KR20090016727A - 부위 특이적 페길화 방법 - Google Patents

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소시에떼 더 콘세이유 더 레세르세 에 다플리까띠옹 시엔띠피끄, 에스.아.에스.
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Abstract

본 발명은 단백질, 펩타이드 및 다른 분자에서 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노산을 가지고 있는 시스테인의 화학-선택적인 페길화 방법에 관한 것이다. 유사한 방법이 호모시스테인, 셀레노시스테인, 페니실아민의 화학-선택적인 페길화를 위해 제공된다.

Description

부위 특이적 페길화 방법{METHODS FOR SITE-SPECIFIC PEGYLATION}
본 발명은 단백질, 펩타이드 및 그외 분자에서의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄와 유리 α-아미노산를 가진 시스테인 잔기의 화학-선택적인 페길화(chemo-selective pegylation) 방법에 관한 것이다.
통상 경구 경로로 투여되는 소형 분자 약물, 단백질계 치료제 및 펩타이드계 치료제는 전형적으로 이들의 매우 낮은 경구 생체이용가능성으로 인해 주사로 투여된다. 주사 후 대부분의 단백질 및 펩타이드는 효소에 의해 신속하게 분해되어 신체에서 없어지므로, 생체내 순환성 반감기가 짧다. 짧은 순환성 반감기는 보다 낮은 효능, 보다 잦은 투여, 낮은 환자 순응성 및 단백질 및 펩타이드 치료제의 높은 단가의 원인이 된다. 따라서, 단백질 및 펩타이드 약물이 작용하는 기간을 연장시키는 방법의 개발 필요성이 절실한 실정이다.
단백질 또는 펩타이드에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 공유결합으로 부착시키는 것은 체내에서의 단백질 및 펩타이드의 순환성 반감기를 증가시키는 유용한 방법인 것으로 입증되고 있다(Abuchowski, A. et al., Cancer Biochem. Biophys., 1984, 7:175-186; Hershfield, M.S. et al., N. Engl. J. Medicine 316:589-596; and Meyers, F. J. et al., Clin. Pharmacol. Ther., 1991, 49:307-313). 단백질 및 펩타이드에의 PEG의 공유결합성 부착은 분자를 효소 분해로부터 보호할 뿐만 아니라 신체에서의 이의 소거율(clearance rate)을 감소시킨다. 단백질에 부착되는 PEG의 크기는 단백질의 순환성 반감기에 상당한 영향을 미친다. 통상적으로, PEG가 클수록, 부착된 단백질의 생체내 반감기는 길어진다. 목표한 순환성 반감기를 보이는 단백질 및 펩타이드 제조에 적합한, 여러가지 크기의 PEG를 상업적으로 이용할 수 있다(Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006; 및 DS Catalogue Ver 7.1). 또한, PEG 모이어티는 수용성을 증가시키고, 단백질, 펩타이드 및 그외 분자의 면역원성을 감소시킨다(Katre, N.V. et al., Proc. Natl. Aced. Sci. USA, 1998, 84:1487-1491; and Katre N.V. et al., J. Immunology, 1990, 144:209-213).
단백질을 페길화하는 여러가지 방법들이 논문들에 보고되어 있다. 예를 들면, N-하이드록시 숙신이미드 (NHS)-PEG는 라이신 잔기의 유리 아민기와 단백질의 N-말단을 페길화하는데 사용된다. 단백질은 통상적으로 여러 개의 라이신 잔기와 말단의 아민기를 포함하고 있기 때문에, 단백질의 여러 부위들을 이러한 방법을 이용하여 페길화한다. 여러 개의 PEG 모이어티는 통상적으로 단백질과 이들의 생물학적 타겟 분자 사이의 상호작용을 교란하기 때문에 이러한 비-선택적인 페길화는 페길화된 단백질의 효능을 감소시키는 결과를 초래한다(Teh, L.-C. and Chapman, G.E., Biochem . Biophys . Res . Comm ., 1988, 150:391-398; and Clark, R. et al ., J. Biol. Chem. 1996, 271:21969-21977). 또한, 여러 부위의 비선택적인 페길화는 최종 산물들의 이질적인 혼합물을 탄생시킨다. 이러한 이질적인 페길화된 단백질들 다수는 낮은 비활성(specific acrivity)으로 인해 의학적 용도에 적합하지 않 다. 이질적인 페길화된 단백질을 정제하고 특정화하는 것은 어려운 일이다. 이질적인 페길화된 단백질의 여러가지 산물 배치(batch)들간에 내용물의 편차가 통상적으로 높으며 이들 혼합물의 품질을 관리하기 어렵다.
알데하이드기를 가지고 있는 PEG는 환원제 존재하에 단백질의 아미노-말단을 페길화하는데 사용되고 있지만, 이러한 방법으로는 균질한 N-말단 페길화된 단백질을 만들 수 없으며, 단백질의 라이신 잔기도 또한 페길화된다. 따라서, 제조되는 단백질 역시 이질적인 혼합물이다(Kinstler O. B. et al., U.S. Application No. 09/817,725). 이러한 방법은 또한 엄격한 환원 반응 조건을 이용하는 문제점이 있다. 시아노보로하이드라이드와 같은 환원제는 단백질에 해로울 수 있으며, 반응 수율을 더 낮게 할 수 있다.
말레이미드 관능기가 있는 PEG는 단백질에서 시스테인 잔기의 유리 티올기를 선택적으로 페길화하는데 사용되었다. 이러한 방법에는 종종 새로운 시스테인의 포인트 돌연변이가 요구된다. 대부분의 단백질에는 하나 이상의 시스테인 잔기가 있기 때문에, 새로운 "비천연성" 시스테인 잔기의 티올기가 다른 시스테인 잔기와 이황화 연결(disulfide bridge)을 형성하는 것을 선택적으로 저지하고 선택적으로 페길화하기 위해서는, 특정한 새로운 시스테인 잔기에는 복잡한 반응 조건이 요구된다(2004년 6월 22일자로 공포된 미국 특허 제 6,753,165호 및 2003년 8월 19일자로 공포된 미국 특허출원 제 6,608,183호). 제어된 반응 조건 하에서도, 그외 다른 시스테인 잔기가 페길화될 수 있으며, 이질적인 물질이 수득된다.
성장 호르몬의 아세틸-페닐알라닌 잔기의 부위 특이적인 페길화가 보고되었 다. 이러한 방법에는 비천연 아미노산 아세틸-페닐알라닌을 이용한 포인트 돌연변이가 필요하다(2005년 1월 28일자 미국 출원번호 제 11/046,432호). 이러한 방법의 문제점 중 하나는 아세틸-페닐알라닌과 같은 비천연 아미노산을 가진 단백질의 페길화는 포유류 세포가 아닌 박테리아에서만 행해질 수 있다는 것이다.
아민 티올락톤과 인터루킨-2의 유리 아민기와의 반응으로부터 형성되는 유리 티올 및 아민기는 단백질의 페길화에 사용된다. 그러나, 이러한 방법에서, 사용된 아민 티올락톤은 라이신 잔기의 임의의 아민 관능기와 단백질의 N-말단과 반응하며, 이 방법은 부위-선택적이지 않다(2001년 10월 30일자 미국 특허 제 6,310,180호).
따라서, 여러가지 기들을 통한 종래의 노력들에도 불구하고, 단백질, 펩타이드 및 다른 분자의 부위-특이적인 페길화를 위한 쉽고 실용적인 방법의 개발 필요성이 여전히 절실한 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 일반적으로 단백질, 펩타이드 및 다른 분자의 부위-특이적인 페길화를 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 알데하이드 관능기를 포함하고 있는 PEG(PEG-알데하이드)는 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 가진 시스테인과 광범위한 pH에서 수용액 중에서 자발적으로 반응하여, 티아졸리딘을 형성하며, PEG의 소수성 특성과 커다란 크기(예, 30 kDa)로 인해, 확실하진 않지만, PEG-알데하이드는 다양한 관능기를 포함하고 있는 펩타이드 단편과 반응가능한 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노산을 가지고 있는 시스테인 잔기만 PEG-알데하이드와 반응하는 것으로 확인하였다. 다른 잔기(예, 유리 α-아미노기가 없는 시스테인의 티올기, Arg의 구아니디닐기, Lys의 아미노기, Asp의 측쇄 카르복시산기, Glu의 측쇄 카르복시산기, Tyr의 하이드록시기 및 Ser의 하이드록시기)는 PEG-알데하이드와 반응하지 않는다.
본 방법을 이용함으로써, 단백질, 펩타이드 및 그외 분자에서 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노산을 가지고 있는 시스테인 잔기만 페길화되고, 다른 아미노산들은 페길화되지 않는다. 따라서, 본 방법은 매우 부위-선택적이다. 본 페길화 방법의 부위-특이적인 특성은 특정화, 정제 및 제조가 용이한 보다 동질적인 산물의 생산을 가능하게 하며, 다양한 배치들간에 편차를 낮춘다. 단백질 및 펩타이드의 특정 부위(시스테인의 N-말단)에 부착된 PEG는 생물학적 타겟과 상호작용할 기회가 거의 없어야 하며, 따라서 매우 강력한 치료제가 된다.
본 발명에서, PEG의 알데하이드 관능기는 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에서 시스테인 잔기의 아민 및 티올 관능기와 소정 pH 범위(예, pH 2-8)와 여러가지 온도(예, 실온)에서 수용액 중에서 자발적으로 반응한다. PEG와 단백질 또는 펩타이드 사이에 새롭게 형성된 관능기는 1,3-티아졸리딘이다. 글루탐산과 아스타르트산 잔기의 카르복시기와 C-말단 카르복시기, 라이신 잔기의 아민기, 아르기닌 잔기의 구아니디닐기, 중간 시스테인 잔기의 티올기 및 세린, 트레오닌 및 티로신 잔기의 하이드록시기는, 이러한 페길화 조건하에서 PEG의 알데하이드 관능기와 반응하지 않는다. 따라서, 본 발명은 N-말단 시스테인 잔기의 부위-특이적 페길화를 제공한다. 페길화 동안에 이황화 결합 형성을 방해하기 위해, 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP)과 같은 환원제를 사용할 수 있으며, 질소 및 아르곤 하에서 반응을 행할 수 있다. 1-4 당량의 PEG-알데하이드를 사용할 수 있다. 반응은 통상 용액의 pH와 사용되는 PEG-알데하이드 당량에 따라 2 내지 72 시간내에 완료된다. 만일 페길화가 폴딩되지 않은 단백질(unfolded protein)에서 이루어지면, 단백질 산물은 페길화된 후 다시 폴딩될 수 있다. 페길화가 올바르게 폴딩된 단백질에서 이루어진다면, 재폴딩 단계는 생략된다.
본 발명에서 사용되는 PEG는 다양한 분자량을 가질 수 있으며, 선형, 분지형 및 다중-팔 구조(multi-arm structure)를 가질 수 있으며, 1개 이상의 알데하이드 관능기를 포함할 수 있다. 2개의 알데하이드 관능기를 포함하는 PEG가 사용되는 경우, 최종 산물은 단백질 또는 펩타이드 다이머일 것이며, 이들 사이의 링커는 PEG이다. 다수의 알데하이드 관능기를 가진 PEG는 페길화된 단백질 또는 펩타이드의 다량체를 형성할 것이다.
반응액의 pH를 조절하기 위해, PBS와 같은 완충화된 용액 시스템을 사용할 수 있다. 또한, 반응액은 EDTA와 같이 반응을 용이하게 하기 위한 다른 물질을 포함할 수도 있다.
최종적으로 페길화된 단백질 및 펩타이드는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusive chromatography), 및 이온교환 크로마토그래피와 같은 여러가지 정제 방법으로 정제할 수 있으며, MALDI-MS, 크로마토그래피 방법, 전기영동, 아미노산 분석 및 단백질과 펩타이드의 서열분석 기법에 의해 특정화할 수 있다.
제1예에서, 본 발명은 분자의 시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기에 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기를 상기 시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 반응시켜, 산물에 1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계를 포함하며, 상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인,
Figure 112008088427517-PCT00001
구조를 갖는다.
제2예에서, 본 발명은 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합(conjugation)하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 반응액 중에서 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응시켜, 중간체로서 1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계, 및 상기 수용액의 pH를 약 7로 조절하는 단계를 포함하며, 이로 인해 중간체가 재배열되어 최종 산물이 형성되며, 상기 중간체의 구조는
Figure 112008088427517-PCT00002
이며, 상기 최종 산물의 구조는
Figure 112008088427517-PCT00003
이다.
상기 식에서, R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자이다. 여기에서, 용어 "약"은 평균 + 10%를 의미한다.
제3예에서, 본 발명은 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응시켜, 산물에 5,5-디메틸-1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계를 포함하며, 상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00004
을 갖는다.
제4예에서, 본 발명은 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응액 중에서 반응시켜, 중간체로서 5,5-디메틸-1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계 및 상기 반응액의 pH를 약 7로 조절하는 단계를 포함하며, 이로 인해 중간체가 재배열되어 최종 산물이 형성되며, 상기 중간체는 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00005
을 가지며, 상기 최종 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00006
을 갖는다. 여기에서, 용어 "약"은 평균 + 10%를 의미한다.
제5예에서, 본 발명은 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응시켜, 산물에 6원 고리 시스템을 만드는 단계를 포함하며, 상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00007
을 갖는다.
제6예에서, 본 발명은 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응액 중에서 반응시켜, 중간체로서 6원 고리 시스템을 만드는 단계 및 상기 반응액의 pH를 약 7로 조절하는 단계를 포함하며, 이로 인해 중간체가 재배열되어 최종 산물이 형성되며, 상기 중간체는 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00008
을 가지며, 상기 최종 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00009
을 갖는다. 여기에서, 용어 "약"은 평균 + 10%를 의미한다.
제7예에서, 본 발명은 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 유리 셀레노기와 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 유리 셀레노기와 유리 α-아미노기를 반응시켜, 산물에 5원 고리 시스템을 만드는 단계를 포함하며, 상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00010
을 갖는다.
제8예에서, 본 발명은 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 유리 셀레노기와 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 유리 셀레노기와 유리 α-아미노기를 반응액 중에서 반응시켜, 중간체로서 5원 고리 시스템을 만드는 단계 및 상기 반응액의 pH를 약 7로 조절하는 단계를 포함하며, 이로 인해 중간체가 재배열되어 최종 산물이 형성되며, 상기 중간체는 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00011
을 가지며, 상기 최종 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00012
을 갖는다.
제9예에서, 본 발명은 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 N-메틸-시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-메틸-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 N-메틸-시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-메틸-아미노기를 반응시켜, 산물에 3-메틸-1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계를 포함하며, 상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00013
을 갖는다.
본 발명의 전술한 각 예 - 즉, 본 발명의 제1 내지 제9예 -에서, 유리 알데하이드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드, 또는 아민 관능기나 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착된다.
제10예에서, 본 발명은 유리 말레이미드기를 포함하는 PEG를 분자의 N-메틸-시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 말레이미드기와 상기 N-메틸-시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 반응시켜 접합 산물을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 접합 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00014
을 갖는다.
제11예에서, 본 발명은 유리 말레이미드기를 포함하는 PEG를 분자의 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 말레이미드기와 상기 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 반응시켜 접합 산물을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 접합 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00015
을 갖는다.
제12예에서, 본 발명은 유리 말레이미드기를 포함하는 PEG를 분자의 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 말레이미드기와 상기 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 반응시켜 접합 산물을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 접합 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00016
을 갖는다.
제13예에서, 본 발명은 유리 말레이미드기를 포함하는 PEG를 분자의 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 셀레노 측쇄와 화학적으로 접합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 PEG의 유리 말레이미드기와 상기 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 셀레노 측쇄를 반응시켜 접합 산물을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 접합 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00017
을 갖는다.
본 발명의 전술한 각 예 - 즉, 본 발명의 제10 내지 제13예 - 에서, 유리 말레이미드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드, 또는 아민 관능기나 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착된다.
본 발명의 전술한 모든 예에서, PEG는 선형 구조, 분지형 구조 또는 다중-팔 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 전술한 모든 예에서, PEG의 평균 분자량은 약 100 Da 내지 약500,000 Da이며, 더 바람직하게는 평균 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다.
발명의 상세한 설명
당업자는 본 명세서에 기재된 사항을 기초로 본 발명을 가장 넓은 범위로 활용할 수 있는 것으로 생각된다. 하기 구체적인 예들은 주로 예시적인 것으로 파악되며, 어떠한 방식으로도 나머지 기재된 사항을 한정하는 것은 아니다.
별도로 언급되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 통상의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 또한, 본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허 및 그외 참조문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
명명 및 약어
기호 의미
Ala 또는 A 알라닌
Arg 또는 R 아르기닌
Asn 또는 N 아스파르긴
Asp 또는 D 아스파르트산
Cys 또는 C 시스테인
hCys 호모시스테인
Gln 또는 Q 글루타민
Glu 또는 E 글루탐산
Gly 또는 G 글리신
His 또는 H 히스티딘
Ile 또는 I 이소루신
Leu 또는 L 루신
Lys 또는 K 라이신
Met 또는 M 메티오닌
Nle 노르루신
N-Me-Cys 또는 NMECys 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00018
의 N-메틸-시스테인
PEG 폴리에틸렌 글리콜
Pen 페니실아민
Phe 또는 F 페닐알라닌
Pro 또는 P 프롤린
Ser 또는 S 세린
selenoCys 셀레노시스테인
Thr 또는 T 트레오닌
Trp 또는 W 트립토판
Tyr 또는 Y 타이로신
Val 또는 V 발린
본 명세서에서 사용된 그외 특정 약어는 다음과 같다:
Boc tert-부틸옥시카르보닐
Bzl 벤질
DCM 디클로로메탄
DIC N,N-디이소프로필카르보디이미드
DIEA 디이소프로필에틸아민
Dmab 4-{N-(1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-3-메틸부틸)-아미노}벤질
DMAP 4-(디메틸아미노)피리딘
DMF 디메틸포름아미드
DNP 2,4-디니트로페닐
DTT 디티오트레이톨
EDAT 에틸렌디아민테트라아세트산
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카르보닐
HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
cHex 사이클로헥실
HOAT O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HOBt 1-하이드록시-벤조트리아졸
Me 메틸
Mmt 4-메톡시트리틸
NMP N-메틸피롤리돈
Pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조퓨란-5-설포닐
tBu tert-부틸
TCEP 트리스(카르복시에틸)포스핀
TIS 트리이소프로필실란
TOS 토실
trt 트리틸
TFA 트리플루오로아세트산
TFFH 테트라메틸플루오로포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트
Z 벤질옥시카르보닐
Tha 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00019
로 표시되는 1,3-티아졸리딘-4-카르복시산
Tmc 구조식: 로 표시되는 1,3-티아졸리딘-3-메틸-4-카르복시산
Dma 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00021
로 표시되는 5,5-디메일-1,3-티아졸리딘-4-카르복시산
Thc 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00022
로 표시되는 1,3-티아지난-4-카르복시산
Sez 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00023
로 표시되는 1,3-셀렌아졸리딘-4-카르복시산
Hth 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00024
로 표시되는 2-하이드록시메틸-1,3-티아졸리딘-4-카르복시산
Hdm 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00025
로 표시되는 2-하이드록시메틸-5,5-디메틸-1,3-티아졸리딘-4-카르복시산
Haz 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00026
로 표시되는 2-하이드록시메틸-1,3-티아지난-4-카르복시산
Hsz 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00027
로 표시되는 2-하이드록시메틸-1,3-셀렌아졸리딘-4-카르복시산
말레이미드
Figure 112008088427517-PCT00028
Prd 구조식:
Figure 112008088427517-PCT00029
로 표시되는 피롤리딘-2,5-디온
NMeCys(Prd-PEG)
Figure 112008088427517-PCT00030
Pen(Prd-PEG)
Figure 112008088427517-PCT00031
hCys(Prd-PEG)
Figure 112008088427517-PCT00032
selenoCys(Prd-PEG)
Figure 112008088427517-PCT00033
PEG는 당업계에 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조되거나 또는 상업적으로 이용가능한, 공지된 수용성 폴리머이다(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, VOl3, pages 138-161). 용어 "PEG"는 넓게는 PEG의 말단 변형이나 크기와 관련없이, 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 것으로 사용된다.
실시예1) H-NMeCys-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 1)
Figure 112008088427517-PCT00034
Rink 아미드 MBHA 수지(211mg, 0.152mmole)(Novabiochem, San Diego, Calif.)를 디클로로메탄(DCM)에서 부풀리고, 디메틸포름아미드(DMF)로 세정하였다. 수지에 25% 피페리딘/DMF(10 mL) 용액을 2 x 10 분간 처리하여, 블록킹을 제거하였다. 수지를 DMF(10mL)로 3번 세정하였다. N-메틸피롤리돈(NMP)(2mL) 중에 Fmoc-Phe-OH(Novabiochem, San Diego, Calif.)(235mg, 0.606mmole), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)(92.3mg, 0.606mmole), 및 디이소프로필카르보디이미드(DIC)(77mg, 0.606mmole) 용액을 1시간 동안 처리하여, 첫번째 아미노산을 수지에 커플링시켰다. 수지를 여과하고, DMF(10mL)로 3번 세정하였다.
2 x 10 분 동안 25% 피페리딘/DMF(10mL) 용액으로 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였고, 수지를 DMF(10mL)로 3번 세정하였다. NMP(2mL) 중의 HOBt(0.606mmole) 및 DIC(0.606mmole) 존재 하에 한시간 동안 Fmoc-Lys(Boc)-OH(Novabiochem, San Diego, Calif.)(285mg 0.606mmole)를 제조되는 유리 아민 수지과 커플링하였다.
블록킹 제거 및 세정 과정을 상기와 같이 반복하였다. HOBt(51mg, 0.33mmole) 및 DIC(83.8mg, 0.66mmole)의 NMP(2mL) 용액을 이용하여, 12시간 동안 Fmoc-N-Me-Cys(Trt)-OH(Timen Chemicals, Lodz, Poland.)(100mg, 0.167mmole)를 제조되는 펩타이드-수지에 커플링시켰다. 테트라메틸플루오로포름아미디늄펜타플루오로포스페이트(TFFH)(20mg, 0.075mmole) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA)(19.4mg, 0.150mmole)의 NMP(2mL) 용액을 이용하여 한시간 동안 Fmoc-N-Me-Cys(Trt)-OH(45mg, 0.075mmole)의 커플링을 반복하였다. 블록킹 제거 및 세정 과정을 상기와 같이 반복하였다. 수지를 DCM으로 3번, 그리고 메탄올로 3번 세정하였다. 수지는 진공하에 건조시켰다.
2시간 동안 8% 트리스프로필실란/트리플루오로아세트산(TFA)(2mL)과 함께 수지를 교반하여 펩타이드를 수지에서 탈착시켰다. 수지를 여과하고, DCM(2mL)로 세정하였다. 여과물을 모아 1mL로 농축하였다. 여기에 디에틸 에테르(35mL)을 첨가하여 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 원심분리 후 수집하였다. 펠렛 을 물 및 아세토니트릴에 용해한 다음 동결 건조하였다.
수득되는 조산물을 역상 HPLC 시스템(Luna 5micron C8 (2) 100 X 20mm column)에서 정제하고, 100% 완충액 A(수 중 0.1% TFA) 및 0% 완충액 B(아세토니트릴 중의 0.1% TFA)에서 80% 완충액 A 및 20% 완충액 B로의 30분간의 농도 구배를 통해 용출시키고, 235nm에서 모니터링하였다. 동결건조한 후, 최종 산물 51.2mg을 수득하였다. 410.3 Da에서의 M+1 이온을 ESI 질량분광측정기로 검출하였고, 이는 분자량 계산치 409.6 Da와 일치되었다.
실시예 2) mPEG - Tmc - Lys - Phe - NH 2 의 제조 (서열번호: 2)
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
Figure 112008088427517-PCT00035
실시예 1의 펩타이드 산물(0.5mg 1.22micromole)을 pH4 완충액(20mmolar NaOAc, 150mmolar NaCl, 및 1mmolar EDTA) 1.0mL에 용해하였다. 제조되는 용액에 mPEG-알데하이드(1.5 당량, 평균 분자량은 31378 Da임, NOF Corp., Tokyo, Japan)를 첨가하였다. 역상 분석용 HPLC 시스템(Vydac C18 5μ 펩타이드/단백질 컬럼, 4.6 x 250mm)을 이용한 분석을 기초로, 실온에서의 27시간 후에 반응은 약 90% 완 료되었다. 반응 혼합물을 5mL Zeba™ 탈염 스핀 컬럼(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 적용하였다. 하얀 거품이 동결건조 후 수득되었다(36.7mg).
실시예 3) H- NMeCys ( Prd - PEG )- Lys - Phe - NH 2 의 제조(서열번호: 3)
Figure 112008088427517-PCT00036
실시예 1의 펩타이드 산물(0.5mg 1.22micromole)을 1.0mL의 pH 7 완충액(20mmolar NaOAc)에 용해하였다. 제조되는 용액에 α-(3-(3-말레이미도-1-옥소프로필)아미노)프로필-ω-메톡시-폴리옥시에틸렌(1.5 당량, 평균 분자량: 11962 Da, NOF Corp., Tokyo, Japan) 및 2 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)를 첨가하였다. 반응은, 역상 분석용 HPLC 시스템(Vydac C18 5μ 펩타이드/단백질 컬럼, 4.6 x 250mm)을 이용한 분석을 기초로, 실온에서의 1시간 후에 완료되었다. 반응 혼합물을 5mL Zeba™ 탈염 스핀 컬럼(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 적용하였다. 하얀 거품이 동결건조 후 수득되었다(15.1mg). 산물을 High Trap™ SPXL 양이온 교환 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ)에서 더 정제하였다. 정제된 산물의 분자량 분포를 MALDI-TOF 분 자량 분광측정으로 결정하였다. 수득되는 실험 결과는 분자량 분포 계산치와 일치하였다.
실시예 4) H-Cys-Lys-Phe-NH 2 의 제조 (서열번호: 4)
Figure 112008088427517-PCT00037
표제 펩타이드를 Rink amide MBHA 수지(347mg, 0.25mmole)(Novabiochem, San Diego, Calif)를 이용하여 LibertyTM 모델 마이크로웨이브 펩타이드 합성기(CEM Corp., Matthews, NC)에서 합성하였다. HBTU 활성화에 아미노산 Fmoc-Phe-OH, Fmoc Lys(Boc)-OH, 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH(Novabiochem, San Diego, CA)를 4배 과량으로 사용하였고, 각 커플링을 반복하였다.
수지를 8% 트리스프로필실란/트리플루오로아세트산(TFA) 및 1% 디티오트레이톨(10mL)과 3시간 동안 교반하여, 수지에서 펩타이드를 절단하였다. 수지를 여과하고 DCM(5mL)으로 세정하였다. 여과물을 모아 3mL로 농축하였다. 디에틸에테르(35mL)를 첨가하여, 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 원심분리후 수집하였다. 펠렛을 물 및 아세토니트릴에 용해한 다음, 동결건조하였다.
수득되는 조산물을 역상 HPLC 시스템(Luna 5micron C8 (2) 100 X 20mm column)에서 정제하고, 100% 완충액 A(수 중 0.1% TFA) 및 0% 완충액 B(아세토니트릴 중의 0.1% TFA)에서 70% 완충액 A 및 30% 완충액 B로의 35분간의 농도 구배를 통해 용출시키고, 235nm에서 모니터링하였다. 동결건조한 후, 최종 산물 89.1mg을 수득하였다. 396.5 Da에서의 M+1 이온을 ESI 질량분광측정기로 검출하였고, 이는 분자량 계산치 395.5 Da와 일치되었다.
실시예 5) mPEG-Tha-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 5)
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
Figure 112008088427517-PCT00038
실시예 4의 펩타이드 산물(0.5mg 1.26micromole)을 pH4 완충액(20mmolar NaOAc) 1.0mL에 용해하였다. 제조되는 용액에 mPEG-알데하이드(1.5 당량, 평균 분자량 20644 Da, NOF Corp., Tokyo, Japan) 및 TCEP(2.0당량)를 첨가하였다. 역상 분석용 HPLC 시스템(Vydac C18 5μ 펩타이드/단백질 컬럼, 4.6 x 250mm)을 이용한 분석을 기초로, 실온에서의 3시간 후에 반응은 약 85% 완료되었다. 반응 혼합물을 10mL Zeba™ 탈염 스핀 컬럼(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 적용하였다. 하얀 거품이 동결건조 후 수득되었다.
실시예 6) H-hCys- Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 4)
Figure 112008088427517-PCT00039
표제 펩타이드를 Rink amide MBHA 수지(347mg, 0.25mmole)(Novabiochem, San Diego, Calif)를 이용하여 LibertyTM 모델 마이크로웨이브 펩타이드 합성기(CEM Corp., Matthews, NC)에서 합성하였다. HBTU 활성화에 아미노산 Fmoc-Phe-OH, Fmoc Lys(Boc)-OH, 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH(Novabiochem, San Diego, CA)를 4배 과량으로 사용하였고, 각 커플링을 반복하였다.
수지를 8% 트리스프로필실란/트리플루오로아세트산(TFA) 및 1% 디티오트레이톨(10mL)과 3시간 동안 교반하여, 수지에서 펩타이드를 절단하였다. 수지를 여과하고 DCM(5mL)으로 세정하였다. 여과물을 모아 3mL로 농축하였다. 디에틸에테르(35mL)를 첨가하여, 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 원심분리후 수집하였다. 펠렛을 물 및 아세토니트릴에 용해한 다음, 동결건조하였다.
수득되는 조산물을 역상 HPLC 시스템(Luna 5micron C8 (2) 100 X 20mm column)에서 정제하고, 100% 완충액 A(수 중 0.1% TFA) 및 0% 완충액 B(아세토니트릴 중의 0.1% TFA)에서 75% 완충액 A 및 25% 완충액 B로의 35분간의 농도 구배를 통해 용출시키고, 235nm에서 모니터링하였다. 동결건조한 후, 최종 산물 85.7mg을 수득하였다. 410.5에서의 M+1 이온을 ESI 질량분광측정기로 검출하였고, 이는 분자량 계산치 409.6 Da와 일치되었다.
실시예 7) H-Pen- Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 6)
Figure 112008088427517-PCT00040
표제 펩타이드를 Rink amide MBHA 수지(347mg, 0.25mmole)(Novabiochem, San Diego, Calif)를 이용하여 LibertyTM 모델 마이크로웨이브 펩타이드 합성기(CEM Corp., Matthews, NC)에서 합성하였다. HBTU 활성화에 아미노산 Fmoc-Phe-OH, Fmoc Lys(Boc)-OH, 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH(Novabiochem, San Diego, CA)를 4배 과량으로 사용하였고, 각 커플링을 반복하였다.
수지를 8% 트리스프로필실란/트리플루오로아세트산(TFA) 및 1% 디티오트레이톨(10mL)과 3시간 동안 교반하여, 수지에서 펩타이드를 절단하였다. 수지를 여과하고 DCM(5mL)으로 세정하였다. 여과물을 모아 3mL로 농축하였다. 디에틸에테르(35mL)를 첨가하여, 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 원심분리후 수집하였다. 펠렛을 물 및 아세토니트릴에 용해한 다음, 동결건조하였다.
수득되는 조산물을 역상 HPLC 시스템(Luna 5micron C8 (2) 100 X 20mm column)에서 정제하고, 100% 완충액 A(수 중 0.1% TFA) 및 0% 완충액 B(아세토니트릴 중의 0.1% TFA)에서 80% 완충액 A 및 20% 완충액 B로의 35분간의 농도 구배를 통해 용출시키고, 235nm에서 모니터링하였다. 동결건조한 후, 최종 산물 83.9mg을 수득하였다. 424.5에서의 M+1 이온을 ESI 질량분광측정기로 검출하였고, 이는 분 자량 계산치 423.6 Da와 일치되었다.
실시예 8) mPEG-Dma- Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 7)
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
Figure 112008088427517-PCT00041
실시예 7의 펩타이드 산물(0.5mg 1.18 micromole)을 pH4 완충액(20mmolar NaOAc) 1.0mL에 용해하였다. 제조되는 용액에 mPEG-알데하이드(1.5 당량, 평균 분자량 20644 Da, NOF Corp., Tokyo, Japan) 및 TCEP(2.0 당량)를 첨가하였다. 역상 분석용 HPLC 시스템(Vydac C18 5μ 펩타이드/단백질 컬럼, 4.6 x 250mm)을 이용한 분석을 기초로, 실온에서의 3시간 후에 반응은 약 80% 완료되었다. 반응 혼합물을 10mL Zeba™ 탈염 스핀 컬럼(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 적용하였다. 하얀 거품이 동결건조 후 수득되었다.
실시예 9) mPEG-Thc-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 8)
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
Figure 112008088427517-PCT00042
실시예 6의 펩타이드 산물(0.5mg 1.22 micromole)을 pH4 완충액(20mmolar NaOAc) 1.0mL에 용해하였다. 제조되는 용액에 mPEG-알데하이드(1.5 당량, 평균 분자량 20644 Da, NOF Corp., Tokyo, Japan) 및 TCEP(2.0 당량)를 첨가하였다. 역상 분석용 HPLC 시스템(Vydac C18 5μ 펩타이드/단백질 컬럼, 4.6 x 250mm)을 이용한 분석을 기초로, 실온에서의 3시간 후에 반응은 약 90% 완료되었다. 반응 혼합물을 10mL Zeba™ 탈염 스핀 컬럼(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 적용하였다. 하얀 거품이 동결건조 후 수득되었다.
실시예 10) selenoCys- Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 9)
Figure 112008088427517-PCT00043
실질적으로 실시예 1에 기재된 방법에 따라 표제 화합물을 합성하였다. Fmoc-selenoCys(4-MeOBzl)-OH(Novabiochem, San Diego, CA)를 N-말단에 셀레노시스테인 잔기의 병합에 사용한다.
실시예 11) mPEG-Sez- Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 10)
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
Figure 112008088427517-PCT00044
실질적으로 실시예 2에 기재된 방법에 따라 표제 펩타이드를 합성한다. 실시예 10에서 수득되는 산물이 펩타이드 출발 물질이다.
실시예 12)
Figure 112008088427517-PCT00045
의 제조
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
mPEG-C(O)OH 세슘염을 DMF 중에서 브로모아세트알데하이드 디메틸아세탈과 2일간 60 ℃에서 반응시킨다. 용매를 제거한 후, 산물에 DCM 중의 40% TFA와 소량의 물을 약 30분간 0 ℃에서 처리한다.
실시예 13) mPEG-Hth-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 11)
Figure 112008088427517-PCT00046
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
표제 펩타이드는 실질적으로 실시예 2에 기재된 공정에 따라 합성한다. 펩타이드 출발 물질은 실시예 4에서 수득되는 산물이다. PEG-알데하이드 출발 물질은 실시예 12에서 수득한 산물이다. 완충액의 pH를 조절하는 추가적인 단계가 있으며, 실온에서 2시간 동안 pH4에서 정치한 후, 반응액의 pH를 7로 조절하고, 정제하기 전 3일 동안 실온에서 정치시킨다.
실시예 14) mPEG-Hdm-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 12)
Figure 112008088427517-PCT00047
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
표제 펩타이드는 실질적으로 실시예 8에 기재된 공정에 따라 합성한다. 펩타이드 출발 물질은 실시예 4에서 수득되는 산물이다. PEG-알데하이드 출발 물질은 실시예 12에서 수득한 산물이다. 완충액의 pH를 조절하는 추가적인 단계가 있 으며, 실온에서 밤새 정치한 후, 반응액의 pH를 7로 조절하고, 정제하기 전 3일 동안 실온에서 정치시킨다.
실시예 15) mPEG-Haz-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 13)
Figure 112008088427517-PCT00048
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
표제 펩타이드는 실질적으로 실시예 9에 기재된 공정에 따라 합성한다. 펩타이드 출발 물질은 실시예 6에서 수득되는 산물이다. PEG-알데하이드 출발 물질은 실시예 12에서 수득한 산물이다. 완충액의 pH를 조절하는 추가적인 단계가 있으며, 실온에서 밤새 pH4에서 정치한 후, 반응액의 pH를 7로 조절하고, 정제하기 전 3일 동안 실온에서 정치시킨다.
실시예 16) mPEG-Hsz-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 14)
Figure 112008088427517-PCT00049
본원에서 mPEG는 n이 양의 정수인 구조식: CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-로 표시된다.
표제 펩타이드는 실질적으로 실시예 11에 기재된 공정에 따라 합성한다. 펩타이드 출발 물질은 실시예 10에서 수득되는 산물이다. PEG-알데하이드 출발 물질은 실시예 12에서 수득한 산물이다. 완충액의 pH를 조절하는 추가적인 단계가 있으며, 실온에서 2시간 동안 pH4에서 정치한 후, 반응액의 pH를 7로 조절하고, 정제하기 전 3일 동안 실온에서 정치시킨다.
실시예 17) H-Pen(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 15)
Figure 112008088427517-PCT00050
표제 펩타이드는 실질적으로 실시예 3에 기재된 공정에 따라 합성한다. 펩타이드 출발 물질은 실시예 7에서 수득한 산물이다.
실시예 18) H-hCys(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 16)
Figure 112008088427517-PCT00051
실시예 6의 펩타이드 산물(1.0mg 2.44micromole)을 pH7 완충액(20mmolar NaOAc) 1.0mL에 용해하였다. 제조되는 용액에 α-(3-(3-말레이미도-1-옥소프로필)아미노)프로필-ω-메톡시-폴리옥시에틸렌(1.5 당량, 평균 분자량 11962 Da, NOF Corp., Tokyo, Japan) 및 2 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEF)를 첨가하였다. 역상 분석용 HPLC 시스템(Vydac C18 5μ 펩타이드/단백질 컬럼, 4.6 x 250mm)을 이용한 분석을 기초로, 실온에서의 1시간 후에 반응은 완료되었다. 반응 혼합물을 10mL Zeba™ 탈염 스핀 컬럼(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 적용하였다. 하얀 거품이 동결건조 후 수득되었다.
실시예 19) H-selenoCys(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH 2 의 제조(서열번호: 17)
Figure 112008088427517-PCT00052
표제 펩타이드는 실질적으로 실시예 3에 기재된 공정에 따라 합성한다. 펩타이드 출발 물질은 실시예 10에서 수득한 산물이다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOMEASURE, INC. <120> METHODS FOR SITE-SPECIFIC PEGYLATION <130> 176P2 PCT2 Yankwich TBA <140> TBA <141> TBA <150> TBA <151> TBA <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for site-specific pegylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = N-methyl-cysteine (N-MeCys) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> AMIDATION <400> 1 Xaa Lys Phe 1 <210> 2 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = methoxy-polyethylene glycol-1,3-thiazolidine-3-methyl-4-carboxylic acid lysine (mPEG-Tmc-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 2 Xaa Phe 1 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = N-methyl-cysteine pyrrolidine-2,5-dione polyethylene glycol (H-N-MeCys(Prd-PEG)) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> AMIDATION <400> 3 Xaa Lys Phe 1 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for site-specific pegylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = cysteine (Cys) or homocysteine (hCys) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> AMIDATION <400> 4 Xaa Lys Phe 1 <210> 5 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = methoxy-polyethylene glycol-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid lysine (mPEG-Tha-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 5 Xaa Phe 1 <210> 6 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for site-specific pegylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = penicillamine lysine (H-Pen-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 6 Xaa Phe 1 <210> 7 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = methoxy-polyethylene glycol-5,5-dimethyl-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid lysine (mPEG-Dma-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 7 Xaa Phe 1 <210> 8 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = methoxy-polyethylene glycol-1,3-thiazinane-4-carboxylic acid lysine (mPEG-Thc-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 8 Xaa Phe 1 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for site-specific pegylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = selenocysteine (selenoCys) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> AMIDATION <400> 9 Xaa Lys Phe 1 <210> 10 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = methoxy-polyethylene glycol-1,3-selenazolidine-4-carboxylic acid lysine (mPEG-Sez-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 10 Xaa Phe 1 <210> 11 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = methoxy-polyethylene glycol-2-hydroxymethyl-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid lysine (mPEG-Hth-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 11 Xaa Phe 1 <210> 12 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = methoxy-polyethylene glycol-2-hydroxymethyl-5,5-dimethyl-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid lysine (mPEG-Hdm-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 12 Xaa Phe 1 <210> 13 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = methoxy-polyethylene glycol-2-hydroxymethyl-1,3-thiazinane-4-carboxylic acid lysine (mPEG-Haz-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 13 Xaa Phe 1 <210> 14 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = methoxy-polyethylene glycol-2-hydroxymethyl-1,3-selenazoline-4-carboxylic acid lysine (mPEG-Hsz-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 14 Xaa Phe 1 <210> 15 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = penicillamine pyrrolidine-2,5-dione polyethylene glycol lysine (H-Pen(Prd-PEG)-Lys) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> AMIDATION <400> 15 Xaa Phe 1 <210> 16 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = homocysteine pyrrolidine-2,5-dione polyethylene glycol (H-hCys(Prd-PEG)) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> AMIDATION <400> 16 Xaa Lys Phe 1 <210> 17 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pegylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = selenocysteine pyrrolidine-2,5-dione polyethylene glycol (H-selenoCys(Prd-PEG)) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> AMIDATION <400> 17 Xaa Lys Phe 1

Claims (152)

  1. 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기를 상기 시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응시켜, 산물에 1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계를 포함하며,
    상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112008088427517-PCT00053
  2. 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 반응액 중에서 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응시켜, 중간체로서 1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계, 및 상기 수용액의 pH를 약 7로 조절하는 단계를 포함하며, 이로써 중간체가 재배열되어 최종 산물이 형성되며,
    상기 중간체의 구조는
    Figure 112008088427517-PCT00054
    이고,
    상기 최종 산물의 구조는
    Figure 112008088427517-PCT00055
    인 것을 특징으로 하는 방법.
    (상기 식에서, R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자임)
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유리 알데하이드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드 또는 아민 관능기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PEG는 선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PEG는 분지형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PEG는 다중-팔 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 유리 알데하이드기가 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 100 Da 내지 약 500,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 L-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 유기 분자에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산물 또는 상기 최종 산물은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제2항에 있어서, 상기 중간체는 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 반응에 환원제가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 환원제는 TCEP 및 산화되지 않은 설프하이드릴기를 가지고 있는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응시켜, 산물에 5,5-디메틸-1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계를 포함하며,
    상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112008088427517-PCT00056
  20. 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법으로서
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응액 중에서 반응시켜, 중간체로서 5,5-디메틸-1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계 및 상기 반응액의 pH를 약 7로 조절하는 단계를 포함하며, 이로써 중간체가 재배열되어 최종 산물이 형성되며,
    상기 중간체는 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00057
    을 가지며,
    상기 최종 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00058
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 유리 알데하이드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드 또는 아민 관능기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 PEG는 선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 PEG는 분지형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 PEG는 다중-팔 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, 하나 이상의 유리 알데하이드기가 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 100 Da 내지 약 500,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 L-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 유기 분자에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 산물 또는 상기 최종 산물은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 중간체는 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 반응에 환원제가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 환원제는 TCEP 및 산화되지 않은 설프하이드릴기를 가지고 있는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응시켜, 산물에 6원 고리 시스템을 만드는 단계를 포함하며,
    상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00059
    를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-아미노기를 반응액 중에서 반응시켜, 중간체로서 6원 고리 시스템을 만드는 단계 및 상기 반응액의 pH를 약 7로 조절하는 단계를 포함하며, 이로써 중간체가 재배열되어 최종 산물이 형성되며, 상기 중간체는 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00060
    을 가지며,
    상기 최종 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00061
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 유리 알데하이드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드 또는 아민 관능기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 PEG는 선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 PEG는 분지형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 PEG는 다중-팔 구조를 가지는 것을 특징 으로 하는 방법.
  43. 제37항 또는 제38항에 있어서, 하나 이상의 유리 알데하이드기가 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 100 Da 내지 약 500,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 L-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 유기 분자에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 산물 또는 상기 최종 산물은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 중간체는 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 반응에 환원제가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 환원제는 TCEP 및 산화되지 않은 설프하이드릴기를 가지고 있는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 유리 셀레노기와 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 유리 셀레노기와 유리 α-아미노기를 반응시켜, 산물에 5원 고리 시스템을 만드는 단계를 포함하며, 상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00062
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 유리 셀레노기와 유리 α-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 유리 셀레노기와 유리 α-아미노기를 반응액 중에서 반응시켜, 중간체로서 5원 고리 시스템을 만드는 단계 및 상기 반응액의 pH를 약 7로 조절하는 단계를 포함하며, 이로 인해 중간체가 재배열되어 최종 산물이 형성되며, 상기 중간체는 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00063
    을 가지며,
    상기 최종 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00064
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 유리 알데하이드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드 또는 아민 관능기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 PEG는 선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 PEG는 분지형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 PEG는 다중-팔 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제55항 또는 제56항에 있어서, 하나 이상의 유리 알데하이드기가 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 100 Da 내지 약 500,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 L-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 유기 분자에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 산물 또는 상기 최종 산물은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제56항에 있어서, 상기 중간체는 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 반응에 환원제가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 환원제는 TCEP 및 산화되지 않은 설프하이드릴기 또는 산화되지 않은 유리 셀레노기를 가지고 있는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 유리 알데하이드기를 포함하는 PEG를 분자의 N-메틸-시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-메틸-아미노기와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 알데하이드기와 상기 N-메틸-시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄 및 유리 α-메틸-아미노기를 반응시켜, 산물에 3-메틸-1,3-티아졸리딘기를 만드는 단계를 포함하며,
    상기 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00065
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 유리 알데하이드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드 또는 아민 관능기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 PEG는 선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제73항에 있어서, 상기 PEG는 분지형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제73항에 있어서, 상기 PEG는 다중-팔 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제73항에 있어서, 하나 이상의 유리 알데하이드기가 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제73항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 100 Da 내지 약 500,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제73항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 L-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제73항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제73항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제73항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제73항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 유기 분자에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제73항에 있어서, 상기 산물 또는 상기 최종 산물은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제73항에 있어서, 상기 반응에 환원제가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 환원제는 TCEP 및 산화되지 않은 설프하이드릴기를 가지고 있는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 유리 말레이미드기를 포함하는 PEG를 분자의 N-메틸-시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 말레이미드기와 상기 N-메틸-시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 반응시켜 접합 산물을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 접합 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00066
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 유리 알데하이드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드 또는 아민 관능기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 PEG는 선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제89항에 있어서, 상기 PEG는 분지형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제89항에 있어서, 상기 PEG는 다중-팔 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제89항에 있어서, 하나 이상의 유리 알데하이드기가 상기 PEG에 부착되는 것 을 특징으로 하는 방법.
  95. 제89항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 100 Da 내지 약 500,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제89항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 L-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제89항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제89항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제89항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제89항에 있어서, 상기 N-메틸-시스테인 잔기는 유기 분자에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제89항에 있어서, 상기 접합 산물은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제89항에 있어서, 상기 반응에 환원제가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 환원제는 TCEP인 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 유리 말레이미드기를 포함하는 PEG를 분자의 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 말레이미드기와 상기 페니실아민 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 반응시켜 접합 산물을 제조하는 단계를 포함하며,
    상기 접합 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00067
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 유리 말레이미드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드 또는 아민 관능기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 제105항에 있어서, 상기 PEG는 선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 제105항에 있어서, 상기 PEG는 분지형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 제105항에 있어서, 상기 PEG는 다중-팔 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  110. 제105항에 있어서, 하나 이상의 유리 말레이미드기가 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  111. 제105항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 100 Da 내지 약 500,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  112. 제111에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  113. 제105항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 L-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 제105항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  115. 제105항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  116. 제105항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  117. 제105항에 있어서, 상기 페니실아민 잔기는 유기 분자에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  118. 제105항에 있어서, 상기 접합 산물은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  119. 제105항에 있어서, 상기 반응에 환원제가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 환원제는 TCEP인 것을 특징으로 하는 방법.
  121. 유리 말레이미드기를 포함하는 PEG를 분자의 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 말레이미드기와 상기 호모시스테인 잔기의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 반응시켜 접합 산물을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 접합 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00068
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 유리 알데하이드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미 드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드 또는 아민 관능기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  123. 제121항에 있어서, 상기 PEG는 선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  124. 제121항에 있어서, 상기 PEG는 분지형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  125. 제121항에 있어서, 상기 PEG는 다중-팔 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  126. 제121항에 있어서, 하나 이상의 말레이미드기가 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  127. 제121항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 100 Da 내지 약 500,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da 인 것을 특징으로 하는 방법.
  129. 제121항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 L-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 제121항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  131. 제121항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  132. 제121항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  133. 제121항에 있어서, 상기 호모시스테인 잔기는 유기 분자에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  134. 제121항에 있어서, 상기 접합 산물은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 제121항에 있어서, 상기 반응에 환원제가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 제135항에 있어서, 상기 환원제는 TCEP인 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 유리 말레이미드기를 포함하는 PEG를 분자의 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 셀레노 측쇄와 화학적으로 접합하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 PEG의 유리 말레이미드기와 상기 셀레노시스테인 잔기의 산화되지 않은 셀레노 측쇄를 반응시켜 접합 산물을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 접합 산물은 R1이 상기 PEG이고 R2가 상기 분자인 하기 구조식:
    Figure 112008088427517-PCT00069
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 제137항에 있어서, 상기 유리 말레이미드기는 아미드, 에스테르, 설폰아미드, 설포닐, 티올, 옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 말레이미드 또는 아민 관능기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 링커를 통해 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  139. 제137항에 있어서, 상기 PEG는 선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  140. 제137항에 있어서, 상기 PEG는 분지형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  141. 제137항에 있어서, 상기 PEG는 다중-팔 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  142. 제137항에 있어서, 하나 이상의 유리 말레이미드기가 상기 PEG에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  143. 제137항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 100 Da 내지 약 500,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  144. 제143항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  145. 제137항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 L-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  146. 제137항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 방법.
  147. 제137항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  148. 제137항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  149. 제137항에 있어서, 상기 셀레노시스테인 잔기는 유기 분자에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  150. 제137항에 있어서, 상기 접합 산물은 하나 이상의 단백질, 펩타이드, 유기 분자 모이어티 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  151. 제137항에 있어서, 상기 반응에 환원제가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  152. 제151항에 있어서, 상기 환원제는 TCEP인 것을 특징으로 하는 방법.
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WO (1) WO2007139997A2 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2095829A1 (en) * 2008-02-27 2009-09-02 LEK Pharmaceuticals D.D. Selenium containing modifying agents and conjugates
US20120178914A1 (en) * 2009-09-25 2012-07-12 Vybion, Inc. Polypeptide modification
TWI510246B (zh) 2010-04-30 2015-12-01 Molecular Partners Ag 抑制ｖｅｇｆ－ａ受體交互作用的經修飾結合性蛋白質
AU2011307236A1 (en) * 2010-09-29 2013-03-28 Philogen S.P.A. Thiazolidine linker for the conjugation of drugs to antibodies
CA2867611A1 (en) * 2012-03-16 2013-09-19 Belrose Pharma, Inc. Polymeric conjugates of c1-inhibitors
US10046058B2 (en) 2014-12-02 2018-08-14 Rezolute, Inc. Use of hydrophobic organic acids to increase hydrophobicity of proteins and protein conjugates
JP2018516874A (ja) 2015-06-04 2018-06-28 アントリアバイオ インコーポレイテッドＡｎｔｒｉａｂｉｏ，Ｉｎｃ． 部位特異的タンパク質コンジュゲートの調製のためのアミンｐｅｇ化方法
IL257420B (en) * 2015-08-12 2022-08-01 Pfizer Antibodies that contain cysteine or cysteine containing a protective group and their use for the preparation of antibody and drug preparations
US20200262887A1 (en) 2018-11-30 2020-08-20 Opko Ireland Global Holdings, Ltd. Oxyntomodulin peptide analog formulations

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US817725A (en) 1891-11-23 1906-04-10 Ncr Co Cash-register.
US4643205A (en) 1984-02-02 1987-02-17 R. J. Reynolds Tobacco Company Smoking product
US6310180B1 (en) 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
US5589356A (en) * 1993-06-21 1996-12-31 Vanderbilt University Litigation of sidechain unprotected peptides via a masked glycoaldehyde ester and O,N-acyl rearrangement
WO1999003887A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6753165B1 (en) 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
WO2001062827A2 (en) * 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
EP1294752A2 (en) * 2000-06-16 2003-03-26 Curis, Inc. Angiogenesis-modulating compositions and uses
US7122189B2 (en) * 2002-08-13 2006-10-17 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US20040142870A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
US7217845B2 (en) * 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
DE60321825D1 (de) * 2002-12-31 2008-08-07 Nektar Therapeutics Al Corp Maleinsäureamid polymerderivate und ihre biokonjugate
NZ586034A (en) * 2004-02-02 2011-10-28 Ambrx Inc Modified human growth hormone polypeptides and their uses
NZ582684A (en) * 2004-06-18 2011-05-27 Ambrx Inc Use of an antibody or binding fragment thereof comprising a non naturally encoded amino acid coupled to a linker

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