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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Derivate von menschlichem gluconartigem
Peptid-1 (glucon-like peptide-1; GLP-1) und Fragmente davon und
Analoga derartiger Fragmente, die ein lang anhaltendes Wirkungsprofil
aufweisen, und Verfahren zu der en Herstellung und Verwendung.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Peptide
werden weithin in der medizinischen Praxis verwendet, und, da sie
durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden können, ist
es zu erwarten, dass ihre Bedeutung auch in den kommenden Jahren
zunimmt. Werden native Peptide oder Analoga davon therapeutisch
verwendet, ist im Allgemeinen zu finden, dass sie eine hohe Clearance
aufweisen. Eine hohe Clearance eines Therapeutikums ist in Fällen, in welchen
es erwünscht
ist, über
eine längere
Zeitdauer einen hohen Blutgehalt davon beizubehalten, ungünstig, da
dann wiederholte Verabreichungen nötig sind. Beispiele für Peptide,
die eine hohe Clearance aufweisen, sind: ACTH, Corticotropin-freisetzender
Faktor, Angiotensin, Calcitonin, Insulin, Glucagon, glucagonartiges
Peptid-1, glucagonartiges Peptid-2, insulinartiger Wachstumsfaktor-1, insulinartiger
Wachstumsfaktor-2, gastrisches inhibitorisches Peptid, Wachstumshormon-freisetzender
Faktor, Hypophysenadenylatcyclase-aktivierendes Peptid, Sekretin,
Enterogastrin, Somatostatin, Somatotropin, Somatomedin, Paratropin,
Thrombopoietin, Erythropoietin, Hypothalamus-freisetzende Faktoren,
Prolactin, Thyrotropine, Endorphine, Enkephaline, Vasopressin, Oxytozin,
Opioide und Analoga davon, Superoxiddismutase, Interferon, Asparaginase,
Arginase, Arginindeaminase, Adenosindeaminase und Ribonuklease.
In einigen Fällen
ist es möglich,
das Freisetzungsprofil von Peptiden durch Anwenden von geeigneten Arzneimitteln
zu beeinflussen, jedoch weist diese Vorgehensweise verschiedene
Nachteile auf und ist nicht allgemein anwendbar.
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Die
Hormone, die die Insulinabsonderung regulieren, gehören zu der
so genannten Enteroinselachse, die eine Gruppe von Hormonen bezeichnet,
die als Reaktion auf die Gegenwart und Absorption von Nähstoffen im
Darm von der Magen-Darm-Schleimhaut
freigesetzt werden, die eine frühe
und wirksam gemachte Insulinfreisetzung fördern. Die Verbesserungswirkung
auf die Insulinabsonderung, die so genannte Inkretin-Wirkung, ist
möglicherweise
für eine
normale Glucosetoleranz bedeutsam. Viele der Magen-Darm-Hormone,
einschließlich
Gastrin und Sekretin (Cholecystokinin ist beim Menschen nicht insulinotrop)
sind insulinotrop, jedoch handelt es sich bei den einzigen physiologisch
Wichtigen, denjenigen, die für
die Inkretin-Wirkung verantwortlich sind, um das glucoseabhängige insulinotrope
Polypeptid, GIP, und das glucagonartige Peptid-1 (GLP-1). Aufgrund
seiner insulinotropen Wirkung fand das 1973 isolierte GIP (1) unter
Diabetologen sofort beträchtliches Interesse.
Jedoch wurden in den darauf folgenden Jahren zahlreiche Untersuchungen
durchgeführt,
die klar darauf hinwiesen, dass eine fehlerhafte Absonderung von
GIP an der Krankheitsentstehung von insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM)
oder nicht-insulinabhängiger
Diabetes mellitus (NIDDM) nicht beteiligt war (2). Des Weiteren
wurde gefunden, dass ein insulinotropes Hormon, GIP, bei NIDDM nahezu
unwirksam war (2). Das andere Inkretin-Hormon, GLP-1, ist die wirksamste insulinotrope
Substanz, die bekannt ist (3). Anders als GIP ist es beim Stimulieren
der Insulinabsonderung bei NIDDM-Patienten überraschend
wirksam. Zudem und im Gegensatz zu den anderen insulinotropen Hormonen
(möglicherweise
mit Ausnahme von Sekretin) hemmt es auch wirksam die Glucagonabsonderung.
Aufgrund dieser Aktionen weist es insbesondere bei Patienten mit
NIDDM ausgeprägte
Blutglucose-senkende Wirkungen auf.
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GLP-1,
ein Produkt des Proglucagons (4), ist eines der jüngsten Vertreter
der Sekretin-VIP-Familie, ist jedoch als wichtiges Darmhormon mit
regulatorischer Funktion beim Glucosestoffwechsel und der Magen-Darm-Absonderung
und dem Magen-Darm-Stoffwechsel schon etabliert (5). Das Glucagongen
wird in der Bauchspeicheldrüse
und im Darm verarbeitet. In der Bauchspeicheldrüse (9) führt die Verarbeitung zur Bildung und
gleichzeitigen Absonderung von 1) Glucagon selbst, das die Positionen
33-61 von Proglucagon (PG) einnimmt; 2) einem N-terminalen Peptid mit 20 Aminosäuren (PG
(1-30)), häufig
als Gilcetinverwandtes Bauchspeicheldrüsenpeptid, GRPP, bezeichnet
(10 11); 3) einem Hexapeptid, entsprechend PG (64-69); 4) und schließlich des
so genannten Hauptproglucagonfragments (PG (72-158)), in welchem
die beiden glucagonartigen Sequenzen verborgen sind (9). Glucagon
scheint das einzige biologisch aktive Produkt zu sein. Im Gegensatz
dazu ist es in der Darmschleimhaut Glucagon, das in einem größeren Molekül verborgen
ist, während die
beiden glucagonartigen Peptide getrennt gebildet werden (8). Die
folgenden Produkte werden gleichzeitig gebildet und abgesondert:
1) Glicentin, entsprechend PG (1-69), wobei die Glucagonsequenz
die Reste Nr. 33-61 einnimmt (12); 2) GLP-1(7-36)amid (PG (78-107))amid (13), nicht
wie ursprünglich
angenommen PG (72-107)amid oder 108, das inaktiv ist). Kleine Mengen
an C-terminalen Glycin-verlängerten,
jedoch gleichermaßen
bioaktiven GLP-1(7-37), (PG (78-108)) werden ebenfalls gebildet
(14); 3) intervenierendes Peptid-2 (PG (111-122)amid) (15); und
4) GLP-2 (PG (126-158)) (15, 16). Eine Glicentinfraktion wurde weiter
zu GRPP (PG (1-30)) und Oxyntomodulin (PG (33-69)) (17, 18) aufgespaltet.
Unter diesen Peptiden weist GLP-1 die auffälligsten biologischen Aktivitäten auf.
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Aus
der mit Glicentin/Enteroglucagon gleichzeitigen Absonderung, folgt
dass die vielen Studien der Enteroglucagonabsonderung (6, 7) zu
einem gewissen Grad auch für
die GLP-1-Absonderung gelten, jedoch wird GLP-1 mit einer Plasma-Halbwertszeit im
Menschen von 2 Min. schneller metabolisiert (19). Kohlenhydrat-
oder fettreiche Mahlzeiten stimulieren vermutlich infolge der direkten
Wechselwirkung von noch nicht absorbierten Nährstoffen mit den Kleinzotten
der L-Zellen vom
offenen Typ der Darmschleimhaut die Absonderung (20). Endokrine oder
neuronale Mechanismen, die die GLP-1-Absonderung fördern, können vorliegen, wurden
jedoch im Menschen bisher noch nicht aufgezeigt.
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Die
Inkretin-Funktion von GLP-1(29-31) wurde in Versuchen mit dem GLP-1-Rezeptorantagonisten, Exendin
9-39, der die durch orale Glucose in Ratten ausgelösten Inkretin-Wirkung
drastisch reduziert, deutlich veranschaulicht (21, 22). Das Hormon
zeigt eine direkte Wechselwirkung mit den β-Zellen über den GLP-1-Rezeptor (23), der
zu der Glucagon/VIP/Calcitonin-Familie von G-Proteingekuppelten
7-Transmembran-umspannenden Rezeptoren gehört. Die Bedeutung des GLP-1-Rezeptors
beim Regulieren der Insulinabsonderung wurde in jüngsten Versuchen
veranschaulicht, in welchen eine gezielte Spaltung des GLP-1-Rezeptorgens in Mäusen durchgeführt wurde.
Tiere, die für
die Spaltung homozygot waren, hatten eine stark verschlechterte Glucosetoleranz
und Nüchternhyperglykämie, und
selbst heterozygote Tiere waren glucoseintolerant (24). Der Signalübertragungsmechanismus
(25) bringt hauptsächlich
die Aktivierung von Adenylatcyclase mit sich, jedoch waren auch
Erhöhungen
des intrazellulären
Ca2+ beträchtlich (25, 26). Die Wirkung
des Hormons ist am Besten als Potenzierung von glucosestimulierter
Insulinfreisetzung zu beschreiben (25), jedoch ist der Mechanismus,
der Glucose- und GLP-1-Stimulierung verbindet, nicht bekannt. Er
kann eine calciuminduzierte Calciumfreisetzung mit sich bringen
(26, 27). Wie schon erwähnt,
wird die insulinotrope Wirkung von GLP-1 in diabetischen γ-Zellen bewahrt.
Die Beziehung von Letzterem zu dem Vermögen, eine „Glucosekompetenz" zu vermitteln, zu
isolierten insulinabsondernden Zellen (26, 28), die auf Glucose
oder GLP-1 allein schlecht, jedoch vollständig auf eine Kombination der
beiden ansprechen, ist ebenfalls nicht bekannt. Gleichermaßen wichtig
jedoch hemmt das Hormon auch wirksam die Glucagonabsonderung (29).
Der Mechanismus ist nicht bekannt, scheint jedoch über benachbarte
Insulin- oder Somatostatinzellen paracrin zu sein. Auch ist die
glucagonostatische Wirkung glucoseabhängig, so dass die hemmende
Wirkung abnimmt, wenn die Blutglucose abnimmt. Aufgrund dieser Doppelwirkung
ist, wenn die Plasma-GLP-1-Konzentrationen
entweder durch eine erhöhte
Absonderung oder durch exogene Infusion zunehmen, das Molverhältnis von
Insulin zu Glucagon im Blut, das über die Portalzirkulation die
Leber erreicht, stark erhöht,
wodurch die Leberglucoseproduktion abnimmt (30). Infolgedessen nehmen
die Blutglucosekonzentrationen ab. Aufgrund der Glucoseabhängigkeit
der insulinotropen und glucagonostatischen Wirkungen ist der glucosesenkende
Effekt selbstbeschränkend,
und das Hormon verursacht ungeachtet der Dosis keine Hypoglykämie (31).
Die Wirkungen werden in Patienten mit Diabetes mellitus bewahrt
(32), in welchen Infusionen von leicht supraphysiologischen Dosen
von GLP-1 Blutglucosewerte trotz der schlechten metabolischen Steuerung
und des Sekundärversagens
von Sulfonylharnstoff vollständig
normalisiert (33). Die Bedeutung der glucagonostatischen Wirkung
wird durch den Fund veranschaulicht, dass GLP-1 ohne Restkapazität der β-Zell-Absonderung
auch Blutglucose in Patienten mit Diabetes Typ 1 senkt (34).
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Zusätzlich zu
seinen Wirkungen auf die Langerhans-Inseln wirkt sich GLP-1 stark
auf den Magen-Darm-Trakt aus. In physionlogischen Mengen infundiert,
hemmt GLP-1 wirksam die Pentagastrin-induzierte sowie die durch
Mahlzeiten induzierte Magensäureabsonderung
(35, 36). Es hemmt auch die Entleerungsgeschwindigkeit des Magens
und die Absonderung des Bauchspeicheldrüsenenzyms (36). Ähnliche hemmende
Wirkungen auf die Magen- und Bauchspeicheldrüsenabsonderung und -beweglichkeit
können beim
Menschen durch Perfusion des Ileums mit kohlenhydrat- oder lipidhaltigen
Lösungen
ausgelöst
werden (37, 38). Gleichzeitig wird die GLP-1-Absonderung stark stimuliert,
und es wurden Vermutungen angestellt, dass GLP-1 zumindest teilweise
für diese
so genannte „Ileum-Brems"-Wirkung verantwortlich sein kann. Tatsächlich legen
jüngste
Studien nahe, dass die Ileum-Brems-Wirkungen von GLP-1 physiologisch
bedeutender als seine Wirkungen auf die Langerhans-Inseln sind.
Folglich beeittflusst GLP-1 in Dosis-Wirkungs-Studien die Entleerungsgeschwindigkeit
des Magens bei Infusionsgeschwindigkeiten, die mindestens so niedrig
wie diejenigen sind, die zum Beeinflussen der Inselabsonderung erforderlich
sind (39).
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GLP-1
scheint eine Wirkung auf die Nahrungsaufnahme zu haben. Eine intraventrikuläre Verabreichung
von GLP-1 hemmt hochgradig die Nahrungsaufnahme in Ratten (40, 42).
Diese Wirkung scheint äußerst spezifisch
zu sein. So ist N-terminal-verlängertes
GLP-1 (PG 72-107)amid inaktiv, und geeignete Dosen des GLP-1-Antagonisten
Exendin 9-39 heben die Wirkungen von GLP-1 auf (41). Eine akute
periphere Verabreichung von GLP-1 hemmt die Nahrungsaufnahme in
Ratten nicht akut (41, 42). Jedoch bleibt die Möglichkeit bestehen, dass aus
den L-Zellen des Darms abgesondertes GLP-1 auch als Sättigungssignal
wirken kann.
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Nicht
nur insulinotrope Wirkungen, sondern auch die Wirkungen von GLP-1
auf den Magen-Darm-Trakt werden in diabetischen Patienten bewahrt
(43) und können
durch Mahlzeiten induzierte Glucoseabweichungen unterstützen, jedoch
bedeutender auch die Nahrungsmittelaufnahme beeinflussen. es zeigte
sich, dass intravenös
kontinuierlich für
eine Dauer von einer Woche verabreichtes GLP-1 mit 4 ng/kg/Min.
ohne erhebliche Nebenwirkungen die glykämische Steuerung in NIDDM-Patienten
drastisch verbessert (44). Das Peptid ist nach einer subkutanen
Verabreichung voll aktiv (45), wird jedoch hauptsächlich aufgrund
des Abbaus durch Dipeptidylpeptidase-IV-artige Enzyme rasch abgebaut
(46, 47).
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Die
Aminosäuresequenz
von GLP-1 ist u.a. von Schmidt et al. (Diabetologia 28 704-707 (1985)
bereitgestellt. Obwohl die interessanten pharmakologischen Eigenschaften
von GLP-1(7-37) und Analoga davon in den letzten Jahren viel Aufmerksamkeit
erregten, ist nur wenig über
die Struktur dieser Moleküle
bekannt. Die Sekundärstruktur
von GLP-1 in Mizellen wurde von Thorton et al. (Biochemistry 33
3532-3539 (1994)) beschrieben, jedoch wird in normaler Lösung GLP-1
als sehr flexibles Molekül
betrachtet. Überraschenderweise fanden
wir, dass eine Derivatisierung dieses relativ kleinen und sehr flexiblen
Moleküls
zu Verbindungen führte, deren
Plasmaprofil sehr viel länger
anhielt und die immer noch Aktivität beibehielten.
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GLP-1
und GLP-1-Analoga und Fragmente davon sind möglicherweise u.a. bei der Behandlung
von Diabetes Typ 1 und Typ 2 nützlich.
Jedoch beschränkt
die hohe Clearance die Nützlichkeit
dieser Verbindungen und folglich besteht immer noch eine Notwenigkeit
für Verbesserungen
auf diesem Gebiet. Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, Derivate von GLP-1 und Analoga davon bereitzustellen,
die ein lang anhaltendes Wirkungsprofil in Bezug auf GLP-1(7-37)
aufweisen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Derivate von
GLP-1 und Analoga davon bereitzustellen, die eine niedrigere Clearance
als GLP-1(7-37) aufweisen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung,
ein eine erfindungsgemäße Verbindung
umfassendes Arzneimittel bereitzustellen und eine Verbindung der
Erfindung zu verwenden, um ein derartiges Mittel bereitzustellen.
Auch ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Behandlung von insulinabhängiger
und nicht-insulinabhängiger
Diabetes mellitus bereitzustellen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Menschliches
GLP-1 ist ein Peptid mit 37 Aminosäureresten, das von Präproglucagon
stammt, das u.a. in den L-Zellen des Distalileums, in der Bauchspeicheldrüse und im
Gehirn synthetisiert wird. Die Verarbeitung von Präproglucagon
zum Erhalt von GLP-1(7-36)amid, GLP-1(7-37) und GLP-2 findet hauptsächlich in
den L-Zellen statt. Ein einfaches System wird zum Beschreiben von
Fragmenten und Analoga dieses Peptids verwendet. So bezeichnet z.B.
Gly8-GLP-1(7-37)
ein GLP-1-Fragment, das durch Deletieren der Aminosäurereste
Nr. 1 bis 6 und Substituieren des natürlich vorkommenden Aminosäurerests
in Position 8 (Ala) durch Gly formal von GLP-1 abgeleitet ist. Gleichermaßen bezeichnet
Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37) GLP-1(7-37),
in welchem die ε-Aminogruppe
des Lys-Rests in
Position 34 tetradecanoyliert worden ist. Wird in diesem Text auf
C- terminal verlängerte GLP-1-Analoga
Bezug genommen, ist, wenn nicht anders angegeben, der Aminosäurerest
in Position 38 Arg, ist wenn nicht anders angegeben, der optionale
Aminosäurerest in
Position 39 ebenfalls Arg und ist, wenn nicht anders angegeben,
der optionale Aminosäurerest
in Position 40 Asp. Falls sich ein C-terminal verlängertes Analogon auf Position
41, 42, 43, 44 oder 45 verlängert,
ist, wenn nicht anders angegeben, die Aminosäuresequenz dieser Verlängerung
wie in der entsprechenden Sequenz im menschlichen Präproglucagon.
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In
ihrem breitesten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Derivate
von GLP-1 und Analoga davon. Die erfindungsgemäßen Derivate weisen interessante
pharmakologische Eigenschaften auf, insbesondere weisen sie ein
länger
anhaltendes Wirkungsprofil als die Ursprungspeptide auf.
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Im
vorliegenden Text wird die Bezeichnung „ein Analogon" verwendet, um ein
Peptid zu bezeichnen, in welchem ein oder mehrere Aminosäurereste
des Ursprungspeptids durch einen anderen Aminosäurerest substituiert worden
sind und/oder wobei ein oder mehrere Aminosäurereste des Ursprungspeptids
deletiert worden sind und/oder wobei ein oder mehrere Aminosäurereste
an das Ursprungspeptid addiert worden sind. Eine derartige Addition
kann entweder am N-terminalen
Ende oder am C-terminalen Ende des Ursprungspeptids oder an beidem
stattfinden.
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Der
Ausdruck „Derivat" wird im vorliegenden
text verwendet, um ein Peptid zu bezeichnen, in welchem ein oder
mehrere der Aminosäurereste
des Ursprungspeptids, z.B. durch Alkylierung, Acylierung, Esterbildung oder
Amidbildung chemisch modifiziert worden sind.
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Der
Ausdruck „ein
GLP-1-Derivat" wird
im vorliegenden Text verwendet, um ein Derivat von GLP-1 oder ein
Analogon davon zu bezeichnen. Im vorliegenden Text wird das Ursprungspeptid,
von welchem ein derartiges Derivat formal abgeleitet ist, an manchen
Stellen als die „GLP-1-Einheit" des Derivats bezeichnet.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, in welchem mindestens ein Aminosäurerest
des Ursprungspeptids einen angelagerten lipophilen Substituenten
aufweist, mit der Maßgabe,
dass, falls nur ein lipophiler Substituent vorliegt und dieser Substituent
am N-terminalen oder C-terminalen Aminosäurerest des Ursprungspeptids
angelagert ist, dieser Substituent dann eine Alkylgruppe oder eine
Gruppe, die eine ω-Carbonsäuregruppe
aufweist, ist.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein GLP-1-Derivat mit nur einem lipophilen Substituenten.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein GLP-1-Derivat mit nur einem lipophilen Substituenten,
wobei der Substituent eine Alkylgruppe oder eine Gruppe ist, die
eine ω-Carbonsäuregruppe aufweist
und am N-terminalen Aminosäurerest
des Ursprungspeptids angelagert ist.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein GLP-1-Derivat mit nur einem lipophilen Substituenten,
wobei der Substituent eine Alkylgruppe oder eine Gruppe ist, die
eine ω-Carbonsäuregruppe aufweist
und am C-terminalen Aminosäurerest
des Ursprungspeptids angelagert ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform,
wie beschrieben in Anspruch 1, betrifft die vorliegende Erfindung
ein Derivat von GLP-1(7-37) oder ein Analogon von GLP-1(7-37), wobei das
Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, dadurch
gekennzeichnet, dass das Derivat nur einen lipophilen Substituenten
aufweist, der an einen Aminosäurerest
angelagert ist, bei welchem es sich nicht um den N-terminalen oder
C-terminalen Aminosäurerest
handelt.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, in welchem zwei lipophile Substituenten
vorliegen.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, in welchem zwei lipophile Substituenten
vorliegen, wobei einer am N-terminalen Aminosäurerest angelagert ist, während der
andere am C-terminalen Aminosäurerest
angelagert ist.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform,
wie beschrieben in Anspruch 3, betrifft die vorliegende Erfindung
ein Derivat von GLP-1(7-37) oder ein Analogon von GLP-1(7-37), wobei
das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, dadurch gekennzeichnet,
dass das Derivat nur zwei lipophile Substituenten aufweist, die
an die Aminosäurereste
angelagert sind, bei welchen es sich nicht um die N-terminalen oder
die C-terminalen Aminosäurereste
handelt.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform,
wie beschrieben in Anspruch 2, betrifft die vorliegende Erfindung
ein Derivat von GLP-1(7-37) oder ein Analogon von GLP-1(7-37), wobei
das Derivat ein Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist, dadurch gekennzeichnet,
dass das Derivat nur zwei lipophile Substituenten aufweist, wobei
einer am C-terminalen Aminosäurerest
angelagert ist, während
der andere an einem Aminosäurerest
angelagert ist, bei welchem es sich nicht um die N-terminalen oder
die C-terminalen Aminosäurereste
handelt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform,
wie beschrieben in Anspruch 4, betrifft die vorliegende Erfindung
ein Derivat eines Analogons von GLP-1(7-37), wobei das Derivat ein
Agonist des menschlichen GLP-1-Rezeptors ist und wobei das Analogon
GLP-1(7-C) ist, wobei C 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 und 45 beträgt, dadurch
gekennzeichnet, dass das Derivat nur einen lipophilen Substituenten
aufweist, der am C-terminalen Aminosäurerest angelagert ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
der lipophile Substituent 4 bis 40 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt
8 bis 25 Kohlenstoffatome umfasst.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
ein lipophiler Substituent in einer derartigen Weise an einen Aminosäurerest
angelagert ist, dass eine Carboxygruppe des lipophilen Substituenten
eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests
bildet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
ein lipophiler Substituent in einer derartigen Weise an einen Aminosäurerest
angelagert ist, dass eine Aminogruppe des lipophilen Substituenten
eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe des Aminosäurerests
bildet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter an das Ursprungspeptid
angelagert ist.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat,
in welchem ein lipophiler Substituent – wahlweise durch einen Abstandhalter – an die ε-Aminogruppe
eines im Ursprungspeptid enthaltenen Lys-Rests angelagert ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem
es sich um eine unverzweigte Alkan-α,ω-dicarbonsäuregruppe mit 1 bis 7 Methylengruppen,
vorzugsweise zwei Methylengruppen handelt, an das Ursprungspeptid
angelagert ist, wobei der Abstandhalter eine Brücke zwischen einer Aminogruppe
des Ursprungspeptids und einer Aminogruppe des lipophilen Substituenten
bildet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem
es sich um einen Aminosäurerest
außer
Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys
handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist. Im vorliegenden text
wird der Ausdruck „ein
Dipeptid wie Gly-Lys" verwendet,
um ein Dipeptid zu bezeichnen, in welchem der C-terminale Aminosäurerest
Lys, His oder Trp, vorzugsweise Lys ist, und in welchem der N-terminale
Aminosäurerest
ausgewählt
ist aus der Gruppe, umfassend Ala, Arg, Asp, Asn, Gly, Glu, Gln,
Ile, Leu, Val, Phe und Pro.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem
es sich um einen Aminosäurerest
außer
Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys
handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist, und in welchem eine
Carboxygruppe des Ursprungspeptids eine Amidbindung mit einer Aminogruppe
eines Lys-Rests oder eines einen Lys-Rest enthaltenden Dipeptids
bildet und die andere Aminogruppe des Lys-Rests oder eines einen Lys-Rest
enthaltenden Dipeptids eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe
des lipophilen Substituenten bildet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem
es sich um einen Aminosäurerest
außer
Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys
handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist, und wobei eine Aminogruppe
des Ursprungspeptids eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe des
Aminosäurerest-
oder Dipeptid-Abstandhalters bildet und eine Aminogruppe des Aminosäurerest-
oder Dipeptid-Abstandhalters eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe
des lipophilen Substituenten bildet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem
es sich um einen Aminosäurerest
außer
Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys
handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist, und wobei eine Carboxygruppe
des Ursprungspeptids eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des
Amino säurerest-Abstandhalters
oder Dipeptid-Abstandhalters bildet und die Carboxygruppe des Aminosäurerest-Abstandhalters oder
Dipeptid-Abstandhalters eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des
lipophilen Substituenten bildet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, in welchem
ein lipophiler Substituent durch einen Abstandhalter, bei welchem
es sich um einen Aminosäurerest
außer
Cys oder ein Dipeptid wie Gly-Lys
handelt, an das Ursprungspeptid angelagert ist, und wobei eine Carboxygruppe
des Ursprungspeptids eine Amidbindung mit einer Aminogruppe eines
Abstandhalters, bei welchem es sich um Asp oder Glu handelt, oder
eines einen Asp- oder
Glu-Rest enthaltenden Dipeptid-Abstandhalters, bildet und eine Carboxygruppe
des Abstandhalters eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des lipophilen
Substituenten bildet.
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In
einer weiteren bevorztugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, der ein teilweise oder vollständig hydriertes Cyclopentanophenathrengerüst umfasst.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine geradkettige oder verzweigte
Alkylgruppe handelt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine geradkettige oder verzweigte
Fettsäure
handelt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Acylgruppe, ausgewählt aus
der Gruppe, umfassend CH3(CH2)nCO-, wobei n eine ganze Zahl von 4 bis 38,
vorzugsweise eine ganze Zahl von 4 bis 24 ist, stärker bevorzugt
ausgewählt
aus der Gruppe, umfassend CH3(CH2)6CO-, CH3(CH2)8CO-, CH3(CH2)10CO-, CH3(CH2)12CO-,
CH3(CH3)14CO-, CH3(CH2)16CO-, CH3(CH2)18CO-,
CH3(CH2)20CO- und CH3(CH2)22CO-, handelt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Acylgruppe einer geradkettigen
oder verzweigten Alkan-α,ω-dicarbonsäure handelt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Acylgruppe, ausgewählt aus
der Gruppe, umfassend HOOC(CH2)mCO-,
wobei m eine ganze Zahl von 4 bis 38, vorzugsweise eine ganze Zahl
von 4 bis 24 ist, stärker
bevorzugt ausgewählt
aus der Gruppe, umfassend HOOC(CH2)14CO-, HOOC(CH2)16CO-, HOOC(CH2)18CO-, HOOC(CH2)20CO- und HOOC(CH2)22CO-, handelt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel CH3(CH2)p((CH2)qCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO- handelt, wobei
p und q ganze Zahlen sind und p+q eine ganze Zahl von 8 bis 33, vorzugsweise
von 12 bis 28 ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO- handelt, wobei
r eine ganze Zahl von 10 bis 24 ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COO)CO- handelt,
wobei s eine ganze Zahl von 8 bis 24 ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel COOH(CH2)tCO- handelt, wobei
t eine ganze Zahl von 8 bis 24 ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3 handelt,
wobei u eine ganze Zahl von 8 bis 18 ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel -NHCH(COO)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3 handelt, wobei
w eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)4CH(COO)NH-CO(CH2)xCH3 handelt, wobei
x eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen
Substituenten, bei welchem es sich um eine Gruppe der Formel -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COO)NHCO (CH2)yCH3 handelt,
wobei y 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein GLP-1-Derivat mit einem lipophilen Substituenten,
der negativ geladen sein kann. Ein derartiger lipophiler Substituent
kann z.B. ein Substituent sein, der eine Carboxygruppe aufweist.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, dessen Ursprungspeptid ausgewählt ist
aus der Gruppe, umfassend GLP-1(1-45) oder einem Analogon davon.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein GLP-1-Derivat, abgeleitet von einem GLP-1-Fragment,
ausgewählt
aus der Gruppe, umfassend GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-36)amid, GLP-1(7-37),
GLP-1(7-38), GLP-1(7-39),
GLP-1(7-40) und GLP-1(7-41) oder einem Analogon davon.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
veranschaulicht ist ein GLP-1-Analogon,
abgeleitet von einem GLP-1-Analogon, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend
GLP-1(1-35), GLP-1(1-36), GLP-1(1-36)amid, GLP-1(1-37), GLP-1(1-38), GLP-1(1-39),
GLP-1(1-40) und GLP-1(1-41) oder einem Analogon davon.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
veranschaulicht ist ein GLP-1-Derivat, wobei die Bezeichnung Analogon
Derivate umfasst, in welchen insgesamt bis zu fünfzehn, vorzugsweise bis zu
zehn Aminosäurereste
mit einem beliebigen α-Aminosäurerest
ausgetauscht worden sind.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
veranschaulicht ist ein GLP-1-Derivat, wobei die Bezeichnung Analogon
Derivate umfasst, in welchen insgesamt bis zu fünfzehn, vorzugsweise bis zu
zehn Aminosäurereste
mit einem beliebigen α-Aminosäurerest,
der durch den genetischen Kode kodiert werden kann, ausgetauscht
worden sind.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei die
Bezeichnung Analogon Derivate umfasst, in welchen insgesamt bis
zu sechs Aminosäurereste
mit einem anderen α-Aminosäurerest,
der durch den genetischen Kode kodiert werden kann, ausgetauscht
worden sind.
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Beschrieben
hier, jedoch nicht ausdrücklich
beansprucht ist ein Ursprungspeptid für ein erfindungsgemäßes Derivat,
ausgewählt
aus der Gruppe, umfassend Arg26-GLP-1(7-37); Arg34-GLP-1(7-37); Lys36-GLP-1(7-37);
Arg26,36Lys36-GLP-1(7-37);
Arg26,34Lys38GLP-1(7-38);
Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39); Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40);
Arg26Lys36-GLP-1(7-37);
Arg34Lys36-GLP-1(7-37);
Arg26Lys39-GLP-1(7-39); Arg34Lys40-GLP-1(7-40);
Arg26,36Lys36,39-GLP-1(7-39);
Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40); Gly8Arg26-GLP-1(7-37); Gly8Arg34-GLP-1(7-37);
Gly8Lys36-GLP-1(7-37);
Gly8Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39); Gly26,34Lys40-GLP-1(7-40); Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39); Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40);
Gly8Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39)
und Gly8Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist ein Ursprungspeptid für
ein erfindungsgemäßes Derivat
ausgewählt
aus der Gruppe, umfassend Arg26,34Lys38GLP-1(7-38);
Arg26,34Lys39GLP-1(7-39); Arg26,34Lys40GLP-1(7-40);
Arg26,34Lys41GLP-1(7-41); Arg26,34Lys42GLP-1(7-42);
Arg26,34Lys43GLP-1(7-43); Arg26,34Lys44GLP-1(7-44); Arg26,34Lys45GLP-1(7-45);
Arg26,34Lys38GLP-1(1-38);
Arg26,34Lys39GLP-1(1-39); Arg26'3aLys40GLP-1(1-40);
Arg26,34Lys41GLP-1(1-41);
Arg26,34Lys42GLP-1(1-42); Arg26,34 Lys43GLP-1(1-43); Arg26,34Lys44GLP-1(1-44);
Arg26,34Lys45GLP-1(1-45); Arg26,34Lys38GLP-1(2-38);
Arg26,34Lys39GLP-1(2-39); Arg26,34Lys40GLP-1(2-40); Arg26,34Lys41GLP-1(2-41);
Arg26,34Lys42GLP-1(2-42);
Arg26,34Lys43GLP-1(2-43); Arg26,34Lys44GLP-1(2-44);
Arg26,34Lys45GLP-1(2-45);
Arg26,34Lys38GLP-1(3-33); Arg26,34Lys39GLP-1(3-39); Arg26,34Lys40 GLP-1(3-40);
Arg26,34Lys41GLP-1(3-41); Arg26,34Lys42GLP-1(3-42);
Arg26,34Lys43GLP-1(3-43); Arg26,34Lys44-1(3-44); Arg26,34Lys45GLP-1(3-45);
Arg26,34Lys38GLP-1(4-38);
Arg26,34Lys39GLP-1(4-39); Arg26,34 Lys40GLP-1(4-40);
Arg26,34Lys41GLP-1(4-41);
Arg26,34Lys42GLP-1(4-42); Arg26,34Lys43GLP-1(4-43); Arg26,34Lys44GLP-1(4-44);
Arg26,34Lys45GLP-1(4-45); Arg26,34Lys38GLP-1(5-38);
Arg26,34Lys39GLP-1(5-39); Arg26,34Lys40GLP-1(5-40); Arg26,34Lys41GLP-1(5-41);
Arg26,34Lys42GLP-1(5-42);
Arg26,34Lys43GLP-1(5-43); Arg26,34Lys44GLP-1(5-44);
Arg26,34Lys45GLP-1(5-45);
Arg26,34Lys38GLP-1(6-38); Arg26,34Lys39GLP-1(6-39); Arg26,34Lys40GLP-1(6-40);
Arg26,34Lys41GLP- 1(6-41); Arg26,34Lys42GLP-1(6-42);
Arg26,34Lys43GLP-1(6-43); Arg26,34Lys44GLP-1(6-44); Arg26,34Lys45GLP-1(6-45);
Arg26Lys38GLP-1(1-38);
Arg34Lys38GLP-1(1-38); Arg26,34Lys36,38GLP-1(1-38); Arg26Lys38GLP-1(7-38); Arg34Lys38GLP-1(7-38); Arg26,34Lys36,38GLP-1(7-38); Arg26,34Lys38GLP-1(7-38); Arg26Lys39GLP-1(1-39) Arg34Lys39GLP-1(1-39); Arg26,34Lys36,39GLP-1(1-39); Arg26Lys39GLP-1(7-39); Arg34Lys39GLP-1(7-39) und Arg26,34Lys36,39GLP-1(7-39).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei das
Ursprungspeptid ausgewählt
ist aus der Gruppe, umfassend Arg26-GLP-1(7-37),
Arg34-GLP-1(7-37), Lys36-GLP-1(7-37),
Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37),
Arg26Lys36-GLP-1(7-37),
Arg34Lys36-GLP-1(7-37), Gly8Arg26-GLP-1(7-37),
Gly8Arg34-GLP-1(7-37),
Gly8Lys36-GLP-1(7-37),
Gly8Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37), Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)
und Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei das
Ursprungspeptid ausgewählt
ist aus der Gruppe, umfassend Arg26Lys38-GLP-1(7-38), Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38), Arg26,34Lys36,38-GLP-1(7-38),
Gly8Arg26Lys38-GLP-1(7-38) und Gly8Arg26,34Lys36,38-GLP-1(7-38).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei das
Ursprungspeptid ausgewählt
ist aus der Gruppe, umfassend Arg26Lys39-GLP-1(7-39), Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39), Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39) und Gly8Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39).
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, wobei das
Ursprungspeptid ausgewählt
ist aus der Gruppe, umfassend Arg34Lys40-GLP-1(7-40), Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40)Gly8Arg34Lys40 GLP-1(7-40)
und Gly8Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein GLP-1-Derivat, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, umfassend:
Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Gly8Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Gly8Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Arg26Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37);
Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Gly8Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Gly8Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Arg26Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-38);
Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Gly8Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Gly8Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Arg26Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-39);
Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Gly8Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Gly8Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-40);
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Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Gly8Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Gly8Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
Arg26Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-36);
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Gly8Lys26(Nε-(ω-carboxynonadecanoyl))Arg34-GLP-1(7-38);
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Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-40);
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Arg26Lys34(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-37);
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Lys34(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys26,34-bis(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Lys26(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Lys34(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
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8);
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Gly8Lys26,34-bis(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
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Lys26,34-bis(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
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Gly8Lys26,34-bis(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
Arg26Lys34(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-36);
Lys26(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Lys34(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Lys26,34-bis(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Gly8Lys26(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Gly8Lys34(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-35);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-3
5);
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Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
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Gly8Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Arg26Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
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Gly8Lys26(Nε-(7-deoxycholoyl))Arg34-GLP-1(7-38);
Arg26,34Lys36(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Arg26,34Lys38(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Arg26Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Arg26Lys34(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
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Gly8Lys26(Nε-(7-deoxycholoyl))Arg34-GLP-1(7-39);
Arg26,34Lys36(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Arg26Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Arg26Lys34(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Lys26(Nε-(7-deoxycholoyl))Arg34-GLP-1(7-40);
Gly8Lys26(Nε-(7-deoxycholoyl))Arg34-GLP-1(7-40);
Arg26,34Lys36(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(7-deoxycholoyl))-GLP-1(7-40);
Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Gly8Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Gly8Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Arg26Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Gly8Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Gly8Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Arg26Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36);
Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Gly8Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Gly8Lys34(N☐-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
Arg26Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-35);
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Gly8Lys26(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly8Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-36)amid;
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Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-37);
Lys26(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys26,34-bis(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly8Lys26(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly8Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
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Gly8Lys26(Nε-(choloyl))Arg34-GLP-1(7-38);
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Arg26,34Lys38(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-38);
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Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Lys26,34-bis(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly8tys26(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
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Gly8Lys26,34-bis(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
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Lys26(Nε-(choloyl))Arg34-GLP-1(7-39);
Gly8Lys26(Nε-(choloyl))Arg34-GLP-1(7-39);
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Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-39);
Lys26(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys26,34-bis(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Lys26(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(lithocheloyl))-GLP-1(7-39);
Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Arg26Lys34(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
Lys26(Nε-(choloyl))Arg34-GLP-1(7-40);
Gly8Lys26(Nε-(choloyl))Arg34-GLP-1(7-40);
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Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(choloyl))-GLP-1(7-40);
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Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
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Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36);
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Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
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Gly8Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-35);
Lys26(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Lys26,34-bis(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly8Lys26(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly8Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly8Lys26,34-bis(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-36)amid;
Gly8Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Lys26(Nε-(lithocholoyl))Arg34-GLP-1(7-37);
Gly8Lys26(Nε-(lithocholoyl))Arg34-GLP-1(7-37);
Arg26,34Lys36(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Arg26,34Lys38(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly8Arg26,34Lys36 (Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-37);
Gly8Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-3
8);
Lys26(Nε-(lithocholoyl))Arg34-GLP-1(7-38);
Gly8Lys26(Nε-(lithocholoyl))Arg34-GLP-1(7-38);
Arg26,34Lys36(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Arg26,34Lys38(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-3
8);
Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-38);
Gly8Arg26Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Lys26(Nε-(lithocholoyl))Arg34-GLP-1(7-39);
Gly8Lys26(Nε-(lithocholoyl))Arg34-GLP-1(7-39);
Arg26,34Lys36(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-39);
Gly8Arg26 Lys34(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40);
Lys26(Nε-(lithocholoyl))Arg34-GLP-1(7-40);
Gly8Lys26(Nε-(lithocholoyl))Arg34-GLP-1(7-40);
Arg26,34Lys36(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40)
und
Gly8Arg26,34Lys36(Nε-(lithocholoyl))-GLP-1(7-40).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausfizhrungsform betrifft die vorliegende
Erfindung ein Arzneimittel, das ein GLP-1-Derivat und ein pharmazeutisch
verträgliches
Vehikulum oder einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen GLP-1-Derivats
zur Herstellung eines Medikaments, das ein lang anhaltendes Wirkungsprofil
in Bezug auf GLP-1(7-37) aufweist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen GLP-1-Derivats
zur Herstellung eines Medikaments mit lang anhaltendem Wirkungsprofil
zur Behandlung von nicht-insulinabhängiger Diabetes
mellitus.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen GLP-1-Derivats
zur Herstellung eines Medikaments mit lang anhaltendem Wirkungsprofil
zur Behandlung von insulinabhängiger
Diabetes mellitus.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen GLP-1-Derivats
zur Herstellung eines Medikaments mit lang anhaltendem Wirkungsprofil
zur Behandlung von Fettsucht.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von insulinabhängiger oder
nicht-insulinabhängiger
Diabetes mellitus bei einem eine derartige Behandlung benötigenden
Patienten, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen
Menge eines GLP-1-Derivats nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch
verträglichen
Träger
an einen Patienten.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Zum
Erhalt eines zufrieden stellenden lang anhaltenden Wirkungsprofils
des GLP-1-Derivats
umfasst der an die GLP-1-Einheit angelagerte lipophile Substituent
vorzugsweise 4-40 Kohlenstoffatome, insbesondere 8-25 Kohlenstoffatome.
Der Lipophile Substituent kann an die Aminogruppe der GLP-1-Einheit
durch eine Carboxygruppe des lipophilen Substituenten angelagert
sein, die eine Amidbindung mit einer Aminogruppe des Aminosäurerests,
an welchem sie angelagert ist, bildet. Alternativ dazu kann der
lipophile Substituent an den Aminosäurerest in einer derartigen
Weise angelagert sein, dass eine Aminogruppe des lipophilen Substituenten
eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe des Aminosäurerests
bildet. Als weitere Variante kann der lipophile Substituent mit
der GLP-1-Einheit über
eine Esterbindung verknüpft
sein. Formal kann der Ester entweder durch Reaktion zwischen einer
Carboxygruppe der GLP-1-Einheit und einer Hydroxygruppe des zukünftigen
Substituenten oder durch Reaktion zwischen einer Hydroxygruppe der
GLP-1-Einheit und einer Carboxygruppe des zukünftigen Substituenten gebildet
werden. Als weitere Alternative kann der lipophile Substituent eine
Alkylgruppe sein, die in eine primäre Aminogruppe der GLP-1-Einheit eingebracht
wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist der lipophile Substituent durch einen Abstandhalter
in einer derartigen Weise an die GLP-1-Einheit angelagert, dass
eine Carboxygruppe des Abstandhalters eine Amidbindung mit einer
Aminogruppe der GLP-1-Einheit bildet. Beispiele für geeignete
Abstandhalter sind Bernsteinsäure,
Lys, Glu oder Asp oder ein Dipeptid wie Gly-Lys. Ist der Abstandhalter
Bernsteinsäure, kann
eine Carboxygruppe davon eine Amidbindung mit einer Aminogruppe
des Aminosäurerests
und die andere Carboxygruppe davon eine Amidbindung mit einer Aminogruppe
des lipophilen Substituenten bilden. Ist der Abstandhalter Lys,
Glu oder Asp, kann die Carboxygruppe davon eine Amidbindung mit
einer Aminogruppe des Aminosäurerests
und die Aminogruppe davon eine Amidbindung mit einer Carboxygruppe
des lipophilen Substituenten bilden. Wird Lys als der Abstandhalter
verwendet, kann in manchen Fällen
ein weiterer Abstandhalter zwischen die ε-Aminogruppe von Lys und den
lipophilen Substituenten eingefügt
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein derartiger
weiterer Abstandhalter Bernsteinsäure, die mit der ε-Aminogruppe
von Lys und mit einer im lipophilen Substituenten vorliegenden Aminogruppe
eine Amidbindung bildet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist ein derartiger weiterer Abstandhalter Glu oder Asp, das mit der ε-Aminogruppe
von Lys eine Amidbindung und mit einer im lipophilen Substituenten
vorliegenden Carboxygruppe, d.h. der lipophile Substituent ist ein
Nε-acylierter
Lysinrest, eine andere Amidbindung bildet.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung weist der lipophile Substituent eine
Gruppe auf, die negativ geladen sein kann. Eine bevorzugte Gruppe,
die negativ geladen sein kann, ist eine Carbonsäuregruppe.
-
Das
Ursprungspeptid kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das
das Züchten
einer Wirtszelle, die eine das Polypeptid kodierende DNA-Sequenz
enthält
und das Polypeptid in einem geeigneten Nährmedium unter die Expression
des Peptids ermöglichenden
Bedingungen exprimieren kann, hergestellt werden, wonach das resultierende
Peptid aus der Kultur gewonnen wird.
-
Bei
dem zum Züchten
der Zellen verwendeten Medium kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Medium,
das zum Wachsen der Wirtszellen geeignet ist, wie Minimal- oder
Komplexmedien, die geeignete Ergänzungsstoffe
enthalten, handeln. Geeignete Medien sind im Handel erhältlich oder
können
gemäß (z.B.
in Katalogen der American Type Culture Collection) veröffentlichten
Rezepturen hergestellt werden. Das durch die Zellen hergestellte
Peptid kann dann durch herkömmliche
Prozeduren, einschließlich
Abtrennen der Wirtszellen von dem Medium durch Zentrifugation oder
Filtration, Ausfällen
der proteinhaltigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats durch
ein Salz, z.B. Ammoniumsulfat, Reinigung je nach fraglichem Peptidtyp
durch eine Vielfalt an chromatogafischen Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatogaphie,
Gelfiltrationschromatogafie, Affinitätschromatogaphie oder dergleichen
aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
-
Die
das Ursprungspeptid kodierende DNA-Sequenz kann geeigneterweise
genomischen oder cDNA-Ursprungs sein, der z.B. durch Herstellen
einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Durchmustern auf das
gesamte Peptid oder einen Teil des Peptids kodierende DNA-Sequenzen
durch Hybridisierung unter Verwendung von geeigneten Oligonukleotidsonden
gemäß Standardtechniken
erhalten wird (siehe z.B. Sambrook, J, Fritsch, EF und Maniatis,
T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York, 1989). Die das Peptid kodierende DNA-Sequenz kann durch
etablierte Standardverfahren, z.B. das Phosphoamiditverfahren, beschrieben
von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 – 1869,
oder das Verfahren, beschrieben von Matthes et al., EMBO Journal
3 (1984), 801 – 805
auch synthetisch hergestellt werden. Die DNA-Sequenz kann auch durch
Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von spezifischen Primern,
z.B. wie beschrieben in
US 4,683,202 oder
Saiki et al., Science 239 (1988), 487 – 491, hergestellt werden.
-
Die
DNA-Sequenz kann in einen beliebigen Vektor eingefügt werden,
der günstigerweise
rekombinanten DNA-Prozeduren unterzogen werden kann, und die Wahl
des Vektors hängt
häufig
von der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen ist. So kann der
Vektor ein autonom replizierender Vektor, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale
Einheit vorliegt, deren Replikation von der Chromosomenreplikation
unabhängig
ist, z.B. ein Plasmid sein. Alternativ dazu kann der Vektor einer
sein, der beim Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom
integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welches)
er integriert wurde, repliziert wird.
-
Der
Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in welchem die das
Peptid kodierende DNA-Sequenz mit zusätzlichen für eine Transkription der DNA
erforderlichen Segmenten wie einen Promotor funktionsfähig verknüpft ist.
Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die in der Wirtszelle
der Wahl zusätzliche
transkriptionelle Aktivität
zeigt, und von Genen abgeleitet sein, die Proteine entweder homolog oder
heterolog zur Wirtszelle kodieren. Beispiele für geeignete Promotoren zum
Leiten der Transkription der das Peptid der Erfindung kodierenden
DNA in einer Vielfalt von Wirtszellen sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl.
z.B. Sambrook et al., vorstehend.
-
Die
das Peptid kodierende DNA-Sequenz kann gegebenenfalls auch mit einem
geeigneten Terminator, Polyadenylierungssignalen, Transktriptionsverstärkersequenzen
und Translationsverstärkersequenzen funktionsfähig verbunden
sein. Der rekombinante Vektor der Erfindung kann ferner eine DNA-Sequenz
umfassen, die es dem Vektor ermöglicht,
in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren.
-
Der
Vektor kann auch eine selektierbare Markierung, z.B. ein Gen, dessen
Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ausgleicht oder eines, das
Resistenz gegen ein Arzneimittel, z.B. Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol,
Neomycin, Hygromycin oder Methotrexat verleiht, sein.
-
Zum
Leiten eines Ursprungspeptids der vorliegenden Erfindung in den
sekretorischen Weg der Wirtszelle, kann eine sekretorische Signalsequenz
(auch bekannt als Leadersequenz, Präprosequenz oder Präsequenz)
im rekombinanten Vektor bereitgestellt sein. Die sekretorische Signalsequenz
ist an die DNA-Sequenz gebunden, die das Peptid in korrektem Leseraster
kodiert. Sekretorische Signalsequenzen befinden sich üblicherweise
an der 5'-Position
der das Peptid kodierenden DNA-Sequenz. Die sekretorische Signalsequenz kann
diejenige sein, die normalerweise mit dem Peptid verbunden ist,
oder von einem Gen stammen, das ein anderes sekretiertes Protein
kodiert.
-
Die
Verfahren, die zum Ligieren der das vorliegende Peptid kodierenden
DNA-Sequenzen, des
Promotors und wahlweise des Terminators und/oder von sekretorischen
Signalsequenzen und zu deren Einfügen in geeignete Vektoren,
die die zur Replikation nötigen
Informationen enthalten, verwendet werden, sind dem Fachmann bekannt
(vgl. z.B. Sambrook et al., vorstehend).
-
Die
Wirtszelle, in welche die DNA-Sequenz oder der rekombinante Vektor
eingebracht wird, kann eine beliebige Zelle sein, die das vorliegende
Peptid herstellen kann und schließt Bakterien-, Hefe-, Pilz-
und höhere
eukaryontische Zellen ein. Beispiele für geeignete Wirtszellen, die
bekannt sind und auf dem Fachgebiet verwendet werden, sind ohne
Beschränkung
E. coli, Saccharomyces cerevisiae oder BHK- oder CHO-Zelllinien
des Säugers.
-
Beispiele
für Verbindungen,
die als erfindungsgemäße GLP-1-Einheiten
nützlich
sein können,
sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 87/06941 (The
General Hospital Corporation) beschrieben, die ein GLP-1(7-37) und
funktionelle Derivate davon umfassendes Peptidfragment und dessen
Verwendung als insulinotrope Mittel betrifft.
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Ferner
sind GLP-1-Analoga in der Internationalen Patentanmeldung Nr. 90/11296
(The General Hospital Corporation) beschrieben, die Peptidfragmente,
die GLP-1(7-36)
und funktionelle Derivate davon umfassen und eine insulinotrope
Aktivität
aufweisen, die die insulinotrope Aktivität von GLP-1(1-36) oder GLP-1(1-37) übersteigt,
und deren Verwendung als insulinotrope Mittel betrifft.
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Die
Internationale Patentanmeldung Nr. 91/11457 (Buckley et al.) offenbart
Analoga der aktiven GLP-1-Peptide 7-34, 7-35, 7-36 und 7-37, die
ebenfalls als erfindungsgemäße GLP-1-Einheiten
nützlich
sein können.
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Arzneimitel
-
Arzneimittel,
die ein erfindungsgemäßes GLP-1-derivat
enthalten, können
eine derartigen Behandlung benötigenden
Patienten parenteral verabreicht werden. Die Parenterale Verabreichung
kann durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion
mithilfe einer Spritze, wahlweise einer penförmigen Spritze durchgeführt werden.
Alternativ dazu kann die parenterale Verabreichung mithilfe einer
Infusionspumpe durchgeführt werden.
Eine weitere Variante ist eine Zusammensetzung, die ein Pulver oder
eine Flüssigkeit
zur Verabreichung des GLP-1-Derivats
in Form eines Nasen- oder Pulmonalsprays sein kann. Als noch weitere
Variante können
die GLP-1-Derivate der Erfindung auch transdermal, z.B. von einem
Pflaster, wahlweise einem iontophoretischen Pflaster, oder transmukosal,
z.B. bukkal verabreicht werden.
-
Arzneimittel,
die ein GLP-1-Derivat der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch
herkömmliche Techniken,
z.B. wie beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985 oder
in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. Auflage,
1995, hergestellt werden.
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So
können
die injizierbaren Zusammensetzungen des GLP-1-Derivats der Erfindung
unter Verwendung der herkömmlichen
Techniken der pharmazeutischen Industrie hergestellt werden, die
das wie geeignete Lösen
und Mischen der Inhaltsstoffe zum Erhalt des gewünschten Endprodukts, bedingen.
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Gemäß einer
Prozedur wird das GLP-1-Derivat in einer Wassermenge gelöst, die
etwas weniger als das Endvolumen der herzustellenden Zusammensetzung
beträgt.
Ein isotonisches Mittel, ein Konservierungsmittel und ein Puffer
werden nach Bedarf zugesetzt, und der pH-Wert der Lösung wird – gegebenenfalls – unter Verwendung
einer Säure,
z.B. von Salzsäure,
oder einer Base, z.B. einer wässrigen
Natriumhydroxidlösung nach
Bedarf eingestellt. Schließlich
wird das Volumen der Lösung
mit Wasser eingestellt, um die gewünschte Konzentration der Inhaltsstoffe
zu erhalten.
-
Beispiele
für isotonische
Mittel sind Natriumchlorid, Mannit und Glycerin.
-
Beispiele
für Konservierungsmittel
sind Phenol, m-Cresol, Methyl-p-hydroxybenzoat und Benzylalkohol.
-
Beispiele
für geeignete
Puffer sind Natriumacetat und Natriumphosphat.
-
Zusätzlich zu
den vorstehend erwähnten
Bestandteilen können
Lösungen,
die ein erfindungsgemäßes GLP-1-Derivat
enthalten, auch ein oberflächenaktives
Mittel enthalten, um die Löslichkeit
und/oder die Stabilität
des GLP-1-Derivats zu verbessern.
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Eine
Zusammensetzung zur nasalen Verabreichung von bestimmten Peptiden
kann z.B. wie im Europäischen
Patent Nr. 272097 (an Novo Nordisk A/S) oder in WO 93/18785 beschrieben
hergestellt werden.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das GLP-1-Derivat in Form einer
Zusammensetzung bereitgestellt, die zur Verabreichung durch Injektion
geeignet ist. Eine derartige Zusammensetzung kann entweder eine
gebrauchsfertige injizierbare Lösung
oder eine Menge einer festen Zusammensetzung, z.B. eines lyophilisierten
Produkts, die/das in einem Lösungsmittel
zu lösen
ist, bevor es injiziert werden kann, sein. Die injizierbare Lösung enthält vorzugsweise
nicht weniger als etwa 2 mg/ml, vorzugsweise nicht weniger als etwa
5 mg/ml, stärker
bevorzugt nicht weniger als etwa 10 mg/ml des GLP-1-Derivats und
vorzugsweise nicht mehr als etwa 100 mg/ml des GLP-1-Derivats.
-
Die
GLP-1-Derivate dieser Erfindung können bei der Behandlung von
verschiedenen Erkrankungen verwendet werden. Das besondere zu verwendende
GLP-1-Derivat und der optimale Dosisgehalt für den jeweiligen Patienten
hängt von
der zu behandelnden Erkrankung und von einer Vielfalt an Faktoren,
einschließlich
der Wirksamkeit des spezifischen eingesetzten Peptidderivats, des
Alters, Körpergewichts,
der Körperaktivität und der
Ernährung
des Patienten, von einer möglichen
Kombination mit anderen Arzneimitteln und von der Schwere des Falls
ab. Es wird empfohlen, dass die Dosierung des GLP-1-Derivats der
Erfindung für
jeden einzelnen Patienten vom Fachmann bestimmt wird.
-
Insbesondere
ist es vorgesehen, dass das GLP-1-Derivat zur Herstellung eines
Medikaments mit einem lang anhaltenden Wirkungsprofil zur Behandlung
von nicht-insulinabhängiger
Diabetes mellitus und/oder zur Behandlung von Fettsucht nützlich ist.
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Die
vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele
veranschaulicht, die jedoch nicht als Beschränkung des Schutzumfangs betrachtet
werden sollen. Die in der vorangehenden Beschreibung und in den
folgenden beispielen offenbarten Merkmale können sowohl getrennt als auch
in Kombination davon Material zum Verwirklichen der Erfindung in
unterschiedlichen Formen davon sein.
-
BEISPIELE
-
Die
folgenden Akronyme für
im Handel erhältliche
Chemikalien werden verwendet:
- DMF:
- N,N-Dimethylformamid.
- NMP:
- N-Methyl-2-pyrrolidon.
- EDPA:
- N-Ethyl-N,N-diisopropylamin.
- EGTA:
- Ethylenglycolbis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure.
- GTP :
- Guanosin-5'-triphosphat.
- TFA:
- Trifluoressigsäure.
- THF:
- Tetrahydrofuran
- Myr-ONSu:
- Tetradecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
- Pal-ONSu:
- Hexadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
- Ste-ONSu
- Octadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
- HOOC-(CH2)6-COONSu:
- ω-Carboxyheptansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
- HOOC-(CH2)10-COONSu:
- ω-Carboxyundecansäure 2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
- HOOC-(CH2)12-COONSu:
- ω-Carboxytridecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
- HOOC-(CH2)14-COONSu:
- ω-Carboxypentadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
- HOOC-(CH2)16-COONSu:
- ω-Carboxyheptadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
- HOOC-(CH2)18-COONSu:
- ω-Carboxynonadecansäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
-
Abkürzungen:
-
-
- PDMS:
- Plasmadesorptionsmassenspektrometrie
- MALDI-MS:
- Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisierungs-massenspektrometrie
- HPLC:
- Hochleistungsflüssigchromatographie
- amu:
- Atommasseneinheiten
-
Analytisches
-
Plasmadesorptionsmassenspektrometrie
-
Probenpräparation
-
Die
Probe wird in 0,1 % TFA/EtOH (1:1) mit einer Konzentration von 1 μg/μl gelöst. Die
Probenlösung (5-10 μl) wird auf
ein Nitrocellulosetarget (Bio-ion AB, Uppsala, Schweden) gegeben,
und man lässt
es auf der Targetoberfläche
für eine
Dauer von 2 Minuten absorbieren. Das Target wird anschließend mit
2×25 μl 0,1 % TFA
gespült
und geschleudert. Schließlich
wird das Nitrocellulosetarget in ein Targetkarussel gegeben und
in das Massenspektrometer eingebracht.
-
MS-Analyse:
-
Eine
PDMS-Analyse wurde unter Verwendung eines Laufzeitgeräts des Typs
Bio-ion 20 (Bio-ion
Nordic AB, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Eine Beschleunigungsspannung
von 15 kV wurde angelegt, und durch den Beschuss der Nitrocelluloseoberfläche mit
252-Cf-Spaltfragmenten gebildete Molekülionen wurden zu einem Stoppdetektor
hin beschleunigt. Das erhaltene Laufzeitspektrum wurde unter Verwendung
der H+- und NO+-Ionen
mit einem m/z von 1 bzw. 30 zu einem tatsächlichen Massenspektrum kalibriert.
Die Massenspektrendaten wurden im Allgemeinen für 1,0×106 Spaltereignisse,
entsprechend 15-20 Minuten, akkumuliert. Die zugeordneten Massen
Aller entsprechen isotop gemittelten Molekularmassen. Die Genauigkeit
der Massenbestimmung ist im Allgemeinen besser als 0,1 %.
-
MALDI-MS
-
Eine
MALDI-TOF-MS-Analyse wurde unter Verwendung eines Geräts des Typs
Voyager RP (PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA), ausgestattet
mit einer verzögerten
Extraktion und betrieben in linearem Modus, durchgeführt. alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure wurde
als Matrix verwendet, und die Massenbestimmungen basierten auf einer
externen Kalibrierung.
-
Beispiel 1
-
Synthese von Lys26(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37).
-
Die
Titelverbindung wurde aus GLP-1(7-37) synthetisiert. Ein Gemisch
aus GLP-1(7-37)
(25 mg, 7,45 μm),
EDPA (26,7 mg, 208 μm),
NMP (520 μl)
und Wasser (260 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Myr-ONSu (2,5 mg, 7,67 μm) in
NMP (62,5 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt,
wonach man es für
eine Dauer von 20 Min. stehen ließ. Eine zusätzliche Menge Myr-ONSu (2,5 mg,
7,67 μm)
in NMP (62,5 μl)
wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch für eine Dauer von 5 Min. sanft geschüttelt. Nach
einer Gesamtreaktionszeit von 40 Min. wurde die Reaktion durch die
Zugabe einer Lösung von
Glycin (12,5 mg, 166 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (12,5 ml) abgeschreckt. Die Titelverbindung wurde aus dem
Reaktionsgemisch durch HPLC unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN)
und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
isoliert, Ausbeute: 1,3 mg (entsprechend 4,9% der theoretischen
Ausbeute). Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgadient betrug in 60 Minuten 0-100%. Das isolierte
Produkt wurde durch PDMS analysiert und der m/z-Wert für das prototierte
Molekülion
als 3567,93 befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich
3566,9+3 amu (theoretischer Wert: 3565,9 amu). Die Acy lierungsposition
(Lys26) wurde durch enzymatische Spaltung der Titelverbindung mit
V8-Protease von Staphylococcus aureus und anschließende Massenbestimmung
der Peptidfragmente durch PDMS bestätigt.
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Zusätzlich zur
Titelverbindung wurden zwei andere GLP-1-Derivate unter Verwendung
derselben Chromatografiesäule
und eines flacheren Gradienten (35-38% Acetonitril in 60 Minuten)
aus dem Reaktionsgemisch isoliert, siehe Beispiel 2 und 3.
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Beispiel 2
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Synthese von Lys34(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37).
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Die
Titelverbindung wurde durch HPLC aus dem in Beispiel 1 beschriebenen
Reaktionsgemisch isoliert. Eine PDMS-Analyse ergab ein protoniertes
Molekülion
mit einem m/z von 3567,713. Das Molekulargewicht wurde folglich
als 3566,73 amu (theoretischer Wert: 3565,9 amu) befunden. Die Acylierungsstelle
wurde auf der Basis des Fragmentierungsmusters bestimmt.
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Beispiel 3
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Synthese von Lys26,34-bis(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37).
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Die
Titelverbindung wurde durch HPLC aus dem in Beispiel 1 beschriebenen
Reaktionsgemisch isoliert. Eine PDMS-Analyse ergab ein protoniertes
Molekülion
mit einem m/z von 3778,4+3. Das Molekulargewicht wurde folglich
als 3777,4+3 amu (theoretischer Wert: 3776,1 amu) befunden.
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Beispiel 4
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Synthese von Lys26(Nε-tetradecanoyl)Arg34-GLP-1(7-37).
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Die
Titelverbindung wurde aus Arg34-GLP-1(7-37)
synthetisiert. Ein Gemisch aus Arg34-GLP-1(7-37)
(5 mg, 1,47 μm),
EDPA (5,3 mg, 41,1 μm),
NMP (105 μl)
und Wasser (50 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Myr-ONSu (0,71 mg, 2,2 μm)
in NMP (17,8 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine Dauer von 20 Min. stehen gelassen. Nach einer Gesamtreaktionszeit
von 30 Min. wurde die Reaktion durch die Zugabe einer Lösung von
Glycin (25 mg, 33,3 μm)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (2,5 ml) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch
HPLC wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. Eine PDMS-Analyse
ergab ein protoniertes Molekülion
mit einem m/z von 3594,93. Das Molekulargewicht wurde folglich als
3593,93 amu (theoretischer Wert: 3593,9 amu) befunden.
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Beispiel 5
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Synthese von Gly8Arg26,34Lys36(Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37).
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Die
Titelverbindung wurde aus Gly8Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37),
das von QCB erworben wurde, synthetisiert. Ein Gemisch aus Gly8Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37) (1,3 mg, 0,39 μm), EDPA
(1,3 mg, 10 μm),
NMP (125 μl) und
Wasser (30 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Myr-ONSu (0,14 mg, 0,44 μm)
in NMP (3,6 ml) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer
von 15 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch
die Zugabe einer Lösung
von Glycin (0,1 mg, 1,33 μm)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (10 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt, und
die Titelverbindung (60 μg,
4%) wurde isoliert.
-
Beispiel 6
-
Synthese von Arg26,34Lys36 (Nε-tetradecanoyl)-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37)-OH
(5,0 mg, 1,477 μmol),
EDPA (5,4 mg, 41,78 μmol), NMP
(105 μl)
und Wasser (50 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen
Gemisch wurde eine Lösung
von Myr-ONSu (0,721 mg, 2,215 μmol)
in NMP (18 μl)
zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 45 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,5 mg, 33,3 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (250 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(1,49 mg, 28%) wurde isoliert und Das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3595 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3594 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3594 amu).
-
Beispiel 7
-
Synthese von Lys26,34bis(Nε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (70 mg, 20,85 μmol), EDPA (75,71 mg, 585,8 μmol), NMP
(1,47 ml) und Wasser (700 μL)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)18-COONSu
(27,44 mg, 62,42 μmol)
in NMP (686 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für eine
zusätzliche
Dauer von 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (34,43 mg, 458,7 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (3,44 ml) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch
Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C erwärmt, und
der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(8,6 mg, 10%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 4006 ± 3 befunden.
Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 4005 ± 3 amu
(theoretischer Wert 4005 amu).
-
Beispiel 8
-
Synthese von Arg26,34Lys36(Nε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36-GLP-1(7-36)-OH
(5,06 mg, 1,52 μmol),
EDPA (5,5 mg, 42,58 μmol), NMP
(106 μl)
und Wasser (100 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen
Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)18-COONSu
(1,33 mg, 3,04 μmol)
in NMP (33,2 μl) zugesetzt,
das Reaktionsgemisch wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann
für eine
zusätzliche
Dauer von 2,5 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,50 mg, 33,34 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (250 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,46 mg, 8%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3652 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3651 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3651 amu).
-
Beispiel 9
-
Synthese von Arg26,34Lys33(Nε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH
(5,556 mg, 1,57μmol),
EDPA (5,68 mg, 43,96 μmol), NMP
(116,6 μl)
und Wasser (50 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)18-COONSu
(1,38 mg, 3,14 μmol)
in NMP (34,5 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt und
dann für
eine zusätzliche
Dauer von 2,5 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,5 mg, 33,3 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (250 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,7 mg, 12%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3866 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3865 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3865 amu).
-
Beispiel 10
-
Synthese von Arg34Lys26 (Nε-(ω-carboxynonadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg34-GLP-1(7-37)-OH (5,04 mg,
1,489 μmol),
EDPA (5,39 mg, 41,70 μmol),
NMP (105 μl)
und Wasser (50 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)18-COONSu
(1,31 mg, 2,97 μmol)
in NMP (32,8 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 30 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,46 mg, 32,75 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (246 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(1,2 mg, 22%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3709 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3708 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3708 amu).
-
Beispiel 11
-
Synthese von Arg34Lys26 (Nε-(ω-carboxyheptadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg34-GLP-1(7-37)-OH (5,8 mg,
1,714 μmol),
EDPA (6,20 mg, 47,99 μmol),
NMP (121,8 μl)
und Wasser (58 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen
Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)16-COONSu
(2,11 mg, 5,142 μmol)
in NMP (52,8 μl) zugesetzt,
das Reaktionsgemisch wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann
für eine
zusätzliche
Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,83 mg, 37,70 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (283 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,81 mg, 13%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3681 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3680 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3680 amu).
-
Beispiel 12
-
Synthese von Arg26,34Lys36 (Nε-(ω-carboxyheptadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37)-OH
(3,51 mg, 1,036 μmol),
EDPA (3,75 mg, 29,03 μmol), NMP
(73,8 μl)
und Wasser (35 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)16-COONSu
(1,27 mg, 3,10 μmol)
in NMP (31,8 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur
sanft geschüttelt und
dann für
eine zusätzliche
Dauer von 2 Std. und 10 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (1,71 mg, 22,79 μmol) in 50%igem,
wässrigem
Ethanol (171 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule wurde
auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,8 mg, 21%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion wurde
als 3682 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3681 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3681amu).
-
Beispiel 13
-
Synthese von Arg26,34Lys38(Nε-(ω-carboxyheptadecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH
(5,168 mg, 1,459 μmol),
EDPA (5,28 mg, 40,85 μmol), NMP
(108,6 μl)
und Wasser (51,8 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)16-COONSu
(1,80 mg, 4,37 μmol)
in NMP (45 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 10 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt und
dann für
eine zusätzliche
Dauer von 2 Std. und 15 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,41 mg, 32,09 μmol) in 50%igem,
wässrigem
Ethanol (241 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule wurde
auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,8 mg, 14%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion wurde
als 3838 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3837 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3837 amu).
-
Beispiel 14
-
Synthese von Arg26,34Lys36 (Nε-(ω-carboxyheptadecanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36-GLP-1(7-36)-OH
(24,44 mg, 7,34 μmol),
EDPA (26,56 mg, 205,52 μmol),
NMP (513 μl)
und Wasser (244,4 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)16-COONSu
(9,06 mg, 22,02 μmol)
in NMP (1,21 ml) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer
von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche
Dauer von 30 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (12,12 mg, 161,48 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (1,21 ml) abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch
Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung (7,5
mg, 28%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der
m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3625 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3624 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3624 amu).
-
Beispiel 15
-
Synthese von Arg26,34Lys36 (Nε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37)-OH
(4,2 mg, 1,24 μmol),
EDPA (4,49 mg, 34,72 μmol), NMP
(88,2 μl)
und Wasser (42 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)10-COONSu
(1,21 mg, 3,72 μmol)
in NMP (30,25 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 40 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde
durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,04 mg, 27,28 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (204 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule wurde
auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,8 mg, 18%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion wurde
als 3598 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3597 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3597 amu).
-
Beispiel 16
-
Synthese von Arg26,34Lys38(Nε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH
(5,168 mg, 1,46 μmol),
EDPA (5,28 mg, 40,88 μmol), NMP
(108,6 μl)
und Wasser (51,7 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)10-COONSu
(1,43 mg, 4,38 μmol)
in NMP (35,8 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt und
dann für
eine zusätzliche
Dauer von 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,41 mg, 32,12 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (241 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,85 mg, 16%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3753 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3752 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3752 amu).
-
Beispiel 17
-
Synthese von Lys26,34bis(Nε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (10,0 mg, 2,98 μmol), EDPA (10,8 mg, 83,43 μmol), NMP
(210 μl) und
Wasser (100 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)10-COONSu
(2,92 mg, 8,94 μmol)
in NMP (73 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (4,92 mg, 65,56 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (492 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(1,0 mg, 9%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3781 ± 3 befunden.
Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3780 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3780amu).
-
Beispiel 18
-
Synthese von Arg26,34Lys36 (Nε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36-GLP-1(7-36)-OH
(15,04 mg, 4,52 μmol),
EDPA (16,35 mg, 126,56 μmol),
NMP (315,8 μl)
und Wasser (150,4 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)10-COONSu
(4,44 mg, 13,56 μmol)
in NMP (111 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 40 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (7,5 mg, 99,44 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (750 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule wurde
auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(3,45 mg, 22%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion wurde
als 3540 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3539 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3539 amu).
-
Beispiel 19
-
Synthese von Arg34Lys26 (Nε-(ω-carboxyundecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg34-GLP-1(7-37)-OH (5,87 mg,
1,73 μmol),
EDPA (6,27 mg, 48,57 μmol),
NMP (123,3 μl)
und Wasser (58,7 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen
Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)10-COONSu
(1,70 mg, 5,20 μmol)
in NMP (42,5 μl) zugesetzt,
das Reaktionsgemisch wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann
für eine
zusätzliche
Dauer von 40 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,86 mg, 286 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (286 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(1,27 mg, 20%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3597 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3596 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3596 amu).
-
Beispiel 20
-
Synthese von Arg34Lys26 (Nε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg34-GLP-1(7-37)-OH (4,472
mg, 1,32 μmol),
EDPA (4,78 mg, 36,96 μmol),
NMP (94 μl)
und Wasser (44,8 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)6-COONSu
(1,07 mg, 3,96 μmol)
in NMP (26,8 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann stehen gelassen für
eine zusätzliche
Dauer von 1 Std. und 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,18 mg, 29,04 μmol) in 50%igem,
wässrigem Ethanol
(218 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung einer
Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,5 mg, 11%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3540 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3539 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3539 amu).
-
Beispiel 21
-
Synthese von Arg26,34Lys38(Nε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH
(5,168 mg, 1,459 μmol),
EDPA (5,28 mg, 40,85 μmol), NMP
(108,6 μl)
und Wasser (51,6 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)6-COONSu
(1,18 mg, 4,37 μmol)
in NMP (29,5 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt und
dann für
eine zusätzliche
Dauer von 1 Std. und 50 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (2,40 mg, 32,09 μmol) in 50%igem,
wässrigem
Ethanol (240 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule wurde
auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,5 mg, 9%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protovierte Molekülion wurde
als 3697 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3695 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3695 amu).
-
Beispiel 22
-
Synthese von Arg26,34Lys36 (Nε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36 -GLP-1(7-37)-OH
(5,00 mg, 1,47 μmol),
EDPA (5,32 mg, 41,16 μmol), NMP
(105 μl)
und Wasser (50 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen
Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)6-COONSu
(1,19 mg, 4,41 μmol)
in NMP (29,8 μl) zugesetzt,
das Reaktionsgemisch wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann
für eine
zusätzliche
Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,42 mg, 32,34 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (242 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,78 mg, 15%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protovierte Molekülion
wurde als 3542 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3541 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3541 amu).
-
Beispiel 23
-
Synthese von Arg26,34Lys36 (Nε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36-GLP-1(7-36)-OH
(5,00 mg, 1,50 μmol),
EDPA (5,44 mg, 42,08 μmol), NMP
(210 μl)
und Wasser (50 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen
Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)6-COONSu
(1,22 mg, 4,5 μmol)
in NMP (30,5 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,47 mg, 33,0 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (247 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,71 mg, 14%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protovierte Molekülion
wurde als 3484 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3483 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3483 amu).
-
Beispiel 24
-
Synthese von Lys26,34bis(Nε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (10 mg, 2,5 μmol), EDPA (10,8 mg, 83,56 μmol), NMP
(210 μl)
und Wasser (100 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)6-COONSu
(2,42 mg, 8,92 μmol)
in NMP (60,5 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 2 Std. und 35 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (4,92 mg, 65,54 μmol) in 50%igem,
wässrigem
Ethanol (492 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(2,16 mg, 24%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3669 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3668 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3668 amu).
-
Beispiel 25
-
Synthese von Arg34Lys26 (Nε-(ω-carboxypentadecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg34-GLP-1(7-37)-OH (4,472
mg, 1,321 μmol),
EDPA (4,78 mg, 36,99 μmol),
NMP (93,9 μl)
und Wasser (44,7 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen
Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)14-COONSu
(1,519 mg, 3,963 μmol)
in NMP (38 μl) zugesetzt,
das Reaktionsgemisch wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann
für eine
zusätzliche
Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,18 mg, 29,06 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (218 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,58 mg, 12%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3654 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3653 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3653 amu).
-
Beispiel 26
-
Synthese von Arg26,34Lys36 (Nε-(ω-carboxyheptanoyl))-GLP-1(7-36)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36-GLP-1(7-36)-OH
(5,00 mg, 1,50 μmol),
EDPA (5,44 mg, 42,08 μmol), NMP
(210 μl)
und Wasser (50 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem erhaltenen
Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)14-COONSu
(1,72 mg, 4,5 μmol)
in NMP (43 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,48 mg, 33 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (248 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,58 mg, 11%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3596 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3595 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3595 amu).
-
Beispiel 27
-
Synthese von Lithocholinsäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester.
-
Einem
Gemisch aus Lithocholinsäure
(5,44 g, 14,34 mmol), N-Hydroxysuccinimid
(1,78 g, 15,0 mmol), wasserfreies THF (120 ml) und wasserfreies
Acetonitril (30 ml), gehalten bei 10°C, wurde eine Lösung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (3,44 g, 16,67
mmol) in wasserfreiem THF zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde
bei Umgebungstemperatur für
eine Dauer von 16 Std. gerührt,
filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand in Dichlormethan (450
ml) gelöst,
mit einer 10%igen, wässrigen
Na2CO3-Lösung (2×150 ml)
und Wasser (2×150
ml) gewaschen und getrocknet (MgSO4). Es
wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt, um einen kristallinen
Rückstand
zu erhaltern. Der Rückstand
wurde aus einem Gemisch aus Dichlormethan (30 ml) und n-Heptan (30 ml) umkristallisiert,
um die Titelverbindung (3,46 g, 51%) als kristallinen Feststoff zu
erhalten.
-
Beispiel 28
-
Synthese von Arg35Lys26(Nε-lithocholyl)-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg34-GLP-1(7-37)-OH (4,472
mg, 1,32 μmol),
EDPA (4,78 mg, 36,96 μmol),
NMP (94 μl)
und Wasser (44,8 μl)
wurde für
eine Dauer von 10 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Lithocholinsäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester
(1,87 mg, 3,96 μmol) in
NMP (46,8 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde
durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,18 mg, 29,04 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (218 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule wurde
auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgadient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(1,25 mg, 25%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protovierte Molekülion wurde
als 3744 +– 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3743 +– 3 amu
(theoretischer Wert 3743 amu).
-
Beispiel 29
-
Synthese von Nα-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBut.
-
Einer
Suspension von H-Glu(OH)-OBut (2,5 g, 12,3
mmol), DMF (283 ml) und EDPA (1,58 g, 12,3 mmol) wurde eine Lösung von
Myr-ONSu (4,0 g, 12,3 mmol) in DMF (59 ml) zugetropft. Das Reaktionsgemisch für eine Dauer
von 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum auf
ein Gesamtvolumen von 20 ml eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen 5%iger,
wässriger
Zitronensäure
(250 ml) und Ethylacetat (150 ml) aufgeteilt, und die Phasen wurden
getrennt. Die organischen Phasen wurden im Vakuum eingeengt, und der
Rückstand
wurde in DMF (40 ml) gelöst.
Die erhaltene Lösung
wurde einer 10%igen wässrigen
Zitronensäurelösung (300
ml), gehalten bei 0°C,
zugetropft. Die ausgefällte
Verbindung wurde aufgefangen und mit Eiswasser gewaschen und in
einem Vakuumtrockenofen getrocknet. Die getrocknete Verbindung wurde
in DMF (23 ml) gelöst,
und HONSu (1,5 g, 13 mmol) wurde zugesetzt. Dem erhaltenen Gemisch
wurde eine Lösung
von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
(2,44 g, 11,9 mmol) in Dichlormethan (47 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch
wurde für
eine Dauer von 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt und die ausgefällte Verbindung
abfiltriert. Der Niederschlag wurde aus n-Heptan/2-Propanol umkristallisiert,
um die Titelverbindung (3,03 g, 50%) zu erhalten.
-
Beispiel 30
-
Synthese von Glu22,23,30Arg26,34Lys38(Nε-(γ-glutamyl(Nα-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Glu22,23,30Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH (1,0 mg, 0,272 μmol), EDPA
(0,98 mg, 7,62 μmol),
NMP (70 μl)
und Wasser (70 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Nα-tetradecanoyl-G1u(ONSu)-OBut, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben,
(0,41 mg, 0,816 μmol)
in NMP (10,4 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 45 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (0,448 mg, 5,98 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (45 μl).
Eine 0,5%ige, wässrige
Ammoniumacetatlösung
(0,9 ml) wurde zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde auf einer
Hülse des
Typs Varian 500 mg C8 Mega Bond Elut® immobilisiert,
die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (10 ml)
gewaschen und schließlich
durch Elution mit TFA (10 ml) aus der Hülse freigesetzt. Das Eluat
wurde im Vakuum eingeengt und das Reaktionsgemisch durch Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,35 mg, 32%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 4012 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 4011 ± 3 amu
(theoretischer Wert 4011 amu).
-
Beispiel 31
-
Synthese von Glu23,26Arg34Lys38(Nε-(γ-glutamyl(Nα-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Glu23,26Arg34Lys38-GLP-1(7-38)-OH (6,07 mg, 1,727 μmol), EDPA
(6,25 mg, 48,36 μmol),
NMP (425 μl)
und Wasser (425 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Nα-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBut, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben,
(2,65 mg, 5,18 μmol)
in NMP (66,3 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche
Dauer von 45 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (2,85 mg, 38,0 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (285 μl).
Eine 0,5%ige, wässrige
Ammoniumacetatlösung
(5,4 ml) wurde zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde auf einer
Hülse des
Typs Varian 500 mg C8 Mega Bond Elut® immobilisiert,
die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigen Acetonitril (10 ml)
gewaschen, und schließlich
durch Elution mit TFA (10 ml) aus der Hülse freigesetzt. Das Eluat
wurde im Vakuum eingeengt und das Reaktionsgemisch durch Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,78 mg, 12%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3854 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3853 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3853 amu).
-
Beispiel 32
-
Synthese von Lys26,34-bis(Nε-(ω-carboxytridecanoyl))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (30 mg, 8,9 μmol), EDPA (32,3 mg, 250 μmol), NMP
(2,1 ml) und Wasser (2,1 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH2)12-COONSu (12,7 mg, 35,8 μmol) in NMP (318 μl), das Reaktionsgemisch
wurde für
eine Dauer von 1 Std. und 40 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (3,4 mg, 44,7 μmol) in 50%igem,
wässrigem
Ethanol (335 μl) abgeschreckt.
Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(10 mg, 29%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3840 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3839 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3839 amu).
-
Beispiel 33
-
Synthese von Lys26,34-bis(Nε-(γ-glutamyl(Nα-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-37)-OH.
(NNC 90-1167).
-
Ein
Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (300 mg, 79,8 μmol), EDPA (288,9 mg, 2,24 mmol),
NMP (21 ml) und Wasser (21 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Nε-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBut, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben,
(163 mg, 319,3 μmol)
in NMP (4,08 ml) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer
von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt und dann für eine zusätzliche
Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (131,8 mg, 1,76 mmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (13,2 ml).
Eine 0,5%ige, wässrige
Ammoniumacetatlösung
(250 ml) wurde zugesetzt, und das erhaltene Gemisch in vier gleiche
Portionen aufgeteilt. Jede Portion wurde auf eine Hülse des Typs
Varian 500 mg C8 Mega Bond Elut® eluiert,
die immobilisierte Verbindung mit 0,1 %igem wässrigen TFA (3,5 ml) gewaschen
und schließlich
durch Elution mit 70%igem, wässrigen
Acetonitril (4 ml) freigesetzt. Die vereinigten Eluate wurden mit
0,1 %, wässrigem
TFA (300 ml) verdünnt.
Die ausgefällte
Verbindung wurde abzentrifugiert, mit 0,1%igem, wässrigem
TFA (50 ml) gewaschen und schließlich abzentrifugiert. Dem
Niederschlag wurde TFA (60 ml) zugesetzt und das erhaltene Reaktionsgemisch
für eine
Dauer von 1 Std. und 30 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges TFA
wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in Wasser (50 ml) gegossen.
Die ausgefällte
Verbindung wurde durch Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung (27,3
mg, 8%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der
m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 4036 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 4035 ± 3 amu
(theoretischer Wert 4035 amu).
-
Beispiel 34
-
Synthese von Arg26,34Lys38(Nε-(ω-carboxypentadecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH
(30 mg, 8,9 μmol),
EDPA (32,3 mg, 250 μmol),
NMP (2,1 ml) und Wasser (2,1 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von HOOC-(CH2)14-COONSu (13,7 mg, 35,8 μmol) in NMP (343 μl) zugesetzt,
das Reaktionsgemisch wurde für
eine Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe einer Lösung
von Glycin (3,4 mg, 44,7 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (335 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung (4,8
mg, 14%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert. Der
m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3894 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3893 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3893 amu).
-
Beispiel 35
-
Synthese von Nα-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OBut.
-
Einer
Suspension von H-Glu(OH)-OBut (4,2 g, 20,6
mmol), DMF (500 ml) und EDPA (2,65 g, 20,6 mmol) wurde eine Lösung von
Pal-ONSu (7,3 g, 20,6 mmol) in DMF (100 ml) zugetropft. Das Reaktionsgemisch
wurde für
eine Dauer von 64 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum auf
ein Gesamtvolumen von 20 ml eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen 10%iger,
wässriger
Zitronensäure
(300 ml) und Ethylacetat (250 ml) aufgeteilt, und die Phasen wurden
getrennt. Die organischen Phasen wurden im Vakuum eingeengt, und
der Rückstand
wurde in DMF (50 ml) gelöst.
Die erhaltene Lösung
wurde einer 10%igen, wässrigen
Zitronensäurelösung (500
ml), gehalten bei 0°C,
zugetropft. Die ausgefällte
Verbindung wurde aufgefangen und mit Eiswasser gewaschen und in
einem Vakuumtrockenofen getrocknet. Die getrocknete Verbindung wurde
in DMF (45 ml) gelöst,
und HONSu (2,15 g, 18,7 mmol) wurde zugesetzt. Dem erhaltenen Gemisch
wurde eine Lösung
von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
(3,5 g, 17 mmol) in Dichlormethan (67 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch
wurde für
eine Dauer von 16 Std. bei Raumtemperatur gerührt und die ausgefällte Verbindung
abfiltriert. Der Niederschlag wurde aus n-Heptan/2-Propanol umkristallisiert,
um die Titelverbindung (6,6 g, 72%) zu erhalten.
-
Beispiel 36
-
Synthese von Lys26,34-bis(Nε-(γ-glutamyl(Nα-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus GLP-1(7-37)-OH (10 mg, 2,9 μmol), EDPA (10,8 mg, 83,4 μmol), NMP
(0,7 ml) und Wasser (0,7 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Nε-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OBut, hergestellt wie in Beispiel 33 beschrieben, (163
mg, 319,3 μmol)
in NMP (4,08 ml) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer
von 1 Std. und 20 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (4,9 mg, 65,6 μmol) in 50%igem,
wässrigem
Ethanol (492 μl)
abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige
Ammoniumacetatlösung
(9 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf eine Hülse des
Typs Varian 1 g C8 Mega Bond Elut® eluiert,
die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (10 ml)
gewaschen und schließlich
durch Elution mit TFA (10 ml) aus der Hülse freigesetzt. Das Eluat
wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(2,4 mg, 20%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 4092 ± 3 befunden.
Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 4091 ± 3 amu
(theoretischer Wert 4091 amu).
-
Beispiel 37
-
Synthese von Arg34Lys26(Nε-(γ-glutamyl(Nα-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg34-GLP-1(7-37)-OH (3,7 mg,
1,1 μmol),
EDPA (4,0 mg, 30,8 μmol),
Acetonitril (260 μl)
und Wasser (260 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Nα-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OBut, hergestellt wie in Beispiel 35 beschrieben,
(1,8 mg, 3,3 μmol)
in Acetonitril (44,2 μl)
zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und
20 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch
die Zugabe einer Lösung
von Glycin (1,8 mg, 24,2 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (181 μl)
abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige
Ammoniumacetatlösung
(12 ml) und NMP (300 μl)
wurden zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde auf eine Hülse des
Typs Varian 1g C8 Mega Bond Elut® eluiert,
die immobilisierte Verbindung wurde mit 5%igemmm, wässrigem
Acetonitril (10 ml) gewaschen und schließlich durch Elution mit TFA
(6 ml) aus der Hülse
freigesetzt. Man ließ das
Eluat für
eine Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur stehen, wonach es im Vakuum
eingeengt wurde. Der Rückstand
wurde durch Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,23 mg, 6%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3752 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3751 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3751 amu).
-
Beispiel 33
-
Synthese von Arg26,34Lys38(Nε-(γ-glutamyl(Nα-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys36-GLP-1(7-38)-OH
(14 mg, 4,0 μmol),
EDPA (14,3 mg, 110,6 μmol),
NMP (980 μl)
und Wasser (980 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Nα-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBut, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben,
(12,1 mg, 23,7 μmol)
in NMP (303 μl)
zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 2 Std. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (6,5 mg, 86,9
mmol) in 50%igem, wässrigem
Ethanol (652 μl)
abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige
Ammoniumacetatlösung
(50 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf eine Hülse des
Typs Varian 1g C8 Mega Bond Elut® eluiert,
die immobilisierte Verbindung wurde mit 5%igem, wässrige Acetonitril
(15 ml) gewaschen und schließlich
durch Elution mit TFA (6 ml) aus der Hülse freigesetzt. Man ließ das Eluat
für eine Dauer
von 1 Std. und 45 Min. bei Raumtemperatur stehen, wonach es im Vakuum
eingeengt wurde. Der Rückstand
wurde durch Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(3,9 mg, 26%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3881 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3880 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3880 amu).
-
Beispiel 39
-
Synthese von Arg26,34Lys38(Nε-(ω-carboxypentadecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH
(14 mg, 4,0 μmol),
EDPA (14,3 mg, 111 μmol),
NMP (980 μl)
und Wasser (980 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)14-COONSu
(4,5 mg, 11,9 μmol)
in NMP (114 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und
45 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Eine zusätzliche
Lösung
von of HOOC-(CH2)14-COONSu (4,0
mg, 10,4 μmol)
in NMP (100 μl)
wurde zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde für eine zusätzliche
Dauer von 1 Std. und 30 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (1,5 mg, 19,8 μmol) in 50%igem,
wässrigem
Ethanol (148 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(3,9 mg, 26%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3809 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3808 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3808 amu).
-
Beispiel 40
-
Synthese von Arg26,34Lys38(Nε-(γ-glutamyl(Nα-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH
(14 mg, 4,0 μmol),
EDPA (14,3 mg, 110,6 μmol),
NMP (980 μl)
und Wasser (980 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Nα-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OBut, hergestellt wie in Beispiel 35 beschrieben,
(6,4 mg, 11,9 μmol)
in NMP (160 μl)
zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und
20 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch
die Zugabe einer Lösung
von Glycin (6,5 mg, 87 mmol) in 50%igem, wässrigem Ethanol (653 μl) abgeschreckt.
Eine 0,5%ige, wässrige
Ammoniumacetatlösung
(50 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf eine Hülse des Typs
Varian 1g C8 Mega Bond Elut® eluiert, die immobilisierte
Verbindung wurde mit 5%igem, wässrigem
Acetonitril (10 ml) gewaschen und schließlich durch Elution mit TFA
(6 ml) aus der Hülse
freigesetzt. Man ließ das Eluat
für eine
Dauer von 1 Std. und 30 Min. bei Raumtemperatur stehen, wonach es
im Vakuum eingeengt wurde. Der Rückstand
wurde durch Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(7,2 mg, 47%) wurde isoliert und das Produkt durch PDMS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protovierte Molekülion
wurde als 3881 ± 3 befunden.
Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3880 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3880 amu).
-
Beispiel 41
-
Synthese von Arg18,23,26,30,34Lys38(Nε-hexadecanoyl)-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg18,23,26,30,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH (1,0 mg, 0,27 μmol), EDPA
(0,34 mg, 2,7 μmol) und
DMSO (600 μl)
wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von Pal-ONSu (0,28 mg, 0,8 μmol)
in NMP (7 μl)
zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt
und dann für
eine zusätzliche Dauer
von 6 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde
durch die Zugabe einer Lösung von
Glycin (1,6 mg, 21,7 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (163 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(0,17 mg, 16%) wurde isoliert und das Produkt durch MALDI-MS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protovierte Molekülion
wurde als 3961 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3960 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3960 amu).
-
Beispiel 42
-
Synthese von Arg26,34Lys38(Nε-(ω-carboxytridecanoyl))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34Lys38-GLP-1(7-38)-OH
(14 mg, 4,0 μmol),
EDPA (14,3 mg, 111 μmol),
NMP (980 μl)
und Wasser (980 ml) wurde für
eine Dauer von 5 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Dem
erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung
von HOOC-(CH2)12-COONSu
(4,2 mg, 11,9 μmol)
in NMP (105 μl)
zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 1 Std. und
50 Min. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die Reaktion wurde durch
die Zugabe einer Lösung
von Glycin (6,5 mg, 87 μmol)
in 50%igem, wässrigem
Ethanol (652 μl)
abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Säulenchromatografie unter Verwendung
einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems gereinigt.
Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(5,8 mg, 39%) wurde isoliert und das Produkt durch MALDI-MS analysiert.
Der m/z-Wert für das
protonierte Molekülion
wurde als 3780 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3779 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3781 amu).
-
Beispiel 43
-
Synthese von Arg34Lys26(Nε-(-glutamyl(Nα-tetradecanoyl)))-GLP-1(7-37)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg34-GLP-1(7-37)-OH (15 mg,
4,4 μmol),
EDPA (16 mg, 124 μmol),
NMP (2 ml) und Wasser (4,8 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Nα-tetradecanoyl-Glu(ONSu)-OBut, hergestellt wie in Beispiel 29 beschrieben, (12,1
mg, 23,7 μmol)
in NMP (303 μl)
zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für eine Dauer von 2 Std. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (6,5 mg, 86,9 μmol) in 50%igem,
wässrigem
Ethanol (652 μl)
abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige
Ammoniumacetatlösung
(50 ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch auf eine Hülse des
Typs Varian 1g C8 Mega Bond Elut® eluiert,
die immobilisierte Verbindung mit 5%igem, wässrigem Acetonitril (15 ml)
gewaschen und schließlich
durch Elution mit TFA (6 ml) aus der Hülse freigesetzt. Man ließ das Eluat
für eine
Dauer von 1 Std. und 45 Min. bei Raumtemperatur stehen wonach es
im Vakuum eingeengt wurde. Der Rückstand
wurde durch Säulenchromatografie
unter Verwendung einer Cyanopropylsäule (Zorbax 300SB-CN) und eines
standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(3,9 mg, 26%) wurde isoliert und das Produkt durch MALDI-MS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3723 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3722 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3723 amu).
-
Beispiel 44
-
Synthese von Nα-octadecanoyl-Glu(ONSu)-OBut.
-
Einer
Suspension von H-Glu(OH)-OBut (2,82 g, 13,9
mmol), DMF (370 ml) und EDPA (1,79 g, 13,9 mmol) wurde eine Lösung von
Ste-ONSu (5,3 g, 13,9 mmol) in DMF (60 ml) zugetropft. Dichlormethan
(35 ml) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch für eine Dauer
von 24 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum eingeengt.
Der Rückstand
wurde zwischen 10%iger, wässriger
Zitronensäure
(330 ml) und Ethylacetat (200 ml) aufgeteilt, und die Phasen wurden
getrennt. Die organischen Phasen wurden im Vakuum eingeengt, und
der Rückstand
wurde in DMF (60 ml) gelöst.
Die erhaltene Lösung
wurde einer 10%igen, wässrigen
Zitronensäurelösung (400
ml), gehalten bei 0°C,
zugetropft. Die ausgefällte
Verbindung wurde aufgefangen und mit Eiswasser gewaschen und in
einem Vakuumtrockenofen getrocknet. Die getrocknete Verbindung wurde
in DMF (40 ml) gelöst,
und HONSu (1,63 g, 14,2 mmol) wurde zugesetzt. Dem erhaltenen Gemisch
wurde eine Lösung
von DCC (2,66 g, 12,9 mmol) in Dichlormethan (51 ml) zugesetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde für
eine Dauer von 64 Std. bei Raumtemperatur gerührt und die ausgefällte Verbindung
abfiltriert. Der Niederschlag wurde aus n-Heptan/2-Propanol umkristallisiert,
um die Titelverbindung (4,96 g, 68%).
-
Beispiel 45
-
Synthese von Arg26,34Lys38(Nε-(γ-glutamyl(Nα-octadecanoyl)))-GLP-1(7-38)-OH.
-
Ein
Gemisch aus Arg26,34-GLP-1(7-38)-OH (28
m 7,9 μmol)
EDPA (28,6 m 221,5 μmol),
NMP (1,96 ml) und Wasser (1,96 ml) wurde für eine Dauer von 5 Min. bei
Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Dem erhaltenen Gemisch wurde eine Lösung von Nα-octadecanoyl-Glu(ONSu)-OBut (17,93 g, 31,6 ☐mol), hergestellt
wie in Beispiel 44 beschrieben, in NMP (448 μl) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch
wurde für
eine Dauer von 2 Std. bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe einer Lösung von Glycin (13,1 mg, 174 μmol) in 50%igem,
wässrigem
Ethanol (1,3 ml) abgeschreckt. Eine 0,5%ige, wässrige Ammoniumacetatlösung (120
ml) wurde zugesetzt und das erhaltene Gemisch in zwei gleiche Portionen
aufgeteilt. Jede Portion wurde auf eine Hülse des Typs Varian 5 g C8
Mega Bond Elut® eluiert,
die immobilisierte Verbindung wurde mit 5%igem, wässrigem
Acetonitril (25 ml) gewaschen und schließlich durch Elution TFA (25
ml) aus der Hülse
freigesetzt. Man ließ die
vereinigten Eluate für
eine Dauer von 1 Std. und 25 Min. bei Raumtemperatur stehen, wonach
sie im Vakuum eingeengt wurden. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie unter
Verwendung einer Cyanopropylsäule
(Zorbax 300SB-CN) und eines standardmäßigen Acetonitril/TFA-Systems
gereinigt. Die Säule
wurde auf 65°C
erwärmt,
und der Acetonitrilgradient betrug in 60 Minuten 0-100%. Die Titelverbindung
(3,6 mg, 11%) wurde isoliert und das Produkt durch MALDI-MS analysiert.
Der m/z-Wert für
das protonierte Molekülion
wurde als 3940 ± 3
befunden. Das erhaltene Molekulargewicht beträgt folglich 3939 ± 3 amu
(theoretischer Wert 3937 amu).
-
BIOLOGISCHE
FUNDE
-
Langzeitwirkung von GLP-1-Derivaten
nach einer s.c.-Verabreichung
-
Die
Langzeitwirkung einer Anzahl von GLP-1-Derivaten der Erfindung wurde
durch Überwachen
ihrer Konzentration in Plasma nach einer sc-Verabreichung an gesunde
Schweine unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Verfahrens bestimmt.
Zum Vergleich folgte auch die Konzentration in Plasma von GLP-1(7-37) nach einer sc-Verabreichung.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Die Langzeitwirkung von
anderen GLP-1-Derivaten der Erfindung kann in derselben Weise bestimmt
werden.
-
Schweine
(50% Duroc, 25% Yorkshire, 25% Danish Landrace, etwa 40 kg) wurden
von Beginn des Versuchs an die Nahrung entzogen. Jedem Schwein wurden
0,5 nmol Testverbindung pro kg Körpergewicht in
einer 50 μM
isotonischen Lösung
(5 mM Phosphat, pH 7,4, 0,02% Tween®-20
(Merck), 45 mg/ml Mannit (pyrogenfrei, Novo Nordisk) verabreicht.
Blutproben wurden aus einem Katheter in der Jugularisvene zu den
in Tabelle 1 angegebenen Stunden entnommen. 5 ml der Blutproben
wurden in gekühlte
Glasbehälter,
enthaltend 175 μl
der folgenden Lösung,
gegossen: 0,18 M EDTA, 1500 KIE/ml Aprotinin (Novo Nordisk) und
3% Bacitracin (Sigma), pH 7,4. Innerhalb von 30 Min. wurden die
Proben für
eine Dauer von 10 Min. bei 5-6000·g zentrifugiert. Die Temperatur
wurde bei 4°C
gehalten. Der Überstand
wurde in verschiedene Glasbehälter
pipettiert und bei –20°C bis zur
Verwendung aufbewahrt.
-
Die
Plasmakonzentrationen der Peptide wurden durch RIA unter Verwendung
eines monoklonalen Antikörpers,
der für
den N-terminalen Bereich von GLP-1(7-37) spezifisch ist, bestimmt. Die Kreuzreaktivitäten betrugen
mit GLP-1(1-37) und GLP-1(8-36)amid weniger als 1% und mit GLP-1(9-37),
GLP-1(10-36)amid und GLP-1(11-36)amid <0,1%. Das gesamte Verfahren wurde bei
4°C durchgeführt.
-
Der
Test wurde wie folgt durchgeführt:
100 μl Plasma
wurden mit 271 μl
96%igem Ethanol gemischt, unter Verwendung eines Wirbelmischers
gemischt und bei 2600·g
für eine
Dauer von 30 Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde in Minisorp-Röhrchen dekantiert
und vollständig
eingedampft (Savant Speedvac AS290). Der Eindampfungsrückstand
wurde im Testpuffer, bestehend aus 80 mM NaH
2PO
4/Na
2HPO
4,
0,1% HSA (Orpha 20/21, Behring), 10 mM EDTA, 0,6 mM Thiomersal (Sigma),
pH 7,5, rekonstituiert. Proben wurden in Volumina rekonstituiert,
die für
ihre erwarteten Konzentrationen geeignet waren, und man ließ sie für eine Dauer von
30 Min. rekonstituieren. Zu 300 μl
Probe wurden 100 μl
Antikörperlösung in
Verdünnungspuffer,
enthaltend 40 mM NaH
2PO
4/Na
2HPO
4, 0,1% HSA,
0,6 mM Thiomersal, pH 7,5, zugesetzt. Eine nicht-spezifische Probe wurde
durch Mischen von 300 μl
Puffer mit 100 μl
Verdünnungspuffer
hergestellt. Individuelle Standards wurden aus gefriergetrockneten
Ausgangsmaterialien, gelöst
in 300 μl
Testpuffer, hergestellt. Alle Proben wurden wie vorstehend beschrieben
für eine
Dauer von 72 Std. in Minisorp-Röhrchen
mit Antikörper
vorinkubiert. 200 μl
Tracer in Verdünnungspuffer,
enthaltend 6-7000 CPM, wurden zugesetzt, die Proben wurden gemischt
und für
eine Dauer von 48 Std. inkubiert. 1,5 ml einer Suspension von 200
ml pro Liter heparinstabilisiertes Rinderplasma und 18 g pro Liter
Aktivkohle (Merck) in 40 mM NaH
2PO
4/Na
2HPO
4,
0,6 mM Thiomersal, pH 7,5, wurden jedem Röhrchen zugesetzt. Vor der Verwendung
wurde die Suspension gemischt und für eine Dauer von 2 Std. bei
4°C stehen
gelassen. Alle Proben wurden für
eine Dauer von 1 Std. bei 4°C
inkubiert und dann bei 3400·g
für eine
Dauer von 25 Min. zentrifugiert. Sofort nach der Zentrifugation
wurde der Überstand
abdekantiert und in einem γ-Zähler gezählt. Die
Konzentration in den Proben wurde aus individuellen Standardkurven berechnet.
Die folgenden Plasmakonzentrationen wurden gefunden, berechnet als
% der maximalen Konzentration für
die einzelnen Verbindungen (n=2): Tabelle
1
- *)
Die Testverbindungen sind die Titelverbindungen der Beispiele mit
den angegebenen Zahlen
-
Wie
aus Tabelle 1 ersichtlich, weisen die GLP-1-Derivate der Erfindung
ein lang anhaltendes Wirkungsprofil in Bezug auf GLP-1(7-37) auf
und sind in Plasma viel beständiger
als GLP-1(7-37). Es ist auch aus Tabelle 1 ersichtlich, dass die
Zeit, bei welcher die Höchstkonzentration
in Plasma erzielt wird, je nach dem ausgewählten bestimmten GLP-1-Derivat
innerhalb breiter Grenzen variiert?.
-
Stimulation
der eAMP-Bildung in einer Zelllinie, die den klonierten menschlichen
GLP-1-Rezeptor esprimiert Zum Aufzeigen der Wirksamkeit der GLP-1-Derivate
wurde deren Vermögen,
die cAMP-Bildung in einer den klonierten menschlichen GLP-1-Rezeptor
exprimie renden Zelllinie zu stimulieren, getestet. Ein EC50 wurde aus der Dosis-Wirkungs-Kurve berechnet.
-
Baby-Hamsternieren(BHK)-Zellen,
die den menschlichen Bauspeicheldrüsen-GLP-1-Rezeptor exprimieren, wurden verwendet
(Knudsen und Pridal, 1996, Eur. J. Pharm. 318, 429-435). Plasmamembrane
wurden durch Homogenisierung in Puffer (10 mmol/l Tris-HCl und 30
mmol/l NaCl pH 7,4, enthaltend zusätzlich 1 mmol/l Dithiothreitol,
5 mg/l Leupeptin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 5 mg/l Pepstatin (Sigma,
St. Louis, MO, USA), 100 mg/l Bacitracin (Sigma, St. Louis, MO,
USA) und 16 mg/l Aprotinin (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark))
präpariert
(Adelhorst et al, 1994, J. Biol. Chem. 269, 6275). Das Homogenisat
wurde auf einer Schicht aus 41 G/V% Saccharose zentrifugiert. Die
weiße
Bande zwischen den beiden Schichten wurde in Puffer verdünnt und
zentrifugiert. Plasmamembranen wurden bis zur Verwendung bei –80°C aufbewahrt.
-
Der
Test wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Mulden in einem Gesamtvolumen
von 140 μl
durchgeführt. Der
verwendete Puffer war 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4 unter Zugabe von
1 mmol/l EGTA, 1,5 mmol/l MgSO
4, 1,7 mmol/l
ATP, 20 mM GTP, 2 mmol/l 3-Isobutyl-1-methylxanthin, 0,01 % Tween-20
und 0,1 % Humanserumalbumin (Reinst, Behringwerke AG, Marburg, Germany).
Verbindungen, die auf Agonistaktivität zu testen waren, wurden gelöst und in
Puffer verdünnt,
den auf Agonistaktivität
zu testenden Membranen zugesetzt, und das Gemisch wurde für eine Dauer
von 2 Std. bei 37°C
inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 25 μl0,05 mol/l
HCl gestoppt. Die Proben wurden vor der Analyse auf cAMP durch einen
Szintillationsannäherungstest
(RPA 538, Amersham, UK) auf das 10-Fache verdünnt. Die folgenden Ergebnisse
wurden gefunden:
- *)
Die Testverbindungen sind die Titelverbindungen der Beispiele mit
den angegebenen Zahlen.