ES2828526T3 - Esteres activos DCHBS de compuestos PEG y sus usos - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que comprende Quím. 7b: **(Ver fórmula)** en donde n es un número entero en el intervalo de 1-2, -Z1 y -Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -Cl, -F, -Br, -NO2, -CN, -SO2X2, - CONH y -CF3, en donde X2 se selecciona del grupo que consiste en -OH, CH3, -CF3 y -N(R1R2) (por ejemplo, -N(CH3)2), -Y1 y -Y2 independientemente están ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en -Cl y -F, -X y X2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -OH, CH3, -CF3 y -N(R1R2) (por ejemplo, -N(CH3)2), en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C1-C5, en donde el alquilo C1-C5 puede ser lineal, ramificado o cíclico y opcionalmente sustituido con un resto hidrofílico (tal como -OH o -COOH); o una sal de este.
Description
DESCRIPCIÓN
Ésteres activos DCHBS de compuestos PEG y sus usos
La presente invención se refiere a nuevos agentes acilantes, su preparación y su uso para preparar aminoácidos, péptidos y proteínas acilados.
Incorporación como referencia del listado de secuencias
El Listado de Secuencias, titulado "LISTADO DE SECUENCIAS", de 9433 bytes, se creó el 7 de noviembre de 2017 y se incorpora en la presente descripción como referencia.
Antecedentes de la invención
La unión de uno o más sustituyentes a péptidos o proteínas mediante acilación de uno o más grupos amino del péptido o proteína es bien conocida en la técnica. Para un péptido o proteína farmacéutica, esta puede ser una forma eficiente de lograr una duración prolongada de la acción in vivo del péptido o proteína farmacéutica.
Los ejemplos no limitantes de péptidos o proteínas farmacéuticos que han sido acilados incluyen, por ejemplo, péptidos GLP-1 y péptidos de insulina.
Se describen varios ejemplos de péptidos GLP-1 monoacilados, diacilados y triacilados en, por ejemplo, los documentos WO 2006/097537, WO 2011/080103, WO 2012/140117, WO 2015/000942, WO 2015/022400, WO 2016/083499 y WO 2016/097108.
Se describen varios ejemplos de péptidos de insulina acilados en, por ejemplo, el documento WO 2009/115469). Los métodos para acilar péptidos y proteínas se describen, por ejemplo, en los documentos WO 00/55119 y WO 2010/029159.
Tetrahedron Letters, vol. 35, no. 51 pp. 9561-9564 (1994) describe el uso de un cloruro de o-hidroxibencenosulfonilo como un reactivo de condensación.
Resumen
La presente invención se refiere a un nuevo agente acilante en la forma de un éster de un compuesto que comprende un elemento del Quím. 6b:
Quím. 6b:
en donde n es un número entero en el intervalo de 1-2, con un activador de Quím. 1c:
Quím. 1c:
en donde
-Z1 y -Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -Cl, -F, -Br, -NO2 , -CN, -SO2X2, -CONH y -CF3 , en donde X2 se selecciona del grupo que consiste en -OH, CH3 , -CF3 y -N(R 1R2) (por ejemplo, -N(CH 3)2),
-Y1 y -Y2 independientemente están ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en -Cl y -F,
-X se selecciona del grupo que consiste en -OH, CH3, -CF3 y -N(R 1R2) (por ejemplo, -N(CH 3)2),
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C1-C5, en donde el alquilo C1-C5 puede ser lineal, ramificado o cíclico y opcionalmente sustituido con un resto hidrofílico (tal como -OH o -COOH).
Por tanto, la presente invención se refiere a un nuevo agente acilante en la forma de un compuesto que comprende Quím. 7b:
Quím. 7b:
en donde 
n es un número entero en el intervalo de 1-2,
-Z1 y -Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -Cl, -F, -Br, -NO2 , -CN, -SO2X2, -CONH y -CF3 , en donde X2 se selecciona del grupo que consiste en -OH, CH3 , -CF3 y -N(R 1R2) (por ejemplo, -N(CH 3)2),
-Y1 y -Y2 independientemente están ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en -Cl y -F,
-X se selecciona del grupo que consiste en -OH, CH3, -CF3 y -N(R 1R2) (por ejemplo, -N(CH 3)2),
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C1-C5, en donde el alquilo C1-C5 puede ser lineal, ramificado o cíclico y opcionalmente sustituido con un resto hidrofílico (tal como -OH o -COOH);
o una sal de este.
En algunas modalidades, la presente invención se refiere a un nuevo agente acilante en la forma de un éster de un compuesto que comprende un elemento de Quím. 6a:
Quím. 6a:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10, y n es un número entero en el intervalo de 1-2, con un activador de Quím. 1b:
Quím. 1b:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10, y n es un número entero en el intervalo de 1-2; o una sal de este. Este compuesto se puede denominar típicamente éster activado o un éster fenólico activado.
El elemento de Quím. 6a se usa a menudo como un elemento enlazador o espaciador en sustituyentes acilados a uno o más grupos amino de péptidos o proteínas farmacéuticos. Estos sustituyentes, o cadenas laterales, pueden comprender típicamente un resto lipofílico distal, a menudo denominado resto prolongado y un enlazador que típicamente puede comprender uno o más elementos enlazadores que incluyen el elemento enlazador Quím. 6. El resto prolongado y uno o más elementos enlazadores de la cadena lateral pueden estar interconectados típicamente mediante enlaces amida. El elemento Quím. 6a une toda la cadena lateral al péptido o proteína en cuestión, bajo la formación de un enlace amida entre el grupo -CO de Quím. 6a y un grupo amino del péptido o proteína, dando como resultado un péptido o proteína acilado (N-acilado). En consecuencia, el elemento enlazador Quím. 6a es el primer elemento enlazador de la cadena lateral, se puede decir que se encuentra en primer lugar, justo al lado o adyacente al grupo amino del péptido o proteína en cuestión. El grupo amino del péptido o proteína al que se une la cadena lateral puede ser típicamente, pero no exclusivamente, los grupos épsilon-amino de un residuo de Lys del péptido o proteína. Véanse las publicaciones WO mencionadas anteriormente para ver varios ejemplos no limitantes de tales péptidos y proteínas farmacéuticos acilados. Este uso de Quím. 6a también se aplica a Quím. 6b y/o Quím. 6c.
El activador de Quím. 1b puede denominarse brevemente 3,5-DC-2-HBSA, que significa ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibencenosulfónico.
La presente invención también se refiere a un método para preparar el agente acilante de la invención al hacer reaccionar un compuesto que comprende Quím. 6a como se definió anteriormente con un compuesto de Quím. 1a:
Quím. 1a:
en donde R1 es OH o un grupo saliente.
La presente invención también se refiere a un método para acilar un grupo amino en un aminoácido, un péptido o una proteína, el método que comprende una etapa de reacción del aminoácido, péptido o proteína con el agente acilante de la invención.
Finalmente, la presente invención también se refiere a una serie de péptidos y derivados peptídicos de GLP-1 novedosos en los que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales del péptido GLP-1 y cuya preparación mediante el uso del método de acilación de la presente invención se describe en la presente descripción. Estos compuestos pueden denominarse como precursores de los péptidos y derivados peptídicos correspondientes en los que se incluyen los dos aminoácidos N-terminales, que se conocen de las publicaciones WO mencionadas anteriormente.
Los métodos para acilar un péptido o proteína con un sustituyente que comprende el elemento Quím. 6a como un primer elemento enlazador se describe con gran detalle en, por ejemplo, el documento WO 2010/029159 mencionado anteriormente, véase por ejemplo, las páginas 12-14 donde se enumeran varios activadores. La parte experimental del documento WO 2010/029159 informa sobre la preparación de varios agentes acilantes, típicamente en forma de ésteres de N-hidroxisuccinimida, y el uso de los mismos para preparar una variedad de péptidos y proteínas farmacéuticos. El activador usado en los ésteres de N-hidroxisuccinimida activados es NHS (N-Hidroxi Succinimida) de Quím. 2:
Quím. 2:
En un aspecto, la invención proporciona un activador alternativo, el activador Quím. 1b, 3,5-DC-2-HBSA, para su uso en la acilación de un grupo amino de un aminoácido, un péptido o una proteína. En otro aspecto, la invención proporciona un activador alternativo, 3,5-DC-2-HDMBSA, para su uso en la acilación de un grupo amino de un aminoácido, un péptido o una proteína.
También o alternativamente, en un segundo aspecto, la invención proporciona un proceso de acilación mejorado mediante el cual se reducen los problemas en relación con el proceso de acilación conocido.
También o alternativamente, en un tercer aspecto, la invención proporciona un agente acilante de estabilidad mejorada.
También o alternativamente, en un cuarto aspecto, la invención proporciona un proceso de acilación más robusto.
También o alternativamente, en un quinto aspecto, la invención proporciona un proceso de acilación más económico, donde se reduce la cantidad usada del agente acilante y/o se mejora el rendimiento del aminoácido, péptido o proteína acilados deseados.
Descripción
En lo que sigue, las letras griegas pueden representarse por sus símbolo o el nombre escrito correspondiente, por ejemplo: a = alfa; p = beta; s = épsilon; y = gamma; ó = delta; o = omega; etcétera. Además, la letra griega de p puede representarse por "u", por ejemplo en pl = ul, o en pM = uM.
Un asterisco (*) o una línea ondulada en una fórmula Quím. designa i) un punto de unión, ii) un radical, y/o iii) un electrón no compartido.
La presente invención se refiere a nuevos agentes acilantes, métodos para su preparación, el uso de los mismos en la preparación de péptidos y proteínas acilados, y nuevos péptidos y derivados precursores de GLP-1.
Agente acilante
La presente invención se refiere a un compuesto que comprende Quím. 7b:
Quím. 7b:
en donde
n es un número entero en el intervalo de 1-2,
-Z1 y -Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -Cl, -F, -Br, -NO2 , -CN, -SO2X2, -CONH y -CF3 , en donde X2 se selecciona del grupo que consiste en -OH, CH3 , -CF3 y -N(R 1R2) (por ejemplo, -N(CH 3)2),
-Y1 y -Y2 independientemente están ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en -Cl y -F,
-X se selecciona del grupo que consiste en -OH, CH3, -CF3 y -N(R 1R2) (por ejemplo, -N(CH 3)2),
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C1-C5, en donde el alquilo C1-C5 puede ser lineal, ramificado o cíclico y opcionalmente sustituido con un resto hidrofílico (tal como -OH o -COOH);
o una sal de este.
En algunas modalidades, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende Quím. 7a:
Quím. 7a:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10, y los sustituyentes restantes son como se definen en la presente descripción.
En algunas modalidades, -Z1 y/o -Z2 son -Cl. En algunas modalidades, -Z1 y -Z2 son -Cl. En algunas modalidades -Z2 no es -NO2 más o -SO2X2. En algunas modalidades, -X y/X2 son -OH o -N(CH3)2. En algunas modalidades, Y1 y/o Y2 están ausentes. En algunas modalidades, Y1 y Y2 están ausentes.
El compuesto de Quím. 7b o Quím. 7a también puede denominarse como un agente acilante o cadena lateral activada, y es un éster fenólico de un compuesto que comprende un elemento de Quím. 6b o Quím. 6a como se define en la presente descripción, respectivamente, con un activador de Quím. 1c como se define en la presente descripción. El elemento Quím. 6b o Quím. 6 puede denominarse como un elemento enlazador o espaciador. En algunas modalidades, la sal de Quím. 7b o Quím. 7a es una sal de metal alcalino o una sal de amina terciaria.
En algunas modalidades, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende Quím. 7:
Quím. 7:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10, y n es un número entero en el intervalo de 1-2; o una sal de este.
Este compuesto también puede denominarse como un agente acilante o cadena lateral activada, y es un éster fenólico de un compuesto que comprende un elemento de Quím. 6a:
Quím. 6a:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10, y n es un número entero en el intervalo de 1-2, con un activador de Quím. 1b:
Quím. 1b:
El elemento Quím. 6a puede denominarse como un elemento enlazador o espaciador.
En algunas modalidades, cuando k es 1 y n es 1, Quím. 6a representa ácido 8-amino-3,6-d¡oxaoctano¡co, abreviado Ado.
En algunas modalidades, la sal de Quím. 7 es una sal de ácido sulfónico, tal como una sal de metal alcalino o una sal de amina terciaria.
En algunas modalidades, el agente acilante de la invención es un compuesto que comprende la Fórmula I:
Fórmula I:
(P-L)u-BL-B-A, en donde
A es un activador de Quím. 1:
B es un elemento enlazador de Quím. 6:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10 y n es un número entero en el intervalo de 1-2; y p es un número entero en el intervalo de 1-5 con la condición que si k > 1 entonces p es 1;
U representa el número de grupos (P-L) en el compuesto y es 1 o 2;
cada grupo (P-L) comprende
un resto de prolongación (P) seleccionado independientemente de Quím. 10, Quím. 11, Quím. 12, Quím. 13 y Quím.
14:
Quím. 10:
Quím. 14:
y
un enlazador (L) que comprende al menos un elemento enlazador seleccionado de Quím. 15, Quím. 16, Quím. 17 y Quím. 18:
Quím. 15:
en donde
R es -COOH; cada uno de s, x, y, z y l representa independientemente un número entero en el intervalo de 8-20; cada uno de r, m y q representa independientemente un número entero en el intervalo de 0-4; g es un número entero en el intervalo de 1-10; h es un número entero en el intervalo de 1-2 y t es un número entero en el intervalo de 1-5;
BL es un enlazador ramificado opcional seleccionado de Quím. 19 y Quím. 20:
Quím. 19:
en donde u y v representan independientemente un número entero en el intervalo de 0-5, con la condición de que cuando u es 0 v es un número entero en el intervalo de 1-5, y cuando v es 0, u es un número entero en el intervalo de 1-5; y cada w representa independientemente un número entero en el intervalo de 0-2; y
en donde el enlace entre A y B es un enlace éster, el enlace entre P y L es un enlace amida, y
si BL está presente, los enlaces entre L y BL, y BL y B son enlaces amida, o si BL está ausente, el enlace entre L y B es un enlace amida;
o una sal, amida o éster de este.
En algunas modalidades, cuando U es 1 y BL está ausente, la Fórmula I se convierte en la Fórmula Ia: P-L-B-A. Los ejemplos 1-3 y 8 de la presente descripción son ejemplos de agentes acilantes de este tipo.
En algunas modalidades, cuando U es 2 y BL está presente, la Fórmula I se convierte en la Fórmula 1b: (P-L)2-BL-B-A. Los ejemplos 4-7 de la presente descripción son ejemplos de agentes acilantes de este tipo. Estos tienen una estructura bifurcada o en forma de horquilla, donde el enlazador ramificado, BL, proporciona la base de la horquilla. En algunas modalidades, cada P en (P-L)2 es sustancialmente idéntico. En algunas modalidades, cada P en (P-L)2 es idéntico.En algunas modalidades, cada P en (P-L)2 son diferentes.
En algunas modalidades, cada L en (P-L)2 es sustancialmente idéntico. En algunas modalidades, cada L en (P-L)2 es idéntico. En algunas modalidades, cada L en (P-L)2 son diferentes.
En algunas modalidades, cada P-L en (P-L)2 es sustancialmente idéntico. En algunas modalidades, cada P-L en (P-L)2 es idéntico. En algunas modalidades, cada P-L en (P-L)2 son diferentes.
En algunas modalidades, cuando BL es Quím. 19, y u es 0 y v es 4 (o u es 4 y v es 0), el BL puede denominarse como Eps-Lys(Bis) que es un bis-amino tri-radical de lisina. El elemento Quím. 19 puede estar en su forma L o D. En algunas modalidades, el elemento Quím. 19 está en la forma L.
En algunas modalidades, cuando BL es Quím. 20 y w es 1, el BL puede denominarse como Amino-C3-(Gly(Bis)) que es un bis-amino tri-radical de un derivado de glicina.
En algunas modalidades, p en Quím. 6 (B) es 1,2 o 4. En algunas modalidades, k y n en Quím. 6 son ambos 1 (Ado).
En algunas modalidades, P es Quím. 10. En algunas modalidades, s en Quím. 10 es 8-10, tal como 9.
En algunas modalidades, P es Quím. 11. En algunas modalidades, x en Quím. 11 es 16 (diácido C18). En algunas modalidades, x en Quím. 11 es 18 (diácido C20).
En algunas modalidades, L comprende Quím. 15. En algunas modalidades, cuando r, m y q en Quím. 15 son 0, 2 y 1, respectivamente, Quím. 15 puede denominarse como g-Glu (para gamma-Glu). El elemento Quím. 15 puede estar en su forma L o D. En algunas modalidades, el elemento Quím. 15 está en la forma L.
En algunas modalidades, L comprende Quím. 16. En algunas modalidades, g y h en Quím. 16 son ambos 1 (Ado). En algunas modalidades, Quím. 16 se incluye dos veces en L. En algunas modalidades, Quím. 16 se incluye cuatro veces en L. En algunas modalidades, Quím. 16 no está incluido en L.
En algunas modalidades, L comprende Quím. 17, que puede denominarse como Trx (ácido tranexámico). En algunas modalidades, Quím. 17 no está incluido en L.
En algunas modalidades, L contiene de uno a seis elementos enlazadores. En algunas modalidades, L se selecciona de gGlu, Trx-gGlu, Trx-gGlu-2xAdo y Trx-gGlu-4xAdo.
En algunas modalidades, el agente acilante de la invención se selecciona de Quím. 21, Quím. 22, Quím. 23, Quím.
24, Quím. 25, Quím. 26, Quím. 27, y Quím. 28; o una sal, amida o éster aceptable farmacéuticamente de este. Las estructuras de Quím. 21-Quím. 28 se muestran en los Ejemplos 1-8, respectivamente. En algunas modalidades, el agente acilante de la invención se selecciona de Quím. 36, Quím. 37, y Quím. 38; o una sal, amida, o éster aceptable farmacéuticamente de este. Las estructuras de Quím. 36-Quím. 38 se muestran en los Ejemplos 8B-8D, respectivamente.
El Ejemplo 9 de la presente solicitud compara la estabilidad hidrolítica de cadenas laterales activadas o agentes acilantes de la invención con cuatro cadenas laterales de referencia. El Ejemplo 13 de la presente solicitud compara la estabilidad hidrolítica de cadenas laterales activadas o agentes acilantes adicionales de la invención.
En algunas modalidades, el agente acilante de la invención es hidrolíticamente más estable que el correspondiente agente acilante activado con NHS (NHS es Quím. 2, mostrado a continuación).
En algunas modalidades, el agente acilante de la invención es hidrolíticamente más estable que otros activadores fenólicos sustituidos con cloro tales como 2,4-DC-fenol y 2,6-DC-fenol (Quím. 3 y Quím. 4, respectivamente, mostrado a continuación).
En algunas modalidades, el agente acilante de la invención es hidrolíticamente más estable que un agente acilante activado con 3,5-DC-4-HBSA (Quím. 5, mostrado a continuación), que solo difiere del activador para su uso de acuerdo con la invención (3,5-DC-2-HBSA, Quím. 1b, mostrado a continuación) en la posición del grupo hidroxi en el anillo de benceno.
Quím. 1b:
Quím. 2
Quím. 3:
Quím. 4:
Quím. 5:
A continuación se describen modalidades particulares adicionales del agente acilante de la invención, en la sección titulada “MODALIDADES PARTICULARES”.
Método de preparación del agente acilante
La presente invención también se refiere a un método para preparar el agente acilante de la invención.
En algunas modalidades, el método comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto que comprende Quím. 6b o Quím. 6c:
Quím. 6b:
con un compuesto de Quím. 1c como se define en la presente descripción.
En algunas modalidades, Quím. 6b puede usarse como una alternativa a Quím. 6a en métodos o modalidades de la presente descripción que especifican Quím. 6a. En algunas modalidades, Quím. 6c puede usarse como una alternativa a Quím. 6a en métodos o modalidades de la presente descripción que especifican Quím. 6a. En algunas modalidades, Quím. 1c puede usarse como una alternativa a Quím. 1a en métodos o modalidades de la presente descripción que especifican Quím. 1a. En algunas modalidades, el método comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto que comprende Quím. 6a:
Quím. 6a:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10 y n es un número entero en el intervalo de 1-2;
con un compuesto de Quím. 1a:
Quím. 1a:
en donde Ri es OH o un grupo saliente.
En algunas modalidades, el compuesto que comprende Quím. 6a es un carboxilato de Quím. 6a (carboxilato en el extremo derecho), que cuando reaccionó con Quím. 1a da como resultado un anhídrido mixto carboxílico-sulfónico que, después de una fácil reacción de transferencia de acilo intramolecular a la función fenolato, da como resultado el agente acilante de la invención.
Alternativamente, en algunas modalidades, el método comprende una reacción de esterificación de una etapa entre el compuesto que comprende Quím. 6a y la versión de ácido sulfúrico de Quím. 1a (Quím. 1a con R1 = OH, es decir Quím. 1b) que da como resultado el agente acilante de la invención. Un ejemplo no limitante de un reactivo acoplador adecuado para esta reacción es DCC.
En algunas modalidades de cualquiera de estos dos métodos, cuando el extremo izquierdo de Quím. 6a comprende grupos químicos que han sido protegidos (tales como grupos de ácido carboxílico protegidos con, por ejemplo, tBu o Bn), el método también comprende una etapa de desprotección del agente acilante.
En algunas modalidades, el agente acilante preparado por este método es como se define en cualquiera de las modalidades del agente acilante discutidas anteriormente y/o en cualquiera de las “MODALIDADES PARTICULARES” más adelante.
En algunas modalidades, el método comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto de LA Fórmula Ic: (P-L)u-BL-B, con el compuesto de Quím. 1a EN donde R1 es OH o un grupo saliente, y en donde P, L, U, BL y B son como se definen en las secciones de agentes acilantes anteriores y/o en las "MODALIDADES PARTICULARES" más adelante.
En algunas modalidades R1 representa halógeno. En algunas modalidades R1 representa Cl. En algunas modalidades R1 representa OH.
El agente acilante de la invención puede prepararse sobre un soporte sólido mediante el uso de procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida bien conocidos en la técnica, o en fase de solución como también se conocen bien
en la técnica. En la parte Experimental de la presente solicitud se incluyen ejemplos no limitantes de tales métodos de preparación.
A continuación se describen modalidades particulares adicionales del método de preparación del agente acilante de la invención, en la sección titulada “MODALIDADES PARTICULARES”.
Método de uso del agente acilante
La presente invención también se refiere a un método para acilar un grupo amino en un aminoácido, un péptido o una proteína, el método que comprende una etapa de reacción del aminoácido, péptido o proteína con el agente acilante de la invención.
En algunas modalidades, el agente acilante para usar en este método es como se define en cualquiera de las modalidades del agente acilante discutidas anteriormente y/o en las “MODALIDADES PARTICULARES” más adelante.
En algunas modalidades, se acilan uno o más grupos amino en el aminoácido, péptido o proteína. En algunas modalidades, se acilan uno, dos o tres grupos amino. En algunas modalidades, se acilan uno o dos grupos amino. En algunas modalidades, cada grupo amino que se acila es el grupo épsilon-amino de un residuo de Lys en el aminoácido, péptido o proteína (eps-Lys).
El método de acilación de la invención tiene lugar en condiciones adecuadas, que son conocidas por el experto en la técnica. En algunas modalidades, la reacción de acilación tiene lugar en un medio de reacción acuoso (un medio de reacción que contiene agua). En algunas modalidades, el pH en la mezcla de reacción de acilación está en el intervalo de pH 8-14. En algunas modalidades, la temperatura en la mezcla de reacción está en el intervalo de -5°C a 50°C. En algunas modalidades, la reacción de acilación termina cuando se detiene la adición del agente acilante. En algunas modalidades, el método comprende la etapa adicional de ajustar el pH a un pH de 6,5-9,0 después de que se haya detenido la adición del agente acilante.
El método de acilación de la presente invención es bastante robusto. Por ejemplo, proporciona una gran flexibilidad con respecto a la adición del agente acilante de la invención al aminoácido, péptido o proteína a acilar. Además, o alternativamente, no hay necesidad de que el recipiente de reacción tenga un diseño particular. Además, o alternativamente, no es necesario que la agitación sea óptima u optimizada. El Ejemplo 10 de la presente descripción demuestra que el agente acilante de la invención puede añadirse como una solución, y lentamente, rápidamente o con velocidad intermedia, o puede añadirse como un sólido, sin afectar el rendimiento del producto deseado. Esto es contrario al conocido método de acilación basado en NHS, donde el agente acilante debe añadirse muy lentamente y bajo un control riguroso debido a su inestabilidad hidrolítica.
El método de acilación de la presente invención da un producto de mayor pureza y/o con un proceso más económico en comparación con el método de acilación conocido basado en NHS. Como se demuestra en los Ejemplos 10-12 de la presente descripción, la pureza puede ser al menos similar, y/o tiene que usarse una cantidad menor del agente acilante (menor excedente o menos equivalentes de la cadena lateral (Eq SC) en relación con la cantidad de aminoácido, péptido o proteína que se va a acilar).
En algunas modalidades, el método de acilación de la presente invención comprende una etapa adicional, después de la reacción de acilación, de purificar el producto deseado de la reacción de acilación. Los expertos en la técnica conocen métodos adecuados para purificar aminoácidos, péptidos y proteínas acilados.
En algunas modalidades, el método de acilación de la presente invención comprende una etapa adicional, antes de la reacción de acilación, de disolver el aminoácido, péptido o proteína que se va a acilar. En algunas modalidades, el aminoácido, péptido o proteína se disuelve en una solución acuosa. Los expertos en la técnica conocen los intervalos adecuados de pH, concentración de aminoácidos, péptidos o proteínas y temperatura.
El método de acilación de la invención se refiere a "aminoácido, péptido o proteína" ya que en principio es aplicable a cualquier aminoácido, péptido o proteína, cualquiera que sea el tamaño (número de residuos de aminoácidos) u otro parámetro estructural.
Un aminoácido puede definirse como un compuesto que comprende un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. El grupo amino puede, por ejemplo, ser un grupo amino primario o secundario. Un aminoácido incluye opcionalmente uno o más grupos adicionales a los que a menudo se hace referencia como una cadena lateral de aminoácidos. Los aminoácidos pueden clasificarse de diversas formas, por ejemplo, según el origen, como aminoácidos codificados o aminoácidos no codificados. Los aminoácidos codificados pueden definirse por referencia a la tabla 1 de la IUPAC en la sección 3AA-1. Puede usarse cualquier aminoácido en el método de acilación de la invención. En algunas modalidades, el aminoácido es un aminoácido codificado. En algunas modalidades, el aminoácido es un aminoácido no codificado. Un ejemplo no limitante de un aminoácido no codificado es Aib (ácido alfa-aminoisobutírico).
La distinción entre péptido y proteína puede no ser siempre del todo clara. Por ejemplo, un péptido a veces se define de modo que contenga un máximo de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, un polipéptido a veces que contenga un mínimo de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos y una proteína a veces consiste en uno o más péptidos o polipéptidos dispuestos en una estructura más compleja que puede ser necesaria para la actividad biológica. Sin embargo, la insulina (que consiste en dos cadenas de péptidos cada una de una longitud de menos de 50 aminoácidos, acopladas mediante enlaces Cys-Cys) se conoce tradicionalmente como un péptido.
Para el presente propósito se aplican las siguientes definiciones: Un péptido contiene hasta un total de 200 residuos de aminoácidos, en una o más cadenas de péptidos individuales; y una proteína contiene más de 200 aminoácidos en total, en una o más cadenas de péptidos individuales.
Los ejemplos no limitantes de péptidos para su uso en el método de la invención incluyen el péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) que es un péptido de 31 residuos de aminoácidos ((GLP-1) humano nativo en una cadena), insulina que es un péptido de 51 residuos de aminoácidos en total (insulina humana nativa, 30 aminoácidos en la cadena B y 21 aminoácidos en la cadena A), proinsulina que es un péptido de 86 residuos de aminoácidos en una cadena (proinsulina humana nativa que incluye el péptido A, B y C) y pre-proinsulina que es un péptido que además de los 86 aminoácidos de la proinsulina incluye una pre-secuencia de 24 residuos de aminoácidos en una cadena (preproinsulina humana nativa).
En algunas modalidades, el péptido para usar en el método de la invención contiene a) al menos 2 residuos de aminoácidos, b) al menos 5 residuos de aminoácidos, c) al menos 20 aminoácidos; y/o d) un máximo de 150 residuos de aminoácidos.
En algunas modalidades, la proteína no contiene más de 2000 residuos de aminoácidos en total.
En algunas modalidades, el aminoácido, péptido o proteína para usar en el método de acilación de la invención es un aminoácido.
En algunas modalidades, el aminoácido, péptido o proteína para usar en el método de acilación de la invención es un péptido.
En algunas modalidades, el aminoácido, péptido o proteína para usar en el método de acilación de la invención es una proteína.
Los residuos de aminoácidos incorporados en el péptido o proteína para su uso en el método de acilación de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos codificados y/o no codificados. El término "aminoácidos codificados" se refiere a los 20 aminoácidos "naturales" (véase, por ejemplo, IUPAC, tabla 1, sección 3AA-1). Un ejemplo no limitante de un aminoácido no codificado es Aib, que se refiere al ácido alfa-aminoisobutírico (nombre alternativo alfametilalanina). A menos que se especifique lo contrario, el(los) residuo(s) de aminoácido en el aminoácido, péptido o proteína para usar en el método de acilación de la invención están en la forma L.
En algunas modalidades, el péptido o proteína para usar en el método de acilación de la invención es un péptido o proteína farmacéutica, lo que significa que el péptido o proteína tiene un efecto, demostrado in vitro o in vivo, que se considera al menos potencialmente relevante para la profilaxis o el tratamiento de una o más enfermedades. Los ejemplos no limitantes de enfermedades incluyen diabetes, obesidad y enfermedades y trastornos relacionados.
Los ejemplos no limitantes de péptidos o proteínas que se van a acilar mediante el uso del método de la invención incluyen GLP-1, insulina, pYY, amilina y análogos de estos.
En algunas modalidades, el péptido o proteína que se acila es un péptido GLP-1. El término péptido GLP-1 incluye GLP-1(7-37) humano nativo (SEQ ID NO: 1), así como también análogos de este (análogos de GLP-1). En algunas modalidades, el análogo de GLP-1 tiene un máximo de 10 cambios de aminoácidos en comparación con GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1). En algunas modalidades, los cambios de aminoácidos se seleccionan entre sustituciones, extensiones y deleciones de aminoácidos, en comparación con GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1). En algunas modalidades, el análogo de GLP-1 comprende una secuencia de aminoácidos de la Fórmula III:
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42;
en donde Xaa7 es L-histidina, ácido (S)-2-hidroxi-3-(1H-imidazol-4-il)-propiónico, D-histidina, desamino-histidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, Na-formil-histidina, Na-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Ser, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, o ácido (1-aminociclobutil) carboxílico; Xaa12 es Phe o Leu; Xaa16 es Val o Leu; Xaa18 es Ser, Val, Arg, o Leu; Xaa19 es Tyr o Gln; Xaa20 es Leu, Lys, o Met; Xaa22 es Gly o Glu; Xaa23 es Gln, Glu, o Arg; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es Lys o Arg; Xaa27 es Glu, Lys, o Leu; Xaa30 es Ala, Glu, o Arg; Xaa31 es Trp o His; Xaa33 es Val; Xaa34 es Arg, His, Asn, Gly, o Gln; Xaa35 es Gly, Ala, o ausente; Xaa36 es Arg, Lys, Gly, o ausente; Xaa37 es Gly, Pro, Lys, o ausente; Xaa38 es Ser, Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, o ausente;
Xaa39 es Ser, Gly, Ala, Glu, Pro, o ausente; Xaa40 es Ser, Gly, Ala, Glu, Pro, o ausente; Xaa41 es Ser, Gly, Ala, Glu, Pro, o ausente; y Xaa42 es Lys o ausente; en donde al menos uno de Xaa20, Xaa26, Xaa27, Xaa36, Xaa37, Xaa38, y Xaa42 es Lys; con la condición de que si uno de Xaa35, Xaa36, Xaa37, Xaa38, Xaa39, Xaa40, o Xaa41 está ausente, entonces cada uno de los aminoácidos subsecuentes también está ausente; o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
En la Fórmula III y fórmulas similares en la presente descripción, la numeración de los residuos de aminoácidos sigue la práctica establecida en la técnica para GLP-1 nativo, principalmente que el primer residuo de aminoácido (N-terminal) se numera o se concede la posición núm. 7, y los residuos de aminoácidos subsecuentes aguas abajo hacia el extremo C se numeran 8, 9, 10, y así sucesivamente, hasta el último residuo de aminoácidos (C-terminal). En el GLP-1 nativo el residuo de aminoácido C-terminal es Gly, con el número 37. Sin embargo, como aparece en la fórmula anterior, en el péptido de la Fórmula III el aminoácido C-terminal puede ser cualquiera de los residuos de aminoácidos entre Xaa34 y Xaa42 es decir, tener un número de 34 a 42.
La numeración es diferente en el listado de secuencias, donde el primer residuo de aminoácido de la SEQ ID NO: 1 (His) se asigna núm. 1 y el último (Gly) núm. 31. Sin embargo, en la presente descripción seguimos la práctica de numeración establecida en la técnica, como se explicó anteriormente.
Un análogo de GLP-1 pueden describirse por referencia i) al número del residuo de aminoácido en el GLP-1(7-37) nativo correspondiente al residuo de aminoácido que se cambia (es decir, la posición correspondiente en el GLP-1 nativo) y ii) al cambio actual.
La “posición correspondiente”, así como también la cantidad y el tipo de cambios, se deducen fácilmente, por ejemplo mediante simple escritura y a simple vista (inspección visual); y/o puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptidos, tal como "align" que se basa en un algoritmo de Needleman-Wunsch. Este algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa de alineamiento de Myers y W. Miller en "Alignments Optimum in Linear Space" CABIOS (aplicaciones informáticas en las biociencias) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM62 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una interrupción puede fijarse en -12 o preferentemente en -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupción en -2 o preferentemente en -0,5.
En algunas modalidades, el péptido GLP-1 para usar en la reacción de acilación de la invención se selecciona de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 18; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
En algunas modalidades, el péptido o proteína para usar en la reacción de acilación de la invención es un precursor de un péptido GLP-1, en donde los dos aminoácidos correspondientes a los residuos de aminoácidos en la posición 7 y 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1) han sido eliminados. El péptido precursor de GLP-1 es en todos los demás aspectos como se definió anteriormente y en las "MODALIDADES PARTICULARES" más adelante. En algunas modalidades, el precursor se selecciona de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 17, y la SEQ ID NO: 19; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
En algunas modalidades, el precursor se prepara mediante expresión recombinante. Los expertos en la técnica conocen métodos de expresión recombinantes adecuados, véanse, por ejemplo, los Ejemplos 1-3 del documento WO 2009/083549. En algunas modalidades, el precursor se purifica antes de ser acilado de acuerdo con la invención. En algunas modalidades, el precursor acilado, producto de la reacción de acilación de la invención, se purifica en una etapa adicional.
En algunas modalidades, el precursor acilado se hace reaccionar (se liga) con un dipéptido protegido (His-Aib) de Quím. 8:
en donde R2 es H o un grupo protector de amino, y R3 es un grupo protector de amino; o R2 es un grupo alquilo eliminable, y R3 es H o un grupo alquilo eliminable; o R2 y R3 están formando conjuntamente un anillo; R4 es H, o un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión de metal que forma una sal con el grupo carboxilato; y R5 está ausente o es una sal ácida, lo que resulta en el péptido o proteína acilado de longitud completa correspondiente con grupos de protección en el N-terminal del péptido o proteína.
Las condiciones de reacción de ligación adecuadas que incluyen grupos R preferidos en Quím. 8, y cómo eliminar los grupos de protección en el N-terminal se describen en el documento WO 2013/098191.
En algunas modalidades, el método de acilación de la invención cuando se aplica a un péptido precursor de GLP-1 incluye una o más de las siguientes etapas adicionales: (i) purificar el precursor acilado, (ii) ligar el dipéptido Quím. 8 a él, (iii) desproteger el N-terminal y (iv) purificar el péptido GLP-1 de longitud completa acilado resultante.
En algunas modalidades, los péptidos GLP-1 acilados (excluyendo los precursores) que se producen mediante el uso del método de acilación de la invención son agonistas del receptor de GLP-1.
Un agonista de receptor puede definirse como un análogo que se une a un receptor y provoca una respuesta típica del ligando natural (ver, por ejemplo, "Principles of Biochemistry", AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Segunda Edición, Worth Publishers, 1993, página 763). Así, por ejemplo, un “agonista del receptor de GLP-1” puede definirse como un compuesto que es capaz de unirse al receptor de GLP-1 humano y es capaz de activarlo. Se conocen en la técnica ensayos adecuados de unión al receptor de GLP-1 y activación del receptor de GLP-1. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 33 y 34 en el documento WO 2016/083499.
En algunas modalidades, el péptido o la proteína que se va a acilar mediante el uso del método de la invención es un péptido de insulina. El término péptido de insulina incluye insulina humana, proinsulina humana, pre-proinsulina humana y análogos de estos. Las secuencias de la insulina humana, proinsulina humana y pre-proinsulina humana son conocidas en la técnica. En algunas modalidades, el análogo de insulina para usar en el método de acilación de la invención tiene un máximo de 10 cambios de aminoácidos en comparación con la insulina humana. En algunas modalidades, el máximo de 10 cambios de aminoácidos se compara con la proinsulina humana. En algunas modalidades, el análogo de insulina comprende al menos uno de los siguientes cambios de aminoácidos: A14E, B16H, B25H, desB27 y/o desB30. La terminología usada en la presente descripción para nombrar análogos de insulina es la habitual en la técnica, como se explica, por ejemplo, en el documento WO 2009/115469. Así, por ejemplo, A14E se refiere al aminoácido correspondiente al residuo de aminoácido núm. 14 en la cadena A de la insulina humana que ha sido reemplazado por Glu (E); B16H se refiere al aminoácido correspondiente al residuo de aminoácido núm. 16 en la cadena B de la insulina humana que ha sido reemplazado por His (H); y desB30 se refiere al aminoácido correspondiente al residuo de aminoácido núm. 30 en la cadena B de la insulina humana que ha sido eliminado. Para identificar los números de posición/residuos correspondientes, puede usarse escritura manual simple e inspección visual, y/o un programa de alineación tal como align, como se discutió anteriormente para los análogos de GLP-1. En algunas modalidades, el análogo de insulina para usar en el método de acilación de la presente invención se selecciona de i) insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30 (SEQ ID NO: 8 y 9); ii) insulina humana A14E, B25H, desB30 (SEQ ID NO: 10 y 11); iii) insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30 (SEQ ID NO: 20 y 21); o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
En algunas modalidades, el péptido de insulina para usar en el método de acilación de la invención es un análogo de la proinsulina humana, que puede prepararse mediante expresión recombinante. Los expertos en la técnica conocen métodos de expresión recombinantes adecuados, véase, por ejemplo, el documento WO 2009/115469 mencionado anteriormente. En algunas modalidades, el método de acilación de la invención cuando se aplica a un análogo de proinsulina humana incluye uno o más de las siguientes etapas adicionales: (i) purificar el análogo de proinsulina acilado, (ii) escindir la parte del péptido C (por ejemplo, enzimáticamente ) y (iii) purificar el péptido de insulina acilado.
En algunas modalidades, el péptido de insulina acilado final producido por el método de acilación de la invención (que excluye la proinsulina acilada, pre-proinsulina y análogos de estas) tiene afinidad por un receptor de insulina. Se conocen en la técnica ensayos adecuados de afinidad del receptor de insulina, véase, por ejemplo, el Ejemplo 178 del documento WO 2009/115469. Mediante el uso de este ensayo con 0 % de HSA, el péptido de insulina acilado final producido de acuerdo con la invención tiene una afinidad de al menos 0,10 %.
En algunas modalidades, el péptido o la proteína que se va a producir mediante el método de la invención es un agonista del receptor de pYY. En los documentos Wo 2015/071355 y WO 2015/071356 se describen ejemplos no limitantes de agonistas del receptor de pYY adecuados.
En algunas modalidades, el péptido o proteína que se produce mediante el método de la invención es un agonista del receptor de amilina. En los documentos WO 2016/034604, WO 2012/168430, WO 2012/168431 y WO 2012/168432 se describen ejemplos no limitantes de agonistas del receptor de amilina adecuados.
En algunas modalidades, el método de acilación de la invención incluye una etapa adicional de eliminar una secuencia señal secretora del péptido o proteína. La secuencia señal secretora puede tener la forma de una extensión N-terminal y/o C-terminal, véase, por ejemplo, la pág. 44 del documento WO 2009/083549.
En algunas modalidades del método de acilación de la invención, el aminoácido N-terminal del péptido o proteína está cargado negativamente. Un ejemplo no limitante de un residuo de aminoácido cargado negativamente es Glu.
A continuación se describen modalidades particulares adicionales del método de uso del agente acilante de la invención, en la sección titulada “MODALIDADES PARTICULARES”.
Nuevos compuestos precursores de GLP-1
Se describen los siguientes nuevos compuestos:
(xi) un compuesto como se muestra en el Ejemplo 3 del documento WO 2015/000942 en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,
(xii) un compuesto como se muestra en el Ejemplo 11 del documento WO 2015/000942 en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,
(xiv) un compuesto como se muestra en el Ejemplo 31 del documento WO 2012/140117 en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,
(xv) un compuesto como se muestra en el Ejemplo 5 del documento WO 2012/140117 en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,
(xvi) un compuesto como se muestra en el Ejemplo 2 del documento WO 2011/080103 en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,
(xvii) un compuesto como se muestra en el Ejemplo 14 del documento WO 2016/097108 en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,
(xiix) un compuesto como se muestra en el Ejemplo 1 del documento WO 2016/097108 en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,
(xix) un compuesto como se muestra en el Ejemplo 11 del documento WO 2016/083499 en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,
(xx) un compuesto como se muestra en el Ejemplo 12 del documento WO 2016/083499 en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,
en donde los Ejemplos relevantes de cada una de las publicaciones WO referidas en (xi)-(xii) y (xiv)-(xx) anteriormente se incorporan en la presente descripción como referencia; o
un compuesto que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 17, o la SEQ ID NO: 19; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
Sales, amidas y ésteres
La cadena lateral activada de la invención (el agente acilante), el péptido y la proteína para usar en el método de acilación de la invención y el péptido y la proteína acilados resultantes, así como también el nuevo compuesto precursor de GLP-1 de la invención pueden estar en forma de una sal, amida o éster. En algunas modalidades, la sal, amida o éster son farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, la sal, amida o éster se forma en uno o más grupos químicos del compuesto en cuestión.
Las sales se forman, por ejemplo, mediante una reacción química entre una base y un ácido, por ejemplo: 2NH3 + H2SO4 ^ (NH4)2SO4.
La sal puede ser una sal básica, una sal ácida, o puede no ser ninguna de estas (es decir, una sal neutra). En agua, las sales básicas producen iones hidróxido y las sales ácidas iones hidronio.
Las sales pueden formarse con cationes o aniones añadidos entre los grupos aniónicos o catiónicos, respectivamente. Estos grupos pueden ubicarse en, por ejemplo, el resto peptídico, y/o en el resto de la cadena lateral.
Los ejemplos no limitantes de grupos aniónicos incluyen grupos carboxílicos libres y grupos de ácido sulfónico libres en la cadena lateral, si los hay, así como también en el resto peptídico. La porción peptídica incluye frecuentemente
un grupo de ácido carboxílico libre en el C-terminal y puede incluir, además, grupos carboxílicos libres en los residuos aminoacídicos ácidos internos tales como Asp y Glu.
Los ejemplos no limitantes de grupos catiónicos en la porción peptídica incluyen el grupo amino libre en el N-terminal, si se presenta, así como también cualquier grupo amino libre de residuos aminoacídicos básicos internos tales como His, Arg y Lys.
El éster de los derivados de la invención puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo de ácido carboxílico libre con un alcohol o un fenol, que conduce al reemplazo de al menos un grupo hidroxilo por un grupo alcoxi o ariloxi.
La formación de ésteres puede implicar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, y/o cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral.
La amida de los derivados de la invención puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo de ácido carboxílico libre con una amina o una amina sustituida, o mediante la reacción de un grupo amino libre o sustituido con un ácido carboxílico.
La formación de amida puede involucrar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral, el grupo amino libre en el N-terminal del péptido, y/o cualquier grupo amino libre o sustituido del péptido en el péptido y/o la cadena lateral.
En algunas modalidades, la sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable es una sal farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable es una amida farmacéuticamente aceptable, preferentemente con un grupo amida en el C-terminal del péptido. En algunas modalidades, la sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable es un éster farmacéuticamente aceptable.
A menos que se defina lo contrario en la presente descripción, el término "un" significa "uno o más".
A menos que se defina lo contrario en la presente descripción, el término "aproximadamente" significa /- 10 %. A menos que se defina lo contrario en la presente descripción, los términos presentados en forma singular también incluyen la situación en plural.
EJEMPLOS
Esta parte experimental comienza con una lista de abreviaturas y le continúa una sección que incluye los métodos generales para sintetizar y caracterizar los análogos y derivados de péptidos de la invención. Luego sigue una serie de ejemplos que se relacionan con la preparación de cadenas laterales activadas específicas, y al final se han incluido una serie de ejemplos relacionados con las propiedades de estas cadenas laterales activadas y su uso para acilar péptidos o análogos de proteínas para producir los derivados deseados del mismo. Los ejemplos sirven para ilustrar la invención.
Abreviaturas usadas:
Las siguientes abreviaturas se usan en el resto de esta parte experimental.
AcOH: Ácido acético
Ado: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico
Cadena principal: Péptido o análogo de péptido (GLP-1, insulina)
Boc terc Butiloxicarbonilo
Bn: Bencilo
Bz: Benzoilo
CH3CN: Acetonitrilo
DCC: N,N'-diciclohexilcarbodiimida
DCM: Diclorometano
DIC: Diisopropilcarbodiimida
DIPEA: Diisopropiletilamina
DMAP: 4-Dimetilaminopiridina
DMF: W,W-Dimetilfori r iaiT iida
EDC: 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EtOAc: Etilacetato
Et2O: Dietil éter
Eq: Equivalente
Fmoc: 9 H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo
HFIP: Hexafluoroisopropanol
H2O: Agua
HOBt: 1-Hidroxibenzotriazol
/-PrOH Isopropanol
MeOH Metanol
MeTHF Metil tetrahidrofurano
MgSO4 : Sulfato de Magnesio
PM: Peso molecular
NaOH: Hidróxido de sodio
NHS: N-Hidroxisuccinimida
NMP: 1 -metil-pirrolidin-2-ona
OEG: Oligo etilenglicol, nombre alternativo a Ado, ver arriba OtBu: éster de terc-Butilo
Oxyma Pure®: Éster etílico de ácido ciano-hidroxiimino-acético TA: Temperatura ambiente
OSu: éster de N-hidroxisuccinimida
Pd/C: Paladio sobre carbono
Pt/C: Platino sobre carbono
PTFE: Politetrafluoroetileno
qNMR: Resonancia magnética nuclear cuantitativa
SC: Cadena lateral
tBu: terc-Butilo
TEA: Trietilamina
TFA: Ácido trifluoroacético
THF: Tetrahidrofurano
TIPS: Triisopropilsilano
T rx: Ácido tranexámico (ácido trans-4-(aminometil)cidohexanocarboxílico)
Vol: Volumen
A. Materiales y métodos generales de preparación, detección y caracterización
Esta sección se refiere a métodos para la síntesis de péptidos en fase sólida (métodos SPPS, que incluyen métodos para la desprotección de aminoácidos, métodos para escindir el péptido de la resina y para su purificación), así como los métodos para detectar y caracterizar las cadenas laterales resultantes. (Métodos LCMS y UPLC y NMR). Los espectros NMR de 1H y13C se registraron a 400 MHz y 100 MHz, respectivamente, en un instrumento Bruker Aeon 400. Para qNMR se usó 1,3-benzodioxol como la referencia estándar. Los desplazamientos químicos se informan en ppm en la 8 escala relativa al desplazamiento químico del disolvente deuterado. La prueba de Kaiser (presencia de aminas libres en SPPS) y la prueba de cloranilo (prueba de piperidina en NMP) se realizaron de acuerdo con “Fmoc solid phase peptide synthesis a practical approach” Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford 2000 (2004), University Press páginas 61-62.
A1. Métodos de preparación y modificación
1. Síntesis de la cadena lateral protegida
Las cadenas laterales protegidas unidas a resina se prepararon en una resina de 2-clorotritilcloruro mediante el uso de química de Fmoc estándar. El primer ácido aminocarboxílico protegido con Fmoc (2 eq) (elemento enlazador) se disolvió en DCM y se añadió a una resina lavada y drenada con DCM. Se añadió una base de amina terciaria tal como DIPEA o TEA (4 Eq) y la mezcla de resina se agitó durante un período de tiempo entre 12 y 17 horas a RT. Se dejó que la resina reaccionara con MeOH (0,79 ml/g de resina) para cubrir los sitios de cloruro libres a RT durante 1 hora. La resina se drenó y se lavó en flujo tres veces con NMP o DMF (aproximadamente 5,2 ml/g de resina).
La desprotección de Fmoc se logró mediante el uso de piperidina en NMP, preferentemente piperidina al 20 % (1,05 ml/g de resina) en NMP (4,15 ml/g de resina), a RT durante 15 a 45 min, típicamente 30 min, antes de que la resina se lavara a fondo con NMP o DMF. La etapa se repitió hasta que se obtuvo la desprotección completa, típicamente dos veces o más. La resina se drenó y se lavó en flujo tres veces o más con NMP o DMF (aproximadamente 5,2 ml/g de resina) hasta que la prueba de Cloranilo dio un resultado negativo.
El acoplamiento de los ácidos amino carboxílicos protegidos con Fmoc secuenciales (enlazador) y el diácido carboxílico monoprotegido final (tal como el ácido 18-benciloxi-18-oxo-octadecanoico) o el diácido fenoxicarboxílico (tal como el ácido 10-(4-benciloxicarbonilfenoxi)decanoico), (prolongador) se logró mediante el uso de condiciones de acoplamiento convencionales como se describe a continuación.
A una solución de ácido aminocarboxílico protegido con Fmoc (2-3 eq.) en un solvente como NMP o DMF y Oxyma Pure® (2-3 eq.) se le añadió DIC (2-3 eq.). La mezcla se agitó durante 15 a 60 min antes de añadirla a la resina. La mezcla se agitó a RT durante 1 a 18 horas, típicamente 17 horas. Alternativamente, si el acoplamiento no se completó a juzgar por la prueba de Kaiser, la etapa se repitió hasta que se logró una prueba negativa.
Después de la síntesis, la resina se lavó con DCM y la cadena lateral protegida se escindió de la resina mediante tratamiento con TFA al 1 % en DCM durante 1-3 horas. La solución de escisión se evaporó al vacío hasta la sequedad y el material bruto se usó sin purificación adicional en la etapa de activación descrita en la siguiente sección.
2. Activación de la cadena lateral protegida
La activación de la cadena lateral protegida obtenida del procedimiento 1 se realizó mediante el uso de condiciones estándar conocidas en la técnica.
Los ésteres de NHS se prepararon mediante uno de los siguientes procedimientos: El ácido carboxílico (cadena lateral protegida del procedimiento 1) se disolvió en un solvente apropiado tal como DCM. Se añadieron NHS y EDC a la solución junto con una base de amina terciaria tal como DIPEA o t Ea . La mezcla se agitó a RT hasta que la reacción se completó, típicamente de 3 a 16 horas. Alternativamente el ácido carboxílico se disolvió junto con NHS y tratarse con DIC. La fase orgánica se lavó con una mezcla 1:1 de HCl 0,5 M (ac.) y NaCl saturado. Después de la separación de las fases, la fase orgánica se secó sobre MgSO4. La filtración y evaporación del solvente produjeron un material bruto que se usó directamente en la siguiente etapa.
Los ésteres fenólicos (tal como los ésteres de 2,4-DC-fenol y 2,6-DC-fenol) se prepararon mediante el siguiente procedimiento: El ácido carboxílico (cadena lateral protegida del procedimiento 1) se disolvió en un solvente apropiado tal como THF, DCM, NMP o DMF. Se añadieron a la solución el derivado fenólico sustituido relevante, DMAP y EDC. La mezcla se agitó a RT hasta que la reacción se completó, típicamente de 2 a 16 horas. La mezcla de productos se
sometió al mismo procedimiento de elaboración descrito para el caso de NHS con una diferencia. Después de la separación de las fases, la fase orgánica se lavó con una mezcla 1:1 de NaHCO3 al 5 % (vol/vol) (ac) y NaCl saturado seguido de otro lavado con una mezcla 1:1 de NaHSO4 al 10 % (vol/vol) y NaCl saturado. La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el solvente se eliminó al vacío. El material bruto se usó directamente en la siguiente etapa.
3. Métodos para la eliminación de grupos de protección tBu o Bn
La desprotección de los ésteres de tBu o Bn se logró mediante el uso de procedimientos estándar descritos en la literatura (Greene's Protective Group in Organic Synthesis, 4ta adición, ISBN-13:978-0471697541).
Método: Mod_Bz_1
La desprotección del éster bencílico se realizó mediante el siguiente procedimiento; la cadena lateral activada del procedimiento 2 anterior, se disolvió en un solvente adecuado tal como THF, EtOAc, acetona, /'-PrOH, AcOH, NMP, DMF o HFIP. Se añadió un catalizador heterogéneo tal como Pd/C o Pt/C y la mezcla resultante se agitó bajo una atmósfera de gas hidrógeno hasta que se completó la reacción. El tiempo de reacción fue típicamente de una a 16 horas. La mezcla de reacción se filtró para eliminar el catalizador y la cadena lateral activada se aisló por precipitación en un solvente apropiado tal como éter dietílico, MeTHF, EtOAc o heptano. Un procedimiento de aislamiento alternativo fue extraer el producto de una mezcla 1:1 de EtOAc y agua. Después de la separación de las fases, la fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el solvente se evaporó a presión reducida para producir el material bruto.
Método: Mod_tBu_1
La desprotección del éster terc-butílico se realizó mediante el siguiente procedimiento; la cadena lateral activada del procedimiento 2 anterior se disolvió en una mezcla de TFA con 1-3 % de agua. La mezcla se agitó a RT hasta que la reacción se completó, típicamente de 1 a 3 horas. Alternativamente, podría usarse ácido clorhídrico concentrado o TFA o una mezcla 1:1 de TFA y un solvente adecuado tal como THF o DCM en su lugar. La mezcla de productos se sometió a evaporación al vacío para producir un aceite bruto. La precipitación del aceite en un solvente apropiado tal como dietiléter, isopropiléter, terc-butilmetiléter o heptano seguido de filtración proporcionó el material bruto.
Las cadenas laterales activadas se secaron al vacío, se analizaron por UPLC, MS o NMR y se usaron en los ejemplos descritos en la sección C sin purificación adicional.
A2. Métodos Generales de Detección, Análisis y Caracterización
1. Métodos de LC-MS
Método: LC-MS_A_1
El análisis se realizó en una configuración que consiste en un sistema UPLC Waters H-Class equipado con un espectrómetro de masas QDa. El control del instrumento y la adquisición de los datos se realizaron mediante el programa Empower 3 Build 3471 SPs.
La bomba UPLC se conectó a dos recipientes de elución que contenían:
A: Ácido fórmico al 0,1 % (vol/vol) en agua
B: Ácido fórmico al 0,1 % (vol/vol) en acetonitrilo
El análisis se realizó a RT mediante la inyección de un volumen apropiado de la muestra (preferentemente 2-10 j l ) en la columna que se eluyó con un gradiente de A y B.
Las condiciones de UPLC, las configuraciones del detector y las configuraciones del espectrómetro de masa fueron: Columna: Acquity UPLC® H Waters BEH C-18, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm.
Gradiente: 10 % - 90 % (vol/vol) de acetonitrilo lineal durante 9 min a 0,40 ml/min
Detección: 214 nm (salida analógica del TUV (detector de UV sintonizable))
Modo de ionización de MS: API-ES (positivo o negativo).
Barrido: 250-1250 amu) en el paso 0,1 de amu.
Método: LC-MS A 2
El análisis de RP se realizó mediante el uso del sistema Waters Acquity UPLC. Detección UV a 214 y 280 nm. Columna: Waters Acquity BEH C18, 1,7 um, 2,1 x 150 mm. Temperatura propia de la columna = 40 °C.
A: agua
B: acetonitrilo
D: formiato de amonio 50 mM pH 9 en agua
Gradiente: 95 a 0 % (vol/vol) de A, 0 a 95 % (vol/vol) de B y 5 % (vol/vol) de D, 4 min, 0,4 ml/min
Detector: Waters Xevo G2-XS Qtof barrido negativo 50-4000
Método: LC-MS_A_3
El análisis de RP se realizó mediante el uso del sistema Waters Acquity UPLC. Detección UV a 214 y 280 nm. Columna: Waters Acquity BEH C18, 1,7 um, 2,1 x 150 mm. Temperatura propia de la columna = 40 °C.
A: ácido fórmico al 0,10 % (vol/vol) en agua
B: ácido fórmico al 0,10 % (vol/vol) en acetonitrilo
Gradiente: 5 a 95 % (vol/vol) de B, durante 4 min 0,4 ml/min
Detector: Waters Xevo G2-XS Qtof barrido positivo 50-4000
2. Métodos de UPLC y HPLC
Método: UPLC_A_1
El análisis de RP se realizó mediante el uso del sistema Waters Acquity UPLC equipado con un detector de celda de flujo analítico TUV. Detección UV a 210 nm. Columna: Waters C18 BEH, 1,7 pm, 100 A, 50 mm x 2,1 mm. Temperatura propia de la columna = 35 °C.
Eluyente: A acetonitrilo al 10 % (vol/vol) TFA al 0,1 % (vol/vol) en agua.
Eluyente: B acetonitrilo al 95 % (vol/vol) TFA al 0,1 % (vol/vol) en agua.
Flujo 0,5 ml/min, gradiente: 70 %-40 % de A (vol/vol) durante 1,5 min, 40 % (vol/vol) de A durante 1,2 min, 40-0 % (vol/vol) de A durante 0,05 min, 0 % de A durante 1,25 min.
Método: UPLC_A_2
El análisis RP se realizó mediante el uso del sistema Waters Acquity UPLC equipado con un detector PDA. Detección UV a 214, 254 y 280 nm. Columna: Kinetex C18, 1,7 pm, 100 A, 50 mm x 2,1 mm. Temperatura propia de la columna = 35 °C. Gradiente lineal de acetonitrilo al 10-90 % (vol/vol) TFA al 0,1 % (vol/vol) en agua. Flujo 0,6 ml/min.
Método: UPLC_A_3
El análisis de RP se realizó mediante el uso del sistema Waters Acquity UPLC. Detección UV a 214 nm. Columna: Waters C18 BEH, 1,7 um, 2,1 x 150 mm. Temperatura propia de la columna = 40 °C.
A: TFA al 0,05 % (vol/vol) en agua
B: TFA al 0,05 % (vol/vol) en acetonitrilo
Gradiente: 5 a 60 % (vol/vol) de B, 16 min, 0,4 ml/min
Método: UPLC_A_4
El análisis de RP se realizó mediante el uso del sistema Waters Acquity UPLC. Detección UV a 214 nm. Columna: Waters C18 BEH, 1,7 um, 2,1 x 150 mm. Temperatura propia de la columna = 40 °C.
A: TFA al 0,05 % (vol/vol) en agua
B: TFA al 0,05 % (vol/vol) en acetonitrilo
Gradiente: 5 a 95 % (vol/vol) de B, 12 min, 0,4 ml/min
Método: UPLC_A_5
El análisis de RP se realizó mediante el uso del sistema Waters Acquity UPLC. Detección UV a 214 nm. Columna: Waters C18 BEH, 1,7 um, 2,1 x 50 mm. Temperatura propia de la columna = 40 °C.
A: TFA al 0,05 % (vol/vol) en agua
B: TFA al 0,05 % (vol/vol) en acetonitrilo
Gradiente: 5 a 95 % (vol/vol) de B, 4 min, 0,45 ml/min
Barrido positivo del detector QDA 100-1250
Método: UPLC-MS_A_6
El análisis de RP se realizó mediante el uso del sistema Waters Acquity UPLC. Detección UV a 214 nm. Columna: Waters C18 BEH, 1,7 um, 2,1 x 150 mm. Temperatura propia de la columna = 40 °C.
A: TFA al 0,05 % (vol/vol) en agua
B: TFA al 0,05 % (vol/vol) en acetonitrilo
Gradiente: 5 a 60 % (vol/vol) de B, 16 min, 0,4 ml/min
Barrido positivo del detector QDA 100-1250
Método: UPLC_A_7
El análisis de RP se realizó mediante el uso del sistema Waters Acquity UPLC. Detección UV a 214 nm. Columna: Waters C18 BEH, 1,7 um, 2,1 x 150 mm. Temperatura propia de la columna = 40 °C.
A: TFA al 0,05 % (vol/vol) en agua
B: TFA al 0,05 % (vol/vol) en acetonitrilo
Gradiente: 5 a 95 % (vol/vol) de B, 16 min, 0,4 ml/min
Método: HPLC_A_1
El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema Dionex Ultimate 3000 equipado con una columna Kinetex C18 de 2,6 pm, 100 A, 150 mm x 4,6 mm. Detección UV a 210 nm.
Eluyente A: acetonitrilo al 10 % TFA al 0,1 % en agua
Eluyente B: acetonitrilo al 90 %, TFA al 0,1 % en agua
Flujo 1,5 ml/min, gradiente lineal de 40-100 % (vol/vol) de B durante 9 min.
B. Síntesis de cadenas laterales activadas de la invención y cadenas laterales de referencia
Los Ejemplos 1-8 describen la síntesis de ocho cadenas laterales activadas de la invención, todas con el grupo activador 3,5-DC-2-HBSA (Quím. 1). Los Ejemplos 8B-8D describen la síntesis de cadenas laterales activadas adicionales de la invención, con el grupo activador 3,5-DC-2-HBSA o 3,5-DC-2-HDMBSA (3,5-dicloro-2-hidroxi-N,N-dimetil-bencenosulfonamida).
Los Ejemplos A-E describen la síntesis de cinco cadenas laterales activadas de referencia donde el grupo activador se selecciona entre cuatro activadores diferentes (NHS, 2,4-DC-fenol, 2,6-DC-fenol y 3,5-DC-4-HBSA (Quím. 2 a Quím. 5, respectivamente)).
Ejemplo 1: Preparación de éster de 3.5-DC-2-HBSA: ácido 20-rí4-rí(1S)-1-carbox¡-4-r2-r2-r2-r2-r2-r2-(2,4-d¡cloro-6-sulfo-fenox¡)-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-4-oxo-but¡l1carbamo¡l1ciclohex¡l1met¡lam¡no1-20-oxo-icosanoico
Quím. 21:
La cadena lateral protegida con Bn se preparó como se describió en la sección A. Después de eliminar el TFA, la solución filtrada de DCM se añadió TEA hasta pH 9,5 (probado con papel húmedo de pH) seguido de cloruro de 3,5-dicloro-2-hidroxibencenosulfonilo (0,62 g, 2,37 mmol, 1,1 eq) y se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente. La solución se lavó con NaHCO3 al 5 % (vol/vol) acuoso, 20 ml x 3 o KHSO40,5 M, seguido de una solución saturada de cloruro de sodio (20 ml x 3). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, seguido de la eliminación del solvente al vacío, lo que da como resultado un aceite pegajoso.
El aceite se disolvió en HFIP (10 ml) y se añadió Pd/C al 5 % (p/vol) (298 mg, 10 % p/p, (Escat™ 1431, Strem Chemicals)). La atmósfera en el matraz de reacción se intercambió a nitrógeno, seguido de intercambio a hidrógeno. La reacción se agitó en una atmósfera de hidrógeno (1 bar) durante 3,5 horas. Luego, la atmósfera se intercambió a nitrógeno antes de volver a cambiar a aire atmosférico. La solución de reacción se filtró a través de un filtro de PTFE de 0,4 pm. El Pd/C se lavó con HFIP (4 ml) en total. Después de que la solución de HFIP se enfriara en un baño de hielo por debajo de 5 °C, se añadió éter dietílico (14 ml) para proporcionar una suspensión blanca. El precipitado se recogió mediante filtración y se lavó dos veces con éter dietílico frío. A continuación, el precipitado se secó al vacío durante 3 días, produciendo el éster como un polvo blanco en 1,62 g. El contenido activo de material de 1H qNMR es 75,8 % p/p. Rendimiento 46 %.
El compuesto se analizó por 1H NMR y LC-MS.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) □□ppm 1,20 - 1,35 (m, 32 H) 1,42 - 1,55 (m, 4 H) 1,68 - 1,83 (m, 5 H) 1,89 -2,01 (m, 1 H) 2,05 (t, 2 H) 2,11 - 2,23 (m, 5 H) 2,89 (d, 2 H) 3,21 (q, 2 H) 3,30 (q, 2 H) 3,42 (t, 2 H) 3,47 (t, 2H) 3,51 - 3,62 (m, 7 H) 3,67 - 3,74 (m, 2 H) 3,89 (s, 2 H) 4,09 - 4,18 (m, 1 H) 4,41 (br. s., 2 H) 7,65 - 7,78 (m,4 H) 7,89 (t, 1 H) 7,94 (d, 1 H) LC-MS_A_1: Rt = 4,9 min m/z = 1125,6 = [M+1]+
Ejemplo 2: Preparación de éster de 3.5-DC-2-HBSA: ácido 18-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,4-dicloro-6-sulfofenox¡)-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-4-oxo-but¡l1amino1-18-oxo-octadecano¡co
Quím. 22:
La cadena lateral protegida con Bn se preparó como se describió en la sección A, y la cadena lateral se activó con el mismo procedimiento usado en el Ejemplo 1. Se usó isopropanol para la hidrogenación y se usó terc-butil metil éter para la precipitación. El compuesto se caracterizó por LC-MS y 1H NMR.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) □ ppm 1,22 - 1,23 (m, 24 H) 1,41 - 1,54 (m, 4 H) 1,70 - 1,82 (m, 1 H) 1,88 -2,01 (m, 1 H) 2,05 - 2,22 (m, 6 H) 3,20 (q, 2 H) 3,28 (q, 2 H) 3,40 (t, 2 H) 3,46 (t, 2 H) 3,50 - 3,61 (m, 6 H)3,69 - 3,69 (m, 2 H) 3,88 (s, 2 H) 4,09 - 4,19 (m, 1 H) 4,40 (s, 2 H) 7,63 - 7,71 (m, 2 H) 7,75 (s, 1 H) 7,89 (t, 1H) 8,03 (d, 1 H)
LC-MS_A_1: Rt = 3,6 min m/z = 958,5 = [M+11+
Ejemplo 3: Preparación de éster de 3,5-DC-2-HBSA: ácido 4-[10-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,4-dicloro-6-sulfo-fenox¡)-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-4-oxo-but¡l1am¡no1-10-oxo-decox¡1benzoico Quím. 23:
La cadena lateral protegida con Bn se prepara como se describió en la sección A, y la cadena lateral se activa con el mismo procedimiento usado en el Ejemplo 1.
Ejemplo 4: Preparación de éster de 3.5-DC-2-HBSA: ácido 20-rr4-rrí1S)-1-carboxi-4-r2-r2-r2-r2-r2-r2-r2-r2-r2-r2-r2-r2-rr(5S)-5-rr2-r2-r2-rr2-r2-r2-rr2-r2-r2-rr2-r2-r2-rr(4S)-4-carbox¡-4-rr4-r(19-carbox¡nonadecano¡lam¡no)met¡l1hexanocarbon¡l1am¡no1butano¡l1am¡no1etox¡1etox¡1acet¡l1amino1etox¡1etox¡1acet¡l1am¡n o1etoxi1etoxi1acetil1amino1etoxi1etoxi1acetil1amino1-6-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2.4-dicloro-6-sulfo-fenoxi)-2-oxoetox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-6-oxo-hex¡l1am¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1etilam¡no1-2-oxoetox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1etilam¡no1-4-oxobut¡l1carbamo¡l1c¡clohex¡l1met¡lam¡no1-20-oxo-icosano¡co
Quím. 24:
La cadena lateral protegida con Bn se prepara como se describió en la sección A. y la cadena lateral se activa con el mismo procedimiento usado en el Ejemplo 1.
Ejemplo 5: Preparación de éster de 3.5-DC-2-HBSA: ácido 20-[[4-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[[2-[2-[2-rr2-r2-r2-rr(4S)-4-carbox¡-4-rr4-r(19-carboxinonadecanoilamino)metil1ciclohexanocarbonil1amino1butanoil1amino1etoxi1etoxi1acetil1amino1etoxi1etoxi1acetil1a m¡no1-6-r2-r2-r2-í2.4-d¡cloro-6-sulfo-fenox¡)-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-6-oxo-hexil1am¡no1-2-oxoetox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-4-oxo-but¡l1carbamo¡l1c¡clohex¡l1met¡lam¡no1-20-oxo-¡cosano¡co
Quím. 25:
mismo procedimiento usado en el Ejemplo 1.
Ejemplo 6: Preparación de éster de 3.5-DC-2-BSA: ácido 20-[[4-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-r3-rr2-r2-r2-rr2-r2-r2-rr2-r2-r2-rr2-r2-r2-rrí4S)-4-carbox¡-4-rr4-rn9-carboxinonadecanoilamino)metil1ciclohexanocarbonil1amino1butanoil1amino1etoxi1etoxi1acetil1amino1etoxi1etoxi1acetil1a mino1etoxi1etoxi1acetil1amino1etoxi1etoxi1acetil1amino1propil-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2.4-dicloro-6-sulfo-fenoxi)-2-oxoetox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-et¡l1am¡no1prop¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1etilam¡no1-2-oxoetoxi1etoxi1etilamino1-2-oxo-etoxi1etoxi1etilamino1-2-oxo-etoxi1etoxi1etilamino1-4-oxobut¡l1carbamo¡l1c¡clohex¡l1met¡lam¡no1-20-oxo-icosano¡co
Quím. 26:
Ejemplo 7: Preparación de éster de 3.5-DC-2-BSA: ácido 20-[[4-[[(1S)-1-carbox¡-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[3-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carbox¡-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil1ciclohexanocarbonil1amino1butanoil1amino1etoxi1etoxi1acetil1amino1etoxi1etox¡1acetil1a mino1propil-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2.4-dicloro-6-sulfo-fenoxi)-2-oxo-etoxi1etox¡1etilamino1-2-oxoetoxi1etoxi1etilaminoÍ-2-oxo-etoxi1etoxi1etilamino1-2-oxo-etoxi1etox¡1etilamino1-2-oxo-etil1amino1propilamino1-2-oxoetoxi1etoxi1etilamino1-2-oxo-etoxi1etoxi1etilamino1-4-oxo-butil1carbamoil1ciclohexil1metilamino1-20-oxo-icosanoico; ácido fórmico
Quím. 27:
Ejemplo 8: Preparación de éster de 3.5-DC-2-HBSA: ácido 20-rr(1S)-1-carboxi-4-r2-r2-r2-r2-r2-r2-(2.4-dicloro-6-sulfofenoxi)-2-oxo-etoxi1etoxi1etilamino1-2-oxo-etoxi1etoxi1etilamino1-4-oxo-butil1amino1-20-oxo-icosanoico
Quím. 28:
mismo procedimiento usado en el Ejemplo 1. Se usa isopropanol para la hidrogenación y se usa terc-butil metil éter para la prec¡p¡tac¡ón.
Ejemplo 8B: Preparación de ácido 3.5-dicloro-2-(2-metoxiacetil)oxi-bencenosulfónico
Quím. 36:
Se disolvió ácido metoxiacético (92 pl. 1.20 mmol. 1.0 eq) en DCM (2 ml). Se añadió trietilamina (352 pl. 2.53 mmol.
2.1 eq) a la solución agitada a RT. Se disolvió cloruro de 3.5-dicloro-2-hidroxibencenosulfonilo (0.331 g. 1.26 mmol.
1.0 eq) en DCM (1 ml) y se añadió durante 5 min a la solución de ácido metoxiacético. La solución se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. El solvente se eliminó a presión reducida. El producto bruto se disolvió en EtOAc (10 ml) y la solución se lavó con una mezcla de solución acuosa al 5 % (vol/vol). KHSO4 y salmuera (5 ml/5 ml). La fase acuosa se extrajo con EtOAc (10 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4. seguido de la eliminación del solvente al vacío. El producto bruto se disolvió en CH3CN y agua 1/10 (50 ml) y se liofilizó.
Rendimiento de producto (0.16 g. 42 %). El contenido activo de material de 1H qNMR es 70 % p/p.
El compuesto se caracterizó por 1H NMR y LC-MS.
1H NMR (400 MHz. DMSO-d6) □ ppm 3.39 (s. 3 H) 4.31 (s. 2 H) 7.7.65 (s. 1 H) 7.77 (s. 1H)
LC-MS_A_2: Rt = 2,06 min m/z = 313 = [M-1]-Ejemplo 8C: Preparación de 3,5-DC-2-HDMBSA-éster: ácido 18-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2.4-dicloro-6-(dimetilsulfamoil)fenoxi1-2-oxo-etoxi1etoxi1etilamino1-2-oxo-etoxi1etoxi1etilamino1-4-oxo-butil1amino1-18-oxooctadecanoico
Quím. 37:
C18-diácido-YGlu-Ado-Ado-OH protegido con t-Bu (0.461 mmol. 0.390 g). 3.5-dicloro-2-hidroxi-N.N-dimetilbencenosulfonamida (0.507 mmol. 0.137 g. 1.1 eq) y d Cc (0.553 mmol. 0.114 g. 1.2 eq) se disolvieron en 1.5 ml de DCM. La solución se agitó a RT durante 18 horas. Las mezclas de reacción se analizaron mediante UPLC_A_7. Se añadió DCC extra (0.340 mmol. 0.07 g. 0.7 eq) y la reacción se agitó a RT durante otras 18 horas. La conversión fue ~ 57 % cuando se eliminó la DCU por filtración. El sobrenadante se lavó con salmuera y se secó sobre Mg2SO4. El producto bruto se purificó mediante el uso de cromatografía en columna de gel de sílice con un eluyente en gradiente de DCM a MeOH al 5 % en DCM. Después de la evaporación. el rendimiento del producto fue de 307 mg (61 %). Se usó el método Mod_tBu_1 para escindir los tBu-ésteres durante 1.5 horas. La mezcla de escisión se evaporó a presión reducida. El compuesto se disolvió dos veces en MeCN y se evaporó. El aceite pegajoso se trituró en éter dietílico. Se obtuvo un precipitado blanco. Rendimiento del producto (0.198 g. 72 %). El contenido activo de material de 1H qNMR es 92 % p/p
El compuesto se caracterizó por LC-MS y 1H NMR.
1H NMR (400 MHz. DMSO-d6) □ ppm 1.22 - 1.23 (m. 24 H) 1.41 - 1.54 (m. 4 H) 1.70 - 1.82 (m. 1 H) 1.88 -2.01 (m. 1 H) 2.05 - 2.22 (m. 6 H) 2.70 (s. 6 H) 3.20 (q. 2 H) 3.28 (q. 2 H) 3.40 (t. 2 H) 3.46 (t. 2 H) 3.50 - 3.61 (m. 6 H)3.69 - 3.69 (m. 2 H) 3.88 (s. 2 H) 4.09 - 4.19 (m. 1 H) 4.40 (s. 2 H) 7.67 (t. 1 H) 7.83 (d. 1 H) 7.89 (t. 1H) 8.04 (d. 1 H) 8.24 (d. 1 H)
LC-MS_A_3: Rt = 3.79 min m/z = 986.4 = [M+11+
Ejemplo 8D: Preparación de 3.5-DC-2-HBSA-éster: ácido 3.5-dicloro-2-[3-[2-[2-(2-prop-2-¡nox¡etox¡)etox¡1etox¡1propanoilox¡1benzenosulfón¡co
Quím. 38:
El compuesto se preparó mediante el uso del procedimiento descrito en el Ejemplo 8B con el uso de ácido 3-[2-[2-(2-prop-2-inoxietoxi)etoxi1etox¡1propanoico y cloruro de 3.5-dicloro-2-hidroxibencenosulfonilo. Rendimiento del producto (294 mg). El contenido activo de material de 1H qNMR es 77 % p/p.
El compuesto se analizó por 1H NMR y LC-MS.
1H NMR (400 MHz. DMSO-d6) □ ppm 1.78 - 1.82 (m. 2 H) 2.79 (br s. 2 H) 3.44 (t. 1 H) 3.52-3.55 (m. 12 H) 3.73 (t. 2 H) 4.15 (d. 2 H) 7.63 (d. 1 H) 7.75 (d. 1 H)
UPLC_A_5: Rt = 2.73 min m/z = 485 = [M+11+
Ejemplo A: Preparación de éster de NHS: ácido 18-rr(1S)-1-carbox¡
(2,5-d¡oxop¡rrol¡d¡n-1-¡l)ox¡-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-4-oxo-but¡l1amino1-18-oxo-octadecano¡co
Quím. 31:
El compuesto se preparó como se describe en el documento WO2010/029159.
Ejemplo B: Preparación de éster de NHS: ácido 20-[[4-[[(1S)-1-carbox¡-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-d¡oxop¡rrol¡d¡n-1-¡l)ox¡-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-4-oxo-but¡l1carbamo¡l1c¡clohex¡l1met¡lam¡no1-20-oxo-¡cosano¡co
Quím. 32:
El compuesto se preparó como se describe en el documento WO2015/000942.
Ejemplo C: Preparación de éster de 2,4-DC-fenol: ácido 20-[[4-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,4-d¡clorofenox¡)-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-4-oxo-but¡l1carbamo¡l1c¡clohex¡l1met¡lam¡no1-20-oxo-icosano¡co
Quím. 33:
C20-diácido-Trx-YGlu-Ado-Ado-OH protegido con Bn (1.36 mmol, 1.466 g). 2,4-diclorofenol (2.69 mmol, 0,438 g. 2 eq) y DMAP (1,41 mmol. 0,172 g. 1 eq) se disolvieron en 30 ml de DCM. A esta solución se le añadió EDC (2,02 mmol.
0,388 g. 1.5 eq). La solución se agitó durante 2 horas.
La solución se extrajo con NaOH 0.5 M (15 ml x 3). seguido de extracción con HCl 0.5 M en una solución de NaCl al 10 % (15 ml x 3). Luego se secó la fase orgánica sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se eliminó al vacío. El producto se usó sin purificación adicional. El rendimiento del producto fue 1,30 g.
Pd/C al 5 % (p/vol) (10 % p/p. 0,132 g. (Escat™ 1431, Strem Chemicals)) se añadió a una solución de HFIP en agitación (9 ml) con el material activado (1,30 g). La atmósfera del matraz de reacción se cambió a nitrógeno. seguido de intercambio de hidrógeno. La reacción se agitó en una atmósfera de hidrógeno (1 bar) durante 5 horas. Luego. la atmósfera se intercambió a nitrógeno antes de volver a cambiar a aire atmosférico. Después. la solución de reacción se filtró a través de un filtro de PTFE de 0,45 pm. El Pd(0) sobre carbón se lavó con HFlP (3 ml). La solución se enfrió a menos de 5 °C y se añadió éter dietílico (20 ml) dando como resultado un precipitado blanco. El precipitado se recogió mediante filtración y se lavó con éter dietílico (10 ml). El producto se secó al vacío durante 4 días.
Rendimiento del producto (0,8326 g. 45,6 %). El contenido activo de material de 1H qNMR es 84 % p/p.
El compuesto se analizó por 1H NMR y LCMS.
1H NMR (400 MHz. DMSO-d6) □ ppm 1,15 - 1,36 (m. 32 H) 1,41 - 1,53 (m. 4 H) 1.67 - 1,82 (m. 5 H) 1.90 -2,00 (m. 1 H) 2,05 (t. 2 H) 2.09 - 2,22 (m. 5 H) 2.89 (t. 2 H) 3,20 (q. 2 H) 3.29 (q. 2 H) 3,41 (t. 2 H) 3.47 (t. 2H) 3,50 - 3,62 (m. 7
H) 3,67 - 3,74 (m, 2H) 3,88 (s, 2 H) 4,10 - 4,18 (m, 1 H) 4,51 (s, 2 H) 7,41 (d, 1 H) 7,50(d, 1 H) 7,66 (t, 1 H) 7,72 (t, 1 H) 7,78 (s, 1 H) 7,89 (t, 1 H) 7,96 (d, 1 H)
LC-MS_A_1: Rt = 5,9 min m/z = 1045,6 = [M+1]+
Ejemplo D: Preparación de éster de 2,6-DC fenol: ácido 20-[[4-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,6-diclorofenoxi)-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-4-oxo-but¡l1carbamo¡l1c¡clohex¡l1met¡lam¡no1-20-oxo-icosano¡co Quím. 34:
El compuesto se preparó mediante el uso del procedimiento descrito en el Ejemplo C con el uso de 2,6-diclorofenol y se analizó mediante 1H NMR y LC-MS.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) □ ppm 1,16 - 1,35 (m, 32 H) 1,41 - 1,54 (m, 4 H) 1,67 - 1,82 (m, 5 H) 1,89 -2,01 (m, 1 H) 2,06 (t, 2 H) 2,10 - 2,23 (m, 5 H) 2,89 (t, 2 H) 3,21 (q, 2 H) 3,30 (q, 2 H) 3,41 (t, 2 H) 3,48 (t, 2H) 3,51 - 3,63 (m, 7 H) 3,70 - 3,76 (m, 2 H) 3,89 (s, 2 H) 4,10 - 4,18 (m, 1 H) 4,61 (s, 2 H) 7,38 (t, 1 H) 7,63(d, 2 H) 7,68 (t, 1 H) 7,74 (t, 1 H) 7,91 (t, 1 H) 7,97 (d, 1 H)
LC-MS_A_1: Rt = 5,7 m/z = 1045,6 = [M+11+
Ejemplo E: Preparación de éster de 3.5-DC-4-HBSA: ácido 18-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,6-dicloro-4-sulfofenox¡)-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-2-oxo-etox¡1etox¡1et¡lam¡no1-4-oxo-butil1am¡no1-18-oxo-octadecano¡co
Quím. 35:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) □ ppm 1,22 - 1,23 (m, 24 H) 1,41 - 1,54 (m, 4 H) 1,70 - 1,82 (m, 1 H) 1,88 -2,01 (m, 1 H) 2,05 - 2,22 (m, 6 H) 3,20 (q, 2 H) 3,28 (q, 2 H) 3,40 (t, 2 H) 3,46 (t, 2 H) 3,50 - 3,61 (m, 6 H)3,69 - 3,69 (m, 2 H) 3,88 (s, 2 H) 4,09 - 4,19 (m, 1 H) 4,40 (s, 2 H) 7,63 - 7,71 (m, 3 H) 7,89 (t, 1H) 8,03 (d, 1 H)
LC-MS_A_1: Rt = 3,3 min m/z = 958,5 = [M+11+
C. Estabilidad hidrolítica de las cadenas laterales activadas de la invención y su uso en reacciones de acilación
Ejemplo 9: Estabilidad hidrolítica de cadenas laterales activadas
El propósito de este ejemplo es probar la estabilidad hidrolítica de las cadenas laterales activadas de la invención. Más en particular, la estabilidad hidrolítica de las cadenas laterales activadas de los Ejemplos 1 y 2 (ambas activadas con 3,5-DC-2-HBSA (Quím. 1b)) se compara con la estabilidad hidrolítica de cuatro cadenas laterales de referencia (Ejemplos B, C, D y E activados con cuatro activadores diferentes NHS, 2,4-DC-fenol, 2,6-DC-fenol y 3,5-DC-4-HBSA (Quím. 2, 3, 4, 5 , respectivamente)).
Procedimiento
Se disolvieron 0,1 mmol de cada cadena lateral activada en 1,0 ml de NMP. A esta solución se le añadió 5 ml de solución tampón de NaHCO31 M ajustada a pH 10,0 con NaOH. La solución se agitó (pH ~ 10,3) tomándose alícuotas
a diferentes intervalos de tiempo para determinar hasta qué punto se hidrolizaron las diversas cadenas laterales activadas.
Las mezclas de reacción se analizaron por UPLC (Ejemplo núm. 2 y E - UPLC_A_1) y HPLC (Ejemplo núm. 1, B, C y D - HPLC_A_1), y el por ciento de hidrólisis para las diversas cadenas laterales se estimó mediante comparación de las áreas en la detección UV a 210 nm. En cada ejemplo, las áreas combinadas para el grupo de activación liberado (pico A) y la cadena lateral no activada (pico B) se compararon con el área para la cadena lateral activada (pico C). Los tiempos de retención (rt-A, rt-B y rt-C para los distintos picos (pico A, pico B y pico C) para cada cadena lateral se resumen a continuación; 1 (rt-A =1,94 min, rt-B = 7,18-7,25 min, rt-C = 7,48 min, Hp LC_A_1), 2 (rt-A = 0,48 min, rt-B = 2,11 min, rt-C = 2,29 min, UPLC_A_1), B (sólo rt-B detectado en el momento del análisis), C (rt-A = 4,40 min, rt-B = 7,25 min, HPLC_A_1), D (rt-A = 4,01 min, rt-B = 7,25 min, rt-C = 10,16 min, HPLC_A_1), E (rt-A = 2,08 min, rt-B = 2,10 min, rt-C = 2,10 min, UPLC_A_1).
Los datos de hidrólisis se resumen en la Tabla 1. “Tiempo de hidrólisis” indica el momento en el que se tomó la alícuota para el análisis del % de hidrólisis, e “Hidrólisis (%) a pH 10,3” muestra el resultado de la determinación de la cadena lateral hidrolizada en ese momento.
Tabla 1: Hidrólisis de cadenas laterales activadas
Los resultados de la Tabla 1 muestran que la cadena lateral activada del Ejemplo B (con el activador del estado de la técnica NHS) es hidrolíticamente muy inestable ya que se hidrolizó cuantitativamente en un minuto (tiempo de hidrólisis = 0). Contrariamente a esto, aproximadamente el 12 % de las cadenas laterales activadas de la invención (Ejemplos 1 y 2) permanecieron aún después de una exposición prolongada a las condiciones básicas (tiempos de hidrólisis alrededor de 1100-1300 minutos). Las dos cadenas laterales activadas probadas de la invención muestran una estabilidad hidrolítica similar y muy buena, lo que indica que la variación estructural en la parte distal de la cadena lateral (distal al punto de unión del activador) no parece influir en la estabilidad hidrolítica de la cadena lateral activada. En la Tabla 1, el resultado "Cuantitativo" se refiere a que más del 99 % de la cadena lateral está hidrolizada.
Los resultados de la Tabla 1 también muestran que las cadenas laterales activadas de la invención (Ejemplos 1 y 2) son mucho más estables frente a la hidrólisis que las cadenas laterales activadas con tres activadores diferentes de estructura algo similar o muy similar (Ejemplos C, D y E). Más en particular, las cadenas laterales activadas de los Ejemplos C y D (con activador 2,4- y 2,6-DC-fenol, respectivamente) también se hidrolizan muy rápido y casi cuantitativamente. Además, una comparación de los resultados para las cadenas laterales activadas de los Ejemplos 1 y 2 de la invención (3,5-DC-2-HBSA) con los de la cadena lateral activada del Ejemplo E (3,5-DC-4- HBSA) deja claro que la posición del grupo de ácido sulfónico en el anillo de fenilo marca una gran diferencia (el ácido sulfónico debe estar en la posición orto con respecto al enlace éster en lugar de en la posición para).
Ejemplo 10: Preparación de un análogo de GLP-1 monoacilado N{Épsilon-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Arg34]-GLP-1-(9-37)-péptido
El propósito de este ejemplo es estudiar el uso de la cadena lateral activada de la invención en una reacción de acilación para producir un análogo de GLP-1 monoacilado. La cadena lateral activada de la invención usada en este ejemplo es la del Ejemplo 2, y se prueba junto con las cadenas laterales activadas del Ejemplo A, para la comparación. La solidez del proceso se centra en este ejemplo, a saber, formas alternativas de añadir la cadena lateral activada de la invención al análogo de GLP-1 en cuestión (adición lenta, intermedia o rápida de la cadena lateral en solución, o adición como un sólido). También se determinan la pureza del producto final acilado deseado (el rendimiento) y el excedente que se necesita de la cadena lateral activada para que la reacción de acilación proceda como se desee.
El análogo de GLP-1 que se acila en este ejemplo es (R34)GLP-1(9-37) (SEQ ID NO: 7), que puede prepararse, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 2009/083549.
La cadena lateral que se unirá a la lisina en la posición 26 de este análogo consiste en un prolongador diácido C18 y un enlazador gGlu-2xAdo.
Procedimiento de acilación
Al análogo de GLP-1 (2,03 g) se le añadieron 23 ml de agua desmineralizada y luego se añadió TEA hasta pH 9,5. Se tomó una muestra para la determinación de la concentración cuando la mezcla estaba completamente disuelta (10
min). 20 |jl de solución disuelta en 980 |jl 50/25/25 (vol/vol/vol) de ácido acético/agua/MeCN (dilución 1:40). La concentración fue de 25,1 g/l.
A 16,0 ml de la solución de análogo de GLP-1 (0,40 g del análogo) se le añadieron 4,0 ml de agua desmineralizada para dar una concentración de 20,1 g/l. Esta solución se ajustó a pH 11,3 con TEA.
La cadena lateral activada del Ejemplo 2 que contiene 181,2 mg de material activo, 1,49 eq., se disolvió en 890 j l de NMP. Volumen total = 1070 jl.
Para la adición "intermedia" del mismo se usó una jeringa con D = 5 mm, la velocidad de adición se fijó en 1,15 eq./10 min. Se añadió un total de 0,83 ml, para dar un total de eq. de 1,16 durante 11,5 minutos. El pH se ajustó manualmente durante la acilación mediante el uso de NaOH 1 M. El pH se mantuvo en un intervalo de 11,28-11,32 durante la adición. Después de que se detuvo la adición, el pH se mantuvo entre 11,26-11,35 durante el resto del tiempo de reacción. La temperatura durante la acilación fue de 23,7-24,3 °C.
Para la adición "rápida", se siguió el procedimiento descrito anteriormente con la diferencia de que la cadena lateral se añadió durante un período de 3,3 min.
Para la adición "lenta", se siguió el procedimiento descrito anteriormente con la diferencia de que la cadena lateral se añadió durante un período de aproximadamente 30 min.
Para la adición como un sólido, se siguió el procedimiento descrito anteriormente con la diferencia de que toda la cadena lateral no disuelta se añadió directamente.
Cadena lateral activada del Ejemplo A, adición lenta
La reacción de acilación con la cadena lateral activada del Ejemplo A se realizó de la misma manera que se describió anteriormente.
Resultados
Se determinaron los siguientes parámetros para cada uno de estos experimentos y los resultados se muestran en la Tabla 2 a continuación:
“Eq. SC” que se refiere al número de equivalentes usados de la cadena lateral activada en relación con el péptido.
“% Cadena Principal”, “% Producto” y “% Diacilado” que son indicativos de la pureza del producto final. Producto se refiere al producto final deseado que es el compuesto monoacilado, la cadena principal se refiere al análogo no acilado y diacilado se refiere a un subproducto no deseado de la reacción. Las reacciones se analizaron mediante métodos UPLC o HPLC como se indica a continuación, y se estimó la eficiencia en el proceso de acilación mediante comparación de áreas en UV a 210 nm. Para mayor claridad en comparación, el área combinada de "Cadena Principal", "Producto" y "Diacilado" se normalizó al 100 %. Los tiempos de retención para los picos del parámetro de interés fueron los siguientes; "Cadena Principal": alrededor de 1,5-1,6 min (UPLC_A_1) o 3,6 min (HPLC_A_1), "Producto" - alrededor de 2,1 a 2,3 min (UPLC_A_1) o 5,9 min (HPLC_A_1), "Diacilado" - alrededor de 2,70-3,00 min (UPLC_A_1) o 8,0 min (HPLC_A_1). Las muestras analíticas se tomaron de las mezclas de reacción entre 80 y 107 minutos después de la adición inicial de la cadena lateral.
Tabla 2: Variaciones del proceso, excedente necesario de cadena lateral activada y pureza Cadena l Adición Eq. SC Produc Cade Diacilado Ejemplo rincip
A Solución, lenta 1,10 95,6 2,2 2,2 2 Solución, lenta 1,15 98,0 0,5 1,5 2 olución, intermedi 1,16 97,1 0,2 1,7 2 Solución, rápida 1,14 93,3 0 4,7
2 
Sólido 
1,16 
97,5 
0,1 
2,4
Los resultados de la Tabla 2 muestran que, en general, la cadena lateral activada de la invención (Ejemplo 2) da como resultado un producto de aproximadamente la misma o mejor pureza en comparación con la cadena lateral activada del estado de la técnica (Ejemplo A), y también se usa un excedente similar de cadena lateral activada. Los resultados también muestran que la cadena lateral activada de la invención proporciona una gran flexibilidad de proceso ya que la pureza del producto y el excedente necesario no dependen de la velocidad de adición y, de hecho, se puede añadir como un sólido. Esto es una gran ventaja ya que es un hecho establecido que la cadena lateral activada conocida (Ejemplo A) tiene que añadirse muy lentamente y bajo un control riguroso debido a su inestabilidad hidrolítica en las condiciones de la reacción de acilación.
Por tanto, estos resultados indican que la cadena lateral activada de la invención proporciona un producto de pureza similar al proceso conocido pero con un proceso de acilación mucho más robusto.
Ejemplo 11: Preparación de un análogo de GLP-1 diacilado N(Alfa)írGlu22.Ara26.Ara341-GLP-1-í9-37)-peptid¡l)-N(Éps¡lon>r2-r2-r2-rr2-r2-r2-rr(4S)-4-carbox¡-4-rr4-r(19-carboxinonadecanoilamino)metil1ciclohexanocarbonil1amino1butanoil1amino1etoxi1etoxi1acetil1amino1etoxi1etoxi1acetil1L vs-Glv-Glv-Ser-WÉpsilonire-re-re-rre-re-re-rr^SM-carboxi^-rR-rmcarboxinonadecanoilamino)metil1ciclohexanocarbonil1amino1butanoil1amino1etoxi1etoxi1acetil1amino1etoxi1etoxi1acetil1L ys
El propósito de este ejemplo es estudiar el uso de la cadena lateral activada de la invención en una reacción de acilación para producir un análoao de GLP-1 diacilado. La atención se centra en la pureza del producto final diacilado deseado (el rendimiento) y en el excedente que se necesita de la cadena lateral activada para que la reacción de acilación proceda como se desea. La cadena lateral activada de la invención usada en este ejemplo es la del Ejemplo 1. y se prueba junto con las cadenas laterales activadas de los Ejemplos B. C y D, para la comparación.
El análogo de GLP-1 usado en este ejemplo es (22E,26R,34R)GLP-1(9-37)(38K,39G,40G,41S,42K) (SEQ ID NO: 3). a saber. un análoao de GLP-1 extendido de manera C-terminal (extendido en 5 aminoácidos) donde además se han eliminado dos aminoácidos N-terminales y se han sustituido tres aminoácidos. todos en relación con GLP-1(7-37) nativo (SEQ ID NO: 1). Este análogo es idéntico al análogo de GLP-1 descrito en el Ejemplo 3 del documento WO 2015/000942 excepto por los dos aminoácidos N-terminales eliminados. y puede prepararse como se describe en esta referencia o usarse cualquier otro método conocido en la técnica.
Se deben unir dos cadenas laterales a este análogo, más en particular a las lisinas en las posiciones 38 y 42. Cada cadena lateral consiste en un prolongador de diácido C20 y un enlazador T rx-gGlu-2xAdo.
Procedimiento de acilación
Al análogo de GLP-1 (2,94 g) se le añadió agua desmineralizada (40 ml). El pH de la suspensión se ajustó con TEA (100 |jl) a pH 10,6 y se agitó hasta que todo el material se disolvió. y para entonces el pH fue 9.6. Se tomó una muestra para la determinación de la concentración del análogo de GLP-1 en solución. La concentración fue de 21.5 g/l. A 18 ml de esta solución (0,43 g. 0,12 mmol) se le añadió agua desmineralizada (2 ml) y se ajustó a pH 11,0 con TEA seguido de ajuste a pH 11,3 con NaOH (1 M).
Cadena lateral activada del Ejemplo 1
La sal de TEA de la cadena lateral activada del Ejemplo 1 (399 mg. 0,32 mmol. 2.81 eq del análogo en cuestión) se disolvió en NMP (2.6 ml). El volumen total se estimó en 3.1 ml. lo que equivale a 0,96 eq/ml.
La solución se añadió a la solución del análogo de GLP-1 con una velocidad de 3.1 ml/h a temperatura ambiente. Se tomaron muestras de la reacción durante la adición. es decir. en los siguientes puntos (IPC) después de la adición del siguiente número de equivalentes (eq) de la cadena lateral activada (SC):
IPC1: se añadió 1.50 eq de SC;
IPC2: se añadió 2.52 eq de SC.
Debido a la lenta reactividad de la cadena lateral activada (se tomó una alícuota adicional de 100 jl. se agitó por separado durante 130 min antes de analizarla):
IPC3: se añadió 2.8 eq de SC.
El pH se mantuvo en el intervalo de 11,27-11,33 durante la adición mediante el uso de NaOH 1 M.
Cadena lateral activada de los Ejemplos B, C y D
La acilación del análogo de GLP-1 con las cadenas laterales activadas de los Ejemplos B. C y D se realizó con el mismo protocolo pero debido a la hidrólisis rápida se usaron más equivalentes (ver Tabla 3 a continuación).
Resultados
Se determinaron los siguientes parámetros para cada uno de estos experimentos y los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación:
“Eq. SC” que se refiere al número de equivalentes usados de la cadena lateral activada en relación con el péptido.
“% Cadena Principal”, “% Monoacilado”, “% Diacilado” y “% Subproductos” que son indicativos de la pureza del producto final. El producto final deseado es aquí el compuesto diacilado, la cadena principal se refiere al análogo no acilado, monoacilado se refiere al producto monoacilado no deseado y subproducto se refiere a otros subproductos de la reacción. Las reacciones se analizaron por HPLC_A_1, y se estimó la eficiencia en el proceso de acilación mediante comparación de áreas en UV a 210 nm. Para mayor claridad en la comparación, el área combinada de "Cadena Principal", "Monoacilado", "Diacilado" y "Subproductos" se normalizó al 100 %, y solo se incluyó el "Subproducto" más grande. Los tiempos de retención para los picos del parámetro de interés fueron los siguientes; “Cadena Principal” - alrededor de 2,6 min, “Monoacilado” - alrededor de 5,5 min, “Diacilado” - alrededor de 8,3 min y “Subproductos” - alrededor de 10,9 min.
Tabla 3: Exceso necesario de cadena lateral activada (SC) y pureza3
a El análisis de las reacciones se realizó después de 130 min.
Con respecto a la pureza, es decir, el rendimiento del producto final diacilado deseado, los resultados de la Tabla 3 muestran que la cadena lateral activada de la invención (Ejemplo 1) da como resultado un producto de mejor pureza en comparación con la cadena lateral activada del estado de la técnica del Ejemplo B (NHS). Además, la pureza es mucho mejor en comparación con la cadena lateral activada del Ejemplo C. Pero la pureza usando la cadena lateral activada del Ejemplo D está al mismo nivel alto que para la cadena lateral de la invención (Ejemplo 1), sin embargo, esto es a expensas de tener que usar un excedente de equivalentes de la cadena lateral activada.
Volviendo al excedente necesario de la cadena lateral activada, los resultados de la Tabla 3 muestran que para la cadena lateral del Ejemplo 1 de la invención se necesitan sustancialmente menos equivalentes en comparación con todas las demás cadenas laterales.
En conclusión, estos resultados indican que la cadena lateral activada de la invención da un producto de mayor pureza que el proceso conocido y con un proceso de acilación más económico.
Ejemplo 12: Preparación de análogo de insulina acilado N(Épsilon-B29)-r2-r2-r2-rí2-r2-r2-rí(4S)-4-carbox¡-4-(17-carbox¡heptadecano¡lam¡no)butano¡l1am¡no1etox¡1etox¡1acet¡l1am¡no1etox¡1etox¡1acet¡l1-rGluA14,H¡sB251.des-ThrB27,ThrB30-Insulina
Nombre alternativo insulina humana A14E, B25H, B29K(NsIcosanedioil-yGlu-(3-(2-(2-r2-(2-aminoetoxi)etoxi1etoxi)etoxi)propionil), desB30
El propósito de este ejemplo es estudiar el uso de la cadena lateral activada de la invención para preparar un análogo de insulina acilado. La atención se centra en la pureza del producto final deseado (el rendimiento) y en el excedente que se necesita de la cadena lateral activada para que la reacción de acilación proceda como se desea. La cadena lateral activada de la invención usada en este ejemplo es la del Ejemplo 2, y se prueba junto con la cadena lateral activada del Ejemplo A, para la comparación (la cadena lateral del Ejemplo A se conoce, por ejemplo, del Ejemplo 4 del documento WO 2010/029159).
El análogo de insulina usado en este ejemplo es insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30 que es un análogo de la insulina humana en donde el aminoácido en la posición 14 de la cadena A ha sido reemplazado por ácido glutámico, el aminoácido en la posición 25 de la cadena B ha sido reemplazado por histidina y se han eliminado los aminoácidos B27 y B30. La secuencia y la preparación de este análogo se describen en el documento WO 2008/0343881 (SEQ ID NO: 8).
La cadena lateral debe unirse a B29K de este análogo. B29K se refiere al residuo de lisina en la posición 29 de la cadena B. La cadena lateral consiste en un prolongador de diácido C18 y un enlazador gGlu-2xAdo. El derivado resultante es idéntico al compuesto del Ejemplo 76 del documento WO 2009/1154699).
Procedimiento de acilación
Se pesó el análogo de insulina sólido (240 mg de compuesto de interés, 43,2 Dmol) y se transfirió al recipiente de titulación y se mezcló con 1,00 ml de agua durante aproximadamente 15 min. El péptido se disolvió lentamente. El pH estaba cerca de 9.
El recipiente de autotitulación se conectó a un sistema de refrigeración y se enfrió a 5 °C y el pH se elevó a 10,5 al añadir NaOH (0,2 M, 400 j l) gota a gota. La mezcla era transparente e incolora. Se añadieron manualmente 400 j l de agua para dar un volumen total de 1,80 ml. Justo antes de la adición de la cadena lateral activada, la solución de análogo de insulina se tituló a pH 11,7 con NaOH (0,5 M, 185 jl). El volumen total y la concentración de la solución de péptido fue de 2,0 ml y 120 mg/ml.
Cadena lateral activada del Ejemplo A
La cadena lateral activada del Ejemplo A (52 mg de compuesto de interés, 1,5 eq.) se disolvió en 0,44 ml de NMP para dar un volumen total de 0,50 ml.
Titulador: Titrando/dosino®
Las muestras de la reacción se analizaron mediante UPLC _A_3.
La acilación del análogo de insulina fue controlada por el Titrando®. El aparato se puso en funcionamiento para añadir 1,5 eq. de cadena lateral en 19 min. Las muestras se extrajeron a 0 eq., 1 eq. y 1,5 eq. Las muestras se inactivaron en R-320: hidrogenofosfato disódico 50 mM, dihidratado con Tween® 0,1 mg/ml a pH 8 antes de analizar las muestras. Cadena lateral activada del Ejemplo 2
El mismo protocolo que se describió anteriormente para la "Cadena lateral activada del Ejemplo A" se usó para la cadena lateral activada del Ejemplo 2.
Resultados
Se determinaron los siguientes parámetros para cada uno de estos experimentos y los resultados se muestran en la Tabla 4 a continuación:
“Eq. SC” que se refiere al número de equivalentes usados de la cadena lateral activada en relación con el péptido. “% Cadena Principal”, “% Producto” y “% Diacilado” que son indicativos de la pureza del producto final. El producto final deseado es el compuesto monoacilado, la cadena principal se refiere al análogo no acilado, diacilado se refiere a los subproductos no deseados de la reacción. Las reacciones se analizaron por UPLC_A_3, y se estimó la eficiencia en el proceso de acilación mediante comparación de áreas en UV a 210 nm. Para mayor claridad en comparación, el área combinada de "Cadena Principal", "Producto" y "Diacilado" se normalizó al 100 %. Los tiempos de retención para los picos del parámetro de interés fueron los siguientes; “Cadena Principal”: alrededor de 9,4 min, “Producto”: alrededor de 12,2 min y “Diacilado”: alrededor de 14,9 min.
Tabla 4: Exceso necesario de cadena lateral activada (SC) y pureza.
Diacilado 16,0
, , , 17,0 Con respecto a la pureza, es decir, el rendimiento del producto deseado, los resultados de la Tabla 4 muestran que la cadena lateral activada de la invención (Ejemplo 2) da como resultado un producto de una pureza mucho mayor en comparación con la cadena lateral activada del Ejemplo A (NHS) del estado de la técnica cuando se usa el mismo número de equivalentes (1 equivalente). Sin embargo, cuando se usa 1,5 equivalentes de la cadena lateral activada del Ejemplo A, se obtiene la misma pureza que con 1 equivalente de la cadena lateral activada de la invención (Ejemplo 2).
En conclusión, estos resultados indican que la cadena lateral activada de la invención proporciona un producto de tan alta pureza como con el proceso conocido pero hay que usar menos excedente de la cadena lateral activada, por lo tanto con un proceso de acilación más económico.
Ejemplo 13: Estabilidad hidrolítica de cadenas laterales activadas adicionales
El propósito de este ejemplo es probar la estabilidad hidrolítica de las cadenas laterales activadas adicionales de la invención. Más en particular, la estabilidad hidrolítica de las cadenas laterales activadas del Ejemplo 1 y tres cadenas laterales adicionales de los Ejemplos 8B, 8C y 8D así como también el activador adicional 3,5-DC-2-HDMBSA. Estabilidad hidrolítica
Claims (1)
- REIVINDICACIONESUn compuesto que comprende Quím. 7b:Quím. 7b:
en donden es un número entero en el intervalo de 1-2,-Z1 y -Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -Cl, -F, -Br, -NO2, -CN, -SO2X2, -CONH y -CF3, en donde X2 se selecciona del grupo que consiste en -OH, CH3, -CF3 y -N (R1R2) (por ejemplo, -N(CH3)2),-Y1 y -Y2 independientemente están ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en -Cl y -F,-X y X2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -Oh , CH3, -CF3 y -N (R1R2) (por ejemplo, -N(CH3)2),en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C1-C5, en donde el alquilo C1-C5 puede ser lineal, ramificado o cíclico y opcionalmente sustituido con un resto hidrofílico (tal como -OH o -Co Oh );o una sal de este.El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicho compuesto comprende Quím. 7a:Quím. 7a:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10, y los sustituyentes restantes son como se definen en la reivindicación 1.Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho compuesto comprende Quím. 7:Quím. 7:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10, y n es un número entero en el intervalo de 1-2; o una sal de este.El compuesto de la reivindicación 3, que comprende la Fórmula I:Fórmula I:(P-L)u-BL-B-A, en dondeA es un activador de Quím. 1:
B es un elemento enlazador de Quím. 6:
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-10 y n es un número entero en el intervalo de 1-2; y p es un número entero en el intervalo de 1-5 con la condición que si k > 1 entonces p es 1;U representa el número de grupos (P-L) en el compuesto y es 1 o 2;cada grupo (P-L) comprendeun resto de prolongación (P) seleccionado independientemente de Quím. 10, Quím. 11, Quím. 12, Quím. 13 y Quím. 14:Quím. 10:
Quím. 12
; yun enlazador (L) que comprende al menos un elemento enlazador seleccionado de Quím. 15, Quím. 16, Quím.17 y Quím. 18:Quím. 15:
en dondeR es -COOH; cada uno de s, x, y, z y l representa independientemente un número entero en el intervalo de 8 20; cada uno de r, m y q representa independientemente un número entero en el intervalo de 0-4; g es un número entero en el intervalo de 1-10; h es un número entero en el intervalo de 1-2 y t es un número entero en el intervalo de 1-5;BL es un enlazador ramificado opcional seleccionado de Quím. 19 y Quím. 20:Quím. 19:
en donde u y v representan independientemente un número entero en el intervalo de 0-5, con la condición de que cuando u es 0 v es un número entero en el intervalo de 1-5, y cuando v es 0, u es un número entero en el intervalo de 1-5; y cada w representa independientemente un número entero en el intervalo de 0-2; y en donde el enlace entre A y B es un enlace éster, el enlace entre P y L es un enlace amida, ysi BL está presente, los enlaces entre L y BL, y BL y B son enlaces amida, o si BL está ausente, el enlace entre L y B es un enlace amida;o una sal, amida o éster de este.5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en donde k es 1, n es 1 y/o 4p es 1, 2 o 4.6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en donde P es Quím. 10 o Quím. 11.7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde L comprende el elemento enlazador Quím.15, elemento enlazador Quím. 16, y/o elemento enlazador Quím. 17.8. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en dondei) si U es 1 BL está ausente y el compuesto comprende la Fórmula Ia:Fórmula Ia: P-L-B-A; oii) si U es 2 BL está presente, y el compuesto comprende la Fórmula Ib:Fórmula Ib: (P-L)2-BL-B-A.9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en dondei) BL es Quím. 19, en donde u es 0 y v es 4; oii) BL es Quím. 20, en donde cada w es 1.10. Un compuesto seleccionado de los siguientes:Quím. 21:
Quím. 25:
11. Un método para acilar uno o más grupos amino en un aminoácido, un péptido o una proteína, el método que comprende una etapa de hacer reaccionar el aminoácido, péptido o proteína con un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10.12. El método de la reivindicación 11, que comprende una etapa adicional de purificar el producto deseado de la reacción de acilación.13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en donde el producto deseado de la reacción de acilación se selecciona de los siguientes compuestos:(i) Quím. 41:
(vi) Quím. 46:
(iix) Quím. 48:
(x) Quím. 50:
(xii) : un compuesto como en el punto (ii) anterior en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,(xiii) : un compuesto como en el punto (iii) anterior en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,(xiv) : un compuesto como en el punto (iv) anterior en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,(xv) : un compuesto como en el punto (v) anterior en el que los dos aminoácidos N-terminales se han eliminado,(xvi) : un compuesto como en el punto (vi) anterior en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,(xvii) : un compuesto como en el punto (vii) anterior en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,(xiix): un compuesto como en el punto (iix) anterior en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,(xix) : un compuesto como en el punto (ix) anterior en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,(xx) : un compuesto como en el punto (x) anterior en el que se han eliminado los dos aminoácidos N-terminales,(xxi) Quím. 51:
(xxiii) Quím. 53:
o una sal, amida, o éster aceptable farmacéuticamente de este.14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en donde cuando el producto deseado de la reacción de acilación es un péptido GLP-1 truncado en el extremo N-terminal tal como los definidos en la reivindicación 14 (xi) -(xx), el método comprende además la etapa (I) de:(I) hacer reaccionar el producto de la reacción de acilación con un dipéptido protegido de Quím. 8:
en dondeR2 es H o un grupo protector de amino, y R3 es un grupo protector de amino; oR2 es un grupo alquilo eliminable, y R3 es H o un grupo alquilo eliminable; oR2 y R3 forman conjuntamente un anillo;R4 es H, o un catión de amonio secundario, un catión de amonio terciario o un catión de metal que forma una sal con el grupo carboxilato; yR5 está ausente o es una sal ácida, que resulta en el péptido o proteína acilado de longitud completa correspondiente con grupos de protección en el extremo N-terminal del péptido o proteína;y el método comprende además una o más de las siguientes etapas adicionales (II) y (III) de:(II) eliminar los grupos protectores R1 y/o R2; y/o(III) purificar el péptido o proteína acilado de longitud completa;en donde cada una de las etapas (II) y (III) son opcionales.
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