KR20200010353A - Mic-1 화합물 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 MIC-1 화합물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 N-말단 아미노산 연장부 및 아미노산 연장부에 부착된 프로트랙터를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 포함하는 화합물에 관한 것이며, 아미노산 연장부는 3개 내지 36개의 아미노산 잔기를 포함하고, MIC-1 폴리펩티드 및 N-말단 아미노산 연장부는 함께 6.5 미만의 산출된 pI를 갖는다. 본 발명의 화합물은 MIC-1 활성을 갖는다. 본 발명은 또한 이러한 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물 뿐만 아니라, 화합물의 의학적 용도에 관한 것이다.
Description
기술 분야
본 발명은 MIC-1 화합물 및 그들의 약학적 용도에 관한 것이다.
참조에 의한 서열 목록의 통합
"SEQUENCE LISTING"이라는 명칭의 서열 목록은 205.032바이트이고, 2018년 5월 23일에 생성되었으며, 참조로서 본원에 통합된다.
대식세포 억제 사이토카인-1(MIC-1)은 활성화된 대식세포의 증가된 발현을 나타내는 실험에 기초하여 1997년에 처음 설명되었다(Bootcov 외, Proc. Natl. Acad. Sci., 1997 10월). MIC-1은 그 후에 다른 사람에 의해 확인되었으며, 태반 전환 성장 인자 베타(PTGF-β), 태반 골 형성 단백질, 성장 분화 인자-15(GDF15), 전립선 유래 인자(PDF), 비스테로이드성 항염증 약물 활성화 유전자(NAG-1) 및 PL74와 같은 몇몇 추가적인 명칭을 갖고 있다. MIC-1은 세포 성장 및 분화에 관여하는 펩티드 호르몬 패밀리인, TGF-베타 초패밀리의 먼 구성원이다. MIC-1은 24.5 kDa의 분자량을 갖는 시스테인이 풍부한 동종 이량체로서 순환한다. 인간 야생형 MIC-1은 짧은 반감기를 가지는데. 즉, wt-MIC-1을 이용한 치료는 효능을 유지하기 위해 매일 투여가 필요하다는 것을 의미한다.
축적된 증거는 비만 및 당뇨병과 같은 대사 장애에서 MIC-1의 치료 유용성을 뒷받침한다. 진행암을 가진 환자의 데이터에서 MIC-1의 순환 레벨과 상관된 중량 손실이 나타났다(Johnen 외, Nat Med., 2007 11월). MIC-1을 과발현하는 형질변환 쥐는 정상적인 저지방 식이와 고지방 식이 둘 다에서 체중 및 체지방이 줄어들었다(Macia 외, PLoS One, 2012 4월). 또한, 저지방 및 고지방 식이 둘 다 공급된 MIC-1을 과발현하는 형질변환 쥐는 비슷한 식이의 야생형 동물에 비해 개선된 포도당 내성을 가졌다.
WO 2005099746은 MIC-1 조절제를 투여함으로써 식욕 및/또는 체중을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 N-말단 아미노산 연장부 및 상기 아미노산 연장부에 부착된 프로트랙터(protractor)를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 포함하는 MIC-1 화합물에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 N-말단 아미노산 연장부 및 상기 아미노산 연장부에 부착된 프로트랙터를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 포함하며, 아미노산 연장부는 3개 내지 200개의 아미노산 잔기를 포함하고, 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 6.5 미만의 산출된 pI를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 하나의 시스테인 잔기를 갖는 N-말단 아미노산 연장부를 가지며, 프로트랙터가 시스테인 잔기에 부착된다. 이들 구현예에서, 프로트랙터는 각각의 Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 구성되고,
Chem. 1은
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1C: HOOC-벤젠-O-(CH2)y-CO-*, 및
Chem. 1D: (1H-테트라졸-5-일)-(CH2)x-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
x는 12~20의 범위 내 정수이고,
y는 5~15의 범위 내 정수이며,
Chem. 2는
Chem. 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*,
Chem. 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, 및
Chem. 2C: *-(NH-(CH2)m-cyclohexane-CO)k-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
Chem. 2의 m은 1~5의 범위 내 정수이고,
Chem. 2의 k는 0~4의 범위 내 정수이며,
Chem. 3은
* (NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l이며,
Chem. 3의 k는 1~10의 범위 내 정수이고,
n은 1~5의 범위 내 정수이고,
l은 0~5의 범위 내 정수이며,
Chem. 4는
Chem. 4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
Chem. 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
Chem. 4C: *-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NH-CO-CH2-*, 및
Chem. 4D: 
로부터 선택되며,
Chem.4의 m은 1~5의 범위 내 정수이고, n은 2~6 범위 내 정수이며;
여기서, Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3, 및 Chem. 4는 한 Chem의*-NH 말단을 또 다른 Chem의 CO-* 말단에 연결하는 아미드 결합을 통해 상호 연결되며, Chem. 4는 아미노산 연장부 시스테인 잔기의 황 원자에 연결된다.
화학식의 별표(*)는 부착 지점을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 (리신, 아르기닌, 및/또는 히스티딘과 같은) 염기성 아미노산 잔기의 수와 비교하여 적어도 3, 4, 5 또는 6개의 (아스파르트산 및/또는 글루탐산과 같은) 산성 아미노산 잔기 과잉을 갖는 N-말단 연장부를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, MIC-1 화합물은 A, C, E, G, P, S, T, Q, N 및 D로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기로 구성된 N 말단 연장부를 포함하며, 아미노산 연장부는 적어도 3개의 E 및/또는 D 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 서열번호 1의 MIC-1과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 동일성을 나타내는 MIC-1 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 서열번호 1의 MIC-1과 비교하여 처음 3개 잔기의 결실(MIC-1-Δ1~3) 또는 3번 위치 아스파라긴의 결실(des-N3)을 포함하는 MIC-1 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, MIC-1 화합물은 MIC-1 폴리펩티드 및 서열번호 87, 90, 92, 93, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 108, 109, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 164, 288, 289, 290, 291 또는 292에 따른 아미노산 서열을 갖는 N-말단 아미노산 연장부를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 음식 섭취량 및 체중 감소에 대한 MIC-1 수용체 효력 및 생체 내 효능을 유지하였다. 따라서 이들 MIC-1 화합물은 비만, 당뇨병, 심혈관 질환(예: 이상지질혈증 및 동맥경화증)과 같은 대사 장애와, 지방간염 및 당뇨성 신병증과 같은 다른 장애의 치료를 위해 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 MIC-1 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 또는 에스테르, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 대사 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 MIC-1 화합물을 제공하는데, 대사 장애는 비만, 제2형 당뇨병, 이상지질혈증 또는 당뇨성 신병증이다.
일 양태에서, 본 발명은 이상지질혈증, 동맥경화증, 비알코올성 지방간염, 또는 당뇨성 신병증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 MIC-1 화합물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 장기간 혈장 노출, 즉, 인간 야생형 MIC-1와 비교하여 연장된 반감기를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 개선된 용해도를 갖는다. 일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 개선된 화학적 안정성을 갖는다.
도 1: 단일 12량체 구성 요소로 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현. 모든 세포를 37℃ TB에서 성장시켰고, OD600이 1.0에 도달한 후 0.5mM IPTG를 첨가하여 단백질이 발현되도록 유도하였다. 세포를 하룻밤 후에 수확하고, 총 용해물을 SDS-PAGE에 로딩하여 발현 수준을 확인하였다. 야생형 인간 MIC-1(MIC-1)을 양성 대조군으로서 로딩하였다.
도 2: 이중 12량체 구성 요소로 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현. 모든 세포를 37
에서 성장시켰고, OD600이 1.0에 도달한 후 0.5mM IPTG를 첨가하여 단백질이 발현되도록 유도하였다. 세포를 하룻밤 후에 수확하고, 총 용해물을 SDS-PAGE에 로딩하여 발현 수준을 확인하였다. MIC-1을 양성 대조군으로서 로딩하였다.
도 3: a) 12량체-(4+2+_), -(4+4+_) 및 -(4+3+_)로 시작하는 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드 사이의 발현 수준 비교. 그룹 12량체-(4+3_)를 함유한 군 및 점에 의해 표시된 구조체는 MIC-1 폴리펩티드 서열에 M57L을 함유한다. b) 연장된 12량체가 발현 수준에 미치는 효과. 또한, 3.6 군의 가장 낮은 데이터 포인트는 M57L을 함유하는 MIC-1 폴리펩티드이다. 이 도면에서, "1.6 말단"은 TSTEEG를 나타내고, "2.6"은 TSESAT를 나타내고, "3.6"은 TSTEPS를 나타내고, "4.6"은 SEPATS를 나타낸다.
도 4: 12량체-(4+2+_), 12량체-(4+3+_)+M57L, 12량체-(3회 반복) 및 12량체-(4회 반복)를 함유하는 대표 물질의 SDS-PAGE. T: 총 단백질, S: 가용성 분율, P: 세포 펠릿(봉입체).
도 5: 서열 내 돌연변이를 갖는 MIC-1 폴리펩티드. 이 도면에서, MIC-1 폴리펩티드 서열은 MIC-1 Δ1~3이다. T: 총 단백질, S: 가용성 분율, P: 세포 펠릿(봉입체).
도 6: 돼지에서 약력학(PD) 연구 동안 시간 경과에 따른 체중 변화. 01: 화합물 01, 05: 화합물 05
도 2: 이중 12량체 구성 요소로 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현. 모든 세포를 37
도 3: a) 12량체-(4+2+_), -(4+4+_) 및 -(4+3+_)로 시작하는 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드 사이의 발현 수준 비교. 그룹 12량체-(4+3_)를 함유한 군 및 점에 의해 표시된 구조체는 MIC-1 폴리펩티드 서열에 M57L을 함유한다. b) 연장된 12량체가 발현 수준에 미치는 효과. 또한, 3.6 군의 가장 낮은 데이터 포인트는 M57L을 함유하는 MIC-1 폴리펩티드이다. 이 도면에서, "1.6 말단"은 TSTEEG를 나타내고, "2.6"은 TSESAT를 나타내고, "3.6"은 TSTEPS를 나타내고, "4.6"은 SEPATS를 나타낸다.
도 4: 12량체-(4+2+_), 12량체-(4+3+_)+M57L, 12량체-(3회 반복) 및 12량체-(4회 반복)를 함유하는 대표 물질의 SDS-PAGE. T: 총 단백질, S: 가용성 분율, P: 세포 펠릿(봉입체).
도 5: 서열 내 돌연변이를 갖는 MIC-1 폴리펩티드. 이 도면에서, MIC-1 폴리펩티드 서열은 MIC-1 Δ1~3이다. T: 총 단백질, S: 가용성 분율, P: 세포 펠릿(봉입체).
도 6: 돼지에서 약력학(PD) 연구 동안 시간 경과에 따른 체중 변화. 01: 화합물 01, 05: 화합물 05
본 발명은 N-말단 아미노산 연장부 및 상기 아미노산 연장부에 부착된 프로트랙터를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 포함하는 MIC-1 화합물에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 N-말단 아미노산 연장부 및 상기 아미노산 연장부에 부착된 프로트랙터를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 포함하며, 아미노산 연장부는 3개 내지 200개의 아미노산 잔기를 포함하고, MIC-1 폴리펩티드 및 아미노산 연장부는 함께 6.5 미만의 산출된 pI를 갖는다.
본 발명의 MIC-1 화합물은 생물학적으로 활성이다. 예를 들어, 이들은 강하고, MIC-1에 비해 완전한 효능을 유지하고, 또한, 장기간 혈장 노출 프로파일을 가진다. 즉, 연장된 반감기를 갖는다. 효력 및 긴 반감기의 특정한 조합은 바람직하다.
MIC-1
본원에서 사용되는 바와 같이 "MIC-1"이라는 용어는 대식세포 억제 사이토카인-1(MIC-1)을 의미하고, 또한 성장 분화 인자 15(GDF-15), 태반 골 형성 단백질(PLAB) 및 비스테로이드성 항염증 약물 활성화 유전자(NAG-1)로도 알려져 있다. MIC-1은 62 kDa 세포 내 동종 이량체 전구체 단백질로서 합성되고, 이어서 24.5 kDa 동종 이량체로 퓨린 유사 단백질 분해효소에 의해 분해된다. 전체 길이의 야생형 인간 MIC-1의 서열은 UNIPROT 데이터베이스 수탁 번호 Q99988에서 이용 가능하다. 308개 아미노산 전구체 서열은 신호 펩티드(아미노산 1-29번), 프로펩티드(아미노산 30-196번) 및 MIC-1 단량체 서열(아미노산 197-308번)을 포함한다. 112개 아미노산 MIC-1 단량체 서열은 서열번호 1로 본원에 포함된다. MIC-1 단량체는 9 개의 시스테인 잔기를 함유하며, 공유 결합된 24.5 kDa 동종 이량체를 생성하기 위해 4개의 사슬 간 이황화 결합 및 1개의 사슬 내 이황화 결합을 생기게 한다. MIC-1 단량체 서열(서열번호 1)에서 H6D에 상응하는 자연 발생 돌연변이가 설명되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "MIC-1 화합물"이라는 용어는 MIC-1 폴리펩티드, N-말단 아미노산 연장부, 및 프로트랙터를 포함하는 화합물을 지칭한다. MIC-1 화합물은 통상적으로 동종 이량체의 형태이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "MIC-1 폴리펩티드"라는 용어는 서열번호 1의 인간 MIC-1 단량체 서열 또는 이의 유사체를 의미한다. 특정 MIC-1 잔기에 대한 수치적 언급은 달리 언급되지 않는 한 112개의 아미노산 단량체 서열을 의미한다(즉, 1번 잔기는 알라닌(A1)이고, 112번 잔기는 이소류신(I112)이다).
본원에서 사용되는 바와 같이 "MIC-1 유사체(MIC-1 analogue, 또는 analogue of MIC-1)"라는 용어는 MIC-1 폴리펩티드를 의미하고, 서열번호 1의 단량체 MIC-1 서열의 아미노산 변이체이다. 즉, MIC-1 유사체는 인간 MIC-1(서열번호 1)와 비교할 때 다수의 아미노산 잔기가 변경된 MIC-1 폴리펩티드이다. 이러한 변화는 독립적으로, 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실을 나타낼 수 있다.
MIC-1 유사체는 변경되는 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 수(즉, 위치에 상응하는 MIC-1 단량체 서열(서열 번호 1)에서), 및 변경(예를 들어, 아미노산 잔기로 변경)을 참조하여 설명될 수 있다.
일 양태에서, MIC-1 유사체는 서열번호 1의 MIC-1의 기능적 변이체이다. 본 발명의 일 양태에서, MIC-1 유사체는 서열번호 1의 MIC-1과 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 나타낸다. 두 유사체 사이의 서열 동일성 결정을 위한 방법의 예로서, H6D MIC-1 및 서열 변호 1의 MIC-1의 두 펩티드를 정렬한다. 서열번호 1의 MIC-1에 상대적인 H6D MIC-1 유사체의 서열 동일성은, 정렬된 동일한 잔기의 수를 서열번호 1의 MIC-1에서 정렬된 잔기의 총 수로 나눈 값으로 주어진다. 따라서, 실시예에서, 서열 동일성 백분율은 (112-1)/112 X 100이다. MIC-1 유사체의 서열 동일성 결정 시, N-말단 아미노산 연장부는 포함되지 않는다. 적절한 정렬 프로그램은 Needleman-Wunsch 정렬인 적절한 정렬 프로그램 "니들(needle)"을 이용하여 시험될 수 있다. 이 정렬 프로그램의 알고리즘은 Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443~453에 설명되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, MIC-1 유사체는 서열 번호 1의 인간 MIC-1에 비해 15, 10 또는 5개 미만의 아미노산 변형(치환, 결실, (삽입을 포함한) 첨가, 및 이들의 임의 조합)을 포함한다. 본 출원 전체에 걸쳐 사용된 "아미노산 변형"이라는 용어는 단량체 MIC-1(서열 번호 1)과 비교하여 아미노산에 대한 변형의 의미로 사용된다. 이러한 변형은 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 한 아미노산을 다른 것 또는 펩티드의 아미노산에 공유 결합으로 부착된 치환기로의 치환의 결과일 수 있다.
치환: 일 양태에서, 아미노산은 보존적 치환으로 치환될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 "보존적 치환"이라는 용어는 하나 이상의 아미노산이 다른 생물학적으로 유사한 잔기로 대체되는 것을 나타낸다. 예로는 유사한 특성을 갖는 아미노산 잔기의 치환을 포함한다(예를 들어, 작은 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 소수성 아미노산 및 방향성 아미노산).
일 양태에서, 아미노산은 비보존적 치환으로 치환될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 "비보존적 치환"이라는 용어는 하나 이상의 아미노산이 상이한 특징을 갖는 다른 아미노산으로 대체되는 것을 나타낸다. 예로는 염기성 아미노산 잔기를 산성 아미노산 잔기로 치환, 극성 아미노산 잔기를 방향족 아미노산 잔기로 치환하는 것 등을 포함한다. 일 양태에서, 비보존적 치환은 코드화된 아미노산을 상이한 특징을 갖는 다른 코드화된 아미노산으로의 치환이다. 일 양태에서, MIC-1 유사체는 하나 이상의 비정상적인 아미노산 및/또는 비-아미노산(예컨대 아미노산 모방체)을 MIC-1의 서열 내로 치환시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 단량체 MIC-1 서열(서열 번호 1)의 3번 위치에 대응하는 위치의 아스파라긴은 세린(N3S), 글루탐산(N3E), 알라닌(N3A), 또는 글루타민(N3Q)으로 치환된다. 본 발명의 일 양태에서, 인간 MIC-1 단량체 서열(서열 번호 1)의 3번 위치에 대응하는 위치의 아스파라긴은 글루탐산(N3E)으로 치환된다.
본 발명의 일 양태에서, 인간 MIC-1 단량체 서열(서열 번호 1)의 2번 위치에 대응하는 위치의 아르기닌은 알라닌(R2A)으로 치환되었으며, 인간 MIC-1 단량체 서열(서열 번호 1)의 3번 위치에 상응하는 위치의 아스파라긴은 글루탐산(N3E)으로 치환되었다.
본 발명의 일 양태에서, 인간 MIC-1 단량체 서열(서열 번호 1)의 2번 위치에 대응하는 위치의 아르기닌은 글루탐산(R2E)으로 치환되었으며, 인간 MIC-1 단량체 서열(서열 번호 1)의 3번 위치에 상응하는 위치의 아스파라긴은 세린(N3S)으로 치환되었다.
결실 및 절단: 일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 유사체는 단독으로 또는 하나 이상의 삽입 또는 치환과 함께, MIC-1의 아미노산 서열 (서열 번호 1)로부터 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다.
아미노산이 결실된 MIC-1 유사체는 결실된 아미노산 잔기를 의미하는, "des"로 설명될 수 있고, 결실된 아미노산의 수(즉, 단량체 MIC-1(서열 번호 1)에서 상응하는 위치)가 뒤에 붙을 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 인간 단량체 MIC-1(서열 번호 1)의 3번 위치에 대응하는 위치의 아스파라긴은 결실된다(MIC-1 des-N3, 서열 번호 2). 본 발명의 일부 구현예에서, 인간 단량체 MIC-1(서열 번호 1)의 1번 위치에 대응하는 위치의 알라닌은 결실된다(MIC-1 des-A1).
N 또는 C 말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 절단된 MIC-1 유사체는 "MIC-1-Δ"로 설명될 수 있고, 결실된 아미노산 잔기의 수(들)(즉, 단량체 MIC-1(서열 번호 1)에서 상응하는 위치)가 참조에 의해 설명될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, N 말단에서 처음 3개의 잔기(A1, R2, N3)가 결실된다(MIC-1-Δ1~3, 서열 번호 3).
삽입: 일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 유사체는 하나 이상의 결실 및/또는 치환 단독으로 또는 조합으로, 인간 MIC-1의 아미노산 서열 내로 삽입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다.
일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 유사체는 하나 이상의 비정상 아미노산 및/또는 비-아미노산이 MIC-1의 서열 내로 삽입되는 것을 포함한다.
본원에서 예를 들어 사용되는 바와 같이, "단백질" 또는 "폴리펩티드"라는 용어는 아미드(또는 펩티드) 결합에 의해 상호 연결된 일련의 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭한다.
아미노산은 아민기 및 카르복실산 기를 함유하는 분자이며, 그리고, 선택적으로, 종종 측쇄로서 지칭되는, 하나 이상의 추가적인 기를 함유한다.
"아미노산"이라는 용어는 코드화된 (또는 단백질생성(proteinogenic) 또는 천연) (그 20개의 표준 아미노산 중에) 아미노산 뿐만 아니라 비코드화된 (또는 비단백질생성 또는 비천연) 아미노산을 포함한다. 코드화된 아미노산은 단백질에 자연적으로 통합되는 것이다. 표준 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것이다. 비코드화된 아미노산은 단백질에서는 발견되지 않거나, 표준 세포 기구에 의해 생성되지 않는다(예를 들어, 번역 후 변형의 대상이 될 수 있음). 다음에서, 광학 이성질체가 언급되지 않은 MIC-1 단백질의 모든 아미노산은 (달리 명시되지 않는 한) L-이성질체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
상기에서 명백한 바와 같이, 아미노산 잔기는 그들의 전체 이름, 그들의 1글자 코드 및/또는 3글자 코드에 의해 식별될 수 있다. 이 세 가지 방법은 완전히 동등하다. 독자의 편의를 위해, 단일 및 세 글자 아미노산 코드가 아래에 제공된다.
글리신: G 및 Gly; 프롤린: P 및 Pro; 알라닌: A 및 Ala; 발린: V 및 Val; 류신: L 및 Leu; 이소류신: I 및 Ile; 메티오닌: M 및 Met; 시스테인: C 및 Cys; 페닐알라닌: F 및 Phe; 티로신: Y 및 Tyr; 트립토판: W 및 Trp; 히스티딘: H 및 His; 리신: K 및 Lys; 아르기닌: R 및 Arg; 글루타민: Q 및 Gln; 아스파라긴: N 및 Asn; 글루탐산: E 및 Glu; 아스파르트산: D 및 Asp; 세린: S 및 Ser; 및 트레오닌: T 및 Thr.
N-말단 아미노산 연장
본 발명의 MIC-1 화합물은 N-말단 아미노산 연장부를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "N-말단 아미노산 연장부"라는 용어는 MIC-1 폴리펩티드의 N-말단이 펩티드 결합을 통해 N-말단 아미노산 연장부의 C-말단에 부착되는 것을 의미한다. 본원에서 "N-말단 아미노산 연장부", "N-말단 연장부", 및 "N-연장부"라는 용어는 동일한 것을 의미하며 상호교환적으로 사용된다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 N-말단에서 부착된 아미노산 연장부를 갖는 인간 MIC-1 단량체 서열(서열 번호 1), 즉 펩티드 결합을 통해 1번 위치에서 알라닌(A1)을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, N-말단 아미노산 연장부는 최대 200개 아미노산 잔기 길이이다. 본 발명의 특정 구현예에서, N-말단 아미노산 연장부는 3 내지 36개 아미노산 잔기를 갖는다.
본 발명의 일 양태에서, N-말단 아미노산 연장부는 염기성 아미노산(리신, 아르기닌, 및/또는 히스티딘) 잔기의 수와 비교하여 적어도 3, 4, 5 또는 6개의 산성 아미노산(아스파르트산 및/또는 글루탐산) 잔기 과잉을 갖는다. 산성 아미노산 잔기의 "과잉"은 산성 잔기가 염기성 잔기의 수를 초과한다는 것을 의미한다. 산성 아미노산 잔기의 과잉으로 정의된 값은 산성 잔기의 수에서 염기성 잔기의 수를 빼서 산출된다.
메티오닌은 원핵 세포(예를 들어, 박테리아, 예컨대, E.coli)에서 단백질 발현을 위한 초기 아미노산이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 초기 메티오닌은 단백질 발현 동안 단백질로부터 제거된다. 따라서, 초기 메티오닌은 MIC-1 화합물의 N-연장부의 서열에 포함되지 않는다. 그러나, 당업자는 초기 메티오닌을 코딩하는 개시 코돈이 단백질 번역 개시에 필요하고 예외 없이 단백질 발현을 위한 뉴클레오티드 서열의 바로 앞에 포함되어야 하는 것을 알고 있다.
한편, 초기 메티오닌이 있는 N-연장부를 갖는 그 MIC-1 화합물은 또한 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 이해할 수 있다.
프로트랙터
본 발명의 MIC-1 화합물은 프로트랙터를 포함한다. 프로모터는 MIC-1 폴리펩티드 또는 N-말단 아미노산 연장부의 특정 아미노산 잔기에 공유 결합으로 부착된다.
"프로트랙터"라는 용어는 연장된 혈장 노출("반감기 연장 부분(moiety)")을 부여하는 특성에 관한 것이며, 본원에서 MIC-1에 접합될 때 MIC-1의 생체 내 순환 반감기를 증가시킬 수 있는 -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2와 같은 아미노산 부위 사슬 작용기에 부착된 화학기(chemical group)를 지칭하는 것으로 이해된다. 프로트랙터의 예로는, 지방산 및 이의 유도체, 히드록시 알킬 전분(HAS)(예를 들어, 히드록시 에틸 전분(HES)), 폴리 에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(글리신x-세린y)n(HAP), 히알루론산(HA), 헤파로산 중합체(HEP), 포스포릴콜린계 중합체(PC 중합체), 플렉시머, 덱스트란, 폴리시알산(PSA), Fc 도메인, 트랜스페린, 알부민, 엘라스틴 유사 펩티드, 구조화되지 않고 반복되는 아미노 서열(예를 들어, XTEN 중합체), 알부민 결합 펩티드, CTP 펩티드, 및 이들의 임의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일부 구현예에서, MIC-1 화합물과 알부민의 결합이 단지 서서히 분해되어 활성 약학적 성분을 방출한다는 사실로 인해, 프로트랙터는 알부민과 비공유 결합을 형성하여 MIC-1 화합물의 혈액/혈장 노출 시간을 증가시킬 수 있으며, 또한 MIC-1 화합물의 작용 시간을 연장시키는 효과를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 프로트랙터를 포함하는 지방산은 알부민과 비공유 결합을 형성하여, 인간 야생형 MIC-1과 비교하여 MIC-1 화합물의 혈장 반감기를 연장시킬 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 프로트랙터는 MIC-1 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 공유 결합으로 부착된다. 일 구현예에서, 프로트랙터는 티오-에테르 결합으로도 지칭되는 황-탄소 공유결합(이 과정은 Cys-알킬화라고 지칭됨)의 형성 하에서, 시스테인 잔기의 티올기와 반응하는 할로아세트아마이드기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 프로트랙터는 황-탄소 공유결합의 형성 하에서, 시스테인 잔기의 티올기와 반응하는 말레이미드기를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 프로트랙터는 N-말단 아미노산 연장부의 N-말단 아미노산에 공유 결합으로 부착된다.
프로트랙터를 포함하는 지방산
본 발명의 일 양태에서, 프로트랙터는 각각의 Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 구성되고,
Chem. 1은
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1C: HOOC-벤젠-O-(CH2)y-CO-*, 및
Chem. 1D: (1H-테트라졸-5-일)-(CH2)x-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
x는 12~20의 범위 내 정수이고,
y는 5~15의 범위 내 정수이며,
Chem. 2는
Chem. 2A: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,
Chem. 2B: *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*, 및
Chem. 2C: *-NH-(CH2)m-사이클로헥산-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
Chem. 2의 m은 1~5의 범위 내 정수이며,
Chem. 3은
* NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*이며,
Chem. 3의 k는 1~10의 범위 내 정수이고,
n은 1~5의 범위 내 정수이며,
Chem. 4는
Chem. 4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
Chem. 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
Chem. 4C: *-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NH-CO-CH2-*, 및
Chem. 4D: 
로부터 선택되며,
Chem.4의 m은 1~5의 범위 내 정수이고, n은 2~6 범위 내 정수이거나; 또는
(화학식 I)이고,
Chem. 4는 화학식 I, II 또는 III으로 구성된 군으로부터 선택되며
(화학식 II) 또는
(화학식 III)
여기서, Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4는 아미드 결합을 통해 상호연결되고, 한 Chem의*-NH 말단을 또 다른 Chem의 CO-* 말단에 연결한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 프로트랙터는 하나의 Chem. 1, 하나의 Chem. 4, 및 하나 이상의 Chem. 2 및 Chem. 3을 포함한다. 비제한적인 예로서, 상기 프로트랙터는 하나의 Chem. 1 요소, 2개의 Chem. 2 요소, 2개의 Chem. 3 요소, 및 하나의 Chem. 4 요소로 이루어져 있다.
Chem. 2 및 Chem. 3 요소는 모두 -NH- 및 CO- 말단을 보유하여 이들이 서로 그리고 Chem. 1 또는 Chem. 4의 -CO- 또는 -NH-에 아미드 결합에 의해 연결될 수 있도록 한다. Chem. 4는 (Chem. 2 또는 Chem. 3에 아미드 결합을 형성할 수 있는) -NH- 말단을 가지고 있다. Chem. 4는 미반응 형태에서 시스테인 잔기의 티올기와 반응할 수 있는 할로아세트아미드인 -NH-CO-CH2-말단, 또는 미반응 형태에서 시스테인의 티올기와 반응할 수 있는 말레이미드인 (-N*-CO-CH2-CH**-CO)-말단(괄호는 환상 구조를 나타냄), 또는 환원성 알킬화 반응에서 N-말단 아미노기와 반응할 수 있는 알데히드를 갖는다.
x 또는 y로 정의된 Chem. 1의 탄소 사슬의 길이는 x는 12~20, y는 5~15로 달라질 수 있다. 더 짧거나 긴 버전은 프로트랙터의 상이한 유형에서 선호될 수 있다. 특정 구현예에서, Chem. 1A, *-(CH2)x-*는 직선형 알킬렌을 지칭하며, x는 (14~18과 같은 또는 16과 같은) 12~20의 범위 내 정수이다.
이 Chem. 1은 간단히 C18 이산(diacid), 즉 18개의 탄소 원자를 갖는 지방 디카르복실산으로서 지칭될 수 있다. x=16일 때, 이 연결 요소의 구조는 Chem. 1a에 상응한다: HOOC-(CH2)16-CO-*.
추가 구현예에서, Chem. 1은
Chem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*,
Chem. 1b: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*
Chem. 1c: HOOC-벤젠-O-(CH2)9-CO-*, 및
Chem. 1d: (1H-테트라졸-5-일)-(CH2)15-CO-*로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, Chem. 2는
Chem. 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* 및
Chem. 2c: *-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양태에서, 프로트랙터는 시스테인 잔기에 부착되고, 프로트랙터는 각각의 Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 구성되고,
Chem. 1은
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1C: HOOC-벤젠-O-(CH2)y-CO-*, 및
Chem. 1D: (1H-테트라졸-5-일)-(CH2)x-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
x는 12~20의 범위 내 정수이고,
y는 5~15의 범위 내 정수이며,
Chem. 2는
Chem. 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*,
Chem. 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, 및
Chem. 2C: *-(NH-(CH)2)m-사이클로헥산-CO)k-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
Chem. 2의 m은 1~5의 범위 내 정수이고,
k는 0~4의 범위 내 정수이며,
Chem. 3은
* (NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l이며,
Chem. 3의 k는 1~10의 범위 내 정수이고,
n은 1~5의 범위 내 정수이고,
l은 0~5의 범위 내 정수이며,
Chem. 4는
Chem. 4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*, 및
Chem. 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
Chem. 4의 m은 1~5의 범위 내 정수이며,
여기서, Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3, 및 Chem. 4는 한 Chem의*-NH 말단을 또 다른 Chem의 CO-* 말단에 연결하는 아미드 결합을 통해 상호 연결되며, Chem. 4의 CH2-* 말단은 아미노산 연장부 시스테인 잔기의 황 원자에 연결된다.
본 발명의 일 양태에서, 프로트랙터는 N-말단 아미노산에 부착되고, 각각의 Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 구성되고,
Chem. 1은
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1C: HOOC-벤젠-O-(CH2)y-CO-*, 및
Chem. 1D: (1H-테트라졸-5-일)-(CH2)x-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
x는 12~20의 범위 내 정수이고,
y는 5~15의 범위 내 정수이며,
Chem. 2는
Chem. 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*,
Chem. 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, 및
Chem. 2C: *-(NH-(CH)2)m-사이클로헥산-CO)k-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
Chem. 2의 m은 1~5의 범위 내 정수이고,
k는 0~4의 범위 내 정수이며,
Chem. 3은
* (NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l이며,
Chem. 3의 k는 1~10의 범위 내 정수이고,
n은 1~5의 범위 내 정수이고,
l은 0~5의 범위 내 정수이며,
Chem. 4는 화학식 I, II 또는 III으로 구성된 군으로부터 선택되며,
(화학식 I)
(화학식 II) 또는
(화학식 III)
여기서, Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3, 및 Chem. 4는 한 Chem의*-NH 말단을 또 다른 Chem의 CO-* 말단에 연결하는 아미드 결합을 통해 상호 연결되며, Chem. 4의 CH2-* 말단은 아미노산 연장부 N-말단의 알파-아미노기에 연결된다.
명명법은 당업계에서 통상적인 바와 같으며, 예를 들어 상기 화학식에서 *-CO-*는 (*-C(=O)-*) 카르보닐을 지칭한다. 벤젠은 고리 구조를 지칭하며, Chem. 1C는 -O-(CH2)x-* 및 -COOH 각각에 의해 C1 및 C3 또는 C4에서 치환된다. HO-S(=O)2-*는 설폰산 기를 말한다.
본 발명의 화합물/프로트랙터는 동일한 분자식 및 결합 원자 서열을 갖는 상이한 입체 이성질체 형태로 존재할 수 있지만, 공간에서의 그 원자의 3차원 배향만 상이할 수 있다. 본 발명의 예시된 화합물/프로트랙터의 입체 이성질 현상은 표준 명명법을 사용하여, 명칭 및 구조로 실험 섹션에 나타나 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본 발명은 청구된 화합물/프로트랙터의 모든 입체 이성질체 형태에 관한 것이다.
등전점(pI)
N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 산출된 pI는 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 순 산출 전하가 0인 pH로서 정의된다. pH의 함수로서 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 산출된 전하는 표 1 및 B. Skoog and A. Wichman(Trends in Analytical Chemistry, 1986, vol. 5, pp. 82~83)에 의해 설명된 식에서 기술된 아미노산 잔기의 pKa 값을 사용하여 얻어진다. 시스테인(Cys)의 측쇄 pKa는 자유 설프히드릴기를 갖는 시스테인에 대한 전하 계산에만 포함된다. 예로서, 동종 이량체로서 인간 야생형 MIC-1의 산출된 pI값은 8.8이다.
본원에 기술된 바와 같이, N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드에 대한 pI 계산은 동종 이량체에서 이루어진다.
기능적 특성
일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 양호한 생체 물리학적 특성을 갖는다.
본 발명의 MIC-1 화합물은 생물학적으로 활성이다. 예를 들면, 이들은 효력이 있고, MIC-1 수용체 복합체에 결합하여, 활성화시킨다. 또한, MIC-1 화합물은 더 긴 반감기로 정의된 연장된 플라즈마 노출을 나타낸다. 예를 들어, MIC-1 화합물은 MIC-1(서열번호 1)과 비교하여 랫트 및/또는 미니피그에 i.v.로 투여시 현저히 긴 혈장 반감기를 갖는다. 유지되는 수용체 효능 및 긴 혈장 반감기의 특정 조합은 매우 바람직할 수 있다.
시험관 내 활성
일 양태에서, 본 발명의 화합물은 인간 MIC-1(서열 번호 1)에 비해 MIC-1 수용체 효력이 유지되었다. 수용체 효력과 효능은 인간 (hGFRAL, GDNF군 수용체 알파 유사) MIC-1 수용체 및 이의 신호 전달 공동 수용체 hRET (원암 유전자 티로신-단백질 키나아제 수용체, Ret)로 형질감염된 포유류 세포에서 측정될 수 있다. 수용체 복합체의 MIC-1 화합물 활성은 실시예 6에 기술된 바와 같이 세포외 신호 조절 키나아제(ERK)의 인산화에 의해 측정된다.
본원에 기술된 바와 같이, 수용체 효력과 효능은 MIC-1 화합물에 대하여 동종이량체로 측정된다.
생체 내 생물학적 활성
일 양태에서, 본 발명의 화합물은 생체 내에서 효력이 있으며, 이는 임의의 적합한 동물 모델에서 당업계에 알려진 바대로 결정될 수 있다.
비만이 아닌 스프라구돌리(Sprague Dawley) 랫트는 적합한 동물 모델의 일례이고, 음식 섭취량의 변화는 예를 들어, 실시예 14에 기술된 바와 같이, 이러한 랫트 생체 내에서 결정될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 화합물은 비만이 아닌 스프라구돌리 랫트에서 생체 내 음식 섭취량을 억제한다.
생체 내 혈장 반감기
일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 연장되고 길어진 생체 내 혈장 반감기를 가지며, 이는 적절한 약동학적 생체 내 연구에서 결정될 수 있다.
길어진 혈장 노출은 랫트 또는 미니피그와 같은 동물에게 i.v. 투여 후 혈장 반감기(T½)로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 적어도 10시간, 더 바람직하게는 25~50시간 사이, 또는 가장 바람직하게는 적어도 50시간 랫트에게 i.v. 투여 후, 실시예 16에 기술된 바와 같이 결정된 혈장 반감기를 가진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 적어도 50시간, 더 바람직하게는 50~200시간 사이, 더욱 바람직하게는 적어도 200시간, 또는 가장 바람직하게는 적어도 300시간 미니피그에게 i.v. 투여 후, 실시예 17에 기술된 바와 같이 결정된 혈장 반감기를 가진다.
제3 양태에 따르면, 본 발명의 화합물은 연장됨과 동시에 생체 내 효력을 유지한다. 유지되는 효력 및 긴 혈장 반감기의 특정 조합은 매우 바람직할 수 있다.
용해도
인간 야생형 MIC-1은 소수성 단백질이며, 동종 이량체 기준으로 8.8의 산출된 pI를 가진다. 결과적으로, 야생형 MIC-1은 중성 pH 수성 완충계에서 약 0.5 mg/ml로만 가용화될 수 있다. MIC-1의 낮은 용해도는 이의 약학적 제형 특성 및 치료적 사용을 상당히 방해하므로, 개선된 용해도를 갖는 MIC-1 화합물을 개발하는 것은 치료적 유용성을 크게 개선시킬 것이다.
일 양태에서, 본 발명의 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 인간 MIC-1에 비해 개선된 용해도(즉, 더 가용성인)를 갖는다.
본원에 기술된 바와 같이, 용해도는 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 pH8.0 Tris 완충액에서 적어도 1 mg/ml의 용해도를 갖는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 pH8.0 Tris 완충액에서 적어도 5 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 또는 적어도 40 mg/ml의 용해도를 갖는다.
MIC-1 화합물을 제조하기 위해 프로트랙터를 첨가하는 것은 N-연장부를 갖는 상응하는 MIC-1 폴리펩티드를 대상으로 측정된 것의 개선된 용해도를 현저하게 변경시키지 않는다(실시예 12).
본원에 기술된 바와 같이, 용해도는 MIC-1 화합물 및 동종이량체로서 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드에 대해 측정되었다.
안정성
인간 야생형 MIC-1 서열은 화학적으로 불안정하고, 아미노산 서열의 여러 잔기는 3번 위치 아스파라긴(N3)에서 탈아미드화 및 M43, M57 및 M86 메티오닌의 산화를 포함하여, 저장 동안에 변형될 수 있다. 특정 잔기의 화학적 불안정성은 약학적 특성에 영향을 줄 수 있으므로, 화학적 안정한 MIC-1 화합물을 개발하는 것은 MIC-1 치료 화합물을 제조하는 것의 또 다른 중요 부분일 것이다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물은 서열번호 1의 인간 MIC-1에 비해 개선된 화학적 안정성을 갖는다.
"화학적 안정성(chemical stability)"이라는 용어는 온전한 폴리펩티드와 비교할 때 감소된 생물학적 활성, 감소된 용해도, 및/또는 증가된 면역원성 효과를 잠재적으로 갖는 화학적 분해 산물의 형성을 초래하는 폴리펩티드 구조의 화학적 변화를 나타낸다. 화학적 안정성은 상이한 환경 조건에 노출한 후에 다양한 시점에서 화학적 분해 산물의 양을 측정함으로써 (예를 들어, SEC-HPLC, 및/또는 RP-HPLC에 의해) 평가될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, MIC-1 단량체 서열(서열 번호 1)의 특정 잔기는, 예를 들어, MIC-1 화합물의 화학적 안정성을 증가시키기 위해 치환에 의해, 변형된다. 탈아미드화를 피하기 위해, N3은 결실되거나 다른 아미노산, 예를 들어, E 또는 Q로 치환된다. 산화를 감소시키기 위해, 메티오닌은 다른 아미노산, 예를 들어, E 또는 L로 치환된다.
면역원성
일 양태에서, 본 발명의 MIC-1 화합물은 면역원성 위험이 낮다.
생산 공정
본 발명의 N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 재조합 단백질 기술의 방법에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로, 관심있는 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 핵산 서열은 N-연장부를 갖는 원하는 MIC-1 폴리펩티드를 암호화하기 위해 변형된다. 이러한 변형된 서열은 그 다음에 발현 벡터 내에 삽입되고, 이는 차례로 발현 숙주 세포 내로 형질전환되거나 형질감염된다.
N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 구조체는 적절하게는 게놈, cDNA 또는 합성 기원일 수 있다. 아미노산 서열 변경은 잘 알려진 기술에 의해 유전자 코드의 변형에 의해 이뤄진다.
N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 일반적으로 재조합 벡터 내에 삽입되는데, 이는 임의의 벡터일 수 있으며, 통상적으로 재조합 DNA 절차를 거칠 수 있고, 벡터의 선택은 종종 도입될 숙주 세포에 의존할 것이다. 따라서, 벡터는 자가 복제 벡터, 즉, 염색체 외 독립체로서 존재하는 벡터일 수 있고, 복제는 염색체 복제와 무관하다(예를 들어, 플라스미드). 대안적으로, 숙주 세포 내로 도입될 때, 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 통합되고 통합되는 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다.
벡터는 바람직하게는 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 암호하하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 요구되는 추가 분절에 작동 가능하게 연결되는 발현 벡터이다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는, 분절이 의도된 목적을 위해 함께 기능하도록 배열되는 것을 나타낸다(예를 들어, 전사는 프로모터에서 시작하고 종결자 내에서 종결될 때까지 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 통해 진행한다).
따라서, N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 발현할 때 사용하는 발현 벡터는 클로닝된 유전자 또는 cDNA의 전사를 개시하고 유도할 수 있는 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있고, 숙주 세포에 상동의(homologous) 또는 이종 유래의(heterologous) 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유도될 수도 있다.
추가적으로, N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현에 대한 발현 벡터는 또한 종결자 서열, 전사를 종결하도록 숙주 세포에 의해 인식되는 서열을 포함할 것이다. 종결자 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동 가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능하는 임의의 종결자가 본 발명에서 사용될 수 있다.
N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현은 숙주 세포의 세포질에서의 세포 내 발현을 목표로 하거나 또는 증식 배지로의 세포 외 발현을 위한 분비 경로로 유도될 수 있다.
세포내 발현은 기본 경로이며, 프로모터를 포함하는 DNA 서열, 다음에 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열, 다음에 종결자를 갖는 발현 벡터를 필요로 한다.
숙주 세포의 분비 경로로 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 서열을 보내기 위해, MIC-1 서열의 연장으로서 (신호 펩티드 또는 사전 서열로도 알려진) 분비 신호 서열을 필요로 한다. 신호 펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 정확한 판독 프레임에서 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 결합된다. 신호 펩티드는 일반적으로 단백질과 연관되거나, 또 다른 분비 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드, 프로모터, 종결자 및/또는 분비 신호 서열, 각각을, 코딩하는 DNA 서열을 묶기 위해, 그리고 복제에 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터 내로 이들을 삽입하기 위해 사용되는 절차는 당업자에게 잘 알려져 있다(참조, 예를 들어, Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열이 도입되는 숙주 세포는, 세포 내 또는 외로 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 함유하고, N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하의 적합한 영양 배지에서 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포의 비제한적인 예는, 대장균, 효모 뿐만 아니라 인간 배아 신장(HEK), 아기 햄스터 신장(BHK) 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 번역 후 변형을 필요로 하면, 적합한 숙주 세포로는 효모, 곰팡이, 곤충 및 포유류 세포와 같은 고등의 진핵 세포를 포함한다.
일단 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드가 숙주 유기체에서 발현되었다면, 이는 통상의 기술에 의해 요구되는 품질로 회수 및 정제될 수 있다. 이러한 통상적인 회수 및 정제 기술의 비제한적인 예는 원심분리, 가용화, 여과, 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 고정된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC), 역상-고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 겔 여과 및 동결 건조이다.
MIC-1 단백질의 재조합 발현 및 정제의 예는, 예를 들어, Cordingley 외, J. Virol. 1989, 63, pp5037~5045; Birch 외, Protein Expr Purif., 1995, 6, pp 609~618 및 WO2008/043847에서 찾을 수 있다.
MIC-1 단백질의 미생물 발현 및 정제의 예는 예컨대 Chich 외, Anal. Biochem, 1995, 224, pp 245~249 및 Xin 외, 단백질 Expr. Purif. 2002, 24, pp530~538에서 찾을 수 있다.
본 발명의 N-확장부를 갖는 다수의 MIC-1 폴리펩티드를 제조하는 방법의 구체적인 예는 실험 부분에 포함된다.
봉입체 및 단백질 발현
N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 E. coli와 같은 세균에서 발현될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, N-확장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 대규모 단백질 생산은 봉입체(IB)를 사용하여 이뤄질 수 있는데, 이것이 공정 회수, 단백질 순도, 단백질 분해효소 분해 및 일반적인 단백질 안정성을 제어하는 것에 대해 유리한 접근을 나타내기 때문이다. 이는 대규모 단백질 생산에 특히 중요해진다. IB의 품질에 있어서 매우 중요한 것은 산출된 pI 및 IB 형성에 의해 부분적으로 제어되는 N-연장부 용해도를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 균형이다.
투여 모드
투여 경로는 본 발명의 화합물을 체 내에 원하는 또는 적절한 장소로 효율적으로 전달하는, 비경구(예를 들어, 피하, 근육 내 또는 정맥 내)와 같은, 임의의 경로일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 화합물은 경구로, 폐로, 직장으로, 경피로, 구강으로, 설하로, 또는 비강으로 투여될 수 있다.
투여될 본 발명의 화합물의 양, 본 발명의 화합물을 투여하는 빈도의 결정, 및 임의로 또 다른 약학적 활성제와 함께 투여할 본 발명의 화합물 또는 화합물들들의 선택은 비만 및 관련 장애의 치료에 익숙한 전문의와 상담하여 결정 된다.
약학적 조성물
본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 또는 에스테르, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물들이 당업계에 열려진된 바와 같이 제조될 수도 있다.
"부형제"라는 용어는 활성 치료 성분 이외의 임의의 성분을 광범위하게 가리킨다. 부형제는 불활성 물질, 비활성 물질, 및/또는 약이 아닌 활성 물질일 수 있다.
부형제는 다양한 목적, 예를 들어, 담체, 비히클, 희석제, 정제 보조제로서, 및/또는 투여 및/또는 활성 물질의 흡수를 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
다양한 부형제를 갖는 약학적 활성 성분의 제형은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g. 19th edition (1995), 및 이후 버전) 참조).
병용 치료
본 발명에 따른 화합물을 이용한 치료는 또한 하나 이상의 약학적 활성 물질(예를 들어, 항비만제, 식욕 조절제, 및 비만으로 야기되거나 연관된 합병증 및 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 제제로부터 선택된)과 병용될 수 있다.
약학적 징후
일 양태에서, 본 발명은 약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 화합물에 관한 것이다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 화합물은 하기의 의학적 치료에 사용될 수 있다:
(i) 예를 들어, 음식 섭취량 감소, 체중 감소, 식욕 억제 및/또는 포만감 유발에 의한 섭식 장애(예: 비만)의 예방 및/또는 치료
(ii) 고혈당, 인슐린 저항성 및/또는 내당능 장애의 예방 및/또는 치료.
(iii) 이상지질혈증의 예방 및/또는 치료.
일부 구현예에서, 본 발명은 체중 관리 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 식욕 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 음식 섭취량 감소 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 비만으로 고통받는 모든 대상체는 또한 과체중으로 고통받는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비만의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비만의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 MIC-1 화합물의 사용에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 비만으로 고통받는 대상체는 성인 인간 또는 (영아, 어린이, 및 청소년을 포함하는) 소아 인간과 같은 인간이다. 체질량 지수(BMI)는 키와 체중을 기준으로 한 체지방의 척도이다. 산출 공식은 BMI = 체중 kg/(키 m)2이다. 비만으로 고통받는 인간 대상은 30 이상의 BMI를 가지며, 또한 비만으로 언급될 수 있다. 일부 구현예에서, 비만으로 고통받는 인간 대상체는 35 이상의 BMI 또는 30 이상 내지 40 미만 범위의 BMI를 갖는다. 일부 구현예에서, 비만은 중증 비만 또는 병적 비만이며, 인간 대상체는 40 이상의 BMI를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 적어도 하나의 체중 관련 동반 질병의 존재 하에, 과체중의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 적어도 하나의 체중 관련 동반 질병의 존재 하에, 과체중의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 MIC-1 화합물의 사용에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 과체중으로 고통받는 대상체는 성인 인간 또는 (영아, 어린이, 및 청소년을 포함하는) 소아 인간과 같은 인간이다. 일부 구현예에서, 과체중으로 고통받는 인간 대상체는, 27 이상의 BMI와 같은, 25 이상의 BMI를 갖는다. 일부 구현예에서, 과체중으로 고통받는 인간 대상체는 25 이상 내지 30 미만의 범위 또는 27 이상 내지 30 미만의 범위의 BMI를 갖는다. 일부 구현예에서, 중량-관련 동반 질병은 고혈압, (제2형 당뇨병과 같은) 당뇨병, 이상지연혈증, 고콜레스테롤, 및 폐색성 수면 무호흡증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 체중 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 체중 감소를 위해 본 발명의 MIC-1 화합물의 사용에 관한 것이다. 본 발명에 따른 체중 감소의 대상이 되는 인간은, 27 이상의 BMI 또는 30 이상의 BMI와 같은, 25 이상의 BMI를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 체중 감소의 대상이 되는 인간은 35 이상의 BMI 또는 40 이상의 BMI를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 동맥경화증과 같은 심혈관 질환 및 지방간염, 및 당뇨성 신병증과 같은 다른 장애의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상을 하나 또는 하나 이상으로, 즉, 적어도 하나라고 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예로서, "MIC-1 폴리펩티드(a MIC-1 polypeptide)"는 하나의 MIC-1 폴리펩티드 또는 하나 이상의 MIC-1 폴리펩티드를 의미한다.
화학식에서 별표(*)는 부착 지점을 나타낸다.
특정 구현예
본 발명은 하기 본 발명의 제한 없는 구현예에 의해 추가로 기술된다:
1. N-말단 아미노산 연장부 및 프로트랙터를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 포함하는 MIC-1 화합물로서, 프로트랙터는 아미노산 연장부에 부착된, MIC-1 화합물.
2. 구현예 1에 있어서, 화합물은 동종 이량체인, MIC-1 화합물.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, N-말단 아미노산 연장부는 시스테인 잔기를 포함하고, 프로트랙터는 시스테인 잔기에서 아미노산 연장부에 부착되는, MIC-1 화합물.
4. 구현예 3에 있어서, 프로트랙터는 각각의 Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 구성되고,
Chem. 1은
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1C: HOOC-벤젠-O-(CH2)y-CO-*, 및
Chem. 1D: (1H-테트라졸-5-일)-(CH2)x-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
x는 12~20의 범위 내 정수이고,
y는 5~15의 범위 내 정수이며,
Chem. 2는
Chem. 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*,
Chem. 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, 및
Chem. 2C: *-(NH-(CH)2)m-사이클로헥산-CO)k-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
Chem. 2의 m은 1~5의 범위 내 정수이고,
k는 0~4의 범위 내 정수이며,
Chem. 3은
* (NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l이며,
Chem. 3의 k는 1~10의 범위 내 정수이고,
n은 1~5의 범위 내 정수이고,
l은 0~5의 범위 내 정수이며,
Chem. 4는
Chem. 4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*, 및
Chem. 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
Chem. 4C: *-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NH-CO-CH2-*, 및
Chem. 4D: 
로부터 선택되며,
Chem.4의 m은 1~5의 범위 내 정수이고, n은 2~6 범위 내 정수이며; 그리고
여기서, Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3, 및 Chem. 4는 한 Chem의*-NH 말단을 또 다른 Chem의 CO-* 말단에 연결하는 아미드 결합을 통해 상호 연결되며, Chem. 4의 CH2-* 말단은 아미노산 연장부 시스테인 잔기의 황 원자에 연결되는, MIC-1 화합물.
5. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 프로트랙터는 아미노산 연장부의 N-말단 아미노산에 부착된, MIC-1 화합물.
6. 구현예 3에 있어서, 프로트랙터는 각각의 Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 구성되고,
Chem. 1은
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1C: HOOC-벤젠-O-(CH2)y-CO-*, 및
Chem. 1D: (1H-테트라졸-5-일)-(CH2)x-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
x는 12~20의 범위 내 정수이고,
y는 5~15의 범위 내 정수이며,
Chem. 2는
Chem. 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*,
Chem. 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, 및
Chem. 2C: *-(NH-(CH)2)m-사이클로헥산-CO)k-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
Chem. 2의 m은 1~5의 범위 내 정수이고,
k는 0~4의 범위 내 정수이며,
Chem. 3은
* (NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l이며,
Chem. 3의 k는 1~10의 범위 내 정수이고,
n은 1~5의 범위 내 정수이고,
l은 0~5의 범위 내 정수이며,
Chem. 4는 화학식 I, II 또는 III으로 구성된 군으로부터 선택되며,
(화학식 I)
(화학식 II) 또는
(화학식 III).
여기서, Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3, 및 Chem. 4는 한 Chem의*-NH 말단을 또 다른 Chem의 CO-* 말단에 연결하는 아미드 결합을 통해 상호 연결되며, Chem. 4의 CH2-* 말단은 아미노산 연장부 N-말단의 아미노기에 연결되는, MIC-1 화합물.
7. 구현예 4 및 구현예 6 중 어느 한 예에 있어서, Chem. 1은:
Chem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*,
Chem. 1b: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*
Chem. 1c: HOOC-벤젠-O-(CH2)9-CO-*, 및
Chem. 1d: (1H-테트라졸-5-일)-(CH2)15-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되는, MIC-1 화합물.
8. 구현예 4, 구현예 6 내지 구현예 7 중 어느 한 예에 있어서, Chem. 2는:
Chem. 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* 및
Chem. 2c: *-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되는, MIC-1 화합물.
9. 구현예 4, 구현예 6 및 구현예 7 중 어느 한 예에 있어서, Chem. 2~Chem. 3은 하기의 화학식 IV이며,
(화학식 IV)
n은 0~3이고, m은 0~3인, MIC-1 화합물.
10. 구현예 4 및 구현예 7 내지 구현예 9 중 어느 한 예에 있어서, Chem. 4는:
Chem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-* 및
Chem. 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*로 구성된 군으로부터 선택되는, MIC-1 화합물.
11. 구현예 4 및 구현예 7 내지 구현예 9 중 어느 한 예에 있어서, Chem. 4는 화학식 V, VI 또는 VII로 구성된 군으로부터 선택되며,
(화학식 V)
(화학식 VI)
(화학식 VII)
n은 1~4인, MIC-1 화합물.
12. 구현예 4 및 구현예 7 내지 구현예 9 중 어느 한 예에 있어서, Chem. 4는 하기의 화학식 VIII이며,
(화학식 VIII)
p는 1~5이고, q는 1~5인, MIC-1 화합물.
13. 구현예 1 내지 구현예 3 및 구현예 5 중 어느 한 예에 있어서, 프로프랙터는 화학식 IX, 화학식 X, 화학식 XI, 화학식 XII 및 화학식 XIII으로 구성된 군으로부터 선택되는, MIC-1 화합물.
(화학식 IX)
(화학식 XI).
(화학식 XII),
(화학식 XIII).
14. 구현예 1 내지 구현예 3 및 구현예 5 중 어느 한 예에 있어서, 프로트랙터는 생체에 적합한 지방산 및 이의 유도체, 히드록시 알킬 전분(HAS)(예를 들어, 히드록시 에틸 전분(HES)), 폴리 에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(글리신x-세린y)n(HAP), 히알루론산(HA), 헤파로산 중합체(HEP), 포스포릴콜린계 중합체(PC 중합체), 플렉시머, 덱스트란, 폴리시알산(PSA), Fc 도메인, 트랜스페린, 알부민, 엘라스틴 유사 펩티드, XTEN 중합체, 알부민 결합 펩티드, CTP 펩티드, 및 이들의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된, MIC-1 화합물.
15. 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 6.5 미만의 산출된 pI를 갖는, MIC-1 화합물.
16. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 6.1 미만인, MIC-1 화합물.
17. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 6.0 미만인, MIC-1 화합물.
18. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 또는 5.2, 5.1, 또는 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1 또는 4.0 미만인, MIC-1 화합물.
19. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 4.7 초과인, MIC-1 화합물.
20. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 4.8 초과인, MIC-1 화합물.
21. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 4.9 초과인, MIC-1 화합물.
22. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 5.0 초과인, MIC-1 화합물.
23. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 5.1 초과인, MIC-1 화합물.
24. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 6.5~3.0, 6.5~3.5, 6.5~4.0, 6.1~3.0, 6.1~3.5, 6.1~4.0, 6.1~4.7, 6.1~4.9, 6.1~5.0, 6.1~5.1, 6.0~3.0, 6.0~3.5, 6.0~4.0, 5.9~3.0, 5.9~3.5, 5.9~4.0, 5.9~5.0, 5.9~5.1, 5.8~3.0, 5.8~3.5, 5.8~4.0, 5.8~5.1, 5.8~5.2, 5.5~3.0, 5.5~3.5, 5.5~4.0, 또는 5.0~4.0의 범위인, MIC-1 화합물.
25. 구현예 15에 있어서, 산출된 pI는 5.8~5.2의 범위인, MIC-1 화합물.
26. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 3 내지 200개의 아미노산 잔기를 포함하는, MIC-1 화합물.
27. 구현예 1 내지 구현예 26 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 길이에 있어서 아미노산 잔기가 3~100, 3~50, 3~40, 3~30, 5~100, 5~50, 5~40, 5~30, 10~100, 10~50, 10~40, 10~30, 3~36, 3~30, 3~25, 3~24, 3~12, 4~36, 4~30, 4~24, 4~12, 5~36, 5~30, 5~24, 5~12, 6~36, 6~30, 6~24, 6~12, 7~36, 7~30, 7~24, 7~12, 8~36, 8~30, 8~24, 8~12, 30~36, 32~36, 30~34, 또는 30~32개의 범위인, MIC-1 화합물.
28. 구현예 1 내지 구현예 27 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 길이에 있어서 아미노산 잔기가 3 내지 36개 또는 30 내지 32개의 범위인, MIC-1 화합물.
29. 구현예 1 내지 구현예 28 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 염기성 아미노산(리신, 아르기닌, 또는 히스티딘) 잔기의 수와 비교하여 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 산성 아미노산(아스파르트산 또는 글루탐산) 잔기 과잉을 갖는, MIC-1 화합물.
30. 구현예 1 내지 구현예 29 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 염기성 아미노산(리신, 아르기닌, 또는 히스티딘) 잔기의 수와 비교하여 산성 아미노산(아스파르트산 또는 글루탐산) 잔기의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 75% 과잉을 포함하는, MIC-1 화합물.
31. 구현예 30에 있어서, 아미노산 연장부는 적어도 10%의 산성 아미노산 잔기를 포함하는, MIC-1 화합물.
32. 구현예 30에 있어서, 아미노산 연장부는 적어도 15%의 산성 아미노산 잔기를 포함하는, MIC-1 화합물.
33. 구현예 11에 있어서, 아미노산 연장부는 적어도 25%의 산성 아미노산 잔기를 포함하는, MIC-1 화합물.
34. 구현예 1 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 A, C, E, G, P, S, T, Q, N 및 D로 구성된 군 사이에서 선택된 아미노산 잔기로 구성되고, 아미노산 연장부는 적어도 3개의 E 및/또는 D 아미노산 잔기를 포함하는, MIC-1 화합물.
35. 구현예 34에 있어서, 아미노산 연장부는 아미노산 잔기 A, C, E, G, P, S 및 T로 구성된, MIC-1 화합물.
36. 구현예 35에 있어서, 아미노산 연장부는 적어도 3개의 E 및 적어도 1개의 P를 포함하는, MIC-1 화합물.
37. 구현예 36에 있어서, 아미노산 연장부는 적어도 6개의 세린, 4개의 프롤린, 4개의 글리신, 4개의 트레오닌, 4개의 글루탐산 및 2개의 알라닌을 포함하는, MIC-1 화합물.
38. 구현예 37에 있어서, 상기 아미노산 연장부는 SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG 및 SEPATSGSETPG로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 2개를 포함하고, 아미노산 연장부의 아미노산 중 하나는 시스테인으로 대체되는, MIC-1 화합물.
39. 구현예 38에 있어서, 아미노산 연장부는 SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG 또는 SEPATSGSETPG의 (처음 6~8개의 아미노산 잔기, 마지막 6~8개의 잔기 또는 내부 6~8개의 잔기와 같은) 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 추가로 포함하며, 아미노산 연장부의 아미노산 중 하나는 시스테인으로 대체되는, MIC-1 화합물.
40. 구현예 3 내지 구현예 39 중 어느 한 예에 있어서, 시스테인은 N-말단 아미노산 연장부의 임의의 위치에 위치하는, MIC-1 화합물.
41. 구현예 40에 있어서, N-말단 연장부의 시스테인 잔기와 MIC-1 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 사이의 거리는 (N-말단 연장부의 시스테인 잔기는 포함하나, MIC-1 폴리펩티드의 N-말단 아미노산은 포함하지 않는) 적어도 1, 3, 5, 10, 15, 19, 23, 26, 29, 또는 32개 아미노산인, MIC-1 화합물.
42. 구현예 40에 있어서, N-말단 연장부의 시스테인 잔기와 MIC-1 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 사이의 거리는 (N-말단 연장부의 시스테인 잔기는 포함하나, MIC-1 폴리펩티드의 N-말단 아미노산은 포함하지 않는) 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개 아미노산인, MIC-1 화합물.
43. 구현예 42에 있어서, N-말단 연장부의 시스테인 잔기와 MIC-1 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 사이의 거리는 (N-말단 연장부의 시스테인 잔기는 포함하나, MIC-1 폴리펩티드의 N-말단 아미노산은 포함하지 않는) 26 내지 29개 아미노산인, MIC-1 화합물.
44. 구현예 1 내지 구현예 43 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 S로 시작하는, MIC-1 화합물.
45. 구현예 1 내지 구현예 44 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 SE로 시작하는, MIC-1 화합물.
46. 구현예 1 내지 구현예 45 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 SEP로 시작하는, MIC-1 화합물.
47. 구현예 1 내지 구현예 46 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물:
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS (서열 번호 223),
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPS (서열 번호 224),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS (서열 번호 240),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTE (서열 번호 241),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPG (서열 번호 242),
SEPCTSGSETPGTSESATPES (서열 번호 243),
SEPCTSGSETPG (서열 번호 244),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP (서열 번호 245),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP (서열 번호 246),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP (서열 번호 247),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT (서열 번호 248),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT (서열 번호 249),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT (서열 번호 250),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE (서열 번호 251),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE (서열 번호 252),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE (서열 번호 253),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS (서열 번호 254),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS (서열 번호 255),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS (서열 번호 256),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG (서열 번호 257),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG (서열 번호 258),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG (서열 번호 259),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG (서열 번호 260),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG (서열 번호 261),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG (서열 번호 262),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG (서열 번호 263),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG (서열 번호 264),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG (서열 번호 265),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG (서열 번호 266),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG (서열 번호 267),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG (서열 번호 268),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG (서열 번호 269),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 270),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG (서열 번호 271),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 272),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG (서열 번호 273),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 274),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG (서열 번호 275),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 276),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG (서열 번호 277),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 278),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG (서열 번호 279),
SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 280),
SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG (서열 번호 281),
SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 282),
SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG (서열 번호 283),
GPCEGPSEGPSEGPSEGPSEGPSEGPSE (서열 번호 284),
GECPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQP (서열 번호 285),
PACEEEDDPDGGGSGGGSGGGS (서열 번호 286),
PDECTEEETEGGGSGGGSGGGS (서열 번호 287),
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 226),
SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 227),
SEPACSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 229),
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 230),
SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 231),
SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 232),
SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 233),
SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 234),
SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 235),
SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEG (서열 번호 236),
SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEG (서열 번호 237),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSCEPSEG (서열 번호 238),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPCEG (서열 번호 239).
48. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 A, E, G, P, S, T, D, N, 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 구성되며, 여기서 상기 아미노산 연장은 적어도 3개의 E 및/또는 D 아미노산 잔기를 포함하는, MIC-1 화합물.
49. 구현예 1 내지 구현예 48 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는A, E, G, P, S, T, Q 및 D로 구성된 군 사이에서 선택된 아미노산 잔기로 구성되고, 아미노산 연장부는 적어도 3개의 E 및/또는 D 아미노산 잔기를 포함하는, MIC-1 화합물.
50. 구현예 48 또는 구현예 49에 있어서, 아미노산 연장부는 적어도 3개의 E 및 적어도 1개의 P를 포함하는, MIC-1 화합물.
51. 구현예 50에 있어서, 아미노산 연장부는 S, G, T 및 A를 추가로 포함하는, MIC-1 화합물.
52. 구현예 51에 있어서, 아미노산 연장부는 6개의 세린, 4개의 프롤린, 4개의 글리신, 4개의 트레오닌, 4개의 글루탐산 및 2개의 알라닌을 포함하는, MIC-1 화합물.
53. 구현예 51에 있어서, 상기 아미노산 연장부는 SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG 및 SEPATSGSETPG로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 2개를 포함하는, MIC-1 화합물.
54. 구현예 53에 있어서, 아미노산 연장부는 SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG 또는 SEPATSGSETPG의 (처음 6~8개의 아미노산 잔기, 마지막 6~8개의 잔기 또는 내부 6~8개의 잔기와 같은) 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 추가로 포함하는, MIC-1 화합물.
55. 구현예 48 내지 구현예 54 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 S로 시작하는, MIC-1 화합물.
56. 구현예 55에 있어서, 아미노산 연장부는 SE로 시작하는, MIC-1 화합물.
57. 구현예 56에 있어서, 아미노산 연장부는 SEP로 시작하는, MIC-1 화합물.
58. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열을 하나 이상 포함하는, MIC-1 화합물:
SPAGSP (서열 번호 4), TSESAT (서열 번호 5), TSTEPE (서열 번호 6),
SEPATS (서열 번호 7), TSTEEG (서열 번호 8), PESGPG (서열 번호 9),
SGSAPG (서열 번호 10), GSETPG (서열 번호 11),
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 12), SEPATSGSETPGTSESATPESGPG (서열 번호 13), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 14), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP (서열 번호 15), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP (서열 번호 16), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP (서열 번호 17), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT (서열 번호 18), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT (서열 번호 19), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT (서열 번호 20), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE (서열 번호 21), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE (서열 번호 22), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE (서열 번호 23), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS (서열 번호 24), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS (서열 번호 25), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS (서열 번호 26), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG (서열 번호 27), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG (서열 번호 28), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG (서열 번호 29), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG (서열 번호 30), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG (서열 번호 31), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG (서열 번호 32), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG (서열 번호 33), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG (서열 번호 34), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG (서열 번호 35), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG (서열 번호 36), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG (서열 번호 37), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG (서열 번호 38), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS (서열 번호 70), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 71), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG (서열 번호 39), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 40), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG (서열 번호 41), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 42), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG (서열 번호 43), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 44), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG (서열 번호 45), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 46), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG (서열 번호 47), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 48), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG (서열 번호 49), SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 50), SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG (서열 번호 51), SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 52), SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG (서열 번호 53), GEPS (서열 번호 118), GPSE (서열 번호 119), GPES (서열 번호 120), GSPE (서열 번호 121), GSEP (서열 번호 122), GEPQ (서열 번호 123), GEQP (서열 번호 124), GPEQ (서열 번호 125), GPQE (서열 번호 126), GQEP (서열 번호 127) 또는 GQPE (서열 번호 128), PEDEETPEQE (서열 번호 129), PDEGTEEETE (서열 번호 130), PAAEEEDDPD (서열 번호 131), AEPDEDPQSED (서열 번호 132), AEPDEDPQSE (서열 번호 133), AEPEEQEED (서열 번호 134), AEPEEQEE (서열 번호 135), GGGS (서열 번호 136), GSGS (서열 번호 137), GGSS (서열 번호 138) 및 SSSG (서열 번호 139).
59. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열을 하나 이상 포함하는, MIC-1 화합물:
SPAGSP, TSESAT, TSTEPE, SEPATS, TSTEEG, PESGPG, SGSAPG, GSETPG,
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG,
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG,
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG,
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG,
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG,
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG, SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG,
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG,
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG, GEPQ, GEPS, GGGS, GSGS, GGSS, 및 SSSG.
60. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 임의의 2~6개의 임의 조합을 포함하는, MIC-1 화합물: SPAGSP, TSESAT, TSTEPE, SEPATS, TSTEEG, PESGPG, SGSAPG, GSETPG, GEPQ, GEPS, GGGS, GSGS, GGSS, 및 SSSG.
61. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물: GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS, 및 SSSG.
62. 구현예 61에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 2~9개의 임의 조합을 포함하는, MIC-1 화합물: GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS, 및 SSSG.
63. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물: GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GGGS, GSGS, GGSS, 및 SSSG.
64. 구현예 63에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 2~9개의 임의 조합을 포함하는, MIC-1 화합물: GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GGGS, GSGS, GGSS, 및 SSSG.
65. 구현예 64에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물: GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS (서열 번호 140), GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE (서열 번호 141), GPESGPESGPESGPESGPES (서열 번호 142), GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE (서열 번호 143), 및 GSEPGSEPGSEPGSEPGSEP (서열 번호 144).
66. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물: GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS, 및 SSSG.
67. 구현예 66에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 2~9개의 임의 조합을 포함하는, MIC-1 화합물: GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS, 및 SSSG.
68. 구현예 67에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물: GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ (서열 번호 145), GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP (서열 번호 146), GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(서열 번호 147), GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE (서열 번호 148), GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP (서열 번호 149), 및 GQPEGQPEGQPEGQPEGQPE (서열 번호 150).
69. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물: PEDEETPEQE, PDEGTEEETE, PAAEEEDDPD, AEPDEDPQSED, AEPDEDPQSE, AEPEEQEED, 및 AEPEEQEE, GGGS, GSGS, GGSS, 및 SSSG.
70. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 2 내지 3개의 임의 조합을 포함하는, MIC-1 화합물: PEDEETPEQE, PDEGTEEETE, PAAEEEDDPD, AEPDEDPQSED, AEPDEDPQSE, AEPEEQEED, AEPEEQE 및 AEEAEEAEEAEEAEE.
71. 구현예 1 내지 구현예 2 및 구현예 5 내지 구현예 33 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 다음 서열 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물: 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 서열 번호 72, 서열 번호 161, 서열 번호 162, 서열 번호 181, 서열 번호 182, 서열 번호 183, 서열 번호 184, 서열 번호 185, 서열 번호 186, 서열 번호 187, 서열 번호 188, 서열 번호 189, 서열 번호 190, 서열 번호 191, 서열 번호 192, 서열 번호 193, 서열 번호 194 및 서열 번호 195.
72. 구현예 1 내지 구현예 71 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 N-말단에 1 내지 3개의 알라닌 아미노산 잔기를 포함하는, MIC-1 화합물.
73. 구현예 1 내지 구현예 72 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 C-말단에 1 내지 4개의 글리신 및 세린 아미노산 잔기를 포함하는, MIC-1 화합물.
74. 구현예 1 내지 구현예 73 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 C-말단에 (글리신-세린)n 또는 (세린-글리신)n 서열을 포함하고, n은 1~8 사이의 정수인, MIC-1 화합물.
75. 구현예 1 내지 구현예 74 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부는 C-말단에 GGGS, GSGS, GGSS 또는 SSSG를 포함하는, MIC-1 화합물.
76. 구현예 1 내지 구현예 75 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 야생형 MIC-1(서열 번호 1)에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는, MIC-1 화합물.
77. 구현예 70에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 야생형 MIC-1(서열 번호 1)에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 나타내는, MIC-1 화합물.
78. 구현예 1 내지 구현예 70 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 변형을 가지는, MIC-1 화합물.
79. 구현예 1 내지 구현예 72 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 최대 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 아미노산 변형을 가지는, MIC-1 화합물.
80. 구현예 1 내지 구현예 79 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 야생형 MIC-1(서열 번호 1)과 비교하여 다음 치환 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물: P11E, H18E, R21E, A30E, M43L, M43E, A47E, R53E, A54E, M57E, M57L, H66E, R67E, L68E, K69E, A75E, A81E, P85E, M86F, M86L, Q90E, T92E, L105E, K107E, K69R, K107R 및 K91R.
81. 구현예 1 내지 구현예 80 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 다음 치환 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물: R2S, R2A, R2E, N3S, N3E, N3A, N3T, N3P, N3G, N3V, N3H, N3Y 또는 N3Q.
82. 구현예 1 내지 구현예 81 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 N3의 결실(des-N3)을 포함하는, MIC-1 화합물.
83. 구현예 1 내지 구현예 82 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 M57E 또는 M57L 치환을 포함하는, MIC-1 화합물.
84. 구현예 1 내지 구현예 83 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 M86L 또는 M86F 치환을 포함하는, MIC-1 화합물.
85. 구현예 84에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 Q90E 또는 T92E 치환을 추가로 포함하는, MIC-1 화합물.
86. 구현예 1 내지 구현예 85 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 H66E 치환을 포함하는, MIC-1 화합물.
87. 구현예 1 내지 구현예 86 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 R67E 치환을 포함하는, MIC-1 화합물.
88. 구현예 1 내지 구현예 87 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 처음 3, 4, 5 또는 6개 잔기의 결실을 포함하는, MIC-1 화합물.
89. 구현예 1 내지 구현예 88 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 처음 3개 잔기의 결실을 포함하는, MIC-1 화합물.
90. 구현예 1 내지 구현예 75 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 154(M43L/des-N3)에 따른 서열을 갖는, MIC-1 화합물.
91. 구현예 1 내지 구현예 75 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 155(M43L/Δ1~3)에 따른 서열을 갖는, MIC-1 화합물.
92. 구현예 1 내지 구현예 91 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 156(M57E/H66E/des-N3)에 따른 서열을 갖는, MIC-1 화합물.
93. 구현예 1 내지 구현예 75 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 157(M57L/Δ1~3)에 따른 서열을 갖는, MIC-1 화합물.
94. 구현예 1 내지 구현예 75 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 158(M57L/des-N3)에 따른 서열을 갖는, MIC-1 화합물.
95. 구현예 1 내지 구현예 75 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 159(M86L/Δ1~3)에 따른 서열을 갖는, MIC-1 화합물.
96. 구현예 1 내지 구현예 75 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 160(M86L/des-N3) 또는 서열 번호 222(M57L, M86L/des-N3)에 따른 서열을 갖는, MIC-1 화합물.
97. 구현예 1 내지 구현예 75 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1에 따른 서열을 갖는, MIC-1 화합물.
98. 구현예 1 내지 구현예 97 중 어느 한 예에 있어서, MIC-1 폴리펩티드 및 N-말단 아미노산 연장부는 다음 서열에 따른 아미노산 서열을 함께 포함하는, MIC-1 화합물:
서열 번호 89, 서열 번호 90, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 93, 서열 번호 94, 서열 번호 95, 서열 번호 96, 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 102, 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 106, 서열 번호 107, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110, 서열 번호 111, 서열 번호 112, 서열 번호 113, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116, 서열 번호 117, 서열 번호 164, SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 288),
SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 289),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 290),
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 291),
SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 292),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPCEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 293),
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANEHAQIKTSLERLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 294),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 295),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 296),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 297),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 298),
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 299),
SAPATSGSATPGSAPATSGSATPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 300),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 301),
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 302),
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 303),
SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 304), SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 305), SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 306),
SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 307),
SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 308), SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 309), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSCEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 310), EEAEADDDDKESGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호 311), 또는 SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLRPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQRTDTGVSLQTYDDLLARDCHCI (서열 번호 312).
99. 다음 화학식 중 하나를 갖는 구현예 1에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 01)
(화학식 02)
(화학식 03)
(화학식 04)
(화학식 05)
(화학식 06)
(화학식 07)
(화학식 08)
(화학식 09)
(화학식 10)
(화학식 11)
(화학식 12)
(화학식 13)
(화학식 14)
(화학식 15)
(화학식 16)
(화학식 17)
(화학식 18)
(화학식 19)
(화학식 20)
(화학식 21)
100. 구현예 1 내지 구현예 99 중 어느 한 예에 있어서, 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 길어진 혈장 반감기를 나타내는, MIC-1 화합물.
101. 구현예 1 내지 구현예 100 중 어느 한 예에 있어서, 랫트에게 i.v.로 화합물을 투여하고 시간에 따른 화합물의 혈장 농도 변화로부터 말단 반감기를 추정함으로써 측정할 때, 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 개선된 혈장 반감기를 나타내는, MIC-1 화합물.
102. 구현예 1 내지 구현예 101 중 어느 한 예에 있어서, 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 유지되는 효력을 나타내는, MIC-1 화합물.
103. 구현예 1 내지 구현예 102 중 어느 한 예에 있어서, 화합물을 랫트에게 s.c.로 투여하고 매일 음식 섭취량의 변화를 측정함으로써 측정할 때, 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 지속되는 효능을 나타내는, MIC-1 화합물.
104. 구현예 1 내지 구현예 103 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 허용 가능한 용해도를 갖는, MIC-1 화합물.
105. 구현예 1 내지 구현예 99 중 어느 한 예에 있어서, 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는, pH 8.0의 Tris 완충계에서 측정할 때, 0.5, 1.0, 5.0, 10, 30 또는 50 mg/ml의 용해도를 갖는, MIC-1 화합물.
106. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 N3의 결실(des-N3)을 포함하고, 아미노산 연장부는 다음의 서열 SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225)를 가지며, 프로트랙터는 다음의 화학식,
(화학식 X)을 가지고,
프로트랙터는 아미노산 연장부의 시스테인에 부착되는, MIC-1 화합물.
107. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 288에 따른 서열을 가지며, 프로트랙터는 다음의 화학식,
(화학식 X)을 가지고,
프로트랙터는 아미노산 연장부의 시스테인에 부착되는, 화합물.
108. 구현예 1 내지 구현예 107 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 또는 에스테르.
109. 구현예 1 내지 구현예 109 중 어느 한 예에 있어서, 화합물은 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 음식 섭취량을 줄이고/줄이거나 체중을 줄일 때 개선된 생체 내 효능을 가지는, MIC-1 화합물.
110. 약으로서 사용하기 위해 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물.
111. 대사 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물.
112. 대사 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 구현예 111에 있어서, 대사 장애는 비만, 제2형 당뇨병, 이상지질혈증 또는 당뇨성 신병증인, MIC-1 화합물.
113. 비만과 같은 섭식 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물.
114. 음식 섭취량을 감소시키고, 체중을 줄이고, 식욕을 억제하고/억제하거나 포만감을 유발함으로써 비만의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 구현예 113에 따른 MIC-1 화합물.
115. 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물.
116. 이상지질혈증, 동맥경화증, 지방간염, 또는 당뇨성 신병증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 구현예 115에 따른 MIC-1 화합물.
117. 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 아미드 또는 에스테르, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
118. 대사 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 약의 제조에서 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 사용으로서, 대사 장애는 비만, 제2형 당뇨병, 이상지질혈증 또는 당뇨성 신병증인, 사용.
119. 섭식 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 약의 제조에서 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 사용.
120. 비만의 예방 및/또는 치료를 위해 약의 제조에서 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 사용.
121. 음식 섭취량을 감소시키고, 체중을 줄이고, 식욕을 억제하고/억제하거나 포만감을 유발함으로써 비만의 예방 및/또는 치료를 위해 약의 제조에서 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 사용.
122. 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 약의 제조에서 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 사용.
123. 이상지질혈증, 동맥경화증, 지방간염, 또는 당뇨성 신병증의 예방 및/또는 치료를 위해 약의 제조에서 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 사용.
124. 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 약학적 활성량을 투여함으로써 대사 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 대사 장애는 비만, 제2형 당뇨병, 이상지질혈증, 또는 당뇨성 신병증인, 방법.
125. 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 약학적 활성량을 투여함으로써 섭식 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법.
126. 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 약학적 활성량을 투여함으로써 비만을 치료 및/또는 예방하는 방법.
127. 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 약학적 활성량을 투여함으로써, 음식 섭취량를 감소시키고, 체중을 줄이고, 식욕을 억제하고/억제하거나 포만감을 유발함으로써 비만을 치료 및/또는 예방하는 방법.
128. 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 약학적 활성량을 투여함으로써 심혈관 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.
129. 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 약학적 활성량을 투여함으로써 이상지질혈증, 동맥경화증, 지방간염, 또는 당뇨성 신병증을 치료 및/또는 예방하는 방법.
130. 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자.
131. 구현예 1 내지 구현예 109 및 구현예 132 내지 구현예 152 중 어느 한 예에 따른 MIC-1 화합물의 약학적 활성량을 투여함으로써, 음식 섭취량을 감소시키고, 체중을 줄이고, 식욕을 억제하고/억제하거나 포만감을 유발함으로써 과체중을 치료 및/또는 예방하는 방법.
132. 화학식 01에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 01).
133. 화학식 02에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 02).
134. 화학식 03에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 03).
135. 화학식 04에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 04)
136. 화학식 05에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 05).
137. 화학식 06에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 06)
138. 화학식 07에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 07).
139. 화학식 08에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 08).
140. 화학식 09에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 09)
141. 화학식 10에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 10).
142. 화학식 11에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 11).
143. 화학식 12에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 12)
144. 화학식 13에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 13)
145. 화학식 14에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 14).
146. 화학식 15에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 15)
147. 화학식 16에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 16).
148. 화학식 17에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 17)
149. 화학식 18에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 18).
150. 화학식 19에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 19)
151. 화학식 20에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 20).
152. 화학식 21에 따른 MIC-1 화합물:
(화학식 21).
실시예
약어 목록
"주 피크"는 밀리 흡수 단위(milliabsorbance units)에서 최고 UV 강도를 가지며 융합 단백질을 함유하는 정제 크로마토그램의 피크를 나타낸다.
HPLC는 고성능 액체 크로마토그래피이다.
SDS-PAGE는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동이다.
IMAC는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피이다.
SEC는 크기 배제 크로마토그래피이다.
MS는 질량 분석법이다.
이 설명에서, 그리스 문자는 기호 또는 해당하는 이름으로 표시될 수 있다(예를 들어, α = 알파, β = 베타, ε = 엡실론, γ = 감마, ω = 오메가, Δ = 델타, 등). 또한, 그리스 문자 μ는 "u"로 표시할 수 있다(예를 들어, μl=ul, 또는 μM=uM).
개선된 용해도를 가지는 MIC-1 폴리펩티드
본 발명의 일 양태에서, MIC-1 폴리펩티드를 증가된 용해도를 갖도록 설계하였다.
본 발명의 일 양태에서, N-말단 "산성" 아미노산 연장부를 MIC-1 폴리펩티드에 첨가함으로써 달성하였다.
본 발명의 일 양태에서, 용해성이 향상되었으며, MIC-1 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형에 의해 안정성이 개선되었다. 예를 들어, 변형은 MIC-1 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에서 수행되었다(서열 내 돌연변이).
N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 E. coli와 같은 세균에서 발현될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, N-확장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 대규모 단백질 생산은 봉입체(IB)를 사용하여 이뤄질 수 있는데, 이것이 공정 회수, 단백질 순도, 단백질 분해효소 분해 및 일반적인 단백질 안정성을 제어하는 것에 대해 유리한 접근을 나타내기 때문이다. 이는 대규모 단백질 생산에 특히 중요해진다. IB의 품질에 있어서 매우 중요한 것은 N-연장부 용해도를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 개선된 용해도 및 IB 형성 사이에서의 균형이다.
N-연장부 설계:
N-말단 아미노산 연장부의 설계에서, F, I, L, M, V, W 및 Y는 단백질 응집의 원인이 될 수 있기 때문에 제외하였다. H, K, 및 R은 또한 세포막에서 원하지 않는 결합을 야기할 수 있기 때문에 배제되었다. A, C, E, G, P, S, T, D, N, 및 Q는 N-연장부 서열로 바람직하다. E 및 D는 화합물의 pI 값을 감소시킴으로써 용해도를 증가시키므로 특히 바람직하다. C는 지방산 컨주게이션 및 페길레이션과 같은, 프로트랙터 목적으로 사용될 수 있는 -SH기를 제공할 수 있다. 구체적으로, 일부 N-연장부의 경우, N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드가 대장균에서 발현될 때 초기 메티오닌 제거 효능을 증가시키기 위해 N-연장부 맨 뒤에 1개 또는 2개의 알라닌, 글리신 또는 세린을 첨가하였다.
다양한 N-말단 아미노산 연장부를 설계하였다. 일부 N-연장부는 인간 단백질로부터 유래된 서열(인간화 서열)을 포함하고, 일부는 인공적으로 설계된 서열(예를 들어, GS, SG, AEE, AES, GEPQ (서열 번호 123), GEPS (서열 번호 118))을 포함하고, 일부는 인간화 서열 또는 인공 서열의 여러 반복을 포함하고, 일부는 상기의 조합을 포함한다. 여러 6개 잔기 서열(6-량체(6-mers))을 설계하였다. N-연장부는 하나 이상의 6량체, 6량체의 일부(예를 들어, 6량체 중 1 내지 5개의 잔기), 또는 상기의 조합을 포함할 수 있다. (6량체를 포함하는) 인공 서열 및 인간화 서열의 아미노산 잔기는 임의의 순서로 배열될 수 있다.
일부 대표적인 6량체 및 6량체의 조합을 표 2에 나열하였고, N-연장부의 다른 예는 표 3에 나열하였다.
| 6량체: | 6량체-1: SPAGSP (서열 번호 4) |
| 6량체-2: TSESAT (서열 번호 5) | |
| 6량체-3: TSTEPE (서열 번호 6) | |
| 6량체-4: SEPATS (서열 번호 7) | |
| 6량체-5: TSTEEG (서열 번호 8) | |
| 6량체-6: PESGPG (서열 번호 9) | |
| 6량체-7: SGSAPG (서열 번호 10) | |
| 6량체-8: GSETPG (서열 번호 11) | |
| 조합: | SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 12) |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPG (서열 번호 13) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 14) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP (서열 번호 15) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP (서열 번호 16) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP (서열 번호 17) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT (서열 번호 18) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT (서열 번호 19) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT (서열 번호 20) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE (서열 번호 21) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE (서열 번호 22) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE (서열 번호 23) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS (서열 번호 24) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS (서열 번호 25) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS (서열 번호 26) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG (서열 번호 27) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG (서열 번호 28) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG (서열 번호 29) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG (서열 번호 30) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG (서열 번호 31) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG (서열 번호 32) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG (서열 번호 33) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG (서열 번호 34) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG (서열 번호 35) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG (서열 번호 36) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG (서열 번호 37) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG (서열 번호 38) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG (서열 번호 39) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 40) | |
| SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG (서열 번호 41) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 42) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG (서열 번호 43) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 44) | |
| SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG (서열 번호 45) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 46) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG (서열 번호 47) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 48) | |
| SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG (서열 번호 49) | |
| SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (서열 번호 50) | |
| SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG (서열 번호 51) | |
| SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (서열 번호 52) | |
| SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG (서열 번호 53) |
| 서열 번호 | 잔기 번호 | N-연장부 서열 |
| 서열 번호 54 | 6 | AEEAES |
| 서열 번호 55 | 3 | AES |
| 서열 번호 56 | 9 | (AEE)2AES |
| 서열 번호 57 | 20 | (GEPS)5 |
| 서열 번호 58 | 24 | SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG |
| 서열 번호 59 | 21 | (AEE)6AES |
| 서열 번호 60 | 18 | (AEE)5AES |
| 서열 번호 61 | 12 | (AEE)3AES |
| 서열 번호 62 | 26 | AASPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG |
| 서열 번호 63 | 24 | TSESATPESGPGTSESATPESGPG |
| 서열 번호 64 | 26 | AASPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG |
| 서열 번호 65 | 22 | AAPEDEETPEQEGSGSGSGSGS |
| 서열 번호 66 | 12 | AAPEDEETPEQE |
| 서열 번호 67 | 22 | AAPDEGTEEETEGSGSGSGSGS |
| 서열 번호 68 | 24 | SEPATSGSETPGSEPATSGSETPG |
| 서열 번호 69 | 25 | A(GPEQGQEP)3 |
| 서열 번호 70 | 30 | SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS |
| 서열 번호 71 | 32 | SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG |
| 서열 번호 72 | 24 | (GEPS)6 |
| 서열 번호 161 | 36 | (GEPS)9 |
| 서열 번호 162 | 36 | (GPEQ)9 |
| 서열 번호 163 | 25 | AGPEQGQEPGEPQGQEPQPGEPEGQ |
서열 내 돌연변이:
MIC-1의 특정 내부 잔기(서열 번호 1)를 변경하였다(예를 들어, 치환에 의해). 예를 들어, MIC-1 화합물의 용해도를 증가시키기 위해, MIC-1의 소수성 잔기를 친수성 잔기로, 바람직하게는 산성 잔기로 치환할 수 있고; 양전하 잔기는 산성 잔기 등으로 치환할 수 있다. 산화를 감소시키기 위해, 메티오닌을 다른 아미노산(예를 들어, E, F 또는 L)으로 치환할 수 있다.
용해도를 증가시키기 위한 서열 내 돌연변이는 다음을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다: P11E, H18E, R21E, A30E, A47E, R53E, A54E, M57E, H66E, R67E, L68E, K69E, A75E, A81E, P85E, Q90E, T92E, L105E 및 K107E.
산화를 감소시키기 위한 서열 내 돌연변이는 다음을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다: M43L, M43E, M57E, M57L, M86F 및 M86L.
화학적 안정성을 증가시키기 위한 서열 내 돌연변이는 N3S, N3E, N3A, N3T, N3P, N3G, N3V, N3H, N3Y 및 N3Q를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
컨주게이션을 위한 서열 내 돌연변이는 K69R, K107R 및 K91R을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
다른 서열 내 돌연변이는 N3(des-N3)의 결실 및/또는 처음 3개의 잔기의 결실을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다.
pI 계산
N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 산출된 pI는 N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 순 산출 전하가 0인 pH로서 정의된다. pH의 함수로서 N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 산출된 전하를 표 1에 기술된 아미노산 잔기의 pKa값 및 B. Skoog와 A. Wichman에 의해 기술된 방법을 사용하여 구한다(Trends in Analytical Chemistry, 1986, vol. 5, pp. 82~83). 시스테인(Cys)의 측쇄 pKa는 자유 설프히드릴기를 갖는 시스테인에 대한 전하 계산에만 포함된다. N-연장부는 하나의 시스테인 돌연변이를 포함할 수 있다. 예로서, 인간 야생형 MIC-1의 산출된 pI값은 동종 이량체로서 8.8이다. MIC-1 폴리펩티드의 산출된 pI값들을 표 4에 나타냈다.
본원에서, 그리고 본 문서 전반에 걸쳐, N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드에 대한 pI 계산은, 달리 언급되지 않는 경우, 동종 이량체에서 이루어진다.
재료 및 방법
일반적인 제조 방법
실시예 1: MIC-1 폴리펩티드 또는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현 및 발효
MIC-1 폴리펩티드 또는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 cDNA를 pET11b 유래 벡터 내로 서브 클로닝하였다. 세포 밀도가 OD600으로 1.0에 도달할 때, 봉입체로서 MIC-1f 폴리펩티드 또는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 과발현을 E. coli에서 0.5 mM 이소프로필 β-d-티오갈락토시드(IPTG)에 의해 유도하였다. 20시간 동안 37℃에서 연속 성장 후, 세포를 수확하였고, LC/MS 및 UPLC 둘 다에 대한 시료를 준비하여 분자량을 확인하였다.
발효는 보충제로 화학적으로 정의된 배지에서 유가 배양 공정으로 수행하였다. 발효 수율은 상이한 폴리펩티드에 주로 의존하며, 폴리펩티드마다 1 g/L 내지 8 g/L로 다양하였다.
실시예 2: 정제 및 재접힘
:
MIC-1 폴리펩티드 또는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 다음과 같이 추가 정제하였다.
pH 8.0의 10 mM Tris 완충액에서 E.coli 슬러리(20% w/v)를 초음파 처리(5분 동안 얼음 위에서 3초 온/오프 간격)하였고, MIC-1 폴리펩티드 또는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1을 원심 분리(10,000 x g, 30분 동안)하여 펠릿화하였다. 봉입체를 pH 8.0의 20 mM Tris에서 8 M 요소로 재용해시켰고, 잔해물을 원심 분리(10,000 x g, 30분 동안)로 제거하였다. 생성된 상청액 중 MIC-1 폴리펩티드 또는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 수집하여 최종 농도가 0.1 mg/ml가 되도록 재접힘 완충액(50 mM Tris, pH 8.5 및 10% DMF 또는 10% DMSO) 내로 희석시켰다. 재접힘 공정을 냉장실에서 48시간 동안 지속하였다. 생성된 용액을 0.4 μm 필터로 여과하였고, Protein Purification. Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes, Robert K. 3rd ed., 1994 (Chapters 6 및 8)에서 일반적으로 설명된 바와 같이, Q Sepharose Fast Flow 수지(GE Healthcare)를 사용하여 소수성 상호작용 컬럼 또는 음이온 교환 크로마토그래피(50 mM Tris, pH 8.0, 0~500 mM NaCl)에 로딩하였다. 일부 예에서, 50 mM Tris pH 8.0 및 200 mM NaCl로 작동되는 HiLoad 26/60 Superdex pg 75 column(GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 추가 정제를 수행하였다. 보관을 위해, MIC-1 폴리펩티드 또는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 DPBS로 옮기고 냉동 보관하였다. MIC-1 폴리펩티드 또는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드 및 그의 pH 8 Tris 완충액에서 최대 용해도를 표 5에 나타냈다.
실시예 3: N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 pH 의존성 용해도
이 실험의 목적은 개선된 용해도를 갖는 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 스크리닝하고, 제형을 위한 최적의 pH 창을 결정하는 것이었다.
N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 물 및 에탄올의 혼합물(60% 물 및 40% 에탄올)에 3 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도 범위로 용해시켰다. 용매를 6시간 동안 SpeedVac(Concentrator Plus, Eppendorf)으로 증발시켜 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 펠릿을 얻었다.
하기의 완충액은 이 pH 의존성 용해도 곡선 검정을 위해 사용한다: 아세트산염 완충액(pH 3 내지 pH 6), Tris 완충액(pH 7 내지 pH 9), CAPS 완충액(pH 10 내지 pH 11).
완충액을 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드와 함께 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 사용된 양은 정확하게 동일하지 않을 수 있지만, 모두 12~18 mg/ml 이내의 이론적 농도를 목표로 한다. 상청액에서 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 농도를 UPLC를 이용하여 결정하였다(표 6). 결과에 기초하여, 본 발명의 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 용해도는 wtMIC-1과 비교하여 pH 6~9에서 상당히 개선되었다. N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 최적의 pH 창은 제형에 바람직한 pH 범위, 예를 들어 pH 6.5~8.5내로 떨어진다.
실시예 4: pH 8에서 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 최대 용해도
최대 용해도를 시험하기 위해, N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 물 및 에탄올의 혼합물(60% 물 및 40% 에탄올)에 3 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도 범위로 용해시켰다. 그런 다음 용액(각 웰별 150 μL)을 96 웰 플레이트(Corning)로 등분하였다. 용매를 6시간 동안 SpeedVac(Concentrator Plus, Eppendorf)으로 증발시켜 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 펠릿을 얻었다. Tris 완충액(부형제 없이, pH 8.0)을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 웰에 첨가된 완충액의 양은, 최대 농도를 달성하도록, 웰에서 전체 펠릿을 용해시키기 위해 필요한 양보다 적게 하였다. 플레이트를 플레이트 진탕기에서 800 rpm(MixMate, Eppendorf)으로 2시간 동안 진탕시켰다. 펠릿을 3600 g에서 5분 동안 원심 분리로 가라앉혔다. 상청액을 96-딥-웰 플레이트로 옮기고, 40% 에탄올로 20회 희석하였다. 그런 다음 모든 시료에 UPLC(Acquity, Waters), 플레이트 판독기(Infinite M200 pro, Tecan) 및 UV 분광계(NanoDrop 8000, Thermo Scientific)를 수행하여 농도를 결정하였다(표 7).
결과에 기초하여, 본 발명의 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 용해도는 pH 8.0에서 상당히 개선되었다. 특히, N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 pH 8.0에서 용해도가 30 mg/ml를 초과를 달성하였다.
N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 개선된 용해도는 MIC-1 화합물 내에서 지속되었다(즉, 프로트랙터를 첨가하는 것은 용해도를 현저하게 저하시키지 않았다.)(실시예 12).
시험관 내 활성 선별의 일반적인 방법
실시예 5: BHK21-hGFRAL-IRES-hRET 세포주의 확립
이 실시예의 목적은 MIC-1 활성을 시험하기 위해 시험관 내 분석에 기초한 세포를 확립하는 것이었다. 포유류 세포를 형질 감염시켰고 안정적으로 전체 길이의 MIC-1 수용체(hGFRAL) 및 이의 완전한 신호 전달 공수용체 hRET51를 발현시켰다.
전체 길이 hGFRAL 및 전체 길이 hRET51을 발현하는 플라스미드를 전체 길이 hGFRAL 및 전체 길이 hRET51을 암호화하는 합성된 DNA 뉴클레오티드를 포유류 발현 벡터 pEL로 삽입함으로써 구축하였다. IRES(내부 리보솜 진입 부위)는 두 DNA 서열이 동시에 mRNA로 번역되도록 2개의 DNA 서열 사이에서 흔히 사용되는 링커이다. pEL 벡터 골격은 Taihegene CRO 사에서 제공하였다.
2백만개의 BHK21 세포를 10cm 페트리 접시에 씨딩하고 배양 배지(DMEM+10%FBS+1%PS)에서 밤새 배양하였다. 세포를 pEL-hGFRAL-IRES-hRET 플라스미드로 형질 감염시켰다. 형질 감염된 세포를 상이한 밀도로 새로운 10cm 접시에 분할하고, 2주 이상 동안 선택 배지(DMEM+10%FBS+1%PS+1mg/ml G418)에서 성장시켜 단일 클론을 얻었다. 단일 클론을 6 웰 플레이트로 옮기고 100% 합류율(confluence)로 배양하였다. hGFRAL 및 hRET의 mRNA 발현은 qPCR로 측정하였다. 성공적으로 형질감염된 클론을 획득하여 MIC-1 결합을 위해 시험하였다.
실시예 6: MIC-1 세포 기반 시험관 내 활성 분석
wtMIC-1 및 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 BHK21-hGFRAL-IRES-hRET 안정한 세포에서 ERK1/2의 인산화를 둘 다 유도하였다(표 8). MIC-1, GFRAL 및 RET의 삼원 복합체가 ERK1/2의 인산화에 의해 ERK/MAPK 경로를 포함하는 신호 경로를 통해 MIC-1의 생체 내 활성을 유도하기 위해 RET 단백질 티로신 키나제를 인산화시켜야하는 결과로부터 결론을 내릴 수 있다.
BHK21-hGFRAL-IRES-hRET를 사용하여 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 스크리닝 결과를 표 8에 나타냈다. N-연장부만을 갖는 MIC-1 폴리펩티드 또는 서열 내 돌연변이를 갖는 MIC-1 유사체는 wtMIC-1과 같거나 심지어 더 높은 시험관 내 활성만을 달성하였다. 또한, N-연장부 및 서열 내 돌연변이의 조합은 또한 유사한 활성을 달성할 수 있다.
생체 내 효능
실시예 7: 마른 스프라구돌리 랫트에서 음식 섭취량에 대한 N-말단 연장부 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 효과
N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 생체 내 효능을 9~11주령의 나이든 마른 수컷 스프라구돌리 랫트에서 측정하였다. 동물에게 암기 주기를 개시하기 1~2시간 전에 1일 1회 8 nmol/kg 체중의 투여량으로 주사하였다. 적절한 완충 용액 내에서 화합물을 피하로 투여하였다(1~4 ml/kg). 음식 섭취량의 변화를 자동 음식 모니터링 시스템(랫트용 BioDAQ 시스템 및 HM2 시스템)에 의해 측정하였다. BioDAQ 시스템에서는 동물을 단일 수용하였으며, HM2 시스템에서는 동물을 케이지 당 최대 3마리의 동물과 함께 집단으로 수용하였다. 각 화합물을 n=4~8마리 동물에서 시험하였다. 실험 전 적어도 7일 동안 동물을 순응시켰다. 수집된 데이터는 각 매일의 12시간 암기의 개시부터 다음날 암기까지 측정된 일일 음식 섭취량(24시간 음식 섭취량)으로서 표현한다. 투여된 화합물에 대한 반응으로 음식 섭취량의 일일 변화는 치료군의 평균 일일 음식 섭취량으로부터 비히클군의 평균 일일 음식 섭취량을 빼서 계산하였다. 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여, p가 0.1 미만인 경우, 변화는 유의미한 것으로 간주하였다. 결과를 시험 기간 동안 기록된 비히클과 비교하여 음식 섭취량에서 "최대 감소"로서 표현하였다(백분율). 데이터를 또한 시험 기간 동안 음식 섭취량(백분율)에서 상당한(p<0.1) 일일 감소의 합으로서 음식 섭취량의 "누적 감소"로 표현하였다.
본 발명자들은 놀랍게도 N-연장부를 갖는 이들 MIC-1 폴리펩티드가 용해성 분자를 증가시켰을 뿐만 아니라 wtMIC-1과 동일하거나 심지어 더 나은 효능을 야기시켰다는 것을 발견했다(표 9). 예를 들어, 서열번호 105 및 서열번호 106에 따른 화합물은 피하 투여한 wtMIC-1보다 40~50% 더 큰 최대 및 누적된 생체 내 효능을 가졌다. 효능의 증가는, 서열 번호 92, 서열 번호 104, 서열 번호 105 및 서열 번호 106에 따른 화합물 모두가 wtMIC-1과 비교하여 증가된 용해도 및 현저히 큰 생체 내 효능을 가짐에 따라, 또한 용해도의 증가와 관련이 있었다. 서열 번호 105에 따른 화합물을 제외한 표 8의 모든 화합물이 wtMIC-1과 비슷한 Emax를 가지기 때문에, 이러한 상관 관계는 시험관 내 Emax의 변화에 의해 설명되지 않는 것으로 보인다. 실제로, 서열 번호 105의 화합물은 wtMIC-1보다 낮은 Emax를 가졌고, 생체 내 wtMIC-1보다 더 효과적이었다. 또한, 시험관 내 효력은, 화합물 중 어느 것도 wtMIC-1과 다른 EC50을 가지지 않으므로, 화합물들 간에 비슷하였다. 따라서, 증가된 생체 내 효능 및 증가된 용해도 사이의 연관성은 놀라운 것이며, 단순히 시험관 내에서 증가된 수용체 활성의 변화에 의해 설명될 수 없다.
실시예 8: 상이한 12량체 블록의 MIC-1 발현 및 초기 메티오닌 제거 효율
인체에서, N-포르밀-메티오닌은 면역계에 의해 이물질로 또는 손상된 세포에 의해 방출되는 알람 신호로 인식되어, 신체가 잠재적 감염에 대항하여 싸우도록 자극한다(Pathologic Basis of Veterinary Disease5: Pathologic Basis of Veterinary Disease, By James F. Zachary, M. Donald McGavin). 또한, 메티오닌은 쉽게 산화될 수 있는 불안정한 잔기이다. 따라서, N-Met 절단 효율은 MIC-1 발현에 매우 중요하다.
4가지 다른 유형의 12량체가 있으며, 이들 모두는 3개의 세린, 2개의 프롤린, 2개의 글리신, 2개의 트레오닌, 2개의 글루탐산 및 1개의 알라닌을 포함한다. 그러나, 각 반복에서 12개의 잔기는 상이한 방식으로 배열된다.
발현 수준 및 N-Met 절단 효율에 대한 상이한 12량체의 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 따라서, 단일 및 이중 12량체 각각으로 개시하는 MIC-1 폴리펩티드의 체계적으로 조사하는 것이 매우 필요하다.
N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 cDNA를 pET11b 유래 벡터 내에 서브 클로닝하였다. 세포 밀도가 OD600으로 1.0에 도달할 때, 봉입체 또는 가용성 단백질로서 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 과발현을 E. coli에서 0.5 mM 이소프로필 β-d-티오갈락토시드(IPTG)에 의해 유도하였다. 20시간 동안 37℃ TB에서 연속 성장 후, 세포를 수확하였고, 완충액 A(20 mM Tris, pH 8.0)에서 초음파 처리하였다. 생성된 혼합물을 10,000 g에서 20분 동안 원심 분리하였고, LC/MS 및 SDS-PAGE로 분석하여 분자량을 확인하였다.
발효는 보충제로 화학적으로 정의된 배지에서 유가 배양 공정으로 수행하였다. 발효 수율은 상이한 화합물에 주로 의존하며, 화합물마다 1 g/L 내지 8 g/L로 다양하였다.
단일 12량체 시험을 위해 설계된 화합물 및 결과를 표 10과 도 1에 나타냈다.
| N-연장부 | N-aa 서열 | MIC-1 폴리펩티드 | N-Met 절단 효율 (%) |
| 12량체-1 | SPAGSPTSTEEG (서열 번호 166) |
MIC-1 Δ1~3 | N/A |
| 12량체-2 | TSESATPESGPG (서열 번호 167) |
0 | |
| 12량체-3 | TSTEPSEGSAPG (서열 번호 168) |
0 | |
| 12량체-4 | SEPATSGSETPG (서열 번호 169) |
100 |
N/A: N-말단 연장부를 갖는 MIC-1이 E.coli에서 발현되지 않았다는 것을 의미한다.
이중 12량체를 지니는 화합물을 표 11에 나열하였고, 결과 또한 나타내었다(표 11 및 도 2 참조).
| 서열 번호 | N-연장부 | N-aa 서열 | MIC-1 폴리펩티드 | N-Met 절단 효율(%) |
| N/A | 12량체-(1+1) | SPAGSPTSTEEG- SPAGSPTSTEEG (서열 번호 170) |
MIC-1 Δ1~3 |
N/A |
| N/A | 12량체-(1+3) | SPAGSPTSTEEG- TSTEPSEGSAPG (서열 번호 171) |
N/A | |
| N/A | 12량체-(1+4) | SPAGSPTSTEEG- SEPATSGSETPG (서열 번호 172) |
N/A | |
| N/A | 12량체-(2+1) | TSESATPESGPG- SPAGSPTSTEEG (서열 번호 173) |
58.1 | |
| N/A | 12량체-(2+2) | TSESATPESGPG- TSESATPESGPG (서열 번호 174) |
30.0 | |
| N/A | 12량체-(2+3) | TSESATPESGPG- TSTEPSEGSAPG (서열 번호 175) |
58.5 | |
| N/A | 12량체-(2+4) | TSESATPESGPG- SEPATSGSETPG (서열 번호 176) |
64.5 | |
| N/A | 12량체-(3+1) | TSTEPSEGSAPG- SPAGSPTSTEEG (서열 번호 177) |
10.0 | |
| N/A | 12량체-(3+2) | TSTEPSEGSAPG- TSESATPESGPG (서열 번호 178) |
1.0 | |
| N/A | 12량체-(3+3) | TSTEPESGSAPG- TSTEPESGSAPG (서열 번호 179) |
26.4 | |
| N/A | 12량체-(3+4) | TSTEPSEGSAPG- SEPATSGSETPG (서열 번호 180) |
10.5 | |
| N/A | 12량체-(4+1) | SEPATSGSETPG- SPAGSPTSTEEG (서열 번호 12) |
N/A | |
| 서열 번호 182 | 12량체-(4+2) | SEPATSGSETPG- TSESATPESGPG (서열 번호 13) |
100 | |
| 서열 번호 103 | 12량체-(4+3) | SEPATSGSETPG- TSTEPSEGSAPG (서열 번호 14) |
100 | |
| 서열 번호 104 | 12량체-(4+4) | SEPATSGSETPG- SEPATSGSETPG (서열 번호 181) |
100 |
N/A: N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드가 E.coli에서 발현되지 않았다는 것을 의미한다.
결론적으로, 12량체-1 블록으로 시작하는 N-연장부는 E.coli에서 발현될 수 없었다. 다른 12량체 블록의 경우, 단백질 발현이 이뤄졌으나, 단지 12량체-4만이 초기 서열로서 완전한 메티오닌 절단을 초래하였다. 또한, 12량체-2 시리즈의 N-met 절단 효율은 12량체-3 시리즈의 것보다 우수하다.
실시예 9: 2배 또는 2.5배의 12량체 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현 수준 및 봉입체 비율
(1)
2.5배의 12량체 N-연장부
를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현
단백질 생산 방법은 실시예 8을 참조한다. 결과를 표 12, 도 3 및 도 4에 나타내었다.
| 서열 번호 | N-연장부 | N-aa 서열 | MIC-1 폴리펩티드 | UPLC 셰이커 플라스크 (g/L/10OD) |
UPLC 발효조 (g/L/10OD) |
| 서열 번호 200 |
12량체-(4+2+1.6 말단) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSTEEG (서열 번호 28) |
MIC-1 Δ1~3 |
N.D. | |
| 서열 번호 201 |
12량체-(4+2+2.6) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSESAT (서열 번호 19) |
0.197 | ||
| 서열 번호 202 | 12량체-(4+2+2.6 내부) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPGESATPE(서열 번호 183) | 0.206 | ||
| 서열 번호 108 | 12량체-(4+2+3.6) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPS(서열 번호 70) | 0.367 | 0.374 | |
| 서열 번호 203 | 12량체-(4+2+3.6 내부) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPG STEPSE(서열 번호 184) |
0.243 | ||
| 서열 번호 109 | 12량체-(4+2+3.8) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 71) |
0.273 | 0.162 | |
| 서열 번호 204 | 12량체-(4+2+4.6) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPGSEPATS (서열 번호 25) |
0.373 | ||
| 서열 번호 205 |
12량체-(4+3+1.6 말단) | SEPATSGSETPG TSTEPSEGSAPGTSTEEG(서열 번호 185) |
MIC-1 Δ1~3, M57L | 0.195 | |
| 서열 번호 206 |
12량체-(4+3+2.6) | SEPATSGSETPG TSTEPSEGSAPGTSESAT(서열 번호 186) |
0.234 | ||
| 서열 번호 207 | 12량체-(4+3+3.6) | SEPATSGSETPG TSTEPSEGSAPGTSTEPS(서열 번호 187) |
0.367 | ||
| 서열 번호 208 | 12량체-(4+3+4.6) | SEPATSGSETPG TSTEPSEGSAPG SEPATS(서열 번호 188) |
0.324 | ||
| 서열 번호 209 |
12량체-(4+4+1.6 말단) | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPGTSTEEG(서열 번호 189) |
MIC-1 Δ1~3, M57L | 0.148 | |
| 서열 번호 210 |
12량체-(4+4+2.6) | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG TSESAT(서열 번호 190) |
MIC-1 Δ1~3 |
0.361 | |
| 서열 번호 211 | 12량체-(4+4+2.6 내부) | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG ESATPE(서열 번호 191) |
N.D. | ||
| 서열 번호 212 |
12량체-(4+4+3.6) | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPGTSTEPS(서열 번호 192) |
MIC-1 Δ1~3, M57L | 0.262 | |
| 서열 번호 213 | 12량체-(4+4+3.6 내부) | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG STEPSE(서열 번호 193) |
MIC-1 Δ1~3 |
N.D. | |
| 서열 번호 214 |
12량체-(4+4+4.6) | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG SEPATS(서열 번호 194) |
0.330 |
참고: ".6"은 12량체의 처음 6개 아미노산을 의미하고, "말단(latter)"은 12량체의 마지막 6개 아미노산을 의미하며, "내부(inter)"는 12량체로부터 내부 6개 아미노산을 의미한다. "N.D."은 "검출되지 않음"을 의미한다.
길어진 12량체(6개 아미노산)가 N-말단으로부터 멀어지게 24개 아미노산을 위치시키지만, N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현 수준은 상이한 그룹마다 많이 다르다. 12량체-1의 단편은 발현에 적합하지 않으며, 이는 이전의 결과와 일치한다는 것이 명백하다. 12량체-(4+_+3.6) 및 -(4+_+4.6)의 평균 발현 수준은 다른 것보다 상대적으로 높다.
(2) 2배 또는 2.5배의 12량체 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 봉입체 비율
대규모 단백질 생산의 경우, 봉입체는 일반적으로 높은 발현 수준, 간단한 회수 단계 및 높은 순도, 단백질 분해효소 저항성 및 우수한 공정 안정성을 주로 포함하는 더 잘 규모를 키우는 특성으로 인해 주로 우수한 선택으로 간주된다.
N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 봉입체 또는 가용성 형태로 발현될 수 있으며, 이것은 주로 화합물의 pI 및 길어진 길이에 좌우된다. 결과를 표 13 및 도 4에 나타내었다.
| 서열 번호 | N-연장부 | N-연장부 서열 | MIC-1 폴리펩티드 | 봉입체 비율* | pI값 |
| 서열 번호 104 |
12량체-(4+4) | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (서열 번호 181) |
MIC-1 1~3 |
100% | 5.8 |
| 서열 번호 108 |
12량체-(4+2+3.6) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPS (서열 번호 70) |
100% | 5.5 | |
| 서열 번호 109 | 12량체-(4+2+3.8) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 71) |
90% | 5.2 | |
| 서열 번호 215 | 12량체-(4+2)-GPEQGPEQ | SEPATSGSETPG TSESATPESGPGGPEQGPEQ (서열 번호 195) |
90% | 5.2 | |
| 서열 번호 216 | 12량체-(4+2)-GEPSGEPS | SEPATSGSETPG TSESATPESGPG GEPSGEPS (서열 번호 196) |
95% | 5.2 | |
| 서열 번호 112 | 12량체-(4+4) M57E, H66E | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (서열 번호 181) |
70% | 5.0 | |
| 서열 번호 113 | 12량체-(4+4) M57E, R67E | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (서열 번호 181) |
70% | 5.0 | |
| 서열 번호 217 |
12량체-(3회 반복) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSTEPSEGSAPG (서열 번호 197) |
MIC-1-des-N3 | 85% | 5.4 |
| 서열 번호 218 | 12량체-(4회 반복) | SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPG (서열 번호 198) |
MIC-1-des-N3 | 30% | 5.1 |
| 서열 번호 219 | 12량체-(5회 반복) | SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG (서열 번호 199) |
MIC-1 | 0% | 4.8 |
| 서열 번호 220 | 12량체-(4+4) M57E, H66E, R67E | SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (서열 번호 181) |
MIC-1 Δ1~3 |
0% | 4.7 |
| 서열 번호 221 | 12량체-(4+2+3.6) M57E, R67E | SEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPS (서열 번호 70) |
0% | 4.7 |
참조: * 여기 숫자는 SDS-PAGE에 의해 추정된다.
서열 내 돌연변이를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 용해도는 표 14 및 도 5에 나타나 있다(MIC-1 폴리펩티드 서열은 MIC-1 Δ1~3이다.).
| N-연장부 | 서열 내 M | 세포에서 용해도 |
| SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (12량체-(4+4)) (서열 번호 181) |
M57E | IB |
| M57E/H66E | 부분적으로 용해됨 | |
| M57E/H66E/R67E | 완전히 용해됨 | |
| SEPATSGSETPG TSESATPESGPG-TSTEPS (12량체-(4+2+3.6)) (서열 번호 70) |
M57E | N.D. |
| M57E/H66E | 완전히 용해됨 | |
| M57E/H66E/R67E | 완전히 용해됨 |
12량체-(4+2+_), -(4+4+_) 및 -(4+3+_)으로 시작하는 MIC-1 폴리펩티드는 봉입체를 발현하는 능력이 있음을 조사하였다. pI가 5.1을 초과할 때, 봉입체 비율은 90%를 초과하는 것으로 나타났다. 또한, 서열 내 돌연변이 M57E/H66E를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 주로 가용성 분획을 발현시켰다.
실시예 9: 시스테인 돌연변이를 포함하는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 생산
N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위해, 지속에 사용된 상이한 지방산 사슬을 위치 지정 돌연변이에 의해 도입된 시스테인에 의해 매개된 알킬화를 통해 N-말단 연장부에 컨주게이션시켰다. 시스테인 돌연변이를 위한 위치는 체계적으로 맵핑하였고, N-말단 연장부를 갖는 생성된 MIC-1 폴리펩티드를 실시예 8에서 기술된 방법에 따라 재접힘시키고 정제하였다.
1. 지속을 위해 N-말단 연장부에 시스테인 돌연변이를 도입한다.
PCR 방법을 사용하여 위치 지정 돌연변이에 의해 총 20개의 상이한 시스테인 돌연변이체를 생성하였고, 구조체는 표 15와 같다.
| 구조체 (서열 번호) |
N-말단 연장부 | 시스테인 돌연변이 | MIC-1 폴리펩티드 | 봉입체 비율? | pI값 |
| 서열 번호 301 | SEPATCGSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPS (서열 번호 223) | S(-25)C | MIC-1, des-N3 | 100% | 5.7 |
| 서열 번호 302 | SEPATSGCETPG- TSESATPESGPG-TSTEPS(서열 번호 224) | S(-23)C | 100% | 5.7 | |
| 서열 번호 288 | SEPCTSGSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 225) | A(-29)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 291 | SEPATCGSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 226) | S(-27)C | 100% | 5.4 | |
| - | SEPATSCSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 227) | G(-26)C | 100% | 5.4 | |
| - | SEPCTSGSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 225) | A(-29)C | MIC-1, des-N3, M57L | 100% | 5.4 |
| - | SEPATSCSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 227) | G(-26)C | 100% | 5.4 | |
| - | SEPCTSGSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 228) | A(-29)C | MIC-1, des-N3, M57L, M86L | 100% | 5.4 |
| - | SEPACSGSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 229) | T(-28)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 289 | SEPATSCSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 227) | G(-26)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 303 | SEPATSGCETPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 230) | S(-25)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 304 | SEPATSGSECPG- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 231) | T(-23)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 305 | SEPATSGSETPC- TSESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 232) | G(-21)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 306 | SEPATSGSETPG- TCESATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 233) | S(-19)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 307 | SEPATSGSETPG- TSECATPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 234) | S(-17)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 292 | SEPATSGSETPG- TSESACPESGPG-TSTEPSEG(서열 번호 235) | T(-15)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 308 | SEPATSGSETPG- TSESATPECGPG-TSTEPSEG(서열 번호 236) | S(-12)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 309 | SEPATSGSETPG- TSESATPESCPG-TSTEPSEG(서열 번호 237) | G(-11)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 310 | SEPATSGSETPG- TSESATPESGPG-TSCEPSEG(서열 번호 238) | T(-6)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 293 | SEPATSGSETPG- TSESATPESGPG-TSTEPCEG(서열 번호 239) | S(-3)C | 100% | 5.4 | |
| 서열 번호 316 | GEQPCEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQP (서열 번호 317 ) | G(-24)C | MIC-1 | 100% | 5.3 |
N.A.=이용할 수 없음.
*: (시스테인 돌연변이 열의) 괄호 내 숫자는 MIC-1 폴리펩티드의 시스테인과 N-말단 아미노산 사이의 거리를 의미한다.
시스테인 돌연변이를 갖는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 발현 수준이 시스테인 돌연변이가 없는 것들과 유사함을 보여준다.
2. 시스테인 돌연변이를 포함하는 N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의 재접힘 및 정제
wtMIC-1 동종 이량체는 총 9쌍의 이황화 결합을 함유하고 이론상, 새로운 시스테인을 도입하는 것은 불규칙한 이황화결합에 의해 원래의 이황화 결합의 매칭을 방해할 것이고, 이는 재접힘 수율을 추가로 감소시킬 수 있다. 우리의 실험에서, 나열된 시스테인 돌연변이체를 wtMIC-1 재접힘에 사용된 동일한 재접힘 완충액에서 시험하였고, wtMIC-1 또는 기술된 N-말단 연장부를 갖는 용해도가 조작된 MIC-1과 유사한 재접힘 수율(~50% 내지 60%)을 보였다는 것을 발견한 것이 놀랍다.
3. 시스테인 돌연변이를 포함한
N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드의
pH 의존성 용해도 및 최대 용해도
pH 의존성 용해도 및 최대 용해도를 실시예 4에 기술된 것과 동일한 방법으로 결정하였다. 결과를 표 16 및 표 17에 나타냈다.
| 서열 번호 | 구조 | pH | ||||||||
| 3.0 | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 | 8.0 | 9.0 | 10.0 | 11.0 | ||
| 서열 번호 288 | SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG-MIC-1-Δ3 | 8.81 | 4.22 | 1.34 | 5.18 | 13.52 | 15.65 | 15.1 | 15.84 | 15.97 |
| 서열 번호 289 | SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG-MIC-1(M57L, M86L) | 7.91 | 5.12 | 1.37 | 5.91 | 13.59 | 15.62 | 15.15 | 15.83 | 16.47 |
| 서열 번호 316 | GEQPCEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQP-MIC-1 | 6.24 | 3.14 | 2.54 | 4.71 | 9.43 | 13.24 | 14.21 | 15.21 | 15.2 |
| 서열 번호 | 구조 | 최대 용해도(mg/ml) |
| 서열 번호 288 | SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG-MIC-1-Δ3 | 36.1 |
| 서열 번호 289 | SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG-MIC-1(M57L, M86L) | 38.4 |
| 서열 번호 316 | GEQPCEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQP-MIC-1 | 32.1 |
Cys 돌연변이는 MIC-1 폴리펩티드에 N-말단 아미노산 연장부를 첨가함으로써 얻어진 개선된 용해도에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다.
실시예 10: MIC-1 화합물을 위한 프로트랙터 제조
실시예 10.1: 17-[(S)-1-카복시-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-포르밀벤질카바모일)메톡시]에톡시}에틸-카바모일)-메톡시]에톡시}에틸카바모일)프로필카바모일]헵타데칸산의 제조
(화학식 A)
t-Bu-N-(4-포르밀벤질) 카바메이트(100 mg)를 TFA/DCM(1:1)으로 1시간 동안 처리하였다. 혼합물을 진공에서 농축시키고 톨루엔과 함께 농축시켰다(2회). 잔류물을 THF(2.5 mL)에 용해시키고, THF(5 mL)에 17-((S)-1-카복시 -3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘 -1-일옥시카보닐 -메톡시)-에톡시]에틸카바모일}메톡시)에톡시]에틸카바모일}프로필카바모일)헵타데칸산의 용액(320 mg, WO2009/083549에 사전에 기술된 바와 같이 제조됨)을 첨가하였다. DIPEA(0.5 ml)를 서서히 첨가하였다. 130분 후, 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc 및 1N HCl에 용해시켰다. 유기층을 1N HCl 및 염수로 추출하였다. 유기층을 건조(Na2SO4) 및 진공에서 농축시켜서 표제 화합물을 백색 고체로 수득하였으며, 이를 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수율 234 mg(72%)
LCMS2: 이론적 질량: 851.0 수득: 851.5(M+1).
실시예 10.2(C16): 16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카복시-4-옥소-부틸]아미노]-16-옥소-헥사데칸산의 제조
(화학식 B)
고체상 합성 프로토콜:
디클로로 메탄(500 mL) 중 N-(벤질옥시카보닐옥시)숙신이미드(ZOSu, 100 g, 401 mmol)의 용액을 디클로로메탄(750 mL) 중 에틸렌디아민(1, 189 mL, 2.81 mol)의 용액에 2시간에 걸쳐 적가하였다. 30분 후 현탁액을 여과하고 고체를 디클로로메탄으로 세척하였다. 여액을 증발 건조시키고 잔류물을 톨루엔(1.00 L) 및 물(0.50 L)로 희석하였다. 생성된 혼합물을 여과하고 여액을 분리하여 2개의 상을 수득하였다. 수성상은 생성물을 함유하였고, 따라서 이를 디클로로메탄(2 x 250 mL)으로 추출하였다. 모든 유기상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 톨루엔(750 mL)으로 희석하고 2 M 수성 염산(500 mL) 및 1 M 수성 염산(100 mL)으로 추출하였다. 산성 수성상을 합하고 물(90 mL) 중 수산화 나트륨 용액(60.0 g, 1.50 mol)으로 염기성화시켰다. 생성된 혼합물을 디클로로메탄(4 x 200 mL)으로 추출하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하고 헥산 (200 mL)으로 희석하였다. 에테르 중 4 M 염화수소 용액(100 mL, 400 mmol)을 용액에 첨가하고, 생성된 현탁액을 진공에서 농축하고 헥산(1.00 L)으로 희석하였다. 침전된 고체를 여과하고, 헥산으로 세척하고, 진공에서 건조하여 (2-아미노-에틸)-카르밤산 벤질 에스테르 염산염을 백색 분말로 수득하였다.
수율: 62.62 g (68%).
RF (SiO2, 디클로로메탄/메탄올 4:1): 0.25 (유리 염기).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, 80 ℃, dH): 7.42-7.26 (m, 5 H); 5.16 (s, 2 H); 3.60 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 3.32 (t, J=5.7 Hz, 2 H).
2-클로로트리틸 수지 100~200 메쉬 1.7 mmol/g(3, 40.1 g, 68.1 mmol)을 건조 디클로로메탄(250 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(50 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-Ado-OH, 17.5 g, 45.4 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(30.1 mL, 173 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 5시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(15.8 mL, 90.8 mmol)의 용액으로 처리하였다(4:1, 250 mL, 2 x 5분). 그런 다음 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 250 mL)로 세척하였다. 디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 250 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 250 mL), 2-프로판올(2 x 250 mL) 및 디클로로메탄(300 mL, 2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(140 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-Ado-OH, 26.3 g, 68.1 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TCTU, 24.2 g, 68.1 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(21.4 mL, 123 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(250 mL)로 세척하였다. 디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 250 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 250 mL), 2-프로판올(2 x 250 mL) 및 디클로로메탄(300 mL, 2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(140 mL) 중 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-펜탄디온산 1-터트-부틸 에스테르(Fmoc-Glu-OtBu, 29.0 g, 68.1 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TCTU, 24.2 g, 68.1 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(21.4 mL, 123 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 250 mL), 디클로로메탄(2 x 250 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(250 mL)로 세척하였다. 디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 250 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 250 mL), 2-프로판올(2 x 250 mL) 및 디클로로메탄(300 mL, 2 x 250 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드/디클로로메탄 혼합물(4:1, 200 mL)에서 16-(터트-부톡시)-16-옥소헥사데칸산(23.3 g, 68.1 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TCTU, 24.2 g, 68.1 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(21.4 mL, 123 mmol)을 수지에 첨가하였다. 수지를 1시간 동안 진탕시키고, 여과하고, N,N-디메틸포름아미드(3 x 250 mL), 디클로로메탄(2 x 250 mL), 메탄올(2 x 250 mL) 및 디클로로메탄(350, 6 x 250 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(250 mL)로 18시간 동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하여 제거하고 디클로로메탄(2 x 250 mL), 2-프로판올/디클로로메탄 혼합물(1:1, 2 x 250 mL), 2-프로판올(250 mL) 및 디클로로메탄(3 x 250 mL)으로 세척하였다. 용액을 조합하였다: 용매를 증발시키고 조 생성물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040~0.060 mm; 용리제: 디클로로메탄/메탄올 1:0~9:1)로 정제하였다. 순수 (S)-22-(터트-부톡시카보닐)-41,41-디메틸-10,19,24,39-테트라옥소-3,6,12,15,40-펜타옥사-9,18,23-트리아자도테트라콘탄산을 진공에서 건조하고 담황색 두꺼운 황색 오일로서 수득하였다.
수율: 30.88 g (83%).
RF (SiO2, 디클로로메탄/메탄올 4:1): 0.30
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, dH): 7.36 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 7.02 (t, J=5.4 Hz, 1 H); 6.55 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 4.46 (m, 1 H); 4.18 (s, 2 H); 4.02 (s, 2 H); 3.83-3.36 (m, 16 H); 2.44-2.12 (m, 7 H); 2.02-1.86 (m, 1 H); 1.60 (m, 4 H); 1.47 (s, 9 H); 1.45 (s, 9 H); 1.36-1.21 (m, 20 H).
LC-MS 방법 4:
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.60분.
수득 m/z, z=1: 818.7 (M+H)+
2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU, 11.4 g, 30.1 mmol) 및 트리에틸아민(8.77 mL, 62.9 mmol)을 이어서 건조 디클로로메탄(110 mL) 중 (S)-22-(터트-부톡시카보닐)-41,41-디메틸-10,19,24,39-테트라옥소-3,6,12,15,40-펜타옥사-9,18,23-트리아자도테트라콘탄산(22.4 g, 27.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 트리에틸아민(5.72 mL, 41.0 mmol)을 건조 디클로로메탄(165 mL) 중 (2-아미노-에틸)-카르밤산 벤질 에스테르 염산염(6.94 g, 30.1 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 증발 건조시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(500 mL)에 재용해시키고, 1 M 수성 염산(2 x 200 mL), 5% 탄산나트륨 수용액(2 x 200 mL, 상의 매우 느린 분리), 1 M 수성 염산(8 x 200 mL) 및 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 진공에서 증발 건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040~0.060 mm; 용리제: 디클로로메탄/메탄올 95:5)에 의해 정제하여 15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-벤질옥시카보닐아미노-에틸카바모일)-메톡시]-에톡시}-에틸카바모일)-메톡시]-에톡시}-에틸카바모일)-1-터트-부톡시카보닐-프로필카바모일]-펜타데칸산 터트-부틸 에스테르를 담황색 두꺼운 오일로서 수득하였다.
수율: 23.84 g (88%)
RF (SiO2, 디클로로메탄/메탄올 9:1): 0.35
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.39-7.26 (m, 6 H); 7.19 (t, J=6.3 Hz, 1 H); 6.91 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 6.52 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 5.83 (t, J=5.5 Hz, 1 H); 5.09 (s, 2 H); 4.41 (ddd, J=12.3, 4.6 and 4.3 Hz, 1 H); 3.99 (s, 2 H); 3.97 (s, 2 H); 3.71-3.30 (m, 20 H); 2.33-2.08 (m, 7 H); 1.97-1.83 (m, 1 H); 1.67-1.51 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.35-1.20 (m, 20 H).
LCMS 방법 4
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 4.18분
수득 m/z, z=1: 994.9 (M+H)+
탄소 상의 팔라듐(10%, 1.27 g, 1.20 mmol)을 메탄올(350 mL) 중 상기 화합물(23.8 g, 24.0 mmol)의 용액에 첨가하고 생성된 혼합물을 4시간 동안 정상 압력에서 수소화하였다. 촉매를 여과하여 제거하고 여액을 증발 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄으로부터 여러 번 증발시켜 메탄올의 잔류물을 제거하고 진공에서 건조하여 터트-부틸 (S)-1-아미노-25-(터트-부톡시카보닐)-4,13,22,27-테트라옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12,21,26-테트라아자도테트라콘탄-42-오에이트를 두꺼운 무색 오일로서 수득하였다.
수율: 20.50 g (99%).
RF (SiO2, 디클로로메탄/메탄올 9:1): 0.05.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.54 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 7.41 (t, J=5.6 Hz, 1 H); 7.14 (t, J=5.5 Hz, 1 H); 6.68 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 5.25 (bs, 2 H); 4.39 (td, J=8.3 and 4.2 Hz, 1 H); 4.01 (s, 4 H); 3.74-3.39 (m, 18 H); 2.96 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 2.34-2.06 (m, 7 H); 1.97-1.83 (m, 1 H); 1.68-1.50 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.43 (s, 9 H); 1.37-1.19 (m, 20 H).
LCMS 방법 4
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 1.43분
수득 m/z, z=1: 860.8 (M+H)+
N,N-디이소프로필에틸아민(4.98 mL, 28.6 mmol)을 건조 디클로로메탄(290 mL) 중 상기 아민(6, 20.5 g, 23.8 mmol)의 용액에 -30℃ 아르곤 하에서 첨가하였다. 브로모아세틸 브로마이드(2.48 mL, 28.6 mmol)를 적가하고 생성된 용액을 -30℃에서 추가 3시간 동안 교반하였다. 냉각 욕조를 제거하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(450 mL)에 재용해시키고 시트르산(300 mL)의 5% 수용액으로 세척하였다. 상을 1시간 이내에 분리하였다. 유기층을 물(300 mL)로 세척하고 생성된 유화액을 밤새 방치하여 분리해서 3개의 상을 수득하였다. 투명한 수성층을 제거하고, 남은 2개의 상에 브롬화 칼륨(100 mL)의 포화 수성 용액을 첨가하여 진탕시켰다. 상을 밤새 방치하여 분리하고, 수성층을 제거한 후, 무수 황산나트륨으로 유기층을 건조시켰다. 용매를 진공에서 제거하고 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040~0.060 mm; 용리제: 디클로로메탄/메탄올 95:5)에 의해 정제하여 터트-부틸 (S)-1-브로모-28-(터트-부톡시카보닐)-2,7,16,25,30-펜타옥소-9,12,18,21-테트라옥사-3,6,15,24,29-펜타아자펜타테트라콘탄-45-오에이트를 무색 고체로서 수득하였다.
수율: 19.46 g (83%).
RF (SiO2, 디클로로메탄/메탄올 9:1): 0.25
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.46 (m, 1 H); 7.33 (t, J=5.9 Hz, 1 H); 7.21 (t, J=5.1 Hz, 1 H); 6.92 (t, J=5.2 Hz, 1 H); 6.50 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 4.41 (ddd, J=12.2, 4.5 and 4.2 Hz, 1 H); 4.01 (s, 4 H), 3.85 (s, 2 H); 3.75-3.40 (m, 20 H), 2.36-2.08 (m, 7 H); 1.99-1.84 (m, 1 H); 1.68-1.51 (m, 4 H), 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.38-1.19 (m, 20 H)
LCMS 방법 4
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.51분.
수득 m/z, z=1: 980.9, 982.9 (M+H)+
상기 화합물(19.5 g, 19.8 mmol)을 트리플루오로아세트산(120 mL)에 용해시키고 생성된 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 트리플루오로아세트산을 진공에서 제거하고 잔류물을 디클로로메탄(6 x 200 mL)에서 증발시켰다. 디에틸 에테르(200 mL)를 유성 잔류물에 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하여 현탁액을 수득하였다. 고체 생성물을 여과하고, 디에틸 에테르 및 헥산으로 세척하고, 진공에서 건조하여 표제 생성물 15-{(S)-1-카복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}펜타데칸산을 백색 분말로 수득하였다.
수율: 16.74 g (97%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.61 (dd, J=8.8 and 4.8 Hz, 1 H); 4.12 (s, 2 H), 4.10 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77 -3.39 (m, 20 H), 2.49-2.18 (m, 7 H); 2.16-1.04 (m, 1 H); 1.71-1.56 (m, 4 H), 1.30 (bs, 20 H)
LCMS 방법 4
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.51분
이론적 m/z, z=1: 869,8, 수득: m/z, z=1: 868.7, 870.7
실시예 10.3(C14): 14-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카복시-4-옥소-부틸]아미노]-14-옥소-테트라데칸산의 제조
(화학식 C)
13-{(S)-1-카복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}트리데칸산을 실시예 10.2에 기술된 것과 동일한 방법으로 제조하여 진한 황색 오일을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.61 (dd, J=8.9 and 4.9 Hz, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.11 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77-3.40 (m, 20 H); 2.49-2.18 (m, 7 H); 2.16-2.07 (m, 1 H); 1.70-1.56 (m, 4 H); 1.31 (bs, 16 H).
LCMS 방법 4
순도: 100%(ELSD)
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.94분
이론적 m/z, z=1: 841.9, 수득: m/z, z=1: 841.7, 843.7
실시예 10.4(C18): 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산
(화학식 D)
용액 상 합성 프로토콜:
단계 1: 벤질 18-[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-벤질옥시카보닐-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산
0℃에서 DCM(80 ml) 및 트리에틸아민(5.2 ml) 중 에틸렌디아민(8.2 ml)의 용액에, DCM(320 ml) 중, WO10029159에 기술된 바와 같이 제조된, 벤질 18-[[(1S)-1-벤질옥시카보닐-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥타데칸산(26 g)의 용액을 75분 동안 적가하였다. 2시간 동안 교반한 후 침전물을 여과하여 제거하였다. 여액에 물(200 ml) 및 이소프로판올(50 ml)을 첨가하였다. 혼합물을 추출하였다. 유기층을 MgSO4를 사용하여 건조시켰다. MgSO4를 여과하여 제거하고 여액을 진공에서 건조시켜 표제 화합물을 20,07 g(81%) 수득하였다. LCMS 이론적 질량: 956.2, 수득: m/z, z=1: 957.0
단계 2: 벤질 18-[[(1S)-1-벤질옥시카보닐-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-클로로아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산
클로로아세트산(0,19 g)을 DCM(15 ml)에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(0.22g) 및 EDAC HCl(0.42g)을 첨가하였다. 2.5시간동안 교반 후 벤질 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-벤질옥시카보닐-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산(1.5g)을 DCM(5 ml)에 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 혼합물을 1M HCl(2x20 ml) 및 물/염수 2:1(30 ml)로 추출하였다. 유기층을 건조하고(MgSO4), 여과하고 진공에서 농축시켜 투명한 오일, 1.37 g(84%)을 수득하였다.
LCMS: 이론적 질량: 1032.7; m/z, z=1: 1033.1
단계 3: 18-[[(1S)-1-카복시-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-클로로아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산
아세톤(140 ml) 중 벤질 18-[[(1S)-1-벤질옥시카보닐-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-클로로아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산(10.5 g)의 용액을 질소 통기 후 10% PD/C(1.0 g)에 첨가하였다. 6시간 동안 수소화 후, 혼합물을 여과 전에 40~50℃로 가열하였다. 저온 여액 내의 침전물을 분리하고 아세톤으로 세척하고 건조시켜 표제 화합물 7.42 g(85%)을 수득하였다.
단계 4: 8-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산
아세톤(60 ml) 중 18-[[(1S)-1-카복시-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-클로로아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산의 현탁액에 브롬화 나트륨(5 eq, 1.21 g)을 첨가하였다. 혼합물을 실온의 암실에서 교반하였다. 2시간 후, 브롬화 나트륨(10 eq, 2.41 g)을 더 첨가하였다. 2일 후, 브롬화 나트륨(5 eq, 1.21 g)을 더 첨가하였다. 5일 후, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물의 절반에 DCM(30 ml), 10% 아스코르브산(20 ml) 및 물 30 ml를 첨가하였다. 유화액에 이소프로판올(50 ml) 및 물(30 ml)을 첨가하였다. 유기상을 분리하고 10% 아스코르브산(20 ml) 및 이소프로판올(10 ml)의 혼합물로 2회 세척하였다. 유기층을 건조하고(MgSO4), 여과하고 농축시켜, 고체 오일을 수득하고, 이를 아세톤에서 결정화시키고 여과로 분리하여 출발 물질로 오염된 표제 화합물 0.80 g(72%)을 수득하였다.
LCMS: 이론적 질량: 896.9. 수득 m/z, z=1: 898.9(M+1)
실시예 10.5(C12): 12-[[(1S)-1-카복시-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(4-포르밀페닐)메틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-12-옥소-도데칸산의 제조
(화학식 E)
화합물을 실시예 10.1에 기술된 바와 동일한 방법으로 제조하였다.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.39-7.29 (m, 1 H); 7.03-6.93 (m, 1 H); 6.59-6.51 (m, 1 H); 4.49-4.37 (m, 1 H); 4.15 (s, 2 H); 4.01 (s, 2 H); 3.78-3.39 (m, 16 H); 2.36-2.10 (m, 7 H); 2.01-1.85 (m, 1 H); 1.68-1.50 (m, 4 H); 1.48-1.41 (m, 18 H); 1.34-1.22 (m, 12 H).
실시예 10.6: (2S)-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-5-옥소-2-(16-술포헥사데카노일아미노)펜탄산의 제조
(화학식 F)
2-클로로트리틸 수지 100~200 메쉬 1.5 mmol/g(18.0 g, 27.0 mmol)을 건조 디클로로메탄(160 mL)에서 20분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(100 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 6.94 g, 18.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(12.5 mL, 72.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(4.12 mL, 23.7 mmol)의 용액으로 처리하였다(4:1, 2 x 5분, 2 x 100 mL). 그런 다음 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 100 mL), 디클로로메탄(2 x 100 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 100 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 100 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 100 mL), 2-프로판올(2 x 100 mL) 및 디클로로메탄(3 x 100 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(100 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 10.4 g, 27.0 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 9.60 g, 27.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(8.50 mL, 48.6 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 100 mL), 디클로로메탄(2 x 100 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 100 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 100 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 100 mL), 2-프로판올(2 x 100 mL) 및 디클로로메탄(3 x 100 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(100 mL) 중 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-펜타디온산 1-터트-부틸 에스테르(Fmoc-gGlu-OtBu, 11.5 g, 27.0 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 9.60 g, 27.0 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(8.50 mL, 48.6 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 100 mL), 디클로로메탄(2 x 100 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(2 x 100 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 100 mL). 수지(2)를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 100 mL), 2-프로판올(2 x 100 mL) 및 디클로로메탄(3 x 100 mL)로 세척하였다. 수지를 4등분 하고, 이 합성을 원래 양(4.50 mmol)의 1/4로 계속하였다. 디메틸 술폭시드(180 mL) 중 나트륨 16-술포-헥사데칸산(3, 6.16 g, 17.2 mmol, 제조는 REaD-22296 화합물의 합성을 위한 절차에서 기술됨, Batch No.195-257-1), (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP, 8.95 g, 17.2 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(6.00 mL, 34.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 4시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 100 mL), N,N-디메틸포름아미드/물(2:1, 2 x 100 mL), 디메틸술폭시드(2 x 100 mL), 물(2 x 100 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 100 mL)로 세척하였다. 생성물을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(80 mL)로 2시간 동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(4 x 100 mL)으로 세척하였다. 용액을 조합하고, 휘발성 물질을 증발시키고, 정제하지 않은 (S)-22-(터트-부톡시카보닐)-10,19,24-트리옥소-39-술포-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자노나트리아콘탄산(4)을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
수율: 정량적(ELSD 기준).
LC-MS 순도: 96%.
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 100 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.07분.
LC-MS m/z: 812.9(M+H)+.
이어서 1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(V)(HATU, 1.87 g, 4.92 mmol) 및 트리에틸아민(3.43 mL, 24.6 mmol)을 건조 디클로로메탄(40 mL) 중 (S)-22-(터트-부톡시카보닐)-10,19,24-트리옥소-39-술포-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자노나트리아콘탄산(4.5 mmol)의 용액에 첨가하였다(40 mL). 트리에틸아민(1.82 mL, 13.1 mmol)을 건조 디클로로메탄(20 mL) 중 (2-아미노-에틸)-카르밤산 벤질 에스테르 염산염(5, 1.93 g, 8.37 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 16시간 후, 1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(V)(HATU, 0.38 g, 1 mmol), 트리에틸아민(2.00 mL, 14.3 mmol) 및 (2-아미노-에틸)-카르밤산 벤질 에스테르 염산염(5, 0.40 g, 1.70 mmol)의 또 다른 부분을 첨가하고, 혼합물을 또 다른 2시간 동안 교반하였다. 용액을 1 M 수성 염산(2 x 100 mL) 및 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 증발 건조시켰다. 정제하지 않은 (S)-29-(터트-부톡시카보닐)-3,8,17,26,31-펜타옥소-1-페닐-2,10,13,19,22-펜타옥사-4,7,16,25,30-펜타아자헥사테트라콘탄-46-술폰산(6)을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
수율: 정량적(ELSD 기준).
LC-MS 순도: 83%(ELSD).
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.35분.
LC-MS m/z: 989.1(M+H)+.
탄소 상의 팔라듐(10%, 0.22 g, 0.20 mmol)을 메탄올(100 mL) 중 상기 화합물(4.50 mmol)의 용액에 첨가하고 생성된 혼합물을 16시간 동안 정상 압력에서 수소화한 다음 1시간 동안 40℃에서 초음파 처리하였다. 촉매를 CeliteTM로 여과하여 제거하고 여액을 감압하여 증발 건조시켰다. 잔류물을 preparative HPLC(컬럼 DeltaPak C18, 15 m; 50 x 500 mm; 아세토니트릴/물 30:70 80분 동안 + 0.05% TFA)로 정제하고 동결 건조시켜 (S)-1-아미노-25-(터트-부톡시카보닐)-4,13,22,27-테트라옥소-6,9,15,18-테트라옥소-3,12,21,26-테트라아자도테트라콘탄-42-술폰산(7)을 무색 고체로 수득하였다.
수율: 1.95 g(1로부터 45%).
LC-MS 순도: 98%(ELSD).
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.87분.
LC-MS m/z: 854.7(M+H)+.
2,4,6-콜리딘(1.60 mL, 12.0 mmol)을 0℃아르곤 하에서 무수 N,N-디메틸포름아미드(20 mL) 중 상기 아민(7, 2.06 g, 2.11 mmol)의 용액에 첨가하였다. 2-브로모아세틱 무수물(0.68 g, 2.61 mmol)을 첨가하고 생성된 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 감압하여 증발 건조시키고, 잔류물을 디에틸 에테르(2 x 10 mL)로 분쇄하였다. 남은 화합물 (S)-1-브로모-28-(터트-부톡시카보닐)-2,7,16,25,30-펜타옥소-9,12,18,21-테트라옥사-3,6,15,24,29-펜타아자펜타테트라콘탄-45-술폰산(8)을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
수율: 정량적(ELSD 기준).
LC-MS 순도: 95%(ELSD).
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.04분.
LC-MS m/z: 976.9(M+H)+.
상기 화합물 (8, 2.00 mmol)을 디클로로메탄(20 mL), 물(2 mL) 및 트리플루오로아세트산(25 mL)에 용해시키고 생성된 용액을 2시간 동안 교반하였다. 트리플루오로아세트산을 감압하여 제거하고 잔류물을 디클로로메탄(3 x 80 mL)과 함께 공동 증발시켰다. 잔류물을 preparative HPLC(컬럼 DeltaPak C18, 15 m; 50 x 500 mm; 아세토니트릴/물 30:70 70분 동안 + 0.05% TFA)로 정제하고 동결 건조시켜 (S)-1-브로모-2,7,16,25-테트라옥소-28-(16-술포헥사데칸아미도)-9,12,18,21-테트라옥사-3,6,15,24-테트라아자노나콘산-29-오익산(9)을 흰색 고체로 수득하였다.
수율: 1.92 g(2단계에 걸쳐 98%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, AcOD-d4, 80 C, dH): 4.68-4.58 (m, 1 H); 4.20-4.08 (m, 4 H); 3.94 (s, 2 H); 3.82-3.64 (m, 12 H); 3.60-3.46 (m, 8 H); 3.20-3.10 (m, 2 H); 2.51 (t, J=7.2 Hz, 2 H); 2.37 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 2.26 (bs, 1 H); 1.92-1.80 (m, 2 H); 1.73-1.62 (m, 2 H); 1.55-1.44 (m, 2 H); 1.43-1.29 (m, 21 H).
LC-MS 순도: 95%(ELSD).
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.73분.
LC-MS m/z: 920.9(M+H)+.
실시예 10.7: (2S)-6-[(2-브로모아세틸)아미노]-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(1H-테트라졸-5-일)헵타데카노일술파모일]부타노일아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥산산의 제조
(화학식 G)
Wang Fmoc-Lys(Mtt) 수지 0.29 mmol/g(17.24 g, 5.0 mmol)을 DMF(60 mL)에서 팽윤하도록 방치하고 7 x 5분 동안 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(2 x 60 mL, 2 x 15분). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(6 x 60 mL)로 세척하였다. 2개의 반응을 위해 Fmoc-OEG-OH를 측량하였다(2 x 20 mmol 15.416g). Oxyma(0.3M)와 함께 120 mL DMF에서 용해시키고 2개의 53 mL 부피로 나누었다. DMF(53.2 mL, 0.3 M) 중 Fmoc-OEG-OH 및 Oxyma의 용액을 DMF 중 DIC(26.6 mL, 0.6 M)와 혼합하였다. AA를 10분에 걸쳐 활성화시킨 다음 수지에 첨가하고 혼합물을 8시간 동안 진탕시켰다.
수지를 배수하고 N,N-디메틸포름아미드(4 x 60 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(2 x 60 mL, 2 x 15분). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(6 x 60 mL)로 세척하였다. DMF(53.2 mL, 0.3 M) 중 Fmoc-OEG-OH 및 Oxyma의 용액을 DMF 중 DIC(26.6 mL, 0.6M)와 혼합하였다. AA를 10분에 걸쳐 활성화시킨 다음 수지에 첨가하고 혼합물을 8시간 동안 진탕시켰다. 수지를 배수하고 N,N-디메틸포름아미드(4 x 60 mL)로 세척한 후 아세토니트릴(2 x 60 mL, 2 x 8시간)로 세척하였다.
상기 수지, 0.27 mmol/g(2.46 g, 0.66 mmol)을 DMF(12 mL, 3 x 5분)에서 팽윤시켰다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(2 x 12 mL, 1 x 15분 + 1 x 30분). 수지를 N,N-디메틸포름아미드 (2 x 15 mL), DCM(2 x 15 mL), DMF(2 x 15 mL)로 세척하였다.
N,N-디메틸포름아미드(15 mL) 중 4-[17-(1H-테트라졸-5-일)헵타데카노일술파모일]부탄산(0.966 g, 1.98 mmol), Oxyma(0.281 g, 1.98 mmol) 및 DIC(0.309 mL)의 용액을 제조하고 약 10분 동안 방치하여 아미노산을 활성화시켰다. 이어서, 혼합물을 반응 튜브에 첨가하고 밤새 진탕시켰다.
수지를 배수하고 N,N-디메틸포름아미드(2 x 15 mL), DCM(5 x 15 mL)으로 세척하였다. MTT기를 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올/DCM/트리이소프로필실란 80/18/2, 3 x 20 ml(각 처리 사이에 DCM으로 세척, 3 x 20분)로 절단한 다음, 4 x 20 mL DCM으로 세척하였다. 10 mL DMF 중 브로모아세트산(1.10 g, 7.92 mmol) 및 DIC(0.62 mL, 3.96 mmol)을 수지에 첨가하고 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 20 mL) 및 디클로로메탄(5 x 20 mL)로 세척하였다.
생성물을 1시간 동안 20 mL의 TFA(98%), 물(2%)을 이용하여, 0.5시간 동안 20 mL의 TFA(98%), 물(2%)을 이용하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 20 mL DCM으로 세척하였다. 용매를 증발시켜 황색 오일을 수득하였다. 오일을 EtOAc(50 mL)에 용해시키고 물 2 x 100 mL로 세척하였다. EtOAc 층에 백색 고체를 시켰다. EtOAc의 양을 진공에서 감소시키고 여과하였다. 침전물을 EtOAc로 세척하고 필터 상에서 건조시켜 270 mg의 백색 고체를 수득하였다.
LC-MS m/z: 1026.39 (M+H)+ .
실시예 10.8: 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-5-카복시펜틸]아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카복시-4-옥소부틸]아미노]-10-옥소데크옥시]벤조산의 제조
(화학식 H)
2-클로로트리틸 수지 100~200 메쉬 1.5 mmol/g(1, 2.70 g, 4.05 mmol)을 건조 디클로로메탄(40 mL)에서 30분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(40 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 1.04 g, 2.70 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(1.82 mL, 10.3 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(0.94 mL, 5.40 mmol)의 용액으로 처리하였다(4:1, 2 x 5분, 2 x 40 mL). 그런 다음 수지를 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL), 디클로로메탄(4 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 10분, 1 x 30분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 3.18 g, 8.20 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 2.93 g, 8.20 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.87 mL, 16.4 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL), 디클로로메탄(4 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 10분, 1 x 30분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-펜타디온산 1-터트-부틸 에스테르(Fmoc-L-Glu-OtBu, 3.50 g, 8.20 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 2.93 g, 8.20 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.87 mL, 16.4 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL), 디클로로메탄(4 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 10분, 1 x 30분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 10-(4-(터트-부톡시카보닐)페녹시)데칸산(CNB, 3.00 g, 8.20 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 2.93 g, 8.20 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.87 mL, 16.4 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고, N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL), 디클로로메탄(4 x 40 mL), N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL) 및 디클로로메탄(10 x 40 mL)으로 세척하였다.
생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(40 mL)로 밤새 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(4 x 40 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발 건조시켜 순수 (S)-22-(터트-부톡시카보닐)-33-(4-(터트-부톡시카보닐)페녹시)-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자트리트리아콘탄산을 황색 오일로서 수득하였다.
수율: 2.26 g(100%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, dH): 7.95-7.87 (m, 2 H); 7.41-7.32 (m, 1 H); 7.05-6.95 (m, 1 H); 6.92-6.82 (m, 2 H); 6.61 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 4.49-4.37 (m, 1 H); 4.15 (s, 2 H); 4.04-3.95 (m, 4 H); 3.76-3.36 (m, 17 H); 2.39-2.09 (m, 5 H); 2.04-1.85 (m, 1 H); 1.84-1.70 (m, 2 H); 1.67-1.52 (m, 10 H); 1.50-1.39 (m, 11 H); 1.37-1.24 (m, 8 H).
LC-MS 순도: 100%(ELSD).
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 4.49분.
LC-MS m/z: 841.2(M+H)+.
Wang-Fmoc-Lys(Mtt)-OH 수지 0.33 mmol/g(3, 4.15 g, 1.37 mmol)를 디클로로메탄(50 mL)에서 30분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 디클로로메탄(2 x 5 분, 2 x 10 분, 1 x 15 분, 1 x 30 분, 6 x 50 mL)에서 80% 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판-2-올로 처리하여 Mtt 기를 제거하였다. 수지 3을 디클로로메탄 (1 x 50 mL) 및 디클로로메탄 (2 x 50 mL)에서 디클로로메탄(4 x 70 mL), 10% N,N-디이소프로필에틸아민으로 세척하였다.
N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 중 (S)-22-(터트-부톡시카보닐)-33-(4-(터트-부톡시카보닐)페녹시)-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자트리트리아콘탄산(2, 2.30 g, 2.73 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥시드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 0.97 g, 2.73 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(1.20 mL, 6.85 mmol)의 용액을 수지에 용액에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(4 x 50 mL), 디클로로메탄(4 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 10분, 1 x 30분, 2 x 50 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 50 mL), 2-프로판올(2 x 50 mL) 및 디클로로메탄(3 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 중 브로모아세트산(0.76 g, 5.48 mmol), N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC, 0.85 mL, 5.48 mmol), 2,4,6-콜리딘(0.91 mL, 5.48 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고, N,N-디메틸포름아미드(4 x 50 mL), 디클로로메탄(4 x 50 mL), N,N-디메틸포름아미드(4 x 50 mL) 및 디클로로메탄(10 x 40 mL)으로 세척하였다. 생성물(4)을 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 혼합물(2:1, 30 mL)로 3시간 동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(4 x 40 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발 건조시켜 순수 (2S,29S)-29-(2-브로모아세트아미도)-2-(10-(4-카복시페녹시)데칸아미도)-5,14,23-트리옥소-9,12,18,21-테트라옥사-6,15,24-트리아자트리아콘탄디오산(4)을 황색 오일로 수득하였다.
수율: 1.33 g(100%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, DMSO-d6 + DCl, dH): 7.93-7.76 (m, 2 H); 7.05-6.89 (m, 2 H); 4.16-4.05 (m, 3 H); 4.05-3.93 (m, 2 H); 3.93-3.79 (m, 5 H); 3.60-3.48 (m, 9 H); 3.46-3.32 (m, 4 H); 3.30-3.21 (m, 2 H); 3.21-3.12 (m, 2 H); 3.10-3.00 (m, 2 H); 2.19-1.77 (m, 6 H); 1.77-1.49 (m, 7 H); 1.48-1.22 (m, 12 H).
LC-MS 순도: 95%(ELSD).
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.02분.
LC-MS m/z: 977.3(M+H)+.
실시예 10.9: 4-[12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(6S)-6-[(2-브로모아세틸)아미노]-6-카보시헥실]아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카복시-4-옥소부틸]아미노]-12-옥소도데크옥시]벤조산의 제조
(화학식 K)
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 100~200 메쉬 1.5 mmol/g(2.60 g, 3.90 mmol)을 건조 디클로로메탄(40 mL)에서 30분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 건조 디클로로메탄(40 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 1.02 g, 2.60 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(1.75 mL, 10.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 메탄올/디클로로메탄 혼합물 중 N,N-디이소프로필에틸아민(0.90 mL, 5.20 mmol)의 용액으로 처리하였다(4:1, 2 x 5분, 2 x 40 mL). 그런 다음 수지를 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL), 디클로로메탄(4 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 10분, 1 x 30분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산(Fmoc-OEG-OH, 3.06 g, 7.90 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 2.82 g, 7.90 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.76 mL, 15.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL), 디클로로메탄(4 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 10분, 1 x 30분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-펜타디온산 1-터트-부틸 에스테르(Fmoc-L-Glu-OtBu, 3.40 g, 7.90 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 2.82 g, 7.90 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.76 mL, 15.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL), 디클로로메탄(4 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 10분, 1 x 30분, 2 x 40 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL), 2-프로판올(2 x 40 mL) 및 디클로로메탄(3 x 40 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 40 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40 mL) 중 12-(4-(터트-부톡시카보닐)페녹시)도데칸산(CUB, 3.12 g, 7.90 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 2.82 g, 7.90 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.76 mL, 15.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고, N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL), 디클로로메탄(4 x 40 mL), N,N-디메틸포름아미드(4 x 40 mL) 및 디클로로메탄(10 x 40 mL)으로 세척하였다.
생성물을 2,2,2-트리플루오에탄올(40 mL)로 밤새 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(4 x 40 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발 건조시켜 순수 (S)-22-(터트-부톡시카보닐)-35-(4-(터트-부톡시카보닐)페녹시)-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자펜타트리아콘탄산을 황색 오일로서 수득하였다.
수율: 1.93 g(86%).
LC-MS 순도: 100%(ELSD).
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 4.88분.
LC-MS m/z: 869.2(M+H)+.
Wang-Fmoc-Lys(Mtt)-OH 수지 0.33 mmol/g(3.40 g, 1.11 mmol)를 디클로로메탄(50 mL)에서 30분 동안 팽윤하도록 방치하였다. 디클로로메탄(2 x 5 분, 2 x 10 분, 1 x 15 분, 1 x 30 분, 6 x 50 mL)에서 80% 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판-2-올로 처리하여 Mtt 기를 제거하였다. 수지를 디클로로메탄 (1 x 50 mL) 및 디클로로메탄 (2 x 50 mL)에서 디클로로메탄(4 x 70 mL), 10% N,N-디이소프로필에틸아민으로 세척하였다.
N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 중 (S)-22-(터트-부톡시카보닐)-35-(4-(터트-부톡시카보닐)페녹시)-10,19,24-트리옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18,23-트리아자펜타트리아콘탄산(1.93 g, 2.22 mmol), 5-클로로-1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥시드 테트라플루오로보레이트(TCTU, 0.79 g, 2.22 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.86 mL, 6.66 mmol)의 용액을 수지에 용액에 첨가하고 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과하고 N,N-디메틸포름아미드(4 x 50 mL), 디클로로메탄(4 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 10분, 1 x 30분, 2 x 50 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 50 mL), 2-프로판올(2 x 50 mL) 및 디클로로메탄(3 x 50 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드(3 x 50 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(50 mL) 중 브로모아세트산(0.62 g, 4.44 mmol), N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC, 0.69 mL, 4.44 mmol), 2,4,6-콜리딘(0.59 mL, 4.44 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고, N,N-디메틸포름아미드(4 x 50 mL), 디클로로메탄(4 x 50 mL), N,N-디메틸포름아미드(4 x 50 mL) 및 디클로로메탄(10 x 40 mL)으로 세척하였다. 생성물을 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 혼합물(2:1, 30 mL)로 3시간 동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(4 x 40 mL)으로 세척하였다. 용매를 증발 건조시켜 순수 (2S,29S)-29-(2-브로모아세트아미도)-2-(12-(4-카복시페녹시)도데칸아미도)-5,14,23-트리옥소-9,12,18,21-테트라옥사-6,15,24-트리아자트리아콘탄디오산을 황색 오일로 수득하였다.
수율: 1.10 g(99%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, DMSO-d6 + DCl, dH): 7.93-7.74 (m, 2 H); 7.06-6.86 (m, 2 H); 4.20-3.93 (m, 5 H); 3.92-3.78 (m, 6 H); 3.54 (s, 9 H); 3.46-2.94 (m, 12 H); 2.19-1.84 (m, 5 H); 1.81-1.52 (m, 6 H); 1.51-1.23 (m, 15 H).
LC-MS 순도: 97%(ELSD).
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.20분.
LC-MS m/z: 1005.3(M+H)+.
실시예 10.10: (2S)-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소에톡시]에톡시]에틸아미노]-5-옥소-2-[16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데카노일아미노]펜탄산의 제조
(화학식 J)
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염(EDCHCl, 6.25 g, 32.6 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(70 mL) 중 16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데칸산(1, 5.28 g, 16.3 mmol) 및 N-히드록시숙시닉 이미드(HOSu, 3.75 g, 32.6 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 1 M 염산(400 mL) 수용액으로 희석시켰다. 정제하지 않은 생성물을 에틸 아세테이트(4 x 400 mL)으로 추출하고 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 용매를 감압하여 제거하였다. 2-프로판올(100 mL)을 유성 잔류물에 첨가하고 침전된 백색 고체를 여과하여 제거하였다. 백색 미정질 고체로서 2-프로판올(70 mL)로부터 재결정화해서 순수 생성물(2)을 수득하였다.
수율: 4.73 g(69%).
RF(SiO2, 에틸 아세테이트): 0.35.
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, AcOD-d4, dH): 3.02 (t, J=7.7 Hz, 2 H); 2.86 (s, 4 H); 2.62 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 1.90-1.63 (m, 4 H); 1.30 (bs, 22 H).
Fmoc-gGlu(tBu)-OEG-OEG-가 결합된 2-클로로트리틸 수지(11.5 mmol, 제조는 실시예 10.6의 프로트랙터의 합성을 위한 절차에 기술됨)를 디클로로메탄(100 mL)에서 20분 동안 방치하여 팽윤시켰다. 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2 x 100 mL)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다(1 x 5분, 1 x 30분, 2 x 100 mL). 수지를 N,N-디메틸포름아미드(3 x 100 mL), 2-프로판올(2 x 100 mL) 및 디클로로메탄(8 x 100 mL)로 세척하였다. 생성물을 2시간 동안 디클로로메탄(2:8, 80 mL)에서 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올로 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄(2 x 80 mL)으로 세척하였다. 용액을 합하였다: 용매를 증발시켜 생성물(4)를 갈색 오일로 수득하였다. 정제하지 않은 생성물은 2 당량의 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올을 함유하였다.
수율: 9.49 g(99%, 2 당량의 HFIP를 갖는 부가물로 계산).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, CDCl3, dH): 7.72-7.64 (m, 1 H); 7.59-7.50 (m, 1 H); 4.00 (s, 2 H); 3.94 (s, 2 H); 3.94-3.85 (m, 1 H); 3.71-3.32 (m, 16 H); 2.56-2.45 (m, 2 H); 2.42-2.26 (m, 1 H); 2.16-2.02 (m, 1 H); 1.49 (s, 9 H).
테트라하이드로푸란(50 mL) 중 상기 산(6.10 g, 7.93 mmol)과 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데카노에이트(2, 3.33 g, 7.93 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민(6.91 mL, 39.6 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 그런 다음 용매를 감압하여 제거하고, 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040~0.063 mm; 용리제: 디클로로메탄/메탄올/아세트산 15:1:0.2 내지 5:1:0.2)로 정제하였다. 잔류 아세트산을 아세토니트릴/물 혼합물 1:1로부터 동결 건조에 의해 제거하여 순수한(5) 회백색 고체로 수득하였다.
수율: 1.39 g(22%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, DMSO-d6, dH): 8.13-8.07 (m, 1 H); 8.01-7.93 (m, 1 H); 7.74-7.68 (m, 1 H); 4.11-3.99 (m, 1 H); 3.88 (s, 2 H); 3.82 (s, 2 H); 3.62-3.49 (m, 8 H); 3.49-3.37 (m, 4 H); 3.33-3.15 (m, 4 H); 2.73-2.65 (m, 2 H); 2.18-2.03 (m, 4 H); 1.94-1.81 (m, 1 H); 1.80-1.67 (m, 1 H); 1.66-1.53 (m, 2 H); 1.53-1.41 (m, 2 H); 1.38 (s, 9 H); 1.23 (s, 22 H).
N,N-디메틸포름아미드(30 mL) 중 상기 화합물(1.39 g, 1.73 mmol), 1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(V)(HATU, 657 mg, 1.73 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(1.21 mL, 6.90 mmol)의 용액에 벤질 (2-아미노에틸)카바메이트(6, 400 mg, 1.73 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 그런 다음 용매를 감압하여 제거하고, 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60, 0.040~0.063 mm; 용리제: 에틸 아세테이트/메탄올/아세트산 15:1:0.2 내지 디클로로메탄/메탄올/아세트산 15:1:0.2)로 정제하여 순수한 생성물(7)을 갈색의 점착성 고체로 수득하였다.
수율: 1.63 g(97%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, AcOD-d4, dH): 7.35 (bs, 5 H); 5.25-5.12 (m, 2 H); 4.50-4.42 (m, 1 H); 4.14 (s, 2 H); 4.09 (s, 2 H); 3.79-3.30 (m, 20 H); 3.02 (t, J=7.6 Hz, 2 H); 2.46-2.27 (m, 4 H); 2.26-2.09 (m, 1 H); 2.05-1.92 (m, 1 H); 1.88-1.72 (m, 2 H); 1.72-1.53 (m, 2 H); 1.47 (s, 9 H); 1.29 (bs, 22 H).
메탄올 중 상기 화합물(1.63 g, 1.67 mmol)의 용액에 수소 분위기에서 탄소 상 팔라듐(10%, 0.25 g, 0.23 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 격렬하게 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 짧은 규조토 패드를 통해 여과시키고 메탄올로 세척하였다. 용매를 감압하여 제거하고 순수한 생성물(8)을 백색 고체 발포체로 수득하였다.
수율: 1.32 g(94%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.50-4.42 (m, 1 H); 4.16-4.10 (m, 4 H); 3.71-3.61 (m, 14 H); 3.59-3.51 (m, 2 H); 3.51-3.45 (m, 2 H); 3.40-3.32 (m, 2 H); 3.02 (t, J=7.6 Hz, 2 H); 2.45-2.28 (m, 4 H); 2.27-2.12 (m, 1 H); 2.05-1.93 (m, 1 H); 1.89-1.74 (m, 2 H); 1.70-1.58 (m, 2 H); 1.47(s, 9 H); 1.30 (bs, 22 H).
상기 화합물(1.32 g, 1.57 mmol)을 트리플루오로아세트산(90 mL) 및 물(10 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 90분 후, 휘발성 물질을 감압하여 제거하고 잔류물을 톨루엔(3 x 50 mL)과 함께 증발시켰다. 잔류물을 N,N-디메틸포름아미드(15 Ml)에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 브로모아세틱 무수물(678 mg, 2.61 mmol) 및 중탄산 나트륨(2.02 g, 24.0 mmol)을 교반하면서 첨가하고 반응 혼합물을 주변 온도까지 승온시켰다. 60분 후, 추가 브로모아세틱 무수물(200 mg, 0.77 mmol)을 첨가하여 반응을 완료하였다. 30분 후, 용매를 감압하여 제거하고, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 및 물과 혼합되지 않는 갈색 액체를 수득하였다. 잔류물을 분별 깔때기에 넣고 에틸 아세테이트(50 mL) 및 물(50)에 용해시키려고 시도하였다. 3개의 상을 만들었다. 에틸 아세테이트 상과 수상을 제거하고 세 번째 상을 preparative HPLC(컬럼 labio DeltaPak C18, 15mm, 50 x 500 mm, 아세토니트릴/물 25:75 내지 50:50 + 0.05% TFA)로 정제하였다. 생성된 용액을 동결 건조하여 표제 생성물(9)을 백색 고체로 수득하였다.
수율: 210 mg(15%).
1H NMR 스펙트럼(300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.64-4.56 (m, 1 H); 4.12 (s, 2 H); 4.10 (s, 2 H); 3.95 (s, 2 H); 3.77-3.59 (m, 12 H); 3.59-3.37 (m, 8 H); 3.02 (t, J=7.6 Hz, 2 H); 2.44 (t, J=7.8 Hz, 2 H); 2.34 (t, J=8.0 Hz, 2 H); 2.28-2.18 (m, 1 H); 2.15-2.04 (m, 1 H); 1.86-1.70 (m, 2 H); 1.70-1.56 (m, 2 H), 1.29 (bs, 22 H).
LC-MS 순도: 100%.
LC-MS Rt(Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.35분.
LC-MS m/z: 908.8(M+H)+.
실시예 11: 프로트랙터를 갖는 MIC-1 화합물의 제조
실시예 11.1: 화합물 01
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1,des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 01)
30 mg 프로트랙터(실시예 10.4, 8 당량)를 1.5 mL의 포화 NaHCO3에 용해시키고, pH 7.4, 2.1 mg/mL PBS 완충액에서 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 288) 108 mg에 첨가하였다. 19 mg의 비스(p-술폰아토페닐)페닐포스핀, 칼륨염 이수화물, Sigma-Aldrich 698539(8 당량)를 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 방치한 후, 10~50% 에탄올/인산염 완충액 pH 3.0 구배를 사용하여 C4 역상 컬럼으로 단백질을 정제하였다. 정제 후 수율: ~20%
이론적 질량: 32006.3; 수득: 32006.5.
실시예 11.2: 화학물 02
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 02)
화합물 02는 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 291)를 사용하여 실시예 11.1에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 31974.3; 수득: 31974.0
실시예 11.3: 화합물 03
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(15-카복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(15-카복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 03)
화합물 03은 실시예 10.2에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 291)를 사용하여 실시예 11.1에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 31918.2; 수득: 31918.0.
실시예 11.4: 화합물 04
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(13-카복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(13-카복시트리데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 04)
화합물 04는 실시예 10.3에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 291)를 사용하여 실시예 11.1에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 31862.1; 수득: 31862.0.
실시예 11.5: 화합물 05
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 05)
화합물 05는 실시예 10.4에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 289)를 사용하여 실시예 11.1에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 31962.2; 수득: 31962.0.
실시예 11.6: 화합물 06
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 06)
화합물 06은 실시예 10.4에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 303)를 사용하여 실시예 11.1에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 31902.1; 수득: 31902.0
실시예 11.7: 화합물 07
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 07)
화합물 07은 실시예 10.4에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 292)를 사용하여 실시예 11.1에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 31874.1; 수득: 31873.0.
실시예 11.8: 화합물 08
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 08)
화합물 08은 실시예 10.4에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 293)를 사용하여 실시예 11.1에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 31902.1; 수득: 31901.0
실시예 11.9 및 실시예 11.10: 화합물 09 및 화합물 10
화합물 09:
N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
화합물 10:
N{A-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸,N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 09)
(화학식 10)
40% 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린 2 mL에 용해된 프로트랙터(실시예 10.1, 8 당량) 20 mg을 pH 7.4 PBS 완충액 40 mL에서 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 164) 75 mg에 첨가하였다. 보란 피리딘 복합체(8 M) 100 μL를 첨가하였다. 실온에서 24시간 방치한 후, 프로트랙터 20 mg 및 보란 시약 100 μL을 다시 첨가하였다.
48시간 후, 10~50% 에탄올/포스페이트 완충액 pH 3.0 구배를 사용하여 C4 역상 칼럼으로 모노 및 디알킬화 단백질 혼합물을 정제하였다. 정제 후 수율: ~19% 모노알킬화 단백질(화합물 09) 및 6% 디알킬화 단백질(화합물 10)
화합물 09: 이론적 질량: 31073.0; 수득: 31073.5
화합물 10: 이론적 질량: 31908.1; 수득: 31908.5
실시예 11.11: 화합물 11
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 11)
화합물 11은 실시예 10.4에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 290)를 사용하여 실시예 11.1에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 31934.1; 수득: 31938.5.
실시예 11.12 및 실시예 11.13: 화합물 12 및 화합물 13
화합물 12:
N{A-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸,N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA-4,AspA-3,AspA-2,AspA-1,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB-4,AspB-3,AspB-2,AspB-1[LysA1,GluA2,SerA3,LysB1,GluB2,SerB3]-MIC-1
화합물 13:
N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA-4,AspA-3,AspA-2,AspA-1,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB-4,AspB-3,AspB-2,AspB-1[LysA1,GluA2,SerA3,LysB1,GluB2,SerB3]-MIC-1
(화학식 12)
(화학식 13)
화합물 12 및 13은 실시예 10.1에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 311)를 사용하여 실시예 11.10에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
화합물 12: 이론적 질량: 28212.3; 수득: 28211.9
화합물 13: 이론적 질량: 27377.2; 수득: 27376.8
실시예 11.14: 화합물 14
N{A-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(11-카복시운데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸,N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(11-카복시운데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA-4,AspA-3,AspA-2,AspA-1,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB-4,AspB-3,AspB-2,AspB-1[LysA1,GluA2,SerA3,LysB1,GluB2,SerB3]-MIC-1
(화학식 14)
화합물 14는 실시예 10.5에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 311)를 사용하여 실시예 11.10에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 28043.9; 수득: 28043.6.
실시예 11.15 및 실시예 11.16: 화합물 15 및 화합물 16
화합물 15:
N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,ArgA69,LeuA86,ArgA91,ArgA107,LeuB57,ArgB69,LeuB86,ArgB91,ArgB107],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
화합물 16:
N{A-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸,N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]메틸]페닐]메틸-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,ArgA69,LeuA86,ArgA91,ArgA107,LeuB57,ArgB69,LeuB86,ArgB91,ArgB107],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 15)
(화학식 16)
화합물 15 및 16은 실시예 10.1에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 312)를 사용하여 실시예 11.10에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
화합물 15: 이론적 질량: 31241.1; 수득: 31242.0.
화합물 16: 이론적 질량: 32076.0; 수득: 32075.0.
실시예 11.17: 화합물 17
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(16-술포헥사데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-(16-술포헥사데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 17)
2M TRIS 완충액 4 mL를 pH 3, 2.2 mg/mL의 15 mM 시트르산/450 mM 염화나트륨에서 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 288) 176 mg에 첨가하였다. 실시예 10.6에 기술된 프로트랙터를 20 mg/L, 8당량이 되도록 포화 탄산 수소 나트륨에 용해시켰다. 이어서, 프로트랙터를 폴리펩티드 용액에 첨가하였다. 12.4 mg의 비스(p-술폰아토페닐)페닐포스핀, 물에 용해된 칼륨염 이수화물, Sigma-Aldrich 698539(0.1 mg/mL)를 첨가하고 반응 혼합물을 10초 동안 부드럽게 진탕시켰다. 6시간 후, 10~50% 에탄올/인산염 완충액 pH 3.0을 사용하여 C4 역상 컬럼을 사용한 C4 컬럼으로 화합물을 정제하였다.
이론적 질량: 32050.3; 수득: 32050.0.
실시예 11.18: 화합물 18
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{베타}-[2-[[(5S)-5-카복시-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(1H-테트라졸-5-일)헵타데카노일술파모일]부타노일아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]펜틸]아미노]-2-옥소에틸]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{베타}-[2-[[(5S)-5-카복시-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(1H-테트라졸-5-일)헵타데카노일술파모일]부타노일아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]펜틸]아미노]-2-옥소에틸]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 18)
화합물 18은 실시예 10.7에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 288)를 사용하여 실시예 11.17에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 32266.6; 수득: 32266.0.
실시예 11.19: 화합물 19
(화학식 19)
화합물 19는 실시예 10.8에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 288)를 사용하여 실시예 11.17에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 32166.3; 수득: 32166.0.
실시예 11.20: 화합물 20
(화학식 20)
화합물 20은 실시예 10.9에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 288)를 사용하여 실시예 11.17에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 32222.4; 수득: 32222.0.
실시예 11.21: 화합물 21
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-[16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{베타}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카복시-4-[16-(1H-테트라졸-5-일)헥사데카노일아미노]부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
(화학식 21)
화합물 21은 실시예 10.10에 기술된 프로트랙터 및 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드(서열 번호 288)를 사용하여 실시예 11.17에 기술된 절차를 사용하여 제조하였다.
이론적 질량: 32026.3; 수득: 32026.0.
화합물 01~21의 구조를 표 18에 요약하였다.
| 화합물 번호 | N-연장부 | MIC-1 폴리펩티드 | 프로트랙터 |
| 화합물 01 | SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225) | MIC-1, des-N3 (서열 번호 2) | 화학식 D (C18) |
| 화합물 02 | SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 226) | MIC-1, des-N3 (서열 번호 2) | 화학식 D (C18) |
| 화합물 03 | SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 226) | MIC-1, des-N3 (서열 번호 2) | 화학식 B (C16) |
| 화합물 04 | SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 226) | MIC-1, des-N3 (서열 번호 2) | 화학식 C (C14) |
| 화합물 05 | SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 227) | MIC-1, des-N3, M57L, M86L (서열 번호 222) | 화학식 D (C18) |
| 화합물 06 | SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 230) | MIC-1, des-N3, M57L, M86L (서열 번호 222) | 화학식 D (C18) |
| 화합물 07 | SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 235) | MIC-1, des-N3, M57L, M86L (서열 번호 222) | 화학식 D (C18) |
| 화합물 08 | SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPCEG (서열 번호 239) | MIC-1, des-N3, M57L, M86L (서열 번호 222) | 화학식 D (C18) |
| 화합물 09 | SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 71) | MIC-1, des-N3, M57L, M86L (서열 번호 222) | 화학식 A (C18)* |
| 화합물 10 | SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 71) | MIC-1, des-N3, M57L, M86L (서열 번호 222) | 화학식 A (C18) |
| 화합물 11 | SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225) | MIC-1, des-N3, M57L, M86L (서열 번호 222) | 화학식 D (C18) |
| 화합물 12 | EEAEADDDDK (서열 번호 313) | MIC-1, des-A1, R2E, N3S | 화학식 D (C18) |
| 화합물 13 | EEAEADDDDK (서열 번호 313) | MIC-1, des-A1, R2E, N3S (서열 번호 314) | 화학식 D (C18)* |
| 화합물 14 | EEAEADDDDK (서열 번호 313) | MIC-1, des-A1, R2E, N3S (서열 번호 314) | 화학식 E (C12) |
| 화합물 15 | SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 71) | MIC-1, del-N3, M57L, M86L, K69R, K107R, K91R (서열 번호 315) | 화학식 A (C18)* |
| 화합물 16 | SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 71) | MIC-1, del-N3, M57L, M86L, K69R, K107R, K91R (서열 번호 315) | 화학식 A (C18) |
| 화합물 17 | SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225) | MIC-1, des-N3 (서열 번호 2) | 화학식 F |
| 화합물 18 | SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225) | MIC-1, des-N3 (서열 번호 2) | 화학식 G |
| 화합물 19 | SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225) | MIC-1, des-N3 (서열 번호 2) | 화학식 H |
| 화합물 20 | SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225) | MIC-1, des-N3 (서열 번호 2) | 화학식 K |
| 화합물 21 | SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225) | MIC-1, des-N3 (서열 번호 2) | 화학식 J |
참고: *는 단 하나의 프로트랙터가 화합물 09, 화합물 13 또는 화합물 15에 부착됨을 의미한다. 즉, 이량체로서 화합물 09, 화합물 13 또는 화합물 15는 2개의 N-말단의 연장부 중 하나에 부착된 한 개의 프로트랙터만 가진다. 다른 화합물의 경우, 하나의 프로트랙터는 이량체의 각각의 두 N-말단 연장부, 즉, 이량체 화합물 당 두개의 프로트랙터가 부착된다.
실시예 12: MIC-1 화합물의 용해도
MIC-1 화합물의 시료를 pH 7.4 PBS 완충액에서 제조한 다음 시료를 시료를 35 mg/ml 초과되게 상향 농축(up-concentrating)시켰다.
PBS 중 MIC-1 화합물 시료를 Vivaspin 매뉴얼의 설명에 따라Vivaspin 20에서 10 kDa MWCO (Sartorius)으로 농축시켰다. 진동하 물통 회전자(swinging-bucket rotor)가 장착된 Heraus Multifuge X3R 원심분리기(Thermo Scientific)를 4000 rpm(3310 x g)으로 사용하여 MIC-1 화합물 시료를 농축하였다. 이어서 Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) 상에서 280 nm에서 UV를 측정함으로써 농도를 결정하였다. 측정한 농도를 표 19에 제시하였다.
| MIC-1 화합물 | 용해도(mg/ml) |
| 화합물 03 | 43 |
| 화합물 05 | 36 |
| 화합물 01 | 32 |
| 화합물 07 | 35 |
| 화합물 17 | 41 |
| 화합물 19 | 37 |
| 화합물 20 | 39 |
| 화합물 21 | 31 |
다양한 프로트랙터를 부착하는 것은 MIC-1 폴리펩티드에 N-말단 아미노산 연장부를 추가함으로써 얻어진 개선된 용해도에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다.
실시예 13: 프로트랙터를 갖는 MIC-1 화합물의 시험관 내 효력 및 결합 활성 분석
세포주
루시페라아제 리포터 앞에 혈청 반응 요소(SRE)를 갖는 벡터를 첨가하여 Novo Nordisk에서 안정한 세포주 BHK21-hGFRAL-IRES-hRET를 생성하였다(실시 예 5 참조). 인간 GFRAL 및 인간 RET 서열을 Uniprot에서 얻었다: UniProtKB - Q6UXV0 (GFRAL_HUMAN) 및 UniProtKB - P07949 (RET_HUMAN). 이 세포주를 기능성 루시페라아제 분석뿐만 아니라 섬광근접 시험(SPA) 결합을 위한 막 제조에 사용하였다.
루시페라아제 분석: hGFRAL, hRET 수용체 및 SRE-루시페라아제 리포터 유전자로 안정적으로 형질감염시킨 BHK21 세포를 상이한 농도의 MIC-1 화합물로 처리하였다. 수용체의 활성을 루시페라아제 활성의 정량화에 의해 측정하였으며 화합물의 효력은 EC50을 이용하여 계산하였다.
SPA 결합: BHK21-hGFRAL-IRES-hRET, SRE-루시페라아제 세포의 세포막을 분리하여 50 pM의 I125로 표지된 상이한 농도의 MIC-1 화합물로 처리하였다. MIC-1 화합물의 결합 효력을 변위 곡선의 IC50를 이용하여 계산하였다.
루시페라아제 분석
동결 세포가있는 바이알을 빠르게 해동시키고 세포를 포도당과 나트륨 피로베이트가 많고, 열 비활성 10% 소 태아 혈정, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1 mg/ml G418-제네티신 및 400 μg/ml 하이그로마이신이 있는 DMEM을 포함하는 미리 예열된 완전 배지 10 mL를 50 mL짜리 코닝 튜브로 세포를 옮겼다. 세포를 1200rpm으로 원심 분리하고 상청액을 버렸다. 이 세척 절차를 1회 반복하여 세포를 2회 세척하였다. 세포를 완전 배지에서 1.2×106개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 세포를 Poly-D-Lysine이 코팅된 96 웰 시험용 팔레트에 웰 당 1.2×10 5개의 세포(100 μl/웰)로 시딩하였다. 세포를 웰의 바닥 표면에서 +34℃에서 4~6시간 동안 부착시킨 후, 15 mM HEPES가 있는 RPMI 배지를 포함하는 결핍 배지 80 μL으로 배지를 변화시켰다. 세포를 5% CO2로 가습된 환경에서 +34℃로 밤새 방치하여 배양하였다. 시험 화합물을 RPMI, 15 mM HEPES 및 5% 인간 혈청 알부민(HSA)이 있거나 없는 0.5% 오브알부민으로 구성되는 분석 배지에서 연속적으로 희석하였다. 시험 화합물을 함유하는 분석 완충액 20μl를 각 웰에 첨가하여 블랭크를 포함하여 0.1%의 오브알부민, 1% HSA 및 30000 pM 내지 3 pM 범위인 시험 화합물의 최종 농도를 야기하였다. 플레이트를 5% CO2로 가습된 환경에서 +37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 100 μl 루시페라아제 기질 용액을 각 웰에 첨가하고 밀봉하였다. 플레이트를 15분 동안 배양한 다음 발광을 판독하였다. 발광의 강도 측정은 S자형 선량 반응 곡선의 비선형 회귀 분석에 의한 EC50 값의 계산을 위해 사용하였다.
SPA 결합
BHK21-hGFRAL-IRES-hRET 세포를 5% CO2로 가습된 분위기에서 포도당과 나트륨 피로베이트가 많고, 열 비활성 10% 소 태아 혈정, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1 mg/ml G418-제네티신 및 400 μg/ml 하이그로마이신이 있는 DMEM을 포함하는 완전 배지에서 +37℃에서 배양하였다. 세포를 얼음처럼 차가운 둘베코스의 포스페이트 완충 설린(DPBS)에서 2회 세척하고, 스크래핑으로 기계적으로 분리하고, 얼음처럼 차가운 DPBS에서 원뿔 모양의 원심 분리 튜브로 옮기고, 5분 동안 1500 rpm에서 +20℃에서 원심 분리시켰다. 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 균질화 완충액 A(50 mM Tris, 2.5 mM EDTA, 1개의 EDTA-프리 프로테아제 억제제 칵테일 정제/50 ml로 pH 7.4 조정) 10 ml에 재현탁시키고 20초 동안 균질화하였다. 균질물을 +4℃에서 20분 만에 16000rpm으로 원심 분리하였다. 상청액을 버리고 펠릿을 10ml 균질화 완충액 B(50 mM Tris, 320 mM 수크로오스, 1개의 EDTA-프리 프로테아제 억제제 칵테일 정제/50 ml로 pH 7.4 조정) 10 ml로 재구성하고, 20초 동안 균질화하고, +4℃에서 20분 만에 16000 rpm으로 원심 분리하였다. 이 절차를 한 번더 반복하였다. 상청액을 버리고 펠릿을 3 ml 균질화 버퍼 B로 재구성하고 저속으로 10초 동안 균질화시켰다. 단백질 농도는 표준 브래드 포드 방법으로 측정하였고, 1.5 mg 단백질/튜브를 동결 튜브로 분취하여 -80℃에 보관하였다. 결합 분석을 웰 당 전체 부피 200 μl로 흰색 96 웰 플레이트에서 수행하였다. 밀 배아 응집소 SPA 비드를 분석 완충액(50 mM Tris/HCl, 4.5 mM MgCl2, 0.02% Tween 20 및 0.25% 오브알부민 pH 7.4)에서 재구성하고 막 조제물과 혼합하여 웰 당 SPA 비드 0.5 mg 및 총 단백질 10 μg의 최종 농도가 되었다. 방사성 리간드 인간[125I]-MIC-1(Novo Nordisk에서 생성함)의 웰 당 분 당 50,000 카운트를 50 pM의 농도에 상응하는 농도로 첨가하였다. 테스트될 MIC-1 화합물을 분석 완충액에서 연속적으로 희석하여 1 μM 내지 1 pM 범위의 최종 분석 농도를 얻었다. 플레이트를 밀봉하고 350 rpm으로 설정된 플레이트 진탕기에서 2시간 동안 +22℃에서 배양한 후 SPA 비드 발광을 판독하기 전에 10분 동안 1500 rpm으로 원심 분리하였다. SPA 비드로부터의 발광 감소로서 방사성 리간드의 변위를 측정하고, IC50 값을 S자형 선량 반응 곡선의 비선형 회귀 분석에 의해 계산하였다(표 20).
| 화합물 번호/서열 번호 | 루시페라아제 NNDK EC50(pM) | 루시페라아제 +0.1% HSA NNDK EC50(pM) | MIC-1 SPA 결합 IC50(nM) |
| 서열 번호 1 | 59 | 36 | 0.67 |
| 서열 번호 164 | 85 | 64 | 119 |
| 서열 번호 288 | 70 | 47 | 6.7 |
| 서열 번호 291 | 80 | 45 | 10 |
| 서열 번호 312 | 42 | 35 | 116 |
| 서열 번호 303 | 57 | 34 | 43 |
| 서열 번호 292 | 125 | 115 | 29 |
| 서열 번호 293 | 217 | 243 | 83 |
| 서열 번호 289 | 35 | 26 | 36 |
| 서열 번호 290 | 100 | 75 | 80 |
| 화합물 10 | 71 | 146 | 20 |
| 화합물 02 | 123 | 107 | 4.9 |
| 화합물 03 | 96 | 106 | 11 |
| 화합물 04 | 90 | 58 | 17 |
| 화합물 01 | 72 | 59 | 3.8 |
| 화합물 15 | 61 | 39 | 39 |
| 화합물 16 | 63 | 51 | 11 |
| 화합물 06 | 81 | 61 | 21 |
| 화합물 05 | 57 | 63 | 23 |
| 화합물 08 | 139 | 651 | 56 |
| 화합물 11 | 55 | 62 | 29 |
| 화합물 07 | 121 | 198 | 29 |
| 화합물 17 | 43 | 65 | 4.7 |
| 화합물 18 | 66 | 67 | 1.3 |
| 화합물 19 | 45 | 62 | 17 |
| 화합물 20 | 49 | 77 | 6.5 |
| 화합물 21 | 53 | 56 | 1.0 |
표 20에서 알 수 있는 바와 같이, 지방산을 갖는 MIC-1 화합물은 지방산이 없는 MIC-1 폴리펩티드와 비교하여 시험관 내 효력이 유사하다. 그러나 Cys 돌연변이가 Cys 돌연변이 S(-3)C와 같은 MIC-1 폴리펩티드의 N-말단에 가까운 경우 시험관 내 효력은 낮을 것이다.
지방산을 갖는 MIC-1 화합물이 지방산이 없는 MIC-1 폴리펩티드와 유사한 효력을 갖는다는 발견은 놀랍다. 일반적으로, 지속을 위해 지방산을 약학적 생물학적 화합물에 첨가하는 것은 효력의 감소를 초래하고, 일반적으로 이러한 감소는 알부민의 존재 하에 효력을 측정함으로써 더욱 강화된다. 따라서, 지방산 프로트랙터를 갖는 MIC-1 화합물의 효력 감소가 없다는 발견은 예상치 못한 것이다.
실시예 14: 마른 스프라구돌리 랫트에서 음식 섭취량과 체중에 대한 MIC-1 화합물의 효과
본 발명의 MIC-1 화합물의 생체내 효능을 9~11주령의 나이든 마른 수컷 스프라구돌리 랫트에서 측정하였다. 동물에게 암기 주기를 개시하기 1~2시간 전에 일일 8 nmol/kg 체중의 투여량으로 주사하였다. 적절한 완충 용액 내에서 화합물을 피하로 투여하였다(1~4 ml/kg). 자동 음식 모니터링 시스템(BioDAQ 시스템 및 랫트용 HM2 시스템)을 사용하여 7일 동안 음식 섭취량의 변화를 측정하였다. BioDAQ 시스템에서는 동물을 단일 수용하였으며, HM2 시스템에서는 동물을 케이지 당 최대 3마리의 동물과 함께 집단으로 수용하였다. 8 일째에, 화합물을 투여한 후 2~3시간 동안 꼬리 혈액 시료를 채취하고, 이 시료를 투여된 화합물의 플라즈마 농도를 측정하기 위해 사용하였다. 각 화합물을 n=4~8마리 동물에서 시험하였다. 실험 전 적어도 7일 동안 동물을 순응시켰다. 수집된 음식 섭취량 데이터는 매일 12시간 암기 상에서 다음 날 암기 단계로 측정되는 매일 음식 섭취량(24시간 음식 섭취량)로서 표현된다. 투여된 화합물에 대한 반응으로 매일 음식 섭취량의 일일 변화는 평균적인 일일 음식 섭취량로부터 비히클군의 평균 일일 먹이 섭취량을 빼서 계산하였다. 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여, p가 0.1 미만인 경우, 변화는 유의미한 것으로 간주하였다. 결과는 시험 기간 동안 기록된 비히클(완충 용액, %)과 비교하여 음식 섭취량에서 "최대 감소"로서 표현된다. 데이터는 또한 시험 기간 동안 음식 섭취량(백분율)의 일일 감소의 합으로 인해 음식 섭취량에서 “축적된 감소”로서 표현된다(p<0.1). 동물의 체중을 교정된 저울을 사용하여 연구 종료 당일에 측정하였다. 체중에 대한 치료의 효과를, 연구 종료 시 비히크를 처리한 동물과 비교하여 화합물을 처리한 동물 간 체중 차이의 백분율로서 계산하였다(표 21).
| 화합물 번호/서열 번호 | 음식 섭취량 감소 | 체중 감소[비히클 대비 (%)] | |
| 8 nmol/kg에서의 최대 효능@[비히클 대비 감소(%)] | 7일 누적 효능[비히클 대비 감소(%)] | ||
| 서열 번호 1 | 67 | 391 | 18.4 |
| 화합물 12 | 66 | 342 | 18.5 |
| 서열 번호 300 | 87 | 431 | 23.5 |
| 서열 번호 299 | 92 | 453 | 26.0 |
| 서열 번호 298 | 83 | 446 | 24.2 |
| 서열 번호 297 | 92 | 495 | 26.6 |
| 서열 번호 296 | 86 | 427 | 22.6 |
| 서열 번호 295 | 92 | 533 | 29.5 |
| 서열 번호 311 | 77 | 420 | 23.4 |
| 화합물 13 | 75 | 431 | 25.2 |
| 화합물 14 | 89 | 484 | 26.1 |
| 서열 번호 164 | 71 | 408 | 23.3 |
| 화합물 09 | 54 | 283 | 16.5 |
| 화합물 10 | 61 | 288 | 18.4 |
| 화합물 02 | 86 | 470 | 27.2 |
| 화합물 03 | 86 | 458 | 27.4 |
| 화합물 04 | 79 | 497 | 30.2 |
| 화합물 07 | 77 | 375 | 20.0 |
| 화합물 08 | 70 | 353 | 17.7 |
| 화합물 05 | 75 | 405 | 19.9 |
| 화합물 01 | 77 | 426 | 23.4 |
| 화합물 11 | 58 | 287 | 17.5 |
| 화합물 17 | 63 | 371 | 18.6 |
| 화합물 18 | 72 | 384 | 21.2 |
| 화합물 19 | 68 | 398 | 23.5 |
| 화합물 20 | 69 | 374 | 22.5 |
| 화합물 21 | 73 | 394 | 23.1 |
표 21의 실험 데이터로부터, 프로트랙터가 있거나 없는 MIC-1 화합물이 야생형 MIC-1 폴리펩티드와 비교했을 때 랫트에서 동등하거나 더 나은 생체 내 효능을 가진다는 것을 나타낸다. 데이터는 또한 이들 프로트랙터가 MIC-1 화합물의 생체 내 효능에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 15: 돼지에서 약력학(PD) 연구
이 실험의 목적은 돼지에서 음식 섭취량 및 체중에 대한 MIC-1 화합물의 효과를 조사하는 것이었다. 이는 하기에 기재된 바와 같이 약력학(PD) 연구에서 수행하였으며, 여기서 MIC-1 화합물의 단일 투여량의 투여 후 1 내지 21일에서 음식 섭취량을 비히클 처리 대조군과 비교하여 측정하였다.
대략 30~35kg 무게의 3개월령 암컷 Landrace Yorkshire Duroc(LYD) 돼지를 사용하였다(그룹 당 n=4~6). 대략 1주 동안 동물들이 동물 시설에 순응하는 동안 그룹에 수용시켰다. 순응 기간의 마지막 부분 동안, 동물을 개별 펜스에 (투여 2주 전) 두었고, 개별 음식 섭취량를 측정하기 위한 전체 실험 동안 두었다. 기준선으로서 음식 섭취량을 투여 전 마지막 3일 동안 측정하였다.
적응 및 실험 기간 동안 동물들에게 항상 돼지 사료(Svinefoder Danish Top SI 611+3’, Danish Agro)를 임의로 공급하였다. HMview 시스템(Ellegaard Systems, Faaborg, 덴마크)을 사용하여 사료 무게를 지속적으로 기록함으로써 음식 섭취량을 온라인으로 모니터링하였다. 임의의 주목할 만한 유출물을 수집하고 칭량하하였고, 자동으로 측정된 음식 섭취량을 이 양에 대해 보정하였다.
연구 동안 매주 1회 또는 2회 체중을 측정하였다. MIC-1 화합물을 적절한 완충액에서 1 또는 9 nmol/kg의 용량에 상응하는 약 25 또는 100 nmol/ml의 농도로 용해시켰다. 완충 용액은 또한 비히클로서 작용하였다.
동물에게 1일째 아침에 MIC-1 화합물 또는 비히클의 단일 피하 투여량을 투여하고, 투여 후 21일 동안 음식 섭취량를 측정하였다. 연구의 마지막에, 귀 정맥 카테터를 통해 투여된 i.v. 과량의 유타솔(Euthasol)로 동물을 안락사시켰다.
음식 섭취량을 24 시간 간격으로 계산하였다(0~24시간, 24~48시간, 48~72시간, 72~96시간,최대 20~21일). 표 22에서, 평균 음식 섭취량의 결과는 동일한 시간 간격으로 비히클군의 평균 음식 섭취량의 백분율로서 나타낸다.
| MIC-1 화합물 / 시간 간격(일) |
돼지의 PD, 음식 섭취량(비히클 %) 표시된 시간 간격에서 |
||
| 6~7 | 13~14 | 20~21 | |
| 비히클 | 100 | 100 | 100 |
| 화합물 05 (1 nmol/kg) | 88 | 100 | 117 |
| 화합물 05 (9 nmol/kg) | 36 | 38 | 65 |
| 화합물 01 (1 nmol/kg) | 49 | 86 | 103 |
| 화합물 01 (9 nmol/kg) | 29 | 22 | 23 |
데이터는 돼지에서 시험 화합물의 단일 s.c. 주사가 주사 후 최대 21일 동안 및 심지어 21일보다 길게 음식 섭취량의 감소를 야기하였다는 것을 보여준다(화합물 01의 9 nmol/kg 용량에 대해).
연구 동안 체중을 측정하였으며 MIC-1 화합물을 처리한 군에서 돼지는 체중이 더 적었다(표 23, 도 6).
| MIC-1 화합물 / 시간(일) |
돼지의 PD, Δ체중 (비히클 대비 (%)) |
||
| 7 | 14 | 21 | |
| 비히클 | 0 | 0 | 0 |
| 화합물 05 (1 nmol/kg) | -5.7 | -5.7 | -1.1 |
| 화합물 05 (9 nmol/kg) | -15.7 | -26.5 | -22.0 |
| 화합물 01 (1 nmol/kg) | -9.8 | -9.1 | -6.6 |
| 화합물 01 (9 nmol/kg) | -18.4 | -26.9 | -29.4 |
실시예 16: 마른 SD 랫트의 약동학 연구
이 연구의 목적은 마른 스프라구돌리 랫트에게 정맥 내 및 피하 투여 후 MIC-1 화합물의 생체 내 최종 반감기(T½), 평균 체류 시간(MRT), 최대 혈장 수준을 위한 시간(Tmax)의 및 생체이용률(F) 시간을 결정하는 것이다. 이를 약동학(PK) 연구에서 행하였고, 여기서 해당 MIC-1 화합물의 PK 파라미터가 결정된다. T½는 일반적으로 정맥 내 투여로 초기 분포 단계 후에 측정된 특정 혈장 농도를 절반으로 줄이는 데 걸리는 시간을 의미한다. MRT는 일반적으로 해당 화합물이 신체에 머무르는 평균 시간을 의미한다. Tmax는 일반적으로 해당 화합물이 혈액 혈장에서 가장 높은 농도에 도달할 때 해당 화합물의 피하 투여 후 시점을 의미한다. F는 일반적으로 혈액 혈장에서 나타나는 피하로 투여된 화합물의 분율을 의미한다.
상기 언급한 PK 파라미터는 300~500 g의 마른 SD 랫트에서 화합물을 꼬리 정맥 또는 목의 피하 조직으로 주입한 후 노출 분석을 위해 다양한 시점에서 혈액 혈장 시료를 수집함으로써 측정하였다. 화합물(4~5 nmol/kg 체중)을 적절한 완충 용액 중에 정맥 (1 ml/kg)로 투여하였다. 정맥 내 투여 그룹의 그룹 크기는 통상적으로 4마리였고, 피하 투여 그룹의 그룹 크기는 통상적으로 5마리였다. 랫트는 전체 실험 동안 깨어있었고, 음식과 물에 접근할 수 있었다.
12시간 미만의 T½를 갖는 화합물의 경우, 혈액 시료를 통상적으로 투여후 5분, 15분, 30분, 60분, 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 14시간, 22시간, 30시간, 48시간 또는 투여 후 0분, 15분, 30분, 60분, 90분, 2시간, 2.5시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 24시간, 30시간, 48시간에 혀에서 수집하였다. 24시간 초과의 T½를 갖는 화합물의 경우, 혈액 시료를 통상적으로 투여 후 5분, 15분, 30분, 60분, 120분, 360분, 720분, 24시간, 30시간, 48시간, 54시간, 72시간, 96시간, 168시간, 216시간, 264시간, 336시간에 혀에서 수집하였고, 혈액의 200 μl를 EDTA 튜브에 모아서 최대 20분 동안 얼음에 보관하였다. 혈액 시료를 4℃, 10000G에서 5분 동안 원심 분리하여 혈장 시료를 생성하였다. 이어서, 시료를 드라이아이스 상의 마이크로닉 튜브에 피펫팅하고 LOCI 또는 ELISA와 같은 유사 항체 기반 분석을 사용하여 각각의 MIC-1 화합물의 혈장 농도를 분석할 때까지 -20℃에서 유지하였다. 개별 혈장 농도-시간 프로파일을 Phoenix v. 6.4 소프트웨어(Pharsight Inc., Mountain View, CA, 미국)에서 비구획 모델에 의해 분석하였으며, T½, MRT, Tmax 및 F 결과값을 결정하였다(표 24).
| 화합물 번호/서열 번호 | 투여량 | 투여 경로 | T½ 시간(평균) | MRT 시간(평균) | Tmax 시간(평균) | BA %(평균) |
| 서열 번호 1 | 4 nmol/kg | IV | 1.7 | 0.53 | NA | NA |
| 서열 번호 92 | 4 nmol/kg | IV | 3.9 | 2.2 | NA | NA |
| 서열 번호 100 | 4 nmol/kg | IV | 4.0 | 3.0 | NA | NA |
| 서열 번호 104 | 4 nmol/kg | IV | 3.8 | 3.2 | NA | NA |
| 서열 번호 105 | 4 nmol/kg | IV | 3.4 | 2.1 | NA | NA |
| 서열 번호 106 | 4 nmol/kg | IV | 3.4 | 1.7 | NA | NA |
| 서열 번호 107 | 4 nmol/kg | IV | 2.8 | 1.4 | NA | NA |
| 서열 번호 108 | 4 nmol/kg | IV | 3.8 | 3.8 | NA | NA |
| 서열 번호 294 | 4 nmol/kg | IV | 2.9 | 1.5 | NA | NA |
| 서열 번호 1 | 4 nmol/kg | SC | 1.9 | 4.1 | 2.2 | 70 |
| 서열 번호 106 | 4 nmol/kg | SC | 3.3 | 6.7 | 3.0 | 88 |
| 서열 번호 107 | 4 nmol/kg | SC | 3.4 | 6.8 | 2.8 | 82 |
| 서열 번호 108 | 4 nmol/kg | SC | 4.1 | 8.6 | 3.0 | 90± |
| 서열 번호 294 | 4 nmol/kg | SC | 2.8 | 6.2 | 3.0 | 67 |
| 화합물 13 | 5 nmol/kg | IV | 26.3 | 33.1 | NA | NA |
| 화합물 12 | 5 nmol/kg | IV | 42.1 | 54.8 | NA | NA |
| 화합물 14 | 5 nmol/kg | IV | 2.9 | 2.1 | NA | NA |
| 화합물 10 | 4 nmol/kg | IV | 37.0 | 45.7 | NA | NA |
| 화합물 02 | 4 nmol/kg | IV | 73.8 | 106.2 | NA | NA |
| 화합물 03 | 4 nmol/kg | IV | 62.4 | 89.3 | NA | NA |
| 화합물 04 | 4 nmol/kg | IV | 15.6 | 16.8 | NA | NA |
| 화합물 06 | 4 nmol/kg | IV | 46.6 | 63.8 | NA | NA |
| 서열 번호 289 | 4 nmol/kg | IV | 5.1 | 2.8 | NA | NA |
| 화합물 01 | 4 nmol/kg | IV | 58 | 82 | NA | NA |
| 화합물 05 | 4 nmol/kg | IV | 53 | 71 | NA | NA |
| 화합물 11 | 4 nmol/kg | IV | 50 | 72 | NA | NA |
| 화합물 01 | 4 nmol/kg | SC | 56 | 114 | 50 | 36 |
| 화합물 05 | 4 nmol/kg | SC | 53 | 106 | 50 | 35 |
| 화합물 11 | 4 nmol/kg | SC | 57 | 116 | 50 | 52 |
| 화합물 17 | 4 nmol/kg | SC | 55.8 | 57.2 | 55.5 | 42.3 |
| 화합물 18 | 4 nmol/kg | SC | 52.9 | 53.1 | 54.0 | 38.2 |
| 화합물 17 | 4 nmol/kg | IV | 68.5 | 90.1 | NA | NA |
| 화합물 18 | 4 nmol/kg | IV | 50.8 | 67.4 | NA | NA |
프로트랙터를 갖는 MIC-1 화합물이 프로트랙터가 없이 N-연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드와 비교하여 훨씬 긴 T½, MRT 및 Tmax를 갖는다는 것을 알 수 있다. 일반적으로, 비슷한 지방산 프로트랙터를 갖는 약학적 생물학적 화합물의 지속은 랫트에서 말기 반감기가 12시간을 초과하는 경우가 거의 없다. 48시간 초과의 말기 반감기의 발견은 예상치 못한 일이고 놀랍다.
실시예 17: 미니피그에서 약동학 연구
본 연구의 목적은 미니피그에게 i.v. 투여 후 MIC-1 화합물의 생체 내 지속, 즉, 신체에서 그들의 시간 연장 및 이에 따른 작용 시간을 결정하는 것이었다. 이는 약동학(PK) 연구에서 수행되었으며, 여기서 해당 화합물의 말기 반감기를 결정하였다. 말단 반감기는 말단 제거 단계에서 특정 혈장 농도를 절반으로 하는 데 걸리는 시간을 의미한다.
암컷 Gottingen 미니피그를 Ellegaard Gottingen 미니피그(Dalmose, 덴마크)로부터 수득하였고, 대략 8개월령이고 체중은 대략 23~25 kg을 연구에 사용하였다. 미니피그(영구 카테터 함유 돼지)를 짚이 베딩된 펜스 내에 개별적으로 수용시켰고, Altromin 9030 미니피그 사료(Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG)를 하루에 한 번 제한적으로 공급하였다.
순응 3주 후, 두 개의 영구 중심 정맥 카테터를 각 동물에서 대정맥 뒷면에 이식하였다. 동물을 수술 후 1주일 동안 회복시킨 후, 이어서 연속 투여 사이에 적절한 세척 기간을 갖는 반복적인 약동학 연구에 사용하였다.
화합물의 정맥 내 주사(0.17 ml/kg에 상응하는 부피)를 하나의 카테터를 통해 제공하였고, 투여 후 12일까지 (바람직하게는 다른 카테터로) 사전에 정의된 시점에 혈액을 샘플링하였다.
혈액 시료(예를 들어, 0.8 ml)를 EDTA(8 mM)가 코팅된 관에서 수집한 다음 4℃ 및 1942g에서 10분 동안 원심 분리하였다. 혈액 시료를 미리 정의된 시점에서 수집하였다. 예로서 혈액 시료는 t= 투여 전, 투여 후 0.0833, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 168, 192, 216, 240, 264, 및 288시간에 수집하였다.
혈장을 드라이아이스 상의 마이크로닉 튜브에 피펫팅하고 LOCI를 사용하여 MIC-1 화합물의 혈장 농도를 분석할 때까지 -20℃에서 유지하였다. 개별 혈장 농도-시간 프로파일을 Phoenix v. 6.4(Pharsight Inc., Mountain View, CA, 미국)에서 비구획 약동학 방법에 의해 분석하였으며, 말기 반감기(조화 평균)를 결정하였다.
결과
하기 결과를 얻었다(표 25).
| 화합물 번호 | 미니피그 IV PK | |
| t½(시간) | MRT(시간) | |
| 화합물 02 | 338 | 487 |
| 화합물 05 | 290 | 420 |
| 화합물 11 | 347 | 489 |
말기 반감기(t½)는 조화 평균이며, n=3이다.
일반적으로 비슷한 지방산 프로트랙터를 갖는 약학적 생물학적 화합물의 지속은 미니피그에서 말기 반감기가 100시간을 초과하는 경우가 거의 없다. 300시간 초과의 말기 반감기의 발견은 예상치 못한 일이고 놀랍다.
SEQUENCE LISTING
<110> Novo Nordisk A/S
Zhang, Xujia
<120> MIC-1 화합물 및 그 용도
<130> 170039WO03
<150> CN2017/085576
<151> 2017-05-23
<150> CN2017/113335
<151> 2017-11-28
<160> 317
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 호모사피엔스
<400> 1
Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 des-N3
<400> 2
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
1 5 10 15
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
20 25 30
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
35 40 45
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
50 55 60
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1-Del (1-3)
<400> 3
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 4
Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 5
Thr Ser Glu Ser Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 6
Thr Ser Thr Glu Pro Glu
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 7
Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 8
Thr Ser Thr Glu Glu Gly
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 9
Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 10
Ser Gly Ser Ala Pro Gly
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 11
Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1 5
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 12
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20
<210> 13
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 13
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20
<210> 14
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 14
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly
20
<210> 15
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 15
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
20 25 30
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 16
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
20 25 30
<210> 17
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 17
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
20 25 30
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 18
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
20 25 30
<210> 19
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 19
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
20 25 30
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 20
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
20 25 30
<210> 21
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 21
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu
20 25 30
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 22
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu
20 25 30
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 23
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu
20 25 30
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 24
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
20 25 30
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 25
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
20 25 30
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 26
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
20 25 30
<210> 27
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 27
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20 25 30
<210> 28
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 28
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20 25 30
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 29
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20 25 30
<210> 30
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 30
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 31
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 32
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 33
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly
20 25 30
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 34
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly
20 25 30
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 35
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly
20 25 30
<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 36
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20 25 30
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 37
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20 25 30
<210> 38
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 38
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20 25 30
<210> 39
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 39
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly
35
<210> 40
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 40
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Glu Gly
35
<210> 41
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 41
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly
35
<210> 42
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 42
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Glu Gly
35
<210> 43
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 43
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly
35
<210> 44
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 44
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly
35
<210> 45
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 45
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
20 25 30
Glu Thr Pro Gly
35
<210> 46
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 46
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Glu Gly
35
<210> 47
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 47
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly
35
<210> 48
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 48
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly
35
<210> 49
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 49
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
20 25 30
Glu Thr Pro Gly
35
<210> 50
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 50
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Glu Gly
35
<210> 51
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 51
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly
35
<210> 52
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 52
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly
35
<210> 53
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 53
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
20 25 30
Glu Thr Pro Gly
35
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 54
Ala Glu Glu Ala Glu Ser
1 5
<210> 55
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 55
Ala Glu Ser Met
1
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 56
Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Ser
1 5
<210> 57
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 57
Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ser
20
<210> 58
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 58
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20
<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 59
Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Glu Ala Glu Ser
20
<210> 60
<211> 18
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 60
Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 61
Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Ser
1 5 10
<210> 62
<211> 26
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 62
Ala Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
1 5 10 15
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20 25
<210> 63
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 63
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20
<210> 64
<211> 26
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 64
Ala Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
1 5 10 15
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20 25
<210> 65
<211> 22
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 65
Ala Ala Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
20
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 66
Ala Ala Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu
1 5 10
<210> 67
<211> 22
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 67
Ala Ala Pro Asp Glu Gly Thr Glu Glu Glu Thr Glu Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
20
<210> 68
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 68
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20
<210> 69
<211> 25
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 69
Ala Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu
1 5 10 15
Pro Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro
20 25
<210> 70
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 70
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
20 25 30
<210> 71
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 71
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 72
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 72
Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
20
<210> 73
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 73
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 74
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 74
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Glu Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 75
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 75
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Glu Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 76
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 76
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu Glu Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 77
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 77
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Glu Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 78
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 78
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Glu Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 79
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 79
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Glu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 80
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 80
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 81
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 81
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 82
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 82
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 83
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 83
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Glu Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 84
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 84
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Glu Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 85
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 85
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Glu Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 86
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 86
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Glu Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 87
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 87
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Glu Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 88
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 88
Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Glu Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 89
<211> 115
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 89
Ala Glu Glu Ala Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg
1 5 10 15
Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp
20 25 30
Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile
35 40 45
Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile
50 55 60
Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys
65 70 75 80
Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys
100 105 110
His Cys Ile
115
<210> 90
<211> 112
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 90
Ala Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 91
<211> 118
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 91
Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
1 5 10 15
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
35 40 45
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
50 55 60
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
65 70 75 80
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
85 90 95
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
100 105 110
Lys Asp Cys His Cys Ile
115
<210> 92
<211> 132
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 92
Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly
20 25 30
Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly
35 40 45
Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys
50 55 60
Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln
65 70 75 80
Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro
85 90 95
Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr
100 105 110
Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp
115 120 125
Cys His Cys Ile
130
<210> 93
<211> 136
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 93
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro
20 25 30
Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu
35 40 45
Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln
50 55 60
Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn
65 70 75 80
Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr
85 90 95
Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu
100 105 110
Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu
115 120 125
Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 94
<211> 130
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 94
Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Glu Ala Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys
20 25 30
Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala
35 40 45
Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly
50 55 60
Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys
65 70 75 80
Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys
85 90 95
Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr
100 105 110
Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His
115 120 125
Cys Ile
130
<210> 95
<211> 127
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 95
Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
20 25 30
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
35 40 45
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
50 55 60
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
65 70 75 80
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
85 90 95
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
100 105 110
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
115 120 125
<210> 96
<211> 121
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 96
Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Ser Gly Asp His Cys
1 5 10 15
Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser
20 25 30
Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val
35 40 45
Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala
50 55 60
Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp
65 70 75 80
Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val
85 90 95
Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp
100 105 110
Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
115 120
<210> 97
<211> 138
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 97
Ala Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
1 5 10 15
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ala Arg Asn Gly Asp His
20 25 30
Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala
35 40 45
Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu
50 55 60
Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala
65 70 75 80
Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro
85 90 95
Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met
100 105 110
Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp
115 120 125
Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 98
<211> 136
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 98
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro
20 25 30
Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu
35 40 45
Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln
50 55 60
Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn
65 70 75 80
Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr
85 90 95
Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu
100 105 110
Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu
115 120 125
Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 99
<211> 135
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 99
Ala Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
1 5 10 15
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu
20 25 30
Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu
35 40 45
Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val
50 55 60
Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met
65 70 75 80
His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val
85 90 95
Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile
100 105 110
Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu
115 120 125
Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 100
<211> 131
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 100
Ala Ala Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg
20 25 30
Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp
35 40 45
Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile
50 55 60
Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile
65 70 75 80
Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys
85 90 95
Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp
100 105 110
Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys
115 120 125
His Cys Ile
130
<210> 101
<211> 121
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 101
Ala Ala Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu Gly Asp His Cys
1 5 10 15
Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser
20 25 30
Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val
35 40 45
Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala
50 55 60
Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp
65 70 75 80
Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val
85 90 95
Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp
100 105 110
Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
115 120
<210> 102
<211> 131
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 102
Ala Ala Pro Asp Glu Gly Thr Glu Glu Glu Thr Glu Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg
20 25 30
Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp
35 40 45
Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile
50 55 60
Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile
65 70 75 80
Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys
85 90 95
Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp
100 105 110
Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys
115 120 125
His Cys Ile
130
<210> 103
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 103
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 104
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 104
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 105
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 105
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 106
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 106
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 107
<211> 134
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 107
Ala Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu
1 5 10 15
Pro Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
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100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 108
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 108
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 109
<211> 141
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 109
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
35 40 45
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
50 55 60
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
65 70 75 80
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
85 90 95
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
100 105 110
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
115 120 125
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 110
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 110
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 111
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 111
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 112
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 112
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu Glu Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 113
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 113
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Glu Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 114
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 114
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Glu Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 115
<211> 140
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 115
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Gly
20 25 30
Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val
35 40 45
Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro
50 55 60
Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe
65 70 75 80
Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu
85 90 95
Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn
100 105 110
Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr
115 120 125
Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 116
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 116
Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 117
<211> 135
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 117
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu
20 25 30
Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu
35 40 45
Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val
50 55 60
Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met
65 70 75 80
His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val
85 90 95
Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile
100 105 110
Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu
115 120 125
Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 118
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 118
Gly Glu Pro Ser
1
<210> 119
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 119
Gly Pro Ser Glu
1
<210> 120
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 120
Gly Pro Glu Ser
1
<210> 121
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 121
Gly Ser Pro Glu
1
<210> 122
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 122
Gly Ser Glu Pro
1
<210> 123
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 123
Gly Glu Pro Gln
1
<210> 124
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 124
Gly Glu Gln Pro
1
<210> 125
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 125
Gly Pro Glu Gln
1
<210> 126
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 126
Gly Pro Gln Glu
1
<210> 127
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 127
Gly Gln Glu Pro
1
<210> 128
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 128
Gly Gln Pro Glu
1
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 129
Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu
1 5 10
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 130
Pro Asp Glu Gly Thr Glu Glu Glu Thr Glu
1 5 10
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 131
Pro Ala Ala Glu Glu Glu Asp Asp Pro Asp
1 5 10
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 132
Ala Glu Pro Asp Glu Asp Pro Gln Ser Glu Asp
1 5 10
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 133
Ala Glu Pro Asp Glu Asp Pro Gln Ser Glu
1 5 10
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 134
Ala Glu Pro Glu Glu Gln Glu Glu Asp
1 5
<210> 135
<211> 8
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 135
Ala Glu Pro Glu Glu Gln Glu Glu
1 5
<210> 136
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 136
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 137
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 137
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 138
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 138
Gly Gly Ser Ser
1
<210> 139
<211> 4
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 139
Ser Ser Ser Gly
1
<210> 140
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 140
Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ser
20
<210> 141
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 141
Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Glu
20
<210> 142
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 142
Gly Pro Glu Ser Gly Pro Glu Ser Gly Pro Glu Ser Gly Pro Glu Ser
1 5 10 15
Gly Pro Glu Ser
20
<210> 143
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 143
Gly Ser Pro Glu Gly Ser Pro Glu Gly Ser Pro Glu Gly Ser Pro Glu
1 5 10 15
Gly Ser Pro Glu
20
<210> 144
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 144
Gly Ser Glu Pro Gly Ser Glu Pro Gly Ser Glu Pro Gly Ser Glu Pro
1 5 10 15
Gly Ser Glu Pro
20
<210> 145
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 145
Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln
1 5 10 15
Gly Glu Pro Gln
20
<210> 146
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 146
Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro
1 5 10 15
Gly Glu Gln Pro
20
<210> 147
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 147
Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln
1 5 10 15
Gly Pro Glu Gln
20
<210> 148
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 148
Gly Pro Gln Glu Gly Pro Gln Glu Gly Pro Gln Glu Gly Pro Gln Glu
1 5 10 15
Gly Pro Gln Glu
20
<210> 149
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 149
Gly Gln Glu Pro Gly Gln Glu Pro Gly Gln Glu Pro Gly Gln Glu Pro
1 5 10 15
Gly Gln Glu Pro
20
<210> 150
<211> 20
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 150
Gly Gln Pro Glu Gly Gln Pro Glu Gly Gln Pro Glu Gly Gln Pro Glu
1 5 10 15
Gly Gln Pro Glu
20
<210> 151
<211> 15
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 151
Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu
1 5 10 15
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> Linker
<400> 152
Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser
1 5
<210> 153
<211> 31
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> Linker
<400> 153
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro
20 25 30
<210> 154
<211> 111
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 154
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
1 5 10 15
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
20 25 30
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Leu Cys Ile Gly Ala Cys Pro
35 40 45
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
50 55 60
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 155
<211> 109
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 155
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Leu Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 156
<211> 111
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 156
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
1 5 10 15
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
20 25 30
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
35 40 45
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
50 55 60
Glu Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 157
<211> 109
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 157
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 158
<211> 111
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 158
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
1 5 10 15
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
20 25 30
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
35 40 45
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
50 55 60
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 159
<211> 109
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 159
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 160
<211> 111
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 160
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
1 5 10 15
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
20 25 30
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
35 40 45
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
50 55 60
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 161
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 161
Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
20 25 30
Gly Glu Pro Ser
35
<210> 162
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 162
Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln
1 5 10 15
Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln
20 25 30
Gly Glu Pro Gln
35
<210> 163
<211> 25
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 163
Ala Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Glu Pro Gln Gly Gln Glu
1 5 10 15
Pro Gln Pro Gly Glu Pro Glu Gly Gln
20 25
<210> 164
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 164
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
35 40 45
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
50 55 60
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
65 70 75 80
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
85 90 95
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 165
<211> 134
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 165
Ala Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Glu Pro Gln Gly Gln Glu
1 5 10 15
Pro Gln Pro Gly Glu Pro Glu Gly Gln Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 166
<211> 12
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 166
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
1 5 10
<210> 167
<211> 12
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 167
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1 5 10
<210> 168
<211> 12
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 168
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
1 5 10
<210> 169
<211> 12
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 169
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1 5 10
<210> 170
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 170
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20
<210> 171
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 171
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
20
<210> 172
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 172
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20
<210> 173
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-teminal extension
<400> 173
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20
<210> 174
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-external extension
<400> 174
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20
<210> 175
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 175
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
20
<210> 176
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 176
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20
<210> 177
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 177
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20
<210> 178
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 178
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20
<210> 179
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 179
Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly
20
<210> 180
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 180
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20
<210> 181
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 181
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20
<210> 182
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드 + N-말단 연장부
<400> 182
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 183
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 183
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
<210> 184
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 184
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Thr Glu Pro Ser Glu
20 25 30
<210> 185
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 185
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20 25 30
<210> 186
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 186
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
20 25 30
<210> 187
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 187
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
20 25 30
<210> 188
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 188
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
20 25 30
<210> 189
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 189
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20 25 30
<210> 190
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 190
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
20 25 30
<210> 191
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 191
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
<210> 192
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 192
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
20 25 30
<210> 193
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 193
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Thr Glu Pro Ser Glu
20 25 30
<210> 194
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 194
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
20 25 30
<210> 195
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 195
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln
20 25 30
<210> 196
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 196
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
20 25 30
<210> 197
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 197
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly
35
<210> 198
<211> 48
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 198
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
35 40 45
<210> 199
<211> 60
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 199
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
35 40 45
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
50 55 60
<210> 200
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 200
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 201
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 201
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 202
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 202
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Glu Ser Ala Thr Pro Glu Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 203
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 203
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 204
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 204
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 205
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 205
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 206
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 206
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 207
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 207
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 208
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 208
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 209
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 209
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 210
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 210
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 211
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 211
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Glu Ser Ala Thr Pro Glu Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 212
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 212
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 213
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 213
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 214
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 214
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 215
<211> 141
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 215
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln
20 25 30
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
35 40 45
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
50 55 60
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
65 70 75 80
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
85 90 95
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
100 105 110
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
115 120 125
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 216
<211> 141
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 216
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser
20 25 30
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
35 40 45
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
50 55 60
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
65 70 75 80
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
85 90 95
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
100 105 110
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
115 120 125
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 217
<211> 147
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 217
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp
50 55 60
Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile
65 70 75 80
Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile
85 90 95
Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys
100 105 110
Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp
115 120 125
Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys
130 135 140
His Cys Ile
145
<210> 218
<211> 159
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 218
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
35 40 45
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
50 55 60
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
65 70 75 80
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
85 90 95
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
100 105 110
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
115 120 125
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
130 135 140
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
145 150 155
<210> 219
<211> 172
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 219
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
35 40 45
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala Arg Asn Gly
50 55 60
Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val
65 70 75 80
Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro
85 90 95
Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe
100 105 110
Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu
115 120 125
Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn
130 135 140
Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr
145 150 155 160
Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
165 170
<210> 220
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 220
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu Glu Glu Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys
100 105 110
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 221
<211> 139
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 221
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Asp
20 25 30
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
35 40 45
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asn Glu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Glu Leu Lys
85 90 95
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
100 105 110
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
115 120 125
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135
<210> 222
<211> 111
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 222
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
1 5 10 15
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
20 25 30
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
35 40 45
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
50 55 60
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 223
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 223
Ser Glu Pro Ala Thr Cys Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
20 25 30
<210> 224
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 224
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Cys Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
20 25 30
<210> 225
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 225
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 226
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 226
Ser Glu Pro Ala Thr Cys Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 227
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 227
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Cys Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 228
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 228
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 229
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 229
Ser Glu Pro Ala Cys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 230
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 230
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Cys Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 231
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 231
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Cys Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 232
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 232
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Cys Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 233
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 233
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Cys Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 234
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 234
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Cys
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 235
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 235
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Cys Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 236
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 236
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Cys Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 237
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 237
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Cys Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 238
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 238
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Cys Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
<210> 239
<211> 32
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 239
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Cys Glu Gly
20 25 30
<210> 240
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 240
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
20 25 30
<210> 241
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 241
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
20 25
<210> 242
<211> 24
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 242
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20
<210> 243
<211> 21
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 243
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser
20
<210> 244
<211> 12
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 244
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1 5 10
<210> 245
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 245
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
20 25 30
<210> 246
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 246
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
20 25 30
<210> 247
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 247
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
20 25 30
<210> 248
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 248
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
20 25 30
<210> 249
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 249
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
20 25 30
<210> 250
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 250
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
20 25 30
<210> 251
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 251
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu
20 25 30
<210> 252
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 252
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu
20 25 30
<210> 253
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 253
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu
20 25 30
<210> 254
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 254
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
20 25 30
<210> 255
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 255
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
20 25 30
<210> 256
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 256
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
20 25 30
<210> 257
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 257
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20 25 30
<210> 258
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 258
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20 25 30
<210> 259
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 259
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly
20 25 30
<210> 260
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 260
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
<210> 261
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 261
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
<210> 262
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 262
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
<210> 263
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 263
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly
20 25 30
<210> 264
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 264
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly
20 25 30
<210> 265
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 265
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly
20 25 30
<210> 266
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 266
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20 25 30
<210> 267
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 267
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20 25 30
<210> 268
<211> 30
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 268
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20 25 30
<210> 269
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 269
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly
35
<210> 270
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 270
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Glu Gly
35
<210> 271
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 271
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly
35
<210> 272
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 272
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Glu Gly
35
<210> 273
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 273
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly
35
<210> 274
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 274
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly
35
<210> 275
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 275
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
20 25 30
Glu Thr Pro Gly
35
<210> 276
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 276
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Glu Gly
35
<210> 277
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 277
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly
35
<210> 278
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 278
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly
35
<210> 279
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 279
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
20 25 30
Glu Thr Pro Gly
35
<210> 280
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 280
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Glu Gly
35
<210> 281
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 281
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly
35
<210> 282
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 282
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly
35
<210> 283
<211> 36
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 283
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
20 25 30
Glu Thr Pro Gly
35
<210> 284
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 284
Gly Pro Cys Glu Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu
20 25
<210> 285
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 285
Gly Glu Cys Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro
1 5 10 15
Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro
20 25
<210> 286
<211> 22
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 286
Pro Ala Cys Glu Glu Glu Asp Asp Pro Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20
<210> 287
<211> 22
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 287
Pro Asp Glu Cys Thr Glu Glu Glu Thr Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20
<210> 288
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 288
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
35 40 45
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
50 55 60
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
65 70 75 80
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
85 90 95
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 289
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 289
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Cys Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
35 40 45
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
50 55 60
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
65 70 75 80
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
85 90 95
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 290
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 290
Ser Glu Pro Cys Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
35 40 45
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
50 55 60
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
65 70 75 80
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
85 90 95
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 291
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 291
Ser Glu Pro Ala Thr Cys Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
35 40 45
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
50 55 60
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
65 70 75 80
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
85 90 95
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 292
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 292
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Cys Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
35 40 45
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
50 55 60
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
65 70 75 80
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
85 90 95
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 293
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 293
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Cys Glu Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
35 40 45
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
50 55 60
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
65 70 75 80
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
85 90 95
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
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<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 294
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Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met
50 55 60
Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Leu Glu Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Asp Cys His Cys Ile
130
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<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 295
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
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20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 296
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<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 297
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115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
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<211> 141
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 298
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20 25 30
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
35 40 45
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<211> 141
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 299
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Ala Arg
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Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 300
<211> 133
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 300
Ser Ala Pro Ala Thr Ser Gly Ser Ala Thr Pro Gly Ser Ala Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Ala Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
20 25 30
Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu
35 40 45
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130
<210> 301
<211> 141
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 301
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<211> 141
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 302
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115 120 125
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130 135 140
<210> 303
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 303
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Cys Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
35 40 45
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
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130 135 140
<210> 304
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 304
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Cys Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 305
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 305
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Cys Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
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35 40 45
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130 135 140
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<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 306
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Cys Glu Ser
1 5 10 15
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115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 307
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 307
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Cys
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Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
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<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 308
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
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130 135 140
<210> 309
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 309
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
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Ala Thr Pro Glu Ser Cys Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
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115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 310
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 310
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
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115 120 125
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130 135 140
<210> 311
<211> 121
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 311
Glu Glu Ala Glu Ala Asp Asp Asp Asp Lys Glu Ser Gly Asp His Cys
1 5 10 15
Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
115 120
<210> 312
<211> 143
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 312
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
35 40 45
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
50 55 60
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
65 70 75 80
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
85 90 95
His Arg Leu Arg Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Arg Thr Asp Thr Gly Val Ser
115 120 125
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Arg Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 313
<211> 10
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 313
Glu Glu Ala Glu Ala Asp Asp Asp Asp Lys
1 5 10
<210> 314
<211> 111
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 314
Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
1 5 10 15
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
20 25 30
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
35 40 45
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
50 55 60
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
65 70 75 80
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85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 315
<211> 111
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> MIC-1 폴리펩티드
<400> 315
Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
1 5 10 15
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
20 25 30
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35 40 45
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
50 55 60
His Arg Leu Arg Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Arg Thr Asp Thr Gly Val Ser
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Arg Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 316
<211> 140
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드
<400> 316
Gly Glu Gln Pro Cys Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro
1 5 10 15
Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Ala Arg Asn Gly
20 25 30
Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val
35 40 45
Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro
50 55 60
Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe
65 70 75 80
Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu
85 90 95
Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn
100 105 110
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115 120 125
Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
130 135 140
<210> 317
<211> 28
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> N-말단 연장부
<400> 317
Gly Glu Gln Pro Cys Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro
1 5 10 15
Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro
20 25
Claims (15)
- N-말단 아미노산 연장부 및 상기 아미노산 연장부에 부착된 프로트랙터(protractor)를 갖는 MIC-1 폴리펩티드를 포함하는 MIC-1 화합물로서, 아미노산 연장부는 3개 내지 36개의 아미노산 잔기를 포함하고, 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 6.5 미만의 산출된 pI를 갖는, MIC-1 화합물.
- 제1항에 있어서, N-말단 아미노산 연장부는 하나의 시스테인 잔기를 포함하고, 프로트랙터는 시스테인 잔기에서 아미노산 연장부에 부착되는, MIC-1 화합물.
- 제2항에 있어서, 프로트랙터는 Chem 1, Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4를 포함하고,
Chem. 1은
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1C: HOOC-벤젠-O-(CH2)y-CO-*, 및
Chem. 1D: (1H-테트라졸-5-일)-(CH2)x-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
x는 12~20의 범위 내 정수이고,
y는 5~15의 범위 내 정수이며,
Chem. 2는
Chem. 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*, ,
Chem. 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, 및
Chem. 2C: *-(NH-(CH)2)m-사이클로헥산-CO)k-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
Chem. 2의 m은 1~5의 범위 내 정수이고,
Chem. 2의 k는 0~4의 범위 내 정수이며,
Chem. 3은
* (NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l이며,
Chem. 3의 k는 1~10의 범위 내 정수이고,
n은 1~5의 범위 내 정수이고,
l은 0~5의 범위 내 정수이며,
Chem. 4는
Chem. 4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*, 및
Chem. 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*로 구성된 군으로부터 선택되며,
Chem. 4의 m은 1~5의 범위 내 정수이며,
Chem. 1, Chem. 2, Chem. 3, 및 Chem. 4는 한 Chem의*-NH 말단을 또 다른 Chem의 CO-* 말단에 연결하는 아미드 결합을 통해 상호 연결되며, Chem. 4의 CH2-* 말단은 아미노산 연장부 시스테인 잔기의 황 원자에 연결되는, MIC-1 화합물. - 제3항에 있어서, Chem. 1은
Chem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*,
Chem. 1b: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-* 및
Chem. 1c: HOOC-벤젠-O-(CH2)9-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되는, MIC-1 화합물. - 제3항 또는 제4항에 있어서, Chem. 2는
Chem. 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* 및
Chem. 2c: *-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*로 구성된 군으로부터 선택되는, MIC-1 화합물. - 제3항 내지 제5항에 있어서, Chem. 4는
Chem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-* 및
Chem. 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*로 구성된 군으로부터 선택되는, MIC-1 화합물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로트랙터는 화학식 IX, 화학식 X, 화학식 XI, 화학식 XII 및 화학식 XIII으로 구성된 군으로부터 선택되는, MIC-1 화합물:
(화학식 IX),
(화학식 X),
(화학식 XI),
(화학식 XII), 및
(화학식 XIII). - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 아미노산 연장부는 (리신, 아르기닌, 및/또는 히스티딘과 같은) 염기성 아미노산 잔기의 수와 비교하여 적어도 3, 4, 5 또는 6개의 (아스파르트산 및/또는 글루탐산과 같은) 산성 아미노산 잔기 과잉을 갖는, MIC-1 화합물.
- 제8항에 있어서, N-말단 아미노산 연장부는 A, C, E, G, P, S 및 T로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 구성되는, MIC-1 화합물.
- 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 연장부의 시스테인 잔기와 MIC-1 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 사이의 거리는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32 개 아미노산인, MIC-1 화합물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 아미노산 연장부는 다음 서열 중 하나 이상을 포함하는, MIC-1 화합물:
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS (서열 번호 223),
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPS (서열 번호 224),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 225),
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 226),
SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 227),
SEPACSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 229),
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 230),
SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 231),
SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 232),
SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 233),
SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 234),
SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG (서열 번호 235),
SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEG (서열 번호 236), 및
SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEG (서열 번호 237). - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, MIC-1 폴리펩티드는 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여, M57L 및/또는 M86L 중 적어도 하나의 치환을 포함하고/포함하거나, 서열 번호 1의 MIC-1과 비교하여 처음 3개 잔기의 결실 또는 N3의 결실을 포함하는, MIC-1 화합물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 아미노산 연장부를 갖는 MIC-1 폴리펩티드는 서열번호 100, 서열번호 104, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 164, 서열번호 288, 서열번호 289, 서열번호 290, 서열번호 291 또는 서열번호 292에 따른 아미노산 서열을 포함하는, MIC-1 화합물.
- 제1항에 있어서, 화합물은
(화학식 01),
(화학식 02),
(화학식 03),
(화학식 05),
(화학식 07),
(화학식 11),
(화학식 17),
(화학식 18),
(화학식 19),
화학식 20 및,
화학식 21
로 구성된 군으로부터 선택되는, MIC-1 화합물. - 대사 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 MIC-1 화합물로서, 대사 장애는 비만, 당뇨병, 심혈관 질환(예: 이상지질혈증, 동맥경화증), 지방간염, 또는 당뇨성 신병증인, MIC-1 화합물.
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