CN101495536B - 位点特异性聚乙二醇化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质、肽和其他分子中具有未氧化的巯基侧链和游离α-氨基的半胱氨酸残基的化学选择性聚乙二醇化的方法。本发明提供同型半胱氨酸、硒代半胱氨酸、青霉胺和N-甲基-半胱氨酸残基的化学选择性聚乙二醇化的类似方法。

Description

位点特异性聚乙二醇化的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质、肽和其他分子中具有未氧化的巯基侧链和游离α-氨基的半胱氨酸残基的化学选择性聚乙二醇化的方法。 
背景技术
不像通常通过口服途径施用的小分子药物，基于蛋白质和肽的治疗剂由于它们极其低的口服生物利用度通常通过注射施用。注射后大多数蛋白质和肽会被酶快速断裂并从机体清除，导致短暂的体内循环半衰期。这种短暂的循环半衰期是效能较低、施用更频繁、患者顺应性减少以及蛋白质和肽治疗法成本较高的主要原因。因此，强烈需要开发延长蛋白质和肽药物作用的持续时间的方法。 
蛋白质或肽与聚乙二醇(PEG)的共价连接(Covalent attachment)已证明是增加机体中蛋白质和肽的循环半衰期的有用方法(Abuchowski，A.等人，Cancer Biochem.Biophys.，1984，7：175-186；Hershfield，M.S.等人，N.Engl.J.Medicine 316：589-596；和Meyers，F.J.等人，Clin.Pharmacol.Ther.，1991，49：307-313)。PEG与蛋白质和肽的共价连接不仅保护分子免遭酶降解，而且降低它们从机体中清除的速率。与蛋白质连接的PEG的大小对蛋白质的循环半衰期有显著的影响。通常PEG越大，结合的蛋白质的体内半衰期越长。几种大小的PEG市售可得(Nektar Advanced PEGylationCatalog 2005-2006；和NOF DDS Catalogue Ver 7.1)，它们适用于产生具有靶向循环半衰期的蛋白质和肽。PEG部分还增加蛋白质、肽和其他分子的水溶性并且降低免疫原性(Katre，N.V.等人，Proc.Natl.Aced.Sci.USA，1998，84：1487-1491；和Katre N.V.等人，J.Immunology，1990， 144：209-213)。 
已经在文献中报道对蛋白质进行聚乙二醇化的几种方法。例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-PEG用于聚乙二醇化蛋白质的N-末端和赖氨酸残基的游离氨基。由于蛋白质通常包含多个赖氨酸残基和末端氨基，所以通过使用这种方法蛋白质的多个位点将被聚乙二醇化。这种非选择性聚乙二醇化导致聚乙二醇化蛋白质的功效降低，因为多个PEG部分通常会扰乱蛋白质与其生物靶分子之间的相互作用(Teh，L.-C.和Chapman，G.E.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1988，150：391-398；及Clark，R.等人，J.Biol.Chem.1996，271：21969-21977)。多位点的非选择性聚乙二醇化还造成终产物的非均质混合物。很多这些非均质的聚乙二醇化的蛋白质由于低的比活性而不适于医疗用途。很难纯化和表征非均质的聚乙二醇化的蛋白质。不同批的非均质的聚乙二醇化的蛋白质产物之间含量的变化通常很高，并且很难对这些混合物进行质量控制。 
尽管含有醛基的PEG已用于在还原剂的存在下对蛋白质的氨基末端进行聚乙二醇化，但是这样的方法不产生唯一的N-末端聚乙二醇化的蛋白质，蛋白质的赖氨酸残基也被聚乙二醇化。因此，所得的蛋白质也是非均质混合物(Kinstler O.B.等人，U.S.Application No.09/817,725)。这种方法也具有使用苛刻的还原反应条件的缺点。还原剂如氰基硼氢化物能损害蛋白质，造成较低的反应产率。 
具有马来酰亚胺官能团的PEG用于选择性聚乙二醇化蛋白质中的半胱氨酸残基的游离巯基。这种方法经常需要带来新半胱氨酸的点突变。由于大多数蛋白质包含一个或多个半胱氨酸残基，所以为选择性阻止该新的“非天然”半胱氨酸残基的巯基与其他半胱氨酸残基形成二硫键、并且然后为了选择性聚乙二醇化该特定的新半胱氨酸，需要复杂的反应条件(2004年6月22日授权的美国专利第6,753,165号；和2003年8月19日授权的美国专利第6,608,183号)。甚至在受控的反应条件下，其他半胱氨酸残基也可被聚乙二醇化并且获得非均质材料。 
曾报道生长激素类似物的乙酰苯丙氨酸残基的位点特异性聚乙二醇 化。这种方法需要带来非天然氨基酸乙酰苯丙氨酸的点突变(于2005年1月28号提交的美国专利申请第11/046,432号)。这种方法的缺点之一是含非天然氨基酸如乙酰苯丙氨酸的蛋白质的聚乙二醇化只可在细菌中进行但不可在哺乳动物细胞中进行。 
由胺硫内酯与白介素-2的游离氨基的反应所产生的游离巯基和氨基已用于聚乙二醇化所述蛋白质。然而，在这种方法中，所用的胺硫内酯与蛋白质的N-末端和赖氨酸残基中的任何氨基官能团均反应，这种方法不是位点选择性的(2001年10月30日授权的美国专利第6,310,180号)。 
因此，尽管来自不同研究组的先前努力，但是仍强烈需要开发容易且实用的蛋白质、肽和其他分子的位点特异性聚乙二醇化的方法。 
发明概述 
本发明一般涉及用于位点特异性聚乙二醇化蛋白质、肽和其他分子的新方法。发现含有醛官能团的PEG(PEG-醛)与带有未氧化的巯基侧链和游离α-氨基的半胱氨酸可以在宽pH范围内于水溶液中自发地反应，生成噻唑烷，这使得PEG-醛可以与含有各种各样官能团的肽片段反应，而这由于PEG的亲水性质和大尺寸(例如30千道尔顿)在以前是不确定的。我们还发现仅有带未氧化的巯基侧链和游离α-氨基的半胱氨酸残基与PEG-醛反应。其他残基中的其他官能团(例如不含游离α-氨基的半胱氨酸的巯基、Arg的胍基、Lys的氨基、Asp的侧链羧基、Glu的侧链羧基、Tyr的羟基和Ser的羟基)不与PEG-醛反应。 
通过使用本发明，蛋白质、肽和其他分子中仅含未氧化的巯基侧链和游离α-氨基的半胱氨酸残基被聚乙二醇化，而任何其他氨基酸均不被聚乙二醇化。因此，本方法是高位点选择性的。本发明聚乙二醇化方法的位点特异性性质导致更为均质的产物，所述均质产物容易表征、纯化和制备并且其不同批次之间的含量差异较小。连接在蛋白质和肽的特异性位点(即N-末端半胱氨酸)的PEG应该有较少的机会与生物靶点相互作用，并因此应导致更有效的治疗剂。 
在本发明中，PEG的醛官能团可以与蛋白质或肽的N-末端的半胱氨酸残基的氨基和巯基官能团在pH范围(例如pH 2-8)内在不同温度(例如室温)在水溶液中自发地反应。在PEG和蛋白质或肽之间新产生的官能团是1，3-噻唑烷。谷氨酸和天冬氨酸残基的羧基和C-末端羧基、赖氨酸残基的氨基、精氨酸残基的胍基、中间半胱氨酸残基的巯基与丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基在这种聚乙二醇化条件下不与PEG的醛官能团反应。因此，本发明提供N-末端半胱氨酸残基的位点特异性聚乙二醇化。为了在聚乙二醇化期间防止二硫键生成，可以使用还原剂如三(羧乙基)膦(TCEP)并且所述反应可以在氮和氩下进行。可以使用1-4当量的PEG-醛。反应通常在2至72小时完成，这取决于溶液的pH和所用PEG-醛的当量。如果聚乙二醇化在未折叠蛋白上发生，则所述蛋白产物可在聚乙二醇化后重折叠。如果聚乙二醇化在正确折叠的蛋白上进行，则重折叠步骤可省略。 
用于本发明的PEGs可具有不同的分子量(例如2-40千道尔顿)，具有线性、支链和多臂(multi-arm)结构并且包含一个或一个以上醛官能团。当使用包含两个醛官能团的PEG时，终产物将是蛋白质或肽二聚物并且之间的连接基团(linker)是PEG。含有多个醛官能团的PEG将产生聚乙二醇化的蛋白质或肽的多聚体。 
缓冲溶液体系如PBS可用于控制反应溶液的pH。该反应溶液还可包含其他试剂如EDTA以促进所述反应。 
最终的聚乙二醇化的蛋白质和肽可通过不同纯化方法如反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法来纯化，并且可以通过MALDI-MS、色谱法、电泳、氨基酸分析和蛋白质及肽测序技术来表征。 
在第一实施方案中，本发明涉及使含游离醛基的PEG与分子的半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括使所述PEG的游离醛基与所述半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基反应以在产物中生成1，3-噻唑烷基团，其中所述产物具有以下结构： 
Figure DEST_PATH_G50969832150138000D000011
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。 
在第二实施方案中，本发明涉及使含游离醛基的PEG与分子的半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括使所述PEG的游离醛基与所述半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基在反应溶液中反应以在中间体中生成1，3-噻唑烷基团，和将该反应溶液的pH调节至约为7，由此所述中间体重排以生成终产物，其中所述中间体具有以下结构： 
Figure DEST_PATH_G50969832150138000D000012
且所述终产物具有以下结构： 
Figure DEST_PATH_G50969832150138000D000013
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。在这里，术语“约”表示±10％。 
在第三实施方案中，本发明涉及使含游离醛基的PEG与分子的青霉胺残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括使所述PEG的游离醛基与所述青霉胺残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基反应以在产物中生成5，5-二甲基-1，3-噻唑烷基团，其中所述产物具有以下结构： 
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。 
在第四实施方案中，本发明涉及使含游离醛基的PEG与分子的青霉胺残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括使所 述PEG的游离醛基与所述青霉胺残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基在反应溶液中反应以在中间体中生成5，5-二甲基-1，3-噻唑烷基团，和将该反应溶液的pH调节至约为7，由此所述中间体重排以形成终产物，其中所述中间体具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00061
且所述终产物具有以下结构： 
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。在这里，术语“约”表示±10％。 
在第五实施方案中，本发明涉及使含游离醛基的PEG与分子的同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括使所述PEG的游离醛基与所述同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基反应以在产物中生成六元环系统，其中所述产物具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00063
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。 
在第六实施方案中，本发明涉及使含游离醛基的PEG与分子的同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离醛基与所述同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基在反应溶液中反应以在中间体中生成六元环系统，和将该反应溶液的pH调节至约为7，由此所述中间体重排以形成终产物，其中所述中间体具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00064
且所述终产物具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00071
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。在这里，术语“约”表示±10％。 
在第七实施方案中，本发明涉及将含游离醛基的PEG与分子的硒代半胱氨酸残基的未氧化游离硒基和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离醛基与所述硒代半胱氨酸残基的未氧化游离硒基和游离α-氨基反应以在产物中生成五元环系统，其中所述产物具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00072
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。 
在第八实施方案中，本发明涉及将含游离醛基的PEG与分子的硒代半胱氨酸残基的未氧化游离硒基和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包将所述PEG的游离醛基与所述硒代半胱氨酸残基的未氧化游离硒基和游离α-氨基在反应溶液中反应以在中间体中生成五元环系统，并且将该反应溶液的pH调节至约为7，由此所述中间体重排以形成终产物，其中所述中间体具有以下结构 
且所述终产物具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00074
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。在这里，术语“约”表示±10％。 
在第九实施方案中，本发明涉及将含游离醛基的PEG与分子的N-甲基-半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-甲基-氨基化学缀合的方法， 所述方法包括将所述PEG的游离醛基与所述N-甲基-半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-甲基-氨基反应以在产物中生成3-甲基-1，3-噻唑烷基团，其中所述产物具有以下结构 
Figure G2007800281465D00081
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。 
在本发明的每一个前述实施方案中-即本发明的第一到第九实施方案-所述游离醛基通过连接基团与所述PEG连接，所述连接基团可包含酰胺、酯、磺酰胺、磺酰基、巯基、氧基、烷基、链烯基、炔基、芳基、马来酰亚胺或胺官能团或其任何组合。 
在第十实施方案中，本发明涉及将含游离马来酰亚胺基团的PEG与分子的N-甲基-半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离马来酰亚胺基团与所述N-甲基-半胱氨酸的未氧化巯基侧链反应以生成缀合产物，其中所述缀合产物具有以下结构： 
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。 
在第十一实施方案中，本发明涉及将含游离马来酰亚胺基团的PEG与分子的青霉胺残基的未氧化巯基侧链化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离马来酰亚胺基团与所述青霉胺残基的未氧化巯基侧链反应以生成缀合产物，其中所述缀合产物具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00091
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。 
在第十二实施方案中，本发明涉及将含游离马来酰亚胺基团的PEG与分子的同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离马来酰亚胺基团与所述同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链反应以生成缀合产物，其中所述缀合产物具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00092
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。 
在第十三实施方案中，本发明涉及将含游离马来酰亚胺基团的PEG与分子的硒代半胱氨酸残基的未氧化硒基侧链化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离马来酰亚胺基团与所述硒代半胱氨酸残基的未氧化硒基侧链反应以生成缀合产物，其中所述缀合产物具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00093
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。 
在本发明的每一个前述实施方案-即本发明的第十到第十三实施方案一中，游离马来酰亚胺基团通过连接基团与所述PEG连接，所述连接基团可包含酰胺、酯、磺酰胺、磺酰基、巯基、氧基、烷基、链烯基、炔基、 芳基、马来酰亚胺或胺官能团或其任何组合。 
在本发明的所有前述实施方案中，PEG可具有线性结构、支链结构或多臂结构。 
在本发明的所有前述实施方案中，PEG具有约100道尔顿至约500,000道尔顿的平均分子量，且更优选具有约1,000道尔顿至约50,000道尔顿的平均分子量。 
发明详述 
本领域技术人员被认为可以根据本文描述利用本发明至其最充分的程度。因此，下面特定的实施方案应理解为仅仅是举例说明性的，而无论如何并不限定本发明的剩余部分。 
除非另有定义，本文所用的所述技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。同样，本文所提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献各自以其全部内容通过引用并入。 
命名法和缩写 
Figure G2007800281465D00101
Figure G2007800281465D00111
本文所用的某些其他缩写如下定义： 
Boc     叔丁氧羰基 
Bzl     苄基 
DCM     二氯甲烷 
DIC     N，N-二异丙基碳二亚胺 
DIEA    二异丙基乙胺 
Dmab    4-{N-(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己亚基)-3-甲丁基)-氨基} 
        苄基 
DMAP    4-(二甲氨基)吡啶 
DMF     二甲基甲酰胺 
DNP     2，4-二硝基苯基 
DTT     二硫苏糖醇 
EDTA    乙二胺四乙酸 
Fmoc    芴基甲氧羰基 
HBTU    2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐 
cHex    环己基 
HOAT    O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐 
HOBt    1-羟基-苯并三唑 
Me      甲基 
Mmt     4-甲氧基三苯甲基 
NMP     N-甲基吡咯烷酮 
Pbf     2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基 
tBu     叔丁基 
TCEP    三(羧乙基)膦 
TIS     三异丙基硅烷 
TOS     甲苯磺酰基 
trt     三苯甲基 
TFA     三氟乙酸 
TFFH    四甲基氟代甲脒鎓六氟磷酸盐 
Z       苄氧基羰基 
Tha     1，3-噻唑烷-4-羧酸，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00121
Tmc     1，3-噻唑烷-3-甲基-4-羧酸，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00131
Dma    5，5-二甲基-1，3-噻唑烷-4-羧酸，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00132
Thc    1，3-噻嗪烷-4-羧酸，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00133
Sez    1，3-硒唑烷-4-羧酸，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00134
Hth    2-羟甲基-1，3-噻唑烷-4-羧酸，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00135
Hdm    2-羟甲基-5，5-二甲基-1，3-噻唑烷-4-羧酸，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00136
Haz    2-羟甲基-1，3-噻嗪烷-4羧酸，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00137
Hsz    2-羟甲基-1，3-硒唑烷-4-羧酸，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00141
马来酰亚胺具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00142
Prd  吡咯烷-2，5-二酮，其具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00143
NMeCys(Prd-PEG)具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00144
Pen(Prd-PEG)具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00145
hCys(Prd-PEG)具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00151
selenoCys(Prd-PEG)具有以下结构： 
Figure G2007800281465D00152
PEG是众所周知的、水溶性聚合物，它是市售可得的或可根据本领域已知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo，PolymerSynthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138-161页)。术语“PEG”按广义使用，包括任何聚乙二醇分子，而不涉及PEG的大小和末端修饰。PEG可具有线性、支链或多臂结构。 
实施例 
实施例1)制备H-NMeCys-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00153
将Rink酰胺MBHA树脂(211mg，0.152毫摩尔)(Novabiochem，SanDiego，Calif.)在二氯甲烷(DCM)中溶胀，并用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤。通过用25％哌啶/DMF(10mL)溶液处理2×10分钟，使树脂脱封闭(debolck)。将树脂用DMF(10mL)洗涤三次。通过用Fmoc-Phe-OH (Novabiochem，San Diego，Calif.)(235mg，0.606毫摩尔)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(92.3mg，0.606毫摩尔)和二异丙基碳二亚胺(DIC)(77mg，0.606毫摩尔)在N-甲基吡咯烷酮(NMP)(2mL)中的溶液处理1小时，将第一个氨基酸偶联到树脂。将树脂过滤，并用DMF(10mL)洗涤三次。 
通过用25％哌啶/DMF(10mL)溶液处理2×10分钟，将Fmoc保护基去除，并且将树脂用DMF(10mL)洗涤三次。于存在NMP(2mL)中的HOBt(0.606毫摩尔)和DIC(0.606毫摩尔)的情况下1小时，将Fmoc-Lys(Boc)-OH(Novabiochem，San Diego，Calif.)(285mg，0.606毫摩尔)偶联到所得的游离胺树脂。 
如上重复脱封闭和洗涤操作。通过使用NMP(2mL)中的HOBt(51mg，0.33毫摩尔)和DIC(83.8mg，0.66毫摩尔)12小时，将Fmoc-N-Me-Cys(Trt)-OH(Timen Chemicals，Lodz，Poland.)(100mg，0.167毫摩尔)偶联到所得的肽-树脂。通过使用NMP(2mL)中的四甲基氟代甲脒鎓五氟磷酸盐(TFFH)(20mg，0.075毫摩尔)和二异丙基乙胺(DIEA)(19.4mg，0.150毫摩尔)1小时，重复Fmoc-N-Me-Cys(Trt)-OH(45mg，0.075毫摩尔)的偶联。如上重复脱封闭和洗涤操作。将树脂用DCM洗涤三次，然后用甲醇洗涤三次。在真空下干燥所述树脂。 
通过用三异丙基硅烷(trispropylsilane)/三氟乙酸(TFA)(2mL)振摇树脂2小时，将肽从所述树脂上断裂下来。将树脂过滤并用DCM(2mL)洗涤。将滤液合并，且浓缩至1mL。加入乙醚(35mL)以沉淀肽。离心后收集沉淀的肽。将沉淀物溶解于水和乙腈中，然后冻干。 
将所得的粗品在反相HPLC系统(Luna 5微米C8(2)100×20mm柱)上纯化，从100％缓冲液A(水中的0.1％TFA)和0％缓冲液B(乙腈中的0.1％TFA)至80％缓冲液A和20％缓冲液B洗脱30分钟并在235nm下监控。冻干后，获得51.2mg终产物。通过ESI质谱分析法检测到410.3道尔顿的M+1离子，这与计算的分子量409.6道尔顿相符。 
实施例2)制备mPEG-Tmc-Lys-Phe-NH 2
mPEG在此具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
Figure G2007800281465D00171
将实施例1的肽产物(0.5mg，1.22微摩尔)溶解于1.0mL pH 4缓冲液(20毫摩尔NaOAc，150毫摩尔NaCl和1毫摩尔EDTA)。将mPEG-醛(1.5当量，平均分子量为31378道尔顿，NOF Corp.，Tokyo，Japan)加至所得溶液中。根据通过使用反相分析型HPLC系统(Vydac C18 5μ肽/蛋白质柱，4.6×250mm)所进行的分析，反应在室温下27小时后大约完成90％。将反应混合物上样于5mL ZebaTM脱盐自旋柱(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。冻干后获得白色泡沫状物(36.7mg)。 
实施例3)制备H-NMeCys(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00172
将实施例1的肽产物(0.5mg，1.22微摩尔)溶解于1.0mL pH 7缓冲液(20毫摩尔NaOAc)。将α-(3-(3-马来酰亚氨基-1-氧代丙基)氨基)丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯(1.5当量，平均分子量为11962道尔顿，NOF Corp.，Tokyo，Japan)和2当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)加至所得溶液。根据通过使用反相分析型HPLC系统(Vydac C18 5μ肽/蛋白质柱，4.6×250mm)所进行的分析，反应在室温下1小时后完成。将反应混合物上样于5mL ZebaTM脱盐自旋柱(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。冻干后获得白色泡沫状物(15.1mg)。将该产物在High TrapTM SPXL阳离子交换柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上进一步纯化。经纯化的产物的分子量分布通过使用MALDI-TOF质谱分析法来确定。所获得的实验结果与计算的分子量分布一致。 
实施例4)制备H-Cys-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00181
使用Rink酰胺MBHA树脂(347mg，0.25毫摩尔)(Novabiochem，SanDiego，Calif.)在LibertyTM型微波肽合成仪(CEM Corp.，Matthews，NC)上合成标题肽。利用HBTU活化，以四倍过量使用氨基酸Fmoc-Phe-OH、Fmoc Lys(Boc)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH(Novabiochem，San Diego，CA)，并且重复进行每个偶联。 
通过用三异丙基硅烷/三氟乙酸(TFA)和1％二硫苏糖醇(10mL)振摇树脂3小时，将肽从所述树脂上断裂。将树脂过滤并用DCM(5mL)洗涤。将该滤液合并，且浓缩至3mL。加入乙醚(35mL)以沉淀肽。离心后收集沉淀的肽。将沉淀物溶解于水和乙腈中，然后冻干。 
将所得的粗品在反相HPLC系统(Luna 5微米C8(2)100×20mm柱)上纯化，从100％缓冲液A(水中的0.1％TFA)和0％缓冲液B(乙腈中的0.1％TFA)至70％缓冲液A和30％缓冲液B洗脱35分钟并在235nm下监控。冻干后，获得89.1mg终产物。通过ESI质谱分析法检测396.5道尔顿的M+1离子，这与计算的分子量395.5道尔顿相符。 
实施例5)制备mPEG-Tha-Lys-Phe-NH 2
mPEG在此具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
将实施例4的肽产物(0.5mg，1.26微摩尔)溶解于1.0mL pH 4缓冲液(20毫摩尔NaOAc)。将mPEG-醛(1.5当量，平均分子量为20644道尔顿，NOF Corp.，Tokyo，Japan)和TCEP(2.0当量)加至所得溶液中。根据通过使用反相分析型HPLC系统(Vydac C18 5μ肽/蛋白质柱，4.6×250mm)所进行的分析，反应在室温下3小时后大约完成85％。将反应混合物加样于10mL ZebaTM脱盐自旋柱(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。冻干后获得白色泡沫状物。 
实施例6)制备H-hCys-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00192
使用Rink酰胺MBHA树脂(347mg，0.25毫摩尔)(Novabiochem，SanDiego，Calif.)在LibertyTM型微波肽合成仪(CEM Corp.，Matthews，NC)上合成标题肽。利用HBTU活化，以四倍过量使用氨基酸Fmoc-Phe-OH、Fmoc Lys(Boc)-OH和Fmoc-hCys(Trt)-OH(Novabiochem，San Diego，CA)，并且重复进行每个偶联。 
通过用三异丙基硅烷/三氟乙酸(TFA)和1％二硫苏糖醇(10mL)振摇树脂3小时，将肽从所述树脂上断裂。将树脂过滤并用DCM(10mL)洗涤。将该滤液合并，且浓缩至3mL。加入乙醚(35mL)以沉淀肽。离心后收集沉淀的肽。将沉淀物溶解于水和乙腈中，然后冻干。 
将所得的粗品在反相HPLC系统(Luna 5微米C8(2)100×20mm柱)上纯化，从100％缓冲液A(水中的0.1％TFA)和0％缓冲液B(乙腈中的 0.1％TFA)至75％缓冲液A和25％缓冲液B洗脱35分钟并在235nm下监控。冻干后，获得85.7mg终产物。通过ESI质谱分析法检测到410.5道尔顿的M+1离子，这与计算的分子量409.6道尔顿相符。 
实施例7)制备H-Pen-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00201
使用Rink酰胺MBHA树脂(347mg，0.25毫摩尔)(Novabiochem，SanDiego，Calif.)在LibertyTM型微波肽合成仪(CEM Corp.，Matthews，NC)上合成标题肽。利用HBTU活化，以四倍过量使用氨基酸Fmoc-Phe-OH、Fmoc Lys(Boc)-OH和Fmoc-Pen(Trt)-OH(Novabiochem，San Diego，CA)，并且重复进行每个偶联。 
通过用三异丙基硅烷/三氟乙酸(TFA)和1％二硫苏糖醇(10mL)振摇树脂3小时，将肽从所述树脂上断裂。将树脂过滤并用DCM(5mL)洗涤。将该滤液合并，且浓缩至3mL。加入乙醚(35mL)以沉淀肽。离心后收集沉淀的肽。将沉淀物溶解于水和乙腈中，然后冻干。 
将所得的粗品在反相HPLC系统(Luna 5微米C8(2)100×20mm柱)上纯化，从100％缓冲液A(水中的0.1％TFA)和0％缓冲液B(乙腈中的0.1％TFA)至80％缓冲液A和20％缓冲液B洗脱35分钟并在235nm下监控。冻干后，获得83.9mg终产物。通过ESI质谱分析法检测到424.5道尔顿的M+1离子，这与计算的分子量423.6道尔顿相符。 
实施例8)制备mPEG-Dma-Lys-Phe-NH 2
mPEG在此具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
Figure G2007800281465D00211
将实施例7的肽产物(0.5mg，1.18微摩尔)溶解于1.0mL pH 4缓冲液(20毫摩尔NaOAc)。将mPEG-醛(1.5当量，平均分子量为20644道尔顿，NOF Corp.，Tokyo，Japan)和TCEP(2.0当量)加至所得溶液中。根据通过使用反相分析型HPLC系统(Vydac C18 5μ肽/蛋白质柱，4.6×250mm)所进行的分析，反应在室温下3小时后大约完成80％。将反应混合物加样于10mL ZebaTM脱盐自旋柱(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。冻干后获得白色泡沫状物。 
实施例9)制备mPEG-Thc-Lys-Phe-NH 2
mPEG在此具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
Figure G2007800281465D00212
将实施例6的肽产物(0.5mg，1.22微摩尔)溶解于1.0mL pH 4缓冲液(20毫摩尔NaOAc)。将mPEG-醛(1.5当量，平均分子量为20644道尔顿，NOF Corp.，Tokyo，Japan)和TCEP(2.0当量)加至所得溶液中。根据通过使用反相分析型HPLC系统(Vydac C18 5μ肽/蛋白质柱，4.6×250mm)所进行的分析，反应在室温下3小时后大约完成90％。将反应混合物加样于10mL ZebaTM脱盐自旋柱(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。冻干后获得白色泡沫状物。 
实施例10)制备selenoCys-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00221
基本上依照实施例1中所述的操作合成标题肽。Fmoc-selenoCys(4-MeOBzl)-OH(Novabiochem，San Diego，CA)用于在N-末端并入硒代半胱氨酸。 
实施例11)制备mPEG-Sez-Lys-Phe-NH 2
mPEG在此具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
基本上依照实施例2中所述的操作合成标题肽。从实施例10获得的产物是肽起始材料。 
实施例12)制备
Figure G2007800281465D00223
mPEG在此具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
在60℃、mPEG-C(O)OH铯盐与溴代乙醛二甲基乙缩醛在DMF中反应2天。去除溶剂后，在0℃将产物用DCM中的40％TFA和少量水处理约30分钟。 
实施例13)制备mPEG-Hth-Lys-Phe-NH 2
在此mPEG具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
基本上依照实施例2中所述的操作合成标题肽。肽起始材料是从实施例4获得的产物。PEG-醛起始材料是从实施例12获得的产物。存在调节缓冲液溶液的pH的额外步骤：在pH4于室温静置2小时后，将反应溶液的pH调节至7，并在室温静置3天后纯化。 
实施例14)制备mPEG-Hdm-Lys-Phe-NH 2
此处mPEG具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
基本上依照实施例8中所述的操作合成标题肽。肽起始材料是从实施例7获得的产物。PEG-醛起始材料是从实施例12获得的产物。存在调节缓冲液溶液的pH的额外步骤：在室温静置过夜后，将反应溶液的pH调节至7，并在纯化前于室温静置溶液3天。 
实施例15)制备mPEG-Haz-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00232
此处mPEG具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
基本上依照实施例9中所述的操作合成标题肽。肽起始材料是从实施例6获得的产物。PEG-醛起始材料是从实施例12获得的产物。存在调节缓冲液溶液的pH的额外步骤：在pH4于室温静置过夜后，将反应溶液的pH调节至7，并在纯化前于室温静置溶液3天。 
实施例16)制备mPEG-Hsz-Lys-Phe-NH 2
在此mPEG具有CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)2-的结构，其中n为正整数。 
基本上依照实施例11中所述的操作合成标题肽。肽起始材料是从实施例10获得的产物。PEG-醛起始材料是从实施例12获得的产物。存在调节缓冲液溶液的pH的额外步骤：在pH4于室温静置2小时后，将反应溶液的pH调节至7，并在纯化前于室温静置溶液3天。 
实施例17)制备H-Pen(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00241
基本上依照实施例3中所述的操作合成标题肽。肽起始材料是从实施例7获得的产物。 
实施例18)制备H-hCys(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00242
将实施例6的肽产物(1.0mg，2.44微摩尔)溶解于1.0mL pH 7缓冲液(20毫摩尔NaOAc)。将α-(3-(3-马来酰亚氨基-1-氧代丙基)氨基)丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯(1.5当量，平均分子量为11962道尔顿，NOF Corp.，Tokyo，Japan)和2当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)加至所得溶液。根据通过使用反相分析型HPLC系统(Vydac C18 5μ肽/蛋白质柱，4.6×250mm)所进行的分析，在室温下1小时后反应完全。将反应混合物加样于10mL ZebaTM脱盐自旋柱(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。冻干后获得白色泡沫状物。 
实施例19)制备H-selenoCys(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH 2
Figure G2007800281465D00251
基本上依照实施例3中所述的操作合成标题肽。肽起始材料是从实施例10获得的产物。 

Claims (22)

1.一种将含一个或多个游离醛基的PEG与分子的D-或L-半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离醛基与所述半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基反应以在产物中生成1，3-噻唑烷基团，其中所述产物具有以下结构：
Figure FSB00000602807900011
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
2.一种将含一个或多个游离醛基的PEG与分子的D-或L-半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括
将所述PEG的游离醛基与所述半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基在反应溶液中反应以在中间体中生成1，3-噻唑烷基团；和
将所述反应溶液的pH调节至约为7，其中“约”表示±10％，由此所述中间体重排以形成终产物，其中所述中间体具有以下结构：
Figure FSB00000602807900012
且所述终产物具有以下结构：
Figure FSB00000602807900013
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
3.一种将含一个或多个游离醛基的PEG与分子的D-或L-青霉胺残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离醛基与所述青霉胺残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基反应以在产物中生成5，5-二甲基-1，3-噻唑烷基团，其中所述产物具有以下结构：
Figure FSB00000602807900021
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
4.一种将含一个或多个游离醛基的PEG与分子的D-或L-青霉胺残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括
将所述PEG的游离醛基与所述青霉胺残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基在反应溶液中反应以在中间体中生成5，5-二甲基-1，3-噻唑烷基团；和
将所述反应溶液的pH调节至约为7，其中“约”表示±10％，由此所述中间体重排以形成终产物，其中所述中间体具有以下结构：
且所述终产物具有以下结构：
Figure FSB00000602807900023
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
5.一种将含一个或多个游离醛基的PEG与分子的D-或L-同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离醛基与所述同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基反应以在产物中生成六元环系统，其中所述产物具有以下结构：
Figure FSB00000602807900024
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
6.一种将含一个或多个游离醛基的PEG与分子的D-或L-同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括
将所述PEG的游离醛基与所述同型半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-氨基在反应溶液中反应以在中间体中生成六元环系统；和
将该反应溶液的pH调节至约为7，其中“约”表示±10％，由此所述中间体重排以形成终产物，其中所述中间体具有以下结构：
Figure FSB00000602807900031
且所述终产物具有以下结构：
Figure FSB00000602807900032
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
7.一种将含一个或多个游离醛基的PEG与分子的D-或L-硒代半胱氨酸残基的未氧化游离硒基和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离醛基与所述硒代半胱氨酸残基的未氧化游离硒基和游离α-氨基反应以在产物中生成五元环系统，其中所述产物具有以下结构：
Figure FSB00000602807900033
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
8.一种将含一个或多个游离醛基的PEG与分子的D-或L-硒代半胱氨酸残基的未氧化游离硒基和游离α-氨基化学缀合的方法，所述方法包括：
将所述PEG的游离醛基与所述硒代半胱氨酸残基的未氧化游离硒基和游离α-氨基在反应溶液中反应以在中间体中生成五元环系统；和
将该反应溶液的pH调节至约为7，其中“约”表示±10％，由此所述中间体重排以形成终产物，其中所述中间体具有以下结构：
Figure FSB00000602807900034
且所述终产物具有以下结构：
Figure FSB00000602807900041
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
9.一种将含一个或多个游离醛基的PEG与分子的D-或L-N-甲基-半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-甲基-氨基化学缀合的方法，所述方法包括将所述PEG的游离醛基与所述N-甲基-半胱氨酸残基的未氧化巯基侧链和游离α-甲基-氨基反应以在产物中生成3-甲基-1，3-噻唑烷基团，其中所述产物具有以下结构
Figure FSB00000602807900042
其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
10.根据权利要求1-9之任一项的方法，其中游离醛基通过连接基团与所述PEG连接，所述连接基团包含酰胺、酯、磺酰胺、磺酰基、巯基、氧基、烷基、链烯基、炔基、芳基、马来酰亚胺或胺官能团，或其任何组合。
11.根据权利要求10的方法，其中所述PEG具有线性、支链或多臂结构。
12.根据权利要求11的方法，其中所述PEG具有100道尔顿至500,000道尔顿的平均分子量。
13.根据权利要求12的方法，其中所述PEG具有1,000道尔顿至50,000道尔顿的平均分子量。
14.根据权利要求1-9之任一项的方法，其中所述半胱氨酸、青霉胺、同型半胱氨酸、硒代半胱氨酸、或N-甲基-半胱氨酸残基在蛋白质中。
15.根据权利要求1-9之任一项的方法，其中所述半胱氨酸、青霉胺、同型半胱氨酸、硒代半胱氨酸、或N-甲基-半胱氨酸残基在肽中。
16.根据权利要求1-9之任一项的方法，其中所述半胱氨酸、青霉胺、同型半胱氨酸、硒代半胱氨酸、或N-甲基-半胱氨酸残基在有机分子中。
17.根据权利要求1-9之任一项的方法，其中所述缀合物产物包含一个或多个有机分子部分。
18.根据权利要求17的方法，其中所述缀合物产物包含一个或多个蛋白质、或肽部分、或其任何组合。
19.根据权利要求1-6或权利要求9之任一项的方法，其中还原剂用于所述反应中。
20.根据权利要求19的方法，其中所述还原剂选自由TCEP和含未氧化巯基的化合物组成的组。
21.根据权利要求7或8的方法，其中还原剂用于所述反应中。
22.根据权利要求21的方法，其中所述还原剂选自由TCEP、含未氧化巯基的化合物和含有未氧化的游离硒基的化合物组成的组。
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