BR112019024102A2 - Composto mic-1 - Google Patents

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Abstract

a invenção refere-se a compostos mic-1. mais especificamente, refere-se a compostos que compreendem um polipeptídeo mic-1 e uma extensão de aminoácido n-terminal e um transferidor, em que referida extensão de aminoácido compreende de 3 a 36 resíduos de aminoácido e onde o polipeptídeo mic-1 e a extensão de aminoácido n-terminal têm, juntamente, um pi calculado menor do que 6,5. os compostos da invenção têm atividade de mic-1. a invenção refere-se também a composições farmacêuticas, compreendendo esses compostos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis, bem como o uso médico dos compostos.

Description

COMPOSTO MIC-1
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção relaciona-se aos compostos MIC-1 e a seu uso farmacêutico.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DA LISTAGEM DA SEQUÊNCIA [002] A Listagem de Sequência, intitulada SEQUENCE LISTING, tem 205,032 bytes, foi criada em 23 de maio de 2018 e está incorporada ao presente documento por referência.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] A Citocina-1 Inibidora de Macrófagos (MIC-1) foi descrita pela primeira vez em 1997 (Bootcov et al, Proc. Natl. Acad. Sei. outubro de 1997) com base em experimentos mostrando aumento de expressão em macrófagos ativados. A MIC-1 foi subsequentemente identificada por outros e recebeu vários nomes adicionais, tais como fator de transformador do crescimento placentário beta (PTGF-β), proteína óssea morfogenética placentária, fator de diferenciação de crescimento-15 (GDF15), fator derivado da próstata (PDF), gene anti-inflamatório não esteroide ativado por fármacos (NAG-1) e PL74.A MIC-1 é um membro distante da superfamília TGF-beta, uma família de hormônios peptídicos envolvidos no crescimento e diferenciação celular. A MIC-1 circula como um homodímero rico em cisteína com uma massa molecular de kDa 24,5. O MIC-1 do tipo selvagem humano tem uma meia-vida curta, significando que o tratamento com wtMIC-1 requer administração diária para manter a eficácia.
[004] As evidências cumulativas apoiam a utilidade terapêutica de
MIC-1 em distúrbios metabólicos, tais como obesidade e diabetes. Dados de pacientes com câncer avançado mostraram que perda de peso se relacionava com níveis circulantes de MIC-1 (Johnen et al, Nat Med., Nov, 2007). Além disso, camundongos transgênicos superexpressando MIC-1 ganham menos peso e gordura corporal em uma dieta de baixa gordura normal e em uma
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 8/241 /209 dieta de alta gordura (Macia et al, PLoS One, abril de 2012). Também, camundongos transgênicos superexpressando MIC-1 alimentados tanto em uma dieta de gordura alta e baixa, respectivamente, tiveram sua tolerância à glicose melhorada, em comparação com animais de tipo selvagem em dieta comparáveis.
[005] A WO 2005099746 refere-se a um método de modulação do apetite e/ou do peso corporal através da administração de um agente modulador de MIC-1.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A presente invenção refere-se a compostos MIC-1 que compreendem um polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido Nterminal e um prolongador anexado à extensão de aminoácido. Em um aspecto, os compostos MIC-1 da invenção compreendem um polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido N-terminal e um prolongador anexado à extensão de aminoácido, em que a extensão de aminoácido compreende de 3 a 200 resíduos de aminoácidos, e o polipeptídeo MIC-1 com a extensão de aminoácido tem um pi calculado inferior a 6,5.
[007] Em algumas modalidades, os compostos MIC-1 da invenção têm uma extensão de aminoácido N-terminal com um resíduo de Cisteína, em que o prolongador é anexado ao resíduo de Cisteína. Nestas modalidades, o prolongador compreende, ou consiste em, pelo menos, uma dentre cada uma de Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3 e Substância Química 4;
em que a Substância Química 1 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química IA:
Substância Química 1B:
Substância Química 1C:
HOOC-(CH2)x-CO-*,
HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
HOOC-benzeno-O-(CH2)y-CO
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 9/241 /209
Substância Química ID: (lH-tetrazol-5-il)-(CH2)x-CO-*, em que x é um número inteiro na faixa de 12-20, em que y é um número inteiro na faixa de 5-15;
em que a Substância Química 2 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)mCO)k*,
Substância Química 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, e
Substância Química 2C: *-(NH-(CH2)m-ciclohexanoCO)k-*, em que m da Substância Química 2 é um número inteiro na faixa de 1-5, e k da Substância Química 2 é um número inteiro na faixa de 04;
em que a Substância Química 3 é *(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)i, em que k da Substância Química 3 é um número inteiro na faixa de 1-10, n é um número inteiro na faixa de 1-5, e é um número inteiro na faixa de 0-5;
em que a Substância Química 4 é selecionada dentre Substância Química 4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
Substância Química 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NHCO-CH2-*, Substância Química 4C: *-NH-(CH2)m-CH(COOH)NH-CO-CH2-*, e
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 10/241 /209
Ο *-NH-(CH2)n-NH-CO-(CH2)m --Ο
Substância Química 4D:
em que m da Substância Química 4 é um número inteiro na faixa de 1-5, e n é um número inteiro na faixa 2-6; e em que a Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3, e Substância Química 4 são interligadas através de ligações de amida, conectando a extremidade *-NH de uma Substância Química à extremidade CO-* de outra Substância Química, e em que a Substância Química 4 está conectada ao átomo de enxofre do resíduo de Cisteína da extensão de aminoácido.
[008] Um asterisco (*) em uma fórmula química designa um ponto de ligação.
[009] Em algumas modalidades o os compostos MIC-1 da invenção compreendem uma extensão N-terminal que tem excesso de resíduos de aminoácidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico) de pelo menos 3, 4, 5 ou 6 em relação ao número de resíduos de aminoácidos básicos (lisina, arginina e histidina).
[0010] Em algumas modalidades da invenção, os compostos MIC-1 compreendem extensões N-terminais compostas de resíduos de aminoácidos selecionados dentre o grupo consistindo de A, C, E, G, P, S, T, Q, N e D, em que a referida extensão de aminoácido compreende pelo menos três resíduos de aminoácidos E e/ou D.
[0011] Em algumas modalidades, os compostos MIC-1 da invenção compreendem um polipeptídeo MIC-1 que apresenta pelo menos 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a MIC-1 da SEQ ID NO: 1.
[0012] Em algumas modalidades, os compostos MIC-1 da invenção
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 11/241 /209 compreendem um polipeptídeo MIC-1 que compreende uma deleção dos primeiros três resíduos (ΜΙΟ1-Δ1-3) ou uma deleção de Asparagina 3 (desN3) em comparação com MIC-1 da SEQ ID NO:1.
[0013] Em uma modalidade particular da invenção, o composto MIC1 compreende um polipeptídeo MIC-1 e uma extensão de aminoácido Nterminal com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 87, 90, 92, 93, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 108, 109, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 164, 288, 289, 290, 291 ou 292.
[0014] Em um aspecto, os compostos MIC-1 da invenção retiveram a potência do receptor de MIC-1 e a eficácia in vivo na redução da ingestão de alimentos e do peso corporal. Estes compostos MIC-1, portanto, podem ser usados para o tratamento de distúrbios metabólicos como obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares, como dislipidemia e a arteriosclerose e outras doenças tais como esteatohepatite e nefropatia diabética.
[0015] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica, compreendendo o composto MIC-1 composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável, amida ou éster do mesmo e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0016] Em um aspecto, a invenção fornece um composto MIC-1 da invenção para uso na prevenção e/ou tratamento de um distúrbio metabólico, em que o distúrbio metabólico é obesidade, diabetes tipo 2, dislipidemia ou nefropatia diabética.
[0017] Em um aspecto, a invenção fornece um composto MIC-1 para uso na prevenção e/ou tratamento de dislipidemia, arteriosclerose, esteatohepatite não alcoólica ou nefropatia diabética.
[0018] Em um aspecto, os compostos MIC-1 da invenção têm uma exposição plasmática prolongada, isto é, uma meia-vida prolongada em comparação ao MIC-ltipo selvagem humano.
[0019] Em um aspecto, os compostos MIC-1 da invenção têm
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 12/241 /209 solubilidade melhorada. Em um aspecto, os compostos MIC-1 da invenção têm estabilidade química melhorada.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0020] Fig.l: A expressão de polipeptídeos MIC-1 com extensões N com blocos de construção 12-mer únicos. Todas as células foram cultivadas em TB a 37°C e as proteínas foram induzidas a expressar pela adição de 0,5 mM IPTG depois que OD600 atingiu 1,0. As células foram colhidas após a noite e o nível de expressão foi verificado através do carregamento do lisado total em SDS-PAGE. MIC-1 humano do tipo selvagem (MIC-1) foi carregado como controle positivo.
[0021] Fig.2: A expressão de polipeptídeos MIC-1 com extensões N com blocos de construção duplos 12-mer. Todas as células foram cultivadas em TB a 37°C e as proteínas foram induzidas a expressar pela adição de 0,5 mM IPTG depois que OD600 atingiu 1,0. As células foram colhidas após a noite e o nível de expressão foi verificado através do carregamento do lisado total em SDS-PAGE. MIC-1 foi carregado como controle positivo.
[0022] Fig.3: a) Comparação dos níveis de expressão entre polipeptídeos MIC-1 com extensões N iniciando com 12mer-(4 +2 +_)-(4 +4 +_) e - (4 +3 +_). Deve ser notado que o grupo com 12mer-(4 +3_) e o construto indicada pelo ponto que contêm M57L na sequência de polipeptídeos de MIC-1. b) os efeitos dos 12mers estendidos no nível de expressão. Além disso, o ponto mais baixo de dados no grupo de 3,6 é o polipeptídeo MIC-1 contendo M57L. Nesta figura, 1.6 último representa TSTEEG, 2.6 representa TSESAT, representa 3.6 TSTEPS e 4.6 representa SEP ATS.
[0023] Fig.4: SDS-PAGE de representantes com 12mer- (4 +2 + _), 12mer- (4 +3 + _) + M57L, 12mer- (três repetições) e 12mer- (quatro repetições). T: proteína total, S: fração solúvel, P: pélete celular (corpo de inclusão).
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 13/241 /209
[0024] Fig.5: Polipeptideos MIC-1 com mutações em sequência. Nesta figura, a sequência polipeptídica MIC-1 é MIC-1 Δ1-3. T: proteína total, S: fração solúvel, P: pélete celular (corpo de inclusão).
[0025] Fig.6: Alteração no peso corporal ao longo do tempo durante o estudo farmacodinâmica (PD) em porcos. 01: Composto 01; 05: Composto 05 [0026] Descrição Detalhada
[0027] A invenção refere-se a compostos MIC-1 que compreendem um polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido N-terminal e um prolongador anexado à extensão de aminoácido.
[0028] Em um aspecto, os compostos MIC-1 da invenção compreende um polipeptídeo MIC-1, uma extensão de aminoácido N-terminal e um prolongador anexado ao a extensão de aminoácido, em que a extensão de aminoácido compreende de 3 a 200 resíduos de aminoácidos, e o polipeptídeo MIC-1 e a extensão de aminoácido juntos têm um pi calculado inferior a 6,5. [0029] Os compostos MIC-1 da invenção são biologicamente ativos. Por exemplo, eles são potentes, mantêm a eficácia completa em comparação com MIC-1 e também têm um perfil de exposição plasmática prolongado, ou seja, tem uma meia-vida prolongada. A combinação particular de potência e meia-vida longa é desejável.
MIC-1
[0030] O termo “MIC-1” como usado aqui significa Citocina Inibidora de Macrófagos-1 (MIC-1), também conhecida como Fator de Diferenciação de Crescimento 15 (GDF-15), proteína morfogenética óssea placentária (PLAB) e gene anti-inflamatório não esteroide ativado por fármacos (NAG-1). A MIC-1 é sintetizada como uma proteína precursora ao homodímero intracelular de 62 kDa que é subsequentemente clivada por uma protease do tipo furina em um homodímero de 24,5 kDa. A sequência da MIC-1 humana de tipo selvagem de comprimento total está disponível no banco de dados UNIPROT com número de acesso Q99988. A sequência de
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 14/241 /209 precursor de aminoácidos 308 inclui um peptídeo de sinalização (aminoácidos 1-29), um pró-peptídeo (aminoácidos 30-196) e uma sequência monomérica de MIC-1 (aminoácidos 197-308). A sequência monomérica de MIC-1 de aminoácidos 112 é incluída neste documento como SEQ ID NO: 1. O monômero MIC-1 contém nove resíduos de cisteína que originam a formação de 4 ligações dissulfeto intracadeias e uma ligação dissulfeto intercadeias para criar um homodímero de 24,5 kDa ligado covalentemente. Uma mutação que ocorre naturalmente correspondendo a H6D na sequência monomérica de MIC-1 (SEQ ID NO: 1) foi descrita.
[0031] O termo “composto MIC-1”, conforme usado neste documento, refere-se a um composto compreendendo um polipeptídeo MIC1, uma extensão de aminoácido N-terminal, e um prolongador. O composto MIC-1 está tipicamente na forma de um homodímero.
[0032] Os termos “polipeptídeo MIC-1”, conforme é utilizado neste documento, refere-se à sequência monomérica da MIC-1 humana da SEQ ID NO: 1 ou a um análogo da mesma. Referências numéricas a determinados resíduos de MIC-1, se não indicado em contrário, referem-se à sequência monomérica de 112 aminoácidos (isto é, o resíduo 1 é alanina (Al) e o resíduo 112 é Isoleucina (1112).
[0033] O termo “análogo a MIC-1” ou análogo de MIC-1, tal como é utilizado neste documento, refere-se a um polipeptídeo MIC-1, que é uma variante de aminoácido da sequência monomérica de MIC-1 da SEQ ID NO: 1. Em outras palavras, um análogo de MIC-1 é um polipeptídeo MIC-1 em que um número de resíduos de aminoácidos foi alterado quando comparado com a MIC-1 humana (SEQ ID NO: 1). Estas alterações podem representar, independentemente, uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos.
[0034] Os análogos de MIC-1 podem ser descritos por referência ao resíduo de aminoácido que está alterado, o número do resíduo de aminoácido
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 15/241 /209 (isto a posição correspondente na sequência monomérica de MIC-1 (SEQ ID NO: 1)) e a alteração (por exemplo, o resíduo de aminoácido muda para).
[0035] Em um aspecto, o análogo de MIC-1 é uma variante funcional do MIC-1 da SEQ ID NO: 1. Em um aspecto da invenção, os análogos de MIC-1 tem pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência à MIC1 da SEQ ID NO:1. Como um exemplo de um método para determinação da identidade de sequência entre dois análogos, os dois peptídeos H6D MIC-1 e MIC-1 da SEQ ID NO:1 são alinhados. A identidade de sequência do análogo H6D MIC-1 em relação à MIC-1 da SEQ ID NO: 1 é dada pelo número de resíduos idênticos alinhados dividido pelo número total de resíduos alinhados em MIC-1 da SEQ ID NO: 1. Por conseguinte, no referido exemplo, a identidade de sequência em percentagem é (112-1)/112 X 100. Na determinação da identidade de sequência de um análogo de MIC-1, a extensão do aminoácido N-terminal não está incluída. Um programa de alinhamento adequado pode ser testado com uma agulha do programa de alinhamento adequado, que é um alinhamento de Needleman-Wunsch. O algoritmo para este programa de alinhamento é descrito em Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453.
[0036] Em um outro aspecto da invenção, os análogos de MIC-1 compreendem menos do que 15, 10 ou 5, modificações de amino ácido (substituições, deleções, adições (incluindo inserções) e qualquer combinação destes) para MIC-1 humana da SEQ ID NO: 1. O termo “modificação de aminoácidos” utilizado ao longo deste pedido é usado com o significado de uma modificação em um aminoácido em comparação com o monômero MIC1 (SEQ ID NO: 1). Esta modificação pode ser o resultado de uma deleção de um aminoácido, a adição de um aminoácido, a substituição de um aminoácido com outro ou um substituinte covalentemente ligado a um aminoácido do peptídeo.
[0037] Substituições: Em um aspecto, os aminoácidos podem ser
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 16/241 / 209 substituídos por substituição conservativa. O termo substituição conservativa tal como aqui utilizado indica que um ou mais aminoácidos são substituídos por outro resíduo biologicamente semelhante. Exemplos incluem a substituição dos resíduos de aminoácidos com características semelhantes, por exemplo, pequenos aminoácidos, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrofóbicos e aminoácidos aromáticos.
[0038] Em um aspecto, os aminoácidos podem ser substituídos por substituição não conservativa. O termo substituição não conservativa, como utilizado neste documento indica que um ou mais aminoácidos são substituídos por um outro aminoácido com características diferentes. Exemplos incluem a substituição de um resíduo de aminoácido básico com um resíduo de aminoácido ácido, substituição de um resíduo de aminoácido polar com um resíduo de aminoácido aromático, etc. Em um aspecto, a substituição não conservativa é a substituição de um aminoácido codificado por outro aminoácido codificado com características diferentes. Em um aspecto, os MIC-1 análogos podem incluir substituições de um ou mais aminoácidos não naturais e/ou não aminoácidos, por exemplo, o mimético de aminoácido, na sequência do MIC-1.
[0039] Em um aspecto da invenção, a asparagina na posição correspondente a posição 3 da sequência monomérica MIC-1 (SEQ ID NO: 1) é substituída por Serina (N3S), ácido glutâmico (N3E), Alanina (N3A) ou Glutamina (N3Q). Em um aspecto da invenção, a asparagina na posição correspondente a posição 3 da sequência monomérica MIC-1 humana (SEQ ID NO: 1) é substituída por ácido glutâmico (N3E).
[0040] Em um aspecto da invenção, a arginina na posição correspondente à posição 2 da sequência monomérica MIC-1 humana (SEQ ID NO: 1) foi substituída por alanina (R2A) e a asparagina na posição correspondente a posição 3 da sequência monomérica MIC-1 humana (SEQ
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 17/241 /209
ID NO: 1) foi substituída por ácido glutâmico (N3E).
[0041] Em um aspecto da invenção, a arginina na posição correspondente à posição 2 da sequência monomérica MIC-1 humana (SEQ ID NO: 1) foi substituída por ácido glutâmico (R2E) e a asparagina na posição correspondente a posição 3 da sequência monomérica MIC-1 humana (SEQ ID NO: 1) foi substituída por Serina (N3S).
[0042] Deleções e Truncamentos: Em um aspecto, os análogos de MIC-1 da invenção podem ter um ou mais resíduos de aminoácidos, excluídos da sequência de aminoácidos de MIC-1 (SEQ ID NO: 1), sozinho ou em combinação com um ou mais inserções ou substituições.
[0043] Os análogos de MIC-1 com deleções de aminoácido podem ser descritos por des, referência para o resíduo de aminoácido que é excluído e seguido pelo número do aminoácido excluído (ou seja, a posição correspondente no monômero MIC-1 (SEQ ID NO: 1)). Em algumas modalidades da invenção, a asparagina na posição correspondente à posição 3 do monômero MIC-1 humano (SEQ ID NO: 1) é excluído (MIC-1 des-N3, SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades da invenção, a alanina na posição correspondente à posição 1 do monômero MIC-1 humano (SEQ ID NO: 1) é deletada (MIC-1, des-Al).
[0044] Os análogos de MIC-1 com um truncamento de um ou mais resíduos de aminoácidos no terminal N ou C podem ser descritos por MIC-ΙΑ e a referência para o(s) número(s) dos resíduos de aminoácidos excluídos (ou seja, posição correspondente no monômero MIC-1 (SEQ ID NO: 1)). Em algumas modalidades da invenção, os três primeiros resíduos (Al, R2, N3) no terminal N são excluídos (MIC-1-A1-3, SEQ ID NO: 3).
[0045] Inserções: Em um aspecto, os análogos de MIC-1 da invenção podem ter um ou mais resíduos de aminoácidos inseridos na sequência de aminoácidos de MIC-1 humana, sozinhos ou em combinação com uma ou mais deleções e/ou substituições.
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[0046] Em um aspecto, os análogos de MIC-1 da invenção incluem inserções de um ou mais aminoácidos não naturais e/ou não aminoácidos na sequência de MIC-1.
[0047] O termo proteína ou polipeptídeo, como por exemplo, utilizado neste documento, refere-se a um composto que compreende uma série de aminoácidos ligados entre si por ligações Amida (ou peptídicas).
[0048] Os aminoácidos são moléculas que contém um grupo amina e um grupo ácido carboxílico e, opcionalmente, um ou mais grupos adicionais, muitas vezes referidos como uma cadeia lateral.
[0049] O termo aminoácido inclui aminoácidos codificado (ou proteico ou natural) (dentre aqueles os 20 aminoácidos-padrão), bem como aminoácidos não codificados (ou não proteico ou não natural). Aminoácidos codificados são aqueles que são naturalmente incorporados em proteínas. Os aminoácidos-padrão são aqueles codificados pelo código genético. Aminoácidos não codificados não são encontrados em proteínas ou não produzidos pela maquinaria celular padrão (por exemplo, eles podem ter sido sujeitos a modificação pós-traducional). No que se segue, todos os aminoácidos das proteínas MIC-1, para o qual o isômero óptico não é indicado deve entender-se o L-isômero (a menos que especificado de outra forma).
[0050] Como é evidente a partir do acima exposto, os resíduos de aminoácidos podem ser identificados pelo seu nome completo, seu código de uma letra, e/ou seu código de três letras. Essas três formas são totalmente equivalentes. Para a conveniência do leitor, os códigos de aminoácidos de uma e de três letras são fornecidos abaixo:
[0051] Glicina: G e Gly; Prolina: P e Pro; Alanina: A e Ala; Valina: V e Vai; Leucina: L e Leu; Isoleucina: I e He; Metionina: M e Met; Cisteína: C e Cys; Fenilalanina: F e Phe; Tirosina: Y e Tyr; Triptofano: W e Trp; Histidina: H e His; Lisina: K e Lys; Arginina: R e Arg; Glutamina: Q e Gin; Asparagina:
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N e Asn; Ácido glutâmico: E e Glu; Ácido aspártico: D e Asp; Serina: S e Ser; e treonina: T e Thr.
Extensão de aminoácido N-terminal
[0052] Os compostos MIC-1 da invenção compreendem uma extensão de aminoácido N-terminal.
[0053] O termo extensão de aminoácido N-terminal, conforme utilizado neste documento, significa que o N-terminal do polipeptídeo MIC-1 está ligado ao C-terminal da extensão do aminoácido N-terminal através de uma ligação peptídica. Os termos extensão de aminoácido N-terminal, extensão N-terminal e extensão N neste documento significam a mesma coisa e são usados de forma intercambiável. Em uma modalidade, o composto da invenção compreende a sequência monomérica de MIC-1 humana (SEQ ID NO: 1) com uma extensão de aminoácido ligada ao N-terminal, isto é, a alanina na posição 1 (Al) através de uma ligação peptídica.
[0054] Em algumas modalidades da invenção, a extensão do aminoácido N-terminal é de até 200 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade particular da invenção, a extensão do aminoácido N-terminal tem de 3 a 36 resíduos de aminoácidos.
[0055] Em um aspecto da invenção, a extensão de aminoácido Nterminal tem um excesso de resíduos de aminoácidos ácidos (ácido aspártico e/ou ácido glutâmico) de pelo menos 3, 4, 5 ou 6 em relação ao número de resíduos de aminoácidos básicos (Lisina, Arginina e/ou Histidina). Um excedente de resíduos de aminoácidos ácidos significa que o número de resíduos ácidos excede o número de resíduos básicos. Um valor definido do excedente de resíduos de aminoácidos ácidos é calculado como o número de resíduos ácidos, menos o número de resíduos básicos.
[0056] A metionina é o aminoácido inicial na expressão de proteínas em células procarióticas (por exemplo, as bactérias, por exemplo, Escherichia coli). Em algumas modalidades da invenção, a metionina inicial é removida
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 20/241 /209 da proteína durante a expressão da proteína. Portanto, a Metionina inicial não está incluída na sequência da extensão N do composto MIC-1. Contudo, alguém versado na técnica sabe que o códon de iniciação, que codifica a Metionina inicial, é necessário para a iniciação da tradução da proteína e deve ser incorporado imediatamente em frente da sequência nucleotídica para expressão da proteína, sem exceção.
[0057] Entretanto, pode ser entendido que os compostos MIC-1 com extensões N com a Metionina inicial também caem no âmbito da invenção. Prolongador
[0058] Os compostos MIC-1 da invenção compreendem um prolongador. O prolongador é ligado covalentemente a um resíduo de aminoácido específico do polipeptídeo MIC-1 ou da extensão de aminoácido N-terminal.
[0059] O termo prolongador refere-se às propriedades de transmitir exposição plasmática prolongada (porção de extensão de meia-vida) e é entendido neste documento como se referindo a um grupo químico ligado a funcionalidades de cadeia de sítio de aminoácido como -SH, -OH, -COOH, CONH2, -NH2 que pode aumentar a meia-vida circulatória in vivo de MIC-1 quando conjugado ao MIC-1. Exemplos de prolongadores incluem, mas não estão limitados a: ácidos graxos e derivados do mesmo, hidroxialquil amido (HAS), por exemplo, hidroxietil amido (HES), polietileno glicol (PEG), poli (Glyx-Sery)n (HAP), ácido hialurônico (HA), polímeros de heparosano (HEP), polímeros à base de fosforilcolina (polímero PC), flexímeros, dextrano, ácidos polissiálicos (PSA), e domínio Fc, transferrina, albumina, peptídeos tipo elastina, sequências de amino repetidas e não desestruturadas (por exemplo, polímeros XTEN), peptídeos de ligação a albumina, um peptídeo CTP e qualquer combinação destes.
[0060] Em algumas modalidades da invenção, o prolongador é capaz de formar associações não covalentes com albumina, aumentando assim o
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 21/241 /209 tempo de exposição no sangue/plasma do composto MIC-1, e também tendo ο efeito de prolongar o tempo de ação do composto MIC-1, devido ao fato de que a associação do composto MIC-1 e albumina só é lentamente desintegrada para liberar o ingrediente farmacêutico ativo.
[0061] Em algumas modalidades, o ácido graxo que compreende os prolongadores da invenção é capaz de formar associações não covalentes com albumina e, desse modo, prolonga-se a meia-vida plasmática do composto MIC-1 em comparação com o MIC-1 tipo amplo humano.
[0062] Em algumas modalidades da invenção, o prolongador é ligado covalentemente a um resíduo de cisteína da extensão de aminoácido N terminal do polipeptídeo MIC-1. Em uma modalidade, o prolongador compreende um grupo de haloacetamida, que reage com o grupo tiol de um resíduo de cisteína, sob formação de uma ligação covalente de enxofrecarbono (este processo sendo referido como Cys-alquililação), que também é referido como uma ligação de tio-éter. Em outra modalidade, o prolongador compreende um grupo maleimida, que reage com o grupo tiol de um resíduo de cisteína, sob formação de uma ligação covalente de enxofre-carbono.
[0063] Em algumas modalidades da invenção, o prolongador é ligado covalentemente ao aminoácido N-terminal da extensão de aminoácido Nterminal.
Ácido graxo compreendendo o prolongador
[0064] Em um aspecto da invenção, o prolongador compreende, ou consiste em, pelo menos um dentre cada um da Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3 e Substância Química 4:
em que a Substância Química 1 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química IA:
Substância Química 1B:
Substância Química 1C:
HOOC-(CH2)x-CO-*,
HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
HOOC-benzeno-O-(CH2)y-CO
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 22/241 /209
Substância Química ID: (lH-tetrazol-5-il)-(CH2)x-CO-*, em que x é um número inteiro na faixa de 12-20, em que y é um número inteiro na faixa de 5-15;
em que a Substância Química 2 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química 2A: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-COSubstância Química 2B: :>NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*, e
Substância Química 2C: *-NH-(CH2)m-ciclohexano-CO em que m de a Substância Química 2 é um número inteiro na faixa de 1-5;
em que a Substância Química 3 é * NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, em que k da Substância Química 3 é um número inteiro na faixa de 1-10, n é um número inteiro na faixa de 1-5; e em que a Substância Química 4 é selecionada dentre
Substância Química 4A: :>NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
Substância Química 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NHCO-CH2-*, *-NH-(CH2)n-NH-CO-(CH2)m ---N
O
Substância Química 4C: *-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NHCO-CH2-*, e
Substância Química 4D:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 23/241 /209 em que m da Substância Química 4 é um número inteiro na faixa de 1-5 e n é um número inteiro na faixa de 2-6 ou
Figure BR112019024102A2_D0001
(Fórmula I) em que a Substância Química 4 é selecionada do grupo consistindo na Fórmula I, II ou III:
Figure BR112019024102A2_D0002
(Fórmula II) ou
Figure BR112019024102A2_D0003
(Fórmula III).
em que a Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3, e Substância Química 4 são interligadas através de ligações de amida, conectando a extremidade *-NH de uma Substância Química à extremidade CO-* de outra Substância Química.
[0065] Em algumas modalidades, o prolongador da invenção compreende uma Substância Química 1, uma Substância Química 4, e uma ou mais dentre Substância Química 2 e Substância Química 3. Como um exemplo não limitante, o prolongador consiste em um elemento da Substância Química 1, dois elementos da Substância Química 2, dois elementos da Substância Química 3 e um elemento da Substância Química 4.
[0066] Os elementos Substância Química 2 e Substância Química 3 mantêm uma extremidade -NH- e CO- permitindo que eles sejam ligados por ligações de amida entre si e por -CO- ou -NH- da Substância Química 1 ou Substância Química 4. A Substância Química 4 tem uma extremidade -NH
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 24/241 /209 (capaz de formar uma ligação de amida com Substância Química 2 ou Substância Química 3). A Substância Química 4 ainda tem uma extremidade NH-CO-CH2-, que na forma não reagida é uma haloacetamida capaz de reagir com o grupo tiol de um resíduo de cisteína, ou uma extremidade (-N*-COCH2-CH**-CO), o parênteses que representa uma estrutura cíclica, que na forma não reagida é um maleimida capaz de reagir com o grupo tiol de cisteína; ou um aldeído capaz de reagir com o grupo amino N-terminal em uma reação de alquilação redutiva.
[0067] O comprimento da cadeia de carbono da Substância Químical definida por x ou y pode variar de 12-20 para x e 5-15 para y. Versões mais curtas ou mais longas podem ser favorecidas para diferentes tipos de prolongadores. Em uma determinada modalidade da Substância Química IA, *-(CH2)x-* refere-se a alquileno reto, em que x é um número inteiro no intervalo de 12-20, tal como 14-18 ou tal como 16.
[0068] Esta Substância Química 1 pode ser brevemente referida como diácido Cl8, isto é, um ácido di-carboxílico graxo com 18 átomos de carbono. Quando x=l6, a estrutura deste elemento ligante corresponde à Substância Química la: HOOC-(CH2)i6-CO-*.
[0069] Em outras modalidades, a Substância Química 1 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química la:
Substância Química 1b:
Substância Química 1c:
*, e
Substância Química Id:
HOOC-(CH2)i6-CO-*, HO-S(=O)2-(CH2)i5-CO-* HOOC-benzeno-O-(CH2)9-CO(lH-tetrazol-5-il)-(CH2)i5-CO-*,
Em outras modalidades, a Substância Química 2 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Substância Química 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* e
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 25/241 /209
Substância Química 2c: *-NH-CH2-ciclohexano-CO-*.
[0070] Em um aspecto da invenção, o prolongador é ligado a um resíduo de Cisteína; e o prolongador compreende, ou consiste em, pelo menos uma dentre cada uma da Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3 e Substância Química 4;
em que a Substância Química 1 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química IA:
Substância Química 1B:
Substância Química 1C:
*, e
Substância Química 1D:
HOOC-(CH2)X-CO-*,
HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
HOOC-benzeno-O-(CH2)y-CO(lH-tetrazol-5-il)-(CH2)x-CO-*, em que x é um número inteiro na faixa de 12-20, em que y é um número inteiro na faixa de 5-15;
em que a Substância Química 2 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)mCO)k*, Substância Química 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, e
Substância Química 2C: *-(NH-(CH2)m-ciclohexanoCO)k-*, em que m da Substância Química 2 é um número inteiro na faixa de 1-5, e k é um número inteiro na faixa de 0-4;
em que a Substância Química 3 é *(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)i, em que k da Substância Química 3 é um número inteiro na faixa de 1-10, n é um número inteiro na faixa de 1-5, e
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 26/241 / 209 é um número inteiro na faixa de 0-5;
em que a Substância Química 4 é selecionada dentre
Substância Química 4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*, e
Substância Química 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NHCO-CH2-*, em que m da Substância Química 4 é um número inteiro na faixa de 1-5; e em que a Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3, e Substância Química 4 são interligadas através de ligações de amida, conectando a extremidade *-NH de uma Substância Química à extremidade CO-* de outra Substância Química, e em que a extremidade CH2-* da Substância Química 4 está conectada ao átomo de enxofre do resíduo de Cisteína da extensão de aminoácido.
[0071] Em um aspecto da invenção, o prolongador é ligado a um aminoácido N-terminal, e compreende, ou consiste em, pelo menos uma de cada uma da Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3 e Substância Química 4;
em que a Substância Química 1 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química IA:
Substância Química 1B:
Substância Química 1C:
*, e
Substância Química 1D:
HOOC-(CH2)x-CO-*, HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*, HOOC-benzeno-O-(CH2)y-CO(lH-tetrazol-5-ií)-(CH2)x-CO-* em que x é um número inteiro na faixa de 12-20, em que y é um número inteiro na faixa de 5-15;
em que a Substância Química 2 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)mPetição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 27/241 /209
CO)k*,
Substância Química 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, e
Substância Química 2C: *-(NH-(CH2)m-ciclohexanoCO)k-*, em que m da Substância Química 2 é um número inteiro na faixa de 1-5, e k é um número inteiro na faixa de 0-4;
em que a Substância Química 3 é *(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)i, em que k da Substância Química 3 é um número inteiro na faixa de 1-10, n é um número inteiro na faixa de 1-5, e é um número inteiro na faixa de 0-5;
em que a Substância Química 4 é selecionada do grupo consistindo na Fórmula I, II ou III:
Figure BR112019024102A2_D0004
em que a Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3, e Substância Química 4 são interligadas através de ligações de amida, conectando a extremidade *-NH de uma Substância Química à extremidade CO-* de outra Substância Química, e em que a
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 28/241 /209 extremidade CH2-* da Substância Química 4 está conectada ao grupo alfaamino do N-terminal da extensão de aminoácido.
[0072] A nomenclatura é como é habitual na técnica, por exemplo, nas fórmulas acima *-CO-* refere-se a carbonila (*-C(=O)-*). O benzeno refere-se à estrutura do anel que, na Substância Química 1C, é substituída em Cl e C3 ou C4 por -O-(CH2)x-* e -COOH, respectivamente. HO-S(=O)2*descreve um grupo ácido sulfônico.
[0073] Os compostos/prolongadores da invenção podem existir em diferentes formas estéreo isoméricas tendo a mesma fórmula molecular e sequência de átomos ligados, mas diferindo apenas na orientação tridimensional de seus átomos no espaço. O estereoisomerismo dos compostos/prolongadores exemplificados da invenção é indicado na seção experimental, nos nomes, bem como nas estruturas, usando nomenclatura padrão. Salvo indicação em contrário, a invenção se refere a todas as formas estereoisoméricas dos compostos/prolongadores reivindicados.
Ponto isoelétrico (pi)
[0074] O pi calculado do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido N-terminal é definido como o pH no qual a carga calculada líquida do polipeptídeo MIC-1 com a extensão N é zero. A carga calculada do polipeptídeo MIC-1 com a extensão N em função do pH é obtida usando os valores de pKa dos resíduos de aminoácidos descritos na Tabela 1 e o método descrito por B. Skoog e A. Wichman (Trends in Analytical Chemistry, 1986, vol. 5, pp. 82-83). O pKa de cadeia lateral de cisteína (Cys) só é incluído no cálculo de carga para cisteinas com um grupo sulfidrila livre. Como um exemplo, o valor pi calculado de MIC-1 do tipo selvagem humano é 8,8 como o homodímero.
[0075] Conforme descrito neste documento, cálculos pi sobre polipeptídeos MIC-1 com extensões N são feitos em homodímeros.
Tabela 1: pKa de resíduos de aminoácidos utilizada para o cálculo de
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 29/241 /209 pi. Os valores de pKa são descritos em “Correlation of Electrophoretic Mobilities from Capillary Electrophoresis with Physicochemical Properties of Proteins and Peptides by Rickard EC, Strohl MM, Nielsen RG. Analytical Biochemistry 1991, vol 197, pp 197-207 ___________________________
Terminal N Terminal C Cadeia lateral
Asp 8,6 2,75 3,5
Asn 7,3 2,75 -
Thr 8,2 3,2 -
Ser 7,3 3,2 -
Glu 8,2 3,2 4,5
Gin 7,7 3,2 -
Pro 9 3,2 -
Gly 8,2 3,2 -
Ala 8,2 3,2 -
Vai 8,2 3,2 -
Cys 7,3 2,75 10,3
Met 9,2 3,2 -
lie 8,2 3,2 -
Leu 8,2 3,2 -
Tyr 7,7 3,2 10,3
Phe 7,7 3,2 -
Lys 7,7 3,2 10,3
His 8,2 3,2 6,2
Trp 8,2 3,2 -
Arg 8,2 3,2 12,5
Propriedades funcionais
[0076] Em um aspecto, os compostos MIC-1 da invenção têm boas propriedades biofísicas.
[0077] Os compostos MIC-1 da invenção são biologicamente ativos. Por exemplo, eles são potentes, se ligam e ativam o complexo receptor MIC1. Além disso, os compostos MIC-1 apresentam exposição plasmática prolongada definida como meia-vida mais longa. Por exemplo, os compostos MIC-1 têm uma meia-vida plasmática marcadamente maior quando administrados i.v. para ratos e/ou mini porcos em comparação com MIC-1 (SEQ ID 1). A combinação particular de potência do receptor retida e meiavida plasmática longa pode ser altamente desejável.
Atividade in vitro
[0078] Em um aspecto, os compostos da invenção retiveram potência de receptores de MIC-1 em à MIC-1 humana (SEQ ID NO: 1). A eficácia e
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 30/241 /209 potência do receptor podem ser medidas em células de mamíferos transfectadas com receptor humano de MIC-1 (hGFRAL, receptor da família GDNF similar ao alfa) e seu co-receptor de sinalização hRET (receptor Ret de proteína tirosina quinase proto-oncogene). A ativação dos compostos MIC-1 do complexo receptor é medida por fosforilação de quinases reguladas por sinal extracelulares (ERKs), conforme descrito no exemplo 6.
[0079] Conforme descrito neste documento a eficácia e potência do receptor é medida em compostos MIC-1 como homodímeros.
Atividade biológica in vivo
[0080] Em um aspecto os compostos da invenção são potentes in vivo, o que pode ser determinado como é conhecido na arte em qualquer modelo animal adequado.
[0081] O rato Sprague Dawley não obeso é um exemplo de um modelo adequado de animal, e as alterações na ingestão de alimentos podem ser determinadas em tais ratos in vivo, por exemplo, como descrito no exemplo 14. Em um aspecto os compostos da invenção inibem a ingestão de alimentos em vivo em ratos Sprague Dawley não obesos.
Meia-vida plasmática in vivo
[0082] Em um aspecto, os compostos MIC-1 da invenção são prolongados e têm uma meia-vida plasmática in vivo estendida, que pode ser determinada em um estudo in vivo farmacocinético adequado.
[0083] A exposição plasmática prolongada pode ser determinada como meia-vida plasmática (7½) após administração i.v. a animais, tais como ratos ou mini porcos.
[0084] Em algumas modalidades, os compostos MIC-1 da invenção têm uma meia-vida plasmática após administração i.v. a ratos de pelo menos 10 horas, mais preferencialmente entre 25-50 horas, ou mais preferencialmente pelo menos 50 horas, determinados conforme descrito no Exemplo 16.
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 31/241 /209
[0085] Em algumas modalidades, os compostos MIC-1 da invenção têm uma meia-vida plasmática após administração i.v. a mini porcos de pelo menos 50 horas, mais preferencialmente entre 50-200 horas, ainda mais preferencialmente pelo menos 200 horas ou mais preferencialmente pelo menos 300 horas, determinados conforme descrito no Exemplo 17.
[0086] De acordo com um terceiro aspecto, os compostos da invenção são prolongados e, ao mesmo tempo, mantêm a potência in vivo. A combinação particular de potência retida e meia-vida plasmática longa pode ser altamente desejável.
Solubilidade
[0087] A MIC-1 humana de tipo selvagem é uma proteína hidrofóbica, com um pi calculado de 8,8 baseado no homodímero. Consequentemente, a MIC-1 de tipo selvagem só pode ser solubilizada até cerca de 0,5 mg/ml em sistemas de tampão aquoso de pH neutro. A baixa solubilidade de MIC-1 dificulta significativamente suas propriedades farmacêuticas da formulação e o uso terapêutico, de modo que o desenvolvimento de um composto MIC-1 com solubilidade melhorada melhoraria significativamente a utilidade terapêutica.
[0088] Em um aspecto, os polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N da invenção têm solubilidade melhorada (isto é, são mais solúveis) em relação à MIC-1 humana da SEQ ID NO: 1.
[0089] Como aqui descrito, a solubilidade é medida como descrito no Exemplo 4.
[0090] Em certas modalidades, os polipeptídeos com uma extensão N MIC-1 da invenção têm uma solubilidade de pelo menos 1 mg/ml em tampão Tris a um pH 8,0. Em outras modalidades, os polipeptídeos MIC-1 com extensões N da invenção têm uma solubilidade de pelo menos 5 mg/ml, pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 30 mg/ml, ou pelo menos 40 mg/ml em tampão Tris a pH 8,0.
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[0091] Adicionar um prolongador para produzir um composto MIC-1 não altera marcadamente a solubilidade melhorada de medido para os polipeptídeos MIC-1 correspondentes com uma extensão N (Exemplo 12).
[0092] Conforme descrito neste documento, a solubilidade é medida em compostos MIC-1 e polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N como homodímeros.
Estabilidade
[0093] A sequência de MIC-1 humana de tipo selvagem é quimicamente instável e vários resíduos da sequência de aminoácidos podem ser modificados durante o armazenamento, incluindo desamidação em Asparagina na posição 3 (N3) e oxidação das metioninas M43, M57 e M86. A instabilidade química de certos resíduos podería ter impacto nas propriedades farmacêuticas, pelo que o desenvolvimento de compostos químicos de MIC-1 estáveis seria outra parte importante da produção de um composto MIC-1 terapêutico.
[0094] Em um aspecto, os compostos da invenção têm estabilidade química melhorada em relação à MIC-1 humana da SEQ ID NO: 1.
[0095] O termo estabilidade química se refere a alterações químicas na estrutura polipeptídica, levando à formação de produtos de degradação química potencialmente com uma atividade biológica reduzida, solubilidade reduzida e/ou efeito imunogênico aumentado em comparação com o polipeptídeo intacto. A estabilidade química pode ser avaliada medindo-se a quantidade de produtos de degradação química em vários pontos de tempo após a exposição a condições ambientais diferentes, por exemplo, SECHPLC, e/ou RP-HPLC.
[0096] Em certas modalidades da invenção, certos resíduos da sequência monomérica de MIC-1 (SEQ ID NO: 1) são modificados, por exemplo, por substituição para aumentar a estabilidade química dos compostos MIC-1. Para evitar desamidação, N3 é deletado ou substituído com
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 33/241 /209 outros aminoácidos, por exemplo, E ou Q. Para diminuir a oxidação, a Metionina é substituída com outros aminoácidos, por exemplo, E ou L. Imunogenicidade
[0097] Em um aspecto, os compostos MIC-1 da invenção têm risco de baixa imunogenicidade.
Processos de produção
[0098] Os polipeptídeos MIC-1 com uma extensão de aminoácido Nterminal da presente invenção podem ser produzidos através de uma tecnologia de proteína recombinante conhecida por aqueles versados na técnica. Em geral, as sequências de ácido nucleico codificando as proteínas de interesse ou as variantes funcionais das mesmas são modificadas para codificar o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N desejado. Esta sequência modificada é então inserida em um vetor de expressão, que é por sua vez transformado ou transfectado nas células hospedeiras de expressão.
[0099] O construto de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N pode ser adequadamente de origem genômica, de cDNA ou sintética. As alterações na sequência de aminoácidos são realizadas por modificação do código genético por técnicas bem conhecidas.
[00100] A sequência de DNA que codifica o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N é introduzida geralmente em um vetor recombinante que pode ser qualquer vetor, que pode convenientemente ser sujeitado aos procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira em que deve ser introduzida. Assim, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é. um vetor, que exista como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação do cromossomo, por exemplo, um plasmídeo. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossomo(s) em que foi integrado.
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[00101] O vetor de preferência é um vetor de expressão em que a sequência de DNA codificando o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N está operacionalmente ligada a segmentos adicionais requeridos para a transcrição do DNA. O termo, “ligado operacionalmente” indica que os segmentos estão arranjados de modo que funcionam em concerto para os fins pretendidos, por exemplo, a transcrição inicia em um promotor e os procede através da sequência de DNA codificando o polipeptídeo até que ele termina dentro de um terminador.
[00102] Assim, os vetores de expressão para o uso na expressão do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N compreenderão um promotor capaz de iniciar e de dirigir a transcrição de um cDNA ou um gene clonado. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA, que mostrar a atividade de transcrição na célula hospedeira de escolha e que puder ser derivada dos genes que codificam as proteínas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira.
[00103] Adicionalmente, os vetores de expressão para a expressão do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N também compreenderão uma sequência terminadora, uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora é ligada operacionalmente ao terminal 3' da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que for funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.
[00104] A expressão do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N pode ser dirigida para a expressão intracelular no citosol da célula hospedeira ou ser direcionada na via secretora para expressão extracelular em um meio de cultura.
[00105] A expressão intracelular é a via padrão e requer um vetor de expressão com uma sequência de DNA que compreenda um promotor seguido pela sequência de DNA que codifica o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão
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N seguido por um terminador.
[00106] Para direcionar a sequência do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N na via secretora das células hospedeiras, uma sequência de sinal secretora (também conhecida como peptídeo de sinal ou uma pré-sequência) é necessária como uma extensão da sequência MIC-1. Uma sequência de DNA que codifica o peptídeo de sinal é ligada à extremidade 5' da sequência de DNA que codifica o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N no quadro de leitura correto. O peptídeo de sinal pode ser normalmente associado com a proteína ou pode ser de um gene que codifica outra proteína secretada.
[00107] Os procedimentos usados para ligar as sequências de DNA que codificam para o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N, o promotor, o terminador e/ou a sequência de sinal secretor, respectivamente, e para introduzi-los nos vetores apropriados contendo a informação necessária para a replicação, são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica (cf., por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
[00108] A célula hospedeira na qual a sequência de DNA que codifica o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N é introduzida pode ser qualquer célula que seja capaz de expressar o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N de forma intracelular ou extracelular. O polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N pode ser produzido pela cultura de uma célula hospedeira contendo uma sequência de DNA que codifica o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N e capaz de expressar o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N em um meio nutriente adequado sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N. Exemplos não limitantes de células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N são: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, bem como linhas celulares de rim embrionário humano (HEK), rim de hamster bebê (BHK) ou ovário de hamster chinês (CHO). Se as modificações
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 36/241 / 209 pós-tradução forem necessárias, células hospedeiras adequadas incluem fermento, fungos, insetos e células e eucarióticas superiores, tais como células de mamíferos.
[00109] Uma vez que o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N foi expresso em um organismo hospedeiros, ele pode ser recuperado e purificado à qualidade requerida por técnicas convencionais. Exemplos não limitantes de tais técnicas convencionais de recuperação e purificação são centrifugação, solubilização, filtração, precipitação, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC), fase reversa cromatografia líquida de alta eficiência (RP-HPLC), filtração em gel e liofilização.
[00110] Exemplos de expressão recombinante e purificação de proteínas MIC-1 podem ser encontrados em, por exemplo, Cordingley et al., J. Virol. 1989, 63, pp5037-5045; Birch et al., Protein Expr Purif., 1995, 6, pp 609-618 e em W02008/043847.
[00111] Os exemplos de expressão microbiana e purificação das proteínas MIC-1 podem ser encontrados, por exemplo, em Chich et al, Anal. Biochem, 1995, 224, pp 245-249 e Xin et al., Protein Expr. Purif. 2002, 24, pp530-538.
[00112] Os exemplos específicos dos métodos para preparar um número de polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N da invenção são incluídos na seção experimental.
Corpo de Inclusão e Expressão de Proteína
[00113] Polipeptídeos MIC-1 com uma extensão de aminoácidos Nterminal podem ser expressos em bactérias como E. coli. No contexto da presente invenção, a produção de proteína em larga escala dos polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N podería utilizar Corpos de Inclusão (IB), já que isso representa uma abordagem vantajosa para controlar a recuperação de processos, a pureza da proteína, a degradação da protease e a estabilidade
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 37/241 /209 geral da proteína. Isto se toma particularmente importante para a produção em larga escala. De importância crítica para a qualidade do IB é o equilíbrio da solubilidade dos polipeptídeos MIC-1 com de extensão N parcialmente controlada pela formação de pl e IB calculada.
Modo de Administração
[00114] A rota de administração pode ser qualquer rota que transporte efetivamente um composto desta invenção ao lugar desejado ou apropriado no corpo, tal como parenteralmente, por exemplo, subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente. Altemativamente, um composto desta invenção pode ser administrado por via oral, pulmonar, retal, transdérmica, bucal, sublingual, ou nasal.
[00115] A quantidade de um composto desta invenção a ser administrada, a determinação de quão frequentemente administrar um composto desta invenção, e a eleição de qual composto ou compostos desta invenção a administrar, opcionalmente junto com um outro agente farmaceuticamente ativo, é decidido em consulta com um médico que seja familiar com o tratamento de obesidade e de disfunções relacionadas.
[00116] Composições farmacêuticas
[00117] As composições farmacêuticas que compreendem um composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável, amido, ou éster do mesmo, e um excipiente farmaceuticamente aceitável podem ser preparadas como é conhecido na técnica.
[00118] O termo excipiente refere-se amplamente a qualquer componente diferentes do(s) ingrediente(s) terapêutico(s) ativo(s). O excipiente pode ser uma substância inerte, uma substância inativa e/ou uma substância não ativa medicinalmente.
[00119] O excipiente pode servir a várias finalidades, por exemplo, como um carreador, um veículo, um diluente, um comprimido e/ou para melhorar a administração, e/ou absorção da substância ativa.
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[00120] A formulação de ingredientes farmaceuticamente ativos com vários excipientes é conhecida na técnica, ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por exemplo, 19a edição (1995), e quaisquer edições posteriores).
Tratamento de combinação
[00121] O tratamento com um composto de acordo com a presente invenção pode também ser combinado com uma ou mais substâncias farmacologicamente ativas, por exemplo, selecionadas dentre agentes do antiobesidade, agentes reguladores de apetite e agentes para o tratamento e/ou a prevenção das complicações e distúrbios que resultam ou são associados à obesidade.
Indicações Farmacêuticas
[00122] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um composto da invenção para uso como um medicamento.
[00123] Em modalidades particulares, o composto da invenção pode ser usado para os seguintes tratamentos médicos:
[00124] (i) Prevenção e/ou tratamento de distúrbios alimentares, tais como obesidade, por exemplo, diminuindo a ingestão de alimentos, reduzindo o peso corporal, suprimindo o apetite e/ou induzindo a saciedade.
[00125] (ii) Prevenção e/ou tratamento da hiperglicemia, da resistência à insulina e/ou da tolerância danificada à glicose.
[00126] (iii) Prevenção e/ou tratamento de dislipidemia.
[00127] Em algumas modalidades que a invenção refere-se a um método para a gerência do peso. Em algumas modalidades a invenção referese a um método para a redução do apetite. Em algumas modalidades a invenção refere-se a um método para a redução da entrada de alimento.
[00128] Em geral, todos os sujeitos que sofrem de obesidade são considerados como também sofrendo de sobrepeso. Em algumas modalidades a invenção relaciona-se a um método para o tratamento ou a prevenção da
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 39/241 /209 obesidade. Em algumas modalidades a invenção refere-se ao uso dos compostos MIC-1 da invenção para o tratamento ou prevenção da obesidade. Em algumas modalidades o sujeito que sofre de obesidade é humano, como um adulto humano ou um ser humano pediátrico (incluindo bebês, crianças e adolescentes). O IMC (índice de massa corporal) é uma medida da gordura corporal com base na altura e peso. A fórmula para o cálculo é IMC = peso em quilogramas/altura em metros2. Um sujeito humano que sofre de obesidade tem um IMC >30; este sujeito pode também ser referido como obeso. Em algumas modalidades o sujeito humano que sofre de obesidade tem um IMC >35 ou um IMC na faixa de >30 a <40. Em algumas modalidades a obesidade é obesidade severa ou obesidade mórbida, em que o sujeito humano tem um IMC >40.
[00129] Em algumas modalidades a invenção se relaciona a um método para o tratamento ou a prevenção de sobrepeso, opcionalmente na presença de pelo menos de uma comorbidade relacionada a peso. Em algumas modalidades a invenção relaciona-se ao uso dos compostos MIC-1 da invenção para o tratamento ou a prevenção do sobrepeso, opcionalmente na presença de pelo menos uma comorbidade relacionada a peso.
[00130] Em algumas modalidades o sujeito que sofre de sobrepeso é humano, como um adulto humano ou um ser humano pediátrico (incluindo bebês, crianças e adolescentes). Em algumas modalidades um sujeito humano que sofre de sobrepeso tem um IMC >25, tal como um IMC >27. Em algumas modalidades um sujeito humano que sofre de sobrepeso tem um IMC na escala de 25 a <30 ou na escala de 27 a <30. Em algumas modalidades a comorbidade relacionada a peso é selecionada dentro o grupo que consiste em hipertensão, diabetes (tal como diabetes tipo 2), dislipidaemia, colesterol alto e apneia obstrutiva do sono.
[00131] Em algumas modalidades a invenção refere-se a um método para a redução do peso corporal. Em algumas modalidades a invenção refere
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 40/241 / 209 se ao uso dos compostos MIC-1 da invenção para a redução do peso corporal. Um ser humano a ser submetido a uma redução do peso corporal de acordo com a presente invenção tem um IMC > 25, tal como um IMC >27 ou um IMC > 30. Em algumas modalidades o ser humano a ser submetido a uma redução do peso corporal de acordo com a presente invenção tem um IMC >35 ou um IMC > 40.
[00132] Em algumas modalidades a invenção refere-se a um método para tratamento ou prevenção de doenças cardiovasculares como arteriosclerose e outras doenças como esteatohepatite e nefropatia diabética.
[00133] Os artigos um e uma são aqui usados para se referir a um ou a mais de um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, um polipeptídeo MIC-1 significa um polipeptídeo MIC-1 ou mais de um polipeptídeo MIC-1.
[00134] Um asterisco (*) em uma fórmula química designa um ponto de ligação.
MODALIDADES PARTICULARES
[00135] A invenção é descrita pelas modalidades seguintes não limitantes da invenção:
[00136] 1. Um composto MIC-1 compreendendo um polipeptídeo
MIC-1 com uma extensão de aminoácido N-terminal e um prolongador, em que o prolongador está anexado à extensão de aminoácido.
[00137] 2. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 1, em que o composto é um homodímero.
[00138] 3. O composto MIC-1, de acordo com as modalidades 1 ou 2, em que a extensão de aminoácido N-terminal compreende um resíduo de cisteína e em que o prolongador é ligado à extensão de aminoácido no resíduo de Cisteína.
[00139] 4. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 3, em que o prolongador compreende, ou consiste em, pelo menos uma dentre cada uma
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 41/241 /209 dentre a Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3 e Substância Química 4;
em que a Substância Química 1 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química IA:
Substância Química 1B:
Substância Química 1C:
*, e
Substância Química 1D:
HOOC-(CH2)X-CO-*, HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*, HOOC-benzeno-O-(CH2)y-CO(lH-tetrazol-5-il)-(CH2)x-CO-* em que x é um número inteiro na faixa de 12-20, em que y é um número inteiro na faixa de 5-15;
em que a Substância Química 2 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)mCO)k*, Substância Química 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, e
Substância Química 2C: *-(NH-(CH2)m-ciclohexanoCO)k-*, em que m da Substância Química 2 é um número inteiro na faixa de 1-5, e k é um número inteiro na faixa de 0-4;
em que a Substância Química 3 é *(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)i, em que k da Substância Química 3 é um número inteiro na faixa de 1-10, n é um número inteiro na faixa de 1-5, e é um número inteiro na faixa de 0-5;
em que a Substância Química 4 é selecionada dentre
Substância Química 4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*, e
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 42/241 /209
Substância Química 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NHCO-CH2-*,
Substância Química 4C: *-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NHCO-CH2-*, e
O *-NH-(CH2)n-NH-CO-(CH2)m --O
Substância Química 4D:
em que m da Substância Química 4 é um número inteiro na faixa de 1-5 e n é um número inteiro na faixa de 2-6; e em que a Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3, e Substância Química 4 são interligadas através de ligações de amida, conectando a extremidade *-NH de uma Substância Química à extremidade CO-* de outra Substância Química, e em que a extremidade CH2-* da Substância Química 4 está conectada a um átomo de enxofre do resíduo de cisteína da extensão de aminoácido.
[00140] 5. O composto MIC-1 de acordo com as modalidades 1 ou 2, e em que o prolongador é ligado ao aminoácido N-terminal da extensão de aminoácido.
[00141] 6. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 5, em que o prolongador compreende, ou consiste em, pelo menos uma dentre cada uma dentre a Substância Química 1, Substância Química 2, Substância Química 3 e Substância Química 4;
em que a Substância Química 1 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química IA:
Substância Química 1B:
Substância Química 1C:
HOOC-(CH2)x-CO-*,
HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
HOOC-benzeno-O-(CH2)y-CO
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 43/241 /209 *, e
Substância Química ID: (lH-tetrazol-5-il)-(CH2)x-CO-* em que x é um número inteiro na faixa de 12-20, em que y é um número inteiro na faixa de 5-15;
em que a Substância Química 2 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)mCO)k*,
Substância Química 2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*, e
Substância Química 2C: *-(NH-(CH2)m-ciclohexanoCO)k-*, em que m da Substância Química 2 é um número inteiro na faixa de 1-5, e k é um número inteiro na faixa de 0-4;
em que a Substância Química 3 é *(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)i, em que k da Substância Química 3 é um número inteiro na faixa de 1-10, n é um número inteiro na faixa de 1-5, e 1 é um número inteiro na faixa de 0-5;
em que a Substância Química 4 é selecionada do grupo consistindo na Fórmula I, II ou III:
Figure BR112019024102A2_D0005
Figure BR112019024102A2_D0006
(Fórmula I)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 44/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0007
(Fórmula II) ou
Figure BR112019024102A2_D0008
(Fórmula III).
em que a Substância Química 1, Substância Química 2,
Substância Química 3, e Substância Química 4 são interligadas através de ligações de amida, conectando a extremidade *-NH de uma Substância Química à extremidade CO-* de outra Substância Química, e em que a extremidade CH2-* da Substância Química 4 está conectada ao grupo amino do N-terminal da extensão de aminoácido.
[00142] 7. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 4 e 6, em que a Substância Química 1 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química la:
HOOC-(CH2)i6-CO-*,
Substância Química 1b:
HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*
Substância Química 1c:
HOOC-benzeno-O-(CH2)9-COSubstância Química Id:
(lH-tetrazol-5-il)-(CH2)i5-CO[00143]
8. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 4, 6 e 7, em que a Substância Química 2 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*, Substância Química 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* e Substância Química 2c: *-NH-CH2-ciclohexano-CO-*.
9. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 4, 6 e 7, em que a Substância Química 2-Substância Química 3 é
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 45/241 /209 a seguinte Fórmula IV:
Figure BR112019024102A2_D0009
(Fórmula IV) onde n é de 0-3 e m é 0-3
[00144] 10. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 4 e 7-9, em que a Substância Química 4 é selecionada do grupo consistindo em:
Substância Química 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-* e
Substância Química 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NHCO-CH2-*.
[00145] 11. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 4 e 7-9, em que a Substância Química 4 é selecionada do grupo consistindo em Fórmula V, VI ou VII:
Figure BR112019024102A2_D0010
(Fórmula V)
Figure BR112019024102A2_D0011
(Fórmula VI)
Figure BR112019024102A2_D0012
N H (Fórmula VII) onde n é 1-4.
[00146] 12. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 4 e 7-9, em que a Substância Química 4 é a seguinte Fórmula VIII:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 46/241 / 209
Ο *-NH-(CH2)p-NH-CO-(CH2)q—Ν
Figure BR112019024102A2_D0013
Ο (Fórmula VIII) onde ρ é 1-5, e q é 1-5.
[00147] 13. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 1- 3 e 5, em que o prolongador é selecionado do grupo consistindo na Fórmula IX, Fórmula X, Fórmula XI, Fórmula XII e Fórmula
Figure BR112019024102A2_D0014
(Fórmula X)
Figure BR112019024102A2_D0015
(Fórmula XI)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 47/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0016
(Fórmula XII)
Figure BR112019024102A2_D0017
[00148] 14. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 1-3 e 5, em que o prolongador é selecionado do grupo constituído por: Ácidos graxos biocompatíveis e derivados dos mesmos, hidroxialquil amido (HAS), por exemplo, hidroxietil amido (HES), polietilglicol glicol (PEG), poli (Glyx-Sery)n (HAP), ácido hialurônico (HA), polímeros de heparosano (HEP), polímeros à base de fosforilcolina (polímero PC), Flexímeros, Dextrano, ácidos poli-siálico (PSA), domínio Fc, transferrina, albumina, peptídeos tipo elastina, polímeros XTEN, peptídeos de ligação a albumina, um peptídeo CTP, e qualquer combinação destes.
[00149] 15. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 com a extensão de aminoácido tem um pi calculado inferior a 6,5.
[00150] 16. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 15, em que o pi calculado é menor do que 6,1.
[00151] 17. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 15, em que o pi calculado é menor do que 6,0.
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 48/241 /209
[00152] 18. O composto MIC-1 de acordo a modalidade 15, em que o pi calculado é inferior a 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, ou 5,2, 5,1, ou 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1 ou 4,0.
[00153] 19. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 15, em que o pi calculado é superior a 4,7.
[00154] 20. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 15, em que o pi calculado é superior a 4,8.
[00155] 21. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 15, em que o pi calculado é superior a 4,9.
[00156] 22. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 15, em que o pi calculado é superior a 5,0.
[00157] 23. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 15, em que o pi calculado é superior a 5,1.
[00158] 24. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 15, em que o pi calculado está na faixa de 6,5-3,0, 6,5-3,5, 6,5-4,0, 6,1-3,0, 6,1-3,5,
6,1-4,0, 6,1-4,7, 6,1-4,9, 6,1-5,0, 6,1-5,1, 6,0-3,0, 6,0-3,5, 6,0-4,0, 5,9-3,0,
5,9-3,5, 5,9-4,0, 5,9-5,0, 5,9-5,1, 5,8-3,0, 5,8-3,5, 5,8-4,0, 5,8-5,1, 5,8-5,2,
5,5-3,0, 5,5-3,5, 5,5-4,0, ou 5,0-4,0.
[00159] 25. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 15, em que o pi calculado está na faixa de 5,8-5,2.
[00160] 26. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácido compreende 3 a 200 de resíduos de aminoácidos.
[00161] 27. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos está na faixa de 3100, 3-50, 3-40, 3-30, 5-100, 5-50, 5-40, 5-30, 10-100, 10-50, 10-40, 10-30, 3-36, 3-30, 3-25, 3-24, 3-12, 4-36, 4-30, 4-24, 4-12, 5-36, 5-30, 5-24, 5-12, 636, 6-30, 6-24, 6-12, 7-36, 7-30, 7-24, 7-12, 8-36, 8-30, 8-24, 8-12, 30-36, 3236, 30-34, ou 30-32 resíduos de aminoácidos em comprimento.
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 49/241 /209
[00162] 28. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos está na faixa de 336 ou 30-32 resíduos de aminoácidos em comprimento.
[00163] 29. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos tem um excesso de resíduos de aminoácidos ácidos (ácido aspártico ou ácido glutâmico) de pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 em comparação com o número de resíduos de aminoácidos básicos (Lisina, Arginina ou Histidina).
[00164] 30. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades, em que a extensão de aminoácidos compreende pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 75% de excesso de resíduos de aminoácidos ácidos (ácido aspártico ou ácido glutâmico) em comparação com o número de resíduos de aminoácidos básicos (Lisina ou Arginina ou Histidina).
[00165] 31.0 composto MIC-1 de acordo com a modalidade 30, em que a extensão de aminoácidos compreende pelo menos 10% de resíduos de aminoácidos ácidos.
[00166] 32. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 30, em que a extensão de aminoácidos compreende pelo menos 15% de resíduos de aminoácidos ácidos.
[00167] 33. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 11, em que a extensão de aminoácidos compreende pelo menos 25% de resíduos de aminoácidos ácidos.
[00168] 34. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 1-33, em que a extensão de aminoácidos é composta de resíduos de aminoácidos selecionados dentre o grupo consistindo de A, C, E, G, P, S, T, Q, N e D, e em que a extensão de aminoácidos compreende pelo menos três resíduos de aminoácidos E e/ou D.
[00169] 35. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 34, em
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 50/241 /209 que a extensão de aminoácidos é composta pelos resíduos de aminoácidos ácidos A, C, E, G, P, S e T.
[00170] 36. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 35, em que a extensão de aminoácido compreende pelo menos três E e pelo menos um P.
[00171] 37. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 36, em que a extensão de aminoácidos compreende pelo menos 6 Ser, 4 Pro, 4 Gly, 4 Thr, 4 Glu e 2 Ala.
[00172] 38. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 37, em que a extensão de aminoácidos compreende duas sequências selecionadas do grupo que consiste em SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG e SEPATSGSETPG, e em que um dos aminoácidos da extensão de aminoácidos é substituído com Cisteína.
[00173] 39. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 38, em que a extensão de aminoácidos compreende ainda 6-8 aminoácidos consecutivos de SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG ou SEPATSGSETPG, como os primeiro 6-8 resíduos de aminoácidos, os últimos 6-8 resíduos de ou os resíduos internos de 6-8, e em que um dos aminoácidos da extensão de aminoácidos é substituído com Cisteína.
[00174] 40. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 3-39, em que Cisteína localiza-se em qualquer posição da extensão de aminoácido N-terminal.
[00175] 41. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 40, em que a distância entre o resíduo de Cisteína da extensão N-terminal e o aminoácido N-terminal do polipeptídeo MIC-1 é de pelo menos 1, 3, 5, 10, 15, 19, 23, 26, 29 ou 32 aminoácidos (incluindo o resíduo de Cisteína da extensão N-terminal, mas não incluindo o aminoácido N-terminal do polipeptídeo MIC-1).
[00176] 42. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 40, em
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 51/241 /209 que a distância entre o resíduo de Cisteína da extensão N-terminal e o aminoácido N-terminal do polipeptídeo MIC-1 é de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos (incluindo o resíduo de Cisteína da extensão N-terminal, mas não incluindo o aminoácido N-terminal do polipeptídeo MIC-1).
[00177] 43. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 42, em que a distância entre o resíduo de Cisteína da extensão N-terminal e o aminoácido N-terminal do polipeptídeo MIC-1 é de 26-29 aminoácidos (incluindo o resíduo de Cisteína da extensão N-terminal, mas não incluindo o aminoácido N-terminal do polipeptídeo MIC-1).
[00178] 44. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácido começa com S. [00179] 45. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos começa com SE. [00180] 46. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos começa com SEP. [00181] 47. O composto MIC-1, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos compreende uma ou mais das seguintes sequências
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS (SEQ ID NO: 223), SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPS (SEQ ID NO: 224), SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225), SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS (SEQ ID NO: 240), SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTE (SEQ ID NO: 241), SEPCTSGSETPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO: 242), SEPCTSGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 243), SEPCTSGSETPG (SEQ ID NO: 244), SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP (SEQ ID NO: 245), SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP (SEQ ID NO: 246),
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 52/241 /209
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP (SEQ ID NO: 247),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT (SEQ ID NO: 248),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT (SEQ ID NO: 249),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT (SEQ ID NO: 250),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE (SEQ ID NO: 251),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE (SEQ ID NO: 252),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE (SEQ ID NO: 253),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS (SEQ ID NO: 254),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS (SEQ ID NO: 255),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS (SEQ ID NO: 256),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG (SEQ ID NO: 257),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG (SEQ ID NO: 258),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG (SEQ ID NO: 259),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG (SEQ ID NO: 260),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG (SEQ ID NO: 261),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG (SEQ ID NO: 262),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG (SEQ ID NO: 263),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG (SEQ ID NO: 264),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG (SEQ ID NO: 265),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG (SEQ ID NO: 266),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG (SEQ ID NO: 267),
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG (SEQ ID NO: 268),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG (SEQ ID NO: 269),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 270),
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO: 271),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 272),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO: 273),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO: 274),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 275),
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 53/241 /209
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 276), SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO: 277), SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO: 278), SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 279), SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 280), SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO: 281), SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO: 282), SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 283), GPCEGPSEGPSEGPSEGPSEGPSEGPSE (SEQ ID NO: 284), GECPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQP (SEQ ID NO: 285), PACEEEDDPDGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 286), PDECTEEETEGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 287), SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 226), SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 227), SEPACSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 229), SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 230), SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 231), SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 232), SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 233), SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 234), SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 235), SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 236), SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 237), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSCEPSEG (SEQ ID NO: 238), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPCEG (SEQ ID NO: 239).
[00182] 48. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 1-2 e 5-33, em que a extensão de aminoácidos é composta de resíduos de aminoácidos selecionados dentre o grupo consistindo de A, E, G, P, S, T, D, N e Q, em que a extensão de aminoácidos compreende pelo menos
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 54/241 /209 três resíduos de aminoácidos E e/ou D.
[00183] 49. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos é composta de resíduos de aminoácidos selecionados dentre o grupo consistindo de A, E, G, P, S, T, Q e D em que a extensão de aminoácidos compreende pelo menos três resíduos de aminoácidos E e/ou D.
[00184] 50. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 48 ou 49, em que a extensão de aminoácidos compreende pelo menos três E e pelo menos um P.
[00185] 51.0 composto MIC-1 de acordo com a modalidade 50, em que a extensão de aminoácidos compreende ainda S, G, T e A.
[00186] 52. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 51, em que a extensão de aminoácidos compreende 6 Ser, 4 Pro, 4 Gly, 4 Thr, 4 Glu e 2 Ala.
[00187] 53. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 51, em que a extensão de aminoácidos compreende duas sequências selecionadas do grupo que consiste em SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG e SEPATSGSETPG.
[00188] 54. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 53, em que a extensão de aminoácidos compreende ainda 6-8 aminoácidos consecutivos de SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG ou SEPATSGSETPG, como os primeiro 6-8 resíduos de aminoácidos, os últimos 6-8 resíduos de ou os resíduos internos de 6-8.
[00189] 55. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 48 a 54, em que a extensão de aminoácidos começa com S.
[00190] 56. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 55, em que a extensão de aminoácidos começa com SE.
[00191] 57. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 56, em que a extensão de aminoácidos começa com SEP.
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 55/241 /209
[00192] 58. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 1-2 e 5-33, em que a extensão de aminoácidos compreende um ou mais das seguintes sequências: SPAGSP (SEQ ID NO:4), TSESAT (SEQ ID NO:5), TSTEPE (SEQ ID NO:6), SEPATS (SEQ ID NO:7), TSTEEG (SEQ ID NO:8), PESGPG (SEQ ID NO:9), SGSAPG (SEQ ID NO: 10), GSETPG (SEQ ID NO: 11), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID
NO: 12), SEPATSGSETPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO: 13),
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO: 14),
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP (SEQ ID NO: 15),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP (SEQ ID NO: 16),
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP (SEQ ID NO: 17),
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT (SEQ ID NO: 18),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT (SEQ ID NO: 19),
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT (SEQ ID NO:20),
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE (SEQ ID NO:21),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE (SEQ ID NO:22),
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE (SEQ ID NO:23),
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS (SEQ ID NO:24),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS (SEQ ID NO:25),
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS (SEQ ID NO:26),
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG (SEQ ID NO:27),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG (SEQ ID NO:28),
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG (SEQ ID NO:29),
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG (SEQ ID NO:30),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG (SEQ ID NO:31),
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG (SEQ ID NO:32),
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG (SEQ ID SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG (SEQ ID NO:34), NO:33),
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG (SEQ ID NO:35),
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 56/241 /209
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG (SEQ ID NO: 36),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG (SEQ ID NO: 37),
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG (SEQ ID NO:38), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS (SEQ ID NO:70), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO:71), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG (SEQ ID NO: 39), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO:40), SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO:41), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO:42), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO:43), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO:44), SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO:45), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO:46), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO:47), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO:48), SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO:49), SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO:50), SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO:51), SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO:52), SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO:53),
GEPS (SEQ ID NO: 118), GPSE (SEQ ID NO: 119), GPES (SEQ ID NO: 120), GSPE (SEQ ID NO: 121), GSEP (SEQ ID NO: 122), GEPQ (SEQ ID NO: 123), GEQP (SEQ ID NO: 124), GPEQ (SEQ ID NO: 125), GPQE (SEQ ID NO: 126), GQEP (SEQ ID NO:127)ou GQPE (SEQ ID NO: 128), PEDEETPEQE (SEQ ID NO: 129), PDEGTEEETE (SEQ ID NO: 130), PAAEEEDDPD (SEQ ID NO: 131), AEPDEDPQSED (SEQ ID NO: 132), AEPDEDPQSE (SEQ ID NO: 133), AEPEEQEED (SEQ ID NO: 134), AEPEEQEE (SEQ ID NO:135), GGGS (SEQ ID NO: 136), GSGS (SEQ ID NO: 137), GGSS (SEQ ID NO:138) e SSSG (SEQ ID NO: 139).
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 57/241 /209
[00193] 59. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 1-2 e 5-33, em, que a extensão de aminoácidos compreende uma ou mais das seguintes sequências SPAGSP, TSESAT, TSTEPE, SEP ATS, TSTEEG, PESGPG, SGSAPG, GSETPG,
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG,
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 58/241 /209
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG, SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG, SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG, SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG, SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG, SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG, SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG, SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG, GEPQ, GEPS, GGGS, GSGS, GGSS, e SSSG.
[00194] 60. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 1-2 e 5-33, em que a extensão de aminoácidos compreende qualquer combinação de quaisquer 2-6 das seguintes sequências SPAGSP, TSESAT, TSTEPE, SEPATS, TSTEEG, PESGPG, SGSAPG, GSETPG, GEPQ, GEPS, GGGS, GSGS, GGSS, e SSSG.
[00195] 61. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-2 e 5-33, em que a extensão de aminoácidos compreende uma ou mais dentre as seguintes sequências GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS, e SSSG.
[00196] 62. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 61, em que a extensão de aminoácidos compreende qualquer combinação de 2-9
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 59/241 /209 dentre as seguintes sequências GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS, e SSSG.
[00197] 63. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-2 e 5-33, em que a extensão de aminoácidos compreende uma ou mais dentre as seguintes sequências GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GGGS, GSGS, GGSS, e SSSG.
[00198] 64. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 63, em que a extensão de aminoácidos compreende qualquer combinação de 2-9 dentre as seguintes sequências GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GGGS, GSGS, GGSS, e SSSG.
[00199] 65. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 64, em que a extensão de aminoácidos compreende uma ou mais das seguintes
sequências GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS (SEQ ID NO: 140),
GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE (SEQ ID NO: 141),
GPESGPESGPESGPESGPES (SEQ ID NO: 142),
GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE (SEQ ID GSEPGSEPGSEPGSEPGSEP (SEQ ID NO: 144). NO: 143), e
[00200] 66. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-2 e 5-33, em que a extensão de aminoácidos compreende uma ou mais das seguintes sequências GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS, e SSSG.
[00201] 67. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 66, em que a extensão de aminoácidos compreende qualquer combinação de 2-9 das seguintes sequências GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS, e SSSG.
[00202] 68. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 67, em que a extensão de aminoácidos compreende uma ou mais das seguintes sequências GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ (SEQ ID NO: 145), GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP (SEQ ID NO: 146),
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GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(SEQ ID NO: 147),
GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE (SEQ ID NO: 148), GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP (SEQ ID NO: 149), e
GQPEGQPEGQPEGQPEGQPE (SEQ ID NO: 150).
[00203] 69. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-2 e 5-33, em que a extensão de aminoácidos compreende uma ou mais das seguintes sequências PEDEETPEQE, PDEGTEEETE, PAAEEEDDPD, AEPDEDPQSED, AEPDEDPQSE, AEPEEQEED, e AEPEEQEE, GGGS, GSGS, GGSS e SSSG.
[00204] 70. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-2 e 5-33, em que a extensão de aminoácidos compreende qualquer combinação de duas a três das seguintes sequências PEDEETPEQE, PDEGTEEETE, PAAEEEDDPD, AEPDEDPQSED, AEPDEDPQSE, AEPEEQEED, AEPEEQEE e AEEAEEAEEAEEAEE.
[00205] 71. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 1-2 e 5-33, em que a extensão de aminoácidos compreende uma ou mais das seguintes sequências SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID
NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID
NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID
NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194 e SEQ ID NO: 195.
[00206] 72. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos compreende de 13 resíduos de aminoácidos de alanina de forma N-terminal.
[00207] 73. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 61/241 /209 modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos compreende de 14 resíduos de aminoácido de Glicina e Serina de forma C-terminal.
[00208] 74. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a extensão de aminoácidos compreende uma sequência (Gly-Ser)n ou (Ser-Gly)n de forma C-terminal, em que n é um número inteiro entre 1-8.
[00209] 75. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que a extensão de aminoácidos compreende GGGS, GSGS, GGSS ou SSSG de forma C-terminal.
[00210] 76. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com MIC-1 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1).
[00211] 77. O composto MC-1 de acordo com a modalidade 70, em que o polipeptídeo MIC-1 apresenta pelo menos 95% de identidade de sequência com MIC-1 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1).
[00212] 78. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-70, em que o polipeptídeo MIC-1 tem um máximo de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácidos em comparação com MIC-1 de SEQ ID NO: 1.
[00213] 79. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-72, em que o polipeptídeo MIC-1 tem um máximo de 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 modificações de aminoácidos em comparação com o MIC-1 de SEQ ID NO:1.
[00214] 80. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma ou mais das seguintes substituições P11E, H18E, R21E, A30E, M43L, M43E, A47E, R53E, A54E, M57E, M57L, H66E, R67E, L68E, K69E, A75E, A81E, P85E, M86F, M86L, Q90E, T92E, L105E, K107E, K69R, K107R e K91R em
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 62/241 /209 comparação com MIC-1 de tipo selvagem (SEQ ID NO:1).
[00215] 81. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma ou mais das seguintes substituições R2S, R2A, R2E, N3S, N3E, N3A, N3T, N3P, N3G, N3V, N3H, N3Y ou N3Q em comparação com MIC-1 de SEQ ID NO: 1.
[00216] 82. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma deleção de N3 (des-N3) em comparação com MIC-1 de SEQ ID NO:1.
[00217] 83. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma substituição de M57E ou M57L em comparação com MIC-1 do SEQ ID NO:1.
[00218] 84. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma substituição de M86L ou M86Fem comparação com MIC-1 de SEQ ID NO: 1. [00219] 85. O composto MIC-1 de acordo com a modalidade 84, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende ainda uma substituição de Q90E ou T92E em comparação com MIC-1 da SEQ ID NO: 1.
[00220] 86. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma substituição de H66E em comparação com MIC-1 de SEQ ID NO:1.
[00221] 87. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma substituição de R67E em comparação com MIC-1 de SEQ ID NO:1.
[00222] 88. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma deleção dos primeiros 3, 4, 5 ou 6 resíduos em comparação com MIC-1 de SEQ ID NO:1.
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 63/241 /209
[00223] 89. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma deleção dos primeiros 3 resíduos em comparação com MIC-1 de SEQ ID NO:1.
[00224] 90. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-75, em que o polipeptídeo MIC-1 possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 154 (M43L/des-N3).
[00225] 91. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-75, em que o polipeptídeo MIC-1 possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 155 (Μ43Ε/Δ1-3).
[00226] 92. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-75, em que o polipeptídeo MIC-1 possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 156 (M57E/H66E/des-N3).
[00227] 93. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-75, em que o polipeptídeo MIC-1 possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 157 (Μ57Ε/Δ1-3).
[00228] 94. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-75, em que o polipeptídeo MIC-1 possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 158 (M57L/des-N3).
[00229] 95. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-75, em que o polipeptídeo MIC-1 possui uma de acordo com a SEQ ID NO: 159 (Μ86Ε/Δ1-3).
[00230] 96. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-75, em que o polipeptídeo MIC-1 possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 160 (M86L/des-N3) ou SEQ ID NO:222 (M57L, M86L/des-N3).
[00231] 97. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-75, em que o polipeptídeo MIC-1 possui uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 1.
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[00232] 98. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC -1 e uma extensão de aminoácido N-terminal em conjunto compreendem uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO:
104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO:
108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO:
112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO:
116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 164,
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYD DLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 288),
SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 289),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 290),
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYD DLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 291),
SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 65/241 /209
NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 292),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPCEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 293),
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGGDHCPLGPGRCCRLH TVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANEHAQIKTSL ERLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 294),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYD DLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 295),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGP GRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANL HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLL AKDCHCI (SEQ ID NO: 296),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYD DLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 297),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGP GRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANM HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLL AKDCHCI (SEQ ID NO: 298),
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSARGDHCPLGP GRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANM HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLL
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 66/241 / 209
AKDCHCI (SEQ ID NO: 299),
SAPATSGSATPGSAPATSGSATPGGDHCPLGPGRCCRLH TVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTS LHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHC I (SEQ ID NO: 300), SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGP
GRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANM HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLL AKDCHCI (SEQ ID NO: 301),
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGP GRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANM HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLL AKDCHCI (SEQ ID NO: 302),
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 303),
SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 304), SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL
GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 305),
SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 306),
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SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 307),
SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 308),
SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 309),
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSCEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDD LLAKDCHCI (SEQ ID NO: 310),
EEAEADDDDKESGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLG WADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 311), ou
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPL GPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA NLHAQIKTSLHRLRPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQRTDTGVSLQTYDD LLARDCHCI (SEQ ID NO: 312).
99. Composto MIC-1 de acordo com a modalidade 1 com uma das seguintes Fórmulas:
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Figure BR112019024102A2_D0018
P
Figure BR112019024102A2_D0019
P
S
P
P (Fórmula 01)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 69/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0020
OH
OH
Ο
G T S T E P
H2N' .OH •E
G
Q
F
K
Figure BR112019024102A2_D0021
P
A
E
M
P
A (Fórmula 02)
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Figure BR112019024102A2_D0022
Figure BR112019024102A2_D0023
Figure BR112019024102A2_D0024
G P
S Q
Q K
SQF
Q K T
Figure BR112019024102A2_D0025
PASYNPMV
EGARGDHC
T M C I G A C P
ASYNPMVL
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Figure BR112019024102A2_D0026
ο
G Ρ
Figure BR112019024102A2_D0027
Figure BR112019024102A2_D0028
G P
S Q
Q K
S Q F
Q K T
Figure BR112019024102A2_D0029
PASYNPMVL I
EGARGDHCPL
VTMC I GACP
PASYNPMVL I
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 72/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0030
ο
G Ρ
SQF
Figure BR112019024102A2_D0031
G P
SQF
Ρ A
G R
Figure BR112019024102A2_D0032
C
P
Figure BR112019024102A2_D0033
L V L
D H C
A C P
L V L (Fórmula 05)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 73/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0034
ο G Ρ
Figure BR112019024102A2_D0035
GRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QV
EGARGDHCPL
T M C I G A C P
Figure BR112019024102A2_D0036
G P
SQF
P
G
R
D
Figure BR112019024102A2_D0037
(Fórmula 06)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 74/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0038
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
Figure BR112019024102A2_D0039
P
E
G
S
S
E
S
S
Figure BR112019024102A2_D0040
(Fórmula 07)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 75/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0041
ο
G Ρ
Figure BR112019024102A2_D0042
Figure BR112019024102A2_D0043
G Ρ
SQF
Q Κ Τ
S Q F
Q Κ Τ
Figure BR112019024102A2_D0044
Ν Ρ L V L
R G D Η C
I G A C Ρ
Ν Ρ L V L
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 76/241 /209
0 0 JU H J £ ir\|-E PATSGSET PGTSESATPE H 0 GPGRCCRLHT VRASLEDLGW Η 1 N. H SGPGTSTEPS EGARGDHCPL ADWVLSPREV QVTMCIGACP
H SQFRAANLHA QIKTSLHRLK PDTVPA P-l·! CH, V QKTDTGVSLQ TYDDLLAKDC H C-hrSi—OH H 0 £ H2n/ Π~Ε PATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTE 0 GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPRE S SQFRAANLHA QIKTSLHRLK PDTVPA P-Nzyr ch3 h II I J 0 QKTDTGVSLQ TYDDLLAKDC Η 0-Νζ^|—OH 0 (Fórmula 09) 0 Jl-C V PASYNPLVLI *s PS EGARGDHCPL V QVTMCIGACP -CV PASYNPLVLI
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Figure BR112019024102A2_D0045
STEPS EGARGDHCPL
PREV QVTMCIGACP
Figure BR112019024102A2_D0046
PASYNPLVL I
EGARGDHCPL
VTMCIGACP
PASYNPLVL I
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 78/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0047
Figure BR112019024102A2_D0048
(Fórmula 11)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 79/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0049
C R L
N Μ H
Η T V R AS
A Q I K T S
Figure BR112019024102A2_D0050
S
H
A
L Q T Y
T V R
Q I K
QTY
ASLEDLGWAD
TSLHRLKPD
Figure BR112019024102A2_D0051
Figure BR112019024102A2_D0052
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 80/241 /209
0 H0^''~X'''——z\/\z 0 II H /X. H o 0 \ HOy° N^Tj-E aeaddddk esgdhcp H 0 WVLSPREVQV TMCIGACP 0 Η II T V P A P-N M VPA SYNPMVL OH Η 1 ^N. X. lT 0 t 0 X H LGP GRCCRLHTVR ASLEDLGWAD SQ FRAANMHAQI KTSLHRLKPD ch3 1 Q K TDTGVSLQTY DDLLAKDCH C--OH
Hy HjhrS-E AEADDDDK 0 WVLSPREVQV T V P A P-irNi-C VPA H Γ Η II 0 ESGDHCPLGP GRCCRLHTVR ASLEDLGWAD TMCIGACPSQ FRAANMHAQI KTSLHRLKPD ch3 SYNPMVL IQK TDTGVSLQTY DDLLAKDCH C--OH 0 (Fórmula 13)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 81/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0053
c c
CH
Η II p-n. β-c c—ir Voh
H II 0
V
P
A
S
N
P
M
V
Q
K
D
G
T V
P
A
Figure BR112019024102A2_D0054
H
H
A
S
CH
C—Nx >i—OH
H II
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Figure BR112019024102A2_D0055
STEPS EGARGDHCPL
PREV QVTMCIGACP .OH
H-Ν' H •Yj-E 0 P
P
H
P
E
W
P
H
Figure BR112019024102A2_D0056
P
E
Q
V
P (Fórmula 15)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 83/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0057
STEPS EGARGDHCPL
PREV QVTMCIGACP
SQFRAANLHA QIKTSLHRLR
QRTDTGVSLQ TYDDLLARDC
Figure BR112019024102A2_D0058
PASYNPLV .OH
HN‘
E
SQFRAANLHA QIKTSLHRLR
QRTDTGVSLQ TYDDLLARDC
Figure BR112019024102A2_D0059
PASYNPLVL I
Figure BR112019024102A2_D0060
(Fórmula 16)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 84/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0061
Figure BR112019024102A2_D0062
(Fórmula 17)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 85/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0063
P
Q
Figure BR112019024102A2_D0064
A
A (Fórmula 18)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 86/241 / 209
Figure BR112019024102A2_D0065
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
Figure BR112019024102A2_D0066
(Fórmula 19)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 87/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0067
Figure BR112019024102A2_D0068
(Fórmula 20)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 88/241 / 209
Figure BR112019024102A2_D0069
Figure BR112019024102A2_D0070
Figure BR112019024102A2_D0071
Ε ρ_|χ< T SGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS EGARGDHCPL H || o o
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
Figure BR112019024102A2_D0072
(Fórmula 21)
[00233] 100. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, apresentando meia-vida plasmática extendida em comparação com MIC-1 de SEQ ID NO: 1.
[00234] 101. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, apresentando uma meia-vida plasmática melhorada em comparação com MIC-1 da SEQ ID NO:1 conforme medido pela administração do composto a rato i.v. e estimativa da meia-vida terminal a partir das alterações na concentração plasmática do composto ao longo do tempo.
[00235] 102. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, apresentando potência mantida em comparação com
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 89/241 /209
MIC-1 deSEQ ID NO:1.
[00236] 103. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, apresentando eficácia mantida em comparação com MIC-1 da SEQ ID NO:1 conforme medido pela administração do composto em ratos s.c. e medindo as alterações na ingestão diária de alimentos.
[00237] 104. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido tem solubilidade aceitável em comparação com MIC-1 da SEQ ID NO:1.
[00238] 105. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-99, em que o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido tem uma solubilidade de 0,5, 1,0, 5,0, 10, 30 ou 50 mg/ml conforme medido em pH 8,0 em um sistema de tampão Tris.
106. O composto MIC-1 de acordo com as modalidades 1 ou 2, em que o polipeptídeo MIC-1 compreende uma deleção de N3 (des-N3) em comparação com MIC-1 da SEQ ID NO:1, em que a extensão de aminoácido tem a seguinte sequência SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225), e em que o prolongador tem a seguinte fórmula:
Figure BR112019024102A2_D0073
Figure BR112019024102A2_D0074
o (Fórmula X), e em que o prolongador é ligado à Cisteína da extensão de aminoácido.
[00239] 107. Composto, de acordo com as modalidades 1 ou 2, em que o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido N-terminal possui a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 288, e o prolongador possui a
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 90/241 / 209 seguinte fórmula:
Figure BR112019024102A2_D0075
(Fórmula X), e em que o prolongador é ligado à Cisteína da extensão de aminoácido.
[00240] 108. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades 1-107 ou um sal, amida ou éster farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00241] 109. O composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o composto possui eficácia in vivo melhorada na redução da ingestão de alimentos e/ou redução do peso corporal em comparação com MIC-1 da SEQ ID NO: 1.
[00242] 110. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, para uso como um medicamento.
[00243] 111. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, para uso na prevenção e/ou tratamento de um distúrbio metabólico.
[00244] 112. Composto MIC-1 de acordo com a modalidade 111, para uso na prevenção e/ou tratamento de um distúrbio metabólico, em que o distúrbio metabólico é obesidade, diabetes tipo 2, dislipidemia ou nefropatia diabética.
[00245] 113. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, para uso na prevenção e/ou tratamento de distúrbios alimentares, tais como obesidade.
[00246] 114. Composto MIC-1 de acordo com a modalidade 113, para
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 91/241 /209 uso na prevenção e/ou tratamento da obesidade, diminuindo a ingestão de alimentos, reduzindo o peso corporal, suprimindo o apetite e/ou induzindo a saciedade.
[00247] 115. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, para uso na prevenção e/ou tratamento de uma doença cardiovascular.
[00248] 116. Composto MIC-1 de acordo com a modalidade 115, para uso na prevenção e/ou tratamento de dislipidemia, arteriosclerose, esteatohepatite ou nefropatia diabética.
[00249] 117. Composição farmacêutica, compreendendo o composto
MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152 ou um sal, amida ou éster farmaceuticamente aceitável da mesma, e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00250] 118. O uso de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152 na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de um distúrbio metabólico, em que o distúrbio metabólico é obesidade, diabetes tipo 2, dislipidemia ou nefropatia diabética.
[00251] 119. Uso de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios alimentares.
[00252] 120. Uso de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento da obesidade.
[00253] 121. O uso de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento da obesidade, diminuindo a ingestão de alimentos, reduzindo o peso corporal, suprimindo o apetite e/ou induzindo a saciedade.
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 92/241 /209
[00254] 122. O uso de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de uma doença cardiovascular.
[00255] 123. O uso de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de dislipidemia, arteriosclerose, esteatohepatite ou nefropatia diabética.
[00256] 124. Método para tratar e/ou prevenir um distúrbio metabólico por meio da administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa do composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152, em que o distúrbio metabólico é obesidade, diabetes tipo 2, dislipidemia ou nefropatia diabética.
[00257] 125. Método para e/ou prevenir transtornos alimentares por meio da administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152.
[00258] 126. Método para e/ou prevenir obesidade por meio da administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152.
[00259] 127. Método para tratar e/ou prevenir a obesidade, diminuindo a ingestão de alimentos, reduzindo o peso corporal, suprimindo o apetite e/ou induzindo a saciedade pela administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152.
[00260] 128. Método para e/ou prevenir uma doença cardiovascular por meio da administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152.
[00261] 129. Método para tratar e/ou prevenir um dislipidemia,
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 93/241 /209 arterioesclerose, esteato-hepatite, ou nefropatia diabética por meio da administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de composto MIC1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152.
[00262] 130. Molécula polinucleotídica codificando um composto
MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152.
[00263] 131. Método para tratar e/ou prevenir o sobrepeso, diminuindo a ingestão de alimentos, reduzindo o peso corporal, suprimindo o apetite e/ou induzindo a saciedade pela administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de um composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-109 e 132-152.
[00264] 132. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 01:
Figure BR112019024102A2_D0076
S P R E V
Q
C
S Q
P-N
E
P
S P R E
V
Q
S Q
P-N
O
Q (Fórmula 01)
R
Figure BR112019024102A2_D0077
C
V
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 94/241 /209
[00265] 133. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 02:
Figure BR112019024102A2_D0078
Figure BR112019024102A2_D0079
(Fórmula 02).
[00266]
134. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 03:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 95/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0080
Figure BR112019024102A2_D0081
Figure BR112019024102A2_D0082
G P
S Q
Q K
SQF
Q K T
Figure BR112019024102A2_D0083
PASYNPMV
EGARGDHC
T M C I G A C P
ASYNPMVL (Fórmula 03).
[00267]
135. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 04:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 96/241 / 209
Figure BR112019024102A2_D0084
ο
G Ρ
Figure BR112019024102A2_D0085
Figure BR112019024102A2_D0086
G P
S Q
Q K
S Q F
Q K T
Figure BR112019024102A2_D0087
PASYNPMVL I
EGARGDHCPL
VTMC I GACP
PASYNPMVL I (Fórmula 04).
[00268]
136. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 05:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 97/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0088
ο
G Ρ
SQF
Figure BR112019024102A2_D0089
G P
SQF
Ρ A
G R
Figure BR112019024102A2_D0090
C
P
Figure BR112019024102A2_D0091
L V L
D H C
A C P
L V L (Fórmula 05).
[00269] 137. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 06:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 98/241 / 209
Figure BR112019024102A2_D0092
ο G Ρ
Figure BR112019024102A2_D0093
GRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QV
EGARGDHCPL
T M C I G A C P
Figure BR112019024102A2_D0094
G P
SQF
A
P
G
R
D
Figure BR112019024102A2_D0095
(Fórmula 06).
[00270] 138 composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 07:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 99/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0096
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
Figure BR112019024102A2_D0097
P
E
G
Q I K T S
T Y D D L
P G T S
V R A S
Q I K T S
T Y D D L
Figure BR112019024102A2_D0098
(Fórmula 07).
[00271] 139. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 08:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 100/241 / 209
Figure BR112019024102A2_D0099
Figure BR112019024102A2_D0100
[00272] 140. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 09:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 101/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0101
SQFRAANLHA QIKTSLHRLK
QKTDTGVSLQ TYDDLLAKDC
Figure BR112019024102A2_D0102
PASYNPLVL I
Figure BR112019024102A2_D0103
G P G
PATSGSET PGTS
RCCRLHT VRASL
ESATPE SGPGTST
EDLGW ADWVLSPR
EPS EGARGDHCPL
EV QVTMCIGACP
SQFRAANLHA QIKTSLHRLK
PASYNPLVL I
QKTDTGVSLQ TYDDLLAKDC
P D T V P A P-Nz>1- C V
Figure BR112019024102A2_D0104
(Fórmula 09).
[00273]
141. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 10:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 102/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0105
s
Figure BR112019024102A2_D0106
P
A
G
A
M
A
S
[00274]
142. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 11
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 103/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0107
Figure BR112019024102A2_D0108
(Fórmula 11).
[00275]
143. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 12:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 104/241 /209
Figure BR112019024102A2_D0109
HC) .0
ΗΙΨ π—Ε AEADDDDK ESGDHCPLGP GRCCRLHTVR ASLEDLGWAD
Figure BR112019024102A2_D0110
(Fórmula 12).
[00276] 144. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 13:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 105/241 /209
O OH
Figure BR112019024102A2_D0111
Figure BR112019024102A2_D0112
Νχ >-Ε AEADDDDK ESGDHCPLGP GRCCRLHTVR ASLEDLGWAD
Η II ο
WVLSPREVQV TMCIGACPSQ FRAANMHAQI KTSLHRLKPD
Figure BR112019024102A2_D0113
SYNPMVL I Q Κ
TDTGVSLQTY
DDL
Figure BR112019024102A2_D0114
Figure BR112019024102A2_D0115
WVLSPREVQV
Κ ESGDHCP
Τ Μ Ο I G A Ο Ρ
GRCCRLHTVR ASLEDLGWAD
RAANMHAQI KTSLHRLKPD
Figure BR112019024102A2_D0116
(Fórmula 13).
[00277] 145. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 14:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 106/241
100 /209
Figure BR112019024102A2_D0117
Νχ π—E AEADDDDK ESGDHCPLGP GRCCRLHTVR ASLEDLGWAD
H II 0 WVLSPREVQV TMCIGACPSQ FRAANMHAQI KTSLHRLKPD
P A
Figure BR112019024102A2_D0118
QK TDTGVSLQTY
Figure BR112019024102A2_D0119
T V
S Y N P Μ V
Figure BR112019024102A2_D0120
ASLEDLGWAD
TSLHRLKPD
Figure BR112019024102A2_D0121
[00278] 146. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 15:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 107/241
101 /209
O OH
Figure BR112019024102A2_D0122
Figure BR112019024102A2_D0123
Ο
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLS
STEPS EGARGDHCPL
PREV QVTMCIGACP
SQFRAANLHA QIKTSLHRLR
QRTDTGVSLQ TYDDLLARDC
Figure BR112019024102A2_D0124
PASYNPLVL I
OH
Figure BR112019024102A2_D0125
G P G
T PGTSESATPE SGPGTSTE. PS EGARGDHCPL
VRASLEDLGW ADWVLSPREV
QVTMC I GACP
SQFRAANLHA QIKTSLHRLR
QRTDTGVSLQ TYDDLLARDC
Figure BR112019024102A2_D0126
PASYNPLVL I (Fórmula 15).
[00279]
147. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 16:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 108/241
102 /209
Figure BR112019024102A2_D0127
STEP
P R E V
Figure BR112019024102A2_D0128
P
A
E
G
V
T
P
A
[00280]
148. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 17
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 109/241
103 /209
Figure BR112019024102A2_D0129
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
Figure BR112019024102A2_D0130
(Fórmula 17).
[00281]
149. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 18:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 110/241
104 /209
Figure BR112019024102A2_D0131
Figure BR112019024102A2_D0132
[00282] 150. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 19:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 111/241
105 /209
Figure BR112019024102A2_D0133
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
Figure BR112019024102A2_D0134
CH3 (Fórmula 19).
[00283]
151. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 20:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 112/241
106 /209
Figure BR112019024102A2_D0135
Figure BR112019024102A2_D0136
ch3 (Fórmula 20)
[00284]
152. Composto MIC-1 de acordo com a Fórmula 21:.
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107 /209
Figure BR112019024102A2_D0137
P R E V
Q V
PGTSTEPS
Figure BR112019024102A2_D0138
EXEMPLOS
Lista de Abreviações “Pico principal” refere-se ao pico em um cromatograma de purificação que tenha a intensidade de UV a mais elevada em unidades do miliabsorbância e que contenha a proteína de fusão.
HPLC é cromatografia líquida de alta eficiência.
SDS-PAGE é eletroforese em gel de policacrilamida de dodecil sulfato de sódio.
IMAC é cromatografia de afinidade por ions metálicos imobilizados.
SEC é cromatografia por exclusão de tamanho.
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108 /209
MS é espectrometria de massa.
[00285] Nesta descrição, letras gregas podem ser representadas por seu símbolo ou pelo nome escrito correspondente, por exemplo: oc = alfa; β = beta; ε = épsilon; γ = gama; ω = ômega; Δ = delta; etc. Além disso, a letra grega μ pode ser representada por u, por exemplo, em μΐ = ul, ou em μΜ = uM.
Polipeptídeos MIC-1 com solubilidade melhorada
[00286] Em um aspecto da invenção, polipeptídeos MIC-1 são projetados de modo a ter solubilidade aumentada.
[00287] Em um aspecto da invenção, isso foi obtido pela adição de uma extensão ácida de aminoácidos N-terminal ao polipeptídeo MIC-1.
[00288] Em um aspecto da invenção, a solubilidade foi aumentada e a estabilidade melhorada por modificação da sequência de aminoácidos do polipeptídeo MIC-1. Por exemplo, modificação foi realizada dentro da sequência de aminoácidos do polipeptídeo MIC-1 (mutação em sequência).
[00289] Polipeptídeos MIC-1 com uma extensão de aminoácidos Nterminal podem ser expressos em bactérias como E. coli. No contexto da presente invenção, a produção de proteína em larga escala dos polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N podería utilizar Corpos de Inclusão (IB), já que isso representa uma abordagem vantajosa para controlar a recuperação de processos, a pureza da proteína, a degradação da protease e a estabilidade geral da proteína. Isto se toma particularmente importante para a produção em larga escala. De importância crítica para a qualidade do IB é o equilíbrio entre solubilidade melhorada e formação de IB dos polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N.
Projeto de extensão N:
[00290] No projeto da extensão de aminoácido_N-terminal, F, I, L, M, V, W e Y foram excluídos, posto que poderíam contribuir para a agregação proteica. Η, K, e R foram excluídos também, posto que poderíam causar
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109 /209 ligação indesejada na membrana celular. A, C, E, G, P, S, T, D, N, e Q são preferidos para a sequência da extensão N. E e D são particularmente preferidos pois aumentam a solubilidade diminuindo o valor de pi do composto. C podería fornecer um grupo -SH que pode ser usado para a finalidade de prolongamento, tal como a PEGuilação e conjugação de ácido graxo. Particularmente, para algumas extensões N, uma ou duas Alanina(s), Glicina(s) ou Serina(s) adicionais foram adicionadas no próprio N-terminal para aumentar a eficiência de remoção de Metionina inicial quando os polipeptídeos MIC-1 com extensão N foram expressos em E.coli.
[00291] Várias extensões de aminoácido_N-terminais foram projetadas. Algumas extensões N compreendem as sequências que originam das proteínas humanas (sequências humanizadas); algumas compreendem sequência(s) artificialmente projetadas(s) (por exemplo GS, SG, AEE, AES, GEPQ (SEQ ID NO: 123), GEPS (SEQ ID NO: 118)); algumas compreendem diversas repetições das sequências humanizadas ou sequências artificiais; algumas compreendem uma combinação das acima. Várias sequências de 6 resíduos (6-mers) foram projetadas. As extensões N podem compreender um ou mais dentre 6-mers, parte de 6-mers (por exemplo, 1-5 resíduos de 6-mers), ou uma combinação dos anteriores. Os resíduos de aminoácidos das sequências artificiais (incluindo 6-mers) e as sequências humanizadas podem ser dispostas em qualquer ordem.
[00292] Alguns 6-meros representativos e combinações de 6-meros estão listados na Tabela 2, e outros exemplos de extensão N estão listados na Tabela 3.
Tabela 2: 6-mers e combinações de 6-mers_________________
6-mers: 6-mer-l: SPAGSP (SEQ ID NO:4)
6-mer-2: TSESAT (SEQ ID NO:5)
6-mer-3: TSTEPE (SEQ ID NO:6)
6-mer-4: SEP ATS (SEQ ID NO:7)
6-mer-5: TSTEEG (SEQ ID NO:8)
6-mer-6: PESGPG (SEQ ID NO:9)
6-mer-7: SGSAPG (SEQ ID NO: 10)
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110 /209
6-mer-8: GSETPG (SEQ ID NO:11)
Combinações: SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 12)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO: 13)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO: 14)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP (SEQ ID NO: 15)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP (SEQ ID NO: 16)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP (SEQ ID NO: 17)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT (SEQ ID NO: 18)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT (SEQ ID NO: 19)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT (SEQ ID NO:20)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE (SEQ ID NO:21)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE (SEQ ID NO:22)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE (SEQ ID NO:23)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS (SEQ ID NO:24)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS (SEQ ID NO:25)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS (SEQ ID NO:26)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG (SEQ ID NO:27)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG (SEQ ID NO:28)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG (SEQ ID NO:29)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG (SEQ ID NO:30)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG (SEQ ID NO:31)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG (SEQ ID NO:32)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG (SEQ ID NO:33)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG (SEQ ID NO:34)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG (SEQ ID NO:35)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG (SEQ ID NO:36)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG (SEQ ID NO:37)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG (SEQ ID NO:38)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG (SEQ ID NO:39)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO:40)
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO:41)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO:42)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO:43)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO:44)
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO:45)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO:46)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO:47)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO:48)
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO:49)
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO:50)
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG (SEQ ID NO:51)
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG (SEQ ID NO:52)
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO:53)
Tabela 3: Exemplos de extensões N
SEQ ID NO Número do resíduo Sequência da extensão N
SEQ ID NO:54 6 AEEAES
SEQ ID NO:55 3 AES
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Ill /209
SEQ ID NO Número do resíduo Sequência da extensão N
SEQ ID NO:56 9 (AEE)2AES
SEQ ID NO:57 20 (GEPS)5
SEQ ID NO:58 24 SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG
SEQ ID NO:59 21 (AEE)6AES
SEQ ID NO:60 18 (AEE)sAES
SEQ ID NO:61 12 (AEE)3AES
SEQ ID NO:62 26 AASPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG
SEQ ID NO:63 24 TSESATPESGPGTSESATPESGPG
SEQ ID NO:64 26 AASPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG
SEQ ID NO:65 22 AAPEDEETPEQEGSGSGSGSGS
SEQ ID NO:66 12 AAPEDEETPEQE
SEQ ID NO:67 22 AAPDEGTEEETEGSGSGSGSGS
SEQ ID NO:68 24 SEPATSGSETPGSEPATSGSETPG
SEQ ID NO:69 25 A(GPEQGQEP)3
SEQ ID NO:70 30 SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS
SEQ ID NO:71 32 SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG
SEQ ID NO:72 24 (GEPS)6
SEQ ID NO: 161 36 (GEPS)9
SEQ ID NO: 162 36 (GPEQ)9
SEQ ID NO: 163 25 AGPEQGQEPGEPQGQEPQPGEPEGQ
Mutações em sequência:
[00293] Determinados resíduos internos de MIC-1 (SEQ ID
NO:I)foram modificados, por exemplo, por substituição. Por exemplo, para aumentar a solubilidade dos compostos MIC-1, um resíduo hidrofóbico de MIC-1 podería ser substituído com um resíduo hidrofilico, de preferência por com um resíduo ácido; um resíduo positivamente carregado podería ser substituído com um resíduo ácido, etc. Para diminuir a oxidação, metionina podería ser substituída por outros aminoácidos, por exemplo, E, F ou L.
[00294] Mutações em sequência para aumentar a solubilidade incluem mas não estão limitadas a: P11E, H18E, R21E, A30E, A47E, R53E, A54E,
M57E, H66E, R67E, L68E, K69E, A75E, A81E, P85E, Q90E, T92E, L105E e K107E.
[00295] Mutações em sequência para diminuir a oxidação incluem mas não estão limitadas a: M43L, M43E, M57E, M57L, M86F e M86L.
[00296] Mutações em sequência para aumentar a estabilidade química incluem mas não estão limitadas a N3S, N3E, N3A, N3T, N3P, N3G, N3V, N3H, N3Y e N3Q.
[00297] Mutações em sequência para conjugação incluem, mas não
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112 /209 estão limitadas a K69R, K107R e K91R.
[00298] Outras mutações em sequência incluem, mas não estão limitadas a, uma deleção de N3 (des-N3) e/ou uma deleção dos primeiros 3 resíduos.
Cálculo de pi
[00299] O pi calculado de um polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido N-terminal é definido como o pH no qual a carga calculada líquida do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido N-terminal é zero. A carga calculada do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácidos N-terminal em função do pH é obtida usando os valores de pKa dos resíduos de aminoácidos descritos na Tabela 1 e o método descrito por B. Skoog e A. Wichman (Trends in Analytical Chemistry, 1986, vol. 5, pp. 8283). O pKa de cadeia lateral de cisteína (Cys) só é incluído no cálculo de carga para cisteinas com um grupo sulfidrila livre. A extensão N pode conter uma mutação de cisteína. Como um exemplo, o valor de pi calculado de MIC1 de tipo selvagem humano é 8,8 como o homodímero. Os valores de pi calculados do polipeptídeo MIC-1 são mostrados na Tabela 4.
[00300] Neste documento, e ao longo deste documento, cálculos de pi sobre o polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido N-terminal, se não indicado de outra forma, são feitos em homodímeros.
Tabela 4: Valores de pi calculados
MIC-1 (SEQ ID MIC-1-des- NO:1) N3 MIC-1 Δ1-3 MIC-1-A1-3 (M57E) MIC-1-A1-3 -MIC-1-A1-MIC-1-A1-(M57E, 3 (M57E,3 (M57E,H66E e H66E) R67E) R67E)
Quaisquer combinações de quatro de ómers 1-8 6,1 6,1 5,8 5,5 5,0 5,0 4,7
Quaisquer combinações de cinco ómers 1-8 5,8 5,8 5,5 5,2 4,8 4,8 4,6
(GEPQ*)5 (GEPS*)5 OU 5,8 5,8 5,5 5,2 4,8 4,8 4,6
(GEPQ*)6 5,5 5,5 5,2 5,2 4,7 4,7 4,5
Sequências humanizadas exemplos em 4,5 ~ 5,5 4,5 - 5,5 4,2 - 5,3 4,2 - 5,2 4,2-5,1 4,2-5,1 4,2 - 5,0
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[00301] * Os resíduos de aminoácidos de “GEPQ” ou “GEPS” podem ser dispostos em qualquer ordem
[00302] “Um Cys na extensão N-terminal alterou o pi em menos de ±0,1.
Materiais e Métodos
Métodos Gerais de Preparação
Exemplo-1: Expressão e fermentação do polipeptídeo MIC-1 ou do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal
[00303] O cDNA do polipeptídeo MIC-1 ou polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal foi subclonado em um vetor derivado de pETl 1b. A superexpressão de polipeptídeo MIC-lf ou polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal como corpos de inclusão foi induzida em E. coli por 0,5 mM de isopropil β-d-tiogalactosídeo (IPTG) quando a densidade celular atingiu um OD600 de 1,0. Depois de contínuo crescimento em TB por 20h a 37 ° C, as células foram colhidas e amostras para LC/MS e UPLC foram preparadas para confirmar o peso molecular.
[00304] A fermentação foi executada em processo semidescontínuo em meio definido quimicamente como suplemento. A produção de fermentação dependia de polipeptídeo diferente, que variou de 1 g/L a 8 g/L de polipeptídeo para polipeptídeo.
Exemplo-2: Purificação e redobramento:
[00305] O polipeptídeo MIC-1 ou polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal a foi ainda purificado da seguinte forma:
[00306] Pasta (20% p/v) de E. coli em lOmM de tampão Tris e pH 8,0 foi lisada (intervalos de 3 segundos dentro/fora em gelo por 5 minutos) e o polipeptídeo MIC-1 ou polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal foi peletizado por centrifugação (10.000 x g, durante 30 minutos). Os corpos de inclusão foram solubilizados novamente por 8M ureia em 20 mM Tris pH 8,0 e os detritos removidos por centrifugação (10.000 x g, durante 30 minutos). O
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114 /209 polipeptídeo MIC-1 ou polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal no sobrenadante resultante foi coletado e diluído no tampão de redobramento (50 mM Tris, pH 8,5 e 10% DMF ou 10% DMSO) para a concentração final de 0,1 mg/ml. O processo de redobramento durou 48 horas em sala fria. A solução resultante foi filtrada por filtro 0,4pm e carregada em cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia de troca aniônica (50 mM Tris pH 8,0, 0-500 mM NaCl) usando resina Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), conforme descrito de maneira geral em Protein Purification. Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes, Robert K. 3rd ed., 1994 (Capítulo 6 e Capítulo 8). Em alguns casos, purificação adicional foi feita por cromatografia por exclusão de tamanho usando uma coluna HiLoad 26/60 Superdex pg 75 (GE Healthcare) operada com 50 mM Tris pH 8,0 e 200 mM NaCl. Para armazenamento, o polipeptídeo MIC-1 ou polipeptídeo MIC-1 com uma extensão terminal N foi transferido para DPBS e armazenado congelado. Polipeptídeos MIC-1 ou polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal e sua solubilidade máxima em pH8 em tampão Tris são mostrados na Tabela 5.
Tabela 5: Polipeptídeos MIC-1 ou polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal e sua solubilidade máxima em pH8 em tampão Tris testado de acordo com o Exemplo 4
SEQ ID NO Estrutura pi calculado Solubilidade máxima (mg/ml)
SEQ ID NO:1 MIC-1 (SEQ ID NO:1) 8,8 0,3
SEQ ID NO:73 MIC-1(R2A,N3E) 6,8 0,9
SEQ ID NO:74 MIC-1(R2A,N3E,A54E) 6,4 1,0
SEQ ID NO:75 MIC-1(R2A,N3E,A81E) 6,4 N.D.*
SEQ ID NO:76 MIC-1(R2A,N3E,H18E) 6,2 1,7
SEQ ID NO:77 MIC-1(R2A,N3E,K69E) 6,1 2,2
SEQ ID NO:78 MIC-1 (R2 A,N3E,K107E) 6,1 1,9
SEQ ID NO:79 MIC-1(R2A,N3E,L68E) 6,4 3,9
SEQ ID NO:80 MIC-1 (R2 A,N3E, A47E) 6,4 1,0
SEQ ID NO:81 MIC-l(R2A,N3E,L105E) 6,4 N.D.
SEQ ID NO:82 MIC-1(R2A,N3E,M57E) 6,4 1,7
SEQ ID NO:83 MIC-1(R2A,N3E,P85E) 6,4 N.D.
SEQ ID NO:84 MIC-1(R2A,N3E,P11E) 6,4 1,6
SEQ ID NO:85 MIC-1(R2A,N3E,R21E) 6,1 1,8
SEQ ID NO:86 MIC-1(R2A,N3E,R53E) 6,1 1,9
SEQ ID NO:87 MIC-1 (R2 A,N3E,R67E) 6,1 1,8
SEQ ID NO:88 MIC-l(R2A,N3E,A30E) 6,4 1,5
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SEQ ID NO Estrutura pi calculado Solubilidade máxima (mg/ml)
SEQ ID NO:89 AEEAES-.VIIC-I-\l-3 6,1 N.D.
SEQ ID NO:90 AES-MIC-1-A1-3 6,8 0,9
SEQ ID NO:91 (AEE)2AES-MIC-l-Al-3 5,5 N.D.
SEQ ID NO:92 (GEPS)5-MIC-1(SEQ ID NO:1) 5,8 35,1
SEQ ID NO:93 SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG- MIC-1(SEQID NO:1) 6,1 44,5
SEQ ID NO:94 (AEE)6AES-MIC-1(SEQ ID NO:1) 4,5 39,0
SEQ ID NO:95 (AEE)5AES-MIC-l-Al-3 4,6 35,0
SEQ ID NO:96 (AEE)3AES-MIC-l-Al-3 5,0 36,0
SEQ ID NO:97 AASPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG- MIC-1(SEQID NO:1) 6,1 N.D.
SEQ ID NO:98 TSESATPESGPGTSESATPESGPGMIC-1(R2A,N3E) 5,5 N.D.
SEQ ID NO:99 AASPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG- MIC-1-A1-3 5,8 N.D.
SEQ ID NO: 100 AAPEDEETPEQEGSGSGSGSGS- MIC-1-A1-3 5,2 35,7
SEQ ID NO: 101 AAPEDEETPEQE-MIC-1 -Δ 1 -3 5,2 N.D.
SEQ ID NO: 102 AAPDEGTEEETEGSGSGSGSGS- MIC-1-A1-3 5,2 N.D.
SEQ ID NO: 103 SEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPG- MIC-1-A1-3 5,8 N.D.
SEQ ID NO: 104 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 -3 5,8 35,4
SEQ ID NO: 105 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 3(M57E) 5,5 37,1
SEQ ID NO: 106 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 3(M57L) 5,8 32,5
SEQ ID NO: 107 A(GPEQGQEP)3-MIC-1 -Δ1 -3 5,2 32,2
SEQ ID NO: 108 SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST EPS-MIC-l-Al-3 5,5 40,0
SEQ ID NO: 109 SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSTEPSEG-MIC-1 -Δ 1 -3 5,2 40,0
SEQ ID NO: 110 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 3(M86L) 5,8 N.D.
SEQ ID NO:111 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 3(M57L, M86L) 5,8 31,1
SEQ ID NO: 112 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 3(M57E, H66E) 5,0 N.D.
SEQ ID NO: 113 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 3(M57E, R67E) 5,0 N.D.
SEQ ID NO: 114 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 3(M57E, R67E, M86L) 5,0 N.D.
SEQ ID NO: 115 SEPATSGSETPG TSES ATPESGPGTSTEPSG-MIC-1-Δ13(M57L, M86L) 5,5 N.D.
SEQ ID NO: 116 (GEPS)6-MIC-l-Al-3 5,2 N.D.
SEQ ID NO: 117 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1 -des-N3 6,1 N.D.
*N.D.: Não determinado
Exemplo-3: solubilidade dependente de pH do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal
[00307] O objetivo deste experimento foi analisar os polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N com solubilidade melhorada e determinar a janela de pH ideal para formulação.
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[00308] Polipeptídeos MIC-1 com extensões N-terminais foram dissolvidos em uma mistura de água e etanol (60% água e 40% etanol), com uma faixa de concentração entre 3 mg/ml a 10 mg/ml. O solvente foi evaporado com Speed Vac (Concentrator Plus, Eppendorf) durante 6 horas para obter pélete do polipeptídeo MIC-1 com extensão N-terminal.
[00309] Os tampões abaixo foram usados para este teste de curva de solubilidade dependente do pH: tampão de acetato (pH 3 a pH 6); tampão Tris (pH 7 a pH 9); tampão CAPS (pH 10 a pH 11).
[00310] Tampões foram adicionados em cada poço da placa de 96 poços juntamente com os polipeptídeos MIC-1 com extensões N-terminais. A quantidade usada pode não ser exatamente a mesma, mas todas visando uma concentração teórica dentro de 12-18 mg / ml. A concentração do polipeptídeo MIC-1 com a extensão N-terminal no sobrenadante foi determinada por UPLC (Tabela 6). Com base nos resultados, a solubilidade dos polipeptídeos MIC-1 com extensão N-terminal da invenção foi melhorada significativamente entre pH 6-9 em comparação com wtMIC-1. A janela ideal de pH dos polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal cai na faixa de pH que é preferido para a formulação, por exemplo, pH 6,5-8,5.
Tabela 6: teste de solubilidade dependente de pH dos polipeptídeos MIC1 com uma extensão N-terminal (mg/ml)
SEQ NO ID Estrutura PH
3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0
SEQ NO:1 ID MIC-1 (SEQ ID NO:1) 12,8 2,0 0,2 0,3 0,2 0,3 0,6 3,6 13,9
SEQ NO:74 ID MIC- 1(R2A,N3E,A5 4E) 13,3 1,3 0,4 0,6 0,5 1,0 1,5 3,6 15,5
SEQ NO:76 ID MIC- 1(R2A,N3E,H1 8E) 14,5 3,4 0,4 0,4 0,9 1,7 3,0 14,3 13,6
SEQ NO:79 ID MIC- 1(R2A,N3E,L68 E) 13,6 1,4 1,4 1,7 3,2 3,9 3,9 4,0 12,1
SEQ NO:80 ID MIC- 1(R2A,N3E,A4 7E) 13,4 2,5 0,5 0,6 0,9 1,0 1,0 2,9 10,8
SEQ NO:85 ID MIC- 1(R2A,N3E,R21 E) 14,9 1,6 0,5 0,5 1,4 1,8 1,7 2,5 12,9
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SEQ ID NO:88 MIC- 1(R2A,N3E,A3 0E) 13,9 1,7 0,8 0,8 1,4 1,5 2,1 2,4 13,7
SEQ ID NO:90 AES-MIC-1-ΔΙ3 12,5 2,3 0,6 0,7 1,2 0,9 1,0 3,6 8,9
SEQ ID NO:93 SPAGSPTSTEE GTSESATPES GPG-MIC1(SEQ ID NO:1) 12,9 1,5 1,2 1,4 5,1 12,8 13,0 13,0 13,5
SEQ ID NO:94 (AEE)6AES- MIC-1-A1-3 7,3 0,2 2,9 9,5 11,6 15,3 15,1 15,0 14,8
SEQ ID NO:95 (AEE)sAES- MIC-1-A1-3 11,9 0,3 1,6 5,7 9,4 15,8 15,7 14,9 15,0
SEQ ID NO: 100 AAPEDEETPE QEGSGSGSGS GS-MIC-1-A1-3 11,2 3,2 2,1 5,1 8,3 15,0 15,3 15,0 15,6
SEQ ID NO: 104 (SEPATSGSET PG)2-MIC-1- Δ1-3 12,2 0,7 0,3 1,0 4,6 16,4 16,9 16,0 16,2
SEQ ID NO: 105 (SEPATSGSET PG)2-MIC-1- Δ1-3(Μ57Ε) 7,2 1,2 0,8 3,8 11,5 15,6 15,2 14,9 16,2
SEQ ID NO: 106 (SEPATSGSET PG)2-MIC-1- Δ1-3(Μ57Ε) 10,1 0,2 0,3 1,6 4,3 15,6 16,1 16,1 16,8
Exemplo 4: Solubilidade máxima de polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal em pH 8
[00311] A fim de testar a solubilidade máxima, os polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal foram dissolvidos em uma mistura de água e etanol (60% água e 40% etanol), com uma faixa de concentração entre 3 mg/ml a 10 mg/ml. Então a solução (150 pL cada poço) foi aliquotada em uma placa de 96 poços (Corning). O solvente foi evaporado com SpeedVac (Concentrator Plus, Eppendorf) durante 6 horas para obter pélete do polipeptídeo de MIC-1 com uma extensão N-terminal. Tampão Tris (pH 8,0, sem excipientes) foi adicionado a cada poço da placa de 96 poços. A quantidade de tampão adicionado ao poço foi inferior à quantidade necessária para solver o pélete todo no poço, de modo que a concentração máxima fosse alcançada. A placa foi agitada num agitador de placa a 800 rpm (MixMate, Eppendorf) por 2 horas. O pélete foi girado a 3600 g durante 5 min. Os sobrenadantes foram transferidos para uma placa de 96 poços profundos e diluídos 20 vezes com 40% de etanol. Então todas as amostras foram sujeitas a UPLC (Acquity, Waters), leitor de placas (Infinite M200 pro, Tecan) e
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118 /209 espectrômetro UV (NanoDrop 8000, Thermo Scientific) para determinar a concentração (Tabela 7)
[00312] Com base nos resultados, a solubilidade dos polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal da invenção foi melhorada significativamente em pH 8,0. Especialmente, os polipeptídeos MIC-1 com extensão N-terminal atingiram solubilidade de mais de 30 mg/ml a pH 8,0.
Tabela 7: Teste de solubilidade máxima de polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal em pH 8,0
SEQ IN NO Estrutura Solubilidade (mg/ml)
SEQ ID NO:96 (AEE)3 AES -MIC-1 -Δ 1 -3 36,0
SEQ ID NO:95 (AEE)5AES-MIC-l-Al-3 35,0
SEQ ID NO:94 (AEE)6AES-MIC-1 (SEQ ID NO:1) 39,0
SEQ ID NO:93 SPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPG-MIC-1 44,5
SEQ ID NO:92 (GEPS)s-MIC-l(SEQ ID NO:1) 35,1
SEQ ID NO: 100 AAPEDEETPEQEGSGSGSGSGS -MIC-1 -Δ 1 -3 35,7
SEQ ID NO:79 MIC-1(R2A,N3E,L68E) 3,9
SEQ ID NO:85 MIC-1(R2A,N3E,R21E) 1,8
SEQ ID NO:88 MIC-1 (R2A,N3E, A30E) 1,5
SEQ ID NO:74 MIC-1 (R2A,N3E, A54E) 1,0
SEQ ID NO:76 MIC-1(R2A,N3E,H18E) 1,7
SEQ ID NO:77 MIC-1 (R2A,N3E,K69E) 2,2
SEQ ID NO:80 MIC-1 (R2A,N3E, A47E) 1,0
SEQ ID NO:90 AES-MIC-l-Al-3 0,9
SEQ ID NO:78 MIC-1 (R2A,N3E,K107E) 1,9
SEQ ID NO:82 MIC-1 (R2A,N3E,M57E) 1,7
SEQ ID NO:84 MIC-1(R2A,N3E,P11E) 1,6
SEQ ID NO:86 MIC-1(R2A,N3E,R53E) 1,9
SEQ ID NO:87 MIC-1 (R2A,N3E,R67E) 1,8
SEQ ID NO: 104 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1 -Δ 1 -3 35,4
SEQ ID NO: 105 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1 -Δ 1 -3(M57E) 37,1
SEQ ID NO: 106 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1 -Δ 1 -3(M57L) 32,5
SEQ ID NO: 107 A(GPEQGQEP)3-MIC-1 -Δ 1 -3 32,2
SEQ ID NO: 108 SEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPS-MIC-1 -Δ 1 -3 40,0
SEQ ID NO: 109 SEPATSGSETPGTSESATPESGPG TSTEPSEG-MIC-1-ΔΙ3 40,0
SEQ ID NO:111 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 -3(M57L, M86L) 31,1
SEQ ID NO:73 MIC-1(R2A, N3E) 0,9
SEQ ID NO: 164 SEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEG-MIC-1 -desN3 (M57L, M86L) 40,0
SEQ ID NO:1 MIC-1(SEQ ID NO:1) 0,3
[00313] A solubilidade melhorada de polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N foi retida nos compostos MIC-1, ou seja, a adição de um prolongador não reduziu significativamente a solubilidade (Exemplo 12).
Métodos Gerais de análise de atividade in vitro
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Exemplo 5: Estabelecimento de linhagem celular BHK21-hGFRALIRES-hRET
[00314] O propósito deste exemplo foi estabelecer uma célula com base em ensaio in vitro para testar atividade de MIC-1. Células de mamíferos foram transfectadas e expressaram estavelmente o receptor de MIC-1 de comprimento completo (hGFRAL) e o seu co-receptor de sinalização completo hRET51.
[00315] Plasmídeos expressando hGFRAL de comprimento completo e hRET51 de comprimento completo foram construídos por meio da inserção de nucleotídeos de DNA sintetizados codificando hGFRAL de comprimento completo e hRET51 de comprimento completo em vetor de expressão pEL de mamífero. IRES (sítio de entrada de ribossoma interno) é um ligante comumente usado entre duas sequências de DNA, de modo que as duas sequências de DNA podem ser simultaneamente traduzidas em mRNA. Estrutura de vetor pEL foi fornecida pela empresa Taihegene CRO.
[00316] Dois milhões de células BHK21 foram semeadas em uma placa de Petri de 10 cm e cultivadas ao longo na noite em meio de cultura (DMEM +10% FBS +1% PS). As células foram transfectadas com plasmídeos pEL-hGFRAL-IRES-hRET. Células transfectadas foram divididas em novos pratos de 10 cm em diferentes densidades e cresceram no meio de seleção (DMEM+ 10%FBS+l%PS+lmg/ml G418) por mais de 2 semanas para se obter clones únicos. Os clones únicos foram transferidos para placas de 6 poços e cultivadas até confluência de 100%. Expressão de mRNA de hGFRAL e hRET foi medida por qPCR. Clones transfectados com sucesso foram selecionados e testados para ligação a MIC-1.
Exemplo 6: Ensaio de atividade in vitro baseado em células MIC-1
[00317] wtMIC-1 e polipeptídeos MIC-1 com extensão N-terminal ambos induziram a fosforilação de ERK1/2 em células estáveis de BHK21hGFRAL-IRES-hRET (Tabela 8). Pode concluir-se a partir dos resultados que
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120 /209 o complexo temário de MIC-1, GFRAL e RET fosforila proteína tirosina quinase RET para induzir atividades in vivo de MIC-1 através de vias de sinalização compreendendo via de ERK/MAPK por fosforilação de ERK1/2. [00318] Os resultados da análise dos polipeptideos MIC-1 com uma extensão N-terminal usando BHK21-hGFRAL-IRES-hRET são mostrados na Tabela 8. Somente polipeptideos MIC-1 com extensões N ou somente análogos de MIC-1 com mutações em sequência alcançaram atividade in vitro igual ou mesmo superior a wtMIC-1. Além disso, a combinação de extensão N e na mutações em sequência também pode alcançar a atividade semelhante.
Tabela 8: Atividade in vitro
SEQ IN NO Estrutura pERK EC50 (nM) Emax (%)
SEQ ID NO:1 MIC-1(SEQID NO:1) 0,3 100%
SEQ ID NO:73 MIC-1(R2A, N3E) 0,3 100%
SEQ ID NO:74 MIC-1(R2A,N3E,A54E) 0,3 100%
SEQ ID NO:75 MIC-1(R2A,N3E,A81E) 0,3 100%
SEQ ID NO:76 MIC-1(R2A,N3E,H18E) 0,5 100%
SEQ ID NO:77 MIC-1(R2A,N3E,K69E) 0,5 100%
SEQ ID NO:78 MIC-1 (R2 A,N3E,K107E) 0,3 100%
SEQ ID NO:79 MIC-1(R2A,N3E,L68E) 0,8 100%
SEQ ID NO:80 MIC-1 (R2 A,N3E, A47E) 0,4 100%
SEQ ID NO:81 MIC-l(R2A,N3E,L105E) 0,7 100%
SEQ ID NO:82 MIC-1(R2A,N3E,M57E) 0,3 70%
SEQ ID NO:83 MIC-1(R2A,N3E,P85E) 0,6 100%
SEQ ID NO:84 MIC-1(R2A,N3E,P11E) 0,4 100%
SEQ ID NO:85 MIC-1(R2A,N3E,R21E) 0,6 100%
SEQ ID NO:86 MIC-1(R2A,N3E,R53E) 0,4 100%
SEQ ID NO:87 MIC-1 (R2 A,N3E,R67E) 0,5 100%
SEQ ID NO:88 MIC-l(R2A,N3E,A30E) 0,7 100%
SEQ ID NO:89 AEEAES-MIC-l-Vl-3 0,3 100%
SEQ ID NO:90 AES-MIC-l-Vl-3 0,3 100%
SEQ ID NO:91 (AEE)2AES-MIC-l-Vl-3 0,4 100%
SEQ ID NO:92 (GEPS)5-MIC-1(SEQ ID NO:1) 0,5 100%
SEQ ID NO:93 SPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPG-MIC-1 (SEQ ID NO:1) 0,4 100%
SEQ ID NO:94 (AEE)6AES-MIC-1 0,8 100%
SEQ ID NO:95 (AEE)5AES-MIC-l-Vl-3 0,5 100%
SEQ ID NO:96 (AEE)3AES-MIC-l-Vl-3 0,5 100%
SEQ ID NO:97 AASPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG-MIC1(SEQID NO:1) 0,4 100%
SEQ ID NO:98 TSESATPESGPGTSESATPESGPG-MIC1(R2A,N3E) 0,3 100%
SEQ ID NO:99 AASPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPG-MIC-1 Δ1-3 0,7 100%
SEQ ID NO: 100 AAPEDEETPEQEGSGSGSGSGS-MIC-l-Al-3 0,5 100%
SEQ ID NO: 101 AAPEDEETPEQE-MIC-1 -Δ 1 -3 0,5 100%
SEQ ID NO: 102 AAPDEGTEEETEGSGSGSGSGS-MIC-l-Al-3 0,5 100%
SEQ ID NO: 103 SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG-MIC-l-Al-3 0,7 100%
SEQ ID NO: 104 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 -3 0,4 100%
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SEQ IN NO Estrutura pERK EC50 (nM) Emax (%)
SEQ ID NO: 105 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 -3(M57E) 0,6 60%
SEQ ID NO: 106 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 -3(M57L) 0,6 100%
SEQ ID NO: 107 A(GPEQGQEP)3-MIC-1 -Δ1 -3 0,8 100%
SEQ ID NO: 108 SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS- ΜΚ>1-Δ1-3 0,4 100%
SEQ ID NO: 109 SEPATSGSETPGTSESATPESGPG TSTEPSEG- ΜΚ>1-Δ1-3 0,4 100%
SEQ ID NO: 110 (SEP ATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 -3(M86L) 0,4 100%
SEQ ID NO:111 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 -3(M57L, M86L) 0,4 100%
Eficácia in vivo
Exemplo 7: Efeito de polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal na ingestão de alimentos em ratos Sprague Dawley magros
[00319] A eficácia in vivo de polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal foi medido em ratos Sprague Dawley magros machos de 9-11 semanas de idade. Os animais foram injetados uma vez por dia com uma dose de 8nmol/kg por peso corporal 1-2 horas antes do início do período de escuro. Os compostos foram administrados subcutaneamente (l-4ml/kg) em solução tampão apropriada. As mudanças na ingestão de alimento foram medidas por sistemas de monitoramento automáticos de alimento (sistema BioDAQ e sistema HM2 para rato). No sistema BioDAQ os animais eram abrigados individualmente; e no sistema HM2 os animais eram abrigados em grupos com até 3 animais por gaiola. Cada composto foi testado em animais n=4-8. Os animais foram aclimatados por no mínimo 7 dias antes da experiência. Os dados coletados são expressos como a ingestão de alimento diária (ingestão de alimento 24 horas) medida do início de cada fase de escuro de 12 horas diária à fase do dia seguinte escura. As mudanças diárias na ingestão de alimento em resposta ao composto administrado foram calculadas subtraindo a ingestão de alimento diária da média do grupo do veículo da entrada de alimento diária da média do grupo do tratamento. As alterações foram consideradas significativas se p<0,l usando um teste t de Student bicaudal. Os resultados são expressos como a redução máxima na ingestão de alimentos em comparação com o veículo (porcentagem) registada durante o período de estudo. Dados também são expressos como a redução acumulada na
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122 /209 ingestão de alimentos que, como a soma das reduções diárias significativas (p < 0,1) na ingestão de alimentos (porcentagem) durante o período de estudo.
Tabela 9: Efeito das doses diárias (8 nmol/kg) de polipeptídeos
MIC-1 com uma extensão N na ingestão de alimentos em ratos SD magros.
SEQ ID NO Estrutura Máximo Eficácia (%) Acumulada Eficácia (%)
SEQ ID NO:1 MIC-1(SEQ ID NO:1) 68 361
SEQ ID NO:77 MIC-1 (R2A,N3E,K69E) 46 247
SEQ ID NO:82 MIC-1 (R2A,N3E,M57E) 72 395
SEQ ID NO:92 (GEPS)5-MIC-1(SEQ ID NO:1) 84 469
SEQ ID NO:97 AASPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG-MIC1(SEQ ID NO:1) 90 456
SEQ ID NO:98 rSESATPESGPGTSESATPESGPG-MIC1(R2A,N3E) 90 503
SEQ ID NO: 100 AAPEDEETPEQEGSGSGSGSGS -MIC-1 -Δ 1 -3 84 446
SEQ ID NO: 101 AAPEDEETPEQE-MIC-1-Δ1 -3 75 408
SEQ ID NO: 102 AAPDEGTEEETEGSGSGSGSGS-MIC-1 -Δ 1 3 82 423
SEQ ID NO: 103 SEPATSGSETPGTSTEPESGS APG-MIC-1 Δ1-3 82 452
SEQ ID NO: 104 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1 -Δ 1 -3 93 509
SEQ ID NO: 105 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1 -Δ 1 -3(M57E) 97 532
SEQ ID NO: 106 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1 -Δ 1 -3(M57L) 99 532
SEQ ID NO: 107 A(GPEQGQEP)3-MIC-1 -Δ 1 -3 81 395
SEQ ID NO: 108 SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS- ΜΚ>1-Δ1-3 80 448
SEQ ID NO: 165 A(GPEQGQEPGEPQGQEPQPGEPEGQ)- ΜΚ>1-Δ1-3 78 382
SEQ ID NO: 109 SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSE G-MIC-l-Al-3 82 445
SEQ ID NO: 110 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1-Δ1 -3 (M86L) 70 398
SEQ ID NO:111 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1 -Δ 1 -3 (M57L/M86L) 85 462
SEQ ID NO: 112 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1 -Δ 1 -3 (M57E/H66E) 80 369
SEQ ID NO: 113 (SEPATSGSETPG)2-MIC-1 -Δ 1 -3 (M57E/R67E) 67 266
Nota: * significa que a dose de administração é 4nmol/kg em peso corporal.
[00320] Os inventores surpreendentemente descobriram que estes polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N não só aumentaram a solubilidade das moléculas, mas também resultaram em eficácia igual ou até melhor do que wtMIC-1 (Tabela 9). Por exemplo, compostos de acordo com SEQ ID NO: 105 e SEQ ID NO: 106 tinham uma eficácia in vivo máxima e acumulada que era 40-50% maior do que wtMIC-1 com administração subcutânea. O aumento na eficácia foi adicionalmente associado a um aumento na
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123 /209 solubilidade uma vez que os compostos de acordo com as SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 e SEQ ID NO: 106 apresentaram solubilidade elevada e uma eficácia in vivo significativamente maior em comparação com wtMIC-1. Esta correlação não parece ser explicada por alterações no Emax in vitro uma vez que todos os compostos na Tabela 8, exceto o composto de acordo com SEQ ID NO: 105, tinha um Emax comparável com wtMIC-1. Na verdade, o composto da SEQ ID NO: 105 tinha um Emax menor do que wtMIC-1 e foi ainda mais eficaz do que wtMIC-1 in vivo. Além disso, as potências in vitro foram comparáveis entre compostos posto que nenhum dos compostos tinha um EC50 que diferia de wtMIC-1. Assim, a associação entre eficácias in vivo aumentadas e a solubilidade aumentada é surpreendente e não pode ser simplesmente explicada por mudanças na ativação aumentada do receptor in vitro.
Exemplo 8: Expressão de MIC-1 e eficiência de remoção de Met de diferentes blocos de 12-mers
[00321] No corpo humano, N-Formil-Metionina é reconhecida pelo sistema imune como material estranho, ou como um sinal de alarme liberado por células danificadas, e estimula o corpo a lutar contra infecção potencial (Pathologic Basis of Veterinary Disease5: Pathologic Basis of Veterinary Disease, de James F. Zachary, M. Donald McGavin). Além disso, a Metionina é um resíduo instável que pode facilmente ser oxidado. Consequentemente, a eficiência de clivagem de N-Met é muito importante para a expressão de MIC-1.
[00322] Há 4 tipos diferentes de 12mers, e todos eles são compostos de 3 Ser, 2 Pro, 2 Gly, 2 Thr, 2 Glu e 1 Ala. No entanto, os 12 resíduos em cada repetição são organizados de diferentes maneiras.
[00323] Pouco é conhecido sobre os efeitos de diferentes 12mers sobre o nível de expressão e a eficiência de clivagem de N-Met. Assim, a investigação sistemática de polipeptídeos MIC-1 iniciando com I2mers
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124 /209 únicos e duplos, respectivamente, é bastante necessária.
[00324] O cDNA do polipeptídeo MIC-1 com extensão N-terminal foi subclonado em um vetor derivado de pETllb. A superexpressão dos polipeptídeos MIC-1 com uma extensão N-terminal como corpos de inclusão ou proteína solúvel foi induzida em E. coli por 0,5 mM de isopropil β-dtiogalactosídeo (IPTG) quando a densidade celular atingiu um OD600 de 1,0. Depois de contínuo crescimento em TB por 20h a 37 ° C, as células foram colhidas e sonicadas no tampão A (20 mM Tris, pH 8,0). A mistura resultante foi centrifugada a 10.000 g por 20 min e analisada por LC/MS e SDS-PAGE para confirmar o peso molecular.
[00325] A fermentação foi executada em processo semidescontínuo em meio definido quimicamente como suplemento. O rendimento de fermentação dependeu largamente de diferentes compostos, que variaram delg/la8g/l de composto para composto.
[00326] Compostos projetados para o teste de 12mer único e o resultado são mostrados na Tabela 10 e na Figura 1.
Tabela 10: Eficiência de remoção de Met inicial de blocos de construção de 12-mer únicos ___________________________________
Extensão N Sequência N-aa Polipeptídeo MIC1 Eficiência de clivagem de N-Met (%)
12mer-l SPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 166) MIC-1 Δ1-3 N/A
12mer-2 TSESATPESGPG (SEQ ID NO: 167) 0
12mer-3 TSTEPSEGSAPG (SEQ ID NO: 168) 0
12mer-4 SEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 169) 100
N/A: significa que MIC-1 com a extensão N-terminal não expressou em E. coli.
[00327] Compostos portando 12mers duplos são listados na Tabela 11, e os resultados são mostrados também (ver Tabela lie Figura 2).
Tabela 11: Eficiência de remoção de Met inicial de blocos de construção de 12-mer duplos_______________________________
SEQ ID NO Extensão N Sequência N-aa Polipeptídeo MIC-1 Eficiência de clivagem de NMet (%)
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N/A 12mer-(l+l) SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 170) MIC-1 Δ1-3 N/A
N/A 12mer-(l+3) SPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG (SEQ ID NO: 171) N/A
N/A 12mer-(l+4) SPAGSPTSTEEGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 172) N/A
N/A 12mer-(2+l) TSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 173) 58,1
N/A 12mer-(2+2) TSESATPESGPG- TSESATPESGPG (SEQ ID NO: 174) 30,0
N/A 12mer-(2+3) TSESATPESGPG- TSTEPSEGSAPG (SEQ ID NO: 175) 58,5
N/A 12mer-(2+4) TSESATPESGPG- SEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 176) 64,5
N/A 12mer-(3+l) TSTEPSEGSAPG- SPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 177) 10,0
N/A 12mer-(3+2) TSTEPSEGSAPG- TSESATPESGPG (SEQ ID NO: 178) 1,0
N/A 12mer-(3+3) TSTEPESGSAPG- TSTEPESGSAPG (SEQ ID NO: 179) 26,4
N/A 12mer-(3+4) TSTEPSEGSAPG- SEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 180) 10,5
N/A 12mer-(4+l) SEPATSGSETPG- SPAGSPTSTEEG (SEQ ID NO: 12) N/A
SEQ ID NO: 182 12mer-(4+2) SEPATSGSETPG- TSESATPESGPG (SEQ ID NO: 13) 100
SEQ ID NO: 103 12mer-(4+3) SEPATSGSETPG- TSTEPSEGSAPG (SEQ ID NO: 14) 100
SEQ ID NO: 104 12mer-(4+4) SEPATSGSETPGSEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 181) 100
N/A: significa que o polipeptídeo MIC-1 com a extensão N-terminal não expressou em E. coli.
[00328] Em conclusão, extensões N começando com o bloco de 12mer-l puderam ser expressas em E. coli. Para os outros blocos de 12mer, expressão da proteína foi alcançada mas apenas 12mer-4 como sequência inicial resultou na divagem completa da metionina. Além disso, a eficiência de divagem de N-met da série 12mer-2 é melhor que a da série 12mer-3.
Exemplo 9: Nível da expressão e razão do corpo de inclusão do
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126 /209 polipeptídeo MIC-1 com extensão N de 2* on 2,5*12mer (1) Expressão de polipeptídeo MIC-lcowz extensão N de 2,5*12mer
[00329] Veja o Exemplo 8 para método de produção da proteína. Os resultados são mostrados na Tabela 12, Figura 3 e Figura 4.
Tabela 12: Teste de construtos e produção de proteína para
2,5*12mer___________________________________________________
SEQ ID NO Extensão N Sequência N-aa Polipeptídeo MIC-1 UPLC Frasco Agitador (g/L/10OD) UPLC Fermentador (g/L/10OD)
SEQ ID NO: 200 12mer(4+2+1.6 últimos) SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSTEEG (SEQ ID NO:28) MIC-1 Δ1-3 N.D.
SEQ ID NO: 201 12mer(4+2+2,6) SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSESAT (SEQ ID NO: 19) 0,197
SEQ ID NO: 202 12mer(4+2+2,6 inter) SEPATSGSETPG TSESATPESGPG ESATPE (SEQ ID NO: 183) 0,206
SEQ ID NO: 108 12mer(4+2+3,6) SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSTEPS (SEQ ID NO:70) 0,367 0,374
SEQ ID NO: 203 12mer(4+2+3,6 inter) SEPATSGSETPG TSESATPESGPG STEPSE (SEQ ID NO: 184) 0,243
SEQ ID NO: 109 12mer(4+2+3,8) SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSTEPSEG (SEQ ID NO:71) 0,273 0,162
SEQ ID NO: 204 12mer(4+2+4,6) SEPATSGSETPG TSESATPESGPG SEPATS (SEQ ID NO:25) 0,373
SEQ ID NO: 205 12mer(4+3+1.6 últimos) SEPATSGSETPG TSTEPSEGSAPG TSTEEG (SEQ ID NO: 185) MIC-1 Δ1-3, M57L 0,195
SEQ ID NO: 206 12mer(4+3+2,6) SEPATSGSETPG TSTEPSEGSAPG TSESAT (SEQ ID NO: 186) 0,234
SEQ ID NO: 207 12mer(4+3+3,6) SEPATSGSETPG TSTEPSEGSAPG TSTEPS (SEQ ID NO: 187) 0,367
SEQ ID NO: 208 12mer(4+3+4,6) SEPATSGSETPG TSTEPSEGSAPG SEPATS (SEQ ID NO: 188) 0,324
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SEQ ID NO Extensão N Sequência N-aa Polipeptídeo MIC-1 UPLC Frasco Agitador (g/L/10OD) UPLC Fermentador (g/L/10OD)
SEQ ID NO: 209 12mer(4+4+1.6 últimos) SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG TSTEEG(SEQ ID NO: 189) MIC-1 Δ1-3, M57L 0,148
SEQ ID NO: 210 12mer(4+4+2,6) SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG TSESAT (SEQ ID NO: 190) MIC-1 Δ1-3 0,361
SEQ ID NO: 211 12mer(4+4+2,6 inter) SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG ESATPE (SEQ ID NO:191) N.D.
SEQ ID NO: 212 12mer(4+4+3,6) SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG TSTEPS (SEQ ID NO: 192) MIC-1 Δ1-3, M57L 0,262
SEQ ID NO: 213 12mer(4+4+3,6 inter2) SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG STEPSE (SEQ ID NO: 193) MIC-1 Δ1-3 N.D.
SEQ ID NO: 214 12mer(4+4+4,6) SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG SEPATS (SEQ ID NO: 194) 0,330
[00330] Notas: .6 significa os primeiros 6aa de 12mers, último significa os últimos 6aa de 12mers, inter significa os 6aa internos de 12mers. “N.D. significa não detectado.
[00331] Embora o 12mer estendido (6aa) esteja localizado a 24aa do N-terminal, os níveis de expressão do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal variam muito entre os diferentes grupos. E claro que o fragmento de 12mer-l não é adequado para a expressão, o que é consistente com os resultados anteriores. Os níveis de expressão médios de 12mer-(4+_+3,6) e (4+_+4,6) são relativamente mais elevados que outros.
(2) Razão de corpo de inclusão de polipeptídeo MIC-1 com extensão N de 2* ou 2,5*12mer
[00332] Para a produção de proteína em larga escala, o corpo de inclusão é geralmente considerado como uma boa escolha principalmente devido a suas propriedades aprimoradas de ajuste, que incluem principalmente: nível elevado de expressão, etapa de recuperação simples e pureza elevada, resistente a protease e boa estabilidade de processo.
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[00333] Os polipeptideos MIC-1 com uma extensão N-terminal podem ser expressos tanto em corpo de inclusão quanto em forma solúvel, o que é principalmente dependente do pi e do comprimento de extensão do composto. Os resultados são mostrados na Tabela 13 e Figura 4.
Tabela 13: Solubilidade em citosol celular e seus valores de pi
SEQ ID NO Extensão N Sequências da extensão N Polipeptídeo MIC-1 Razão do corpo de inclusão* Valores de pi
SEQ ID NO: 104 12mer-(4+4) SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 181) MIC-1 Δ1-3 100% 5,8
SEQ ID NO: 108 12mer-(4+2+3,6) SEPATSGSETPG TSESATPESGPGT STEPS (SEQ ID NO:70) 100% 5,5
SEQ ID NO: 109 12mer-(4+2+3,8) SEPATSGSETPG TSESATPESGPGT STEPSEG (SEQ ID NO:71) 90% 5,2
SEQ ID NO: 215 12mer-(4+2)GPEQGPEQ SEPATSGSETPG TSESATPESGPGG PEQGPEQ (SEQ ID NO: 195) 90% 5,2
SEQ ID NO: 216 12mer-(4+2)GEPSGEPS SEPATSGSETPG TSESATPESGPG GEPSGEPS (SEQ ID NO: 196) 95% 5,2
SEQ ID NO: 112 12mer-(4+4) M57E, H66E SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 181) 70% 5,0
SEQ ID NO: 113 12mer-(4+4) M57E, R67E SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 181) 70% 5,0
SEQ ID NO: 217 12mer-(três repetições) SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSTEPSEGSAPG (SEQ ID NO: 197) MIC-1 -des-N3 85% 5,4
SEQ ID NO: 218 12mer-(quatro repetições) SEPATSGSETPG TSESATPESGPG TSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPG (SEQ ID NO: 198) MIC-1-des-N3 30% 5,1
SEQ ID NO: 219 12mer-(cinco repetições) SPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTS TEPSEGSAPGSPA GSPTSTEEGTSTE PSEGSAPG (SEQ ID NO: 199) MIC-1 0% 4,8
SEQ ID NO: 220 12mer-(4+4) M57E, H66E, R67E SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (SEQ ID NO: 181) MIC-1 Δ1-3 0% 4,7
SEQ ID NO: 221 12mer-(4+2+3,6) M57E, R67E SEPATSGSETPG TSESATPESGPGT STEPS (SEQ ID NO:70) 0% 4,7
Nota:* O número aqui é estimado por SDS-PAGE.
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[00334] A solubilidade dos polipeptideos MIC-1 com mutações em sequência é mostrada na Tabela 14 e Figura 5 (a sequência polipeptídica MIC-1 é MIC-1 Δ1-3).
Tabela 14: Solubilidade do polipeptídeo MIC-1 com mutações em sequência____________________________________________________
Extensão N M em sequência Solubilidade na célula
SEPATSGSETPG SEPATSGSETPG (12mer-(4+4)) (SEQ ID NO: 181) M57E IBs
M57E/H66E Parcialmente solúvel
M57E/H66E/R67E Totalmente solúvel
SEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPS (12mer-(4+2+3,6)) (SEQ ID NO:7Q) M57E N.D.
M57E/H66E Totalmente solúvel
M57E/H66E/R67E Totalmente solúvel
[00335] Polipeptideos MIC-1 iniciando com 12mer- (4+2+_), (4+4+_) e - (4+3+_) foram investigados em sua habilidade para expressar corpo de inclusão. Demonstrou-se que a razão do corpo de inclusão é >90% quando pl>5,l. Além disso, os polipeptideos MIC-1 com mutações em sequência M57E/H66E expressaram principalmente frações solúveis.
Exemplo 9: Produção de polipeptideos MIC-1 com uma extensão Nterminal incluindo uma mutação de Cys
[00336] Para aumentar a meia-vida de polipeptideos MIC-1 com uma extensão N-terminal, diferentes cadeias de ácidos graxos que foram usadas para prolongamento foram conjugadas à extensão N-terminal através da alquilação mediada pela Cisteína introduzida pela mutação sítio-dirigida. A posição para a mutação de Cys foi sistematicamente mapeada e os polipeptideos MIC-1 resultantes com uma extensão N-terminal foram redobrados e purificados de acordo com os métodos descritos no Exemplo 8.
1. Introdução de uma mutação de Cys à extensão N-terminal para o prolongamento
[00337] O total de 20 mutantes de cisteína diferentes foram gerados por mutações sítio-dirigidas usando método PCR e os construtos estão
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130 /209 listados como Tabela 15.
Tabela 15: Construtos com mutação de Cys em posições diferentes
Construtos (SEQ ID NO) Extensão N- terminal Mutação de Cys Polipeptídeo MIC-1 Razão do corpo de inclusão ★ Valores de pi
SEQ ID NO: 301 SEPATCGSETPG TSESATPESGPG -TSTEPS (SEQ ID NO: 223) S(-25)C MIC-1, des-N3 100% 5,7
SEQ ID NO: 302 SEPATSGCETPG TSESATPESGPG -TSTEPS(SEQ ID NO: 224) S(-23)C 100% 5,7
SEQ ID NO: 288 SEPCTSGSETPGTSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 225) A(-29)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 291 SEPATCGSETPG TSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 226) S(-27)C 100% 5,4
SEPATSCSETPGTSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 227) G(-26)C 100% 5,4
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 225) A(-29)C MIC-1, des- N3, M57L 100% 5,4
SEPATSCSETPGTSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 227) G(-26)C 100% 5,4
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 228) A(-29)C MIC-1, des- N3, M57L, M86L 100% 5,4
SEPACSGSETPG TSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 229) T(-28)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 289 SEPATSCSETPGTSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 227) G(-26)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 303 SEPATSGCETPG TSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 230) S(-25)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 304 SEPATSGSECPG TSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 231) T(-23)C 100% 5,4
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SEQ1dNO:'3Õ5 §ú>77kGSETPCTSESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 232) G(-21)C Fòõ%........................
SEQ ID NO: 306 SEPATSGSETPG TCESATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 233) S(-19)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 307 SEPATSGSETPG TSECATPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 234) S(-17)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 292 SEPATSGSETPG TSESACPESGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 235) T(-15)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 308 SEPATSGSETPG TSESATPECGPG -TSTEPSEG(SEQ ID NO: 236) S(-12)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 309 SEPATSGSETPG TSESATPESCPGTSTEPSEG(SEQ ID NO: 237) G(-11)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 310 SEPATSGSETPG TSESATPESGPG -TSCEPSEG(SEQ ID NO: 238) T(-6)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 293 SEPATSGSETPG TSESATPESGPG -TSTEPCEG(SEQ ID NO: 239) S(-3)C 100% 5,4
SEQ ID NO: 316 GEQPCEQPGEQ PGEQPGEQPGE QPGEQP (SEQ ID NO: 317) G(-24)C MIC-1 100% 5,3
N.A. = Indisponível.
*: O número entre colchetes (da coluna mutação de Cys ) significa a distância entre Cys e o aminoácido Nterminal do polipeptídeo MIC-1.
[00338] Ele mostra que o nível de expressão do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal com uma mutação de Cys é semelhante àqueles sem mutação de Cys.
2. Redobramento e purificação do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal incluindo uma mutação de Cys
[00339] O homodímero de WtMIC-1 contém total de 9 pares de ligações dissulfeto e, em teoria, a introdução de uma nova cisteína irá
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132 /209 perturbar a ligação de dissulfeto original, correspondendo ao embaralhamento da ligação de dissulfeto, o que podería diminuir ainda mais o rendimento de redobramento. Enquanto em nossos experimentos, é surpreendente constatar que estes mutantes de Cys listados foram testados no mesmo tampão de redobramento usado para redobramento de wtMIC-1 e mostraram rendimento de redobramento semelhante (~ 50% a 60%) conforme descrito para wtMIC-1 ou polipeptídeo MIC-1 manipulado por solubilidade com uma extensão Nterminal.
3. Solubilidade dependente de pH e solubilidade máxima de polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal incluindo uma mutação de Cys [00340] A solubilidade dependente de pH e a solubilidade máxima foram determinadas pelo mesmo método conforme descrito no Exemplo 4. Os resultados são mostrados na Tabela 16 e Tabela 17.
Tabela 16: Teste de solubilidade dependente de pH do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal incluindo uma mutação de Cys
SEQ ID NO Estrutura pH
3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0
SEQ ID NO: 288 SEPCTSGSETP GTSESATPESG PGTSTEPSEGMIC-1-A3 8,81 4,22 1,34 5,18 13,52 15,65 15,1 15,84 15,97
SEQ ID NO: 289 SEPATSCSETP GTSESATPESG PGTSTEPSEGMIC-1 (M57L, M86L) 7,91 5,12 1,37 5,91 13,59 15,62 15,15 15,83 16,47
SEQ ID NO: 316 GEQPCEQPGEQ PGEQPGEQPGE QPGEQP-MIC-1 6,24 3,14 2,54 4,71 9,43 13,24 14,21 15,21 15,2
Tabela 17: Teste de determinação de solubilidade máxima do polipeptídeo MIC-1 com uma extensão N-terminal incluindo uma
mu tação de Cys
SEQ ID NO Estrutura Solubilidade máxima (mg/ml)
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SEQ ID NO: 288 SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG -MIC-1-A3 36,1
SEQ ID NO: 289 SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG -MIC-1 (M57L, M86L) 38,4
SEQ ID NO: 316 GEQPCEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPMIC-1 32,1
[00341] Pode ser visto que uma mutação de Cys não afeta a solubilidade melhorada obtida pela adição de uma extensão de aminoácido Nterminal a um polipeptídeo MIC-1.
Exemplo 10: Preparação de prolongadores para compostos MIC-1 Exemplo 10.1: Preparação de ácido r7-[(S)-l-carboxi-3-(2-{2-[(2-{2-[(4formilbenzilcarbamoil)metoxi]etoxi}etilcarbamoil)metoxi]etoxi}etilcarbamoil)propilcarbamoil]heptadecanoico
Figure BR112019024102A2_D0139
(Fórmula A)
[00342] O carbamato de t-Bu-N-(4-Formilbenzil) (100 mg) foi tratado com TFA/DCM (1:1) por Ih. A mistura foi concentrada in vacuo e coconcentrada com tolueno (duas vezes). O resíduo foi dissolvido em THF (2,5 ml) e foi adicionada uma solução de ácido 17-((S)-l-carboxi-3-{2-[2-({2-[2(2,5-dioxopirrolidin-1-iloximicarbonil-metoxi)etoxi]etilcarbamoil}metoxi)etoxi]etilcarbamoil}propilcarbamoil)heptadecanoi co (320 mg, preparado conforme descrito anteriormente em W02009/083549) em THF (5 ml). DIPEA (0,5 ml) foi adicionado lentamente. Após 130 min, a mistura foi concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em EtOAc e IN HC1. A camada orgânica foi extraída com IN HC1 e salmoura. A camada orgânica foi seca (NazSCU) e concentrada in vacuo para transformar o composto do título em um sólido branco, que foi usado sem purificação
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134 /209 adicional. Rendimento de 234 mg (72%) [00343] LCMS2: Massa teórica: 851,0 encontrado: 851,5 (M+l).
Exemplo 10.2 (C16): Preparação de ácido 16-[[(lS)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-l-carboxi-4-oxo-butil]amino]-16-oxohexadecanoico
Figure BR112019024102A2_D0140
(Fórmula B)
Protocolo sintético de fase sólida:
[00344] Uma solução de N-(benziloxicarboniloxi)succinimida (ZOSu, 100 g, 401 mmol) em diclorometano (500 mL) foi adicionada gota a gota durante 2 horas a uma solução de etilenodiamina (1, 189 mL, 2,81 mol) em diclorometano (750 mL). Após 30 minutos, a suspensão foi filtrada e os sólidos lavados com diclorometano. O filtrado foi evaporado até secar e o resíduo diluído com tolueno (1,00 L) e água (0,50 L). A mistura resultante foi filtrada e o filtrado foi separado para gerar duas fases. A fase aquosa continha o produto; portanto, foi extraída com diclorometano (2 x 250 mL). Todas as fases orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio anidro, filtradas e concentradas in vacuo. O resíduo foi diluído com tolueno (750 mL) e extraído com ácido clorídrico aquoso a 2 M (500 mL) e ácido clorídrico aquoso a 1 M (100 mL). As fases aquosas ácidas foram combinadas e basificadas com uma solução de hidróxido de sódio (60,0 g, 1,50 mol) em água (90 mL). A mistura resultante foi extraída com diclorometano (4 x 200
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135 /209 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada, concentrada in vacuo e diluída com hexanos (200 mL). Uma solução de cloreto de hidrogênio em éter a 4 M (100 mL, 400 mmol) foi adicionada à solução, a suspensão resultante foi concentrada in vacuo e diluída com hexanos (1,00 L). O sólido precipitado foi filtrado, lavado com hexanos e seco in vacuo para obter cloreto de éster benzílico de ácido (2-amino-etil)-carbâmico como pó branco.
[00345] Rendimento: 62,62 g (68%).
[00346] RF (SiO2, diclorometano/metanol 4:1): 0,25 (base livre).
[00347] Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, 80 °C, dH): 7,427,26 (m, 5 H); 5,16 (s, 2 H); 3,60 (t, 1=5,7 Hz, 2 H); 3,32 (t, 1=5,7 Hz, 2 H).
[00348] Uma resina de 2-clorotritil de 100-200 mesh e 1,7 mmol/g (3, 40,1 g, 68,1 mmol) foi deixada inchando em diclorometano seco (250 mL) durante 20 minutos. Uma solução de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-Ado-OH, 17,5 g, 45,4 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (30,1 mL, 173 mmol) em diclorometano seco (50 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada por 5 horas. A resina foi filtrada e tratada com uma solução de N,N-di-isopropiletilamina (15,8 mL, 90,8 mmol) em mistura de metanol/diclorometano (4:1, 250 mL, 2 x 5 min). Em seguida, a resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (2 x 250 mL), diclorometano (2 x 250 mL) e N,N-dimetilformamida (3 x 250 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em dimetilformamida (1x5 min, 1x10 min, 1 x 30 min, 3 x 250 mL). A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (3 x 250 mL), 2-propanol (2 x 250 mL) e diclorometano (300 mL, 2 x 250 mL). Uma solução de ácido {2-[2(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-Ado-OH, 26,3 g, 68,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-l-il)Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametilurônio (TCTU, 24,2 g, 68,1 mmol) e N,N-diisopropiletilamina (21,4 mL, 123 mmol) em N,N-dimetilformamida (140 mL) foi agitada por 1 hora. A resina foi filtrada e lavada com N,N
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136 /209 dimetilformamida (2 χ 250 mL), diclorometano (2 x 250 mL) e N,Ndimetilformamida (250 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em dimetilformamida (1x5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 250 mL). A resina foi lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (3 χ 250 mL), 2-propanol (2 x 250 mL) e diclorometano (300 mL, 2 x 250 mL). Uma solução de éster 1-terc-butrlico de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico (Fmoc-Glu-OtBu, 29,0 g, 68,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1 -il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (TCTU, 24,2 g, 68,1 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (21,4 mL, 123 mmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (140 mL) foi agitada por 1 hora. A resina foi filtrada e lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (2 x 250 mL), diclorometano (2 x 250 mL) e Ν,Ν-dimetilformamida (250 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em dimetilformamida (1x5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 250 mL). A resina foi lavada com Ν,Νdimetilformamida (3 x 250 mL), 2-propanol (2 x 250 mL) e diclorometano (300 mL, 2 x 250 mL). A solução de ácido 16-(terc-butoxi)-16oxohexadecanoico (23,3 g, 68,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-clorobenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (TCTU, 24,2 g, 68,1 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (21,4 mL, 123 mmol) em mistura de N,Ndimetilformamida/diclorometano (4:1, 200 mL) foi adicionada à resina. A resina foi agitada por 1 hora, filtrada e lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (3 x 250 mL), diclorometano (2 x 250 mL), metanol (2 x 250 mL) e diclorometano (350, 6 x 250 mL). O produto foi clivado da resina pelo tratamento com 2,2,2-trifluoetanol (250 mL) por 18 horas. A resina foi filtrada e lavada com diclorometano (2 x 250 mL), mistura de 2propanol/diclorometano (1:1, 2 x 250 mL), 2-propanol (250 mL) e diclorometano (3 x 250 mL). As soluções foram combinadas; o solvente evaporado e o produto bruto foram purificados por cromatografia flash em coluna (Silicagel 60, 0,040-0,060 mm; eluente: diclorometano/metanol 1:0
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9:1). Ácido (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-41,41-dimetil-10,19,24,39-tetraoxo3,6,12,15,40-pentaoxa-9,18,23-triazadotetracontanoico puro foi seco in vacuo e obtido como óleo amarelo espesso pálido.
[00349] Rendimento: 30,88 g (83%).
[00350] RF (SiO2, diclorometano/metanol 4:1): 0,30.
[00351] Espectro 1H NMR (300 MHz, CDC13, dH): 7,36 (t, 1=5,7 Hz, 1 H); 7,02 (t, J=5,4 Hz, 1 H); 6,55 (d, J=7,7 Hz, 1 H); 4,46 (m, 1 H); 4,18 (s, 2 H); 4,02 (s, 2 H); 3,83-3,36 (s, 16 H); 2,44-2,12 (s, 7 H); 2,02-1,86 (s, 1 H); 1,60 (s, 4 H); 1,47 (s, 9 H); 1,45 (s, 9 H); 1,36-1,21 (m, 20 H).
Método LC-MS 4:
[00352] Pureza: 100%
[00353] Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 50:50 a 100:0 + 0,l%FA): 3,60 min.
[00354] Obteve-se m/z, z= 1: 818,7 (M+H)+
[00355] Hexafluorofosfato de 2-(7-aza-lH-benzotriazol-l-il)-l,1,3,3tetrametilurônio (HATU, 11,4 g, 30,1 mmol) e trietilamina (8,77 mL, 62,9 mmol) foram posteriormente adicionados a uma solução de ácido (S)-22(terc-butoxicarbonil)-41,41-dimetil-10,19,24,39-tetraoxo-3,6,12,15,40pentaoxa-9,18,23-triazadotetracontanoico (22,4 g, 27,4 mmol) em diclorometano seco (110 mL). Trietilamina (5,72 mL, 41,0 mmol) foi adicionada a uma suspensão de cloridrato de éster benzílico de ácido (2amino-etil)-carbâmico (6,94 g, 30,1 mmol) em diclorometano seco (165 mL) e a mistura resultante foi adicionada à solução acima. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite e, em seguida, foi evaporada até secar. O resíduo foi redissolvido em acetato de etila (500 mL); lavado com ácido clorídrico aquoso a 1 M (2 x 200 mL), solução aquosa a 5% de carbonato de sódio (2 x 200 mL, separação de fases muito lenta), ácido clorídrico aquoso a 1 M (8 x 200 mL) e salmoura; seco sobre sulfato de sódio anidro e evaporado até secar in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em coluna
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138 /209 (Silicagel 60, 0,040-0,060 mm; eluente: diclorometano/metanol 95:5) para gerar éster terc-butílico de ácido 15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2benziloxicarbonilamino-etilcarbamoil)-metoxi]-etoxi}-etilcarbamoil)-1-tercbutoxicarbonil-propilcarbamoil]-pentadecanoico como óleo amarelo espesso pálido.
[00356] Rendimento: 23,84 g (88%)
[00357] RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,35
[00358] Espectro 1H NMR (300 MHz, CDC13, dH): 7,39-7,26 (m, 6 H); 7,19 (t, .1=6.3 Hz, 1 H); 6,91 (t, .1=5.7 Hz, 1 H); 6,52 (d, .1=7.5 Hz, 1 H); 5,83 (t, J=5,5 Hz, 1 H); 5,09 (s, 2 H); 4,41 (ddd, J=12,3, 4,6 e 4,3 Hz, 1 H); 3,99 (s, 2 H); 3,97 (s, 2 H); 3,71-3,30 (m, 20 H); 2,33-2,08 (m, 7 H); 1,971,83 (m, 1 H); 1,67-1,51 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,35-1,20 (m, 20 H).
Método LCMS 4
[00359] Pureza: 100%
[00360] Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 50:50 a 100:0 + 0,l%FA): 4,18 min
[00361] Obteve-se m/z, z= 1: 994,9 (M+H)+
[00362] Paládio em carbono (10%, 1,27 g, 1,20 mmol) foi adicionado a uma solução do composto acima (23,8 g, 24,0 mmol) em metanol (350 mL) e a mistura resultante foi hidrogenada à pressão normal por 4 horas. O catalisador foi filtrado e o filtrado, evaporado até secar. O resíduo foi evaporado várias vezes a partir de diclorometano a fim de remover resíduos de metanol e seco in vacuo para produzir (S)-l-amino-25-(tercbutoxicarbonil)-4,13,22,27-tetraoxo-6,9,15,18-tetraoxa-3,12,21,26tetraazadoetracontan-42-oato de terc-butila como um óleo incolor espesso. [00363] Rendimento: 20,50 g (99%).
[00364] RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,05.
[00365] Espectro 1H NMR (300 MHz, CDC13, dH): 7,54 (t, J=5,7 Hz,
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H); 7,41 (t, .1=5.6 Hz, 1 H); 7,14 (t, .1=5.5 Hz, 1 H); 6,68 (d, .1=7.5 Hz, 1 H); 5,25 (bs, 2 H); 4,39 (td, 1=8,3 e 4,2 Hz, 1 H); 4,01 (s, 4 H); 3,74-3,39 (m, 18 H); 2,96 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 2,34-2,06 (m, 7 H); 1,97-1,83 (m, 1 H); 1,68-1,50 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,43 (s, 9 H); 1,37-1,19 (m, 20 H).
Método LCMS 4
[00366] Pureza: 100%
[00367] Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 50:50 a 100:0 + 0,1% FA): 1,43 min
[00368] Obteve-se m/z, z=l: 860,8 (M+H)+
[00369] N,N-di-isopropiletilamina (4,98 mL, 28,6 mmol) foi adicionada a uma solução da amina acima (6, 20,5 g, 23,8 mmol) em diclorometano seco (290 mL) a -30 °C sob argônio. Brometo de bromoacetila (2,48 mL, 28,6 mmol) foi adicionado gota a gota e a solução resultante foi agitada a -30 °C por mais 3 horas. O banho de resfriamento foi removido, a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora, e então o solvente foi removido in vacuo. O resíduo foi redissolvido em acetato de etila (450 mL) e lavado com solução aquosa a 5% de ácido cítrico (300 mL). As fases foram separadas dentro de 1 hora. A camada orgânica foi lavada com água (300 mL) e a emulsão resultante foi deixada separando durante a noite para obter 3 fases. A camada aquosa clara foi removida e as 2 fases residuais foram agitadas com solução aquosa saturada de brometo de potássio (100 mL). As fases foram deixadas separando durante a noite, a aquosa foi então removida e a orgânica seca sobre sulfato de sódio anidro. O solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia flash em coluna (Silicagel 60, 0,040-0,060 mm; eluente: diclorometano/metanol 95:5) para gerar (S)-lbromo-28-(terc-butoxicarbonil)-2,7,16,25,30-pentaoxo-9,12,18,21-tetraoxa3,6,15,24,29-pentaazapentatetracontan-45-oato de terc-butila como um sólido incolor.
[00370] Rendimento: 19,46 g (83%).
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[00371] RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,25
[00372] Espectro 1H NMR (300 MHz, CDC13, dH): 7,46 (m, 1 H); 7,33 (t, .1=5.9 Hz, 1 H); 7,21 (t, J=5,1 Hz, 1 H); 6,92 (t, .1=5.2 Hz, 1 H); 6,50 (d, 1=7,5 Hz, 1 H); 4,41 (ddd, J=12,2, 4,5 e 4,2 Hz, 1 H); 4,01 (s, 4 H), 3,85 (s, 2 H); 3,75-3,40 (m, 20 H), 2,36-2,08 (m, 7 H); 1,99-1,84 (m, 1 H); 1,681,51 (m, 4 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,38-1,19 (m, 20 H) Método LCMS 4
[00373] Pureza: 100%
[00374] Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 50:50 a 100:0 + 0,1% FA): 3,51 min.
[00375] Obteve-se: m/z, z= 1: 980,9, 982,9 (M+H)+
[00376] O composto acima (19,5 g, 19,8 mmol) foi dissolvido em ácido trifluoroacético (120 mL) e a solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1,5 hora. O ácido trifluoroacético foi removido in vacuo e o resíduo foi evaporado a partir de diclorometano (6 x 200 mL). Éter dietílico (200 mL) foi adicionado ao resíduo oleoso e a mistura foi agitada durante a noite para obter uma suspensão. O produto sólido foi filtrado, lavado com éter dietílico e hexanos e seco in vacuo para gerar o produto titular ácido 15-{(S)-l-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2Bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi} -etoxi)etilcarbamoil]metoxi} etoxi)etilcarbamoil]propil carbamoil}pentadecanoico como um pó branco.
[00377] Rendimento: 16,74 g (97%).
[00378] Espectro 1H NMR (300 MHz, AcoD-d4, dH): 4,61 (dd, J=8,8 e 4,8 Hz, 1 H); 4,12 (s, 2 H), 4,10 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,77 -3,39 (m, 20 H), 2,49-2,18 (m, 7 H); 2,16-1,04 (m, 1 H); 1,71-1,56 (m, 4 H), 1,30 (bs, 20 H) Método LCMS 4:
[00379] Pureza: 100%
[00380] Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 50:50 a 100:0 + 0,l%FA): 3,51 min
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[00381] m/z teórico, z=l: 869,8, Obteve-se: m/z, z=l: 868,7, 870,7
Exemplo 10.3 (C14): Preparação de ácido 14-[[(lS)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-l-carboxi-4-oxo-butil]amino]-14-oxotetradecanoico
Figure BR112019024102A2_D0141
(Fórmula C)
[00382] Ácido 13-{(S)-l-carbóxi-3-[2-(2-{[2-(2-{ [2-(2bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi} -etoxi)etilcarbamoil]metoxi }etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil }tridecanoico foi preparado pelo mesmo método que o descrito no Exemplo 10.2, resultando em um óleo amarelo espesso.
[00383] Espectro 1H NMR (300 MHz, AcoD-d4, dH): 4,61 (dd, J=8,9 e4,9 Hz, 1 H); 4,13 (s, 2 H); 4,11 (s, 2H); 3,96 (s, 2 H); 3,77-3,40 (m, 20 H); 2,49-2,18 (m, 7 H); 2,16-2,07 (m, 1 H); 1,70-1,56 (m, 4 H); 1,31 (bs, 16 H).
Método LCMS 4:
[00384] Pureza: 100% (ELSD)
[00385] Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,l%FA): 2,94 min
[00386] m/z teórico, z=l: 841,9, Obteve-se: m/z, z=l: 841,7, 843,7
Exemplo 10.4 (C18): Preparação de
Ácido 18-[ [(1S)-4- [2-[2- [2- [2- [2- [2- [2- [(2-bromoacetil)amino]etilamino] -2oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-l-carboxi-4-oxobutil]amino]-18-oxo-octadecanoico
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Figure BR112019024102A2_D0142
(Fórmula D)
Protocolo sintético de fase de solução:
[00387] Etapa 1: 18-[[(lS)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-aminoetilamino)-2oxo-etoxi] etoxi] etilamino] -2-oxo-etoxi] etoxi] etilamino] -1 -benziloxicarbonil4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoato benzílico A uma solução de etilenodiamina (8,5 ml) em DCM (80 ml) e trietilamina (5,2 ml) a 0 °C foi adicionada uma solução de 18-[[(lS)-l-benziloxicarbonil-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2(2,5 -dioxopirrolidin-1 -il)oxi-2-oxo-etoxi] etoxi] etoxi] etilamino] -2-oxoetoxi] etoxi] etilamino]-4-oxo-butil] amino]-1 8-oxo-octadecanoato benzílico (26 g), preparado conforme descrito em WO10029159, em DCM (320 ml) gota a gota por 75 min. Após agitação por 2 h o precipitado foi filtrado. Ao filtrado foi adicionado água (200 ml) e isopropanol (50 ml). A mistura foi extraída. A camada orgânica foi seca usando MgSO4. O MgSO4 foi removido por filtração e o filtrado foi seco in vacuo para obter o composto titular, 20,07 g ( 81%) LCMS: Massa teórica: 956,2; Obteve-se m/z, z=l: 957,0
[00388] Etapa 2: 18-[[(lS)-l-benziloxicarbonil-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2[(2-cloroacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi] etoxi] etilamino]-4-oxo-butil] amino]-18-oxo-octadecanoato benzílico [00389] Ácido cloroacético (0,19 g) foi dissolvido em DCM (15 ml). N-hidroxisuccinimida (0,22 g) e HC1 EDAC (0,42 g) foram adicionados. Após agitação por 2,5h 18-[[(lS)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-aminoetilamino)-2oxo-etoxi] etoxi] etilamino] -2-oxo-etoxi] etoxi] etilamino] -1 -benziloxicarbonil4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoato benzílico (1,5 g) em DCM (5 ml) foi adicionado. Após agitação durante a noite à RT, a mistura foi extraída com
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HC1 IM (2x20 ml) e água/salmoura 2:1 (30 ml). A camada orgânica foi seca (MgSO4), filtrada e concentrada in vacuo para obter um óleo claro, 1,37 g (84%)
[00390] LCMS: Massa teórica: 1032,7; Obteve-se m/z, z=l: 1033,1 [00391] Etapa 3: Ácido 18-[[(lS)-l-carbóxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2cloroacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil] amino]-18-oxo-octadecanoico
[00392] A uma solução de 18-[[(lS)-l-benziloxicarbonil-4-[2-[2-[2-[2[2-[2-[2-[(2-cloroacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil] amino]-18-oxo-octadecanoato benzrlico (10,5 g) em acetona (140 ml) foi adicionado 10% PD/C (1,0 g) após a aeração de nitrogênio. Após a hidrogenação por 6h, a mistura foi aquecida a 40-50°C antes da filtração. O precipitado no filtrado frio foi isolado e lavado com acetona e seco para obter o composto titular, 7,42 g (85%).
[00393] Etapa 4: Ácido 8-[[(lS)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1 -carboxi-4-oxo-butil] amino] -18-oxo-octadecanoico. [00394] A uma suspensão de ácido 18-[[(lS)-l-carbóxi-4-[2-[2-[2-[2[2-[2-[2-[(2-cloroacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico em acetona (60 ml) foi adicionado brometo de sódio (5 eq, 1,21 g). A mistura foi agitada à RT no escuro. Após 2 h mais brometo de sódio (10 eq, 2,41 g) foi adicionado. Após 2 dias mais brometo de sódio (5 eq, 1,21 g) foi adicionado. Após 5 dias, a mistura foi concentrada. À metade do resíduo foi adicionado DCM (30 ml), ácido ascórbico a 10% (20 ml) e 30 ml de água. À emulsão foi adicionado isopropanol (50 ml) e água (30 ml). A fase orgânica foi separada e lavada duas vezes com uma mistura de ácido ascórbico a 10% (20 ml) e isopropanol (10 ml). A camada orgânica foi seca (MgSO4), filtrada e concentrada para obter um óleo sólido, que foi cristalizada em acetona e
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144 /209 isolada por filtração para obter o composto titular contaminado com matéria prima, 0,80 g (72%).
[00395] LCMS: Massa teórica: 896,9. Obteve-se m/z, z=l: 898,9 (M+l)
Exemplo 10.5 (C12): Preparação de ácido 12-[[(lS)-l-carbóxi-4-[2-[2-[2[2- [2- [2- [(4-formilfenil)metilamino] -2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino] -2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]amino]-12-oxo-dodecanoico
Figure BR112019024102A2_D0143
(Fórmula E)
[00396] O composto foi preparado pelo mesmo método que o descrito para o exemplo 10.1.
[00397] Espectro 1H NMR (300 MHz, CDC13, dH): 7,39-7,29 (m, 1 H); 7,03-6,93 (m, 1 H); 6,59-6,51 (m, 1 H); 4,49-4,37 (m, 1 H); 4,15 (s, 2 H); 4,01 (s, 2 H); 3,78-3,39 (m, 16 H); 2,36-2,10 (m, 7H); 2,01-1,85 (m, 1 H); 1,68-1,50 (m, 4 H); 1,48-1,41 (m, 18 H); 1,34-1,22 (m, 12 H).
Exemplo 10.6: Preparação de ácido (2S)-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2 oxoetoxi]etoxi]etilamino]-5-oxo-2-(16-sulfohexadecanoilamino)pentanoico
Figure BR112019024102A2_D0144
(Fórmula F)
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145 /209
[00398] A resina de 2-Clorotritil 100-200 mesh 1,5 mmol/g (18,0 g, 27,0 mmol) foi deixada inchando em diclorometano seco (160 mL) durante 20 minutos. Uma solução de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 6,94 g, 18,0 mmol) e N,N-diisopropiletilamina (12,5 mL, 72,0 mmol) em diclorometano seco (100 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada durante a noite. A resina foi filtrada e tratada com uma solução de N,N-di-isopropiletilamina (4,12 mL, 23,7 mmol) em mistura de metanol/diclorometano (4:1, 2 x 5 min, 2 x 100 mL). Em seguida, a resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (2 x 100 mL), diclorometano (2 x 100 mL) e N,N-dimetilformamida (3 x 100 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em N,Ndimetilformamida (1x5 min, 1 x 30 min, 2 x 100 mL). A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (3 x 100 mL), 2-propanol (2 x 100 mL) e diclorometano (3 x 100 mL). Uma solução de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 10,4 g, 27,0 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato de 5-cloro-l((dimetilamino)(dimetiliminio)metil)-1 H-benzo[d] [1,2,3]triazol (TCTU, 9,60 g, 27,0 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (8,50 mL, 48,6 mmol) em N,Ndimetilformamida (100 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada por 2 horas. A resina foi filtrada e lavada com N,N-dimetilformamida (2 x 100 mL), diclorometano (2 x 100 mL) e N,N-dimetilformamida (3 x 100 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em N,Ndimetilformamida (1x5 min, 1 x 30 min, 2 x 100 mL). A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (3 x 100 mL), 2-propanol (2 x 100 mL) e diclorometano (3 x 100 mL). Uma solução de éster 1-terc-butílico de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico (Fmoc-gGluOtBu, 11,5 g, 27,0 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato de 5-cloro-l((dimetilamino)(dimetilamino)metil)-1 H-benzo[d][ 1,2,3]triazol (TCTU, 9,60 g, 27,0 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (8,50 mL, 48,6 mmol) em N,N
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146 /209 dimetilformamida (100 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada por 2 horas. A resina foi filtrada e lavada com N,N-dimetilformamida (2 x 100 mL), diclorometano (2 x 100 mL) e N,N-dimetilformamida (2 x 100 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em N,Ndimetilformamida (1x5 min, 1 x 30 min, 2 x 100 mL). A resina (2) foi lavada com N,N-dimetilformamida (3 x 100 mL), 2-propanol (2 x 100 mL) e diclorometano (3 x 100 mL). A resina foi dividida em 4 partes iguais e esta síntese continuou com um quarto da quantidade original (4,50 mmol). A solução de ácido 16-sulfo-hexadecanoico (3, 6,16 g, 17,2 mmol, a preparação é descrita no procedimento para síntese do composto REaD-22296, Lote n° 195-257-1), hexafluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)tripirrolidinofosfônio (PyBOP, 8,95 g, 17,2 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (6,00 mL, 34,0 mmol) em dimetilsulfóxido (180 mL) foi agitada por 4 horas. A resina foi filtrada e lavada com N,N-dimetilformamida (2 x 100 mL), N,Ndimetilformamida/água (2:1, 2 x 100 mL), dimetilsulfóxido (2 x 100 mL), água (2 x 100 mL) e N,N-dimetilformamida (3 x 100 ml). O produto foi clivado da resina pelo tratamento com l,l,l,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (80 mL) por 2 horas. A resina foi filtrada e lavada com diclorometano (4 x 100 mL). As soluções foram combinadas, os voláteis evaporados e ácido (S)-22(terc-butoxicarbonil)-lO, 19,24-trioxo-39-sulfo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23triazanonatriacontanoico (4) bruto foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional.
Rendimento: quantitativo (baseado em ELSD). [00399] Pureza LC-MS: 96%.
[00400] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 100 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,1% FA): 3,07 min.
[00401] LC-MS m/z: 812,9 (M+H)+.
[00402] 3-óxido hexafluorofosfato de 1((dimetilamino)(dimetilamino)metil)-lH-[l,2,3]triazolo[4,5-b]triazolo(V)
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147 /209 (HATU, 1,87 g, 4,92 mmol) e trietilamina (3,43 mL, 24,6 mmol) foram posteriormente adicionados a uma solução de ácido (S)-22-(tercbutoxicarbonil)-10,19,24-trioxo-39-sulfo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23triazanonatriacontanoico (4,5 mmol) em diclorometano seco (40 mL). Trietilamina (1,82 mL, 13,1 mmol) foi adicionada a uma suspensão de cloridrato de éster benzílico de ácido (2-amino-etil)-carbâmico (5, 1,93 g, 8,37 mmol) em diclorometano seco (20 mL) e a mistura resultante foi adicionada à solução acima. A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Após 16 horas, outra porção de 3-óxido hexafluorofosfato de l-((dimetilamino)(dimetilamino)metil)-lH[l,2,3]triazolo[4,5-b]piridina(V) (HATU, 0,38 g, 1 mmol), trietilamina (2,00 mL, 14,3 mmol) e cloridrato de éster benzílico de ácido (2-amino-etil)carbâmico (5, 0,40 g, 1,70 mmol) foram adicionados e a mistura foi agitada por mais 2 horas. A solução foi lavada com ácido clorídrico aquoso a 1 M (2 x 100 mL) e solução salina (50 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e evaporada até secar. Ácido (S)-29-(terc-butoxicarbonil)-3,8,17,26,31pentaoxo-1 -fenil-2,10,13,19,22-pentaoxa-4,7,16,25,30pentaazahexatetracontano-46-sulfônico (6) bruto foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional.
[00403] Rendimento: quantitativo (baseado em ELSD). [00404] Pureza LC-MS: 83 % (ELSD).
[00405] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,1% FA): 3,35 min.
[00406] LC-MS m/z: 989,1 (M+H)+.
[00407] Paládio em carbono (10%, 0,22 g, 0,20 mmol) foi adicionado a uma solução do composto acima (4,50 mmol) em metanol (100 mL) e a mistura resultante foi hidrogenada sob pressão normal por 16 horas e em seguida em sonicador por 1 hora a 40 °C. O catalisador foi filtrado em CeliteTM e o filtrado foi evaporado até secar sob pressão reduzida. O resíduo
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148 /209 foi purificado por HPLC preparativa (Coluna DelTapak Cl8, 15 m; 50 x 500 mm; acetonitrila/água 30:70 durante 80 min + 0,05% TFA) e liofilizado para gerar ácido (S)- l-amino-25-(terc-butoxicarbonil)-4,13,22,27-tetraoxo6,9,15,18-tetraoxa-3,12,21,26-tetraazadoetracontano-42-sulfônico (7) como um sólido incolor.
[00408] Rendimento: 1,95 g (45% de 1).
[00409] Pureza LC-MS: 98% (ELSD).
[00410] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,1% FA): 2,87 min.
[00411] LC-MS m/z: 854,7 (M+H)+.
[00412] 2,4,6-Collidina (1,60 mL, 12,0 mmol) foi adicionada a uma solução da amina acima (7, 2,06 g, 2,11 mmol) em N,N-dimetilformamida anidra (20 mL) a 0 °C sob argônio. Anidrido 2-bromoacético (0,68 g, 2,61 mmol) foi adicionado e a solução resultante foi agitada a 0 °C por 1 hora. A mistura de reação foi então evaporada até secar sob pressão reduzida e o resíduo foi triturado com éter dietílico (2 x 10 mL). O composto restante ácido (S)-1 -bromo-28-(terc-butoxicarbonil)-2,7,16,25,30-pentaoxo9,12,18,21-tetraoxa-3,6,15,24,29-pentaazapentatetracontano-45-sulfônico (8) foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional.
[00413] Rendimento: quantitativo (baseado em ELSD).
[00414] Pureza LC-MS: 95% (ELSD).
[00415] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,1% FA): 3,04 min.
[00416] LC-MS m/z: 976,9 (M+H)+.
[00417] O composto acima (8, 2,00 mmol) foi dissolvido em diclorometano (20 mL), água (2 mL) e ácido trifluoroacético (25 mL) e a solução resultante foi agitada por 2 horas. O ácido trifluoroacético foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi co-evaporado com diclorometano (3 x 80 mL). O resíduo foi purificado por HPLC preparativa
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149 /209 (Coluna DelTapak C18, 15 m; 50 x 500 mm; acetonitrila/água 30:70 durante 70 min + 0,05% TFA) e liofilizado para gerar ácido (S)-l-bromo-2,7,16,25tetraoxo-28-(16-sulfohexadecanamido)-9,12,18,21-tetraoxa-3,6,15,24tetraazanonaano-29-oico (9) como um sólido branco.
[00418] Rendimento: 1,92 g (98% em 2 etapas).
[00419] Espectro 1H NMR (300 MHz, AcoD-d4, 80 C, dH): 4,68-4,58 (m, 1 H); 4,20-4,08 (m, 4 H); 3,94 (s, 2 H); 3,82-3,64 (m, 12 H); 3,60-3,46 (m, 8 H); 3,20-3,10 (m, 2 H); 2,51 (t, J=7,2 Hz, 2 H); 2,37 (t, 1=7,3 Hz, 2 H); 2,26 (bs, 1 H); 1,92-1,80 (m, 2 H); 1,73-1,62 (m, 2 H); 1,55-1,44 (m, 2 H);; 1,43-1,29 (m, 21 H).
[00420] Pureza LC-MS: 95 % (ELSD).
[00421] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,1% FA): 2,73 min.
[00422] LC-MS m/z: 920,9 (M+H)+.
Exemplo 10.7: Preparação de ácido (2S)-6-[(2-bromoacetil)amino]-2-[[2[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(lH-tetrazol-5 il)heptadecanoilsulfamoil]butanoilamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]et oxi]acetil]amino]hexanoico
Figure BR112019024102A2_D0145
(Fórmula G)
[00423] A resina Wang Fmoc-Lys(Mtt) 0,29 mmol/g (17,24 g, 5,0 mmol) foi deixada inchando e lavada em DMF (60 mL) durante 7x5 minutos. O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em N,N-dimetilformamida (2 x 60 mL, 2x15 min). A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (6 x 60 mL). Fmoc-OEG-OH foi pesado para duas
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150 /209 reações (2x20 mmol 15,416 g). Dissolvido em 120 mL de DMF com Oxyma (0,3 M) e dividido em volumes de 2x53mL. Uma solução de Fmoc-OEG-OH e Oxyma em DMF (53,2 mL, 0,3 M) foi misturada com DIC (26,6 mL, 0,6 M) em DMF. O A A foi ativado durante 10 min, então adicionado à resina e a mistura foi agitada por 8 horas.
[00424] A resina foi drenada e lavada com N,N-dimetilformamida (4 x 60 mL).
[00425] O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em N,N-dimetilformamida (2 x 60 mL, 2 x 15 min). A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (6 x 60 mL)
[00426] Uma solução de Fmoc-OEG-OH e Oxyma em DMF (53,2 mL, 0,3 M) foi misturada com DIC (26,6 mL, 0,6 M) em DMF. O AA foi ativado durante 10 min, então adicionado à resina e a mistura foi agitada por 8 horas. A resina foi drenada e lavada com N,N-dimetilformamida (4 x 60 mL) e então com acetonitrila (2 x 60 mL 2x8h).
[00427] A resina acima, 0,27 mmol/g (2,46 g, 0,66 mmol) foi inchada em DMF (12 mL, 3x 5 min). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em N,N-dimetilformamida (2 x 12 mL, 1x15 min + 1 x 30 min). A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (2x15 mL), DCM (2 x 15 mL), DMF (2 x 15 mL).
[00428] Uma solução de ácido 4-[17-(lH-tetrazol-5il)heptadecanoilsulfamoil]butanoico (0,966 g, 1,98 mmol), Oxyma (0,281 g, 1,98 mmol) e DIC (0,309 mL) em N,N-dimetilformamida (15 mL) foi feita e deixada por aproximadamente 10 min a fim de ativar o aminoácido. A mistura foi então adicionada ao tubo de reação e agitada durante a noite.
[00429] A resina foi drenada e lavada com N,N-dimetilformamida (2 x 15 mL), DCM (5 x 15 mL). O grupo MTT foi clivado por 1,1,1,3,3,3hexafluoro-2-propanol/DCM/Triisopropilsilano 80/18/2, 3 x 20 ml, (3 x 20 min com lavagem DCM entre cada tratamento) e então lavado com 4 x 20 mL
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151 /209 de DCM. Ácido bromoacético (1,10 g, 7,92 mmol) e DIC (0,62 mL, 3,96 mmo) em 10 mL de DMF foram adicionados à resina e agitados por 1 h. A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (3 x 20 mL) e diclorometano (5 x 20 mL).
[00430] O produto foi clivado da resina com TFA (98%), água (2%), 20 mL por Ih e 20 mL por Vih. A resina foi lavada com 20 mL de DCM. Os solventes foram evaporados para obter um óleo amarelo. O óleo foi dissolvido em EtOAc (50 mL) e lavado com água (2 x 100 mL). Um sólido branco precipitou na camada EtOAc. A quantidade de EtOAc foi reduzida em vácuo e filtrada. O precipitado foi lavado com EtOAc e seco no filtro, obtendo 270 mg de sólido branco.
[00431] LC-MS m/z: 1026,39 (M+H)+.
Exemplo 10.8: Preparação de ácido 4-[10-[[(lS)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(5S)5-[(2-bromoacetil)amino]-5-carboxipentil]amino]-2oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-l-carboxi-4oxobutil]amino] - 10-oxodecóxi]benzoico o
Figure BR112019024102A2_D0146
(Fórmula H)
[00432] Uma resina de 2-clorotritil de 100-200 mesh e 1,5 mmol/g (1, 2,70 g, 4,05 mmol) foi deixada inchando em diclorometano seco (40 mL) durante 30 minutos. Uma solução de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 1,04 g, 2,70 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (1,82 mL, 10,3 mmol) em diclorometano seco (40 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada durante a noite. A resina foi filtrada e tratada com uma solução de N,N-di-isopropiletilamina (0,94 mL, 5,40 mmol) em mistura de metanol/diclorometano (4:1, 2 x 5 min, 2 x 40 mL). Em seguida, a resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (4 x 40 mL), diclorometano (4 x 40 mL) e N,N-dimetilformamida (4 x 40 mL). O
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152 /209 grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em N,Ndimetilformamida (1 x 10 min, 1 x 30 min, 2 x 40 mL). A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (3 x 40 mL), 2-propanol (2 x 40 mL), diclorometano (3 x 40 mL) e N,N-dimetilformamida (3 x 40 mL). Um solução de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi }-acético (Fmoc-OEG-OH, 3,18 g, 8,20 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato de 5-cloro-l((dimetilamino)(dimetiliminio)metil)-1 H-benzo [d] [1,2,3] triazol (TCTU, 2,93 g, 8,20 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (2,87 mL, 16,4 mmol) em N,Ndimetilformamida (40 mL) foi agitada por 1 hora. A resina foi filtrada e lavada com N,N-dimetilformamida (4 x 40 mL), diclorometano (4 x 40 mL) e N,N-dimetilformamida (4 x 40 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em Ν,Ν-dimetilformamida (1 x 10 min, 1 x 30 min, 2 x 40 mL). A resina foi lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (3 x 40 mL), 2-propanol (2 x 40 mL), diclorometano (3 x 40 mL) e Ν,Νdimetilformamida (3 x 40 mL). Uma solução de éster 1-terc-butílico de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico (Fmoc-L-GluOtBu, 3,50 g, 8,20 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato de 5-cloro-l((dimetilamino)(dimetilimidinio)metil)-1 H-benzo [d] [ 1,2,3]triazol (TCTU, 2,93 g, 8,20 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (2,87 mL, 16,4 mmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (40 mL) foi agitada por 1 hora. A resina foi filtrada e lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (4 x 40 mL), diclorometano (4 x 40 mL) e Ν,Ν-dimetilformamida (4 x 40 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em Ν,Ν-dimetilformamida (1 x 10 min, 1 x 30 min, 2 x 40 mL). A resina foi lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (3 x 40 mL), 2-propanol (2 x 40 mL), diclorometano (3 x 40 mL) e Ν,Νdimetilformamida (3 x 40 mL). Solução de ácido 10-(4-(tercbutoxicarbonil)fenoxi)decanoico (CNB, 3,00 g, 8,20 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato de 5 -cloro-1 -((dimetilamino)(dimetilamino)metil)-1Hbenzo[d][l,2,3]triazol (TCTU, 2,93 g, 8,20 mmol) e N,N-di
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153 /209 isopropiletilamina (2,87 mL, 16,4 mmol) em N,N-dimetilformamida (40 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada por 1 hora. A resina foi filtrada e lavada com N,N-dimetilformamida (4 x 40 mL), diclorometano (4 x 40 mL), N,N-dimetilformamida (4 x 40 mL) e diclorometano (10 x 40 mL).
[00433] O produto foi clivado da resina pelo tratamento com 2,2,2trifluoroetanol (40 mL) durante a noite. A resina foi filtrada e lavada com diclorometano (4 x 40 mL). O solvente foi evaporado até secar para gerar ácido (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-33-(4-(terc-butoxicarbonil)fenoxi)10,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-triazatritriacontoico puro como um óleo amarelo.
[00434] Rendimento: 2,26 g (100%).
[00435] Espectro 1H NMR (300 MHz, CDC13, dH): 7,95-7,87 (m, 2 H); 7,41-7,32 (m, 1 H); 7,05-6,95 (m, 1 H); 6,92-6,82 (m, 2 H); 6,61 (d, J=7,7 Hz, 1 H); 4,49-4,37 (m, 1 H); 4,15 (s, 2 H); 4,04-3,95 (m, 4 H); 3,76-3,36 (m, 17 H); 2,39-2,09 (m, 5 H); 2,04-1,85 (m, 1 H); 1,84-1,70 (m, 2 H); 1,67-1,52 (m, 10 H); 1,50-1,39 (m, 11 H); 1,37-1,24 (m, 8 H).
[00436] Pureza LC-MS: 100% (ELSD).
[00437] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 50:50 a 100:0 + 0,1% FA): 4,49 min.
[00438] LC-MS m/z: 841,2 (M+H)+.
[00439] A resina Wang-Fmoc-Lys(Mtt)-OH 0,33 mmol/g (3, 4,15 g, 1,37 mmol) foi deixada inchando em diclorometano (50 mL) durante 30 minutos. O grupo Mtt foi removido pelo tratamento com 80% de 1,1,1,3,3,3hexafluoropropan-2-ol em diclorometano (2x5 min, 2 x 10 min, 1x15 min, 1 x 30 min, 6 x 50 mL). A resina 3 foi lavada com diclorometano (4 x 70 mL), 10% de N,N-di-isopropiletilamina em diclorometano (1 x 50 mL) e diclorometano (2 x 50 mL).
[00440] Uma solução de ácido (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-33-(4(terc-butoxicarbonil)fenoxi)-10,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23
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154 /209 triazatritriacontanoico (2, 2,30 g, 2,73 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato de 5cloro-1 -((dimetilamino)(dimetiliminio)metil)-1 H-benzo[d] [ 1,2,3] triazol (TCTU, 0,97 g, 2,73 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (1,20 mL, 6,85 mmol) em N,N-dimetilformamida (50 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada durante a noite. A resina foi filtrada e lavada com N,Ndimetilformamida (4 x 50 mL), diclorometano (4 x 50 mL) e N,Ndimetilformamida (4 x 50 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em Ν,Ν-dimetilformamida (1 x 10 min, 1 x 30 min, 2 x 50 mL). A resina foi lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (3 x 50 mL), 2propanol (2 x 50 mL), diclorometano (3 x 50 mL) e Ν,Ν-dimetilformamida (3 x 50 mL). Uma solução de ácido bromoacético (0,76 g, 5,48 mmol), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC, 0,85 mL, 5,48 mmol), 2,4,6-colidina (0,91 mL, 5,48 mmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (50 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada por 1 hora. A resina foi filtrada e lavada com Ν,Νdimetilformamida (4 x 50 mL), diclorometano (4 x 50 mL), Ν,Νdimetilformamida (4 x 50 mL) e diclorometano (10 x 40 mL). O produto (4) foi clivado da resina pelo tratamento com mistura de ácido trifluoroacético/diclorometano (2:1, 30 mL) por 3 horas. A resina foi filtrada e lavada com diclorometano (4 x 40 mL). O solvente foi evaporado até secar para gerar ácido (2S,29S)-29-(2-bromoacetamido)-2-( 10-(4carboxifenoxi)decanamido)-5,14,23-trioxo-9,12,18,21 -tetraoxa-6,15,24triazatriacontanodioico (4) puro como um óleo amarelo.
[00441] Rendimento: 1,33 g (100%).
[00442] Espectro 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6 + DC1, dH): 7,937,76 (m, 2 H); 7,05-6,89 (m, 2 H); 4,16-4,05 (m, 3 H); 4,05-3,93 (m, 2 H); 3,93-3,79 (m, 5 H); 3,60-3,48 (m, 9 H); 3,46-3,32 (m, 4 H); 3,30-3,21 (m, 2 H); 3,21-3,12 (m, 2 H); 3,10-3,00 (m, 2 H); 2,19-1,77 (m, 6 H); 1,77-1,49 (m, 7H); 1,48-1,22 (m, 12 H).
[00443] Pureza LC-MS: 95 % (ELSD).
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[00444] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,1% FA): 3,02 min.
[00445] LC-MS m/z: 977,3 (M+H)+.
Exemplo 10.9: Preparação de ácido 4-[12-[[(lS)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(6S)6-[(2-bromoacetil)amino]-6-carboxihexil]amino]-2 oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-l-carboxi-4oxobutil]amino] - 12-oxododecóxi]benzoico
Figure BR112019024102A2_D0147
Figure BR112019024102A2_D0148
Figure BR112019024102A2_D0149
(Fórmula K)
[00446] Uma resina de cloreto de 2-Clorotritil 100-200 mesh 1,5 mmol/g (2,60 g, 3,90 mmol) foi deixada inchando em diclorometano seco (40 mL) durante 30 minutos. Uma solução de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 1,02 g, 2,60 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (1,75 mL, 10,0 mmol) em diclorometano seco (40 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada durante a noite. A resina foi filtrada e tratada com uma solução de N,N-di-isopropiletilamina (0,90 mL, 5,20 mmol) em mistura de metanol/diclorometano (4:1, 2 x 5 min, 2 x 40 mL). Em seguida, a resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (4 x 40 mL), diclorometano (4 x 40 mL) e N,N-dimetilformamida (4 x 40 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em N,Ndimetilformamida (1 x 10 min, 1 x 30 min, 2 x 40 mL). A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (3 x 40 mL), 2-propanol (2 x 40 mL), diclorometano (3 x 40 mL) e N,N-dimetilformamida (3 x 40 mL). Uma solução de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}acético (Fmoc-OEG-OH, 3,06 g, 7,90 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato de 5cloro-1 -((dimetilamino)(dimetiliminio)metil)-1 H-benzo[d] [ 1,2,3]triazol (TCTU, 2,82 g, 7,90 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (2,76 mL, 15,0 mmol) em N,N-dimetilformamida (40 mL) foi agitada por 1 hora. A resina foi
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156 /209 filtrada e lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (4 x 40 mL), diclorometano (4 x 40 mL) e Ν,Ν-dimetilformamida (4 x 40 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em Ν,Ν-dimetilformamida (1 x 10 min, 1 x 30 min, 2 x 40 mL). A resina foi lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (3 x 40 mL), 2-propanol (2 x 40 mL), diclorometano (3 x 40 mL) e Ν,Νdimetilformamida (3 x 40 mL). Uma solução de éster 1-terc-butílico de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico (Fmoc-L-GluOtBu, 3,40 g, 7,90 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato 5-cloro-l((dimetilamino)(dimetilimidinio)metil)- lH-benzo[d] [ 1,2,3]triazol (TCTU, 2,82 g, 7,90 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (2,76 mL, 15,0 mmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (40 mL) foi agitada por 1 hora. A resina foi filtrada e lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (4 x 40 mL), diclorometano (4 x 40 mL) e Ν,Ν-dimetilformamida (4 x 40 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em Ν,Ν-dimetilformamida (1 x 10 min, 1 x 30 min, 2 x 40 mL). A resina foi lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (3 x 40 mL), 2-propanol (2 x 40 mL), diclorometano (3 x 40 mL) e Ν,Νdimetilformamida (3 x 40 mL). Uma solução de ácido 12-(4-(tercbutoxicarbonil)fenoxi)dodecanoico (CUB, 3,12 g, 7,90 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato de 5 -cloro-1 -((dimetilamino)(dimetilamino)metil)-1Hbenzo[d][l,2,3]triazol (TCTU, 2,82 g, 7,90 mmol) e N,N-diisopropiletilamina (2,76 mL, 15,0 mmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (40 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada por 1 hora. A resina foi filtrada e lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (4 x 40 mL), diclorometano (4 x 40 mL), Ν,Ν-dimetilformamida (4 x 40 mL) e diclorometano (10 x 40 mL).
[00447] O produto foi clivado da resina pelo tratamento com 2,2,2trifluoroetanol (40 mL) durante a noite. A resina foi filtrada e lavada com diclorometano (4 x 40 mL). O solvente foi evaporado até secar para gerar ácido (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-35-(4-(terc-butoxicarbonil)fenoxi)10,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23-triazapentatriacontoico puro como
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157 /209 um óleo amarelo.
[00448] Rendimento: 1,93 g (86%).
[00449] Pureza LC-MS: 100% (ELSD).
[00450] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,1% FA): 4,88 min.
[00451] LC-MS m/z: 869,2 (M+H)+.
[00452] A resina Wang-Fmoc-Lys(Mtt)-OH 0,33 mmol/g (3,40 g, 1,11 mmol) foi deixada inchando em diclorometano (50 mL) durante 30 minutos. O grupo Mtt foi removido pelo tratamento com 80% de 1,1,1,3,3,3hexafluoropropan-2-ol em diclorometano (2x5 min, 2 x 10 min, 1x15 min, 1 x 30 min, 6 x 50 mL). A resina foi lavada com diclorometano (4 x 70 mL), 10% de N,N-di-isopropiletilamina em diclorometano (1 x 50 mL) e diclorometano (2 x 50 mL).
[00453] Uma solução de ácido (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-35-(4(terc-butoxicarbonil)fenoxi)-10,19,24-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18,23triazapentatriacontanoico (1,93 g, 2,22 mmol), 3-óxido tetrafluoroborato de 5cloro-1 -((dimetilamino)(dimetiliminio)metil)-1 H-benzo[d] [ 1,2,3]triazol (TCTU, 0,79 g, 2,22 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (0,86 mL, 6,66 mmol) em N,N-dimetilformamida (50 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada durante à noite. A resina foi filtrada e lavada com N,Ndimetilformamida (4 x 50 mL), diclorometano (4 x 50 mL) e N,Ndimetilformamida (4 x 50 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em Ν,Ν-dimetilformamida (1 x 10 min, 1 x 30 min, 2 x 50 mL). A resina foi lavada com Ν,Ν-dimetilformamida (3 x 50 mL), 2propanol (2 x 50 mL), diclorometano (3 x 50 mL) e Ν,Ν-dimetilformamida (3 x 50 mL). Uma solução de ácido bromoacético (0,62 g, 4,44 mmol), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC, 0,69 mL, 4,44 mmol) e 2,4,6-colidina (0,59 mL, 4,44 mmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (50 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada por 1 hora. A resina foi filtrada e lavada com N,N
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158 /209 dimetilformamida (4 x 50 mL), diclorometano (4 x 50 mL), N,Ndimetilformamida (4 x 50 mL) e diclorometano (10 x 40 mL). O produto foi clivado da resina pelo tratamento com mistura de ácido trifluoroacético/diclorometano (2:1, 30 mL) por 3 horas. A resina foi filtrada e lavada com diclorometano (4 x 40 mL). O solvente foi evaporado até secar para gerar ácido (2S,29S)-29-(2-bromoacetamido)-2-(12-(4carboxifenoxi)dodecanamido)-5,14,23-trioxo-9,12,18,21-tetraoxa-6,15,24triazatriacontanodioico puro como um óleo amarelo.
[00454] Rendimento: 1,10 g (99%).
[00455] Espectro 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6 + DC1, dH): 7,937,74 (m, 2 H); 7,06-6,86 (m, 2 H); 4,20-3,93 (m, 5 H); 3,92-3,78 (m, 6 H); 3,54 (s, 9 H); 3,46-2,94 (m, 12 H); 2,19-1,84 (m, 5 H); 1,81-1,52 (m, 6 H); 1,51-1,23 (m, 15 H).
[00456] Pureza LC-MS: 97% (ELSD).
[00457] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,1% FA): 3,20 min.
[00458] LC-MS m/z: 1005,3 (M+H)+.
Exemplo 10.10: Preparação de ácido (2S)-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2oxoetoxi]etoxi]etilamino]-5-oxo-2-[16-(lH-tetrazol-5-
Figure BR112019024102A2_D0150
(Fórmula J)
[00459] Cloridrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCHC1, 6,25 g, 32,6 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de ácido
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16-(lH-tetrazol-5-il)hexadecanoico (1, 5,28 g, 16,3 mmol) e imida Nhidroxisuccinica (HOSu, 3,75 g, 32,6 mmol) em N,N-dimetilformamida (70 mL) e mistura foi agitada durante a noite. A mistura de reação foi diluída com solução aquosa a 1 M de ácido clorídrico (400 mL). O produto bruto foi extraído com acetato de etila (4 x 400 mL) e a fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro. Após a filtragem, o solvente foi removido sob pressão reduzida. 2-Propanol (100 mL) foi adicionado ao resíduo oleoso e o sólido branco precipitado foi filtrado. O produto puro (2) foi obtido por recristalização de 2-propanol (70 mL) como um sólido microcristalino branco. [00460] Rendimento: 4,73 g (69%).
[00461] RF (SiO2, acetato de etila): 0,35.
[00462] Espectro 1H NMR (300 MHz, AcoD-d4, dH): 3,02 (t, J=7,7 Hz, 2 H); 2,86 (s, 4 H); 2,62 (t, 1=7,3 Hz, 2 H); 1,90-1,63 (m, 4 H); 1,30 (bs, 22 H).
[00463] Fmoc-gGlu(tBu)-OEG-OEG- ligado à resina de 2-clorotritil (11,5 mmol, a preparação é descrita no procedimento para síntese do prolongador do Exemplo 10,6) foi deixada inchando em diclorometano (100 mL) por 20 minutos. A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (2 x 100 mL). O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em N,N-dimetilformamida (1x5 min, 1 x 30 min, 2 x 100 mL). A resina foi lavada com N,N-dimetilformamida (3 x 100 mL), 2-propanol (2 x 100 mL) e diclorometano (8 x 100 mL). O produto foi clivado da resina pelo tratamento com l,l,l,3,3,3-hexafluoro-2-propanol em diclorometano (2:8, 80 mL) por 2 horas. A resina foi filtrada e lavada com diclorometano (2 x 80 mL). As soluções foram combinadas; solventes evaporados para obter o produto (4) como um óleo acastanhado. O produto bruto continha 2 equivalentes de 1,1,1,3,3,3-hexafhioro-2-propanol.
[00464] Rendimento: 9,49 g (99%, contado para aduto com 2 equivalentes de HFIP).
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[00465] Espectro 1H NMR (300 MHz, CDC13, dH): 7,72-7,64 (m, 1 H); 7,59-7,50 (m, 1 H); 4,00 (s, 2 H); 3,94 (s, 2 H); 3,94-3,85 (m, 1 H); 3,713,32 (m, 16 H); 2,56-2,45 (m, 2 H); 2,42-2,26 (m, 1 H); 2,16-2,02 (m, 1 H); 1,49 (s, 9 H).
[00466] A uma solução do ácido acima (6,10 g, 7,93 mmol) em tetrahidrofurano (50 mL) e 2,5-dioxopirirolidin-l-il 16-(lH-tetrazol-5il)hexadecanoato (2, 3,33 g, 7,93 mmol) foi adicionada N,N-diisopropiletilamina (6,91 mL, 39,6 mmol) e a mistura de reação foi agitada durante a noite. Em seguida, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia flash em coluna (Silicagel 60, 0,0400,063 mm; eluente: diclorometano/metanol/acético ácido 15:1:0,2 a 5:1:0,2). O residual acético ácido foi removido por liofilização da mistura de acetonitrila/água 1:1 obtendo (5) puro como um sólido esbranquiçado.
[00467] Rendimento: 1,39 g (22%).
[00468] Espectro 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, dH): 8,13-8,07 (m, 1 H); 8,01-7,93 (m, 1 H); 7,74-7,68 (m, 1 H); 4,11-3,99 (m, 1 H); 3,88 (s, 2 H); 3,82 (s, 2 H); 3,62-3,49 (m, 8 H); 3,49-3,37 (m, 4 H); 3,33-3,15 (m, 4 H); 2,73-2,65 (m, 2 H); 2,18-2,03 (m, 4 H); 1,94-1,81 (m, 1 H); 1,80-1,67 (m, 1 H); 1,66-1,53 (m, 2 H); 1.53-1.41 (m, 2 H); 1,38 (s, 9 H); 1,23 (s, 22 H).
[00469] A uma solução do composto acima (1,39 g, 1,73 mmol), 3óxido hexafluorofosfato de l-((dimetilamino)(dimetilamino)metil)-lH[l,2,3]triazolo[4,5-b]piridina (V) (HATU, 657 mg, 1,73 mmol) e N,N-diisopropiletilamina (1,21 mL, 6,90 mmol) em N,N-dimetilformamida (30 mL) foi adicionado (2-aminoetil)carbamato benzílico (6, 400 mg, 1,73 mmol) e a mistura de reação foi agitada durante a noite. Em seguida, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia flash em coluna (Silicagel 60, 0,040-0,063 mm; eluente: acetato de etila/metanol/acético ácido 15:1:0,2 para diclorometano/metanol/acético ácido 15:1:0,2) obtendo o produto (7) puro como um sólido viscoso acastanhado.
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[00470] Rendimento: 1,63 g (97%).
[00471] Espectro 1H NMR (300 MHz, AcoD-d4, dH): 7,35 (bs, 5 H); 5,25-5,12 (m, 2 H); 4,50-4,42 (m, 1 H); 4,14 (s, 2 H); 4,09 (s, 2 H); 3,79-3,30 (m, 20 H); 3,02 (t, 1=7,6 Hz, 2 H); 2,46-2,27 (m, 4 H); 2,26-2,09 (m, 1 H); 2,05-1,92 (m, 1 H); 1,88-1,72 (m, 2 H); 1,72-1,53 (m, 2 H); 1,47 (s, 9 H); 1,29 (bs, 22 H).
[00472] A uma solução do composto acima (1,63 g, 1,67 mmol) em metanol foi adicionado paládio em carbono (10%, 0,25 g, 0,23 mmol) sob manta de hidrogênio e a mistura de reação foi vigorosamente agitada por 2 horas. Em seguida, a mistura de reação foi filtrada através de um pequeno filtro de diatomita e lavada com metanol. O solvente foi removido sob pressão reduzida obtendo o produto (8) puro como uma espuma sólida branca.
[00473] Rendimento: 1,32 g (94%).
[00474] Espectro 1H NMR (300 MHz, AcoD-d4, dH): 4,50-4,42 (m, 1 H); 4,16-4,10 (m, 4 H); 3,71-3,61 (m, 14 H); 3,59-3,51 (m, 2 H); 3,51-3,45 (m, 2 H); 3,40-3,32 (m, 2 H); 3,02 (t, 1=7,6 Hz, 2 H); 2,45-2,28 (m, 4 H); 2,27-2,12 (m, 1 H); 2,05-1,93 (m, 1 H); 1,89-1,74 (m, 2 H); 1,70-1,58 (m, 2 H); l,47(s, 9 H); 1,30 (bs, 22 H).
[00475] O composto acima (1,32 g, 1,57 mmol) foi dissolvido em uma mistura de ácido trifluoroacético (90 mL) e água (10 mL). Após 90 minutos, os voláteis foram removidos sob pressão reduzida e o resíduo foi evaporado com tolueno (3 x 50 mL). O resíduo foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (15 mL) e resfriado até 0 °C. Anidrido bromoacético (678 mg, 2,61 mmol) e bicarbonato de sódio (2,02 g, 24,0 mmol) foram adicionados durante a agitação e a mistura de reação foi deixada aquecendo até a temperatura ambiente. Após 60 minutos, anidrido bromoacético adicional (200 mg, 0,77 mmol) foi adicionado para completar a reação. Após 30 minutos, o solvente foi removido sob pressão reduzida, obtendo líquido acastanhado imiscível com diclorometano, acetato de etila e água. O resíduo foi colocado em um
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162 /209 funil separador e tentou-se dissolvê-lo em acetato de etila (50 mL) e água (50). Criou-se três fases. A fase de acetato de etila e a fase de água foram removidas e a terceira fase foi purificada por HPLC preparativa (Coluna labio DelTapak C18, 15 mm, 50 x 500 mm, acetonitrila/água 25:75 a 50:50 + 0,05% TFA). A solução resultante foi liofilizada para fornecer o produto titular (9) como um sólido branco.
[00476] Rendimento: 210 mg (15%).
[00477] Espectro 1H NMR (300 MHz, AcoD-d4, dH): 4,64-4,56 (m, 1 H); 4,12 (s, 2 H); 4,10 (s, 2 H); 3,95 (s, 2 H); 3,77-3,59 (m, 12 H); 3,59-3,37 (m, 8 H); 3,02 (t, 1=7,6 Hz, 2 H); 2,44 (t, 1=7,8 Hz, 2 H); 2,34 (t, J=8,0 Hz, 2 H); 2,28-2,18 (m, 1 H); 2,15-2,04 (m, 1 H); 1,86-1,70 (m, 2 H); 1,70-1,56 (m, 2H), 1,29 (bs, 22 H).
[00478] Pureza LC-MS: 100%.
[00479] LC-MS Rt (Kinetex Cl8, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrila/água 20:80 a 100:0 + 0,1% FA): 3,35 min.
[00480] LC-MS m/z: 908,8 (M+H)+.
Exemplo 11: Preparação de compostos MIC-1 com prolongadores Exemplo 11.1: Composto 01
[00481] SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21 ,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA17, AlaA-16,ThrA-15 ,ProA- 14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11 ,ProA-10,GlyA9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB32,GluB-31,ProB-30,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4(17-carboxi-heptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi]etoxi]acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysB-29,ThrB-28,SerB27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerBPetição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 169/241
163 /209
19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyBH,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB2,GlyB-1 ,des-AsnA3, AsnB3-MIC-1
Figure BR112019024102A2_D0151
S P R E V
Q .S h-C
S Q
P-N'
S h-C
V
S Q
P-N'
Q
K
R (Fórmula 01)
[00482] O prolongador de 30 mg (exemplo 10,4, 8 equivalentes) foi dissolvido em 1,5 Ml de sat. NAHCO3 e adicionado a 108 mg de polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 288) em tampão PBS, pH 7,4, 2,1 mg/Ml. 19 mg de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina, sal de Kalium dihidratado, Sigma-Aldrich 698539 (8 equivalentes) foram adicionados. Após 24h permanecendo em temperatura ambiente, a proteína foi purificada em uma coluna de fase reversa C4 usando um gradiente de etanol/fosfato de 10
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 170/241
164 /209
50% pH 3,0. Rendimento -20% após purificação.
[00483] Massa teórica: 32006,3; Obteve-se: 32006,5.
Exemplo 11.2: Composto 02
[00484] Ser A-32,GluA-31 ,ProA-30, AlaA-29,Thr A-28 ,S {Beta} - [2- [2[[2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [[(4S)-4-carboxi-4-( 17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA23,ProA-22,GlyA-21 ,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA-16,ThrA15,Pro A- 14,GluA-13,SerA- 12,GlyA-11 ,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB30,AlaB-29,ThrB-28,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-ll,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-ldes-AsnA3,AsnB3-MIC-l
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165 /209
Figure BR112019024102A2_D0152
Figure BR112019024102A2_D0153
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
SQFRAANMHA QIKTSLHRLK
QKTDTGVSLQ TYDDLLAKDC
Figure BR112019024102A2_D0154
PASYNPMVL I
Figure BR112019024102A2_D0155
(Fórmula 02)
[00485] O composto 02 foi preparado usando o procedimento descrito no exemplo 11.1 usando polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 291).
[00486] Massa teórica: 31974,3; Obteve-se: 31974,0
Exemplo 11.3: Composto 03
[00487] Ser A-32,GluA-31 ,ProA-30, AlaA-29,Thr A-28 ,S {Beta} - [2- [2[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15carboxipentadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] eto xi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 172/241
166 /209
24,ThrA-23 ,ProA-22,GlyA-21 ,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA16,ThrA-15 ,ProA- 14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11 ,ProA-10,GlyA-9,ThrA8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4carboxi-4-(15carboxipenttadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] et oxi] acetil] amino] etilamino] -2-oxoetil] Cy sB -27, GlyB -26, SerB -25, GluB 24,ThrB-23 ,ProB-22,GlyB-21 ,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-ll,ProB-10,GlyB-9,ThrB8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-ldes-AsnA3,AsnB3MIC-1
OH > Π X X 0 Η,ΙυΝ,-Ε P A T-I\T Yi-G set HhU^P O^OH^/ PGTSESATPE SGPGTSTEPS EGARGDHCPL
II H II 0 0 GPGRCCRLHT SQFRAANMHA Q QKTDTGVSLQ T Hl· /. NH 0 H if X X 0 H2nZJTE P A hP SET VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP 0 Η II 1 KTSLHRLK PDTVPA P-N. V PASYNPMVLI CH3 CCH3 £\s YDDLLAKDC H C-N^h-OH xVtAw; 0^X)H^^ PGTSESATPE SGPGTSTEPS EGARGDHCPL
VRASLEDLGW ADWVLSPREV
SQFRAANMHA QKTDTGVSLQ (Fórmula 03) s QIKTSLHRLK PDTVPA P-N^Ai-C V PASYNPMVLI ch3 h II I 0 0 < AH3 TYDDLLAKDC H C-N'^SpOH 0
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 173/241
167 /209
[00488] O composto 03 foi preparado usando o procedimento descrito no exemplo 11.1 usando o prolongador descrito no exemplo 10.2 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 291).
[00489] Massa teórica: 31918,2; Obteve-se: 31918,0.
Exemplo 11.4: Composto 04
[00490] Ser A-32,GluA-31 ,ProA-30, AlaA-29,Thr A-28 ,S {Beta} - [2- [2[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13carboxitridecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA23,ProA-22,GlyA-21 ,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA-16,ThrA15,Pro A- 14,GluA-13,SerA- 12,GlyA-11 ,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB30,AlaB-29,ThrB-28,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4(13carboxitridecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-ll,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-ldes-AsnA3,AsnB3-MIC-l
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 174/241
168 /209
Figure BR112019024102A2_D0156
Figure BR112019024102A2_D0157
Ο ο
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
SQFRAANMHA QIKTSLHRLK
QKTDTGVSLQ TYDDLLAKDC
Figure BR112019024102A2_D0158
PASYNPMVL I
Ο
Ο
Ο ΙΟ
Figure BR112019024102A2_D0159
C Ρ L
S Ρ R Ε V
S Q
Ο (Fórmula 04)
[00491] Ο composto 04 foi preparado usando o procedimento descrito no exemplo 11.1 usando o prolongador descrito no exemplo 10.3 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 291).
[00492] Massa teórica: 31862,1; Obteve-se: 31862,0.
Exemplo 11.5: Composto 05
[00493] SerA-32,GluA-31 ,ProA-30, AlaA-29,ThrA-28,SerA27,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA22,GlyA-21 ,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA-16,ThrA-15 ,ProA14,GluA-13,SerA- 12,GlyA-11 ,ProA- 10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrAPetição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 175/241
169 /209
6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB29,ThrB-28,SerB-27,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4(17-carboxi heptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB
22,GlyB-21 ,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17, AlaB-16,ThrB-15,ProB
14,GluB-13 ,SerB-12,GlyB-11 ,ProB- 10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB
5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-l[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],desAsnA3,AsnB3-MIC-l
Figure BR112019024102A2_D0160
Figure BR112019024102A2_D0161
(Fórmula 05)
[00494] O composto 05 foi preparado usando o procedimento descrito no exemplo 11.1 usando o prolongador descrito no exemplo 10.4 e
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 176/241
170 /209 polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 289). [00495] Massa teórica: 31962,2; Obteve-se: 31962,0.
Exemplo 11.6: Composto 06
[00496] SerA-32,GluA-31 ,ProA-30, AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA26,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA21 ,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA-16,ThrA-15 ,ProA-14,GluA13,SerA-12,GlyA-ll,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA4,SerA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB27,GlyB-26,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB13,SerB-12,GlyB-ll,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB4,SerB-3,GluB-2,GlyB-l[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],desAsnA3,AsnB3-MIC-l
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 177/241
171 /209
Figure BR112019024102A2_D0162
Figure BR112019024102A2_D0163
Ο ο
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV Q V
EGARGDHCPL
Τ Μ C I G A C Ρ
Figure BR112019024102A2_D0164
(Fórmula 06)
[00497] Ο composto 06 foi preparado usando o procedimento descrito no exemplo 11.1 usando o prolongador descrito no exemplo 10.4 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 303).
[00498] Massa teórica: 31902,1; Obteve-se: 31902,0
Exemplo 11.7: Composto 07
[00499] SerA-32,GluA-31 ,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA18,SerA-17,AlaA-16,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-15,Pro A-14,Glu A-13,SerA-12,GlyAH,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluAPetição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 178/241
172 /209
2,GlyA-1 ,SerB-32,GluB-31 ,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB18,SerB-17,AlaB-16,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4 (17-carboxi heptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyBH,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB2,GlyB-l[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-l
Figure BR112019024102A2_D0165
Figure BR112019024102A2_D0166
SQFRAANLHA
QKTDTGVSLQ £
h2n/X-e patsgset
GPGRCCRLHT
SQFRAANLHA
QKTDTGVSLQ
Figure BR112019024102A2_D0167
(Fórmula 07)
[00500] O composto 07 foi preparado usando o procedimento descrito no exemplo 11.1 usando o prolongador descrito no exemplo 10.4 e
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173 /209 polipeptideo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 292). [00501] Massa teórica: 31874,1; Obteve-se: 31873,0.
Exemplo 11.8: Composto 08
[00502] SerA-32,GluA-31 ,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA18,SerA-17, AlaA-16,ThrA-15 ,ProA- 14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11 ,ProA10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-ll,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysB-3,GluB-2,GlyBl[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-l
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 180/241
174 /209
Figure BR112019024102A2_D0168
Figure BR112019024102A2_D0169
G P
SQF
Q K T
SQF
Q K T
Figure BR112019024102A2_D0170
N P L V L
R G D H C
I G A C P
N P L V L (Fórmula 08)
[00503] O composto 08 foi preparado usando o procedimento descrito no exemplo 11.1 usando o prolongador descrito no exemplo 10.4 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 293).
[00504] Massa teórica: 31902,1; Obteve-se: 31901,0
Exemplo 11.9 e Exemplo 11.10: Composto 09 e Composto 10
Composto 09:
[00505] N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17 carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]metil]fenil]metil-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 181/241
175 /209
28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA-16,ThrA-15,Pro A- 14,GluA-13 ,SerA12,GlyA-ll,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyBH,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB2,GlyB-l[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-l
Composto 10:
[00506] N{A-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] aceti l]amino]metil]fenil]metil,N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] aceti l]amino]metil]fenil]metil-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA-16,ThrA-15,Pro A- 14,GluA-13 ,SerA12,GlyA-ll,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyBH,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB2,GlyB-l[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-l
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 182/241
176 /209
Figure BR112019024102A2_D0171
STEPS EGARGDHCPL
PREV QVTMCIGACP .OH
H2N'
SQFRAANLHA
QKTDTGVSLQ
QI KTSLHRLK
TYDDLLAKDC
T PGTSESATP
VRASLEDLGW
QI KTSLHRLK
TYDDLLAKDC
Figure BR112019024102A2_D0172
PASYNPLVL I
EGARGDHCPL
VTMC I GACP
PASYNPLVL I (Fórmula 09)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 183/241
177 /209 ο
OH
Figure BR112019024102A2_D0173
.OH
S
G
S
G
S
S
S
G P
E
P
A
E
P
E
A
P
E
G
G
R
C
C
R
H
V
R
A
S
E
D
L
G
W
A
D
W V
N'
H
P
STEP
S
P R E V
Q
V
Figure BR112019024102A2_D0174
S Y N
R G D
C I G
Y N P (Fórmula 10)
[00507] mg do prolongador (exemplo
10,1, 8 equivalentes) dissolvidos em 2 mL de Hidroxipropil-beta-ciclodextrina 40% foram adicionados a 75 mg de polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 164) em tampão PBS de 40 mL, pH 7,4. 100 μί de complexo de borano piridina (8 M) foram adicionados. Após 24h permanecendo em temperatura
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 184/241
178 /209 ambiente, 20 mg do prolongador e 100 pl do reagente de borano foram adicionados novamente.
[00508] Após 48h, a mistura de proteína mono e dialquilada foi purificada em uma coluna de fase reversa C4 usando um gradiente de etanol/fosfato de 10-50% pH 3,0. Rendimento -19% de proteína monoalquilada (Composto 09) e 6% de proteína dialquilada (Composto 10) após purificação.
Composto 09:Massa teórica: 31073,0; Obteve-se: 31073,5 Composto 10:Massa teórica: 31908,1; Obteve-se: 31908,5 Exemplo 11.11: Composto 11
[00509] SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoyl] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acet il]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21 ,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA17, AlaA-16,ThrA-15 ,ProA- 14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11 ,ProA-10,GlyA9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB32,GluB-31,ProB-30,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoyl] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acet il]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21 ,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-ll,ProB-10,GlyB9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB![LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-l
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 185/241
179 /209
Figure BR112019024102A2_D0175
Figure BR112019024102A2_D0176
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
SQFRAANLHA QIKTSLHRLK
QKTDTGVSLQ TYDDLLAKDC
Figure BR112019024102A2_D0177
PASYNPLVL I
Figure BR112019024102A2_D0178
(Fórmula 11)
[00510] O composto 11 foi preparado usando o procedimento descrito no exemplo 11.1 usando o prolongador descrito no exemplo 10.4 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 290).
[00511] Massa teórica: 31934,1; Obteve-se: 31938,5.
Exemplo 11.12 e Exemplo 11.13: Composto 12 e Composto 13
Composto 12:
[00512] N{A-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] aceti l]amino]metil]fenil]metil,N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 186/241
180 /209 (17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] aceti l]amino]metil]fenil]metil-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA4,AspA-3,AspA-2,AspA-l,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB4,AspB-3,AspB-2,AspB-l[LysAl,GluA2,SerA3,LysBl,GluB2,SerB3]-MIC1
Composto 13:
[00513] N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] aceti l]amino]metil]fenil]metil-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA4,AspA-3,AspA-2,AspA-l,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB4,AspB-3,AspB-2,AspB-l[LysAl,GluA2,SerA3,LysBl,GluB2,SerB3]-MIC1
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 187/241
181 /209
Figure BR112019024102A2_D0179
HTVR ASLEDLGWAD
A Q I KTSLHRLKPD
Figure BR112019024102A2_D0180
Figure BR112019024102A2_D0181
ASLEDLGWA
TSLHRLKPD
DDLLAKDCH
Figure BR112019024102A2_D0182
(Fórmula 12)
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 188/241
182 /209
Figure BR112019024102A2_D0183
Η
Τ
V
A
Η II P-hl >-c
HO.
.0 s
CH
C---N
H
Figure BR112019024102A2_D0184
OH
H2N ΝγΟ W V •E ,S
P-N Yc
H II
CH
C----N
H
Figure BR112019024102A2_D0185
OH compostos preparados
11.10 usando o prolongador descrito foram usando no (Fórmula 13)
[00514] Os procedimento descrito no exemplo exemplo 10.1 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 311).
[00515] Composto 12: Massa teórica: 28212,3; Obteve-se: 28211,9
[00516] Composto 13: Massa teórica: 27377,2; Obteve-se: 27376,8
Exemplo 11.14: Composto 14
[00517] N{A-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(ll carboxiundecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]metil]fenil]metil,N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4 carboxi-4-(ll carboxiundecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil]amino]metil]fenil]metil-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 189/241
183 /209
4,AspA-3,AspA-2,AspA-l,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB4,AspB-3,AspB-2,AspB-l[LysAl,GluA2,SerA3,LysBl,GluB2,SerB3]-MIC1
HO.
Ν'
H
E
XvVxw·
Η Η ...I. _
HN.
HO'
CH •C
S
Q
V
P
A
N
P
M
V
K
D
V
P
A
H II
P-N >
Figure BR112019024102A2_D0186
C
R
L
N
M
H
G
S
V (Fórmula 14)
C—Nx >r
H II
CH
C—Nx >
H II 0
OH
OH
[00518] O composto 14 foi preparado usando o procedimento descrito no exemplo 11.10 usando o prolongador descrito no exemplo 10.5 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 311).
[00519] Massa teórica: 28043,9; Obteve-se: 28043,6.
Exemplo 11.15 e Exemplo 11.16: Composto 15 e Composto 16
Composto 15:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 190/241
184 /209
[00520] N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] eto xi]acetil]amino]metil]fenil]metil-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA-16,ThrA-15,Pro A- 14,GluA-13 ,SerA12,GlyA-ll,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyBH,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB2,GlyBl[LeuA57,ArgA69,LeuA86,ArgA91,ArgA107,LeuB57,ArgB69,LeuB86,Arg B91,ArgB107],des-AsnA3,AsnB3-MIC-l
Composto 16:
[00521] N{A-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] eto xi]acetil]amino]metil]fenil]metil,N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4carboxi-4-(17carboxiheptadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] eto xi]acetil]amino]metil]fenil]metil-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA-16,ThrA-15,Pro A- 14,GluA-13 ,SerA12,GlyA-ll,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyBH,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB2,GlyBl[LeuA57,ArgA69,LeuA86,ArgA91,ArgA107,LeuB57,ArgB69,LeuB86,Arg
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 191/241
185 /209
B91,ArgB107],des-AsnA3,AsnB3-MIC-l
O OH
Figure BR112019024102A2_D0187
Figure BR112019024102A2_D0188
Nx >-E PATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS EGARGDHCPL
Η II 0 GPGRCCRLHT VRASLEDLGW SQFRAANLHA QIKTSLHRLR QRTDTGVSLQ TYDDLLARDC ADWVLSPREV QVTMCIGACP 0 Η II P D T V P A P-N k-C V PASYNPLVLI ÇH3 y H C-hrV- OH
£ H-N^Y-E PATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTE PS EGARGDHCPL
Η II 0 GPGRCCRLHT VRASLEDLGW SQFRAANLHA QIKTSLHRLR QRTDTGVSLQ TYDDLLARDC (Fórmula 15) ADWVLSPREV QVTMCIGACP r P D T V P A P-N^Yf-C V PASYNPLVLI ÇH3 H J k,.CH3 H C-N^V-OH H II O
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 192/241
186 /209
O OH
Figure BR112019024102A2_D0189
Figure BR112019024102A2_D0190
Ο
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLS
STEPS EGARGD
PREV QVTMCIG
Figure BR112019024102A2_D0191
(Fórmula 16)
[00522]
Os compostos 15 e 16 foram preparados usando procedimento descrito no exemplo 11.10 usando o prolongador descrito exemplo 10.1 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 312). [00523] Composto 15: Massa teórica: 31241,1; Obteve-se: 31242,0.
[00524] Composto 16: Massa teórica: 32076,0; Obteve-se: 32075,0.
Exemplo 11.17: Composto 17
O no
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 193/241
187 /209
[00525] SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2[[(4S)-4-carboxi-4-(16-sulfohexadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil ]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21 ,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA17, AlaA-16,ThrA-15 ,ProA- 14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11 ,ProA-10,GlyA9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB32,GluB-31,ProB-30,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4(16-sulfohexadecanoilamino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil ]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21 ,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-ll,ProB-10,GlyB9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-ldesAsnA3,AsnB3-MIC-l
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 194/241
188 /209
Figure BR112019024102A2_D0192
G P G R C C R
HT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
Figure BR112019024102A2_D0193
(Fórmula 17)
[00526] mL de tampão TRIS 2M foi adicionado a
176 mg de polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 288) em 15 mM de ácido cítrico/450 mM de cloreto de sódio, pH 3, 2,2 mg/mL. O prolongador descrito no Exemplo 10.6 foi dissolvido em hidrogenocarbonato de sódio saturado para 20 mg/L, 8 equivalentes. O prolongador foi então adicionado à solução de polipeptídeo. 12,4 mg de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina, sal de kalium di-hidratado, Sigma-Aldrich 698539 dissolvido em água (0,1 mg/mL) foram adicionados e a mistura de reação foi suavemente agitada por 10s. Após 6 horas, o composto foi purificado em uma coluna C4 usando uma coluna de fase reversa C4 usando um tampão etanol/fosfato de 10-50% pH 3,0.
[00527] Massa teórica: 32050,3; Obteve-se: 32050,0.
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 195/241
189 /209
Exemplo 11.18: Composto 18
[00528] SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{Beta}-[2-[[(5S)-5-carboxi-5-[[2[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(lH-tetrazol-5il)heptadecanoilsulfamoil]butanoilamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi] acetyl]amino]pentil]amino]-2-oxoetil]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA18,SerA-17, AlaA-16,ThrA-15 ,ProA- 14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11 ,ProA10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyAl,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{Beta}-[2-[[(5S)-5-carboxi-5-[[2-[2-[2-[[2-[2[2-[4-[17-(lH-tetrazol-5il)heptadecanoilsulfamoil]butanoilamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi] acetyl]amino]pentil]amino]-2-oxoetil]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-ll,ProB10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-ldesAsnA3,AsnB3-MIC-l
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 196/241
190 /209
Figure BR112019024102A2_D0194
Figure BR112019024102A2_D0195
(Fórmula 18)
[00529] Os compostos 18 foram preparados usando o procedimento descrito no Exemplo 11.17 usando o prolongador descrito no Exemplo 10.7 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 288).
[00530] Massa teórica: 32266,6; Obteve-se: 32266,0.
Exemplo 11.19: Composto 19
[00531] SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{Beta}-[2-[[(lS)-l-carboxi-5-[[2[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino]pentil] amino] -2oxoetil]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrAPetição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 197/241
191 /209
23,ProA-22,GlyA-21 ,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17, AlaA-16,ThrA15,Pro A- 14,GluA-13,SerA- 12,GlyA-11 ,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB30,S{Beta}-[2-[[(lS)-l-carboxi-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino]pentil] amino] -2oxoetil]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB22,GlyB-21 ,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17, AlaB-16,ThrB-15,ProB14,GluB-13 ,SerB-12,GlyB-11 ,ProB- 10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-ldes-AsnA3,AsnB3-MIC-l
Figure BR112019024102A2_D0196
Figure BR112019024102A2_D0197
Figure BR112019024102A2_D0198
ch3
Figure BR112019024102A2_D0199
Figure BR112019024102A2_D0200
Figure BR112019024102A2_D0201
ch3 (Fórmula 19)
[00532] Os compostos 19 foram preparados usando o procedimento descrito no Exemplo 11.17 usando o prolongador descrito no Exemplo 10.8 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 288).
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192 /209
[00533] Massa teórica: 32166,3; Obteve-se: 32166,0.
Exemplo 11.20: Composto 20
[00534] SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{Beta}-[2-[[(lS)-l-carboxi-5-[[2[2- [2- [[2- [2- [2- [ [(4S)-4-carboxi-4- [ 12- (4carboxifenoxi)dodecanoilamino]butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etox i]etoxi]acetil]amino]pentil]amino]-2-oxoetil]CysA-29,ThrA-28,SerA27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyAH,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{Beta}-[2-[[(lS)-l-carboxi-5-[[2-[2[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[12-(4carboxifenoxi)dodecanoilamino]butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etox i]etoxi]acetil]amino]pentil]amino]-2-oxoetil]CysB-29,ThrB-28,SerB27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyBH,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB2,GlyB- ldes-AsnA3,AsnB3-MIC-1
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 199/241
193 /209
Figure BR112019024102A2_D0202
ο ο
GPGRCCRLHT VRASLEDLGW ADWVLSPREV QVTMCIGACP
Figure BR112019024102A2_D0203
CH3 (Fórmula 20)
[00535] Os compostos 20 foram preparados usando o procedimento descrito no Exemplo 11.17 usando o prolongador descrito no Exemplo 10.9 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 288).
[00536] Massa teórica: 32222,4; Obteve-se: 32222,0.
Exemplo 11.21: Composto 21
[00537] SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2[[(4S)-4-carboxi-4- [16-(1 H-tetrazol-5 il)hexadecanoilamino]butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]CysA-29,ThrA-28,SerA27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyAH,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA2,GlyA-l,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{Beta}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 200/241
194 /209
[[(4S)-4-carboxi-4- [16-(1 H-tetrazol-5 il)hexadecanoilamino]butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etilamino] -2-oxoetil] Cy sB -29 ,ThrB -28, SerB 27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyBH,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB2,GlyB- ldes-AsnA3,AsnB3-MIC-1
N. ν' ^7 Vn ,s
H íí
S—N 11
II VXOH o £ ,ΟΗ
S
G
S
E
P
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G
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C
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G
W
A
D
W
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Q
V
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R
P—Ν' H
C
H2N Π-E o P
Figure BR112019024102A2_D0204
s
N
E
G
A
M
C s
N (Fórmula 21)
[00538] descrito no Exemplo 11.17 usando o prolongador descrito no Exemplo 10.10 e polipeptídeo MIC-1 com N-extensão (SEQ ID NO: 288).
Os compostos foram preparados usando procedimento
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[00539] Massa teórica: 32026,3; Obteve-se: 32026,0.
[00540] As estruturas dos Compostos 01-21 estão resumidas na Tabela 18.
Tabela 18 1: As estruturas dos compostos MIC-1
n° do Composto Extensão N Polipeptídeo MIC-1 prolongador
Composto 01 SEPCTSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225) MIC-1, des-N3 (SEQ ID NO:2) Fórmula D (Cl8)
Composto 02 SEPATCGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 226) MIC-1, des-N3 (SEQ ID NO:2) Fórmula D (Cl8)
Composto 03 SEPATCGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 226) MIC-1, des-N3 (SEQ ID NO:2) Fórmula B (Cl6)
Composto 04 SEPATCGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 226) MIC-1, des-N3 (SEQ ID NO:2) Fórmula C (Cl4)
Composto 05 SEPATSCSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 227) MIC-1, des-N3, M57L, M86L (SEQ ID NO:222) Fórmula D (Cl8)
Composto 06 SEPATSGCETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 230) MIC-1, des-N3, M57L, M86L (SEQ ID NO:222) Fórmula D (Cl8)
Composto 07 SEPATSGSETPGTSESAC PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 235) MIC-1, des-N3, M57L, M86L (SEQ ID NO:222) Fórmula D (Cl8)
Composto 08 SEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPCEG (SEQ ID NO: 239) MIC-1, des-N3, M57L, M86L (SEQ ID NO:222) Fórmula D (Cl8)
Composto 09 SEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 71) MIC-1, des-N3, M57L, M86L (SEQ ID NO:222) Fórmula A (Cl8)*
Composto 10 SEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 71) MIC-1, des-N3, M57L, M86L (SEQ ID NO:222) Fórmula A (Cl8)
Composto 11 SEPCTSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225) MIC-1, des-N3, M57L, M86L (SEQ ID NO:222) Fórmula D (Cl8)
Composto 12 EEAEADDDDK (SEQ ID NO: 313) MIC-1, des-Al, R2E, N3S Fórmula D (Cl8)
Composto 13 EEAEADDDDK (SEQ ID NO: 313) MIC-1, des-Al, R2E, N3S (SEQ ID NO:314) Fórmula D (Cl8)*
Composto 14 EEAEADDDDK (SEQ ID NO: 313) MIC-1, des-Al, R2E, N3S (SEQ ID NO:314) Fórmula E (Cl2)
Composto 15 SEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 71) MIC-1, del-N3, M57L, M86L, K69R, K107R, K91R (SEQ ID NO:315) Fórmula A (Cl8)*
Composto 16 SEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 71) MIC-1, del-N3, M57L, M86L, K69R, K107R, K91R (SEQ ID NO:315) Fórmula A (Cl8)
Composto 17 SEPCTSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225) MIC-1, des-N3 (SEQ ID NO:2) Fórmula F
Composto 18 SEPCTSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225) MIC-1, des-N3 (SEQ ID NO:2) Fórmula G
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Composto 19 SEPCTSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225) MIC-1, des-N3 (SEQ ID NO:2) Fórmula H
Composto 20 SEPCTSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225) MIC-1, des-N3 (SEQ ID NO:2) Fórmula K
Composto 21 SEPCTSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225) MIC-1, des-N3 (SEQ ID NO:2) Fórmula J
Nota: * significa que apenas um prolongador está ligado ao Composto 09, Composto 13 ou Composto 15, ou seja, o Composto 09, Composto 13 ou Composto 15 como um dímero tem apenas um prolongador ligado a uma de suas duas extensões N-terminais. Para os outros compostos, um prolongador é ligado a cada uma das duas extensões N-terminais do dímero, isto é, dois prolongadores por Composto dímero.
Exemplo 12: Solubilidade dos compostos MIC-1
[00541] Amostras dos compostos MIC-1 foram preparadas em tampão PBS pH 7,4 seguido por um aumento de concentração das amostras até acima de 35 mg/ml.
[00542] Amostras de compostos MIC-1 em PBS foram concentradas em uma Vivaspin 20 10 kDa MWCO (Sartorius) de acordo com a descrição no manual Vivaspin. Uma centrífuga Heraus Multifuge X3R equipada com rotor de caçamba giratória (Thermo Scientific) foi usada a 4000 rpm (3310 x g) para concentrar as amostras de compostos MIC-1. A concentração foi determinada posteriormente pela medição de UV a 280 nm em uma Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). As concentrações medidas são apresentadas na Tabela 19.
Tabela 19: A solubilidade dos compostos MIC-1
Compostos MIC-1 Solubilidade (mg/ml)
Composto 03 43
Composto 05 36
Composto 01 32
Composto 07 35
Composto 17 41
Composto 19 37
Composto 20 39
Composto 21 31
[00543] Pode ser visto que a fixação de vários prolongadores não afeta a solubilidade melhorada obtida pela adição de uma extensão de aminoácido N-terminal a um polipeptídeo MIC-1.
Exemplo 13: Ensaio de potência in vitro e atividade de ligação de compostos MIC-1 com prolongadores
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Linhagem celular
[00544] A linhagem celular estável BHK21-hGFRAL-IRES-hRET foi gerada na Novo Nordisk com a adição de um vetor com o Elemento de Resposta Sérica (SRE, Serum Response Element) na frente do repórter da luciferase (ver Exemplo 5). A sequência para GFRAL humano e RET humana foi obtida na Uniprot: UniProtKB - Q6UXV0 (GFRAL.HUMAN) e UniProtKB - P07949 (RET_HUMAN). Esta linhagem celular foi usada para o ensaio de luciferase funcional bem como para preparação de membrana para ligação de ensaio de proximidade de Cintilação (SPA, Scintillation proximity assay).
[00545] Ensaio de luciferase: Células BHK21 estavelmente transfectadas com hGFRAL, receptores hRET e genes repórter SRELuciferase foram tratadas com diferentes concentrações de compostos MIC-1. A ativação de receptores foi medida pela quantificação da atividade da luciferase e as potências dos compostos foram calculadas por EC50.
[00546] Ligação de SPA: Membrana celular de BHK21-hGFRALIRES-hRET, células SRE-Luciferase foram tratadas isoladamente com 50pM de MIC-1 marcado com 1125 com diferentes concentrações de compostos MIC-1. As potências de ligação dos compostos MIC-1 foram calculadas por IC50 de curvas de deslocamento.
Ensaio de luciferase
[00547] Frascos com células congeladas foram rapidamente descongelados e as células foram movidas para um tubo coming de 50 ml com 10 ml de meio completo pré-aquecido consistindo em DMEM com alto teor de glicose e pirovato de sódio, 10% de Soro Fetal Bovino inativado, 1% de Penicilina-Estreptomicina, 1 mg/ml de G418-Geneticina e 400 pg/ml de Higromicina. As células foram centrifugadas a 1200 rpm e o sobrenadante foi descartado. Este procedimento de lavagem foi repetido uma vez resultando em lavagem 2 vezes das células. As células foram ressuspensas em meio
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198 /209 completo a uma concentração de 1,2x106 células por ml. As células foram semeadas a 1,2 x 105 células por poço (100 μΐ/poço) em 96 poços de palatos de ensaio revestidos com Poli-D-Lisina. As células foram deixadas ligando-se à superfície inferior dos poços por 4-6 horas a +34°C seguido pela mudança de meio para 80 pl de meio de inanição consistindo em meio RPMI com 15 Mm de HEPES. As células foram deixadas incubar durante a noite a +34°C em um meio umidificado com 5% de CO2. Os compostos de teste foram diluídos serialmente em meio de ensaio consistindo em RPMI, 15 Mm HEPES e 0,5% de ovalbumina com ou sem 5% de albumina sérica humana (HSA). 20μ1 de tampão de ensaio contendo compostos de teste foram adicionados a cada poço resultando em uma concentração final de 0,1% ovalbumina, 1% HSA e compostos de teste variando de 30000 pM a 3 pM com um branco incluído. As placas foram incubadas por 4 horas a +37°C em um meio umedecido com 5% de CO2. Após a incubação, 100 μΐ de soluções de substrato de luciferase foram adicionados a cada poço e vedados. A placa foi deixada incubando por 15 minutos, seguido pela leitura da luminescência. Uma medição de intensidade da luminescência foi usada para cálculos de valores EC50 por análise de regressão não linear das curvas de dose-resposta sigmoidal.
Ligação de SPA
[00548] Células BHK21-hGFRAL-IRES-hRET foram cultivadas a +37°C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 em meio completo consistindo em DMEM com alto teor de glicose e pirovato de sódio, 10% de soro fetal bovino inativado, 1% de penicilina-estreptomicina, 1 mg/ml de G418-Geneticina e 400 ug/ml de Higromicina. As células foram lavadas duas vezes em solução salina gelada (DPBS) e destacadas mecanicamente por raspagem, transferidas em DPBS gelado para tubos cônicos de centrífuga e centrifugadas por 5 min a 1500 rpm a +20°C. O pélete celular foi ressuspenso em uma quantidade total de 10 ml de tampão de homogeneização gelado A
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199 /209 (50 Mm Tris, 2,5 Mm de EDTA, ajustar o pH 7,4 com um coquetel de inibidor de protease sem EDTA/50 ml) e homogeneizado por 20 segundos. Ο homogeneizado foi centrifugado a 16000 rpm em 20 minutos a +4°C. O sobrenadante foi descartado e o pélete foi reconstituído em 10 ml de tampão de homogeneização B (50 Mm Tris, 320 Mm sacarose, ajustando pH 7,4 com um coquetel de inibidor de protease sem EDTA/50 ml) e homogeneizado por 20 segundos e centrifugado a 16000 rpm em 20 minutos a +4°C. Este procedimento foi repetido mais uma vez. O sobrenadante foi descartado e o pélete foi reconstituído em 3 ml de tampão de homogeneização B e homogeneizado por 10 segundos a baixa velocidade. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford padrão e 1,5 mg de proteína/tubo foi aliquotada a criotubos e armazenada a -80°C. Os ensaios de ligação foram realizados em placas de 96 poços brancas em um volume total de 200 μΐ por poço. Grânulos de SP A de aglutinina de germe de trigo foram reconstituídos em tampão de ensaio (50 Mm Tris/HCl, 4,5 Mm MgCE, 0,02% Tween 20 e 0,25% Ovalbumina pH 7,4) e misturado com preparação de membrana para obter uma concentração final de 0,5 mg de grânulos de SP A e 10 pg de proteína total por poço. Cinquenta mil contagens por minuto por poço do ligante radioativo [125I]-MIC-1 humano (gerado na Novo Nordisk) foi adicionado correspondendo a uma concentração de 50 pM. Os compostos MIC-1 a serem testados foram diluídos em série em tampão de ensaio para obter uma concentração de ensaio final variando de 1 pm a 1 pM. A placa foi vedada e incubada a +22°C por 2 horas em um agitador de placa ajustado para 350 rpm e, posteriormente, centrifugada a 1500 rpm por 10 minutos antes da leitura da emissão de luz por grânulos de SPA. O deslocamento do ligante radioativo foi medido como redução da emissão de luz de grânulos de SPA e os valores IC50 foram calculados pela análise de regressão não linear de curvas de dose-resposta sigmoidal (Tabela 20).
Tabela 20: Potência e atividade de ligação de compostos MIC-1
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200 /209
N° de composto/SEQ ID NO Luciferase NNDK EC50 (PM) Luciferase +0,l%HSA NNDK EC50 (pM) IC50 de ligação de SPA de MIC-1 (nM)
SEQ ID NO: 1 59 36 0,67
SEQ ID NO: 164 85 64 119
SEQ ID NO: 288 70 47 6,7
SEQ ID NO: 291 80 45 10
SEQ ID NO: 312 42 35 116
SEQ ID NO: 303 57 34 43
SEQ ID NO: 292 125 115 29
SEQ ID NO: 293 217 243 83
SEQ ID NO: 289 35 26 36
SEQ ID NO: 290 100 75 80
Composto 10 71 146 20
Composto 02 123 107 4,9
Composto 03 96 106 11
Composto 04 90 58 17
Composto 01 72 59 3,8
Composto 15 61 39 39
Composto 16 63 51 11
Composto 06 81 61 21
Composto 05 57 63 23
Composto 08 139 651 56
Composto 11 55 62 29
Composto 07 121 198 29
Composto 17 43 65 4,7
Composto 18 66 67 1,3
Composto 19 45 62 17
Composto 20 49 77 6,5
Composto 21 53 56 1,0
[00549] Como pode ser visto a partir da Tabela 20, os compostos MIC1 com ácidos graxos têm potência in vitro similar em comparação com polipeptideos MIC-1 sem ácidos graxos. Mas a potência in vitro seria menor se a mutação de Cys estiver próxima do N-terminal do polipeptídeo MIC-1, tal como a mutação de Cys S(-3)C.
[00550] A descoberta de que os compostos MIC-1 com ácidos graxos têm potência semelhante à de polipeptideos MIC-1 sem ácidos graxos é surpreendente. Em geral, adicionar ácidos graxos a compostos biológicos farmacêuticos para o prolongamento resulta em uma diminuição na potência e esta diminuição é em geral reforçada pela medição da potência na presença de albumina. Portanto, a descoberta de que não há nenhuma redução na potência de compostos MIC-1 com prolongadores de ácidos graxos é inesperada.
Exemplo 14: Efeito de compostos MIC-1 na ingestão de alimentos em e peso corporal de ratos Sprague Dawley magros
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201 /209
[00551] A eficácia in vivo de compostos MIC-1 da invenção foi medida em ratos Sprague Dawley magros do sexo masculino de 9-11 semanas de idade. Os animais foram injetados uma vez por dia com uma dose de 8nmol/kg de peso corporal 1-2 horas antes do início do período de escuro. Os compostos foram administrados subcutaneamente (l-4ml/kg) em solução tampão apropriada. As mudanças na ingestão de alimento foram medidas por 7 dias usando sistemas de monitoramento automáticos de alimento (sistema BioDAQ e sistema HM2 para rato). No sistema BioDAQ os animais eram abrigados individualmente; e no sistema HM2 os animais eram abrigados em grupos com até 3 animais por gaiola. No dia 8, uma amostra de sangue da cauda foi coletada 2-3 horas após a administração do composto, e esta amostra foi usada para medir as concentrações plasmáticas de compostos administrados. Cada composto foi testado em animais n=4-8. Os animais foram aclimatados por no mínimo 7 dias antes da experiência. Os dados de ingestão de alimentos coletados são expressos como a ingestão de alimento diária (ingestão de alimento em 24 horas) medida do início de cada fase de escuro de 12 horas diária à fase de escuro do dia seguinte. As mudanças diárias na ingestão de alimento em resposta ao composto administrado foram calculadas subtraindo a ingestão de alimento diária da média do grupo do veículo da entrada de alimento diária da média do grupo do tratamento. As mudanças foram consideradas significativas se p<0,l usando um teste t de Student bicaudal. Os resultados são expressos como a redução máxima na ingestão de alimentos em comparação com o veículo (solução tampão, porcentagem) registada durante o período de estudo. Dados também são expressos como a redução acumulada na ingestão de alimentos que, como a soma das reduções diárias significativas (p < 0,1) na ingestão de alimentos (porcentagem) durante o período de estudo. O peso corporal dos animais foi medido no dia da terminação do estudo usando uma balança calibrada. O efeito do tratamento no peso corporal foi calculado como a diferença
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202 /209 percentual no peso corporal entre animais tratados com composto em comparação com animais tratados com veículo na terminação do estudo (Tabela 21).
Tabela 21: Redução da ingestão de alimentos e do peso corporal em ratos SD
N° de composto/SEQ ID NO Redução da ingestão de alimentos Redução do peso corporal [% em comparação com o veículo]
Eficácia máxima @ 8 nmol/kg [% de redução em comparação ao veículo] Eficácia do Acc, 7 dias [% de redução em comparação ao veículo]
SEQ ID NO: 1 67 391 18,4
Composto 12 66 342 18,5
SEQ ID NO: 300 87 431 23,5
SEQ ID NO: 299 92 453 26,0
SEQ ID NO: 298 83 446 24,2
SEQ ID NO: 297 92 495 26,6
SEQ ID NO: 296 86 427 22,6
SEQ ID NO: 295 92 533 29,5
SEQ ID NO: 311 77 420 23,4
Composto 13 75 431 25,2
Composto 14 89 484 26,1
SEQ ID NO: 164 71 408 23,3
Composto 09 54 283 16,5
Composto 10 61 288 18,4
Composto 02 86 470 27,2
Composto 03 86 458 27,4
Composto 04 79 497 30,2
Composto 07 77 375 20,0
Composto 08 70 353 17,7
Composto 05 75 405 19,9
Composto 01 77 426 23,4
Composto 11 58 287 17,5
Composto 17 63 371 18,6
Composto 18 72 384 21,2
Composto 19 68 398 23,5
Composto 20 69 374 22,5
Composto 21 73 394 23,1
[00552] É mostrado a partir dos dados experimentais da Tabela 21 que os compostos MIC-1 com ou sem prolongadores têm eficácia equivalente ou melhor in vivo em ratos quando comparados com polipeptídeo MIC-1 do tipo selvagem. Os dados também mostram que esses prolongadores não têm um impacto negativo sobre a eficácia in vivo de compostos MIC-1.
Exemplo 15: Estudo farmacodinâmico (PD) em porcos
[00553] O objetivo deste experimento foi investigar o efeito dos compostos MIC-1 na ingestão de alimentos e no peso corporal em porcos. Isto
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203 /209 foi feito em um estudo farmacodinâmico (PD) conforme descrito abaixo, em que a ingestão de alimento foi medida de 1 a 21 dias após a administração de uma dose única do composto MIC-1, em comparação com um grupo de controle tratado com veículo.
[00554] Foram utilizados porcos em Landrace Yorkshire Duroc (LYD) fêmeas de aproximadamente 3 meses de idade, pesando aproximadamente 3035 kg (n=4-6 por grupo). Os animais foram alojados em um grupo por aproximadamente 1 semana durante a aclimatização para as instalações animais. Durante a última parte do período de aclimatização, os animais foram colocados em chiqueiros individuais (2 semanas antes da dosagem) e durante todo o experimento para a medição da ingestão de alimento individual. A ingestão de alimento medida nos últimos três dias antes da dosagem serviu como base de referência.
[00555] Os animais foram alimentados com ad libitum com forragem suína (Svinefoder Danish Top SI 611+3', Danish Agro) o tempo todo durante a aclimatização e o período experimental. A ingestão de alimentos foi monitorada online, registrando o peso da forragem continuamente usando o sistema HMview (Ellegaard Systems, Faaborg, Dinamarca). Qualquer derramamento notável foi coletado e pesado, e a ingestão de alimento medida automaticamente foi corrigida para esta quantidade.
[00556] O peso corporal foi medido uma ou duas vezes por semana durante o estudo.
[00557] Os compostos MIC-1 foram dissolvidos em um tampão apropriado em concentrações de aproximadamente 25 ou 100 nmol/ml correspondentes a doses de 1 ou 9 nmol/kg. A solução tampão também serviu como veículo.
[00558] Os animais foram dosados com uma única dose subcutânea dos compostos MIC-1 ou veículo na manhã do dia 1, e a ingestão de alimentos foi medida por 21 dias após a dosagem. No final do estudo os
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204 /209 animais foram sacrificados com uma superdosagem i.v. de Euthasol administrada através do cateter da veia espátula.
[00559] A ingestão de alimentos foi calculada em intervalos de 24 h (024 h, 24-48 h, 48-72 h, 72-96 h até 20-21 dias). Na Tabela 22, a ingestão de alimento média resultante é apresentada como porcentagem da ingestão de alimento média do grupo veículo no mesmo intervalo de tempo.
Tabela 22: Efeito sobre a ingestão de alimentos em porcos
Composto MIC-1 / Intervalo de tempo (dias) PD em porco, ingestão de alimentos (% do veículo) em intervalos de tempo indicados
6-7 13-14 20-21
Veículo 100 100 100
Composto 05 (1 nmol/kg) 88 100 117
Composto 05 (9 nmol/kg) 36 38 65
Composto 01 (1 nmol/kg) 49 86 103
Composto 01 (9 nmol/kg) 29 22 23
[00560] Os dados mostram que uma única injeção s.c. dos compostos testados em porcos causou uma ingestão de alimento reduzida por até e mesmo mais de 21 dias após a injeção (para as doses de 9 nmol/kg do Composto 01).
[00561] O peso corporal foi medido durante o estudo e os porcos ganharam menos peso nos grupos tratados com compostos MIC-1 (Tabela 23, Figura 6).
Tabela 23: Alteração no ganho de peso corporal em relação ao grupo do veículo______________________________________________
Compostos MIC-1 / Tempo (dias) PD em porco, Apeso corporal (em relação ao veículo (%))
7 14 21
Veículo 0 0 0
Composto 05 (1 nmol/kg) -5,7 -5,7 -1,1
Composto 05 (9 nmol/kg) -15,7 -26,5 -22,0
Composto 01 (1 nmol/kg) -9,8 -9,1 -6,6
Composto 01 (9 nmol/kg) -18,4 -26,9 -29,4
Exemplo 16: Estudo farmacocinético em ratos SD magros
[00562] O objetivo deste estudo é determinar a meia-vida terminal (ΤΆ), o tempo de residência médio (MRT), o tempo para níveis plasmáticos máximos (Tmax) e o tempo de biodisponibilidade (F) in vivo dos compostos
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205 /209
MIC-1 após administração intravenosa e subcutânea a ratos Sprague Dawley magros. Isto é feito em um estudo farmacocinético (PK), onde os parâmetros PK dos compostos MIC-1 em questão são determinados. Por Έό, geralmente entende-se o período de tempo que leva para cortar pela metade uma certa concentração plasmática, medida após a fase de distribuição inicial com dosagem intravenosa. Por MRT, em geral, entende-se o período médio de tempo em que o composto em questão permanece no corpo. Por Tmax, em geral, entende-se o ponto no tempo após a administração subcutânea do composto em questão quando o composto em questão atinge a concentração mais alta no plasma sanguíneo durante. Por F, em geral, entende-se a fração de composto administrado por via subcutânea que aparece no plasma sanguíneo.
[00563] Os parâmetros PK supracitados foram medidos em 300 g-500 g de ratos SD magros por injeção do composto na veia da cauda ou na subcutite do pescoço, seguido pela coleta de amostras de plasma sanguíneo em vários pontos no tempo para análise de exposição. Os compostos (4-5 nmol/kg de peso corporal) foram administrados por via intravenosa (1 ml/kg) em uma solução tampão apropriada. O tamanho do grupo intravenoso era tipicamente 4 e o tamanho do grupo do grupo subcutâneo era normalmente 5. Os ratos estavam acordados durante todo o experimento e têm acesso a alimentos e água.
[00564] Para compostos com um 7½ de menos de 12 horas, amostras de sangue foram coletadas da língua tipicamente no horário 5min, 15min, 30min, 60min, 90min, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 8h, 12h, 14h, 22h, 30h, 48h após a dosagem ou no horário Omin, 15min, 30min, 60min, 90min, 2h, 2!/2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 8h, 24h, 30h, 48h após a dosagem. Para compostos com um 7½ de mais de 24 horas de amostras de sangue foram normalmente coletadas da língua no tempo 5min, 15min, 30min, 60min, 120min, 360min, 720min, 24h, 30h, 48h, 54h, 72h, 96h, 168h, 216h, 264h, 336h após a dosagem, 200 μί de
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206 /209 sangue foram coletados em tubos de EDTA e armazenados em gelo por até 20 minutos. As amostras de plasma foram geradas por centrifugação de amostras de sangue por 5 minutos a 10000 G em 4°C. A amostra foi subsequente pipetada em tubos Micronic em gelo seco e mantida a -20°C até ser analisada quanto à concentração plasmática do respectivo composto MIC-1 usando LOCI ou um ensaio baseado em anticorpo similar, tal como ELISA. Os perfis de concentração plasmática em função do tempo individuais foram analisados por um modelo não compartimentado no software Phoenix v. 6.4 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EUA) e a ΤΆ, MRT, Tmax e F resultantes foram determinados (Tabela 24).
Tabela 24: Perfis farmacocinéticos de compostos/polipeptídeos
MIC-1 com extensão N-terminal
N° de composto/SEQ ID NO Dose ROA P/2 h (média) MRT h (média) Tmax h (média) BA % (média)
SEQ ID NO: 1 4 nmol/kg IV 1,7 0,53 NA NA
SEQ ID NO: 92 4 nmol/kg IV 3,9 2,2 NA NA
SEQ ID NO: 100 4 nmol/kg IV 4,0 3,0 NA NA
SEQ ID NO: 104 4 nmol/kg IV 3,8 3,2 NA NA
SEQ ID NO: 105 4 nmol/kg IV 3,4 2,1 NA NA
SEQ ID NO: 106 4 nmol/kg IV 3,4 1,7 NA NA
SEQ ID NO: 107 4 nmol/kg IV 2,8 1,4 NA NA
SEQ ID NO: 108 4 nmol/kg IV 3,8 3,8 NA NA
SEQ ID NO: 294 4 nmol/kg IV 2,9 1,5 NA NA
SEQ ID NO: 1 4 nmol/kg SC 1,9 4,1 2,2 70
SEQ ID NO: 106 4 nmol/kg SC 3,3 6,7 3,0 88
SEQ ID NO: 107 4 nmol/kg SC 3,4 6,8 2,8 82
SEQ ID NO: 108 4 nmol/kg SC 4,1 8,6 3,0 90+
SEQ ID NO: 294 4 nmol/kg SC 2,8 6,2 3,0 67
Composto 13 5 nmol/kg IV 26,3 33,1 NA NA
Composto 12 5 nmol/kg IV 42,1 54,8 NA NA
Composto 14 5 nmol/kg IV 2,9 2,1 NA NA
Composto 10 4 nmol/kg IV 37,0 45,7 NA NA
Composto 02 4 nmol/kg IV 73,8 106,2. NA NA
Composto 03 4 nmol/kg IV 62,4 89,3 NA NA
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207 /209
Composto 04 4 nmol/kg IV 15,6 16,8 NA NA
Composto 06 4 nmol/kg IV 46,6 63,8 NA NA
SEQ ID NO: 289 4 nmol/kg IV 5,1 2,8 NA NA
Composto 01 4 nmol/kg IV 58 82 NA NA
Composto 05 4 nmol/kg IV 53 71 NA NA
Composto 11 4 nmol/kg IV 50 72 NA NA
Composto 01 4 nmol/kg SC 56 114 50 36
Composto 05 4 nmol/kg SC 53 106 50 35
Composto 11 4 nmol/kg SC 57 116 50 52
Composto 17 4 nmol/kg SC 55,8 57,2 55,5 42,3
Composto 18 4 nmol/kg SC 52,9 53,1 54,0 38,2
Composto 17 4 nmol/kg IV 68,5 90,1 NA NA
Composto 18 4 nmol/kg IV 50,8 67,4 NA NA
[00565] Pode-se ver que os compostos MIC-1 com prolongadores têm ΤΆ, MRT e Tmax muito mais longos em comparação com seus polipeptídeos MIC-1 não prolongados com N-extensões. O prolongamento de compostos biológicos farmacêuticos com prolongadores de ácido graxo comparáveis em geral resulta em uma meia-vida terminal raramente excedendo 12 horas em ratos. A descoberta de meia-vida terminal de mais de 48 horas é inesperada e surpreendente.
Exemplo 17: Estudo farmacocinético em mini-porcos
[00566] O objetivo deste estudo foi determinar o prolongamento in vivo do composto MIC-1 após administração i.v. a mini-porcos, ou seja, o prolongamento do seu tempo no corpo e, assim, seu tempo de ação. Isso foi feito em estudos farmacocinéticos (PK), onde a meia-vida terminal do composto em questão foi determinada. Por meia-vida terminal entende-se o tempo que leva para cortar pela metade uma certa concentração plasmática na fase de eliminação terminal.
[00567] Mini-porcos Gottingen fêmeas obtidos da Ellegaard Gottingen Minipigs (Dalmose, Dinamarca) de aproximadamente 8 meses de idade e pesando aproximadamente 23-25 kg foram usados nos estudos. Os miniporcos foram alojados individualmente (porcos com cateteres permanentes) em chiqueiros com palha como roupa de cama e alimentados de forma restritiva uma vez ao dia com dieta de mini porco Altromin 9030 (Altromin Spezialfutter Gmbh & Co. KG).
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208 /209
[00568] Após três semanas de aclimatização, dois cateteres venosos centrais permanentes foram implantados na veia cava caudalis em cada animal. Os animais foram deixados de recuperação de 1 semana após a cirurgia e foram então usados para estudos farmacocinéticos repetidos com um período de lavagem adequado entre dosagens sucessivas.
[00569] Injeções intravenosas (o volume correspondente a 0,17 ml/kg) do composto foram aplicadas através de um cateter, e o sangue foi amostrado em pontos no tempo predefinidos por até 12 dias após a dosagem (preferencialmente a partir do outro cateter).
[00570] Amostras de sangue (por exemplo, 0,8 ml) foram coletadas em tubos revestidos com EDTA (8 Mm) e então centrifugadas a 4°C e 1942g por 10 minutos. As amostras de sangue foram coletadas em pontos no tempo predefinidos. No exemplo, amostras de sangue foram coletadas em t= prédose, 0,0833, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 168, 192, 216, 240, 264 e 288 horas após a dose.
[00571] O plasma foi pipetado em tubos Micronic em gelo seco e mantido a -20°C até ser analisado quanto à concentração plasmática do composto MIC-1 usando LOCI. Perfis de concentração plasmática-tempo individuais foram analisados por um método farmacocinético não compartimentário em Phoenix v. 6.4 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EUA) e as meias-vidas terminais resultantes (média harmônica) determinadas. Resultados
[00572] O seguinte resultado foi obtido (Tabela 25).
Tabela 25: Estudo In vivo em mini-porcos Gottingen após administração intravenosa ______________________________________
n° do Composto PK iv dos mini-porcos
V/i (horas) MRT (horas)
Composto 02 338 487
Composto 05 290 420
Composto 11 347 489
[00573] Meia-vida terminal (1½) é a média harmônica, n=3
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209 /209
[00574] O prolongamento de compostos biológicos farmacêuticos com prolongadores de ácidos graxos comparáveis em geral resulta em uma meiavida terminal raramente excedendo 100 horas em mini-porcos. O resultado de uma meia-vida terminal de mais de 300 horas é inesperado e surpreendente.

Claims (17)

1. Composto MIC-1, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido Nterminal e um transferidor anexado à extensão de aminoácido, em que a extensão de aminoácido compreende 3 a 36 resíduos de aminoácidos e em que o polipeptídeo MIC-1 com a extensão de aminoácido tem um pi calculado menor do que 6,5.
2. Composto MIC-1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a extensão de aminoácido N-terminal compreende um resíduo de cisteína e em que o transferidor é ligado à extensão de aminoácido no resíduo de cisteína.
3. Composto MIC-1 de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o transferidor compreende a Substância química 1, Substância química 2, Substância química 3 e Substância química 4;
em que a Substância química 1 é selecionada dentre o grupo que consiste em:
Substância química A:H00C-(CH)2)x-C0-*,
Substância química 1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*,
Substância química 1C: HOOC-benzeno-O-(CH2)y-CO-*, e
Substância química 1D: (lH-tetrazol-5-il)-(CH2)x-CO-*, em que x é um número inteiro na faixa de 12-20, em que y é um número inteiro na faixa de 5-15;
em que a Substância química 2 é selecionada dentre o grupo que consiste em:
Substância química 2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)mCO)k*,
Substância química 2B: :;:-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k:::, e
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2 / 17
Substância química 2C: *-(NH-(CH2)m-ciclo-hexanoC0)k-*, em que m da Substância química 2 é um número inteiro na faixa de 1-5, e k da Substância química 2 é um número inteiro na faixa de 04;
em que a Substância química 3 é * (NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)i, em que k da Substância química 3 é um número inteiro na faixa de 1-10, n é um número inteiro na faixa de 1-5, e
1 é um número inteiro na faixa de 0-5;
em que a Substância química 4 é selecionada dentre
Substância química 4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*, e
Substância química 4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NHco-ch2-*, em que m da Substância química 4 é um número inteiro na faixa de 1-5; e em que a Substância química 1, Substância química 2, Substância química 3, e Substância química 4 são interligadas através de ligações de amida, conectando a extremidade *-NH de uma Substância química à extremidade CO-* de outra Substância química, e em que a CH2-* extremidade da Substância química 4 é conectada a um átomo de enxofre do resíduo de Cisteína da extensão de aminoácido.
4. Composto MIC-1 de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a Substância química 1 é selecionada dentre o grupo que consiste em:
Substância química la: HOOC-(CH2)i6-CO-*,
Substância química 1b: HO-S(=O)2-(CH2)i5-CO-* e
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3 /17
Substância química 1c: HOOC-benzeno-O-(CH2)9-CO-*.
5. Composto MIC-1 de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a Substância química 2 é selecionada dentre o grupo que consiste em:
Substância química 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Substância química 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* e
Substância química 2c: *-NH-CH2-ciclo-hexano-CO-*.
6. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a Substância química 4 é selecionada dentre o grupo que consiste em:
Substância química 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-* e
Substância química 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NHCO-CH2-*.
7. Composto MIC-1 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o transferidor é selecionado dentre o grupo que consiste na Fórmula IX, Fórmula X, Fórmula XI, Fórmula XII e Fórmula
XIII:
Figure BR112019024102A2_C0001
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4 / 17
Ο
Figure BR112019024102A2_C0002
(Fórmula XI),
Figure BR112019024102A2_C0003
(Fórmula XII) e
Figure BR112019024102A2_C0004
8. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a extensão de aminoácido N-terminal tem um excesso de resíduos de aminoácidos ácidos (tal como ácido aspártico e/ou ácido glutâmico) de pelo menos 3, 4, 5 ou 6 em comparação com o número de resíduos de aminoácidos básicos (tal como Lisina, Arginina e/ou Histidina).
9. Composto MIC-1 de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a extensão de aminoácido N-terminal é composta por resíduos de aminoácidos selecionados dentre o grupo que consiste em A, C, E, G, P, S e T.
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5 /17
10. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, caracterizado pelo fato de que a distância entre o resíduo de Cisteína da extensão de aminoácido e aminoácido N-terminal do polipeptídeo MIC-1 é de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos.
11. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a extensão de aminoácido N-terminal compreende uma ou mais das seguintes sequências:
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS (SEQ ID NO: 223),
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPS (SEQ ID NO: 224),
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 225),
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 226),
SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 227),
SEPACSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 229),
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 230),
SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 231),
SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 232),
SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 233),
SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO:
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6 /17
234),
SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 235),
SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 236), e
SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEG (SEQ ID NO: 237).
12. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MIC1 compreende pelo menos uma substituição de M57L e/ou M86L, em comparação com MIC-1 da SEQ ID NO:1, e/ou compreende uma exclusão dos primeiros três resíduos ou uma exclusão de N3 em comparação com MIC1 da SEQ ID NO:1.
13. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que um polipeptídeo MIC-1 com uma extensão de aminoácido N-terminal compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID
NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID
NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID
NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 164, SEQ ID
NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 ou SEQ ID NO: 292.
14. Composto MIC-1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado dentre o grupo que consiste em:
Petição 870200001025, de 03/01/2020, pág. 222/241
7 / 17
Figure BR112019024102A2_C0005
Fórmula 01;
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8 /17
Figure BR112019024102A2_C0006
Ρ Μ V I
Ο
Figure BR112019024102A2_C0007
L S [>
I. 6 Λ
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M V i.
Fórmula 02
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Ü: Ρ
Figure BR112019024102A2_C0010
βaCC«LHΤ VRASLÊBL6W
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Figure BR112019024102A2_C0011
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Figure BR112019024102A2_C0013
Fórmula 05;
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GM
Figure BR112019024102A2_C0014
G P G R C Ç R L
Figure BR112019024102A2_C0015
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Fórmula 07;
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8 P S R C C R l « ϊ V R A S L E 0 L G W A 0 W V L 8 P R E V □ V ΐ Μ S ! G A C P
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Fórmula 11;
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Fórmula 17;
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Fórmula 18;
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Fórmula 19;
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Fórmula 20 e;
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Η $
C«J
Fórmula 21.
15. Composto MIC-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de ser para uso na prevenção e/ou tratamento de um distúrbio metabólico, em que o distúrbio metabólico é obesidade, diabetes, dislipidemia cardiovascular, arteriosclerose, esteatohepatite ou nefropatia diabética.
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