PL210455B1 - Sposób otrzymywania acylowanych peptydów - Google Patents

Sposób otrzymywania acylowanych peptydów

Info

Publication number
PL210455B1
PL210455B1 PL375916A PL37591603A PL210455B1 PL 210455 B1 PL210455 B1 PL 210455B1 PL 375916 A PL375916 A PL 375916A PL 37591603 A PL37591603 A PL 37591603A PL 210455 B1 PL210455 B1 PL 210455B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
glp
peptide
val
arg
amide
Prior art date
Application number
PL375916A
Other languages
English (en)
Other versions
PL375916A1 (pl
Inventor
Dorte Lunoee Dünweber
Inge Holm Jensen
Louis Brammer Hansen
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of PL375916A1 publication Critical patent/PL375916A1/pl
Publication of PL210455B1 publication Critical patent/PL210455B1/pl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania N-acylowanych peptydów.
Dziedzina wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu acylowania peptydów i białek. Konkretniej, wynalazek dotyczy sposobu wprowadzania jednej lub większej liczby grup acylowych do peptydu lub białka.
Tło wynalazku
Dużą liczbę peptydów dopuszczono do stosowania w praktyce medycznej i peptydy te można otrzymywać w odpowiednich komórkach gospodarza za pomocą technik rekombinacji DNA lub można je otrzymywać na drodze syntezy za pomocą dobrze opracowanej technologii syntezy peptydów. Jednak peptydy natywne, jak również ich analogi, mają tendencję do wykazywania dużej szybkości klirensu, która jest niedopuszczalna w przypadku wielu wskazań klinicznych, w których wysokie stężenie peptydu w osoczu jest wymagane przez dłuższy okres czasu. Przykłady peptydów, które w swej natywnej postaci odznaczają się wysokim klirensem obejmują: ACTH, czynnik uwalniający kortykotropinę, angiotensyne, kalcytoninę, insulinę, glukagon, glukagonopodobny peptyd 1 (GLP-1), glukagonopodobny peptyd 2 (GLP-2), insulinopodobny czynnik wzrostu 1, insulinopodobny czynnik wzrostu 2, żołądkowy peptyd hamujący, czynnik uwalniający hormon wzrostu, przysadkowy peptyd aktywujący cyklazę adenylanową, sekretynę, enterogastrynę, somatostatynę, somatotropinę, somatomedynę, hormon przytarczyc, trombopoetynę, erytropoetynę, podwzgórzowe czynniki uwalniające, prolaktynę, tyreotropiny, endorfiny, enkefaliny, wazopresynę, oksytocynę, opioidy i ich analogi, dysmutazę ponadtlenkową, interferon, asparaginazę, arginazę, deaminazę argininową, deaminazę adenozynową i rybonukleazę.
Odkryto, że na szybkość klirensu peptydów wpływają w pożądanym kierunku różne derywatyzacje peptydów i analogów peptydów. Jedną z takich derywatyzacji jest wprowadzanie do terapeutycznego peptydu lipofilowej grupy acylowej, wywołującej pożądany wydłużony profil działania wzglęem peptydu nieacylowanego. Będące skutkiem tego rzadsze podawanie terapeutycznego białka poprawia stosowanie się pacjentów do przepisanej terapii i zmniejsza ilość peptydu, który trzeba podawać. Zostało to opisane i przedstawione w WO 98/08871, która między innymi ujawnia acylowanie GLP-1 i jego analogów, w publikacji WO 98/08872, która między innymi ujawnia acylowanie GLP-2 i jego analogów oraz publikacji WO 99/43708, która między innymi ujawnia acylowanie eksendyny i jej analogów. Wykazano, że między peptydem i grupą acylową pożądana jest obecność grup przestrzennych mono- lub dipeptydowych, takich jak kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Grupy przestrzenne obejmujące wolną grupę kwasu karboksylowego muszą być przed procesem acylowania zabezpieczone i następnie odbezpieczane.
Opis patentowy EP 1227107 ujawnia acylowanie grup ε-aminowych ludzkiej insuliny.
Publikacja WO00/55119 ujawnia sposób acylowania peptydów (np. GLP-1) i nowe środki acylujące.
Aby peptydy terapeutyczne były ekonomicznie opłacalne zasadniczy jest koszt wytwarzania tych peptydów, jak również lecznicza dawka peptydów. Główny koszt podczas produkcji peptydów terapeutycznych stanowią etapy oczyszczania konieczne dla oddzielenia białka docelowego od zanieczyszczeń, które są blisko spokrewnione z białkami docelowymi, np. izomery, postacie desamido itd. Te etapy oczyszczania są zwykle przeprowadzane za pomocą chromatografii, co wymaga zastosowania drogich matryc i rozpuszczalników chromatograficznych, i wiąże się również z mniejszą wydajnością całkowitą.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie skutecznego i ekonomicznego sposobu wprowadzania grup lipofilowych do peptydów poprzez grupy przestrzenne kwasu a-amino-α,ω-dikarboksylowego. Sposób ten jest bardziej swoisty, więc daje wyższe wydajności i mniejszą ilość blisko spokrewnionych zanieczyszczeń. Uzyskuje się istotne zmniejszenie kosztu produkcji acylowanych peptydów. Tańsze acylowane peptydy są bardzo pożądane dla maksymalizacji liczby pacjentów, dla których dostępne jest leczenie, jak również dla wykorzystania zalet alternatywnych dróg dostarczania, które odznaczają się niższą biodostępnością niż wstrzyknięcie podskórne, np. dostarczanie przezskórne i płucne.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania N-acylowanego peptydu, w którym:
a) poddaje się reakcji peptyd posiadający co najmniej jedną wolną grupę aminową ze środkiem acylującym o wzorze ogólnym I:
PL 210 455 B1
w którym n wynosi 0-8;
R1 oznacza COOR4;
2
R2 oznacza ugrupowanie lipofilowe;
R3 razem z grupą karboksylową, z którą R3 jest związany oznacza reaktywny ester lub reaktywny ester N-hydroksyimidowy;
i R4 jest wybrany spoś ród atomu wodoru, C1-12-alkilu i benzylu, w warunkach zasadowych, w mieszaninie wodnej;
b) jeśli R4 nie oznacza atomu wodoru, zmydla się grupę estrową (COOR4) acylowanego peptydu w warunkach zasadowych;
c) wyodrębnia się N-acylowany peptyd, przy czym sposób ten polega na tym, że mieszanina wodna w etapie a) zawiera poniżej 8% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
Korzystnie reakcję w etapie a) przeprowadza się w mieszaninie wodnej zawierającej poniżej 5% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego, korzystniej poniżej 3% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
Korzystnie środek acylujący dodaje się do mieszaniny reakcyjnej w postaci stałej.
Korzystnie reakcję w etapie a) przeprowadza się w obecności aprotonowego rozpuszczalnika polarnego, a taki aprotonowy rozpuszczalnik polarny jest wybrany z grupy składającej się z N-metylo-2-pirolidonu, tetrahydrofuranu i dimetylsulfotlenku.
Korzystniej całość aprotonowego rozpuszczalnika organicznego dodaje się do mieszaniny reakcyjnej w postaci rozpuszczalnika dla środka acylującego.
Korzystnie] środek acylujący dodaje się do mieszaniny reakcyjnej w postaci roztworu, który jest stabilizowany przez dodanie kwasu.
Jeszcze korzystniej kwas dodaje się do aprotonowego rozpuszczalnika polarnego w stężeniu wynoszącym od 0,01% wagowych do 1% wagowych, korzystnie w stężeniu wynoszącym od 0,05% wagowych do 0,5% wagowych.
Jeszcze korzystniej stosuje się kwas wybrany z grupy składającej się z kwasu siarkowego, kwasu metanosulfonowego i kwasu trifluorooctowego.
Korzystnie reakcję w etapie a) przeprowadza się przy braku aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
Korzystnie R4 oznacza atom wodoru.
Korzystnie R4 jest wybrany spośród C1-8-alkilu i benzylu. 33
Korzystnie R3 razem z grupą karboksylową, z którą R3 jest związany oznacza reaktywny ester N-hydroksyimidowy.
Korzystnie ester acylowanego peptydu zmydla się przy wartości pH w zakresie 10-14, korzystnie w zakresie pH od 9-13.
Korzystnie pH mieszaniny reakcyjnej w etapie a) wynosi od pH 9 do pH 13, korzystnie od pH 10 do pH 12 lub korzystniej od pH 11,0 do pH 11,5.
Korzystnie temperatura mieszaniny reakcyjnej w etapie a) wynosi w zakresie 0-50°C, korzystnie w zakresie od 5-40°C i korzystniej w zakresie od 10-30°C.
Korzystnie R2 jest wybrany spośród C3-39-alkilu, C3-39-alkenylu, C3-39-alkadienylu i reszt steroidowych.
2
Korzystniej R2-C(=O)- jest wybrany z grupy składającej się z litocholoilu i heksadekanoilu.
Korzystnie jako postać materiału wyjściowego dla etapu a) stosuje się peptyd odznaczający się czystością peptydu wynoszącą co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 93%, co najmniej 95% lub co najmniej 97%, jak określono za pomocą RP-HPLC.
Korzystnie stosuje się peptyd wybrany z grupy składającej się z GLP-1, eksendyny-4, GLP-2, glukagonu, insuliny, ich analogów i pochodnych każdego z powyższych.
Korzystnie stosuje się peptyd będący agonistą GLP-1.
PL 210 455 B1
Korzystnie stosuje się peptyd wybrany z grupy, w skład której wchodzi eksendyna-3, eksendyna-4, Arg34-GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-36)-amid, Gly8-GLP-1(7-37), Val8-GLP-1(7-36)-amid, Val8-GLP-1(7-37), Val8Asp22-GLP-1(7-36)-amid, Val8Asp22-GLP-1(7-37), Val8Glu22-GLP-1(7-36)-amid, Val8Glu22-GLP-1(7-37), Val8Lys22-GLP-(7-36)-amid, Val8Lys22-GLP-1(7-37), Val8Arg22-GLP-1(7-36)-amid, Val8Arg22-GLP-1(7-37), Val8His22-GLP-1(7-36)-amid, Val8His22-GLP-1(7-37), ludzka insulina des(B30) i ich pochodne.
Korzystniej stosuje się peptyd wybrany spośród HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2 (ZP-10) i jego analogów.
Korzystnie w etapie a) stosuje się mieszaninę reakcyjną zawierającą bufor, który jest odpowiedni do utrzymania zasadniczo stałego pH podczas reakcji.
Korzystnie stosuje się peptyd niebędący peptydem insulinowym, to znaczy niebędący insuliną lub jej analogiem.
Opis wynalazku Peptydy i białka
Niniejszy wynalazek jest przydatny do wprowadzania lipofilowych grup acylowych do dowolnego peptydu (lub białka) w celu zmniejszenia szybkości klirensu in vivo. Przykłady takich peptydów i białek obejmują ACTH, czynnik uwalniający kortykotropinę, angiotensynę, kalcytoninę, eksendynę i jej analogi, insulinę i jej analogi, glukagon i jego analogi, glukagonopodobny peptyd 1 i jego analogi, glukagonopodobny peptyd 2 i jego analogi, insulinopodobny czynnik wzrostu 1, insulinopodobny czynnik wzrostu 2, żołądkowy peptyd hamujący, czynnik uwalniający hormon wzrostu, przysadkowy peptyd aktywujący cyklazę adenylanową, sekretynę, enterogastrynę, somatostatynę, somatotropmę, somatomedynę, hormon przytarczyc, trombopoetynę, erytropoetynę, podwzgórzowe czynniki uwalniające, prolaktynę, tyreotropiny, endorfiny, enkefaliny, wazopresynę, oksytocynę, opiody i ich analogi, dysmutazę ponadtlenkową, interferon, asparaginazę, arginazę, deaminazę argininową, deaminazę adenozynową i rybonukleazę.
Należy rozumieć, że peptyd (lub białko) powinien nieść co najmniej jedną wolną grupę aminową, przy czym taka grupa aminowa jest N-terminalną grupą aminową lub grupą aminową łańcucha bocznego. Peptydy lub białka mogą obejmować aminokwasy, które nie są kodowane przez kod genetyczny, takie jak D-aminokwasy, 3-hydroksyprolina, ornityna i pentyloglicyna. Szczególnie interesujące są grupy aminowe lizynowych i ornitynowych reszt aminokwasowych. Sposób jest szczególnie istotny dla N-acylowania grupy ε-aminowej reszt lizyny. Należy również rozumieć, że peptyd lub białko będące przedmiotem sprawy mogą obejmować dwie lub większą liczbę doczepionych grup aminowych, które wszystkie mogą być N-acylowane według niniejszego wynalazku.
Niniejszy wynalazek jest szczególnie odpowiedni do acylowania GLP-1 i jego analogów. Przykłady GLP-1 i analogów, które mogą być N-acylowane według niniejszego wynalazku obejmują GLP-1 i analogi skrócone, takie jak Arg26-GLP-1(7-37); Arg34-GLP-1(7-37); Lys36-GLP-1(7-37) Arg26,34-Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys38GLP-1(7-38); Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39); Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40) Arg34Lys36-GLP-1(7-37); Arg26Lys39-GLP-1(7-39); Arg34Lys40-GLP-1(7-40); Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39)
Arg26,34Lys36,34-GLP-1(7-40);
Gly8Lys36-GLP-1(7-37);
Gly8Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40); Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)
Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys40-GLP-1(7-37)
Arg26Lys36-GLP-1(7-37); Arg34Lys36-GLP-1(7-37); Val8Arg22-GLP-1(7-37); Met8Arg22-GLP-1(7-37) Gly8His22-GLP-1(7-37); Val8His22-GLP-1(7-37); Met8His22-GLP-1(7-37); His37-GLP-1(7-37)
Gly8GLP-1(7-37); Val8-GLP-1(7-37); Met8-GLP-1(7-37); Gly8Asp22-GLP-1(7-37); Val8Asp22-GLP-1(7-37) Met8Asp22-GLP-1(7-37); Gly8Glu22-GLP-1(7-37); Val8Glu22-GLP-1(7-37); Met8Glu22-GLP-1(7-37) Gly8Lys22-GLP-1(7-37); Val8Lys22-GLP-1(7-37); Met8Lys22-GLP-1(7-37); Gly8Arg22-GLP-1(7-37)
22 37
Gly8Arg34-GLP-1(7-37) Gly8Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39)
Gly8Arg28-GLP-1(7-37); 4Lys36-GLP-1(7-37);
Gly8Arg2
Gly8Glu22His37-GLP-1(7-37); Gly8Lys22His37-GLP-1(7-37); Val8Arg22His37-GLP-1(7-37); Val8His22His37-GLP-1(7-37);
Met8His37-GLP-1(7-37) Met8Asp22His37-GLP-1(7-37); Lys36-GLP-1(7-36)-amid; Arg26,34Lys36-GLP-1(7-36)-amid;
Val8Lys22His37-GLP-1(7-37); Met8Glu22His37-GLP-1(7-37); Gly8Arg22His37-GLP-1(7-37); Gly8His22His37-GLP-1(7-37); Gly8His37GLP-1(7-37); Val8His37-GLP-1(7-37); Val8Asp22His37-GLP-1(7-37); Arg34-GLP-1(7-36)-amid; Arg26,34-GLP-1(7-37)-amid; Arg34Lys36-GLP-1(7-36)-amid;
Val8Glu2
Met8Lys2
His37-GLP-1(7-37)
His37-GLP-1(7-37)
Met8Arg22His37-GLP-1(7-37) Met8His22His37-GLP-1(7-37) Gly8Asp22His37-GLP-1(7-37)
Arg
Arg
Arg26-GLP-1(7-36)-amid ,34Lys36-GLP-1(7-36)-amid 6Lys36-GLP-1(7-36)-amid
Gly8-GLP-1(7-36)-amid; Val8-GLP-1(7-36)-amid; Met8-GLP-1(7-36)-amid
PL 210 455 B1
Gly8Glu22His37-GLP-1(7-36)-amid;
Gly8Glu22-GLP-1(7-36)-amid;
Gly8Lys22-GLP-1(7-36)-amid;
Gly8His22His37-GLP-1(7-36)-amid;
Met8Arg22-GLP-1(7-36)-amid;
Met8His22-GLP-1(7-36)-amid;
Met8Arg22His37-GLP-1(7-36)-amid;
Val8Asp22-GLP-1(7-36)-amid
Val8Glu22-GLP-1(7-36)-amid
Val8Lys22-GLP-1(7-36)-amid
Gly8Arg22-GLP-1(7-36)-amid
Gly8His22-GLP-1(7-36)-amid
His37-GLP-1(7-36)-amid
Gly8His37-GLP-1(7-36)-amid
Met8His37-GLP-1(7-36)-amid;
Gly8Asp22His37-GLP-1(7-36)-amid
Gly8Asp22-GLP-1(7-36)-amid;
Met8Asp22-GLP-1(7-36)-amid;
Met8Glu22-GLP-1(7-36);
Met8Lys22-GLP-1(7-36)-amid;
Val8Arg22-GLP-1(7-36)-amid;
Val8His22-GLP-1(7-36)-amid;
Val8Arg22His37-GLP-1(7-36)-amid Val8His37-GLP-1(7-36)-amid;
Val8Asp22His37-GLP-1(7-36)-amid; Met8Asp22His37-GLP-1(7-36)-amid; Val8Glu22His37-GLP-1(7-36)-amid Met8Glu22His37-GLP-1(7-36)-amid; Gly8Lys22His37-GLP--1(7-36)-amid; Val8Lys22His37-GLP-1(7-36)-amid Met8Lys22His37-GLP-1(7-36)-amid; Gly8Arg22His37-GLP-1(7-36)-amid; Val8His22His37-GLP-1(7-36)-amid Met8His22His37-GLP-1(7-36)-amid; i ich pochodne. Każdy z tych analogów GLP-1 i analogów skróconych stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku.
Niniejszy wynalazek jest również szczególnie odpowiedni do acylowania GLP-2 i jego analogów. Przykłady GLP-2 i analogów, które mogą być N-acylowane według niniejszego wynalazku obejmują analogi GLP-2 i analogi skrócone, takie jak Lys20GLP-2(1-33); Lys20Arg30GLP-2(1-33); Arg30Lys34GLP-2(1-34); Arg30Lys35GLP-2(1-35); Arg30,35Lys20GLP-2(1-35) i Arg35GLP-2(1-35). Każdy z tych analogów GLP-2 i skróconych analogów stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku.
Niniejszy wynalazek jest również szczególnie odpowiedni do acylowania eksendyny-3 i eksendyny-4 oraz ich analogów. Przykłady analogów eksendyny, które mogą być N-acylowane według niniejszego wynalazku są ujawnione w np. publikacji WO99/43708. Każdy z tych analogów eksendyny i analogów skróconych stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku.
Niniejszy wynalazek jest również szczególnie odpowiedni do acylowania insuliny i jej analogów. Przykłady insuliny i jej analogów, które mogą być N-acylowane według niniejszego wynalazku obejmują ludzką insulinę i ludzką insulinę des(B30).
W inne] postaci realizacji niniejszego wynalazku N-acylowanie ma miejsce przy grupie ε-aminowej reszt lizyny.
Środek acylujący
W sposobie według wynalazku, peptyd (lub białko), który ma co najmniej jedną wolną grupę aminową reaguje ze środkiem acylującym o wzorze ogólnym I:
Liczba całkowita n we wzorze I wynosi korzystnie 0-8, w szczególności 0-6 odpowiadając np. kwasowi asparaginowemu, kwasowi glutaminowemu itd. Dogodnie n wynosi 0-4, tak jak 0-2, np. 0 (kwas asparaginowy) lub 1 (kwas glutaminowy). Każda z tych liczb całkowitych i zakresów stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku.
R1 we wzorze I oznacza wolną grupę kwasową (COOH) lub grupę estrową (COOR4). W przypadkach, gdzie R1 oznacza grupę estrową, R4 jest wybrany z grup, które mogą być usunięte (jak odpowiednie alkohole) przez hydrolizę w warunkach zasadowych. Przykłady takich grup to C1-12-alkil, np. metyl, etyl, prop-1-yl, prop-2-yl, but-1-yl, but-2-yl, 2-metyl-prop-1-yl, 2-metyl-prop-2-yl (tert-butyl), heks-1-yl itd. i benzyl. Każda z tych grup stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku.
R2 we wzorze I oznacza ugrupowanie lipofilowe, które wprowadza się do peptydu lub białka. Takie ugrupowanie lipofilowe jest zwykłe wybrane spośród C3-39-alkilu, C3-39-alkenylu, C3-39-alkadienylu i reszt steroidowych. Konkretne przykłady C3-39-alkilu to heptyl, nonyl, undekanyl, tridekanyl, pentadekanył, heptadekanyl i nonadekanyl. Każde z tych lipofilowych ugrupowań stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku.
Podstawnik lub ugrupowanie lipofilowe cechuje się rozpuszczalnością w wodzie w temperaturze 20°C wynoszącą w zakresie od około 0,1 mg/100 ml wody do około 250 mg/100 ml wody, dogodnie
PL 210 455 B1 w zakresie od okoł o 0,3 mg/100 ml wody do okoł o 75 mg/100 ml wody. Przykł adowo, kwas oktanowy (C8) ma rozpuszczalność w wodzie w temperaturze 20°C wynoszącą 68 mg/100 ml, kwas dekanowy (C10) ma rozpuszczalność w wodzie w temperaturze 20°C wynoszącą 15 mg/100 ml, kwas oktadekanowy (C18) ma rozpuszczalność w wodzie w temperaturze 20°C wynoszącą 0,3 mg/100 ml. Każdy z tych zakresów dla podstawnika lipofilowego stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku.
Określenia „C3-39-alkil, „C3-39-alkenyl i „C3-39-alkadienyl w zamierzeniu odnoszą się do prostołańcuchowych i rozgałęzionych, zwłaszcza prostołańcuchowych, nasyconych, mononienasyconych i dinienasyconych, odpowiednio, rodników wę glowodorowych o 3-39 atomach wę g ł a. Konkretne przykłady C3-39-alkilu to heptyl, nonyl, undekanyl, tridekanyl, pentadekanyl, heptadekanyl i nonadekanyl.
Stosowane tu określenie „reszta steroidowa oznacza w zamierzeniu grupę lipofilową, która razem z grupą karbonylową, z którą R2 jest połączony, pochodzi od steroidowego kwasu karboksylowego, to znaczy tri-, tetra- i pentacyklicznego, w pełni nasyconego lub częściowo nienasyconego C16-36-węglowodoru. Przykłady takich grup R2-C(=O)- obejmują litocholoil, deoksycholoil i choloil.
Wśród grup lipofilowych wymienionych powyżej, szczególnie istotne są C7-25-alkil, C7-25-alkenyl, C7-25-alkadienyl i reszty steroidowe. Szczególnie interesujące przykłady to heptyl, nonyl, undekanyl, tridekanyl, pentadekanyl, heptadekanyl, nonadekanyl, litocholoil, deoksycholoil i choloil. Każda z tych grup lipofilowych stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku.
R3 we wzorze I, razem z grupą karboksylową, z którą R3 jest związany, oznacza reaktywny ester lub reaktywny ester N-hydroksyimidowy. Każdy z tych estrów stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku. Reaktywne estry i reaktywne estry N-hydroksyimidowe są dobrze znane w chemii organicznej (zwł aszcza w chemii peptydów) jako grupy funkcyjne, które wykorzystuje się przy acylowaniu grup amino, tio i hydroksy. W kontekście niniejszego wynalazku określenie „reaktywny ester lub reaktywny ester N-hydroksyimidowy w zamierzeniu oznacza przeprowadzoną w ester postać grupy kwasu karboksylowego odpowiednią do acylowania aminy, dogodnie aminy pierwszorzędowej. Należy zatem rozumieć, że wybiórczość dla acylowania amin pierwszorzędowych jest zalecana w stosunku do acylowania grup hydroksy i tio. Reaktywne estry N-hydroksyimidowe są szczególnie zalecane.
Przykłady reaktywnych estrów obejmują estry i pochodne 1-hydroksybenzotriazolu. Znane są liczne bardzo skuteczne odczynniki do tworzenia takich aktywowanych estrów kwasów karboksylowych, np. tetra-fluoroboran 2-(1H-benzotriazolilo)-1,1,3,3,-tetrametylmocznika. Takie reaktywne estry są zwykle otrzymywane in situ w obecności zasady, np. zasady organicznej, takiej jak trialkiloamina.
Przykłady imidowej części reaktywnych estrów N-hydroksyimidowych to te konkretnie opisane w opisie patentowym EP 0511600 A2, strona 3 do strony 7. Szczególnie interesujące przykłady części imidowych wśród nich to sukcynoimid, ftalimid, itd. Każda z tych części imidowych stanowi alternatywne postaci realizacji niniejszego wynalazku.
Reaktywne estry N-hydroksyimidowe o wzorze I mogą być otrzymywane tak jak opisano w publikacji WO00/55119 i WO98/02460.
W przypadku gdy odczynnik acylują cy o wzorze I ma być uż yty w postaci wolnego kwasu α-karboksylowego (R4 = atom wodoru), związek o wzorze I, w którym R4 oznacza grupę, która może być wybiórczo usunięta, przekształca się w odpowiedni związek, w którym R4 oznacza atom wodoru. Grupą zabezpieczającą kwas karboksylowy może być grupa benzylowa, która może być usunięta przez katalityczne uwodornienie, lub grupa allilowa, która może być usunięta wybiórczo. Benzylową grupę zabezpieczającą można usunąć przez uwodornienie katalityczne w aprotonowym rozpuszczalniku polarnym, np. w acetonie, w temperaturze pokojowej za pomocą palladu osadzonego na węglu i wodoru. Reakcja może być przeprowadzana w zamkniętym naczyniu w atmosferze wodoru (zwykle 0,1-10 atm) przy energicznym mieszaniu. Reakcja ulega zwykle zakończeniu w ciągu 0,5-12 godzin w zależności od jakości katalizatora palladowego. Stosuje się konwencjonalne postępowanie.
Warunki reakcji
Reakcję między środkiem acylującym o wzorze I i peptydem lub białkiem przeprowadza się w warunkach zasadowych w roztworze wodnym zawierającym poniżej 8% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
W jednej postaci realizacji wynalazku reakcję w etapie a) przeprowadza się w roztworze wodnymi zawierającym od 1% wagowych do 8% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
Środek acylujący o wzorze I jest zwykle stosowany w lekkim nadmiarze w stosunku do liczby grup aminowych peptydów, które mają być acylowane. Stosunek ten wynosi zwykle 1:1 do 1:20
PL 210 455 B1 z nadmiarem środka acylującego, dogodnie 1:1,2 do 1:5, biorąc pod uwagę liczbę grup aminowych w peptydzie. Środek acylujący może być dodany do mieszaniny reakcyjnej w postaci stałej lub może on być dodany do mieszaniny reakcyjnej w postaci roztworu. Jeśli środek acylujący jest dodawany w postaci roztworu jest on rozpuszczany w aprotonowym rozpuszczalniku polarnym i dogodnie stabilizowany przez dodanie kwasu. Kwasem do stabilizacji jest zwykle kwas mineralny, np. kwas siarkowy.
Należy rozumieć, że peptyd może być w pełni N-acylowany lub tylko częściowo N-acylowany, w zależności od ilości stosowanego środka acylującego i warunków reakcji. Zaleca się, by N-acylowanie było zasadniczo stechiometryczne.
Aprotonowe rozpuszczalniki polarne są rozpuszczalnikami o średnio wysokiej stałej dielektrycznej, które nie zawierają kwasowego atomu wodoru (zobacz np. Momson i Boyd, Organic Chemistry, 5 wydanie, str. 229). Aprotonowy rozpuszczalnik polarny wybrany jest zwykle spośród bezwodnego tetrahydrofuranu (THF), bezwodnego dimetyloformamidu (DMF), acetonu, dichlorometanu, dimetylosulfotlenku (DMSO), dioksanu, dimetyloacetamidu i N-metylo-2-pirolidonu i ich mieszanin, spośród których zalecany jest dimetyloformamid, dimetylsulfotlenek, dimetyloacetamid i N-metylo-2-pirolidon, a szczególnie zalecany jest N-metylo-2-pirolidon.
Temperatura jest zwykle utrzymywana w zakresie -10-50°C.
Aby reakcja przebiegała bez zakłóceń istotne jest, aby wartość pH mieszaniny rozpuszczalnika była w zakresie 7-14, takim jak 9-13, dogodnie w zakresie 10-12, dla spokojnego postępu reakcji. Wynik pod względem wydajności i czystości jest zwykle optymalny jeśli wartość pH mieszaniny rozpuszczalnika jest w zakresie 10-12. Pożądaną wartość pH otrzymuje się przez dodanie wodorotlenków metali alkalicznych, np. wodorotlenku sodu i wodorotlenku potasu, i/lub zasad organicznych, takich jak trialkiloaminy (np. trietyloamina, N,N-diizopropyloetyloamina, itd.). Może być również zalecane dodanie buforu, który jest odpowiedni do utrzymywania pH blisko wartości wyjściowej przed rozpoczęciem reakcji. Przykłady buforów, które można zastosować do tego celu to bufor fosforanowy, bufor boranowy i podobne.
Jako typowy przykład, reakcję w etapie (a) przeprowadza się stosując białko i środek acylujący o wzorze I w stosunku molowym 1:1 do 1:5. Peptyd jest zwykłe wstępnie rozpuszczany w wodzie w temperaturze -10-30°C, takiej jak 0-25°C i pH jest regulowane do żądanego poziomu za pomocą wodorotlenku metalu alkalicznego (np. wodorotlenku sodu lub wodorotlenku potasu). Wartość pH może być dodatkowo wyregulowana za pomocą kwasów, np. kwasu octowego, oraz zasad, np. trialkiloaminy, ale dogodnie temperatura jest w powyższym zakresie. Alternatywnie peptyd jest wstępnie rozpuszczany bezpośrednio w roztworze wodnym w odpowiednie] ilości stosownego kwasu lub zasady. Środek acylujący jest następnie dodawany w postaci stałej lub w postaci roztworu w aprotonowym rozpuszczalniku polarnym. Przed dodaniem wody i kwasu, np. kwasu octowego, do pH 6,5-9,0, reakcji zazwyczaj pozwala się na postęp aż do jej zakończenia (może być monitorowana za pomocą HPLC), które zwykle następuje w ciągu 0,2-4 godzin, tak jak 0,2-1 godziny. Produkt jest zwykle wyodrębniany i oczyszczany za pomocą HPLC, lub jest wytracany za pomocą izoelektrycznej wartości pH, lub jest poddawany hydrolizie (etap (b)) przed oczyszczeniem.
Gdy stosuje się środek acylujący o wzorze I, gdzie R4 oznacza atom wodoru, otrzymuje się bezpośrednio N-acylowany peptyd lub białko niosący ugrupowania lipofilowe i wolne grupy karboksylowe. Tak więc wariant, w którym R4 oznacza atom wodoru jest zalecaną postacią realizacji sposobu według wynalazku według niniejszego wynalazku.
Alternatywnie, to znaczy gdy grupą R4 jest C1-12-alkil lub benzyl, ester N-acylowanego peptydu (lub ester białka) zmydla się w warunkach zasadowych tak, aby otrzymać N-acylowany peptyd lub N-acylowane białko. Zmydlanie przeprowadza się zwykle w 0,01-4,0 M roztworze wodorotlenku metalu alkalicznego, np. wodorotlenku sodu lub potasu. pH roztworu wynosi zwykle 10-14. Pozwala się zwykle na postęp przez 0,1-12 godzin, dogodnie na 0,5-4 godzin, w temperaturze 0-40°C, takiej jak około temperatury pokojowej.
Po reakcji produkt jest oczyszczany, np. przez wytrącanie w wartości pH punktu izoelektrycznego i/lub za pomocą preparatywnej HPLC. Tak więc wariant, w którym R4 oznacza C1-12-alkil lub benzyl jest inną zalecaną postacią realizacji sposobu według niniejszego wynalazku.
W jednej postaci realizacji sposobu według wynalazku środek acylujący jest dodawany do mieszaniny reakcyjnej w postaci stałej.
W innej postaci realizacji sposobu według wynalazku taka reakcja w etapie a) zachodzi w mieszaninie wodnej zawierającej od 0% wagowych do 8% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika
PL 210 455 B1 polarnego, korzystnie od 0% wagowych do 5% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego, jeszcze korzystniej od 0% wagowych do 3% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku reakcja w etapie a) zachodzi w obecności aprotonowego rozpuszczalnika polarnego, i taki aprotonowy rozpuszczalnik polarny jest wybrany z grupy składającej się z N-metylo-2-pirolidonu, tetrahydrofuranu i dimetylsulfotlenku.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu wedł ug wynalazku cał y aprotonowy rozpuszczalnik organiczny jest dodawany do mieszaniny reakcyjnej w postaci rozpuszczalnika dla środka acylującego.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu wedł ug wynalazku ś rodek acylują cy jest dodawany do mieszaniny reakcyjnej w postaci roztworu, który jest stabilizowany przez dodanie kwasu.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku taki kwas jest dodawany do aprotonowego rozpuszczalnika polarnego w stężeniu wynoszącym od 0,01% wagowych do 1% wagowych, korzystnie w stężeniu wynoszącym od 0,05% wagowych do 0,5% wagowych.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu wedł ug wynalazku taki kwas jest wybrany z grupy składającej się z kwasu siarkowego, kwasu metanosulfonowego i kwasu trifluorooctowego.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu wedł ug wynalazku reakcja w etapie a) zachodzi przy braku aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku R4 we wzorze I oznacza atom wodoru.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku R4 jest wybrany spoś ród C1-8-alkilu i benzylu.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu wedł ug wynalazku R3 razem z grupą karboksylową , z którą R3 jest zwią zany, oznacza reaktywny ester N-hydroksyimidowy.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku ester acylowanego peptydu zmydla się przy wartości pH w zakresie 10-14, korzystnie w zakresie pH od 9-13.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku ester acylowanego peptydu zmydla się przy wartości pH w zakresie 9-14, takiej jak w zakresie pH od 10-13.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku pH mieszaniny reakcyjnej w etapie a) wynosi od pH 9 do pH 13, korzystnie od pH 10 do pH 12, lub korzystniej od pH 11,0 do pH 11,5.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku mieszanina reakcyjna w etapie a) obejmuje bufor, który jest odpowiedni do utrzymania zasadniczo stałego pH podczas reakcji. W jednej postaci realizacji sposobu według wynalazku takim buforem jest bufor fosforanowy, bufor boranowy lub ich mieszanina.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku temperatura mieszaniny reakcyjnej w etapie a) wynosi w zakresie 0-50°C, korzystnie w zakresie od 5-40°C i korzystniej w zakresie od 10-30°C.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku R2 jest wybrany spoś ród C3-39-alkilu, C3-39-alkenylu, C3-39-alkadienylu i reszt steroidowych.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu wedł ug wynalazku R2-C(=O)- jest wybrany z grupy składającej się z litocholoilu i heksadekanoilu.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku taki peptyd stosowany w postaci materiału wyjściowego dla etapu a) odznacza się czystością peptydu wynoszącą co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 93%, co najmniej 95%, lub co najmniej 97%, co określa się za pomocą RP-HPLC.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu wedł ug wynalazku taki peptyd jest wybrany z grupy składającej się z GLP-1, eksendyny-4, GLP-2, glukagonu, insuliny, ich analogów i pochodnych każdego z powyższych.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu wedł ug wynalazku taki peptyd jest agonistą GLP-1.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku taki peptyd jest wybrany z grupy, w skł ad której wchodzi eksendyna-3, eksendyna-4, Arg34-GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-36)-amid, Gly8-GLP-1(7-37), Val8-GLP-1(7-36)-amid, Val8-GLP-1(7-37), Val8Asp22-GLP-1(7-36)-amid,
Val8Asp22-GLP-1(7-37), Val8Glu22-GLP-1(7-36)-amid, Val8Glu22-GLP-1(7-37), Val8Lys22-GLP-1(7-36)-amid, Val8Lys22-GLP-1(7-37), Val8Arg22-GLP-1(7-36)-amid, Val8Arg22-GLP-1(7-37), Val8His22-GLP-1(7-36)-amid, Val8His22-GLP-1(7-37), ludzka insulina des(B30) i ich pochodne.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku taki peptyd jest wybrany z grupy, w skład której wchodzi Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37), Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37), Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Leu18Glu22-GLP-1(7-37), Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37),
PL 210 455 B1
Val8Glu22His17-GLP-1(7-37), Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22Val25lle33-GLP-1(7-37),
Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37), Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37) i ich analogi.
W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku taki peptyd jest wybrany spośród HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2 (ZP-10) i ich analogów.
W innej postaci realizacji sposobu według wynalazku taki peptyd nie jest peptydem insuliny, to znaczy nie jest insuliną lub jej analogiem. W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku taki peptyd obejmuje tylko jeden łańcuch polipeptydowy. W jeszcze innej postaci realizacji sposobu według wynalazku taki peptyd obejmuje dwa łańcuchy polipeptydowe, które są kowalencyjnie połączone co najmniej jednym wiązaniem disiarczkowym.
Innym aspektem niniejszego wynalazku jest zastosowanie sposobu acylowania do otrzymania pochodnej peptydu wybranej z grupy składającej się z Arg34, Lys26 (^-(γ-Glu (Na-heksadekanoilo)))-GLP-1(7-37) i Lys829(NMetradekanoilo) ludzkie] insuliny des(B30) i ludzkiej insuliny Lys26(NE-[Nalitocholoil-Glu-OH)) des(B30).
P r z y k ł a d y
Otrzymywanie odczynników do acylowania przeprowadzono tak jak opisano w publikacji
WO 00/55119.
Końcowe oczyszczenie produktu uzyskano w przykładach za pomocą chromatografii kolumnowej.
P r z y k ł a d 1
Arg34GLP-1(7-37) poddano ekspresji w komórkach drożdży (S. cerevisiae) za pomocą konwencjonalnej technologii rekombinacji DNA, np. tak jak opisano w publikacji WO 98/08871. Arg34GLP-1(7-37) w bulionie fermentacyjnym oczyszczono wtedy za pomocą konwencjonalnej chromatografii z odwróconą fazą i następnie wytrącono przy pH dla punktu izoelektrycznego peptydu, to znaczy przy pH 5,4. Osad wyodrębniono przez wirowanie i zamrożono.
Arg34-GLP-1 (7-37) (1,47 g zamrożonego poddanego izoprecypitacji materiału peptydowego, około 0,10 mmola) rozpuszczono w 0,1 mola/kg trietyloaminy (23 ml) w temperaturze 10-15°C. pH roztworu wynosiło 11,6. Dodano ester γ-N-hydroksysukcynoimidowy kwasu N-heksadekanoiloglutaminowego (63,7 mg, 0,13 mmola). Po 20 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę (42 ml) i pH wyregulowano do 8,0 przez dodanie 1,0 M kwasu octowego.
Wydajność: Za pomocą analitycznej RP-HPLC wykazano, że mieszanina reakcyjna zawiera 84% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-:;-(-i'-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1 (7-37) i 0,5% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-:;-(a-Glu (N-heksadekanoilo))]-GLP-1 (7-37).
P r z y k ł a d 2
Arg34GLP-1(7-37) poddano ekspresji w komórkach drożdży (S. cerevisiae) za pomocą konwencjonalnej technologii rekombinacji DNA, np. tak jak opisano w publikacji WO 98/08871. Arg34GLP-1(7-37) w bulionie fermentacyjnym oczyszczono następnie za pomocą konwencjonalnej chromatografii z odwróconą fazą, po czym wytrącono przy pH dla punktu izoelektrycznego peptydu, to znaczy przy pH 5,4. Osad wyodrębniono przez wirowanie i zamrożono.
Arg34-GLP-1(7-37) (1,57 g zamrożonego poddanego izoprecypitacji materiału peptydowego, około 0,14 mmola) rozpuszczono w 0,1 mola/kg trietyloaminy (23 ml) w temperaturze 10-15°C. pH roztworu wyregulowano do 11,5 przez dodanie trietyloaminy. Dodano 1,7 ml estru γ-N-hydroksysukcynoimidowego kwasu N-heksadekanoiloglutaminowego (92,1 mg, 0,19 mmola) rozpuszczonego w N-metylo-2-pirolidonie zawierającym 0,105% wagowych 1 M H2SO4. Po 20 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę (42 ml), i pH dostosowano do 8,0 przez dodanie 1,0 M kwasu octowego.
Wydajność: Za pomocą analitycznej RP-HPLC wykazano, że mieszanina reakcyjna zawiera 83% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N^-(Y-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1(7-37) i 0,4% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-:;-(a-Glu (N-heksadekanoilo))]-GLP-1(7-37).
P r z y k ł a d 3
Arg34GLP-1(7-37) poddano ekspresji w komórkach drożdży (S. cerevisiae) za pomocą konwencjonalnej technologii rekombinacji DNA, np. tak jak opisano w publikacji WO 98/08871. Arg34GLP-1(7-37) w bulionie fermentacyjnym oczyszczono następnie za pomocą konwencjonalnej chromatografii z odwróconą fazą, po czym wytrącono przy pH dla punktu izoelektrycznego peptydu, to znaczy przy pH 5,4. Osad wyodrębniono przez wirowanie i zamrożono.
Arg34-GLP-1(7-37) (1,53 g zamrożonego poddanego izoprecypitacji materiału peptydowego, około 0,13 mmola) rozpuszczono w 0,05 mola/kg trietyloaminy (25 ml) w temperaturze pokojowej.
PL 210 455 B1 pH roztworu wynosiło 10,9. Dodano 1,8 ml estru γ-N-hydroksysukcynoimidowego kwasu N-heksadekanoiloglutaminowego (94,2 mg, 0,19 mmola) rozpuszczonego w N-metylo-2-pirolidonie bez H2SO4. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę (48 ml), i pH wyregulowano do 8,0 przez dodanie 1,0 M kwasu octowego.
Wydajność: Za pomocą analitycznej RP-HPLC wykazano, że mieszanina reakcyjna zawiera 75% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-!;-(Y-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1 (7-37) i 4,0% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-!;-(a-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1 (7-37).
P r z y k ł a d 4 - przykład odniesienia z aprotonowym rozpuszczalnikiem polarnym, stężenie > 10% wagowych.
Arg34GLP-1(7-37) poddano ekspresji w komórkach drożdży (S. cerevisiae) za pomocą konwencjonalnej technologii rekombinacji DNA, np. tak jak opisano w publikacji WO 98/08871. Arg34GLP-1(7-37) w bulionie fermentacyjnym oczyszczono następnie za pomocą konwencjonalnej chromatografii z odwróconą fazą, po czym wytrącono przy pH dla punktu izoelektrycznego peptydu, to znaczy przy pH 5,4. Osad wyodrębniono przez wirowanie i zamrożono.
Arg34-GLP-1(7-37) (1,57 g zamrożonego poddanego izoprecypitacji materiału peptydowego, około 0,14 mmola) rozpuszczono w 0,1 mola/kg trietyloaminy (23 ml) w temperaturze 10-15°C. Dodano N-metylo-2-pirolidon (6,8 ml) i pH roztworu wyregulowano do 11,5 przez dodanie trietyloaminy. Następnie dodano ester γ-N-hydroksysukcynoimidowy kwasu N-heksadekanoiloglutaminowego (92,1 mg, 0,19 mmola) rozpuszczony w 1,7 ml N-metylo-2-pirolidonu zawierającego 0,105% wagowych 1M H2SO4. Po 20 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę (54 ml) i pH wyregulowano do 8,0 przez dodanie 1,0 M kwasu octowego.
Wydajność: Za pomocą analitycznej RP-HPLC wykazano, że mieszanina reakcyjna zawiera 87% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-3-(Y-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1(7-37) i 0,5% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-3-(a-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1 (7-37).
P r z y k ł a d 5 - przykład odniesienia z aprotonowym rozpuszczalnikiem polarnym, stężenie > 10% wagowych.
Arg34GLP-1(7-37) poddano ekspresji w komórkach drożdży (S. cerevisiae) za pomocą konwencjonalnej technologii rekombinacji DNA, np. tak jak opisano w publikacji WO 98/08871. Arg34GLP-1(7-37) w bulionie fermentacyjnym oczyszczono następnie za pomocą konwencjonalnej chromatografii z odwróconą fazą, po czym wytrącono przy pH dla punktu izoelektrycznego peptydu, to znaczy przy pH 5,4. Osad wyodrębniono przez wirowanie i zamrożono.
Arg34-GLP-1(7-37) (1,51 g zamrożonego poddanego izoprecypitacji materiału peptydowego, około 0,13 mmola) rozpuszczono w 0,1 mola/kg trietyloaminy (20 ml) i N-metylo-2-pirolidonie (100 ml) w temperaturze 10-15°C. Następnie dodano ester γ-N-hydroksysukcynoimidowy kwasu N-heksadekanoiloglutaminowego (74 mg, 0,15 mmola) rozpuszczony w 1,4 ml N-metylo-2-pirolidonu zawierającego 0,105% wagowych 1M H2SO4. Po 45 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę (206 ml), i pH wyregulowano do 8 przez dodanie 1,0 M kwasu octowego.
Wydajność: Za pomocą analitycznej RP-HPLC wykazano, że mieszanina reakcyjna zawiera 57% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-3-(Y-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1(7-37) i 14% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-3-(a-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1(7-37).
P r z y k ł a d 6
W tabeli 1 omówione są warunki doświadczalne stosowane do acylowania Arg34-GLP-1(7-37) w doświadczeniach z przykładów 1-5 i wymieniona jest otrzymana zawartość zanieczyszczeń Arg34Lys26-[N-3-(a-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1(7-37) (w skrócie α-glu). Bez dodatku H2SO4 jako stabilizatora widać wyraźnie, że niższe stężenie aprotonowego rozpuszczalnika polarnego skutecznie redukuje ilość zanieczyszczenia α-glu. Gdy dodawany jest stabilizator tworzenie istotnych ilości zanieczyszczeń α-glu zaczyna się przy znacznie wyższym stężeniu aprotonowego rozpuszczalnika polarnego, to znaczy przy stężeniu ponad 28% wagowych.
PL 210 455 B1
T a b e l a 1
Zawartość aprotonowego rozpuszczalnika polarnego w mieszaninie reakcyjnej przy acylowaniu peptydów GLP-1 i uzyskana frakcja zanieczyszczeń Arg34Lys-[N-;:-(a-Glu(N-heksadekanoilo))-GLP-1(7-37) (α-glu).
(Dane z przykładów 1-5)
Przykład nr Wodny roztwór peptydu (ml) Dodany NMP (mL) Zawartość NMP (% wagowy) Dodany H2SO4 α-glu
1 23 0 0% 0,5%
2 23 1,7 7% + 0,4%
3 25 1,8 7% 4%
4 23 6,8+1,7 28% + 0,5%
5 20 100+1,4 84% + 14%
P r z y k ł a d 7
Krystalizowaną sodem ludzką insulinę des(B30) (1,74 g zamrożonego materiału peptydowego wyodrębnianego przez precypitację izoelektryczną, około 0,088 mmola) rozpuszczono w 0,1 mola/kg trietyloaminy (10,85 ml) w temperaturze pokojowej. pH roztworu wynosiło 10,9. Następnie, dodano (2S)-5-[(2,5-diokso-1-pirolidinylo)oksy]-2-{[(3a,5b)-3-hydroksy-9-metylo-24-oksocholan-24-ylo]amino}-5-oksopentanonian metylu (55,1 mg, 0,089 mmola) rozpuszczony w N-metylo-2-pirolidonie (1,25 ml). Po 30 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę (5°C, 85 ml).
Wydajność: Za pomocą analitycznej RP-HPLC wykazano, że mieszanina reakcyjna zawiera 34% (powierzchniowo) ludzkiej Ne-(litocholoilo-Y-glutamylo)-Lys829-des(B30)-insuliny.
P r z y k ł a d 8
Arg34GLP-1(7-37) poddano ekspresji w komórkach drożdży (S. cerevisiae) za pomocą konwencjonalnej technologii rekombinacji DNA, np. tak jak opisano w publikacji WO 98/08871. Arg34GLP-1(7-37) w bulionie fermentacyjnym oczyszczono następnie za pomocą konwencjonalnej chromatografii z odwróconą fazą, po czym wytrącono przy pH dla punktu izoelektrycznego peptydu, to znaczy przy pH 5,4. Osad wyodrębniono przez wirowanie i zamrożono.
Precypitat izoelektryczny zawierający Arg34GLP-1(7-37) (5,70 g zamrożonego wytrąconego materiału peptydowego, około 0,38 mmola) rozpuszczono w 0,1 M roztworze dihydratu wodorofosforanu disodowego (170 ml, pH wyregulowane do 11,35 za pomocą 1 M NaOH) w temperaturze 15°C. pH roztworu wyregulowano do 11,4 przez dodanie 1 M NaOH. Wkroplono 3 ml estru γ-N-hydroksysukcynoimidowego kwasu N-heksadekanoiloglutaminowego (248,1 mg, 0,51 mmola) rozpuszczonego w N-metylopirolidonie zawierającym 0,105% wagowych 1 M H2SO4, w ciągu 8 minut.
Próbki odciągnięto w ciągu 21,5 godzin reakcji w temperaturze 15°C i dodano 0,1 M roztwór dihydraru wodorofosforanu disodowego zawierający 1 mg/ml glicyny, pH 7,5. Ostateczną mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą (300 ml) i pH wyregulowano do 8,0 przez dodanie lodowatego kwasu.
Wydajność: Za pomocą analitycznej RP-HPLC wykazano, że mieszanina reakcyjna zawiera 78-80% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-c-(Y-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1(7-37) i 0,24-1,67% (powierzchniowo) Arg34Lys26-[N-c-(a-Glu(N-heksadekanoilo))]-GLP-1(7-37).
T a b e l a 2
Zawartość Arg34Lys26-[N<-(y-Glu (N-heksadekanoilo) ) ]-GLP-1(7-37) (γ-Glu) i Arg34Lys26-[N-;:-(a-Glu (N-heksadekanollo))]-GLP-1(7-37) (α-Glu) w stosunku do czasu reakcji. (Dane z przykładu 8)
Czas (godziny) γ-Glu (% powierzchni) α-Glu (% powierzchni)
0,17 78,01 0,24
1 79,35 0,31
2 79,45 0,36
4 80,49 0,45
21,5 80,27 1,67
PL 210 455 B1
Lista sekwencji <110> Novo Nordisk A/S <120> Sposób acylowania peptydów <130> 6546.204-WO <160> 1 <170> Patentin wersja 3.1 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Konstrukcja syntetyczna <220>
<221> Amidowanie grupy karboksylowej <222> (44)..(44) <223>
<400> 1
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys

Claims (24)

1. Sposób otrzymywania N-acylowanego peptydu, w którym:
a) poddaje się reakcji peptyd posiadający co najmniej jedną wolną grupę aminową ze środkiem acylującym o wzorze ogólnym I w którym n wynosi 0-8;
R1 oznacza COOR4;
2
R2 oznacza ugrupowanie lipofilowe;
R3 razem z grupą karboksylową, z którą R3 jest związany oznacza reaktywny ester lub reaktywny ester N-hydroksyimidowy;
i R4 jest wybrany spośród atomu wodoru, C1-12-alkilu i benzylu, w warunkach zasadowych, w mieszaninie wodnej;
b) jeśli R4 nie oznacza atomu wodoru, zmydla się grupę estrową (COOR4) acylowanego peptydu w warunkach zasadowych;
c) wyodrębnia się N-acylowany peptyd, znamienny tym, że taka mieszanina wodna w etapie a) zawiera poniżej 8% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję w etapie a) przeprowadza się w mieszaninie wodnej zawierającej poniżej 5% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego, korzystniej poniżej 3% wagowych aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że środek acylujący dodaje się do mieszaniny reakcyjnej w postaci stałej.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że reakcję w etapie a) przeprowadza się w obecności aprotonowego rozpuszczalnika polarnego, a taki aprotonowy rozpuszczalnik polarny jest wybrany z grupy składającej się z N-metylo-2-pirolidonu, tetrahydrofuranu i dimetylsulfotlenku.
PL 210 455 B1
5. Sposób wedł ug zastrz. 4, znamienny tym, ż e cał o ść aprotonowego rozpuszczalnika organicznego dodaje się do mieszaniny reakcyjnej w postaci rozpuszczalnika dla środka acylującego.
6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że środek acylujący dodaje się do mieszaniny reakcyjnej w postaci roztworu, który jest stabilizowany przez dodanie kwasu.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że kwas dodaje się do aprotonowego rozpuszczalnika polarnego w stężeniu wynoszącym od 0,01% wagowych do 1% wagowych, korzystnie w stężeniu wynoszącym od 0,05% wagowych do 0,5% wagowych.
8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się kwas wybrany z grupy składającej się z kwasu siarkowego, kwasu metanosulfonowego i kwasu trifluorooctowego.
9. Sposób wedł ug któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienny tym, ż e reakcję w etapie a) przeprowadza się przy braku aprotonowego rozpuszczalnika polarnego.
10. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-9, znamienny tym, że R4 oznacza atom wodoru.
11. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-9, znamienny tym, że R4 jest wybrany spośród
C1-8-alkilu i benzylu.
12. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-11, znamienny tym, że R3 razem z grupą karboksylową, z którą R3 jest związany oznacza reaktywny ester N-hydroksyimidowy.
13. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-9, znamienny tym, że ester acylowanego peptydu zmydla się przy wartości pH w zakresie 10-14, korzystnie w zakresie pH od 9-13,
14. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-13, znamienny tym, że pH mieszaniny reakcyjnej w etapie a) wynosi od pH 9 do pH 13, korzystnie od pH 10 do pH 12 lub korzystniej od pH 11,0 do pH 11,5.
15. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-14, znamienny tym, że temperatura mieszaniny reakcyjnej w etapie a) wynosi w zakresie 0-50°C, korzystnie w zakresie od 5-40°C i korzystniej w zakresie od 10-30°C.
16. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-15, znamienny tym, że R2 jest wybrany spośród C3-39-alkilu, C3-39-alkenylu, C3-39-alkadienylu i reszt steroidowych.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że R2-C(=O)- jest wybrany z grupy składającej się z litocholoilu i heksadekanoilu.
18. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-17, znamienny tym, że jako postać materiału wyjściowego dla etapu a) stosuje się peptyd odznaczający się czystością peptydu wynoszącą co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 93%, co najmniej 95% lub co najmniej 97%, jak określono za pomocą RP-HPLC.
19. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-18, znamienny tym, że stosuje się peptyd wybrany z grupy składającej się z GLP-1, eksendyny-4, GLP-2, glukagonu, insuliny, ich analogów i pochodnych każdego z powyższych.
20. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-19, znamienny tym, że stosuje się peptyd będący agonistą GLP-1.
21. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-20, znamienny tym, że stosuje się peptyd wybrany z grupy, w skład której wchodzi eksendyna-3, eksendyna-4, Arg34-GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-36)-amid, Gly8-GLP-1(7-37), Val8-GLP-1(7-36)-amid, Val8-GLP-1(7-37), Val8Asp22-GLP-1(7-36)-amid, Val8Asp22-GLP-1(7-37), Val8Glu22-GLP-1(7-36)-amid, Val8Glu22-GLP-1(7-37), Val8Lys22-GLP-1-(7-36)-amid, Val8Lys22-GLP-1(7-37), Val8Arg22-GLP-1(7-36)-amid, Val8Arg22-GLP-1(7-37), Val8His22-GLP-1(7-36)-amid, Val8His22-GLP-1(7-37), ludzka insulina des(B30) i ich pochodne.
22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się peptyd wybrany spośród
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2 (ZP-10) i jego analogów.
23. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-14, znamienny tym, że w etapie a) stosuje się mieszaninę reakcyjną zawierającą bufor, który jest odpowiedni do utrzymania zasadniczo stałego pH podczas reakcji.
24. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-23, znamienny tym, że stosuje się peptyd niebędący peptydem insulinowym, to znaczy niebędący insuliną lub jej analogiem.
PL375916A 2002-09-25 2003-09-25 Sposób otrzymywania acylowanych peptydów PL210455B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200201421 2002-09-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL375916A1 PL375916A1 (pl) 2005-12-12
PL210455B1 true PL210455B1 (pl) 2012-01-31

Family

ID=32039050

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL375916A PL210455B1 (pl) 2002-09-25 2003-09-25 Sposób otrzymywania acylowanych peptydów

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP1546090B1 (pl)
JP (1) JP4468174B2 (pl)
KR (1) KR101131783B1 (pl)
CN (1) CN100586926C (pl)
AT (1) ATE434602T1 (pl)
AU (1) AU2003266218B2 (pl)
BR (1) BR0314289B8 (pl)
CA (1) CA2500123A1 (pl)
DE (1) DE60328112D1 (pl)
ES (1) ES2328687T3 (pl)
MX (1) MXPA05003002A (pl)
PL (1) PL210455B1 (pl)
RU (1) RU2345062C2 (pl)
WO (1) WO2004029077A2 (pl)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101784562B (zh) * 2007-08-15 2016-07-13 诺沃-诺迪斯克有限公司 具有酰基和亚烷基二醇部分的胰岛素类似物
ES2561208T3 (es) 2008-09-12 2016-02-25 Novo Nordisk A/S Método de acilación de un péptido o una proteína
BR112012033107A2 (pt) 2010-06-23 2016-10-11 Novo Nordisk As derivados de insulina contendo ligações dissulfeto adicionais.
EP3894387A4 (en) * 2018-12-12 2023-07-19 Levim Biotech LLP ACYLATION PROCESSES FOR THE PRODUCTION OF N-SUBSTITUTED PEPTIDES

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3950517A (en) * 1970-05-08 1976-04-13 National Research Development Corporation Insulin derivatives
KR100310122B1 (ko) * 1993-09-17 2002-04-24 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 아실화된인슐린
US5646242A (en) * 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
EP0938502B1 (en) * 1996-07-11 2004-10-06 Novo Nordisk A/S Selective acylation method
JP2000517308A (ja) * 1996-08-30 2000-12-26 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｇｌｐ―２誘導体
JP3149958B2 (ja) * 1996-08-30 2001-03-26 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｇｌｐ―１誘導体
AU3247799A (en) * 1998-02-27 1999-09-15 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives of glp-1 and exendin with protracted profile of action
HUP0200297A3 (en) * 1999-03-17 2002-09-30 Novo Nordisk As Method for acylating peptides and the glutaminic acid derivatives as acylating agents
US6451974B1 (en) * 1999-03-17 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Method of acylating peptides and novel acylating agents

Also Published As

Publication number Publication date
BR0314289B8 (pt) 2021-07-27
MXPA05003002A (es) 2005-06-22
EP1546090B1 (en) 2009-06-24
BR0314289A (pt) 2005-07-26
AU2003266218A1 (en) 2004-04-19
CN100586926C (zh) 2010-02-03
ATE434602T1 (de) 2009-07-15
BRPI0314289B1 (pt) 2015-12-29
RU2345062C2 (ru) 2009-01-27
KR101131783B1 (ko) 2012-03-30
JP2006515831A (ja) 2006-06-08
ES2328687T3 (es) 2009-11-17
CA2500123A1 (en) 2004-04-08
EP1546090A2 (en) 2005-06-29
JP4468174B2 (ja) 2010-05-26
WO2004029077A2 (en) 2004-04-08
RU2005112260A (ru) 2006-10-27
DE60328112D1 (de) 2009-08-06
PL375916A1 (pl) 2005-12-12
AU2003266218B2 (en) 2009-09-03
CN1684941A (zh) 2005-10-19
WO2004029077A3 (en) 2004-05-13
KR20050038654A (ko) 2005-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9562910B2 (en) Method for producing acylated peptides
EP1163211B1 (en) Method for acylating peptides and proteins
US6451974B1 (en) Method of acylating peptides and novel acylating agents
JP5591243B2 (ja) ペプチド又はタンパク質のアシル化の方法
US20200254065A1 (en) Long-acting glp-2 analogs
WO2017160669A1 (en) Insulin-incretin conjugates
EP2820038A1 (en) Glp-1 prodrugs
PL210455B1 (pl) Sposób otrzymywania acylowanych peptydów
JP5551670B2 (ja) ペプチドのアシル化方法及び新規アシル化剤
MXPA01009209A (en) Method for acylating peptides and novel acylating agents

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification