CN104011064A - 包含非成蛋白质性的氨基酸的二肽 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了包含非成蛋白质性的氨基酸的二肽、制备所述二肽的方法、和在制备包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白的方法中使用所述二肽的方法。

Description

包含非成蛋白质性的氨基酸的二肽
技术领域
本发明涉及包含非成蛋白质性的(non-proteogenic)氨基酸的二肽、制备所述二肽的方法、和使用所述二肽生产包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白的方法。
背景技术
已经批准大量多肽和蛋白用于医疗实践。所述多肽和蛋白可以通过重组DNA技术在合适的宿主细胞中生产，或它们可以通过非常确定的肽合成技术合成生产。但是，天然的多肽和蛋白倾向于表现出高清除率，这对于许多在延长的时间段内需要多肽的高血浆浓度的临床适应症而言是不可接受的。
天然的多肽和蛋白可以从天然形式改变成类似物及其衍生物，以改变或增强某些特征。例如，可以将非成蛋白质性的氨基酸(即非天然氨基酸)添加或置换进多肽或蛋白中，以例如赋予对抗水解(诸如DPP-IV对GLP-1肽的水解)的某种保护。
可以如下制备含有一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽，诸如N端修饰的GLP-1类似物：经由化学合成以逐步方式引入非成蛋白质性的氨基酸(一个或多个)，其中对于要向多肽或蛋白添加的每个氨基酸应用偶联步骤和随后的去保护步骤。
但是，所述逐步合成是费时的和不方便的，它可能导致许多副产物的形成，可能需要中间纯化步骤，且它可能导致某些氨基酸残基（诸如组氨酸残基）的大量外消旋化。
可替换地，可以将包含非成蛋白质性的氨基酸(一个或多个)的肽片段偶联至剩余的多肽或蛋白上，其中在所述方法中使用被完全保护的片段，例如在N端氨基和侧链氨基上被保护的片段。
但是，这样的肽片段可能不溶于水性介质中，从而限制了它的应用。此外，如果在所述片段中存在正交保护基，需要几个去保护步骤，且如果分离的话，合成步骤之间的中间纯化可能是必要的，并且可能发生中间分离的问题。
WO 2009/083549涉及一种用于制备含有非成蛋白质性的氨基酸的GLP-1类似物和衍生物的方法。专利申请WO 2007/147816 A1和WO 2010/125079 A2涉及肽片段的合成偶联。Bourgault, S. 等人在PEPTIDES, 第29卷, 第6(1)期, 2008年6月, 第919-932页中描述了常规肽化学的用途。
仍然需要这样的肽片段：其用在改进的用于得到含有一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽的方法中。
发明内容
本发明涉及化学式1的二肽：
其中
R1是H或氨基保护基，且R2是氨基保护基；或者
R1是可除去的烷基，且R2是H或可除去的烷基；或者
R1和R2共同形成环；
R3是H或与羧酸根基团形成盐的仲铵阳离子、叔铵阳离子或金属阳离子；且
R4不存在或是酸性盐。
也预见到一种用于生产本发明的二肽的方法。
此外，描述了一种用于得到包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白的方法，其中所述方法包括使本发明的二肽与多肽或蛋白反应的步骤。
本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容显而易见的其它问题。
具体实施方式
本发明涉及包含非成蛋白质性的氨基酸的二肽，其中所述二肽适合用于偶联至多肽或蛋白。
在一个方面，本发明的二肽具有游离的未保护的咪唑基基团。在一个方面，本发明的二肽是呈羧酸盐的形式。
在本发明的一个方面，所述二肽具有化学式1：
其中
R1是H或氨基保护基，例如，但不限于，Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde或Nps，且R2是氨基保护基，例如，但不限于，Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde或Nps；或者
R1是可除去的烷基，例如，但不限于，苄基或叔丁基，且
R2是H或可除去的烷基，例如，但不限于，苄基或叔丁基；或者
R1和R2共同形成环，例如，但不限于，酞酰亚胺（phatalimide）或1,3,5-二噁嗪；
R3是H或与羧酸根基团形成盐的仲铵阳离子、叔铵阳离子或金属阳离子，诸如碱金属阳离子或碱土金属阳离子；和
R4不存在或是酸性盐，诸如但不限于TFA、HCl、HBr的盐或硫酸氢盐。
在本发明的一个方面，R1是H，且R2是氨基保护基，例如，但不限于，Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde或Nps；或R1和R2共同形成环，例如，但不限于，酞酰亚胺（phatalimide）或1,3,5-二噁嗪；或R1是可除去的烷基，例如，但不限于，苄基或叔丁基，且R2是H或可除去的烷基，例如，但不限于，苄基或叔丁基。
在一个方面，R1是H，且R2是碱敏感的保护基，例如，但不限于，Fmoc。在一个方面，R1是H，且R2是Fmoc。
在本文中使用的术语“氨基保护基”应理解为，肽化学领域的技术人员已知的保护基(替代性术语: 保护基团)，其通过胺(官能)基团的化学修饰而引入二肽中，以便防止在化学反应过程中在非常相同的胺上的反应。
在本文中使用的术语“可除去的烷基”应理解为，可以通过催化氢解方法除去的烷基，诸如但不限于苄基。在本发明的一个方面，R1是苄基，且R2是H。
R3可以是氢、仲铵阳离子、叔铵阳离子或金属阳离子，其中所述仲铵阳离子、所述叔铵阳离子或所述金属阳离子与它附近的羧酸根基团形成盐。在本发明的一个方面，所述金属阳离子是碱金属阳离子或碱土金属阳离子。在一个方面，R3选自：H、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、钙阳离子、镁阳离子、从仲胺衍生出的阳离子（诸如但不限于N,N-二环己基铵阳离子、N,N-二叔丁基铵阳离子）或从叔胺衍生出的阳离子（诸如但不限于三乙基铵阳离子）。
在本发明的一个方面，R3是H。在一个方面，R3与它附近的羧酸根基团一起形成盐，诸如但不限于，单价盐、二价盐或从胺衍生出的盐。
根据本发明的一个方面，R3可以是与它附近的羧酸根基团形成盐的仲铵阳离子、叔铵阳离子或金属阳离子，诸如碱金属阳离子或碱土金属阳离子。R3和羧酸根基团之间的盐可以是例如：单价盐，诸如但不限于碱金属盐，包括锂盐、钠盐、钾盐或铯盐，二价盐，诸如但不限于钙盐或镁盐，从仲胺（例如，但不限于，N,N-二环己基胺或N,N-二叔丁基胺）衍生出的盐，或从叔胺（例如，但不限于，三乙胺）衍生出的盐。
发明人已经惊人地发现，本发明的二肽（其中R3是H，或是与它附近的羧酸根基团形成盐的仲铵阳离子、叔铵阳离子或金属阳离子，且R4不存在或是酸性盐）在例如水性酰化反应（其中使所述二肽与肽或多肽反应）中是特别好的。
在本发明的一个方面，R4不存在。在一个方面，R4是与二肽形成盐的酸性组分。在一个方面，R4选自：TFA、HCl、HBr和硫酸氢盐。在一个方面，R4是TFA。
在一个方面，本发明的二肽是化学式2的对映异构的或外消旋的二肽Fmoc-His-Aib-OH
其中* 指示二肽的手性中心，且R4不存在或是酸性组分，例如，但不限于，TFA、HCl、HBr或硫酸氢盐，所述酸性组分与所述二肽形成盐。在一个方面，R4是TFA。
在本文中，在化合物样品中术语“对映异构的”应理解为，在样品中过量的一种对映异构形式，即L-形式或D-形式。在本文中使用的术语“外消旋的”应理解为，在化合物样品中等量的L-形式和D-形式。作为一个非限制性例子，化学式2的对映异构的Fmoc-His-Aib-OH的组氨酸残基可以呈L-组氨酸或D-组氨酸的形式。
在本发明的一个方面，用本领域技术人员已知的活化剂活化化学式1或化学式2的二肽。在一个方面，用基于鏻的偶联剂活化化学式1或化学式2的二肽。在一个方面，所述基于鏻的偶联剂选自：苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐(BOP)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyAOP)、6-氯-苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyClocK)、O-[(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基)氨基]-氧基三(吡咯烷-1-基)鏻六氟磷酸盐PyOxP、O-[(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基)氨基]-氧基三(吡咯烷-1-基)鏻四氟硼酸盐(PyOxB)。在一个方面，基于鏻的偶联剂是苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。
术语“基于鏻的偶联剂”在本文中应当理解为含有鏻盐的偶联剂，其当在原位与羧酸反应时，会形成将与多肽或蛋白反应的活化羧酸。
本发明的二肽是惊人稳定的，且具有长贮存期限。
在本文中使用的术语“稳定化的”或“稳定的”当提及本发明的二肽时表示，具有增加的化学稳定性、增加的物理稳定性、或增加的物理和化学稳定性的二肽。
在一个方面，本发明的二肽对于超过6周的使用和对于超过2年的贮存是稳定的。在另一个方面，本发明的二肽对于超过4周的使用和对于超过2年的贮存是稳定的。在另一个方面，本发明的二肽对于超过4周的使用和对于超过3年的贮存是稳定的。在另一个方面，本发明的二肽对于超过2周的使用和对于超过1年的贮存是稳定的。
在本文中使用的术语“环境温度”是指环境的温度。在室内条件下，环境温度与室温相同，且可以是例如25℃。
与逐步固相肽合成的常规步骤相比，由于减少的化学修饰步骤（诸如去保护和活化步骤）的量，本发明的二肽易于操作，且其在肽化学中的应用是容易的。
根据一个方面，本发明的二肽可以用在用于得到包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白的方法中。
在一个方面，根据本发明的二肽用在将所述二肽与多肽或蛋白共价偶联的方法中。在一个方面，所述二肽用在将所述二肽与多肽或蛋白的N端胺偶联的方法中。在一个方面，所述二肽用在将所述二肽与其它分子中的亲核基团偶联的方法中，所述亲核基团不属于多肽和/或蛋白的化学基团。
在一个方面，所述二肽所偶联的多肽或蛋白由成蛋白质性的氨基酸组成，即所述二肽所偶联的多肽或蛋白不包含任何非成蛋白质性的氨基酸。
在本发明的一个方面，化学式1或化学式2的二肽是用于将所述二肽与多肽或蛋白偶联，以在化学式1的二肽的羧酸根基团（即含有R3的官能团）或化学式2的羧酸与多肽或蛋白的游离胺之间形成酰胺键。在一个方面，使化学式1或化学式2的二肽与多肽或蛋白在水性介质中反应，以在化学式1或化学式2的二肽的羧酸与多肽或蛋白的N端胺之间形成酰胺键。
根据本发明的一个方面，在与多肽或蛋白的反应结束以后，除去R1和/或R2。在一个方面，在一个化学步骤中除去R1和/或R2。在一个方面，在碱性条件下在去保护步骤中除去R1和/或R2。在一个方面，在包括向所述反应介质中添加碱的去保护步骤中除去R1和/或R2。在一个方面，在包括向所述反应介质中添加胺的去保护步骤中除去R1和/或R2。在一个方面，在包括向所述反应介质中添加哌啶的去保护步骤中除去R1和/或R2。
在本发明的一个方面，在与多肽或蛋白的酰化反应结束以后，在一个化学步骤中原位除去R1和/或R2。
根据一个方面，本发明的二肽可以用在用于得到包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白的方法中。在一个方面，所述反应在溶液中进行。在一个方面，使本发明的活化二肽与溶解于水性介质中的多肽或蛋白反应。在一个方面，所述偶联反应在本领域技术人员已知的固相肽合成中进行。发明人已经发现，通过使用所述用于得到包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸和在其N端的组氨酸的多肽或蛋白的方法，会得到这样的多肽或蛋白产物：其中所述组氨酸残基没有外消旋或仅轻度外消旋。
在一个方面，用于得到包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白的方法包括下述步骤：
1. 用基于鏻的偶联剂活化所述二肽
2. 使所述活化的二肽与多肽或蛋白反应
3. 在原位除去保护基(一个或多个)
由此得到最终的多肽或蛋白。
在一个方面，用于得到包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白的方法包括下述步骤：
1. 用基于鏻的偶联剂活化化学式1或化学式2的二肽
2. 使所述活化的二肽与多肽或蛋白反应
3. 在原位除去保护基(一个或多个)
由此得到最终的多肽或蛋白。
在一个方面，使所述活化的二肽与多肽或蛋白在水性介质中反应。本文中使用的术语“水性介质”包括任意基于水的介质，例如，水、盐水溶液、糖溶液、输液溶液、缓冲液和任意其它容易得到的基于水的介质。此外，水性介质可以含有一种或多种水溶性的有机溶剂，例如，但不限于，二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲基乙酰胺(DMAC)、二甲亚砜(DMSO)、乙腈、二噁烷、水溶性的缩醛（例如二甲基缩醛、二乙基缩醛或1,3-二氧戊环（dioxalane））和水溶性的醇（例如甲醇、乙醇、丙醇、2-丙醇和丁氧基-2-乙醇）。
在一个方面，活化的二肽与多肽或蛋白在其中反应的水性介质包含100-10%的水和因而0-90%的其它溶剂（一种或多种），其中其它溶剂的非限制性例子例如可以选自：DMF、NMP、DMAC、DMSO、乙腈、二噁烷、水溶性的缩醛（例如二甲基缩醛、二乙基缩醛或1,3-二氧戊环）和水溶性的醇（例如甲醇、乙醇、丙醇、2-丙醇和丁氧基-2-乙醇）。在一个方面，所述水性介质包含80-20%的水，诸如60-30%的水。在一个方面，所述水性介质包含50-30%的水。在一个方面，所述水性介质包含约50%的水。在一个方面，所述水性介质包含约40%的水。在一个方面，所述水性介质包含约30%的水。
在本发明的一个方面，在将所述二肽加入水性介质（在其中与肽或多肽反应）中之前，将所述二肽溶解在非质子的有机溶剂或其混合物，例如，但不限于，DMF、NMP、DMAC、DMSO、乙腈和二噁烷中。
在本文中使用的术语“非质子的”是用于溶剂如丙酮或二氯甲烷：其倾向于具有大的偶极矩，即在相同分子内的部分正电荷和部分负电荷的分离，并经由它们的负偶极溶剂合带正电荷的物质。非质子溶剂的例子包括、但不限于二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、DMF、NMP、DMAC、DMSO、乙腈、二噁烷和碳酸丙烯酯。
在一个方面，使用肽化学领域的技术人员已知的操作，如在例如ISBN 0-7167-7009-1“Synthetic Peptides”（Gregory A. Grant编）中所述，使活化的二肽与固相上的多肽或蛋白反应。
在一个方面，所述基于鏻的偶联剂是PyBOP。在一个方面，所述保护基是Fmoc。在一个方面，在溶液中得到最终的多肽或蛋白。
在一个方面，在碱性条件下除去保护基。在一个方面，在至少7的pH除去保护基。在一个方面，用哌啶、DBU (1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯)或叔丁基胺除去保护基。
在本发明的一个方面，将酰化步骤中的水性反应混合物的pH调至pH 7至pH 14之间。在一个方面，反应介质的pH是在pH 8至pH 13之间。在另一个方面，所述pH是在pH 8至pH 12之间。在另一个方面，所述pH是在pH 8至pH 10之间。在另一个方面，所述pH是在pH 8.3至pH 9.7之间。
“反应混合物”在本文中应当理解为，当使本发明的二肽与多肽或蛋白反应时，使用的溶剂和试剂的混合物。所述反应混合物可以是水性的，即水存在于所述反应混合物中。
通过本领域技术人员已知的方式，可以控制反应混合物的pH。例如，可以使用简单的pH试纸试验(pH棒)或pH计测量pH值，并可以手工地加入酸或碱以调节pH，或可以使用具有反馈机制的pH计，其可以控制溶液的pH。
适合用于调节pH的酸包括、但不限于：盐酸、硫酸、硫酸氢盐、磷酸、柠檬酸和乙酸。
适合用于调节pH的碱包括、但不限于：叔胺碱例如，但不限于，三乙胺或二异丙基乙胺、N-甲基吗啉，碱金属氢氧化物例如，但不限于，氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铯，和碱金属碳酸盐例如，但不限于，碳酸钾、碳酸钠、碳酸锂、碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸氢锂。
在本发明的一个方面，所述反应混合物包含缓冲液。在本发明的一个方面，所述缓冲液选自：磷酸盐缓冲液、碳酸钠缓冲液、Bicine（N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸缓冲液）、HEPPS缓冲液(3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸缓冲液)、HEPES缓冲液(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液)、MOPS缓冲液(3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液)和TEA缓冲液(三乙胺缓冲液)。在本发明的一个方面，所述反应混合物包含TEA缓冲液(三乙胺缓冲液)。
在加入到反应混合物中之前，可以活化所述二肽，即可以将所述二肽的羧酸官能团(functionality)转化成所述羧酸的活化酯。当活化本发明的二肽时，在活化步骤中的反应混合物的温度可以是在-5℃至50℃之间，诸如在0℃至50℃之间。在一个方面，所述温度是在5℃至40℃之间。在另一个方面，所述温度是在10℃至35℃之间。在另一个方面，所述温度是在15-25℃之间。在另一个方面，在活化步骤中的温度是约20℃。
在酰化步骤（其中使本发明的活化二肽与多肽或蛋白反应）中的反应混合物的温度可以是在-5℃至50℃之间，诸如在0℃至50℃之间。在一个方面，所述温度是在5℃至40℃之间。在另一个方面，所述温度是在10℃至35℃之间。在另一个方面，所述温度是在15-25℃之间。在另一个方面，所述温度是约20℃。
本文中使用的术语“多肽或蛋白”是指，由至少2个通过多肽键连接的组分氨基酸组成的化合物。组分氨基酸可以选自由遗传密码编码的氨基酸(成蛋白质性的氨基酸)，并且它们可以是不由遗传密码编码的天然氨基酸以及合成氨基酸(非成蛋白质性的氨基酸)。22种成蛋白质性的氨基酸是：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
因此，非成蛋白质性的氨基酸是可以通过多肽键掺入多肽或蛋白中的基团，但不是成蛋白质性的氨基酸。例子是：γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-氨基酸诸如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的非成蛋白质性的氨基酸包括通过化学合成制备的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，诸如D-丙氨酸和D-亮氨酸，Aib (α-氨基异丁酸)，Abu (α-氨基丁酸)，鸟氨酸，Dap (2,3-二氨基丙酸)，Dab (2,4-二氨基丁酸)，Tle (叔丁基甘氨酸)，3-氨基甲基苯甲酸，邻氨基苯甲酸，脱氨基-组氨酸，氨基酸的β类似物，诸如β-丙氨酸等，D-组氨酸，脱氨基-组氨酸，2-氨基-组氨酸，β-羟基-组氨酸，高组氨酸，Nα-乙酰基-组氨酸，α-氟甲基-组氨酸，α-甲基-组氨酸，3-吡啶基丙氨酸，2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸，(1-氨基环丙基)羧酸，(1-氨基环丁基)羧酸，(1-氨基环戊基)羧酸，(1-氨基环己基)羧酸，(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸。
本文中关于多肽或蛋白使用的术语“类似物”是指修饰的多肽或蛋白，其中多肽或蛋白的一个或多个氨基酸残基已经被其它氨基酸残基置换，和/或，其中一个或多个氨基酸残基已经从多肽或蛋白删除，和/或，其中一个或多个氨基酸残基已经从多肽或蛋白删除，和或，其中一个或多个氨基酸残基已经被添加到多肽或蛋白上。氨基酸残基的这种添加或删除可以发生在多肽或蛋白的N端和/或在多肽或蛋白的C端。一种简单的系统常常用于描述类似物∶例如[Aib8, Arg34]GLP-1(7-37)表示这样的GLP-1(7-37)类似物，其中在8位的天然存在的丙氨酸被α-氨基异丁酸置换，在34位的赖氨酸被精氨酸置换。将没有说明光学异构体的所有氨基酸理解为是指L-异构体。在本发明的方面中，已经修饰了最多17个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多15个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多10个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多8个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多7个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多6个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多5个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多4个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多3个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了最多2个氨基酸。在本发明的方面中，已经修饰了1个氨基酸。
在本发明的一个方面，根据本发明的衍生物的C端可以以酸或酰胺的形式终止。在一个方面，本发明的衍生物的C端是酰胺。在另一个方面，本发明的衍生物的C端是酸。
本发明特别适合用于制备适合于治疗例如糖尿病的包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白，诸如高血糖素样肽和胰岛素。
在一个方面，要与所述二肽反应的多肽或蛋白是高血糖素样肽。
本文中使用的术语“高血糖素样肽”是指高血糖素家族的多肽、exendins及其类似物。高血糖素家族的多肽由前高血糖素原基因编码，并且包括具有高度同源性的三个小多肽，即高血糖素(1-29)、GLP-1 (1-37)和GLP-2 (1-33)。Exendins是在蜥蜴中表达的多肽，且象GLP-1一样，是促胰岛素的。Exendins的例子是exendin-3和exendin-4。
术语GLP-1、GLP-2、exendin-3和exendin-4是本领域技术人员已知的。例如，本文中使用的“GLP-1化合物”或“GLP-1多肽”是指人GLP-1(7-37)、其促胰岛素类似物和其促胰岛素衍生物。GLP-1类似物的非限制性例子是：GLP-1(7-36)酰胺、Arg34-GLP-1(7-37)、Aib8Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺和Val8Asp22-GLP-1(7-37)。GLP-1衍生物的非限制性例子是：脱氨基-His7, Arg26, Lys34(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰基)))-GLP-1(7-37)、脱氨基-His7, Arg26, Lys34(Nε-辛酰基)-GLP-1(7-37)、Arg26,34, Lys38(Nε-(ω-羧基十五酰基))-GLP-1(7-38)、Arg26,34, Lys36(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰基)))-GLP-1(7-36)和Arg34, Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰基)))-GLP-1(7-37)。根据本领域中确立的实践，GLP-1命名法开始于被称作第7号的组氨酸残基，并将以后的氨基酸残基编号，因此，结束于第37号甘氨酸。因此，通常，在本文中对GLP-1(7-37)序列的氨基酸残基编号或位置编号的任何提及是指，开始于第7位的His且结束于第37位的Gly的序列。可以通过提及以下内容来描述本发明的衍生物的GLP-1类似物：i)天然GLP-1(7-37)中与发生变化的氨基酸残基相对应的氨基酸残基(即，天然GLP-1中的对应位置)的编号，和ii)实际的变化。
在一个方面，根据本发明的高血糖素样肽是二肽基氨肽酶IV保护的。在另一个方面，根据本发明的高血糖素样肽是二肽基氨肽酶IV保护的。
本文中使用的术语“二肽基氨肽酶IV保护的”是指，比天然化合物(例如GLP-1(7-37))更耐受二肽基氨肽酶IV(DPP-IV)的高血糖素样肽(例如GLP-1类似物)。通过例如天然化合物的突变和/或衍生化，可以获得这样的保护。通过下述降解测定来确定GLP-1化合物对由二肽基氨肽酶IV引起的降解的抗性：
在37℃，在100µL 0.1 M三乙胺-HCl缓冲液（pH 7.4）中，将GLP-1化合物的等分试样(5 nmol)与1 μL纯化二肽基氨肽酶IV(相当于5 mU的酶活性)一起温育10-180分钟。通过加入5 μL的10%三氟乙酸来终止酶反应，并使用HPLC分析来分离和定量多肽降解产物。进行该分析的一种方法是∶根据Siegel等人, Regul. Pept. 1999;79: 93-102和Mentlein等人. Eur. J. Biochem. 1993;214: 829-35，将混合物施加到Vydac C18大孔径(30 nm孔，5 μm颗粒) 250 x 4.6 mm柱上，并以1 ml/min的流速洗脱，采用乙腈在0.1%三氟乙酸中的溶液的线性阶式梯度(0%乙腈保持3 min，0-24%乙腈保持17 min，24-48%乙腈保持1 min)。通过它们在220 nm (肽键)或280 nm (芳族氨基酸)处的吸光度，可以监测多肽和它们的降解产物，并且通过积分它们的峰面积(与标准品的面积相关联)来定量。估算在导致小于10%的GLP-1化合物被水解的温育时间时二肽基氨肽酶IV对GLP-1化合物的水解速率。
本文中关于高血糖素样肽使用的术语“促胰岛素的”是指，响应于增加的血浆葡萄糖水平而刺激胰岛素分泌的能力。促胰岛素的高血糖素样肽是GLP-1受体的激动剂。通过本领域已知的体外或体内测定，可以确定化合物的促胰岛素性能。下列体外测定可以用于确定化合物(诸如高血糖素样肽)的促胰岛素特性。在以下测定中，优选的促胰岛素的化合物显示出小于5 nM的EC50值，甚至更优选小于500 pM的EC50值。
在DMEM培养基中培养表达克隆的人GLP-1受体的幼仓鼠肾(BHK)细胞(BHK 467-12A)，所述DMEM培养基加入了100 IU/mL青霉素、100µL/mL链霉素、10%胎牛血清和1 mg/mL遗传霉素G-418 (Life Technologies)。通过在缓冲液(10 mM Tris-HCl、30 mM NaCl和1 mM二硫苏糖醇, pH 7.4，另外含有5 mg/mL亮抑酶肽(Sigma)、5 mg/L胃酶抑素(Sigma)、100 mg/L杆菌肽(Sigma)和16 mg/L抑肽酶(Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA))中匀浆化来制备质膜。在41%W/v蔗糖层上面将匀浆物离心。将两个层之间的白色带在缓冲液中稀释并离心。在使用之前在-80℃保存质膜。
通过测量cAMP作为对促胰岛素的多肽或促胰岛素的化合物的刺激的应答，进行功能性受体测定。在96-孔微孔滴定板中进行温育，总体积为140 mL，且具有下述终浓度∶50 mM Tris-HCl，1 mM EGTA，1.5 mM MgSO4，1.7 mM ATP，20 mM GTP，2 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，0.01%w/v吐温-20，pH 7.4。将化合物在缓冲液中溶解并稀释。为每个实验新制备GTP∶将2.5 μg膜加入到每个孔中，并在室温、在暗处在摇动下将该混合物温育90分钟。通过加25 mL 0.5 M HCl来终止反应。通过闪烁迫近测定(RPA 542, Amersham, UK)测量形成的cAMP。为化合物绘制剂量-响应曲线，并使用GraphPad Prism软件计算EC50值。
本文中使用的术语“促胰岛素的化合物的前药”是指，施用给患者之后被转化成促胰岛素的化合物的化学修饰的化合物。这样的前药通常是促胰岛素的化合物的氨基酸延伸形式或酯。
本文中使用的术语“exendin-4化合物”定义为：exendin-4(1-39)、其促胰岛素的片段、其促胰岛素的类似物和其促胰岛素的衍生物。Exendin-4的促胰岛素的片段是促胰岛素的多肽，其整个序列可以在exendin-4的序列中找到，并且其中已经删除了至少一个末端氨基酸。Exendin-4(1-39)的促胰岛素的片段的例子是exendin-4(1-38)和exendin-4(1-31)。通过本领域众所周知的体内或体外测定，可以确定化合物的促胰岛素的性能。例如，可以将化合物施用给动物，并监测随时间变化的胰岛素浓度。Exendin-4(1-39)的促胰岛素的类似物表示这样的各种分子：其中一个或多个氨基酸残基已经与其它氨基酸残基交换，和/或，已从其删除一个或多个氨基酸残基，和/或，已给其添加一个或多个氨基酸残基，条件是，所述类似物是促胰岛素的化合物，或是促胰岛素的化合物的前药。Exendin-4(1-39)的促胰岛素的类似物的一个例子是Ser2Asp3-exendin-4(1-39)，其中在2和3位的氨基酸残基已经分别被丝氨酸和天冬氨酸替换(这种特定类似物在本领域还称为exendin-3)。Exendin-4(1-39)及其类似物的促胰岛素的衍生物是本领域技术人员认为是这些多肽的衍生物的那些，即，具有至少一个不存在于母体多肽分子中的取代基，条件是，所述衍生物是促胰岛素的化合物，或是促胰岛素的化合物的前药。取代基的例子是酰胺、碳水化合物、烷基、酯和亲脂取代基。Exendin-4(1-39)及其类似物的促胰岛素的衍生物的一个例子是Tyr31-exendin-4(1-31)-酰胺。
本文中使用的术语“稳定的exendin-4化合物”是指化学修饰的exendin-4(1-39)，即，通过常规方法确定，在人类中表现出至少10小时的体内血浆消除半衰期的类似物或衍生物。
本文中使用的术语“二肽基氨肽酶IV保护的exendin-4化合物”是指，通过二肽基氨肽酶IV保护的GLP-1化合物的定义下面所描述的测定确定，比exendin-4更耐受血浆肽酶二肽基氨肽酶IV (DPP-IV)的exendin-4化合物。
GLP-1类似物可以是这样的类似物，其中在GLP-1(7-37)的34位的天然存在的Lys已被Arg置换。
此外，本发明包括促胰岛素的多肽的前体或中间体的衍生物。
在本发明的一个方面，所述高血糖素样肽是促胰岛素的。在另一个方面，所述促胰岛素的高血糖素样肽选自：GLP-1、GLP-2、exendin-4、exendin-3及其类似物和衍生物。
基于蛋白的药物的构象稳定性对于维持生物活性而言和对于使由变性和纤维性颤动引起的不可逆结构损失最小化而言是重要的。尤其是，由于复杂的重折叠模式，大的促胰岛素的多肽和蛋白在构象变化方面是不稳定的。此外，具有已知纤维性颤动历史的促胰岛素的多肽，诸如GLP-1，尤其对三级结构的失稳敏感(即，形成融化的球态)。
在一个方面，根据本发明的高血糖素样肽的组分氨基酸可以选自由遗传密码编码的氨基酸，并且它们可以是不由遗传密码编码的天然氨基酸以及合成氨基酸。不由遗传密码编码的天然氨基酸是例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通过化学合成制备的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，诸如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib (α-氨基异丁酸)、Abu (α-氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸。
在本发明的一个方面，要与根据本发明的二肽反应的高血糖素样肽是GLP-1多肽。在另一个方面，所述GLP-1多肽是具有在WO 2006/005667、WO 2005/027978、WO 2011/080103或WO 2006/097537中提及的侧链的GLP-1肽。在一个方面，所述GLP-1多肽是：GLP-1(9-37)；Arg34-GLP-1(9-37)；Aib22,Arg34-GLP-1(9-37)；Arg34, Pro37-GLP-1(9-37)或Aib22,27,30,35,Arg34,Pro37- GLP-1 (9-37)酰胺，其具有在WO 2006/005667、WO 2005/027978、WO 2011/080103或WO 2006/097537中提及的侧链。在一个方面，所述GLP-1多肽是在WO 2011/080103第84页第24行至第95页第2行中提及的GLP-1肽，或在WO 2006/097537第19页第25行至第22页第4行中提及的GLP-1类似物。
在另一个方面，要与根据本发明的二肽反应的高血糖素样肽是选自以下的GLP-1多肽：
Arg34-GLP-1(9-37)；
Aib22,Arg34-GLP-1(9-37)；
Arg34, Pro37-GLP-1(9-37)；
Aib,22,27,30,35,Arg34,Pro37- GLP-1 (9-37)酰胺；
N ε 26 -[2-(2-{2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基} 乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽；
N ε 26 {2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}, N ε 37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽；
N ε 26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽酰胺；
N ε 26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽酰胺；
N ε 26 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽酰胺；
Nε 26 (17-羧基十七酰基)-[Arg34]GLP-1-(9-37)-肽；
N ε 26-(19-羧基十九酰基)-[Arg34]GLP-1-(9-37)-肽；
N ε 26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Arg34]GLP-1-(9-37)肽；和
N ε 26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-羧基二十一酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Arg34]GLP-1-(9-37)肽。
在另一个方面，要与根据本发明的二肽反应的高血糖素样肽是选自以下的GLP-1多肽：
Arg34-GLP-1(9-37)；
Aib22,Arg34-GLP-1(9-37)；
Arg34,Pro37-GLP-1(9-37)；和
Aib,22,27,30,35,Arg34,Pro37- GLP-1 (9-37)酰胺。
在另一个方面，要与根据本发明的二肽反应的高血糖素样肽是选自以下的GLP-1多肽：
N ε 26 -[2-(2-{2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基} 乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽；
N ε 26 {2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}, N ε 37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽；
N ε 26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][ Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽酰胺；
N ε 26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽酰胺；和
N ε 26 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37) -肽酰胺。
在另一个方面，要与根据本发明的二肽反应的高血糖素样肽是选自以下的GLP-1多肽：
N ε 26 (17-羧基十七酰基)-[Arg34]GLP-1-(9-37)-肽；
N ε 26 -(19-羧基十九酰基)-[Arg34]GLP-1-(9-37)-肽；
N ε 26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Arg34]GLP-1-(9-37)肽；和
N ε 26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-羧基二十一酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Arg34]GLP-1-(9-37)肽。
在一个方面，通过本发明的方法得到包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的高血糖素样肽。在另一个方面，通过本发明的方法得到的包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的高血糖素样肽是包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的GLP-1肽。在另一个方面，包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的GLP-1肽是这样的GLP-1肽：其包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸，且具有在WO 2006/005667、WO 2005/027978、WO 2011/080103或WO 2006/097537中提及的侧链。在一个方面，包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的GLP-1肽是：Aib8,Arg34-GLP-1(7-37)；Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37)；Aib8,Arg34, Pro37-GLP-1(7-37)或Aib8,22,27,30,35,Arg34,Pro37- GLP-1 (7-37)酰胺，其具有在WO 2006/005667、WO 2005/027978、WO 2011/080103或WO 2006/097537中提及的侧链。在一个方面，包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的GLP-1肽是：在WO 2011/080103中在第84页第24行到第95页第2行的部分中提及的GLP-1肽，或在WO 2006/097537中在第19页第25行到第22页第4行的部分中提及的GLP-1类似物。
在一个方面，所述包含一个或多个成蛋白质性的氨基酸的GLP-1肽选自：
Aib8,Arg34-GLP-1(7-37)；
Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37)；
Arg34-GLP-1(7-37)；
Aib8,Arg34,Pro37-GLP-1(7-37)；
Aib8,22,27,30,35,Arg34,Pro37- GLP-1 (7-37)酰胺；
N ε 26 -[2-(2-{2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基} 乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)肽；
N ε 26 {2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}, N ε 37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -肽；
N ε 26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][ Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -肽酰胺；
N ε 26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -肽酰胺；
N ε 26 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -肽酰胺；
N ε 26 (17-羧基十七酰基)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-肽；
N ε 26 -(19-羧基十九酰基)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-肽；
N ε 26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽；和
N ε 26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-羧基二十一酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽。
在一个方面，所述包含一个或多个成蛋白质性的氨基酸的GLP-1肽选自：
Aib8,Arg34-GLP-1(7-37)；
Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37)；
Arg34-GLP-1(7-37)；
Aib8,Arg34,Pro37-GLP-1(7-37)；和
Aib8,22,27,30,35,Arg34,Pro37-GLP-1(7-37)酰胺。
在一个方面，所述包含一个或多个成蛋白质性的氨基酸的GLP-1肽选自：
N ε 26 -[2-(2-{2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基} 乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)肽；
N ε 26 {2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}, N ε 37 -{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37) -肽；
N ε 26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-肽酰胺；
N ε 26 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-肽酰胺；和
N ε 26 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基], N ε 37 -[2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-肽酰胺。
在一个方面，所述包含一个或多个成蛋白质性的氨基酸的GLP-1肽选自：
N ε 26 (17-羧基十七酰基)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-肽；
N ε 26 -(19-羧基十九酰基)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-肽；
N ε 26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽；和
N ε 26 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-羧基二十一酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽。
肽和蛋白的生产是本领域众所周知的。肽或蛋白可以例如通过经典的肽合成来生产，例如使用t-Boc或Fmoc化学法或其它非常确定的技术的固相肽合成，参见例如Greene和Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, “Organic Synthesis on solid Phase”, Florencio Zaragoza Dörwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000, “Novabiochem Catalog”, Merck Biosciences 2006/2007和“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, W.C. Chan和P.D. White编, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5。肽或蛋白也可以通过包括以下步骤的方法来生产：在合适的营养培养基中，在允许表达肽或蛋白的条件下，培养含有编码肽或蛋白的DNA序列并且能够表达肽或蛋白的宿主细胞。对于包含非天然氨基酸残基的肽或蛋白而言，应当修饰重组细胞，从而将非天然氨基酸掺入肽或蛋白中(例如，通过使用tRNA突变体)。
本文中使用的术语“约”或“大约”是指，在所述数值的合理近似内，诸如±10%，或对于pH值，±0.2，或对于温度，±5摄氏度。
以下是根据本发明的实施方案的一个非限制性列表：
1. 化学式1的二肽：
其中
R1是H或氨基保护基，且R2是氨基保护基；或者
R1是可除去的烷基，且R2是H或可除去的烷基；或者
R1和R2共同形成环；
R3是H或与羧酸根基团形成盐的仲铵阳离子、叔铵阳离子或金属阳离子；且
R4不存在或是酸性盐。
2. 实施方案1的二肽，其中所述氨基保护基选自：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps。
3. 实施方案1或2的二肽，其中所述可除去的烷基选自：苄基和叔丁基。
4. 实施方案1-3中的任一个的二肽，其中，当R1和R2共同形成环时，所述共同形成的环选自：酞酰亚胺（phatalimide）和1,3,5-二噁嗪。
5. 实施方案1-4中的任一个的二肽，其中
R1是H或选自以下的氨基保护基：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps，且R2是选自以下的氨基保护基：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps；或者
R1是选自苄基和叔丁基的可除去的烷基，且R2是H或选自苄基和叔丁基的可除去的烷基；或者
R1和R2共同形成选自以下的环：酞酰亚胺（phatalimide）和1,3,5-二噁嗪；
R3是H或与羧酸根基团形成盐的仲铵阳离子、叔铵阳离子、碱金属阳离子或碱土金属阳离子；且
R4不存在，或是选自以下的酸性盐：TFA的盐、HCl的盐、HBr的盐和硫酸氢盐的盐。
6. 实施方案1-5中的任一个的二肽，其中
R1是H或选自以下的氨基保护基：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps，且
R2是选自以下的氨基保护基：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps。
7. 实施方案1-5中的任一个的二肽，其中R1是H，且R2是选自以下的氨基保护基：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps。
8. 实施方案1-5中的任一个的二肽，其中R1是H，且R2是Fmoc。
9. 实施方案1-5中的任一个的二肽，其中R1是选自以下的氨基保护基：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps，且
R2是选自以下的氨基保护基：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps。
10. 实施方案1-5中的任一个的二肽，其中
R1是选自苄基和叔丁基的可除去的烷基，且
R2是H或选自苄基和叔丁基的可除去的烷基。
11. 实施方案1-5中的任一个的二肽，其中
R1是选自苄基和叔丁基的可除去的烷基，且
R2是H。
12. 实施方案1-5中的任一个的二肽，其中
R1是选自苄基和叔丁基的可除去的烷基，且
R2是选自苄基和叔丁基的可除去的烷基。
13. 实施方案1-12中的任一个的二肽，其中R3是H。
14. 实施方案1-12中的任一个的二肽，其中R3是与羧酸根基团形成盐的仲铵阳离子。
15. 实施方案1-12中的任一个的二肽，其中R3是与羧酸根基团形成盐的叔铵阳离子。
16. 实施方案1-12中的任一个的二肽，其中R3是与羧酸根基团形成盐的碱金属阳离子。
17. 实施方案1-12中的任一个的二肽，其中R3是与羧酸根基团形成盐的碱土金属阳离子。
18. 实施方案1-17中的任一个的二肽，其中R4不存在。
19. 实施方案1-17中的任一个的二肽，其中R4是选自以下的酸性盐：TFA的盐、HCl的盐、HBr的盐和硫酸氢盐的盐。
20. 根据实施方案1-19中的任一个的二肽，其中
R1是H；
R2是Fmoc；
R3是H；且
R4不存在或是酸性盐诸如TFA、HCl、HBr或HOAc。
21. 根据实施方案1-3中的任一个的二肽，所述二肽是
化学式2的Fmoc-His-Aib-OH
其中His是组氨酸，Aib是人工氨基酸2-氨基异丁酸，Fmoc是保护基9-芴基甲氧羰基，且R4不存在或是酸性盐诸如TFA、HCl、HBr或HOAc。
22. 根据实施方案1-3中的任一个的二肽，所述二肽是Fmoc-His-Aib-OH的TFA盐：
Fmoc-His-Aib-OH,TFA
其中His是组氨酸，Aib是人工氨基酸2-氨基异丁酸，Fmoc是保护基9-芴基甲氧羰基，且TFA是三氟乙酸。
23. 根据实施方案1-22中的任一个的二肽，所述二肽用活化剂诸如基于鏻的偶联剂诸如(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)活化。
24. 一种用于生产根据实施方案1-23中的任一个的二肽的方法。
25. 一种用于得到包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白的方法，其中所述方法包括下述步骤：使根据实施方案1-23中的任一个的二肽与多肽或蛋白反应。
26. 一种用于得到根据实施方案25的多肽或蛋白的方法，其中使所述二肽与多肽或蛋白在水性介质中反应。
27. 一种用于得到根据实施方案25的多肽或蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：使所述二肽与所述多肽或蛋白在水性介质中混合。
28. 一种用于得到根据实施方案25-27中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中在与多肽或蛋白的反应结束以后除去所述二肽的R1和/或R2。
29. 一种用于得到根据实施方案25-28中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中在去保护步骤中在碱性条件下除去所述二肽的R1和/或R2。
30. 一种用于得到根据实施方案25-29中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中在将哌啶加入到所述反应介质中的去保护步骤中，除去所述二肽的R1和/或R2。
31. 一种用于得到根据实施方案25-30中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中在与多肽或蛋白的酰化反应结束以后，在一个化学步骤中原位除去所述二肽的R1和/或R2 。
32. 一种用于得到根据实施方案25-31中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述多肽或蛋白是N端Fmoc保护的，所述方法包括这样的步骤：其中将N端Fmoc保护的多肽或蛋白在原位去保护。
33. 一种用于得到根据实施方案25-32中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：
　　1. 用基于鏻的偶联剂活化化学式1或化学式2的二肽
　　2. 使所述活化的二肽与多肽或蛋白反应
　　3. 在原位除去保护基(一个或多个)
由此得到最终的多肽或蛋白。
34. 一种用于得到根据实施方案33的多肽或蛋白的方法，其中在步骤2中，使所述活化的二肽与多肽或蛋白在水性介质中反应。
35. 一种用于得到根据实施方案26-34中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述水性介质包含一种或多种选自以下的水溶性的有机溶剂：DMF、NMP、DMAC、DMSO、乙腈、二噁烷、丁氧基-2-乙醇、水溶性的缩醛和水溶性的醇。
36. 一种用于得到根据实施方案35的多肽或蛋白的方法，其中所述一种或多种水溶性的有机溶剂是NMP。
37. 一种用于得到根据实施方案26-36中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述活化的二肽与多肽或蛋白在其中反应的水性介质包含10-100%的水。
38. 一种用于得到根据实施方案26-36中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述活化的二肽与多肽或蛋白在其中反应的水性介质包含约40%的水。
39. 一种用于得到根据实施方案26-38中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述水性介质的pH是在pH 7至pH 14之间。
40. 一种用于得到根据实施方案26-38中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述水性介质的pH是在pH 8.7至pH 9.4之间。
41. 一种用于得到根据实施方案26-38中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述水性介质的pH是约pH 9.1。
42. 一种用于得到根据实施方案26-38中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述水性介质的pH是约pH 9.3。
43. 一种用于得到根据实施方案26-38中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述水性介质包含缓冲液。
44. 一种用于得到根据实施方案25-38中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中所述包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白在溶液中得到。
45. 一种用于得到根据实施方案1-23中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中与所述二肽反应的多肽或蛋白被固定在固相上。
46. 用于得到根据实施方案1-23中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中使所述二肽与多肽或蛋白的α-N端反应。
47. 用于得到根据实施方案1-23中的任一个的多肽或蛋白的方法，其中要与所述二肽反应的多肽或蛋白是GLP-1肽。
实施例
缩写列表
ADO: 8-氨基-3,6-二氧杂辛酸
Aib: 2-氨基异丁酸
Alloc: 烯丙氧基羰基
Boc: 叔丁氧基羰基
Bpoc: 2-(对联苯基)-2-丙氧基羰基
Cbz: 苄氧基羰基
DCM: 二氯甲烷
DIC: N,N'-二异丙基碳二亚胺
DIPEA: N,N-二异丙基乙胺
DME: 二甲醚
dNBS: 2,4-二硝基苯磺酰基
EtOH: 乙醇
Fmoc: 9-芴基甲氧羰基
HBr: 氢溴酸
HCl: 盐酸
His: 组氨酸
HOAc: 乙酸
HOBt: 羟基苯并三唑
ivDde: 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基
Lys: 赖氨酸
MeCN: 乙腈
Mtt: 4-甲基三苯甲基
NMP: N-甲基-2-吡咯烷酮
Nps: 邻-或对-硝基苯基次磺酰基
Nsc: 2-(4-硝基苯基)磺酰基乙氧基羰基
oNBS: 邻-硝基苯磺酰基
OtBu: 叔丁氧基
pNBS: 对-硝基苯磺酰基
PyBOP: (苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐
TBME: 叔丁基甲基醚
TBTU: O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
TEA: 三甲胺
TFA: 三氟乙酸
TIPS: 三异丙基硅烷
Trt: 三苯基甲基。
实施例 1: 2-[(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(1H-咪唑-4-基)-丙酰基氨基]-2-甲基-丙酸三氟乙酸盐(替代名称: Fmoc-His-Aib-OH, TFA)
将Fmoc-His(Trt)-Aib-OH (1摩尔当量, 起始原料)悬浮于DCM (1,5 mL/g)中，并加入TIPS (1.7摩尔当量)。加入冷却(0-10℃)的TFA (3 mL/g)，并将混合物在环境温度搅拌，直到反应结束(高效液相色谱法(HPLC)转化)。加入DME (1 mL/g起始原料)和TBME (11 mL/g起始原料)，导致温度升高。使温度缓慢地恢复至室温(rt)，导致白色固体的沉淀。将混合物搅拌另外3小时并过滤。将沉淀物用TBME (3 mL/g起始原料)洗涤2次，并在真空中干燥过夜，以90%收率得到作为TFA盐的去三苯甲基化的二肽。
在冷冻温度(<-15℃±5℃)、冷藏温度(5℃±3℃)和室温(20℃±3℃)的稳定性研究显示出超过24个月的稳定性。
NMR数据：
。
实施例 2: N ε 26 [(S)-(22,40-二羧基-10,19,24-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十烷-1-酰基)] [Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)肽(替代名称: N ε 26 [2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基][Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)肽)
步骤1
二肽Fmoc-His-Aib-OH,TFA的原位活化(混合物I)：
在环境温度，向Fmoc-His-Aib-OH,TFA (4摩尔当量)和HOBt*H2O (4摩尔当量)的混合物中，加入NMP (4.7 mL/g二肽)。向搅拌溶液中加入TEA直到pH 8，同时使用冰浴使溶液温度保持在环境温度。在环境温度，将PyBOP (3.9摩尔当量)在NMP (2.4 mL/g二肽)中的溶液加入到含有二肽的溶液中。通过使用TEA，将反应混合物的pH调至pH 8。将混合物在环境温度搅拌20 min，然后加入到混合物II中。
用于酰化的肽(N ε 26 [(S)-(22,40-二羧基-10,19,24-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十烷-1-酰基)] [Arg34]GLP-1-(9-37)肽(替代名称: N ε 26 [2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七酰基氨基)-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基][Arg34]GLP-1-(9-37)肽)的制备(混合物II)：
将N ε 26 [(S)-(22,40-二羧基-10,19,24-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十烷-1-酰基)] [Arg34]GLP-1-(9-37)悬浮于40 w/w%的H2O在NMP中的溶液中(37 g肽/L溶剂混合物)。向冷却的混悬液中加入TEA直到pH 9.3。
步骤2：
肽N ε 26 [(S)-(22,40-二羧基-10,19,24-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十烷-1-酰基)] [Arg34]GLP-1-(9-37)肽的酰化(混合物III)：
在环境温度，将混合物I逐滴加入到混合物II中。加入以后，用TEA将pH重新调至pH 9.3 (pH计)。搅拌混合物直到最佳转化(通过HPLC测量)。
步骤3：
保护基(Fmoc)的除去
向混合物III中加入哌啶(20摩尔当量/二肽)，并将混合物在室温搅拌40 min。
Orbitrap m/z 1028,7 (4+) 1371,4 (3+)。
实施例 3：N ε26,N ε37-二[(S)-(22-羧基-33-(4-羧基苯氧基)-10,19,24-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂三十三烷-1-酰基)][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)肽(替代名称: N ε 26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-、N ε 37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8, Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽)的制备
步骤1: 侧链酰化
将[Arg34, Lys37]-GLP-1-(9-37)-肽作为等电沉淀的沉淀物（isoprecipitated pellet）(15 g，大约13%w/w的肽含量，~93%的纯度)悬浮于水(50 mL)中，并加入NaOH (水溶液) (1 M; 1150 μL)以溶解所述肽。将得到的溶液(57 mL)转移至滴定器设备中的150 mL反应室。测得溶液的pH为10.6。通过滴定计用稀NaOH (水溶液) (0.5 M, 0.67 mL)将pH调至11.3，并将体积用水调至60 mL，得到大约33 mg/mL的最终肽浓度。测定溶液至[Arg34, Lys37]-GLP-1-(9-37)-肽的标准曲线，得到1.71 g的校正肽含量。使用1.71 g肽得到28.5 mg/mL的校正溶液浓度。将活化的侧链(S)-(22-羧基-33-(4-羧基苯氧基)-10,19,24-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂三十三烷酸[2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基]酯(替代名称: (4-[9-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2-羟基-5-氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨甲酰基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨甲酰基}-丙基氨甲酰基)-壬基氧基]-苯甲酸)，作为83%活性酯，1.73 g 3.3当量)溶解在NMP (4.8 mL)中，得到5.20 mL溶液(0.63当量/mL)。将侧链的NMP溶液以恒定速率从注射泵缓慢地加入，用控制NaOH水溶液(水溶液) (0.5 M)的加入的滴定计保持pH恒定在11.3。历时1小时10分钟加入3.90 mL (2.4当量)的侧链(~2当量/h)。超高效液相色谱法(UPLC)分析表明酰化几乎结束，并继续加入至共2.8当量的侧链(4.43 mL)。在加入过程中，通过滴定计加入共(16.71 mL; 8.4 mmol) 0.5 N NaOH (水溶液)。
步骤2: 等电沉淀
将反应混合物与水一起转移至4 x 50 mL离心管形瓶(各22 mL)，并通过加入浓乙酸将各自的pH调至4.8，以得到白色沉淀物。加入EtOH (2.2 mL，至共约10%v/v)。将沉淀物离心，并不经进一步纯化用在下一步中。
步骤3：二肽的连接
将等电沉淀物悬浮于NMP (48 mL; 50 mg肽/mL)中，并加入DIPEA (656 μL)。在用900 μL水稀释的100 μL混合物的样品中，测得得到的溶液的pH为pH= 9.6。
通过Karl Fischer滴定，测得料浆的含水量为1.4%。加入水(9.12 mL)，以得到约20%的含水量。
将Fmoc-His-Aib-OH.TFA; 1058 mg, 3.5当量)用在NMP中的HOBt (248 mg; 3.5当量)、PyBOP (907 mg, 3.325当量)和三乙胺(545 μL)活化15分钟。用湿pH棒测得pH为4-5。将混合物加入到肽溶液中，并用三乙胺将pH调至pH 9.3 (通过测量加入到水(900 μL)中的反应混合物(100 μL)的样品)。1 h以后，UPLC表明几乎完全转化为期望的产物。
步骤4: Fmoc去保护
向得自连接步骤的反应混合物中加入哌啶(3.35 mL, (5%v/v))，并将混合物搅拌25分钟，此后UPLC分析表明完全转化为产物。加入水，以得到1:1 NMP-水溶液，并用乙酸将pH调至8.5，并通过标准色谱法纯化产物。
分析：
RP-UPLC: BEH C18, 150*1mm，45℃和0.1ml/min；梯度为：30-60%的0.04%TFA在MeCN中的溶液(B洗脱液)保持30 min，然后升高至90%B，总运行时间38 min。UV: 215nm, 5Hz
Synapt高分辨力质谱法(HDMS)：m/z 200-2500 (1Hz)的正ES-MS模式。V(帽)：3kV；V(锥)：28V；去溶剂化气体250℃, 750l/h；锥气体50l/h, 110℃
Rt = 15.18 min
准确质量: 4885,4477 Da；实测：M/4: 1222.35; M/3: 1629.45。
实施例 4：N ε 26[(S)-(22-羧基-33-(4-羧基苯氧基)-10,19,24-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂三十三烷-1-酰基)][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)肽(替代名称:N ε 26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8, Arg34, Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽)的制备：
使用固相肽合成法合成所述肽：
向1.04 g树脂Fmoc-Lys(Boc)-Wang-LL (当量0.24 mmol/g)中以逐步方式加入4摩尔当量标准Fmoc/OtBu方案保护的氨基酸或Ser-Ser假脯氨酸或Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH。使筒中的活化氨基酸(4摩尔当量)与4摩尔当量DIC和4摩尔当量HOBt在NMP中反应7分钟。将得到的肽与树脂一起转移至反应容器并反应30 min。加入DIPEA (4摩尔当量)，并继续反应30 min。将树脂用NMP流式洗涤，随后使用20%哌啶(10ml, 20 min)去保护。将树脂再次用NMP流式洗涤。
MTT去保护：
在DCM中洗涤树脂。加入1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(10 ml持续10 min)，并将树脂排液。将去保护操作重复共计4次。将树脂用DCM洗涤，随后用NMP洗涤。
向(S)-22-(叔丁氧基羰基)-33-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)-10,19,24-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂三十三烷-1-酸、HOBt (4摩尔当量)和DIPEA (4摩尔当量)在NMP (10 ml)中的混合物中，加入作为固体的TBTU (3.8摩尔当量)，并将混合物摇动15 min，然后加入到树脂中。2小时以后，将树脂排液，并用NMP和DCM流式洗涤。
将肽基树脂在NMP (10 mL)中在环境温度溶胀10 min。将容器排液。将20体积%的哌啶在NMP中的溶液(20 mL)加入到树脂中。将混合物在环境温度溶胀20 min。将二肽Fmoc-L-His-Aib-OH.TFA (580 mg)和HOBt.H2O (153 mg)放入20 mL瓶中。加入NMP (4 mL)。向混合物中加入TEA (650µL)直到pH 8 (pH棒)。向反应混合物中加入PyBOP (500 mg)在NMP中的溶液(4 mL)。向反应混合物中再次加入TEA (200µL)直到pH 8 (pH棒)。将混合物在环境温度搅拌35 min。将容器排液。将20体积%的哌啶在NMP中的溶液(20 mL)再次加入到树脂中(双重去保护)。将混合物在环境温度溶胀20 min，并将树脂排液。将树脂用NMP (50 mL)、DCM (50 mL)和NMP (50 mL)(3次)流式洗涤。最后，将树脂用DCM流式洗涤并排液。用TFA、H2O和TIPS的混合物(95%、2.5%、2.5%)，从树脂切割肽3小时。将得到的切割的肽在乙醚中沉淀，并通过过滤进行分离。
TOF MS ES+: m/z，实测值m/4 (1045.54)，计算值m/4 (1045.5)。
尽管在本文中已经解释和描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在可以做出许多修改、替换、变化和等同方案。因此，应当理解，所附权利要求意图涵盖落入本发明的真实精神内的所有这样的修改和变化。

Claims (15)

1.化学式1的二肽：
其中
R1是H或氨基保护基，且R2是氨基保护基；或者
R1是可除去的烷基，且R2是H或可除去的烷基；或者
R1和R2共同形成环；
R3是H或与羧酸根基团形成盐的仲铵阳离子、叔铵阳离子或金属阳离子；且
R4不存在或是酸性盐。
2.权利要求1的二肽，其中所述氨基保护基选自：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps。
3.权利要求1或2的二肽，其中所述可除去的烷基选自：苄基和叔丁基。
4.权利要求1-3中的任一项的二肽，其中，当R1和R2共同形成环时，所述共同形成的环选自：酞酰亚胺和1,3,5-二噁嗪。
5.权利要求1-4中的任一项的二肽，其中
R1是H或选自以下的氨基保护基：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps，且R2是选自以下的氨基保护基：Boc、Trt、Bpoc、Fmoc、Nsc、Cbz、Alloc、oNBS、pNBS、dNBS、ivDde和Nps；或者
R1是选自苄基和叔丁基的可除去的烷基，且R2是H或选自苄基和叔丁基的可除去的烷基；或者
R1和R2共同形成选自以下的环：酞酰亚胺和1,3,5-二噁嗪；
R3是H或与羧酸根基团形成盐的仲铵阳离子、叔铵阳离子、碱金属阳离子或碱土金属阳离子；且
R4不存在，或是选自以下的酸性盐：TFA的盐、HCl的盐、HBr的盐和硫酸氢盐的盐。
6.权利要求1-5中的任一项的二肽，其中R4不存在。
7.权利要求1-5中的任一项的二肽，其中R4是选自以下的酸性盐：TFA的盐、HCl的盐、HBr的盐和硫酸氢盐的盐。
8.根据权利要求1-3中的任一项的二肽，所述二肽是
化学式2的Fmoc-His-Aib-OH
其中His是组氨酸，Aib是人工氨基酸2-氨基异丁酸，Fmoc是保护基9-芴基甲氧羰基，且R4不存在或是酸性盐诸如TFA、HCl、HBr或HOAc。
9.根据权利要求1-3中的任一项的二肽，所述二肽是Fmoc-His-Aib-OH的TFA盐：
Fmoc-His-Aib-OH,TFA
其中His是组氨酸，Aib是人工氨基酸2-氨基异丁酸，Fmoc是保护基9-芴基甲氧羰基，且TFA是三氟乙酸。
10.根据权利要求1-9中的任一项的二肽，所述二肽用活化剂诸如基于鏻的偶联剂诸如(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)活化。
11.一种用于生产根据权利要求1-10中的任一项的二肽的方法。
12.一种用于得到包含一个或多个非成蛋白质性的氨基酸的多肽或蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：使根据权利要求1-10中的任一项的二肽与多肽或蛋白反应。
13.一种用于得到根据权利要求12的多肽或蛋白的方法，其中在去保护步骤中在碱性条件下除去所述二肽的R1和/或R2。
14.一种用于得到根据权利要求12-13中的任一项的多肽或蛋白的方法，其中所述水性介质的pH是在pH 8.7至pH 9.4之间。
15.用于得到根据权利要求12-14中的任一项的多肽或蛋白的方法，其中使所述二肽与所述多肽或蛋白的α-N端反应。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106928340A (zh) * 2015-12-31 2017-07-07 深圳翰宇药业股份有限公司 一种利西拉来的制备方法
ES2835033T3 (es) 2016-03-03 2021-06-21 Novo Nordisk As Derivados de GLP-1 y sus usos
CN108883305B (zh) 2016-03-11 2021-03-16 英特塞普特医药品公司 3-脱氧衍生物及其药物组合物
EP3534962B1 (en) 2016-11-07 2020-08-19 Novo Nordisk A/S Dchbs-active esters of peg compounds and their use
TW201918494A (zh) 2017-07-19 2019-05-16 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 雙功能性化合物
WO2020190757A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Novetide Ltd. Improved processes for the preparation of semaglutide
US20240124520A1 (en) * 2019-10-16 2024-04-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University N-acylated histidine dipeptides as anticancer agents
KR102647938B1 (ko) * 2020-09-14 2024-03-15 엘지전자 주식회사 이차전지의 파우치 두께 측정장치

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007147816A1 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Insulinotropic peptide synthesis
WO2009083549A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Novo Nordisk A/S Semi-recombinant preparation of glp-1 analogues
WO2010125079A2 (en) * 2009-05-01 2010-11-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Insulinotropic peptide synthesis using solid and solution phase combination techniques

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705483A (en) 1993-12-09 1998-01-06 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptides, compositions and methods
US6458924B2 (en) 1996-08-30 2002-10-01 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
US6277819B1 (en) 1996-08-30 2001-08-21 Eli Lilly And Company Use of GLP-1 or analogs in treatment of myocardial infarction
DE122009000079I2 (de) 1996-08-30 2011-06-16 Novo Nordisk As Novo Alle Glp-1 derivate
JP2002510193A (ja) 1997-03-31 2002-04-02 イーライ・リリー・アンド・カンパニー グルカゴン様ペプチド−１類似体
CN1352034A (zh) * 2000-11-10 2002-06-05 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——二肽氨基肽酶iv相关蛋白(dppx)9.24和编码这种多肽的多核苷酸
US7595172B2 (en) 2001-07-24 2009-09-29 Novo Nordisk A/S Method for making acylated polypeptides
BRPI0414539B8 (pt) 2003-09-19 2021-05-25 Novo Nordisk As composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto
BRPI0417684A (pt) 2003-12-18 2007-03-20 Novo Nordisk As composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto
BRPI0512988A (pt) 2004-07-08 2008-04-22 Novo Nordisk As método para aumentar a meia-vida plasmática de uma molécula, composto, uso do mesmo, e, composição farmacêutica
WO2006037810A2 (en) 2004-10-07 2006-04-13 Novo Nordisk A/S Protracted glp-1 compounds
TWI372629B (en) 2005-03-18 2012-09-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
WO2006097536A2 (en) 2005-03-18 2006-09-21 Novo Nordisk A/S Dimeric peptide agonists of the glp-1 receptor
AU2006224537A1 (en) 2005-03-18 2006-09-21 Novo Nordisk A/S Extended GLP-1 compounds
CN101151369B (zh) * 2005-03-29 2017-02-15 协和发酵生化株式会社 二肽的结晶及其制备方法
WO2009147816A1 (ja) 2008-06-02 2009-12-10 国立大学法人鳥取大学 ヘテロポリ酸分解触媒及びそれを用いるディーゼル燃料油の製造方法
EP2512518A1 (en) 2009-12-16 2012-10-24 Novo Nordisk A/S Glp-1 receptor agonist compounds with a modified n-terminus

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007147816A1 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Insulinotropic peptide synthesis
WO2009083549A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Novo Nordisk A/S Semi-recombinant preparation of glp-1 analogues
WO2010125079A2 (en) * 2009-05-01 2010-11-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Insulinotropic peptide synthesis using solid and solution phase combination techniques

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