ES2682253T3 - Dipéptido que comprende un aminoácido no proteogénico - Google Patents

Abstract

Un método de obtención de un polipéptido o proteína final que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos, en el que el método comprende una etapa de hacer reaccionar un dipéptido con un primer polipéptido o proteína, y dicho dipéptido es de Fórmula 1:**Fórmula** en la que R1 es H o un grupo protector de amino, y R2 es un grupo protector de amino; o R1 es un grupo alquilo extraíble, y R2 es H o un grupo alquilo extraíble; o R1 y R2 forman conjuntamente un anillo; R3 es H, o un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión metálico que forma una sal con el grupo carboxilato; y R4 está ausente o es una sal de ácido.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

DESCRIPCIÓN

Dipéptido que comprende un aminoácido no proteogénico CAMPO TÉCNICO

La presente invención está relacionada con un dipéptido que comprende un aminoácido no proteogénico, métodos de su preparación y métodos de uso de dicho dipéptido para producir un polipéptido o proteína que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos.

ANTECEDENTES

Se han autorizado un gran número de polipéptidos y proteínas para su uso en la práctica médica. Los polipéptidos y proteínas se pueden producir en células hospedadoras adecuadas por tecnología de ADN recombinante o se pueden producir sintéticamente por tecnología bien establecida de síntesis de péptidos. Sin embargo, los polipéptidos y proteínas nativos tienden a presentan altas tasas de eliminación que son inaceptables para muchas indicaciones clínicas donde se requiere una alta concentración plasmática del polipéptido durante un periodo de tiempo prolongado.

Los polipéptidos y proteínas nativos se pueden alterar de la forma natural a análogos y derivados de los mismos para cambiar o potenciar ciertas características. Por ejemplo, se pueden añadir o sustituir aminoácidos no proteogénicos (es decir, aminoácidos no naturales) en polipéptidos o proteínas para, por ejemplo, conferir una cierta protección contra la hidrólisis (tal como hidrólisis por dPp-IV de péptidos GLP-1).

Se pueden preparar polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos no proteogénicos tales como análogos de GLP-1 modificados en el extremo N introduciendo el (los) aminoácido(s) no proteogénico(s) mediante síntesis química de una manera escalonada en la que se aplica una etapa de acoplamiento, seguido por una etapa de desprotección para cada aminoácido que se añade al polipéptido o proteína.

Sin embargo, la síntesis escalonada requiere mucho tiempo y es inapropiada, puede conducir a la formación de muchos subproductos, se pueden necesitar etapas intermedias de purificación, y puede dar como resultado una cantidad significativa de racemización de algunos restos de aminoácidos tales como los restos de histidina.

Alternativamente, se puede acoplar al polipéptido o proteína restante un fragmento de péptido que incluye el (los) aminoácido(s) no proteogénico(s) donde se usa en el método el fragmento completamente protegido, tal como, por ejemplo, un fragmento protegido en el grupo amino del extremo N y los grupos amino de cadena lateral.

Sin embargo, tal fragmento de péptido puede no ser soluble en medios acuosos limitando su uso. Además, se necesitan varias etapas de desprotección si están presentes en el fragmento grupos protectores ortogonales y si se aísla, se pueden necesitar entre las etapas sintéticas purificaciones intermedias, y pueden ocurrir problemas de aislamiento intermedio.

El documento WO 2009/083549 está relacionada con un método para la preparación de análogos y derivados de GLP-1 que contienen aminoácidos no proteogénicos. Las solicitudes de patente WO 2007/147816 A1 y WO 2010/125079 A2 están relacionadas con el acoplamiento sintético de fragmentos de péptido. Bourgault, S. et al. describen en PEPTIDES, vol. 29, no. 6(1), junio de 2008, páginas 919-932, el uso de química convencional de péptidos.

Todavía se necesita un fragmento de péptido para su uso en un método mejorado de obtención polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos no proteogénicos.

SUMARIO

La presente invención está relacionada con métodos de obtención de un polipéptido o proteína final que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos, en la que el método comprende una etapa de hacer reaccionar un dipéptido con un primer polipéptido o proteína, y dicho dipéptido es de Fórmula 1:

imagen1

en la que

R1 es H o un grupo protector de amino, y R2 es un grupo protector de amino; o

2

5

10

15

20

25

30

35

40

R1 es un grupo alquilo extraíble, y R2 es H o un grupo alquilo extraíble; o R1 y R2 forman conjuntamente un anillo;

R3 es H, o un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión metálico que forma una sal con el grupo carboxilato; y

R4 está ausente o es una sal de ácido.

También se contempla un método de producción de un dipéptido de la invención.

La invención también puede resolver además problemas que serán evidentes a partir de divulgación de las realizaciones a modo de ejemplo

DESCRIPCIÓN

La presente invención está relacionada con un método de obtención de un polipéptido o proteína que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos que comprende uso de un dipéptido que comprende un aminoácido no proteogénico, en la que el dipéptido es adecuado para el acoplamiento a un polipéptido o proteína.

En un aspecto, el dipéptido para su uso en la invención tiene un resto de imidazolilo sin proteger libre. En un aspecto, el dipéptido para su uso en la invención está en forma de una sal de ácido carboxílico.

En un aspecto de la invención, el dipéptido es de Fórmula 1:

imagen2

en la que

R1 es H o un grupo protector de amino tal como, pero no se limita a, Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde o Nps, y R2 es un grupo protector de amino tal como, pero no se limita a, Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde o Nps; o

R1 es un grupo alquilo extraíble tal como, pero no se limita a, bencilo o terc-butilo, y R2 es H o un grupo alquilo extraíble tal como, pero no se limita a, bencilo o terc-butilo; o

R1 y R2 forman conjuntamente un anillo tal como, pero no se limita a, ftalimida o 1,3,5-dioxazina;

R3 es H, o un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión metálico, tal como un catión de metal alcalino o un catión de metal alcalinotérreo, que forma una sal con el grupo carboxilato; y

R4 está ausente o es una sal de ácido tal como, pero no se limita a, una sal de TFA, HCI, HBr o hidrógeno sulfato.

En un aspecto de la invención, R1 es H y R2 es un grupo protector de amino tal como, pero no se limita a, Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde o Nps; o R1 y R2 forman conjuntamente un anillo tal como, pero no se limita a, ftalimida o 1,3,5-dioxazina; o R1 es un grupo alquilo extraíble tal como, pero no se limita a, bencilo o terc-butilo y R2 es H o un grupo alquilo extraíble tal como, pero no se limita a, bencilo o terc-butilo.

En un aspecto, R1 es H y R2 es un grupo protector sensible a bases tal como, pero no se limita a, Fmoc. En un aspecto, R1 es H y R2 es Fmoc.

Cuando se usa en el presente documento, el término "grupo protector de amino" se debe entender como un grupo protector (término alternativo: grupo protector) conocidos para el experto en la materia de la química de los péptidos que se introduce en el dipéptido por modificación química de un grupo de amina (funcional) con el fin de prevenir la reacción en la mismísima amina durante una reacción química.

Cuando se usa en el presente documento, el término "grupo alquilo extraíble" se debe entender como un grupo alquilo, tal como, pero no se limita a, un grupo bencilo, que puede eliminarse por metodología de hidrogenólisis catalítica. En un aspecto de la invención, R1 es bencilo y R2 es H.

R3 puede ser hidrógeno, un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión metálico, en el que el catión de amonio secundario, el catión de amonio terciario o el catión metálico forma una sal con el grupo carboxilato al que es adyacente. En un aspecto de la invención, el catión metálico es un catión de metal alcalino o un catión de metal alcalinotérreo. En un aspecto, R3 está seleccionado del grupo que consiste en: H, catión de litio, 5 catión de sodio, catión de potasio, catión de cesio, catión de calcio, catión de magnesio, un catión derivado de una amina secundaria tal como, pero no se limita a, catión de N,N-diciclohexilamonio, catión de N,N-di-terc-butilamonio o un catión derivado de una amina terciaria tal como, pero no se limita a, catión de trietilamonio.

En un aspecto de la invención, R3 es H. En un aspecto, R3 junto con el grupo carboxilato al que es adyacente forma una sal, tal como, pero no se limita a, una sal monovalente, una sal bivalente, o una sal derivada de una amina.

10 Según un aspecto de la invención, R3 puede ser un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión metálico, tal como un catión de metal alcalino o un catión de metal alcalinotérreo, que forma una sal con el grupo carboxilato al que es adyacente. La sal entre R3 y el grupo carboxilato puede ser, por ejemplo, una sal monovalente, tal como, pero no se limita a, una sal alcalina que incluye una sal de litio, una sal de sodio, una sal de potasio o una sal de cesio, una sal bivalente tal como, pero no se limita a, una sal de calcio o una sal de magnesio, 15 una sal derivada de una amina secundaria tal como, pero no se limita a, N,N-diciclohexilamina o N,N-di-terc- butilamina o una sal derivada de una amina terciaria tal como, pero no se limita a, trietilamina.

Se ha descubierto de manera sorprendente por los inventores que el dipéptido para su uso en la invención donde R3 es H, o es un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión metálico que forma una sal con el grupo carboxilato al que es adyacente, y R4 está ausente o es una sal de ácido, es particularmente bueno en, por 20 ejemplo, una reacción acuosa de acilación donde el dipéptido se hace reaccionar con un péptido o polipéptido.

En un aspecto de la invención, R4 está ausente. En un aspecto, R4 es un componente ácido que forma una sal con el dipéptido. En un aspecto, R4 se selecciona del grupo que consiste en: TFA, HCI, HBr e hidrógeno sulfato. En un aspecto, R4 es TFA.

En un aspecto, el dipéptido para su uso en la invención es el dipéptido enantiomérico o racémico Fmoc-His-Aib-OH 25 de Fórmula 2

imagen3

en la que * indica el centro quiral del dipéptido y R4 está ausente o es un componente ácido tal como, pero no se limita a, TFA, HCI, HBr o hidrógeno sulfato, formando dicho componente ácido una sal con el dipéptido. En un aspecto, R4 es TFA.

30 En el presente documento, el término "enantiomérico" en una muestra de compuestos se debe entender como un exceso de una forma enantiomérica, es decir, cualquiera de la forma L o D, en la muestra. Cuando se usa en el presente documento, el término "racémico" se debe entender como cantidades equivalentes de la forma L y D en una muestra de compuestos. Como ejemplo no limitante, el resto de histidina de Fmoc-His-Aib-OH enantiomérico de Fórmula 2 puede estar en forma de L-histidina o D-histidina.

35 En un aspecto de la invención, el dipéptido de Fórmula 1 o Fórmula 2 se activa por un agente de activación conocido por un experto en la materia. En un aspecto, el dipéptido de Fórmula 1 o Fórmula 2 se activa por un reactivo de acoplamiento basado en fosfonio. En un aspecto, el reactivo de acoplamiento basado en fosfonio se selecciona del grupo que consiste en: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1- 40 iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyAOP), hexafluorofosfato de 6-cloro-benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidinofosfonio (PyClocK), hexafluorofosfato de 0-[(1-ciano-2-etoxi-2-oxoetiliden)amino]-oxitri(pirrolidin-1-il)fosfonio PyOxP, tetrafluoroborato de O-[(1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilidene)amino]-oxitri(pirrolidin-1-il)fosfonio (PyOxB). En un aspecto, el reactivo de acoplamiento basado en fosfonio es hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP).

El término "reactivo de acoplamiento basado en fosfonio" se debe entender en el presente documento como un 45 reactivo de acoplamiento que contiene una sal de fosfonio que, cuando reacciona in situ con un ácido carboxílico, forma un ácido carboxílico activado que reacciona con un polipéptido o proteína.

El dipéptido para su uso en la invención es sorprendentemente estable y tiene una larga estabilidad en almacén.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Cuando se usa en el presente documento el término "estabilizado" o "estable" cuando se refiere a un dipéptido para su uso en la invención, se refiere a un dipéptido con elevada estabilidad química, elevada estabilidad física o elevada estabilidad física y química.

En un aspecto, un dipéptido para su uso en la invención es estable durante más de 6 semanas de uso y durante más de 2 años de almacenamiento. En otro aspecto, un dipéptido para su uso en la invención es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de dos años de almacenamiento. En un aspecto adicional, un dipéptido para su uso en la invención es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento. En aún aspecto adicional, un dipéptido para su uso en la invención es estable durante más de 2 semanas de uso y durante más de 1 año de almacenamiento.

Cuando se usa en el presente documento el término "temperatura ambiente" significa la temperatura de los alrededores. En condiciones interiores, la temperatura ambiente es la misma que la temperatura de la habitación y puede ser, por ejemplo, 25 °C.

El dipéptido para su uso en la invención es fácil de manipular y es fácil el uso del mismo en la química de los péptidos en comparación con la síntesis convencional etapa a etapa de péptidos en fase sólida debido a la reducida cantidad de etapas de modificación química, tales como las etapas de desprotección y activación.

En un aspecto, el dipéptido para su uso en la invención se usa en un proceso para acoplar covalentemente el dipéptido a un polipéptido o proteína. En un aspecto, el dipéptido se usa en un proceso para acoplar el dipéptido a la amina del extremo N de un polipéptido o proteína. En un aspecto, el dipéptido se usa en un proceso para acoplar el dipéptido a nucleófilos en otras moléculas que no pertenecen al grupo químico de los polipéptidos y/o proteínas.

En un aspecto, el polipéptido o proteína al que se acopla el dipéptido consiste en aminoácidos proteogénicos, es decir, el polipéptido o proteína al que se acopla el dipéptido no comprende ningún aminoácido no proteogénico.

En un aspecto de la invención, el dipéptido de Fórmula 1 o Fórmula 2 se usa para acoplar dicho dipéptido a un polipéptido o proteína para formar un enlace amida entre el grupo carboxilato del dipéptido de Fórmula 1, es decir, el grupo funcional que contiene R3, o el ácido carboxílico de Fórmula 2 y una amina libre de un polipéptido o proteína. En un aspecto, el dipéptido de Fórmula 1 o Fórmula 2 se hace reaccionar con un polipéptido o proteína en un medio acuoso para formar un enlace amida entre el ácido carboxílico del dipéptido de Fórmula 1 o Fórmula 2 y la amina del extremo N de un polipéptido o proteína.

Según un aspecto de la invención, R1 y/o R2 se eliminan después de la finalización de la reacción con un polipéptido o proteína. En un aspecto, R1 y/o R2 se eliminan en una etapa química. En un aspecto, R1 y/o R2 se eliminan en una etapa de desprotección en condiciones básicas. En un aspecto, R1 y/o r2 se eliminan en una etapa de desprotección que comprende añadir base al medio de reacción. En un aspecto, R1 y/o R2 se eliminan en una etapa de desprotección que comprende añadir una amina al medio de reacción. En un aspecto, R1 y/o R2 se eliminan en una etapa de desprotección que comprende añadir piperidina al medio de reacción.

En un aspecto de la invención, R1 y/o R2 se eliminan in situ en una etapa química después de la finalización la reacción de acilación con un polipéptido o proteína.

Según un aspecto, el dipéptido para su uso en la invención se puede usar en un método de obtención de un polipéptido o proteína que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos. En un aspecto, la reacción se lleva a cabo en disolución. En un aspecto, el dipéptido activado para su uso en la invención se hace reaccionar con un polipéptido o proteína disuelto en un medio acuoso. En un aspecto, la reacción de acoplamiento se lleva a cabo en una síntesis de péptidos en fase sólida como se conoce por el experto en la materia. Se ha encontrado por los inventores que usando dicho método de obtención de un polipéptido o proteína que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos y un histidina en el extremo N de los mismos, se obtiene un polipéptido o producto de proteína en que no está racemizado o solo ligeramente el resto de histidina.

En un aspecto, el método de obtención de un polipéptido o proteína que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos comprende las siguientes etapas:

1. activar el dipéptido con un reactivo de acoplamiento basado en fosfonio

2. hacer reaccionar el dipéptido activado con un polipéptido o proteína

3. eliminar el (los) grupo(s) protector(es) in situ por el cual se obtiene el polipéptido o proteína final.

En un aspecto, el método de obtención de un polipéptido o proteína que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos comprende las siguientes etapas:

1. activar el dipéptido de Fórmula 1 o Fórmula 2 con un reactivo de acoplamiento basado en fosfonio

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2. hacer reaccionar el dipéptido activado con un polipéptido o proteína

3. eliminar el (los) grupo(s) protector(es) in situ por el cual se obtiene el polipéptido o proteína final.

En un aspecto, el dipéptido activado se hace reaccionar con un polipéptido o proteína en un medio acuoso. Como se usa en el presente documento, los términos "medio acuoso" o "medios acuosos" incluyen cualquier medio basado en agua, por ejemplo, agua, solución salina, una disolución de azúcar, una disolución para transfusión, un tampón, y cualquier otro medio basado en agua fácilmente disponible. Además, un medio acuoso puede contener uno o más disolventes orgánicos solubles en agua tales como, pero no se limitan a, dimetilformamida (DMF), N-metil-2- pirrolidona (NMP), dimetilacetamida (DMAC), sulfóxido de dimetilo (DMSO), acetonitrilo, dioxano, un acetal soluble en agua tal como, por ejemplo, dimetilacetal, dietilacetal o 1,3-dioxalano y un alcohol soluble en agua tal como, por ejemplo, metanol, etanol, propanol, 2-propanol y butoxi-2-etanol.

En un aspecto, el medio acuoso en el que se hace reaccionar el dipéptido activado con un polipéptido o proteína comprende 100-10% de agua y así 0-90% de disolvente(s) adicional(es), donde ejemplos no limitantes de disolventes adicionales se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en DMF, NMP, DMAC, DMSO, acetonitrilo, dioxano, un acetal soluble en agua tal como, por ejemplo, dimetilacetal, dietilacetal o 1,3-dioxalano y un alcohol soluble en agua tal como, por ejemplo, metanol, etanol, propanol, 2-propanol y butoxi-2-etanol. En un aspecto, el medio acuoso comprende 80-20 % de agua, tal como 60-30 % de agua. En un aspecto, el medio acuoso comprende 50-30 % de agua. En un aspecto, el medio acuoso comprende aproximadamente 50 % de agua. En un aspecto, el medio acuoso comprende aproximadamente 40 % de agua. En un aspecto, el medio acuoso comprende aproximadamente 30 % de agua.

En un aspecto de la invención, el dipéptido se disuelve en un disolvente orgánico aprótico o una mezcla del mismo tal como, pero no se limita a, DMF, NMP, DMAC, DMSO, acetonitrilo y dioxano, antes de que se añada al medio acuoso en el que se hace reaccionar con un péptido o polipéptido.

Cuando se usa en el presente documento el término "aprótico", se usa para disolventes tales como, por ejemplo, acetona o diclorometano que tienden a tener grandes momentos dipolares, es decir, separación de cargas parciales positivas y parciales negativas dentro de la misma molécula, y especies positivamente cargadas de solvato mediante su dipolo negativo. Ejemplos de disolventes apróticos incluyen, pero no se limita a, diclorometano (DCM), tetrahidrofurano (THF), acetato de etilo, acetona, DMF, NMP, DMAC, DMSO, acetonitrilo, dioxano y carbonato de propileno.

En un aspecto, el dipéptido activado se hace reaccionar con un polipéptido o proteína en fase sólida usando un procedimiento conocido por el experto en la materia de la química de los péptidos, como se describe, por ejemplo, en ISBN 0-7167-7009-1 "Synthetic Peptides", ed. Gregory A. Grant.

En un aspecto, el reactivo de acoplamiento basado en fosfonio es PyBOP. En un aspecto, el grupo protector es Fmoc. En un aspecto, se obtiene el polipéptido o proteína final en disolución.

En un aspecto, el grupo protector se elimina en condiciones básicas. En un aspecto, el grupo protector se elimina a un pH que es al menos 7. En un aspecto, el grupo protector se elimina por piperidina, DBU (1,8-diazabicicloundec-7- eno) o terc-butilamina.

En un aspecto de la invención, el pH de la mezcla acuosa de reacción en la etapa de acilación se ajusta a entre pH 7 y pH 14. En un aspecto, el pH del medio de reacción es entre pH 8 y pH 13. En otro aspecto, el pH es entre pH 8 y pH 12. En otro aspecto, el pH es entre pH 8 y pH 10. En otro aspecto, el pH es entre pH 8,3 y pH 9,7.

La "mezcla de reacción" se entiende en el presente documento como la mezcla de disolventes y reactivos usada cuando se hace reaccionar el dipéptido para su uso en la invención con un polipéptido o proteína. La mezcla de reacción puede ser acuosa, es decir, está presente agua en la mezcla de reacción.

El pH de la mezcla de reacción se puede controlar por medios conocidos para el experto en la materia. Por ejemplo, se puede usar una simple prueba de papel de pH (tira de pH) o un pH-metro para medir el pH y se puede añadir manualmente ácido o base para ajustar el pH, o se puede usar un pH-metro con un mecanismo de retroalimentación, que puede controlar el pH de la disolución.

Ácidos adecuados para ajustar el pH incluyen, pero no se limitan a: Ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, hidrógeno sulfato, ácido fosfórico, ácido cítrico y ácido acético.

Bases adecuadas para ajustar el pH incluyen, pero no se limitan a: Bases de amina terciaria tales como, pero no se limitan a, trietilamina o diisopropiletilamina, N-metilmorfolina, hidróxidos de metales alcalinos tales como, pero no se limitan a, hidróxido de litio, hidróxido sódico, hidróxido potásico o hidróxido de cesio y carbonatos alcalinos tales como, pero no se limitan a, carbonato de potasio, carbonato sódico, carbonato de litio, hidrógeno carbonato de potasio, hidrógeno carbonato de sodio o hidrógeno carbonato de litio.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

En un aspecto de la invención, la mezcla de reacción comprende un tampón. En un aspecto de la invención, el tampón se selecciona del grupo que consiste en: Tampón fosfato, tampón carbonato sódico, tampón bicina N,N- bis(2-hidroxietil)glicina, tampón HEPPS (tampón ácido 3-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]propanosulfónico), tampón HEPES (tampón ácido 4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico), tampón MOPS (tampón ácido 3-(N- Morfolino)propanosulfónico) y tampón TEA (tampón trietilamina). En un aspecto de la invención, la mezcla de reacción comprende un tampón TEA (tampón trietilamina).

Antes de la adición a la mezcla de reacción, el dipéptido se puede activar, es decir, la funcionalidad de ácido carboxílico del dipéptido se puede convertir en un éster activado de dicho ácido carboxílico. Cuando se activa el dipéptido de la invención, la temperatura de la mezcla de reacción durante la etapa de activación puede estar entre - 5 °C y 50 °C, tal como entre 0 °C y 50 °C. En un aspecto, la temperatura es entre 5 °C y 40 °C. En otro aspecto, la temperatura es entre 10 °C y 35 °C. En un aspecto adicional, la temperatura es entre 15 y 25 °C. En aún un aspecto adicional, la temperatura es aproximadamente 20 °C durante la etapa de activación.

La temperatura de la mezcla de reacción durante la etapa de acilación, donde el dipéptido activado para su uso en la invención se hace reaccionar con un polipéptido o proteína, puede ser entre -5 °C y 50 °C tal como entre 0 °C y 50 °C. En un aspecto, la temperatura es entre 5 °C y 40 °C. En otro aspecto, la temperatura es entre 10 °C y 35 °C. En un aspecto adicional, la temperatura es entre 15 y 25 °C. En aún un aspecto adicional, la temperatura es aproximadamente 20 °C.

El término "polipéptido o proteína", como se usa en el presente documento, significa un compuesto que está compuesto de al menos dos aminoácidos constituyentes conectados por enlaces polipeptídicos. Los aminoácidos constituyentes se pueden elegir del grupo de los aminoácidos codificados por el código genético (aminoácidos proteogénicos) y pueden ser aminoácidos naturales que no están codificadas por el código genético, así como aminoácidos sintéticos (aminoácidos no proteogénicos). Los 22 aminoácidos proteogénicos son: Alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, hidroxiprolina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.

Así, un aminoácido no proteogénico es un resto que se puede incorporar en un polipéptido o proteína mediante enlaces polipeptídicos, pero no es un aminoácido proteogénico. Ejemplos son Y-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, los D-aminoácidos tales como D-alanina y D-glutamina. Los aminoácidos no proteogénicos sintéticos comprenden aminoácidos fabricados por síntesis química, es decir, D-isómeros de los aminoácidos codificados por el código genético tal como D-alanina y D-leucina, Aib (ácido a-aminoisobutírico), Abu (ácido a-aminobutírico), ornitina, Dap (ácido 2,3-diaminopropiónico), Dab (ácido 2,4-diaminobutanoico), Tie (terc-butilglicina), ácido 3- aminometilbenzoico, ácido antranílico, des-amino-histidina, los análogos beta de aminoácidos tales como 3-alanina, etc. D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, a- fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina, ácido (1- aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1- aminociclohexil)carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil)carboxílico o ácido (1-aminociclooctil)carboxílico.

El término "análogo", como se usa en el presente documento con referencia a un polipéptido o proteína, significa un polipéptido o proteína modificado en el que uno o más restos de aminoácidos del polipéptido o proteína se han sustituido con otros restos de aminoácidos y/o en el que uno o más restos de aminoácidos se han delecionado del polipéptido o proteína y/o en el que uno o más restos de aminoácidos se han delecionado del polipéptido o proteína y o en el que uno o más restos de aminoácidos se han añadido al polipéptido o proteína. Tal adición o deleción de restos de aminoácidos puede tener lugar en el extremo N del polipéptido o proteína y/o en el extremo C del polipéptido o proteína. Se usa frecuentemente un simple sistema para describir análogos: Por ejemplo [Aib8,

Arg34]GLP-1(7-37) designa un análogo de GLP-1(7-37) en el que la alanina que existe de forma natural en la

posición 8 se sustituye con ácido alfa-aminoisobutírico y la lisina en la posición 34 se ha sustituido con arginina. Se debe entender que todos los aminoácidos para los que el isómero óptico no se establece significan el isómero L. En aspectos de la invención se ha modificado un máximo de 17 aminoácidos. En aspectos de la invención se ha modificado un máximo de 15 aminoácidos. En aspectos de la invención se ha modificado un máximo de 10

aminoácidos. En aspectos de la invención se ha modificado un máximo de 8 aminoácidos. En aspectos de la

invención se ha modificado un máximo de 7 aminoácidos. En aspectos de la invención se ha modificado un máximo de 6 aminoácidos. En aspectos de la invención se ha modificado un máximo de 5 aminoácidos. En aspectos de la invención se ha modificado un máximo de 4 aminoácidos. En aspectos de la invención se ha modificado un máximo de 3 aminoácidos. En aspectos de la invención se ha modificado un máximo de 2 aminoácidos. En aspectos de la invención se ha modificado 1 aminoácido.

En un aspecto de la invención, el extremo C del derivado según la invención se puede terminar como cualquiera de un ácido o una amida. En un aspecto, el extremo C del derivado de la invención es una amida. En otro aspecto, el extremo C del derivado de la invención es un ácido.

La presente invención es especialmente adecuada para producir polipéptidos o proteínas que comprenden uno o más aminoácidos no proteogénicos adecuados para tratar, por ejemplo, diabetes tales como péptidos de tipo glucagón e insulinas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

En un aspecto, el polipéptido o proteína que se va hacer reaccionar con el dipéptido es un péptido de tipo glucagón.

El término "péptido de tipo glucagón", como se usa en el presente documento, significa la familia del glucagón de polipéptidos, exendinas y análogos de las mismas. La familia del glucagón de polipéptidos se codifica por el gen de preproglucagón y engloba tres polipéptidos pequeños con un alto grado de homología, es decir, glucagón (1-29), GLP-1 (1-37) y GLP-2 (1-33). Las exendinas son polipéptidos expresados en lagartos y al igual que GLP-1 son insulinotrópicas. Ejemplos de exendinas son exendina-3 y exendina-4.

Los términos GLP-1, GLP-2, exendina-3 y exendina-4 son conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, "compuesto de GLP-1" o "polipéptido GLP-1", como se usa en el presente documento, significa GLP-1(7-37) humano, análogo insulinotrópico del mismo y derivados insulinotrópicos del mismo. Ejemplos no limitantes de análogos de GLP-1 son amida de GLP-1(7-36), Arg34-GLP-1(7-37), Aib3Arg34-GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-37), amida de Val8-GLP-1(7-36) y Val8Asp22-GLP-1(7-37). Ejemplos no limitantes de derivados de GlP-1 son desamino-His7, Arg26, Lys34(NE-(Y-Glu(Na-hexadecanoil)))-GLP-1(7-37), desamino-His7, Arg26, Lys34(NE-octanoil)-GLP-1(7-37), Arg26,34, Lys38(NE-(w-carboxipentadecanoil))-GLP-1(7-38), Arg26,34, Lys36(NE-(Y-Glu(Na-hexadecanoil)))-GLP-1(7-36) y Arg34, Lys26(NE-(Y-Glu(Na-hexadecanoil)))-GLP-1(7-37). Según la práctica establecida en la materia, la nomenclatura de GLP-1 empieza en el resto de histidina que se denomina N.° 7, y restos de aminoácidos posteriores se numeran en consecuencia, terminando con la glicina N.° 37. Por tanto, generalmente, cualquier referencia en el presente documento a un número de resto de aminoácido o un número de posición de la secuencia de GLP-1(7-37) es a la secuencia que empieza con His en la posición 7 y que termina con Gly en la posición 37. Los análogos de GLP-1 de los derivados de la invención se puede describir por referencia a i) el número del resto de aminoácido en GLP-1(7- 37) nativo que se corresponde con el resto de aminoácido que se cambia (es decir, la posición correspondiente en el GLP-1 nativo), y a ii) el cambio real.

En un aspecto, el péptido de tipo glucagón según la invención está protegido de dipeptidil aminopeptidasa IV. En otro aspecto, el péptido de tipo glucagón según la invención está protegido de dipeptidil aminopeptidasa IV.

El término "protegido de dipeptidil aminopeptidasa IV ", como se usa en el presente documento, significa un péptido de tipo glucagón, por ejemplo un análogo de GLP-1, que es más resistente a dipeptidil aminopeptidasa IV (DPP-IV) que el compuesto nativo, por ejemplo GLP-1(7-37). Tal protección se puede obtener por, por ejemplo, mutaciones y/o derivatización del compuesto nativo. La resistencia de un compuesto de GLP-1 a la degradación por dipeptidil aminopeptidasa IV se determina por el siguiente ensayo de degradación:

Se incuban alícuotas del compuesto de GLP-1 (5 nmoles) a 37 °C con 1 pl de dipeptidil aminopeptidasa IV purificada correspondiente a una actividad enzimática de 5 mU durante 10-180 minutos en 100 pl de tampón trietilamina-HCI 0,1 M, pH 7,4. Se terminan las reacciones enzimáticas mediante la adición de 5 pl de 10 % de ácido trifluoroacético, y los productos de degradación de polipéptidos se separan y se cuantifican usando análisis de HPLC. Un método para realizar este análisis es: Las mezclas se aplican sobre una columna Vydac C18 de poro ancho (poros de 30 nm, partículas de 5 pm) de 250 x 4,6 mm y se eluyen a un caudal de 1 ml/min con gradientes escalonados lineales de acetonitrilo en 0,1 % de ácido trifluoroacético (0 % de acetonitrilo durante 3 min, 0-24 % de acetonitrilo durante 17 min, 24-48 % de acetonitrilo durante 1 min) según Siegel et al., Regul. Pept. 1999;79: 93-102 y Mentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993;214: 829-35. Los polipéptidos y sus productos de degradación se pueden monitorizar por su absorbancia a 220 nm (enlaces peptídicos) o 280 nm (aminoácidos aromáticos), y se cuantifican por integración de sus áreas pico relacionadas con las de patrones. La tasa de hidrólisis de un compuesto de gLP-1 por dipeptidil aminopeptidasa IV se estima a tiempos de incubación que dan como resultado menos del 10 % del compuesto de GLP-1 que se hidroliza.

El término "insulinotrópico", como se usa en el presente documento con referencia a un péptido de tipo glucagón, significa la capacidad para estimular la secreción de insulina en respuesta a un aumento del nivel de glucosa en plasma. Los péptidos insulinotrópicos de tipo glucagón son agonistas del receptor de GLP-1. La propiedad insulinotrópica de un compuesto se puede determinada por ensayos in vitro o in vivo conocidos en la técnica. Se puede usar el siguiente ensayo in vitro para determinar la naturaleza insulinotrópica de un compuesto tal como un péptido de tipo glucagón. Preferentemente, los compuestos insulinotrópicos presentan un valor de CE50 en el siguiente ensayo de menos de 5 nM, incluso más preferentemente un valor de CE50 de menos de 500 pM.

Se cultivan células de riñón de hámster bebé (BHK) que expresan el receptor de GLP-1 humano clonado (BHK 467- 12A) en medio DMEM con la adición de 100 UI/ml de penicilina, 100 pl/ml de estreptomicina, 10 % de suero bovino fetal y 1 mg/ml de Geneticin G-418 (Life Technologies). Se preparan membranas plasmáticas por homogeneización en tampón (Tris-HCI 10 mM, NaCl 30 mM y ditiotreitol 1 mM, pH 7,4, que contiene, además, 5 mg/ml de leupeptina (Sigma), 5 mg/l de pepstatina (Sigma), 100 mg/l de bacitracina (Sigma) y 16 mg/l de aprotinina (Calbiochem- Novabiochem, La Jolla, CA)). El homogeneizado se centrifuga en la parte superior de una capa de 41 % en p/v de sacarosa. La banda blanca entre las dos capas se diluye en tampón y se centrifuga. Las membranas plasmáticas se almacenan a -80 °C hasta que se usan.

El ensayo de receptor funcional se lleva a cabo midiendo AMPc como una respuesta a la estimulación por el polipéptido insulinotrópico o compuesto insulinotrópico. Se llevan a cabo incubaciones en placas de microtitulación de 96 pocillos en un volumen total de 140 ml y con las siguientes concentraciones finales: Tris-HCl 50 mM, EGTA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

1 mM, MgSO41,5 mM, ATP 1,7 mM, GTP 20 mM, 3-isobutil-1-metilxantina 2 mM (IBMX), 0,01 % en p/v de Tween- 20, pH 7,4. Los compuestos se disuelven y se diluyen en tampón. Se prepara nuevo GTP para cada experimento: se añaden 2,5 |jg de membrana a cada pocilio y la mezcla se incuba durante 90 min a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación. La reacción se detiene mediante la adición de 25 ml de HCl 0,5 M. Se mide el AMPc formado por un ensayo de proximidad de centelleo (RPA 542, Amersham, R.U.). Se representa una curva de dosis- respuesta para el compuesto y el valor de CE50 se calcula usando el software GraphPad Prism.

El término "profármaco de un compuesto insulinotrópico", como se usa en el presente documento, significa un compuesto químicamente modificado que tras la administración al paciente se convierte en un compuesto insulinotrópico. Tales profármacos normalmente son versiones extendidas de aminoácidos o ésteres de un compuesto insulinotrópico.

El término "compuesto de exendina-4", como se usa en el presente documento, se define como exendina-4(1-39), fragmentos insulinotrópicos de la misma, análogos insulinotrópicos de la misma y derivados insulinotrópicos de la misma. Los fragmentos insulinotrópicos de exendina-4 son polipéptidos insulinotrópicos para los que la secuencia entera se puede encontrar en la secuencia de exendina-4 y donde se ha delecionado al menos un aminoácido terminal. Ejemplos de fragmentos insulinotrópicos de exendina-4(1-39) son exendina-4(1-38) y exendina-4(1-31). La propiedad insulinotrópica de un compuesto se puede determinar por ensayos in vivo o in vitro muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un animal y monitorizar la concentración de insulina con el tiempo. Análogos insulinotrópicos de exendina-4(1-39) se refieren a las moléculas respectivas en las que uno o más de los restos de aminoácidos se han intercambiado con otros restos de aminoácidos y/o de las que se han delecionado uno o más restos de aminoácidos y/o a las que se han añadido uno o más restos de aminoácidos con la condición de que dicho análogo sea o bien insulinotrópico o bien sea un profármaco de un compuesto insulinotrópico. Un ejemplo de un análogo insulinotrópico de exendina-4(1-39) es Ser2Asp3-exendina-4(1-39) en la que los restos de aminoácidos en la posición 2 y 3 se han sustituido con serina y ácido aspártico, respectivamente (este análogo particular también se conoce en la técnica como exendina-3). Derivados insulinotrópicos de exendina- 4(1-39) y análogos de la misma son los que el experto en la materia considera que son derivados de estos polipéptidos, es decir, que tienen al menos un sustituyente que no está presente en la molécula de polipéptido original con la condición de que dicho derivado sea o bien insulinotrópico o sea un profármaco de un compuesto insulinotrópico. Ejemplos de sustituyentes son amidas, hidratos de carbono, grupos alquilo, ésteres y sustituyentes lipófilos. Un ejemplo de un derivado insulinotrópico de exendina-4(1-39) y análogo del mismo es amida de Tyr31- exendina-4(1-31).

El término "compuesto estable de exendina-4", como se usa en el presente documento, significa una exendina-4(1- 39) químicamente modificada, es decir, un análogo o un derivado que presenta una semivida de eliminación del plasma in vivo de al menos 10 horas en el hombre, como se ha determinado por métodos convencionales.

El término "compuesto de exendina-4 protegido de dipeptidil aminopeptidasa IV", como se usa en el presente documento, significa un compuesto de exendina-4 que es más resistente a la peptidasa dipeptidil aminopeptidasa IV (DPP-IV) plasmática que la exendina-4, como se ha determinado por el ensayo descrito en la definición del compuesto de GLP-1 protegido de dipeptidil aminopeptidasa IV.

Los análogos de GLP-1 pueden ser tales en los que la Lys que existe de forma natural en la posición 34 de GLP-1(7- 37) se ha sustituido con Arg.

Por tanto, derivados de precursores o productos intermedios de polipéptidos insulinotrópicos se cubren por la invención.

En un aspecto de la invención, el péptido de tipo glucagón es insulinotrópico. En un aspecto adicional, el péptido insulinotrópico de tipo glucagón se selecciona del grupo que consiste en GLP-1, GLP-2, exendina-4, exendina-3 y análogos y derivados de las mismas.

Es importante la estabilidad conformacional de los fármacos basados en proteínas para mantener la actividad biológica y para minimizar la pérdida irreversible de estructura debido a desnaturalización y fibrilación. Polipéptidos y proteínas insulinotrópicos especialmente grandes son lábiles con respecto al cambio conformacional debido a los complicados patrones de replegamiento. Por tanto, polipéptidos insulinotrópicos con un antecedente conocido de fibrilación, tal como GLP-1, son particularmente sensibles a la desestabilización de la estructura terciaria (es decir, formación de un estado globular fundido).

En un aspecto, los aminoácidos constituyentes de un péptido de tipo glucagón según la invención se puede seleccionar del grupo de los aminoácidos codificados por el código genético y pueden ser aminoácidos naturales que no están codificados por el código genético, así como aminoácidos sintéticos. Los aminoácidos naturales que no están codificadas por el código genético son, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D- alanina y D-glutamina. Los aminoácidos sintéticos comprenden aminoácidos fabricados por síntesis química, es decir, D-isómeros de los aminoácidos codificados por el código genético tales como D-alanina y D-leucina, Aib (ácido a-aminoisobutírico), Abu (ácido a-aminobutírico), Tie (terc-butilglicina), 3-alanina, ácido 3-aminometilbenzoico, ácido antranílico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

En un aspecto de la invención, el péptido de tipo glucagón que se hace reaccionar con el dipéptido para su uso en la invención es un polipéptido de GLP-1. En un aspecto adicional, el polipéptido de GLP-1 es un péptido GLP-1 que tiene una cadena lateral mencionada en los documentos WO 2006/005667, WO 2005/027978, WO 2011/080103 o WO 2006/097537. En un aspecto, el polipéptido GLP-1 es GLP-1(9-37); Arg34-GLP-1(9-37); Aib22,Arg34-GLP-1(9-37); Arg34,Pro37-GLP-1(9-37) o amida de Aib22, 730,35,Arg34,Pro37-GLP-1(9-37) que tiene una cadena lateral mencionada en los documentos WO 2006/005667, WO 2005/027978, WO 2011/080103 o WO 2006/097537. En un aspecto, el polipéptido GLP-1 es un péptido GLP-1 mencionado en el documento WO 2011/080103 página 84, línea 24 a página 95, línea 2, o un análogo GLP-1 mencionado en el documento WO 2006/097537 página 19, línea 25 a página 22, línea 4.

En otro aspecto, el péptido de tipo glucagón que se hace reaccionar con el dipéptido para su uso en la invención es un polipéptido GLP-1 que se selecciona del grupo que consiste en:

Arg34-GLP-1(9-37);

Aib22,Arg34-GLP-1(9-37);

Arg34, Pro37-GLP-1(9-37);

Amida de Aib 2227,30,35,Arg34,Pro37-GLP-1(9-37);

W£26-[2-(2-{2-[10-(4-Carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetilo], péptido W£37-[2-(2-{2-[10-(4-

carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetil]-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37);

W£26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}-

etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, péptido W£37-(2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-carboxi-4-[10-(4-

carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}-etoxi)etoxi]acetil}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37);

W£26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]-

etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], amida del péptido W£37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-í(S)-4-carboxi-4-(15-

carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}-etoxi)acetil][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37);

W£26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}-

etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], amida del péptido N£37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-(11-

carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)-acetil][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37);

W£26-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)-acetilo], amida del péptido W£37-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]-etoxi}etoxi)acetil][Arg34,Lys37]GLP-1(9- 37);

Péptido A/£26(17-carboxiheptadecanoil)-[Arg34]GLP-1-(9-37);

Péptido N:26-(19-carboxinonadecanoil)-[Arg34]GLP-1-(9-37);

Péptido W£26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)-

etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg34]GLP-1 -(9-37); y

Péptido N£26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-carboxiuneicosanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)-

etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg34]GLP-1-(9-37).

En otro aspecto, el péptido de tipo glucagón que se hace reaccionar con el dipéptido para su uso en la invención es un polipéptido GLP-1 que se selecciona del grupo que consiste en:

Arg34-GLP-1(9-37);

Aib22,Arg34-GLP-1(9-37);

Arg34, Pro37-GLP-1(9-37); y

Amida de Aib,2227,30,35,Arg34,Pro37- GLP-1(9-37)

En otro aspecto, el péptido de tipo glucagón que se hace reaccionar con el dipéptido para su uso en la invención es un polipéptido GLP-1 que se selecciona del grupo que consiste en:

W£26-[2-(2-{2-[10-(4-Carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetilo], péptido N37-[2-(2-{2-[10-(4-

Carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetil]-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37);

W£26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}-

etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, péptido W£37-(2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-carboxi-4-[10-(4-

carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}-etoxi)etoxi]acetil}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37);

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]-

etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], amida del péptido N37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-í(S)-4-carboxi-4-(15-

carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}-etoxi)acetil][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37);

N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}-

etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], amida del péptido N37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-(11-

carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)-acetil][Arg34,Lys37]GLP-1(9-37); y

N26-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)-acetilo], amida del ácido N37-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butirilamino]-etoxi}etoxi)acetil][Arg34,Lys37]GLP-1(9- 37).

En otro aspecto, el péptido de tipo glucagón que se hace reaccionar con el dipéptido para su uso en la invención es un polipéptido GLP-1 que se selecciona del grupo que consiste en:

Péptido N26(17-carboxiheptadecanoil)-[Arg34]GLP-1-(9-37);

Péptido N26-(19-carboxinonadecanoil)-[Arg34]GLP-1-(9-37);

Péptido N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)-

etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg34]GLP-1 -(9-37); y

Péptido N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-carboxiuneicosanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)-

etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg34]GLP-1-(9-37).

En un aspecto, se obtiene un péptido de tipo glucagón que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos por el método de la invención. En otro aspecto, el péptido de tipo glucagón que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos obtenido por el método de la invención es un péptido GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos. En un aspecto adicional, el péptido GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos es un péptido GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos y que tiene una cadena lateral mencionada en los documentos WO 2006/005667, WO 2005/027978, WO 2011/080103 o WO 2006/097537. En un aspecto, el péptido GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos es Aib8,Arg34-GLP-1(7-37); Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37); Aib8,Arg34, Pro37-GLP-1(7-37) o amida de

A¡b8,22, ,30,35,Arg34Pro-GLP-1(7-37) que tiene una cadena lateral mencionada en los documentos WO 2006/005667, WO 2005/027978, WO 2011/080103 o WO 2006/097537. En un aspecto, el péptido GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos es un péptido GLP-1 mencionado en el documento WO 2011/080103 en la sección en la página 84, línea 24 que une con la página 95, línea 2, o un análogo de GLP-1 mencionado en el documento WO 2006/097537 en la sección en la página 19, línea 25 que une con la página 22, línea 4.

En un aspecto, el péptido GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos proteogénicos se selecciona del grupo que consiste en:

Aib8,Arg34-GLP-1(7-37);

Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37);

Arg34-GLP-1(7-37);

Aib8,Arg34, Pro37-GLP-1(7-37);

Amida de Aib8,2227,30,35,Arg34,Pro37-GLP-1 (7-37);

N26-[2-(2-{2-[10-(4-Carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetilo], péptido N37-[2-(2-{2-[10-(4-

Carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetil]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37);

N26{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}-

etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, péptido N37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-carbox¡-4-[10-(4-

carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}-etoxi)etoxi]acetil}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-

37);

N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carbox¡-4-(15-carbox¡pentadecano¡lam¡no)butir¡lam¡no]-

etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], amida del péptido N37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carbox¡-4-(15-

carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}-etoxi)acetil][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37);

N26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxil-

etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], amida del péptido N37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carbox¡-4-(11-

carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)-acetil][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37);

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

N26-[2-[2-(2-(2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitndecanoilamino)butinlamino]etoxi}etoxi)-acetilo], amida del péptido N37-[2-[2-(2-(2-[(S)-4-carboxi-4-(13-carboxitndecanoilamino)butirilamino]-etoxi}etoxi)acetil][Aib8Arg34Lys37]GLP- 1(7-37);

Péptido N26 (17-carboxiheptadecanoil)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);

Péptido N26-(19-carboxinonadecanoil)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37); N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutinlamino]etoxi)-

etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)péptido; y péptido N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-

carboxiuneicosanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)-etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-

1-(7-37).

En un aspecto, el péptido GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos proteogénicos se selecciona del grupo que consiste en:

Aib8,Arg34-GLP-1(7-37);

Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37);

Arg34-GLP-1(7-37);

Aib8,Arg34, Pro37-GLP-1(7-37); y

Amida de Aib82227,30,35,Arg34,Pro37- GLP-1 (7-37).

En un aspecto, el péptido GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos proteogénicos se selecciona del grupo que consiste en:

N26-[2-(2-(2-[10-(4-Carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetilo], péptido N37-[2-(2-{2-[10-(4-

carboxifenoxi)decanoilamino]etoxi}etoxi)acetil]-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37);

N26{2-[2-(2-{2-[2-(2-((S)-4-Carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butinlamino}-

etoxi)etoxi]acetilamino}etoxi)etoxi]acetilo}, péptido N37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-((S)-4-carboxi-4-[10-(4-

carboxifenoxi)decanoilamino]butirilamino}etoxi)etoxi]acetilamino}-etoxi)etoxi]acetil}-[Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-

37);

N26-[2-(2-(2-[2-(2-(2-[(S)-4-Carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butirilamino]-

etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], amida del péptido N37-[2-(2-{2-[2-(2-(2-[(S)-4-carboxi-4-(15-

carboxipentadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}-etoxi)acetil][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37);

N26-[2-(2-(2-[2-(2-(2-[(S)-4-Carboxi-4-(11-carboxiundecanoilamino)butinlamino]etoxi}-

etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetilo], amida del péptido N37-[2-(2-{2-[2-(2-(2-[(S)-4-carboxi-4-(11-

carboxiundecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)-acetil][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37); y

N26-[2-[2-(2-(2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitndecanoilamino)butinlamino]etoxi}etoxi)-acetilo], amida del péptido

N37-[2-[2-(2-(2-[(S)-4-Carboxi-4-(13-carboxitndecanoilamino)butirilamino]-

etoxi}etoxi)acetil][Aib8Arg34,Lys37]GLP-1(7-37).

En un aspecto, el péptido GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos proteogénicos se selecciona del grupo que consiste en:

Péptido N26 (17-carboxiheptadecanoil)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);

Péptido N26-(19-carboxinonadecanoil)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37); N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutinlamino]etoxi)-

etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)péptido; y péptido N26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-

Carboxiuneicosanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)-etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-

1-(7-37).

La producción de péptidos y proteínas es muy conocida en la técnica. Se pueden producir péptidos o proteínas, por ejemplo, por síntesis clásica de péptidos, por ejemplo síntesis de péptidos en fase sólida usando química de t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, véase, por ejemplo, Greene y Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999, "Organic Synthesis on solid Phase", Florencio Zaragoza Dorwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000, "Novabiochem Catalog", Merck Biosciences 2006/2007 y "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis", Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000, ISBN 24

5. Los péptidos o proteínas también se pueden producir por un método que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene una secuencia de ADN que codifica el péptido o proteína y capaz de expresar el péptido o proteína en un medio nutritivo adecuado en condiciones que permiten la expresión del péptido o proteína. Para

5

10

15

20

25

30

35

40

péptidos o proteínas que comprenden restos de aminoácidos no naturales, la célula recombinante se debe modificar de forma que los aminoácidos no naturales se incorporen en el péptido o proteína, por ejemplo por uso de mutantes de ARNt.

El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, significa en proximidad razonable del valor numérico establecido, tal como más o menos el 10 %, o para valores de pH más o menos 0,2 o para temperatura más menos 5 grados Celsius.

Lo siguiente es una lista no limitante de las realizaciones según la invención:

1. Un método de obtención de un polipéptido o proteína final que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos, en el que el método comprende una etapa de hacer reaccionar un dipéptido con un polipéptido o proteína, y dicho dipéptido es de Fórmula 1:

imagen4

en la que

R1 es H o un grupo protector de amino, y R2 es un grupo protector de amino; o R1 es un grupo alquilo extraíble, y R2 es H o un grupo alquilo extraíble; o R1 y R2 forman conjuntamente un anillo;

R3 es H, o un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión metálico que forma una sal con el grupo carboxilato; y

R4 está ausente o es una sal de ácido.

2. El método de la realización 1, en el que el grupo protector de amino se selecciona del grupo que consiste en: Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde y Nps.

3. El método de la realización 1 o 2, en el que el grupo alquilo extraíble se selecciona del grupo que consiste en: Bencilo y terc-butilo.

4. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-3, en el que, cuando R1 y R2 forman conjuntamente un anillo, el anillo conjuntamente formado se selecciona del grupo que consiste en: Ftalimida y 1,3,5- dioxazina.

5. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-4, en el que

R1 es H o un grupo protector de amino seleccionado del grupo que consiste en: Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde y Nps, y R2 es un grupo protector de amino seleccionado del grupo que consiste en: Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde y Nps; o

R1 es un grupo alquilo extraíble seleccionado del grupo que consiste en: Bencilo y terc-butilo, y R2 es H o un grupo alquilo extraíble seleccionado del grupo que consiste en: Bencilo y terc-butilo; o

R1 y R2 forman conjuntamente un anillo seleccionado del grupo que consiste en: Ftalimida y 1,3,5- dioxazina;

R3 es H, o un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario, un catión de metal alcalino o un catión de metal alcalinotérreo que forma una sal con el grupo carboxilato; y

R4 está ausente o es una sal de ácido seleccionada del grupo que consiste en: Una sal de TFA, una sal de HCI, una sal de HBr y una sal de hidrógeno sulfato.

6. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-5, en el que

R1 es H o un grupo protector de amino seleccionado del grupo que consiste en: Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde y Nps, y

5

10

15

20

25

30

35

R2 es un grupo protector de amino seleccionado del grupo que consiste en: Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde y Nps.

7. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-5, en el que R1 es H y R2 es un grupo protector de amino seleccionado del grupo que consiste en: Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde y Nps.

8. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-5, en el que R1 es H y R2 es Fmoc.

9. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-5, en el que R1 es un grupo protector de amino seleccionado del grupo que consiste en: Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde y Nps, y

R2 es un grupo protector de amino seleccionado del grupo que consiste en: Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde y Nps.

10. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-5, en el que

R1 es un grupo alquilo extraíble seleccionado del grupo que consiste en: Bencilo y terc-butilo, y R2 es H o un grupo alquilo extraíble seleccionado del grupo que consiste en: Bencilo y terc-butilo.

11. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-5, en el que

R1 es un grupo alquilo extraíble seleccionado del grupo que consiste en: Bencilo y terc-butilo, y R2 es H.

12. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-5, en el que

R1 es un grupo alquilo extraíble seleccionado del grupo que consiste en: Bencilo y terc-butilo, y R2 es un grupo alquilo extraíble seleccionado del grupo que consiste en: Bencilo y terc-butilo.

13. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-12, en el que R3 es H.

14. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-12, en el que R3 es un catión de amonio secundario que forma una sal con el grupo carboxilato.

15. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-12, en el que R3 es un catión de amonio terciario que forma una sal con el grupo carboxilato.

16. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-12, en el que R3 es un catión de metal alcalino que forma una sal con el grupo carboxilato.

17. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-12, en el que R3 es un catión de metal alcalinotérreo que forma una sal con el grupo carboxilato.

18. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-17, en el que R4 está ausente.

19. El método de una cualquiera de las realizaciones 1-17, en el que R4 es una sal de ácido seleccionada del grupo que consiste en: Una sal de TFA, una sal de HCI, una sal de HBr y una sal de hidrógeno sulfato.

20. El método según una cualquiera de las realizaciones 1-19, en el que R1 es H;

R2 es Fmoc;

R3 es H; y

R4 está ausente o es una sal de ácido tal como TFA, HCI, HBr o HOAc.

21. El método según una cualquiera de las realizaciones 1-3, que es Fmoc-His-Aib-OH de Fórmula 2

5

10

15

20

25

30

35

40

imagen5

en la que His es histidina, Aib es el aminoácido artificial ácido 2-aminoisobutírico, Fmoc es el grupo de protección 9-fluorenilmetiloxicarbonilo y R4 está ausente o es una sal de ácido tal como TFA, HCI, HBr o HOAc.

22. El método según una cualquiera de las realizaciones 1-3, que es la sal de TFA de Fmoc-His-Aib-OH: Fmoc-His-Aib-OH,TFA

en la que His es histidina, Aib es el aminoácido artificial ácido 2-aminoisobutírico, Fmoc es el grupo de protección 9-fluorenilmetiloxicarbonilo y TFA es ácido trifluoroacético.

23. El método según una cualquiera de las realizaciones 1-22, que se activa por un agente de activación tal como un reactivo de acoplamiento basado en fosfonio tal como hexafluorofosfato de (benzotriazol-1- iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP).

24. Un método de producción de un dipéptido como se define en una cualquiera de las realizaciones 1-23.

25. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 1-23, en el que dicho dipéptido se hace reaccionar con un polipéptido o proteína en un medio acuoso.

26. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 1-23, que comprende la etapa de mezclar el dipéptido y el polipéptido o proteína en un medio acuoso.

27. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones precedentes, en el que R1 y/o R2 de dicho dipéptido se elimina después de la finalización de la reacción con un polipéptido o proteína.

28. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones precedentes, en el que R1 y/o R2 de dicho dipéptido se elimina en una etapa de desprotección en condiciones básicas.

29. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones precedentes, en el que R1 y/o R2 de dicho dipéptido se elimina en una etapa de desprotección en la que se añade una piperidina al medio de reacción.

30. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones precedentes, en el que R1 y/o R2 de dicho dipéptido se elimina in situ en una etapa química después de la finalización de la reacción de acilación con un polipéptido o proteína.

31. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones precedentes, en el que el polipéptido o proteína está protegido con Fmoc en el extremo N, que comprende una etapa en la que el polipéptido o proteína protegido con Fmoc en el extremo N se desprotege in situ.

32. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones precedentes, en el que el método comprende las etapas:

1. activar un dipéptido de Fórmula 1 o Fórmula 2 con un reactivo de acoplamiento basado en fosfonio.

2. hacer reaccionar dicho dipéptido activado con un polipéptido o proteína

3. eliminar el (los) grupo(s) protector(es) in situ por el cual se obtiene el polipéptido o proteína final.

33. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según la realización 32, en el que en la etapa 2 dicho dipéptido activado se hace reaccionar con un polipéptido o proteína en un medio acuoso.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

34. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 25-33, en lela que dicho medio acuoso comprende uno o más disolventes orgánicos solubles en agua seleccionados del grupo que consiste en: DMF, NMP, DMAC, DMSO, acetonitrilo, dioxano, butoxi-2-etanol, un acetal soluble en agua y un alcohol soluble en agua.

35. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según la realización 34, en el que dicho uno o más disolventes orgánicos solubles en agua es NMP.

36. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 25-35, en el que el medio acuoso en el que dicho dipéptido activado se hace reaccionar con un polipéptido o proteína comprende 10-100 % de agua.

37. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 25-35, en el que el medio acuoso en el que dicho dipéptido activado se hace reaccionar con un polipéptido o proteína comprende aproximadamente 40 % de agua.

38. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 25-37, en el que el pH del medio acuoso es entre pH 7 y pH 14.

39. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 25-37, en el que el pH del medio acuoso es entre pH 8,7 y pH 9,4.

40. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 25-37, en el que el pH del medio acuoso es aproximadamente pH 9,1.

41. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 25-37, en el que el pH del medio acuoso es aproximadamente pH 9,3.

42. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 25-37, en el que el medio acuoso comprende un tampón.

43. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 25-37, en el que el polipéptido o proteína que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos se obtiene en disolución.

44. Un método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 1-23, en el que el polipéptido o proteína que reacciona con dicho dipéptido se inmoviliza sobre una fase sólida.

45. El método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 1-23, en la que dicho dipéptido se hace reaccionar con el extremo a-N del polipéptido o proteína.

46. El método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las realizaciones 1-23, en el que el polipéptido o proteína que se hace reaccionar con dicho dipéptido es un péptido GLP-1.

Ejemplos

Lista de abreviaturas

ADO: Ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoicoo

Aib: Ácido 2-aminoisobutírico

Alloc: Aliloxicarbonilo

Boc: terc-Butoxicarbonilo

Bpoc: 2-(p-Bifenilil)-2-propiloxicarbonilo

Cbz: Benciloxicarbonilo

DCM: Diclorometano

DIC: N,N'-Diisopropilcarbodiimida

DIPEA: N,N-Diisopropiletilamina

DME: Dimetil éter

dNBS: 2,4-Dinitrobencenosulfonilo

EtOH: Etanol

5

10

15

20

25

30

35

Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

HBr: Ácido bromhídrico

HCl: Ácido clorhídrico

His: Histidina

HOAc: Ácido acético

HOBt: Hidroxibenzotriazol

ivDde: 1-(4,4-Dimetil-2,6-dioxociclo-hexiliden)-3-metilbutilo

Lys: Lisina

MeCN: Acetonitrilo

Mtt: 4-Metiltritilo

NMP: N-Metil-2-pirrolidona

Nps: o- o p-Nitrofenilsulfenilo

Nsc: 2-(4-Nitrofenil)sulfoniletoxicarbonilo

oNBS: o-Nitrobencenosulfonilo

OtBu: terc-Butoxi

pNBS: p-Nitrobencenosulfonilo

PyBOP: Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonio TBME: terc-Butil metil éter

TBTU: Tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio

TEA: Trimetilamina

TFA: Ácido trifluoroacético

TIPS: Triisopropilsilano

Trt: Trifenilmetilo

Ejemplo 1: Trifluoracatato de ácido 2-[(S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-3-(1H-imidazol-4-il)- propanoilamino]-2-metil-propanoico (nombre alternativo: Fmoc-His-Aib-OH, TFA)

imagen6

Se suspendió Fmoc-His(Trt)-Aib-OH (1 eq. molar, material de partida) en DCM (1,5 ml/g) y se añadió TIPS (1,7 eq. molar). Se añadió TFA enfriado (0-10 °C) (3 ml/g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que se completó la reacción (conversión por cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC)). Se añadieron DME (1 ml/g de material de partida) y TBME (11 ml/g de material de partida) que condujo a un aumento en la temperatura. Se permitió que la temperatura volviera lentamente hasta temperatura ambiente (ta), dando como resultado la precipitación de un sólido blanco. La mezcla se agitó durante 3 h adicionales y se filtró. El precipitado se lavó dos veces con TBME (3 ml/g de material de partida) y se secó durante la noche a vacío proporcionando el dipéptido destritilado como la sal de TFA con un rendimiento del 90 %.

Los estudios de estabilidad a la temperatura de congelación (<-15 °C ± 5 °C), de frigorífico (5°C ± 3°C) y ambiente (20 °C ± 3 °C) muestran más de 24 meses de estabilidad.

Datos de RMN:

imagen7

1H

Desplazamiento químico 5 (ppm) Integral Patrón de acoplamiento Constantes de acoplamiento nJHH (Hz)

H18

1,34 3 H singlete ND

H19

1,38 3 H singlete ND

H14

2,93 1 H Doblete de dobletes 2Jhh= 14, JJHH= 9

H14'

3,08 1 H Doblete de dobletes 2Jhh= 14, jJhh= 5

H9

4,20 1 H Multiplete ND

H10, H10'

4,25 2 H Multiplete ND

H13

4,37 1 H multiplete ND

H2, H7

7,33 2 H Triplete 3Jhh= 7

H15

7,33 1 H Singlete ND

H3, H6

7,42 2 H Triplete 3Jhh= 7

H1, H8

7,68 2 H Doblete 3Jhh= 7

H12

7,71 1 H Doblete 3Jhh= 8,5

H4, H5

7,90 2 H doblete 3Jhh= 7

H17

8,17 1 H singlete ND

H16

8,97 1 H singlete ND

H20

12,5 1 H singlete ancho ND

Ejemplo 2: Péptido WE26-[(S)-(22,40-dicarboxi-10,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-triazatetracontan-1 -

5 oil)][Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)(nombre alternativo: péptido WE26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-(17-carboxi-

heptadecanoilamino)-butirilamino]-etoxi}-etoxi)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-acetil][Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37))

Etapa 1

Activación in situ del dipéptido Fmoc-His-Aib-OH,TFA (Mezcla I):

A una mezcla de Fmoc-His-Aib-OH,TFA (4 eq. molares) y HOBt*H2O (4 eq. molares) se añadió NMP (4,7 ml/g de 10 dipéptido) a temperatura ambiente. A la disolución con agitación se añadió TEA hasta pH 8, mientras que la temperatura de la disolución se mantuvo a temperatura ambiente usando un baño de hielo. Se añadió una disolución de PyBOP (3,9 eq. molares) en NMP (2,4 ml/g de dipéptido) a la disolución que contenía el dipéptido a temperatura ambiente. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH 8 usando TEA. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 min antes de la adición a la mezcla II.

15 Preparación de péptido el péptido (WE26-[(S)-(22,40-dicarboxi-10,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-

triazatetracontan-1-oil)][Arg34]GLP-1-(9-37) (nombre alternativo: péptido NE26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-(17- carboxi-heptadecanoilamino)-butirilamino]-etoxi}-etoxi)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-acetil][Arg34]GLP-1-(9-37) para

acilación (Mezcla II): Se suspendió WE26-[(S)-(22,40-dicarboxM0,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

triazatetracontan-1-oil)][Arg34]GLP-1-(9-37) en 40 % en p/p de H2O en NMP (37 g de péptido/l de mezcla de disolventes). A la suspensión enfriada se añadió TEA hasta pH 9,3.

Etapa 2:

Acilación del péptido el péptido WE26-[(SH22,40-dicarboxM0,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23- triazatetracontan-1-oil)] [Arg34]GLP-1-(9-37) (Mezcla III):

Se añadió gota a gota la mezcla I a la mezcla II a temperatura ambiente. Después de la adición, el pH se reajustó a pH 9,3 (pH-metro) por TEA. La mezcla se agitó hasta conversión óptima (medida por HPLC).

Etapa 3:

Eliminación del grupo protector (Fmoc)

A la mezcla III se añadió piperidina (20 eq. molares/dipéptido) y la mezcla se agitó durante 40 min a ta.

Orbitrap m/z 1028,7 (4+) 1371,4 (3+)

Ejemplo 3: Preparación del péptido WE26,WE37-bis[(S)-(22-carboxi-33-(4-carboxifenoxi)-10,19,24-trioxo-3,6,12,15- tetraoxa-9,18,23-triazatritriacontan-1-oil)][Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37) (nombre alternativo: lN26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2- [[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxiletoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-, péptido WE37-[2-[2-[2-[[2-[2-í2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-

carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilHAib,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)- péptido)

Etapa 1: Acilación de la cadena lateral

Se suspendió en agua (50 ml) el péptido [Arg34, Lys37]-GLP-1-(9-37) como sedimento isoprecipitado (15 g, contenido de péptido de aproximadamente 13 % p/p, pureza de -93 %) y se añadió NaOH (ac) (1 M; 1150 pl) para disolver el péptido. La disolución resultante (57 ml) se transfirió a una cámara de reacción de 150 ml en una configuración valorada. El pH de la disolución se midió a 10,6. El pH se ajustó por el aparato de valoración usado a 11,3 con NaOH (ac) diluido (0,5 M, 0,67 ml) y el volumen se ajustó con agua a 60 ml dando una concentración de péptido final de aproximadamente 33 mg/ml. Ensayando la disolución con respecto a una curva patrón del péptido [Arg34, Lys37]- GLP-1-(9-37) dio un contenido de péptido corregido de 1,71 g. El uso de 1,71 g de péptido dio una concentración corregida de la disolución de 28,5 mg/ml. Se disolvió en NMP (4,8 ml) 2,5-dioxopirrolidin-1-iloxi (S)-(22-carboxi-33-(4- carboxifenoxi)-10,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-triazatritriacontanato de cadena lateral activada (nombre alternativo: (ácido 4-[9-((S)-1-carboxi-3-{2-[2-({2-[2-(2-hidroxi-5-oxo-pirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]-

etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-noniloxi]-benzoico) como éster activo al 83 %, 1,73 g, 3,3 eq) dando 5,20 ml de disolución (0,63 eq/ml). Se añadió lentamente la disolución de NMP de la cadena lateral de una bomba de jeringa a una velocidad constante manteniendo el pH constante a 11,3 por adición controlada por el aparato de valoración de NaOH ac. (ac.) (0,5 M). Se añadieron 3,90 ml (2,4 eq) de cadena lateral durante 1 h y 10 minutos (~2 eq/h). El análisis de cromatografía de líquidos de ultra-resolución (UPLC) mostró que la acilación estaba casi completa y la adición continuó hasta un total de 2,8 eq de cadena lateral (4,43 ml). Durante la adición se añadió un total (16,71 ml; 8,4 mmoles) de NaOH 0,5 N (ac) por el aparato de valoración.

Etapa 2: Isoprecipitación

Se transfirió la mezcla de reacción con agua a 4 x viales de centrifugadora de 50 ml (22 ml en cada uno) y se ajustó el pH en cada uno a 4,8 mediante la adición de ácido acético conc. para dar un precipitado blanco. Se añadió EtOH (2,2 ml hasta un total de aproximadamente 10 % v/v). El precipitado se centrifugó y se usó sin más purificación en la siguiente etapa.

Etapa 3: Ligación de dipéptido

Se suspendió en NMP (48 ml; 50 mg de péptido/ml) el isoprecipitado y se añadió DIPEA (656 pl). Se midió el pH de la disolución resultante a pH= 9,6 en una muestra de 100 pl de la mezcla diluida con 900 pl de agua.

Se midió el contenido de agua de la suspensión al 1,4 % por valoración de Karl Fischer. Se añadió agua (9,12 ml) dando un contenido de agua de aproximadamente el 20 %.

Se activó Fmoc-His-Aib-OH.TFA; 1058 mg, 3,5 eq) con HOBt (248 mg; 3,5 eq), PyBOP (907 mg, 3,325 eq) y trietilamina (545 pl) en NMP durante 15 minutos. El pH fue 4-5 medido por una tira de pH húmeda. La mezcla se añadió a la disolución de péptido y el pH se ajustó con trietilamina hasta pH 9,3 (midiendo una muestra de la mezcla de reacción (100 pl) añadida a agua (900 pl). Después de 1 h la UPLc mostró conversión casi completa en el producto deseado.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Etapa 4: Desprotección de Fmoc

A la mezcla de reacción de la etapa de ligación se añadió piperidina (3,35 ml, (5 % v/v)) y la mezcla se agitó durante 25 minutos, después de lo cual el análisis de UPLC mostró conversión completa en el producto. Se añadió agua dando 1:1 de NMP-disolución acuosa y el pH se ajustó a 8,5 con ácido acético y el producto se purificó por cromatografía estándar.

Análisis:

RP-UPLC: BEH C18, 150*1 mm a 45 °C y 0,1 ml/min; gradiente del 30 al 60% de 0,04% de TFA en MeCN (eluyente B) en 30 min, luego hasta el 90% de B, tiempo total de realización 38 min. UV a 215 nm, 5 Hz. Espectrometría de masas de alta definición Synapt (HDMS): modo positivo de EM-ES de m/z 200-2500 (1 Hz). V (cap): 3 kV; V (cono): 28 V; gas de desolvatación 250 °C a 750 l/h; gas del cono 50 l/h a 110 °C

Rt = 15,18 min

Masa exacta: 4885,4477 Da; hallada: M/4: 1222,35; M/3: 1629,45

Ejemplo 4: Preparación del péptido WE26[(S)-(22-carbox¡-33-(4-carboxifenox¡)-10,19,24-tr¡oxo-3 6,12,15-tetraoxa- 9,18,23-triazatritriacontan-1-oil)][Aib8Arg34Lys37]GLP-1-(7-37) (nombre alternativo: péptido l\f-[2-[2-[2-[[2-[2-[2- [[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]- [Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)):

El péptido se sintetizó usando síntesis de péptidos en fase sólida:

A 1,04 g de resina Fmoc-Lys(Boc)-Wang-LL (eq. 0,24 mmol/g) se añadieron de una manera escalonada 4 eq. molares de aminoácidos estándar protegidos por el protocolo de Fmoc/OtBu o Ser-Ser pseudoprolina o Fmoc-L- Lys(Mtt)-OH. Se hizo reaccionar el aminoácido de activación (4 eq. molares) en cartucho durante 7 minutos con 4 eq. molares de DIC y 4 eq. molares de HOBt en NMP. El péptido resultante se transfirió a un recipiente de reacción con resina y se hizo reaccionar durante 30 min. Se añadió DIPEA (4 eq. molares) y la reacción continuó durante 30 min. La resina se lavó con NMP y posteriormente se desprotegió usando 20 % de piperidina (10 ml, 20 min). La resina se lavó nuevamente con NMP.

Desprotección de MTT:

La resina se lavó en DCM. Se añadió 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (10 ml durante 10 min) y se drenó la resina. Se repitió cuatro veces en total el procedimiento de desprotección. La resina se lavó con DCM, seguido por NMP.

A una mezcla de ácido (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-33-(4-(terc-butoxicarbonil)fenoxi)-10,19,24-trioxo-3,6,12,15- tetraoxa-9,18,23-triazatritriacontan-1-oico, se añadieron HOBt (4 eq. molares) y DIPEA (4 eq. molares) en NMP (10 ml), y se añadió TBTU (3,8 eq. molares) como un sólido, y la mezcla se agitó durante 15 min antes de añadirse a la resina. Después de 2 h, la resina se drenó y se lavó con nMp y DCM.

Se hinchó la resina de peptidilo en NMP (10 ml) durante 10 min a temperatura ambiente. Se drenó el recipiente. Se añadió a la resina 20 % en vol. de piperidina en NMP (20 ml). La mezcla se hinchó durante 20 min a temperatura ambiente. Se dispusieron el dipéptido Fmoc-L-His-Aib-OH.TFA (580 mg) y HOBt.H2O (153 mg) en un vial de 20 ml vial. Se añadió NMP (4 ml). A la mezcla se añadió TEA (650 pl) hasta pH 8 (tira de pH). A la mezcla de reacción se añadió una disolución de PyBOP (500 mg) en NMP (4 ml). A la mezcla de reacción se añadió nuevamente TEA (200 pl) hasta pH 8 (tira de pH). La mezcla se agitó durante 35 min a temperatura ambiente. Se drenó el recipiente. Se añadieron nuevamente 20 % en vol. de piperidina en NMP (20 ml) a la resina (desprotección doble). La mezcla se hinchó durante 20 min a temperatura ambiente y se drenó la resina. La resina se lavó con NMP (50 ml), DCM (50 ml) y 3 veces NMP (50 ml). Finalmente, la resina se lavó con DCM y se drenó. El péptido se escindió de la resina por una mezcla de TFA, H2O y TIPS (95 %, 2,5 %, 2,5 %) durante 3 h. El péptido escindido resultante se precipitó en dietil éter y se aisló por filtración.

TOF-EM ES+: m/z, hallado m/4 (1045,54), calculado m/4 (1045,5)

Aunque ciertas características de la invención se han ilustrado y descrito en el presente documento, a continuación se producirán muchas modificaciones, sustituciones, cambios y equivalentes por aquellos expertos habituales en la materia. Por tanto, se debe entender que las reivindicaciones adjuntas pretenden cubrir todas aquellas modificaciones y cambios.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un método de obtención de un polipéptido o proteína final que comprende uno o más aminoácidos no proteogénicos, en el que el método comprende una etapa de hacer reaccionar un dipéptido con un primer polipéptido o proteína, y dicho dipéptido es de Fórmula 1:

   imagen1

   en la que

   R1 es H o un grupo protector de amino, y R2 es un grupo protector de amino; o R1 es un grupo alquilo extraíble, y R2 es H o un grupo alquilo extraíble; o R1 y R2 forman conjuntamente un anillo;

   R3 es H, o un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión metálico que forma una sal con el grupo carboxilato; y

   R4 está ausente o es una sal de ácido.
2. 2. El método de obtención de un polipéptido o proteína según la reivindicación 1, en el que R1 y/o R2 de dicho dipéptido se eliminan en una etapa de desprotección en condiciones básicas.
3. 3. El método de obtención de un polipéptido o proteína según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho dipéptido se hace reaccionar con el extremo a-N del polipéptido o proteína.
4. 4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho método comprende una etapa de activar dicho dipéptido por un agente de activación.
5. 5. El método según la reivindicación 4, en el que el dipéptido activado se hace reaccionar con dicho primer polipéptido o proteína disuelto en un medio acuoso.
6. 6. El método según la reivindicación 4 o 5, en el que dicho agente de activación es un reactivo de acoplamiento basado en fosfonio, tal como hexafluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP).
7. 7. El método de obtención de un polipéptido o proteína según la reivindicación 5 o 6, en el que el pH de dicho medio acuoso es entre pH 8,7 y pH 9,4.
8. 8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el grupo protector de amino se selecciona del grupo que consiste en: Boc, Trt, Bpoc, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde y Nps.
9. 9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dipéptido se disuelve en un disolvente orgánico aprótico o una mezcla del mismo, tal como DMF, NMP, DMAC, DmSo, acetonitrilo o dioxano, antes de que dicho dipéptido se someta a la etapa de reacción.
10. 10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho primer polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:

    Péptido N26 (17-carboxiheptadecanoil)-[Arg34]GLP-1-(9-37);

    Péptido N£26-(19-carboxinonadecanoil)-[Arg34]GLP-1-(9-37);

    Péptido N£26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecano¡lam¡no)-4(S)-carbox¡but¡r¡lam¡no]-

    etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg34]GLp-1-(9-37); y

    Péptido N£26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-Carbox¡une¡cosano¡lamino)-4(S)-carbox¡but¡r¡lam¡no]-

    etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg34]GLP-1-(9-37).
11. 11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polipéptido final se selecciona del grupo que consiste en:

    Péptido N26 (17-carboxiheptadecanoil)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);

    21

    10

    15

    20

    25

    Péptido NE26-(19-carboxinonadecanoil)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);

    Péptido NE26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]-

    etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37); y

    Péptido N£26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-Carboxiuneicosanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]-

    etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37).
12. 12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en dicho dipéptido de Fórmula 1:

    R1 es H, y R2 es un grupo protector de amino;

    R3 es H; y

    R4 está ausente o es una sal de ácido.
13. 13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R4 está ausente.
14. 14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R4 es una sal de ácido seleccionada del grupo que consiste en: Una sal de TFA, una sal de HCI, una sal de HBr y una sal de hidrógeno sulfato.
15. 15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho dipéptido es el dipéptido enantiomérico o racémico

    Fmoc-His-Aib-OH de Fórmula 2

    imagen2

    en la que * indica el centro quiral del dipéptido, His es histidina, Aib es el aminoácido artificial ácido 2- aminoisobutírico, Fmoc es el grupo de protección 9-fluorenilmetiloxicarbonilo y R4 está ausente o es un componente de ácido, tal como TFA, HCI, HBr o hidrógeno sulfato, formando dicho componente de ácido una sal con el dipéptido.
16. 16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho dipéptido es la sal de TFA de Fmoc-His-Aib-OH:

    Fmoc-His-Aib-OH,TFA

    en la que His es histidina, Aib es el aminoácido artificial ácido 2-aminoisobutírico, Fmoc es el grupo de protección 9- fluorenilmetiloxicarbonilo y TFA es ácido trifluoroacético.
17. 17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, en el que el resto de histidina que comprende R4 es L-histidina.