ES2315226T3

ES2315226T3 - Metodo de acilacion de peptidos y proteinas.

Info

Publication number: ES2315226T3
Application number: ES00910573T
Authority: ES
Inventors: Louis Brammer Hansen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: AU3273500A; DE60040333D1; IL144989A0; RU2001128068A; EP1163211B1; ZA200106884B; NO20014508D0; EP1956000A1; WO2000055119A1; ATE409193T1; HUP0200297A2; HUP0200297A3; NO20014508L; EP1956000B1; PL351326A1; CZ20013018A3; BR0009040A; EP1163211A1; CN1344248A; CA2361830A1

Abstract

Método para acilar un grupo amino de un péptido o una proteína, el método comprendiendo: (a) reacción de un péptido o proteína que tiene al menos un grupo amino libre con un agente acilante de la fórmula general I ** ver fórmula** donde n es 0-8; R 1 es COOR 4 ; R 2 es una fracción lipofílica; R 3 con el grupo carboxilo al que R 3 está unido designa un éster reactivo o un éster de N-hidroxi-imida reactivo; y R 4 es seleccionado de hidrógeno, C 1-12-alquilo y bencilo, bajo condiciones básicas en una mezcla de un solvente aprótico polar y agua; y (b) si R 4 no es hidrógeno, saponificación del grupo de éster de péptido acilado (COOR 4 ) bajo condiciones básicas; para obtener un péptido N-acilado.

Description

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Método de acilación de péptidos y proteínas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de introducción de uno o más grupos acilo en un péptido o una proteína. Más particularmente, la invención se refiere a un método mejorado de acilar el grupo \alpha-amino de un residuo de lisina contenido en un GLP-1 de origen natural o un derivado análogo.

Antecedentes de la invención

Los péptidos son muy usados en la práctica médica, y puesto que pueden ser producidos por tecnología del ADN recombinante, puede ser previsto que su importancia aumente también en los años futuros. Cuando los péptidos nativos o sus análogos son usados en terapia, se encuentra generalmente que tienen un alto aclaramiento. Un alto aclaramiento de un agente terapéutico es inconveniente en casos en los que se desea mantener un alto nivel en la sangre del mismo en un periodo temporal prolongado puesto que luego serán necesarias administraciones repetidas. Ejemplos de péptidos que en su forma nativa tienen un alto aclaramiento son: ACTH, factor de liberación de corticotropina, angiotensina, calcitonina, exendina, exendina-3, exendina-4, insulina, glucagón, péptido-1 de tipo glucagón, péptido-2 de tipo glucagón, factor de crecimiento-1 de tipo insulina, factor de crecimiento-2 de tipo insulina, péptido gástrico inhibitorio, factor liberador de la hormona del crecimiento, péptido activador de la adenilato-ciclasa pituitaria, secretina, enterogastrina, somatostatina, somatotropina, somatomedina, hormona paratiroidea, trombopoyetina, eritropoyetina, factores de liberación hipotalámica, prolactina, hormonas estimuladoras de la tiroides, endorfinas, enquefalinas, vasopresina, oxitocina, opioides y sus análogos, superóxido-dismutasa, interferón, asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, adenosina-desaminasa y ribonucleasa.

La introducción de grupos acilo lipofílicos en péptidos de origen natural o sus análogos conduce a péptidos acilados con un perfil prolongado de acción con respecto al péptido nativo (o análogo inmodificado). Este fenómeno ha sido íntegramente descrito y demostrado en las solicitudes precedentes del presente solicitante, WO98/08871, que entre otros, expone la acilación de GLP-1 y análogos, y WO98/08872, que entre otros, expone la acilación de GLP-2 y análogos, y WO99/43708, que entre otros, expone la acilación de exendina y análogos. Además, ha sido sugerido que la inclusión de un grupo que puede ser cargado negativamente, p. ej. un grupo de ácido carboxílico, contiguo al grupo lipofílico puede ser ventajosa.

La solicitud de patente europea nº. 92107035.5 (Kuraray Co.) describe monoésteres reactivos de ácidos dicarboxílicos de cadena larga para la introducción de ácidos carboxílicos de cadena larga en proteínas.

La introducción de grupos de acilo lipofílico en GLP-1 vía separadores de mono- o dipéptidos pueden ser especialmente interesantes y han sido sugeridos y ejemplificados en WO98/08871. Acido asparático y ácido glutámico fueron mencionados como enlaces adecuados. No obstante, como tales separadores de mono- y dipéptidos incluyen un grupo de ácido carboxílico suplementario, las fases de protección y desprotección posterior fueron consideradas necesarias. La desprotección fue realizada bajo condiciones acídicas que a un cierto grado condujeron a la destrucción del péptido (GLP-1). Así, métodos alternativos para la preparación de estas variantes son deseables.

Así, ha sido el objetivo de la presente invención proporcionar un método alternativo para la introducción de grupos lipofílicos en péptidos vía separadores de ácido \alpha-amino-\alpha,\omega-dicarboxílico. Tal método facilitará la preparación de péptidos modificados donde los grupos de ácido carboxílico cargables son introducidos en la proximidad de grupos lipofílicos, pero sin influencia directa en el grupo lipofílico.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método para acilar uno o más grupos amino de un péptido o proteína, el método comprendiendo:

(a): reacción de un péptido o proteína que tiene al menos un grupo amino libre con un agente acilante de la fórmula general I

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\quad: donde

\quad: n es 0-8;

\quad: R^{1} es COOR^{4};

\quad: R^{2} es una fracción lipofílica, p. ej. seleccionada de C_{3-39}-alquilo, C_{3-39}-alquenilo, C_{3-39}-alcadienilo y residuos esteroidales;

\quad: R^{3} con el grupo carboxilo al que R^{3} es unido designa un éster reactivo o un éster de N-hidroxi-imida reactivo; y

\quad: R^{4} es seleccionado de hidrógeno, C_{1-12}-alquilo y bencilo, bajo condiciones básicas en una mezcla de un solvente aprótico polar y agua; y

(b): si R^{4} no es hidrógeno, saponificación del éster de péptido acilado (COOR^{4}) bajo condiciones básicas; para obtener un péptido N-acilado (o una proteína N-acilada).

Se ha descubierto que la saponificación del éster de péptido acilado (donde R^{4} es un grupo alquilo o bencilo) bajo condiciones básicas es posible con sólo menos o ninguna racemización de los distintos fragmentos de \alpha-aminoácidos del péptido y el separador. El presente solicitante ha encontrado ventajas determinadas sobre la hidrólisis acídica previamente usada respecto a la pureza y supresión de productos secundarios, p. ej. productos de degradación.

Se ha encontrado también que la acilación usando el agente acilante como el ácido libre (donde R^{4} es hidrógeno) bajo condiciones básicas conduce esencialmente directamente al producto deseado, el péptido acilado, sin productos secundarios y sin la necesidad de una fase de desprotección.

En la presente, se describen compuestos útiles como agentes acilantes en el método arriba mencionado, tales compuestos tienen la fórmula general I

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donde

\quad: n es 0-8;

\quad: R^{1} es COOH;

\quad: R^{2} es una fracción lipofílica, p. ej. seleccionada de C_{3-39}-alquilo, C_{3-39}-alquenilo, C_{3-39}acladienilo y residuos esteroidales; y

\quad: R^{3} con el grupo carboxilo al que R^{3} está unido designa un éster reactivo

\quad: o un éster de N-hidroxi-imida reactivo.

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Descripción detallada de la invención Péptidos y proteínas

Se ha considerado generalmente que la presente invención es útil para la introducción de grupos de acilo lipofílico en cualquier péptido (o proteína) para reducir el nivel de aclaramiento in vivo. Ejemplos de tales péptidos y proteínas son, ACTH, factor liberador de corticotropina, angiotensina, calcitonina, exendina y análogos de los mismos, insulina y sus análogos, glucagón y sus análogos, péptido-1 de tipo glucagón y sus análogos, péptido-2 de tipo glucagón y sus análogos, factor de crecimiento-1 de tipo insulina, factor de crecimiento-2 de tipo insulina, péptido gástrico inhibitorio, factor de liberación de la hormona del crecimiento, péptido activador de la adenilato-ciclasa pituitaria, secretina, enterogastrina, somatostatina, somatotropina, somatomedina, hormona paratiroidea, trombopoyetina, eritropoyetina, factores de liberación hipotalámica, prolactina, hormonas estimuladoras de la tiroides, endorfinas, enquefalinas, vasopresina, oxitocina, opioides y sus análogos, superóxido dismutasa, interferón, asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, adenosina-desaminasa y ribonucleasa.

Debe ser entendido que el péptido (o proteína) debería llevar al menos un grupo amino libre, tal grupo amino siendo el grupo amino N-terminal o un grupo amino de cadena lateral. Particularmente interesantes son los grupos amino de residuos de aminoácidos de lisina y de ornitina. El método es particularmente pertinente para la N-acilación del grupo \varepsilon-amino de residuos de lisina. Debería también ser entendido que el péptido o proteína en cuestión puede comprender dos o más grupos amino pendientes que todos pueden ser N-acilados según la presente invención.

Se considera actualmente que la presente invención es especialmente adecuada para la modificación de GLP-1 y sus análogos. Ejemplos de GLP-1 y análogos que pueden ser N-acilados según la presente invención son GLP-1 y análogos truncados, tales como Arg^{26}-GLP-1 (7-37); Arg^{34}-GLP-1 (7-37); Lys^{36}-GLP-1 (7-37); Arg^{26.34}Lys^{36}-GLP-1(7-37)-, Arg^{26.34}Lys^{38}GLP-1(7-38); Arg^{26.34}Lys^{39}-GLP-1(7-39); Arg^{26.34}Lys^{40}-GLP-1(7-40); Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{34}Lys^{36}-G LP-1 (7-37); Arg^{26}Lys^{39}-GLP- 1 (7-39); Arg^{34}Lys^{40}-GLP-1(7-40); Arg^{26.34}Lys^{36.39}-GLP-1(7-39); Arg^{26.34}Lys^{36.40}-GLP-1(7-40); Gly^{8}Arg^{26}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{34}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{26.34}
Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{26.34}Lys^{39}-GLP-1(7-39); Gly^{8}Arg^{26.34}Lys^{40}-GLP-1(7-40); Gly^{8}Arg^{26} Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{26}Lys^{39}-GLP-1 (7-39); Gly^{8}Arg^{34}Lys^{40}-GLP-1(7-40); Gly^{8}Arg^{26.34}Lys^{36.39}-GLP-1(7-39); Gly^{8}Arg^{26.34}Lys^{36.40}-GLP-1(7-40); Arg^{26.34}Lys^{38}GLP-1(7-38); Arg^{26.34}Lys^{39}GLP-1(7-39); Arg^{26.34}Lys^{40}GLP-1(7-40); Arg^{26.34}Lys^{41}GLP-1(7-41); Arg^{26.34}Lys^{42}GLP-1(7-42); Arg^{26.34}Lys^{43} GLP-1(7-43); Arg^{26.34}Lys^{44} GLP-1(7-44); Arg^{26.34}Lys^{45} GLP-1(7-45); Arg^{26.34}Lys_{38} GLP-1(1-38); Arg^{26.34}Lys^{39}GLP-1(1-39); Arg^{26.34}Lys^{40} GLP-1(1-40); Arg^{26.34}
Lys^{41}GLP-1(1-41); Arg^{26.34}Lys^{42} GLP- 1(1-42); Arg^{26.34}Lys^{43} GLP-1(1-43); Arg^{26.34}Lys^{44} GLP-1(1-44); Arg^{26.34}Lys^{45} GLP-1(1-45); Arg^{26.34}Lys^{38} GLP-1(2-38); Arg^{26.34}Lys^{39} GLP-1(2-39); Arg^{26.34}Lys^{40} GLP-1(2-40); Arg^{26.34}Lys^{41} GLP-1(2-41); Arg^{26.34}Lys^{42} GLP-1(2-42); Arg^{26.34}Lys^{43} GLP-1(2-43); Arg^{26.34}Lys^{44} GLP-1(2-44); Arg^{26.34}Lys^{45} GLP-1(2-45); Arg^{26.34}Lys^{38} GLP-1(3-38); Arg^{26.34}Lys^{39} GLP-1(3-39); Arg^{26.34}Lys^{40} GLP-1(3-40); Arg^{26.34}Lys^{41} GLP-1(3-41); Arg^{26.34}Lys^{42} GLP-1(3-42); Arg^{26.34}Lys^{43} GLP-1(3-43); Arg^{26.34}Lys^{44} GLP-1(3-44); Arg^{26.34}Lys^{45} GLP-1(3-45); Arg^{26.34}
Lys^{38} GLP-1(4-38); Arg^{26.34}Lys^{39} GLP-1(4-39); Arg^{26.34}Lys^{40} GLP-1 (4-40); Arg^{26.34}Lys^{41} GLP-1(4-41); Arg^{26.34}Lys^{42} GLP-1(4-42); Arg^{26.34}Lys^{43} GLP-1(4-43); Arg^{26.34}Lys^{44} GLP-1(4-44); Arg^{26.34}Lys^{45} GLP-1(4-45); Arg^{26.34}Lys^{38} GLP-1(5-38); Arg^{26.34}Lys^{39} GLP-1(5-39); Arg^{26.34}Lys^{40} GLP-1(5-40); Arg^{26.34}Lys^{41} GLP-1(5-41); Arg^{26.34}Lys^{42} GLP-1(5-42); Arg^{26.34}Lys^{43} GLP-1(5-43); Arg^{26.34}Lys^{44} GLP-1(5-44); Arg^{26.34}Lys^{45} GLP-1(5-45); Arg^{26.34}Lys^{38} GLP-1(6-38); Arg^{26.34}Lys^{39} GLP-1(6-39); Arg^{26.34}Lys^{40} GLP-1(6-40); Arg^{26.34}Lys^{41} GLP-1(6-41); Arg^{26.34}Lys^{42} GLP-1(6-42); Arg^{26.34}
Lys^{43} GLP-1(6-43); Arg^{26.34}Lys^{44} GLP-1(6-44); Arg^{26.34}Lys^{45} GLP-1(6-45); Arg^{26}Lys^{38} GLP-1(1-38); Arg^{34}Lys^{38} GLP-1(1-38); Arg^{26.34}Lys^{36.35} GLP-1(1-38); Arg^{26}Lys^{38} GLP-1(7-38); Arg^{34}Lys^{38} GLP-1(7-38); Arg^{26.34}Lys^{36.38} GLP-1(7-38); Arg^{26.34}Lys^{38} GLP-1(7-38); Arg^{26}Lys^{39} GLP-1(1-39); Arg^{34}Lys^{39} GLP-1(1-39); Arg^{26.34}Lys^{36.39} GLP-1(1-39); Arg^{26}
Lys^{39} GLP-1 (7-39); Arg^{34}Lys^{39} GLP-1(7-39); Arg^{26.34}Lys^{36.39} GLP-1(7-39); Arg^{26}-GLP-1(7-37), Arg^{34}-GLP-1(7-37), Lys^{36}-GLP-1(7-37), Arg^{26.34}Lys^{36}-GLP-1(7-37), Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1 (7-37), Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37), Gly^{8}Arg^{26}-GLP-1(7-37), Gly^{8}Arg^{34}-GLP-1(7-37), Gly^{8}Lys^{36}-GLP-1(7-37), Gly^{8}Arg^{26.34}Lys^{36}-GLP-1(7-37), Gly^{8}Arg^{26}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Gly^{8}Arg^{34}Lys^{36}-GLP-1(7-37); Arg^{26}Lys^{38}-GLP-1 (7-38), Arg^{26.34}Lys^{38}-GLP-1(7-38), Arg^{26.34}Lys^{36.38}-GLP-1(7-38), Gly^{8}Arg^{26}Lys^{38}-GLP-1(7-38); Gly^{8}Arg^{26.34}Lys^{36.38}-GLP-1(7-38); Gly_{8},Arg^{26.34} Glu^{37},Lys^{38}-GLP-1(7-38), Arg^{26}
Lys^{39}-GLP-1(7-39), Arg^{26.34}Lys^{36.39}-GLP-1(7-39), Gly^{8}Arg^{26}Lys^{39}-GLP-1(7-39); Gly^{8}Arg^{26.34}Lys^{36.39}-GLP-1(7-39);
Arg^{34}Lys^{40}-GLP-1(7-40), Arg^{26.34}Lys^{36.40}-GLP-1(7-40), Gly^{8}Arg^{34}Lys^{40}-GLP-1(7-40) y Gly^{8}Arg^{26.34}Lys^{36.40}-GLP-1(7-40). Cada uno de estos análogos de GLP-1 y análogos truncados para el uso en el método de la presente invención constituyen formas de realización alternativas de la presente invención.

Se considera actualmente que la presente invención es también especialmente adecuada para la modificación de GLP-2 y sus análogos. Ejemplos de GLP-2 y análogos que pueden ser N-acilados según la presente invención son análogos de GLP-2 y análogos truncados, tales como Lys^{20}GLP-2(1-33); Lys^{20}Arg^{30}GLP-2(1-33); Arg^{30}Lys^{34}GLP-2(1-34); Arg^{30}Lys^{35}GLP-2(1-35); Arg^{30.35}Lys^{20}GLP-2(1-35); y Arg^{35}GLP-2(1-35). Cada uno de estos análogos de GLP-2 y análogos truncados para el uso en el método de la presente invención constituye formas de realización alternativas de la presente invención.

Se cree actualmente que la presente invención es también especialmente adecuada para la modificación de exendina y sus análogos. Ejemplos de exendina y análogos que pueden ser N-acilados según la presente invención son análogos de exendina y análogos truncados, tales como exendina-3 y exendina-4. Cada uno de estos análogos de exendina y análogos truncados para el uso en el método de la presente invención, constituye formas de realización alternativas de la presente invención.

En otra forma de realización de la presente invención la N-acilación se desarrolla en el grupo \varepsilon-amino de residuos de lisina.

Los efectos de GLP-1 y sus análogos están íntegramente descritos en WO98/08871. Los efectos de GLP-2 y sus análogos están íntegramente descritos en WO98/08872. Los efectos de exendina y sus análogos están íntegramente descritos en WO99/43708.

Agente acilante

En el método según la invención, un péptido (o proteína) que tiene al menos un grupo amino libre es reaccionado con un agente acilante de la fórmula general I

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El número entero n en la fórmula I es preferiblemente 0-8, en particular 0-6 correspondiendo a, p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico, etc. preferiblemente, n es 0-4 tal como 0-2, p. ej. 0 (ácido aspártico) o 1 (glutámico ácido). Cada uno de estos números enteros y gamas constituye formas de realización alternativas de la presente invención.

R^{1} en la fórmula I representa un grupo ácido libre (COOH) o un grupo éster (COOR^{4}). En los casos donde R^{1} es un grupo éster, R^{4} es seleccionado de grupos que pueden ser eliminados (como los alcoholes correspondientes) por hidrólisis bajo condiciones básicas. Ejemplos de tales grupos son C_{1-12}-alquilo, p. ej. metilo, etilo, prop-1-ilo, prop-2-ilo, but-1-ilo, but-2-ilo, 2 metil-prop-1-ilo, 2-metil-prop-2-ilo (terc-butilo), hex-1-ilo, etc., y bencilo. En el método de la presente invención cada uno de estos grupos constituye formas de realización alternativas de la presente invención.

R^{2} en la fórmula I representa la fracción lipofílica que debe ser incorporada en el péptido o proteína. Tal fracción lipofílica es normalmente seleccionada de C_{3-39}-alquilo, C_{3-39}-alquenilo, C_{3-39}-alcadienilo y residuos esteroidales. Ejemplos específicos de C_{3-39}-alquilo son heptilo, nonilo, undecanilo, tridecanilo, pentadecanilo, heptadecanilo, y nonadecanilo. En el método de la presente invención cada una de estas fracciones lipofílicas constituye formas de realización alternativas de la presente invención.

El sustituyente o fracción lipofílica se caracteriza por tener una solubilidad en agua a 20ºC en la gama de aproximadamente 0,1 mg/100 ml de agua a aproximadamente 250 mg/100 ml de agua, preferible en la gama de aproximadamente 0,3 mg/100 ml de agua a aproximadamente 75 mg/100 ml de agua. Por ejemplo, ácido octanoico (C8) tiene una solubilidad en agua a 20ºC de 68 mg/100 ml, ácido decanóico (C10) tiene una solubilidad en agua a 20ºC de 15 mg/100 ml, y ácido octadecanoico (C18) tiene una solubilidad en agua a 20ºC de 0,3 mg/100 ml. En el método de la presente invención cada una de estas gamas de sustituyente lipofílico constituye formas de realización alternativas de la presente invención.

Los términos "C_{3-39}-alquilo", "C_{3-39}-alquenilo" y "C_{3-39}-alcadenilo" se destinan a cubrir la cadena lineal y ramificada, preferiblemente cadena lineal, saturada, monoinsaturada y diinsaturada, respectivamente, radicales de hidrocarburo de 3-39 átomos de carbono. Ejemplos específicos de C_{3-39}-alquilo son heptilo, nonilo, undecanilo, tridecanilo, pentadecanilo, heptadecanilo, y nonadecanilo.

Cuando se usa en la presente, el término "residuo esteroidal" se destina a significar un grupo lipofílico que con el grupo carbonílico al que se une R^{2} está derivado de un ácido carboxílico esteroide, es decir, un C_{16-36}-hidrocarburo tri-, tetra y pentacíclico, completamente saturado o parcialmente insaturado. Ejemplos de tales grupos R^{2}-C(=O)- son litocoloilo, desoxicoloilo, y coloilo.

Entre los grupos lipofilicos arriba mencionados, C_{7-25}-alquilo, C_{7-25}-alquenilo, C_{7-25}-alcadenilo y residuos esteroidales son especialmente pertinentes. Ejemplos particularmente interesantes son heptilo, nonilo, undecanilo, tridecanilo, pentadecanilo, heptadecanilo, nonadecanilo, litocoloilo, desoxicoloilo, y coloilo. En el método de la presente invención, cada uno de estos grupos lipofilicos constituye formas de realización alternativas de la presente invención.

R^{3} en la fórmula I con el grupo carboxilo al que R^{3} está unido designa un éster reactivo o un éster de N-hidroxi-imida reactivo. En el método de la presente invención, cada uno de estos ésteres constituye formas de realización alternativas de la presente invención. Ésteres reactivos y ésteres de N-hidroxi-imida reactivos son bien conocidos en la técnica de la química orgánica (especialmente en química peptídica) como grupos funcionales que son usados en acilación de grupos amino, tio e hidroxi. Dentro del contexto de la presente invención, el término "éster reactivo o un éster de N-hidroxi-imida reactivo" está destinado a significar una forma de éster funcionalizada de un grupo de ácido carboxílico adecuado para acilar una amina, preferiblemente una amina primaria. Se debería entender, por lo tanto, que la selectividad de acilación de aminas primarias se prefiere sobre la acilación de grupos hidroxi y tio. Los ésteres de N-hidroxi-imida reactivos son especialmente preferidos.

Ejemplos de ésteres reactivos son ésteres de 1-hidroxibenzotriazol y derivados. Varios reactivos altamente eficaces, p. ej. tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio, para la formación de estos ésteres activados de ácidos carboxílicos son conocidos. Estos ésteres reactivos son normalmente formados in situ en presencia de una base, p. ej. una base orgánica tal como una trialquilamina.

Ejemplos de la parte imida de ésteres de N-hidroxi-imida reactivos son aquellos específicamente descritos en la solicitud de patente europea nº. 92107035.5, página 13, línea 3, a página 17, línea 10. Algunos ejemplos especialmente interesantes de partes de imida, son succinimida, ftalimida, etc. cada una de estas partes de imida constituye formas de realización alternativas de la presente invención.

Ésteres de N-hidroxi-imida reactivos de la fórmula I pueden ser preparados por condensación del ácido correspondiente (es decir, el diácido \alpha-carboxi protegido N-acilado (R^{4} no es hidrógeno)) con una cantidad equimolar (p. ej. 0,95-1,05 mol, preferiblemente 1,0 mol) de la N-hidroxi-imida de la imida correspondiente. (El diácido \alpha-carboxi protegido N-acilado es por otro lado normalmente obtenido a partir del correspondiente \alpha-aminodiácido \alpha-carboxi protegido, y un éster de benzotriazol de la fracción lipofílica. Este éster de benzotriazol puede, p. ej., ser obtenido a partir del cloruro de ácido y el benzotriazol o del ácido libre y el benzotriazol por acoplamiento DCC como se describe en WO 98/02460 (ejemplos 1-3)). La condensación es normalmente realizada bajo condiciones de deshidratación, p. ej. en presencia de un reactivo de enlace tal como un reactivo de enlace de carbodiimida (p. ej. diciclohexilcarbodiimida (DCC)). El reactivo de enlace, cuando está presente, es preferiblemente añadido en cantidades equimolares con respecto al ácido. La reacción es normalmente realizada en un solvente polar aprótico tal como tetrahidrofurano anhidro (THF), dimetilformamida anhidro (DMF), acetona anhidro, diclorometano anhidro, dioxano anhidro, dimetilacetamida anhidro, o N-metil-2-pirrolidona anhidro (NMP). La reacción es normalmente realizada a una temperatura en la gama de 0-50ºC, p. ej. 5-30ºC tal como temperatura ambiente, durante un periodo de 1-96 horas tal como 4-36 horas. Un grupo posible de reactivos y condiciones es como sigue: la N-hidroxi-imida (p. ej. succinimida o ftalimida) y el ácido en cuestión en una proporción molar de aproximadamente 1:1 son disueltos en THE anhidro o DMF anhidro (o una mezcla de la misma) y una cantidad equimolar de DCC se añade a la solución. Después de la finalización de la reacción entre la N-hidroxi-imida y el ácido, el producto es aislado y purificado usando medios convencionales tales como filtración (filtración de diciclohexilurea precipitada (DCU) cuando DCC se usa como reactivo de enlace), cristalización, recristalización, cromatografía, etc. Una vía de purificación posible incluye la eliminación del reactivo de enlace usado precipitado por filtración, evaporación del solvente bajo presión reducida, resuspensión del producto, p. ej. en acetona, filtración, cristalización por adición de un solvente no polar, p. ej. hexano, y opcionalmente recristalización y/o lavado. El producto puede ser usado directamente como el reactivo acilante de la fórmula I en el método según la invención.

En el caso en que el reactivo acilante de la fórmula I debe ser usado como el ácido \alpha-carboxílico libre (R^{4} = hidrógeno), un compuesto de la fórmula I donde R^{4} es un grupo que puede ser eliminado selectivamente es convertido al compuesto correspondiente donde R^{4} es hidrógeno. El grupo de protección de ácido carboxílico puede ser un grupo bencilo que puede ser eliminado por hidrogenación catalítica o un grupo alilo que puede ser selectivamente eliminado. Un grupo de protección de bencilo puede ser eliminado por hidrogenación catalítica en un solvente aprótico polar, p. ej. en acetona, a la temperatura ambiente usando paladio-en-carbono e hidrógeno. La reacción puede ser realizada en un vaso cerrado con una atmósfera de hidrógeno (normalmente 0,1-10 atm) bajo agitación vigorosa. La reacción es normalmente completada en 0,5-12 horas dependiendo de la calidad del catalizador de paladio. Se aplica un tratamiento final convencional.

Compuestos para el uso en el método de la presente invención pueden ser de la fórmula general I

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donde

\quad: n es 0-8;

\quad: R^{1} es COOH;

\quad: R^{2} es una fracción lipofílica, preferiblemente seleccionada de C_{3-39}-alquilo, C_{3-39}-alquenilo, C_{3-39}-alcadienilo y residuos esteroidales; y

\quad: o un éster de N-hidroxi-imida reactivo.

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Condiciones de reacción

La reacción entre el agente acilante de la fórmula I y el péptido o proteína es realizada bajo condiciones básicas en una mezcla de un solvente aprótico polar y agua.

El agente acilante de la fórmula I es normalmente usado en un exceso ligero con respecto al número de grupos amino del péptido que debe ser acilado. La proporción es normalmente de 1:1 a 1:20 con un exceso del agente acilante, preferiblemente de 1: 1.2 a 1:5, teniendo en cuenta el número de grupos amino en el péptido.

Debe ser entendido que el péptido puede ser completamente N-acilado o sólo parcialmente N-acilado dependiendo de la cantidad de agente acilante usado y las condiciones de reacción. Se prefiere que la N-acilación sea sustancialmente estoquiométrica.

Normalmente, el solvente aprótico polar es seleccionado de tetrahidrofurano anhidro (THE), dimetilformamida anhidro (DMF), acetona, diclorometano, dimetilsulfóxido (DMSO), dioxano, dimetilacetamida, y N- metil-2-pirrolidona y sus mezclas derivadas, entre las cuales dimetilformamida, dimetilsulfóxido, dimetilacetamida y N-metil-2-pirrolidona son preferidas y N-metil-2-pirrolidona es especialmente preferida. La proporción entre el solvente aprótico polar y agua (p. ej. N-metil-2-pirrolidona y agua) es normalmente de 1:10 a 10:1, en particular de 1:5 a 5:1, especialmente de 1:1 a 3:1.

La temperatura es normalmente mantenida en la gama de -10-50ºC, preferiblemente en la gama de 0-25ºC.

Es importante que el valor de pH de la mezcla de solvente esté en la gama de 7-14, tal como 9-13, preferiblemente en la gama de 9.5-12.5, para que la reacción proceda fácilmente. El resultado con respecto al rendimiento y pureza es normalmente óptimo cuando el valor de pH de la mezcla de solvente esté en la gama de 10-12. El valor de pH deseado es obtenido por adición de hidróxidos de metal alcalino, p. ej. hidróxido sódico y hidróxido potásico, y/o bases orgánicas tales como trialquilaminas (p. ej. trietilamina, N,N-diisopropiletilamina, etc.)

Como un ejemplo típico, la reacción en la fase (a) es realizada usando la proteína y el agente acilante de la fórmula I en una proporción molar de 1:1 a 1:5. El péptido es normalmente predisuelto en agua a -10-30ºC tal como 0-25ºC y el pH es ajustado al nivel deseado usando un hidróxido de metal alcalino (p. ej. hidróxido sódico o hidróxido de potasio). El valor de pH puede ser adicionalmente ajustado usando ácidos, p. ej. ácido acético, y bases, p. ej. trialquilamina, pero la temperatura está preferiblemente dentro de la gama anterior. El solvente aprótico polar (o una mezcla de solventes) es luego añadido. El agente acilante es posteriormente añadido. La reacción es normalmente dejada proceder hasta la terminación (pueden ser vigiladas por HPLC) que es normalmente obtenida en un plazo de 0,2-4 horas, tal como 0,2-1 hora, antes de la adición de agua y un ácido, p. ej. ácido acético, hasta pH 6.5-9.0. El producto es normalmente aislado y purificado por HPLC, o es precipitado por pH isoeléctrico, o es hidrolizado (fase (b)) antes de la purifica-
ción.

Cuando un agente acilante de la fórmula I donde se usa R^{4} es hidrógeno, el péptido N-acilado o proteína portadora de fracciones lipofílicas y grupos carboxílicos libres se obtienen directamente. Así, la variante en la que R^{4} es hidrógeno representa una forma de realización preferida del método de la presente invención.

De forma alternativa, es decir, cuando el grupo R^{4} es C_{1-12}-alquilo o bencilo, el éster peptídico N-acilado (o éster de proteína) es saponificado bajo condiciones básicas para obtener el péptido N-acilado o proteína N-acilada. La saponificación es normalmente realizada en una solución 0.01-4.0 M de un hidróxido de metal alcalino p. ej. hidróxido sódico o potásico. El pH de la solución es normalmente 10-14. La reacción es normalmente dejada proceder durante 0,1-12 horas, preferiblemente durante 0,5-4 horas, a 0-40ºC tal como alrededor de la temperatura ambiente. Después de la reacción, el producto es purificado, p. ej. por precipitación a pH isoeléctrico y/o por HPLC preparatoria. Así, la variante en la que R^{4} es C_{1-12}-alquilo o bencilo representa otra forma de realización preferida del método de la presente invención.

La presente invención también se refiere a los aspectos siguientes:

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Aspecto 1.: Un método para acilar un grupo amino de un péptido o una proteína, el método comprendiendo:

(a): reacción de un péptido o una proteína que tiene al menos en grupo amino libre con un agente acilante de la fórmula general I

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3

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\quad: donde

\quad: n es 0-8;

\quad: R^{1} es COOR^{4};

\quad: R^{2} es una fracción lipofílica;

\quad: R^{3} con el grupo carboxilo al que R^{3} está unido designa un éster reactivo o un éster de N-hidroxi-imida reactivo; y

(b): si R^{4} no es hidrógeno, saponificación del grupo éster de péptido acilado (COOR^{4}) bajo condiciones básicas;

\quad: para obtener un péptido N-acilado.

Aspecto 2.: Un método según el aspecto 1, donde R^{4} es hidrógeno.

Aspecto 3.: Un método según el aspecto 1, donde R^{4} seleccionado de C_{1-8}-alquilo y bencilo.

Aspecto 4.: Un método según cualquiera de los aspectos 1-3, donde el R^{3} con el grupo carboxilo al que R^{3} está unido designa un éster de N-hidroxi-imida reactivo.

Aspecto 5.: Un método según cualquiera de los aspectos 1-4, donde la mezcla del solvente aprótico y agua es una mezcla de 1:5 a 5:1 de N-metil-2-pirrolidona y agua.

Aspecto 6.: Un método según cualquiera de los aspectos 1-5, donde el pH de la mezcla reactiva en la fase (a) está en la gama de 9-13.

Aspecto 7.: Un método según cualquiera de los aspectos 1-6, donde la temperatura de la mezcla reactiva en la fase (a) está en la gama de 0-50ºC.

Aspecto 8.: Un método según cualquiera de los aspectos 3-7, donde el éster de péptido acilado es saponificado a un valor de pH en la gama de 10-14.

Aspecto 9.: Un método según cualquiera de los aspectos precedentes donde R^{2} es seleccionado de C_{3-39}-alquilo, C_{3-39} alquenilo, C_{3-39}-alcadienilo y residuos esteroidales.

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Ejemplos Preparación de materias primas

Ejemplo 1

Preparación de \alpha-bencil éster de ácido N-hexadecanoilglutámico

\alpha-bencil éster de ácido glutámico (4.75 g, 20.0 mmol) fue suspendido en N-metil-2-pirrolidona (100 ml) a 20-25ºC. Se añadió trietilamina (2,53 g, 25,0 mmol) y luego 1-hexadecanoilbenzotriazol (7,15 g, 20,0 mmol). La mezcla reactiva fue agitada a 20-25ºC durante 22 horas. A la solución resultante se le añadió 0.2 M de ácido clorhídrico (250 ml). La suspensión resultante fue enfriada a 0ºC durante 3 horas. El producto fue aislado por filtración, lavado con agua (50 ml x 4), y secado a peso constante bajo presión reducida y a 40ºC.

Rendimiento: 9,15 g (96%) de material blanco, fusión a 90,0ºC (valor máximo) determinado por calorimetría diferencial de barrido (DSC).

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Ejemplo 2

Preparación de \alpha-metil éster de ácido N-hexadecanoilglutámico

Bajo condiciones de reacción similares a las que se describe en el ejemplo 1, se preparó \alpha-metil éster de ácido N-hexadecanoilglutámico usando 8,06 g (50,0 mmol) de \alpha-metil éster de ácido glutámico.

Rendimiento: 17,70 g (88%) de material blanco, fusión a 95,4ºC (valor máximo) determinado por DSC.

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Ejemplo 3

Preparación de éster de \gamma-N-hidroxisuccinimida de \alpha-bencil éster de ácido N-hexadecanoilglutámico

\alpha-bencil éster de ácido N-hexadecanoilglutámico (23,78 g, 50,0 mmol) fue disuelto en tetrahidrofurano (200 ml) a 20-25ºC. N-hidroxisuccinimida (5,75 g, 50,0 mmol), y luego diciclohexilcarbodiimida (10,32 g, 50,0 mmol) fueron añadidas. La mezcla reactiva fue agitada a 20-25ºC durante 20 horas. La suspensión resultante fue filtrada, y el filtrado evaporado a sequedad bajo presión reducida. El residuo cristalino fue disuelto en acetona (100 ml) a 40ºC, y aclarado por filtración. Al filtrado se le añadió n-heptano (300 ml). La suspensión resultante fue agitada durante 4 horas a 20-25ºC, luego enfriada a 0ºC durante ½ hora. El producto fue aislado por filtración, lavado con n-heptano (50 ml x 3), y secado a peso constante bajo presión reducida a 40ºC.

Rendimiento: 23.75 g (83%) de material blanco, fusión a 98.6ºC (valor máximo) determinado por DSC.

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Ejemplo 4

Preparación de éster de \gamma-N-hidroxisuccinimida de \alpha-metil éster de ácido N-hexadecanoilglutámico

Bajo condiciones de reacción similares a las que se describe en el ejemplo 3, se preparó éster de \gamma-N-hidroxisuccinimida de \alpha-metil éster de ácido N-hexadecanoilglutámico, usando 8,00 g (20 mmol) de \alpha-metil éster de ácido N-hexadecanoilglutámico.

Rendimiento: 6,45 g (65%) de material blanco, fusión a 106,0ºC (valor máximo) determinado por DSC.

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Ejemplo 5

Preparación de éster de \gamma-N-hidroxisuccinimida de ácido N- hexadecanoilglutámico

Éster de \gamma-N-hidroxisuccinimida de \alpha-benciléster de ácido N-hexadecanoilglutámico (5,73 g, 10,0 mmol) fue disuelto en acetona (100 ml) a 20-25ºC. Se añadió el 10% de Paladio en pasta de carbono (aprox. 0,25 g como material seco). La suspensión fue agitada bajo hidrógeno hasta que el consumo de hidrógeno se detuvo (290 ml de hidrógeno, 45 minutos). El catalizador fue eliminado por filtración, y el filtrado fue evaporado a sequedad bajo presión reducida a 20-25ºC. El residuo fue disuelto en acetona (25 ml) a 20-25ºC, y aclarado por filtración. Al filtrado se le añadió n-heptano (200 ml). La suspensión resultante fue agitada a 20-25ºC durante 1 hora. El producto fue aislado por filtración, lavado con N-heptano (50 ml x 2) y secado a peso constante bajo presión reducida a 40ºC.

Rendimiento: 4,20 (87%) de material blanco, fusión a 100,8ºC (valor máximo) determinado por DSC.

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Preparación de análogos de GLP-1 acilado

Ejemplo 6

Preparación de Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}

Arg^{34}-GLP-1^{7-37} (5,0 g de material de péptido de isoprecipitado congelado, aprox. 0,15 mmol) fue disuelto en agua (25 ml) a 0-5ºC. El pH de la solución fue ajustado a 12,5 por la adición de 1,0 M de hidróxido sódico (2,25 ml). Después de 2 minutos, se añadió N-metil-2-pirrolidona (50 ml) y 1,0 M de ácido acético (1.25 ml), manteniendo la temperatura a 15ºC. Se añadió trietilamina (0,2 ml) y luego éster de \gamma-N-hidroxisuccinimida de ácido N-hexadecanoilglutámico (97.0 mg, 0.20 mmol). Después de 30 minutos a se añadió agua a 15ºC (50 ml), y el pH fue ajustado a 8.0 por adición de 1,0 M de ácido acético (1.70 ml).

Rendimiento: por RP-HPLC analítica la mezcla reactiva mostró que contenía el 77% (por área) de Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}

La purificación final del producto se obtuvo por cromatografía en columna.

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Ejemplo 7

Preparación de Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu-OMe(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-3}

Bajo condiciones de reacción similares a las que se describe en el Ejemplo 6. Arg^{34}-GLP-1^{7-37} fue acilado usando éster de \gamma-N-hidroxisuccinimida de \alpha-metil éster de ácido N-hexadecanoilglutámico.

Rendimiento: por RP-HPLC analítica la mezcla reactiva mostró que contenía el 64% (por área) de Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu-OMe(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}. El producto podría ser aislado como un precipitado para ajustar el pH de la mezcla reactiva a 6.0 usando 1 M de ácido acético. De forma alternativa, la mezcla reactiva podría ser usada directamente como se describe en el ejemplo posterior 8.

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Ejemplo 8

Preparación de Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-3}

La mezcla reactiva que contiene el producto obtenido en el ejemplo 7 fue sometida a una hidrólisis básica para ajustar el pH a 12-13 usando 1 M de hidróxido sódico. La temperatura de la mezcla reactiva fue mantenida a 8-18ºC. Después de 2 horas la reacción fue completada, y el pH de la mezcla reactiva fue ajustado a 7.45 por adición de 1 M de ácido acético.

Rendimiento: por RP-HPLC analítica la mezcla reactiva mostró que contenía el 65% (por área) de Arg^{34}Lys^{26}-[N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil))]-GLP-1^{7-37}

La purificación final del producto se obtuvo por cromatografía en columna.

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Ejemplo 9

Los compuestos siguientes son preparados análogos al compuesto del Ejemplo 6, y la purificación final del producto se obtiene por cromatografía en columna:

Arg^{26.34},Lys^{36}-(N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil)))-GLP-1^{7-36},

Arg^{26},Lys^{34}-(N-\varepsilon-(\gamma-Glu(n-hexadecanoil)))-GLP-1^{7-37}, y

Gly^{8},Arg^{26,34},Glu^{37},Lys^{38}-(N-\varepsilon-(\gamma-Glu(N-hexadecanoil)))-GLP-1^{7-38}.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

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Documentos de patente citados en la descripción

WO 9808871 A [0003] [0005] [0017]

WO 9808872 A [0003] [0017]

WO 9943708 A [0003] [0017]

EP 92107035 A [0004] [0028]

WO 9802460 A [0029]

Claims

1. Método para acilar un grupo amino de un péptido o una proteína, el método comprendiendo:

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4

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\quad: donde

\quad: n es 0-8;

\quad: R^{1} es COOR^{4};

\quad: R^{2} es una fracción lipofílica;

(b): si R^{4} no es hidrógeno, saponificación del grupo de éster de péptido acilado (COOR^{4}) bajo condiciones básicas;

\quad: para obtener un péptido N-acilado.

2. Método según la reivindicación 1, donde R^{4} es hidrógeno.

3. Método según la reivindicación 1, donde R^{4} seleccionado de C_{1-8}-alquilo y bencilo.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el R^{3} con el grupo carboxilo al que R^{3} está unido designa un éster de N-hidroxi-imida reactivo.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la mezcla del solvente aprótico y agua es una mezcla 1:5 a 5:1 de N-metil-2-pirrolidona y agua.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el pH de la mezcla reactiva en la fase (a) está en la gama de 9-13.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la temperatura de la mezcla reactiva en la fase (a) está en la gama de 0-50ºC.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, donde el éster de péptido acilado es saponificado a un valor de pH en la gama de 10-14.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde R^{2} es seleccionado de C_{3-39}-alquilo, C_{3-39}-alquenilo, C_{3-39}-alcadienilo y residuos esteroidales.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde R^{2} es seleccionado de C_{7-25}-alquilo.

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11. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde dicho péptido es seleccionado de GLP-1 (7-37) y sus análogos, exendina y sus análogos, y GLP-2(1-34) y sus análogos.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde dicho péptido es seleccionado de exendina-3, exendina-4, Arg^{26}-GLP-1(7-37), Arg^{34}-GLP-1(7-37), Val^{8}GLP-1(7-37), Thr^{8}GLP-1(7-37), Met^{8}GLP-1 (7-37), Gly^{8}GLP-1(7-37), Val^{8}GLP-1(7-36) amida, Met^{8}GLP-1(7-36) amida, y Gly^{8}GLP-1(7-36) amida.