese von Lys^26,34bis(N^ε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (10,0 mg, 2,98 μmol), EDPA (10,8 mg, 83,43 μmol), NMP (210 μl) und Wasser (100 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₀-COONSu (2,92 mg, 8,94 μmol) in NMP (73 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (4,92 mg, 65,56 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (492 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (1,0 mg, 9%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3781 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3780 ± 3 amu (theoretischer Wert 3780 amu).
Beispiel 18
Synthese von Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-36)-OH (15,04 mg, 4,52 μmol), EDPA (16,35 mg, 126,56 μmol), NMP (315,8 μl) und Wasser (150,4 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₀-COONSu (4,44 mg, 13,56 μmol) in NMP (111 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 40 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (7,5 mg, 99,44 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (750 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (3,45 mg, 22%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3540 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3539 ± 3 amu (theoretischer Wert 3539 amu).
Beispiel 19
Synthese von Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7-37)-OH (5,87 mg, 1,73 μmol), EDPA (6,27 mg, 48,57 μmol), NMP (123,3 μl) und Wasser (58,7 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₀-COONSu (1,70 mg, 5,20 μmol) in NMP (42,5 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 40 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,86 mg, 286 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (286 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (1,27 mg, 20%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3597 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3596 ± 3 amu (theoretischer Wert 3596 amu).
Beispiel 20
Synthese von Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7-37)-OH (4,472 mg, 1,32 μmol), EDPA (4,78 mg, 36,96 μmol), NMP (94 μl) und Wasser (44,8 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₆-COONSu (1,07 mg, 3,96 μmol) in NMP (26,8 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann stehen gelassen für eine zusätzliche Dauer von 1 Std. und 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,18 mg, 29,04 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (218 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,5 mg, 11%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3540 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3539 ± 3 amu (theoretischer Wert 3539 amu).
Beispiel 21
Synthese von Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (5,168 mg, 1,459 μmol), EDPA (5,28 mg, 40,85 μmol), NMP (108,6 μl) und Wasser (51,6 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₆-COONSu (1,18 mg, 4,37 μmol) in NMP (29,5 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 1 Std. und 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reak tion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,40 mg, 32,09 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (240 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,5 mg, 9%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protovierte Molekülion wurde als 3697 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3695 ± 3 amu (theoretischer Wert 3695 amu).
Beispiel 22
Synthese von Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37)-OH (5,00 mg, 1,47 μmol), EDPA (5,32 mg, 41,16 μmol), NMP (105 μl) und Wasser (50 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₆-COONSu (1,19 mg, 4,41 μmol) in NMP (29,8 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,42 mg, 32,34 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (242 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,78 mg, 15%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protovierte Molekülion wurde als 3542 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3541 ± 3 amu (theoretischer Wert 3541 amu).
Beispiel 23
Synthese von Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-36)-OH (5,00 mg, 1,50 μmol), EDPA (5,44 mg, 42,08 μmol), NMP (210 μl) und Wasser (50 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₆-COONSu (1,22 mg, 4,5 μmol) in NMP (30,5 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,47 mg, 33,0 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (247 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,71 mg, 14%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protovierte Molekülion wurde als 3484 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3483 ± 3 amu (theoretischer Wert 3483 amu).
Beispiel 24
Synthese von Lys^26,34bis(N^ε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (10 mg, 2,5 μmol), EDPA (10,8 mg, 83,56 μmol), NMP (210 μl) und Wasser (100 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₆-COONSu (2,42 mg, 8,92 μmol) in NMP (60,5 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 2 Std. und 35 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (4,92 mg, 65,54 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (492 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300S6-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (2,16 mg, 24%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3669 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3668 ± 3 amu (theoretischer Wert 3668 amu).
Beispiel 25
Synthese von Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxypentadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7-37)-OH (4,472 mg, 1,321 μmol), EDPA (4,78 mg, 36,99 μmol), NMP (93,9 μl) und Wasser (44,7 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₄-COONSu (1,519 mg, 3,963 μmol) in NMP (38 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,18 mg, 29,06 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (218 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,58 mg, 12%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3654 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3653 ± 3 amu (theoretischer Wert 3653 amu).
Beispiel 26
Synthese von Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-36)-OH (5,00 mg, 1,50 μmol), EDPA (5,44 mg, 42,08 μmol), NMP (210 μl) und Wasser (50 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₄-COONSu (1,72 mg, 4,5 μmol) in NMP (43 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,48 mg, 33 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (248 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,58 mg, 11%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3596 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3595 ± 3 amu (theoretischer Wert 3595 amu).
Beispiel 27
Synthese von Lithocholinsäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
Einem Gemisch aus Lithocholinsäure (5,44 g, 14,34 mmol), N-Hydroxysuccinimid (1,78 g, 15,0 mmol), wasserfreies THF (120 ml) und wasserfreies Acetonitril (30 ml), gehalten bei 10°C, wurde eine Lösung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (3,44 g, 16,67 mmol) in wasserfreiem THF zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 16 Std. gerührt, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand in Dichlormethan (450 ml) gelöst, mit einer 10%igen, wässrigen Na₂CO₃-Lösung (2 × 150 ml) und Wasser (2 × 150 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Es wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt, um einen kristallinen Rückstand zu erhaltern. Der Rückstand wurde aus einem Gemisch aus Dichlormethan (30 ml) und n-Heptan (30 ml) umkristallisiert, um die Titelverbindung (3,46 g, 51%) als kristallinen Feststoff zu erhalten.
Beispiel 28
Synthese von Arg³⁵Lys²⁶(N^ε-lithocholyl)-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7-37)-OH (4,472 mg, 1,32 μmol), EDPA (4,78 mg, 36,96 μmol), NMP (94 μl) und Wasser (44,8 μl) wurde für eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Lithocholinsäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester (1,87 mg, 3,96 μmol) in NMP (46,8 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,18 mg, 29,04 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (218 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgadient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (1,25 mg, 25%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protovierte Molekülion wurde als 3744 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3743 ± 3 amu (theoretischer Wert 3743 amu).
Beispiel 29
Synthese von N^α-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t.
Einer Suspension von H-Glu(OH)-OBu^t (2,5 g, 12,3 mmol), DMF (283 ml) und EDPA (1,58 g, 12,3 mmol) wurde eine Lösung von Myr-ONSu (4,0 g, 12,3 mmol) in DMF (59 ml) zugetropft. Das Reaktionsgemisch für eine Dauer von 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum auf ein Gesamtvolumen von 20 ml eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen 5%iger, wässriger Zitronensäure (250 ml) und Ethylacetat (150 ml) aufgeteilt, und die Phasen wurden getrennt. Die organischen Phasen wurden im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde in DMF (40 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde einer 10%igen wässrigen Zitronensäurelösung (300 ml), gehalten bei 0°C, zugetropft. Die ausgefällte Verbindung wurde aufgefangen und mit Eiswasser gewaschen und in einem Vakuumtrockenofen getrocknet. Die getrocknete Verbindung wurde in DMF (23 ml) gelöst, und HONSu (1,5 g, 13 mmol) wurde zugesetzt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (2,44 g, 11,9 mmol) in Dichlormethan (47 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt und die ausgefällte Verbindung abfiltriert. Der Niederschlag wurde aus n-Heptan/2-Propanol umkristallisiert, um die Titelverbindung (3,03 g, 50%) zu erhalten.
Beispiel 30
Synthese von Glu^22,23,30Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-tatradecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Glu^22,23,30Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (1,0 mg, 0,272 μmol), EDPA (0,98 mg, 7,62 μmol), NMP (70 μl) und Wasser (70 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N^α-tetradecanoyl-G1u(ONSu)-OBu^t, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben, (0,41 mg, 0,816 μmol) in NMP (10,4 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 45 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (0,448 mg, 5,98 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (45 μl). Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (0,9 ml) wurde zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde auf einer Hülse des Typs Varian 500 mg C8 Mega Bond Elut^® immobilisiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (10 ml) gewaschen und schließlich durch Elution mit TFA (10 ml) aus der Hülse freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und das Reaktionsgemisch durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,35 mg, 32%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 4012 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 4011 ± 3 amu (theoretischer Wert 4011 amu).
Beispiel 31
Synthese von Glu^23,26Arg³⁴Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Glu^23,26Arg³⁴Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (6,07 mg, 1,727 μmol), EDPA (6,25 mg, 48,36 μmol), NMP (425 μl) und Wasser (425 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N^α-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben, (2,65 mg, 5,18 μmol) in NMP (66,3 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 45 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,85 mg, 38,0 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (285 μl). Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (5,4 ml) wurde zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde auf einer Hülse des Typs Varian 500 mg C8 Mega Bond Elut^® immobilisiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigen Acetonitril (10 ml) gewaschen, und schließlich durch Flution mit TFA (10 ml) aus der Hülse freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und das Reaktionsgemisch durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,78 mg, 12%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3854 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3853 ± 3 amu (theoretischer Wert 3853 amu).
Beispiel 32
Synthese von Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxytridecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (30 mg, 8,9 μmol), EDPA (32,3 mg, 250 μmol), NMP (2,1 ml) und Wasser (2,1 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₂-COONSu (12,7 mg, 35,8 μmol) in NMP (318 μl), das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und 40 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (3,4 mg, 44,7 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (335 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (10 mg, 29%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3840 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3839 ± 3 amu (theoretischer Wert 3839 amu).
Beispiel 33
Synthese von Lys^26,34-bis(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-37)-OH. (NNC 90-1167).
Ein Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (300 mg, 79,8 μmol), EDPA (288,9 mg, 2,24 mmol), NMP (21 ml) und Wasser (21 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N^ε-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben, (163 mg, 319,3 μmol) in NMP (4,08 ml) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (131,8 mg, 1,76 mmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (13,2 ml). Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (250 ml) wurde zugesetzt, und das erhaltene Gemisch in vier gleiche Portionen aufgeteilt. Jede Portion wurde auf eine Hülse des Typs Varian 500 mg C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 0,1%igem wässrigen TFA (3,5 ml) gewaschen und schließlich durch Flution mit 70%igem, wässrigen Acetonitril (4 ml) freigesetzt. Die vereinigten Eluate wurden mit 0,1%, wässrigem TFA (300 ml) verdünnt. Die ausgefällte Verbindung wurde abzentrifugiert, mit 0,1%igem, wässrigem TFA (50 ml) gewaschen und schließlich abzentrifugiert. Dem Niederschlag wurde TFA (60 ml) zugesetzt und das erhaltene Reaktionsgemisch für eine Dauer von 1 Std. und 30 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges TFA wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in Wasser (50 ml) gegossen. Die ausgefällte Verbindung wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300S6-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (27,3 mg, 8%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 4036 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 4035 ± 3 amu (theoretischer Wert 4035 amu).
Beispiel 34
Synthese von Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(ω-carboxypentadecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (30 mg, 8,9 μmol), EDPA (32,3 mg, 250 μmol), NMP (2,1 ml) und Wasser (2,1 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₄-COONSu (13,7 mg, 35,8 μmol) in NMP (343 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (3,4 mg, 44,7 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (335 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (4,8 mg, 14%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3894 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3893 ± 3 amu (theoretischer Wert 3893 amu).
Beispiel 35
Synthese von N^α-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t.
Einer Suspension von H-Glu(OH)-OBu^t (4,2 g, 20,6 mmol), DMF (500 ml) und EDPA (2,65 g, 20,6 mmol) wurde eine Lösung von Pal-ONSu (7,3 g, 20,6 mmol) in DMF (100 ml) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 64 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum auf ein Gesamtvolumen von 20 ml eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen 10%iger, wässriger Zitronensäure (300 ml) und Ethylacetat (250 ml) aufgeteilt, und die Phasen wurden getrennt. Die organischen Phasen wurden im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde in DMF (50 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde einer 10%igen, wässrigen Zitronensäurelösung (500 ml), gehalten bei 0°C, zugetropft. Die ausgefällte Verbindung wurde aufgefangen und mit Eiswasser gewaschen und in einem Vakuumtrockenofen getrocknet. Die getrocknete Verbindung wurde in DMF (45 ml) gelöst, und HONSu (2,15 g, 18,7 mmol) wurde zugesetzt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (3,5 g, 17 mmol) in Dichlormethan (67 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt und die ausgefällte Verbindung abfiltriert. Der Niederschlag wurde aus n-Heptan/2-Propanol umkristallisiert, um die Titelverbindung (6,6 g, 72%) zu erhalten.
Beispiel 36
Synthese von Lys^26,34-bis(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (10 mg, 2,9 μmol), EDPA (10,8 mg, 83,4 μmol), NMP (0,7 ml) und Wasser (0,7 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N^ε-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t, hergestellt wie in Beispiel 33 beschrieben, (163 mg, 319,3 μmol) in NMP (4,08 ml) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und 20 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (4,9 mg, 65,6 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (492 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (9 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf eine Hülse des Typs Varian 1 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (10 ml) gewaschen und schließlich durch Elution mit TFA (10 ml) aus der Hülse freigesetzt. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (2,4 mg, 20%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 4092 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 4091 ± 3 amu (theoretischer Wert 4091 amu).
Beispiel 37
Synthese von Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^t-GLP-1(7-37)-OH (3,7 mg, 1,1 μmol), EDPA (4,0 mg, 30,8 μmol), Acetonitril (260 μl) und Wasser (260 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N^α-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t, hergestellt wie in Beispiel 35 beschrieben, (1,8 mg, 3,3 μmol) in Acetonitril (44,2 μl) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und 20 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (1,8 mg, 24,2 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (181 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (12 ml) und NMP (300 μl) wurden zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde auf eine Hülse des Typs Varian 1 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung wurde mit 5%igemmm, wässrigem Acetonitril (10 ml) gewaschen und schließlich durch Elution mit TFA (6 ml) aus der Hülse freigesetzt. Man ließ das Eluat für eine Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur stehen, wonach es im Vakuum eingeengt wurde. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,23 mg, 6%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3752 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3751 ± 3 amu (theoretischer Wert 3751 amu).
Beispiel 33
Synthese von Agr^26,34Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-38)-OH (14 mg, 4,0 μmol), EDPA (14,3 mg, 110,6 μmol), NMP (980 μl) und Wasser (980 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N^α-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben, (12,1 mg, 23,7 μmol) in NMP (303 μl) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (6,5 mg, 86,9 mmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (652 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (50 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf eine Hülse des Typs Varian 1 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung wurde mit 5%igem, wässrige Acetonitril (15 ml) gewaschen und schließlich durch Elution mit TFA (6 ml) aus der Hülse freigesetzt. Man ließ das Eluat für eine Dauer von 1 Std. und 45 Min. bei Raumtemperatur stehen, wonach es im Vakuum eingeengt wurde. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (3,9 mg, 26%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3881 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3880 ± 3 amu (theoretischer Wert 3880 amu).
Beispiel 39
Synthese von Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(ω-carboxypentadecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (14 mg, 4,0 μmol), EDPA (14,3 mg, 111 μmol), NMP (980 μl) und Wasser (980 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₄-COONSu (4,5 mg, 11,9 μmol) in NMP (114 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und 45 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Eine zusätzliche Lösung von of HOOC-(CH₂)₁₄-COONSu (4,0 mg, 10,4 μmol) in NMP (100 μl) wurde zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde für eine zusätzliche Dauer von 1 Std. und 30 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (1,5 mg, 19,8 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (148 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (3,9 mg, 26%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3809 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3808 ± 3 amu (theoretischer Wert 3808 amu).
Beispiel 40
Synthese von Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (14 mg, 4,0 μmol), EDPA (14,3 mg, 110,6 μmol), NMP (980 μl) und Wasser (980 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N^α-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t, hergestellt wie in Beispiel 35 beschrieben, (6,4 mg, 11,9 μmol) in NMP (160 μl) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und 20 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (6,5 mg, 87 mmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (653 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (50 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf eine Hülse des Typs Varian 1 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung wurde mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (10 ml) gewaschen und schließlich durch Elution mit TFA (6 ml) aus der Hülse freigesetzt. Man ließ das Eluat für eine Dauer von 1 Std. und 30 Min. bei Raumtemperatur stehen, wonach es im Vakuum eingeengt wurde. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (7,2 mg, 47%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der m/z-Wert für das protovierte Molekülion wurde als 3881 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3880 ± 3 amu (theoretischer Wert 3880 amu).
Beispiel 41
Synthese von Arg^{18,23,26,30,24}Lys³⁸(N^ε-hexadecanoyl)-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^{18,23,26,30,24}Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (1,0 mg, 0,27 μmol), EDPA (0,34 mg, 2,7 μmol) und DMSO (600 μl) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Pal-ONSu (0,28 mg, 0,8 μmol) in NMP (7 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche Dauer von 6 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (1,6 mg, 21,7 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (163 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300S6-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (0,17 mg, 16%) wurde isoliert und das Produkt durch MALDI-MS analysiert. Der m/z-Wert für das protovierte Molekülion wurde als 3961 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3960 ± 3 amu (theoretischer Wert 3960 amu).
Beispiel 42
Synthese von Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(ω-carboxytridecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38)-OH (14 mg, 4,0 μmol), EDPA (14,3 mg, 111 μmol), NMP (980 μl) und Wasser (980 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH₂)₁₂-COONSu (4,2 mg, 11,9 μmol) in NMP (105 μl) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und 50 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (6,5 mg, 87 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (652 μl) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (5,8 mg, 39%) wurde isoliert und das Produkt durch MALDI-MS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3780 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3779 ± 3 amu (theoretischer Wert 3781 amu).
Beispiel 43
Synthese von Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(-glutamyl(N^α-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-37)-OH.
Ein Gemisch aus Arg³⁴-GLP-1(7-37)-OH (15 mg, 4,4 μmol), EDPA (16 mg, 124 μmol), NMP (2 ml) und Wasser (4,8 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N^α-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben, (12,1 mg, 23,7 μmol) in NMP (303 μl) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (6,5 mg, 86,9 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (652 μl) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (50 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf eine Hülse des Typs Varian 1 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (15 ml) gewaschen und schließlich durch Elution mit TFA (6 ml) aus der Hülse freigesetzt. Man ließ das Eluat für eine Dauer von 1 Std. und 45 Min. bei Raumtemperatur stehen wonach es im Vakuum eingeengt wurde. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (3,9 mg, 26%) wurde isoliert und das Produkt durch MALDI-MS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3723 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3722 ± 3 amu (theoretischer Wert 3723 amu).
Beispiel 44
Synthese von N^α-octadecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t.
Einer Suspension von H-Glu(OH)-OBu^t (2,82 g, 13,9 mmol), DMF (370 ml) und EDPA (1,79 g, 13,9 mmol) wurde eine Lösung von Ste-ONSu (5,3 g, 13,9 mmol) in DMF (60 ml) zugetropft. Dichlormethan (35 ml) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch für eine Dauer von 24 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen 10%iger, wässriger Zitronensäure (330 ml) und Ethyl acetat (200 ml) aufgeteilt, und die Phasen wurden getrennt. Die organischen Phasen wurden im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde in DMF (60 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde einer 10%igen, wässrigen Zitronensäurelösung (400 ml), gehalten bei 0°C, zugetropft. Die ausgefällte Verbindung wurde aufgefangen und mit Eiswasser gewaschen und in einem Vakuumtrockenofen getrocknet. Die getrocknete Verbindung wurde in DMF (40 ml) gelöst, und HONSu (1,63 g, 14,2 mmol) wurde zugesetzt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von DCC (2,66 g, 12,9 mmol) in Dichlormethan (51 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 64 Std. bei Raumtemperatur gerührt und die ausgefällte Verbindung abfiltriert. Der Niederschlag wurde aus n-Heptan/2-Propanol umkristallisiert, um die Titelverbindung (4,96 g, 68%).
Beispiel 45
Synthese von Arg^26,34Lys³⁸(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-octadecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
Ein Gemisch aus Arg^26,34-GLP-1(7-38)-OH (28 m 7,9 μmol) EDPA (28,6 m 221,5 μmol), NMP (1,96 ml) und Wasser (1,96 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von N^α-octadecanoyl-Glu(ONSu)-OBu^t (17,93 g, 31,6 ☐mol), hergestellt wie in Beispiel 44 beschrieben, in NMP (448 μl) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (13,1 mg, 174 μmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (1,3 ml) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (120 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch in zwei gleiche Portionen aufgeteilt. Jede Portion wurde auf eine Hülse des Typs Varian 5 g C8 Mega Bond Elut^® eluiert, die immobilisierte Verbindung wurde mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich durch Elution TFA (25 ml) aus der Hülse freigesetzt. Man ließ die vereinigten Eluate für eine Dauer von 1 Std. und 25 Min. bei Raumtemperatur stehen, wonach sie im Vakuum eingeengt wurden. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt. Die Säule wurde auf 65°C erwärmt, und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0–100%. Die Titelverbindung (3,6 mg, 11%) wurde isoliert und das Produkt durch MALDI-MS analysiert. Der m/z-Wert für das protonierte Molekülion wurde als 3940 ± 3 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3939 ± 3 amu (theoretischer Wert 3937 amu).
BIOLOGISCHE FUNDE
Langzeitwirkung von GLP-1-Derivaten nach einer s. c.-Verabreichung
Die Langzeitwirkung einer Anzahl von GLP-1-Derivaten der Erfindung wurde durch Überwachen ihrer Konzentration in Plasma nach einer sc-Verabreichung an gesunde Schweine unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Verfahrens bestimmt. Zum Vergleich folgte auch die Konzentration in Plasma von GLP-1(7-37) nach einer sc-Verabreichung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Die Langzeitwirkung von anderen GLP-1-Derivaten der Erfindung kann in derselben Weise bestimmt werden.
Schweine (50% Duroc, 25% Yorkshire, 25% Danish Landrace, etwa 40 kg) wurden von Beginn des Versuchs an die Nahrung entzogen. Jedem Schwein wurden 0,5 nmol Testverbindung pro kg Körpergewicht in einer 50 μM isotonischen Lösung (5 mM Phosphat, pH 7,4, 0,02% Tween^®-20 (Merck), 45 mg/ml Mannit (pyrogenfrei, Novo Nordisk) verabreicht. Blutproben wurden aus einem Katheter in der Jugularisvene zu den in Tabelle 1 angegebenen Stunden entnommen. 5 ml der Blutproben wurden in gekühlte Glasbehälter, enthaltend 175 μl der folgenden Lösung, gegossen: 0,18 M EDTA, 1500 KIE/ml Aprotinin (Novo Nordisk) und 3% Bacitracin (Sigma), pH 7,4. Innerhalb von 30 Min. wurden die Proben für eine Dauer von 10 Min. bei 5–6000·g zentrifugiert. Die Temperatur wurde bei 4°C gehalten. Der Überstand wurde in verschiedene Glasbehälter pipettiert und bei –20°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
Die Plasmakonzentrationen der Peptide wurden durch RIA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der für den N-terminalen Bereich von GLP-1(7-37) spezifisch ist, bestimmt. Die Kreuzreaktivitäten betrugen mit GLP-1(1-37) und GLP-1(8-36)amid weniger als 1% und mit GLP-1(9-37), GLP-1(10-36)amid und GLP-1(11-36)amid < 0,1%. Das gesamte Verfahren wurde bei 4°C durchgeführt.

Der Test wurde wie folgt durchgeführt: 100 μl Plasma wurden mit 271 μl 96%igem Ethanol gemischt, unter Verwendung eines Wirbelmischers gemischt und bei 2600·g für eine Dauer von 30 Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde in Minisorp-Röhrchen dekantiert und vollständig eingedampft (Savant Speedvac AS290). Der Eindampfungsrückstand wurde im Testpuffer, bestehend aus 80 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 0,1% HSA (Orpha 20/21, Behring), 10 mM EDTA, 0,6 mM Thiomersal (Sigma), pH 7,5, rekonstituiert. Proben wurden in Vo lumina rekonstituiert, die für ihre erwarteten Konzentrationen geeignet waren, und man ließ sie für eine Dauer von 30 Min. rekonstituieren. Zu 300 μl Probe wurden 100 μl Antikörperlösung in Verdünnungspuffer, enthaltend 40 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 0,1% HSA, 0,6 mM Thiomersal, pH 7,5, zugesetzt. Eine nicht-spezifische Probe wurde durch Mischen von 300 μl Puffer mit 100 μl Verdünnungspuffer hergestellt. Individuelle Standards wurden aus gefriergetrockneten Ausgangsmaterialien, gelöst in 300 μl Testpuffer, hergestellt. Alle Proben wurden wie vorstehend beschrieben für eine Dauer von 72 Std. in Minisorp-Röhrchen mit Antikörper vorinkubiert. 200 μl Tracer in Verdünnungspuffer, enthaltend 6–7000 CPM, wurden zugesetzt, die Proben wurden gemischt und für eine Dauer von 48 Std. inkubiert. 1,5 ml einer Suspension von 200 ml pro Liter heparinstabilisiertes Rinderplasma und 18 g pro Liter Aktivkohle (Merck) in 40 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 0,6 mM Thiomersal, pH 7,5, wurden jedem Röhrchen zugesetzt. Vor der Verwendung wurde die Suspension gemischt und für eine Dauer von 2 Std. bei 4°C stehen gelassen. Alle Proben wurden für eine Dauer von 1 Std. bei 4°C inkubiert und dann bei 3400·g für eine Dauer von 25 Min. zentrifugiert. Sofort nach der Zentrifugation wurde der Überstand abdekantiert und in einem γ-Zähler gezählt. Die Konzentration in den Proben wurde aus individuellen Standardkurven berechnet. Die folgenden Plasmakonzentrationen wurden gefunden, berechnet als % der maximalen Konzentration für die einzelnen Verbindungen (n = 2): Tabelle 1

Testverbindung^*)	Stunden nach sc-Verabreichung
Testverbindung^*)	0,75	1	2	4	6	8	10	12	24
GLP-1(7-37)		100	9	1
Beispiel 25	73	92	100	98	82	24	16	16	16

Testverbindung^*)	Stunden nach sc-Verabreichung
Beispiel 17	76	71	91	100	84	68	30		9
Beispiel 43		39	71	93	100	91	59	50	17
Beispiel 37		26	38	97	100	71	81	80	45
Beispiel 11	24	47	59	71	100	94	100		94
Beispiel 12	36	54	65	94	80	100	85		93
Beispiel 32	55	53	90	83	88	70	98	100	100
Beispiel 14	18	25	32	47	98	83	97		100
Beispiel 13	15	22	38	59	97	85	100		76
Beispiel 38	60	53	100	66	48	39	25	29	0
Beispiel 39	38	100	70	47	33	33	18	27	14
Beispiel 40	47	19	50	100	51	56	34	14	0
Beispiel 34	19	32	44	84	59	66	83	84	100

*) Die Testverbindungen sind die Titelverbindungen der Beispiele mit den angegebenen Zahlen

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, weisen die GLP-1-Derivate der Erfindung ein lang anhaltendes Wirkungsprofil in Bezug auf GLP-1(7-37) auf und sind in Plasma viel beständiger als GLP-1(7-37). Es ist auch aus Tabelle 1 ersichtlich, dass die Zeit, bei welcher die Höchstkonzentration in Plasma erzielt wird, je nach dem ausgewählten bestimmten GLP-1-Derivat innerhalb breiter Grenzen variiert?.
Stimulation der eAMP-Bildung in einer Zelllinie, die den klonierten menschlichen GLP-1-Rezeptor esprimiert Zum Aufzeigen der Wirksamkeit der GLP-1-Derivate wurde deren Vermögen, die cAMP-Bildung in einer den klonierten menschlichen GLP-1-Rezeptor exprimierenden Zelllinie zu stimulieren, getestet. Ein EC₅₀ wurde aus der Dosis-Wirkungs-Kurve berechnet.
Baby-Hamsternieren(BHK)-Zellen, die den menschlichen Bauspeicheldrüsen-GLP-1-Rezeptor exprimieren, wurden verwendet (Knudsen und Pridal, 1996, Eur. J. Pharm. 318, 429–435). Plasmamembrane wurden durch Homogenisierung in Puffer (10 mmol/l Tris-HCl und 30 mmol/l NaCl pH 7,4, enthaltend zusätzlich 1 mmol/l Dithiothreitol, 5 mg/l Leupeptin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 5 mg/l Pepstatin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 100 mg/l Bacitracin (Sigma, St. Louis, MO, USA) und 16 mg/l Aprotinin (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark)) präpariert (Adelhorst et al, 1994, J. Biol. Chem. 269, 6275). Das Homogenisat wurde auf einer Schicht aus 41 G/V% Saccharose zentrifugiert. Die weiße Bande zwischen den beiden Schichten wurde in Puffer verdünnt und zentrifugiert. Plasmamembranen wurden bis zur Verwendung bei –80°C aufbewahrt.
Der Test wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Mulden in einem Gesamtvolumen von 140 μl durchgeführt.
Der verwendete Puffer war 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4 unter Zugabe von 1 mmol/l EGTA, 1,5 mmol/l MgSO₄, 1,7 mmol/l ATP, 20 mM GTP, 2 mmol/l 3-Isobutyl-1-methylxanthin, 0,01% Tween-20 und 0,1% Humanserumalbumin (Reinst, Behringwerke AG, Marburg, Germany). Verbindungen, die auf Agonistaktivität zu testen waren, wurden gelöst und in Puffer verdünnt, den auf Agonistaktivität zu testenden Membranen zugesetzt, und das Gemisch wurde für eine Dauer von 2 Std. bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 25 μl 0,05 mol/l HCl gestoppt. Die Proben wurden vor der Analyse auf cAMP durch einen Szintillationsannäherungstest (RPA 538, Amersham, UK) auf das 10-Fache verdünnt. Die folgenden Ergebnisse wurden gefunden:

Testverbindung^*) EC₅₀, pM Testverbindung^*) EC₅₀, pM

GLP-1(7-37) 61 Beispiel 31 96

Beispiel 45 120 Beispiel 30 41

Beispiel 43 24 Beispiel 26 8,8

Beispiel 40 55 Beispiel 25 99

Beispiel 39 5,1 Beispiel 19 79

Beispiel 38 54 Beispiel 16 3,5

Beispiel 37 60

*) Die Testverbindungen sind die Titelverbindungen der Beispiele mit den angegebenen Zahlen.

Claims

Derivat von GLP-1(7-37) oder Analogon von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nur einen lipophilen Substituenten aufweist, der an einem Aminosäurerest angelagert ist, der nicht der N-terminale oder C-terminale Aminosäurerest ist.
Derivat von GLP-1(7-37) oder Analogon von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nur zwei lipophile Substituenten aufweist, wobei einer davon an den C-terminalen Aminosäurerest angelagert ist, während der andere an einen Aminosäurerest angelagert ist, bei welchem es sich nicht um den N-terminalen oder C-terminalen Aminosäurerest handelt.
Derivat von GLP-1(7-37) oder Analogon von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nur zwei lipophile Substituenten aufweist, die an Aminosäurereste angelagert sind, bei welchen es sich nicht um den N-terminalen oder C-terminalen Aminosäurerest handelt.
Derivat eines Analogons von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist und wobei das Analogon GLP-1(7-C) ist, wobei C 38 bis 45 beträgt, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nur einen lipophilen Substituenten aufweist, der an den C-terminalen Aminosäurerest angelagert ist.
Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Analogon von GLP-1(7- 37) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Arg²⁶-GLP-1(7-37); Arg³⁴-GLP-1(7-37); Lys³⁶-GLP-1(7-37); Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(7-39); Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7-40); Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7-37); Arg³⁴Lys³⁶-GLP-1(7-37); Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7-39); Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7-40); Arg^26,34Lys^36,39-GLP-1(7-39); Arg^26,34Lys^36,40-GLP-1(7-40); Gly⁸Arg²⁶-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg³⁴-GLP-1(7-37); Gly⁸Lys³⁶-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(7-39); Gly⁸Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7-40); Gly⁸Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg³⁴Lys³⁶-GLP-1(7-37); Gly⁸Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7-39); Gly⁸Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7-40); Gly⁸Arg^26,34Lys^36,39-GLP-1(7-39) und Gly⁸Arg^26,34Lys^36,40-GLP-1(7-40).
Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Analogon von GLP-1(7-37) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(7-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(7-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(7-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(7-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(7-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(7-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(7-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(1-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(1-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(1-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(1-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(1-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(1-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(1-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(1-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(2-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(2-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(2-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(2-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(2-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(2-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(2-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(2-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(3-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(3-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(3-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(3-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(3-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(3-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(3-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(3-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(4-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(4-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(4-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(4-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(4-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(4-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(4-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(4-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(5-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(5-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(5-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(5-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(5-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(5-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(5-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(5-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(6-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(6-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(6-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(6-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(6-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(6-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(6-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(6-45); Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(1-38); Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(1-38); Arg^26,34Lys^36,38GLP-1(1-38); Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys^36,38GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg²⁶Lys³⁹GLP-1(1-39); Arg³⁴Lys³⁹GLP-1(1-39); Arg^26,34Lys^36,39GLP-1(1-39); Arg²⁶Lys³⁹GLP-1(7-39); Arg³⁴Lys³⁹GLP-1(7-39) und Arg^26,34Lys^36,39GLP-1(7-39).
Derivat oder Analogon von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, wobei mindestens ein Aminosäurerest einen angelagerten lipophilen Substituenten aufweist und das Analogon ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(7-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(7-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(7-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(7-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(7-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(7-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(7-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(1-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(1-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(1-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(1-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(1-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(1-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(1-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(1-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(2-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(2-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(2-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(2-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(2-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(2-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(2-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(2-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(3-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(3-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(3-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(3-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(3-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(3-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(3-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(3-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(4-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(4-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(4-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(4-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(4-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(4-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(4-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(4-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(5-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(5-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(5-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(5-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(5-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(5-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(5-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(5-45); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(6-38); Arg^26,34Lys³⁹GLP-1(6-39); Arg^26,34Lys⁴⁰GLP-1(6-40); Arg^26,34Lys⁴¹GLP-1(6-41); Arg^26,34Lys⁴²GLP-1(6-42); Arg^26,34Lys⁴³GLP-1(6-43); Arg^26,34Lys⁴⁴GLP-1(6-44); Arg^26,34Lys⁴⁵GLP-1(6-45); Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(1-38); Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(1-38); Arg^26,34Lys^36,38GLP-1(1-38); Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys^36,38GLP-1(7-38); Arg^26,34Lys³⁸GLP-1(7-38); Arg²⁶Lys³⁹GLP-1(1-39); Arg³⁴Lys³⁹GLP-1(1-39); Arg^26,34Lys^36,39GLP-1(1-39); Arg²⁶Lys³⁹GLP-1(7-39); Arg³⁴Lys³⁹GLP-1(7-39) und Arg^26,34Lys^36,39GLP-1(7-39), mit der Maßgabe, dass, falls nur ein lipophiler Substituent vorliegt und dieser Substituent an den N-terminalen oder an den C-terminalen Aminosäurerest angelagert ist, dieser Substituent eine Alkylgruppe oder eine Gruppe ist, die eine ω-Carboxylgruppe aufweist.
Derivat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der lipophile Substituent 4 bis 40 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt 8 bis 25 Kohlenstoffatome umfasst.
Derivat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein lipophiler Substituent an einen Aminosäurerest in einer derartigen Weise angelagert ist, dass eine Carboxygruppe des lipophilen Substituenten mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests eine Amidbindung bildet.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–8, wobei ein lipophiler Substituent an einen Aminosäurerest in einer derartigen Weise angelagert ist, dass eine Aminogruppe des lipophilen Substituenten mit einer Carboxygruppe des Aminosäurerests eine Amidbindung bildet.
Derivat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der lipophile Substituent durch einen Abstandhalter an den Aminosäurerest angelagert ist.
Derivat nach Anspruch 11, wobei der Abstandhalter eine unverzweigte Alkan-α,ω-dicarbonsäuregruppe mit 1 bis 7 Methylengruppen, vorzugsweise zwei Methylengruppen ist, die zwischen einer Aminogruppe des Peptids und einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten eine Brücke bilden.
Derivat nach Anspruch 11, wobei der Abstandhalter ein Aminosäurerest außer Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys ist.
Derivat nach Anspruch 13, wobei eine Carboxygruppe des Ursprungspeptids mit einer Aminogruppe von Lys oder eines einen Lys-Rest enthaltenden Dipeptids eine Amidbindung bildet und die andere Aminogruppe des Lys-Abstandhalters oder eines einen Lys-Rest enthaltenden Dipeptid-Abstandhalters mit einer Carboxygruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung bildet.
Derivat nach Anspruch 13, wobei eine Aminogruppe des Peptids mit einer Carboxygruppe des Aminosäurerest- oder Dipeptid-Abstandhalters eine Amidbindung bildet und eine Aminogruppe des Aminosäurerest- oder Dipeptid-Abstandhalters mit einer Carboxygruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung bildet.
Derivat nach Anspruch 13, wobei eine Carboxygruppe des Peptids mit einer Aminogruppe des Aminosäurerestabstandhalters oder Dipeptid-Abstandhalters eine Amidbindung bildet und eine Carboxygruppe des Aminosäurerestabstandhalters oder Dipeptid-Abstandhalters mit einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung bildet.
Derivat nach Anspruch 13, wobei eine Carboxygruppe des Ursprungspeptids mit einer Aminogruppe eines Abstandhalters, bei welchem es sich um Asp oder Glu handelt, oder eines einen Asp- oder Glu-Rest enthaltenden Dipeptid-Abstandhalters eine Amidbindung bildet und eine Carboxygruppe des Abstandhalters mit einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten eine Amidbindung bildet.
Derivat nach einem der vorangehenden Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent ein teilweise oder vollständig hydriertes Cyclopentanophenathrengerüst umfasst.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe ist.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent eine Acylgruppe einer geradkettigen oder verzweigten Fettsäure ist.
Derivat nach Anspruch 20, wobei die Acylgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend CH₃(CH₂)_nCO-, wobei n 4 bis 38 ist, vorzugsweise CH₃(CH₂)₆CO-, CH₃(CH₂)₈CO-, CH₃(CH₂)₁₀CO-, CH₃(CH₂)₁₂CO-, CH₃(CH₂)₁₄CO-, CH₃(CH₂)₁₆CO-, CH₃(CH₂)₁₈CO-, CH₃(CH₂)₂₀CO- und CH₃(CH₂)₂₂CO-.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent eine Acylgruppe einer geradkettigen oder verzweigten Alkan-α,ω-dicarbonsäure ist.
Derivat nach Anspruch 22, wobei die Acylgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend HOOC(CH₂)_mCO-, wobei m 4 bis 38, vorzugsweise 4 bis 24 ist, stärker bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, umfassend HOOC(CH₂)₁₄CO-, HOOC(CH₂)₁₆CO-, HOOC(CH₂)₁₈CO-, HOOC(CH₂)₂₀CO- und HOOC(CH₂)₂₂CO-.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent mit dem Abstandhalter eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_p((CH₂)_qCOOH)CHNH CO(CH₂)₂CO- ist, wobei p und q ganze Zahlen sind und p + q eine ganze Zahl von 8 bis 33, vorzugsweise von 12 bis 28 ist.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent mit dem Abstandhalter eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_rCO-NHCH(COOH)(CH₂)₂CO- ist, wobei r eine ganze Zahl von 10 bis 24 ist
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent mit dem Abstandhalter eine Gruppe der Formel CH₃(CH₂)_sCO- NHCH((CH₂)₂COOH)CO- ist, wobei s eine ganze Zahl von 8 bis 24 ist.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent mit dem Abstandhalter eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)_uCH₃ ist, wobei u eine ganze Zahl von 8 bis 18 ist.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent mit dem Abstandhalter eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-COCH((CH₂)₂COOH)NH-CO(CH₂)_wCH₃ ist, wobei w eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent mit dem Abstandhalter eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)₂CH(COOH)NH-CO(CH₂)_xCH₃ ist, wobei x eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
Derivat nach einem der Ansprüche 1–17, wobei der lipophile Substituent mit dem Abstandhalter eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)₂CH(COOH)NH-CO(CH₂)_yCH₃ ist, wobei y null oder eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist.
Derivat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei insgesamt bis zu sechs Aminosäurereste von GLP-1(7-37) mit einem beliebigen α-Aminosäurerest, der durch den genetischen Kode kodiert werden kann, ausgetauscht worden sind.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Lys³⁴(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 2, bei welchem es sich um Lys^26,34-bis(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Lys²⁶(N^ε-tetradecanoyl)Arg³⁴-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Gly⁸Arg^26,34Lys³⁵(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1 (7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 3, bei welchem es sich um Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxynonadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxyheptadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyheptadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg^26,34Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyundecadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 3, bei welchem es sich um Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxyundecadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxyundecadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxyheptadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg^26,4Lys³⁶(N^ε-(ω-carboxyheptadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 3, bei welchem es sich um Lys^26,34-bis(N^ε-(ω-carboxyheptadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(ω-carboxypentadecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(lithocholyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 3, bei welchem es sich um Lys^23,34-bis(N^ε(carboxytridecanoyl)-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 3, bei welchem es sich um Lys^23,34-bis(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 3, bei welchem es sich um Lys^23,34-bis(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-37) handelt.
Derivat nach Anspruch 1, bei welchem es sich um Arg³⁴Lys²⁶(N^ε-(γ-glutamyl(N^α-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-37) handelt.
Arzneimittel, umfassend ein Derivat nach einem der Ansprüche 1–54 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung eines Derivats nach einem der Ansprüche 1–54 zur Herstellung eines Medikaments, das ein lang anhaltendes Wirkungsprofil in Bezug auf GLP-1(7-37) aufweist.
Verwendung eines Derivats nach einem der Ansprüche 1–54 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus.
Verwendung eines Derivats nach einem der Ansprüche 1–54 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von insulinabhängiger Diabetes mellitus.
Verwendung eines Derivats nach einen der Ansprüche 1–54 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fettsucht.
Verwendung eines Derivats nach einem der Ansprüche 1–54 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von einem oder mehreren Zuständen, ausgewählt aus nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus, insulinabhängiger Diabetes mellitus und Fettsucht.